FI104093B - Menetelmä kasvikumituotteen valmistamiseksi ja kasvikumituotteen käyttö - Google Patents

Description

104093 MENETELMÄ KASVIKUMITUOTTEEN VALMISTAMISEKSI JA KASVIKUMI-TUOTTEEN KÄYTTÖ.

Tämä keksintö koskee menetelmää kasvikumituotteen valmistami- * seksi kasvisoluista kudosviljelmässä ja näin valmistetun kasvikumiaineen käyttöä koostumusten lisäaineena ruoka-teollisuudessa. Erityisesti tämä keksintö koskee tämän kasvikumituotteen käyttöä korvaavana aineena kumeille, kuten ara-5 bikumi (paljon käytetty emulsioiden stabilisaattori) ja guar-kumi (paljon käytetty paksunnosaine) ruokateollisuudessa, ja tässä annetaan esimerkkejä tämän kasvikumituotteen käytöstä emulsioiden stabilisaattorina, emulgaattorina, paksunnosai-neena ja koostumuksen muuntajana; keksintö ei kuitenkaan ole 10 rajoittunut näihin käyttöihin.

Yhdistetyillä hiilihydraateilla ja polysakkarideilla on lukuisia toimintoja ruokatuotteissa, kuten toimiminen emulgaat-toreina, emulsion stabiloijina, paksunnos- ja geeliyttämis-aineina sekä suspendoivina aineina (Sandford and Baird, 15 1983). Useimmat polysakkaridit toimivat muuttamalla vesi- liuosten tai dispersioiden ominaisuuksia ensisijaisesti muuttamalla niiden kykyä sitoa vesimolekyylejä ja ioneja; ne vuo-« rovaikuttavat myös toistensa kanssa "rajapintavyöhykkeen" muodostumisen vaikutuksesta (Rees, 1972).

20 Useissa kasvisuvuissa on lajeja, jotka erittävät kumeja, ja • niistä, jotka tuottavat suuria määriä, saadaam kumeja helpos ti. Kumien erittämisen lisäksi niitä saadaan myös siemenistä, -esimerkiksi guarkumi, ja levistä, esim. agar. Aivan viime aikoina kumeja on tuotettu mikrobifermentoinnilla ohjatuissa 25 olosuhteissa, ja ksantaanikumi, jota tuotetaan tällä menetelmällä, on viime aikoina saavuttanut kaupallista merkitystä.

«

Yleensä nämä kumit tai kumiliuokset ovat hiilihydraattirik-kaita suurimolekyylipainoisia polymeerejä, jotka koostuvat happamista ja/tai neutraaleista monosakkaridirakennusyksi-30 köistä liittyneenä toisiinsa glykosidisidoksilla.

Arabikumi on maailman eri trooppisilta ja puolitrooppisilta alueilta löydettävän akaasiapuun (Acacia Senegal) lajeista 2 104093 peräisin oleva kuivattu erite. Akaasiapuut tuottavat suuria määriä arabikumia epäedullisissa olosuhteissa, kosteuden puutteessa, huonolla ravinnolla ja korkeissa lämpötiloissa.

Kumi kerätään sen tihkuessa luonnollisesti haavojen pinnalta, 5 jotka yleensä on tehty varovasti viljeltyihin puihin. Erite ’ kuivataan, jolloin muodostuu tuote, joka on täysin liukoinen kuumaan tai kylmään veteen, jolloin syntyy viskoosi kumi-liuos, jota voidaan laajalti käyttää paksunnosaineena ja emulsioiden stabilisaattorina ruokien, virvokkeiden ja ma-10 keisten suuressa joukossa sekä myös liimoissa, musteissa, tekstiileissä, painamisessa ja kosmetiikassa.

Suspensioviljellyt kasvisolut erittävät kasvualustaan yhdistettyjen hiilihydraattien ja glykoproteiinien seosta. Yhdistettyjen hiilihydraattipolymeerien pääluokat ovat proteogly-15 kaanit (esim. arabinogalaktaaniproteiinit (AGP:t)), polysakkaridit (esim. neutraalit ja happamat pektiinit), hetero- ja homoglukaanit, heteroksylaanit ja hetero- ja homomannaanit (McNeil et ai., 1984). Nyt on havaittu, että näiden polymeerien seos, joka on tuotettu eri kasvisuvuista peräisin ole-20 vien kasvien kudoksista saatujen solujen avulla, on hyödyllinen korvaava aine kasvikumeille ruokateollisuudessa, ja sitä voidaan' käyttää esimerkiksi korvaavana aineena arabikumille emulgoivana, stabiloivana ja/tai paksuntavana aineena.

Kasveja monista kasvisuvuista voidaan viedä kallusviljelmään 25 (kiinteä) ja sitten nestesuspensioviljelmään. On tunnettua, j että AGP:t ja muut monimutkaiset hiilihydraatit ja proteiinit ! erittyvät monista tällaisista solulinjoista (Clarke et ai., 1979; Fincher, et ai., 1983). Tämän keksinnön mukaan soluja mistä tahansa yhdistettyjä hiilihydraatteja erittävästä kas-30 vista viljellään kudosviljelmässä ’sopivassa kasvualustassa niin, että yhdistettyjen hiilihydraattien ja (glyko)proteiinien seos erittyy kasvualustaan. Tämän keksinnön erityisenä piirteenä on havittu, että päärynästä, Pyrus, makeasta kirsikasta, Prunus avium ja ruususta, Rosa, saadut kudosviljelmät 35 erittävät suuria saantoja monimutkaisia hiilihydraatteja.

5 104093 Tämä voi johtua puiden itsensä kyvystä tuottaa kumeja haavojen eritteenä.

*

Keksinnön mukainen menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: (a) kumia erittävien kasvisolujen viljeleminen kudosviljel-5 mässä kasvualustan läsnäollessa; ja ' (b) solujen erittämän kumituotteen talteenottaminen kasvualustasta.

; Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettua kasvi-kumituotetta käytettäessä eräässä erityisessä toteutusmuo-10 dossa ruoka- tuote voi sisältää stabiilin emulsion, jolle on tunnusomaista se, että se sisältää edellä kuvatun kasvikumituotteen emul-goivana tai stabiloivana aineena. Tällaista stabiilia emulsiota voidaan käyttää esimerkiksi majoneesin pohjana. Kuten 15 ruokateo-llisuudessa hyvin tunnetaan, erilaisia majoneeseja erilaisiin tarkoituksiin (meren antimiin, munaruokiin, vihreisiin sälaatteihin, perunasalaatteihin, jne.) voidaan valmistaa käyttäen erilaisia yhdistelmiä väri- ja makuaineista, jotka lisätään öljy-vesiseokseen ennen emulgointia tai sen 20 jälkeen.

* % 4 104093

Keksinnön muissa toteutusmuodoissa kasvikumituote voidaan lisätä ruokatuotteeseen paksunnos- tai geeliytymisaineena, koostumuksen muuntajana, side- tai pinnoiteaineena, tai vastaavana.

f 5 Kuten edellä monin tavoin on esitetty, tämän keksinnön mukaisesti käytettävä kasvikumituote on tuote, joka erittyy sus-pensioviljellyistä kasvisoluista. Kumia erittävän kasvin solut, jotka voivat esimerkiksi olla peräisin lehdestä, emin vartalosta, heteen ponnesta tai varresta, viedään suspensio-10 viljelmään, ja viljelmäseokseen erittyvät kumit otetaan talteen kumituotteen valmistamiseksi. Talteenotto voi olla mikä tahansa sopiva menetelmä, kuten selektiivinen suodatus ja/tai alkoholisaostus.

Esimerkkinä tästä keksinnöstä voi kumituote koostua aineesta, 15 jota erittävät päärynän (Pyrus) suspensioviljellyt solut.

Näiden solujen on havaittu erittävän yhdistettyjen hiilihydraattien seosta saannolla 5,26 mg hiilihydraattia/ ml viljel-mänestettä määritettynä Dubois et al.:n menetelmällä (1956).

Seos sisältää 82% neutraaleja monosakkarideja ja 14% happamia 20 ("pektiinit") monosakkarideja. Happamat jäännökset määritet tiin Bliimenkrantzin ja Asboe-Hansenin menetelmällä (1973). Se sisältää myös suunnilleen 4% proteiinia määritettynä Brad-fordin (1976) menetelmällä. Tässä esimerkissä kumituotteen arabinogalaktaaniproteiinin (AGP) pitoisuus oli 8,9% (w/w) 25 hiilihydraattien kokonaismäärästä määritettynä van Holstin ja darken yksisädediffuusiokokeella (1985). Tämän seoksen erään esimerkin neutraalien monosakkaridien koostumus määritettynä siten, kuin julkaisussa Basic et ai. (1986) on kuvattu, on • seuraava: 5 104093

Monosakkaridi %w/w ’ ramnoosi 2 fukoosi 3 arabinoosi 16 5 ksyloosi 11 mannoosi 4 galaktoosi 18 glukoosi 46

Muissa esimerkeissä samat päämonosakkaridit ovat läsnä, mutta 10 niiden ja makromolekyylien, kuten polysakkaridien ja (glyko)-proteiinien osuudet voivat vaihdella. Arabinoosi, ksyloosi, galaktoosi ja glukoosi ovat pääasialliset neutraalit monosak-karidit, kun taas ramnoosi, fukoosi ja mannoosi muodostavat tyypillisesti pienemmän osan neutraaleista monosakkarideista.

15 Ei ole mitään yksittäistä mittausta tai parametriä, joka osoittaa kumituotteen sopivuuden ruokiin. Sen sijaan suori- « · tetaan'joukko fysikaalisia mittauksia (esim. viskositeetti, leikkausnopeus, geelivahvuus, sulamislämpötila), jotka yhdistettynä subjektiivisten makuarvioiden kanssa (esim. maun 20 "runko", "suun tunto", takertuvuus) osoittavat todennäköiset ruoat, johon kumituotetta voidaan käyttää. Seuraavat yleiset esimerkit kumituotteen käytöstä, joka on valmistettu Pyrus-suvun suspensioviljellyistä soluista, kuten edellä on kuvattu, ja verrattu arabikumin (paljon käytetty emulsioiden sta-25 bilisaattori) ja guarkumin (paljon käytetty paksunnosaine) kanssa, annetaan tässä valaisemaan joitakin tuotteen käyttöjä ruoassa, seuraavalla tavalla:

1 I

1. ' Paksunnosaine »

Kumituotteella on sopivat viskositeetti- ja leik-30 kausohennusominaisuudet tekemään sen sopivaksi käy tettäväksi paksunnosaineena ruokatuotteissa. Kumi-tuotteen mitattu viskositeetti oli vertailukelpoinen guarkumin viskositeetin kanssa samalla konsentraa-tiolla (0,5% w/v).

6 104093

Kumituotteen pienempi viskositeetti yhdessä kasvavan leikkauksen kanssa oli samanlainen kuin guarkumilla havaittu. Tämä tarkoittaa sitä, että kumituotteella oli samat tiksotrooppiset ominaisuudet kuin 5 guarkumilla. ~

Leikkausvoiman vaikutus kumituotteen ja guarkumin mitattuun viskositeettiin on esitetty kuvassa 1, 2.Emulsion stabilisaattori/emulgaattori

Kumituotteella pitoisuutena 0,28% (w/v) oli 10 erinomaiset emulsiota stabiloivat ominaisuudet: suunnilleen kolminkertainen arabikumin konsentraatio (1,0% (w/v)) tarvittiin tuottamaan vastaava emulsio, jota voitiin käsitellä ilman, että se hajosi ja oli rakenteeltaan ja fysikaaliselta kestävyydeltään 15 samanlaista kuin tofu, maitokvarkki tai paistettu vanukas. Tällä suhteellisen korkealla konsentraatiolla (1,0% w/v) saatu arabikumiemulsio ei kuitenkaan ollut niin stabiili säilytettäessä kuin kumituotteella saatu paljon pienemmällä 20 konsentraatiolla (0,28% (w/v)). Vertailevassa j tutkimuksessa öljy värjättiin lisäämällä öljyliukoista väriä, nimeltään Sudan Black, jotta valokuvaus tuli mahdolliseksi. Tulokset osoittavat selvästi, että öljy arabikumiseoksessa on erottunut 25 ja noussut pintaan säilytyksen jälkeen, kun taas kumituotteen avulla valmistettu emulsio pysyy stabiilina, öljy jakautuneena tasaisesti koko l seokseen.

3 .Rakenteen muuntaja 30 Kumituotteella on hyvä "tuntu suussa" ja se on lähes mautonta, mikä tekee sen hyvin sopivaksi lisätä valmistettuun ruokakoostumukseen. Geeli on pehmeätä ja kuitenkin koossa pysyvää ja "puhdasta" kielellä, 7 104093 suussa samanlaista kuin kiinteä jogurtti tai pektii-nistä tai gelatiinista valmistettu geeli. Sitä vas-. toin konsentraatioltaan sama guarliuos tuntui suussa limaiselta ja maistui "papumaiselta".

5 Nämä yleiset esimerkit kumituotteen käytöstä ruokatuotteissa tämän keksinnön mukaisesti osoittavat kasvisoluviljelmän avulla valmistettujen kumien ja emulsioiden stabiloijien mahdollisuudet ruokateollisuudessa.

Voidaan tietenkin arvioida, että kasvikumituotteen valmistus 10 in vitro tämän keksinnön mukaisesti voi tarjota merkittäviä kaupallisia etuja tuotantokustannusten ja saantojen suhteen verrattuna aikaisemmin tunnettuihin menetelmiin kumien, kuten arabikumin tuotannossa, jotka ovat riippuvaisia useita viikkoja kestävästä erittyvän luonnonkumin keräämisestä käsin.

15 Lisäksi, koska näiden kumien hankinta perinteisistä lähteistä ei aina ole pystynyt tyydyttämään teollisuuden kysyntää, eri-, tyisesti ruokateollisuuden tapauksessa, esiintyy tarvetta löytää tehokkaampi ja taloudellisempi lähde sopivalle kumi-tuotteelle, joka on tämän keksinnön tarjoamaa tyyppiä.

20 Seuraavat esimerkit kuvaavat esimerkinomaisesti kumituotteen tuotantoa ja käyttöä tämän keksinnön mukaisesti emulsioiden stabiloijana majoneesin valmistuksessa. Voidaan tietenkin arvioida, että tämän keksinnön tuote on samoin käyttökelpoinen emulgoivana aineena tai stabilisaattorina monissa muissa 25 emulsiotuotteissa ruokateollisuudessa.

ESIMERKKI 1 , ; Kumituotteen tuotanto ja talteenotto

Suspensioviljellyistä Pyrus-soluista erittynyt kumituote valmistettiin ja otettiin talteen seuraavalla tavalla: 30 Solujen viljely. Kasvualusta (700 ml) laajasuisissa

Erlenmeyer-kolveissa (2 litraa vetoisuudeltaan) steriloitiin autoklaavissa (ll0°c, 20 minuuttia) ja siirrostettiin 8 104093 suunnilleen 10%:lla (v/v) 7 päivän ikäisellä viljelmällä sus-pensioviljeltyjä Pyrus-soluja, jotka olivat peräisin kallus-viljelmästä (kiinteä) ja kasvoivat samassa kasvualustassa.

Kolvit inkuboitiin pyörivässä ravistimessa (100 rpm) 27°C:ssa 5 14 päivää. Kasvualustan koostumus oli seuraava, valmistettuna * 1 litraksi Millipore-suodatetulla vedellä:

Makroelementit 100 ml

Mikroelementit 1 ml

Vitamiinit 1 ml 10 CaCl2 2,5 ml

FeEDTA 2,5 ml

Asparagiini 180 mg

Askorbaatti 50 mg

Tiourea 25 mg 15 Sakkaroosi 40 g KI 0,5 ml 2,4-D (2,4-dikloorifenoksi-etikkahappo)* 1 ml pH säädetään arvoon 5,8-6,0 KOH:lla.

20 * (50 mg 2-3 ml:ssa EtOH, lämmitetään lievästi, jotta liuke nee, ja injektoidaan 50 ml:n pulloon, joka sisältää suodatettua vettä.)

Kasvikumituotteen kerääminen ja käsittely. Viljelmä (2,8 littaa) suodatettiin kaksinkertaisen harsokankaan läpi solujen 25 poistamiseksi. Suodos (neste)(l,4 litraa), joka sisälsi 5,26 mg kompleksihiilihydraattia/ml pantiin dialyysipussiin (halkaisija n. 10 cm) ja konsentroitiin suunnilleen puoleen tila-vuuteen käyttäen "Carbowaxia" (polyetyleeniglykoli) l°C:ssa * noin 24 h. Konseptroitu tuote dialysoitiin sitten 24 h noin 30 40 litraa tislattua vettä vastaan, joka sisälsi 0,1 % (w/v) « natriumatsidia mikrobienvastaisena aineena, jonka jälkeen dialysoitiin 24 h samaa tislatun veden tilavuutta vastaan, jossa ei ollut natriumatsidia. Dialyysi suoritettiin vakio-sekoitusolosuhteissa poreiluttamalla vettä pienestä ilmapum-35 pusta tulevalla ilmalla. Syntyneen kasvikumituotteen , 104093 lopullinen tilavuus oli 570 ml. Tuotteen hiilihydraattipitoi-suus oli 13 mg/ml.

b. Ruokatuotteen valmistus

Valmistettiin stabiili öljy-vesi-emulsio, emulgoivana aineena 5 kumituote, joka oli erittynyt Pyrus-kasvisolujen suspensio-viljelmistä, ja käytettiin pohjana valmistettaessa erilaisia majoneeseja.

Kasviöljy (esim. Meadowlea-sekakasvioljy; 20 ml) emulgoitiin 80 ml saan vesifaasia, joka sisälsi 0,25-0,5 g kumituotetta ja 10 riittävästi etikkahappoa halutun maun saamiseksi. Tyypillisesti tämä saadaan aikaan lisäämällä 1-3 ml jääetikkaa tai 10-30 ml viinietikkaa tai rakuunaetikkaa.

Nämä kaksi nestettä emulgoitiin emulgointilaitteessa, kuten "Ultra-Turrax" (Janke & Kunkel KG), tyypillisesti 30 sekuntia , 15 jännitteellä 90 V ja sen jälkeen 30 sekuntia jännitteellä 140 • f V.

Kuten edellä on kuvattu, öljy-vesi-seokseen voidaan lisätä erilaisia väri- ja makuaineiden yhdistelmiä ennen tai jälkeen emulgoinnin erilaisten majoneesien valmistamiseksi erilaisiin 20 tarkoituksiin. Esimerkkejä erilaisina yhdistelminä käytetyis- Λ tä väri- ja makuaineista ovat rakuuna, suola, valkosipulijau- t he, sipulijauhe, basilika, sinappi, tahini, MSG, mustapippuri, paprika ja beta-karoteeni.

ESIMERKKI 2 » : 25 Esimerkissä 1(a) .kuvattu suspensioviljellyistä Pyrus-soluista , erittyneen kumituotteen valmistus on tehty suuremmassa mitta kaavassa 20 litran lasipullossa, joka sisälsi 15 litraa aikaisemmin kuvattua kasvualustaa. Kasvualusta siirrostettiin 2 litralla logaritmifaasin päärynäsolujen suspensioviljelmää ja 30 ilmastettiin pirskotuslaitteella, joka synnyttää hienokuplai-sen dispersion pullon pohjalle (ilmavirta 10 1 ilmaa/min).

10 104093

Kun inkubointia oli suoritettu 27°C:ssa 14 päivää, kumituote kerättiin ja käsiteltiin kuten esimerkissä 1(a) on kuvattu, jolloin saatiin valmistettua tuote, jolla oli samanlaiset ominaisuudet kuin esimerkissä 1 kuvatulla tuotteella.

5 Alan ammattimiehet havaitsevat, että tässä kuvatulle keksinnölle voidaan helposti tehdä muita muutoksia ja muunnoksia kuin ne, jotka tässä on spesifisesti kuvattu. On ymmärrettävä, että keksintö käsittää ne muutokset ja muunnokset, jotka kuuluvat keksinnön henkeen ja piiriin.

« « i 11 104093

VIITEJULKAISUT

1. Bacic, A., Moody, S.F., Clarke, A.E. (1986).

Plant: Physiology 80: 771-777.

2. Blumenkrantz, N. and Asboe-Hansen, G. (1973).

Anal.Biochem. 54 : 484-489.

3. Bradford, M. (1976). Anal .Biochem. 72 : 248-254.

4. Clarke, A.E., Anderson, R.L., and Stone, B.A.

(1979) Phytochemistry, 11 : 521-540.

5. Dubois, M., Gillies, K.A., Hamilton, J.K.,

Rebers, P.A., Smith, F. (1956). Anal. Chem. 23: 350-356.

;· 6. Fincher, Stone & Clarke (1983) Ann. Rev. Plant

Physiol., M: 47-70.

7. McNeil, M., Darvill* A.G., Fry, S.C., Albersheim, P. (1984). Ann. Rev. Biochem. 51: 625: 663.

8. Rees, D.A. (1972), BlPChem,J. 123 ' 257-273.

9. Sandford, P.A. and Baird, J. (1983). In “The Polysaccharides", Voi.2. Aspinall, G.O. (ed), Academic Press, N.Y* 10. , Van Holst, G.J. and Clarke, A.E. (1985). MaJL.

Biochem. 148 : 446-450.

m

Claims (5)

104093"

1. Menetelmä kasvikumituotteen valmistamiseksi,joka kasvikumituote käsittää glykoproteiinia ja monimut- 5 kaista hiilihydraattia, tunnettu siitä, että (a) viljellän kumia erittäviä, putkilokasvien kudok- T sista saatuja^kasvisoluja suspensioviljelmässä kasvu- 10 alustan läsnäollessa; ja (b) otetaan solujen erittämä glykoproteiinia ja monimutkaista hiilihydraattia sisältävä kasvikumituote talteen kasvualustasta. 15

2. Förfarandeenligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att växtcellerna erhällits frän päron, Pyrufe, 15 sött körsbär, Prunus avium e Her rosen, Rosa;

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasvisolut ovat peräisin lajeista päärynä, Pyrus, makea kirsikka, Prunus avion, tai ruusu, Rosa. 2q 3. Patenttivaatimuksen 1 tai patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ku-mitOote otetaan talteen selektiivisellä suodatuksella tai alkoholisadstuksella tai molemmilla. i 25 4.' Suspensiossa viljeltyjen, putkilokasvien kudok sista saatujen, kumia erittävien kasvisolujen erittämän, glykoproteiinia ja monimutkaista hiilihydraattia . sisältävän kasvikumituotteen käyttö emulgoivana . aineena, emulsiota stabiloivana aineena, paksunta-• 30' vana aiqeena, tai geeliyttävänä aineena, kapseloivana aineena, suspentoivana aineena, rakennetta muuntavana aineena, tai sideaineena tai pintaa muodostavana aineena ruoassa. f » f

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että käytetään päärynästä, Pyrus, makeasta kirsikasta, Prunus avion tai ruususta, Rosa peräisin olevia kasvisoluja. i 15 104093 r f 1. Förfarancie för framställning av en växtgummi- produkt som innehäller glykoproteir och komplicerad 5· kolhydrat, (<ännetecknat därav, att det om-fattar stegen att (a) odla gummi avsöndrande växtceller erhallna frän kärlväxters v.ävnader i suspensionodling i närvä ro av ett växtunderlag, och 10 (b) tillvarataga den av cellerna avsöridrade gummi- produkten som bestär av glykoprotein och komplicerad kolhydrat frän växtunder1 aget. ' K'

3. Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, k ä n -netecknat därav, att gummiprodukten tillvara-tagel genom selektiv filtrering eller utfällning med alkohql eller samtliga.

4. AOvändndng »v >i suspension odlade, frän kärlväx ters yävnader erhällna, gummiväxtcellernas avsöndrade, . . glykpprotein och komplicerad kolhydrat innehallande växtgummiprodukt som ett emulgerande medel, emulsion stabiliserande medel, tjockningsmedel, gelningsmede1, • 25 * kapslande medel, -suspense^ande medel, strukturom-vandl.are’’eller ett binde- elier ytbeläggningsmedel föfmaten. •

5. Användning enligt patentkravet 4, k ä n n e - t e c k n a d därav, att:man använder växtceller • 30 som kommer frän päron, Pyrus, sött körsbär, Prunus avium eller rosen, Rosa. >