JPH08504578A

JPH08504578A - ラクトバチルス・サケ類縁菌株、それらの菌体外多糖類の生産および使用

Info

Publication number: JPH08504578A
Application number: JP6512772A
Authority: JP
Inventors: バン・デン・ベルク，デイルク・ヨハネス・コルネリス; レデボア，アドリアヌス・マリヌス; ロビーン，ゲラルト・ウイレム; ブレーカー，ロベルト
Original assignee: クエスト・インターナシヨナル・ベー・ブイ
Priority date: 1992-12-02
Filing date: 1993-11-26
Publication date: 1996-05-21
Also published as: EP0690922A1; EP0690922B1; ZA938903B; ATE169060T1; DE69320067D1; AU5628794A; CA2150665A1; WO1994012656A1; AU691165B2; US5834043A; DE69320067T2; DK0690922T3

Abstract

(57)【要約】食肉製品から得られる新規なラクトバチルス・サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅ）類縁菌株が、提供されるが、その菌株は、低濃度においてさえ、せん断低下性をもち、および／または粘稠化および／またはエマルジョン安定化の性質をもつ、菌体外多糖を生産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】ラクトバチルス・サケ類縁菌株、それらの菌体外多糖類の生産および使用発明の背景マヨネーズ、ドレッシング、マーガリン、スプレッド、または低脂肪もしくは無脂肪代替品のような食品の大多数は、エマルジョン安定化剤もしくは粘稠化剤としての多糖類によって安定化することができる。また、薬物、医薬品および化粧品分野においても、多糖類は、エマルジョン安定化剤として使用される。周知の多糖類は、種々の植物種子、例えばシアモプシス・テトラゴナロバ（Ｃｙａｍｏｐｓｉｓｔｅｔｒａｇｏｎａｌｏｂａ）（グア、ｇｕａｒ）からのグアガム（ｇｕａｒｇｕｍ）、またはローカストビーン（ｌｏｃｕｓｔｂｅａｎ）からのローカストビーンガム（ＬＢＧ）から得られる。その他の周知の給源は、カラギーナン、アルギン酸もしくは寒天を産する海草類である。全てこれらの多糖類の一つの欠点は、需要が、常に成長しつつあるにもかかわらず、給源の供給および多糖類の定常的な入手可能が、不確かなことである。このことは、既に、ＬＢＧのような高度に機能的な多糖についての価格を、高く、また変動しやすいものにして来た。合理的な価格で生産物を製造するための選択として、欧州特許第0121960号（UNILEVER）に記載された方法は、比較的安価であるが比較的用途の狭い多糖グアガムを、明らかに改良されたガムに変換するために開発された。必要なグアα−ガラクトシダーゼの潜在的な商業生産については、WO-A-87/07641（UNILEVER）＝米国特許第5082778号に記載された。その他の欠点は、種子もしくは海草からの多糖類の単離方法が、比較的やっかいであることである。さらなる欠点は、ほとんどの多糖類が、強く求められるせん断低下性（ｓｈｅａｒ−ｔｈｉｎｎｉｎｇ）の非ニュートニアン性をもたないことであり、低濃度においてさえも、せん断力が高まるにつれて、粘度が可逆的に低下するという効果がない。求められるせん断低下の性質をもち、同時に生産と単離に関して信頼できる多糖は、細菌キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）によって、発酵を通じて生産される多糖、キサンタンガムである。したがって、キサンタンガムは、食物および薬物製品に、ますます使用され、将来最も高い潜在的成長力をもつことが期待される。しかしながら、生産する微生物キサントモナス・カンペストリスは、食品グレードではない。そのうえ、添加されたキサンタンガムを含む食料品は、しばしば、添加物含有として表示されねばならない。このことは、へルシーな“自然物（グリーン、ｇｒｅｅｎ）” または単に表示のない食料品に向かう今日の傾向の観点において不利である。したがって、キサンタンガムと同じか、またはそれ以上の優れた性質をもつ、食品グレードの微生物によって生産される多糖に対するニーズが存在する。そのような多糖は、食料品に添加され、その結果生まれる製品が、表示を義務づけられる（が、そこでその製品は、いわゆる“やさしく表示された（ｆｒｉｅｎｄｌｙｌａｂｅｌｌｅｄ）”添加物である）か、またはその微生物が食品グレードであるために、いかなる表示の必要もなしに、イン・サイチュー（ｉｎｓｉｔｕ）で生産され得るかのいずれかである。発明の概要本発明は、種々の食料品、例えば、オリーブ、伝統的チーズ、および発酵した生パンに存在する乳酸菌約６００菌株を包含する大きなスクリーニング計画の結果に基づいており、そのスクリーニング計画により、粘稠化および／またはエマルジョン安定化の性質をもつ菌体外多糖類生産菌３０菌株が単離された。しかしながら、食肉製品、特にベルギーのソーセージに存在すると思われる、これら３０株の乳酸菌類のある種のみが、（１）粘稠化および／または（２）エマルジョン安定化の性質をもつ、菌体外多糖類（ＥＰＳ）を生産し、および／または（３）特に低濃度において非常に望ましいせん断低下の性質さえも示す。その例として、ラクトバチルス・サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅ）類縁菌株として特定され、ラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ−１と名付けられた１株のラクトバチルス属菌株が単離された。上記の３つの異なる性質を合わせ持つこの菌株は、Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, The Netherlandsに、ブダペスト条約の規定に従って、寄託番号ＣＢＳ５３２．９２で寄託された。本発明は、粘度を増加する性質、またはせん断を低下する性質、またはその両性質のいずれかをもつ、該ラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ−１から得られるＥＰＳ、並びに同様のラクトバチルス・サケ類縁菌株から得られる菌体外多糖類に関する。ラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ−１から得られるＥＰＳは、単糖類ラムノースおよびグルコースの単位を含んでなる。また、本発明は、そのようなＥＰＳを生産することができるラクトバチルス・サケ類縁菌株にも関する。好適な菌株は、ＣＢＳ５３２．９２として寄託されたラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ−１である。さらに、本発明は、該ＥＰＳを生成する条件下の適切な培地において、（ａ）ＥＰＳを形成することができるラクトバチルス・サケ類縁菌株を増殖させること、そして任意に、（ｂ）形成されたＥＰＳを単離することを含む、そのようなＥＰＳの製造方法に関する。本発明のこの態様の１つの実施態様においては、そのような方法は、ＥＰＳもしくはＥＰＳ含有製品の製造に使用することができ、そのいずれもが、食料品のために、または薬物、医薬および化粧品への応用における添加物として使用され得る。その他の実施態様においては、その方法は、ラクトバチルス・サケ類縁菌株を、該ＥＰＳを生成する条件下の酪農液体培地において、培養が、該乳酸菌の比較的高い菌濃度をもつまで増殖させることを含む、ＥＰＳのイン・サイチュー（ｉｎｓｉｔｕ）での製造のために使用され得る。好ましくは、該方法によって得られた製品は、その後、激しいせん断処理にはかけられない。そのようなＥＰＳを含む培養物は、ドレッシング、マーガリン、マヨネーズ、およびスプレッド、およびそれらの低脂肪もしくは無脂肪代替品のような酪農原料を含む製品中に、好都合に組み込むことができる。図の簡単な説明図１においては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質パターン間のＰｅａｒｓｏｎＰｒｏｄｕｃｔＭｏｍｅｎｔ相関係数（ｒｘ１００）のＵＰＧＭＡ（ＵｎｗｅｉｇｈｔｅｄＰａｉｒＧｒｏｕｐＭｅｔｈｏｄｕｓｉｎｇＡｖｅｒａｇｅｌｉｎｋａｇｅ）樹状図が示される。“ＬＡＢ”−数により指定された菌株は、the closed“Lactic Acid Bacteria”culture collection of the Univer sity of Ghentに、保存される。“ＬＭＧ”−数により指定された菌株は、the“ Laboratorium voor Microbiologie，Gent”culture collectionsに属する。この研究で使用された対照菌株は、ＥＰＳ生産菌株として樹状図に示される。菌株“ ＬＡＢ２８”（Ｏ−１）は、寄託番号ＣＢＳ５３２．９２をもつラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ−１を指す。図２においては、ラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ−１からのＥＰＳおよびキサンタンガムの両方の１％（ｗｔ／ｖｏｌ）水溶液の、せん断速度対粘度およびせん断速度対せん断応力が、プロットされる。 −△−△− せん断応力１％Ｏ−１ＥＰＳ −□−□− 粘度１％Ｏ−１ＥＰＳ −◇−◇− せん断応力１％キサンタン −＊−＊− 粘度１％キサンタン図３においては、本発明による好適なＥＰＳの構造が提供される。本発明の詳細な説明１つの態様においては、本発明は、食肉製品、例えばベルギーのソーセージから単離されたラクトバチルス・サケ類縁菌株によって生産され得る多糖に関する。したがって、本発明は、食品グレードのラクトバチルス・サケ類縁菌株から得られる多糖を提供する。１つの優先権は、単糖類ラムノースおよびグルコースの単位を、より好ましくは約１：４〜約１：１の比で、最も好ましくは３：７〜１：１の比で含む多糖についてある。ラクトバチルス・サケから得られるＥＰＳは、一般に、アセチルおよびホスホグリセロール側基を含む。ＥＰＳは、部分的にＯ−アセチル化されると信じられ、それによるアシル化のレベルは、ラムノース単位当たり０．４０〜０．４５、例えばラムノース単位当たり０．４２５である。リン酸エステル化のレベルは、ラムノース単位当たり０．４５を超えており、例えばラムノース単位当たり０．５０であると信じられる。図３は、ラクトバチルス・サケＯ−１から得られたＥＰＳのＮＭＲ技術によって得られるような最も可能性のある構造を示す。ＥＰＳは、３グルコース単位および２ラムノース単位をもつ五糖単位の繰り返しからなり、それによるラムノース単位の１つは、１−ホスホグリセロール置換基をもち、他のラムノース単位は、平均で約０．８５のＯ−アセチル基を含む。本発明のある実施態様のために、置換基の数を減少することが、有用なこともある。これは、慣用の化学的技術によって成就され得るが、例えばＥＰＳは、弱いアルカリ処理、例えばアンモニアによってＯ−脱アシル化されてもよい。また、ＥＰＳは、さらにＯ−脱アセチル化および脱リン酸エステル化のために、強いアルカリ処理（ＮａＯＨ）にかけられてもよい。側基の除去は、ＥＰＳのレオロジー性質に影響するであろうと信じられる。その他の優先権は、本発明による多糖は、ＨａａｋｅＲｏｔｏｖｉｓｃｏＲｖ１００粘度計を用いて、水中２ｇ／ｌ（＝０．２％ｗｔ）の濃度およびせん断速度３００ｓ^-1で測定される場合には、粘度少なくとも１０ｍＰａ．ｓを、または水中１０ｇ／ｌ（＝１％ｗｔ）の濃度およびせん断速度３ｓ^-1で測定される場合には、粘度少なくとも１０００Ｍｐａ．ｓを与える。特に好適なものは、せん断速度０．０１ｓ^-1および水中１ｗｔ％の濃度で、１００Ｐａ．ｓを超える粘度である。本発明のＥＰＳの他の好適なレオロジー特性はｐ値０．７〜０．９であり、この場合、粘度（Ｐａ．ｓ）≒（せん断速度（ｓ^-1）^-p。他の特性は、次の通りである：０．０１ｓ^-1における１ｗｔ％溶液の粘度は、相対的にＴ−非依存であり（範囲４〜２０℃において変動５０％未満）、ｐＨ非依存であり（ｐＨ範囲４〜６において変動１０％未満）、そして塩の存在には、相対的に非依存である。さらに、もし本発明のＥＰＳが、グアガムもしくはＬＢＧと合わされる場合には、粘度における相乗的増加が観察されることが分かっていた。また、本発明のＥＰＳは、ゲル化剤よりむしろ粘稠化剤として働く傾向がある。この違いは、剛性率測定によって示すことができる。本発明による多糖のその他の好適な特色は、粘度が、せん断速度の増加につれて可逆的に低下するというせん断低下の性質を、多糖がもつことである。最も好適な多糖は、ＣＢＳ５３２．９２として寄託されたラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ−１から得られるものである。この後者の多糖は、次の性質を有する：外観：無味、無臭の白色粉末；溶解性：水に易溶、メタノール、エタノールおよびアセトンに難溶；組成：６０〜６５％グルコース単位および３５〜４０％ラムノース単位；粘度：ラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ−１からのＥＰＳ、および対照としてのキサンタンの両方について、水溶液中で測定粘度（ｍＰａ．ｓ）濃度せん断速度Ｏ−１ＥＰＳキサンタン０．２％ｗｔ．３００ｓ^-1 １８１４１．０％ｗｔ．３ｓ^-1 ２４４０１２４０その他の態様においては、本発明は、本発明による多糖を製造する方法を提供するが、その方法は、（ａ）該ＥＰＳを生成する条件下の適切な培地において、ＥＰＳを形成することができるラクトバチルス・サケ類縁菌株を増殖させること、そして任意に、（ｂ）形成されたＥＰＳを単離することを含む。適切な培地は、グルコースもしくはその他の発酵性炭水化物のような炭素源、少なくとも１種の窒素源、リン酸源、例えば高いバッファー力をもつような濃度におけるＮａ₂ ＨＰＯ₄およびＫＨ₂ＰＯ₄の混合物、ビタミン、無機成分（特にＭｎ²⁺）、アミノ酸およびペプチド混合物からなるいわゆる半合成培地（ＳＤＭ）であると思われる。２種のＳＤＭが、実施例１および６において示される。当業者には明らかなように、実験室試行のためのこれらのＳＤＭは、商業的に大規模にＥＰＳを生産する場合に、適応されることが必要である。菌株は、一般に、１５℃〜４０℃ で、２４〜４８時間、ＥＰＳの最適な生産には通気なしに増殖される。ＥＰＳは、発酵ブロスから、すべての適切な技術、例えばＥＰＳが、溶解しないか、限られた溶解度をもつ有機溶媒を用いる沈殿方法によって、単離することができる。その他の可能性は、例えば、しばしば商業的規模におけるキサンタンガムの製造で行われているような蒸発によるか、または膜濾過よる水の除去である。このように単離された多糖は、食料品に対する添加物と同じように適用され得る。しかしながら、簡便な容易な取り扱いのために、時には多糖を担体材料に適用することが好適である。これは、どんな適切な技術によっても成し遂げられる。タンパク質担体、例えば、乳清タンパク質もしくは大豆タンパク質の使用が、特に好適であるが、いかなる食用の担体材料が、使用されてもよい。多糖は、実施例においてさらに示されるであろう当業者には普通の方法を用いて、ドレッシング、マヨネーズ、スプレッド、それらの低脂肪および無脂肪等価品、クリーム、ソース、食肉（製品）チーズ、プリン、アイスクリームおよびパン製品の製造において、“やさしく”表示された添加物として適用され得る。多糖のレベルは、一般には、０．０１〜１５ｗｔ％、より好適には０．１〜１０ｗｔ％、最も好適には０．５〜５ｗｔ％であろう。これらの応用（例えばチーズ）のあるものに対しては、製品は、原料を混合後は、望ましくないせん断低下を避けるために、比較的静かな条件下、例えば穏やかな撹拌か無撹拌で作製される。かくして、また、本発明は、粘稠化された水相を含む食品を製造する方法を提供するが、その方法は、該食品中に、本発明による多糖の効果的な量を組み込むことを含む。添加物を含むとして、食品に表示することを必要としない本発明のこの態様のその他の実施態様は、ＥＰＳが、スターター培養のための商業的に受け入れられる培地の発酵の間に、ラクトバチルス・サケ類縁菌株によって形成され、その後、水が、慣用の技術、例えば蒸発、膜濾過、もしくは噴霧乾燥によって除去される方法である。また、多糖が、食品グレードの微生物によって、元の位置で生産される場合には、表示は要求されない。例としては、マヨネーズタイプの製品の製造法であり、その方法では、乳もしくは乳ベースの培地、例えばＨｙｓｏｙ（Quest Biopro ducts, U.S.A.）およびＭｎＳＯ₄を含む滅菌されたスキムミルクが、十分なＥＰＳを生産する十分多量の乳酸菌が、形成されるまで、ラクトバチルス・サケ類縁菌株を用いて、３０℃で１８時間発酵される。続いて、発酵された乳製品は、通常の原料、例えば塩、糖、酸、フレーバー成分および澱粉を含む水相、および別に作製されたマヨネーズのプレエマルジョン相の両方と、注意深く混合される。したがって、本発明は、また、食用の培地、例えば酪農液体培地において、該ＥＰＳが形成される条件下で、該乳酸菌数が、１０⁷〜１０¹¹／ｍｌ、好ましくは１０⁹〜１０¹⁰／ｍｌのオーダーになるまで、ラクトバチルス・サケ類縁菌株を増殖させることを含む、本発明による多糖の元の位置での（ｉｎｓｉｔｕ）生産方法を提供する。好ましくは、該方法によって得られる製品は、その後、激しいせん断処理にはかけられない。本発明のこの態様のその他の実施態様は、ドレッシング、マーガリン、マヨネーズ、およびスプレッド、およびそれらの低脂肪もしくは無脂肪代替品のような酪農原料を含む製品を製造する方法であり、その方法は、本発明による多糖を、元の位置で生産する方法によって得られる液体酪農培地を、該製品中に組み込むことを包含する。酪農原料は、該製品の全水相もしくは水相の少なくとも一部を形成することができる。さらに、本発明は、次の実施例によって例証されるが、これは、本発明の範囲を限定しない。次の実施例のパーセンテージは、別に述べる以外は、ｗｔ．として表される。実施例１ソーセージ中に存在する菌体外多糖を生産する乳酸菌の検索ポルトガルのＡｌｅｎｔｅｉｊｏ地域製の５種の異なる自家製の、伝統的に発酵されたｃｈｏｕｒｉｃｏソーセージ、およびベルギーのＲｅｃｏｇｎｅ製の伝統的に発酵されたサラミソーセージから、ソーセージ１０ｇを、ｓｔｏｍａｃｈｅｒｍｏｄｅｌＢＡ６０２１（Seward Laboratory）を用いて０．８５％ＮａＣｌ溶液９０ｍｌ中に懸濁した。これらの懸濁液は、０．８５％ＮａＣｌ中に、１０^-2，１０^-4および１０^-6倍に希釈され、それぞれの希釈液０．１ｍｌを、酵母もしくはかびの生育を阻止するために、培地１００ｍｌ当たりｐｉｍａｆｕｃｉｎｅ（Duchefa）２０ｍｇを含むＭＲＳ寒天上に塗布した。その平板を、３０℃で４８時間、嫌気的に培養した。全体で、乳酸菌１５９菌株を単離した。全ての菌株を、次のようにＥＰＳ生産について選択した。個々の菌株を、ＭＲＳブロスで３０℃一夜増殖させた。９％スキムミルク粉末（Frico Domo）、０．３５％酵母エキス（Difco）、０．３５％Ｂａｃｔｏペプトン（Difco）および１％グルコースからなる“ＥＰＳ選択培地”（ＥＳＭ）に、この一夜培養液の１％（ｖ／ｖ）を接種した。３０℃で２４時間培養後、ミルク・カードについて、“ねばねば糸を引く（ｒｏｐｉｎｅｓｓ）”か、チェックした。この後、ミルク・カード１ｍｌを、１ｍｌ定量ピペットに採取した。ピペットを再び空にし、ピペットの先端から落ちる液滴が、ねばねばの挙動を示す場合に、これを、ＥＳＭでのＥＰＳ生産と見なした。この方法によって、単離された乳酸菌１５９株中４株を、ＥＰＳ生産株と判定した。これらの４菌株は、すべてベルギーのサラミから単離されたが、一方、ＥＰＳ生産株は、試験されたポルトガルのソーセージからは単離できなかった。一夜増殖培養液（ＭＲＳブロスで）の１％（ｖ／ｖ）接種によって、３０℃２４時間培養された半合成培地（ＳＤＭ−１）（Ｋ₂ＨＰＯ₄２．５ｇ，ＫＨ₂ＰＯ₄ ３．０ｇ，クエン酸（ＮＨ₄）₂０．６ｇ、酢酸Ｎａ１．０ｇ、カザミノ酸（Difc o）５．０ｇ、酵母窒素ベース（Difco）６．７ｇおよび炭素源として２％グルコースを含む）において生産された粘度を、ＨａａｋｅＲｏｔｏｖｉｓｃｏＲＶ１００；システムＣＶ１００（センサーシステムＺＡ−３０）を用いて、せん断速度３００ｓ^-1において測定した。ベルギーのサラミから単離された４菌株の粘度は、大体同じであり、１．９〜２．２ｍＰａ．ｓの範囲であることが分かった。典型的な菌株として、上記条件下で増殖させた場合に生産された、最高の粘度を示す１株を選択した。この菌株を、ラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ−１と名付けた。本明細書中では、また、省略形“菌株Ｏ−１”および“Ｏ−１”も用いた。実施例２菌体外多糖を生産するラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ−１の生理学的および分類学的解析供試菌株Ｏ−１は、グラム陽性、カタラーゼ陰性、運動性なし、であり、ＭＲＳブロスで増殖した場合、細胞１〜５個の短い鎖状で存在する桿状細菌である。この菌株は、次の糖質を発酵することができた（ＡＰＩ５０ＣＨＬを用いて決定）：Ｌ−アラビノース、リボース、ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、エスクリン、サリシン、セロビオース、ラクトースおよびサッカロース。実施例１で述べた種々の発酵ソーセージから単離された乳酸菌の分類学的同定は、タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて実施された。菌株を、ルーフラスコ中のＭＲＳ寒天で、３０℃２４時間増殖させた。ルーフラスコには、２４時間増殖ＭＲＳブロスから植菌した。総細胞抽出物は、既に述べられているように調製された（Kiredjan, 1986）。細胞を、ニードルプローブチップ（長さ１２７ｍｍ，直径４ｍｍ）を備えたＬａｂｓｏｎｉｃ２０００音波処理機（ B.Braun, Melsungen, Germany）を用いる音波処理によって、出力５０Ｗの位置 “ＬＯＷ”で３分間溶菌する。ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、Kiredjan（1986）による記載のように改変されたLaemmliの方法を用いて実施された。タンパク質電気泳動パターンの記録、デンシトメータートレースの標準化、Ｐｅａｒｓｏｎｐｒｏｄｕｃｔｍｏｍｅｎｔ相関係数（ｒ）による菌株のグループ分け、およびＵＰＧＭＡ（ＵｎｗｅｉｇｈｔｅｄＰａｉｒＧｒｏｕｐＭｅｔｈｏｄｕｓｉｎｇＡｖｅｒａｇｅｌｉｎｋａｇｅ）クラスター解析は、ソフトウエアーパッケージＧＥＬＣＯＭＰＡＲ（バージョン２．０；L. Vauterin & P. Vauterin, Applied Maths, Risguons-Toutstraat 38 , B-8511 Kortrijk, Belgiumにおいて市販）を用いて、Pot（1992）により記載の技術によって実施された。この方法は、実施例１記載の伝統的に発酵されたベルギーのサラミから単離された３２菌株の同定に対して使用された。これらの３２菌株の４株が、ＥＰＳを生産でき、その１株は、先に示した菌株Ｏ−１であった。これらの３２菌株の同定のために、タンパク質パターンを、データベース中に保存された乳酸菌６００の対照菌株のタンパク質パターンと比較した。図１において、菌株の全てのペアーの間で計算された平均相関係数（ｒ）のＵＰＧＭＡ樹状図を示した。ベルギーのサラミから得た菌株が、ラクトバチルス・サケ対照菌株とは離れた分類学的位置を占めることを、明らかに示している供試菌株および緊密に関係した対照菌株の両方が提示される。しかしながら、ラクトバチルス・サケとして表現型で同定されたが、異常なタンパク質パターンを示した３対照菌株は、ベルギーのサラミから単離された菌株と密接に関係があった。これらの対照菌株は、“ラクトバチルス・サケ類似”として知られ、それゆえ、ベルギーのサラミから単離された菌株は、また“ラクトバチルス・サケ類似”であると考えられた。実施例３ラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ−１により生産される菌体外多糖の単離および精製菌株Ｏ−１の単一コロニーを、ＭＲＳ寒天プレートから選択し、新鮮なＭＲＳブロスに移植し、３０℃で一夜培養した。新たに調製された半合成培地（ＳＤＭ −１）、実施例１記載に、一夜増殖された菌株Ｏ−１培養液２．５％（ｖ／ｖ）を植菌した。この植菌されたＳＤＭ−１を、３０℃２４時間、無通気で培養した。培養ブロスからのタンパク質の除去のために、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を、濃度４％になるまで添加した。弱い撹拌後、その培養液を、室温で３０分間放置した。その培養液を、２７０００ｇで３０分間遠心し、透明な上澄液を回収した。生産されたＥＰＳを、冷エタノール２．５倍容により沈殿させた。その沈殿を集め、最初の容量の約５％（ｖ／ｖ）の水に再溶解し、脱塩水に対して４℃で２日間透析した。水を、１日に２回更新した。透析後、分画アセトン沈殿を実施した。溶解ＥＰＳの大部分は、５０％（ｖ／ｖ）アセトン画分において沈殿した。この画分は、ＥＰＳの全量の約８０ｗｔ．％を含み、９９ｗｔ．％純粋、すなわち、混入物１ｗｔ．％以下であった。ほぼ１００ｗｔ．％純粋なＥＰＳが、要求される場合には、その材料を、さらに、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−５００（Pharmaci a）のカラムにおけるゲル濾過によって精製することができる。この実施例の沈殿を、脱塩水に再溶解し、凍結乾燥した。その原料は、４℃で乾燥条件下で保存された。実施例４ラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ−１により生産される菌体外多糖の組成分析菌株Ｏ−１によって生産されたＥＰＳの糖組成を決定した。ＥＰＳのメタノリシス、続いて、Ｎ−（リ）アセチル化およびトリメチルシリル化の後、種々のタイプの単糖のメチルグリコシドを、ＧＣ−ＭＳによって決定した。ＥＰＳは、６０〜７０ｗｔ．％グルコースおよび３０〜４０ｗｔ．％ラムノースからなった。実施例５ラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ−１により生産される菌体外多糖およびキサントモナス・カンペストリスにより生産されるキサンタンガムの両方のレオロジー挙動菌株Ｏ−１により生産されるＥＰＳの１％水溶液の粘度を、せん断速度の関数として決定した。全てのレオロジー的測定は、ＨａａｋｅＲｏｔｏｖｉｓｃｏＲＶ１００；システムＣＶ１００；センサーシステムＺＡ−３０を用いて、２５℃で実施した。図２において、粘度プロフィルは、キサンタンガム（Kelc o）の１％水溶液のそれと比較された。図２において、キサンタンガムの有用なせん断低下性は、Ｏ−１ＥＰＳにおいてまた存在することが明らかに示される。せん断速度３ｓ^-1での詳細な測定は、Ｏ−１ＥＰＳの１％水溶液の粘度が、２４４０ｍＰａ．ｓであることを示し、一方キサンタンガムの１％水溶液の粘度は、１２４０ｍＰａ．ｓであった。Ｏ−１ＥＰＳおよびキサンタンガムの１％水溶液のせん断速度３００ｓ^-1において測定された粘度は、それぞれ７０および５４ｍＰａ．ｓとして測定され、一方Ｏ−１ＥＰＳおよびキサンタンガムの０．２％水溶液のせん断速度３００ｓ^-1において測定された粘度は、それぞれ１８および１４ｍＰａ．ｓとして測定された。実施例６菌体外多糖を生産するラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ−１の増殖の最適化菌株Ｏ−１によるＥＰＳの生産の生理学を研究するためには、合成増殖培地が望まれた。ＭＲＳは、栄養豊富な非特異的培地（酵母エキス、肉エキス等を含有）であり、実施例１で使用された培地は、乏しい増殖結果（６１０ｎｍでの光学密度は、約１．２であった）を示したので、新しい半合成培地（ＳＤＭ−２）が開発された。１リットルのＳＤＭ−２について、次の成分が、秤取された：Ｋ₂ ＨＰＯ₄１０．０ｇ，ＮａＨ₂ＰＯ₄１２．４ｇ，クエン酸（ＮＨ₄）₂０．６ｇ、ＭｎＳＯ₄０．０５ｇ、カザミノ酸（Difco）５．０ｇ、Ｂａｃｔｏプロテオ−スペプトン（Difco）１０．０ｇ、酵母窒素ベース（Difco）６．７ｇおよびグルコース２０ｇ。培地の最終ｐＨは、６．５であった。このＳＤＭ−２において、無振盪のエルレンマイヤーフラスコにおいてｐＨコントロールなしに、菌株Ｏ−１を３５℃で培養した後、そのＯＤ₆₁₀は５．０であったが、一方ＭＲＳでの増殖は、ＯＤ₆₁₀で３．５〜４．０であった。ＳＤＭ−２における２０℃４８時間の嫌気的培養の結果は、ＯＤ₆₁₀で６．５であったが、一方培養ブロスの粘度は、ＳＤＭ−１における増殖の場合の最高値２．２（実施例１参照）と比較して３．８ｍＰａ．ｓであった。ブロス中のＥＰＳの濃度は、ＳＤＭ−１における増殖の場合の値３０ｍｇ／ｌと比較して９０ｍｇ／ｌであった。実施例７乳ベースの培地におけるラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ−１の菌体外多糖のｉｎｓｉｔｕ生産粉乳３００ｇおよびＨｙｓｏｙ（Quest Bioproducts, USA）３０ｇを、水に溶解し、最終容量３ｌとした。それを、９０℃１分間保持して殺菌した。続いて、０．３ｍＭＭｎＳＯ₄を添加し、約３０℃に冷却後、乳培地に、同培地で増殖されたラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ−１の一夜培養液を１％（ｖ／ｖ）接種した。培養を、３０℃で１８時間行った後、高い粘稠な発酵乳を得、それを、次の実施例に示すように、低脂肪ドレッシングの製造に使用した。実施例８ラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ−１のｉｎｓｉｔｕ生産された菌体外多糖に基づくドレッシングの作製プレ・エマルジョン相を、等量のビネガー、および水、卵黄、食用オイルおよびβ−カロチンの混合物とを、低いせん断力で混合して作製した。このプレ・エマルジョン相を、ソルビン酸、糖、塩、ビネガー、クエン酸および即席澱粉を含む水相と混合し、続いて、その混合物を、高いせん断においてホモジナイズした。混合物の正確な組成は、最終産物に必要な性質に依存する。このエマルジョンに、前記実施例に記載した調製物、粘稠な発酵乳を、最終濃度１０〜２０％（ｖ／ｖ）で添加した。その混合物を、低せん断下で注意深くホモジナイズした。優れたボディーおよび風味をもつドレッシングを得た。実施例９スプレッドは、上記の菌体外多糖２ｗｔ％（製品において）を含む水相を作製し、その水相６０部と、バター脂肪およびモノグリセリド１％（製品において）ゐ含む脂肪相４０部とを混合することによって、得ることができる。実施例１０ＥＰＳの改良生産次の培地を使用した。Ｎａ₂ＨＰＯ₄ １０ｇ／ｌＫＨ₂ＰＯ₄ １２ｇ／ｌ（ＮＨ₄）₂−クエン酸０．６ｇ／ｌＭｎＳＯ₄ ０．０５ｇ／ｌＮｚ−ＣａｓｅＰｌｕｓ（exQuest）２０ｇ／ｌグルコース２０ｇ／ｌ酵母窒素源（ex Difio）６．７ｇ／ｌｐＨ（NaOH）５．８水一定濃度までラクトバチルス・サケＯ−１を、この培地において、ｐＨ５．８に保ちつつ２０℃で約３６時間、嫌気的に増殖させた。これらの条件下で、ＥＰＳ１３５０ｍｇ／ｌが生産された。ＥＰＳの構造は、ＮＭＲによって決定し、図３に示した通りである（比率グルコース：ラムノース３：２、ラムノース単位当たりＯ− アセチル基０．４２５、ラムノース単位当たり１−ホスホグリセロール０．５）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１１月１７日【補正内容】請求の範囲１．食品グレードの微生物から得られる食品グレードの菌体外多糖であって、ラムノースとグルコースを、比率約１：４〜１：１において含み、そして粘度が、せん断速度を増加するにつれて可逆的に低下される、せん断低下の性質をもつ菌体外多糖。２．ラムノースとグルコースを、比率約３：７〜１：１において含む、請求の範囲１記載の食品グレードの菌体外多糖。３．３個のグルコースおよび２個のラムノースをもつ五糖の繰り返し単位を含む、請求の範囲１または２記載の食品グレードの菌体外多糖。４．６０〜６５％グルコースおよび３５〜４０％ラムノースをもつ、前記請求の範囲のいずれかに記載の食品グレードの菌体外多糖。５．さらに、粘稠化の性質をもつ、前記請求の範囲のいずれかに記載の食品グレードの菌体外多糖。６．さらに、エマルジョン安定化の性質をもつ、前記請求の範囲のいずれかに記載の食品グレードの菌体外多糖。７．例えば、ラムノース単位において部分的にＯ−アセチル化され、そしてラムノース単位において部分的にリン酸エステル化される、アセチルおよびホスホグリセロール側鎖基を含む、前記請求の範囲のいずれかに記載の食品グレードの菌体外多糖。８．ラムノースが、１−ホスホグリセロール置換基によりリン酸エステル化される、前記請求の範囲のいずれかに記載の食品グレードの菌体外多糖。９．ＨａａｋｅＲｏｔｏｖｉｓｃｏＲｖ１００粘度計を用いて、水中０．２％ｗｔの濃度、せん断速度３００ｓ^-1において測定される場合には、粘度少なくとも１０ｍＰａ．ｓを、そして／または水中１％ｗｔの濃度、せん断速度３ｓ^-1において測定される場合には、粘度少なくとも１０００ｍＰａ．ｓを、または水中１ｗｔ％の濃度、せん断速度０．０１ｓ^-1において測定される場合には、粘度少なくとも１００Ｐａ．ｓをもつ、前記請求の範囲のいずれかに記載の食品グレードの菌体外多糖。１０．ラクトバチルス・サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅ）類縁菌株から得られる、前記請求の範囲のいずれかに記載の食品グレードの菌体外多糖。１１．オランダ国、セントラールビュローシメルカルチャーインバーン（C entraal Bureau voor Schimmelcultures in Baarn, the Netherlands）に、寄託番号ＣＢＳ５３２．９２の下に寄託されたラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ−１から得られる、前記請求の範囲のいずれかに記載の食品グレードの菌体外多糖。１２．前記請求の範囲のいずれかに記載の菌体外多糖を生産することができるラクトバチルス・サケ類縁菌株。１３．該菌株が、オランダ国、セントラールビュローシメルカルチャーインバーン（Centraal Bureau voor Schimmelcultures in Baarn,the Netherlands ）に、寄託番号ＣＢＳ５３２．９２の下に寄託される、請求の範囲１２記載のラクトバチルス・サケ類縁菌株。１４．菌体外多糖が形成される条件下の適切な培地において、ラクトバチルス・サケ類縁菌株を増殖させ、そして任意に、形成された菌体外多糖を単離することを含む、請求の範囲１〜１２記載の一つの菌体外多糖を生産する方法。１５．該ＥＰＳが形成される条件下の酪農液体のような食用培地において、該乳酸菌数が、１０⁷〜１０¹¹／ｍｌのオーダーになるまで、請求の範囲１４記載のラクトバチルス・サケ類縁菌株を増殖させることを含む、請求の範囲１〜１２のいずれかに記載の菌体外多糖をイン・サイチューで（ｉｎｓｉｔｕ）製造する方法。１６．当業者に周知の方法を用いる、ドレッシング、マヨネーズ、スプレッド、およびそれらの低脂肪および無脂肪等価物、クリーム、ソース、食肉製品、チーズ、プリン、アイスクリームおよびパン製品の製造に際して、請求の範囲１〜１２のいずれかに記載の菌体外多糖の適用。１７．多糖のレベルが、０．０１〜１５ｗｔ％である、請求の範囲１６記載の適用。１８．粘稠化された水相を含む食品を製造する方法であって、該食品中に、請求の範囲１〜１２のいずれかに記載の多糖の効果的な量を組み込むことを含んでなる方法。１９．乳もしくは乳ベースの培地を、十分なＥＰＳを生産する十分多量の乳酸菌が形成されるまで、請求の範囲１３記載のラクトバチルス・サケ類縁菌株を用いて、３０℃で１８時間発酵させ、続いて、発酵された乳製品を、通常の原料を含む水相、および別に作製されたマヨネーズのプレエマルジョン相と、注意深く混合する、マヨネーズタイプ製品の製造方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:225） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者ロビーン，ゲラルト・ウイレムオランダ・3551エスエルユトレヒト・デイルキエマリアストラート16 (72)発明者ブレーカー，ロベルトオランダ・3248ビーエヌメリサント・ラテラール20

Claims

【特許請求の範囲】１．ラクトバチルス・サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅ）類縁菌株、好ましくは、ＣＢＳ５３２．９２として寄託されたラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ−１から得ることができる多糖。２．単糖類ラムノースとグルコースの各単位を、比率約１：４〜約１：１において含む、多糖。３．ＨａａｋｅＲｏｔｏｖｉｓｃｏＲｖ１００粘度計を用いて、水中０．２％ｗｔの濃度、せん断速度３００ｓ^-1において測定される場合には、粘度少なくとも１０ｍＰａ．ｓを、そして／または水中１％ｗｔの濃度、せん断速度３ｓ^-1において測定される場合には、粘度少なくとも１０００ｍＰａ．ｓを、または水中１ｗｔ％の濃度、せん断速度０．０１ｓ^-1において測定される場合には、粘度少なくとも１００Ｐａ．ｓをもつ、請求の範囲１または２記載の多糖。４．粘度が、せん断速度を増加するにつれて可逆的に低下される、せん断低下の性質をもつ、請求の範囲１記載の多糖。５．（ａ）菌体外多糖（ＥＰＳ）が形成される条件下の適切な培地において、該ＥＰＳを形成することができるラクトバチルス・サケ類縁菌株を増殖させること、そして任意に、（ｂ）形成されたＥＰＳを単離することを含む、請求の範囲１〜４のいずれか１つにおいて請求されるような多糖の製造方法。６．該ＥＰＳが形成される条件下の食用培地において、該乳酸菌数が、１０⁷ 〜１０¹¹／ｍｌ、好ましくは１０⁹〜１０¹⁰／ｍｌのオーダーになるまで、ラクトバチルス・サケ類縁菌株を増殖させることを含む、請求の範囲１〜４のいずれか１つにおいて請求されるような多糖をイン・サイチューで（ｉｎｓｉｔｕ）製造する方法。７．次に示す性質：（１）単糖類ラムノースとグルコースの各単位を、比率約１：４〜約１：１において含み、（２）ＨａａｋｅＲｏｔｏｖｉｓｃｏＲｖ１００粘度計を用いて、水中０．２％ｗｔの濃度、せん断速度３００ｓ^-1において測定される場合には、粘度少なくとも１０ｍＰａ．ｓを、または水中１％ｗｔの濃度、せん断速度３ｓ^-1において測定される場合には、粘度少なくとも１０００ｍＰａ．ｓを、または水中１ｗｔ％の濃度、せん断速度０．０１ｓ^-1において測定される場合には、粘度少なくとも１００Ｐａ．ｓを示し、そして（３）粘度が、より高いせん断速度を適用するにつれて可逆的に低下される、せん断低下の性質をもつ、の少なくとも１つを有するＥＰＳを生産できるラクトバチルス・サケ類縁菌株。８．ＣＢＳ５３２．９２として寄託されたラクトバチルス・サケ類縁菌株Ｏ −１。９．請求の範囲１〜４の１つまたはそれ以上に記載の多糖０．０１〜１５ｗｔ％を含む食品。１０．スプレッド、ドレッシング、クリーム、ソース、食肉（製品）、チーズ、プリン、アイスクリームおよびパン製品の群から選ばれる請求の範囲９記載の食品。