ES3047748T3

ES3047748T3 - Using alternating electric fields to increase cell membrane permeability

Info

Publication number: ES3047748T3
Application number: ES21175489T
Authority: ES
Inventors: Edwin Chang; Chirag B Patel; Sanjiv S Gambhir; Tali VOLOSHIN-SELA; Yaara Porat; Moshe Giladi
Original assignee: Novocure GmbH; Leland Stanford Junior University
Current assignee: Novocure GmbH; Leland Stanford Junior University
Priority date: 2018-07-03
Filing date: 2019-07-03
Publication date: 2025-12-04
Anticipated expiration: 2039-07-03
Also published as: US20200009376A1; EP3773877C0; AU2019299533A1; CN116159242A; EP3900775B1; EP3895758B1; JP7581418B2; CA3254131A1; EP3773877A1; JP2021090424A; EP3838333A1; KR20210032406A; EP3900775A1; IL279465B1; EP4603135A2; US20200254242A1; CA3254134A1; HUE073519T2; ES2934978T3; CA3100859C

Abstract

Ciertas sustancias (p. ej., moléculas grandes) que normalmente no pueden atravesar la membrana celular de las células se pueden introducir en ellas mediante la aplicación de un campo eléctrico alterno a la célula durante un período de tiempo, en el que la frecuencia del campo eléctrico alterno se selecciona de modo que la aplicación del campo eléctrico alterno aumente la permeabilidad de la membrana celular. Una vez que se ha aumentado la permeabilidad de la membrana celular, la sustancia puede atravesar la membrana celular. Este enfoque es particularmente útil en el contexto de las células cancerosas (p. ej., glioblastoma). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Uso de campos eléctricos alternos para aumentar la permeabilidad de la membrana celular

[0005] Antecedentes

[0007] El tratamiento de glioblastoma (GBM) mediante campos eléctricos alternos es una terapia novedosa y validada que se ha convertido en una modalidad adicional (después de la quimiorradiación y la quimioterapia quirúrgicas) para los tratamientos contra el cáncer. Se han estudiado en detalle campos eléctricos alternos de frecuencia intermedia (100-500 kHz). Más recientemente, se ha demostrado que los TTFields prolonga la supervivencia media (en 5 meses) de los pacientes con glioblastoma que reciben quimioterapia de mantenimiento con temozolomida. En el contexto del tratamiento de tumores, los campos eléctricos alternos a estas frecuencias suelen denominarse "campos de tratamiento de tumores" o "TTFields".

[0009] Existen muchas hipótesis sobre el mecanismo de los TTFields, pero el mecanismo de acción contra el cáncer de los TTFields más ampliamente propuesto (“estándar”) se centra en la propiedad de que las subunidades de tubulina tienen momentos dipolares intrínsecos. Al forzar las estructuras de los microtúbulos a alinearse a lo largo de líneas de campo eléctrico alternas a través de la imposición exógena de TTFields de 200 kHz, se altera la funcionalidad de las células que se dividen activamente a través de la interferencia con el citoesqueleto que sostiene los husos mitóticos. Este estrés, en última instancia, promueve una proliferación celular deteriorada. En los últimos diez años se han producido experimentos de prueba de concepto y desarrollos tecnológicos relevantes que culminaron con la aprobación por parte de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de un dispositivo comercial y clínico TTFields (Optune®, Novocure Ltd.) para el tratamiento del glioblastoma recurrente y recién diagnosticado.

[0010] En los últimos años se han publicado detalles adicionales sobre los mecanismos de acción. Por ejemplo, se ha demostrado que los TTFields alteran la localización de las septinas (proteínas intracelulares responsables de anclar los husos mitóticos durante la división celular) y, por lo tanto, perturban la mitosis. Algunos equipos han informado sobre la prolongación del daño del ADN mediante quimioterapia o radioterapia en conjunto con TTFields, mientras que otros han mostrado efectos sobre la función mitocondrial a través de la hinchazón de las matrices mitocondriales. Otros equipos exploraron la combinación de quimioterapias (por ejemplo, temozolomida) con TTFields en pacientes con GBM. Estas investigaciones sobre intervenciones combinadas han descubierto otros efectos prometedores contra el glioblastoma.

[0012] El documento WO 2015/175570 A1 describe un sistema y un método para tratar selectivamente células aberrantes, tal como células cancerosas, mediante la administración de un tren de pulsos eléctricos. La longitud del pulso y el retraso entre pulsos sucesivos se optimizan para producir efectos en los potenciales de membrana intracelular. Las terapias basadas en el sistema y método producen dos zonas de tratamiento: una zona de ablación que rodea los electrodos dentro de la cual se eliminan de forma no selectiva las células aberrantes y una zona de tratamiento selectivo que rodea la zona de ablación dentro de la cual se eliminan selectivamente las células objetivo a través de efectos sobre los potenciales de membrana intracelular.

[0014] El documento WO 2016/161201 A2 describe un método de control adaptativo para controlar los parámetros de los pulsos de EP durante la electroporación (EP) de células o tejido utilizando un sistema de EP. El método incluye proporcionar un sistema para control adaptativo para optimizar parámetros de los pulsos de EP, incluidos parámetros de los pulsos de EP, aplicar señales de excitación de tensión y corriente a las células, obtener datos de las mediciones de corriente y tensión, y procesar los datos para separar los datos deseables de los datos indeseables, extraer características relevantes de los datos deseables, aplicar al menos una parte de las características relevantes a un modelo de diagnóstico entrenado, estimar parámetros de los pulsos de EP basados en un resultado de las características relevantes aplicadas, donde los parámetros de los pulsos de EP inicializados se basan en el modelo entrenado y las características relevantes, para optimizar los parámetros de los pulsos de EP, y aplicar, por parte del generador, un primer pulso de EP basado en los primeros parámetros de pulso. El documento US 2017/281934 A1 describe una secuencia en la que se impone un primer campo eléctrico de CA a una primera frecuencia que se selecciona para interrumpir la mitosis de células cancerosas en una región objetivo. Luego, se impone un segundo campo eléctrico de CA a una segunda frecuencia que se selecciona para reducir la motilidad de las células cancerosas en la región objetivo. Esta secuencia se repite entonces hasta finalizar el tratamiento. El documento US 2017/281934 A1 describe además que, preferiblemente, el curso del tratamiento tiene una duración de al menos 12 horas.

[0016] Compendio de la invención

[0018] La presente invención proporciona, en combinación, una sustancia para administración a través de las membranas celulares en el cuerpo de un sujeto y un aparato de control de la permeabilidad de la membrana celular para facilitar la administración de la sustancia cuando se administra a través de las membranas celulares, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0019] Breve descripción de los dibujos

[0021] La FIG. 1 es una ilustración esquemática que muestra un efecto alternativo de los TTFields en la modulación de la integridad y, por lo tanto, la permeabilidad de las membranas celulares.

[0022] La FIG. 2A representa los efectos ejemplares de los TTFields sobre la bioluminiscencia de células U87-MG/eGFP-fLuc a partir de escaneos de imágenes bioluminiscentes en función del tiempo en condiciones con TTFields frente a sin TTFields.

[0023] La FIG. 2B representa los efectos ejemplares de TTFields sobre la fluorescencia de eGFP para células U87-MG/eGFP-fLuc en función del tiempo en condiciones con TTFields frente a sin TTFields.

[0024] La FIG. 2C representa el efecto de los TTFields en la relación entre la bioluminiscencia de fLuc (fLuc-BLI) y la fluorescencia de eGFP (eGFP-FL) para células U87-MG/eGFP-fLuc en función de la duración de la exposición a los TTFields.

[0025] La FIG. 2D representa el efecto de la exposición a TTFields frente a la no exposición en la relación fLuc-BLI/eGFP-FL en función del tiempo de exposición a los TTFields.

[0026] La FIG. 3A representa los efectos ejemplares de los TTFields en la captación dependiente del tiempo de Etidio D en células U87-MG/eGFP-fLuc entre sin TTFields y con TTFields (200 kHz).

[0027] Las FIGS. 3B-3D representan el impacto ejemplar de las condiciones con TTFields frente a sin TTFields en la secuencia temporal de la captación de Dextrano-FITC para Dextrano-FITC de 4 kDa, Dextrano-FITC de 20 kDa y Dextrano-FITC de 50 kDa, respectivamente.

[0028] La FIG. 4A representa el efecto ejemplar de TTFields (200 kHz) en la captación de ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), como se muestra en la fluorescencia de protoporfirina IX (PpIX) representativa para células U87-MG expuestas y no expuestas a TTFields a las 6 y 24 horas.

[0029] La FIG. 4B representa cómo cambió la fluorescencia de PpIX a lo largo del tiempo en células de glioblastoma frente a fibroblastos en las plataformas de cocultivo que fueron sometidas a TTFields.

[0030] La FIG. 5 proporciona la cuantificación del número y tamaño de los poros a partir de una comparación por SEM de los poros de la membrana plasmática en células U87-MG/eGFP-fLuc expuestas y no expuestas a TTFields durante 3 días.

[0031] La FIG. 6 proporciona la cuantificación del número y tamaño de los poros a partir de una comparación por SEM de los poros de la membrana plasmática en células humanas normales PCS-201 expuestas y no expuestas a TTFields durante 3 días.

[0032] Las FIG. 7A-7C representan los resultados de experimentos que muestran cómo los campos eléctricos alternos aumentan de manera reversible la captación en células U87-MG de D-Luciferina, 5-ALA y Dextrano-FITC (4 kDa), respectivamente.

[0033] La FIG. 7D representa los resultados de un experimento que muestra las características temporales de la permeabilidad que se induce mediante la aplicación de TTFields a células U87-MG.

[0034] La FIG. 8A representa los resultados de un experimento que muestra cómo los campos eléctricos alternos afectan la permeabilidad de las membranas celulares MDA-MB-435 al 7-AAD.

[0035] La FIG. 8B representa los resultados de un experimento que muestra cómo los campos eléctricos alternos afectan la permeabilidad de las membranas celulares resistentes a la Doxiciclina MDA-MB-435 y MDA-MB-435 a la doxorrubicina.

[0036] La FIG. 8C representa los resultados de un experimento que muestra cómo los campos eléctricos alternos afectan la permeabilidad de las membranas celulares resistentes a la Mitoxantrona MCF-7 y MCF-7 a la mitoxantrona. Las FIGS. 9A-9G representan el efecto de los TTFields sobre la sensibilidad a siete combinaciones diferentes de sustancias y tipos de células correspondientes.

[0037] Las FIGS. 10A y 10B representan cada una una relación temporal adecuada entre la aplicación del campo eléctrico alterno y la introducción de la sustancia en las proximidades de la célula cancerosa.

[0038] La FIG. 11A representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor nivel de citotoxicidad a las células U-87 MG.

[0039] La FIG. 11B representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células U-87 MG.

[0040] La FIG. 12A representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor nivel de citotoxicidad a las células MES-SA.

[0041] La FIG. 12B representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células MES-SA.

[0042] La FIG. 12C representa los resultados de un experimento para determinar cómo los campos eléctricos alternos de 150 kHz afectan la permeabilidad de las membranas celulares de las células MES-SA a la doxorrubicina.

[0043] La FIG. 13A representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor nivel de citotoxicidad a las células MCF-7.

[0044] La FIG. 13B representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células MCF-7.

[0045] La FIG. 14 representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células GBM39/Luc.

[0046] La FIG. 15 es un diagrama de bloques de un aparato de doble frecuencia que genera una primera frecuencia para inducir la permeabilidad celular y una segunda frecuencia para inducir la citotoxicidad.

[0047] Se describen varias realizaciones en detalle a continuación con referencia a los dibujos adjuntos, en donde los números de referencia similares representan elementos similares.

[0049] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

[0051] Tal como se utiliza en la presente, la expresión "reducir la viabilidad" de una célula se refiere a reducir el crecimiento, la proliferación o la supervivencia de la célula, o a aumentar la citotoxicidad de la célula.

[0053] Esta solicitud describe un nuevo enfoque para aumentar temporalmente la permeabilidad de las membranas de las células plasmáticas de las células cancerosas utilizando campos eléctricos alternos de modo que las sustancias que normalmente están bloqueadas por la membrana celular puedan atravesar la membrana celular, o de modo que las sustancias que normalmente están impedidas por la membrana celular puedan atravesar la membrana celular más fácilmente. En algunos de los ejemplos descritos en la presente, este enfoque se utiliza para aumentar temporalmente la permeabilidad de las membranas de las células plasmáticas de glioblastoma mediante campos eléctricos alternos de modo que las sustancias que normalmente son impedidas por la membrana de las células de glioblastoma puedan atravesar la membrana de las células de glioblastoma con mayor facilidad.

[0055] Los inventores han demostrado que el tratamiento con TTFields, junto con un novedoso compuesto contra el cáncer, Withaferina A, inhibió sinérgicamente el crecimiento de células de glioblastoma humano. Los inventores plantearon la hipótesis de que dicho efecto sinérgico se debe a una mayor accesibilidad de la Withaferina A a las células de glioblastoma a través de la capacidad de los TTFields de aumentar transitoriamente la permeabilidad de la membrana celular tumoral, como se muestra esquemáticamente en la FIG. 1. En esta figura, 5-ALA = ácido 5-aminolevulínico; Etidio D = bromuro de etidio; y FITC = isotiocianato de fluoresceína.

[0057] Luego se realizaron estudios que validan la hipótesis. En particular, se encontró evidencia que muestra que la exposición a TTFields induce una mayor bioluminiscencia en células de glioblastoma humano que han sido modificadas para expresar luciferasa (renilla y luciérnaga), y que esta inducción se debe a una mayor permeación de los sustratos (D-luciferina y coelenterazina, respectivamente), a través de la membrana plasmática. También se demostró una mayor permeabilidad de la membrana causada por la exposición a TTFields con otros reactivos que penetran la membrana, como Dextrano-FITC y Etidio D.

[0059] También se demostró el uso de TTFields para aumentar la permeabilidad de la membrana en células de glioblastoma utilizando ácido 5-aminolevulínico (5-ALA). El 5-ALA es un precursor de la hemoglobina que se convierte en protoporfirina IX (PpIX) fluorescente en todas las células de mamíferos. Sin embargo, muchas células malignas, incluidos los gliomas de alto grado, tienen una biosíntesis de hemoglobina elevada, lo que se refleja en una mayor acumulación de PpIX dentro de las células y tejidos transformados (en comparación con las células no cancerosas). Esta propiedad ha impulsado muchas investigaciones médicas a utilizar la captación de 5-ALA (y, por consecuencia, su conversión enzimática a PpIX) como un biomarcador fluorescente para células tumorales. Sin embargo, con el nivel actual de tecnología, puede ser difícil distinguir el margen celular preciso entre el tejido tumoral y el no tumoral de manera intraoperativa. Los experimentos descritos en la presente muestran que los TTFields mejoran significativamente la relación entre el tumor y las células normales para la fluorescencia de PpIX (provocada por la exposición y la captación de 5-ALA) y, de esta manera, pueden usarse para delinear mejor los márgenes del tumor en entornos intraoperativos.

[0061] Experimentos adicionales utilizando datos de microscopía electrónica de barrido (SEM) demuestran un aumento en la cantidad y el tamaño de los poros en las membranas de las células de glioblastoma causado por la exposición a TTFields, y que la morfología de la membrana de las células de glioblastoma se altera cuando se aplican TTFields. A través de todas las modalidades estudiadas (bioluminiscencia, fluorescencia y SEM), se encontró que los efectos de los TTFields sobre la permeabilidad de la membrana de las células de GBM eran reversibles después del cese de la exposición a los TTFields.

[0063] RESULTADOS

[0065] La inducción de TTFields aumenta la bioluminiscencia (BLI) en glioblastomas que expresan luciferasa.

[0067] Se sembraron células U87-MG/eGFP-fLuc en cubreobjetos de vidrio Thermanox, se dejaron asentar y crecer y luego se sometieron a TTFields o a ningún TTField. En este experimento, el uso de TTFields (4 V/cm, 200 kHz, duración de 0,5-24 h) aumentó significativamente la intensidad de bioluminiscencia (BLI) de las células U87-MG/eGFP-fLuc en comparación con las condiciones no expuestas. Este aumento de la BLI se produjo tan pronto como 30 minutos después del inicio de TTFields y continuó hasta las 24 h de exposición a TTFields. Cuando se realizó la cuantificación de la ROI, la secuencia temporal de la intensidad de BLI para las muestras expuestas a TTFields fue significativamente elevado en comparación con las muestras no expuestas a TTFields (p < 0,0001, ANOVA de dos vías, TTFields frente a sin TTFields). Los datos que representan la cuantificación temporal de los resultados de BLI de estos experimentos se resumen en la FIG. 2A. Sin estar limitados por esta teoría, se cree que el aumento de la bioluminiscencia no se debió a un efecto directo de los TTFields sobre la actividad de la luciferasa de luciérnaga porque la exposición de la luciferasa de luciérnaga purificada a TTFields de 200 kHz provocó una pérdida de más de 1000 veces en la actividad enzimática 60 minutos después del inicio de los TTFields.

[0069] La FIG. 2B representa el efecto de los TTFields sobre la fluorescencia de eGFP en células U87-MG/eGFP-fLuc observado a partir de la secuencia temporal de imágenes representativas (no se muestran) para U87-MG/eGFP-fLuc expuestas a TTFields frente a no expuestas a TTFields. La presencia de TTFields no aumentó significativamente la fluorescencia de eGFP (eGFP-FL) a lo largo de los experimentos. Cuando se compararon las proporciones de BLI sobre eGFP-FL entre muestras con TTFields y sin TTFields, hubo una proporción significativamente aumentada con respecto al tiempo de incubación de TTFields para las muestras con TTFields, como se muestra en las FIGS. 2C, 2D (p < 0,0001, ANOVA de dos vías, TTFields frente a sin TTFields). Más específicamente, la FIG. 2C representa el efecto de los TTFields en la relación de bioluminiscencia de fLuc (fLuc-BLI) sobre la fluorescencia de eGFP (eGFP-FL) para células U87-MG/eGFP-fLuc en función de la duración de la exposición a los TTFields; y la FIG. 2D representa el efecto de la exposición a TTFields frente a la no exposición en la relación fLuc-BLI/eGFP-FL en función del tiempo de exposición a TTFields (horas). Los TTFields redujeron significativamente la actividad de la luciferasa de luciérnaga purificada en comparación con la condición sin TTFields (p <0,01, ANOVA de dos vías, TTFields frente a sin TTFields).

[0071] La aplicación de TTFields a lo largo del tiempo en otra línea celular de glioblastoma derivada de pacientes, GBM2/GFP-fLuc, también indujo un aumento dependiente del tiempo en la bioluminiscencia en las células GBM2/GFP-fLuc expuestas a TTFields en comparación con los controles sin TTFields (p < 0,0001, ANOVA de dos vías, TTFields frente a sin TTFields). Este mismo efecto se observó en una línea celular de astrocitoma murino (KR158B) que fue modificada genéticamente para expresar la proteína de fusión de la proteína fluorescente roja de luciferasa de Renilla (p < 0,0001, ANOVA de dos vías, TTFields frente a sin TTFields). La actividad de la luciferasa de Renilla no depende de ATP ni de magnesio (a diferencia de la luciferasa de luciérnaga). Por lo tanto, se cree que la inducción de bioluminiscencia por TTFields no se debió a alteraciones en las reservas endógenas de ATP.

[0073] Efecto de los TTFields en la captación de reactivos asociados a la membrana.

[0075] Para probar si la imposición de TTFields afecta las propiedades de la membrana celular y, por lo tanto, la permeabilidad de la membrana, se determinó el efecto de los TTFields en el comportamiento de los reactivos marcados con fluorescencia que se unen a la membrana celular. Inicialmente, se midió el impacto de los TTFields en la unión de Annexina-V-APC a la membrana de las células U87-MG/eGFP-fLuc. La unión de Annexina-V-APC es un marcador característico de la apoptosis temprana, la cual se caracteriza por la ondulación de la membrana. Se utilizó un control positivo para la apoptosis (adición de 21 pM de Withaferina A a las células U87-MG/eGFP-fLuc) para evaluar la visibilidad de la unión de Annexina-V-APC a las células U87-MG/eGFP-fLuc, y demostró que dicha unión podía visualizarse mediante microscopía de fluorescencia sobre muestras no expuestas a TTFields. Sin embargo, cuando se aplicaron TTFields a las células U87-MG/eGFP-fLuc, no se observó la unión de Annexina-V-APC en ningún momento de exposición a TTFields. Por lo tanto, parece que los TTFields no indujeron ningún grado significativo de apoptosis en las células U87-MG.

[0077] En particular, la captación de etidio D aumentó significativamente cuando las células U87-MG/eGFP-fLuc se sometieron a TTFields de 200 kHz, como se muestra en la FIG. 3A (p < 0,0001, ANOVA de dos vías, TTFields frente a sin TTFields). El etidio D penetra tanto la membrana plasmática como la membrana nuclear y se intercala en el ADN genómico. Por lo tanto, estos hallazgos sugieren que los TTFields pueden tener un efecto sobre la permeabilidad de las membranas plasmáticas en las células U87-MG/eGFP-fLuc.

[0079] Otra consecuencia de la mayor permeabilidad de la membrana por los TTFields son las alteraciones en la unión de Dextrano-FITC en la membrana celular. Se sabe que el Dextrano-FITC se une y se intercala en la membrana plasmática. Cuando las células U87-MG se sometieron a 1 h de TTFields de 200 kHz, hubo una captación significativa de Dextrano-FITC de pesos moleculares de 4 kDa y 20 kDa, en comparación con ninguna exposición a TTFields, como se muestra en las FIGS. 3B y 3C. Pero no hubo diferencia significativa en la captación de Dextrano-FITC de 50 kDa, como se representa en la FIG. 3D. Más específicamente, se examinó la unión de Dextrano-FITC en presencia de TTFields durante un plazo de exposición de 0,5 a 24 h; se encontró un aumento significativo en la captación de Dextrano-FITC de 4 kDa en comparación con las muestras no expuestas a TTFields (p < 0,0001, ANOVA de dos vías, TTFields frente a sin TTFields), un aumento significativo en la captación de Dextrano-FITC de 20 kDa bajo la exposición a TTFields (p < 0,01, TTFields frente a sin TTFields) y ninguna diferencia significativa en la captación de Dextrano-FITC de 50 kDa bajo la exposición a TTFields (p = 0,26, no significativo, TTFields frente a sin TTFields). Estos datos sugieren que el tamaño máximo de Dextrano-FITC que se unió y entró en la membrana plasmática bajo exposición a TTFields en este experimento fue de entre aproximadamente 20 y 50 kDa. En todas las comparaciones estadísticas descritas en este párrafo, cada punto de datos representa n = 3 experimentos. En las FIGS 3A-3D, APC = aloficocianina; Etidio D = bromuro de etidio; y FITC = isotiocianato de fluoresceína.

[0081] Efecto de los TTFields sobre la captación de ácido 5-aminolevulínico (5-ALA): cultivo único de U87-MG.

[0082] Se realizaron experimentos para determinar los efectos de los TTFields en la captación de 5-ALA (medida por la acumulación de PpIX y su fluorescencia resultante) en células de glioblastoma. Debido a que es difícil distinguir el margen entre células tumorales y normales utilizando el presente bioensayo de 5-ALA, se utilizó la medición de la fluorescencia de PpIX para abordar este problema. Se realizaron investigaciones para determinar si la permeación de 5-ALA a través de la membrana celular y hacia las células de glioblastoma podría aumentarse con la exposición a TTFields. Se expusieron o no células U87-MG a TTFields, cada una durante períodos de 6-24 h. Los resultados, que se resumen en la FIG. 4A, fueron los siguientes: la exposición a TTFields resultó en una captación significativamente mayor de 5-ALA en células U87-MGZ eGFP-fLuc tan pronto como a las 6 h de exposición a TTFields (p = 0,047, prueba t de Student, TTFields frente a sin TTFields) y este aumento se mantuvo con una exposición prolongada a TTFields de 24 h (p = 0,011).

[0084] Para generar los datos representados en la FIG. 4A, se obtuvieron paneles de fluorescencia de protoporfirina IX (PpIX) para células U87-MG no expuestas a TTFields frente a expuestas a TTFields después de 6 y 24 h de exposición. La cuantificación de dichas imágenes mostró un aumento significativo en las señales de PpIX en las células expuestas a TTFields en comparación con las células sin TTFields, tanto en los puntos de tiempo de 6 h (p = 0,047) como de 24 h (p = 0,01). Todas las comparaciones estadísticas monovariantes entre muestras sin TTFields frente a muestras con TTFields se realizaron mediante la prueba t de Student, con n = 3 experimentos por punto temporal.

[0086] Efecto de los TTFields sobre la captación de ácido 5-aminolevulínico: U87-MG GBM en cocultivos de fibroblastos PCS-201.

[0088] Durante la resección de glioblastoma en pacientes, se utiliza 5-ALA para ayudar a los neurocirujanos a delimitar entre los tumores y el tejido cerebral normal circundante. Asimismo, para distinguir diferencias en la captación de 5-ALA entre células de glioblastoma y células normales, se desarrolló un cocultivo donde las células U87-MG se sembraron en el centro de un lecho de fibroblastos PCS-201 y se sometieron a TTFields o a ningún TTFields. Las fotomicrografías fluorescentes y de campo brillante confirmaron la presencia de regiones discretas de células de glioblastoma frente a fibroblastos en la configuración de cocultivo. Cuando los cocultivos se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E), las fotomicrografías revelaron un número reducido de células de GBM infiltrándose en la periferia de los fibroblastos en las muestras expuestas a TTFields.

[0090] En particular, sin la exposición a TTFields, las células de GBM formaron muchas agrupaciones de neuroesferas adherentes como se informó previamente. Las imágenes de fluorescencia mostraron una mayor fluorescencia de PpIX en células de glioblastoma frente a fibroblastos en las plataformas de cocultivo que fueron sometidas a TTFields durante 6 h. Los resultados, que se resumen en la FIG. 4B, fueron los siguientes: la fluorescencia de PpIX se acumuló con el tiempo, pero la tasa de aumento de la intensidad de la fluorescencia aumentó significativamente (p < 0,001, a No v A de dos vías, TTFields frente a sin TTFields) para los cocultivos expuestos a TTFields en comparación con los cocultivos no expuestos a TTFields. Para generar los datos representados en la FIG. 4B, se obtuvieron paneles fluorescentes de captación de 5-ALA (y posterior fluorescencia de PpIX, Ex = 558 nm, Em - 583 nm) para las condiciones sin TTFields y con TTFields. La duración de las exposiciones es de 2, 6 y 24 h. Cuantificación de la secuencia temporal de la acumulación de PpIX (y, por lo tanto, de la acumulación de flujo fluorescente expresado en fotones/s) en la plataforma de cocultivo de glioblastoma-fibroblastos en condiciones expuestas a TTFields frente a condiciones no expuestas a TTFields (p < 0,001). Los análisis estadísticos consistieron en ANOVA de dos vías para las condiciones sin TTFields frente a condiciones con TTFields, y n = 3 experimentos por punto temporal.

[0092] En un conjunto separado de experimentos, a las 24 h de aplicación de TTFields, la relación de la intensidad de fluorescencia de PpIX en las células de glioblastoma U87-MG sobre las células de fibroblastos PCS-201 circundantes aumentó significativamente en comparación con la relación de intensidad de fluorescencia de las células cocultivadas en condiciones sin TTFields (p = 0,043, ANOVA de dos vías, TTFields frente a sin TTFields). La micrografía electrónica de barrido (SEM) muestra que TTFields altera la morfología de la membrana de las células U87-MG/eGFP-fLuc.

[0094] Se obtuvieron imágenes SEM de células U87-MG/eGFP-fLuc de baja densidad (5000 células/cubreobjetos) que no estuvieron expuestas a TTFields o que estuvieron expuestas a TTFields durante 3 días, con aumentos de 2000x, 20.000x y 60.000x. Los datos obtenidos al revisar estas imágenes SEM se resumen en la FIG. 5. Se observó un aumento significativo en la cantidad de poros de más de 51,8nm2 de tamaño (equivalente a 9píxeles2 con un aumento de 60.000x) dentro de la ROI de las células expuestas a TTFields (53,5 19,1) en comparación con las células no expuestas a TTFields (23,9 ± 11,0), (p = 0,0002, prueba de Mann-Whitney univariante). El tamaño promedio de los poros dentro de la ROI también fue significativamente mayor en las células expuestas a TTFields (240,6 ± 91,7 nm2) en comparación con las células no expuestas a TTFields (129,8 ± 31,9 nm2), (p = 0,0005 (prueba de Mann-Whitney univariante)). Para obtener los datos representados en la FIG. 5, se realizó la cuantificación y comparación del número y tamaño de los poros entre las células expuestas y no expuestas a TTFields dentro de una región circular de interés de 500 nm de radio. El tamaño mínimo de corte del poro se basó en los radios de Stokes de 3,3 y 5,0 nm de Dextrano-FITC de 20 kDa y 50 kDa, respectivamente. Se utilizaron cubreobjetos de tres experimentos por condición y se analizaron al menos 5 células por cubreobjetos para determinar el tamaño y el número de poros, de manera doble ciego.

[0096] También se observaron visualmente los efectos de una exposición de 24 h a TTFields en las membranas plasmáticas de células U87-MG sembradas a alta densidad. En las muestras sin TTFields, la superficie celular parecía estar cubierta de extensiones de membrana densamente entrelazadas, alargadas y aplanadas, similares a volantes de membrana y contiguas a la membrana celular. Por el contrario, después de 24 horas de exposición a TTFields, las estructuras densamente entrelazadas y alargadas fueron reemplazadas por estructuras cortas, abultadas y con forma de vesículas.

[0098] A modo de comparación, también se obtuvieron y analizaron imágenes SEM de células PCS-201 humanas normales. Las células PCS-201 se sembraron a baja densidad (5.000 células por cubreobjetos de vidrio de 13 mm). Las células se cultivaron en condiciones estándar de cultivo de tejidos (37°C, 95% de O2, 5% de CO<2>). Las células no expuestas a TTFields se dejaron en esas condiciones durante todo el estudio. Otras células fueron expuestas a TTFields durante 72 h. Después de 72 horas, se obtuvieron las imágenes de SEM con aumentos de 2000x, 20.000x y 60.000x. Cuantificación y comparación entre células TTFields no expuestas y expuestas del número y tamaño de los poros con un área >51,8 nm2 (equivalente a un círculo de radio de 4-nm o 9 píxeles2 en las imágenes con aumento de 60.000x) dentro de una región circular de interés de radio de 500 nm. El tamaño mínimo de corte del poro se basó en los radios de Stokes de 3,3 nm y 5,0 nm de Dextrano-FITC de 20 kDa y 50 kDa, respectivamente. Los resultados, que se representan en la FIG. 6, fueron los siguientes: No hubo diferencia significativa en el número o tamaño de los poros entre las células PCS-201 humanas normales expuestas y no expuestas a TTFields (análisis de suma de rangos de Wilcoxon). Se utilizaron cubreobjetos de tres experimentos por condición y se analizaron al menos 5 células por cubreobjetos para determinar el tamaño y el número de poros, de manera doble ciego.

[0100] También se observaron visualmente los efectos de una exposición de 24 h a TTFields en las membranas plasmáticas de células PCS-201. A diferencia de la situación descrita anteriormente para las células U87-MG, los TTFields no parecieron alterar la morfología de la membrana de las células PCS-201.

[0102] El efecto de los TTFields sobre la permeabilidad de la membrana es reversible.

[0104] Para evaluar la reversibilidad del efecto de TTFields en las células cancerosas, las células U87-MG/eGFP-fLuc se sometieron a tres condiciones: (1) Sin exposición a TTFields, condiciones estándar de cultivo celular (37°C, 95% de O<2>, 5% de CO<2>), (2) Exposición a TTFields durante 24 h y (3) Exposición a TTFields durante 24 h seguida de ninguna exposición a TTFields durante 24 h. Se obtuvieron las lecturas de BLI, fluorescencia de PpIX (producto de 5-ALA) y fluorescencia de Dextrano-FITC (4 kDa). Todas las condiciones experimentales se realizaron por triplicado. La FIG. 7A resume los datos para BLI: La presencia de TTFields durante 24 h (barra central) aumentó significativamente el flujo de BLI en comparación con ninguna exposición a TTFields (barra izquierda) (p < 0,0005, ANOVA de dos vías, TTFields frente a sin TTFields) pero este aumento se atenuó significativamente cuando las células se reintrodujeron a la condición sin TTFields durante 24 h (barra derecha) (ANOVA de dos vías, p < 0,005, TTFields durante 24 h frente a TTFields durante 24 h seguido de 24 h sin TTFields). La FIG. 7B muestra que ocurrió un patrón similar de lecturas reversibles con fluorescencia de PpIX (p < 0,0005, ANOVA de dos vías, TTFields (barra central) frente a sin TTFields (barra izquierda) y p < 0,0004, TTFields frente a TTFields seguidos de condición sin TTFields (barra derecha)). Y la FIG. 7C muestra que ocurrió un patrón similar de lecturas reversibles para fluorescencia de Dextrano-FITC de 4 kDa (p < 0,05, ANOVA de dos vías, TTFields (barra central) frente a sin TTFields (barra izquierda) y p < 0,05, TTFields frente a TTFields seguidos de condición sin TTFields (barra derecha)). Para cada conjunto experimental, la fluorescencia de eGFP no cambió significativamente. Los estudios mediante SEM también revelaron que el aumento significativo tanto en el número de poros (p = 0,007, ANOVA de dos vías, TTFields frente a sin TTFields) como en el tamaño de los poros (p = 0,0007, ANOVA de dos vías, TTFields frente a sin TTFields) inducido por los TTFields fue reversible tras 24 h sin exposición. Aquí, NS = no significativo; BLI - imágenes bioluminiscentes; eGFP = proteína fluorescente verde mejorada; fLuc = luciferasa de luciérnaga; 5-ALA - ácido 5 aminolevulínico; FITC = isotiocianato de fluoresceína; PpIX = protoporfirina IX; y FL = fluorescencia.

[0105] En resumen, la captación de los compuestos relevantes aumentó cuando se aplicaron campos eléctricos alternos (en comparación con cuando no se aplicaron campos eléctricos alternos). Cada una de estas figuras muestra también que la captación disminuyó sustancialmente después del cese de los campos eléctricos alternos durante 24 horas. De esto podemos inferir que el aumento de la permeabilidad de las membranas celulares inducido por los campos eléctricos alternos no es un efecto permanente y que la permeabilidad disminuye nuevamente después del cese de los campos eléctricos alternos.

[0107] La FIG. 7D muestra los resultados de un experimento para probar cuán rápido la permeabilidad disminuye nuevamente después del cese de los campos eléctricos alternos. Más específicamente, la 7-aminoactinomicina D (7-AAD) es un compuesto químico fluorescente con una fuerte afinidad por el ADN. La 7-AAD es una molécula relativamente grande (1270,43 g/mol, es decir, 1,27 kDa) que normalmente no atraviesa fácilmente las membranas celulares intactas. La FIG. 7D muestra las características temporales de la permeabilidad a 7-AAD que se induce mediante la aplicación de TTFields para células U87-MG. En este experimento, las células fueron tratadas con un campo eléctrico alterno a 300 kHz con una intensidad de campo de 1,62 V/cm RMS durante 24 horas, a una temperatura ambiente de 18°C. Se introdujo 7-AAD en las muestras en cinco momentos diferentes: 15 minutos antes del cese del campo eléctrico alterno; inmediatamente después del cese del campo eléctrico alterno; y 15, 30 y 60 minutos después del cese del campo eléctrico alterno. En cada caso, las células se incubaron con 7-AAD durante 30 minutos después de la introducción de 7-AAD, seguido de un análisis de citometría de flujo del porcentaje de células con mayor acumulación de 7-AAD fluorescente para cada uno de los diferentes tiempos. Como se observa en la FIG. 7D, se observó un aumento significativo en la acumulación de 7-AAD solo en la muestra que se incubó con 7-AAD mientras estaba sujeta a un campo eléctrico alterno.

[0109] Resultados adicionales para diferentes fármacos y diferentes tipos de células cancerosas.

[0111] Los métodos descritos en la presente no se limitan al contexto del glioblastoma. Por el contrario, son aplicables a otros tipos de células cancerosas. Más específicamente, una sustancia puede administrarse a través de una membrana celular de una célula (a) aplicando un campo eléctrico alterno a la célula durante un período de tiempo, en donde la aplicación del campo eléctrico alterno aumenta la permeabilidad de la membrana celular; y (b) introduciendo la sustancia en las proximidades de la célula. La mayor permeabilidad de la membrana celular permite que la sustancia pueda atravesar la membrana celular. En particular, los métodos descritos en la presente pueden usarse para administrar moléculas grandes (que normalmente no pasarían a través de la membrana celular relevante) a través de una membrana celular de diferentes tipos de células (es decir, células que no sean glioblastoma), incluidos, entre otros, otros tipos de células cancerosas (por ejemplo, células MDA-MB-435 y MCF-7).

[0113] La FIG. 8A representa los resultados de un experimento realizado para determinar cómo los campos eléctricos alternos afectan la permeabilidad de las membranas celulares de las células de la línea celular de melanoma humano MDA-MB-435. En este experimento, las células MDA-MB-435 se trataron con un campo eléctrico alterno a 150 kHz con una intensidad de campo de 1,62 V/cm durante 24 horas, a una temperatura ambiente de 18°C y una temperatura de placa de 37°C. (La temperatura de la placa en este y otros ejemplos es más alta que la temperatura ambiente debido al calentamiento causado por los campos eléctricos alternos). Después de las primeras 23,75 horas, se añadió 7-AAD al cultivo y se incubó durante 15 minutos, tiempo durante el cual se continuaron los campos eléctricos alternos (para completar el período de 24 horas). Después de este período de 15 minutos, se finalizó la aplicación del campo eléctrico alterno y las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos más. El porcentaje de células con mayor acumulación de 7-AAD fluorescente se determinó mediante análisis de citometría de flujo. ~66% de las células exhibieron una mayor acumulación de 7-AAD (barra 2 en la FIG. 8A), en comparación con menos del 5% de las células en el control (barra 1), que se sometió a las mismas condiciones, excepto que no se aplicaron los campos eléctricos alternos. Estos resultados indican que los campos eléctricos alternos provocan un aumento muy significativo en la permeabilidad de las membranas celulares.

[0115] En una variación de este experimento, las células de la línea celular de melanoma humano MDA-MB-435 se trataron con un campo eléctrico alterno a 150 kHz con una intensidad de campo de 1,62 V/cm durante 24 horas, a una temperatura ambiente de 18°C y una temperatura de placa de 37°C. Después de este período de 24 horas, los campos eléctricos alternos se apagaron durante 15 minutos, después de lo cual se añadió 7-AAD. Después de esperar 15 minutos más, se determinó el porcentaje de células con mayor acumulación de 7-AAD fluorescente mediante citometría de flujo. Esta vez, solo el -20% de las células exhibieron una mayor acumulación de 7-AAD (barra 3 en la FIG. 8A). Estos resultados indican que el aumento de la permeabilidad de las membranas celulares que es inducido por campos eléctricos alternos es relativamente de corta duración y que la permeabilidad disminuye rápidamente y drásticamente después del cese de los campos eléctricos alternos.

[0117] La FIG. 8B representa los resultados de otro experimento realizado para determinar cómo los campos eléctricos alternos afectan la permeabilidad de las membranas celulares de las células de la línea celular de melanoma humano MDA-MB-435 a la doxorrubicina (543,52 g/mol). En este experimento, tanto las variantes de tipo salvaje como las resistentes a la doxorrubicina de las células MDA-MB-435 se trataron con un campo eléctrico alterno a 150 kHz con una intensidad de campo de 1,62 V/cm durante 23 horas. Después de este período de 23 horas, se añadió doxorrubicina a una concentración de 10 pM y se incubó durante una hora, tiempo durante el cual se continuaron los campos eléctricos alternos. Luego se midió la acumulación intracelular de doxorrubicina. La acumulación intracelular de doxorrubicina aumentó tanto en las células de tipo salvaje (comparar la barra 1 con la barra 3) como en las células resistentes a la doxorrubicina (comparar la barra 2 con la barra 4).

[0119] La FIG. 8C representa los resultados de un experimento similar utilizando células de la línea celular de adenocarcinoma de mama humano MCF-7 y mitoxantrona (444,481 g/mol). En este experimento, tanto las variantes de tipo salvaje como las resistentes a la mitoxantrona de las células MCF-7 se trataron con un campo eléctrico alterno a 150 kHz con una intensidad de campo de 1,62 V/cm durante 23 horas. Después de este período de 23 horas, se añadió mitoxantrona a una concentración de 2 pM y se incubó durante una hora, tiempo durante el cual se continuaron los campos eléctricos alternos. Luego se midió la acumulación intracelular de mitoxantrona. La acumulación intracelular de mitoxantrona aumentó tanto en las células de tipo salvaje (comparar la barra 1 con la barra 3) como en las células resistentes a la mitoxantrona (comparar la barra 2 con la barra 4).

[0120] Los resultados descritos anteriormente en conexión con las FIGS. 8B y 8C indican que los campos eléctricos alternos mejoran la acumulación intracelular de moléculas de quimioterapia tanto en células de tipo salvaje como en células resistentes a los fármacos, y que los campos eléctricos alternos pueden restaurar de forma ventajosa la acumulación intracelular de productos químicos quimioterapéuticos en células cancerosas después de que dichas células hayan desarrollado resistencia múltiple a dichos productos químicos.

[0122] Se realizaron experimentos adicionales para determinar si existe sinergia entre TTFields y varios fármacos para varias líneas de células cancerosas, y las FIGS. 9A-9G representan el resultado de algunos de estos experimentos. Más específicamente, la FIG. 9A muestra cómo la aplicación de TTFields durante 3 días mejora la sensibilidad de las células U87-MG/GFP-Luc a diversas concentraciones de Lomustina (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields). La FIG. 9B muestra cómo la aplicación de TTFields durante 3 días mejora la sensibilidad de las células pcGBM2/GFP-Luc a diversas concentraciones de Lomustina (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields). La FIG. 9C muestra cómo la aplicación de TTFields durante 3 días mejora la sensibilidad de las células GBM39 a diversas concentraciones de Lomustina (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields). La FIG. 9D muestra cómo la aplicación de TTFields durante 3 días mejora la sensibilidad de las células GBM39 a diversas concentraciones de Temozolomida (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields). La FIG. 9E muestra cómo la aplicación de TTFields durante 3 días mejora la sensibilidad de las células GBM39/Luc a diversas concentraciones de Irinotecán (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields). La FIG. 9F muestra cómo la aplicación de TTFields durante 3 días mejora la sensibilidad de las células MDA-MB-235 a diversas concentraciones de Doxorrubicina (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields). Y la FIG. 9G muestra cómo la aplicación de TTFields durante 4 días mejora la sensibilidad de las células U87-MG/eGFP-Luc a diversas concentraciones de Manosa (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields).

[0124] Hasta la fecha, se encontró sinergia para la combinación de TTFields más Withaferina A para GBM39/Luc, U87-MG/GFP-Luc y pcGBM2/GFP-Luc; se encontró sinergia para la combinación de TTFields más Lomustina para GBM39/Luc, U87-MG/GFP-Luc y pcGBM2/GFP-Luc; se encontró sinergia para la combinación de TTFields más Irinotecán para GBM39/Luc; y se encontró sinergia para la combinación de TTFields más Mannosa para U87-MG/GFP-Luc. También se encontró evidencia de sinergia para la combinación de TTFields más Doxorrubicina para MDA-MB-235.

[0126] ANÁLISIS

[0128] Estudios anteriores se han centrado en los efectos de los TTFields en el núcleo (por ejemplo, microtúbulos), la septina, las mitocondrias y la autofagia. Pero se cree que los experimentos descritos en la presente son los primeros en informar los efectos de los TTFields en la integridad de la membrana celular del cáncer y demuestran una mayor permeabilidad de la membrana celular para las células cancerosas (por ejemplo, múltiples líneas celulares de GBM humano) en presencia de TTFields utilizando varias técnicas de evaluación (por ejemplo, imágenes de bioluminiscencia, imágenes de fluorescencia y microscopía electrónica de barrido).

[0130] Las observaciones revelaron una mayor permeabilidad de la membrana celular para los glioblastomas en presencia de TTFields en múltiples líneas celulares de GBM humano. Los enfoques empleados para validar la hipótesis incluyeron imágenes de bioluminiscencia, imágenes de fluorescencia y microscopía electrónica de barrido. Las observaciones también revelaron una mayor permeabilidad de la membrana celular para otros tipos de células cancerosas en presencia de TTFields. Los estudios de TTFields en combinación con quimioterapias han demostrado tanto aditividad terapéutica como sinergia. Para este estudio, postulamos que TTFields media una mejor accesibilidad a las células cancerosas. Varios experimentos demostraron la reversibilidad del efecto de los TTFields sobre las membranas, demostrando así una relación causal entre los TTFields y el aumento de la permeabilidad de la membrana. Estas observaciones también sugieren que los TTFields podrían utilizarse para ajustar la accesibilidad de los fármacos a las células cancerosas.

[0132] La investigación sobre la hipótesis de la permeabilidad celular de la acción de los TTFields se inició parcialmente debido a las observaciones de una mayor bioluminiscencia en las células de GBM que expresaban luciferasa por los TTFields. Sin estar limitados por esta teoría, se cree que los TTFields indujeron una mayor permeabilidad en las membranas celulares de las células de GBM. Se cree que el aumento de la permeabilidad de las células de GBM a la D-luciferina medida por BLI no se debió a los efectos de los TTFields sobre la luciferasa en sí, sino más bien a un mayor influjo de su sustrato D-luciferina en las células diseñadas para expresar la luciferasa de luciérnaga. Además, este hallazgo fue válido tanto para la luciferasa dependiente de ATP (FLuc) como para la independiente de ATP (RLuc). Por lo tanto, a pesar de un informe preliminar que sugiere que el ATP intracelular aumentó en las células de carcinoma colorrectal CT26 expuestas a TTFields, la observación de una mayor permeabilidad de la membrana celular de glioblastoma en el contexto de la exposición a TTFields sugiere un fenómeno independiente. Un aumento en la expresión o activación de la luciferasa debido a la exposición a TTFields no podría haber explicado el aumento de la señal de BLI porque en estas células la enzima luciferasa estaba controlada por el mismo promotor que eGFP, y no se observó un aumento en la señal de fluorescencia en las mismas células. Sin embargo, la exposición a TTFields puede afectar el metabolismo celular, lo que se manifestaría por cambios en los niveles de ATP, alteraciones en la morfología de la membrana y cambios en el consumo de oxígeno.

[0134] Algunos hallazgos clave que respaldan la hipótesis de la permeabilidad provienen de los experimentos de validación de Dextrano-FITC descritos anteriormente en conexión con las FIGS. 3B-D. La accesibilidad de la membrana celular a pequeñas sondas en el contexto de TTFields se evaluó con dextranos marcados con FITC, lo que resultó en un aumento en la afluencia de 4 kDa (radio de Stokes -1,4 nm) y 20 kDa (radio de Stokes -3,3 nm) pero no de dextranos de 50 kDa (radio de Stokes -5 nm). Esto sugiere que los TTFields hacen que las células de GBM se vuelvan más permeables a sustancias de hasta 20 kDa, pero no mayores que 50 kDa. Como referencia, los sustratos de luciferina y coelenterazina tienen un peso molecular lo suficientemente pequeño como para ser accesibles a través de la membrana con exposición a TTFields. La D-luciferina (sustrato de la luciferasa de luciérnaga) tiene un peso molecular de 280,3 g/mol (-280 Da), la coelenterazina H (sustrato de la luciferasa de Renilla) tiene un peso molecular de 407,5 g/mol (-408 Da) y el 5-ALA tiene un peso molecular de 167,6 g/mol (169 Da), consistente con los hallazgos de Dextrano-FITC.

[0136] Los hallazgos de SEM descritos en la presente revelan que, a baja densidad de siembra, 3 días de exposición a TTFields provocaron un aumento significativo en el número y tamaño de poros mayores que 51,8nm2 de área en comparación con la condición sin TTFields, como se describió anteriormente en conexión con la FIG. 5. Este valor de corte para el tamaño de poro representa un círculo de radio de 4,1 nm, que es el radio de Stokes de una molécula de FITC-dextrano con un tamaño de 20-40 kDa. Por lo tanto, la diferencia en la disrupción de la membrana celular visualizada por SEM confirma las observaciones indirectas de los estudios con FITC-dextrano descritos en la presente.

[0138] Curiosamente, la exposición de fibroblastos humanos normales (PCS-201) a TTFields no provocó un aumento significativo en el número o tamaño de los poros de la membrana celular, lo que sugiere que el efecto de permeabilidad puede tener cierta especificidad para las células cancerosas. Cualitativamente, en las células U87-MG, se observó una aparición clara de estructuras abultadas con forma de vesículas, debido a una exposición de 24 h a TTFields bajo una alta densidad de siembra. La aparición de estas estructuras es consistente con una mayor permeabilidad en la membrana externa y la inducción de apoptosis y parece haber poca evidencia de un fenotipo apoptótico con una exposición a TTFields de 24 h. Además, las células PCS-201 de alta densidad no mostraron tales cambios con la exposición a TTFields (los datos no se muestran), lo que sugiere nuevamente la especificidad del efecto TTFields para las células cancerosas.

[0140] Aunque el ciclo celular no estaba sincronizado para los experimentos, el tiempo de duplicación de las células U87-MG es de ~48 h y dado que los TTFields ejercen su efecto antiproliferativo máximo en las células en división, esto podría explicar la falta de apoptosis abundante observada después de una exposición a los TTFields durante 24 h. Una interpretación alternativa puede basarse en los informes que indican que la formación de vesículas celular puede conferir resistencia a la lisis celular. Un informe previo en células de glioblastoma no sincronizadas demostró que 72 h de exposición a TTFields indujo la muerte celular con una marcada proporción de células positivas para Anexina V. Utilizando microscopía electrónica de transmisión, estos informes describieron signos de autofagia que incluían autofagosomas, mitocondrias hinchadas y un retículo endoplasmático dilatado. Por el contrario, los resultados utilizados en la presente utilizan SEM para visualizar mejor los efectos de los TTFields específicamente en la membrana de las células plasmáticas.

[0142] El aumento de la permeabilidad de la membrana por TTFields tiene implicaciones clínicas significativas. Utilizando la plataforma de cocultivo de células de GBM humanas colocadas sobre células de fibroblastos humanos normales, se estudió el impacto de los TTFields en la captación de ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) en las células GBM. La exposición a TTFields resultó en una captación de 5-ALA significativamente mayor en las células de GBM en comparación con las células de fibroblastos. En junio de 2017, la Administración de Alimentos y Medicamentos aprobó el 5-ALA para uso clínico en los Estados Unidos para ayudar a los neurocirujanos a delinear el borde entre el tumor y el tejido cerebral normal durante la resección de gliomas. Por lo tanto, el tratamiento previo de pacientes con glioma con TTFields antes de la administración de 5-ALA será útil para mejorar la delimitación del margen tumoral infiltrativo durante la resección del tumor.

[0144] Con respecto a la detección y medición de los efectos de los TTFields en las células cancerosas, la mayoría de los estudios basados en cultivos celulares hasta la fecha se han centrado en el recuento/viabilidad celular como lectura principal. Esto se basa en la idea predominante de que TTFields interfiere con la mitosis de las células tumorales que se dividen rápidamente, lo que provoca la muerte de las células cancerosas. Además, los estudios de modelado computacional de TTFields en cultivos celulares actualmente están impulsados por el recuento celular como resultado principal del modelo.

[0146] La recurrencia de GBM es inevitable y el tiempo medio hasta la primera recurrencia a pesar del tratamiento estándar es de aproximadamente 7 meses. En aplicaciones clínicas de TTFields en pacientes con GBM, los datos sugieren que un mayor cumplimiento y duración del uso de TTFields se correlaciona con una mejor supervivencia. El cumplimiento de TTFields (>75% frente a<75%)fue un predictor independiente de la supervivencia general en el análisis retrospectivo del conjunto de datos completo del ensayo EF-14 y también se encontró que la duración del uso de TTFields afectaba la supervivencia general. En conjunto, estos datos pueden servir como correlatos clínicos de los efectos observados en el contexto experimental de TTFields basados en cultivos celulares. A saber, se observó una correlación entre la duración de la exposición a TTFields y la duración de su efecto sobre la permeabilidad de la membrana celular después del cese de TTFields. Con exposiciones a TTFields de 0,5 a 3 h, la duración del aumento de BLI (en comparación con condiciones sin TTFields) fue de aproximadamente 5 min. Sin embargo, con exposiciones a TTFields de 12 a 25 h, esta diferencia de BLI entre condiciones con TTFields y sin TTFields se prolongó durante más de 20 min. Asimismo, un nuevo análisis de los datos informados por Ram et al. muestra que el porcentaje de aumento en la supervivencia general (en pacientes tratados con TTFields más temozolomida frente a temozolomida sola) saltó de 32% después de 1 año de exposición a TTFields a 551% después de 5 años de exposición a TTFields, respectivamente.

[0148] Los resultados descritos en la presente, es decir, que los campos eléctricos alternos aumentan la permeabilidad de la membrana celular, son distintos de los efectos previamente informados sobre los TTFields. Esto debería tener un impacto significativo en las prácticas quirúrgicas y clínicas actuales en el tratamiento de glioblastomas así como en otros tipos de cáncer.

[0150] En los experimentos in vitro descritos anteriormente, la frecuencia de los campos eléctricos alternos fue de 200 kHz. Pero en realizaciones alternativas, la frecuencia de los campos eléctricos alternos podría ser otra frecuencia, por ejemplo, aproximadamente 200 kHz, entre 50 y 500 kHz, entre 25 kHz y 1 MHz, entre 50 y 190 kHz, entre 25 y 190 kHz o entre 210 y 400 kHz.

[0152] En los experimentos in vitro descritos anteriormente, la intensidad de campo de los campos eléctricos alternos estuvo entre 1 y 4 V/cm RMS. Pero en realizaciones alternativas, se pueden utilizar diferentes intensidades de campo (por ejemplo, entre 0,1 y 10 V/cm).

[0154] En los experimentos in vitro descritos anteriormente, los campos eléctricos alternos se aplicaron durante una variedad de intervalos diferentes que iban de 0,5 horas a 72 horas. Pero en realizaciones alternativas, se puede utilizar una duración diferente (por ejemplo, entre 0,5 horas y 14 días). En algunas realizaciones, la aplicación de los campos eléctricos alternos puede repetirse periódicamente. Por ejemplo, los campos eléctricos alternos pueden aplicarse todos los días durante dos horas.

[0156] En los experimentos in vitro que utilizan el sistema Inovitro™ descritos en la presente, la dirección de los campos eléctricos alternos se cambió en intervalos de un segundo entre dos direcciones perpendiculares. Pero en realizaciones alternativas, la dirección de los campos eléctricos alternos se puede cambiar a una velocidad más rápida (por ejemplo, a intervalos entre 1 y 1000 ms) o a una velocidad más lenta (por ejemplo, a intervalos entre 1 y 100 segundos).

[0158] En los experimentos in vitro que utilizan el sistema Inovitro™ descritos en la presente, la dirección de los campos eléctricos alternos se cambió entre dos direcciones perpendiculares aplicando una tensión de CA a dos pares de electrodos que están dispuestos a 90° de distancia entre sí en el espacio 2D en una secuencia alterna. Pero en realizaciones alternativas, la dirección de los campos eléctricos alternos puede cambiarse entre dos direcciones que no son perpendiculares reposicionando los pares de electrodos, o entre tres o más direcciones (suponiendo que se proporcionen pares de electrodos adicionales). Por ejemplo, la dirección de los campos eléctricos alternos puede cambiarse entre tres direcciones, cada una de las cuales está determinada por la ubicación de su propio par de electrodos. Opcionalmente, estos tres pares de electrodos pueden posicionarse de modo que los campos resultantes estén dispuestos a 90° de distancia entre sí en el espacio 3D. En otras realizaciones alternativas, no es necesario disponer los electrodos en pares. Ver, por ejemplo, el posicionamiento de los electrodos descrito en la Patente de los Estados Unidos 7.565.205. En otras realizaciones alternativas, la dirección del campo permanece constante.

[0160] En los experimentos in vitro utilizando el sistema Inovitro™ descrito en la presente, el campo eléctrico se acopló capacitivamente al cultivo porque el sistema Inovitro™ utiliza electrodos conductores dispuestos en la superficie externa de las paredes laterales de la placa, y el material de cerámica de las paredes laterales actúa como dieléctrico. Pero en realizaciones alternativas, el campo eléctrico podría aplicarse directamente a las células sin acoplamiento capacitivo (por ejemplo, modificando la configuración del sistema Inovitro™ para que los electrodos conductores estén dispuestos en la superficie interna de la pared lateral en lugar de la superficie externa de la pared lateral).

[0162] Los métodos descritos en la presente también pueden aplicarse en el contexto in vivo aplicando los campos eléctricos alternos a una región objetivo del cuerpo de un sujeto vivo, tanto para células de glioblastoma como para otros tipos de células cancerosas. Al imponer el campo eléctrico en la región objetivo, se incrementará la permeabilidad de las membranas celulares de la región objetivo, lo que permitirá que las moléculas que normalmente están bloqueadas o impedidas por la membrana celular puedan atravesar la membrana celular. Esto puede lograrse, por ejemplo, colocando electrodos sobre o debajo de la piel del sujeto de modo que la aplicación de una tensión de CA entre subconjuntos seleccionados de esos electrodos imponga los campos eléctricos alternos en la región objetivo del cuerpo del sujeto.

[0163] Por ejemplo, en situaciones en las que las células relevantes están localizadas en los pulmones del sujeto, un par de electrodos podría colocarse en la parte frontal y trasera del tórax del sujeto, y un segundo par de electrodos podría colocarse en los lados derecho e izquierdo del tórax del sujeto. En algunas realizaciones, los electrodos están acoplados capacitivamente al cuerpo del sujeto (por ejemplo, utilizando electrodos que incluyen una placa conductora y también tienen una capa dieléctrica dispuesta entre la placa conductora y el cuerpo del sujeto). Pero en realizaciones alternativas, la capa dieléctrica puede omitirse, en cuyo caso las placas conductoras entrarían en contacto directo con el cuerpo del sujeto. En otra realización, se podrían insertar electrodos subcutáneamente debajo de la piel del paciente. Un generador de tensión de CA aplica una tensión de CA a una frecuencia seleccionada (por ejemplo, entre 100 y 200 kHz) entre los electrodos derecho e izquierdo durante un primer período de tiempo (por ejemplo, 1 segundo), lo que induce campos eléctricos alternos donde los componentes más significativos de las líneas de campo son paralelos al eje transversal del cuerpo del sujeto. Entonces, el generador de tensión de CA aplica una tensión de CA a una misma frecuencia (o una frecuencia diferente) entre los electrodos delantero y trasero durante un segundo período de tiempo (por ejemplo, 1 segundo), lo que induce campos eléctricos alternos donde los componentes más significativos de las líneas de campo son paralelos al eje sagital del cuerpo del sujeto. Esta secuencia de dos pasos se repite luego durante la duración del tratamiento. Opcionalmente, se pueden incluir sensores térmicos en los electrodos, y el generador de tensión de CA se puede configurar para disminuir la amplitud de las tensiones de CA que se aplican a los electrodos si la temperatura detectada en los electrodos se vuelve demasiado alta. En algunas realizaciones, se pueden agregar uno o más pares de electrodos adicionales e incluirlos en la secuencia. En realizaciones alternativas, solo se utiliza un único par de electrodos, en cuyo caso no se conmuta la dirección de las líneas de campo. Cabe destacar que cualquiera de los parámetros para esta realización in vivo (por ejemplo, frecuencia, intensidad de campo, duración, tasa de cambio de dirección y colocación de los electrodos) se pueden variar como se describió anteriormente en conexión con las realizaciones in vitro. Pero en el contexto in vivo se debe tener cuidado para garantizar que el campo eléctrico permanezca seguro para el sujeto en todo momento.

[0165] Se puede imaginar fácilmente una amplia variedad de aplicaciones para aumentar la permeabilidad de las membranas celulares en el contexto in vivo. En un ejemplo, se puede inducir una mejora localizada de la captación de fármacos por parte de células tumorales aplicando campos eléctricos alternos a la parte del cuerpo relevante durante un período de tiempo (por ejemplo, 12 o 24 horas) antes y durante la administración de quimioterapias u otros agentes antineoplásicos. En otro ejemplo, la captación de fármacos por células tumorales resistentes a múltiples fármacos puede restablecerse aplicando campos eléctricos alternos a la parte del cuerpo relevante durante un período de tiempo (por ejemplo, 12 o 24 horas) antes y durante la administración de quimioterapias u otros agentes antineoplásicos. En otro ejemplo, el desarrollo de metástasis resistentes a múltiples fármacos se puede prevenir aplicando campos eléctricos alternos a regiones que son propensas a las metástasis durante un período de tiempo (por ejemplo, 12 o 24 horas) antes y durante la administración de un fármaco apropiado (independientemente de si el sujeto tiene un tumor primario que está siendo tratado con campos eléctricos alternos).

[0167] La FIG. 10A representa una primera relación adecuada en tiempo entre la aplicación del campo eléctrico alterno y la introducción de la sustancia en la proximidad de la célula cancerosa en el contexto in vitro; o entre la aplicación del campo eléctrico alterno y la administración de la sustancia a un paciente vivo. Con base en los datos descritos anteriormente en conexión con las FIGS. 7A-7D y 8A, y suponiendo que la sustancia se introduce o administra en un tiempo dado t=0, el campo eléctrico alterno puede comenzar después del tiempo dado y continuar durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, 12 horas) mientras la sustancia todavía está disponible en la proximidad de la célula. En esta situación, la permeabilidad comenzará a aumentar después de que comience el campo eléctrico alterno, y este aumento en la permeabilidad permitirá que la sustancia ingrese a las células relevantes. En el contexto de la quimioterapia, esto correspondería a administrar un agente quimioterapéutico a un paciente, seguido de la aplicación de campos eléctricos alternos durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, durante 12 horas).

[0168] Alternativamente, como se muestra en la FIG. 10B, el campo eléctrico alterno puede comenzar antes del tiempo dado (por ejemplo, 1 hora antes de t=0), y continuar durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, hasta 12 horas después de t=0) mientras que la sustancia todavía está disponible en la proximidad de la célula. En esta situación, la permeabilidad de las células relevantes comenzará a aumentar antes de que la sustancia llegue a la proximidad de la célula (o antes de que la sustancia se administre a un paciente vivo). Esto permitirá que la sustancia cruce la membrana celular inmediatamente después de su llegada a la proximidad de la célula. En el contexto de la quimioterapia, esto correspondería a iniciar la aplicación de los campos eléctricos alternos, seguido de la administración del agente quimioterapéutico mientras los campos eléctricos alternos aún están siendo aplicados, y continuar con la aplicación de los campos eléctricos alternos durante un intervalo de tiempo adicional (por ejemplo, hasta 12 horas después del momento en que se administró el agente quimioterapéutico).

[0170] Cabe destacar que los intervalos de tiempo analizados anteriormente en conexión con las FIGS. 10A y 10B pueden ser ininterrumpidos o pueden incluir descansos que sean preferiblemente cortos. Por ejemplo, suponiendo que el intervalo de tiempo es de 12 horas, podría satisfacerse con un único bloque ininterrumpido de 12 horas. Alternativamente, el intervalo de 12 horas podría satisfacerse aplicando los campos eléctricos alternos durante 6 horas, seguido de un descanso de 1 hora, seguido de la aplicación de los campos eléctricos alternos durante 6 horas adicionales (mientras la sustancia aún se encuentra disponible en las proximidades de la célula). Cabe destacar también que en el contexto de las FIGS. 10A y 10B, cuando la sustancia se administra a un paciente vivo, la administración de la sustancia puede realizarse utilizando cualquiera de una variedad de enfoques que incluyen, entre otros, vía intravenosa, oral, subcutánea, intratecal, intraventricular e intraperitoneal.

[0172] La frecuencia óptima, la intensidad del campo y las características de conmutación se pueden determinar experimentalmente para cada combinación de un tipo dado de célula huésped y un tipo dado de sustancia que se va a administrar a través de la membrana celular. En algunas realizaciones preferidas, la frecuencia es menor que 190 kHz (por ejemplo, entre 50 y 190 kHz o entre 25 y 190 kHz. En otras realizaciones preferidas, la frecuencia está entre 210 y 400 kHz.

[0174] Un enfoque existente para tratar tumores (por ejemplo, glioblastoma) es aplicar campos eléctricos alternos a frecuencias entre 50 y 500 kHz, preferiblemente entre 100 y 300 kHz al tumor. Para el glioblastoma, 200 kHz es la frecuencia más preferida. Los campos eléctricos alternos en estas frecuencias se denominan TTFields y se describen en las Patentes de los Estados Unidos 6.868.289 y 7.565.205. Brevemente, esas dos solicitudes describen la interrupción de la división celular durante la mitosis. La eficacia de los TTFields mejora cuando la dirección del campo eléctrico se cambia periódicamente, cuando la intensidad del campo en al menos una parte del tumor es de al menos 1 V/cm y cuando los campos se aplican durante largos períodos de tiempo (por ejemplo, semanas o meses) con la menor cantidad de descansos posible.

[0176] Pueden surgir situaciones en las que sea deseable tratar el tumor con TTFields y también administrar una sustancia a través de las membranas celulares de las células tumorales (por ejemplo, para ayudar a que una cantidad terapéuticamente efectiva de un fármaco de quimioterapia pase las membranas celulares para proporcionar una línea de ataque adicional contra el tumor). En algunas situaciones, puede ser posible utilizar una sola frecuencia de un campo eléctrico alterno para tratar el tumor y aumentar la permeabilidad de las membranas celulares. En otras situaciones, puede ser deseable utilizar campos eléctricos alternos con diferentes frecuencias: una primera frecuencia que se selecciona para proporcionar mejores resultados para aumentar la permeabilidad de las membranas celulares, y una segunda frecuencia que se selecciona para proporcionar mejores resultados para la acción antitumoral de los TTFields.

[0178] Las FIGS. 11A y 11B representan los resultados de dos experimentos in vitro en células de glioblastoma U-87 MG. Más específicamente, la FIG. 11A representa los resultados de un primer experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor nivel de citotoxicidad a las células U-87 MG; y la FIG. 11B representa los resultados de un segundo experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células U-87 MG.

[0180] En el primer experimento, las células U-87 MG fueron sometidas a campos eléctricos alternos con una intensidad de campo de 1,62 V/cm RMS a diferentes frecuencias durante un período de 72 horas a una temperatura ambiente de 18°C. Después de este período de 72 horas, se midió el número de células que estaban presentes en la muestra para cada una de las diferentes frecuencias mediante citometría de flujo. Como se observa en la FIG. 11A, el menor número de células (lo que indica el mayor nivel de citotoxicidad) se observó en la muestra que se sometió a campos eléctricos alternos a 200 kHz.

[0182] En el segundo experimento, se midió la permeabilidad al 7-AAD (un producto químico fluorescente con un peso molecular de 1270,43 g/mol que normalmente no pasa fácilmente a través de las membranas celulares intactas). En este experimento, las células se trataron con un campo eléctrico alterno a diferentes frecuencias con una intensidad de campo de 1,62 V/cm RMS durante un total de 24 horas, a una temperatura ambiente de 18°C y una temperatura de placa de 37°C. Después de las primeras 23,75 horas, se añadió 7-AAD al cultivo y se incubó durante 15 minutos, tiempo durante el cual se continuaron los campos eléctricos alternos (para completar el período de 24 horas). Después de este período de 15 minutos, se finalizó la aplicación del campo eléctrico alterno y las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos más, seguido del análisis de citometría de flujo del porcentaje de células con mayor acumulación de 7-AAD fluorescente para cada una de las diferentes frecuencias. Como se observa en la FIG. 11B, el mayor porcentaje de células con mayor acumulación de 7-AAD (lo que indica el mayor nivel de permeabilidad) se observó en la muestra que se sometió a campos eléctricos alternos a 300 kHz.

[0184] Las FIGS. 12A y 12B representan los resultados de dos experimentos in vitro similares a los descritos anteriormente en conexión con las FIGS. 11A/B, excepto que se utilizaron células de sarcoma uterino MES-SA. Más específicamente, la FIG. 12A representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor nivel de citotoxicidad a las células MES-SA. El menor número de células MES-SA (lo que indica el mayor nivel de citotoxicidad) se observó en la muestra que se sometió a campos eléctricos alternos a 100 kHz. La FIG. 12B representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células MES-SA. El mayor porcentaje de células MES-SA con mayor acumulación de 7-AAD (lo que indica el mayor nivel de permeabilidad) se observó en la muestra que se sometió a campos eléctricos alternos a 150 kHz.

[0185] La FIG. 12C representa los resultados de otro experimento realizado para determinar cómo los campos eléctricos alternos de 150 kHz afectan la permeabilidad de las membranas celulares de las células MES-SA a la doxorrubicina (543,52 g/mol). En este experimento, las células MES-SA se trataron con un campo eléctrico alterno a 150 kHz con una intensidad de campo de 1,62 V/cm RMS durante 24 horas. Después de las primeras 23 horas, se añadió doxorrubicina a una concentración de 10 pM y se incubó durante una hora, tiempo durante el cual se continuaron los campos eléctricos alternos (para completar el período de 24 horas). Luego se midió la acumulación intracelular de doxorrubicina. La acumulación intracelular de doxorrubicina aumentó en más de 2X para la muestra que fue tratada con el campo eléctrico alterno de 150 kHz.

[0187] Las FIGS. 13A y 13B representan los resultados de dos experimentos in vitro similares a los descritos anteriormente en conexión con las FIGS. 11A/B, excepto que se utilizaron células de adenocarcinoma de mama MCF-7. Más específicamente, la FIG. 13A representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor nivel de citotoxicidad a las células MCF-7. El menor número de células MCF-7 (lo que indica el mayor nivel de citotoxicidad) se observó en la muestra que se sometió a campos eléctricos alternos a 200 kHz. La FIG. 13B representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células MCF-7. El mayor porcentaje de células MCF-7 con mayor acumulación de 7-AAD (lo que indica el mayor nivel de permeabilidad) se observó en la muestra que se sometió a campos eléctricos alternos a 150 kHz.

[0189] Los experimentos descritos anteriormente en conexión con las FIGS. 11-13 revelan que la frecuencia óptima para inducir la permeabilidad celular es diferente de la frecuencia óptima para inducir la citotoxicidad. Más específicamente, para el glioblastoma, la primera frecuencia óptima (para inducir la permeabilidad celular) está entre 250 kHz y 350 kHz; y la segunda frecuencia óptima (para inducir la citotoxicidad) está entre 150 kHz y 250 kHz. Para el sarcoma uterino, la primera frecuencia óptima (para inducir la permeabilidad celular) está entre 125 kHz y 175 kHz; y la segunda frecuencia óptima (para inducir la citotoxicidad) está entre 75 kHz y 125 kHz. Y para el adenocarcinoma de mama, la primera frecuencia óptima (para inducir la permeabilidad celular) está entre 75 kHz y 175 kHz; y la segunda frecuencia óptima (para inducir la citotoxicidad) está entre 100 kHz y 300 kHz. Se pueden determinar experimentalmente pares de rangos de frecuencia para otros tipos de cáncer.

[0191] Cuando se utilizan diferentes frecuencias para inducir la permeabilidad celular y e inducir la citotoxicidad, la frecuencia de citotoxicidad se aplica preferiblemente durante el tiempo máximo que el paciente pueda tolerar cómodamente. Preferiblemente, la frecuencia de citotoxicidad se aplica durante al menos una semana. Más preferiblemente, la frecuencia de citotoxicidad se aplica durante muchos meses. Opcionalmente, el intervalo de tiempo durante el cual se aplica la frecuencia de citotoxicidad puede dividirse en una pluralidad de intervalos de tiempo no contiguos que están separados por descansos, donde la pluralidad de intervalos de tiempo no contiguos suman colectivamente al menos una semana. Por el contrario, la frecuencia para inducir permeabilidad se aplica preferiblemente de modo que la permeabilidad sea alta cuando la sustancia relevante se encuentra en la proximidad de las células objetivo (por ejemplo, como se describió anteriormente en conexión con las FIGS. 10A-10B). La aplicación de estas dos frecuencias diferentes se puede lograr utilizando un único generador de tensión de CA que se puede controlar para generar una primera frecuencia para inducir la permeabilidad celular en ciertos momentos y una segunda frecuencia para inducir la citotoxicidad en otros momentos. Se puede utilizar el mismo conjunto de transductores (es decir, electrodos) para aplicar los campos eléctricos alternos en estas dos frecuencias (dependiendo de qué frecuencia aplica el generador de tensión de CA).

[0193] La FIG. 15 es un diagrama de bloques de un aparato que genera una primera frecuencia para inducir la permeabilidad celular y una segunda frecuencia para inducir la citotoxicidad. El aparato incluye un generador de tensión de CA 44 que es similar a la unidad generadora de campo Optune® convencional, pero tiene la capacidad de operar en dos frecuencias diferentes. Cada una de esas frecuencias está entre 50 y 500 kHz. Esta capacidad puede implementarse, por ejemplo, utilizando relés para conmutar un primer conjunto de componentes o un segundo conjunto de componentes en el circuito convencional que genera la tensión de CA y ajustando la frecuencia operativa de un oscilador. El generador de tensión de C<a>44 está configurado para emitir la primera frecuencia o la segunda frecuencia dependiendo del estado de una entrada de control. Cuando la entrada de control está en un primer estado, el generador de tensión de CA 44 emite la primera frecuencia, y cuando la entrada de control está en un segundo estado, el generador de tensión de CA 44 emite la segunda frecuencia. Un controlador 42 está programado para colocar la entrada de control en el segundo estado de modo que el generador de tensión de CA 44 emita la segunda frecuencia. El controlador 42 también está programado para aceptar una solicitud para cambiar a la primera frecuencia. En la realización representada en la FIG. 15, la solicitud llega a través de una interfaz de usuario 40 que puede implementarse utilizando cualquiera de una variedad de enfoques convencionales que incluyen, entre otros, un botón pulsador, una pantalla táctil, etc. En realizaciones alternativas, la solicitud puede llegar a través de RF (por ejemplo, Bluetooth, WiFi, etc.) desde una tableta, teléfono inteligente, etc.

[0195] Al recibir la solicitud, el controlador 42 colocará la entrada de control en el primer estado para que el generador de tensión de CA 44 emita la primera frecuencia durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, al menos 1 hora, al menos 12 horas o al menos 24 horas). Después de transcurrido el intervalo de tiempo, el controlador 42 colocará la entrada de control en el segundo estado para que el generador de tensión de CA 44 vuelva a emitir la segunda frecuencia.

[0197] Opcionalmente, el generador de tensión de CA 44 puede configurarse para emitir una o más frecuencias adicionales (por ejemplo, una tercera frecuencia, una cuarta frecuencia, etc.), dependiendo del estado de la entrada de control. Preferiblemente, cada una de estas frecuencias adicionales se selecciona para inducir citotoxicidad. En estas realizaciones, el controlador 42 está programado para hacer circular la entrada de control a través de los estados que hacen que el generador de tensión de CA 44 emita la segunda frecuencia y una o más frecuencias adicionales antes de que llegue la solicitud. El controlador 42 también está programado para aceptar una solicitud para cambiar a la primera frecuencia. Al recibir la solicitud, el controlador 42 colocará la entrada de control en el primer estado para que el generador de tensión de CA 44 emita la primera frecuencia durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, al menos 1 hora, al menos 12 horas o al menos 24 horas). Después de transcurrido el intervalo de tiempo, el controlador 42 volverá a ciclar la entrada de control a través de los estados que hacen que el generador de tensión de CA 44 emita la segunda frecuencia y una o más frecuencias adicionales.

[0199] El sistema representado en la FIG. 15 es particularmente útil cuando una persona tiene un tumor que está siendo tratado mediante una terapia combinada que incluye TTFields y quimioterapia.

[0201] En esta situación, el sistema funciona la mayor parte del tiempo en la segunda frecuencia para proporcionar el máximo efecto de citotoxicidad. Pero cuando una persona visita una clínica de quimioterapia para recibir una dosis de quimioterapia, el personal sanitario (o el usuario) activa la interfaz de usuario 40 para cambiar el sistema a la primera frecuencia que promueve la permeabilidad. En esta situación, el accionamiento de la interfaz de usuario podría realizarse, por ejemplo, una hora antes del inicio previsto de la quimioterapia, o poco tiempo después del inicio real de la quimioterapia.

[0203] Alternativamente, al recibir la solicitud (por ejemplo, de la interfaz de usuario 40), el controlador 42 puede controlar la entrada de control para que el generador de tensión de CA 44 emita la primera frecuencia durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, 1 hora) y luego alterne entre la segunda frecuencia y la primera frecuencia (por ejemplo, cambiando cada hora). Finalmente (por ejemplo, cuando la sustancia relevante se ha agotado de la corriente sanguínea del paciente), el controlador 42 controla la entrada de control de modo que el generador de tensión de CA 44 vuelve a emitir la segunda frecuencia.

[0205] Un conjunto de electrodos (no se muestran) que son similares a los electrodos convencionales utilizados con Optune® están conectados a la salida del generador de tensión de CA 44.

[0207] La FIG. 14 representa los resultados de otro experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células GBM39/Luc. En este experimento, las células fueron tratadas con un campo eléctrico alterno a diferentes frecuencias en presencia de Dextrano FITC de 4 kDa (que normalmente no pasa fácilmente a través de las membranas celulares intactas) durante 2 días. Como se observa en la FIG. 14, el nivel más alto de fluorescencia de Dextrano-FITC (que indica el nivel más alto de permeabilidad) se observó para la muestra que se sometió a un campo eléctrico alterno a 100 kHz.

[0209] Los datos experimentales descritos en conexión con las FIGS. 11-14 contienen información que es útil para inducir la permeabilidad celular en la máxima medida posible (para permitir que una mayor cantidad de la sustancia relevante cruce la membrana celular) sin tener en cuenta ninguna citotoxicidad que pueda producirse como efecto secundario. En estas situaciones, el campo eléctrico alterno se aplica preferiblemente a una sola frecuencia, seleccionada para inducir el mayor nivel de permeabilidad celular. En algunas situaciones (por ejemplo, GBM39/Luc, sarcoma uterino y adenocarcinoma de mama), esta frecuencia estará entre 50 y 190 kHz; y en otras situaciones (por ejemplo, glioblastoma U-87 MG), esta frecuencia estará entre 210 y 400 kHz.

[0211] Para aquellas sustancias que normalmente pueden atravesar la membrana celular en un grado significativo, las técnicas descritas en la presente para aumentar la permeabilidad de la membrana celular se pueden utilizar para aumentar la cantidad de sustancia que ingresará a la célula. Esto puede mejorar el resultado terapéutico proporcionado por esas sustancias. Ejemplos de esta clase de sustancias descritas anteriormente incluyen bromuro de etidio (tamaño - 394 Da), doxorrubicina (tamaño = 544 Da), Mitoxantrona (tamaño - 445 Da), etc.

[0212] Y, en particular, las técnicas descritas en la presente también se pueden utilizar para permitir que sustancias que normalmente no podrían atravesar la membrana celular en una medida significativa entren en la célula. Los ejemplos de esta clase de sustancias descritas anteriormente incluyen (a) compuestos que tienen al menos 1,2 kDa (por ejemplo, 7-AAD, cuyo tamaño es 1,27 kDa), (b) compuestos que tienen al menos 4 kDa (por ejemplo, Dextrano-FITC de 4 kDa, y (c) compuestos que tienen al menos 20 kDa (por ejemplo, Dextrano-FITC de 20 kDa), (d) material genético que incluye, entre otros, ADN plasmídico superenrollado,<a>R<ní>y constructos de ARNh, (e) sistema de edición del genoma que incluye, entre otros, meganucleasas, nucleasas de dedo de zinc (ZFN), nucleasas basadas en efectores similares a un activador de la transcripción (TALEN) y repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente separadas (CRISPR/Cas9), (f) cualquier forma de anticuerpo que incluye, entre otros, IgG, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, di-scFv, sdAb. Dicho anticuerpo puede estar no conjugado o conjugado con un agente citotóxico, una toxina, un fluoróforo, puntos cuánticos y enzimas, (g) moléculas cargadas, y (h) moléculas pequeñas, entidades terapéuticas, péptidos y proteínas que típicamente no atraviesan la membrana celular o se destruyen durante la endocitosis. Proporcionar la capacidad de que estas sustancias atraviesen la membrana celular, significa que compuestos que anteriormente podrían haber sido rechazados por ser ineficaces en un proceso de selección de compuestos (debido a su incapacidad para atravesar la membrana celular) de repente pueden volverse utilizables a efectos terapéuticos cuando se usan en combinación con un campo eléctrico alterno que mejora la permeabilidad celular.

[0214] Los métodos descritos en la presente también pueden ser útiles más allá del contexto de las células cancerosas. Más específicamente, los métodos descritos en la presente pueden ser útiles para administrar moléculas grandes (que normalmente no pasarían a través de la membrana celular relevante) a través de una membrana celular de ciertas otras células no cancerosas (por ejemplo, células renales, células pulmonares, células hepáticas, células cardíacas, células cerebrales, células musculares, células de la médula ósea, etc.). La administración de dichos fármacos se puede mejorar aplicando campos eléctricos alternos a la parte del cuerpo relevante durante un período de tiempo (por ejemplo, 24 horas) antes y durante la administración de esos fármacos. Los candidatos para dichos fármacos incluyen, entre otros, fármacos antiepilépticos y fármacos psicotrópicos (por ejemplo, olanzapina, 9-OH risperidona y otras variedades de risperidona, etc.).

[0216] En otro ejemplo, puede ser posible lograr una mejora localizada de la captación de fármacos en bacterias aplicando campos eléctricos alternos a la parte relevante del cuerpo durante un período de tiempo (por ejemplo, 24 horas) antes y durante la administración de un antibiótico adecuado. En situaciones en las que una bacteria en particular ha evolucionado para ser resistente a fármacos o resistente a múltiples fármacos (por ejemplo, basándose en un mecanismo de acción que involucra la membrana celular), la aplicación de campos eléctricos alternos puede aumentar la permeabilidad de la membrana celular de la bacteria hasta el punto en que se pueda superar la resistencia. Se pueden utilizar enfoques similares para mejorar la captación de fármacos para combatir la meningitis, la neumonía, la endocarditis infecciosa, etc. Cabe destacar que en el contexto in vivo, los campos eléctricos alternos pueden aplicarse a una región objetivo (por ejemplo, los pulmones) que esté libre de tumores. Alternativamente, los campos eléctricos alternos pueden aplicarse a una región objetivo que contenga un tumor (por ejemplo, un cerebro que incluye un glioblastoma).

[0218] Aunque la presente invención se ha divulgado con referencia a ciertas realizaciones, son posibles numerosas modificaciones, alteraciones y cambios en las realizaciones descritas sin alejarse del alcance de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. En consecuencia, se pretende que la presente invención no se limite a las realizaciones descritas, sino que tenga todo el alcance definido por el lenguaje de las reivindicaciones enumeradas a continuación y sus equivalentes.

[0220] MATERIAL Y MÉTODOS

[0222] Estudios de cultivo celular:Se utilizaron dos líneas de GBM derivadas de pacientes (GBM2, GBM39), una línea celular de GBM humana disponible comercialmente (U87-MG de ATCC, Manassas, VA, EE.UU.), así como una línea celular de astrocitoma murino (KR158B; un obsequio del Dr. Duane Mitchell del Departamento de Neurocirugía de la Facultad de Medicina de la Universidad de Florida). Las líneas celulares de glioblastoma humano U87-MG, humano PCS-201 y murino KR158B se cultivaron en DMEM (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.)/10% FBS/ y 1x antibiótico-antimicótico (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, CA). GBM2 y GBM39 se cultivaron en un medio definido y sin suero cuya composición se ha descrito previamente.

[0224] Siembra de células en cubreobjetos de vidrio para experimentos TTFields:Brevemente, las células en cultivo se tripsinizaron a través de protocolos estándar y se suspendieron entre 10.000-50.000 células individuales en 200 o 75 pL de DMEM/10% FBS/1x antibiótico-antimicótico y luego se sembraron en el centro de un cubreobjetos de vidrio Thermanox™ de 22 mm o 12 mm de diámetro respectivamente (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). Las células se incubaron durante la noche en una incubadora humidificada con 95% de aire/5%de CO<2>a 37°C. Una vez que las células se adhirieron al cubreobjetos, se agregaron 2 ml o 1 ml de DMEM/10% FBS/1x antibiótico-antimicótico por pocillo de placas de 6 pocillos o 12 pocillos, respectivamente. A menos que se indique lo contrario en la sección de Resultados, las células se dejaron crecer en el cubreobjetos durante dos o tres días (para garantizar que las células estuvieran en la fase de crecimiento) antes de transferirlas a placas de cerámica de un aparato in vitro TTFields inovitro™ (Novocure Inc., Haifa, Israel). Las condiciones de crecimiento (es decir, el tiempo que las células pueden crecer en condiciones expuestas a TTFields frente a condiciones no expuestas) se especifican en la sección Resultados o en las leyendas de las figuras correspondientes.

[0226] Aparato de campo para el tratamiento de tumores in vitro: Los cubreobjetos se transfirieron a una placa de cerámica del sistema inovitro™, que a su vez se montó sobre placas base inovitro™ (Novocure Ltd., Haifa, Israel). Se aplicaron campos de tratamiento de tumores a 200 kHz (1-4 V/cm) a través de un generador de energía inovitro™. Las temperaturas ambiente de la incubadora oscilaron entre 20-27 °C con una temperatura objetivo de 37°C en los platos de cerámica tras la aplicación de los TTFields. La duración de la exposición a los TTFields fue de 0,5 a 72 horas, después de lo cual se retiraron los cubreobjetos y se procesaron para los bioensayos apropiados (ver a continuación). Para los experimentos de reversibilidad, los cubreobjetos expuestos a TTFields se transfirieron a una incubadora normal sin exposición a TTFields durante 24 h (período fuera de TTFields para evaluar la reversibilidad del efecto de TTFields en la permeabilidad de la membrana celular) antes del procesamiento para los bioensayos apropiados. Los medios de cultivo se intercambiaron manualmente cada 24 h durante los experimentos para tener en cuenta la evaporación. Se realizaron experimentos de control correspondientes (sin TTFields) colocando cubreobjetos equivalentes dentro de placas de 6 pocillos o 12 pocillos en una incubadora humidificada para cultivo de tejidos convencional (37°C, 95% de aire/5% de CO<2>) y las células se cultivaron en paralelo con los cubreobjetos expuestos a TTFields. A menos que se indique lo contrario, todos los experimentos se realizaron en al menos muestras por triplicado por condición y por punto de tiempo.

[0228] Ensayo de recuento celular mediante hemocitómetro:La preparación de células para el recuento se logró a través de protocolos establecidos y se visualizaron en un microscopio de sobremesa Zeiss PrimoVert (Dublín, CA, EE.UU.). A menos que se indique lo contrario, los recuentos de células se realizaron en suspensiones de células individuales tripsinizadas con un hemocitómetro y se calculó la media de las cuatro mediciones del recuento de células y se redondeó al número entero más cercano.

[0230] Imágenes de bioluminiscencia:Para todo el trabajo de bioluminiscencia, utilizamos GBM2, GBM39 y U87-MG modificados genéticamente mediante los cuales las células de glioblastoma se transfectaron con vectores lentivirales que expresaban luciferasa de luciérnaga (fLuc para GBM39) o una proteína de fusión de GFP y luciferasa de luciérnaga (GFP/fLuc para GBM2 y eGFP-fLuc para U87-MG) o una fusión de proteína de luciferasa de Renilla - fluorescencia roja (RLuc-RL8 para KR158B). Las células se transdujeron utilizando sobrenadantes virales y la expresión de luciferasas se confirmó midiendo la actividad de luciferasa celular (IVIS Spectrum; Perkin Elmer, Waltman, MA) en presencia de D-Luciferina (concentración final de 0,3 mg/mL) para fLuc y coelenterazina (1 pg/mL) para rLuc.

[0232] Microscopía electrónica de barrido (SEM): se depositaron de 5.000 (condición de siembra baja) a 50.000 (condición de siembra alta) células U87-MG/eGFP-fLuc o de fibroblastos PCS-201 en cubreobjetos de vidrio de 13 mm y luego se prepararon para experimentos con TTFields. Las células se cultivaron en condiciones de incubadora estándar para cultivo de tejidos (37°C, 95% de O<2>, 5% de CO<2>). Al final de los experimentos con y sin exposición a TTFields (1 día para condiciones de alta siembra y 3 días para condiciones de baja siembra), los cubreobjetos se procesaron para SEM. Todos los análisis de ROl se realizaron de manera ciega, en los que ni el individuo responsable de la adquisición de imágenes SEM ni el que realizaba los análisis de datos conocían las condiciones experimentales de las muestras. Un tercer individuo tenía posesión de las identidades de muestra.

[0234] Reactivos químicos: A menos que se indique lo contrario, todos los productos químicos se adquirieron en Selleckchem Inc. (Houston, TX, EE.UU.), Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, e E.UU.) o Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). La luciferina de luciérnaga purificada o luciferasa de luciérnaga (SRE0045-2MG), así como el kit de apoptosis de etidio D (11835246001), se adquirieron de Sigma Aldrich Inc (St. Louis, MO). El Dextrano-FITC de pesos moleculares 4, 20 y 50 kDa (FD4, FD20 y FD50) también se adquirió de Sigma Aldrich Inc. El ácido 5-aminolevulínico (5-ALA, A<a>A16942<m>E) y el kit AnnexinaV-APC (50712549) se adquirieron de Thermo-Fisher Scientific Inc (Waltham, MA).

[0236] Análisis estadístico: Se utilizó el software PRISM 7.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE.UU.) para determinar si los datos tenían una distribución normal. Los datos distribuidos normalmente se analizaron con pruebas t de Student de dos vías o con comparaciones de medias mediante análisis de varianza (ANOVA), mientras que los datos distribuidos no normalmente se analizaron con análisis no paramétricos (por ejemplo, comparación de medianas mediante la prueba U de Mann-Whitney). El nivel de significancia estadística se estableció en alfa = 0,05. Se emplearon correcciones post-hoc de Bonferroni o Dunnet para ajustar alfa para múltiples comparaciones. Todos los datos se presentan como rango, media ± desviación estándar, mediana (rango intercuartil) o porcentaje. En todas las figuras, los niveles de diferencias estadísticamente significativas están representados por: *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un agente quimioterapéutico para su administración a través de una membrana celular de una célula cancerosa en el cuerpo de un sujeto para su uso en un método de tratamiento del cáncer, comprendiendo el método:

aplicar un campo eléctrico alterno a una frecuencia entre 50 kHz y 500 kHz a la célula durante un período de tiempo de al menos 12 horas, en donde la aplicación del campo eléctrico alterno aumenta la permeabilidad de la membrana celular; e

introducir el agente quimioterapéutico en la proximidad de la célula, en donde la mayor permeabilidad de la membrana celular permite que el agente quimioterapéutico cruce la membrana celular.

2. En combinación, un agente quimioterapéutico para su administración a través de las membranas celulares de las células cancerosas en el cuerpo de un sujeto y un aparato de control de la permeabilidad de la membrana celular para facilitar la administración del agente quimioterapéutico cuando se administra a través de las membranas celulares, comprendiendo el aparato:

un generador de tensión de CA (44) configurado para inducir un campo eléctrico alterno a una frecuencia entre 50 kHz y 500 kHz en el cuerpo del sujeto durante un intervalo de tiempo de al menos 12 horas.

3. La combinación de la reivindicación 2, que comprende además:

un conjunto de electrodos configurados para su fijación al cuerpo del sujeto; y un cableado que conecta una salida del generador de tensión de CA (44) al conjunto de electrodos.

4. El agente quimioterapéutico para su uso de la reivindicación 1 o la combinación de la reivindicación 2, en donde la frecuencia está entre 250 kHz y 350 kHz, opcionalmente entre 50 kHz y 190 kHz, opcionalmente entre 75 kHz y 175 kHz u opcionalmente entre 125 kHz y 175 kHz.

5. El agente quimioterapéutico para su uso de la reivindicación 1 o la combinación de la reivindicación 2, en donde el campo eléctrico alterno tiene una intensidad de campo de al menos 1 V/cm RMS, y opcionalmente entre 1 V/cm RMS y 4 V/cm RMS.

6. El agente quimioterapéutico para su uso de la reivindicación 1 o la combinación de la reivindicación 2, en donde la célula es una célula de glioblastoma, una célula de sarcoma uterino o una célula de adenocarcinoma de mama.

7. El agente quimioterapéutico para su uso de la reivindicación 1 o la combinación de la reivindicación 2, en donde el intervalo de tiempo es de al menos 24 horas.

8. El agente quimioterapéutico para su uso de la reivindicación 1 o la combinación de la reivindicación 2, en donde el intervalo de tiempo es ininterrumpido o en donde el intervalo de tiempo está interrumpido por descansos.

9. El agente quimioterapéutico para su uso de la reivindicación 1 o la combinación de la reivindicación 2, en donde el agente quimioterapéutico tiene un peso molecular de al menos 1,2 kDa, al menos 4 kDa o al menos 20 kDa.

10. El agente quimioterapéutico para su uso de la reivindicación 1 o la combinación de la reivindicación 2, en donde el agente quimioterapéutico es Lomustina, la célula cancerosa es una célula de glioblastoma.

11. El agente quimioterapéutico para su uso de la reivindicación 1 o la combinación de la reivindicación 2, en donde el agente quimioterapéutico es Temozolomida, la célula cancerosa es una célula de glioblastoma GBM39.

12. El agente quimioterapéutico para su uso de la reivindicación 1 o la combinación de la reivindicación 2, en donde el agente quimioterapéutico es Irinotecán, la célula cancerosa es una célula de glioblastoma GBM39.

13. El agente quimioterapéutico para su uso de la reivindicación 1 o la combinación de la reivindicación 2, en donde el agente quimioterapéutico es Doxorrubicina, la célula cancerosa es una célula de melanoma humano MDA- MB-235 o MDA-MB-435.

14. El agente quimioterapéutico para su uso de la reivindicación 1 o la combinación de la reivindicación 2, en donde el agente quimioterapéutico es Mitoxantrona, la célula cancerosa es una célula de adenocarcinoma de mama MCF-7.