ES3044232T3 - Isotachophoresis for purification of nucleic acids - Google Patents

Isotachophoresis for purification of nucleic acids

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ES3044232T3
ES3044232T3 ES21161195T ES21161195T ES3044232T3 ES 3044232 T3 ES3044232 T3 ES 3044232T3 ES 21161195 T ES21161195 T ES 21161195T ES 21161195 T ES21161195 T ES 21161195T ES 3044232 T3 ES3044232 T3 ES 3044232T3
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Amy Hiddessen
Nathan P Hoverter
Klint A Rose
Juan Santiago
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Abstract

La presente divulgación se refiere a sistemas y dispositivos fluídicos para el procesamiento, la extracción o la purificación de uno o más analitos. Estos sistemas y dispositivos pueden utilizarse para procesar muestras y extraer ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante isotacoforesis. En particular, los sistemas y métodos relacionados permiten la extracción de ácidos nucleicos, incluidos los no reticulados, de muestras como tejidos o células. Los sistemas y dispositivos también pueden utilizarse para el procesamiento de muestras en paralelo multiplex. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0003] Isotacoforesis para la purificación de ácidos nucleicos
[0005] Antecedentes
[0007] Las muestras fijadas en formalina y embebidas en parafina (FFPE) han sido recolectadas, preparadas, almacenadas y archivadas en grandes bancos de tejidos durante más de un siglo. En el 2008, había más de 400 millones de muestras FFPE almacenadas en biobancos de todo el mundo, y este número va en aumento. Estas muestras a menudo van acompañadas de información clínica tal como el diagnóstico primario, el régimen terapéutico y los datos de seguimiento, lo que las convierte en un recurso importante para el desarrollo de terapias y el descubrimiento de biomarcadores del genoma y el transcriptoma.
[0009] Los métodos de preparación de muestras para extraer y purificar ácidos nucleicos de muestras FFPE siguen siendo manualmente intensivos y laboriosos. Los enfoques para la extracción y purificación de FFPE varían ampliamente, pero a menudo incluyen etapas de eliminación de parafina difíciles de automatizar y difíciles de acelerar, centrifugación, intercambios de tampones, control de temperatura, reducción de entrecruzamiento y tratamiento enzimático. La FFPE generalmente se refiere al entrecruzamiento de proteínas en una muestra que utilizan formalina y que embeben la muestra en parafina (cera). El tratamiento de FFPE de una muestra a menudo permite que la muestra se conserve a lo largo del tiempo y puede ser especialmente útil para el almacenamiento a largo plazo. Las proteínas entrecruzadas se pueden unir al ADN y al ARN de la muestra, lo que generalmente la hace inutilizable para aplicaciones posteriores tales como la amplificación, preparación de bibliotecas o secuenciación.
[0011] La eliminación de enlaces cruzados de parafina y proteínas en muestras FFPE puede ser un proceso desafiante. El desparafinado se realiza tradicionalmente utilizando xilenos altamente inflamables. Alternativamente o en serie, la muestra se puede tratar con otros solventes, aceite mineral y química alcalina y/o a temperatura elevada. Después del desparafinado, las proteínas de la muestra se pueden tratar con diferentes agentes o someter a condiciones que pueden requerir tiempo y esfuerzo adicionales.
[0013] Al final de la digestión y la desnaturalización, puede quedar una mezcla de ácidos nucleicos entrecruzados y no entrecruzados. La eliminación del material no entrecruzado puede ser importante para obtener resultados de alta calidad de ensayos tales como la amplificación o secuenciación; en algunos casos, si la fracción de material no entrecruzado es demasiado baja, es posible que el ensayo posterior no funcione, lo que resulta en una pérdida no solo de la muestra en sí misma, sino también de mano de obra, tiempo y recursos. El documento WO 2008/124064 A1 describe el uso de la isotacoforesis para purificar ácidos nucleicos. Rogacs A e t al, en J. Chromatography A, vol 1335, pp 105-120, 2014, describen el uso de la isotacoforesis para purificar ácidos nucleicos. El documento US 2015/191717 A1 describe dispositivos y métodos para preparar ácidos nucleicos a partir de una muestra al llevar a cabo la isotacoforesis.
[0015] Resumen
[0017] La invención proporciona un método para el enriquecimiento de ácidos nucleicos como se define en la reivindicación 1. La invención también proporciona un sistema como se define en la reivindicación 11. Las características adicionales se definen por las reivindicaciones dependientes. La isotacoforesis (ITP) es una técnica electroforética que puede utilizar un tampón discontinuo que contiene un electrolito líder (LE) con una magnitud de movilidad efectiva más alta y un electrolito de cola (TE) con una magnitud de movilidad efectiva más baja (por ejemplo, en relación con el LE) para enfocar especies de muestra que tienen una magnitud de movilidad efectiva mayor que el electrolito de cola pero una magnitud de movilidad efectiva más baja que el electrolito líder. La ITP puede enfocar selectivamente los ácidos nucleicos de las muestras más de 10,000 veces en menos de cinco minutos. La presente divulgación proporciona métodos y dispositivos que emplean y automatizan la ITP para la preparación de muestras, que incluyen la extracción, purificación, enriquecimiento y cuantificación altamente sensible, y es particularmente útil para preparar y purificar ácidos nucleicos a partir de muestras FFPE y otras muestras biológicas.
[0019] La preparación de muestras es importante para el análisis genómico, sin embargo, sigue siendo una fuente primaria de variabilidad en el análisis y puede requerir un trabajo manual significativo. La presente divulgación incluye técnicas y dispositivos para abordar este desafío, tales como el uso de isotacoforesis en chip (ITP) para la extracción y purificación de ácidos nucleicos. Estas técnicas incluyen métodos para enriquecer (concentrar) ácidos nucleicos no entrecruzados para permitir un mayor rendimiento y una preparación de muestras de ácido nucleico de mayor calidad y producir muestras más utilizables (por ejemplo, menos rechazos de control de calidad) a partir de FFPE y otras muestras conservadas o frescas.
[0021] La presente divulgación incluye técnicas y dispositivos para la automatización de la preparación de muestras de ácido nucleico a partir de muestras, que incluyen tejido sólido, tejido sólido lisado, muestras de tejido preservado o fijo (por ejemplo, FFPE), sangre completa, plasma y suero, hisopos bucales, manchas de sangre seca y otras muestras forenses, tejidos frescos o frescos congelados (FF), tejido de biopsia, tejido de órganos, tejido de órganos sólidos, muestras que comprenden conexiones (por ejemplo, uniones gap, uniones estrechas, uniones adherentes) entre células, células cultivadas o recolectadas de sangre o tejidos, heces y fluidos corporales (por ejemplo, saliva, orina), o cualquier combinación de los mismos. Las muestras pueden incluir ácidos nucleicos celulares y libres de células, tanto para organismos eucariotas como procariotas, o cualquier combinación de los mismos. Las técnicas de la presente divulgación, en comparación con los enfoques existentes, pueden ser más rápidas, menos intensivas manualmente, más adecuadas para cantidades iniciales pequeñas y grandes de tejido, y pueden lograr un mayor rendimiento de las muestras y análisis de mayor calidad de las muestras.
[0023] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un método para la purificación de muestras, que comprende: (a) cargar en un dispositivo fluídico (i) una muestra de tejido que comprende tejido sólido lisado, en la que dicho tejido sólido lisado comprende ácidos nucleicos y un contaminante, (ii) un tampón de electrolito de cola que comprende primeros iones de electrolito de cola con una movilidad efectiva que tiene una magnitud menor que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos ácidos nucleicos, y (iii) un tampón de electrolito líder que comprende primeros iones de electrolito líder, con una segunda movilidad efectiva, en los que dicha segunda movilidad efectiva tiene una magnitud mayor que dicha magnitud de dicha movilidad efectiva de dichos ácidos nucleicos; y (b) aplicar un campo eléctrico dentro de dicho dispositivo fluídico para llevar a cabo isotacoforesis con dichos primeros iones de electrolito de cola, dichos ácidos nucleicos, y dichos primeros iones de electrolito líder, purificando de esta manera dichos ácidos nucleicos de dicho contaminante en dicha muestra de tejido.
[0025] Dicha movilidad efectiva de dichos primeros iones de electrolito de cola pueden tener una magnitud mayor que una magnitud de una movilidad efectiva de dicho contaminante. Dicho dispositivo fluídico puede ser un chip microfluídico y dicha muestra de tejido, dicho tampón de electrolito de cola y dicho tampón de electrolito líder se puede cargar en una primera zona de dicho chip microfluídico. El método puede comprender además, en dicha primera zona de dicho chip microfluídico, llevar a cabo en dicha muestra de tejido al menos un procedimiento de preparación de muestra seleccionado del grupo que consiste en (1) eliminar el material embebido, (2) interrumpir el tejido, (3) lisar las células, (4) desentrecruzar dichos ácidos nucleicos, (5) digerir las proteínas, y (6) digerir dichos ácidos nucleicos. Dicha isotacoforesis se puede llevar a cabo en una segunda zona de dicho chip microfluídico, en el que dicha segunda zona se separa de y se conecta de forma fluídica a dicha primera zona. Dicho tejido sólido se puede derivar de un órgano sólido. Dicho tejido sólido lisado puede comprender un fijador químico. Dicho fijador químico puede ser formalina. Dicho tejido sólido puede ser tejido fijado en formalina y embebido en parafina (FFPE). Dicho tejido sólido lisado puede comprender urea o tiourea. El método puede comprender además interrumpir las uniones célula-célula, matriz extracelular, o tejido conjuntivo para obtener dicho tejido sólido lisado. Dicho tejido sólido lisado puede comprender partículas sólidas. Dichos ácidos nucleicos pueden comprender dispersar o solvatar ácidos nucleicos. Dicho contaminante se puede seleccionar del grupo que consiste en ácidos nucleicos entrecruzados, material embebido, restos de tejido, productos químicos de fijación, proteínas, inhibidores, y combinaciones de los mismos. Dicho contaminante puede comprender ácidos nucleicos entrecruzados. Dicha muestra de tejido se puede combinar con dicho tampón de electrolito de cola antes de dicha carga. Dicha muestra de tejido se puede combinar con dicho tampón de electrolito líder antes de dicha carga. Dicha carga de dicho tampón de electrolito líder se puede llevar a cabo antes de dicha carga de dicha muestra de tejido. Dicho tejido sólido se puede lisar en dicho tampón de electrolito líder antes de dicha carga de dicha muestra de tejido. Dicho tejido sólido se puede lisar en dicho tampón de electrolito de cola antes de dicha carga de dicha muestra de tejido. Dicho procedimiento de preparación de muestra puede comprender, antes de dicha aplicación de dicho campo eléctrico, eliminar el material embebido al incubar dicha muestra de tejido en dicho dispositivo fluídico a una temperatura de al menos aproximadamente 37 °C por una duración de al menos aproximadamente 1 minuto. Dicha temperatura puede ser desde aproximadamente 40 °C hasta aproximadamente 80 °C. Dicha duración puede ser desde aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 120 minutos. Dicho procedimiento de preparación de muestra puede comprender interrumpir el tejido o lisar las células al aplicar la tensión mecánica a dicha muestra de tejido. Dicho procedimiento de preparación de muestra puede comprender interrumpir el tejido o lisar las células al aplicar calor a dicha muestra de tejido. Dicho calor de aplicación puede resultar en una temperatura de dicha muestra de tejido desde aproximadamente 30 °C hasta aproximadamente 80 °C. Dicho procedimiento de preparación de muestra puede comprender interrumpir el tejido o lisar las células al poner en contacto dicha muestra de tejido con una solución con pH de al menos 10 o al digerir de forma proteolítica dicha muestra de tejido. Dicha digestión proteolítica se puede llevar a cabo a una temperatura mayor que aproximadamente 25 °C. Dicho procedimiento de preparación de muestra puede comprender interrumpir el tejido o lisar las células al aplicar al menos un tensioactivo a dicha muestra de tejido. Dicho procedimiento de preparación de muestra puede comprender interrumpir el tejido o lisar las células al aplicar una solución que comprende urea a dicha muestra de tejido o célula. Dicha solución puede comprender además tiourea. Una concentración de dicha urea en dicha solución puede estar dentro de un rango desde aproximadamente 4 M hasta aproximadamente 9 M y una concentración de dicha tiourea en dicha solución está en un rango desde aproximadamente 0.5 M a aproximadamente 3.5 M. Una concentración de dicha urea en dicha solución puede ser desde aproximadamente 6.5 M hasta aproximadamente 7.5 M y una concentración de dicha tiourea en dicha solución puede ser desde aproximadamente 1.5 M hasta aproximadamente 2.5 M. Dicho procedimiento de preparación de muestra puede comprender desentrecruzar dichos ácidos nucleicos al digerir las proteínas de entrecruzamiento con la proteinasa K. Dicho procedimiento de preparación de muestra puede comprender digerir dichos ácidos nucleicos con DNasa o RNasa. El método puede comprender además eluir una solución de salida que comprende dichos ácidos nucleicos purificados desde un depósito de salida de dicho dispositivo fluídico. Una concentración de dichos ácidos nucleicos purificados en dicha solución de salida puede ser al menos aproximadamente dos veces mayor que una concentración de dichos ácidos nucleicos en dicha muestra de tejido. Dicha muestra de tejido y dichos ácidos nucleicos purificados en dicha solución de salida puede comprender ácidos nucleicos entrecruzados y una concentración de dichos ácidos nucleicos entrecruzados en dicha solución de salida puede ser al menos aproximadamente dos veces menor que una concentración de dichos ácidos nucleicos entrecruzados en dicha muestra de tejido. Dicho contaminante puede estar presente en dicha solución de salida a una concentración que es al menos dos veces menor que una concentración de dicho contaminante en dicha muestra de tejido. Dichos primeros iones de electrolito de cola pueden comprender ácido caproico. Dichos primeros iones de electrolito líder pueden comprender cloruro. Dicho tampón de electrolito de cola puede comprender segundos iones de electrolito de cola que tienen una movilidad efectiva diferente de dichos primeros iones de electrolito de cola. Dichos segundos iones de electrolito de cola pueden comprender HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico) o MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico). Dichos segundos iones de electrolito de cola pueden comprender HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico) y dichos primeros iones de electrolito de cola comprenden ácido caproico. Dichos segundos iones de electrolito de cola pueden comprender MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico) y dichos primeros iones de electrolito de cola pueden comprender ácido caproico. Dichos segundos iones de electrolito de cola pueden comprender HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico) y dichos primeros iones de electrolito de cola pueden comprender MOPS. Dicho tampón de electrolito de cola puede comprender segundos iones de electrolito de cola con una segunda movilidad efectiva, en los que dicha segunda movilidad efectiva tiene una magnitud aproximadamente igual o menor que dicha magnitud de dicha movilidad efectiva de dicho contaminante. Dicha muestra de tejido cargada en dicho dispositivo fluídico puede tener un volumen de al menos 50 pl. El método puede comprender además, en dicha primera zona de dicho chip microfluídico, llevar a cabo en dicha muestra de tejido un primer procedimiento de procesamiento de muestras, y en una segunda zona de dicho chip microfluídico, llevar a cabo en dicha muestra de tejido una reacción enzimática. Dicho primer procedimiento de procesamiento de muestras pueden comprender la eliminación del material embebido, interrupción del tejido, o lisis celular, y dicha reacción enzimática comprende desentrecruzar dichos ácidos nucleicos, digerir las proteínas, o digerir ácidos nucleicos. Dicha primera zona y dicha segunda zona cada una se puede calentar a una temperatura por encima de 37 °C. Dicha primera zona se puede calentar a una temperatura de aproximadamente 60 °C a 100 °C durante dicho primer procedimiento de procesamiento de muestras y en el que dicha segunda zona se puede calentar a una temperatura de 40 °C a 60 °C.
[0027] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un método para purificar de forma simultánea los ácidos nucleicos de al menos dos muestras diferentes que comprenden: (a) cargar en un primer canal de un chip microfluídico (i) una primera muestra que comprende primeros ácidos nucleicos y un primer contaminante, (ii) un primer tampón de electrolito de cola que comprende primeros iones de cola, en los que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos primeros iones de cola es menor que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos primeros ácidos nucleicos, y (iii) un primer tampón de electrolito líder que comprende primeros iones líderes, en los que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos primeros iones líderes es mayor que dicha magnitud de dicha movilidad efectiva de dichos primeros ácidos nucleicos; (b) cargar en un segundo canal de dicho chip microfluídico (i) una segunda muestra que comprende segundos ácidos nucleicos y un segundo contaminante, (ii) un segundo tampón de electrolito de cola que comprende segundos iones de cola, en los que una magnitud de dichos segundos iones de cola es menor que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos segundos ácidos nucleicos, y (iii) un segundo tampón de electrolito líder comprende segundos iones líderes, en los que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos segundos iones líderes es mayor que dicha magnitud de dicha movilidad efectiva de dichos segundos ácidos nucleicos; y (c) aplicar un primer campo eléctrico dentro de dicho chip microfluídico para llevar a cabo isotacoforesis en dicho primer canal con dichos primeros iones de cola, dichos primeros ácidos nucleicos, y dichos primeros iones líderes, y aplicar un segundo campo eléctrico para llevar a cabo isotacoforesis en dicho segundo canal con dichos segundos iones de cola, dichos segundos ácidos nucleicos, y dichos segundos iones líderes, purificando de esta manera de forma simultánea dichos primeros ácidos nucleicos de dicho primer contaminante y dichos segundos ácidos nucleicos de dicho segundo contaminante.
[0029] Dicha primera muestra y dicha segunda muestra pueden ser de diferentes tipos de muestra. Dichos primeros ácidos nucleicos y dichos segundos ácidos nucleicos pueden ser de diferentes tipos o longitudes de ácidos nucleicos. Dicho primer tampón de electrolito de cola o dicho primer tampón de electrolito líder puede comprender además un agente de lisis o un agente de interrupción de tejido. Dicho agente de lisis o dicho agente de interrupción de tejido puede comprender uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en una solución con pH mayor que aproximadamente 12, una proteinasa, urea, tiourea, y un tensioactivo. Dicha primera muestra puede comprender tejido sólido lisado. Dicha segunda muestra puede comprender células lisadas. Dicha primera muestra puede no contactar dicha segunda muestra durante dicha conducción de isotacoforesis. El método puede comprender además cargar en un tercer canal de dicho chip microfluídico (i) una tercera muestra que comprende terceros ácidos nucleicos y un tercer contaminante, (ii) un tercer tampón de electrolito de cola que comprende terceros iones de cola, en los que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos terceros iones de cola es menor que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos terceros ácidos nucleicos, y (iii) un tercer tampón de electrolito líder que comprende terceros iones líderes, en los que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos terceros iones líderes es mayor que dicha magnitud de dicha movilidad efectiva de dichos terceros ácidos nucleicos, en los que dicho campo eléctrico se aplica dentro de dicho chip microfluídico para llevar a cabo dicha isotacoforesis en dicho tercer canal con dichos terceros iones de cola, dichos terceros ácidos nucleicos, y dichos terceros iones líderes, purificando de esta manera de forma simultánea dichos primeros ácidos nucleicos de dicho primer contaminante, dichos segundos ácidos nucleicos de dicho segundo contaminante y dichos terceros ácidos nucleicos de dicho tercer contaminante. Dicho primer y segundo campos eléctricos se pueden generar de un único par de electrodos. Dicho primer y segundo campos eléctricos se pueden generar de diferentes pares de electrodos. Dicho primer y segundo canales se pueden acoplar a los sensores independientes. La retroalimentación de dichos sensores independientes se pueden utilizar para controlar independientemente dicho primer y segundo campos eléctricos. Dichos sensores independientes pueden detectar voltaje y se puede utilizar dicha retroalimentación para controlar la corriente (o resistencia) dentro de dicho primer y segundo canales. Dichos ácidos nucleicos pueden comprender ADN. Dichos ácidos nucleicos pueden comprender ARN.
[0031] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un método para la purificación de muestras, que comprende: (a) cargar en un dispositivo fluídico (i) una muestra que comprende células fijas, tejido fijo, o tejido embebido, en la que dicha muestra comprende ácidos nucleicos, (ii) un tampón de electrolito de cola que comprende electrolitos de cola, en el que dichos electrolitos de cola tienen una movilidad efectiva menor que dichos ácidos nucleicos, y (iii) un tampón de electrolito líder que comprende electrolitos líderes, en el que dichos electrolitos líderes tienen una movilidad efectiva mayor que dichos ácidos nucleicos; y (b) aplicar un campo eléctrico sobre dicho dispositivo fluídico para llevar a cabo isotacoforesis con dichos electrolitos de cola, dichos ácidos nucleicos, y dichos electrolitos líderes, purificando de esta manera dichos ácidos nucleicos de un contaminante en dicha muestra.
[0033] Dicho contaminante se puede seleccionar del grupo que consiste en ácidos nucleicos entrecruzados, material embebido, productos químicos de fijación, enzimas, e inhibidores. Dicha muestra puede comprender dichas células fijas, dicho tejido fijo, o tanto dichas células fijas como dicho tejido fijo. Dicha muestra se puede fijar en formalina. Dicha muestra puede comprender dicho tejido embebido. Dicha muestra puede comprender dicho tejido embebido en parafina. Dicha muestra puede ser una muestra de tejido fijada en formalina y embebida en parafina (FFPE). Dicha muestra puede comprender una biopsia de tejido. Dicha muestra puede ser una muestra fijada en formalina y embebida en parafina (FFPE) diseccionada. El método puede comprender además comparar una característica de dichos ácidos nucleicos con ácidos nucleicos de otras muestras, en las que dicha característica es un nivel de expresión, una secuencia de ácidos nucleicos, un peso molecular, integridad del ácido nucleico, cadena de ácidos nucleicos (por ejemplo de cadena doble versus sencilla), o pureza del ácido nucleico. Dicha muestra puede ser una muestra de tumor. Dicho tampón de electrolito de cola puede tener un pH de mayor de aproximadamente 7. El método puede comprender además, antes de dicha aplicación de dicho campo eléctrico, incubar dicha muestra de tejido en dicho dispositivo fluídico a una temperatura de al menos aproximadamente 37 °C por una duración de al menos aproximadamente 1 minuto. Dicha temperatura puede ser desde aproximadamente 40 °C hasta aproximadamente 80 °C. Dicha duración puede ser desde aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 120 minutos. Dicho tampón de electrolito líder puede comprender proteinasa K. El método puede comprender además eliminar enlaces cruzados de proteínas de dichos ácidos nucleicos utilizando dicha proteinasa K. El método puede comprender además, después de dicha aplicación de dicho campo eléctrico, eliminar enlaces cruzados de proteínas de dichos ácidos nucleicos utilizando calor. El método puede comprender además eluir una solución de salida que comprende dichos ácidos nucleicos purificados desde un depósito de salida de dicho dispositivo fluídico. Una concentración de dichos ácidos nucleicos purificados en dicha solución de salida puede ser al menos aproximadamente dos veces mayor que una concentración de dichos ácidos nucleicos en dicha muestra de tejido. Una concentración de dichos ácidos nucleicos entrecruzados en dicha solución de salida puede ser al menos aproximadamente dos veces menor que una concentración de dichos ácidos nucleicos entrecruzados en dicha muestra de tejido. Dicha solución de salida puede tener un volumen igual a o menor que aproximadamente 50 pL. Dicha muestra de tejido puede tener una masa de al menos aproximadamente 1 ng. Dicha muestra de tejido puede tener un volumen mayor que 25 pL. Dichos electrolitos de cola puede tener una movilidad efectiva mayor que dicho contaminante. Dichos electrolitos de cola pueden comprender (i) primeros iones, en los que dichos primeros iones tienen una magnitud de movilidad efectiva mayor que dicho contaminante, y (ii) segundos iones, en los que dichos segundos iones tienen una magnitud de movilidad efectiva aproximadamente igual o menor que dicho contaminante. Dicha isotacoforesis conductora puede neutralizar un pH de dicha muestra de tejido a aproximadamente 7.5. El método puede comprender además, antes de dicha carga, llevar a cabo el desparafinado en dicha muestra. El método puede comprender además detectar una concentración de dichos ácidos nucleicos. Dicha concentración puede ser menor que o igual a aproximadamente 1 picogramo por microlitro (pg/pL).
[0035] Un aspecto de la presente divulgación proporciona un método para el enriquecimiento de ácidos nucleicos, que comprende: (a) cargar en un dispositivo fluídico (i) una muestra que comprende ácidos nucleicos, (ii) un tampón de electrolito de cola, dicho tampón de electrolito de cola que comprende iones de electrolito de cola con una primera movilidad efectiva, en la que dicha primera movilidad efectiva tiene una magnitud menor que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos ácidos nucleicos, (iii) un primer tampón de electrolito líder en un primer depósito de electrolitos líderes, dicho primer tampón de electrolito líder comprende primeros iones de electrolito líder con una segunda movilidad efectiva, en el que dicha segunda movilidad efectiva tiene una magnitud mayor que dicha magnitud de dicha movilidad efectiva de dichos ácidos nucleicos, y (iv) un segundo tampón de electrolito líder en un segundo depósito de electrolito líder, dicho segundo tampón de electrolito líder comprende segundos iones del electrolito líder con una tercera movilidad efectiva, en la que dicha tercera movilidad efectiva tiene una magnitud mayor que dicha magnitud de dicha movilidad efectiva de dichos ácidos nucleicos, en los que dicho primer tampón de electrolito líder es diferente de dicho segundo tampón de electrolito líder y dicho primer tampón de electrolito líder tiene una fuerza iónica mayor que una fuerza iónica de dicho segundo tampón de electrolito líder; (b) primera isotacoforesis conductora con dichos iones de electrolito de cola, dichos ácidos nucleicos, y dichos primeros iones de electrolito líder al aplicar un primer campo eléctrico dentro de dicho dispositivo fluídico con un primer circuito eléctrico, enriqueciendo de esta manera dichos ácidos nucleicos de contaminantes en dicha muestra; y (c) segunda isotacoforesis conductora con dichos iones de electrolito de cola, dichos ácidos nucleicos, y dichos segundos iones del electrolito líder, al aplicar un segundo campo eléctrico dentro de dicho dispositivo fluídico con un segundo circuito eléctrico, en el que dicho primer circuito eléctrico es diferente de dicho segundo circuito eléctrico.
[0037] En algunas realizaciones de los aspectos proporcionados en el presente documento, dicha segunda isotacoforesis conductora comprende cambiar una corriente aplicada desde un primer canal hasta un segundo canal. En algunas realizaciones de los aspectos proporcionados en el presente documento, dichos primeros iones de electrolito líder son los mismos que dichos segundos iones del electrolito líder, y en los que una concentración de dichos primeros iones de electrolito líder en dicho primer tampón de electrolito líder es diferente de una concentración de dichos segundos iones del electrolito líder en dicho segundo tampón de electrolito líder. En algunas realizaciones de los aspectos proporcionados en el presente documento, dicha segunda movilidad efectiva tiene una magnitud mayor que dicha magnitud de dicha tercera movilidad efectiva. En algunas realizaciones de los aspectos proporcionados en el presente documento, dichos primeros iones de electrolito líder son diferentes de dichos segundos iones del electrolito líder. En algunas realizaciones de los aspectos proporcionados en el presente documento, dichos primeros iones de electrolito líder son los mismos que dichos segundos iones del electrolito líder, y en los que una concentración de dichos primeros iones de electrolito líder en dicho primer tampón de electrolito líder es la misma que una concentración de dichos segundos iones del electrolito líder en dicho segundo tampón de electrolito líder, y en el que dicho primer tampón de electrolito líder comprende terceros iones de electrolito líder. En algunas realizaciones de los aspectos proporcionados en el presente documento, dichos primeros iones de electrolito líder son los mismos que dichos segundos iones del electrolito líder, y en los que una concentración de dichos primeros iones de electrolito líder en dicho primer tampón de electrolito líder es la misma que una concentración de dichos segundos iones del electrolito líder en dicho segundo tampón de electrolito líder, y en los que dicho segundo tampón de electrolito líder comprende terceros iones de electrolito líder. Algunas realizaciones de los aspectos proporcionadas en el presente documento comprenden además recolectar dichos ácidos nucleicos en dicho segundo depósito de electrolito líder y eliminar dichos ácidos nucleicos de dicho segundo depósito de electrolito líder. En algunas realizaciones de los aspectos proporcionados en el presente documento, la concentración de dichos segundos iones del electrolito líder en dicho segundo tampón de electrolito líder es menor que 50 mM. En algunas realizaciones de los aspectos proporcionados en el presente documento, dicho segundo tampón de electrolito líder comprende Tris HCl 50 mM.
[0039] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un microdispositivo fluídico que comprende: (a) una primera región de isotacoforesis en un chip microfluídico que comprende: (i) un primer depósito de muestras en comunicación fluida con un primer canal fluídico, (ii) un primer depósito de tampón en comunicación fluida con dicho primer canal fluídico, y (iii) un segundo depósito de tampón en comunicación fluida con dicho primer canal; y (b) una segunda región de isotacoforesis en dicho chip microfluídico que comprende: (i) un segundo depósito de muestras en comunicación fluida con un segundo canal fluídico, (ii) un tercer depósito de tampón en comunicación fluida con dicho segundo canal fluídico, y (iii) un cuarto depósito de tampón en comunicación fluida con dicho segundo canal, en el que dicha primera región de isotacoforesis no está en comunicación fluida con dicha segunda región de isotacoforesis y en la que dicho microdispositivo fluídico se configura para controlar independientemente un primer circuito eléctrico que aplica corriente a dicha primera región de isotacoforesis y un segundo circuito eléctrico que aplica corriente a dicha segunda región de isotacoforesis.
[0041] Una tasa de fuga entre dicha primera y segunda regiones de isotacoforesis puede ser menor que 1 pl por hora. La fuga de corriente entre dicha primera y segunda regiones de isotacoforesis puede ser menor que 1 pA. Una impedancia puede ser mayor que 1 megaOhm. Dicho primer canal fluídico puede contener un volumen de líquido mayor que 100 pl. Dicho primer canal fluídico se puede separar de dicho segundo canal fluídico por una distancia que es al menos 5 veces menor que un ancho de dicho primer canal. Dicho microdispositivo fluídico se puede configurar para controlar dicho primer circuito eléctrico de forma simultánea con dicho segundo circuito eléctrico. El microdispositivo fluídico puede comprender además un depósito de elución en comunicación fluida con dicho primer canal, en el que un sensor de temperatura se sitúa dentro 5 mm de dicho depósito de elución.
[0043] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un método que comprende: (a) proporcionar un dispositivo fluídico electrocinético que comprende un depósito de entrada de muestra en comunicación fluida con un canal; (b) cargar un volumen de muestra en dicho depósito de entrada de muestra; (c) mover al menos 50 % de dicho volumen de muestra desde dicho depósito de entrada de muestra hasta dicho canal, sin agregar volumen adicional a dicho depósito de entrada de muestra; y (d) aplicar una corriente iónica a través de dicho canal.
[0045] Dicho movimiento se puede llevar a cabo con ayuda de la gravedad. Dicha corriente iónica no puede pasar sustancialmente a través de dicho canal. Dicho al menos 50 % de dicho volumen de muestra puede comprender al menos 80 % de dicho volumen de muestra. Dicho volumen de muestra puede comprender ácidos nucleicos. Dicho volumen de muestra puede comprender una muestra de tejido o una muestra fijada en formalina y embebida en parafina (FFPE). Dicha aplicación de una corriente iónica puede comprender isotacoforesis conductora. Un volumen de muestra total cargado en dicho depósito de entrada de muestra puede ser menor que o igual a un volumen interno de dicho depósito de entrada. Dicho depósito de entrada de muestra puede comprender una región superior conectada a una región inferior a través de una región cónica, en la que dicha región superior tiene un primer diámetro y dicha región inferior tiene un segundo diámetro, en el que dicho primer diámetro es al menos dos veces más largo que dicho segundo diámetro con el fin de facilitar dicho movimiento al menos 50 % de dicho volumen de muestra desde dicho depósito de entrada de muestra hasta dicho canal. Dicho volumen de muestra puede ser al menos 25 pl. Dicho volumen de muestra puede ser al menos 50 pl. Dicho volumen de muestra puede ser al menos 100 pl.
[0047] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un chip microfluídico que comprende: un primer depósito de entrada de muestra, en el que dicho primer depósito de entrada de muestra comprende una región superior conectada a una región inferior a través de una región cónica, en la que dicha región superior tiene un primer diámetro hidráulico interior y dicha región inferior tiene un segundo diámetro hidráulico interior, en el que dicho primer diámetro hidráulico interior es al menos 2 veces más largo que dicho segundo diámetro hidráulico interior y en el que dicho primer depósito de entrada de muestra está en comunicación fluida con un primer canal; un primer depósito de tampón en comunicación fluida con dicho primer canal, en el que dicho primer depósito de muestras se configura de tal manera que una superficie libre de un líquido en dicho primer depósito de muestras tiene una diferencia insignificante en la altura del cabezal del amortiguador con respecto a un líquido en dicho primer depósito de tampón; y un segundo depósito de tampón en comunicación fluida con dicho primer canal.
[0049] Dicho primer diámetro hidráulico interior puede tener un rango de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 15 mm. Dicho segundo diámetro hidráulico interior puede tener un rango de aproximadamente 0.5 mm a aproximadamente 5 mm. Dicho primer depósito de muestras se puede configurar para contener un volumen de muestra de al menos 100 pl. Dicho chip microfluídico se puede configurar para mover al menos 50 % de dicho volumen de muestra desde dicho primer depósito de muestras hasta dicho primer canal cuando se aplica un vacío al mismo. Dicho chip microfluídico se puede configurar para llevar a cabo isotacoforesis en una muestra que ingresa a dicho primer canal.
[0051] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un método para extraer ácidos nucleicos, que comprende: (a) exponer una muestra biológica que comprende células o tejido a una solución que comprende urea o tiourea, lisando de esta manera dichas células o tejidos dentro de dicha muestra biológica y produciendo un lisado celular; b) introducir dicho lisado celular en un dispositivo; y (c) realizar isotacoforesis con dicho dispositivo con el fin de aislar ácidos nucleicos de dicho lisado celular.
[0053] El método puede comprender además digerir dicha muestra con la proteinasa K. Dicha solución puede comprender urea y tiourea. Dicha solución puede comprender una relación de urea a tiourea de aproximadamente 2 a 1. Una concentración de dicha urea en dicha solución puede ser desde aproximadamente 4 M hasta aproximadamente 9 M y una concentración de dicha tiourea en dicha solución puede ser desde aproximadamente 0.5 M hasta aproximadamente 3.5 M. Una concentración de dicha urea en dicha solución puede ser desde aproximadamente 6.5 M hasta aproximadamente 7.5 M y una concentración de dicha tiourea en dicha solución puede ser desde aproximadamente 1.5 M hasta aproximadamente 2.5 M. Dicha solución puede comprender iones de electrolito de cola o iones de electrolito líder o ambos iones de electrolito de cola e iones de electrolito líder.
[0055] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un método para purificar ácidos nucleicos de alto peso molecular de una muestra de tejido, que comprende: (a) cargar en un dispositivo fluídico: (i) una muestra celular que comprende ADN genómico y un contaminante, en la que dicha muestra celular se pone en contacto con un tampón de lisis antes de o después de dicha carga de dicha muestra celular en dicho dispositivo fluídico, (ii) un tampón de electrolito de cola, dicho tampón de electrolito de cola que comprende iones de electrolito de cola con una primera movilidad efectiva, en la que dicha primera movilidad efectiva tiene una magnitud menor que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos ácidos nucleicos de alto peso molecular y una magnitud mayor que una magnitud de dicho contaminante, y (iii) un primer tampón de electrolito líder, dicho primer tampón de electrolito líder que comprende primeros iones de electrolito líder con una segunda movilidad efectiva, en el que dicha segunda movilidad efectiva tiene una magnitud mayor que dicha magnitud de dicha movilidad efectiva de dichos ácidos nucleicos de alto peso molecular; (b) llevar a cabo isotacoforesis con dichos iones de electrolito de cola, dichos ácidos nucleicos de alto peso molecular, y dichos primeros iones de electrolito líder, separando de esta manera dichos ácidos nucleicos de alto peso molecular de dicho contaminante y enriqueciendo dichos ácidos nucleicos de alto peso molecular en una zona de isotacoforesis; y (c) eluir dicho ADN genómico en una solución en un depósito de salida, en el que más del 50 % de la masa de ácidos nucleicos dentro de dicha solución es mayor que 30 kilobases.
[0057] Dicho tampón de lisis puede no comprender un tampón alcalino. Dicho tampón de lisis puede comprender etoxilato de octilfenol. Más del 50 % de la masa de ácidos nucleicos dentro de dicha solución puede ser mayor de 50 kilobases.
[0059] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un método de isotacoforesis conductora, que comprende: (a) proporcionar un dispositivo fluídico que comprende un primer canal en comunicación fluida con un depósito de entrada de muestra que comprende una muestra de tejido que comprende tejido sólido lisado, un primer depósito de tampón que comprende un primer tampón de electrolito líder, y un segundo depósito de tampón que comprende un tampón de electrolito de cola; (b) poner en contacto un primer electrodo con dicho primer tampón de electrolito líder en dicho primer depósito de tampón; (c) poner en contacto un segundo electrodo con dicho tampón de electrolito de cola en dicho depósito de tampón; y (d) aplicar un campo eléctrico dentro de dicho dispositivo fluídico para llevar a cabo isotacoforesis, en el que dicha isotacoforesis ocurre sin contacto directo entre dicha muestra de tejido y dicho primer y segundo electrodos.
[0061] Dicho dispositivo fluídico puede comprender además un tercer depósito de tampón en comunicación fluida con dicho primer canal y dicho primer depósito de tampón, dicho tercer depósito de tampón comprende una concentración más baja de dicho primer tampón de electrolito líder que dicho primer depósito de tampón. Dicho tercer depósito de tampón y dicho primer depósito de tampón se pueden conectar por un segundo canal que comprende una o más barreras capilares para limitar el flujo impulsado por presión dentro de dicho segundo canal y entre dicho tercer depósito de tampón y dicho primer depósito de tampón. Dicho dispositivo fluídico puede comprender además un depósito de elución. Dicho depósito de elución puede estar en comunicación fluida con un cuarto depósito de tampón.
[0063] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un sistema microfluídico, dicho sistema microfluídico comprende: (a) un chip microfluídico que comprende un primer canal y un primer depósito en comunicación fluida con dicho primer canal, en el que dicho primer canal y dicho primer depósito cumplen una primera unión; y (b) un miembro mecánico que comprende un primer diente, en el que dicho miembro mecánico se configura para aplicar presión mecánica a dicho primer canal a través de dicho primer diente con el fin de cerrar al menos parcialmente dicho primer canal por deformación plástica de al menos una pared de dicho primer canal y aumentar la resistencia del fluido entre dicho primer canal y dicho primer depósito.
[0065] Dicho chip microfluídico puede comprender además un segundo depósito en comunicación fluida con dicho primer depósito y un segundo canal que conecta dicho primer depósito y dicho segundo depósito, y en el que dicho miembro mecánico comprende además un segundo diente configurado para aplicar presión mecánica a dicho segundo canal con el fin de cerrar plásticamente dicho segundo canal y evitar la comunicación fluida entre dicho primer depósito y dicho segundo depósito. Dicho primer diente se puede configurar para suministrar presión mecánica a dicha primera unión con el fin de cerrar dicho primer canal por deformación plástica de al menos una pared de dicho primer canal. Dicho primer diente se puede configurar para calentar dicho primer canal. Dicho miembro mecánico puede comprender un material con un módulo de Young de elasticidad mayor que un módulo de Young de elasticidad de dicho primer canal. Dicho sistema microfluídico se puede configurar para realizar isotacoforesis. Dicho primer diente se puede acoplar de forma térmica a un elemento de calentamiento. Dicho primer diente se puede calentar a una temperatura mayor que la temperatura de transición vítrea de dicha al menos una pared de dicho primer canal. El sistema microfluídico puede comprender un método para completar un proceso en un sistema fluídico que comprende utilizar dicho sistema microfluídico para al menos cerrar parcialmente dicho primer canal mediante deformación plástica, aumentando de esta manera la resistencia al flujo de fluido entre dicho primer canal y dicho primer depósito. Dicho primer diente de dicho miembro mecánico puede aplicar una fuerza de al menos 0.25 lbs a dicho primer canal. Dicho proceso en dicho sistema fluídico puede ser isotacoforesis.
[0067] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un método para realizar isotacoforesis en una muestra que comprende ácidos nucleicos que comprende: (a) cargar dicha muestra que comprende ácidos nucleicos en un primer depósito de un chip microfluídico; (b) cargar un tampón de electrolito de cola en un segundo depósito de dicho chip microfluídico, en el que dicho tampón de electrolito de cola comprende primeros iones de electrolito de cola con una movilidad efectiva que tiene una magnitud menor que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos ácidos nucleicos; (c) cargar un tampón de electrolito líder en un tercer depósito de dicho chip microfluídico, en el que dicho tercer depósito comprende primeros iones de electrolito líder con una segunda movilidad efectiva, en el que dicha segunda movilidad efectiva tiene una magnitud mayor que dicha magnitud de dicha movilidad efectiva de dichos ácidos nucleicos; (d) aplicar un campo eléctrico dentro de dicho chip microfluídico para llevar a cabo isotacoforesis con dichos primeros iones de electrolito de cola, dichos ácidos nucleicos, y dichos primeros iones de electrolito líder, confinando de esta manera dichos ácidos nucleicos, o una porción de los mismos, a una zona de isotacoforesis; y (e) utilizar un sensor de temperatura para detectar un cambio de temperatura en o cerca de dicha zona de isotacoforesis, en la que la retroalimentación de dicho sensor de temperatura se utiliza para controlar dicho campo eléctrico.
[0069] Dicho control de dicho campo eléctrico puede resultar en el posicionamiento de dichos ácidos nucleicos, o porción de los mismos, en un depósito de elución o región de dicho chip microfluídico. Dicho sensor de temperatura se puede ubicar dentro de máximo 8 mm de dicho depósito de elución. Dicho cambio de temperatura puede estar dentro de un rango de aproximadamente 0.2 °C a 5 °C. dicho campo eléctrico aplicado puede causar que dicho electrolito líder y dicho electrolito de cola se cumple en una interfaz de isotacoforesis y dicha sensor de temperatura detecta dicha interfaz de isotacoforesis.
[0071] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un microdispositivo fluídico que comprende: (a) una primera región de isotacoforesis en un chip microfluídico que comprende: (i) un primer depósito de muestras en comunicación fluida con un primer canal fluídico; (ii) un primer, un segundo, y un tercer depósito de tampón en comunicación fluida con dicho primer canal fluídico, en el que dicho primer y segundo depósitos de tampón se separan por una barrera capilar; y (iii) un depósito de elución en comunicación fluida con dicho primer canal fluídico; (b) un sensor configurado para detectar un cambio de temperatura en dicho primer canal fluídico dentro de dicha primera región de isotacoforesis; y (c) un aparato colocado para suministrar corriente eléctrica dentro de dicho primer canal dentro de dicha primera región de isotacoforesis.
[0073] El dispositivo microfluídico puede comprender además un controlador configurado para activar una reducción o eliminación de dicha corriente eléctrica cuando dicho sensor recibe una señal térmica. Dicho cambio de temperatura puede ser un aumento de la temperatura dentro de un rango de aproximadamente 0.2 °C a 5 °C. Dicho dispositivo microfluídico se puede configurar aún más para aislar una muestra de ácidos nucleicos en dicho depósito de elución después de que dicho sensor detecte un cambio de temperatura. Dicha detección de dichos ácidos nucleicos se puede realizar con un sensor ubicado a un máximo de 8 mm de dicho depósito de elución. Dicho primer canal comprende un único sensor.
[0075] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un método para la purificación de muestras, que comprende: (a) cargar en un dispositivo fluídico (i) una muestra de tejido que comprende ácidos nucleicos y un contaminante, en el que dicha muestra de tejido no es una muestra de sangre completa sin lisar, (ii) un tampón de electrolito de cola que comprende iones de electrolito de cola con una movilidad efectiva que tiene una magnitud mayor que una magnitud de una movilidad efectiva de dicho contaminante y menor que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos ácidos nucleicos, y (iii) un tampón de electrolito líder que comprende iones de electrolito líder, con una segunda movilidad efectiva, en los que dicha segunda movilidad efectiva tiene una magnitud mayor que dicha magnitud de dicha movilidad efectiva de dichos ácidos nucleicos; y (b) aplicar un campo eléctrico dentro de dicho dispositivo fluídico para llevar a cabo isotacoforesis con dichos iones de electrolito de cola, dichos ácidos nucleicos, y dichos iones de electrolito líder, purificando de esta manera dichos ácidos nucleicos de dicho contaminante en dicha muestra de tejido.
[0077] Dicha muestra de tejido puede no ser una muestra de sangre completa. Dichos iones de electrolito de cola pueden comprender ácido caproico. Dichos iones de electrolito líder pueden comprender cloruro. Dicho tampón de electrolito de cola puede comprender segundos iones de electrolito de cola que tienen una movilidad efectiva diferente de dichos primeros iones de electrolito de cola. Dichos segundos iones de electrolito de cola pueden comprender HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico). Dichos segundos iones de electrolito de cola pueden comprender MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico). Dichos segundos iones de electrolito de cola pueden comprender HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico) y primeros iones de electrolito de cola pueden estar comprendidos de ácido caproico. Dichos segundos iones de electrolito de cola pueden comprender MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico) y primeros iones de electrolito de cola están comprendidos de ácido caproico. Dichos segundos iones de electrolito de cola pueden comprender HEPES y los primeros iones de electrolito de cola pueden comprender MOPS. Dicho tampón de electrolito de cola puede comprender segundos iones de electrolito de cola con una segunda movilidad efectiva, en los que dicha segunda movilidad efectiva tiene una magnitud aproximadamente igual o menor que dicha magnitud de dicha movilidad efectiva de dicho contaminante. Dicho contaminante se puede seleccionar del grupo que consiste en ácidos nucleicos entrecruzados, material embebido, productos químicos de fijación, proteínas, inhibidores, y combinaciones de los mismos. Dicho contaminante puede comprender ácidos nucleicos entrecruzados. Dicha muestra de tejido se puede combinar con dicho tampón de electrolito de cola antes de dicha carga. Dicha muestra de tejido se puede combinar con dicho tampón de electrolito líder antes de dicha carga. Dicha carga de dicho tampón de electrolito líder se puede llevar a cabo antes de dicha carga de dicha muestra de tejido. El método puede comprender además eluir una solución de salida que comprende dichos ácidos nucleicos purificados desde un depósito de salida de dicho dispositivo fluídico. Una concentración de dichos ácidos nucleicos purificados en dicha solución de salida puede ser al menos aproximadamente dos veces mayor que una concentración de dichos ácidos nucleicos en dicha muestra de tejido. Una concentración de dichos ácidos nucleicos entrecruzados en dicha solución de salida puede ser al menos aproximadamente dos veces menor que una concentración de dichos ácidos nucleicos entrecruzados en dicha muestra de tejido. Dicha solución de salida puede no comprender dicho contaminante. Dicha muestra de tejido puede ser tejido fresco. Dicha muestra de tejido puede ser tejido congelado fresco (FF). Dicha muestra de tejido puede ser tejido fijado en formalina y embebido en parafina (FFPE). El método puede comprender además, antes de dicha carga, lisar o interrumpir dicha muestra de tejido. Dicho lisado o interrupción se puede llevar a cabo utilizado urea o tiourea.
[0079] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un método para la purificación de muestras, que comprende: (a) cargar en un primer canal en un dispositivo fluídico (i) una primera muestra de tejido que comprende primeros ácidos nucleicos y un primer contaminante, (ii) un primer tampón de electrolito de cola que comprende primeros iones de cola, en los que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos primeros iones de cola es menor que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos primeros ácidos nucleicos, y (iii) un primer tampón de electrolito líder que comprende primeros iones líderes, en los que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos primeros iones líderes es mayor que dicha magnitud de dicha movilidad efectiva de dichos primeros ácidos nucleicos; (b) cargar en un segundo canal en dicho dispositivo fluídico (iv) una segunda muestra de tejido que comprende segundos ácidos nucleicos y un segundo contaminante, (v) un segundo tampón de electrolito de cola que comprende segundos iones de cola, en los que una magnitud de dichos segundos iones de cola es menor que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos segundos ácidos nucleicos, y (vi) un segundo tampón de electrolito líder que comprende segundos iones líderes, en los que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos segundos iones líderes es mayor que dicha magnitud de dicha movilidad efectiva de dichos segundos ácidos nucleicos; y (c) aplicar un campo eléctrico dentro de dicho dispositivo fluídico para llevar a cabo isotacoforesis en dicho primer canal con dichos primeros iones de cola, dichos primeros ácidos nucleicos, y dichos primeros iones líderes, y para llevar a cabo isotacoforesis en dicho segundo canal con dichos segundos iones de cola, dichos segundos ácidos nucleicos, y dichos segundos iones líderes, purificando de esta manera dichos primeros ácidos nucleicos de dicho primer contaminante y purificando dichos segundos ácidos nucleicos de dicho segundo contaminante.
[0081] Dicho primer tampón de electrolito de cola o dicho primer tampón de electrolito líder puede comprender además un agente de lisis o un agente de interrupción de tejido. Dicho segundo tampón de electrolito de cola o dicho segundo tampón de electrolito líder puede comprender además un agente de lisis o un agente de interrupción de tejido. Dicho agente de lisis o dicho agente de interrupción de tejido puede comprender uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en una solución con pH mayor de aproximadamente 12, una proteinasa, urea, tiourea, y un tensioactivo.
[0083] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un método para la purificación de muestras, que comprende: (a) cargar en una primera zona de un dispositivo fluídico (i) una muestra de tejido que comprende ácidos nucleicos y un contaminante, (ii) un tampón de electrolito de cola que comprende iones de cola, en los que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos iones de cola es menor que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos ácidos nucleicos, y (iii) un tampón de electrolito líder que comprende iones líderes, en los que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos iones líderes es mayor que dicha magnitud de dicha movilidad efectiva de dichos ácidos nucleicos; y (b) aplicar un campo eléctrico en dicho dispositivo fluídico para llevar a cabo isotacoforesis en una segunda zona de dicho dispositivo fluídico con dichos iones de cola, dichos ácidos nucleicos, y dichos iones líderes, purificando de esta manera dichos ácidos nucleicos de dicho contaminante, en el que durante dicha aplicación, dicha primera zona se mantiene a una primera temperatura y dicha segunda zona se mantiene a una segunda temperatura diferente de dicha primera temperatura.
[0085] Dicho tampón de electrolito de cola o dicho tampón de electrolito líder puede comprender además un agente de lisis o un agente de interrupción de tejido. Dicho agente de lisis o dicho agente de interrupción de tejido puede comprender uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en una solución con pH mayor que aproximadamente 12, una proteinasa, urea, tiourea, y un tensioactivo. Dicha primera temperatura puede estar entre aproximadamente 4 ° C y aproximadamente 40 °C. Dicha primera temperatura puede estar entre aproximadamente 40 °C y aproximadamente 80 °C.
[0087] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un método para la purificación de muestras, que comprende: (a) cargar en una primera zona de un dispositivo fluídico (i) una muestra de tejido que comprende ácidos nucleicos, (ii) un tampón de electrolito de cola que comprende iones de cola, en los que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos iones de cola es menor que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos ácidos nucleicos, y (iii) un tampón de electrolito líder que comprende iones líderes, en los que una magnitud de una movilidad efectiva de dichos iones líderes es mayor que dicha magnitud de dicha movilidad efectiva de dichos ácidos nucleicos; (b) en dicha primera zona, llevar a cabo en dicha muestra de tejido al menos una preparación de muestra seleccionada del grupo que consiste en (1) eliminar el material embebido, (2) interrumpir el tejido, (3) lisar las células, (4) desentrecruzar ácidos nucleicos, (5) digerir las proteínas y (6) digerir ácidos nucleicos; y (c) aplicar un campo eléctrico dentro de dicho dispositivo fluídico para llevar a cabo isotacoforesis en una segunda zona de dicho dispositivo fluídico con dichos iones de cola, dichos ácidos nucleicos, y dichos iones líderes, purificando de esta manera dichos ácidos nucleicos de un contaminante en dicha muestra de tejido.
[0089] Dicha eliminación del material embebido o dicho lisado de las células puede comprender, antes de dicha aplicación de dicho campo eléctrico, incubar dicha muestra de tejido en dicho dispositivo fluídico a una temperatura de al menos aproximadamente 37 °C por una duración de al menos aproximadamente 1 minuto. Dicha temperatura puede ser desde aproximadamente 40 °C hasta aproximadamente 80 °C. Dicha duración puede ser desde aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 60 minutos. Dicha interrupción del tejido o dicho lisado de las células pueden comprender aplicar la tensión mecánica a dicha muestra. Dicha interrupción del tejido o dicho lisado de las células pueden comprender aplicar calor a dicha muestra. Dicho calor de aplicación puede resultar en una temperatura de dicha muestra de tejido desde aproximadamente 30 °C hasta aproximadamente 65 °C. Dicha interrupción del tejido o dicho lisado de las células pueden comprender un pH de solución de al menos 12. Dicha interrupción del tejido o dicho lisado de las células pueden comprender digestión proteolítica. Dicha digestión proteolítica se puede llevar a cabo a una temperatura mayor que aproximadamente 25 °C. Dicha temperatura puede ser desde aproximadamente 30 °C a aproximadamente 65 °C. Dicha interrupción del tejido o dicho lisado de las células pueden comprender aplicar al menos un tensioactivo a dicho tejido o dichas células. Dicha interrupción del tejido o dicho lisado de las células pueden comprender aplicar una solución que comprende urea a dicho tejido o dichas células. Dicha solución puede comprender además tiourea. Una concentración de dicha urea en dicha solución puede ser desde aproximadamente 4 M hasta aproximadamente 9 M y una concentración de dicha tiourea en dicha solución puede ser desde aproximadamente 0.5 M hasta aproximadamente 3.5 M. Una concentración de dicha urea en dicha solución puede ser desde aproximadamente 6.5 M hasta aproximadamente 7.5 M y una concentración de dicha tiourea en dicha solución puede ser desde aproximadamente 1.5 M hasta aproximadamente 2.5 M. Dicho desentrecruzamiento de ácidos nucleicos pueden comprender digerir proteínas de entrecruzamiento con la proteinasa K. Dicha digestión de ácidos nucleicos se puede realizar con DNasa o RNasa.
[0091] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un método para la purificación de muestras, que comprende: (a) cargar sobre un dispositivo fluídico (i) una muestra de tejido que comprende ácidos nucleicos, en los que se embebe o fija dicha muestra de tejido, (ii) un tampón de electrolito de cola que comprende electrolitos de cola, en el que dichos electrolitos de cola tienen una movilidad efectiva menor que dichos ácidos nucleicos, y (iii) un tampón de electrolito líder que comprende electrolitos líderes, en el que dichos electrolitos líderes tienen una movilidad efectiva mayor que dichos ácidos nucleicos; y (b) aplicar un campo eléctrico en dicho dispositivo fluídico para llevar a cabo isotacoforesis con dichos electrolitos de cola, dichos ácidos nucleicos, y dichos electrolitos líderes, purificando de esta manera dichos ácidos nucleicos de un contaminante en dicha muestra de tejido.
[0093] Dicho contaminante se puede seleccionar del grupo que consiste en ácidos nucleicos entrecruzados, material embebido, productos químicos de fijación, enzimas, e inhibidores. Dicho material embebido puede comprender parafina. Dicha muestra de tejido se fija en formalina. Dicha muestra de tejido se puede embeber y fijar. Dicha muestra de tejido puede ser una muestra de tejido fijada en formalina y embebida en parafina (FFPE). Dicha muestra de tejido puede ser una muestra de tejido diseccionada. Dicha muestra de tejido diseccionada puede ser una muestra FFPE diseccionada. El método puede comprender además la etapa de comparar una característica de dichos ácidos nucleicos con ácidos nucleicos de otras muestras. Dicha característica puede ser un nivel de expresión. Dicha característica puede ser una secuencia de ácidos nucleicos. Dicha característica puede ser un peso molecular. Dicha característica puede ser una integridad del ácido nucleico. Dicha característica puede ser una pureza del ácido nucleico. El método puede comprender además una etapa de administrar un fármaco basado en dicha característica de dichos ácidos nucleicos. Dicha muestra de tejido puede ser una muestra de tumor. Dicho tampón de electrolito de cola puede tener un pH de aproximadamente 7. Dicho tampón de electrolito de cola puede tener un pH mayor que aproximadamente 7. El método puede comprender además, antes de dicha aplicación de dicho campo eléctrico, incubar dicha muestra de tejido en dicho dispositivo fluídico a una temperatura de al menos aproximadamente 37 °C por una duración de al menos aproximadamente 1 minuto. Dicha temperatura puede ser desde aproximadamente 40 °C hasta aproximadamente 80 °C. Dicha duración puede ser desde aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 60 minutos. Dicho tampón de electrolito líder puede comprender proteinasa K. El método puede comprender además eliminar enlaces cruzados de proteínas de dichos ácidos nucleicos utilizando dicha proteinasa K. El método puede comprender además, después de dicha aplicación de dicho campo eléctrico, eliminar enlaces cruzados de proteínas de dichos ácidos nucleicos utilizando calor. El método puede comprender además eluir una solución de salida que comprende dichos ácidos nucleicos purificados desde un depósito de salida de dicho dispositivo fluídico. Una concentración de dichos ácidos nucleicos purificados en dicha solución de salida puede ser al menos aproximadamente dos veces mayor que una concentración de dichos ácidos nucleicos en dicha muestra de tejido. Una concentración de dichos ácidos nucleicos entrecruzados en dicha solución de salida puede ser al menos aproximadamente dos veces menor que una concentración de dichos ácidos nucleicos entrecruzados en dicha muestra de tejido. Dicha solución de salida puede no comprender dicho contaminante. Dicha solución de salida puede tener un volumen igual a o menor que aproximadamente 50 pL. Dicha muestra de tejido puede tener una masa de al menos aproximadamente 1 ng. Dicha muestra de tejido puede tener un volumen de menor que aproximadamente 500 pL. Dichos electrolitos de cola puede tener una movilidad efectiva mayor que dicho contaminante. Dichos electrolitos de cola pueden comprender (i) primeros iones, en los que dichos primeros iones tienen una magnitud de movilidad efectiva mayor que dicho contaminante, y (ii) segundos iones, en los que dichos segundos iones tienen una magnitud de movilidad efectiva aproximadamente igual o menor que dicho contaminante. Dicha isotacoforesis conductora puede neutralizar un pH de dicha muestra de tejido a aproximadamente 7. El método puede comprender además, antes de dicha carga, llevar a cabo el desparafinado en dicha muestra de tejido. Dicha muestra de tejido puede ser una muestra fijada en formalina y embebida en parafina (FFPE) histórica, que comprende además comparar una característica de dichos ácidos nucleicos con una característica de diferentes ácidos nucleicos de una muestra de tejido diferente. El método puede comprender además una etapa de detectar una concentración de dichos ácidos nucleicos. Dicha concentración puede ser menor que o igual a aproximadamente 1 picogramo por microlitro (pg/pL). Dicha concentración puede ser menor que o igual a aproximadamente 0.5 pg/pL. Dicha concentración puede ser al menos aproximadamente 1 picogramo por microlitro (pg/pL).
[0095] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un dispositivo fluídico, que comprende: una región de purificación de muestra, que comprende: (a) una primera zona; (b) una entrada de muestra ubicada en dicha primera zona; (c) un depósito de electrolitos de cola en comunicación fluida con dicha primera zona; (d) una segunda zona en comunicación fluida con dicha primera zona; (e) un depósito de electrolitos líderes en comunicación fluida con dicha segunda zona; (f) una salida de muestra en comunicación fluida con dicha segunda zona; (g) un primer calentador en comunicación térmica con dicha primera zona; y (h) un segundo calentador configurado para transferir calor a dicha segunda zona, en la que dicha primera zona se aísla sustancialmente de forma térmica desde dicha segunda zona.
[0097] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un dispositivo fluídico, que comprende: una región de purificación de muestra, que comprende: (a) una primera zona; (b) una entrada de muestra ubicada en dicha primera zona; (c) un depósito de electrolitos de cola en comunicación fluida con dicha primera zona; (d) una segunda zona en comunicación fluida con dicha primera zona; (e) un depósito de electrolitos líderes en comunicación fluida con dicha segunda zona; (f) una salida de muestra en comunicación fluida con dicha segunda zona; y (g) un calentador en comunicación térmica con dicha primera zona y dicha segunda zona.
[0099] El dispositivo puede comprender además una segunda región de purificación de muestras. Dicha primera zona puede ser una zona de desparafinado. Dicha primera zona puede ser una zona de interrupción. Dicha segunda zona puede ser una zona de isotacoforesis. Dicha primera zona o dicha segunda zona tiene un ancho de menor que aproximadamente 1 mm. Dicha primera zona o dicha segunda zona puede tener un ancho menor que aproximadamente 0.5 mm.
[0101] Los ejemplos no abarcados por la redacción de las reivindicaciones pero útiles para comprender la invención incluyen un kit, que comprende un dispositivo proporcionado en el presente documento, un tampón de electrolito de cola que comprende electrolitos de cola, y un tampón de electrolito líder que comprende electrolitos líderes.
[0103] Dicho tampón de electrolito de cola puede contener una mezcla de al menos dos electrolitos con diferentes movilidades efectivas. Dicha mezcla puede comprender (i) un primer electrolito que tiene una magnitud de movilidad efectiva más baja que un ácido nucleico y una magnitud de movilidad efectiva mayor que un contaminante, y (ii) un segundo electrolito que tiene una magnitud de movilidad efectiva más baja que dicho contaminante. Dicho contaminante puede comprender ácidos nucleicos entrecruzados. Dicho primer electrolito puede comprender ácido caproico. Dicho segundo electrolito puede comprender HEPES.
[0105] En algunas realizaciones de los aspectos proporcionados en el presente documento, dicha concentración de dichos primeros iones de electrolito líder en dicho primer tampón de electrolito líder es diferente de dicha concentración de dichos segundos iones del electrolito líder en dicho segundo tampón de electrolito líder por un factor de al menos 1.5x. En algunas realizaciones de los aspectos proporcionados en el presente documento, el método comprende además recolectar dichos ácidos nucleicos en dicho segundo depósito de electrolito líder. En algunas realizaciones de los aspectos proporcionados en el presente documento, el método comprende además eliminar dichos ácidos nucleicos de dicho segundo depósito de electrolito líder. En algunas realizaciones de los aspectos proporcionados en el presente documento, dicho tampón de electrolito de cola se carga en un depósito de electrolitos de cola que se separa de dicho primer depósito de electrolitos líderes y dicho segundo depósito de electrolito líder
[0106] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un dispositivo fluídico, que comprende: una región de purificación de muestra, que comprende: (a) un canal que comprende una primera zona y una segunda zona en comunicación fluida con dicha primera zona; (b) una entrada de muestra, un depósito de electrolitos de cola que comprende un tampón de electrolito de cola, y un primer depósito de electrolitos líderes que comprende un primer tampón de electrolito líder, cada uno en comunicación fluida con dicha primera zona; y (c) un segundo depósito de electrolito líder que comprende un segundo tampón de electrolito líder, en el que dicho segundo tampón de electrolito líder está en comunicación fluida con dicha segunda zona y en el que dicho segundo tampón de electrolito líder es diferente de dicho primer tampón de electrolito líder.
[0108] Dicha entrada de muestra puede ser capaz de recibir una muestra que comprende al menos algún material biológico no líquido. Dicho segundo tampón de electrolito líder puede comprender un coión de electrolito líder de dicho primer tampón de electrolito líder. Dicho primer tampón de electrolito líder puede comprender primeros iones de electrolito líder y dicho segundo tampón de electrolito líder puede comprender segundos iones del electrolito líder que son los mismos que dichos primeros iones de electrolito líder, y en los que una concentración de dichos primeros iones de electrolito líder en dicho primer tampón de electrolito líder es diferente de una concentración de dichos segundos iones del electrolito líder en dicho segundo tampón de electrolito líder. Dicho primer tampón de electrolito líder puede comprender primeros iones de electrolito líder y dicho segundo tampón de electrolito líder puede comprender segundos iones del electrolito líder, y en los que dicha concentración de dichos primeros iones de electrolito líder en dicho primer tampón de electrolito líder es diferente de dicha concentración de dichos segundos iones del electrolito líder en dicho segundo tampón de electrolito líder por un factor de al menos 1.5x. Dicho primer tampón de electrolito líder puede comprender primeros iones de electrolito líder y dicho segundo tampón de electrolito líder puede comprender segundos iones del electrolito líder que son diferentes de dichos primeros iones de electrolito líder. Dicho primer tampón de electrolito líder puede comprender primeros iones de electrolito líder y dicho segundo tampón de electrolito líder puede comprender segundos iones del electrolito líder que son los mismos que dichos primeros iones de electrolito líder, y en los que una concentración de dichos primeros iones de electrolito líder en dicho primer tampón de electrolito líder es la misma que una concentración de dichos segundos iones del electrolito líder en dicho segundo tampón de electrolito líder, y en el que dicho primer tampón de electrolito líder comprende terceros iones de electrolito líder. Dicho primer tampón de electrolito líder puede comprender primeros iones de electrolito líder y dicho segundo tampón de electrolito líder puede comprender segundos iones del electrolito líder que son los mismos que dichos primeros iones de electrolito líder, y en los que una concentración de dichos primeros iones de electrolito líder en dicho primer tampón de electrolito líder es la misma que una concentración de dichos segundos iones del electrolito líder en dicho segundo tampón de electrolito líder, y en los que dicho segundo tampón de electrolito líder comprende terceros iones de electrolito líder.
[0110] Ejemplos no abarcados en la redacción de las reivindicaciones, pero que se consideran útiles para comprender la invención, incluyen un método que comprende: (a) proporcionar un dispositivo fluídico electrocinético que comprende un depósito en comunicación fluídica con un canal; (b) cargar un volumen de muestra en dicho depósito; (c) mover al menos 50 % de dicho volumen de muestra desde dicho depósito hasta dicho canal; y (d) aplicar una corriente iónica a través de dicho canal.
[0112] Dicho movimiento se puede llevar a cabo con la ayuda de la gravedad. Dicha corriente iónica no puede pasar sustancialmente a través de dicho depósito. Dicho al menos 50 % de dicho volumen de muestra puede comprender al menos 80 % de dicho volumen de muestra. Dicho volumen de muestra puede comprender ácidos nucleicos. Dicho volumen de muestra puede comprender una muestra de tejido. Dicho volumen de muestra puede comprender un muestra fijada en formalina y embebida en parafina (F<f>PE). Dicha aplicación de una corriente iónica puede comprender isotacoforesis conductora (ITP).
[0114] Un aspecto de la presente divulgación proporciona un sistema, que comprende: (a) un dispositivo fluídico que comprende: (i) un depósito de muestras en comunicación fluida con un primer canal fluídico; (ii) un tampón de depósito de electrolitos de cola en comunicación fluida con dicho primer canal fluídico; (iii) un primer depósito de electrolitos líderes en comunicación fluida con dicho primer canal fluídico; y (iv) un segundo depósito de electrolito líder en comunicación fluida con dicho primer canal fluídico, en el que dicho primer depósito de electrolitos líderes comprende un primer tampón de electrolito líder y dicho segundo depósito de electrolito líder comprende un segundo tampón de electrolito líder, en el que dicho segundo tampón de electrolito líder tiene una fuerza iónica menor que una fuerza iónica de dicho primer tampón de electrolito líder; (b) un primer circuito eléctrico configurado para llevar a cabo la primera isotacoforesis al aplicar un primer campo eléctrico dentro de dicho dispositivo fluídico a lo largo de una primera ruta que comprende dicho tampón de depósito de electrolitos de cola, dicho primer canal fluídico, y dicho primer depósito de electrolitos líderes; y (c) un segundo circuito eléctrico configurado para llevar a cabo una segunda isotacoforesis al aplicar un segundo campo eléctrico dentro de dicho dispositivo fluídico a lo largo de una segunda ruta que comprende dicho tampón de depósito de electrolitos de cola, dicho primer canal fluídico, y dicho segundo depósito de electrolito líder, en el que dicho primer circuito eléctrico es diferente de dicho segundo circuito eléctrico, y en el que dicha primera ruta es diferente de dicha segunda ruta.
[0115] En algunas realizaciones de los aspectos proporcionados en el presente documento dicho primer circuito eléctrico comprende un primer par de electrodos, en el que dicho segundo circuito eléctrico comprende un segundo par de electrodos, y en el que dicho primer par de electrodos es diferente de dicho segundo par de electrodos. En algunas realizaciones de los aspectos proporcionados en el presente documento dicho primer circuito eléctrico comprende un primer electrodo en comunicación eléctrica con dicho tampón de depósito de electrolitos de cola y un segundo electrodo en comunicación eléctrica con dicho primer depósito de electrolitos líderes, y en el que dicho segundo circuito eléctrico comprende un tercer electrodo en comunicación eléctrica con dicho tampón de depósito de electrolitos de cola y un cuarto electrodo en comunicación eléctrica con dicho segundo depósito de electrolito líder. En algunas realizaciones de los aspectos proporcionados en el presente documento dicho primer electrodo y dicho tercer electrodo comprende el mismo electrodo. En algunas realizaciones de los aspectos proporcionados en el presente documento dicho primer circuito eléctrico comprende una primera fuente de corriente configurada para aplicar dicho primer campo eléctrico, y en el que dicho segundo circuito eléctrico comprende una segunda fuente de corriente configurada para aplicar dicho segundo campo eléctrico.
[0116] Breve descripción de los dibujos
[0117] Una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención se obtendrá por referencia a la siguiente descripción detallada que establece realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención, y los dibujos que la acompañan:
[0118] La FIG. 1A muestra un protocolo de ejemplo para el procesamiento de muestras y la extracción o purificación de ácidos nucleicos.
[0119] La FIG. 1B muestra un protocolo de ejemplo para el procesamiento automatizado de muestras y la extracción o purificación de ácidos nucleicos.
[0120] La FIG. 2A muestra un esquema de ejemplo de la separación isotaforética y la purificación de ADN y ARN de contaminantes.
[0121] La FIG. 2B muestra un esquema de ejemplo de la separación isotaforética y la purificación de ácidos nucleicos de parafina y otros posibles contaminantes de la muestra concurrentes con la interrupción de tejido mediada por proteinasas y el desentrecruzamiento de ácidos nucleicos.
[0122] La FIG. 3 muestra los resultados de ejemplo de extracción y purificación de ADN mediante isotacoforesis automatizada en un dispositivo fluídico en comparación con los resultados de ejemplo de un kit típico de extracción en columna de fase sólida.
[0123] La FIG. 4A muestra los resultados de ejemplo para extracciones no sesgadas (por ejemplo, con respecto a la secuencia) de oligonucleótidos de ADN sintético ricos en GC y ricos en AT mezclados en relaciones de concentración de muestra utilizando isotacoforesis.
[0124] La FIG. 4B muestra los resultados de ejemplo para la purificación previa y posterior no sesgada (por ejemplo, con respecto al tamaño o el peso molecular), de la purificación, de una escalera de peso molecular de ADN utilizando isotacoforesis; se muestran comparaciones con dos métodos de purificación de ácidos nucleicos basados en columnas de fase sólida.
[0125] La FIG. 5A muestra un esquema de ejemplo de un canal con una zona de preparación de muestras y una zona de purificación isotacoforética.
[0126] La FIG. 5B muestra un cartucho de dispositivo fluídico de ejemplo que comprende ocho canales fluídicos paralelos y depósitos para el procesamiento simultáneo de hasta ocho muestras, como se muestra en la FIG.
[0127] 5A.
[0128] La FIG. 5C muestra un esquema de vista superior de ejemplo de un canal y sus depósitos conectados para un cartucho de dispositivo fluídico como se muestra en la FIG. 5B, ejemplificando aún más el uso de puertos de gas para la aplicación de presión externa o vacío a los canales dentro del cartucho del dispositivo fluídico. La FIG. 5D muestra un esquema de vista lateral de ejemplo de un cartucho de dispositivo fluídico como se muestra en la FIG. 5B.
[0129] La FIG. 5E muestra un esquema de vista final de ejemplo de un cartucho de dispositivo fluídico como se muestra en la FIG. 5B.
[0130] La FIG. 6A muestra un esquema de ejemplo de vista superior de un cartucho de dispositivo fluídico.
[0131] La FIG. 6B muestra un esquema de vista lateral de ejemplo de un cartucho de dispositivo fluídico.
[0132] La FIG. 6C muestra un esquema de vista inferior de ejemplo de un cartucho de dispositivo fluídico.
[0133] La FIG. 6D muestra un esquema de vista completa superior de ejemplo en tres dimensiones de un cartucho de dispositivo fluídico.
[0134] La FIG. 7A muestra un esquema de ejemplo de vista superior de un cartucho de dispositivo fluídico.
[0135] La FIG. 7B muestra un esquema de vista lateral de ejemplo de un cartucho de dispositivo fluídico.
[0136] La FIG. 7C muestra un esquema de vista inferior de ejemplo de un cartucho de dispositivo fluídico.
[0137] La FIG. 7D muestra un esquema de vista completa inferior de ejemplo en tres dimensiones de un cartucho de dispositivo fluídico.
[0138] La FIG. 8A muestra un esquema de ejemplo de vista superior de un cartucho de dispositivo fluídico.
[0139] La FIG. 8B muestra un esquema de vista lateral de ejemplo de un cartucho de dispositivo fluídico.
[0140] La FIG. 8C muestra un esquema de vista inferior de ejemplo de un cartucho de dispositivo fluídico.
[0141] La FIG. 8D muestra un esquema de vista completa inferior de ejemplo en tres dimensiones de un cartucho de dispositivo fluídico.
[0142] La FIG. 9A muestra un esquema de ejemplo de un cartucho de dispositivo fluídico que comprende ocho canales paralelos, como se muestra en la FIG. 5B.
[0143] La FIG. 9B muestra un esquema de ejemplo de dos controladores térmicos, cada uno alineado con una zona de los ocho canales paralelos mostrados en la FIG. 9A.
[0144] La FIG. 10A muestra un canal de gas de ejemplo que puede comprender una barrera capilar.
[0145] La FIG. 10B es un esquema ampliado del canal de gas de la FIG. 10A.
[0146] La FIG. 11 muestra un depósito de muestras de baja pérdida de ejemplo.
[0147] La FIG. 12A muestra un miembro mecánico de ejemplo que se puede utilizar para aplicar presión para cerrar los canales de un dispositivo fluídico.
[0148] La FIG. 12B muestra un miembro mecánico en forma de peine de ejemplo.
[0149] La FIG. 12C muestra la alineación de un miembro mecánico en forma de peine y los canales de un dispositivo fluídico.
[0150] La FIG. 13A muestra un dispositivo de mesa de ejemplo para llevar a cabo la preparación automatizada de muestras y la isotacoforesis en un cartucho de dispositivo fluídico.
[0151] La FIG. 13B muestra un sistema de control por ordenador de ejemplo que está programado o configurado de otra manera para implementar los métodos proporcionados en el presente documento.
[0152] La FIG. 14 muestra los resultados de ejemplo de mediciones y cuantificación basadas en fluorescencia para una serie de titulación de ácidos nucleicos utilizando isotacoforesis.
[0153] La FIG. 15 muestra un esquema de un diseño de ejemplo de un canal fluídico con depósitos conectados, electrodo(s) sin contacto (se puede utilizar como sensor de conductividad) y puerto(s) de gas para llevar a cabo la carga automatizada de fluido en el canal/dispositivo y la isotacoforesis automatizada.
[0154] La FIG. 16 muestra un gráfico de medición de voltaje a lo largo del tiempo en un canal de ITP durante una ejecución.
[0155] La FIG. 17 muestra dos gráficos de análisis derivados de las mediciones de voltaje de la FIG. 16.
[0156] La FIG. 18 muestra un ejemplo de medición de conductividad a lo largo del tiempo en un canal de ITP cerca de un depósito de elución.
[0157] La FIG. 19 muestra un esquema de ejemplo de una implementación de un sensor C4D.
[0158] La FIG. 20A muestra un mapa de temperatura de ejemplo de un canal de ITP tomado utilizando una cámara termográfica.
[0159] La FIG. 20B muestra un gráfico de la temperatura a lo largo del tiempo en la posición del Cursor 1 en la FIG.
[0160] 20A.
[0161] La FIG. 21 muestra un gráfico de la medición de la temperatura y la derivada de la temperatura a lo largo del tiempo durante una ejecución de ITP
[0162] La FIG. 22A muestra un esquema de ejemplo de una configuración ITP vertical (o de columna).
[0163] La FIG. 22B muestra una imagen de ejemplo de una ITP vertical configurada con una banda de ITP de ADN. La FIG. 23 muestra imágenes de ejemplo y los correspondientes rastros de intensidad de fluorescencia de la extracción y separación de ADN amplificable (por ejemplo, desentrecruzado) del ADN entrecruzado de una muestra FFPE utilizando isotacoforesis.
[0164] La FIG. 24A muestra una imagen de ejemplo de la extracción y purificación de ADN de muestras FFPE utilizando isotacoforesis.
[0165] La FIG. 24B muestra rendimientos de ADN de ejemplo medidos por PCR cuantitativa para la extracción y purificación de ADN de muestras FFPE utilizando isotacoforesis en comparación con los resultados de ejemplo de un kit típico de extracción en columna de fase sólida.
[0166] La FIG. 25A muestra una imagen de un chip de ITP de un solo canal cargado con ácido nucleico (extracción y digestión de ARN de células humanas) teñido con tinte para visualización.
[0167] La FIG. 25B muestra una imagen de un chip de ITP de un único canal cargado con ácido nucleico (extracción de ARN y digestión de células humanas) teñido con tinte para visualización.
[0168] La FIG. 26A muestra una imagen de una banda de ITP de ARN en un canal de chip durante la purificación. La FIG. 26B muestra una imagen de una banda de ITP de ácido nucleico total en un canal de chip durante la purificación.
[0169] La FIG. 26C muestra un gráfico de un electroferograma de calidad de ARN para la muestra mostrada en la FIG.
[0170] 26A.
[0171] La FIG. 26D muestra un gráfico de un electroferograma de calidad de ARN para la muestra mostrada en la FIG.
[0172] 26B.
[0173] La FIG. 27A muestra los resultados del rendimiento de ADN (ng) para ITP (cuadrado) en comparación con la extracción en columna (diamante, Qiagen QiaAmp) de sangre entera de ratón en función del porcentaje por volumen de sangre total en la muestra inicial.
[0174] La FIG. 27B muestra una imagen de ácido nucleico total en una banda de ITP durante la purificación de ITP de sangre entera de ratón lisada en un chip.
[0175] La FIG. 27C y la FIG. 27D muestran imágenes de superposición de luz blanca y fluorescencia de los canales de chip de ITP que muestran la separación física del hemo en el canal de electrolito líder/muestra desde el canal de elución y el depósito, antes y después de la purificación de ITP del 50 % por volumen de lisado de sangre completa. El ácido nucleico se tiñe con tinte verde para visualización en el pocillo de elución. La FIG.
[0176] 27C muestra el chip antes de ITP (tampones de lisado de sangre e ITP cargados en el chip; tampón solo en el pocillo de elución). La FIG. 27D muestra el chip después de ITP (lisado de sangre y tampones ITP cargados en chip; ADN purificado en pocillo de elución).
[0177] La FIG. 27E muestra un chip después de la purificación de ITP (50 % en volumen de sangre).
[0178] La FIG. 27F muestra un chip después de la purificación de ITP (25 % en volumen de sangre).
[0179] La FIG. 28 muestra los resultados de la purificación de ADN de alto peso molecular para ITP en comparación con la extracción en fase sólida.
[0180] La FIG. 29A muestra un dispositivo fluídico que comprende 8 canales cerrados.
[0181] La FIG. 29B muestra una vista microscópica ampliada de la segunda ubicación del cierre del canal adyacente al depósito de elución de cada uno de los canales.
[0182] La FIG. 29C muestra el porcentaje de cierre calculado en función de la fuerza aplicada al dispositivo fluídico. La FIG. 29D muestra los resultados de las mediciones de conductividad del cierre de canal.
[0183] FIG. 30 un gráfico de medición de voltaje y derivada de voltaje a lo largo del tiempo durante una ejecución de ITP.
[0184] La FIG. 31A muestra una micrografía de bandas de ITP con ADN enfocado en cada una de las 8 muestras en la región del canal de muestra del dispositivo.
[0186] La FIG. 31B muestra datos de señal de voltaje independientes a corrientes fijas para cada uno de los 8 canales a lo largo del tiempo.
[0188] La FIG. 31C muestra una micrografía de las mismas 8 bandas de ITP con ADN enfocado de las muestras eluidas en el depósito de elución.
[0190] La FIG. 31D es una sección ampliada del rastreo de voltaje (monitorización) utilizado para el activación mostrado en la FIG. 31B.
[0192] Descripción detallada
[0194] Descripción general
[0196] La preparación de muestras es una primera etapa para casi todos los análisis genómicos y transcriptómicos y, sin embargo, puede ser una fuente primaria de variabilidad en los análisis. La preparación de la muestra también puede ser manual, particularmente cuando la muestra es una muestra fijada en formalina y embebida en parafina (FFPE) que contiene proteínas entrecruzadas.
[0198] La presente divulgación proporciona procesos y dispositivos para mejorar la eficiencia de la extracción y purificación de ácidos nucleicos de muestras de tejidos y células, que incluyen las muestras que han sido procesadas de alguna manera, como muestras embebidas en parafina o muestras fijadas químicamente (por ejemplo, muestras FFPE, muestras que contienen tejido sólido). Los métodos proporcionados en el presente documento incluyen métodos de preparación en chip o fuera de chip de dichas muestras procesadas antes de llevar a cabo la isotacoforesis utilizando métodos que incorporan iones del electrolito líder e iones del electrolito de cola. En algunos casos, los métodos incluyen tratar (por ejemplo, mediante la eliminación del material embebido, lisis, interrupción enzimática) un tejido sólido fijo en un tampón de electrolito de cola o tampón de electrolito líder antes de llevar a cabo la isotacoforesis en la muestra. Los métodos incluyen el uso de un segundo tampón de electrolito líder de menor fuerza iónica para producir una muestra compatible con procesos posteriores como la amplificación u otros ensayos enzimáticos. Los dispositivos y sistemas proporcionados en el presente documento incluyen dispositivos adecuados para llevar a cabo isotacoforesis en muestras derivadas de tejidos, que incluyen dispositivos microfluídicos con características de procesamiento paralelo y mecanismos automatizados de control de retroalimentación que pueden incluir sensores térmicos que detectan cambios de temperatura dentro de los canales de procesamiento de muestras.
[0200] Los procesos y dispositivos de la presente divulgación pueden proporcionar una mejor recuperación de ácido nucleico de una muestra, especialmente de muestras de baja abundancia (por ejemplo, menos de 100 ng de ácido nucleico), muestras con volúmenes relativamente altos (por ejemplo, volumen total mayor de 25 pl, volumen total mayor de 50 pl, volumen total mayor de 100 pl, o más) o muestras líquidas que contienen partículas sólidas. Los procesos y dispositivos proporcionados en el presente documento también pueden proporcionar una alta repetibilidad y una polarización reducida para los ácidos nucleicos cortos. Los dispositivos proporcionados en el presente documento pueden integrar la preparación de muestras (por ejemplo, la eliminación de material de entrecruzamiento o incrustación) y las operaciones de extracción de ácidos nucleicos dentro de un dispositivo. Los dispositivos y procesos de la presente divulgación también pueden proporcionar compatibilidad con la automatización de procesos, integración con procesos posteriores, integración con la cuantificación en línea (por ejemplo, con una resolución de un solo picogramo) y/o la integración con el análisis de la longitud y la distribución de la secuencia de ácidos nucleicos.
[0202] Los métodos proporcionados en el presente documento son a menudo métodos para realizar isotacoforesis bajo condiciones adecuadas para extraer ácidos nucleicos de ciertas muestras, especialmente muestras FFPE. En algunos casos, los métodos divulgados incluyen métodos para realizar isotacoforesis utilizando un tampón de electrolito de cola que contiene al menos dos iones con diferentes magnitudes de movilidades efectivas. Los métodos también pueden incluir métodos para llevar a cabo la isotacoforesis utilizando dos tampones de electrolito líder diferentes, uno de los cuales puede servir como tampón de elución de muestra. Los métodos pueden incluir la automatización de procesos y el procesamiento paralelo de múltiples muestras.
[0204] La presente divulgación también incluye protocolos que utilizan productos químicos de tampón y espaciadores. Estas químicas de tampones y espaciadores pueden incluir el uso de múltiples especies de electrolitos para la conducción de ITP. Por ejemplo, los electrolitos de cola pueden comprender una mezcla de especies de electrolitos, capaces de separar los ácidos nucleicos no entrecruzados de los ácidos nucleicos entrecruzados, al tiempo que separan los ácidos nucleicos no entrecruzados o los ácidos nucleicos entrecruzados y no entrecruzados de los contaminantes dentro de una muestra.
[0206] Los dispositivos proporcionados en el presente documento incluyen dispositivos fluídicos moldeados por inyección con canales de procesamiento de muestras paralelos capaces de realizar ITP de manera multiplexada y dispositivos ITP con dos o más regiones que están conectados a un dispositivo térmico. Las técnicas de la presente divulgación pueden emplear ITP para recolectar, purificar y enfocar simultáneamente el ARN y el ADN extraídos, para cuantificar el total de ácido nucleico extraído en chip (por ejemplo, a través de la concentración asistida por ITP en línea en volúmenes muy pequeños o el etiquetado con un tinte fluorescente intercalante) y para suministrar ácidos nucleicos en dirección descendente a depósitos de salida paralelos compatibles con el pipeteo robótico.
[0208] Las técnicas de la presente divulgación pueden permitir la purificación del material de muestra (por ejemplo, ácidos nucleicos) sin unir el material de muestra a un soporte sólido. Las técnicas de la presente divulgación pueden permitir la purificación del material de muestra (por ejemplo, ácidos nucleicos) sin el uso de la extracción en fase líquida. Esto puede permitir la purificación sin depender de las diferencias de solubilidad.
[0210] La operación de los dispositivos de la presente divulgación puede ser automatizado, en gran parte automatizado o parcialmente automatizado. En algunos casos, los métodos de la presente divulgación implican una sola etapa de mezcla fuera de chip para dispensar una muestra (por ejemplo, una sección FFPE) en una solución (por ejemplo, solución alcalina, solución de lisis o solución tamponada que comprende urea y/o tiourea), seguido de la carga de la muestra en un depósito de un dispositivo fluídico para su posterior preparación de muestras en el dispositivo (por ejemplo, desparafinado, interrupción de tejido y lisis celular, digestión de proteasas, digestión proteolítica u otro tratamiento, que incluye la desnaturalización de proteínas o la digestión de nucleasas) y extracción de ácidos nucleicos, purificación, enriquecimiento, cuantificación en línea y dimensionamiento o fraccionamiento (por ejemplo, selección de tamaño). En algunos casos, los métodos de la presente divulgación incluyen la dispensación de una muestra (por ejemplo, una sección de FFPE u otra muestra de tejido) en un depósito o canal de un dispositivo fluídico (por ejemplo, cartucho) precargado con una solución (por ejemplo, solución alcalina, solución de lisis o solución tamponada que comprende urea y/o tiourea) para la preparación de muestras en el dispositivo (por ejemplo, desparafinado, interrupción de tejidos y lisado celular, digestión de proteasas u otro tratamiento, que incluye la desnaturalización de proteínas o la digestión de nucleasas) y la extracción, purificación, enriquecimiento, cuantificación en línea y dimensionamiento o fraccionamiento de ácidos nucleicos (por ejemplo, selección de tamaños). En algunos casos, los métodos de la presente divulgación incluyen la interrupción del tejido y/o el lisado de las células de una muestra fuera del chip, seguidas de la carga de la muestra, que puede ser homogénea o una mezcla no homogénea de tejido sólido lisado y ácidos nucleicos, en un depósito de un dispositivo fluídico para su posterior preparación de la muestra (por ejemplo, desparafinado, digestión de proteasas u otro tratamiento, que incluye la desnaturalización de proteínas o la digestión de nucleasas) y la extracción, purificación, enriquecimiento, cuantificación en línea y dimensionamiento o fraccionamiento de ácidos nucleicos (por ejemplo, selección de tamaños). La digestión de nucleasas puede incluir la eliminación de ADN para extracciones de ARN sin ADN o la eliminación de ARN para extracciones de ADN sin ARN. Los dispositivos fluídicos proporcionados en el presente documento se pueden utilizar con un sistema de mesa para automatizar un método basado en campo eléctrico para la extracción de ADN y ARN de muestras.
[0211] Los dispositivos de la presente divulgación incluyen sistemas que pueden automatizar e integrar el calentamiento en chip (por ejemplo, a una temperatura de 37 °C a 80 °C), preparación de muestras (por ejemplo, desparafinado, interrupción de tejidos y lisis celular), intercambio de tampones, extracción y purificación de ácidos nucleicos, enriquecimiento de ácidos nucleicos no entrecruzados o amplificables (por ejemplo, al separarlos y suministrarlos por separado de los ácidos nucleicos entrecruzados), y el suministro de ácidos nucleicos purificados a un depósito de salida, como una matriz compatible con el pipeteo manual o robótico. Por ejemplo, la presente divulgación incluye un cartucho de ocho canales en un formato de placa de microtitulación estándar, compatible con la automatización robótica, así como prototipos de controladores de mesa integrados que pueden permitir el control automatizado de la carga de tampones y otros fluidos, la aplicación de campos eléctricos y de temperatura al dispositivo, y el procesamiento automatizado de muestras en paralelo desde el inicio y el final de la ejecución. Este sistema se puede modificar fácilmente en el futuro, según sea necesario, para permitir un mayor rendimiento para uso en laboratorios clínicos o de diagnóstico más grandes (por ejemplo, formato de muestra de 96 pocillos).
[0213] Por ejemplo, la FIG. 1A muestra un diagrama de proceso de ejemplo para el procesamiento de muestras y la extracción de ácido nucleico utilizando las técnicas de la presente divulgación. Se puede proporcionar una muestra 101 y someterla a cualesquier etapas de preprocesamiento 102, tales como la mezcla con un tampón, la lisis o la eliminación del material embebido (si está presente). A continuación, la muestra (y, por ejemplo, el tampón) se puede cargar en un dispositivo fluídico 103. A continuación, se pueden realizar en el dispositivo fluídico las etapas de preparación de muestras 104, tales como la eliminación del material embebido (si está presente y si no se ha eliminado previamente durante el preprocesamiento), la interrupción de tejido, la lisis celular, la digestión proteolítica o de proteínas y (por ejemplo) la digestión de nucleasas. A continuación, se puede realizar la isotacoforesis 105 para separar y purificar los ácidos nucleicos de los contaminantes dentro de la muestra (por ejemplo, restos de células, material embebido, ácidos nucleicos entrecruzados, fijadores tales como la formalina, inhibidores, enzimas tales como la digestión o enzimas de restricción). Otras etapas pueden ocurrir simultáneamente con la isotacoforesis, tales como el desentrecruzamiento de los ácidos nucleicos entrecruzados (por ejemplo, con calor o digestión de proteasas). Los ácidos nucleicos se pueden detectar y cuantificar 106 durante o después de la isotacoforesis. Una vez extraídos o purificados, los ácidos nucleicos se pueden eluir y recuperar del dispositivo 107.
[0214] La FIG. 1B muestra un flujo de trabajo de proceso de ejemplo para la ITP automatizada. En la etapa 110, se puede seleccionar un protocolo, tal como al utilizar una interfaz gráfica de usuario en un dispositivo de mesa. El software de la interfaz de usuario puede permitir la facilidad de uso o la operación con manos libres. Por ejemplo, un usuario puede seleccionar de un menú (por ejemplo, menú desplegable). Alternativamente, el dispositivo puede escanear un código de barras (por ejemplo, un código de barras óptico, un chip RFID) asociado con una muestra o un chip de dispositivo fluídico que puede indicar el protocolo que se va a realizar. En la etapa 111, la tapa del instrumento se puede abrir (por ejemplo, manual o automáticamente a través del motor). La apertura motorizada de la tapa puede ser compatible con la automatización robótica de laboratorio. En la etapa 112, el usuario puede cargar un chip (por ejemplo, un dispositivo de fluidos) en el instrumento de mesa. El chip puede comprender una huella de placa de microtitulación estándar (MTP) SLAS monolítica y multicanal para ITP automatizada. En la etapa 113, los líquidos de ITP se pueden cargar en los pocillos de virutas. Los depósitos para fluidos de ITP y muestras de usuario se pueden diseñar para facilitar la carga, tal como a través de una pipeta multicanal (por ejemplo, formato de placa de microtitulación estándar SLAS de etapa de 9 mm). Los diseños geométricos (por ejemplo, barreras capilares) de los canales que conectan los depósitos con el canal de ITP pueden resistir el flujo gravimétrico o la humectación de líquidos en el canal antes de la operación. Estas estructuras pueden detener fluidos en lugares definidos dentro del canal de ITP, que incluye el establecimiento de la interfaz electrolito líder/electrolito de cola, así como permitir la carga sin burbujas. En algunos casos, antes de la operación, se puede aplicar un accionamiento neumático para cebar el canal. El material del chip se puede seleccionar para evitar o resistir la humectación o la absorción de fluidos en canales (por ejemplo, plástico con propiedades hidrofóbicas o un ángulo de contacto alto). El usuario puede cargar reactivos de<i>T<p>y tampones en el chip (por ejemplo, 5 fluidos diferentes); alternativamente, el chip se puede proporcionar con reactivos precargados. En la etapa 114, el usuario o el dispositivo pueden cerrar la tapa del dispositivo. La carga de muestras se puede accionar a través de los puertos de gas o aire del chip. La humectación y/o el flujo por gravedad se pueden utilizar para llenar canales con líquidos, por ejemplo, sin aplicación de presión activa.
[0216] En la etapa 115, el instrumento puede aplicar presión para cargar fluidos en el chip para cebar los canales. En la etapa 116, el dispositivo puede comprobar que los canales se han cebado correctamente. Por ejemplo, se pueden utilizar sensores ópticos (por ejemplo, de reflectancia), eléctricos, de presión y/o de caudal para comprobar que los fluidos se han cargado en las ubicaciones correctas dentro del chip. Los sensores y el software del dispositivo pueden permitir la monitorización y control en tiempo real de la carga de líquidos. La carga del reactivo y del tampón de ITP se puede llevar a cabo antes de cargar la muestra en el chip, de tal manera que, en caso de mala carga, no se desperdicie el material de muestra. Si los canales no están cebados correctamente, el dispositivo puede realizar el informe de errores 130. En la etapa 117 se puede abrir la tapa del aparato. En la etapa 118, la muestra se puede cargar en el dispositivo. La carga de muestras se puede realizar manualmente por un usuario, o se puede realizar de manera automatizada, tal como a través de la robótica de automatización de laboratorio. También se pueden realizar otras etapas de preparación de muestras. Por ejemplo, se puede cargar una muestra embebida en parafina (por ejemplo, FFPE) y, a continuación, el dispositivo puede controlar la temperatura dentro del depósito de muestras para desparafinar la muestra. En la etapa 119, se puede cerrar la tapa del dispositivo. En la etapa 120, el dispositivo puede realizar una autoprueba. Por ejemplo, la retroalimentación eléctrica de los electrodos del dispositivo que interactúan con los depósitos en el chip se puede utilizar para autoprobar el cebado exitoso de líquidos (por ejemplo, detección de burbujas). Los sensores ópticos se pueden utilizar para permitir la retroalimentación sobre el estado del cebado del líquido (por ejemplo, si un líquido ha alcanzado o no una barrera capilar designada). También se pueden utilizar otros mecanismos de detección, como los que se describen en el presente documento. Si la autoprueba determina que el dispositivo no está correctamente cebado, el dispositivo puede realizar el informe de errores 131.
[0218] En la etapa 121, se puede llevar a cabo una purificación basada en ITP El control de retroalimentación y la temporización del proceso mediante sensores (por ejemplo, activación), como se describe en el presente documento, se pueden utilizar para controlar y/o automatizar la purificación de ITP El dispositivo puede determinar si la purificación se realizó correctamente y, si no es así, el dispositivo puede realizar el informe de errores 132. En la etapa 122, los sensores del dispositivo (por ejemplo, sensores ópticos) se pueden utilizar para cuantificar las muestras, por ejemplo, mediante fluorescencia, UV u otra detección óptica. También se puede realizar el dimensionamiento de la muestra. Si el dispositivo determina que la muestra no se cuantificó correctamente o detecta otros problemas, el dispositivo puede realizar un informe de errores 133. En la etapa 123, se puede detectar un cambio en la conductividad, que se puede utilizar para indicar el tiempo de finalización de la ejecución de ITP (por ejemplo, cuando los ácidos nucleicos alcanzan una ubicación de elución o depósito designado). Otros métodos de detección descritos en el presente documento, tal como la temperatura o el voltaje de conducción, también se pueden utilizar para determinar el tiempo de fin de ejecución u otros activadores. Por ejemplo, se puede utilizar un sensor de temperatura o voltaje para controlar un campo eléctrico aplicado a un canal dentro del dispositivo con el fin de automatizar el proceso de ITP Como un ejemplo, se puede aplicar un campo eléctrico a un canal para comenzar la purificación de ITP Un cambio detectado en el voltaje se puede utilizar para activar el inicio de la temperatura u otra detección en una ubicación fija dentro del canal tal como en o cerca del depósito de elución. El voltaje puede cambiar a medida que se mueve la zona de ITP que comprende los ácidos nucleicos confinados. Los cambios indicativos de la zona de ITP que pasa a través de las características del canal, tales como una sección de área de sección transversal disminuida, se pueden detectar por un sensor de voltaje y la retroalimentación se puede utilizar para alterar el campo eléctrico, por ejemplo, al reducir la corriente aplicada. Se puede detectar un cambio en la temperatura a medida que la zona de ITP pasa por un sensor de temperatura en o cerca del depósito de elución y la retroalimentación del sensor se puede utilizar para controlar el campo eléctrico, por ejemplo, al eliminarlo para finalizar la ejecución de ITP. En la etapa 124, el dispositivo puede finalizar la ejecución, por ejemplo, en base a una señal activadora. Los ácidos nucleicos se pueden posicionar o aislar dentro del depósito o región de elución cuando finaliza la ejecución de ITP En la etapa 125, el dispositivo puede cerrar los canales, lo que puede fijar el volumen de elución para mantener un volumen constante para la elución (por ejemplo, al resistir o impedir el flujo hacia el depósito de elución o el depósito de salida durante el pipeteo fuera del volumen eluido). La fijación del volumen de elución puede ayudar a la facilidad de uso y puede ayudar a informar la concentración del material de muestra eluido. En la etapa 126, se puede abrir la tapa del dispositivo (por ejemplo, por un usuario o automáticamente).
[0220] En la etapa 127, se pueden extraer muestras purificadas del dispositivo. Los chips y/o dispositivos se pueden diseñar para un volumen de elución determinado, como se explica en el presente documento. La recuperación de material purificado del dispositivo se puede realizar mediante pipeteo o eliminando de otra manera el material del chip. Alternativamente, la extracción de muestras se puede realizar al interconectar el chip de ITP con otro chip o sistema fluídico (por ejemplo, en ausencia de un depósito de elución). A continuación, se pueden utilizar otros sistemas fluídicos para realizar otras operaciones en el material de muestra purificado, tal como la preparación de la biblioteca de secuenciación de próxima generación (NGS), el análisis de muestras tal como PCR, ddPCR, otras operaciones de secuenciación u otros procesos posteriores. En la etapa 128, el dispositivo puede informar de datos cuantitativos sobre la muestra, tal como la cantidad de muestra y/o la concentración de la muestra. El dispositivo puede contener un algoritmo u otro software para convertir una medición (por ejemplo, una señal de fluorescencia) en una cuantificación de muestra, y puede informar de esos datos a un usuario. En la etapa 129, finaliza el proceso.
[0222] Estos problemas pueden ser especialmente importantes de abordar para muestras preciosas, difíciles de recolectar o de baja abundancia (por ejemplo, menos de 100 ng de ácido nucleico o muestras que contienen una baja abundancia de ácidos nucleicos no dañados o no entrecruzados). Para dichas muestras, los protocolos actuales pueden carecer de repetibilidad, introducir pérdida de material de muestra, introducir sesgo para objetivos de ácidos nucleicos cortos o largos, introducir sesgos hacia la secuencia de objetivos de ácidos nucleicos y/o carecer de repetibilidad. Dichos protocolos también pueden carecer de compatibilidad con la automatización de procesos o los análisis posteriores. Los protocolos actuales para la preparación de ácidos nucleicos pueden incluir la extracción en fase líquida (LPE), como la extracción de fenol-cloroformo o la extracción con Trizol, y la extracción en fase sólida (SPE). Los enfoques de tipo SPE pueden utilizar estructuras que incluyen perlas empaquetadas, estructuras porosas monolíticas y/o perlas magnéticas. En algunos casos, los enfoques de tipo LPE y SPE pueden provocar un cizallamiento mecánico durante el procesamiento, lo que puede causar fragmentación y/o reducir el rendimiento de ácidos nucleicos de largo o alto peso molecular.
[0223] Los métodos y dispositivos de isotacoforesis proporcionados en el presente documento son especialmente adecuados para realizar la extracción de ácidos nucleicos de lisados de tejidos sólidos o semisólidos. Las técnicas de extracción en fase sólida (SPE) normalmente procesan los lisados al bombear todo el volumen de la muestra de lisado a través de una columna para adsorber selectivamente los ácidos nucleicos en las superficies de la columna. Dicho bombeo de un lisado complejo, que puede comprender una mezcla de líquido y partículas, a través de una columna porosa puede provocar la obstrucción o el ensuciamiento de la columna, lo que puede reducir la eficiencia de la extracción de ácidos nucleicos. Por el contrario, los métodos y dispositivos de isotacoforesis descritos en el presente documento a menudo no implican bombear o “filtrar” todo el volumen de la muestra de lisado a través de una columna. En su lugar, se puede aplicar un campo eléctrico al lisado para hacer que los ácidos nucleicos cargados y solvatados dispersos por todo el lisado de muestra compleja migren a través y fuera de la fase líquida continua de la muestra. Los ácidos nucleicos pueden comprender una magnitud de movilidad electroforética relativamente alta en relación con otros solutos, desechos o contaminantes en el lisado de la muestra. Los solutos en la muestra pueden tener una movilidad electroforética relativamente baja y ser demasiado bajos para enfocarse en la zona de isotacoforesis ubicada en la interfaz entre los electrolitos líderes y los electrolitos de cola. La aplicación de un campo eléctrico puede hacer que los ácidos nucleicos migren mientras que las partículas y/u otros restos de tejido (que incluyen, por ejemplo, restos de células, células no lisadas o tejido que puede conectar células con otras células) quedan atrás. Por lo tanto, los métodos y dispositivos de isotacoforesis proporcionados en el presente documento pueden ser muy adecuados para extraer los ácidos nucleicos cargados y solvatados de las muestras complejas de tejido sólido lisado sin tener que procesar toda la mezcla a través de una columna como en SPE.
[0225] Como se utiliza en el presente documento, “partículas” puede referirse a componentes de una mezcla de muestra o una mezcla de lisado de muestra que son una fase diferente a la fase líquida continua de la muestra (por ejemplo, una solución acuosa). Las partículas pueden ser componentes no líquidos de la mezcla de muestra. Las partículas pueden ser, por ejemplo, partículas sólidas suspendidas o cuerpos coloidales suspendidos dentro de una muestra. Dichas partículas pueden tener una variedad de escalas de longitud características que varían desde aproximadamente 1 nanómetro (nm) hasta aproximadamente 1 milímetro
[0226] (mm). En algunos casos, las partículas pueden no ser organismos unicelulares o células.
[0228] Los métodos y dispositivos de isotacoforesis proporcionados en el presente documento pueden proporcionar
[0229] tasas reducidas de deformación a medida que la muestra se mueve a través del canal en comparación con los
[0230] métodos típicos de SPE. En algunos casos, los métodos y dispositivos proporcionados en el presente documento tienen tasas de deformación de menos de aproximadamente 250 s-1, 500 s-1, 750 s-1, 1000 s-1, 2000
[0231] s-1, 3000 s-1, 4000 s-1, 5000 s-1, 6000 s-1, 7000 s-1, 8000 s-1, 9000 s-1, o 10,000 s-1. En algunos casos, los
[0232] métodos y dispositivos proporcionados en el presente documento tienen tasas de deformación de más de aproximadamente 250 s-1, 500 s-1, 750 s-1, 1000 s-1, 2000 s-1, 3000 s-1, 4000 s-1, 5000 s 8000 s-1, 9000 s-1, o 10,000 s-1. En algunos casos, los métodos proporcionados en el presente documento se
[0233] pueden realizar sin centrifugación.
[0235] Química y operación de isotacoforesis
[0237] La FIG. 2A muestra un esquema de ejemplo de un proceso de purificación de ácido nucleico de isotacoforesis
[0238] (ITP). Una muestra 201, por ejemplo una muestra de tejido sólido lisado, que comprende ácidos nucleicos (ADN
[0239] y ARN) 202 y contaminantes 203, se carga con electrolitos de cola (TE) 204 en un canal de isotacoforesis 200
[0240] que contiene electrolitos líderes (LE) 205. Bajo la influencia de un campo eléctrico 220 aplicado al canal de isotacoforesis 210, los ácidos nucleicos 212 migran lejos de los contaminantes 213. El campo eléctrico también
[0241] hace que los electrolitos de cola 214 migren a través del canal en una posición que generalmente está detrás
[0242] de los ácidos nucleicos, y hace que los electrolitos líderes 215 migren a través del canal generalmente por
[0243] delante de los ácidos nucleicos. La magnitud de la movilidad efectiva de los electrolitos líderes es mayor que
[0244] la magnitud de la movilidad efectiva de los ácidos nucleicos, que a su vez es mayor que la magnitud de la
[0245] movilidad efectiva de los electrolitos de cola, que es mayor que la magnitud de la movilidad efectiva de los contaminantes.
[0247] La FIG. 2B muestra un esquema de ejemplo de un proceso para desentrecruzar ácidos nucleicos mientras se
[0248] separan los ácidos nucleicos entrecruzados de los ácidos nucleicos entrecruzados y contaminantes (por
[0249] ejemplo, parafina) utilizando isotacoforesis (ITP) en un dispositivo fluídico. En algunos casos, los contaminantes
[0250] pueden comprender los ácidos nucleicos entrecruzados. Una muestra embebida en parafina se carga en el dispositivo fluídico en un tampón alcalino y se incuba durante 10-30 minutos a aproximadamente pH aproximado de 10 y a una temperatura desde aproximadamente 50 °C hasta aproximadamente 80 °C para la
[0251] lisis de los tejidos y el desparafinado inicial. La incubación puede ocurrir antes o durante la aplicación de un
[0252] campo eléctrico para realizar la isotacoforesis. Alternativamente, la muestra se puede cargar en un tampón de
[0253] electrolito líder. Después de la incubación, en un primer punto de tiempo 240, la muestra que comprende los
[0254] ácidos nucleicos entrecruzados 236 y parafina 237 se ubica en un canal de ITP con electrolitos de cola 232.
[0255] Más adelante en el canal de ITP, en una zona de electrolitos líderes (LE) 238 se encuentran los electrolitos
[0256] líderes 231 y las enzimas Proteinasa K 233. En un segundo punto de tiempo 250, a 50 °C, la neutralización del
[0257] pH impulsado por ITP reduce el pH, y las enzimas Proteinasa K están en contacto y se desentrecruzan de los
[0258] ácidos nucleicos entrecruzados, produciendo ácidos nucleicos no entrecruzados 235 que se concentran en la
[0259] zona de ITP 239 entre los electrolitos de cola y los electrolitos líderes. La reducción del pH (por ejemplo, a un
[0260] rango desde aproximadamente 10-12 hasta aproximadamente 7 (o desde aproximadamente 6.5 hasta aproximadamente 8.5)) puede proporcionar un entorno apropiado para la actividad enzimática y una mejor estabilidad química de los ácidos nucleicos. En un tercer punto de tiempo 260, la Proteinasa K ha entrecruzado
[0261] más ácidos nucleicos, lo que resulta en la proteína libre 234, y los ácidos nucleicos desentrecruzados han
[0262] migrado en dirección ascendente desde la parafina, la proteína libre y otros contaminantes. El funcionamiento
[0263] de un proceso de este tipo se puede llevar a cabo automáticamente mediante el dispositivo fluídico o mediante
[0264] un sistema de mesa.
[0266] En algunos casos, la muestra se puede cargar en un tampón de muestra que comprende una concentración
[0267] de electrolitos líderes 205, 231 que difiere de la concentración de electrolitos líderes 205, 231 utilizada para
[0268] realizar la isotacoforesis. En algunos casos, la muestra se puede cargar en un tampón de muestra que comprende un segundo electrolito líder que difiere del electrolito líder 215. El segundo electrolito líder puede
[0269] tener una magnitud de movilidad efectiva mayor que la magnitud de la movilidad efectiva del ácido nucleico. El
[0270] segundo electrolito líder puede tener una magnitud de movilidad efectiva menor que la magnitud de movilidad
[0271] efectiva del electrolito líder 215.
[0273] En algunos casos, el pH de la muestra se puede neutralizar al realizar la isotacoforesis. En algunos casos, el
[0274] pH de la muestra se puede neutralizar dentro de un rango de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 8.5,
[0275] por ejemplo de aproximadamente 7 o 7.5.
[0277] Se pueden utilizar varios electrolitos líderes y electrolitos de cola para llevar a cabo la ITP. Los electrolitos
[0278] líderes se pueden seleccionar para que tengan una magnitud de movilidad efectiva mayor que el objetivo de
[0279] extracción (por ejemplo, ácidos nucleicos), y los electrolitos de cola se pueden seleccionar para que tengan
[0280] una magnitud de movilidad efectiva menor que el objetivo de extracción. Los electrolitos líderes y/o de cola
[0281] pueden estar presentes en una concentración desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente
[0282] 200 mM. Los electrolitos líderes y/o de cola pueden estar presentes en una concentración de aproximadamente 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, o 200 mM. Los electrolitos líderes y/o de cola pueden estar presentes a una concentración de al menos aproximadamente 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, o 200 mM. Los electrolitos líderes y/o de cola pueden estar presentes a una concentración de como máximo aproximadamente 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, o 200 mM. Los electrolitos líderes utilizados en un caso particular de ITP pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más especies de iones diferentes. Los electrolitos de cola utilizados en un caso particular de ITP pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más especies de iones diferentes. Diferentes especies de iones en los electrolitos líderes y/o electrolitos de cola pueden estar presentes en diferentes concentraciones. Se pueden seleccionar diferentes concentraciones de iones, tales como dentro de los electrolitos de cola o los electrolitos líderes, para manipular el tamaño de una zona de espaciamiento. La zona de espaciado se puede utilizar para separar además un tipo de objetivo de otro, como separar los ácidos nucleicos entrecruzados de los desentrecruzados de proteínas.
[0284] Los electrolitos de cola pueden comprender una mezcla de iones con diferentes magnitudes de movilidades efectivas. El uso de un primer ion electrolito de cola con una primera magnitud de movilidad efectiva y un segundo ion electrolito de cola con una segunda magnitud de movilidad efectiva menor que la del primer ion se puede utilizar para separar los ácidos nucleicos no entrecruzados de los ácidos nucleicos entrecruzados de proteínas, al tiempo que se separan ambos (o al menos los ácidos nucleicos desentrecruzados) de los contaminantes. En tal caso, los ácidos nucleicos no entrecruzados pueden tener una mayor magnitud de movilidad efectiva que los primeros iones del electrolito de cola, que pueden tener una mayor magnitud de movilidad efectiva que los ácidos nucleicos entrecruzados, que a su vez pueden tener una mayor magnitud de movilidad efectiva que los segundos iones del electrolito de cola, que a su vez pueden tener una magnitud de movilidad efectiva mayor que los contaminantes. Por ejemplo, los ácidos nucleicos entrecruzados y no entrecruzados se pueden enriquecer por separado mediante la realización de isotacoforesis utilizando un electrolito líder y dos electrolitos de cola, tales como el ácido caproico como primer ion y HEPES como el segundo ion.
[0286] Los iones del electrolito también se pueden seleccionar en base a la acidez (por ejemplo, pKa). Los iones con pKa particular se pueden seleccionar, por ejemplo, para efectuar un cambio de pH a lo largo de un canal de ITP. Los iones también se pueden seleccionar por razones no electroforéticas, tal como la compatibilidad con procesos posteriores (por ejemplo, procesos enzimáticos como la PCR o la preparación de bibliotecas de secuenciación de próxima generación). Por ejemplo, el ácido caproico, MOPS y HEPES se pueden seleccionar para una buena compatibilidad enzimática en dirección descendente.
[0288] Los iones del electrolito líderes de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, ácido clorhídrico, ácido acético, ácido 2-cloroisocrotónico, ácido salicílico, ácido clorocrónico, ácido nicotínico, ácido gálico, ácido tricloroláctico, ácido butírico, ácido sulfanílico, ácido benzoico, ácido crotónico, ácido tricloroacrílico, ácido propiónico, ácido levulínico, ácido sórbico, ácido orótico, ácido valérico, ácido pícrico, ácido 2-naftalenosulfónico, sacarina, dinitrofenol, ácido p-toluenosulfónico, ácido aspártico, ácido trimetilacrílico, ácido isocaproico, ácido caproico, ácido octilsulfónico, nitrofenol, GABA, ácido cacodílico, ácido trimetilpirúvico, ácido etilmaleico, ácido etilfumárico, ácido toluico, ácido enantílico, ácido mandélico, ácido cinámico, cresol, ácido glutámico, MES, isómeros de los mismos y combinaciones de los mismos.
[0290] Los iones del electrolito de cola incluyen de ejemplo, pero no se limitan a, ácido caprílico, ácido glucónico, ácido vanílico, ácido decilsulfónico, aspirina, ácido glucurónico, ácido pelargónico, ácido bencilaspártico, ácido ascórbico, ácido dodecilsulfónico, MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico), diclorofenol, ácido caproico, ácido cáprico, tirosina, HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico), isómeros de los mismos y combinaciones de los mismos.
[0292] El uso de una mezcla de diferentes iones del electrolito de cola se puede utilizar para lograr separaciones entre paréntesis de movilidad (por ejemplo, separación de ácidos nucleicos no entrecruzados de ácidos nucleicos entrecruzados de contaminantes cruzados), compatibilidad con ensayos posteriores, energía superficial favorable o ángulos de contacto entre fluidos y materiales de dispositivos fluídicos, capacidad de tamponado y solubilidad total de iones.
[0294] La isotacoforesis puede neutralizar el pH de una muestra a neutro o casi neutro. Los iones que afectan al pH local (por ejemplo, los iones de sodio (Na+)) se pueden desplazar desde la zona de la muestra durante la isotacoforesis, desplazando de esta manera el pH de la zona de la muestra a neutro.
[0296] La isotacoforesis se puede llevar a cabo en un rango de voltajes, corrientes e intensidades de campo. Por ejemplo, la isotacoforesis se puede llevar a cabo a un voltaje de aproximadamente 100 V y aproximadamente 1500 V. La isotacoforesis se puede llevar a cabo a un voltaje de aproximadamente 100 V, 200 V, 300 V, 400 V, 500 V, 600 V, 700 V, 800 V, 900 V, 1000 V, 1100 V, 1200 V, 1300 V, 1400 V, o 15000 V. La isotacoforesis se puede llevar a cabo a un voltaje de al menos aproximadamente 100 V, 200 V, 300 V, 400 V, 500 V, 600 V, 700 V, 800 V, 900 V, 1000 V, 1100 V, 1200 V, 1300 V, 1400 V, o 15000 V. La isotacoforesis se puede llevar a cabo a un voltaje de a lo máximo de aproximadamente 100 V, 200 V, 300 V, 400 V, 500 V, 600 V, 700 V, 800 V, 900 V, 1000 V, 1100 V, 1200 V, 1300 V, 1400 V, o 15000 V. La isotacoforesis se puede llevar a cabo a una corriente desde aproximadamente 10 nA a aproximadamente 10 mA. La isotacoforesis se puede llevar a cabo a una corriente de aproximadamente 10 nA, 20 nA, 30 nA, 40 nA, 50 nA, 60 nA, 70 nA, 80 nA, 90 nA, 100 nA, 200 nA, 300 nA, 400 nA, 500 nA, 600 nA, 700 nA, 800 nA, 900 nA, 1 mA, 2 mA, 3 mA, 4 mA, 5 mA, 6 mA, 7 mA, 8 mA, 9 mA, o 10 mA. La isotacoforesis se puede llevar a cabo a una corriente de al menos aproximadamente 10 nA, 20 nA, 30 nA, 40 nA, 50 nA, 60 nA, 70 nA, 80 nA, 90 nA, 100 nA, 200 nA, 300 nA, 400 nA, 500 nA, 600 nA, 700 nA, 800 nA, 900 nA, 1 mA, 2 mA, 3 mA, 4 mA, 5 mA, 6 mA, 7 mA, 8 mA, 9 mA, o 10 mA. La isotacoforesis se puede llevar a cabo a una corriente de a lo máximo aproximadamente 10 nA, 20 nA, 30 nA, 40 nA, 50 nA, 60 nA, 70 nA, 80 nA, 90 nA, 100 nA, 200 nA, 300 nA, 400 nA, 500 nA, 600 nA, 700 nA, 800 nA, 900 nA, 1 mA, 2 mA, 3 mA, 4 mA, 5 mA, 6 mA, 7 mA, 8 mA, 9 mA, o 10 mA. La isotacoforesis se puede llevar a cabo con una intensidad de campo desde aproximadamente 10 V/cm hasta aproximadamente 100 V/cm. La isotacoforesis se puede llevar a cabo a una intensidad de campo de aproximadamente 10 V/cm, 15 V/cm, 20 V/cm, 25 V/cm, 30 V/cm, 35 V/cm, 40 V/cm, 45 V/cm, 50 V/cm, 55 V/cm, 60 V/cm, 65 V/cm, 70 V/cm, 75 V/cm, 80 V/cm, 85 V/cm, 90 V/cm, 95 V/cm, o 100 V/cm. La isotacoforesis se puede llevar a cabo con una intensidad de campo de al menos aproximadamente 10 V/cm, 15 V/cm, 20 V/cm, 25 V/cm, 30 V/cm, 35 V/cm, 40 V/cm, 45 V/cm, 50 V/cm, 55 V/cm, 60 V/cm, 65 V/cm, 70 V/cm, 75 V/cm, 80 V/cm, 85 V/cm, 90 V/cm, 95 V/cm, o 100 V/cm. La isotacoforesis se puede llevar a cabo con una intensidad de campo de a lo máximo aproximadamente 10 V/cm, 15 V/cm, 20 V/cm, 25 V/cm, 30 V/cm, 35 V/cm, 40 V/cm, 45 V/cm, 50 V/cm, 55 V/cm, 60 V/cm, 65 V/cm, 70 V/cm, 75 V/cm, 80 V/cm, 85 V/cm, 90 V/cm, 95 V/cm, o 100 V/cm.
[0298] La isotacoforesis se puede utilizar para concentrar ácidos nucleicos en una muestra. La concentración de ácidos nucleicos en una muestra se puede aumentar después de la isotacoforesis en al menos aproximadamente 2 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces, 1,000 veces, 10,000 veces, 100,000 veces, 1.000. 000 veces, 10,000,000 veces, 100,000,000 veces, o 1,000,000,000 veces. El tiempo de operación para la concentración de ácidos nucleicos con isotacoforesis puede ser menor que o igual a aproximadamente 5 horas, 4.5 horas, 4 horas, 3.5 horas, 3 horas, 2.5 horas, 2 horas, 1.5 horas, 1 horas, 50 minutos, 40 minutos, 30 minutos, 20 minutos, 10 minutos, 9 minutos, 8 minutos, 7 minutos, 6 minutos, 5 minutos, 4 minutos, 3 minutos, 2 minutos, 1 minuto, 45 segundos, 30 segundos, 20 segundos 10 segundos, o 1 segundo. En algunos casos, se puede utilizar isotacoforesis para aumentar la concentración de ácidos nucleicos en una muestra en 1.000. 000 veces es menor que o igual a aproximadamente 2 minutos. En algunos casos (por ejemplo, de una muestra de 25 pL de lisado de sangre), se puede utilizar isotacoforesis para aumentar la concentración de ácidos nucleicos en una muestra en 100,000 veces en menos de o igual a aproximadamente 5 minutos.
[0300] Se pueden utilizar las técnicas de la presente divulgación para reducir la concentración de ácidos nucleicos entrecruzados en una muestra. La concentración de ácidos nucleicos entrecruzados en una muestra se puede reducir después de la isotacoforesis en al menos aproximadamente 2 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces, 1,000 veces, 10,000 veces, 100,000 veces, 1,000,000 veces, 10,000,000 veces, 100,000,000 veces, o 1.000. 000.000 veces. Se puede utilizar isotacoforesis para reducir la concentración de un contaminante en una muestra. La concentración de contaminantes en una muestra se puede reducir después de la isotacoforesis en al menos aproximadamente 2 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces, 1,000 veces, 10,000 veces, 100,000 veces, 1.000. 000 veces, 10,000,000 veces, 100,000,000 veces, o 1,000,000,000 veces.
[0302] Las muestras de ácido nucleico pueden contener desde aproximadamente 0.1 picogramos (pg) hasta aproximadamente 25 microgramos (pg). Por ejemplo, las muestras de ácido nucleico pueden contener desde aproximadamente 5 pg hasta aproximadamente 5 pg. Las muestras de ácido nucleico pueden contener aproximadamente 0.1 pg, 0.2 pg, 0.3 pg, 0.4 pg, 0.5 pg, 0.6 pg, 0.7 pg, 0.8 pg, 0.9 pg, 1 pg, 2 pg, 3 pg, 4 pg, 5 pg, 6 pg, 7 pg, 8 pg, 9 pg, 10 pg, 20 pg, 30 pg, 40 pg, 50 pg, 60 pg, 70 pg, 80 pg, 90 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 nanogramo (ng), 2 ng, 3 ng, 4 ng, 5 ng, 6 ng, 7 ng, 8 ng, 9 ng, 10 ng, 20 ng, 30 ng, 40 ng, 50 ng, 60 ng, 70 ng, 80 ng, 90 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 pg, 2 pg, 3 pg, 4 pg, 5 pg, 6 pg, 7 pg, 8 pg, 9 pg, 10 pg, 11 pg, 12 pg, 13 pg, 14 pg, 15 pg, 16 pg, 17 pg, 18 pg, 19 pg, 20 pg, 21 pg, 22 pg, 23 pg, 24 pg, o 25 pg.
[0304] Las muestras de ácido nucleico pueden contener ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ADN de cadena sencilla, ADN de cadena doble, ADN genómico, ADN complementario, ácidos ribonucleicos (ARN), ARN ribosómico, ARN de transferencia, ARN mensajero, micro ARN o similares, o cualquier combinación de los mismos. Las muestras de ácido nucleico pueden comprender una longitud de al menos 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 kB o más. Las técnicas de la presente divulgación se pueden utilizar para extraer diferentes tipos de muestras en diferentes canales de un dispositivo fluídico. Por ejemplo, se pueden utilizar diferentes canales para extraer ácidos nucleicos de diferentes longitudes y/o diferentes tipos.
[0306] En algunos casos, una característica de una muestra de ácido nucleico se puede comparar con uno o más ácidos nucleicos de otra muestra. La característica puede ser, por ejemplo, un nivel de expresión, una secuencia de ácidos nucleicos, un peso molecular, integridad del ácido nucleico, cadena de ácidos nucleicos o
[0307] pureza del ácido nucleico.
[0309] Las muestras de ácido nucleico pueden ser de una calidad particular antes y/o después de la extracción u otro procesamiento. La calidad del ácido nucleico se puede evaluar mediante varias métricas, que incluyen, pero
[0310] no se limitan a, el número de integridad del ARN (RIN), el número de integridad del ADN (DIN), la distribución
[0311] del tamaño (por ejemplo utilizando electroforesis) y la capacidad de ser amplificado (por ejemplo, por PCR) o
[0312] procesado de otra forma enzimáticamente (por ejemplo, fragmentación, ligadura, adición de cola a o hibridación
[0313] para la preparación de bibliotecas de secuenciación de próxima generación). Las técnicas de la presente divulgación se pueden utilizar para extraer o procesar ácidos nucleicos y proporcionar ácidos nucleicos
[0314] extraídos o procesados con un RIN de al menos aproximadamente 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9,
[0315] 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.
[0316] 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.
[0317] 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.
[0318] 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, o 10.0. Las técnicas de la presente divulgación se pueden utilizar para extraer o procesar
[0319] ácidos nucleicos y proporcionar los ácidos nucleicos extraídos o procesados con un RIN de como máximo aproximadamente 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1,2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0,
[0320] 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5,
[0321] 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0,
[0322] 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, o 10.0. Las técnicas de la
[0323] presente divulgación se pueden utilizar para extraer o procesar ácidos nucleicos y proporcionar los ácidos
[0324] nucleicos extraídos o procesados con un DIN de al menos aproximadamente 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.
[0325] 7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1,
[0326] 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6,
[0327] 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1,
[0328] 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, o 10.0. Las técnicas de la presente divulgación se pueden utilizar para
[0329] extraer o procesar ácidos nucleicos y proporcionar los ácidos nucleicos extraídos o procesados con un DIN de
[0330] como máximo aproximadamente 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6,
[0331] 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1,
[0332] 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6,
[0333] 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, o 10.0.
[0334] Las técnicas de la presente divulgación se pueden utilizar para extraer o procesar ácidos nucleicos y proporcionar los ácidos nucleicos extraídos o procesados de tal manera que al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %,
[0335] 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.9 %, o 99.99 % de la masa de los ácidos
[0336] nucleicos de la muestra tiene un peso molecular de al menos aproximadamente 0.5, 1,2, 5, 10, 20, 30, 40, 50,,
[0337] 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, o 500 kB o más. En algunos casos, aproximadamente 90 %
[0338] a aproximadamente 100 % de la masa de los ácidos nucleicos procesados son desde aproximadamente 10
[0339] hasta aproximadamente 1000 bp, desde aproximadamente 200 hasta aproximadamente 2000 bp, o desde aproximadamente 200-5000 bp.
[0341] La isotacoforesis se puede utilizar para extraer ácidos nucleicos con una eficiencia o rendimiento de extracción, caracterizado como el rendimiento porcentual de ácido nucleico a partir de una cantidad inicial dada de ácido
[0342] nucleico. Las técnicas de la presente divulgación pueden proporcionar ácidos nucleicos extraídos con un rendimiento de al menos aproximadamente el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %,
[0343] 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 99.9 %. Las técnicas de divulgación actuales pueden proporcionar altos rendimientos incluso para cantidades bajas de ácido nucleico,
[0344] que incluyen menos o igual a aproximadamente 104 nanogramos (ng), 103 ng, 102 ng, 101 ng, 100 ng, 10-1 ng o
[0345] 10-2 ng. La FIG. 3, por ejemplo, muestra rendimientos de ejemplo de ácido nucleico de un rango de diferentes cantidades de entrada y fuentes de ácido nucleico. El alto rendimiento y/o la baja pérdida de ácidos nucleicos
[0346] pueden ser importantes para las preparaciones de la biblioteca de secuenciación de próxima generación. La recuperación de ácidos nucleicos puede estar en o cerca del 100 %.
[0348] Las técnicas de la presente divulgación pueden extraer ácidos nucleicos con bajo o ningún sesgo de secuencia.
[0349] Es decir, la composición de la secuencia de los ácidos nucleicos extraídos y purificados (por ejemplo, la relación
[0350] de ácidos nucleicos ricos en GC y ácidos nucleicos ricos en AT) puede ser similar o igual a la composición de
[0351] la secuencia de los ácidos nucleicos de entrada (véase, por ejemplo, la FIG. 4A). La diferencia en la composición de la secuencia de los ácidos nucleicos extraídos de la composición de la secuencia de los ácidos
[0352] nucleicos de entrada puede ser menor o igual a aproximadamente 20 %, 15 %, 10 %, 5%, 4 %, 3 %, 2 % o 1 %.
[0354] Las técnicas de la presente divulgación pueden extraer ácidos nucleicos con un sesgo de longitud bajo o nulo.
[0355] Es decir, la distribución de la longitud de los ácidos nucleicos extraídos (por ejemplo, las relaciones de ácidos
[0356] nucleicos de diferentes tamaños) puede ser similar o igual a la distribución de la longitud de los ácidos nucleicos
[0357] de entrada (véase, por ejemplo, la FIG. 4B). La diferencia en la distribución de longitud de los ácidos nucleicos
[0358] extraídos de la distribución de longitud de los ácidos nucleicos de entrada puede ser menor o igual a aproximadamente 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 %. Por ejemplo, los ácidos nucleicos cortos (por
[0359] ejemplo, alrededor de 10 a aproximadamente 300 pb), los ácidos nucleicos largos (por ejemplo, alrededor de
[0360] 10 kB, 20 kB, 30 kB, 40 kB, 50 kB, 60 kB, 70 kB, 80 kB, 90 kB, 100 kB o más), o los ácidos nucleicos cortos y
[0361] largos se pueden extraer con una reducción de la caída o polarización. Las columnas de fase sólida pueden, en algunos casos, perder hasta el 100% del material de ácido nucleico corto y/o largo. Las técnicas de divulgación actual pueden recuperar nucleótidos desde una sola base hasta cientos de kilobases de tamaño. Las técnicas de divulgación actuales pueden recuperar al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.9 %, o 100 % de los ácidos nucleicos cortos y/o largos presentes en la muestra.
[0363] Las técnicas de la presente divulgación pueden resultar en la eliminación de contaminantes de la muestra. Los contaminantes pueden incluir, pero no se limitan a, material embebido, restos de células, componentes de la matriz extracelular, restos de tejidos, restos embebidos, lípidos, carbohidratos, enzimas, subproductos de ligadura, cebadores, sondas o ligadores no unidos, metales divalentes, detergentes, conservantes, fijadores, anticoagulantes, fibras de colágeno e inhibidores de PCR. Los contaminantes pueden provenir del tejido o las células de la muestra, de los conservantes o materiales embebidos utilizados en la muestra, o de preparaciones, reacciones o ensayos anteriores realizados en la muestra. Por ejemplo, enzimas TALES como las nucleasas de restricción se pueden utilizar para preparar el ADN para un ensayo de huellas dactilares y, después de la digestión (por ejemplo, digestión de la DNasa), el ADN se puede separar de la enzima.
[0365] Muestras
[0367] Las técnicas de la presente divulgación se pueden utilizar para procesar diferentes tipos de muestras, que incluyen, pero no se limitan a, muestras biológicas, tejido sólido, biopsias, biopsias de tejido, biopsias líquidas, órganos, tumores, tejido fresco, órganos sólidos, tejido preservado (por ejemplo, FFPE), FFPE disecado, tejido fresco congelado, muestras fijas, tejido fijo, muestras embebidas, muestras lisadas, muestras no lisadas, muestras que comprenden conexiones entre células (por ejemplo, uniones de brecha, uniones estrechas, uniones adherentes ), muestras que comprendan tejido sólido lisado y ácidos nucleicos, muestras multifásicas, líquidos o soluciones no homogéneas (como tejidos, sangre entera o suspensiones celulares no lisadas), muestras biológicas que comprendan ADN genómico, sangre entera lisada y no licada, plasma y suero, hisopos bucales, gotas de sangre seca y otras muestras forenses, tejidos frescos o frescos congelados, células cultivadas o recolectadas (lisadas y no lisadas) de sangre o tejidos, células fijas, heces y fluidos corporales (por ejemplo, saliva, orina), o cualquier combinación de los mismos. Ejemplos no limitantes de órganos sólidos incluyen el hígado, páncreas, cerebro, corazón, vesícula biliar, colon, pulmones y órganos reproductivos. Las muestras pueden incluir ácidos nucleicos celulares y libres de células, tanto para organismos eucariotas como procariotas. Las muestras fijas pueden ser fijadas químicamente o fijadas físicamente (por ejemplo, calentamiento o congelación). Por ejemplo, las muestras se pueden fijar químicamente con un fijador químico tal como formalina, formalina tamponada neutra (NBF), formaldehído, paraformaldehído, glutaraldehído, glioxal, cloruro de mercurio, sales de zinc, fluido de Bouin, alcohol-formalina-ácido acético (AFA o FAA), citratoacetona-formalina (CAF), acetona, metanol, etanol, fluido de Clarke, fluido de Camoy o metacam de Puchtler. Las muestras embebidas se pueden embeber en materiales que incluyen, pero no se limitan a, cera (por ejemplo, parafina), agar, gelatina o resinas plásticas. Las muestras fijadas en formalina y embebidas en parafina (FFPE) se pueden procesar utilizando las técnicas de la presente divulgación. Las muestras pueden incluir hisopos bucales, gotas de sangre y otras muestras forenses. Las muestras pueden incluir muestras clínicas, aspirados con aguja fina, biopsias, sangre entera, sangre lisada, suero, plasma, orina, lisado de cultivos celulares o lisado de células recién recolectadas (por ejemplo, células sanguíneas, tejido fresco disociado, células madre), células sanguíneas, células circulantes (por ejemplo, células tumorales circulantes (CTC)), ácidos nucleicos de sangre u otros fluidos corporales y otras categorías de muestras. Los ácidos nucleicos libres de células (por ejemplo, cfDNA o cfRNA) se pueden recuperar, tal como de a partir de sangre entera sin litar, utilizando las técnicas de la presente divulgación; a menudo, los ácidos nucleicos libres de células son ácidos nucleicos libres de células circulantes. Las muestras pueden provenir de una variedad de fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, tejido normal, neoplasias benignas, neoplasias malignas, células madre, tejido humano, tejido animal, tejido vegetal, bacterias, virus y fuentes ambientales (por ejemplo, agua). Los tejidos humanos o animales pueden incluir, pero no se limitan a, tejido epitelial, tejido conjuntivo (por ejemplo, sangre, hueso), tejido muscular (por ejemplo, músculo liso, músculo esquelético, músculo cardíaco) y tejido nervioso (por ejemplo, cerebro, médula espinal).
[0369] Las muestras pueden comprender una o más partículas en suspensión. Una o más partículas pueden variar desde el tamaño coloidal hasta el visible. La una o más partículas pueden tener un tamaño de al menos aproximadamente 1 nanómetro (nm), 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 150 nm, 200 nm, 250 nm, 300 nm, 350 nm, 400 nm, 450 nm, 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 950 nm, 1 micrómetro (pm), 10 pm, 20 pm, 30 pm, 40 pm, 50 pm, 60 pm, 70 pm, 80 pm, 90 pm, 100 pm, 150 pm, 175 pm, 200 pm, 225 pm, 250 pm, 275 pm, 300 pm, 350 pm, 400 pm, 450 pm, 500 pm, 550 pm, 600 pm, 650 pm, 700 pm, 750 pm, 800 pm, 850 pm, 900 pm, 950 pm, o 1 milímetro (mm). La una o más partículas pueden tener un tamaño de como máximo aproximadamente 1 nanómetro (nm), 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 150 nm, 200 nm, 250 nm, 300 nm, 350 nm, 400 nm, 450 nm, 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 950 nm, 1 micrómetro (pm), 10 pm, 20 pm, 30 pm, 40 pm, 50 pm, 60 pm, 70 pm, 80 pm, 90 pm, 100 pm, 150 pm, 175 pm, 200 pm, 225 pm, 250 pm, 275 pm, 300 pm, 350 pm, 400 pm, 450 pm, 500 pm, 550 pm, 600 pm, 650 pm, 700 pm, 750 pm, 800 pm, 850 pm, 900 pm, 950 pm, o 1 milímetro (mm). La una o más partículas pueden ser del mismo tamaño o de diferentes tamaños. Una muestra puede, por ejemplo, comprender una pluralidad de partículas que varían en tamaño desde 1 nm hasta 500 pm.
[0371] Muestras de varios volúmenes se pueden procesar en un dispositivo fluídico (por ejemplo, para extraer y purificar ácidos nucleicos). Por ejemplo, un volumen de muestra (con o sin tampón) puede ser de al menos aproximadamente 1 nanolitro (nL), 10 nL, 20 nL, 50 nL, 100 nL, 200 nL, 500 nL, 1 microlitro (pL), 10 pL, 20 pL, 30 pL, 40 pL, 50 pL, 60 pL, 70 pL, 80 pL, 90 pL, 100 pL, 150 pL, 175 pL, 200 pL, 225 pL, 250 pL, 275 pL, 300 pL, 350 pL, 400 pL, 450 pL, 500 pL, 600 pL, 700 pL, 800 pL, 900 pL, 1 mililitro (mL), 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, o 10 mL. Un volumen de muestra (con o sin tampón) puede ser como máximo de aproximadamente 1 nanolitro (nL), 10 nL, 20 nL, 50 nL, 100 nL, 200 nL, 500 nL, 1 microlitro (pL), 10 pL, 20 pL, 30 pL, 40 pL, 50 pL, 60 pL, 70 pL, 80 pL, 90 pL, 100 pL, 200 pL, 300 pL, 400 pL, 500 pL, 600 pL, 700 pL, 800 pL, 900 pL, 1 mililitro (mL), 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, o 10 mL. En algunos casos, un volumen de muestra puede ser desde aproximadamente 1 nL hasta aproximadamente 10 nL. Un volumen de muestra (con o sin tampón) puede ser al menos aproximadamente 1 nanolitro (nL), 10 nL, 20 nL, 50 nL, 100 nL, 200 nL, 500 nL, 1 microlitro (pL), 10 pL, 20 pL, 30 pL, 40 pL, 50 pL, 60 pL, 70 pL, 80 pL, 90 pL, 100 pL, 200 pL, 300 pL, 400 pL, 500 pL, 600 pL, 700 pL, 800 pL, 900 pL, 1 mililitro (mL), 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, o 10 mL. En algunos casos, un volumen de muestra puede ser desde aproximadamente 1 nL hasta aproximadamente 10 nL.
[0373] Las muestras con diferentes números de células se pueden procesar en un dispositivo fluídico (por ejemplo, para extraer y purificar los ácidos nucleicos). Por ejemplo, una muestra puede contener menos o igual a aproximadamente 20,000 células, 15,000 células, 10,000 células, 9,000 células, 8,000 células, 7,000 células, 6,000 células, 5,000 células, 4,500 células, 4,000 células, 3,500 células, 3,000 células, 2,500 células, 2,000 células, 1,500 células, 1,000 células, 900 células, 800 células, 700 células, 600 células, 500 células, 400 células, 300 células, 200 células, 100 células, 90 células, 80 células, 70 células, 60 células, 50 células, 40 células, 30 células, 20 células, 10 células, 5 células, 2 células, o 1 célula. En algunos casos, una muestra contiene al menos aproximadamente 10,000,000 células, 5,000,000 células, 1,000,000 células, 500,000 células, 100,000 células, 50,000 células, 20,000 células, 15,000 células, 10,000 células, 9,000 células, 8,000 células, 7,000 células, 6,000 células, 5,000 células, 4,500 células, 4,000 células, 3,500 células, 3,000 células, 2,500 células, 2,000 células, 1,500 células, 1,000 células, 900 células, 800 células, 700 células, 600 células, 500 células, 400 células, 300 células, 200 células, o 100 células.
[0375] Las muestras de diferentes masas se pueden procesar en un dispositivo fluídico (por ejemplo, para extraer y purificar los ácidos nucleicos). Por ejemplo, una muestra puede contener desde aproximadamente 0.001 miligramos (mg) y aproximadamente 10 mg de tejido. Una muestra puede contener como máximo aproximadamente 0.001 mg, 0.002 mg, 0.003 mg, 0.004 mg, 0.005 mg, 0.006 mg, 0.007 mg, 0.008 mg, 0.009 mg, 0.01 mg, 0.02 mg, 0.03 mg, 0.04 mg, 0.05 mg, 0.06 mg, 0.07 mg, 0.08 mg, 0.09 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, o 10 mg de tejido. Una muestra puede contener al menos aproximadamente 0.001 mg, 0.002 mg, 0.003 mg, 0.004 mg, 0.005 mg, 0.006 mg, 0.007 mg, 0.008 mg, 0.009 mg, 0.01 mg, 0.02 mg, 0.03 mg, 0.04 mg, 0.05 mg, 0.06 mg, 0.07 mg, 0.08 mg, 0.09 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, o 10 mg de tejido. Una muestra puede contener aproximadamente 0.001 mg, 0.002 mg, 0.003 mg, 0.004 mg, 0.005 mg, 0.006 mg, 0.007 mg, 0.008 mg, 0.009 mg, 0.01 mg, 0.02 mg, 0.03 mg, 0.04 mg, 0.05 mg, 0.06 mg, 0.07 mg, 0.08 mg, 0.09 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, o 10 mg de tejido.
[0377] Las muestras con diferentes cantidades de ácido nucleico s pueden procesar en un dispositivo fluídico (por ejemplo, para extraer y purificar ácidos nucleicos). Por ejemplo, las muestras pueden contener menos o igual a aproximadamente 1 microgramo (1 pg), 100 nanogramos (ng), 10 ng, 1 ng, 100 picogramos (pg), 10 pg o 1 pg de ácido nucleico. En algunos casos, las muestras pueden contener más o menos 1 microgramo (1 pg), 100 nanogramos (ng), 10 ng, 1 ng, 100 picogramos (pg), 10 pg o 1 pg de ácido nucleico.
[0379] Las muestras se pueden cargar en un tampón que comprende electrolito de cola o electrolito líder. Las muestras se pueden cargar en un tampón que comprende un segundo electrolito líder que difiere del electrolito líder utilizado para realizar la ITP Las muestras se pueden cargar en un tampón, tal como un tampón acuoso alcalino o un tampón acuoso neutro. Las soluciones alcalinas de ejemplo o tampones (por ejemplo, para la extracción de ADN) pueden contener NaOH 30-120 mM (en algunos casos, NaOH 40-80 mM) a un pH de aproximadamente 10-13 (en algunos casos, con al menos un componente adicional). En algunos casos, cuando la muestra se lisa mediante un tratamiento con una solución alcalina o tampón antes de cargarla en el chip, la muestra lisada se puede neutralizar posteriormente al agregar una solución ácida o tampón para llevar el pH de la muestra lisada dentro de un rango de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 8.5 antes de realizar la isotacoforesis. Los tampones acuosos de ejemplo (por ejemplo, para la extracción de ADN o ARN) pueden comprender Tris-HCl 2 a 150 mM (a un pH de aproximadamente 7 a 8) o BisTris-HCl a un pH de aproximadamente 5.8 a aproximadamente 7.3, con al menos un componente adicional. Los componentes adicionales utilizados en los tampones pueden incluir tensioactivos o detergentes no iónicos, tensioactivos o tensioactivos o detergentes iónicos o zwitteriónicos, agentes caotrópicos, agentes reductores de enlaces disulfuro, proteasas, nucleasas y otros aditivos o componentes que digieren, desnaturalizan, interrumpen o degradan con el fin de extraer, purificar, enriquecer o aislar de otra forma los ácidos nucleicos.
[0381] Los tensioactivos o detergentes no iónicos pueden incluir, pero no se limitan a, tensioactivos de las siguientes clases: etoxilato de octilfenol, polisorbato, poloxámero o polioxietileno. Los tensioactivos de etoxilato de octilfenol pueden incluir, pero no se limitan a, octilfenoxi polietoxietanol ramificado (IGEPAL CA-630), toctilfenoxipolietoxietanol (Triton™ X-100) u otras cadenas de óxido de polietileno con un grupo hidrocarbono aromático lipofílico o hidrofóbico. Los tensioactivos de polisorbato pueden incluir, pero no se limitan a, monolaurato de polietilenglicol sorbitán (Tween® 20), monooleato de polietilenglicol sorbitán (Tween® 80) o monooleato de sorbitán (Span® 80). Los tensioactivos de poloxámero (es decir, copolímeros de bloque basados en óxido de etileno y óxido de propileno) pueden incluir, pero no se limitan a, el copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno (Pluronic® F-68) o el copolímero de bloque de polietileno-polipropilenglicol (Pluronic® F-127). Los tensioactivos de polioxietileno pueden incluir, pero no se limitan a, fenoxipolietoxietanol de nonilo (NP-40).
[0383] Los tensioactivos o detergentes no iónicos pueden incluir, pero no se limitan a, IGEPAL® (por ejemplo, IGEPAL® CA-630), Triton™ X-100, Tween® 20, Tween® 80, NP-40, otros copolímeros en bloque, incluidos Pluronic® (por ejemplo, F-68 o F-127), Span® 80 y polímeros pegilados o copolímeros. Los tensioactivos o detergentes no iónicos se pueden utilizar para reducir o prevenir la adsorción de moléculas biológicas a las paredes del canal, o para controlar las propiedades de humectación y/o tensión superficial de los fluidos para controlar la carga de la muestra en los dispositivos fluídicos. Los tensioactivos o detergentes no iónicos pueden estar presentes en concentraciones desde aproximadamente 0.0005-5 % v/v o p/v. Por ejemplo, IGEPAL CA-630 se puede utilizar aproximadamente 0.05-0.5 % v/v. Los tensioactivos o detergentes iónicos pueden incluir, pero no se limitan a, dodecil sulfato de sodio (por ejemplo, al 0.01-2 % p/v), dodecilbencenosulfonato de sodio (por ejemplo, al 0.01-2 % p/v), sulfato de colesteril de sodio (por ejemplo, al 0.01 %-2 % p/v) y desoxicolato de sodio (por ejemplo, a aproximadamente 10-1000 mM). Los agentes caotrópicos pueden incluir, pero no se limitan a, urea (por ejemplo, a aproximadamente 0.5-9.5 M, o en algunos casos, 5-9.5 M), tiourea, butanol, etanol, cloruro de guanidinio, perclorato de litio, acetato de litio, cloruro de litio, cloruro de magnesio, fenol y propano. Por ejemplo, urea 7.0 M y tiourea 2.0 M se pueden utilizar en una solución tamponada de Tris-HCl 5­ 50 mM (en algunos casos, Tris-HCl 10-20 mM) para extracciones de ARN o ADN, o para extracciones de ácidos nucleicos totales. La relación de urea a tiourea puede ser al menos 1:1, 1.5:1, 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, 4:1, 4.5:1, 5:1, 6:1,6.5:1, 7:1, 7.5:1, o 8:1. Los agentes reductores de enlaces disulfuro pueden incluir, pero no se limitan a, DTT (por ejemplo, a aproximadamente 0.1-40 mM, o en algunos casos aproximadamente de 10 mM) y betamercaptoetanol (por ejemplo, a aproximadamente 0.5-2 %, o en algunos casos aproximadamente del 1 %). Las proteasas pueden incluir, pero no se limitan a, Proteinasa K, proteasas, endoproteinasas (por ejemplo, tripsina, LysC, GluC, AspN), peptidasas, pepsina y papaína. Las nucleasas pueden incluir, pero no se limitan a, enzimas de digestión de ácidos nucleicos no específicas tales como las DNasas, que incluyen la DNasa I (por ejemplo, para preparar extracciones de ARN sin ADN) y la RNasa, como la ARNasa A, la ARNasa T o combinaciones de las mismas (por ejemplo, para preparar extracciones de ADN sin ARN). Las nucleasas también pueden incluir enzimas específicas de digestión de ácidos nucleicos (por ejemplo, enzimas de restricción) que pueden cortar secuencias específicas de ácidos nucleicos y pueden producir tamaños de fragmentos predecibles y distribuciones de tamaño de fragmentos. En algunos casos, uno o más métodos o procesos proporcionados en el presente documento se realizan sin el uso de una nucleasa, sin el uso de una ADNasa o sin el uso de una ARNasa. Por ejemplo, los métodos proporcionados en el presente documento incluyen la extracción de ARN sin el uso de ADNasa.
[0385] Las enzimas de restricción pueden incluir, pero no se limitan a, las enzimas de restricción de Tipo 1 a Tipo V, BamHI, EcoP15I, EcoRI, EcoRII, EcoRV, HaeIII, HgaI, HindIII, HinFI, KpnI, NotI, PstI, PvuII, SacI, SalI, SmaI, SpeI, SphI, XbaI, y StuI. Las nucleasas se pueden utilizar en concentraciones que incluyen 50-400 pg/mL. Las digestiones de nucleasas se pueden realizar a temperaturas que incluyen desde aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 37 °C. Se pueden utilizar otras enzimas modificadoras de ácidos nucleicos, tales como las transposasas, las ligasas, las polimerasas y las fosfatasas. Se pueden utilizar otros agentes de digestión o degradación de proteínas o polinucleótidos, tales como las lisozimas.
[0387] Antes de cargarlas en un dispositivo fluídico, las muestras se pueden someter a varios grados de preprocesamiento. En algunos casos, una muestra se puede cargar simplemente en un tampón antes de cargarla en un dispositivo fluídico, y cualquier otra etapa de preparación de la muestra necesaria o deseada se puede llevar a cabo en el dispositivo. En otros casos, la muestra se puede agregar a un depósito de muestra que está prellenado con un fluido de procesamiento tal como una solución o un tampón. En otros casos, una muestra se puede someter a la eliminación de material embebido, interrupción de tejidos, lisis celular o digestión antes de cargarla en un dispositivo fluídico. En un ejemplo, una muestra se desparafina antes de cargarla en un dispositivo fluídico, y el desentrecruzamiento de los ácidos nucleicos se conduce en el dispositivo fluídico. En otro ejemplo, una muestra se desparafina, se interrumpe y se lisa antes de cargarla en un dispositivo de fluido y, opcionalmente, se conduce el desentrecruzamiento de los ácidos nucleicos en el dispositivo de fluidos. En otro ejemplo, una muestra se desparafina antes de cargarla en un dispositivo fluídico, y la interrupción de tejido y la lisis celular se conducen en el dispositivo fluídico. En otro ejemplo, una muestra se carga en un dispositivo fluídico y se conducen el desparafinado, interrupción de tejido, lisis celular y desentrecruzamiento de los ácidos nucleicos en el dispositivo fluídico. Las etapas de preparación de la muestra se discuten con más detalle en esta divulgación.
[0389] Preparación de muestras
[0391] Las muestras se pueden preparar antes de la isotacoforesis. La preparación de la muestra puede implicar etapas que incluyen, pero no se limitan a, la eliminación del material embebido, la interrupción de tejidos, la lisis celular, la digestión de proteínas, la eliminación del entrecruzamiento de ácidos nucleicos, el proceso enzimático isotérmico, la amplificación enzimática, la digestión enzimática, la interrupción de las uniones célulacélula, la interrupción de la matriz extracelular, la interrupción del tejido conjuntivo y combinaciones de los mismos. La preparación de muestras puede implicar técnicas tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otra amplificación de ácidos nucleicos, aislamiento o purificación de material (por ejemplo, células, ácidos nucleicos) de interés, hibridación de sondas e hibridación de anticuerpos (por ejemplo, la hibridación de anticuerpos contra nucleosomas). En algunos casos, las muestras se pueden preparar al aislar una porción del material de las células de la muestra para posterior análisis. Por ejemplo, las células tumorales circulantes se pueden aislar de una población heterogénea de células utilizando dispositivos de clasificación de células tales como un citómetro de flujo o una columna magnetizada. En otro ejemplo, los linfocitos de sangre periférica (PBL) o las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se pueden aislar de una muestra de sangre. La preparación de la muestra se puede llevar a cabo dentro o fuera del dispositivo. En algunos casos, algunas etapas de preparación de la muestra se conducen fuera del dispositivo y, a continuación, la muestra se carga en un dispositivo fluídico donde se conducen etapas adicionales de preparación de la muestra.
[0393] El material biológico (por ejemplo, células, tejidos, ácidos nucleicos) en una muestra embebida se puede eliminar del material embebido. Por ejemplo, una muestra embebida en parafina se puede desparafinar. La eliminación del material embebido se puede llevar a cabo utilizando técnicas que incluyen, pero no se limitan a, el tratamiento térmico, tratamiento químico (por ejemplo, ácido o base), tratamiento enzimático y combinaciones de los mismos. El desparafinado se puede realizar mediante el tratamiento químico de una muestra, mediante el tratamiento térmico de una muestra, mediante el tratamiento enzimático de una muestra u otros métodos. Por ejemplo, el desparafinado se puede llevar a cabo a una temperatura elevada (por ejemplo, de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 80 °C) en presencia de un tampón neutro o un tampón algo ácido (por ejemplo, hasta un pH aproximado de 5.5) o una solución algo básica (hasta un pH aproximado de 9) o alcalina (por ejemplo, un pH de aproximadamente 12 a aproximadamente 13). La eliminación del material embebido se puede llevar a cabo fuera del dispositivo o dentro del dispositivo. Por ejemplo, una muestra embebida se puede incubar a una temperatura elevada en un recipiente y posteriormente cargar en un dispositivo fluídico. En otro ejemplo, una muestra embebida se puede cargar en un dispositivo fluídico e incubar a una temperatura elevada en el dispositivo, por ejemplo, en el canal o en un depósito.
[0395] La eliminación del material embebido se puede llevar a cabo mediante tratamiento térmico. La incubación para la eliminación del material embebido se puede llevar a cabo a una temperatura de al menos aproximadamente 35 °C, 37 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C, 95 °C, 96 °C, 97 °C, 98 °C, 99 °C, 99.5 °C, o 100 °C. La incubación para la eliminación del material embebido se puede llevar a cabo a una temperatura desde aproximadamente 40 °C hasta aproximadamente 80 °C, desde aproximadamente 50 °C hasta aproximadamente 80 °C, desde aproximadamente 50 °C hasta aproximadamente 99.9 °C, o aproximadamente 95 a aproximadamente 99.5 °C. La incubación para la eliminación del material embebido se puede llevar a cabo por una duración de al menos aproximadamente 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 35 minutos, 40 minutos, 45 minutos, 50 minutos, 55 minutos, 60 minutos, 65 minutos, 70 minutos, 75 minutos, 80 minutos, 85 minutos, 90 minutos, 95 minutos, 100 minutos, 105 minutos, 110 minutos, 115 minutos, o 120 minutos. La incubación para la eliminación del material embebido se puede llevar a cabo por una duración desde aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 20 minutos, desde aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 30 minutos, desde aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 60 minutos, desde aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 120 minutos, o desde aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 20 minutos. La incubación para la eliminación del material embebido por ejemplo se puede llevar a cabo a una temperatura de al menos aproximadamente 37 °C por una duración de al menos aproximadamente 1 minuto. La incubación para la eliminación del material embebido se puede llevar a cabo en la presencia de un tampón alcalino o a neutral buffer (por ejemplo tampón de lisis). Un tampón alcalino (por ejemplo tampón de lisis) puede tener un pH de al menos aproximadamente 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, o 13.5. Un tampón neutro puede tener un pH de aproximadamente 7.0 (por ejemplo, desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 8).
[0397] Los tejidos o células se pueden interrumpir o lisar, liberando ácidos nucleicos para separación, purificación o extracción. La interrupción de tejido o la lisis celular se pueden llevar a cabo utilizando técnicas que incluyen, pero no se limitan a, el estrés mecánico, sonicación, electroporación, presión osmótica, tratamiento químico (por ejemplo, ácido o base), tratamiento enzimático, tratamiento térmico y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, la presión se puede utilizar para impulsar el tejido a través de una estructura (por ejemplo, un canal, una resina tal como una frita o resina porosa, o un material de vidrio) para interrumpir mecánicamente el tejido o lisar las células. En algunos casos, el tampón de electrolito de cola puede comprender uno o más agentes de interrupción de tejido y/o agentes de lisis celular. En algunos casos, el tampón de electrolito líder puede comprender uno o más agentes de interrupción de tejido y/o agentes de lisis celular. En algunos casos, la eliminación del material embebido se puede lograr mediante el mismo proceso que la interrupción de tejidos o la lisis celular. Por ejemplo, la incubación a una temperatura elevada (por ejemplo desde aproximadamente 30 °C hasta aproximadamente 80 °C, desde aproximadamente 50 °C a aproximadamente 80 °C, o desde aproximadamente 30 °C hasta aproximadamente 65 °C) puede lograr la eliminación del material embebido, la interrupción de los tejidos y la lisis celular. La interrupción de tejido o la lisis celular se pueden llevar a cabo fuera del dispositivo o dentro del dispositivo. En un ejemplo, una muestra de tejido se interrumpe en un recipiente y posteriormente se carga en un dispositivo fluídico. En otro ejemplo, una muestra de tejido previamente cargada en un dispositivo fluídico se interrumpe en el dispositivo.
[0399] Las muestras que componen tejido o células se pueden lisar antes o después de cargarlas en un dispositivo fluídico utilizando una solución de lisis o tampón compatible con la isotacoforesis. Los tampones de lisis compatibles con la isotacoforesis pueden incluir tensioactivos o detergentes no iónicos, tensioactivos o detergentes iónicos o zwitteriónicos, agentes caotrópicos, agentes reductores de enlaces disulfuro, proteasas, nucleasas y otros aditivos o componentes que digieren, desnaturalizan, interrumpen o degradan con el fin de extraer, purificar, enriquecer (concentrar) o de otra forma aislar ácidos nucleicos. En algunos casos, un tampón de lisis puede comprender un tampón alcalino. En algunos casos, es posible que un tampón de lisis no comprenda un tampón alcalino. Un tampón de lisis de ejemplo puede incluir urea 0.5 M a 9.5 M, 4 M a 9 M o 6.5 M a 7 M, como se describe en el presente documento. Un tampón de lisis de ejemplo puede incluir tiourea de 0.5 M a 3.5 M o de 1.5 M a 2.5 M, como se describe en el presente documento. Un ejemplo de tampón de lisis puede incluir urea y tiourea 0.5-9.5 M, por ejemplo, urea 7M y tiourea 2M con un tensioactivo no iónico como se describe en el presente documento. El uso de urea sola o en combinación con tiourea se puede utilizar para lisar células para la purificación de ácidos nucleicos. En combinación, la urea y la tiourea pueden actuar sinérgicamente para lisar las células y pueden proporcionar un tampón no cargado compatible con la isotacoforesis para la purificación de ácidos nucleicos.
[0401] Un tampón de lisis de ejemplo puede incluir un tensioactivo no iónico tal como 0.05-0.5 % v/v de IGEPAL CA-630 como se describe en el presente documento. En algunos casos, el tampón de lisis puede comprender uno o más electrolitos líderes. En algunos casos, el tampón de lisis puede comprender un tampón de electrolito de cola con aditivos para la interrupción de tejido o la lisis celular, como se describe en el presente documento. En algunos casos, el tampón de lisis puede comprender uno o más electrolitos líderes. En algunos casos, el tampón de lisis puede comprender un tampón de electrolito líder con aditivos para la interrupción de tejidos o la lisis celular, como se describe en el presente documento. En algunos casos, el tampón de lisis puede comprender uno o más electrolitos líderes y uno o más electrolitos de cola. En algunos casos, el tampón de lisis puede comprender uno o más electrolitos líderes y uno o más electrolitos de cola con aditivos para la interrupción de tejido o la lisis celular, como se describe en el presente documento.
[0403] En algunos casos, un método o proceso descrito en el presente documento puede implicar la lisis de una muestra de célula o tejido utilizando un tampón de lisis que minimiza la interrupción mecánica del ADN y/o ARN durante la reacción de lisis. Por ejemplo, las células o el tejido se pueden lisar en una solución tampón que contiene Tris (por ejemplo, Tris 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM) con HCl (por ejemplo, HCl 1 mM, 5 mM, 10 mM) y un tensioactivo no iónico. El detergente no iónico (por ejemplo, IGEPAL CA-630) puede estar presente en aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 2 %, aproximadamente el 3 %, aproximadamente el 4 % o más en el tampón de lisis, o menos de aproximadamente 1 %. Las células o el tejido se pueden lisar en el tampón de lisis mediante una mezcla suave, como por inversión y a baja velocidad (pipeta automatizada). Una enzima tal como la proteinasa K se puede, en algunos casos, incluir en el tampón de lisado o lisis. En algunos casos, la lisis se lleva a cabo sin centrifugación. En algunos casos, se utiliza la centrifugación en el método de lisis. El lisado se puede introducir en un dispositivo de isotacoforesis para purificar un analito deseado tal como fragmentos de ADN de alto peso molecular.
[0405] Las proteínas en una muestra pueden ser digeridas, por ejemplo, a través de la digestión enzimática con proteasas. Las proteasas pueden incluir, pero no se limitan a, proteinasa K, proteasas, endoproteinasas (por ejemplo, tripsina, LysC, GluC, AspN), peptidasas, pepsina y papaína. Se pueden utilizar otros agentes de digestión o degradación de proteínas o polinucleótidos, tales como las lisozimas. La digestión de las proteínas puede eliminar las proteínas entrecruzadas de los ácidos nucleicos entrecruzados, convirtiéndolos en ácidos nucleicos no entrecruzados. La digestión de las proteínas puede ocurrir a temperatura ambiente o a temperaturas elevadas descritas en el presente documento (por ejemplo, mayor de aproximadamente 25 °C).
[0406] La muestra se puede procesar en un dispositivo (por ejemplo, un dispositivo o sistema electrocinético con al menos un depósito conectado a al menos un canal), de tal manera que el volumen de la muestra pasa a través del depósito hacia el canal con menos del 20 % del volumen de la muestra dejado en el depósito, y posteriormente se puede aplicar una corriente iónica a través del volumen de la muestra en el canal. Es posible que la corriente iónica no pase sustancialmente a través del canal. En algunos casos, menos del 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 % 2 % o 1 % del volumen de muestra queda en el depósito.
[0407] La muestra puede ser procesada en un dispositivo (por ejemplo, un dispositivo o sistema electrocinético con al menos un depósito conectado a al menos un canal), de tal manera que el volumen de muestra que pasa a través del depósito hacia el canal es al menos el 50 % del volumen de muestra cargado en el depósito, y posteriormente se puede aplicar una corriente iónica a través del volumen de muestra en el canal. En algunos casos, al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más del volumen de muestra se traslada del depósito al canal. En algunos casos, el volumen total cargado en el depósito es menor o igual a un volumen interno del depósito. Es posible que la corriente iónica no pase sustancialmente a través del canal. En algunos casos, la aplicación de una corriente iónica implica llevar a cabo la isotacoforesis.
[0408] Dispositivos de isotacoforesis
[0410] La isotacoforesis y/o la preparación de muestras (por ejemplo, desparafinado, digestión, lisis) se pueden llevar a cabo en un dispositivo fluídico, por ejemplo, un chip microfluídico. Por ejemplo, la FIG. 5A muestra un esquema de un canal con una zona 500 de preparación de muestras (por ejemplo, desparafinado) con una entrada de muestra 501 y un depósito de electrolito de cola 502, una zona de purificación (por ejemplo, isotacoforesis) 510 con un depósito de electrolito líder 511 y una salida de elución 520. Una barrera capilar puede proporcionar una interfaz entre el fluido de muestra y el tampón de electrolito líder antes de aplicar voltaje. Se puede proporcionar una barrera capilar entre la zona de preparación de muestras 500 y el depósito de electrolito de cola 502 para limitar, reducir o evitar el flujo de mezcla o presión del fluido de muestra y el tampón de electrolito de cola. Se puede proporcionar una barrera capilar entre la zona de purificación 510 y el depósito de electrolito líder 511 para limitar, reducir o evitar la mezcla o el flujo impulsado por la presión del contenido de la zona 510 y el depósito de electrolito líder 511. En otro ejemplo, el desparafinado se puede realizar primero fuera del chip, o puede ser innecesario debido al material de partida, en cuyo caso el canal puede comprender una zona de lisis y digestión (por ejemplo, pH 7, 56 °C) y una zona de eliminación y purificación de entrecruzamiento (por ejemplo, isotacoforesis) (por ejemplo, pH 7, 80 °C). En otro ejemplo, el desparafinado se puede realizar primero fuera del chip, o puede ser innecesario debido al material de partida, en cuyo caso el canal puede comprender una zona de lisis y digestión (por ejemplo, pH 7, temperatura T1) y una zona de eliminación y/o purificación de entrecruzamiento (por ejemplo, isotacoforesis) (por ejemplo, pH 7, temperatura T2). En otro ejemplo, el desparafinado se puede realizar primero fuera del chip, o puede ser innecesario debido al material de partida, en cuyo caso el canal puede comprender una zona de interrupción y/o lisis (por ejemplo, pH 7, temperatura T1) y una zona de digestión y/o purificación (por ejemplo, isotacoforesis) (por ejemplo, pH 7, temperatura T2). En otro ejemplo, el desparafinado se puede realizar primero en el chip, o puede ser innecesario debido al material de partida, en cuyo caso el canal puede comprender una zona de interrupción y/o lisis (por ejemplo, pH 7, temperatura T1) y una zona de amplificación enzimática isotérmica (por ejemplo, pH 7, temperatura T2). En otro ejemplo, el desparafinado se puede realizar primero o puede ser innecesario debido al material de partida, en cuyo caso el canal puede comprender una zona de interrupción y/o lisis (por ejemplo, pH 7, temperatura T1) y una zona de digestión enzimática isotérmica (por ejemplo, pH 7, temperatura T2). En algunos casos, el canal puede comprender tres zonas, por ejemplo, una zona de interrupción y/o lisis (por ejemplo, pH 7, temperatura T1), una zona de amplificación enzimática isotérmica (por ejemplo, pH 7, temperatura T2) y una zona de purificación (por ejemplo, isotacoforesis) (por ejemplo, pH 7, temperatura T3). La FIG. 5B muestra un ejemplo de cartucho de dispositivo fluídico con ocho canales paralelos cada uno, como se muestra en la FIG. 5A. La FIG. 5C muestra un esquema de vista superior del dispositivo fluídico que se muestra en la FIG. 5B, mientras que la FIG. 5D y la FIG. 5E muestran las vistas lateral y final, respectivamente. Los dispositivos pueden incluir entradas de muestras o depósitos 530, depósitos de tampón de electrolito ITP 531 y salidas o depósitos de elución de muestras 532. Los canales y/o depósitos se pueden acoplar a uno o más puertos neumáticos. Cada uno de los ocho canales paralelos del dispositivo fluídico se puede operar independientemente de cada uno de los otros canales. En algunos casos, cada canal tiene un conjunto dedicado de electrodos y circuitos eléctricos para impulsar ITP Los electrodos se pueden ubicar, por ejemplo, en el depósito de electrolito de cola 502 y en el depósito de electrolito líder 511, de tal manera que los electrodos no entren en contacto directo con el material de muestra.
[0412] En algunos casos, hay poco o ningún flujo de fluido o iones entre canales paralelos. En algunos casos, es posible que los canales paralelos no estén en comunicación fluida entre sí. La tasa de fuga de fluido entre canales paralelos puede ser menor de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, o 1 pL por hora.
[0414] En algunos casos, hay poca o ninguna comunicación eléctrica entre canales paralelos, de tal manera que los canales paralelos están eléctricamente aislados entre sí. Cada uno de los canales paralelos se puede controlar eléctricamente de forma independiente para aplicar un campo eléctrico independiente a cada uno de los canales. En algunos casos, la fuga de corriente entre los canales es menor que aproximadamente 0.1 microamperios (<j>A), 0.2 pA, 0.3 pA, 0.4 pA, 0.5 pA, 0.6 pA, 0.7 pA, 0.8 pA, 0.9 pA, o 1 pA En algunos casos, la impedancia entre canales puede ser mayor de 0.1 mega Ohm (MOhm), 0.2 MOhm, 0.3 MOhm, 0.4 MOhm, 0.5 MOhm, 0.6 MOhm, 0.7 MOhm, 0.8 MOhm, 0.9 MOhm, 1 MOhm, 5 MOhm, 10 MOhm, 20 MOhm, 30 MOhm, 40 MOhm, o 50 MOhm.
[0416] En algunos casos, se puede calentar cada zona del dispositivo isotacofluídico. En algunos casos, las zonas se calientan a la misma temperatura. En algunos casos, las zonas individuales se calientan a diferentes temperaturas. En algunos casos, una primera zona se puede calentar a una temperatura superior a 37 °C, por ejemplo, dentro de un rango de aproximadamente 60 °C a aproximadamente 100 °C. En algunos casos, una segunda zona se puede calentar a una temperatura superior a 37 °C, por ejemplo, dentro de un rango de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 60 °C.
[0418] Un dispositivo fluídico de isotacoforesis puede comprender uno o más depósitos, que incluyen, pero no se limitan a, depósitos de carga de tampón, depósitos de carga de muestras (que incluyen los depósitos que aceptan líquidos o soluciones sólidas, multifásicas u otros no homogéneos tales como tejidos, sangre entera o suspensiones celulares no lisadas), depósitos de electrolitos líderes, depósitos de electrolitos de cola, depósitos de reactivos, depósitos de elución (por ejemplo, para descargar muestras procesadas), y depósitos de gas o aire. En algunos casos, un depósito físico se puede utilizar para múltiples propósitos, como la carga de tampón y la carga de muestras. Los depósitos de líquido o aire se pueden utilizar para aplicar presión externa para la carga de líquido (por ejemplo, presión positiva en pocillos de líquido o vacío en depósitos de gas solamente).
[0419] Los depósitos pueden estar en comunicación térmica con una fuente de calefacción o refrigeración, lo que permite controlar la temperatura del depósito y de cualquier material que contenga (por ejemplo, reactivo, muestra, producto). Por ejemplo, un depósito de elución se puede controlar térmicamente para controlar la temperatura del producto eluido (por ejemplo, para la conservación de la estructura, la integridad) mientras está dentro del dispositivo fluídico.
[0421] Los depósitos de reactivos se pueden utilizar para cargar uno o más reactivos para procesar la muestra antes, durante o después de la isotacoforesis. Los reactivos pueden incluir reactivos de digestión, reactivos de amplificación, reactivos de transcripción inversa, soluciones poliméricas lineales para separaciones basadas en tamaños, sondas para reacciones de hibridación, reactivos de ligadura, tintes, trazadores, etiquetas y otros reactivos. Los depósitos de reactivos se pueden conectar a un canal de reacción, o a una sección de reacción de otro canal, donde pueden producirse reacciones. Se puede aplicar calentamiento o enfriamiento (por ejemplo, con controladores térmicos como se discute en el presente documento) para catalizar reacciones (tales como reacciones enzimáticas con ácidos nucleicos o proteínas), para hibridar o fundir ácidos nucleicos, o eliminar tintes intercalados de los ácidos nucleicos (por ejemplo, antes de la elución). El calentamiento y el enfriamiento también se pueden utilizar para controlar una temperatura de funcionamiento fija para llevar a cabo ITP (por ejemplo, el enfriamiento se puede aplicar para reducir los efectos del calentamiento de Joule), o para mantener un depósito (por ejemplo, un depósito de elución) a una temperatura fija (por ejemplo, más fría que la temperatura ambiente), como para el almacenamiento estable de ácidos nucleicos purificados. La luz se puede aplicar (por ejemplo, con fuentes de luz como se discute en el presente documento) para fines que incluyen interrogación óptica, excitación fluorescente y energía de reacción o catálisis.
[0423] Los depósitos de gas o aire, o salidas de gas o aire, se pueden conectar a través de canales de gas a canales de líquido dentro de un dispositivo fluídico para permitir la purga de aire u otros gases del dispositivo fluídico (por ejemplo, durante el llenado de líquido del dispositivo fluídico). Los depósitos de gas o aire, o los puertos de presión neumática, se pueden conectar a través de canales de gas a canales de líquido para permitir el bombeo de fluidos hacia o dentro del dispositivo fluídico (por ejemplo, para el bombeo de fluidos desde depósitos a canales).
[0425] Un dispositivo puede comprender múltiples zonas de purificación (por ejemplo, isotacoforesis) en conexión entre sí. Por ejemplo, una segunda zona de isotacoforesis se puede dividir y ejecutar en paralelo a una primera zona de isotacoforesis, lo que permite la división de una banda de muestra en una relación específica (por ejemplo, basada en una relación de corrientes entre las dos zonas) para el procesamiento en paralelo.
[0427] Un dispositivo fluídico puede comprender múltiples zonas de purificación en paralelo (véase, por ejemplo, FIG.
[0428] 5C). Por ejemplo, un dispositivo fluídico puede comprender más de un conjunto de zonas de purificación, cada una con depósitos, entradas, salidas, canales y cualesquier otros componentes asociados descritos en el presente documento (por ejemplo, zonas de preparación de muestras, electrodos, calentadores, detectores) en paralelo, separados entre sí y cada uno capaz de procesar una muestra de forma independiente. Un dispositivo fluídico puede comprender al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 48, 96 o más zonas de purificación en paralelo. Un dispositivo fluídico puede comprender varios canales en paralelo. Un dispositivo fluídico puede comprender al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 48, 96 o más canales en paralelo. Los componentes, tales como las zonas o los canales de purificación, ubicados en paralelo pueden estar uno al lado del otro, ubicados en diferentes capas del dispositivo (por ejemplo, capas horizontales o verticales) o colocados en diferentes disposiciones. Los componentes paralelos pueden ser idénticos, o se pueden diseñar de manera diferente, pero funcionan de manera equivalente o casi equivalente. Por ejemplo, los canales paralelos pueden tener diferentes geometrías para permitir una huella general más pequeña del dispositivo fluídico, pero aún así funcionar de manera similar. Alternativamente, los componentes paralelos se pueden diseñar para funcionar de manera diferente, por ejemplo, para procesar diferentes tipos de muestras en paralelo o para someter muestras a diferentes operaciones. En algunos casos, los componentes paralelos se pueden diseñar para someter diferentes tipos de muestras a diferentes operaciones en paralelo. En algunos casos, los componentes paralelos se pueden diseñar para someter los mismos tipos de muestra a diferentes operaciones en paralelo. En algunos casos, los componentes paralelos se pueden diseñar para someter diferentes tipos de muestras a las mismas operaciones en paralelo. En algunos casos, los componentes paralelos se pueden diseñar para someter los mismos tipos de muestra a las mismas operaciones en paralelo. En algunos casos, los componentes paralelos se pueden diseñar para someter simultánea y/o independientemente dos o más muestras a una o más operaciones en paralelo. En algunos casos, una tasa de fuga entre dos o más canales (o entre dos o más zonas de purificación) es menor que 0.5 pl por hora, menos de 1 pl por hora, menos de 5 pl por hora, menos de 10 pl por hora. En algunas realizaciones, una tasa de fuga de corriente entre dos o más canales (o entre dos o más zonas de purificación) es menor que 0.5 pA, menor que 1 pA, menor que 5 pA o menor que 10 pA En algunas realizaciones, una impedancia entre canales o zonas es mayor que 0.5 megaOhm, mayor que 1 megaOhm, mayor que 5 megaOhm, o mayor que 10 megaOhm.
[0430] Como se discutió en el presente documento, un dispositivo fluídico se puede diseñar para procesar diferentes volúmenes de muestra. Por ejemplo, las FIG. 6A, FIG. 6B, FIG. 6C y FIG. 6D muestran las vistas superior, lateral, inferior y superior de tres cuartos, respectivamente, de un dispositivo fluídico de ITP de purificación rápida 600 para volúmenes de muestra mayores o iguales a aproximadamente 200 pL. El dispositivo comprende un canal 600 conectado a los pocillos de entrada de muestra 601, los pocillos tampón de ITP 602 y los pocillos de salida de muestra (elución) 603. Los pocillos tampón de ITP 602 pueden incluir un depósito de tampón de elución 605, un depósito de electrolito líder 606, un depósito de tampón de electrolito líder 607 y un depósito de electrolito de cola 608. El depósito de elución 603 se puede conectar al depósito de tampón de elución 605 mediante un canal de tampón de elución 609. Se puede proporcionar una barrera capilar en el canal de tampón de elución 609 para reducir o evitar la mezcla o el flujo impulsado por la presión entre los contenidos del depósito de tampón de elución 605 y el depósito de elución 603. El depósito de electrolito líder 606 se puede conectar al depósito de tampón de electrolito líder 607 mediante un canal de tampón de electrolito líder 610. Se puede proporcionar una barrera capilar en el canal de tampón de electrolito líder 610 para reducir o evitar la mezcla o el flujo impulsado por la presión entre los contenidos del depósito de tampón de electrolito líder 607 y el depósito de electrolito líder 606. El depósito de tampón 605 puede contener electrolitos tampón de elución con una fuerza iónica mayor que los del depósito de elución 603, mientras que el depósito de tampón 607 puede contener electrolitos líderes con una fuerza iónica mayor que los del depósito de electrolito líder 606. El dispositivo puede comprender además puertos neumáticos 604 a lo largo de sus bordes que están configurados para acoplarse a un dispositivo neumático, por ejemplo, una fuente de vacío en un instrumento de mesa. Los puertos neumáticos 604 se pueden acoplar al canal 600 y los depósitos mediante canales de gas como se describe en el presente documento. La aplicación de succión en los puertos neumáticos 604 puede cargar la muestra, el electrolito líder y el tampón de elución en el canal 600. En algunos casos, el fluido tampón de electrolito de cola permanece en el depósito de electrolito de cola 608. La succión se puede aplicar simultánea o secuencialmente a los puertos neumáticos 604 para cargar el canal 600 simultáneamente o en etapas, respectivamente. La muestra se puede cargar en una primera zona o subcanal del canal 600 que se extiende desde el depósito de electrolito de cola 608 hasta una barrera capilar 611 a una dispersión baja de 180° en el canal 600. La barrera capilar 611 puede proporcionar una interfaz entre la muestra y el tampón de electrolito líder durante la carga para limitar, reducir o evitar la mezcla o el flujo impulsado por la presión. Se puede proporcionar una barrera capilar entre el depósito de electrolito de cola 608 y la primera zona o subcanal para limitar, reducir o evitar la mezcla o el flujo impulsado por la presión entre el contenido del depósito de electrolito de cola 608 y la muestra. El electrolito líder se puede cargar en la segunda zona o subcanal del canal 600 que se extiende desde la barrera capilar 611 hasta la barrera capilar 612. La barrera capilar 612 puede proporcionar una interfaz entre el tampón de electrolito líder y el tampón de elución. El tampón de elución se puede cargar en una tercera zona o subcanal del canal 600 que se extiende desde la barrera capilar 612 hasta el depósito de elución 603. En algunas realizaciones, los pocillos tampón de ITP 602 pueden comprender además un depósito de tampón de electrolito de cola (no mostrado) que contiene electrolitos de cola a una fuerza iónica mayor que los del depósito de electrolito de cola 608. El depósito de tampón de electrolito de cola puede estar conectado al depósito de electrolito de cola 608 mediante un canal de tampón de electrolito de cola (no mostrado). El canal de tampón de electrolito de cola puede comprender una barrera capilar para limitar, reducir o evitar la mezcla o el flujo impulsado por presión entre el contenido del depósito de tampón de electrolito de cola y el depósito de electrolito de cola 608.
[0432] Los electrodos pueden, por ejemplo, estar ubicados en el depósito de electrolito de cola 608, un depósito de tampón de electrolito de cola (no mostrado), el depósito de electrolito líder 606 y/o el depósito de tampón de electrolito líder 607 de tal manera que los electrodos no entren en contacto directo con el material de muestra. Los electrodos se pueden activar para alterar o controlar el campo eléctrico aplicado en respuesta a la retroalimentación de un sensor, por ejemplo, un sensor de voltaje, corriente, conductividad o temperatura, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, se puede detectar el paso de los ácidos nucleicos dentro de la zona de ITP desde la segunda zona del canal 600 a la tercera zona del canal 600 y la retroalimentación del detector puede activar el cambio de la corriente aplicada. Por ejemplo, la corriente se puede aumentar, reducir o terminar de acuerdo con el protocolo del instrumento. Por ejemplo, la corriente se puede pausar (por ejemplo, reducir temporalmente a cero) para permitir la cuantificación en chip de los ácidos nucleicos. Alternativamente o en combinación, la corriente se puede reducir para ralentizar la isotacoforesis dentro de la tercera zona para permitir que los ácidos nucleicos que se pueden haber dispersado en la transición del tampón de electrolito líder al tampón de elución (o segundo tampón de electrolito líder) tengan tiempo para concentrarse aún más antes de llegar al pocillo de elución 603.
[0433] Los métodos y procesos proporcionados en el presente documento incluyen métodos y procesos que utilizan cualquiera de los dispositivos proporcionados en el presente documento. Los dispositivos proporcionados en el presente documento con múltiples canales para procesar múltiples muestras en paralelo se pueden utilizar en una variedad de contextos. En algunos casos, un método puede incluir el uso de un dispositivo para procesar múltiples muestras (por ejemplo, mal llevar a cabo la isotacoforesis en dichas muestras) que comparten una determinada característica (por ejemplo, lisado de tejido sólido, lisado de células, tejido sólido, tejido fijo). En algunos casos, las muestras múltiples pueden ser muestras diferentes. Por ejemplo, el método puede consistir en realizar isotacoforesis en una muestra de tejido en una zona del dispositivo mientras se lleva a cabo simultáneamente, pero de forma independiente, la isotacoforesis en una muestra diferente, como una muestra celular o una muestra que comprende ácidos nucleicos entrecruzados.
[0435] En algunos casos, un método o proceso de multiplexación proporcionado en el presente documento puede implicar llevar a cabo la isotacoforesis en una muestra en un canal en paralelo con llevar a cabo la isotacoforesis en una segunda muestra en un segundo canal utilizando electrolito líder y/o tampones de electrolito de cola que son iguales o similares. En algunos casos, una muestra en uno de los canales se procesa utilizando un primer tampón de electrolito líder y una muestra en un canal diferente se procesa utilizando un segundo tampón de electrolito líder que es diferente del primero. Por ejemplo, el primer tampón de electrolito líder puede contener uno o más iones del electrolito líder que son diferentes de los contenidos en el segundo tampón de electrolito líder. En otro ejemplo, el primer tampón de electrolito líder puede contener uno o más iones del electrolito líder que son los mismos que los contenidos en el segundo tampón de electrolito líder, pero la concentración de dichos iones del electrolito líder en el primer tampón de electrolito líder es diferente de la concentración de dichos iones en el segundo tampón de electrolito líder. En algunos casos, un método o proceso proporcionado en el presente documento puede implicar llevar a cabo la isotacoforesis en una muestra en un canal en paralelo con la conducción de la isotacoforesis en una segunda muestra en un segundo canal utilizando electrolito de cola o tampones de electrolito de cola que son iguales o similares. En algunos casos, una muestra en uno de los canales se procesa utilizando un primer tampón de electrolito de cola y una muestra en un canal diferente se procesa utilizando un segundo tampón de electrolito de cola que es diferente del primero. Por ejemplo, el primer tampón de electrolito de cola puede contener uno o más iones del electrolito de cola que son diferentes de los contenidos en el segundo tampón de electrolito de cola. En otro ejemplo, el primer tampón de electrolito de cola puede contener uno o más iones del electrolito de cola que son los mismos que los contenidos en el segundo tampón de electrolito de cola, la concentración de dichos iones del electrolito de cola es diferente en el primer tampón de electrolito de cola es diferente de la concentración en el segundo tampón de electrolito de cola.
[0437] En algunas realizaciones, uno o más depósitos se pueden conectar a dos canales o subcanales. Por ejemplo, el depósito de elución 603 se puede conectar tanto al canal 600 como al canal 609 de tampón de elución. Alternativamente o en combinación, el depósito de electrolito líder 606 se puede conectar tanto al canal 600 como al canal de tampón de electrolito líder 610. Alternativamente o en combinación, el depósito de electrolito de cola 608 se puede conectar tanto al 600 como a un canal de tampón de electrolito de cola. Alternativamente o en combinación, el pocillo de entrada de muestra 601 se puede conectar a un punto medio en el canal 600 de tal manera que el canal 600 se extienda a la izquierda (como primer subcanal) y a la derecha (como un segundo subcanal) del pocillo de entrada 601. Los dos canales o subcanales se pueden conectar a uno o más depósitos con un ángulo entre los dos canales (barrido en el plano principal del dispositivo fluídico) de al menos 5°, 10°, 20°, 30°, 40°, 45°, 50°, 60°, 70°, 80°, 90°, 100°, 110°, 120°, 130°, 135°, 140°, 150°, 160°, 170° o 180°. Los dos canales o subcanales se pueden conectar a uno o más depósitos con un ángulo entre los dos canales (barrido en el plano mayor del dispositivo fluídico) de como máximo aproximadamente 5°, 10°, 20°, 30°, 40°, 45°, 50°, 60°, 70°, 80°, 90°, 100°, 110°, 120°, 130°, 135°, 140°, 150°, 160°, 170° o 180.
[0439] El dispositivo puede comprender, por ejemplo, 8 canales como se muestra. Cada canal puede contener un volumen de muestra de aproximadamente 50 pL a aproximadamente 275 pL, un volumen total de aproximadamente 500 pL. La baja dispersión de 180° en cada canal puede facilitar volúmenes de muestra tan grandes en una placa multicanal de 8 canales con una huella SLAS estándar.
[0441] Las FIG. 7A, FIG. 7B, FIG. 7C y FIG. 7D muestran las vistas superior, lateral, inferior e inferior de tres cuartos, respectivamente, de un dispositivo fluídico de ITP 700 de purificación rápida para volúmenes de muestra menores o iguales a aproximadamente 100 pL. El dispositivo comprende los pocillos de entrada de muestra 701, los pocillos tampón de ITP 702 y los pocillos de salida de muestra (elución) 703. El dispositivo 700 puede ser sustancialmente similar al dispositivo 600 pero con una geometría de canal diferente (y la geometría del depósito correspondiente) que no incluye un giro de 180° en el canal.
[0443] El dispositivo puede comprender, por ejemplo, 8 canales como se muestra. Cada canal puede contener un volumen de muestra de aproximadamente 10 pLa aproximadamente 100 pL. Un dispositivo con volúmenes de muestra más pequeños puede ser útil para la limpieza de PCR u otras aplicaciones de limpieza de reacciones, o para tamaños de muestra más pequeños (por ejemplo, una muestra con un número bajo de células o una pequeña cantidad de tejido).
[0444] Las FIG. 8A, FIG. 8 B, FIG. 8C y FIG. 8 D muestran las vistas superior, lateral, inferior y tres cuartos inferiores, respectivamente, de otro dispositivo fluídico de ITP de purificación rápida 800 para volúmenes de muestra menores o iguales a aproximadamente 100 pL. El dispositivo comprende los pocillos de entrada de muestra 801, los pocillos tampón de ITP 802 y los pocillos de salida de muestra (elución) 803. El dispositivo 800 puede ser sustancialmente similar a los dispositivos 600 y 700, pero comprende múltiples geometrías de canal diferentes en un solo chip.
[0446] El dispositivo fluídico puede comprender uno o más electrodos que aplican un campo eléctrico a un dispositivo fluídico o a una parte del dispositivo fluídico. Los campos eléctricos aplicados se pueden utilizar para llevar a cabo la isotacoforesis. El dispositivo fluídico puede comprender uno o más electrodos que aplican un solo campo eléctrico a todos los canales del dispositivo fluídico. El dispositivo fluídico puede comprender uno o más electrodos que aplican más de un campo eléctrico al dispositivo fluídico, por ejemplo, un campo eléctrico por canal en el dispositivo. En algunos casos, se genera un primer y segundo campo eléctrico a partir de un solo par de electrodos. En algunos casos, se genera un primer y segundo campo eléctrico a partir de diferentes pares de electrodos. Los campos eléctricos se pueden aplicar simultáneamente, secuencialmente y/o independientemente entre sí. Los electrodos pueden ser externos, tales como un cable que cae en un depósito. Los electrodos pueden ser internos, tales como un elemento microfabricado, impreso u otro elemento embebido incluido en la fabricación del dispositivo fluídico. Los materiales de los electrodos pueden incluir, pero no se limitan a, metales (por ejemplo, platino, titanio) y carbono.
[0448] El uno o más electrodos del dispositivo fluídico pueden ser parte de uno o más circuitos eléctricos que aplican un campo eléctrico a un dispositivo fluídico o parte de un dispositivo fluídico. El dispositivo fluídico puede comprender uno o más circuitos eléctricos que aplican un solo campo eléctrico a todos los canales o regiones de isotacorosis de las zonas del dispositivo fluídico. El dispositivo fluídico puede comprender uno o más circuitos eléctricos que aplican más de un campo eléctrico al dispositivo fluídico, por ejemplo, un campo eléctrico por canal en el dispositivo. En algunos casos, el primer y segundo campo eléctrico se pueden generar a partir de un solo circuito eléctrico. En algunos casos, el primer y segundo campo eléctrico se pueden generar a partir de diferentes circuitos eléctricos. Los campos eléctricos pueden ser aplicados simultáneamente, secuencialmente y/o independientemente entre sí por uno o más circuitos eléctricos. En algunos casos, el dispositivo (o instrumento de mesa) se puede configurar para controlar un primer circuito eléctrico simultáneamente con e independientemente de un segundo circuito eléctrico.
[0450] Los electrodos se pueden ubicar en depósitos, como depósitos de electrolito de cola y de salida, que se pueden separar de los depósitos de muestra mediante canales de tampón. En algunos casos, los electrodos se encuentran en canales de tampón o depósitos de tampón. La ubicación de los electrodos en depósitos de electrolitos o depósitos de tampón de electrolitos puede aislar los electrodos de analitos como los ácidos nucleicos para reducir o eliminar la contaminación de los electrodos por el material de muestra. Este enfoque puede permitir la reutilización de electrodos sin contaminación cruzada entre muestras. En un ejemplo, un depósito de electrolito de cola o un canal de electrolito de cola está conectado por un canal de tampón a un depósito de tampón que contiene iones del electrolito de cola y un electrodo, y el depósito de electrolito de cola también está conectado a un depósito de muestra o canal de muestra, que a su vez está conectado a un depósito de electrolito líder por un canal de electrolito líder; el depósito de electrolito líder también está conectado por un canal de tampón a un depósito de tampón que también contiene electrolitos líderes y un electrodo. En otro ejemplo, o como continuación del ejemplo anterior, un depósito de elución que contiene tampón de elución está conectado a un depósito de electrolito líder mediante un canal de elución y también está conectado a un depósito de tampón que contiene electrolitos tampón de elución y un electrodo. Los canales de tampón entre los depósitos de tampón y sus depósitos correspondientes pueden incluir barreras capilares y/o un área de sección transversal baja para limitar, reducir o evitar la mezcla y el flujo impulsado por presión como se describe en el presente documento. Los depósitos de tampón pueden contener electrolitos con una fuerza iónica igual o superior a la de sus depósitos correspondientes. Por ejemplo, el depósito de elución se puede conectar a un depósito de tampón que contiene electrolitos tampón de elución con una fuerza o concentración iónica igual o superior a la del depósito de elución. El depósito de electrolito de cola se puede conectar a un depósito de tampón que contiene electrolitos de cola con la misma o mayor fuerza o concentración iónica que el depósito de electrolito de cola. El depósito de electrolito líder se puede conectar a un depósito de tampón que contenga electrolitos líderes con la misma o mayor fuerza o concentración iónica que el depósito de electrolito líder. Proporcionar depósitos de tampón dedicados conectados al depósito de elución, al depósito de electrolito de cola y/o al depósito de electrolito líder con resistencias iónicas más altas puede proporcionar un grupo de iones adicionales para mantener el pH y la conductividad en el canal a medida que la muestra se mueve a través del canal.
[0452] Los dispositivos fluídicos se pueden utilizar con uno o más controladores térmicos. Por ejemplo, la FIG. 9A muestra un esquema de un dispositivo de preparación de muestras e isotacoforesis de ocho plexos, que comprende ocho canales paralelos 900 del diseño mostrado en la FIG. 5A. La FIG. 9B muestra un esquema de un primer y un segundo controlador térmico 901, 902. Un primer controlador térmico 901 a temperatura T1 (por ejemplo, 80 °C) está alineado con las zonas de preparación de muestras de los canales y un segundo controlador térmico 902 a temperatura T2 (por ejemplo, 50 °C) está alineado con las zonas de isotacoforesis de los canales. En algunos casos, los controladores térmicos adicionales pueden estar alineados con zonas adicionales de los canales (no mostrados), por ejemplo, un tercer controlador térmico a la temperatura T3 puede estar alineado con una tercera zona a la temperatura T3. En algunos casos, cada zona de cada canal puede tener su propio controlador térmico independiente, en lugar de compartir un controlador térmico común con las zonas respectivas de los otros canales. En otros casos, todas las zonas o canales pueden compartir un controlador térmico. En otros casos, más de una pero menos de todas las zonas o canales pueden compartir un controlador térmico. Los controladores térmicos pueden comprender componentes que incluyen, pero no se limitan a, calentadores resistivos, sistemas de calefacción o refrigeración basados en fluidos y dispositivos Peltier. Los controladores térmicos se pueden fabricar a partir de materiales que incluyen, pero no se limitan a, metales (por ejemplo, platino, titanio, cobre, oro), carbono y óxido de indio y estaño (ITO). Los controladores térmicos pueden comprender sensores de temperatura, que se pueden utilizar para monitorizar la temperatura que se está controlando y proporcionar retroalimentación de temperatura para el control térmico. Los controladores térmicos se pueden utilizar con sistemas de control por ordenador, como se discute más adelante en esta divulgación. En algunos casos, los controladores térmicos operan sin retroalimentación de temperatura. Los controladores térmicos se pueden integrar en dispositivos fluídicos o ubicar externamente, como dentro de un sistema de mesa.
[0454] Los dispositivos fluídicos se pueden utilizar con una o más fuentes de luz. Las fuentes de luz se pueden integrar en dispositivos fluídicos o ubicar externamente a un dispositivo fluídico, tal como dentro de un sistema de mesa o en un dispositivo separado. Las fuentes de luz pueden proporcionar luz para interrogación óptica, excitación fluorescente, detección de temperatura, energía de reacción o catálisis, y otros fines.
[0456] Los dispositivos fluídicos se pueden diseñar de tal manera que su marco o dimensiones más externas cumplan con los estándares de placas de microtitulación (por ejemplo, estándares de placas de microtitulación SLAS). Los dispositivos fluídicos se pueden diseñar para utilizar los puertos definidos de una placa de microtitulación (por ejemplo, placa de microtitulación estándar SLAS) como depósitos de líquido, con puertos de accionamiento neumático ubicados en la superficie no utilizada externa a los depósitos de líquido. Los puertos neumáticos se pueden disponer en los bordes de un dispositivo fluídico con un diseño compatible con placas de microtitulación, de tal manera que se evite la contaminación cruzada a través del accionamiento neumático a través de los depósitos de líquido, y de que los puertos sean de fácil acceso con hardware neumático. Además de sus otras funciones, también se puede utilizar un subconjunto de puertos definidos para el accionamiento neumático. En algunos casos, un dispositivo fluídico se puede diseñar y fabricar en dos partes entrelazadas: primero, un inserto que incluye una unidad de canal (por ejemplo, una capa con una superficie plana que facilita la unión de la película), pocillos y puertos neumáticos; y en segundo lugar, un anillo exterior para proporcionar conformidad con un estándar de placa de microtitulación (por ejemplo, estándares dimensionales de placa de microtitulación SLAS), que incluyen las características de alineación para alinear el dispositivo fluídico con un sistema de mesa y las características de acoplamiento para entrelazarse con la primera parte. Los pocillos se pueden conectar para formar salientes, lo que puede ser más compatible con el moldeo por inyección.
[0458] Los dispositivos fluídicos se pueden fabricar a partir de una variedad de materiales, que incluyen pero no se limitan a, vidrio (por ejemplo, vidrio de borosilicato), silicio, plástico y elastómero. Los plásticos pueden incluir polimetilmetacrilato (PMMA), copolímero de olefina cíclica (COC), polímero de olefina cíclica (COP), polietileno, tereftalato de polietileno (PET), polietileno de alta densidad (HDPE) y polietileno de baja densidad (LDPE). Los elastómeros pueden incluir polidimetilsiloxano (PDMS).
[0460] Los materiales utilizados para la fabricación de dispositivos fluídicos se pueden seleccionar por sus propiedades ópticas. Por ejemplo, se pueden utilizar materiales que exhiban baja autofluorescencia, baja dispersión y alta transmisión en longitudes de onda de interés (por ejemplo, longitudes de onda de excitación y emisión para etiquetas o tintes de ácidos nucleicos). Se pueden utilizar diferentes materiales en un dispositivo fluídico; Por ejemplo, una región de detección se puede fabricar con materiales que exhiban propiedades ópticas útiles, mientras que otras regiones del dispositivo pueden comprender otros materiales.
[0462] Los materiales utilizados para la fabricación de dispositivos fluídicos se pueden seleccionar por sus propiedades térmicas. Por ejemplo, los materiales se pueden seleccionar para una alta conductividad térmica. Alternativamente, se pueden seleccionar materiales de baja conductividad térmica (por ejemplo, para aislar térmicamente un dispositivo fluídico o una región de un dispositivo fluídico. Se pueden utilizar diferentes materiales en un dispositivo fluídico; por ejemplo, una región de calentamiento puede tener materiales con alta conductividad térmica para mejorar la comunicación térmica con un controlador térmico, mientras que la región de calentamiento está rodeada de materiales con baja conductividad térmica para el aislamiento térmico de otras regiones del dispositivo.
[0464] Los materiales utilizados para la fabricación de dispositivos fluídicos o microcanales en los mismos se pueden seleccionar por sus propiedades elastoméricas o de deformación. Por ejemplo, los materiales se pueden seleccionar para una baja elasticidad a fin de permitir el cierre del canal de plástico como se describe en el presente documento. Alternativamente, se pueden seleccionar materiales para una alta elasticidad. Se pueden utilizar diferentes materiales en un dispositivo fluídico; por ejemplo, el poli(metacrilato de metilo) (PMMA), el copolímero de olefina cíclica (COC), el polímero de cicloolefina (COP) o similares se pueden utilizar en un solo dispositivo fluídico. Los materiales pueden tener un módulo de elasticidad de al menos 1 GPa, 1.5 GPa, 2 GPa, 2.5 GPa, 3 GPa, 3.5 GPa, 4 GPa, 4.5 GPa o 5 GPa. Los materiales pueden tener un módulo de elasticidad de como máximo 1 GPa, 1.5 GPa, 2 GPa, 2.5 GPa, 3 GPa, 3.5 GPa, 4 GPa, 4.5 GPa o 5 GPa. Los materiales pueden tener una resistencia a la tracción de al menos 10 MPa, 20 MPa, 30 MPa, 40 MPa, 50 MPa, 60 MPa, 70 MPa, 80 MPa, 90 MPa, 100 MPa, 110 MPa, 120 MPa, 130 MPa, 140 MPa, 150 MPa, 160 MPa, 170 MPa, 180 MPa, 190 MPa, 200 MPa. Los materiales pueden tener una resistencia a la tracción de como máximo 10 MPa, 20 MPa, 30 MPa, 40 MPa, 50 MPa, 60 MPa, 70 MPa, 80 MPa, 90 MPa, 100 MPa, 110 MPa, 120 MPa, 130 MPa, 140 MPa, 150 MPa, 160 MPa, 170 MPa, 180 MPa, 190 MPa, 200 MPa.
[0466] En algunos casos, las superficies de un dispositivo fluídico se pueden utilizar sin tratamientos superficiales o recubrimientos. En otros casos, las superficies de un dispositivo fluídico se pueden utilizar con recubrimientos superficiales, tales como tratamientos hidrofóbicos, tratamientos hidrofílicos o agentes aglutinantes selectivos (por ejemplo, anticuerpos). Las diferentes regiones de un dispositivo fluídico pueden comprender diferentes tratamientos superficiales (o la falta de ellos). Por ejemplo, algunos canales, depósitos o partes de los mismos pueden ser hidrófobos, mientras que otros son hidrófilos.
[0468] Los dispositivos fluídicos pueden incluir un rango de unidades y técnicas de control de flujo, que incluyen pero no se limitan a barreras capilares, depósitos de salida de aire, líneas de gas/aire, monitores de nivel de llenado (por ejemplo, mediante medición de electrodos), geometrías particulares de depósitos, resistencias fluídicas particulares de canales y órdenes de carga de fluidos.
[0470] Las barreras capilares se pueden emparejar con depósitos de salida de aire para purgar el aire (por ejemplo, para evitar burbujas), posicionando de esta manera y estableciendo con éxito una interfaz líquido-líquido (i) entre las soluciones del electrolito líder y de cola que se requiere para la isotacoforesis, y (ii) entre los depósitos de tampón y el electrolito líder o el electrolito de cola y/o las soluciones de muestra. Las barreras capilares se pueden diseñar en combinación con la geometría del canal para automatizar el llenado de los canales en el orden que prefieran. Las resistencias de los canales se pueden seleccionar, por ejemplo, mediante el diseño de las dimensiones de los canales, para proporcionar resistencias fluídicas diferenciales. El pedido de la carga de líquido puede permitir la correcta formación de interfaces líquido-líquido sin burbujas de aire para realizar procesos electrocinéticos. En un ejemplo, un depósito de iones de cola está conectado directamente al analito o al canal de muestra.
[0472] Los canales o líneas de gas (por ejemplo, aire) se pueden utilizar para proporcionar presión neumática accionada a las barreras capilares u otras regiones de un dispositivo fluídico. Los canales de gas se pueden conectar a fuentes de presión de gas externas a través de puertos neumáticos. Los canales de gas pueden tener una mayor resistencia fluídica que los canales de líquido a los que proporcionan presión, por ejemplo, para reducir o evitar el flujo de líquido hacia el canal de gas. Por ejemplo, los canales de gas pueden tener menos de la mitad del área de la sección transversal de un canal principal de isotacoforesis. Se pueden conectar varios canales de gas a un solo depósito o puerto de gas (por ejemplo, con canales ramificados). Las válvulas capilares se pueden emplear con líneas de aire ramificadas para evitar el movimiento del líquido en dirección ascendente. La FIG. 10A muestra un ejemplo de canal de gas 1001 que puede comprender una barrera capilar 1002 conectada a la interfaz de canal líquido 1003 entre la muestra 1004 y los subcanales 1005 del tampón de electrolito líder. La FIG. 10B es un esquema ampliado del canal de gas 1001 que destaca la barrera capilar 1002 que impide el movimiento del líquido en dirección ascendente hacia el puerto neumático 1006.
[0474] Se puede aplicar presión negativa o vacío a los canales de gas a través de los puertos de gas para cargar un canal fluídico. Cada canal fluídico de un dispositivo microfluídico se puede cargar simultánea o independientemente (por ejemplo, secuencialmente) entre sí. Dentro de un canal, los fluidos se pueden cargar simultánea o independientemente unos de otros. Por ejemplo, el tampón de electrolito líder, el tampón de electrolito líder de alta concentración, el tampón de electrolito de cola, el tampón de electrolito de cola de alta concentración, el tampón de elución, el tampón de elución de alta concentración o cualquier combinación de los mismos se pueden cargar antes, simultáneamente o después de cargar la muestra. Por ejemplo, se puede aplicar presión negativa a los puertos de gas en un lado del chip para cargar uno o más fluidos (por ejemplo, tampón de electrolito de cola, tampón de elución, etc.). Posteriormente, se puede aplicar presión negativa a los puertos de gas en el otro lado del chip para cargar fluidos adicionales (por ejemplo, tampón de electrolito líder). Alternativamente, se puede aplicar presión negativa a todos los puertos de gas conectados a un canal al mismo tiempo. La muestra se puede cargar al aplicar presión negativa o vacío antes, durante o después de la carga de los tampones de isotacoforesis. La muestra se puede cargar sin aplicar presión negativa o vacío, por ejemplo, por humectación o gravedad.
[0476] Los sensores (por ejemplo, electrodos) se pueden utilizar para detectar niveles de llenado de líquido o burbujas (por ejemplo, a través de la detección de corriente o voltaje) y proporcionar retroalimentación. Las características geométricas (por ejemplo, constricciones, expansiones o giros) se pueden utilizar en combinación con electrodos para monitorizar la impedancia de los canales y, por lo tanto, la progresión temporal de la isotacoforesis. Por ejemplo, durante la ITP, los ácidos nucleicos están enfocados y el voltaje se puede utilizar para rastrear la ubicación de la banda enfocada en el canal de principio a fin. En un ejemplo, la monitorización de la expansión del fluido en un depósito (tal como un depósito de elución) desde un canal conectado con un área de sección transversal más pequeña se puede utilizar para determinar el tiempo que el analito está eluyendo, lo que permite la elución automatizada y el control final del proceso. En otro ejemplo, una constricción de canal se puede diseñar para permitir la detección de la temporización (o activación) de una etapa en un proceso electrocinético, tal como cuando el analito enfocado entra en una zona de canal donde va a tener lugar una reacción o donde va a tener lugar un evento de detección óptica, lo que permite el control de la temporización de la reacción o la activación del detector.
[0478] Las características del depósito y del canal se pueden diseñar para controlar o prevenir el flujo impulsado por la presión. Por ejemplo, un depósito (por ejemplo, depósitos de muestra y elución) puede tener una forma interna diseñada de tal manera que los grandes cambios en la altura del líquido produzcan sólo pequeñas variaciones en el volumen interno a la altura del cabezal prevista, como se muestra en la FIG. 11. Esto puede proporcionar un control más preciso del volumen de líquido contenido en el depósito. Para otros depósitos, el volumen de líquido puede variar sin detrimento de un proceso de separación; Dichos depósitos se pueden diseñar para tener grandes cambios de volumen en respuesta a pequeños cambios de altura del líquido y pueden ayudar a estabilizar la altura del líquido en todo el dispositivo fluídico. Las bajas resistencias fluídicas entre los depósitos se pueden utilizar para permitir tiempos de equilibrio rápidos de las presiones de carga y para permitir un flujo mínimo de líquidos en los canales antes, durante o después de un proceso electrocinético.
[0479] Los depósitos se pueden diseñar para minimizar la evaporación, por ejemplo, al controlar el área de superficie dentro del depósito para mantener un volumen constante o fijo. Los depósitos se pueden diseñar para maximizar la recuperación de líquidos de los depósitos, por ejemplo, mediante el uso de diseños de paredes en ángulo dibujado para minimizar las zonas muertas. Los depósitos se pueden diseñar para evitar el flujo de líquidos en los canales de conexión al depósito durante la descarga, lo que puede ayudar a mantener la pureza o la separación del material (por ejemplo, ácidos nucleicos) que se descarga. Los depósitos se pueden diseñar para facilitar la carga o descarga mediante pipeteo, por ejemplo, al tener dimensiones que permitan admitir una punta de pipeta o teniendo volúmenes dentro de la operación típica de la pipeta. Por ejemplo, el depósito de elución se puede configurar para admitir una punta de pipeta para la extracción de ácidos nucleicos. Los depósitos se pueden diseñar o separar para aceptar pipetas multicanal (por ejemplo, con un paso de aproximadamente 9 mm).
[0481] Los depósitos (por ejemplo, depósitos de muestra) se pueden ubicar directamente sobre los canales a llenar, lo que puede minimizar la pérdida de líquido en los canales de conexión entre los depósitos y los canales que llenan. Los depósitos (por ejemplo, los depósitos de muestra) pueden tener un fondo de forma cónica y un orificio pasante cilíndrico; el gran diámetro interior en la parte superior de un depósito de este tipo puede permitir que contenga un gran volumen, mientras que el menisco líquido en el fondo del depósito tiene un diámetro interior más pequeño, lo que reduce la cantidad de líquido que queda después de la dispensación. Un diseño de este tipo también puede reducir o evitar la absorción de los fluidos humectantes en esquinas cóncavas. En algunos casos, un orificio pasante desde un depósito (por ejemplo, un depósito de muestra) en un canal es menor o igual a aproximadamente 2 milímetros (mm).
[0483] La FIG. 11 muestra un depósito de muestra 1100 configurado para reducir la cantidad de muestra que queda (o se pierde) en el depósito 1100 después de mover la muestra al canal conectado 1101. El depósito de muestras de baja pérdida 1100 puede reducir la cantidad de muestra que queda en el depósito 1100 después de mover la muestra al canal conectado 1101 sin agregar o bombear volumen adicional (de muestra u otro fluido) al depósito de muestra 1100 después o durante el suministro de la muestra en el canal conectado 1101. El depósito de muestras de baja pérdida 1100 puede comprender una porción superior o de la parte superior 1102 con un diámetro hidráulico interior D1 configurado para contener un volumen de muestra antes de cargar la muestra en el canal 1101, una porción inferior o inferior 1103 con un diámetro hidráulico interior u orificio pasante D2 y altura H1 configurada para contener un volumen de muestra después de cargar la muestra en el canal 1101, y una porción ahusada o cónica 1104 entre ellos. En algunos casos, la porción superior 1102 y/o la porción inferior 1103 no son simétricas, en cuyo caso las dimensiones D1 a D2 pueden representar la dimensión máxima entre las partes superior y/o inferior 1102, 1103, respectivamente.
[0485] El depósito de muestras 1100 se puede configurar para producir una altura del cabezal H2 de la muestra dejada que sea igual o casi igual a la altura del cabezal H3 de los amortiguadores en los otros depósitos 1110 conectados al canal 1101 con el fin de limitar, prevenir o reducir el flujo y la mezcla impulsados por presión en el canal 1101. Un depósito intermedio estándar 1110 puede comprender una porción superior 1112 con un diámetro hidráulico interior D3 y una porción inferior 1113 con un diámetro hidráulico interior D4. A diferencia del pocillo de muestra, D3 puede ser sustancialmente similar a D4, de tal manera que se retiene un mayor volumen de fluido dentro del pocillo tampón 1110 en comparación con el pocillo de muestra 1100 cuando las alturas del cabezal H2 y H3 son iguales o casi iguales.
[0487] El depósito de muestra 1100 se puede configurar para contener un volumen de muestra (con o sin tampón) de al menos aproximadamente 1 nanolitro (nL), 10 nL, 20 nL, 50 nL, 100 nL, 200 nL, 500 nL, 1 microlitro (pL), 10 pL, 20 pL, 30 pL, 40 pL, 50 pL, 60 pL, 70 pL, 80 pL, 90 pL, 100 pL, 200 pL, 300 pL, 400 pL, 500 pL, 600 pL, 700 pL, 800 pL, 900 pL, 1 mililitro (mL), 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, o 10 mL. En algunos casos, el depósito de muestras 1100 se puede configurar para contener un volumen de muestra dentro de un rango de desde aproximadamente 1 nL a aproximadamente 10 nL.
[0489] El diámetro hidráulico interno D1 puede ser mayor que el diámetro hidráulico del orificio pasante D2. El diámetro hidráulico interior D1 de la porción superior puede ser de al menos 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm o 15 mm. El diámetro hidráulico interior D1 de la porción superior puede ser como máximo de aproximadamente 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 11 mm, 12, mm 13 mm, 14 mm o 15 mm. El diámetro hidráulico interior D2 de la porción inferior puede ser de al menos 0.5 mm, 1 mm, 1.5 mm, 2 mm, 2.5 mm, 3 mm, 3.5 mm, 4 mm, 4.5 mm o 5 mm.
[0490] El diámetro hidráulico interior D2 de la porción inferior puede ser como máximo de aproximadamente 0.5 mm, 1 mm, 1.5 mm, 2 mm, 2.5 mm, 3 mm, 3.5 mm, 4 mm, 4.5 mm o 5 mm.
[0492] La relación de D1 a D2 puede determinar la cantidad de muestra que queda en el depósito de muestras después de que la muestra se mueve al canal. En algunos casos, la relación de D1 a D2 es al menos aproximadamente 2: 1, 5: 1, 10: 1, 15: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, 35: 1, 40: 1, 45: 1, o 50: 1. En algunos casos, la relación entre D1 y D2 es a lo sumo 2 como máximo aproximadamente 2: 1, 5: 1, 10: 1, 15: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, 35: 1, 40: 1, 45:
[0493] 1, o 50: 1. Una relación de D1 a D2 puede ser mayor que 2:1 para facilitar el movimiento de al menos el 50 % del volumen de muestra desde el depósito de muestras de baja pérdida 1100 hasta el canal 1101.
[0495] El área en sección transversal de la porción superior puede ser al menos aproximadamente de 3 mm2, 5 mm2, 10 mm2, 15 mm2, 20 mm2, 25 mm2, 30 mm2, 35 mm2, 40 mm2, 45 mm2, 50 mm2, 55 mm2, 60 mm2, 65 mm2, 70 mm2, 75 mm2. El área en sección transversal de la porción superior puede ser como máximo de aproximadamente 3 mm2, 5 mm2, 10 mm2, 15 mm2, 20 mm2, 25 mm2, 30 mm2, 35 mm2, 40 mm2, 45 mm2, 50 mm2, 55 mm2, 60 mm2, 65 mm2, 70 mm2, 75 mm2. El área en sección transversal de la porción inferior puede ser al menos aproximadamente de 0.2 mm2, 0.3 mm2, 0.4 mm2, 0.5 mm2, 1 mm2, 1.5 mm2, 2 mm2, 2.5 mm2, 3 mm2, 3.5 mm2, 4 mm2, 4.5 mm2, 5 mm2, 6 mm2, 7 mm2, 8 mm2, 9 mm2, 10 mm2, 11 mm2, 12 mm2. El área en sección transversal de la porción inferior puede ser como máximo de aproximadamente 0.2 mm2, 0.3 mm2, 0.4 mm2, 0.5 mm2, 1 mm2, 1.5 mm2, 2 mm2, 2.5 mm2, 3 mm2, 3.5 mm2, 4 mm2, 4.5 mm2, 5 mm2, 6 mm2, 7 mm2, 8 mm2, 9mm2, 10 mm2, 11 mm2, 12 mm2.
[0497] La relación entre el área de la sección transversal de la porción superior y el área de la sección transversal de la porción inferior puede determinar la cantidad de muestra que queda en el depósito de muestra después de que la muestra se mueve al canal. En algunos casos, la relación entre el área de la sección transversal de la porción superior y el área de la sección transversal de la porción inferiores al menos aproximadamente 4: 1, 5:
[0498] 1, 10: 1, 20: 1, 30: 1,40: 1, 50: 1,60: 1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 150:1,200:1,250:1, 300:1, 350:1,400:1,450:1, 500:1, 600:1, 700:1, 800: 1, 900: 1, 1000: 1, 1500: 1, 2000: 1, o 2500: 1. En algunos casos, la relación entre el área de la sección transversal de la porción superior y el área de la sección transversal de la porción inferior es como máximo aproximadamente 4:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 150:1, 200:1, 250:1, 300:1, 350:1, 400:1, 450:1, 500:1,600:1, 700:1, 800:1, 900:1, 1000:1, 1500:1,2000:1, o 2500:1.
[0500] La porción cónica entre la porción superior y la porción inferior puede comprender un ángulo para facilitar la humectación de la muestra en la porción inferior y el movimiento de la muestra desde el pocillo de muestra de baja pérdida hasta el canal. En algunos casos, la porción cónica del depósito de muestra de baja pérdida puede comprender un semiángulo entre la porción superior y la porción inferior de menos de aproximadamente 10°, 20°, 30°, 40°, 45°, 50°, 60°, 70°, 80° o 90°. En algunos casos, la porción cónica del depósito de muestra de baja pérdida puede comprender un semiángulo entre la porción superior y la porción inferior de más de aproximadamente 10°, 20°, 30°, 40°, 45°, 50°, 60°, 70°, 80° o 90°.
[0502] En algunos casos, la altura H1 de la porción inferior se puede configurar para producir una altura del cabezal de la muestra dejada atrás que sea igual o casi igual a la altura del cabezal de los amortiguadores en los otros depósitos conectados al canal con el fin de limitar, prevenir o reducir el flujo y la mezcla impulsados por la presión en el canal. La altura H1 de la porción inferior puede ser de al menos 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm o 10 mm. La altura H2 de la porción inferior puede ser como máximo de aproximadamente 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm o 10 mm.
[0504] Los depósitos (por ejemplo, los depósitos de elución) pueden tener diámetros que son grandes en comparación con la escala de longitud de difusión de los analitos (por ejemplo, ácidos nucleicos) para reducir la difusión de analitos fuera de un depósito. En algunos casos, la escala de longitud del diámetro del depósito puede ser del orden de milímetros, y el tiempo de difusión resultante del analito desde el depósito puede ser del orden de horas. Las conexiones entre canales y depósitos (por ejemplo, depósitos de elución) se pueden diseñar sin esquinas afiladas, lo que reduce la prevalencia de regiones de alto campo eléctrico en estas conexiones y aumenta el tiempo de residencia de los analitos dentro del depósito. En algunos casos, la sección transversal de un depósito (por ejemplo, depósito de elución) normal al campo eléctrico puede ser significativamente mayor que la sección transversal del canal normal al campo eléctrico, reduciendo de esta manera la intensidad del campo eléctrico en el depósito y aumentando el tiempo de residencia del analito dentro del depósito.
[0505] En algunos casos, un canal de elución y/o un depósito de elución pueden comprender un segundo tampón de electrolito líder, diferente en tipo o concentración del primer tampón de electrolito líder utilizado en el canal principal. Esto puede permitir que el material purificado se eluya en el segundo tampón de electrolito líder (por ejemplo, un tampón de elución o una solución de salida). La magnitud de movilidad efectiva de los segundos iones del electrolito líder dentro del segundo tampón de electrolito líder puede ser mayor que la magnitud de movilidad efectiva de los ácidos nucleicos. El segundo tampón de electrolito líder 2 tiene una fuerza iónica baja, por ejemplo, una fuerza iónica compatible con los ensayos posteriores (por ejemplo, qPCR, secuenciación de próxima generación). En algunos casos, el segundo tampón de electrolito líder es el mismo que el primer tampón de electrolito líder, pero presente en una concentración o fuerza iónica diferente (por ejemplo, una fuerza iónica menor que la del primer tampón de electrolito líder). Por ejemplo, el primer tampón de electrolito líder puede tener una concentración de iones del electrolito de 70-100 mM (por ejemplo, Tris HCl 70-100 mM), mientras que el segundo tampón de electrolito líder puede tener una concentración de iones del electrolito de menos de 70 mM, menos de 60 mM o menos de 50 mM (por ejemplo, menos de Tris HCl 50 mM).
[0507] Los canales de un dispositivo fluídico pueden cerrarse. Por ejemplo, un accionador mecánico acoplado a un miembro mecánico se puede utilizar para aplicar presión para cerrar total o parcialmente un canal (por ejemplo, por deformación del canal). Los depósitos de elución se pueden cerrar desde el canal de ITP para definir un volumen de elución fijo. El cierre del canal puede resultar en una reducción del flujo o un flujo completamente bloqueado. El cierre del canal puede resultar en una mayor resistencia al flujo de fluido. En algunos casos, el cierre del canal puede aumentar la resistencia fluídica en un factor de al menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100.
[0509] La FIG. 12A muestra un ejemplo del miembro mecánico 1200 que se puede utilizar para aplicar presión para cerrar o al menos cerrar parcialmente los canales 1201 de un dispositivo fluídico 1210 , el dispositivo fluídico 1210 que comprende múltiples canales en paralelo (por ejemplo, el dispositivo de la FIG. 6 C que comprende ocho canales paralelos independientes). El miembro mecánico 1200 puede comprender una estructura en forma de peine con dientes 1202 que se alinean con dos ubicaciones 1204, 1205 en cada uno de los ocho canales del chip como se muestra en la FIG. 12B. Los dientes 1202 pueden aplicar presión mecánica para cerrar permanente o plásticamente o al menos parcialmente los canales 1201 para limitar, reducir o prevenir el flujo de líquido hacia o desde los depósitos de elución 1203 y controlar el volumen de elución. Al menos parcialmente, el cierre de los canales 1201 puede aumentar la resistencia al flujo de fluido entre los canales 1201 y los depósitos de elución 1203. El elemento mecánico 1200 se puede acoplar a un accionador mecánico que genera la fuerza aplicada al canal 1201 por los dientes 1202 del elemento mecánico 1200. El miembro mecánico 1200 puede comprender un material con un módulo de elasticidad de Young mayor que el módulo de elasticidad de Young del canal 1201. Uno o más dientes 1202 del miembro mecánico 1200 se pueden configurar para calentar un canal 1201. Uno o más dientes 1202 del elemento mecánico 1200 pueden estar acoplados térmicamente a un calentador o elemento calefactor. El elemento mecánico 1200 puede comprender opcionalmente por un calefactor o un elemento calefactor. Opcionalmente, se puede aplicar calor por los dientes 1202 para cerrar de forma permanente o plástica los canales 1201. Uno o más dientes 1202 se pueden calentar a una temperatura mayor que la temperatura de transición vítrea de al menos una pared de uno o más canales 1201. La FIG. 12C muestra cómo se alinean los dieciséis dientes 1202 del miembro mecánico 1200 con las dieciséis ubicaciones 1204, 1205 en el chip 1210 (dos por canal). Cada diente 1202 se puede configurar para suministrar presión mecánica al canal 1201 con el fin de deformar plásticamente al menos una pared del canal 1201. Cada canal 1201 es contactado por el miembro mecánico 1200 y se deforma plásticamente en una primera ubicación cercana 1204 y una segunda ubicación cercana 1205 para aislar el volumen del depósito de elución y aumentar la resistencia del fluido entre el canal 1201 y el depósito 1203. En algunos casos, un diente 1202 puede aplicar presión mecánica a la ubicación del canal 1204 en dirección ascendente del depósito 1203. En algunos casos, un diente 1202 puede aplicar presión mecánica a una unión donde se unen el depósito 1203 y el canal 1201. En algunos casos, un diente 1202 puede aplicar presión mecánica a una unión 1205 donde el depósito y un canal de tampón se unen para evitar la comunicación de fluidos entre el depósito 1203 y un depósito de tampón.
[0511] En algunos casos, el miembro mecánico 1200 puede comprender un diente 1202 por canal que se alinea con la primera ubicación cercana 1204. Por ejemplo, el canal mostrado en la FIG. 5A no comprende un canal de tampón o depósito conectado al depósito de elución y, por lo tanto, es posible que no necesite una segunda ubicación cercana 1205 más allá del depósito de elución. En algunos casos, el miembro mecánico 1200 está configurado para cerrar cada uno de los canales 1201 en un chip 1210 en una o más ubicaciones. En algunos casos, el miembro mecánico 1200 está configurado para dejar abierto uno o más canales 1201 en el chip 1210 de tal manera que solo una fracción de los canales 1201 en el chip 1210 estén cerrados.
[0513] El miembro mecánico 1200 puede aplicar una fuerza de al menos 0.25 libras por canal a través de los dientes 1202. Cada diente 1202 del miembro mecánico 1200 puede aplicar una fuerza de al menos 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4 o 5 libras a un canal 1201.
[0515] Los canales en un dispositivo fluídico (por ejemplo, zonas de preparación de muestras, zonas de isotacoforesis) pueden tener un ancho, altura o diámetro lo suficientemente grandes como para que los contaminantes, como el material embebido (por ejemplo, parafina), se puedan depositar en las paredes del canal mientras dejan espacio adecuado para el flujo de fluido dentro del canal. En algunos casos, un canal en un dispositivo fluídico tiene un ancho, alto o diámetro menor o igual a 20 milímetros (mm), 19 mm, 18 mm, 17 mm, 16 mm, 15 mm, 14 mm, 13 mm, 12 mm, 11 mm, 10 mm, 9 mm, 8 mm 7 mm, 6 mm, 5 mm, 4 mm, 3 mm, 2 mm, 1 mm, 0.9 mm, 0.8 mm, 0.7 mm, 0.6 mm, 0.5 mm, 0.4 mm, 0.3 mm, 0.2 mm, o 0.1 mm. En algunos casos, un canal en un dispositivo fluídico tiene un ancho, altura, o diámetro de al menos 0.1 mm, 0.2 mm, 0.3 mm, 0.4 mm, 0.5 mm, 0.6 mm, 0.7 mm, 0.8 mm, 0.9 mm, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm, 15 mm, 16 mm, 17 mm, 18 mm, 19 mm, o 20 mm. En algunos casos, un canal en un dispositivo fluídico tiene un ancho dentro de un rango de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 3.8 mm. En algunos casos, un canal en un dispositivo fluídico tiene una altura dentro de un rango de aproximadamente 0.1 mm a aproximadamente 1.2 mm.
[0517] En algunos casos, un canal en un dispositivo fluídico tiene una longitud de al menos aproximadamente 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm, 15 mm, 16 mm, 17 mm, 18 mm, 19 mm, 20 mm, 25 mm, 30 mm, 35 mm, 40 mm, 45 mm, 50 mm, 60 mm, 70 mm, 80 mm, 90 mm, 100 mm, 110 mm, 120 mm, 130 mm, 140 mm, 150 mm, 160 mm, 170 mm, 180 mm, 190 mm, 200 mm, 210 mm, 220 mm, 230 mm, 240 mm, 250 mm, 260 mm, 270 mm, 280 mm, 290 mm, 300 mm, 310 mm, 320 mm, 330 mm, 340 mm, 350 mm, 360 mm, 370 mm, 380 mm, 390 mm, 400 mm, 410 mm, 420 mm, 430 mm, 440 mm, 450 mm, 460 mm, 470 mm, 480 mm, 490 mm, o 500 mm. En algunos casos, un canal en un dispositivo fluídico tiene una longitud de menos que o igual a aproximadamente 500 mm, 490 mm, 480 mm, 470 mm, 460 mm, 450 mm, 440 mm, 430 mm, 420 mm, 410 mm, 400 mm, 390 mm, 380 mm, 370 mm, 360 mm, 350 mm, 340 mm, 330 mm, 320 mm, 310 mm, 300 mm, 290 mm, 280 mm, 270 mm, 260 mm, 250 mm, 240 mm, 230 mm, 220 mm, 210 mm, 200 mm, 190 mm, 180 mm, 170 mm, 160 mm, 150 mm, 140 mm, 130 mm, 120 mm, 110 mm, 100 mm, 90 mm, 80 mm, 70 mm, 60 mm, 50 mm, 45 mm, 40 mm, 35 mm, 30 mm, 25 mm, 20 mm, 19 mm, 18 mm, 17 mm, 16 mm, 15 mm, 14 mm, 13 mm, 12 mm, 11 mm, 10 mm, 9 mm, 8 mm, 7 mm, 6 mm, 5 mm, 4 mm, 3 mm, 2 mm, o 1 mm.
[0519] Los canales de un dispositivo fluídico pueden tener una anchura, altura o diámetro lo suficientemente grandes como para acomodar un gran volumen de muestra. En algunos casos, un canal en un dispositivo fluídico tiene un ancho mayor que su altura para reducir un aumento de temperatura debido al calentamiento de Joule en el canal. En algunos casos, un canal en un dispositivo fluídico tiene una relación de ancho a altura de al menos 2:1, 5:1, 10:1, 15: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, 35: 1, 40: 1, 45: 1, 50: 1, 55: 1, 60: 1, 65: 1, 70: 1, 75: 1, 80: 1, 85: 1, 90: 1, 95: 1, o 100: 1. En algunos casos, un canal en un dispositivo fluídico tiene una relación de ancho a alto de 2:1, 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 8 5: 1, 90: 1, 9 5: 1 o 100: 1. En algunos casos, un canal en una línea de producto tiene una superficie transversal menor que aproximadamente 0.1 mm2, 0.2 mm2, 0.3 mm2, 0.4 mm2, 0.5 mm2, 0.6 mm2, 0.7 mm2, 0.8 mm2, 0.9 mm2, I mm2, 1.1 mm2, 1.2 mm2, 1.3 mm2, 1.4 mm2, 1.5 mm2, 1.6 mm2, 1.7 mm2, 1.8 mm2, 1.9 mm2, 2 mm2, 2.1 mm2, 2.2 mm2, 2.3 mm2, 2.4 mm2, 2.5 mm2, 2.6 mm2, 2.7 mm2, 2.8 mm2, 2.9 mm2, 3 mm2, 3.1 mm2, 3.2 mm2, 3.3 mm2, 3.4 mm2, 3.5 mm2, 3.6 mm2, 3.7 mm2, 3.8 mm2, 3.9 mm2, 4 mm2, 4.1 mm2, 4.2 mm2, 4.3 mm2, 4.4 mm2, 4.5 mm2, 4.6 mm2, 4.7 mm2, 4.8 mm2, 4.9 mm2, 5 mm2, 6 mm2, 7 mm2, 8 mm2, 9 mm2, 10 mm2, I I mm2, 12 mm2, 13 mm2, 14 mm2, o 15 mm2.. En algunos casos, un canal en un dispositivo fluídico tiene un área en sección transversa mayor de aproximadamente 0.1 mm2, 0.2 mm2, 0.3 mm2, 0.4 mm2, 0.5 mm2, 0.6 mm2, 0.7 mm2, 0.8 mm2, 0.9 mm2, 1 mm2, 1.1 mm2, 1.2 mm2, 1.3 mm2, 1.4 mm2, 1.5 mm2, 1.6 mm2, 1.7 mm2, 1.8 mm2, 1.9 mm2, 2 mm2, 2.1 mm2, 2.2 mm2, 2.3 mm2, 2.4 mm2, 2.5 mm2, 2.6 mm2, 2.7 mm2, 2.8 mm2, 2.9 mm2, 3 mm2, 3.1 mm2, 3.2 mm2, 3.3 mm2, 3.4 mm2, 3.5 mm2, 3.6 mm2, 3.7 mm2, 3.8 mm2, 3.9 mm2, 4 mm2, 4.1 mm2, 4.2 mm2, 4.3 mm2, 4.4 mm2, 4.5 mm2, 4.6 mm2, 4.7 mm2, 4.8 mm2, 4.9 mm2, 5 mm2, 6 mm2, 7 mm2, 8 mm2, 9 mm2, 10 mm2, 11 mm2, 12 mm2, 13 mm2, 14 mm2, o 15 mm2. En algunos casos, un canal en un dispositivo fluídico tiene una escala de longitud mínima para la disipación del calor menor que aproximadamente 1 micrómetro (pm), 5 pm, 10 pm, 20 pm, 30 pm, 40 pm, 50 pm, 100 pm, 150 pm, 200 pm, 250 pm, 300 pm, 350 pm, 400 pm, 450 pm, 500 pm, 550 pm, o 600 pm. En algunos casos, un canal en un dispositivo fluídico tiene una escala de longitud mínima para la disipación del calor mayor de aproximadamente 1 micrómetro (pm), 5 pm, 10 pm, 20 pm, 30 pm, 40 pm, 50 pm, 100 pm, 150 pm, 200 pm, 250 pm, 300 pm, 350 pm, 400 pm, 450 pm, 500 pm, 550 pm, o 600 pm.
[0521] En algunos casos, un canal en un dispositivo de fluido tiene un volumen total de al menos aproximadamente 1 microlitro (pL), 10 pL, 20 pL, 30 pL, 40 pL, 50 pL, 60 pL, 70 pL, 80 pL, 90 pL, 100 pL, 150 pL, 175 pL, 200 pL, 225 pL, 250 pL, 275 pL, 300 pL, 350 pL, 400 pL, 450 pL, 500 pL, 600 pL, 700 pL, 800 pL, 900 pL, 1 mililitro (mL), 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 11 mL, 12 mL, 13 mL, 14 mL, 15 mL, 16 mL, 17 mL, 18 mL, 19 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 35 mL, 40 mL, 50 mL, 55 mL, 60 mL, 65 mL, 70 mL, 75 mL, 80 mL, 85 mL, 90 mL, 95 mL, o 100 mL. En algunos casos, un canal en un dispositivo de fluido tiene un volumen total de como máximo aproximadamente 1 microlitro (pL), 10 pL, 20 pL, 30 pL, 40 pL, 50 pL, 60 pL, 70 pL, 80 pL, 90 pL, 100 pL, 150 pL, 175 pL, 200 pL, 225 pL, 250 pL, 275 pL, 300 pL, 350 pL, 400 pL, 450 pL, 500 pL, 600 pL, 700 pL, 800 pL, 900 pL, 1 mililitro (mL), 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 11 mL, 12 mL, 13 mL, 14 mL, 15 mL, 16 mL, 17 mL, 18 mL, 19 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 35 mL, 40 mL, 50 mL, 55 mL, 60 mL, 65 mL, 70 mL, 75 mL, 80 mL, 85 mL, 90 mL, 95 mL, o 100 mL.
[0523] En algunos casos, un dispositivo fluídico comprende más de un canal. Los canales pueden estar espaciados dentro del dispositivo fluídico a una densidad dada. En algunos casos, la distancia de borde a borde entre los canales es de al menos aproximadamente 0.2 mm, 0.3 mm, 0.4 mm, 0.5 mm, 0.6 mm, 0.7 mm, 0.8 mm,
[0524] 0.9 mm, 1 mm, 1.25 mm, 1.5 mm, 1.75 mm, 2 mm, 2.5 mm, 3 mm, 3.5 mm, 4 mm, 4.5 mm, 5 mm, 5.5 mm, 6 mm, 6.5 mm, 7 mm, 7.5 mm, 8 mm, 8.5 mm, 9 mm, 9.5 mm, o 10 mm. En algunos casos, la distancia de
[0525] borde a borde entre los canales es como máximo aproximadamente 0.2 mm, 0.3 mm, 0.4 mm, 0.5 mm, 0.6 mm,
[0526] 0.7 mm, 0.8 mm, 0.9 mm, 1 mm, 1.25 mm, 1.5 mm, 1.75 mm, 2 mm, 2.5 mm, 3 mm, 3.5 mm, 4 mm, 4.5 mm,
[0527] 5 mm, 5.5 mm, 6 mm, 6.5 mm, 7 mm, 7.5 mm, 8 mm, 8.5 mm, 9 mm, 9.5 mm, o 10 mm. La densidad de los
[0528] canales se puede definir como una relación entre el ancho de los canales y el espacio (o distancia) entre los
[0529] canales. En algunos casos, la relación entre el ancho del canal y la distancia entre canales es de al menos aproximadamente 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, 4:1, 4.5:1, 5:1, 5.5:1, 6:1, 6.5:1, 7:1, 7.5:1, 8:1, 8.5:1, 9:1, 9.5:1, 10:1,
[0530] 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, o 20:1.
[0532] En algunos casos, el volumen total de todos los canales dentro de un microdispositivo fluídico (por ejemplo,
[0533] chip) es de 1 microlitro (|jL), 10 jiL, 20 jiL, 30 jiL, 40 jiL, 50 jiL, 60 jiL, 70 jiL, 80 jiL, 90 |jL, 100 |jL, 150 |jL,
[0534] 175<ji>L, 200<ji>L, 225<ji>L, 250<ji>L, 275<ji>L, 300<ji>L, 350<ji>L, 400<ji>L, 450<ji>L, 500<ji>L, 600<ji>L, 700<ji>L, 800<ji>L,
[0535] 900 jiL, 1 mililitro (mL), 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9mL, 10 mL, 11 mL, 12 mL, 13 mL, 14 mL,
[0536] 15 mL, 16 mL, 17 mL, 18 mL, 19 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 35 mL, 40 mL, 50 mL, 55 mL, 60 mL, 65 mL, 70 mL, 75 mL, 80 mL, 85 mL, 90 mL, 95 mL, o 100 mL. En algunos casos, el volumen total de todos los canales dentro
[0537] de un microdispositivo fluídico (por ejemplo, chip) es de como máximo aproximadamente 1 microlitro (<ji>L),
[0538] 10<ji>L, 20<ji>L, 30<ji>L, 40<ji>L, 50<ji>L, 60<ji>L, 70<ji>L, 80<ji>L, 90<ji>L, 100<ji>L, 150<ji>L, 175<ji>L, 200<ji>L, 225<ji>L, 250<ji>L,
[0539] 275iL 300iL 350iL 400iL 450iL 500iL 600iL 700iL 800iL 900iL 1 mililitro mL 2 mL 3 mL
[0540] L,
L, o 100 mL.
[0542] Las entradas y/o salidas de un dispositivo fluídico se pueden disponerse y espaciar de tal manera que sean compatibles con los formatos estándar de manejo de fluidos. Por ejemplo, las entradas y/o salidas se pueden
[0543] espaciar para alinearse con los pocillos en una placa de titulación de 5” x 3.33”. Un dispositivo puede comprender ocho entradas y/o salidas, espaciadas para corresponder con una pipeta estándar de ocho puntas
[0544] y/o los ocho pocillos en una dimensión de una placa estándar de 24, 48 o 96 pocillos. Un dispositivo puede comprender doce entradas y/o salidas, espaciadas para corresponderse con una pipeta estándar de doce
[0545] puntas y/o con los doce pocillos en una dimensión de una placa estándar de 96 pocillos. Un dispositivo puede comprender dieciséis entradas y/o salidas, espaciadas para corresponder con una pipeta estándar de dieciséis
[0546] puntas y/o con los dieciséis pocillos en una dimensión de una placa estándar de 384 pocillos. Un dispositivo
[0547] puede comprender veinticuatro entradas y/o salidas, espaciadas para corresponder con una pipeta estándar
[0548] de veinticuatro puntas y/o con los veinticuatro pocillos en una dimensión de una placa estándar de 384 pocillos.
[0549] Esto puede permitir un manejo más fácil de fluidos desde dichas placas hasta el dispositivo, por ejemplo, a
[0550] través de sistemas de pipetas robóticos u otras pipetas múltiples.
[0552] La isotacoforesis se puede llevar a cabo utilizando un sistema de mesa o una estación base. Por ejemplo, la
[0553] FIG. 13A muestra un sistema de mesa 1300 llevar a cabo la preparación de muestras y la isotacoforesis en un
[0554] cartucho de dispositivo fluídico 1301. El cartucho del dispositivo fluídico se puede cargar en el sistema de mesa
[0555] como se muestra, y una tapa con tapas y controles a juego 1302 se puede bajar al cartucho del dispositivo
[0556] fluídico. El sistema de mesa también puede incluir un panel de control 1303 con una interfaz de usuario (por
[0557] ejemplo, pantalla táctil) para la operación del sistema.
[0559] El sistema de mesa puede comprender controles de presión que proporcionan presión para manejar fluidos
[0560] (por ejemplo, muestra, tampón, reactivos, soluciones enzimáticas, soluciones de electrolitos) en un dispositivo
[0561] fluídico. El sistema de mesa puede recibir señales de retroalimentación de presión para regular o controlar el
[0562] manejo de fluidos. El manejo de fluidos se puede utilizar para cargar fluidos en un dispositivo fluídico (por
[0563] ejemplo, reactivos, tampones, muestras). El manejo de fluidos se puede utilizar para cebar fluidos (por ejemplo, soluciones de reactivos) en canales secos en un dispositivo fluídico. La presión se puede regular utilizando,
[0564] por ejemplo, válvulas solenoides.
[0566] El sistema de mesa puede comprender electrodos o contactos eléctricos. Los electrodos pueden ser parte de
[0567] un circuito eléctrico y se pueden insertar en depósitos u otras aberturas en un dispositivo fluídico para permitir
[0568] la aplicación de un campo eléctrico dentro del dispositivo fluídico por el circuito completo. Los contactos
[0569] eléctricos se pueden acoplar a los contactos correspondientes de un dispositivo fluídico, por ejemplo, un
[0570] dispositivo fluídico con electrodos integrados.
[0572] El sistema de mesa puede comprender uno o más detectores o sensores, tales como detectores ópticos,
[0573] sensores de reflectancia, detectores infrarrojos (IR), detectores eléctricos, sensores térmicos, sensores de flujo
[0574] y sensores de presión, que incluyen los detectores descritos más adelante en esta divulgación. Los detectores
[0575] ópticos pueden incluir, pero no se limitan a, detectores puntuales de tres ejes, detectores complementarios de semiconductores de óxido metálico (CMOS), detectores de dispositivos de carga acoplada (CCD), sensores de
[0576] luz de fotodiodos, fotorresistencias, tubos fotomultiplicadores y fototransistores. Los detectores eléctricos
[0577] pueden incluir electrodos u otros detectores capaces de detectar un voltaje, un diferencial de voltaje, una
[0578] corriente, una carga u otra propiedad eléctrica. Los detectores eléctricos se pueden utilizar para detectar el
[0579] paso de una banda de ácidos nucleicos extraídos o purificados, por ejemplo, mediante la detección de un cambio en la conductividad en la interfaz entre los electrolitos de cola y los electrolitos líderes. Los sensores térmicos pueden incluir sensores infrarrojos (IR), sensores de temperatura de sonda, termistores, termistores de coeficiente de temperatura negativo (NTC), detectores de temperatura de resistencia (RTD), termopares, sensores basados en semiconductores o similares.
[0581] El uno o más detectores o sensores pueden ser operados y controlados simultánea o independientemente. En algunos casos, un solo canal puede tener un sensor dedicado, por ejemplo, un sensor térmico o de voltaje, que opera independientemente de otros sensores dedicados a otros canales en el dispositivo microfluídico. La retroalimentación del sensor independiente se puede utilizar para controlar de forma independiente uno o más campos eléctricos en el dispositivo. Por ejemplo, un sensor puede detectar un cambio en el voltaje a lo largo del tiempo dentro de un pocillo como se describe en el presente documento y la retroalimentación de ese sensor se puede utilizar para controlar la corriente dentro del canal. Un segundo sensor puede actuar en un segundo canal de manera similar, pero independiente. En algunos casos, un sensor puede detectar un cambio en la corriente a lo largo del tiempo dentro de un pocillo y la retroalimentación de ese sensor se puede utilizar para controlar el voltaje dentro del canal.
[0583] El sistema de mesa puede comprender uno o más controladores térmicos que controlan la temperatura en un dispositivo fluídico o en una parte de un dispositivo fluídico. Los controladores térmicos pueden comprender componentes que incluyen, pero no se limitan a, calentadores resistivos, sistemas de calefacción o refrigeración basados en fluidos y dispositivos Peltier. Los controladores térmicos se pueden fabricar a partir de materiales que incluyen, pero no se limitan a, metales (por ejemplo, platino, titanio, cobre, oro), carbono y óxido de indio y estaño (ITO). Los controladores térmicos pueden comprender sensores de temperatura, que se pueden utilizar para monitorizar la temperatura que se está controlando y proporcionar retroalimentación de temperatura para el control térmico. Los controladores térmicos se pueden utilizar con sistemas de control por ordenador, como se explica más adelante en esta divulgación. Por ejemplo, los sensores de temperatura (por ejemplo, sensores infrarrojos) se pueden utilizar para monitorizar un cambio en la temperatura en los canales de un chip. Dichos cambios de temperatura pueden ser indicativos de la ubicación de una banda de ITP (por ejemplo, una banda de ácido nucleico) durante un proceso de ITP, cuya diferencia de temperatura se puede deber a un cambio en la conductividad entre los electrolitos líderes y los electrolitos de cola. En algunos casos, los controladores térmicos operan sin retroalimentación de temperatura.
[0585] Las técnicas de la presente divulgación (que incluyen, por ejemplo, el uso de dispositivos fluídicos y/o sistemas de mesa discutidos en el presente documento) pueden proporcionar tiempos de procesamiento rápidos. Por ejemplo, se puede preparar una muestra que comprenda ácidos nucleicos (por ejemplo, eliminación de material embebido, interrupción de tejidos, lisis celular, desentrecruzamiento de ácidos nucleicos) y extraer o purificar ácidos nucleicos para análisis posterior, uso o almacenamiento.
[0587] Detección y cuantificación
[0589] Las técnicas de la presente divulgación pueden emplear uno o más detectores. Los detectores se pueden integrar en dispositivos fluídicos o ubicarse externamente a un dispositivo fluídico. Los detectores se pueden utilizar para la cuantificación de ácido nucleico en una muestra, por ejemplo, mediante medición fluorescente o radiación ultravioleta (UV) (por ejemplo, para la medición de cantidad o pureza, tal como la medición de A260/A280), o para proporcionar una medida cualitativa de los ácidos nucleicos en la muestra. Los ácidos nucleicos se pueden detectar mientras se ubican en un dispositivo fluídico, por ejemplo, dentro de una zona de purificación (por ejemplo, canal de ITP) o un depósito (por ejemplo, un depósito de elución). La concentración de los ácidos nucleicos se puede detectar (o calcular en base a una medición de cantidad en un volumen conocido, como en el pocillo de elución descrito en el presente documento). Los ácidos nucleicos se pueden marcar, como con tintes, y la intensidad de fluorescencia de los ácidos nucleicos se puede medir mediante un detector y utilizar para cuantificar los ácidos nucleicos presentes (véase, por ejemplo, FIG. 14). Los ácidos nucleicos se pueden marcar antes de cargarlos en un dispositivo fluídico, mientras están en un dispositivo fluídico o después de la recuperación de un dispositivo fluídico.
[0591] El uso de un detector puede permitir la cuantificación de ácidos nucleicos a partir de muestras con una alta sensibilidad o un límite bajo de detección. Por ejemplo, los ácidos nucleicos se pueden detectar (por ejemplo, en línea en un canal de isotacoforesis) con un límite de detección menor o igual a unos 1000 picogramos por microlitro (pg/pL), 100pg/|jL, 10 pg/pL, 1 pg/pL, 0.9 pg/pL, 0.8 pg/pL, 0.7 pg/pL, 0.6 pg/pL, 0.5 pg/pL, 0.4 pg/pL, 0.3 pg/pL, 0.2 pg/pL, o 0.1 pg/pL. Los ácidos nucleicos se pueden detectar (por ejemplo, en línea en un canal de isotacoforesis) en un límite de detección menor o igual a aproximadamente 1000 picogramos (pg), 100 pg, 10 pg, 1 pg o 0.1 pg.
[0593] El uso de un detector puede permitir la identificación o calificación de ácidos nucleicos en una muestra. Por ejemplo, técnicas como la amplificación de ácidos nucleicos (que incluyen, por ejemplo, la PCR, la PCR en tiempo real y la PCR con transcripción inversa), la hibridación (que incluye, por ejemplo, la hibridación fluorescentein s itu(FISH) y Q-FISH) y la secuenciación se pueden utilizar para identificar la presencia o ausencia de, y opcionalmente cuantificar, una secuencia particular dentro de los ácidos nucleicos en una muestra.
[0595] Los detectores se pueden utilizar en el control de operaciones de extracción o purificación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un detector puede detectar una banda de ácidos nucleicos concentrados por isotacoforesis. Cuando los ácidos nucleicos concentrados alcanzan una ubicación determinada dentro del dispositivo, el proceso puede finalizarse (por ejemplo, los campos eléctricos se pueden neutralizar) y la muestra extraída o purificada se puede recuperar del dispositivo.
[0597] Los detectores pueden incluir, pero no se limitan a, detectores ópticos y detectores eléctricos, sensores térmicos y sensores de presión (por ejemplo, transductores de presión). Los detectores ópticos pueden incluir, pero no se limitan a, detectores de punto de tres ejes, detectores complementarios de semiconductores de óxido metálico (CMOS), detectores de dispositivos de carga acoplada (CCD), sensores de luz de fotodiodos, fotorresistencias, tubos fotomultiplicadores y fototransistores. La detección óptica se puede lograr mediante iluminación LED combinada con detección de fotodiodos. Los detectores eléctricos pueden incluir electrodos u otros detectores capaces de detectar un voltaje, un diferencial de voltaje, una corriente, una carga u otra propiedad eléctrica. Por ejemplo, los detectores eléctricos se pueden utilizar para detectar el paso de una banda de ácidos nucleicos extraídos o purificados.
[0599] Fin de la activación de la ejecución
[0601] Al purificar una muestra utilizando ITP, puede ser importante detener con precisión la aplicación de corriente cuando la zona de ITP de la muestra está en la ubicación de elución (por ejemplo, un canal o un depósito). La presente divulgación proporciona técnicas para evaluar la posición de la zona de ITP, que se pueden utilizar para activar el final de un ciclo de purificación. Estas técnicas pueden incluir la medición del voltaje de conducción, la medición de la conductividad y la medición de la temperatura.
[0603] La FIG. 15 muestra un esquema de un canal de ITP 1500, con electrodos impulsores colocados en el depósito 1501 de electrodo de elución tamponado (EH) y el depósito 1502 de electrolito líder tamponado (LEH), y un electrodo de tierra colocado en el depósito 1503 de electrolito de cola tamponado (TEH). Los electrodos del detector de conductividad (por ejemplo, detector de conductividad sin contacto acoplado capacitivamente (C4D)) se pueden colocar fuera del chip, como cerca del depósito de elución 1505, como se muestra en el lado izquierdo de la figura. El canal también puede comprender un depósito de electrolito líder 1506 y un depósito de muestras o punto de inyección 1507. Los puertos de gas se indican mediante pequeños círculos en los extremos izquierdo y derecho del canal. Los puertos de gas se pueden utilizar para cargar o cebar automáticamente fluidos en los canales desde los depósitos adjuntos, por ejemplo, utilizando vacío o presión aplicada.
[0605] Un método para medir la posición de una banda de ITP es medir el voltaje o la resistencia del canal, como entre el electrodo impulsor y el electrodo de tierra. En sistemas con más de dos electrodos, esta medición se puede tomar entre cualquier par de electrodos. Esta medición se puede realizar fácilmente, ya que la electroforesis de conducción de voltaje es también el voltaje de medición. A lo largo del proceso de purificación, el voltaje puede aumentar a medida que el ion de cola llena el canal. Sin embargo, el depósito de elución puede tener una gran sección transversal, por lo que la contribución a la resistencia general puede ser pequeña. Por lo tanto, es posible que los cambios en la conductividad del tampón en esta región no afecten fuertemente la resistencia general del canal, y el voltaje puede dejar de aumentar cuando la zona de ITP ingresa al depósito de elución. Esto se puede utilizar como señal para dejar de aplicar corriente y finalizar la ejecución.
[0607] Para evaluar este cambio de voltaje, se puede calcular la derivada del voltaje, por ejemplo, como se muestra en la FIG. 16. El método de diferenciación de Lanzcos se puede utilizar para suprimir el ruido de alta frecuencia. Se pueden establecer umbrales para la derivada y, cuando la derivada supera el umbral, se realiza un activador. En algunos casos, la introducción de activadores adicionales puede mejorar la solidez del control. Por ejemplo, la FIG. 16 muestra cuatro puntos de activación. En algunos casos, solo dos de estos activadores se utilizan para cambiar la corriente de conducción (por ejemplo, los activadores 1 y 4), mientras que los otros (por ejemplo, los activadores 2 y 3) se utilizan para marcar puntos de tiempo en la ejecución, lo que puede mejorar la sincronización del activador 4. La FIG. 17 muestra el análisis derivativo de los voltajes en la FIG. 16, con flechas que representan los umbrales derivados utilizados para elegir los puntos de activación.
[0609] La FIG. 16 muestra datos de ejemplo de medición de la tensión de conducción. Cada línea vertical representa un punto de activación. Las dos líneas representan dos electrodos, los electrodos en los depósitos EH y LEH, con respecto al electrodo de tierra. Los puntos A, B, C y D muestran el tiempo en el que la zona de ITP se encuentra en la ubicación correspondiente marcada en la FIG. 15 (A, B, C y D; etiquetados como 1508, 1509, 1510 y 1511, respectivamente). En algunos casos, la conductividad en todas partes del canal puede afectar el voltaje de conducción general, lo que puede dificultar la evaluación de lo que está sucediendo cerca del depósito de elución.
[0610] Un segundo método para detectar la posición de una banda de ITP es realizar una medición localizada de la conductividad. Esto se puede hacer utilizando un detector de conductividad sin contacto (C4D) acoplado capacitivamente. Este método puede utilizar corriente alterna de alta frecuencia para pasar a través de la pared del canal y acoplarse al electrolito. Esta medición localizada se puede realizar en el propio depósito de elución. Esta técnica puede reducir o eliminar la ambigüedad asociada con las mediciones tomadas en todo el canal. En esta técnica, el activador de fin de ejecución se puede elegir tan pronto como se observe un cambio en la conductividad en el detector de conductividad del depósito de elución, por ejemplo, como se muestra en la FIG.
[0611] 18.
[0613] La detección de C4D se puede realizar con electrodos colocados debajo del canal de elución. Maximizar el área del electrodo puede reducir la frecuencia de conducción necesaria. Por ejemplo, se pueden utilizar frecuencias de conducción desde aproximadamente 100 kHz hasta aproximadamente 10 MHz, con almohadillas de contacto de electrodos entre aproximadamente 0.2 mm2 y aproximadamente 50 mm2 Los sensores C4D se pueden implementar con componentes eléctricos que incluyen resistencias, condensadores, un puente de diodos y amplificadores operacionales de alta frecuencia, con una fuente de señal de alta frecuencia, como la de un sintetizador digital directo. La FIG. 19 muestra un esquema de ejemplo de la implementación de un sensor C4D.
[0615] Un tercer método para detectar la posición de una banda de ITP es realizar una medición localizada de la temperatura cerca del depósito de elución. Esta medición se puede realizar con sensores de temperatura que incluyen un termopar o un sensor de temperatura infrarrojo. El sensor se puede colocar debajo del canal cerca del depósito de elución y puede monitorizar la temperatura a lo largo del tiempo. Cuando los iones de cola de menor movilidad desplazan a los iones líder de mayor movilidad (por ejemplo, la interfaz LE-TE de la zona de ITP), el campo eléctrico en el canal puede aumentar y la temperatura puede aumentar. Durante la isotacoforesis, los iones del electrolito de cola la menor movilidad y los iones del electrolito conductores de mayor movilidad pueden encontrarse en una interfaz de isotacoforesis. La interfaz ITP puede comprender los ácidos nucleicos de muestra concentrados entre los iones del electrolito líder y los iones del electrolito de cola. Un aumento de temperatura puede detectar la presencia de la interfaz ITP entre los iones líder de mayor movilidad y los iones de cola de menor movilidad y, por lo tanto, también indica la presencia de los ácidos nucleicos entre ellos. Este aumento de temperatura puede ser de 1-10 °C.
[0617] Las FIG. 20A y FIG. 20B muestran resultados de ejemplo de medición de temperatura utilizando una cámara termográfica. Estas imágenes muestran un claro aumento de la temperatura a medida que el ion de cola entra en el canal. La FIG. 20A muestra un mapa de temperatura de un canal de ITP tomado con una cámara termográfica; la orientación del canal es la misma que en la FIG. 15. La FIG. 20B muestra un gráfico de la temperatura a lo largo del tiempo en la posición del Cursor 1 en la FIG. 20A. Aproximadamente a los 450 segundos, la interfaz ITP y el ion de cola ingresan a la región, lo que provoca un aumento de la temperatura. Este aumento de temperatura se puede detectar y utilizar como una señal de activación para alterar la corriente eléctrica aplicada al canal.
[0619] La temperatura se puede medir en una ubicación de detección en o cerca del depósito de elución (por ejemplo, como se muestra en la FIG. 21). En algunos casos, la ubicación de detección se puede ubicar al menos aproximadamente a 5 mm del depósito de elución. En algunos casos, la ubicación de detección se puede ubicar al menos aproximadamente a 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm, 15 mm, 16 mm, 17 mm, 18 mm, 19 mm, 20 mm, 21 mm, 22 mm, 23 mm, 24 mm, o 25 mm del depósito de elución. En algunos casos, la ubicación de detección se puede ubicar como máximo aproximadamente a 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm, 15 mm, 16 mm, 17 mm, 18 mm, 19 mm, 20 mm, 21 mm, 22 mm, 23 mm, 24 mm, o 25 mm del depósito de elución. En algunos casos, el sensor de temperatura se puede ubicar al menos aproximadamente a 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm, 15 mm, 16 mm, 17 mm, 18 mm, 19 mm, 20 mm, 21 mm, 22 mm, 23 mm, 24 mm, o 25 mm del depósito de elución. En algunos casos, el sensor de temperatura se puede ubicar como máximo aproximadamente a 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm, 15 mm, 16 mm, 17 mm, 18 mm, 19 mm, 20 mm, 21 mm, 22 mm, 23 mm, 24 mm, o 25 mm del depósito de elución.
[0621] El sensor de temperatura puede activar un cambio en la corriente eléctrica cuando se detecta un cambio en la temperatura. En algunos casos, el cambio de temperatura detectado se encuentra dentro de un rango de aproximadamente 0.2 °C a aproximadamente 5 °C. En algunos casos, el cambio de temperatura detectado es de al menos aproximadamente 0.2 °C, 0.3 °C, 0.4 °C, 0.5 °C, 1 °C, 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C, 6 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C, o 10 °C. En algunos casos, el cambio de temperatura detectado es como máximo de aproximadamente 0.2 °C, 0.3 °C, 0.4 °C, 0.5 °C, 1 °C, 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C, 6 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C, o 10 °C.
[0623] En algunos casos, la detección de la zona de ITP, por ejemplo mediante monitorización del voltaje, mediciones de conductividad o detección de temperatura, en uno o más puntos de activación puede hacer que el controlador de mesa altere la corriente eléctrica aplicada al chip microfluídico. El cambio puede aplicarse inmediatamente después de la detección o después de un retraso predeterminado. La detección de la zona de ITP puede activar una disminución, aumento o eliminación de la corriente. Por ejemplo, la detección de la zona de ITP en el punto C 1510 puede activar una disminución de la corriente para aumentar el tiempo de residencia de la zona de ITP en el canal que conduce al depósito de elución. Alternativamente o en combinación, la detección de la zona de ITP en el punto D 1511 situado en el depósito de elución o cerca de él puede activar la eliminación de la corriente eléctrica con el fin de posicionar la zona de ITP (y los ácidos nucleicos) o una parte de la misma dentro del depósito de elución, pocillo o región del canal o chip. En algunos casos, la detección de la zona de ITP puede activar un cambio en la corriente eléctrica después de un período de tiempo predeterminado. Por ejemplo, una ubicación de detección (por ejemplo, 1504 o la posición del cursor 1) se puede colocar en o cerca del depósito de elución a una distancia conocida tal que el tiempo necesario para que la zona de ITP viaje entre la ubicación de detección y el depósito de elución se pueda calcular para una corriente dada. El controlador puede predeterminar un tiempo de viaje y la detección de la zona de ITP en la ubicación de detección puede activar una eliminación retrasada de la corriente después de la cantidad de tiempo predeterminada. En algunos casos - la detección de la zona de ITP en una ubicación de detección específica puede ofrecer una relación espacio-temporal de la zona de ITP, lo que puede resultar en una activación más precisa que otros métodos de detección.
[0625] En algunos casos, la detección de la zona de ITP en un punto de activación puede hacer que la corriente eléctrica aplicada al chip microfluídico cambie de dirección o trayectoria. Por ejemplo, la corriente eléctrica se puede activar para invertirse de tal manera que la zona de ITP invierta la dirección de viaje dentro del canal. En otro ejemplo, el sistema se puede activar para dejar de aplicar corriente entre un primer par de electrodos y comenzar a aplicar corriente a un segundo par de electrodos para impulsar el flujo de iones a lo largo de un ruta diferente. Por ejemplo, un canal puede tener “forma de Y” con un primer canal que conduce a dos canales laterales que se separan del primer canal en diferentes direcciones. Inicialmente, la corriente puede ser impulsada entre el primer y el segundo electrodos conectados al primer canal y a un primer canal lateral, respectivamente. Sin interrupción de la corriente, la zona de ITP puede viajar desde el primer canal hasta el primer canal lateral. La detección de la zona de ITP en una conexión entre un primer canal y dos canales laterales puede hacer que el primer y segundo electrodo dejen de llevar a cabo la corriente y que el tercer y cuarto electrodos conectados al primer canal y al segundo canal lateral, respectivamente, comiencen a llevar a cabo la corriente. A continuación, la zona de ITP viajará desde el primer canal hasta el segundo canal lateral. En algunos casos, el primer y el tercer electrodo son el mismo electrodo. De esta manera, el activador puede hacer que la corriente cambie de tal manera que la trayectoria de la zona de ITP cambie a lo largo del canal.
[0626] Procesamiento y uso adicionales de muestras purificadas
[0628] Los ácidos nucleicos extraídos o purificados se pueden utilizar para la secuenciación, el genotipado, el análisis de mutaciones o polimorfismos, el análisis de los niveles de expresión génica, el diagnóstico de enfermedades, la predicción de enfermedades, la clasificación citológica, el análisis de paternidad o genealógico, o la indicación de las modalidades de tratamiento sugeridas.
[0630] Los ácidos nucleicos extraídos o purificados se pueden utilizar en reacciones de amplificación, que incluyen pero no se limitan a la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), la amplificación de desplazamiento de hebra (SDA), la amplificación dependiente de helicasa (HDA), la amplificación de círculo rodante (RCA), la reacción de amplificación de enzimas de corte (NEAR), la PCR, la PCR de transcripción inversa, la PCR en tiempo real, la PCR cuantitativa (qPCR), la PCR digital y la PCR específica de metilación.
[0632] Los ácidos nucleicos extraídos o purificados se pueden utilizar en reacciones de secuenciación, que incluye la secuenciación de Maxam-Gilbert, secuenciación de terminación de cadena (por ejemplo, secuenciación de Sanger), secuenciación de escopeta, pirosecuenciación, PCR puente, secuenciación de colonias, secuenciación de polonias, secuenciación por síntesis, secuenciación de semiconductores iónicos, secuenciación de nanoporos, secuenciación de nanobolas, secuenciación por ligadura, secuenciación por hibridación y secuenciación en tiempo real de una sola molécula.
[0634] Los ácidos nucleicos extraídos o purificados se pueden utilizar en ensayos de unión a proteínas, como los ensayos de huellas dactilares de ADN. Por ejemplo, la DNasa (por ejemplo, DNasa I) se puede utilizar para cortar aleatoriamente moléculas de ADN de interés. Las técnicas de la presente divulgación se pueden utilizar para separar el ADN digerido de las enzimas DNasa, evitando una mayor digestión. En algunos casos, la digestión de la DNasa se puede realizar fuera de un dispositivo fluídico y, a continuación, la muestra se puede cargar en un dispositivo fluídico para purificación. En otros casos, la digestión de la DNasa se puede realizar en un dispositivo fluídico y, una vez realizada la digestión, los ácidos nucleicos se pueden purificar en el dispositivo fluídico.
[0636] Las muestras, tales como las muestras fijas o integradas (por ejemplo, muestras FFPE), se pueden utilizar para estudios longitudinales, estudios de asociación de todo el genoma y otros análisis a gran escala entre poblaciones.
[0638] ITP vertical o de columna
[0639] Los diseños de dispositivos ITP planos, como los discutidos en el presente documento, pueden utilizar el espacio horizontal para que viajen las bandas de ITP. Para procesar muestras con un alto rendimiento, tal como en el formato de placa de 96 pocillos, puede ser ventajoso instalar un sistema de separación ITP completo para una muestra en un huella determinada, tal como una huella de 9 mm x 9 mm. Una forma de hacerlo es aumentar la altura del sistema para acomodar más volumen de muestra. Esto puede proporcionar la opción de aumentar los volúmenes totales de muestra en el rango de mililitros y aún así procesar muestras con tiempos de ejecución razonables.
[0641] En algunos casos, puede ser importante reducir o prevenir el flujo impulsado por la gravedad y/o el flujo flotante a través de dicho sistema. También puede ser importante ensamblar las zonas de electrolitos necesarias para la ITP sin mezclar los electrolitos.
[0643] Un sistema ITP vertical o de columna puede comprender varias etapas de ITP, donde cada etapa comprende una columna (por ejemplo, plástico) con gel (por ejemplo, agarosa) o material similar en la porción inferior. El gel puede tener una alta conductividad electrolítica. Cada etapa se puede preparar al introducir un electrolito sobre el gel. El gel puede ralentizar o impedir el flujo de líquido. Para crear la columna, las etapas se pueden apilar con el electrolito de cola en la porción superior y el electrolito líder en la porción inferior. A continuación, la corriente se puede llevar a cabo a través del sistema. El analito purificado se puede recuperar al desapilar las columnas y pipeteando.
[0645] La FIG. 22A muestra un esquema de ejemplo de una configuración ITP vertical (o de columna). Los geles de cada etapa pueden soportar el peso del agua (por ejemplo, una solución acuosa de electrolitos) anterior. El área de la sección transversal de la columna puede ser de aproximadamente 9 mm x 9 mm. Un sistema de este tipo puede procesar una muestra con un área aproximada de columna de sección transversal de 9 mm x 9 mm. El diseño se puede escalar, por ejemplo, a 96 muestras (columnas), con las dimensiones generales del dispositivo que se ajustan a una placa de microtitulación estándar. La FIG. 22B muestra una imagen de ejemplo de un ITP vertical configurado con una banda de ITP de ADN. Las etapas son: Electrolito de Cola Alto (TEH), Muestra, Electrolito Líder (LE) y Electrolito Líder Alto (LEH). La zona de ITP se mueve hacia abajo a través del sistema. Esta imagen no muestra la etapa de elución (E, mostrada en la FIG. 22A) que es el destino final del analito.
[0647] Sistemas de control informático
[0649] La presente divulgación proporciona sistemas de control computarizados que están programados para implementar métodos de la divulgación. La FIG. 13B muestra un sistema informático 1304 que está programado o configurado de otro modo para controlar la preparación de muestras, la extracción o purificación de muestras, o la detección. El sistema informático 1304 puede regular varios aspectos de los procesos de extracción, purificación y detección de la presente divulgación, tales como, por ejemplo, la aplicación de presión o campos eléctricos, el control térmico, la detección, la cuantificación, la retroalimentación y el inicio o finalización de un proceso. El sistema informático 1304 puede ser un dispositivo electrónico de un usuario o un sistema informático que se encuentra ubicado a distancia con respecto al dispositivo electrónico. El dispositivo electrónico puede ser un dispositivo electrónico móvil.
[0651] El sistema informático 1304 incluye una unidad central de procesamiento (CPU, también “procesador” y “procesador de ordenador” en el presente documento) 1305, que puede ser un procesador de un solo núcleo o de varios núcleos, o una pluralidad de procesadores para el procesamiento paralelo. El sistema informático 1304 también incluye la memoria o la ubicación de memoria 1310 (por ejemplo, memoria de acceso aleatorio, memoria de solo lectura, memoria flash), la unidad de almacenamiento electrónico 1315 (por ejemplo, disco duro), la interfaz de comunicación 1320 (por ejemplo, adaptador de red) para comunicarse con uno o más de otros sistemas, y los dispositivos periféricos 1325, tales como caché, otra memoria, almacenamiento de datos y/o adaptadores de pantalla electrónica. La memoria 1310, la unidad de almacenamiento 1315, la interfaz 1320 y los dispositivos periféricos 1325 están en comunicación con la CPU 1305 a través de un bus de comunicación (líneas continuas), como una placa base. La unidad de almacenamiento 1315 puede ser una unidad de almacenamiento de datos (o un repositorio de datos) para almacenar datos. El sistema informático 1304 se puede acoplar operativamente a una red informática (“red”) 1330 con la ayuda de la interfaz de comunicación 1320. La red 1330 puede ser Internet, Internet y/o extranet, o una intranet y/o extranet que esté en comunicación con Internet. La red 1330 en algunos casos es una red de telecomunicaciones y/o datos. La red 1330 puede incluir uno o más servidores informáticos, que pueden permitir la computación distribuida, tal como la computación en la nube. La red 1330, en algunos casos con la ayuda del sistema informático 1304, puede implementar una red entre pares, que puede permitir que los dispositivos acoplados al sistema informático 1304 se comporten como un cliente o un servidor.
[0653] La CPU 1305 puede ejecutar una secuencia de instrucciones legibles por máquina, que pueden ser incorporadas en un programa o software. Las instrucciones se pueden almacenar en una ubicación de memoria, como la memoria 1310. Las instrucciones se pueden dirigir a la CPU 1305, que posteriormente puede programar o configurar la CPU 1305 para implementar los métodos de la presente divulgación. Ejemplos de operaciones realizadas por la CPU 1305 pueden incluir búsqueda, decodificación, ejecución y escritura de resultados.
[0655] La CPU 1305 puede ser parte de un circuito, como un circuito integrado. Uno o más componentes del sistema 1304 se pueden incluir en el circuito. En algunos casos, el circuito es un circuito integrado de aplicación específica (ASIC).
[0657] La unidad de almacenamiento 1315 puede almacenar archivos, tales como controladores, bibliotecas y programas guardados. La unidad de almacenamiento 1315 puede almacenar datos de usuario, por ejemplo, preferencias de usuario y programas de usuario. El sistema informático 1304 en algunos casos puede incluir una o más unidades de almacenamiento de datos adicionales que son externas al sistema informático 1304, tal como ubicadas en un servidor remoto que está en comunicación con el sistema informático 1304 a través de una intranet o Internet.
[0659] El sistema informático 1304 se puede comunicar con uno o más sistemas informáticos remotos a través de la red 1330. Por ejemplo, el sistema informático 1304 se puede comunicar con un sistema informático remoto de un usuario. Ejemplos de sistemas informáticos remotos incluyen ordenadores personales (por ejemplo, PC portátiles), tabletas u ordenadore tipo tableta (por ejemplo, Apple® iPad, Samsung® Galaxy Tab), teléfonos, teléfonos inteligentes (por ejemplo, Apple® iPhone, dispositivo habilitado para Android, Blackberry®) o asistentes digitales personales. El usuario puede acceder al sistema informático 1304 a través de la red 1330.
[0660] Los métodos descritos en el presente documento se pueden implementar mediante código ejecutable de máquina (por ejemplo, procesador de ordenador) almacenado en una ubicación de almacenamiento electrónico del sistema informático 1304, tal como, por ejemplo, en la memoria 1310 o en la unidad de almacenamiento electrónico 1315. El código ejecutable o legible por máquina se puede proporcionar en forma de software. Durante el uso, el código se puede ejecutar por el procesador 1305. En algunos casos, el código se puede recuperar de la unidad de almacenamiento 1315 y almacenarse en la memoria 1310 para que el procesador 1305 pueda acceder fácilmente a él. En algunas situaciones, se puede excluir la unidad de almacenamiento electrónico 1315 y las instrucciones ejecutables de la máquina se almacenan en la memoria 1310.
[0662] El código puede ser precompilado y configurado para uso con una máquina que tenga un procesador adaptado para ejecutar el código, o puede ser compilado durante el tiempo de ejecución. El código se puede suministrar en un lenguaje de programación que se puede seleccionar para permitir que el código se ejecute de forma precompilada o según se compila.
[0664] Los aspectos de los sistemas y métodos proporcionados en el presente documento, tales como el sistema informático 1304, pueden incorporarse en la programación. Varios aspectos de la tecnología pueden considerarse como “productos” o “artículos de fabricación”, normalmente en forma de código ejecutable de máquina (o procesador) y/o datos asociados que se transportan o incorporan en un tipo de medio legible por máquina. El código ejecutable de la máquina se puede almacenar en una unidad de almacenamiento electrónico, como memoria (por ejemplo, memoria de solo lectura, memoria de acceso aleatorio, memoria flash) o en un disco duro. Los medios de tipo “almacenamiento” pueden incluir parte o la totalidad de la memoria tangible de los ordenadores, procesadores o similares, o módulos asociados a los mismos, tales como diversas memorias de semiconductores, unidades de cinta, unidades de disco y similares, que pueden proporcionar almacenamiento no transitorio en cualquier momento para la programación del software. En ocasiones, la totalidad o porciones del software se puede comunicar a través de Internet u otras redes de telecomunicaciones. Dichas comunicaciones, por ejemplo, pueden permitir la carga del software de un ordenador o procesador a otro, por ejemplo, desde un servidor de gestión o un ordenador host a la plataforma informática de un servidor de aplicaciones. Por lo tanto, otro tipo de medios que pueden soportar los elementos de software incluyen ondas ópticas, eléctricas y electromagnéticas, como las que se utilizan a través de interfaces físicas entre dispositivos locales, a través de redes fijas cableadas y ópticas y a través de varios enlaces aéreos. Los elementos físicos que transportan dichas ondas, como enlaces cableados o inalámbricos, enlaces ópticos o similares, también se pueden considerar medios portadores del software. Como se utilizan en el presente documento, a menos que se restrinjan a medios de “almacenamiento” tangibles y no transitorios, términos como “medio legible” por ordenador o máquina se refieren a cualquier medio que participe en el suministro de instrucciones a un procesador para ejecución.
[0666] Por lo tanto, un medio legible por máquina, tal como el código ejecutable por ordenador, puede tomar muchas formas, que incluyen pero no se limitan a, un medio de almacenamiento tangible, un medio de onda portadora o un medio de transmisión físico. Los medios de almacenamiento no volátiles incluyen, por ejemplo, discos ópticos o magnéticos, como cualquiera de los dispositivos de almacenamiento de cualquier ordenador(es) o similares, como los que se pueden utilizar para implementar las bases de datos, etc., que se muestran en los dibujos. Los medios de almacenamiento volátiles incluyen memoria dinámica, como la memoria principal de una plataforma informática de este tipo. Los medios de transmisión tangibles incluyen cables coaxiales; alambre de cobre y fibra óptica, que incluyen los cables que componen un bus dentro de un sistema informático. Los medios de transmisión de onda portadora pueden tomar la forma de señales eléctricas o electromagnéticas, u ondas acústicas o luminosas, como las generadas durante las comunicaciones de datos de radiofrecuencia (RF) e infrarrojos (IR). Por lo tanto, las formas comunes de medios legibles por ordenador incluyen, por ejemplo: un disquete, un disco flexible, un disco duro, una cinta magnética, cualquier otro medio magnético, un CD-ROM, DVD o DVD-ROM, cualquier otro medio óptico, tarjetas perforadas, cinta de papel, cualquier otro medio de almacenamiento físico con patrones de agujeros, una RAM, una ROM, una PRO<m>y EPROM, una FLASH-EPROM, cualquier otro chip de memoria o cartucho, una onda portadora que transporta datos o instrucciones, cables o enlaces que transportan dicha onda portadora, o cualquier otro medio desde el cual una ordenador pueda leer código de programación y/o datos. Muchas de estas formas de medios legibles por ordenador pueden estar involucradas en el transporte de una o más secuencias de una o más instrucciones a un procesador para ejecución.
[0668] El sistema informático 1304 puede incluir o estar en comunicación con una pantalla electrónica 535 que comprende una interfaz de usuario (UI) 1340 para proporcionar, por ejemplo, parámetros operativos (por ejemplo, tiempo de procesamiento, temperatura, intensidad de campo), información de cuantificación de ácidos nucleicos u otra información. Ejemplos de UI incluyen, pero no se limitan a, una interfaz gráfica de usuario (GUI) y una interfaz de usuario basada en la web.
[0670] Los métodos y sistemas de la presente divulgación se pueden implementar mediante uno o más algoritmos. Un algoritmo se puede implementar por medio de software una vez ejecutado por la unidad central de procesamiento 1305. El algoritmo puede, por ejemplo, regular controladores térmicos, calcular la cuantificación de ácidos nucleicos, controlar las funciones del proceso y comenzar o finalizar un proceso.
[0672] Kits
[0674] Esta divulgación proporciona kits útiles para llevar a cabo procesos de isotacóforesis. Por lo general, estos kits comprenden un dispositivo microfluídico proporcionado en el presente documento y uno o más tampones. Los tampones pueden incluir uno o más tampones de muestra, uno o más tampones de electrolito líder, uno o más tampones electrolito de cola, uno o más tampones de lisis y/o uno o más tampones de elución, en cualquier combinación. En algunos casos, el kit puede incluir una o más enzimas (por ejemplo, RNasa, ADN, nucleasas, proteasas, proteinasas, polimerasa). Los tampones se pueden suministrar en tubos separados. En algunos casos, el dispositivo microfluídico está precargado con uno o más tampones. Los kits pueden incluir un conjunto de instrucciones para operar el dispositivo y/o procesar una muestra.
[0676] Ejemplos
[0678] Ejemplo 1 - Extracción de ADN de muestras FFPE
[0680] Se obtiene una muestra FFPE de un paciente humano. Se prepara una solución tampón alcalina acuosa 1.1X (solución A1) con NaOH 80 mM, DTT 11 mM y 0.5 % v/v de Igepal CA-630 en agua destilada o desionizada sin nucleasas. Se prepara una solución de enfriamiento de 10X (Solución A2) con HCl 776 mM y Tris base 100 mM o Trizma en agua destilada o desionizada sin nucleasas. También se proporcionan soluciones de Proteinasa K y RNasas disponibles comercialmente. Alternativamente, se puede preparar una solución de Tris-HCl 5-50 mM tamponada neutramente (por ejemplo, pH de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 8.0) con NaCl 0­ 80 mM, DTT 5-10 mM y 0.1-0.5 % v/v de IGEPAL CA-630 en agua destilada o desionizada sin nucleasa.
[0681] Se agrega una sección o rollo de FFPE a un tubo de microcentrífuga de 1.5-2.0 mL. Se agregan 175 pL de solución A1 al tubo. El contenido del tubo se incuba durante 1-20 minutos a 50-99.9 °C (en algunos casos, el contenido del tubo se incuba durante 5-20 minutos a 95-99.9 °C) para desparafinar la muestra. Se agregan 20 pL de solución A2 al tubo para enfriar la solución A1 y lograr una solución tamponada con un pH de aproximadamente 7-8.25. Alternativamente, se puede incubar una sección o rollo de FFPE en 195 pL de tampón templado o neutro (por ejemplo, pH de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 8.0) durante 1-30 minutos a 50-80 °C para desparafinar la muestra. Otros protocolos de desparafinado que se pueden utilizar incluyen (1) el tratamiento de la muestra con xileno, seguido de uno o más lavados con etanol al 96 %-100 % a temperatura ambiente, seguido del secado del tejido; (2 ) incubar la muestra a una temperatura elevada (por ejemplo, 50-100 °C) durante 1-30 minutos en una solución acuosa tamponada a un pH aproximado de 7 a un pH aproximado de 8.25; (3) incubar la muestra a una temperatura elevada (por ejemplo, 50-100 °C) durante 1­ 30 minutos en una solución acuosa alcalina seguida de neutralización a una solución tamponada con un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 8.25; o (4) incubar la muestra a una temperatura elevada (por ejemplo, 50-100 °C) durante 1-30 minutos en aceite mineral.
[0683] Se agregan 5 pL de solución de Proteinasa K a la solución de muestra desparafinada hasta una concentración final de 400-1000 pg/mL (normalmente 600-700 pg/mL) y un volumen final de 200 pL. A continuación, la solución se incuba durante 15-60 minutos a aproximadamente 56 °C. Opcionalmente, la solución se incuba durante 2-60 minutos a 80-90 °C. Opcionalmente, se agregan 3 pL de RNasa A (o aproximadamente 50­ 200 pg/mL de RNasa A) a la solución. A continuación, la solución se enfría a temperatura ambiente y el lisado de FFPE se carga en un dispositivo fluídico para procesamiento posterior, tal como mediante isotacoforesis (ITP).
[0685] Ejemplo 2 - Comparación de los rendimientos de la extracción de ADN
[0686] El ADN se extrajo utilizando un dispositivo controlador de mesa para automatizar la isotacoforesis en un dispositivo fluídico a partir de (i) tampón de qPCR como limpieza posterior a la PCR (FIG. 3, puntos de datos triangulares), y (ii) lisado de cultivo celular (FIG. 3, puntos de datos cuadrados), con rendimiento calculado utilizando qPCR. Los datos de rendimiento de ADN publicados utilizando una columna de extracción en fase sólida tradicional (SPE; FIG. 3, puntos de datos de diamante) se proporcionan para la comparación. La FIG. 3 muestra el rendimiento del ADN frente a la masa de ADN de entrada. El tampón de electrolito líder utilizado para la isotacoforesis comprendió Tris 88 mM con HCl 44 mM. El electrolito de cola se cargó en el depósito de electrolito de cola y comprendió Tris 1.2 M con ácido caproico 0.3 M y MOPS 0.6 M. La muestra de lisado celular se preparó en un segundo tampón de electrolito líder (tampón de muestra) que comprendía Tris 10 mM con HCl 5.6 mM. La extracción de ADN del lisado de cultivo de células Jurkat humanas se realizó con rendimientos de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 90 % para masas de ADN de entrada de aproximadamente 10-2 nanogramos (ng) a aproximadamente 103 ng. Las células se lisaron en una solución acuosa que comprendía NaOH 40 mM durante 1 minuto y posteriormente se neutralizaron a una relación de volumen de 1:1 con una solución ácida tamponada para llevar la muestra final de lisado celular a Tris 10 mM con HCl 5.6 mM y NaCl 20 mM a pH 8. La proteinasa K se agregó a una concentración final de 400 pg/ml dentro del volumen de la muestra de lisado celular y se incubó durante 10 minutos y 56 °C. A continuación, la muestra lisada se llevó a temperatura ambiente y se cargó en el dispositivo fluídico para la isotacoforesis. La extracción de ADN genómico (prepurificado de células Jurkat humanas utilizando un kit comercial de SPE) enriquecido en un tampón que comprende Tris-HCl 10 mM pH 8 se realizó con rendimientos de aproximadamente 90 % a aproximadamente 100% para masas de ADN de entrada de aproximadamente 10-1 ng a aproximadamente 103 ng.
[0688] En comparación con los kits de columna SPE tradicionales, el método y el dispositivo de isotacoforesis utilizados en el presente documento permitieron mayores rendimientos. Esto puede deberse a una mayor eficiencia de lisis fuera del chip con la química de lisis indicada, seguida de una recuperación más eficiente de los ácidos nucleicos utilizando isotacoforesis. Los métodos y dispositivos de isotacoforesis descritos en el presente documento pueden proporcionar una menor adsorción de muestras de ácidos nucleicos a las superficies del chip en comparación con una columna estándar y/o volúmenes muertos más bajos dentro del dispositivo fluídico que una columna. Los métodos y dispositivos de isotacoforesis descritos en el presente documento pueden permitir una recuperación menos sesgada o no sesgada de ácidos nucleicos en base a la longitud y/o la secuencia, lo que también puede proporcionar una recuperación más eficiente. La muestra de ADN genómico enriquecida realizada tuvo una recuperación muy alta (rendimiento), lo que puede indicar que la isotacoforesis tiene muy poca pérdida sistemática de muestra debido al proceso de isotacoforesis en sí mismo (mientras que la muestra de lisado celular puede tener otros factores que contribuyen a la pérdida de eficiencia, como los productos químicos de lisis utilizados, que se pueden mejorar para obtener mayores rendimientos).
[0690] Ejemplo 3 - Separación de ácidos nucleicos entrecruzados y no entrecruzados
[0692] Una muestra de tejido FFPE de ratón desparafinado y lisado (procesada como se describe en el Ejemplo 1) que comprende ácidos nucleicos entrecruzados y no entrecruzados se cargó en un dispositivo fluídico para isotacoforesis con electrolito líder y electrolito de cola. La muestra se lisó como se describe en el Ejemplo 1 y se preparó en una solución electrolítica principal hasta una concentración final de Tris 10 mM con HCl 5.6 mM. El electrolito líder estaba compuesto por Tris 140 mM con HCl 70 mM. El electrolito de cola comprendía una mezcla de Tris 2.1 M con ácido caproico 0.5 M como ion espaciador con una magnitud de movilidad efectiva mayor que HEPES y HEPES 0.7 M como un ion con una magnitud de movilidad efectiva más baja. Durante la isotacoforesis, los ácidos nucleicos no entrecruzados, que tienen una mayor magnitud de movilidad efectiva, se concentran por delante de la zona de ácido caproico y por detrás de la zona de electrolitos principal. Los ácidos nucleicos entrecruzados y los contaminantes de las muestras se concentran detrás de la zona de ácido caproico, y delante o dentro de la zona HEPES, dependiendo del grado de entrecruzamiento y de su magnitud de movilidad efectiva. La FIG. 23 muestra dos imágenes de separación de ADN en un canal de isotacoforesis después de una digestión de dos horas (superior) o de toda la noche (inferior) para eliminar las proteínas entrecruzadas del ADN. Se agregó proteinasa K al tejido lisado desparafinado (neutralizado a pH 8.2) a una concentración final de 700 pg/ml para la digestión. El ADN entrecruzado aparece en el extremo izquierdo del canal, separado por iones espaciadores del ADN no entrecruzado amplificable en el extremo derecho del canal. El gráfico de la Fig. 23 muestra la intensidad de la señal de ADN frente a la posición en el canal durante las digestiones de dos horas 2301 y 2302 durante la noche.
[0694] Ejemplo 4 - Extracción y purificación de ADN de muestras FFPE de pulmón e hígado
[0696] Se obtuvieron muestras de pulmón e hígado de ratón fijadas en formalina y embebidas en parafina (FFPE) (por ejemplo, Zyagen). Se procesaron siete pares de secciones de FFPE (1 cm por 1 cm por 5-10 pm), con una sección de cada par procesada por isotacoforesis en el dispositivo y una sección procesada por un método diferente (kit de ADN FFPE Promega ReliaPrep) para la comparación. El tampón de electrolito líder utilizado para la isotacoforesis comprendió Tris 88 mM con HCl 44 mM. El electrolito de cola se cargó en el depósito de electrolito de cola y comprendió Tris 1.2 M de con Ácido Caproico 0.3 M y MOPS 0.6 M. Las muestras se desparafinaron por incubación en un tampón Tris-HCl 10 mM con DTT 10 mM, NaCl 72 mM y 0.5 % de IGEP AL CA-630 a pH 8.0 durante aproximadamente 1 minuto a 80 °C, y posteriormente se trataron con proteinasa K en la misma solución durante 60 minutos a 56 °C. A continuación, la muestra digerida se incubó durante 15 minutos a 90 °C. La ITP se llevó a cabo en una muestra de cada par de secciones mediante la dispensación de 200 |<j>L de mezcla de muestra preprocesada, incluida la inclusión y los restos de tejido FFPE, en la entrada de muestra de un dispositivo fluídico. La otra sección de cada par se extrajo utilizando el kit de ADNg FFPE ReliaPrep de Promega de acuerdo con el protocolo del fabricante. La FIG. 24A muestra una imagen de dos canales ITP vecinos en un dispositivo fluídico con ADN de muestras FFPE, marcadas con tinte intercalado para visualización. El ADN extraído de las muestras se cuantificó con qPCR. La FIG. 24B muestra el ADN extraído cuantificado en nanogramos (ng) para cada uno de los siete pares de muestras. Para cada par, la barra izquierda más oscura muestra los resultados de ITP y la barra derecha más clara muestra los resultados del kit ReliaPrep. Los dos pares de muestras más a la izquierda son muestras de hígado humano, y los cinco pares de muestras restantes son muestras de pulmón humano. Para los siete pares de muestras, la cantidad de ácidos nucleicos amplificables extraídos a través de ITP es significativamente mayor (normalmente, rendimientos amplificables de aproximadamente 1.5 a 8 veces más altos) que la cantidad de ácidos nucleicos extraídos por el kit ReliaPrep.
[0698] Ejemplo 5 - Cuantificación de ácidos nucleicos basada en 5-ITP
[0700] Se probó la cuantificación de ácidos nucleicos utilizando ITP y se comparó con qPCR. La comparación se realizó en todo el rango de cantidades de muestra utilizando un ensayo de genes de referencia (ABI) humanos RNaseP. Se generaron curvas estándar o de calibración a partir de 50 ejecuciones de qPCR (10 réplicas cada una a concentraciones de 5 órdenes de magnitud) y se utilizaron para cuantificar la incertidumbre de la medición de qPCR para este rango de cantidades de ADN.
[0702] El ADN se extrajo de 4 millones de células Jurkat utilizando un kit estándar (por ejemplo, el kit de ADN genómico Invitrogen PureLink). Para la ITP en el dispositivo, las células Jurkat se lisaron fuera del chip utilizando una solución de NaOH de pH 12.7 durante 2 minutos, se neutralizaron a una solución tamponada a pH 7.5-8 utilizando una solución de ácido clorhídrico y base de Tris, y luego se trataron con Proteinasa K a pH 8 y 56 °C durante 10 minutos.
[0704] El ADN prepurificado se procesó a través de ITP y se cuantificó en el canal de ITP a través de intensidad fluorescente. El tampón de electrolito líder utilizado para la isotacoforesis comprendió Tris 88 mM con HCl 44 mM. El electrolito de cola se cargó en el depósito de electrolito de cola y comprendió Tris 1.2 M con ácido caproico 0.3 M y MOPS 0.6 M. La muestra se preparó en un tampón de electrolito líder (tampón de muestra) que comprendía Tris 10 mM con HCl 5.6 mM. La FIG. 14 muestra una curva de titulación de la intensidad fluorescente medida del ADN en comparación con la masa de la muestra de ADN conocida, y es lineal en siete órdenes de magnitud, desde 0.4 picogramos (pg) hasta aproximadamente 106 pg. El recuadro superior izquierdo de la FIG. 14 muestra una imagen de 250 ng de ADN en un canal de ITP El recuadro inferior derecho de la FIG. 14 muestra la intensidad de la señal fluorescente del detector puntual en una escala logarítmica para el ADN extraído con ITP en un canal de ITP, a 250 pg, 2.5 ng, 25 ng y 250 ng de ADN.
[0706] Ejemplo 6 - Falta de sesgo en la extracción y purificación de ITP
[0708] Se prepararon mezclas de oligonucleótidos sintéticos de ADN marcados con 100 bases sintéticas con un contenido de A-T del 63 % (37 % de contenido de G-C, etiqueta HEX) y oligonucleótidos de ADN con un contenido de 68 % de G-C (etiqueta FAM) a tres concentraciones (1 ng/jL, puntos de datos cuadrados; 10 ng/jL, puntos de datos de diamante; 100 ng/jL, puntos de datos triangulares) y cinco relaciones de concentración (relación general rica en GC- a AT desde 0.1 hasta 10). Las relaciones se calcularon a partir de las mediciones del lector de placas de fluorescencia obtenidas antes y después del procesamiento. La FIG. 4A muestra una comparación de la relación entre GC de salida y AT con la relación entre GC de entrada y AT para el procesamiento de ITP, lo que demuestra una falta de sesgo en el proceso de ITP
[0710] Se midió la longitud de una mezcla de oligonucleótidos de una escalera de ADN de 1 kb (New England Biosciences) antes y después del procesamiento, utilizando señales integradas de picos de electroferograma del kit de análisis de ADN Experion 12k (BioRad). Se comparó la distribución del tamaño dentro de la muestra antes y después del procesamiento para la ITP en el dispositivo (FIG. 4B, arriba), el kit de columna Qiagen QiaAmp (FIG. 4B, centro) y el kit de columna Invitrogen PureLink (FIG. 4B, abajo). El tampón de electrolito líder utilizado para la isotacoforesis comprendió Tris 88 mM con HCl 44 mM de. El electrolito de cola se cargó en el depósito de electrolito de cola y comprendió Tris 1.2 M de con ácido caproico 0.3 M y MOPS 0.6 M. La muestra se preparó en un tampón de electrolito líder (tampón de muestra) compuesto por Tris 10 mM con HCl 5.6 mM. Para cada comparación, la fila superior muestra la distribución de tamaño en la fracción de salida recuperada y la fila inferior muestra la distribución de tamaño inicial en la muestra.
[0712] Ejemplo 7 - Digestión de la proteinasa K fuera o en chip de ácidos nucleicos lisados celulares
[0714] La FIG. 25A muestra una imagen de un chip de ITP de un solo canal cargado con ácido nucleico (extracción de ARN y digestión proteolítica de células humanas) teñido con tinte para visualización. A la izquierda, 2501 hay una banda de ITP de una muestra procesada fuera del chip antes de cargarla con 200 pg/mL de proteinasa K en tampón de muestra, mientras que a la derecha 2502 hay una muestra no procesada con proteinasa K. El tampón de electrolito líder utilizado para la isotacoforesis comprendió Tris 100 mM con HCl 50 mM. El electrolito de cola se cargó en el depósito de electrolito de cola y comprendió Tris 1.8 M con de ácido caproico 1 M y MOPS 1 M. La muestra se preparó en un tampón de electrolito líder (tampón de muestra) que comprendía Tris 10 mM con HCl 5.6 mM. La FIG. 25B muestra una imagen de un chip de ITP de un solo canal cargado con ácido nucleico (extracción de ARN y digestión proteolítica de células humanas) teñido con tinte para visualización. A la izquierda, 2501 es una banda de ITP de una muestra procesada en chip de 200 pg/mL de proteinasa K en electrolito líder, mientras que a la derecha, 2502 es una muestra no procesada con proteinasa K. En ambos casos, la muestra procesada con proteinasa K exhibe una banda de ITP más estrecha, que representa ácidos nucleicos no asociados con proteínas (mayor magnitud de movilidad efectiva), mientras que la muestra no procesada con proteinasa K exhibe una banda frotada, que representa ácido nucleico asociado con cantidades variables de proteína (menor magnitud de movilidad efectiva).
[0716] Ejemplo 8 - Extracción de ARN de células humanas utilizando lisis fuera del chip y purificación de ITP en el chip
[0718] La FIG. 26A muestra una imagen de una banda de ITP de ARN 2601 en un canal de chip durante la extracción y purificación de ARN de lisado celular (células Jurkat) con ADN digerido. La FIG. 26B muestra una imagen de una banda de ITP 2602 de ácido nucleico total en un canal de chip durante la extracción y purificación de ARN de lisado celular (células Jurkat) sin ADN digerido. El tampón de electrolito líder utilizado para la isotacoforesis comprendía Tris 100 mM con HCl 50 mM. El electrolito de cola se cargó en el depósito de electrolito de cola y comprendía Tris 1.8 M con Ácido Caproico 1 M y MOPS 1 M. La muestra se preparó en un tampón de electrolito líder (tampón de muestra) que comprendía Tris 10 mM con HCl 5.6 mM. La FIG. 26C y FIG. 26D muestran gráficos de electroferogramas de calidad de ARN (medidos con el BioRad Experion) para las muestras que se muestran en las figs. 26A y FIG. 26B, respectivamente. La lisis celular y la digestión de la DNasa se realizaron en una solución tamponada a pH 8 que contenía urea 7M, tiourea 2M y un tensioactivo no iónico, como se discute en este trabajo. Estos resultados demuestran la preparación de ARN de alta calidad con o sin digestión del ADN.
[0720] Ejemplo 9 - Extracción de sangre lisada entera utilizando ITP y dispositivo de chip de 200 pl
[0722] La FIG. 27A muestra los resultados del rendimiento de ADN (ng) para ITP (cuadrado) en comparación con la extracción en columna (diamante, Qiagen QiaAmp) de sangre entera de ratón en función del porcentaje por volumen de sangre entera en la muestra inicial. La FIG. 27B muestra una imagen de ácido nucleico total en una banda de ITP 2401 durante la purificación ITP de sangre entera de ratón lisada en un chip. El tampón de electrolito líder utilizado para la isotacoforesis comprendía Tris 260 mM con HCl 130 mM. El electrolito de cola se cargó en el depósito de electrolito de cola y comprendía Tris 2.1 M con Ácido Caproico 0.5 M y MOPS 0.7 M. La muestra se preparó en un tampón de electrolito líder (tampón de muestra) que comprende Tris 10 mM con HCl 5.6 mM.
[0724] Las FIG. 27C y FIG. 27D muestran imágenes de luz blanca y superposición de fluorescencia de los canales de chip de ITP que muestran la separación física del hemo de la muestra de sangre en el canal de muestra y el canal de electrolito (o separación) 2703 del canal de elución y el depósito 2704, antes y después de la purificación de ITP del 50 % por volumen de lisado de sangre total 2702. El ácido nucleico purificado se tiñe con tinte verde para visualización en el pocillo de elución. La FIG. 27C muestra el chip antes de ITP (tampones de lisado de sangre e ITP cargados en el chip; tampón puro y sin ADN en el pocillo de elución). La FIG. 27D muestra el chip después de ITP (tampones de lisado de sangre e ITP cargados en el chip; tampón puro y ADN en el pocillo de elución). La FIG. 27E muestra el chip después de la purificación de ITP, con una imagen de luz blanca del canal del chip que muestra la separación física del hemo de la muestra de sangre en el pocillo de muestra 2705 y el canal de electrolito líder (o separación) del canal de elución y el depósito 2706 en un dispositivo de chip de un solo canal (50 % por volumen de sangre). La FIG. 27F muestra el chip después de la purificación de ITP, con una imagen de luz blanca del canal del chip que muestra la separación física del hemo de la muestra de sangre en el pocillo de muestra 2705 y el canal de electrolito líder (o separación) del canal de elución y el depósito 2706 en el dispositivo de chip de un solo canal (25 % por volumen de sangre).
[0726] Ejemplo 10 - Extracción de ADN de alto peso molecular a partir de células cancerosas humanas cultivadas utilizando lisis fuera del chip y purificación de ITP en el chip
[0728] La FIG. 28 muestra los resultados de la purificación de ADN de alto peso molecular para ITP (línea sólida) en comparación con la extracción en fase sólida (SPE; línea discontinua, Qiagen MagAttract) de células Jurkat humanas cultivadas como el porcentaje de masa de ADN en la muestra purificada que tiene fragmentos más cortos que una longitud dada (Kb). La lisis celular se realizó fuera del chip en una solución de lisis tamponada que contenía Tris 10 mM con HCl 5.6 mM y 0.2 % v/v de IGEPAL CA-630. La solución tamponada se configuró para lisar las células y reducir la interrupción mecánica del ADN durante la lisis. Los gránulos celulares se lisaron en la solución de lisis y se mezclaron suavemente con inversión y pipeteo de punta ancha de baja velocidad (pipeta automatizada) (por ejemplo, punta de diámetro ancho Rainin de 200 pl) para ayudar en la homogeneización del lisado. Se agregó al lisado una concentración final de 500 |jg/ml de Proteinasa K y se incubó durante 20 min a 60 °C. Se realizó ITP en el lisado con Tris 88 mM con HCl 44 mM como electrolito líder y Tris 1.2 M con ácido caproico 0.3 M y MOPS 0.6 M como electrolito de cola. La purificación basada en ITP condujo a longitudes medias de fragmentos de ADN de 2 a 3 veces mayores en comparación con el kit de PSE basado en perlas, en parte debido a la reducción del cizallamiento mecánico del ADN durante la isotacoforesis en comparación con la SPE debido a la falta de un componente de fase sólida o altas fuerzas de cizallamiento (por ejemplo, de la centrifugación) durante el proceso de extracción. El ADN purificado por ITP tenía una longitud media de ADN de aproximadamente 175 Kb (es decir, el 50 % de la masa de ADN contenía fragmentos de ADN superiores a aproximadamente 175 Kb) en comparación con la purificación de SPE, que produjo ADN con una longitud media de aproximadamente 75 Kb. Más del 60 % de la masa del ADN extraído por ITP contenía una longitud media de fragmento superior a 150 kB. La ITP produjo al menos tres veces más fragmentos de ADN con un tamaño de al menos 150 kB que el método SPE.
[0730] Ejemplo 11 - Cierre de canales utilizando miembro mecánico
[0732] La FIG. 29A muestra un dispositivo fluídico que comprende 8 canales cerrados. Cada canal se cerró permanentemente en dos ubicaciones 2902, 2902 como se muestra en la FIG. 12B al aplicar una temperatura de 150 °C y una presión de 30 libras (en las 16 ubicaciones; es decir, 1.875 libras por diente) al dispositivo durante 1 segundo con el miembro mecánico en forma de peine de la FIG. 12A. La FIG. 29B muestra una vista microscópica ampliada de la ubicación de cierre del segundo canal 2902 adyacente al depósito de elución 2903 de cada uno de los canales. La FIG. 29C muestra el porcentaje de cierre calculado en función de la fuerza aplicada a los chips. Se evaluó el grado de cierre del canal sin carga de líquido en el canal. El cierre se midió al aplicar una presión constante y medir el caudal de aire a través del canal. Se evaluaron cinco chips. Los diamantes indican los datos de cierre obtenidos de la primera ubicación de cierre 2901 y los triángulos indican los datos de cierre obtenidos de la segunda ubicación de cierre 2902. Sin una fuerza aplicada, los canales estaban abiertos o casi abiertos. Una fuerza de 10 libras a través del dispositivo fue suficiente cerca de la mayoría de los canales, mientras que una fuerza de 30 libras a través del dispositivo cerró todos o casi todos los canales repetidamente. La FIG. 29D muestra los resultados de las mediciones de conductividad con un medidor de conductividad para determinar si los canales están cerrados. Los depósitos y canales de chips se cargaron con tampones ITP como se describe en las FIGS. 12A-12D o FIG. 15 (electrolito líder, una alta concentración de electrolito líder para el tamponado, electrolito de cola, tampón de elución, una alta concentración de tampón de elución para el tamponado y tampón de muestra sin una muestra biológica). Los canales se cerraron con el elemento mecánico y luego el fluido en el depósito de elución 2903 se pipeteó fuera del depósito y se recogió. Se midió la conductividad del fluido de elución y se comparó con la medición de la conductividad del tampón de elución original (precargado) (el mismo tampón cargado inicialmente en el chip). Se esperaba que la conductividad del fluido medido fuera la misma que la del tampón de elución original si el cierre del canal era suficiente para proporcionar resistencia fluida en la primera ubicación de cierre del canal 2901 entre el depósito de elución 2903 y el canal y en la ubicación de cierre del segundo canal 2902 dentro del canal que conecta el depósito de elución 2903 con el depósito de tampón de elución (a través del canal de tampón de elución; no mostrado). Para un canal completamente cerrado, la conductividad del volumen eluido (sin realizar ITP) puede ser igual a la conductividad del tampón de elución solo, lo que indica que no hay transferencia de fluidos o iones durante la recolección. Se probaron cuatro situaciones - sin un cerrador (canales completamente abiertos), con la primera ubicación cerrada 2901 cerrada (parcialmente cerrada), con ambas ubicaciones 2901, 2902 cerradas (completamente cerradas), o con todos los depósitos excepto el depósito de elución sellados con una película (“Magic Helmet”). En la situación del Magic Helmet, los canales no fueron deformados físicamente por el miembro mecánico, sino que se sellaron con una película aplicada por el operador para aumentar la resistencia al flujo de fluido. Los volúmenes de elución de los canales parcialmente cerrados mostraron una mayor conductividad en comparación con los canales completamente cerrados. El sellado de los depósitos de no elución con el Magic Helmet también aumentó en comparación con los canales completamente cerrados, pero en general se mantuvo menor que la conductividad de un tampón de elución 2x. Sin embargo, estos niveles de conductividad fueron mucho más bajos que los obtenidos a partir de eluidos sin cierre de canal.
[0734] Ejemplo 12 - Medición de voltaje y activación de fin de ejecución
[0736] La FIG. 30 muestra un ejemplo de ejemplo utilizando la medición de la tensión de conducción para activar una reducción o eliminación de una corriente eléctrica en uno de los canales. Un dispositivo fluídico compuesto por 8 canales se cargó con tampones ITP (tampón de electrolito líder que comprende Tris 88 mM con HCl 44 mM, una alta concentración de electrolito líder para tamponado, tampón de electrolito de cola que comprende Tris 1.2 M de ácido caproico 0.3 M y MOPS 0.6 M, un tampón de elución que comprende Tris 10 mM con HCl 5.6 mM, una alta concentración de tampón de elución para tamponado) en cada uno de los canales. Se preparó una muestra compuesta por 50,000 células humanas inmortalizadas lisadas utilizando los métodos descritos en el presente documento y se cargó en cada uno de los canales. Se realizó una separación previa a la isotacoforesis al conducir 900 jA por canal a través del canal durante 1900 segundos. Después de 1900 segundos 3001, la corriente se redujo y se aplicaron 250 jA a cada canal para impulsar los ácidos nucleicos al depósito de elución. 100 segundos después de iniciar la isotacoforesis, se inició el procesamiento de la señal utilizando el voltaje en el electrodo impulsor como fuente de datos 3002. La línea superior que se muestra representa el voltaje y la línea inferior representa la derivada del voltaje. Se utilizaron dos activadores para cambiar la corriente de conducción (correspondientes a los activadores 1 y 4 descritos en la FIG. 16, en las ubicaciones C y D, respectivamente). Los iones de baja conductividad (por ejemplo, iones de muestra o electrolitos de cola) que ingresan al depósito o canal de elución se pueden detectar mediante la monitorización de picos o máximos en la derivada del voltaje. La corriente se encendió en un primer punto de activación (activador 1) 3001 para dirigir los ácidos nucleicos al canal que comprende el tampón de elución y el procesamiento de señales 3002 se inició poco después. Se detectó un primer aumento en el punto de activación 3 3003 cuando los ácidos nucleicos entraron en el depósito de elución y un segundo aumento se detectó en el punto de activación 43004 cuando los electrolitos de cola comenzaron a entrar en el depósito de elución. La corriente se eliminó tras la detección del segundo aumento en el punto de activación 43004 para posicionar o aislar los ácidos nucleicos de la muestra en el pocillo de elución.
[0738] Ejemplo 13 - Detección de temperatura y activación de fin de ejecución
[0740] La FIG. 21 muestra los resultados de ejemplo de medición de temperatura utilizando un sensor térmico infrarrojo para activar una reducción o eliminación de una corriente eléctrica en uno de los canales. Un dispositivo fluídico compuesto por 8 canales se cargó con tampones ITP (tampón de electrolito líder que comprende Tris 88 mM con HCl 44 mM, una alta concentración de electrolito líder para tamponado, tampón de electrolito de cola que comprende Tris 1.2 M con ácido caproico 0.3 M y MOPS 0.6 M, un tampón de elución que comprende Tris 10 mM con HCl 5.6 mM, una alta concentración de tampón de elución para tamponado) en cada uno de los canales. Se preparó una muestra compuesta por 50,000 células humanas inmortalizadas lisadas utilizando los métodos descritos en el presente documento y se cargó en cada uno de los canales. Se realizó una separación previa a la isotacoforesis al conducir 900 pA por canal a través del canal durante 1900 segundos. Después de 1900 segundos, la corriente se redujo y se aplicaron 250 pA a cada canal para impulsar los ácidos nucleicos al depósito de elución. 100 segundos después de iniciar la isotacoforesis, procesamiento de la señal utilizando datos de temperatura recopilados por un sensor de temperatura infrarrojo TMP007. La temperatura se detectó en la ubicación 2105 en el canal de elución cerca del depósito de elución 2106, centrado aproximadamente a 4.5 mm del pocillo de elución 2106. El sensor de temperatura se colocó aproximadamente de 1 mm a 3 mm por debajo de la superficie inferior del canal fluídico. El sensor de temperatura puede estar centrado aproximadamente a 4.5 mm del depósito de elución 2106 (con bordes a aproximadamente 3.55 mm y a aproximadamente 5.45 mm del depósito de elución). El sensor de temperatura se configuró para detectar cambios de temperatura debidos al calentamiento electroforético de Joule en el canal. La disipación de calor en joules electroforéticos por volumen de canal puede ser inversamente proporcional a la conductividad a una corriente constante. Durante la isotacoforesis, los iones de menor conductividad (electrolitos de cola) pueden desplazar a los iones de mayor conductividad (electrolitos líderes) a medida que la zona de ITP se mueve a través del canal. El sensor de temperatura puede detectar que la zona de ITP se mueve más allá de la ubicación de detección 2105, y el desplazamiento de iones a medida que la zona de ITP se mueve, como un aumento de la temperatura dentro del canal en la ubicación de detección.
[0742] La línea superior muestra la temperatura en la ubicación de detección 2105 y la línea inferior muestra la derivada de la temperatura. La temperatura se monitorizó en tiempo real para detectar altas derivaciones con el fin de detectar zonas de amortiguamiento de menor conductividad. Las líneas verticales indican cuándo ocurrieron eventos clave durante la monitorización. De izquierda a derecha, la primera línea 2101 indica la hora a la que se encendió la corriente y la segunda línea 2102 indica el inicio del procesamiento de la señal poco después. La tercera línea 2103 indica la primera detección de un aumento en la derivada de la temperatura, y la cuarta línea 2104 indica la segunda detección de un aumento en la derivada de la temperatura, momento en el que se detuvo la corriente y se desactivó el voltaje para aterrizar el voltaje en el depósito y posicionar o aislar los ácidos nucleicos en el depósito de elución.
[0744] Ejemplo 14 - ITP simultánea en un dispositivo fluídico de 8 canales
[0746] Las FIG. 31A, FIG. 31B, FIG. 31C y FIG. 31D muestran los resultados de la realización simultánea de isotacoforesis en 8 canales de un dispositivo fluídico. El ADN se extrajo del lisado de cultivo celular utilizando un dispositivo controlador de mesa para automatizar la isotacoforesis en un dispositivo fluídico monolítico de 8 canales. El tampón de electrolito líder que contenía Tris 88 mM con HCl 44 mM y 0.002 % de Tween 20 se cargó en el depósito de electrolito líder de cada canal. El electrolito de cola compuesto por Tris 1.2M con Ácido Caproico 0.3 M y MOPS 0.6 M con 0.002 % de Tween 20 se cargó en el depósito de electrolito de cola de cada canal. La muestra para cada canal se preparó en un segundo tampón de electrolito líder (por ejemplo, tampón de muestra) que comprendía Tris 10 mM con HCl 5.6 mM con 0.002 % de Tween 20. Cada muestra constaba de un lisado celular. El número total de células COLO humanas 320 por muestra representaba 100,000 equivalentes de genoma diploide. Las células se granularon y lisaron fuera del chip en una solución de lisis que comprendía NaOH 40 mM durante 2 minutos y posteriormente se neutralizaron a una relación de volumen de 1:1 con una solución ácida tamponada para llevar la muestra final de lisado celular a Tris 10 mM con HCl 5.6 mM y NaCl 20 mM a pH 8. Se agregó proteinasa K a una concentración final de 400 pg/ml dentro del volumen de la muestra de lisado celular. Cuatro de las ocho muestras se trataron con RNasa A a una concentración final de 200 pg/ml y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 2 minutos. Las ocho muestras se incubaron durante 10 minutos a 56 °C. A continuación, las muestras lisadas se llevaron a temperatura ambiente y se cargaron en los ocho depósitos/canales de muestras separados en el dispositivo microfluídico, indicados por los canales de A a H, en preparación para la isotacoforesis. Las cuatro muestras que no fueron tratadas con RNasa A se cargaron en los canales B, D, F y H. Las cuatro muestras tratadas con RNasa A se cargaron en los canales A, C, E y G. Las muestras tratadas con RNasa A contenían iones amortiguadores adicionales para permitir una actividad óptima de la RNasa y, por lo tanto, representaban muestras de mayor fuerza iónica o mayor conductividad que, en condiciones de corriente fija (ITP), dieron lugar a trazas de datos de voltaje diferentes a las de las muestras no tratadas con RNasa. El control independiente del circuito eléctrico de los canales A a H habilitó la señal de voltaje y el control de retroalimentación para el control automatizado y la activación de fin de ejecución para cada uno de los diferentes canales del dispositivo. La FIG. 31A muestra una micrografía de las bandas de ITP con ADN focalizado 3101 en cada una de las 8 muestras en la región del canal de muestra del dispositivo. La banda de ITP del ADN 3101 migra dentro del canal en respuesta a un campo eléctrico aplicado. La banda de ITP primero se aleja del depósito de electrolito de cola en la dirección indicada por la flecha 3102. A continuación, la banda de ITP 3101 atraviesa el giro de baja dispersión de 180° y continúa por el canal hacia el depósito de elución en la dirección opuesta (con respecto al chip) 3103 en respuesta al campo eléctrico aplicado. La FIG. 31B muestra datos de señal de voltaje independientes a corrientes fijas para cada uno de los 8 canales a lo largo del tiempo. La FIG. 31C muestra una micrografía de las mismas 8 bandas de ITP con ADN enfocado 3101 de las muestras eluidas en el depósito de elución mediante un activador basado en voltaje de fin de ejecución controlado de forma independiente (esta imagen representa el final de la ejecución con el campo eléctrico apagado automáticamente). La FIG. 31D es una sección ampliada del rastreo de voltaje (monitorización) utilizado para la activación que se muestra en la FIG.
[0747] 31B. La corriente eléctrica de cada canal se aplicó independientemente al canal y el voltaje de cada canal se monitorizó de forma independiente para activar un cambio (en este caso cese) en el campo eléctrico aplicado a cada canal independientemente de todos los demás canales.
[0749] Como se utiliza en el presente documento, el término “o” significa “y/o” a menos que se indique lo contrario.
[0750] El término “aproximadamente” como se utiliza en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, se refiere a un valor que no está más de un 10 % por encima o por debajo del valor que se modifica por el término. Por ejemplo, el término “aproximadamente -20 °C” significa un rango de -22 °C a -18 °C. Como otro ejemplo, “aproximadamente de 1 hora” significa un rango de 54 minutos a 66 minutos.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES
1. Un método para el enriquecimiento de ácidos nucleicos, que comprende:
(a) cargar en un dispositivo fluídico
i) una muestra que comprende ácidos nucleicos,
ii) un tampón de electrolito de cola, dicho tampón de electrolito de cola comprende iones del electrolito de cola con una primera movilidad efectiva, en el que dicha primera movilidad efectiva tiene una magnitud menor que la magnitud de una movilidad efectiva de dichos ácidos nucleicos,
(iii) un primer tampón de electrolito líder en un primer depósito de electrolito líder, dicho primer tampón de electrolito líder comprende los primeros iones del electrolito líder con una segunda movilidad efectiva, en el que dicha segunda movilidad efectiva tiene una magnitud mayor que dicha magnitud de dicha movilidad efectiva de dichos ácidos nucleicos, y
(iv) un segundo tampón de electrolito líder en un segundo depósito de electrolito líder, dicho segundo tampón de electrolito líder comprende segundos iones del electrolito líder con una tercera movilidad efectiva, en el que dicha tercera movilidad efectiva tiene una magnitud mayor que dicha magnitud de dicha movilidad efectiva de dichos ácidos nucleicos,
en el que dicho primer tampón de electrolito líder es diferente de dicho segundo tampón de electrolito líder, y dicho primer tampón de electrolito líder tiene una fuerza iónica mayor que una fuerza iónica de dicho segundo tampón de electrolito líder;
(b) primero llevar a cabo isotacoforesis con dichos iones del electrolito de cola, dichos ácidos nucleicos, y dichos primeros iones del electrolito líder al aplicar un primer campo eléctrico dentro de dicho dispositivo fluídico con un primer circuito eléctrico, enriqueciendo de esta manera dichos ácidos nucleicos de los contaminantes en dicha muestra; y
(c) segundo llevar a cabo isotacoforesis con dichos iones del electrolito de cola, dichos ácidos nucleicos y dichos segundos iones del electrolito líder, al aplicar un segundo campo eléctrico dentro de dicho dispositivo fluídico con un segundo circuito eléctrico,
en el que dicho primer circuito eléctrico es diferente de dicho segundo circuito eléctrico.
2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho dispositivo fluídico comprende un primer canal fluídico que se divide en un primer canal fluídico lateral y un segundo canal fluídico lateral.
3. El método de la reivindicación 2, en el que dicho primer campo eléctrico se aplica a dicho primer canal fluídico, y en el que dicha segunda isotacoforesis conductora comprende cambiar una corriente aplicada de dicho primer canal fluídico lateral a dicho segundo canal fluídico lateral.
4. El método de la reivindicación 3, en el que el cambio de dicha corriente aplicada comprende detener la aplicación de una primera corriente entre dicho primer canal fluídico y dicho primer canal fluídico lateral, y luego iniciar la aplicación de una segunda corriente a dicho primer canal fluídico y dicho segundo canal fluídico lateral.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dichos primeros iones del electrolito líder son los mismos que los segundos iones del electrolito líder, y en el que una concentración de dichos primeros iones del electrolito líder en dicho primer tampón de electrolito líder es diferente de una concentración de dicho segundos iones del electrolito líder en dicho segundo tampón de electrolito líder.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que los primeros iones del electrolito líder son los mismos que los segundos iones del electrolito líder, y en el que una concentración de dichos primeros iones del electrolito líder en dicho primer tampón de electrolito líder es la misma que una concentración de dichos segundos iones del electrolito líder en dicho segundo tampón de electrolito líder, y en el que dicho primer tampón de electrolito líder o segundo tampón de electrolito líder comprende terceros iones del electrolito líder.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además recolectar dichos ácidos nucleicos enriquecidos en dicho segundo depósito de electrolito líder, y eliminar dichos ácidos nucleicos enriquecidos de dicho segundo depósito de electrolito líder.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la concentración de dichos segundos iones del electrolito líder en dicho segundo tampón de electrolito líder es menor que 50 mM.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicho segundo tampón de electrolito líder comprende Tris HCl 50 mM.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicho primer circuito eléctrico comprende un primer par de electrodos, en el que dicho segundo circuito eléctrico comprende un segundo par de electrodos, y en el que dicho primer par de electrodos es diferente de dicho segundo par de electrodos.
11. Un sistema que comprende:
a) un dispositivo fluídico que comprende:
i) un depósito de muestras en comunicación fluida con un primer canal fluídico;
(ii) un depósito de tampón de electrolito de cola en comunicación fluida con dicho primer canal fluídico;
(iii) un primer depósito de electrolito líder en comunicación fluida con dicho primer canal fluídico; y
(iv) un segundo depósito de electrolito líder en comunicación fluida con dicho primer canal fluídico, en el que dicho primer depósito de electrolito líder comprende un primer tampón de electrolito líder y dicho segundo depósito de electrolito líder comprende un segundo tampón de electrolito líder, en el que dicho segundo tampón de electrolito lídertiene una fuerza iónica menor que una fuerza iónica de dicho primer tampón de electrolito líder;
(b) un primer circuito eléctrico configurado para llevar a cabo la primera isotacoforesis al aplicar un primer campo eléctrico dentro de dicho dispositivo fluídico a lo largo de una primera ruta que comprende dicho depósito de tampón de electrolito de cola, dicho primer canal fluídico y dicho primer depósito de electrolito líder; y (c) un segundo circuito eléctrico configurado para llevar a cabo una segunda isotacoforesis al aplicar un segundo campo eléctrico dentro de dicho dispositivo fluídico a lo largo de una segunda ruta que comprende dicho depósito de tampón de electrolito de cola, dicho primer canal fluídico y dicho segundo depósito de electrolito líder,
en el que dicho primer circuito eléctrico es diferente de dicho segundo circuito eléctrico, y
en la que dicha primera ruta es diferente de dicha segunda ruta.
12. El sistema de la reivindicación 11, en el que dicho primer circuito eléctrico comprende un primer par de electrodos, en el que dicho segundo circuito eléctrico comprende un segundo par de electrodos, y en el que dicho primer par de electrodos es diferente de dicho segundo par de electrodos.
13. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 11-12, en el que dicho primer circuito eléctrico comprende un primer electrodo en comunicación eléctrica con dicho depósito de tampón de electrolito de cola y un segundo electrodo en comunicación eléctrica con dicho depósito de electrolito líder, y en el que dicho segundo circuito eléctrico comprende un tercer electrodo en comunicación eléctrica con dicho depósito de tampón de electrolito de cola y un cuarto electrodo en comunicación eléctrica con dicho segundo depósito de electrolito líder.
14. El sistema de la reivindicación 13, en el que dicho primer electrodo y dicho tercer electrodo comprenden el mismo electrodo.
15. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en el que dicho primer circuito eléctrico comprende una primera fuente de corriente configurada para aplicar dicho primer campo eléctrico, y en el que dicho segundo circuito eléctrico comprende una segunda fuente de corriente configurada para aplicar dicho segundo campo eléctrico.
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