ES3037019T3

ES3037019T3 - Anti-cd25 antibody and application thereof

Info

Publication number: ES3037019T3
Application number: ES20822215T
Authority: ES
Inventors: Deyong Song; Xiu Liu; Jing Han
Original assignee: Shandong Boan Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shandong Boan Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-06-10
Filing date: 2020-06-08
Publication date: 2025-09-26
Anticipated expiration: 2040-06-08
Also published as: EP3932949B1; JP2022527651A; US20220195055A1; CA3135992A1; EP3932949A4; KR20220007120A; KR102789146B1; WO2020248938A1; JP7245358B2; EP3932949C0; AU2020293160B2; CN113924316A; AU2020293160A1; BR112021024826A2; PL3932949T3; CN113924316B; US12325751B2; CA3135992C; EP3932949A1

Abstract

La presente invención proporciona un anticuerpo que se une a CD25 o a un fragmento de unión a antígeno del mismo, y su uso para la preparación de un fármaco terapéutico contra el cáncer. El anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada que contiene una secuencia específica de región determinante de complementariedad. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno presenta una o más de las siguientes ventajas: mayor capacidad de unión a la proteína CD25, mayor afinidad por la proteína CD25, mayor capacidad de destrucción celular que expresa CD25, menor inhibición de la activación de PBMC, mayor capacidad de inhibición del crecimiento tumoral in vivo, mayor capacidad de destrucción tumoral in vivo, mayor capacidad para reducir el número de células Treg o mayor capacidad para aumentar el número de células T efectoras. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo anti-CD25 y la aplicación del mismo

Campo técnico

La invención está relacionada en general con un campo biomédico, y más específicamente, con un anticuerpo que se une a CD25 y la aplicación del mismo.

Antecedentes

Las células T reguladoras (Treg) desempeñan un papel vital en la mediación de la homeostasis inmunitaria y pueden promover el establecimiento y mantenimiento de la tolerancia periférica. Sin embargo, su papel se vuelve más complejo en el contexto del cáncer. Debido a que las células cancerosas expresan sus propios antígenos asociados al tumor, la presencia de Treg que suprimen la respuesta de las células efectoras puede favorecer la progresión tumoral. Por lo tanto, la infiltración de Treg en tumores establecidos es uno de los principales obstáculos para la eficacia. Se cree que las Treg que utilizan mecanismos inhibidores contribuyen de forma significativa a las limitaciones e incluso fracasos de las terapias actuales, especialmente las inmunoterapias que se basan en inducir o potenciar respuestas antitumorales (Onishi Het al.,2012 Anticanc. Res. 32, 997-1003). La infiltración de Treg en los tumores también se asocia a varios cánceres humanos con pronóstico desfavorable (Shang Bet al.,2015, Sci Rep. 5:15179). Se ha demostrado que las células Treg contribuyen al establecimiento y la progresión de tumores en modelos de ratón y su ausencia provoca un retraso en la progresión tumoral. En los seres humanos, una alta proporción de la infiltración de células Treg en los tumores, más importante aún, una menor proporción de células T efectoras (Teff) frente a células Treg, se asocia al pronóstico desfavorable de varios cánceres humanos (Shanget al.,2015).

CD25 es uno de los objetivos moleculares posibles para lograr la depleción de Treg. CD25 también se conoce como cadena alfa del receptor de alta afinidad de la interleucina-2 (IL-2Ra). CD25 se expresa en niveles altos en las Treg, pero CD25 no está presente o se expresa a niveles bajos en Teff.

En la técnica anterior, existen anticuerpos que se unen a CD25 pero no bloquean la unión de IL2 a CD25, como MA251 (Rubinet al.,1985, Hybridoma 4(2)91-102, Tanakaet al.,1986, Microbiol. Immunol 30(4),373-388), pero siguen existiendo defectos como la actividad insuficiente de unión a CD25, la inhibición de la activación de PBMC y desempeño farmacocinético general.

Ante la demanda de medicamentos por parte de los pacientes para el tratamiento de enfermedades, especialmente las demandas de medicamentos anticuerpos, sigue existiendo una necesidad clínica urgente de proporcionar un anticuerpo anti-CD25 con mayor actividad de unión.

El WO2004/045512A2 se refiere a anticuerpos monoclonales humanos aislados que se unen a CD25 humano y lo inhiben, y se divulgan composiciones y moléculas relacionadas basadas en anticuerpos. Los anticuerpos humanos pueden producirse mediante un hibridoma, un transfectoma o en un animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, capaz de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos mediante recombinación V-D-J y cambio de isotipo. También se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos humanos, animales transgénicos no humanos, hibridomas y transfectomas que producen los anticuerpos humanos, y métodos terapéuticos y de diagnóstico para utilizar los anticuerpos humanos.

En el documento US 6 521 230 B1 se divulga que los anticuerpos monoclonales contra el antígeno CD25 se caracterizan por la secuencia de aminoácidos de sus regiones hipervariables. Inicialmente se producían en forma murina y pueden convertirse en formas quiméricas o humanizadas, inmunoconjugados o fragmentos de anticuerpos (generalmente descritos como moléculas de unión). Los productos son útiles para la profilaxis o el tratamiento del rechazo de trasplantes, especialmente junto con otros anticuerpos contra células T activadas, por ejemplo, anticuerpos CD7.

La divulgación WO 2018/167104 A1 se refiere al uso de un anticuerpo anti-CD25, que no inhibe la interacción IL-2 -CD25, con una mayor unión a los Fc gamma R activadores que conducen a una depleción eficaz de las células Treg infiltrantes de tumores y a un mejor control de los tumores establecidos. La combinación con anticuerpos contra la proteína de muerte celular programada 1 mejora aún más el rechazo tumoral.

Sumario

La invención se define en las reivindicaciones y cualquier otro aspecto, configuraciones, casos o realizaciones que se expongan en el presente documento, que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones, se proporciona únicamente a título informativo.

Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento o diagnóstico se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para usar en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

En el texto completo de la presente invención, pero no comprendidas en el texto de las reivindicaciones, diferentes realizaciones relativas a la VL (región variable de cadena ligera), VH (región variable de cadena pesada), LCDR (región determinante de complementariedad de cadena ligera), HCDR (región determinante de complementariedad de cadena pesada), LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 pueden implementarse individualmente o en cualquier combinación.

Un aspecto, no comprendido en el texto de las reivindicaciones, se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada, en donde la secuencia de aminoácidos HCDR1 está representada por SEQ ID NO: 14, la secuencia de aminoácidos HCDR2 está representada por SEQ ID NO: 15, y la secuencia de aminoácidos HCDR3 está representada por SEQ ID NO: 16. Además, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye también tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera, en donde la secuencia de aminoácidos LCDR1 está representada por SEQ ID NO: 11, la secuencia de aminoácidos LCDR2 está representada por SEQ ID NO: 12, y la secuencia de aminoácidos LCDR3 está representada por SEQ ID NO: 13.

En un aspecto de la presente invención, el anticuerpo proporcionado en la presente invención incluye una región variable de cadena pesada representada por SEQ ID NO: 4; incluye además una región variable de cadena ligera representada por SEQ ID NO: 3.

Un aspecto, no comprendido en el texto de las reivindicaciones, se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera, en donde la secuencia de aminoácidos LCDR1 está representada por SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos LCDR2 está representada por SEQ ID NO: 6, y la secuencia de aminoácidos LCDR3 está representada por SEQ ID NO: 7; y/o tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada, en donde la secuencia de aminoácidos HCDR1 está representada por SEQ ID NO: 8, la secuencia de aminoácidos HCDR2 está representada por SEQ ID NO: 9, y la secuencia de aminoácidos HCDR3 está representada por SEQ ID NO: 10.

Un aspecto, no comprendido en el texto de las reivindicaciones, se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye la región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, y/o la región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la secuencia de la región constante de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de los aspectos anteriores es SEQ ID NO: 20.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la secuencia de la región constante de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de los aspectos anteriores es SEQ ID NO: 17.

Específicamente, el anticuerpo proporcionado en la presente invención incluye la región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, la región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, la región constante de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 20 y la región constante de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 17.

Específicamente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado, no comprendido en el texto de las reivindicaciones, incluye preferentemente la región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, la región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, la región constante de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 20 y la región constante de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 17.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, el anticuerpo del mismo de la presente invención se une a CD25, preferentemente a CD25 humano.

Un aspecto, no comprendido en el texto de las reivindicaciones, se refiere al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de los aspectos anteriores, incluido un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento scFv, un fragmento dsFv o similares.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de uno cualquiera de los aspectos anteriores.

Un aspecto, no comprendido en el texto de las reivindicaciones, se refiere a un vector que incluye el ácido nucleico del aspecto anterior, o el vector puede expresar el anticuerpo de cualquiera de los aspectos anteriores.

Preferentemente, el vector puede ser un vector vírico; preferentemente, el vector vírico incluye, entre otros, un vector lentivírico, un vector adenovírico, un vector vírico adenoasociado, un vector retrovírico, o similares; preferentemente, el vector puede ser un vector no vírico; preferentemente, el vector puede ser un vector de expresión de células de mamífero; preferentemente, el vector de expresión puede ser un vector de expresión en bacterias; y, preferentemente, el vector de expresión puede ser un vector de expresión en hongos.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la presente invención se refiere a una célula que puede expresar una célula del anticuerpo de uno cualquiera de los aspectos anteriores. Preferentemente, la célula es una célula bacteriana; preferentemente, la célula bacteriana es una célulaE. coliy similares; preferentemente, la célula es una célula fúngica; preferentemente, la célula fúngica es una célula de levadura; preferentemente, la célula de levadura es una célula dePichia pastorisy similares; preferentemente, la célula es una célula de mamífero; preferentemente, la célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de riñón embrionario humano (293), una célula B, un linfocito T, una célula DC, una célula NK o similares.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que incluye el anticuerpo, el ácido nucleico o la célula de cualquiera de los aspectos anteriores, preferentemente, la composición farmacéutica incluye además un excipiente farmacéuticamente aceptable, y el vector farmacéuticamente aceptable incluye preferentemente uno o más de los siguientes: un disolvente, un dispersante, un aditivo, un plastificante y similares que sean farmacéuticamente aceptables.

En algunas realizaciones, que no forman parte de la invención, la composición farmacéutica puede incluir además otros agentes terapéuticos. Los otros agentes terapéuticos incluyen agentes quimioterapéuticos, agentes inmunoterapéuticos o agentes terapéuticos hormonales. La administración combinada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y los otros agentes terapéuticos puede potenciar el efecto terapéutico de los agentes terapéuticos.

En algunas realizaciones, que no forman parte de la invención, el "potenciar el efecto terapéutico" se refiere a potenciar el efecto terapéutico de otros agentes terapéuticos o terapias. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede administrarse individualmente o en combinación con otros agentes terapéuticos o terapias. Los otros agentes terapéuticos o terapias incluyen agentes quimioterapéuticos, agentes inmunoterápicos, agentes terapéuticos hormonales, radioterapia y cirugía.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un kit que incluye el anticuerpo de la presente invención, o que incluye un ácido nucleico que codifica el anticuerpo.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la presente invención se refiere a una aplicación del anticuerpo, el ácido nucleico, de uno cualquiera de los aspectos anteriores en la preparación de medicamentos para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades.

Un aspecto, no comprendido en el texto de las reivindicaciones, se refiere a una aplicación del anticuerpo o del ácido nucleico de uno cualquiera de los aspectos anteriores en la preparación de kits de diagnóstico o detección.

En un aspecto de la presente invención, se proporciona un método de tratamiento o prevención de enfermedades que incluye la administración del anticuerpo, el ácido nucleico, de la presente invención a sujetos que lo necesitan.

En un aspecto de la presente invención, se proporciona un método de diagnóstico o detección que incluye la administración del anticuerpo, el ácido nucleico de la presente invención a sujetos o muestras que lo necesitan. Preferentemente, el método es un método de diagnóstico o detección de enfermedades.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la presente invención se refiere al uso del anticuerpo, el ácido nucleico, de uno cualquiera de los aspectos anteriores para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la presente invención se refiere al uso del anticuerpo, el ácido nucleico, de uno cualquiera de los aspectos anteriores para la detección o el diagnóstico. Preferentemente, el uso es diagnosticar o detectar enfermedades.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la enfermedad es un cáncer.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, el cáncer incluye el cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer cervicouterino, sarcoma, citoma, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer renal, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, melanoma, cáncer de mama, mieloma, glioma, leucemia, linfoma y similares.

Un aspecto, no comprendido en el texto de las reivindicaciones, se refiere a un método para preparar el anticuerpo de uno cualquiera de los aspectos anteriores, que incluye la transfección de células con el vector anterior, y la expresión del anticuerpo por las células transfectadas; o incluye la expresión del anticuerpo con la célula mencionada.

Un aspecto, no comprendido en el texto de las reivindicaciones, se relaciona con las siguientes ventajas: mayor actividad de unión a la proteína CD25, mayor afinidad por la proteína CD25, mejor capacidad de eliminación de las células que expresan CD25, reducción de la inhibición de la activación de PBMC, mayor capacidad de inhibición del crecimiento tumoralin vivo,mayor capacidad para eliminación de tumoresin vivo,mayor capacidad para reducir el número de células Treg, o mayor capacidad para aumentar el número de células T efectoras.

Breve descripción de los dibujos

Para explicar con mayor claridad la presente invención o las soluciones técnicas del estado de la técnica, se describirán brevemente a continuación los dibujos o la descripción del estado de la técnica. Evidentemente, los expertos habituales en la materia pueden obtener otros dibujos basados en estos dibujos sin necesidad de ejercer su facultad inventiva. La figura 1 muestra los títulos séricos de ratón BoAn-hMab1 de un esquema de inmunización del Ejemplo 1 después de siete inmunizaciones (dilución de 62500 veces);

las figura 2A a figura 2E muestran la sensibilidad de la unión del anticuerpo CD25 y CD25 por detección mediante ELSIA en el Ejemplo 3;

la figura 3A a la figura 3B muestran los resultados de detección de la actividad de eliminación simulada de los anticuerpos candidatos del Ejemplo 3;

la figura 4 muestra los resultados de detección de la actividad de bloqueo celular de los anticuerpos candidatos del Ejemplo 3;

la figura 5 muestra el efecto de CD25Q2-BA9-IgG1 en la reducción del contenido de células Treg de mono rhesus en el Ejemplo 4;

la figura 6 muestra el metabolismo farmacológico del anticuerpo candidato en mono cynomolgus del Ejemplo 4; la figura 7A a figura 7B muestran los resultados de eficacia de los anticuerpos candidatos en el modelo animal de cáncer de colon MC38 de ratón humanizado B-hIL2Ra del Ejemplo 5.1, en donde la figura 7A muestra los datos de peso corporal de los ratones del modelo tumoral MC38, y la figura 7B muestra los datos de volumen del tumor del modelo tumoral MC38.

La figura 8A muestra el contenido de células CD8+ (Teff) en CD3 en el Ejemplo 5.2.

La figura 8B muestra el contenido de células CD25+ Foxp3+ (Treg) en CD3 en el Ejemplo 5.2.

La figura 8C muestra el contenido de células Foxp3+ (Treg) en CD4 en el Ejemplo 5.2.

Descripción

Las soluciones técnicas de la presente invención se describirán clara y completamente a continuación en relación con los dibujos, y como se entenderá, las realizaciones descritas son parte de las realizaciones de la presente invención, pero no todas las realizaciones.

Las características técnicas implicadas en las diferentes realizaciones descritas a lo largo del texto completo de la presente invención pueden implementarse junto con otras.

Ejemplo 1 Producción de anticuerpo monoclonal anti-CD25

1.1 Programa de inmunización

El CD25 (Sino Biological, número de catálogo: 10165-H08H) se emulsiona con adyuvante de Freund para inmunizar al ratón transgénico de anticuerpos totalmente humanos BoAn-hMab1 de Boan bio (preparado de acuerdo con el método descrito en la patente china CN103571872B). En la primera inmunización se utiliza adyuvante completo de Freund (Sigma, número de catálogo: F5881-10ML), en la segunda inmunización hasta la sexta inmunización se utiliza adyuvante incompleto de Freund (Sigma, número de catálogo: F5506-10ML), un total de 14 ratones fueron inmunizados en este momento. Se seleccionaron 7 ratones con los títulos séricos más altos para la inmunización de refuerzo, y los ratones fueron sacrificados 3 días después para extraer el bazo para los experimentos posteriores. Los títulos séricos (dilución de 62500 veces) de los ratones se muestran en la figura 1.

1.2 Creación de la biblioteca de fagos

El ARN se extrae de las células del bazo de los ratones inmunizados en 1.1, y luego se somete a transcripción inversa para obtener ADNc, las etapas para establecer la biblioteca de fagos se realizan siguiendo el método descrito en Carlos F. Barbas III,Phage display: A laboratory manual,las regiones variables de las cadenas pesada y ligera se obtienen a partir del ADNc mediante el método PCR y, a continuación, el scFv se obtiene mediante PCR de extensión solapada de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, el scFv se liga con el plásmido pCOMB3x después de digerirlo y, a continuación, el producto de la ligación se electrotransfecta en célulasE. coliTG1 competentes, se añade el fago para infectar TG1 después de ser incubado, y el sobrenadante del cultivo concentrado es la biblioteca de fagos de la presente invención.

1.3 Cribado de bibliotecas de fagos (dos métodos)

(1) Cribado de placas: la placa se recubre con proteína CD25 (Sino Biological, 10165-H08H) a 1 pg/pocillo, y se deja toda la noche a 4 °C, la placa se bloquea con BSA al 2 % durante 1 h al día siguiente, y se añade a una biblioteca de fagos (2 * 1012) para incubarla durante 2 h, y el fago unido específicamente a CD25 se eluye con tampón de elución (añadiendo 4,2 ml de ácido clorhídrico concentrado (Comeo) a 500 ml de agua ultrapura y se ajustando el pH a 2,2 con glicina en polvo (Biotopped, BG0617-500)) o 15 pg/ml de MA251 después de ser lavado 4-10 veces.

(2) Cribado con perlas magnéticas: La proteína CD25-Fc (Sino Biological, 10165-H02H) se biotinila de acuerdo con las etapas generales, y se une a las perlas magnéticas de Thermo (Invitrogen Dynabeads M-280 Streptavidin, 00355871) y luego se incuba con la biblioteca de fagos, y el fago unido específicamente a CD25 se eluye con tampón de elución (pH 2,2) o 15 pg/ml MA251 después de ser lavado 4-10 veces.

Los clones de fagos cribados expresan scFv, y detectan la unión de scFv y CD25, y detectan el bloqueo de scFv en la unión IL2/CD25, y seleccionan scFv que se une bien a CD25 y no bloquea CD25 para la construcción posterior.

Detección mediante ELISA de la unión de scFv y CD25: Preparación del tampón CBS: se pesan 1,59 g de Na2CO3 (Sinopharm, 10019260) y 2,93 g de NaHCO3, y se añade agua destilada hasta 1 L para preparar el tampón CBS. La proteína CD25 (10165-H08H, Sino Biological) se diluyó a 0,2 pg/ml con CBS a pH 9,6, se recubrió con una placa marcada enzimáticamente, 100 pl/pocillo, y se incubó durante la noche a 4 °C; se utilizó leche en polvo al 3 % desgrasada para el bloqueo a 37 °C durante 1 h después de lavar la placa; se añaden 80 pl de PBST (PBS Tween20 al 0,05 %) después de lavar la placa y, a continuación, se añadieron 20 pl de periplasma de scFv para incubar a 37 °C durante 1 h. Un anticuerpo secundario anti-etiqueta (Proteintech, número de catálogo: HRP-66008) se añadió después de lavar la placa para incubar a 37 °C durante 1 h. Se añadieron 100 pl de TMB (Makewonder, catálogo NO.

1001) a cada pocillo para el desarrollo del color después de lavar la placa, Se añadieron 50 pl de H2SO42 M a cada pocillo para detener el desarrollo del color después de 10 minutos, y se leyó la DO450 con un lector de microplacas.

Detección mediante ELISA del bloqueo de scFv en la unión CD25/IL2: se utilizó la cadena principal CD25 (10165-H08H, Sino Biological) se diluyó a 0,5 pg/ml con CBS a pH 9,6, y se recubrió con placa marcada enzimáticamente, 100 pl/pocillo, y se incubó durante la noche a 4 °C; se utilizó leche en polvo al 3 % desgrasada para el bloqueo a 37 °C durante 1 h después de lavar la placa. Se añadieron 50 pl de periplasma de scFv a cada pocillo después de lavar la placa. Después, se añadió proteína IL2 marcada con biotina (concentración final de 0,02 pg/ml), 50 pl/pocillo y se incubó a 37 °C durante 1 h; se añadió STREP/HRP diluido con PBST después de lavar la placa, 100 pl/pocillo y se incubó a 37 °C durante 1 h. Se añaden 100 pl de TMB a cada pocillo para el desarrollo del color después de lavar la placa, y 50 pl de H2SO42 M a cada pocillo para detener el desarrollo del color después de 10 min, la DO450 se leyó con un lector de microplacas.

Ejemplo 2 Construcción molecular y producción del anticuerpo candidato

Los clones cribados con microesferas magnéticas CD25Q2-BA3\BA9\BA125, CD25Q8-BT942, CD25Q11-BA402\BA406\BA410\BA415\BA422\BA428 y CD25Q14-BA443\BA448\BA458 y los clones cribados en placas CD25Q11-CA35\CA36\CT848 y CD25Q14-c A705\CA707\CA721 se enviaron a Invitrogen Biotechnology Ltd para su secuenciación. Las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera y de la región variable de la cadena pesada de cada clon se exponen en la Tabla 1.

�

El fragmento de secuencia de nucleótidos que codifica VH se insertó finalmente en el vector pCDNA3.4 (Life Technology) con la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena pesada SEQ ID NO: 17 del anticuerpo, el fragmento de secuencia de nucleótidos que codifica la VL se insertó en el vector pCDNA3.4 (Life Technology) con la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena ligera (SEQ ID NO: 20) del anticuerpo, mediante amplificación de genes de región variable (2*Phanta Max Master Mix, fabricante: Vazyme, Artículo N.°: P515-AA, Lote N.°: TE211GB), péptido señal y extensión de solapamiento de región variable, recombinación homóloga (ClonExpress II One Step Cloning Kit, fabricante: Vazyme, Artículo N.°: C112-01, Lote N.°: TE211L8) y similares, mediante técnicas convencionales de biología molecular. El vector vinculado se transfecta en células HEK293 y se incuba en agitador a 37 °C\CO28 %\125 rpm, y después de la expresión transitoria de 6-7 días, el sobrenadante se purificó mediante cromatografía de afinidad con proteína A para obtener el anticuerpo anti-CD25, y la concentración de anticuerpo se determinó mediante el coeficiente de extinción UV280 de la unión.

Producción de anticuerpos de control: El anticuerpo MA251 es un anticuerpo anti CD25 humano que no bloquea la unión de IL2 y CD25 en la técnica anterior, tiene una alta afinidad por el<c>D25 humano, y tiene un buen desempeño al no bloquear la unión de IL2 y CD25. El anticuerpo MA251 es un anticuerpo clásico para el estudio de la unión de IL2 y CD25. La secuencia de nucleótidos que codifica la región variable del anticuerpo MA251 se sintetiza mediante el gen completo y luego se inserta en el vector pCDNA3.4 y se expresa mediante células HEK293, y el anticuerpo producido se denomina CD25-MA251-IgG1 (la secuencia de la región variable de cadena pesada es SEQ ID NO: 18., la secuencia de la región variable de cadena ligera es SEQ ID NO: 19, la secuencia de la región constante de cadena ligera es SEQ ID NO: 20, y la secuencia de la región constante de cadena pesada es SEQ ID NO: 17).

Ejemplo 3 Caracterización de los anticuerpos candidatos

3.1 Detección mediante ELISA de la actividad de unión del anticuerpo candidato y la proteína CD25

La proteína CD25 (10165-H08H, Sino Biological) se diluyó a diferentes concentraciones (0,08 pg/ml, 0,02 pg/ml, 0,005 |jg/ml, 0,00125 pg/ml, 0,0003125 pg/ml, 0,000078125 pg/ml) con CBS, se recubrió con una placa marcada enzimáticamente, 100 pl/pocillo, y se incubó durante la noche a 4 °C; se utilizó leche en polvo al 3 % desgrasada para el bloqueo a 37 °C durante 1 h después de lavar la placa; se añadieron a cada pocillo 100 pl del anticuerpo candidato diluido a 1 pl/ml con PBST (PBS+0,05 % Tween20) y se incubó a 37 °C durante 1 h; luego el anti-IgG/HRP humano de cabra (KPL, número de catálogo: 5450-0009) y se incubó a 37 °C durante 1h, y después de revelar el color durante 10min, se leyó la DO450 en un lector de microplacas para obtener la CE<50>mediante cálculo. Los resultados se muestran en las figura 2A a figura 2E y en las Tablas 2 a 6.

Como se muestra en la tabla 2, un valor de CE<50>de la unión del anticuerpo candidato CD25Q2-BA9-IgG1 y el antígeno CD25 es 3,328, que es significativamente inferior al valor de CE<50>del grupo de control CD25-MA251-IgG1 que es de 10,63, lo que indica que la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo candidato es significativamente mejor que la del grupo de control CD25-MA251-IgG1.

Como se muestra en la tabla 6, un valor de CE<50>de la unión del anticuerpo candidato CD25Q2-BA9-IgG1 y el antígeno CD25 es 2,26, que es significativamente inferior al valor de CE<50>del grupo de control CD25-MA251-IgG1 que es de 24,5, lo que indica que la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo candidato es significativamente mejor que la del grupo de control CD25-MA251-IgG1.

Se predice que los anticuerpos candidatos CD25Q2-BA9-IgG1 y CD25Q8-BT942-IgG1 tienen un mayor efecto de direccionamiento y unión sobre las células Treg que expresan CD25, tienen mejor efecto de eliminación, reducen la inhibición de las células Treg en las células Teff, y tienen mejores efectos farmacéuticos en comparación con el grupo de control CD25-MA251-IgG1.

Tabla 2 Datos de la detección mediante ELISA de la actividad de unión del anticuerpo candidato y la proteína CD25 corres ondientes a la fi ura 2A

Tabla 3 Datos de la detección mediante ELISA de la actividad de unión del anticuerpo candidato y la proteína CD25 corres ondientes a la fi ura 2B

Tabla 4 Datos de la detección mediante ELISA de la actividad de unión del anticuerpo candidato y la proteína CD25 corres ondientes a la fi ura 2C

Tabla 5 Datos de la detección mediante ELISA de la actividad de unión del anticuerpo candidato y la proteína CD25 corres ondientes a la fi ura 2D

Tabla 6 Datos de la detección mediante ELISA de la actividad de unión del anticuerpo candidato y la proteína CD25 corres ondientes a la fi ura 2E

3.2 Detección de la actividad de eliminación simulada del anticuerpo candidato

Se mezclaron FBS (Gibco, número de catálogo: 10091-148) y RPMI-1640 (Gibco, número de catálogo: 11875-093) en proporción 1:99 para preparar RPMI-1640 con 1 % de FBS, se recogieron las células objetivo SU-DHL-1 y se diluyeron a 1,2^10® células/ml utilizando RPMI-1640 con 1 % de FBS, se tomó el anticuerpo candidato apropiado y se diluyó a 25 |jg/ml utilizando RPMI-1640 con 1 % de FBS, esta concentración se utilizó como concentración inicial; diluido en gradiente 4 veces en secuencia hasta un total de 8 puntos para uso futuro; se recogieron células efectoras Jurkat (G7011, Promega) y se diluyeron a 2,4*106 células/ml utilizando RPMI-1640 al 1 % de FBS, las células objetivo se añadieron en la placa blanca de 96 pocillos con 25jl/pocillo; se añadió el anticuerpo diluido en gradiente en los pocillos cubiertos con células objetivo, con 25 jl/pocillo; las células efectoras Jurkat se añadieron con 25 jl/pocillo, y la placa de 96 pocillos se colocó en la incubadora celular para cultivo por 5 h; y se retiró la placa de 96 pocillos y se colocó a temperatura ambiente para permitir que la temperatura de la misma se equilibrara a la temperatura ambiente; se añadió solución cromogénica Bio-Gl (G7940, Promega) con 75 jl/pocillo, reaccionado durante 15 minutos, la luminiscencia se leyó en un lector de microplacas Tecan para obtener un valor. Los resultados se muestran en las figura 3A a figura 3B y en las Tablas 7 a 8.

Tabla 7 Resultado de la detección simulada de la actividad de eliminación del anticuerpo candidato (correspondiente a la fi ura 3A

Tabla 8 Resultado de la prueba de actividad de eliminación simulada del anticuerpo candidato (correspondiente a la fi ura 3B

Como se muestra en la tabla 7, el valor de CE<50>de detección simulada de actividad de eliminación del anticuerpo candidato CD25Q2-BA9-IgG1 es 0,2356, que es inferior al valor de CE<50>del grupo de control CD25-MA251-IgG1 que es de 0,3606, lo que indica que la capacidad de eliminación del anticuerpo candidato contra SU-DHL-1 es mejor que la del grupo de control CD25-MA251-IgG 1.

Los resultados anteriores indican que el anticuerpo candidato CD25Q2-BA9-IgG1 tiene un buen efecto de eliminación sobre las células que expresan CD25, que predice que el anticuerpo candidato puede reducir las células Treg que expresan CD25 y su inhibición en las células Teff, de manera que tiene mejores efectos farmacéuticos.

3.3 Detección mediante BiaCore de la afinidad del anticuerpo

Para medir la cinética de unión de anticuerpos se utiliza el instrumento BIAcore8K basado en la tecnología de resonancia de plasmón superficial (SRP). El amino del anticuerpo anti-IgG humana fue acoplado a un chip biosensor CM5 mediante el kit de acoplamiento de amino GE anti Human IgG Fc (GE, cat # BR-1008-39) para obtener aproximadamente 1000 unidades de respuesta (UR). Para las mediciones de cinética, la proteína CD25 (Sino Biological, 10165-H08H) se diluyó 2 veces de forma continua con tampón HBS-EP 1 * (GE, BR-1008-26), a partir de 50 nM, diluyéndose 2 veces para 4 gradientes de concentración y estableciendo una concentración 0. El anticuerpo que debe detectarse: 2 pg/ml, tiempo de inyección de la muestra 70 s, caudal de 5 pl/min, estable durante 5 s; proteína CD25: unión durante 60 s, caudal de 30 pl/min, disociación durante 450 s; regeneración: la regeneración se realizó durante 30 s con tampón MgCh 3 M, arranca 3 veces. La constante de asociación (ka) y la constante de disociación (kd) se calcularon utilizando un modelo de unión simple uno a uno de Languir (BIAcore Evaluation Software versión 3.2), y la constante de disociación de equilibrio (KD) se calculó mediante el cociente kd/ka. Los datos de afinidad de cada anticuerpo se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9 Datos de la detección BiAcore de la cinética de unión de los anticuer os candidatos

Como se muestra en la tabla 9, el valor de la constante de disociación de equilibrio KD del anticuerpo candidato CD25Q2-BA9-IgG1 es 8,43E-10, que es inferior al valor KD del grupo de control CD25-MA251-IgG1 que es de 5,19E-09, lo que indica que la afinidad de la proteína CD25 del anticuerpo candidato CD25Q2-BA9-IgG1 es mejor que la del grupo de control CD25-MA251-IgG1.

Como se muestra en la tabla 9, el valor de la constante de disociación de equilibrio KD del anticuerpo candidato CD25Q8-BT942-IgG1 es 3,79E-09, que es inferior al valor KD del grupo de control CD25-MA251-IgG1 que es de 5,19E-09, lo que indica que la afinidad de la proteína CD25 del anticuerpo candidato CD25Q8-BT942-IgG1 es mejor que la del grupo de control CD25-MA251-IgG1.

Los resultados anteriores predicen que los anticuerpos candidatos CD25Q2-BA9-IgG1 y CD25Q8-BT942-IgG1 tienen un mayor efecto de direccionamiento y unión sobre las células Treg que expresan CD25, tienen mejor efecto de eliminación, reducen la inhibición de las células Treg en las células Teff, y tienen mejores efectos farmacéuticos en comparación con el grupo de control CD25-MA251-IgG1.

3.4 Actividad de bloqueo celular del anticuerpo candidato

Las PBMC congeladas (células mononucleares de sangre periférica, fabricante: ALLCELLS, artículo N.°: PB003F-C) se recogieron y se cocultivaron con 10 pg/ml de anticuerpo CD25 en la placa de fondo 96-U durante 30 minutos, no se añadieron anticuerpos al grupo de control, el grupo de control se etiquetó como NoAb, y después se añadió IL2 (0,1 U/ml, 1 U/ml 10 U/ml) para incubar durante 10 minutos (medio de trabajo: 1640+ 10 % de f Bs , con 2 mM de L-glutamina y 10000 U/ml de Pen-Strep), para preparar la suspensión celular: después del último lavado, se desechó el sobrenadante y se agitó la muestra en vórtex con pulsos para disociar completamente el precipitado; se añadieron 200 pl de solución de trabajo de fijación/permeabilización de Foxp3 a cada pocillo. Se incubó a 2-8 °C o a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30-60 minutos; la muestra se centrifugó a 400-600 g durante 5 minutos a temperatura ambiente y se desechó el sobrenadante; se añadieron 200 pl de solución 1X de rotura de membrana a cada pocillo, la muestra se centrifugó a 400-600 g durante 5 minutos a temperatura ambiente, se desechó el sobrenadante, y se lavó dos veces; (se pone BD Phosflow™ Perm Buffer III preliminarmente a -20 °C para preenfriar) lavado con PBS una vez, se centrifugó y se desechó el sobrenadante; se añadió lentamente Phosflow™ Perm Buffer III enfriado en hielo mientras se agita en vórtex, y se incubó en hielo durante 30 minutos; las células se lavaron dos veces con PBS, se centrifugó a 250g durante 10 minutos y se guardó el sobrenadante; las células se resuspendieron en PBS hasta 107 células/ml, contenidas por separado en 100 pl/pocillo, se continuó con la tinción de anticuerpos marcados fluorescentemente y se realizó la citometría de flujo; se distinguieron las células vivas y las células T CD3 positivas. Cuanto mayor sea el porcentaje de transductores de señales y activadores de la transcripción 5 (PSTAT5) fosforilados, menor será la tasa de bloqueo. Los resultados se muestran en la figura 4 y la Tabla 10.

Como se muestra en la tabla 10, el valor %PSTAT5 del anticuerpo candidato CD25Q2-BA9-IgG1 es 26,09, que es significativamente superior al valor %PSTAT5 del grupo de control CD25-MA251-IgG1 que es de 18,52, lo que indica que el anticuerpo candidato es significativamente mejor que el grupo de control CD25-MA251-IgG1 a la hora de no bloquear la unión de IL2 y PBMC. Esto indica que el anticuerpo candidato CD25Q2-BA9-IgG1 puede inhibir la activación de PBMC menos que el grupo de control CD25-MA251-IgG1, lo que predice que el anticuerpo candidato CD25Q2-BA9-IgG1 puede lograr mejor el efecto inmunitario de PBMC y tener mejor efecto farmacéutico/antitumoral.

Como se muestra en la tabla 10, el valor %PSTAT5 del anticuerpo candidato CD25Q8-BT942-IgG1 es de 16,46, y el valor %PSTAT5 de CD25-MA251-IgG1 es de 18,52, lo que indica que el anticuerpo candidato básicamente equivalente al grupo de control CD25- MA251-IgG1 en no bloquear la unión de IL2 y PBMC. Esto predice que el anticuerpo candidato CD25Q8-BT942-IgG1 permite bien el efecto inmunitario de PBMC y tiene un buen efecto farmacéutico/antitumoral.

Tabla 10. Datos de la actividad de blo ueo celular del anticuer o candidato corres ondientes a la figura 4)

Ejemplo 4 Actividad in vivo del anticuerpo candidato

4.1 Actividad PD de CD25Q2-BA9-IgG1 en mono rhesus sano

El anticuerpo CD25Q2-BA9-IgG1 se administró por vía intravenosa a 3 monos rhesus a una dosis de 10 mg/kg, se utilizó un citómetro de flujo (CytomicsTM FC500) para detectar el contenido de las células Treg (CD3+CD4+CD25+FoxP3+) en diferentes puntos temporales antes y después de la administración según citometría de flujo, y los puntos de tiempo de detección fueron: (±1 minuto) antes y después de la administración, 0,5 horas (±1 minutos), 3 horas (±2 minutos), 6 horas (±5 minutos), 24 horas (±10 minutos), 48 horas (±20 minutos, 2 días), 96 horas (±30 minutos, 4 días), 168 horas (±1 hora, 7 días), 336 horas (±1 hora, 14 días) después de la administración, los resultados experimentales se muestran en la figura 5.

Como puede observarse en la figura 5, tras la administración de CD25Q2-BA9-IgG1, este puede reducir significativamente el contenido de células Treg en monos rhesus y puede regular eficazmente el microambiente inmunitario.

4.2 Actividad PK del anticuerpo candidato en mono cynomolgus

Hay dos monos cynomolgus en cada grupo, se les inyectaron por vía intravenosa diferentes anticuerpos CD25, y se extrajeron muestras de sangre total por vía intravenosa a (0 h) antes de la administración y 1 min, 30 min, 3 h, 6 h, 1 d, 2 d, 4 d, 7 d, 10 d y 14 d después de la administración, se introdujo en un tubo de recogida de muestras de sangre y se coaguló de forma natural en la hielera, la muestra de sangre se introdujo en la centrífuga dentro de las 8 horas posteriores a su extracción, se centrifugó a 1000~3000 g durante 10 min, el suero se separó y se colocó en el tubo de almacenamiento de muestras, y a los monos cynomolgus se les inyectó por vía intravenosa diferentes anticuerpos CD25 de nuevo el día 14, las muestras de sangre total se extrajeron por vía intravenosa a las (0 h) antes de la administración y 1 min (14 d 1 m), 30 min (14 d 30 m), 3 h (14 d 3 h), 6 h (14 d 6 h), 1 d (15 d), 2 d (16 d), 4 d (18 d) y 7d (21 d) después de la administración, se introdujo en un tubo de recogida de muestras de sangre y se coaguló de forma natural en la hielera, la muestra de sangre se puso en la centrífuga dentro de las 8 horas posteriores a su extracción, se centrifugó a 1000-3000g durante 10 min, se separó el suero y se colocó en el tubo de almacenamiento de muestras, el metabolismo de los anticuerpos en los monos cynomolgus se detectó mediante ELISA, y los resultados se muestran en la figura 6 y en la Tabla 11.

Los resultados indican: CD25Q2-BA9-IgG1 y CD25Q8-BT942-IgG1 tienen una biodisponibilidad superior a la del anticuerpo de control CD25-MA251-IgG1, y presentan un buen comportamiento farmacocinético.

T l 11 M li m l n i r n i n l m n n m l

Ejemplo 5 Eficacia del anticuerpo candidato en un modelo tumoral in vivo

5.1 Prueba de eficacia del anticuerpo candidato en el modelo animal de cáncer de colon MC38 de ratón humanizado B-hIL2Ra

Los ratones humanizados B-hIL2Ra (Biocytogen) se dividieron en 5 grupos según su peso corporal, 10 ratones en el grupo de control negativo G1 y 8 ratones en cada uno de los grupos de tratamiento G2-G4. La administración individual se realizó a partir del día de la agrupación (10 mg/kg, i.p., BIW) (10 mg/kg, inyección intraperitoneal, dos veces a la semana), al día siguiente, las células MC38 resuspendidas en PBS se inocularon por vía subcutánea en el lado derecho de ratones humanizados B-hIL2Ra a una concentración de 5*105 células/0,1 ml con 0,1 ml/ratón. El volumen del tumor y el peso corporal de los animales se midieron dos veces por semana, y se registraron los valores de las mediciones, volumen del tumor (mm3) = 0,5 * diámetro largo * diámetro corto2. Los resultados se muestran en las figura 7A y figura 7B y en las Tablas 12 y 13.

Como se muestra en la figura 7A, el peso corporal de los ratones aumentó de forma constante, lo que indica que CD25Q2-BA9-IgG1, CD25Q8-BT942-IgG1 y CD25Q11-CT848-IgG1 (10 mg/kg, i.p., BIW: dos veces por semana) no tienen efectos tóxicos ni secundarios en los ratones.

Como se muestra en la figura 7B, en comparación con el grupo de control, CD25Q2-BA9-IgG1, CD25Q8-BT942-IgG1 y CD25Q11-CT848-IgG1 pueden inhibir significativamente el crecimiento del tumor de ratón MC38, de los cuales CD25Q8-BT942-IgG1 muestra un mejor efecto antitumoral.

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Tabla 13. Datos del volumen del tumor MC38 corres ondientes a la fi ura 7B

5.2 Detección mediante FACS del efecto de infiltración de células inmunitarias en el tumor MC38 tras la administración

Después de la 5.a administración de los ratones de ensayo (16 días después de la agrupación) en 5.1, se tomaron 4 ratones del grupo de control negativo y 3 ratones de cada grupo de tratamiento, se sacrificaron los ratones y se extirpó el tumor, se añadió al mismo la enzima digestiva, se incubó y digirió durante 40 minutos a 37 °C, y se resuspendió como suspensión unicelular tras filtrar y lavar. se añadieron 25 pl de solución de bloqueo y colorante de viabilidad y 25 pl de suspensión celular a cada pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos, se mezcló bien y se incubó en la oscuridad durante 15 minutos a 4 °C; se añadieron a cada pocillo 50 pl de marcador de superficie, se mezcló bien y se incubó en la oscuridad durante 30 minutos a 4 °C; se añadieron 150 pl de solución FACS a cada pocillo y se lavaron dos veces, 4 °C, 500 g, se centrifugó durante 5 minutos y se desechó el sobrenadante; se añadieron 200 pl de las células resuspendidas en solución de fijación a cada pocillo, se fijaron durante 30 minutos a temperatura ambiente después de mezclar bien; después de la fijación, se centrifugó a 4 °C, 1400 g durante 5 min, y se desechó el sobrenadante; se añadieron a cada pocillo 200 pl de una solución penetrante de la membrana, se centrifugó a 4 °C, 1400 g durante 5 min, y se desechó el sobrenadante; se añadieron a cada pocillo 100 pl de una solución de tinción intracelular, temperatura ambiente, se incubó en la oscuridad durante 30 minutos; se añadieron 150 pl de solución penetrante de la membrana a cada pocillo y se lavaron dos veces, 1400 g, se centrifugó durante 5 minutos y se desechó el sobrenadante; las células se resuspendieron con 250 pl de PBS, y el contenido de células CD8+ (Teff) en CD3, el contenido de células CD25+Foxp3+ (Treg) en CD3 y el contenido de células Foxp3+ (Treg) en CD4 se detectó en la máquina. Los resultados se muestran en las figura 8A a 8C.

Como se muestra en las figuras 8A a 8C, en comparación con el grupo de control IgG1 isotipo kappa humana, CD25Q2-BA9-IgG1, CD25Q8-BT942-IgG1 y CD25Q11-CT848-IgG1 pueden reducir la proporción de células Treg en el tumor de ratón MC38 y aumentar la infiltración de células Teff, mejorando de ese modo la capacidad de eliminación del tumor.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une a CD25, que comprende una región variable de cadena pesada, una región constante de cadena pesada, una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera, en donde la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada está representada por SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada está representada por SEQ ID NO: 17, la región variable de cadena ligera está representada por SEQ ID NO: 3, y la región constante de cadena ligera está representada por SEQ ID NO: 20.

2. Un ácido nucleico, en donde el ácido nucleico codifica el anticuerpo que se une a CD25 de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Una célula, en donde la célula expresa el anticuerpo que se une a CD25 de acuerdo con la reivindicación 1.

4. Una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo que se une a CD25 de acuerdo con la reivindicación 1 o el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 o la célula de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Un kit, que comprende el anticuerpo que se une a CD25 de acuerdo con la reivindicación 1 o el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2.

6. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 para usar en el tratamiento o profilaxis de enfermedades.

7. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 para usar en un método de diagnóstico"in vivo".

8. Uso del anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o del ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 en el diagnóstico"in vitro/ex vivo"del cáncer.

9. El anticuerpo o el ácido nucleico para usar de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la enfermedad es cáncer.

10. El anticuerpo o el ácido nucleico para usar de acuerdo con la reivindicación 9 o el uso del anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el cáncer es cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer cervicouterino, sarcoma, citoma, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer renal, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, melanoma, cáncer de mama, mieloma, glioma, leucemia y linfoma.