ES2994413B2 - Producción de mixoquelina A a partir de una cepa mutante de Myxococcus xanthus - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Producción de mixoquelina A a partir de una cepa mutante deMyxococcus xanthus

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se enmarca en el campo de la Biotecnología y de la Microbiología. En concreto, la invención está dirigida a la obtención, a partir de microorganismos modificados genéticamente, de compuestos orgánicos de interés industrial, en este caso, de un tipo de sideróforo como es la mixoquelina A.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los sideróforos son moléculas de pequeño tamaño y de naturaleza química variada secretadas por microorganismos. Presentan una gran afinidad por el ion hierro Fe3+, la forma en la que se encuentra el hierro en condiciones óxicas. Este ion hierro Fe3+ tiene muy poca solubilidad a pH neutro y por tanto se encuentra poco disponible en muchos medios naturales. Los sideróforos forman complejos con estos iones, quelándolos y haciéndolos así disponibles para los microorganismos, de forma que puedan abastecerse de las cantidades de este metal necesarias para vivir. Debe tenerse en cuenta que el hierro es un metal esencial para la mayoría de los seres vivos.

Actualmente los sideróforos son utilizados en muy diversos campos, entre otros, en Medicina, donde se han utilizado como transportadores de fármacos en el organismo o para tratar enfermedades originadas por un exceso de hierro (1).

Las mixoquelinas son sideróforos que quelan el hierro del medio con una altísima afinidad. Estas sustancias son producidas por mixobacterias, entre ellasMyxococcus xanthus,de quien toma el nombre, y también por otros microorganismos. Fueron descubiertas por Kunze et al., en 1989 (2) y existen dos tipos de ellas, la mixoquelina A y la mixoquelina B, las dos producidas porM. xanthus.

La fórmula molecular de la mixoquelina A es C20H24N2O7, su nombre de acuerdo con IUPAC (3) es: N-[(5S)-5-[(2,3-dihidroxibenzoil)amino]-6-hidroxihexil]-2,3-dihidroxibenzamida. Mientras que la fórmula de la mixoquelina B es C20H25N3O6, y se la denomina N-[(5S)-6-amino-5-[(2,3-dihidroxibenzoil)amino]hexil]-2,3-dihidroxibenzamida.

La fórmula general de las mixoquelinas, con la especificación de los radicales que diferencian a la A de la B, es la siguiente.

Como ocurre con otros sideróforos, las bacterias solamente producen mixoquelinas cuando se encuentran en presencia de bajas concentraciones de hierro, lo que a su vez afecta a la viabilidad y crecimiento de los microorganismos implicados en su producción. Además, los niveles que se producen de estos sideróforos son relativamente bajos de cara a posibilitar su explotación a nivel industrial. Por ello, la producción de estos compuestos y su purificación resulta laboriosa y costosa. La producción actual es bastante escasa y está limitada a unas pocas empresas, lo que impide su comercialización en grandes cantidades.

Las mixoquelinas, y entre ellas la A, tienen multitud de aplicaciones entre las que destacan el campo de la salud, en concreto en el tratamiento del cáncer, donde se ha demostrado que es citotóxico para ciertas células cancerosas humanas, como células de cáncer de colon, pudiendo ser utilizado como antitumoral. También se ha demostrado que las mixoquelinas inhiben la actividad de la 5-lipoxigenasa humana implicada en la enfermedad de este mismo nombre, que causa artritis reumatoide, aterosclerosis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedades autoinmunes, rinitis alérgica, conjuntivitis, asma, erupciones cutáneas, eczema y coronariopatías.

Su uso también está siendo evaluado para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la absorción de hierro, como en la hemocromatosis hereditaria, donde el hierro no se adquiere de forma eficiente por el organismo, o aquellas donde se da una absorción exagerada de hierro porque el organismo no dispone de un mecanismo eficaz para su eliminación, ya que el exceso de hierro puede inducir un estado de estrés oxidativo celular persistente con daño tisular y, eventualmente, fallo multiorgánico. También se puede utilizar para tratar enfermedades relacionadas con el acumulo de hierro en ciertos órganos y síndromes mielodisplásticos y trastornos hemáticos con hematopoyesis ineficaz.

Se conoce su uso como antimicrobiano contra multitud de bacterias patógenas del géneroBacillus,comoB. brevis(DSM30),B. cereus(DSM621),B. megaterium(DSM32),B. subtilis(DSM10),B. thuringiensis(DSM2046), y otras comoMicrococcus luteus(GBF26),Staphylococcus aureus(GBF16),Arthrobacter simplex(DSM20130),Brevibactenum linens(DSM20425),Corynebacterium fascians(DSM20131),Nocardia corallina(ATCC13258) yEscherichia coli(DSM498). Estudios recientes apoyan la idea de utilizar sideróforos como antibióticos para tratar infecciones por estos microorganismos. En todos estos ejemplos, las mixoquelinas impedirían que los patógenos pudieran crecer al no disponer del hierro suficiente.

En el campo de la investigación, las mixoquelinas se pueden utilizar como quelante de alta eficiencia para la sobreexpresión de ciertos antibióticos en algunas bacterias o para estudiar el efecto de los sideróforos de patógenos sobre el sistema inmune humano.

Se plantean también como candidatas óptimas para sustituir al 2,2-dipiridilo, el agente secuestrador de hierro más utilizado en los laboratorios de investigación actualmente, que es mucho menos eficaz que las mixoquelinas.

Se han descrito muchas otras aplicaciones de este compuesto en áreas como la biorremediación, para tratar suelos y aguas contaminados con altas concentraciones de hierro; la agricultura, ya que resultan beneficiosos para las plantas; y la alimentación, como suplemento de hierro en pacientes con anemia o como aditivo con hierro en los productos alimenticios alternativos vegetarianos y veganos, donde puede adicionar hierro sin que sea de origen animal.

El proceso de síntesis de las mixoquelinas enM. xanthuses bien conocido, aunque se desconoce cómo se regula la expresión de estos genes. Se presenta un esquema del proceso de biosíntesis de las mixoquelinas A y B en laFigura 1.

En la actualidad, se han propuesto diversas estrategias para tratar de aumentar la producción de esta molécula. En ese sentido, se plantea la posibilidad de delecionar el gen que produce la mixoquelina B, de tal forma que se produzca un aumento de solamente un tipo de mixoquelina, la A.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente memoria describe una cepa mutante deM. xanthus, LmxcLque presenta una deleción en el genmxcL(MXAN_3640), el cual codifica la proteína MxcL, con actividad aminotransferasa, que actúa en último lugar dentro de la ruta de biosíntesis de las mixoquelinas, implicada únicamente en la síntesis de mixoquelina B (Figura 1). De esta forma, la cepa mutanteAmxcLes capaz de producir exclusivamente mixoquelina A, sin mixoquelina B.

Curiosamente, la producción de este sideróforo, la mixoquelina A, en el mutanteAmxcLse da en cantidades mayores a las que produce la cepa silvestre deM. xanthusde ambos compuestos, mixoquelina A y B.

Por lo tanto, el sobrenadante del medio de cultivo en el que ha crecido este mutante se encuentra muy enriquecido en mixoquelina A, sin presencia de mixoquelina B, lo que simplifica el proceso de purificación de esta sustancia.

Además, este nuevo mutanteAmxcLcrece a mayor velocidad que otros mutantes conocidos, como el mutanteAfurA,objeto de la solicitud de patente española P 202330352.

En el contexto de la presente invención,MxcLse define como la proteína con la secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 1, siendo esta la siguiente:

MxcL también está definido por la molécula de ácido nucleico que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 1, y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),

c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína MxcL.

Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la secuencia nucleotídica aquí nombrada como la SEQ ID NO: 2 y que corresponde con el genmxcL:

El mutante deM. xanthusobtenido por la deleción del genmxcL,lo denominaremos en la presente memoria comoAmxcL.

Este mutanteAmxcLes capaz de producir más mixoquelinas que la cepa silvestre deM. xanthus,y además solo del tipo A. Por tanto, los sobrenadantes de los medios de cultivo en los que ha crecido este mutante se encuentran muy enriquecidos en mixoquelina A. Se propone así un método de producción de mixoquelinas A a partir del cultivo de esta cepa deM. xanthusmodificada genéticamente.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a la cepa mutante deM. xanthuso cepaAmxcL,obtenida mediante deleción del genmxcL,cuyo identificador genómico es MXAN_3640 y cuya secuencia es la nombrada como SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el mutante es obtenido a partir de la cepa silvestreM. xanthusDK1622.

Un segundo aspecto de la invención se refiere al procedimiento de obtención de la mutante deM. xanthusque comprende las siguientes etapas:

a) electroporar una cepa silvestre deM. xanthuscon un plásmido que contiene la región aguas arriba y abajo del genmxcL,y

b) delecionar el genmxcLdel genoma deM. xanthusmediante doble recombinación homóloga entre el plásmido y el genoma deM. xanthus.

Preferiblemente, el plásmido del paso a) se construye a partir del vector pBJ113 y los oligonucleótidos de secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 que anillan con la región aguas arriba del genmxcLy los oligonucleótidos de secuencia SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 que anillan con la región aguas abajo del genmxcL,digeridos con las enzimas de restricciónHindIIIy SamHI y SamHI y EcoRI respectivamente.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el plásmido del paso a) es clonado enEschenchia coli.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el procedimiento además comprende:

c) seleccionar la cepa mutante deM. xanthusque presenta deleción del genmxcL.

Un tercer aspecto de la invención se refiere al uso de la cepa mutante deM. xanthuspara la producción de mixoquelina tipo A.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere al procedimiento de obtención de mixoquelina A utilizando la cepa mutante deM. xanthusque comprende las siguientes etapas:

a) crecer la cepa mutante deM. xanthusen medio líquido, y

b) extraer la mixoquelina A del sobrenadante.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el crecimiento de la cepa mutante deM. xanthusse lleva a cabo a temperatura de 30°C.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Biosíntesis de las mixoquelinas enM. xanthus.A) Ruta biosintética de la producción de mixoquelinas. B) Operón de los genes que intervienen en la biosíntesis de las mixoquelinas.

Figura 2. Southern blot y posterior detección de sonda mediante fosfatasa alcalina de 8 candidatos de intermediariomxcL(1-8) y los controles de la cepa silvestre DK1622 deM. xanthus(WT). Señalados con fechas rojas se encuentran los fragmentos de 15316 pb correspondientes a los intermediarios positivos y de 8658 pb correspondiente a la cepa silvestre deM. xanthus.

Figura 3. Southern blot y posterior detección de sonda mediante fosfatasa alcalina de 8 candidatos de mutanteLmxcL(1-8) y los controles de la cepa silvestre DK1622 deM. xanthus(WT). Señalados con fechas rojas se encuentran los fragmentos de 7384 pb correspondientes a los mutantes positivosLmxcLy de 8658 pb correspondiente a la cepa silvestre deM. xanthus.

Figura 4. Ensayo en Cas-Blue de la cepa silvestre DK1622 deM. xanthusyLmxcL.El halo naranja representa la producción de sideróforos.

Figura 5. Ensayo en X-gal para la visualización de la expresión del genmxcG,implicado en la biosíntesis de mixoquelinas (se detecta por la aparición de color azul), en la cepa silvestre DK1622 yLmxcL.Ambas en presencia y ausencia de hierro adicionado.

Figura 6.Producción de mixoquelina, cantidad medida mediante densidad óptica a 450 nm de la ferrimixoquelina por número de bacterias, tanto en la cepa silvestre DK1622 (silvestre) como en el mutanteLmxcL.

Construcción del mutante

El mutanteLmxcLde la invención se generó mediante la deleción del genmxcLen la cepa silvestre deM. xanthusDK1622, por electroporación de un plásmido con la región aguas arriba y abajo del gen. Posteriormente, mediante una doble recombinación homóloga entre dichos fragmentos y el genoma, se generó un mutante con deleción en el genmxcL.A continuación, se describe el proceso detalladamente:

En primer lugar, se diseñaron 4 oligonucleótidos (Tabla 1) que anillaran en la región aguas arriba y aguas abajo del gen, conservando el codón de inicio y el de terminación.

Para posteriormente unir estos fragmentos entre sí e introducirlos en el vector pBJ113 (3) se le adicionó una secuencia de diana de restricción a dichos oligonucleótidos (secuencia subrayada en los 4 oligonucleótidos de laTabla 1).

Tabla 1.Secuencia de los oligonucleótidos empleados en la construcción del plásmido.

Ambas regiones se amplificaron mediante PCR utilizando el termocicladorMJ Mini Personal Thermal CycledeBioRad.Para realizar este proceso se emplearon 10-200 ng de ADN molde de la cepa DK1622 deM. xanthus,1 ^l de cada uno de los oligonucleótidos (100 ^M), 0,5 ^l de PolimerasaPrimeSTAR™ HS DNA Polymerase(5 unidades/^l), 4 ^l de Mezcla de dNTPs(deoxynucleotide triphosphates)(10 mM), 25 ^l de TampónGC PrimeSTAR(2X), 5 ^l de Dimetilsulfóxido y H2OMilliQhasta completar 50 ^l de volumen final.

Una vez realizada la mezcla, se sometió a 30 ciclos de amplificación en las siguientes condiciones (Tabla 2).

Tabla 2.Condiciones de la PCR para la amplificación de los fragmentos empleados en la construcción del plásmido.

*La temperatura de hibridación estaba condicionada en cada caso por la secuencia (cantidad de adeninas, timinas, citosinas y guaninas) de los oligonucleótidos. Para determinar la temperatura se empleó la siguiente fórmula:

[2x(A+T)+4x(C+G)]-4

Por lo que se utilizó 56°C para el fragmento de aguas arriba y 62°C para el fragmento de aguas abajo.

Una vez obtenidos los dos fragmentos de ADN amplificados, se procedió a su purificación con el kitHigh Pure PCR Product Purífication Kit(Roche). Para ello, se mezcló el ADN con 500 ^l de tampón de unión, para que, posteriormente, el ADN se una a la columna de afinidad del tubo de centrífuga de filtrado. Se sometió a centrifugación a 15.000 rpm durante 1 minuto para dejar unido solamente el ADN. Después, se realizaron dos lavados, uno con 500 ^l y otro con 200 ^l de tampón de lavado del kit. Finalmente, se adicionaron 60 ^l de tampón de elución para separar el ADN de la columna y así recuperarlo.

A continuación, se digirieron los productos de ambas PCRs con las enzimas de restricción correspondientes,HindlIIyBamHIel fragmento de aguas arriba y BamHI y EcoRI el fragmento de aguas abajo. También, se digirió el vector PBJ113 con las enzimasHindIIIy EcoRI, que es el vector plasmídico donde se insertarán dichos fragmentos más adelante. Para realizar esta serie de digestiones se mezclaron por 5 ^g de ADN, 10 ^l de TampónFastDigest(10X) de Thermo scientific, 3 ^l de Enzima de restricción FastDigest de Thermo scientific y H2OMilliQhasta completar 100 ^l de volumen final.

La mezcla se dejó incubando durante 45 minutos a 37°C. Posteriormente, se volvieron a purificar, tanto los fragmentos digeridos como el vector PBJ113, con el kitHigh Pure PCR Product Purification Kit(Roche). Posteriormente, se comprobaron mediante electroforesis con tampón TAE en un gel de agarosa al 0,7% dePronadisa. Acontinuación, se reveló incubándolo con una solución que conteníaGelReddeBiotium.

Después, se realizó la ligación entre el vector y los dos fragmentos con la enzimaT4-DNA ligase.Para ello, se utilizaron 20 ng de vector y 40 ng de cada inserto. Se realizó la mezcla junto con 2 ^l de tampón de ligación 10X y se completó con H2OMilliQhasta un volumen final de 19 ^l. Esta mezcla se incubó a 37°C durante 5 minutos y posteriormente en hielo 10 minutos. Finalmente, se añadió 1 ^l de ligasa a la mezcla y se dejó toda la noche incubando a 16°C para la correcta ligación del ADN.

Al día siguiente, se introdujo la mezcla de ligación en la cepa TOP10 deE. colimediante choque térmico.

Para ello, se utilizaron 30 ^l de células competentes de la cepa TOP10, junto con 10 ng de mezcla de ligación a transformar en un tubo de vidrio estéril y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Después, la mezcla se sometió a un choque térmico que consistió en pasarla rápidamente a un baño a 42°C durante 2 minutos. Seguidamente, se añadió a la mezcla 0,4 ml de medio líquido LB y se incubó a 200 rpm durante 1 hora a 37°C. Finalmente, se sembró 100 ^l del cultivo en una placa de medio LB con kanamicina 25 ^g/ml, para que solamente crezcan las bacterias que hayan incorporado el plásmido ya que el vector posee el gen de resistencia a kanamicina, y X-gal 40 ^g/ml para la selección blanco-azul de las colonias. Las placas se dejaron incubando a 37°C hasta el día siguiente.

Si picaron 16 colonias y se extrajeron los plásmidos mediante el kitHigh Pure Plasmid Isolation Kit.Para ello, las células deE. coliportadoras del plásmido se recogieron con asa de siembra y se transfirieron a un tubo eppendorf. Luego, se resuspendieron en 250 ^l del tampón de resuspensión con ARNasa para eliminar el ARN y, a continuación, con 250 ^l de tampón de lisis, que utiliza NaOH y SDS para lisar las células, durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después, se añadieron 350 ^l de tampón de unión, el cual permite al ADN unirse a la columna de afinidad que poseen los tubos de centrífuga de filtrado y, además, permite que en frío las proteínas y restos celulares formen un precipitado floculante. Por esto, se incubaron 5 minutos en hielo y se centrifugaron a 13.000 rpm durante 10 minutos a 4°C. El ADN plasmídico presente en el sobrenadante se transfirió a los tubos de centrífuga de filtrado, donde se realizaron dos lavados con 500 ^l de cada una de las dos soluciones de lavado que proporciona el kit. Finalmente, se añadieron 60 ^l de tampón de elución para que el ADN se separara de la columna de afinidad y así se recuperara en este tampón.

Los plásmidos extraídos se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,7% (en las mismas condiciones descritas anteriormente).

Además, se realizó una segunda comprobación del plásmido, en la que se utilizaron las mismas enzimas de digestión que fueron empleadas para la ligación, de tal forma que los fragmentos liberados correspondan con los insertos.

Una vez obtenido y verificado el plásmido, se introdujo en la cepa silvestre DK1622 deM. xanthusmediante electroporación.

Previamente se dializó 1 ^g del plásmido con agua destilada mediante una membrana de diálisis (0,025 ^m de tamaño de poro deMerck)durante 30 minutos. Por otro lado, se prepararon células electrocompetentes de la mixobacteria. Para ello, se partió de un cultivo en CTT líquido deM. xanthusDK1622 en fase exponencial. El medio CTT tenía los siguientes componentes y concentraciones: Bacto-casitona (10 g/l), MgSO47H2O (2 g/l), tampón Tris-HCl 1 M pH 7,6 (10 ml/l) y Tampón KH2PO4-K2HPO40,1 M pH 7,6 (10 ml/l).

Se centrifugó 1,5 ml de dicho cultivo a 10.000 rpm durante 2 minutos a temperatura ambiente. El precipitado celular se resuspendió en 1 ml aguaHPLCestéril y se volvió a centrifugar en las mismas condiciones. Tras dos ciclos más de lavado y centrifugado, las células precipitadas se resuspendieron en un volumen de 40 ^l de aguaHPLCy ya estuvieron listas para llevar a cabo la electroporación.

Para la electroporación, en primer lugar, se mezcló el plásmido dializado y las células electrocompetentes. La mezcla se transfirió a una cubeta de electroporación(Gene Pulser Cuvette0,1 cm deBioRad)con dos láminas metálicas de 1 mm de separación, donde se sometió a un choque eléctrico bajo las siguientes condiciones: Voltaje: 650 V; Capacitancia: 25 ^F; Resistencia: 200 Q.

Tras la electroporación, rápidamente se recuperaron las células electroporadas resuspendiéndolas en 1 ml de medio CTT y se transfirió a un matraz con 1,5 ml de medio CTT. Este matraz se incubó a 30°C a 300 rpm de agitación durante 6 horas para permitir la integración del plásmido en el cromosoma por recombinación homóloga y permitir a las células la expresión de los genes de resistencia a antibióticos presentes en él. Por último, el cultivo se sembró mediante sobrecapa de 5 ml de CTT semisólido (0,8% de agar) en dos placas de CTT sólido con kanamicina a 80 ^g/ml, una con 250 ^l de cultivo y la otra con los restantes 2,25 ml. Dichas placas se mantuvieron a 30°C durante una semana, cuando aparecieron las colonias.

Estas colonias se picaron y sembraron en placas de CTT sólido con kanamicina a 80 ^g/ml para asegurar que solo crecen las células que hayan incorporado el plásmido en el genoma mediante recombinación homóloga por alguno de los dos insertos del plásmido, puesto queM. xanthusno puede albergar plásmidos ya que no tiene la maquinaria proteica necesaria para su replicación. A estas cepas que con el plásmido insertado se les denomina intermediarios.

Estos intermediarios se comprobaron mediante PCR. Primero, se extrajo el ADN genómico mediante el kitWizard® Genomic DNA Purífication Kit.Para ello, se partió de 1 ml de cultivo de aproximadamente 1 de densidad óptica a 600 nm y se centrifugó durante 3 minutos a 15.000 rpm. Las células se resuspendieron en 500 ^l de solución de lisis y se dejaron incubando 5 minutos a 80°C para lisar las células. A continuación, se adicionaron 3 ^l de la solución de ARNasa y se incubó la mezcla durante 30 minutos a 37°C para degradar el ARN. Posteriormente, se añadieron 200 ^l de solución de precipitación de proteínas y las muestras se incubaron 5 minutos en hielo. Se centrifugaron las muestras 3 minutos a 15.000 rpm y el sobrenadante, que contiene el ADN, se precipitó con 2-propanol y se sometió a un lavado con etanol al 70%. Finalmente, se rehidrató el ADN con 50 ^l de la solución de rehidratación de ADN y se dejó toda la noche a 4°C. Al día siguiente, se resuspendió en la propia solución y se conservó a -20°C hasta su uso.

Una vez extraído el ADN cromosómico de los candidatos intermediarios, éstos se comprobaron mediante hibridación con sonda y detección con fosfatasa alcalina. Para ello se transfirió el ADN de los candidatos (previamente digerido con la enzima de digestiónSalI)de un gel de agarosa a una membrana de nylon mediante la técnica de Southern blot. A continuación, se realizó la hibridación con sonda marcada con digoxigenina (fragmento aguas arribaHindIII-BamHI)y una posterior detección de las bandas hibridadas mediante la unión con anticuerpos específicos y una posterior reacción colorimétrica con fosfatasa alcalina. Dando como resultado una banda esperada de 8658 pb para los intermediarios y 15316 pb para las silvestres. Por lo que, de los 8 candidatos analizados, todos fueron positivos. En laFigura 2, se muestra que son positivos los 8 candidatos, es decir, que son intermediarios, ya que muestran una banda correspondiente a 15316 pb. Mientras que, a modo de control, la cepa silvestre muestra una banda de 8658 pb.

Posteriormente, para que tenga lugar una segunda recombinación homóloga y así se elimine el plásmido y el gen de interés, estos intermediarios se cultivaron en medio líquido sin kanamicina durante 24 horas para evitar la presión selectiva y que las cepas que sufran una segunda recombinación homóloga puedan sobrevivir. Seguidamente, se realizaron diluciones seriadas y se sembraron mediante sobrecapa semisólida en placas de CTT con galactosa 1%, para así dificultar el crecimiento de las células que posean el plásmido, puesto que conservan el gen de la galactoquinasa presente en el vector PBJ113. La recombinación homóloga puede tener lugar en cualquiera de los dos fragmentos. Por lo tanto, si la recombinación se da en el mismo lugar en el que se insertó al cromosoma, la cepa revertirá a silvestre. Pero, si esta tiene lugar en un sitio distinto al de la primera recombinación, se obtiene el mutante de deleción en fase. Para distinguir qué cepas eran silvestres o cuáles mutantes, se comprobaron mediante PCR. Previamente, nos aseguramos de que las colonias candidatas solamente crecían en medio con galactosa y no en medio con kanamicina, para descartar así la posible contaminación con cepas intermediarias.

Se extrajo el ADN cromosómico, siguiendo el método mencionado anteriormente, y se comprobaron los candidatos mutantes de la misma forma que los intermediarios. Digiriendo su ADN conSalI,realizando una transferencia mediante Southern blot de ADN para la posterior hibridación con sonda y detección colorimétrica mediante fosfatasa alcanila. De tal forma que las cepas que hubieran retornado a silvestres darían una banda de 8658 pb, mientras que los mutantes darían una banda de 7384 pb. En laFigura 3, se muestra que los 8 candidatos, los cuales son todos positivos, es decir, que son mutantesLmxcL,ya que muestran una banda correspondiente a 7384 pb. Mientras que, a modo de control, la cepa silvestre muestra una banda de 8658 pb.

Análisis de la producción de mixoquelinas

Para detectar la producción de sideróforos de este mutante se realizó un ensayo en medio CAS-Blue, el cual tiene una tonalidad azul y se torna a naranja en presencia de sideróforos. En laFigura 4, podemos observar como el mutanteLmxcLproduce un halo naranja de mayor tamaño, 17,2 mm, que la cepa silvestre DK1622, 10,1 mm.

Por otra parte, también se estudió la producción de sideróforos del mutanteLmxcLpara lo cual se construyó una fusión entre el genmxcG(relacionado con la biosíntesis de las mixoquelinas) y el gen reporterolacZdeE. coli,sobre el mutanteLmxcL.Así se pudo observar mediante ensayo en placa de CTT con X-gal y con/sin hierro adicionado, el color azul producido como consecuencia indirecta de la expresión del genmxcG.

En laFigura 5, se muestra que tras la inducción del genmxcG(que interviene en la biosíntesis de mixoquelinas) la colonia de esta construcciónAmxcL-mxcGlacZ(que parte del mutanteLmxci)produce un color azul intenso en ausencia de hierro, mientras que la fusión entre el genmxcGylacZen la cepa silvestre DK1622 presenta una coloración más suave que el mutante en medio sin hierro adicionado. Por tanto, si comparamos la producción de mixoquelinas en la cepa silvestre y en el mutanteAmxcL,observando la intensidad del color azul en la imagen, concluimos que es mayor enAmxcLque en la cepa silvestre, lo que indica que la sobreexpresión de la producción de mixoquelina A en el mutanteAmxcLes mayor que en la cepa silvestre.

En presencia de hierro no se producen sideróforos en ninguno por parte de ninguna de las dos colonias.

Además, ha sido analizada la producción de mixoquelinas del silvestre DK1622 y del mutanteAmxcLmediante espectrofotometría. Para ello, se inocularon las cepas en matraces de 40 ml de CTT líquido ajustando los cultivos a 0.015 de densidad óptica a 600n m a tiempo 0 horas. Se dejaron incubando los matraces a 30°C en agitación de 300 rpm durante 24 horas. Después, se midió la densidad óptica de los cultivos a 600 nm: 0,35 para la cepa silvestre DK1622 y 0,34 para el mutanteAmxcL.Se retiraron las células de los cultivos haciéndolos pasar estos por un filtro, dejando así solamente el sobrenadante que contiene las mixoquelinas. Los sobrenadantes de ambos cultivos se midieron a densidad óptica de 450 nm y se ajustó la densidad óptica de las mixoquelinas a 450 nm por 1010 bacterias, dando como resultado 9,18 para la cepa silvestre DK1622 y 13,51 para el mutanteAmxcL(Figura 4), lo que supone una sobreproducción de mixoquelinas en torno a un 47%.

Los niveles de producción del nuevo mutanteAmxcLaumentan respecto a la cepa silvestre (DK1622) tal y como se puede comprobar en todos los ensayos realizados. Es común en bacterias que al delecionar un gen de función similar a otro, éste se sobreexprese y se produzca más compuesto en lugar de reducirse los niveles. Sin embargo, cabría esperar que este comportamiento fuera de compensación, es decir, que la producción total de sideróforos del mutante con el genmxcLdelecionado tuviera un nivel de producción de mixoquelina A que fuera similar a la suma de mixoquelina A y B producida por la cepa silvestre DK1622.

Sin embargo, si comparamos la producción de mixoquelina total de la cepa silvestre (que incluye el tipo A y B) y del mutanteAmxcL(que solo produce mixoquelina A), podemos concluir que la sobreexpresión de la producción de mixoquelina A en el mutanteAmxcLno responde a una mera compensación de la inhibición de la producción del tipo B como cabría esperar, sino que aumenta la producción total de mixoquelina expresada (Figuras 4,5 y 6).

El producir un solo tipo de sideróforo facilita la purificación de dicha molécula.

Como ya se ha señalado antes, este nuevo mutanteAmxcLcrece a mayor velocidad que otros mutantes conocidos, como el desarrollado previamente por este grupo, el mutanteAfurA,objeto de la solicitud de patente española P 202330352. El tiempo de generación del mutanteAmxcLen medio CTT sin hierro adicionado es 4,26 horas. Sin embargo, el crecimiento deAfurAen medio CTT incluso con hierro adicionado es de 6,46. Por lo tanto,AmxcLcrece más rápido queAfurA,lo que conlleva una mayor producción de mixoquelina puesto que hay más células para producirla.

En conclusión, este mutante produce mixoquelina A en medios sin hierro, a niveles muy superiores con respecto a la producción total de mixoquelina de la cepa silvestre DK1622. Mantiene el mismo ritmo de crecimiento que la bacteria silvestre a diferencia de otros mutantes cuyo crecimiento se veía afectado negativamente y cuyo tiempo de generación era mayor. Este mutante permite obtener grandes cantidades de mixoquelinas tipo A simplificando el proceso de purificación posterior.

Con esta nueva cepa bacteriana se consigue aumentar la producción de mixoquelina A en los sobrenadantes en los que crece, lo aumentaría su producción, y por consiguiente, su disponibilidad en el mercado. Esto favorecería su uso en las múltiples áreas mencionadas anteriormente, por lo que tendría incidencia directa sobre la vida cotidiana.

Referencias

1. Jayasinghe, S., Siriwardhana, A., y Karunaratne, V. (2015). Natural iron sequestering agents: their roles in nature and therapeutic potential. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 7, 8-12. https://innovareacademics.in/journals/index.php/ijpps/article/view/6444.

2. Kunze, B., Bedorf, N., Kohl, W., Hofle, G., y Reichenbach, H. (1989) Myxochelin A, a new iron-chelating compound from Angiococcus disciformis (Myxobacterales). Production, isolation, physico-chemical and biological properties. J. Antibiot (Tokyo). 42, 14-7. doi: 10.7164/antibiotics.42.14. PMID: 2493439.

3. Julien, B., Kaiser, A. D., y Garza, A. (2000). Spatial control of cell differentiation inMyxococcus xanthus.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 9098-9103.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Cepa mutante deMyxococcus xanthusobtenida mediante deleción del genmxcLde secuencia SEQ ID NO: 2.

2. La cepa según la reivindicación anterior caracterizada por que el mutante es obtenido a partir de la cepa silvestreM. xanthusDK1622.

3. Procedimiento de obtención de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1- 2 que comprende las siguientes etapas:

a) electroporar una cepa silvestre deM. xanthuscon un plásmido que contiene la región aguas arriba y abajo del genmxcL,y

b) delecionar el genmxcLdel genoma deM. xanthusmediante doble recombinación homóloga entre el plásmido y el genoma deM. xanthus.

4. El procedimiento de obtención según la reivindicación anterior caracterizado por que el plásmido del paso a) se construye a partir del vector pBJ113 y los oligonucleótidos de secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 que anillan con la región aguas arriba del genmxcLy los oligonucleótidos de secuencia SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 que anillan con la región aguas abajo del genmxcL,digeridos con las enzimas de restricción SamHI yHindIII,y SamHI y EcoRI, respectivamente.

5. Procedimiento de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 3 - 4 caracterizado por que el plásmido del paso a) es clonado enE. coli.

6. Procedimiento de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 3 - 5 caracterizado por que además comprende:

c) seleccionar la cepa mutante deM. xanthusque presenta deleción del genmxcL.

7 Uso de la cepa mutante deM. xanthussegún cualquiera de las reivindicaciones 1 - 2 para la producción de mixoquelina A.

8. Procedimiento de obtención de mixoquelina A utilizando la cepa mutante deM. xanthussegún cualquiera de las reivindicaciones 1- 2 caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) crecer la cepa mutante deM. xanthusen medio líquido, y

b) extraer la mixoquelina A del sobrenadante.

9. Procedimiento de obtención de mixoquelina A según la reivindicación anterior caracterizado por que el crecimiento de la cepa mutante deM. xanthusse lleva a cabo a temperatura de 30°C.