ES2989596T3

ES2989596T3 - Receptores que proporcionan coestimulación dirigida para terapia celular adoptiva

Info

Publication number: ES2989596T3
Application number: ES20701871T
Authority: ES
Inventors: John Bridgeman; Robert Hawkins
Original assignee: Instil Bio UK Ltd
Current assignee: Instil Bio UK Ltd
Priority date: 2019-01-22
Filing date: 2020-01-20
Publication date: 2024-11-27
Anticipated expiration: 2040-01-20
Also published as: MX2021008657A; BR112021014360A2; AU2020211375A1; EP3914611C0; SG11202106787SA; EP3914611B1; US20220160760A1; IL284422A; PE20211662A1; SMT202400467T1; PH12021551754A1; EA202192024A1; CN113423726A; WO2020152451A1; RS66152B1; EP4470547A2; GB201900858D0; EP3914611A1; CO2021009302A2; CA3126431A1

Abstract

La presente invención se refiere a una célula que comprende un receptor de antígeno coestimulador quimérico (CoStAR) útil en la terapia celular adoptiva (ACT). El CoStAR puede actuar como un modulador de la actividad celular mejorando las respuestas a antígenos definidos. La presente invención también proporciona proteínas CoStAR, ácidos nucleicos que codifican el CoStAR y usos terapéuticos de los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores que proporcionan coestimulación dirigida para terapia celular adoptiva

Declaración de secuencias

La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias, que se ha presentado electrónicamente y se incorpora en su totalidad por referencia en la presente memoria.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una célula que comprende un receptor de antígeno coestimulador quimérico (CoStAR) útil en terapia celular adoptiva (ACT). El CoStAR puede actuar como un modulador de la actividad celular que potencia las respuestas a antígenos definidos. La presente invención también proporciona proteínas CoStAR, ácidos nucleicos que codifican el CoStAR y usos terapéuticos de los mismos.

Antecedentes de la invención

La terapia celular adoptiva (ACT) que usa células T autólogas para mediar la regresión del cáncer ha mostrado ser muy prometedora en los ensayos clínicos tempranos. Se han tomado varios enfoques generales tales como el uso de linfocitos que se producen de manera natural reactivos a tumores o que se infiltran en tumores (TIL) expandidos ex vivo. Adicionalmente, las células T pueden modificarse genéticamente para redirigirlas hacia antígenos tumorales definidos. Esto puede hacerse mediante la transferencia génica de receptores de células T (TCR) específicos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) peptídico (p) o fusiones sintéticas entre fragmento de anticuerpo monocatenario específico de tumor (scFv) y dominios de señalización de células T (por ejemplo, CD3Z), siendo denominados estos últimos receptores de antígeno quiméricos (CAR).

La transferencia de TIL y TCR ha demostrado ser particularmente buena cuando se dirige a melanoma (Rosenberg et al. 2011; Morgan 2006), mientras que la terapia con CAR ha mostrado ser muy prometedora en el tratamiento de ciertas malignidades de células B (Grupp et al. 2013).

El éxito de la terapia con CAR en leucemia se ha atribuido parcialmente a la incorporación de dominios coestimuladores (por ejemplo, CD28 o CD137) en la construcción de CAR, señales a partir de las cuales se produce una sinergia con la señal proporcionada por CD3Z para potenciar la actividad antitumoral. La base de esta observación se refiere al paradigma clásico de señal1/señal 2 de la activación de células T. Aquí, la señal 1, proporcionada por el complejo TCR, produce una sinergia con la señal 2 proporcionada por receptores coestimuladores tales como CD28, CD137 o CD134 para permitir que las células experimenten expansión clonal, producción de IL2 y supervivencia a largo plazo sin la muerte celular inducida por activación (AICD) asociada con la señal 1 sola. Además, la implicación de la señal 2 potencia la señal generada a través de la señal 1 permitiendo que las células respondan mejor a interacciones de baja avidez tales como las encontradas durante respuestas antitumorales.

La coestimulación dirigida tendrá efectos beneficiosos para terapias de células T no basadas en CAR. Por ejemplo, se ha mostrado que incorporar dominios coestimuladores en un TCR quimérico potencia las respuestas de las células T hacia pMHC (Govers 2014). Aunque los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) utilizan sus TCR endógenos para mediar el reconocimiento tumoral, no ha sido posible diseñar por ingeniería el TCR endógeno. Por tanto, los TIL están sujetos a limitaciones sustanciales ya que las células tumorales expresan muy pocos ligandos coestimuladores. La capacidad para inducir la coestimulación dirigida de TIL, o de hecho cualquier otro producto de terapia adoptiva de células T, sería beneficiosa.

Sumario de la invención

Los CoStAR y las células que comprenden o expresan los CoStAR como se describe en la presente memoria son beneficiosos para terapias de células T no basadas en CAR y basadas en CAR, por igual. La presente invención usa células según la reivindicación 10 que expresan un receptor coestimulador quimérico novedoso según la reivindicación 1 para proporcionar una señal coestimuladora a las células T tras el acoplamiento con un antígeno asociado a enfermedad definido, por ejemplo, asociado a tumor. Ha habido varios informes en donde la señal 1 y la señal 2 divididas se han usado para dirigir respuestas específicas de antígeno en células T diseñadas por ingeniería (Alvarez-Vallina y Hawkins 1996). Sin embargo, ninguno ha utilizado la molécula de CD28 de longitud completa. Existen ventajas específicas para usar receptores de longitud completa, tales como CD28, en contraposición a formas truncadas. El CD28 de longitud completa es dimérico permitiendo que el receptor funcione en su forma nativa, de hecho, los receptores de antígeno quiméricos no funcionan óptimamente cuando se expresan como un monómero (Bridgeman et al. 2010). La invención también proporciona un receptor coestimulador dirigido según la reivindicación 1 que induce la señal 2 tras el acoplamiento con un antígeno asociado a cáncer o asociado a tumor. La molécula de CD28 de longitud completa contiene motivos críticos para su función nativa en la unión de miembros de la familia B7 de receptores; aunque esto es potencialmente peligroso desde la perspectiva de los CAR que portan receptores CD28 y CD3Z en tándem, en donde la ligación de CAR por B7 podría desencadenar la activación de células T, existen cualidades beneficiosas para receptores que albergan receptores solo de la señal 2.

Los presentes inventores han mostrado que los linfocitos T (linfocitos T) pueden diseñarse por ingeniería para expresar un CoStAR (receptor de antígeno coestimulador) para aumentar la activación de las células T tras el acoplamiento con un antígeno asociado a tumor definido. Los inventores muestran que la activación de las células T, medida por la secreción de IFNy e IL-2, por un mitógeno de señal 1 (OKT3) se potencia cuando también se permite que las células diseñadas por ingeniería reciban la señal 2 a través del CoStAR tras el acoplamiento con el antígeno asociado a tumor CEA. Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un receptor de antígeno coestimulador (CoStAR) recombinante según las reivindicaciones adjuntas.

La invención también proporciona una célula según las reivindicaciones adjuntas.

El CoStAR se diseña de manera que la unión del CoStAR a su antígeno tumoral designado da como resultado la activación del receptor y proporciona una señal coestimuladora para aumentar las señales mediadas por la señal concurrente 1 proporcionadas a través de un TCR recombinante, receptor de antígeno quimérico (CAR) o TCR endógeno. El antígeno tumoral puede ser un antígeno asociado a tumor tal como los de la familia de moléculas de antígenos onco-fetales o de cáncer de testículos tales como CEA o 5T4, y dirigido usando un fragmento de anticuerpo monocatenario. Alternativamente, el antígeno tumoral puede ser uno presentado como un péptido a través del MHC y dirigido usando un fragmento de anticuerpo monocatenario específico de pMHC o TCR monocatenario.

En ciertas disposiciones descritas en la presente memoria, el dominio de señalización comprende un receptor coestimulador de longitud completa (secuencia de proteína completa sin el péptido señal), incluyendo, pero sin limitarse a, CD2, CD9, CD26, CD27, CD28, CD29, CD38, CD40, CD43, CD46, CD49d, CD55, CD73, CD81, CD82, CD99, CD100, CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD150 (SLAM), CD270 (HVEM), CD278 (ICOS), CD357 (GITR) o EphB6. En la presente invención, el CoStAR comprende un primer segmento intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28, y un segundo segmento intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD40.

El dominio coestimulador puede consistir en un dominio de receptor solo, o múltiple en tándem (es decir, un receptor de fusión) por lo que cada dominio está unido directamente o a través de un enlazador flexible de hasta 50 aminoácidos de longitud. En ciertas realizaciones, el dominio de señalización comprende un fragmento de un receptor coestimulador de longitud completa en donde el fragmento es eficaz para la dimerización. Puede haber un enlazador que enlaza el fragmento de anticuerpo monocatenario al dominio de señalización. Este enlazador, si está presente, puede tener 1 50 aminoácidos de longitud. El linfocito puede ser una célula T, incluyendo un linfocito infiltrante de tumor (TIL), una célula T reguladora (Treg) o una célula T primaria, o una célula NK. Además del CoStAR, el linfocito T o la célula NK, puede incluir un receptor de células T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico (CAR) recombinante.

Un individuo con suficiente experiencia sabría que identificar el punto exacto en donde el péptido señal se escinde de la proteína madura es difícil de determinar con precisión, y aunque se puede aplicar un software de predicción, el corte y empalme artificial de secuencias en 5’ de la proteína madura puede crear sitios nuevos para peptidasas de péptidos señal, por lo tanto, el término "longitud completa" en este documento implica la proteína madura completa con hasta 5 deleciones o mutaciones de aminoácidos en el extremo N-terminal de la proteína madura, un proceso crítico para el corte y empalme óptimo del dominio coestimulador en un receptor quimérico. Esto es una distinción clara de las secuencias previas publicadas tales como las usadas en Lanitis et al (2013) donde solo se usó el dominio intracelular de CD28, con un dominio transmembrana de CD8 usado, y en Krause et al. (1998) donde se usó un receptor CD28 truncado, truncado al motivo IEV.

También se describe en la presente memoria una secuencia de ácido nucleico que codifica el CoStAR como se ha descrito anteriormente y en la presente memoria.

También se describe en la presente memoria un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según la secuencia de ácido nucleico que codifica el CoStAR y, si está presente, una secuencia de ácido nucleico de TCR y/o CAR.

También se describe en la presente memoria un método para preparar un linfocito, o una célula T o NK, según la divulgación en la presente memoria, que comprende la etapa de introducir un ácido nucleico que codifica el vector o CoStAR, en el linfocito.

También se describe en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende un vector según lo divulgado en la presente memoria, o linfocito (incluyendo una célula T o NK) según lo divulgado en la presente memoria, junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, así como los usos terapéuticos de los mismos.

También se describe en la presente memoria una célula, por ejemplo, un linfocito, que incluye una célula T o NK, según lo divulgado en la presente memoria, o un vector según lo divulgado en la presente memoria, que incluye para su uso en terapia celular adoptiva.

También se describe en la presente memoria un linfocito, que incluye una célula T o NK, según lo divulgado en la presente memoria, o vector según lo divulgado en la presente memoria, que incluye para su uso en un método para tratar el cáncer.

También se describe en la presente memoria el uso de un linfocito según lo divulgado en la presente memoria, o el uso del vector según lo divulgado en la presente memoria en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer.

También se describe en la presente memoria un linfocito según lo divulgado en la presente memoria, un vector según lo divulgado en la presente memoria o una composición farmacéutica como se divulga en la presente memoria para su uso en el tratamiento del cáncer.

En algunas disposiciones descritas en la presente memoria, el receptor CoStAR comprende un receptor CD28 de longitud completa como se define en la presente memoria. En algunas disposiciones (pero no todas reivindicadas), el CoStAR comprende un dominio de unión a antígeno asociado a tumor fusionado a: un dominio de señalización de fusión que comprende o consiste en CD28 humano de longitud completa, tal como el mostrado en la SEQ ID NO: 2 o una variante del mismo que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia a nivel de proteína; y otro resto seleccionado de: el dominio intracelular de CD137 humano, tal como el mostrado en la SEQ ID NO: 4 o una variante del mismo que tiene al menos un 80 % o 90 % de identidad de secuencia a nivel de proteína; el dominio intracelular de CD134 humano, tal como el mostrado en la SEQ ID NO: 5 o una variante del mismo que tiene al menos un 80 % o 90 % de identidad de secuencia a nivel de proteína; el dominio intracelular de CD2 humano, tal como el mostrado en la SEQ ID NO: 6 o una variante del mismo que tiene al menos un 80 % o 90 % de identidad de secuencia a nivel de proteína; el dominio intracelular de CD29 humano, tal como el mostrado en la SEQ ID NO: 7 o una variante del mismo que tiene al menos un 80 % o 90 % de identidad de secuencia a nivel de proteína; el dominio intracelular de GITR humano, tal como el mostrado en la SEQ ID NO: 8 o una variante del mismo que tiene al menos un 80 % o 90 % de identidad de secuencia a nivel de proteína; el dominio intracelular de IL2Ry humano, tal como el mostrado en la SEQ ID NO: 9 o una variante del mismo que tiene al menos un 80 % o 90 % de identidad de secuencia a nivel de proteína, el dominio intracelular de CD40 humano, tal como el mostrado en la SEQ ID NO: 10 o una variante del mismo que tiene al menos un 80 % o 90 % de identidad de secuencia a nivel de proteína; el dominio intracelular de CD150 humano, tal como el mostrado en la SEQ ID NO: 11 o una variante del mismo que tiene al menos un 80 % o un 90 % de identidad de secuencia a nivel de proteína o el dominio intracelular de CD2 humano y CD40 humano, tal como el mostrado en la SEQ ID NO: 12 o una variante del mismo que tiene al menos un 80 % o un 90 % de identidad de secuencia a nivel de proteína. En una realización de la presente invención, un CoStAR comprende: (i) un dominio de señalización que comprende o consiste en un CD28 humano de longitud completa de SEQ ID NO: 2 o una variante del mismo que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia a nivel de proteína en donde dicho CD28 humano de longitud completa no comprende el péptido señal y opcionalmente carece de hasta 5 aminoácidos en el extremo N-terminal de la proteína del receptor maduro una vez que su péptido señal se ha escindido; y (ii) el dominio intracelular de CD40 humano como se muestra en la SEQ ID NO: 10 o una variante del mismo que tiene al menos un 80 % o un 90 % de identidad de secuencia a nivel de proteína, en donde el dominio intracelular de CD40 humano o una variante del mismo tiene actividad funcional como dominio de señalización intracelular de CD40. En algunas disposiciones, la variante de uno de los restos como se han descrito anteriormente carece de 1, 2, 3, 4 ó 5 o hasta 10 restos de aminoácidos N-terminales con referencia a una secuencia de fusión enumerada anteriormente.

Breve descripción de los dibujos

La siguiente descripción detallada, dada a modo de ejemplo, pero no destinada a limitar la invención únicamente a las realizaciones específicas descritas, puede entenderse mejor junto con los dibujos adjuntos.

Figura 1 - Organización estructural de receptores de dominio coestimulador único y coestimulador de fusión. Se muestra una representación esquemática de los receptores CoStAR expuestos en las reivindicaciones. En primer lugar, un CoStAR basado en un único receptor coestimulador, y en segundo lugar un CoStAR de fusión que consiste en un dominio de señalización de receptor coestimulador de longitud completa fusionado a un segundo dominio coestimulador.

Figura 2 - Organización genómica de configuraciones potenciales de CoStAR - El CoStAR consiste en un dominio de unión a antígeno, un dominio espaciador opcional y un dominio coestimulador como se muestra en la figura y se describe en las reivindicaciones. El CoStAR puede expresarse: A) solo a partir de un promotor con el CoStAR que consiste en un receptor coestimulador único (Ai) o de fusión (Aii); B) puede expresarse con una etiqueta epitópica (por ejemplo, etiqueta His, DYKDDDDDK (SEQ ID NO: 14), etc.) en el extremo N o C para permitir la tinción directa del CoStAR; C) junto con un gen marcador separado usando una secuencia de escisión 2A o un sitio de entrada ribosómico interno (IRES); D) junto con un gen marcador que se expresa a partir de un segundo promotor; E) junto con una proteína de interés tal como un receptor de antígeno quimérico o un receptor de células T separado usando una secuencia de escisión 2A o un sitio de entrada ribosómico interno (IRES); F) junto con una proteína de interés tal como un receptor de antígeno quimérico o receptor de células T que se expresa a partir de un segundo promotor. Sería evidente para un individuo con suficiente conocimiento que el CoStAR y el gen marcador/receptor de antígeno quimérico/receptor de células T/otra proteína de interés podría expresarse en cualquier orientación o 3' (3 prima) o 5' (5 prima) entre sí.

Figura 3 - Actividad funcional de CoStAR en células T en respuesta a antígeno presentado por tumor LS174T y LoVo. Las poblaciones de células T de donantes normales del donante 1 (A y D), donante 2 (B) y donante 3 (C y E) se diseñaron por ingeniería lentiviral para expresar un CoStAR que se dirige al antígeno carcinoembrionario y se clasificaron magnéticamente para enriquecer el transgén usando selección magnética de CD34. Las células T se mezclaron con células tumorales CEA+ no diseñadas por ingeniería de tipo silvestre (tumor no activador) o células tumorales CEA+ diseñadas por ingeniería para expresar un fragmento de anticuerpo monocatenario anti-CD3 anclado en la superficie celular (tumor activador) en las relaciones de efector a diana indicadas e IL-2 medida en el sobrenadante por ELISA. Datos obtenidos usando células LS174T (A, B y C) y LoVo (D y E).

Figura 4 - Efecto de CoStAR sobre la proliferación de células T. Se mezclaron 5x105 células T transducidas y no transducidas con 6,25x103 células LoVo de tipo silvestre o LoVo-OKT3 en presencia (A) o ausencia (B) de IL-2 y se realizaron los recuentos celulares después de tres días. En otro ensayo en las mismas proporciones celulares, las células T de dos donantes se cargaron con colorante de proliferación y el número de ciclos de proliferación a través de los que pasaron las células se determinaron mediante dilución del colorante después de seis días usando citometría de flujo.

Figura 5 - Actividad de IL-2 de receptores de fusión CoStAR en células T humanas primarias. Se transdujeron lentiviralmente células T CD8+ de donantes normales de siete donantes (excepto CoStAR de control en tres donantes) con los CoStAR dirigidos a CEA indicados y se evaluó la producción de IL-2 después de una estimulación durante una noche en presencia de células LoVo-OKT3. La proporción de células positivas para IL-2 se determinó usando tinción de flujo intracelular en poblaciones tanto negativas para CD34 (CoStAR no transducido) como CD34+ (CoStAR transducido). Los asteriscos muestran diferencias significativas entre las poblaciones transducidas y no transducidas usando prueba de rangos con signo de Wilcoxon emparejado con *p<0,05

Figura 6A-6D - Análisis multiparámetro de la actividad de CoStAR en células T humanas primarias. Se transdujeron lentiviralmente células T CD8+ de donantes normales con los CoStAR dirigidos a CEA indicados y la producción de IL-2 se evaluó después de una estimulación durante una noche en presencia de células LoVo-OKT3. La proporción de células positivas para IL-2 (siete donantes) (Fig. 6A), IFN<y>(siete donantes) (Fig. 6B), bcl-xL (cinco donantes) (Fig. 6C) y CD107a (seis donantes) (Fig. 6D) se determinó usando tinción de flujo intracelular en poblaciones tanto negativas para CD34 (CoStAR no transducido) como CD34+ (CoStAR transducido). El control es un CoStAR no específico que se dirige a CA125 y es de tres donantes en todos los casos. Los mapas de calor son promedios de todos los donantes con la intensidad de color relacionada con el porcentaje de células positivas para una lectura particular en las condiciones definidas.

Figura 7 - CD40 potencia la producción de IL-2 a partir de CoStAR basados en CD28. Las células T humanas primarias de tres donantes sanos se dejaron sin transducir o se transdujeron con CD28 truncado en el dominio extracelular (Tr CD28), CD28 de longitud completa (FL CD28) o CoStAR basados en CD28.CD40 que albergaban un scFv específico de CEA (MFE23). Las células transducidas se seleccionaron usando un gen marcador CD34 y se expandieron antes del análisis. Las células T se mezclaron en una proporción de efector a diana 8:1 con células LoVo CEA+ que expresaban OKT3 durante 20 horas antes del análisis de la producción de IL-2 por ELISA.

Figura 8 - Efecto del dominio de señalización y el antígeno diana sobre la expansión de células T mediada por CoStAR. Las células T se transdujeron con CoStAR basados en CD28 o CD28.CD40 marcados con epítopo de DYKDDDDK (SEQ ID NO: 14) que albergaban scFv específicos de CA125, FolR o CEA, o péptido de unión específico de FolR (C7). Las células T se mezclaron con la línea celular OVCAR3 que expresaba OKT3, CA125+/FolR+/CEA-. El número de células transducidas se contó cada 7 días hasta 21 días, con células OVCAR3 frescas añadidas después de cada recuento.

Figura 9 - (A a I) Efecto del dominio de señalización y el antígeno diana sobre la expansión de células T mediada por CoStAR. Las células T se transdujeron con CoStAR basados en CD28 o CD28.CD40 marcados con epítopo de DYKDDDDK (SEQ ID NO: 14) que albergaban scFv específicos de CD125, FolR o CEA, o péptido de unión específico de FolR (C7). Las células T se mezclaron con la línea celular OVCAR3 que expresaba OKT3, CA125+/FolR+/CEA-. El número de células transducidas se contó cada 7 días hasta 21 días, con células OVCAR3 frescas añadidas después de cada recuento.

Figura 10 - (A y B) Los CoStAR basados en CD40 potencian la coestimulación de células T en un modelo de transferencia de TCR. Se transdujeron células T humanas primarias de tres donantes sanos con un TCR específico de CEA más un CoStAR basado en CD28 o CD28.CD40 marcado con DYKDDDK que albergaba un scFv específico de MFE (círculos abiertos o cerrados) o CA125 (cuadrados abiertos). Las células T se mezclaron en una proporción efector:diana 1:1 con células H508 CEA+/CA125- y se realizó tinción de citocinas intracelulares para determinar el número de células T CD4+ o CD8+ que responden en las poblaciones TCR+/CoStAR+, TCR+/CoStAR-, TCR-/CoStAR+ y TCR-/CoStAR-. Se realizó un ANOVA de 2 vías (prueba de Tukeys) para determinar diferencias significativas en la actividad: *p>0,05, **p>0,01, ***p>0,001, ****p>0,0001.

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

Receptor de antígeno coestimulador (CoStAR)

En la presente memoria se proporcionan receptores de antígeno coestimuladores recombinantes (CoStAR) que comprenden: (i) un dominio de unión a antígeno asociado a enfermedad (en las reivindicaciones, cáncer) o tumor; y (ii) un segmento de unión a ligando extracelular de una proteína receptora estimuladora, y (iii) un primer segmento intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de una proteína receptora, y (iv) opcionalmente (pero en la invención reivindicada, no opcional) un segundo segmento intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de una segunda proteína receptora. En la presente invención, el CoStAR es como se define en la reivindicación 1. En ciertas disposiciones (y como se reivindica), el segmento extracelular y el primer segmento intracelular comprenden segmentos de la misma proteína receptora. En ciertas disposiciones (no reivindicadas), el segmento extracelular y el primer segmento intracelular comprenden segmentos de diferentes proteínas receptoras. En ciertas disposiciones, existe un dominio transmembrana interviniente entre un segmento extracelular y el primer segmento intracelular. Las disposiciones que comprenden un segundo segmento intracelular opcional y/o un tercer segmento intracelular opcional pueden comprender además espaciadores entre los segmentos intracelulares. En una forma sencilla, un CoStAR como se describe en la presente memoria comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) fusionado con CD28 de longitud completa que transmite una señal coestimuladora dependiente del acoplamiento del scFv a su antígeno cognado y/o el acoplamiento del CD28 a su ligando cognado. Como se usa en la presente memoria, "proteína de longitud completa" o "receptor de longitud completa" se refiere a una proteína receptora, tal como, por ejemplo, una proteína receptora CD28. El término "longitud completa" abarca proteínas receptoras que carecen de hasta aproximadamente 5 aminoácidos o hasta 10 aminoácidos, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos, en el extremo N-terminal de la proteína receptora madura una vez que su péptido señal se ha escindido. Por ejemplo, aunque puede definirse un sitio de escisión específico de un péptido señal N-terminal de receptores, se ha observado variabilidad en el punto exacto de escisión. El término "longitud completa" no implica la presencia o ausencia de aminoácidos del péptido señal N-terminal de receptores. En una disposición, el término "longitud completa" (por ejemplo, un CD28 de longitud completa según ciertas divulgaciones en la presente memoria) abarca proteínas receptoras maduras (por ejemplo, CD28 según ciertas divulgaciones en la presente memoria) que carecen del péptido señal N terminal que carece de hasta aproximadamente 5, por ejemplo, 1, 2, 3, 4. 5, o hasta 10 aminoácidos en el extremo N-terminal de la proteína receptora madura una vez que su péptido señal ha sido escindido. La SEQ ID NO: 2 muestra la proteína CD28 madura que incluye el péptido señal. Como se mencionó anteriormente, un receptor CD28 "de longitud completa" según las diversas disposiciones descritas en la presente memoria no incluye el péptido señal y puede carecer de hasta aproximadamente 5, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, o hasta 10 aminoácidos en el extremo N de la proteína receptora madura (por ejemplo, residuos N terminales N, K, I, L y/o V). Esto se muestra en las fusiones ejemplares, por ejemplo, las SEQ ID No. 4-12 (obsérvese que estas pueden carecer de hasta aproximadamente 5, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, o hasta 10 aminoácidos en el extremo N-terminal de la proteína receptora madura como se muestra en la región en recuadro).

Los CoStAR tienen forma modular y se pueden construir para comprender dominios extracelulares, transmembrana e intracelulares obtenidos de una o más proteínas, junto con el scFv obtenido de un anticuerpo que se une a un antígeno asociado a enfermedad, por ejemplo, un antígeno asociado a tumor.

Como se describe en la presente memoria, un CoStAR comprende un receptor de antígeno asociado a enfermedad, por ejemplo, asociado a tumor, tal como, pero sin limitarse a, un scFv específico de antígeno asociado a tumor, y una proteína receptora coestimuladora primaria que es capaz de unirse a su ligando cognado y proporcionar una señal intracelular. En ciertas disposiciones, el receptor coestimulador primario puede ser menor que una proteína de longitud completa, pero es suficiente para unirse al ligando cognado y transducir una señal. En ciertas disposiciones, el dominio de receptor coestimulador primario es de longitud completa, tal como, pero sin limitarse a, CD28 de longitud completa. Por tanto, tanto el dominio de unión específico de antígeno como el receptor específico de ligando pueden unirse a antígeno y ligando cognado, respectivamente. La Figura 1 representa dos disposiciones de construcciones de CoStAR. Ambos CoStAR comprenden un dominio de unión a antígeno, un espaciador opcional y una proteína receptora coestimuladora de longitud completa que comprende un segmento de unión a ligando extracelular y un dominio de señalización intracelular. En otra disposición, un CoStAR comprende un dominio de unión a antígeno, un espaciador opcional, una porción de unión a ligando extracelular de una proteína receptora coestimuladora, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular de una segunda proteína receptora coestimuladora diferente. En ciertas disposiciones, la porción de unión al ligando extracelular comprende un truncamiento de CD28, por ejemplo, un truncamiento de CD28 C-terminal después de los aminoácidos IEV como en la SEQ ID NO: 13 y está seguido por un dominio de señalización intracelular. En ciertas disposiciones, el dominio de señalización intracelular procede de CD40. La transmembrana que separa los dominios de unión a ligando extracelular y de señalización intracelular puede ser de, con limitación, CD28, CD40. En comparación con la construcción izquierda de la Fig. 1, la construcción derecha de la Fig. 1 comprende además un segundo dominio de señalización del receptor intracelular adicional y un espaciador opcional. En disposiciones adicionales, los CoStAR pueden comprender dominios coestimuladores adicionales, por ejemplo, un tercer dominio de señalización coestimulador intracelular y, a este respecto, pueden ser similares a receptores de antígeno quiméricos (CAR), que se han clasificado en primera (solo CD3Z), segunda (un dominio coestimulador CD3Z) o tercera generación (más de un dominio coestimulador CD3Z).

Las proteínas receptoras coestimuladoras útiles en los CoStAR de la presente divulgación incluyen, sin limitación, CD2, CD9, CD26, CD27, CD28, CD29, CD38, CD40, CD43, CD46, CD49d, CD55, CD73, CD81, CD82, CD99, CD100, CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD150 (SLAM), CD270 (HVEM), CD278 (ICOS), CD357 (GITR) o EphB6, que, en su forma natural, comprenden dominios de unión a ligando extracelulares y dominios de transducción de señal intracelulares. En la presente invención, se usan CD28 y CD40. Por ejemplo, CD2 se caracteriza como una molécula de adhesión celular encontrada en la superficie de las células T y es capaz de iniciar señales intracelulares necesarias para la activación de las células T. CD27 se caracteriza como una glucoproteína transmembrana de tipo II que pertenece a la superfamilia de TNF (TNFSF) cuya expresión en las células B se induce por activación antígenoreceptor en las células B. CD28 es una de las proteínas en las células T y es el receptor para los ligandos CD80 (B7.1) y CD86 (B7.2) en las células presentadoras de antígeno. El ligando de CD137 (4-1BB) se encuentra en la mayoría de los leucocitos y en algunas células no inmunitarias. El ligando de OX4 se expresa en muchas células presentadoras de antígeno tales como DC2 (células dendríticas), macrófagos y linfocitos B. En una disposición, la proteína receptora coestimuladora es CD28 de longitud completa como se define en la presente memoria.

En disposiciones descritas en la presente memoria, un CoStAR puede expresarse solo bajo el control de un promotor en una población terapéutica de células que tienen actividad terapéutica, por ejemplo, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). Alternativamente, el CoStAR puede expresarse junto con un transgén terapéutico tal como un receptor de antígeno quimérico (CAR) y/o un receptor de células T (TCR), por ejemplo, como se describe en las SEQ ID NO: 3-12 (obsérvese que puede carecer de hasta aproximadamente 5, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, o hasta 10 aminoácidos en el extremo N de la proteína receptora madura). Por tanto, la presente divulgación también se refiere a construcciones de CoStar que tienen una secuencia como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO: 3-12, incluyendo una de estas secuencias que carece de hasta aproximadamente 5, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o hasta 10 aminoácidos en el extremo N-terminal de la proteína receptora madura). Los TCR y CAR adecuados son bien conocidos en la bibliografía, por ejemplo, TCR específicos de HLA-A*02-Ny ESO-1 (Rapoport et al. Nat Med 2015) o CAR de fusión anti-CD19scFv.CD3Z (Kochenderfer et al. J Clin Oncol 2015) que se han usado con éxito para tratar mieloma o malignidades de células B, respectivamente. Los CoStAR descritos en la presente memoria pueden expresarse con cualquier CAR o TCR conocido, proporcionando así a la célula un cambio de crecimiento regulable para permitir la expansión celular in vitro o in vivo, y un mecanismo de activación convencional en forma del TCR o CAR para la actividad anticancerosa. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona una célula para su uso en terapia celular adoptiva que comprende un CoStAR como se describe en la presente memoria y un TCR y/o CAR que se une específicamente a un antígeno asociado a tumor. Un CoStAR ejemplar que comprende CD28 incluye un dominio de unión a antígeno extracelular y un dominio de señalización extracelular, transmembrana e intracelular que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 2.

La expresión "dominio de unión a antígeno", como se usa en la presente memoria, se refiere a un fragmento de anticuerpo que incluye, pero no se limita a, un diacuerpo, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento Fv estabilizado con disulfuro (dsFv), un (dsFv)2, un dsFv biespecífico (dsFv-dsFv'), un diacuerpo estabilizado con disulfuro (diacuerpo ds), una molécula de anticuerpo monocatenario (scFv), un dímero de scFv (diacuerpo bivalente), un anticuerpo multiespecífico formado a partir de una porción de un anticuerpo que comprende una o más CDR, un anticuerpo de dominio único camelizado, un nanocuerpo, un anticuerpo de dominio, un anticuerpo de dominio bivalente o cualquier otro fragmento de anticuerpo que se una a un antígeno, pero no comprende una estructura de anticuerpo completa. Un dominio de unión a antígeno es capaz de unirse al mismo antígeno al que se une el anticuerpo parental o un fragmento de anticuerpo parental (por ejemplo, un scFv parental). En algunas realizaciones, un fragmento de unión a antígeno puede comprender una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo humano particular injertada a regiones marco (FR) conservadas de uno o más anticuerpos humanos diferentes.

El dominio de unión a antígeno puede hacerse específico para cualquier antígeno asociado a enfermedad, incluyendo, pero sin limitación, antígenos asociados a tumor (TAA) y antígenos asociados a enfermedad infecciosa. En ciertas realizaciones, el dominio de unión a ligando es biespecífico. Los antígenos se han identificado en la mayoría de los cánceres humanos, incluyendo linfoma de Burkitt, neuroblastoma, melanoma, osteosarcoma, carcinoma de células renales, cáncer de mama, cáncer de próstata, carcinoma de pulmón y cáncer de colon. Los TAA incluyen, sin limitación, CD19, CD20, CD22, CD24, CD33, CD38, CD123, CD228, CD138, BCMA, GPC3, CEA, receptor de folato (FRa), mesotelina, CD276, gp100, 5T4, GD2, EGFR, MUC-1, PSMA, EpCAM, MCSP, SM5-1, MICA, MICB, ULBP y HER-2. Los TAA incluyen además neoantígenos, complejos péptido/MHC, y complejos HSP/péptido.

En ciertas realizaciones, el dominio de unión a antígeno comprende un receptor de células T o fragmento de unión del mismo que se une a un complejo péptido-MHC específico de tumor definido. El término "receptor de células T" o "TCR" se refiere a un receptor heterodimérico compuesto por cadenas ap o<y>5 que se emparejan en la superficie de una célula T. Cada cadena a, p,<y>y 5 está compuesta por dos dominios similares a Ig: un dominio variable (V) que confiere reconocimiento de antígeno a través de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), seguido por un dominio constante (C) que está anclado a la membrana celular por un péptido conector y una región transmembrana (TM). La región TM se asocia con las subunidades invariantes del aparato de señalización de CD3. Cada uno de los dominios V tiene tres CDR. Estas CDR interaccionan con un complejo entre un péptido antigénico unido a una proteína codificada por el complejo mayor de histocompatibilidad (pMHC) (Davis y Bjorkman (1988) Nature, 334, 395-402; Davis et al. (1998) Annu Rev Immunol, 16, 523-544; Murphy (2012), xix, 868 p.).

En ciertas realizaciones, el dominio de unión a antígeno comprende un ligando natural de una proteína expresada en el tumor o fragmento de unión a tumor de la misma. Por ejemplo, el receptor de transferrina 1 (TfR1), también conocido como CD71, es una proteína homodimérica que es un regulador clave de la homeostasis del hierro y proliferación celular. Aunque TfR1 se expresa a un nivel bajo en una amplia variedad de células, se expresa a niveles más altos en células que proliferan rápidamente, incluyendo células malignas en donde la sobreexpresión se ha asociado con un pronóstico malo. En una realización de la invención, el dominio de unión a antígeno comprende transferrina o un fragmento de unión al receptor de transferrina de la misma.

En ciertas realizaciones, el dominio de unión a antígeno es específico para un antígeno asociado a tumor definido, tal como, pero sin limitación, FRa, CEA, 5T4, CA125, SM5-1 o CD71. En ciertas realizaciones, el antígeno asociado a tumor puede ser un complejo péptido-MHC específico de tumor. En ciertas de tales realizaciones, el péptido es un neoantígeno. En otras realizaciones, el antígeno asociado a tumor es un complejo péptido-proteína de choque térmico.

En disposiciones como se analiza en la presente memoria, el dominio de señalización de dominio extracelular, transmembrana e intracelular de CoStAR tiene la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1.

Como se usa en la presente memoria, el término "se une específicamente" o "es específico para" se refiere a interacciones mensurables y reproducibles, tales como la unión entre una diana y un anticuerpo o resto de anticuerpo, que es determinante de la presencia de la diana en presencia de una población heterogénea de moléculas, incluyendo moléculas biológicas. Por ejemplo, un resto de anticuerpo que se une específicamente a una diana (que puede ser un epítopo) es un resto de anticuerpo que se une a la diana con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que sus uniones a otras dianas. En algunas disposiciones, un resto de anticuerpo que se une específicamente a un antígeno reacciona con uno o más determinantes antigénicos del antígeno (por ejemplo, un antígeno de superficie celular o un complejo péptido/proteína MHC) con una afinidad de unión que es al menos aproximadamente 10 veces su afinidad de unión por otras dianas.

Dominio espaciador

Un CoStAR como se describe en la presente memoria comprende opcionalmente una región espaciadora entre el dominio de unión al antígeno y el receptor coestimulador. Como se usa en la presente memoria, el término "espaciador" se refiere a la región estructural extracelular de un CoStAR que separa el dominio de unión al antígeno del dominio de unión al ligando externo de la proteína coestimuladora. El espaciador proporciona flexibilidad para acceder al antígeno diana y al ligando del receptor. En ciertas disposiciones, se emplean espaciadores largos, por ejemplo, para dirigirse a epítopos proximales a la membrana o antígenos glicosilados (véase Guest R.D. et al. The role of extracellular spacer regions in the optimal design of chimeric immune receptors: evaluation of four different scFvs and antigens. J. Immunother. 2005;28:203-211; Wilkie S. et al., Retargeting of human T cells to tumor-associated MUC1: the evolution of a chimeric antigen receptor. J. Immunol. 2008; 180:4901-4909). En otras disposiciones, los CoStAR llevan espaciadores cortos, por ejemplo, para dirigirse a epítopos distales de la membrana (véase Hudecek M. et al., Receptor affinity and extracellular domain modifications affect tumor recognition by ROR1-specific chimeric antigen receptor T cells. Clin. Cancer Res. 2013; 19:3153-3164; Hudecek M. et al., The nonsignaling extracellular spacer domain of chimeric antigen receptors is decisive for in vivo antitumor activity. Cancer Immunol. Res. 2015; 3: 125-135). En cierta disposición, el espaciador comprende todo o parte de o se deriva de una bisagra de IgG, incluyendo, pero sin limitación, IgG1, IgG2 o IgG4. Por "derivado de una bisagra de Ig" se entiende un espaciador que comprende inserciones, deleciones o mutaciones en una bisagra de IgG. En ciertas disposiciones, un espaciador puede comprender todo o parte de uno o más dominios constantes de anticuerpo, tales como, pero sin limitarse a, dominios CH2 y/o CH3. En ciertas disposiciones, en un espaciador que comprende todo o parte de un dominio CH2, el dominio CH2 se modifica para que no se una a un receptor Fc. Por ejemplo, se ha encontrado que la unión del receptor Fc en células mieloides perjudica la funcionalidad de las células T CAR. En ciertas disposiciones, el espaciador comprende toda o parte de una bisagra similar a Ig de CD28, CD8 u otra proteína que comprende una región bisagra. En ciertas disposiciones que comprenden un espaciador, el espaciador tiene de 1 y 50 aminoácidos de longitud.

Dominio de señalización

Como se ha analizado anteriormente, en ciertas disposiciones (no todas reivindicadas), un CoStAR comprende un receptor coestimulador primario de longitud completa que puede comprender una porción de unión a ligando extracelular y de señalización intracelular de, sin limitación, CD2, CD9, CD26, CD27, CD28, CD29, CD38, CD40, CD43, CD46, CD49d, CD55, CD73, CD81, CD82, CD99, CD100, CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD150 (SLAM), CD270 (HVEM), CD278 (ICOS), CD357 (G<i>T<r>) o EphB6. En la presente invención, el CoStAR comprende una porción de unión a ligando extracelular y de señalización intracelular de CD28. En otras disposiciones, el receptor coestimulador comprende una proteína quimérica, por ejemplo, que comprende un dominio de unión a ligando extracelular de una de las proteínas mencionadas anteriormente y un dominio de señalización intracelular de otra de las proteínas mencionadas anteriormente. En la presente invención, el CoStAR comprende un segmento de unión a ligando extracelular de un CD28, y un primer segmento intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de CD28. En ciertas disposiciones (no reivindicadas), la porción de señalización del CoStAR comprende un único dominio de señalización. En otras disposiciones, la porción de señalización del CoStAR comprende un segundo dominio de señalización intracelular tal como, pero sin limitarse a: CD2, CD27, CD28, CD40, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAM). En la presente invención, el CoStAR comprende un segundo dominio de señalización intracelular de CD40. En ciertas disposiciones (no reivindicadas), el primer y segundo dominios de señalización intracelular son los mismos. En otras disposiciones, el primer y segundo dominios de señalización intracelular son diferentes. En la presente invención, el CoStAR comprende un primer dominio de señalización intracelular de CD28 y un segundo dominio de señalización intracelular de CD40. En ciertas disposiciones, el receptor coestimulador es capaz de dimerización. Sin estar ligado por la teoría, se cree que los CoStAR dimerizan o se asocian con otras moléculas accesorias para la iniciación de la señal. En ciertas disposiciones, los CoStAR dimerizan o se asocian con moléculas accesorias a través de interacciones de dominios transmembrana. En ciertas disposiciones, la dimerización o asociación con moléculas accesorias está asistida por interacciones de receptores coestimuladores en la porción intracelular, y/o la porción extracelular del receptor coestimulador.

Dominio transmembrana

Aunque la función principal de la transmembrana es anclar el CoStAR en la membrana de las células T, en ciertas disposiciones, el dominio transmembrana influye en la función de CoStAR. En ciertas disposiciones, el dominio transmembrana está comprendido por el dominio de receptor coestimulador primario de longitud completa. En disposiciones divulgadas en la presente memoria en donde la construcción de CoStAR comprende un dominio extracelular de un receptor y un dominio de señalización intracelular de un segundo receptor, el dominio transmembrana puede ser el del dominio extracelular o del dominio intracelular. En ciertas disposiciones, el dominio transmembrana es de CD4, CD8a, CD28 o ICOS. Gueden et al. asociaron el uso del dominio transmembrana de ICOS con una persistencia aumentada de las células T CAR y una eficacia antitumoral global (Guedan S. et al., Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation. JCI Insight. 2018;3:96976). En una disposición, el dominio transmembrana comprende una hélice a hidrófoba que se extiende por la membrana celular.

Se proporcionan ejemplos de dominios de señalización de CoStAR como SEQ ID NO. 3-12.

Variantes

En algunas disposiciones, se contemplan variantes de secuencias de aminoácidos de los restos de anticuerpo proporcionados en la presente memoria. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del resto de anticuerpo. Las variantes de secuencias de aminoácidos de un resto de anticuerpo pueden prepararse introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el resto de anticuerpo, o mediante síntesis peptídica. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del resto de anticuerpo. Puede hacerse cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.

En algunas disposiciones, se proporcionan restos de dominio de unión de anticuerpo que comprenden una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos. Los sitios de interés para cambios mutacionales incluyen las regiones variables (VR) de cadena pesada y ligera y regiones marco (FR) conservadas del dominio de unión de anticuerpo. Las sustituciones de aminoácidos pueden introducirse en un dominio de unión de interés y los productos pueden cribarse para detectar una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno retenida/mejorada o inmunogenicidad disminuida. En ciertas disposiciones, las sustituciones de aminoácidos pueden introducirse en uno o más del dominio de receptor coestimulador primario (extracelular o intracelular), dominio de receptor coestimulador secundario o dominio de co-receptor extracelular. Por consiguiente, las divulgadas en la presente memoria son proteínas CoStAR y partes componentes particularmente divulgadas en la presente memoria, así como variantes de las mismas, es decir, proteínas CoStAR y partes componentes que tienen al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 87 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos divulgadas en particular en la presente memoria. Los términos "porcentaje de similitud", "porcentaje de identidad" y "porcentaje de homología" cuando se refieren a una secuencia particular se usan como se expone en el programa de software BestFit de la Universidad de Wisconsin GCG. Se pueden usar otros algoritmos, por ejemplo, BLAST, psiBLAST o TBLASTN (que usan el método de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410), FASTA (que usa el método de Pearson y Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448).

Las variantes particulares de secuencias de aminoácidos pueden diferir de una secuencia de referencia por inserción, adición, sustitución o deleción de 1 aminoácido, 2, 3, 4, 5-10, 10-20 o 20-30 aminoácidos. En algunas disposiciones, una secuencia variante puede comprender la secuencia de referencia con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más residuos insertados, delecionados o sustituidos. Por ejemplo, 5, 10, 15, hasta 20, hasta 30 o hasta 40 residuos pueden insertarse, delecionarse o sustituirse.

En algunas disposiciones preferidas, una variante puede diferir de una secuencia de referencia en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones conservativas. Las sustituciones conservativas implican el reemplazo de un aminoácido por un aminoácido diferente que tiene propiedades similares. Por ejemplo, un residuo alifático puede reemplazarse por otro residuo alifático, un residuo no polar puede reemplazarse por otro residuo no polar, un residuo ácido puede reemplazarse por otro residuo ácido, un residuo básico puede reemplazarse por otro residuo básico, un residuo polar puede reemplazarse por otro residuo polar o un residuo aromático puede reemplazarse por otro residuo aromático. Las sustituciones conservativas pueden ser, por ejemplo, entre aminoácidos dentro de los siguientes grupos: Las sustituciones conservativas se muestran en la Tabla siguiente.

Los aminoácidos pueden agruparse en diferentes clases según propiedades comunes de la cadena lateral: a. hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; b. hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;c.ácidos: Asp, Glu; d. básicos: His, Lys, Arg; e. residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; aromáticos: Trp, Tyr, Phe. Las sustituciones no conservativas implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

Células

Las células usadas en la presente invención pueden ser cualquier linfocito que sea útil en terapia celular adoptiva, tal como una célula T o una célula asesina natural (NK), una célula NKT, una célula T gamma/delta o una célula T reguladora. Las células pueden ser alogénicas o autólogas para el paciente.

Las células T o linfocitos T son un tipo de linfocito que tiene un papel central en la inmunidad mediada por células. Pueden distinguirse de otros linfocitos, tales como células B y células asesinas naturales (células NK), por la presencia de un receptor de linfocitos T (TCR) en la superficie celular. Existen varios tipos de células T, como se resume a continuación. Las células T citotóxicas (células TC o CTL) destruyen células infectadas viralmente y células tumorales, y también están implicadas en el rechazo de trasplantes. Los c Tl expresan la molécula CD8 en su superficie.

Estas células reconocen sus dianas uniéndose a antígeno asociado con MHC de clase I, que está presente en la superficie de todas las células nucleadas. A través de IL-10, adenosina y otras moléculas secretadas por las células T reguladoras, las células CD8+ pueden inactivarse a un estado anérgico, que previene enfermedades autoinmunes tales como encefalomielitis autoinmune experimental.

Las células T de memoria son un subconjunto de células T específicas de antígeno que persisten a largo plazo después de que se haya resuelto una infección. Se expanden rápidamente a un gran número de células T efectoras tras la reexposición a su antígeno cognado, proporcionando así al sistema inmunitario "memoria" contra infecciones pasadas. Las células T de memoria comprenden tres subtipos: células T de memoria central (células TCM) y dos tipos de células T de memoria efectoras (células TEM y células TEMRA). Las células de memoria pueden ser CD4+ o CD8+. Las células T de memoria expresan típicamente la proteína de superficie celular CD45RO. Las células T reguladoras (células Treg), anteriormente conocidas como células T supresoras, son cruciales para el mantenimiento de la tolerancia inmunológica. Su papel principal es detener la inmunidad mediada por células T hacia el final de una reacción inmunitaria y suprimir células T autorreactivas que escaparon del proceso de selección negativa en el timo.

Se han descrito dos clases principales de células T reg CD4+ - células T reg de origen natural y células T reg adaptativas. Las células Treg de origen natural (también conocidas como células Treg CD4+CD25+FoxP3+) surgen en el timo y se han relacionado con interacciones entre células T en desarrollo con células dendríticas mieloides (CD11c+) y plasmacitoides (CD123+) que se han activado con TSLP. Las células Treg de origen natural pueden distinguirse de otras células T por la presencia de una molécula intracelular denominada FoxP3. Las células Treg adaptativas (también conocidas como células Tr1 o células Th3) pueden originarse durante una respuesta inmunitaria normal.

Las células asesinas naturales (o células NK) son un tipo de célula citolítica que forma parte del sistema inmunitario innato. Las células NK proporcionan respuestas rápidas a las señales innatas de las células infectadas por virus de una manera independiente del MHC. Las células NK (pertenecientes al grupo de células linfoides innatas) se definen como linfocitos granulares grandes (LGL) y constituyen el tercer tipo de células diferenciadas del progenitor linfoide común que genera linfocitos B y T.

En ciertas disposiciones divulgadas en la presente memoria, las células terapéuticas comprenden células autólogas diseñadas por ingeniería para expresar un CoStAR. En ciertas disposiciones, las células terapéuticas comprenden células alogénicas diseñadas por ingeniería para expresar un CoStAR. Las células autólogas que expresan CoStAR pueden ser ventajosas para evitar la enfermedad de injerto contra huésped (GVDH) debido al reconocimiento mediado por TCR de aloantígenos receptores. Además, el sistema inmunitario de un receptor de CoStAR podría atacar las células CoStAR infundidas, provocando rechazo. En ciertas disposiciones, para prevenir la GVDH y reducir el rechazo, se elimina el TcR endógeno de las células CoStAR alogénicas mediante edición del genoma.

Ácidos nucleicos

Un aspecto de la presente divulgación proporciona una secuencia de ácido nucleico, que codifica cualquiera de los CoStAR, polipéptidos o proteínas descritos en la presente memoria (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos). Como se usa en la presente memoria, los términos "polinucleótido", "nucleótido" y "ácido nucleico" pretenden ser sinónimos entre sí. Un experto en la técnica entenderá que numerosos polinucleótidos y ácidos nucleicos diferentes pueden codificar el mismo polipéptido como resultado de la degeneración del código genético. Además, debe entenderse que los expertos pueden, usando técnicas rutinarias, realizar sustituciones de nucleótidos que no afecten a la secuencia polipeptídica codificada por los polinucleótidos descritos en la presente memoria para reflejar el uso de codones de cualquier organismo huésped particular en el que van a expresarse los polipéptidos, por ejemplo, optimización de codones. Los ácidos nucleicos según la invención pueden comprender ADN o ARN. Pueden ser monocatenarios o bicatenarios. También pueden ser polinucleótidos que incluyen en ellos nucleótidos sintéticos o modificados. Se conocen en la técnica varios tipos diferentes de modificación de oligonucleótidos. Estas incluyen esqueletos de metilfosfonato y fosforotioato, adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los fines de la presente divulgación, debe entenderse que los polinucleótidos pueden modificarse mediante cualquier método disponible en la técnica. Tales modificaciones pueden llevarse a cabo con el fin de potenciar la actividad in vivo o la duración de la vida de polinucleótidos de interés.

Los términos "variante", "homólogo" o "derivado" en relación con una secuencia de nucleótidos incluyen cualquier sustitución, variación, modificación, reemplazo, deleción o adición de un (o más) ácido nucleico de o a la secuencia. La secuencia de ácido nucleico puede codificar la secuencia de proteína mostrada como SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma. La secuencia de nucleótidos puede comprender la secuencia de ácido nucleico de CD28 humano optimizada por codones mostrada en la SEQ ID NO: 1 o variantes de la misma (representada en la Fig. 1).

La presente divulgación también proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un CoStAR y una secuencia de ácido nucleico adicional que codifica un receptor de células T (TCR) y/o receptor de antígeno quimérico (CAR).

Las secuencias de ácido nucleico pueden estar unidas por una secuencia que permite la coexpresión de las dos o más secuencias de ácido nucleico. Por ejemplo, la construcción puede comprender un promotor interno, una secuencia de secuencia de entrada al ribosoma interna (IRES) o una secuencia que codifica un sitio de escisión. El sitio de escisión puede autoescindirse, de manera que cuando se produce el polipéptido, se escinde inmediatamente en las proteínas discretas sin la necesidad de ninguna actividad de escisión externa. Se conocen diversos sitios de autoescisión, incluyendo el péptido autoescindible del virus de la fiebre aftosa (FMDV) y 2A. La secuencia de coexpresión puede ser una secuencia interna de entrada al ribosoma (IRES). La secuencia de coexpresión puede ser un promotor interno.

Vectores

La presente divulgación proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico o construcción de ácido nucleico de la presente divulgación.

Dicho vector puede usarse para introducir la o las secuencias de ácido nucleico o la o las construcciones de ácido nucleico en una célula huésped de modo que exprese uno o más CoStAR según el primer aspecto de la invención y, opcionalmente, una o más proteínas de interés (POI), por ejemplo, un TCR o un CAR. El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido o un vector viral, tal como un vector retroviral o un vector lentiviral, o un vector basado en transposones o ARNm sintético.

Los ácidos nucleicos de la presente divulgación también pueden usarse para inmunización con ácidos nucleicos y terapia génica, usando protocolos de administración de genes convencionales. Los métodos para la administración de genes son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Pat. de EE. UU. No. 5.399.346, 5.580.859, 5.589.466.

Los vectores derivados de retrovirus, tales como el lentivirus, son herramientas adecuadas para lograr la transferencia génica a largo plazo ya que permiten la integración estable a largo plazo de un transgén o transgenes y su propagación en células hijas. El vector puede ser capaz de transfectar o transducir un linfocito que incluye una célula T o una célula NK. La presente invención también proporciona vectores en los que se inserta un ácido nucleico de la presente invención. La expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican un CoStAR, y opcionalmente un TCR o CAR se logra típicamente uniendo operativamente un ácido nucleico que codifica el polipéptido CoStAR y TCR/CAR o porciones del mismo a uno o más promotores, e incorporando la construcción en un vector de expresión.

Los elementos promotores adicionales, por ejemplo, potenciadores, regulan la frecuencia de iniciación transcripcional. Típicamente, estos están localizados en la región 30-110 pb en 5’ del sitio de inicio, aunque recientemente se ha mostrado que varios promotores contienen también elementos funcionales en 3’ del sitio de inicio. La separación entre elementos promotores es frecuentemente flexible, de modo que la función promotora se conserva cuando los elementos se invierten o se mueven uno con respecto al otro. En el promotor de timidina quinasa (tk), la separación entre los elementos promotores puede aumentarse hasta 50 pb antes de que la actividad comience a disminuir.

Un ejemplo de un promotor adecuado es la secuencia promotora inmediata temprana de citomegalovirus (CMV). Esta secuencia promotora es una secuencia promotora constitutiva fuerte capaz de conducir altos niveles de expresión de cualquier secuencia polinucleotídica unida operativamente a la misma. Otro ejemplo de un promotor adecuado es el factor de crecimiento de elongación-1a (EF-1a). Sin embargo, también se pueden usar otras secuencias promotoras constitutivas, incluyendo, pero sin limitación, el promotor temprano del virus de simio 40 (SV40), virus de tumor mamario de ratón (MMTV), el promotor de repetición terminal larga (LTR) del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el promotor de MoMuLV, un promotor del virus de leucemia aviar, un promotor temprano inmediato del virus de Epstein-Barr, un promotor del virus del sarcoma de Rous, así como promotores de genes humanos tales como, pero sin limitación, el promotor de actina, el promotor de miosina, el promotor de hemoglobina y el promotor de creatina quinasa.

Los vectores pueden ser adecuados para la replicación e integración en células eucariotas. Los vectores de clonación típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para la regulación de la expresión de la secuencia de ácido nucleico deseada. La tecnología de vectores virales es bien conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York), y en otros manuales de virología y biología molecular, véase también, WO 01/96584; WO 01/29058; y Pat. de EE. UU. No. 6.326.193). En algunas disposiciones, las construcciones son como se muestran en las SEQ ID NO: 3-12 (representadas esquemáticamente en la Fig. 2). En algunas disposiciones, los ácidos nucleicos son construcciones multicistrónicas que permiten la expresión de múltiples transgenes (por ejemplo, CoStAR y un TCR y/o CAR, etc.) bajo el control de un único promotor. En algunas disposiciones, los transgenes (por ejemplo, CoStAR y un TCR y/o CAR, etc.) se separan por un péptido 2A de autoescisión. Los ejemplos de péptidos 2A útiles en las construcciones de ácido nucleico divulgadas en la presente memoria incluyen F2A, P2A, T2A y E2A. En otras disposiciones, la construcción de ácido nucleico es una construcción multicistrónica que comprende dos promotores; un promotor que dirige la expresión de CoStAR y el otro promotor que dirige la expresión del TCR o CAR. En algunas disposiciones, las construcciones de promotor doble son unidireccionales. En otras disposiciones, las construcciones de promotor doble son bidireccionales. Con el fin de evaluar la expresión del polipéptido CoStAR o porciones del mismo, el vector de expresión que se va a introducir en una célula también puede contener un gen marcador seleccionable o un gen indicador o ambos para facilitar la identificación y selección de las células que expresan de la población de células que se busca transfectar o transducir a través de vectores virales.

Fuentes de células

Antes de la expansión y modificación genética, se obtiene una fuente de células (por ejemplo, células efectoras inmunitarias, por ejemplo, células T o células NK) de un sujeto. El término "sujeto" pretende incluir organismos vivos en los que se puede incitar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, mamíferos). Los ejemplos de sujetos incluyen seres humanos. También se incluyen perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de los mismos. Las células T pueden obtenerse de varias fuentes, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores.

En una disposición, las células T se aíslan de linfocitos de sangre periférica lisando los glóbulos rojos y deplecionando los monocitos, por ejemplo, por centrifugación a través de un gradiente de PERCOLLTM o por elutriación centrífuga a contraflujo.

Una subpoblación específica de células T, tales como células T CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ y CD45RO+, puede aislarse adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, en una disposición, las células T se aíslan mediante incubación con perlas conjugadas con anti-CD3/anti-CD28, tales como DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, durante un periodo de tiempo suficiente para la selección positiva de las células T deseadas. En una disposición, el período de tiempo es de aproximadamente 30 minutos. En una disposición adicional, el periodo de tiempo varía de 30 minutos a 36 horas o más y todos los valores enteros intermedios. En una disposición adicional, el período de tiempo es de al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. En otra disposición preferida más, el período de tiempo es de 10 a 24 horas. En una disposición, el período de tiempo de incubación es de 24 horas. Pueden usarse tiempos de incubación más largos para aislar células T en cualquier situación en donde hay pocas células T en comparación con otros tipos celulares, tales como en el aislamiento de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) a partir de tejido tumoral o a partir de individuos inmunocomprometidos. Además, el uso de tiempos de incubación más largos puede aumentar la eficiencia de captura de células T CD8+. Por lo tanto, simplemente acortando o alargando el tiempo que se permite que las células T se unan a las perlas de CD3/CD28 y/o aumentando o disminuyendo la relación de perlas a células T (como se describe adicionalmente en la presente memoria), se pueden seleccionar subpoblaciones de células T preferentemente para o contra al inicio del cultivo o en otros puntos de tiempo durante el proceso. Adicionalmente, aumentando o disminuyendo la proporción de anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 en las perlas u otra superficie, las subpoblaciones de células T pueden seleccionarse preferentemente para o contra al inicio del cultivo o en otros puntos de tiempo deseados. El experto en la técnica reconocería que también se pueden usar múltiples rondas de selección en el contexto de esta divulgación. En ciertas disposiciones, puede ser deseable realizar el procedimiento de selección y usar las células "no seleccionadas" en el proceso de activación y expansión. Las células "no seleccionadas" también pueden someterse a rondas adicionales de selección.

El enriquecimiento de una población de células T mediante selección negativa puede conseguirse con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie únicos para las células seleccionadas negativamente. Un método es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que usa un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de la superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para enriquecer las células CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales incluye típicamente anticuerpos contra CD14, CD20, CD16, HLA-DR y CD8. En ciertas disposiciones, puede ser deseable enriquecer o seleccionar positivamente células T reguladoras que expresan típicamente CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+, CD137, PD1, TIM3, LAG-3, CD150 y FoxP3+. Alternativamente, en ciertas disposiciones, las células T reguladoras se deplecionan por perlas conjugadas con anti-CD25 u otro método de selección similar.

Los métodos descritos en la presente memoria pueden incluir, por ejemplo, la selección de una subpoblación específica de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, células T, que son una población deplecionada de células T reguladoras, células deplecionadas de CD25+, usando, por ejemplo, una técnica de selección negativa, por ejemplo, descrita en la presente memoria. Preferiblemente, la población de células de T reguladoras deplecionada contiene menos del 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % de células CD25+.

Una subpoblación específica de células efectoras CoStAR que se unen específicamente a un antígeno diana puede enriquecerse mediante técnicas de selección positiva. Por ejemplo, en algunas disposiciones, las células efectoras se enriquecen mediante incubación con perlas conjugadas con antígeno diana durante un periodo de tiempo suficiente para la selección positiva de las células efectoras abTCR deseadas. En algunas disposiciones, el período de tiempo es de aproximadamente 30 minutos. En algunas disposiciones, el período de tiempo varía de 30 minutos a 36 horas o más (incluidos todos los intervalos entre estos valores). En algunas disposiciones, el período de tiempo es de al menos una, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. En algunas disposiciones, el período de tiempo es de 10 a 24 horas. En algunas disposiciones, el período de tiempo de incubación es de 24 horas. Para el aislamiento de células efectoras presentes a bajos niveles en la población celular heterogénea, el uso de tiempos de incubación más largos, tales como 24 horas, puede aumentar el rendimiento celular. Pueden usarse tiempos de incubación más largos para aislar células efectoras en cualquier situación en donde hay pocas células efectoras en comparación con otros tipos celulares. El experto en la técnica reconocería que también se pueden usar múltiples rondas de selección en el contexto de esta divulgación.

Las células T para estimulación también pueden congelarse después de una etapa de lavado. Después de la etapa de lavado que elimina el plasma y las plaquetas, las células pueden suspenderse en una solución de congelación. Aunque se conocen en la técnica muchas soluciones y parámetros de congelación y serán útiles en este contexto, un método implica usar PBS que contiene DMSO al 20 % y albúmina de suero humano al 8 %, o medios de cultivo que contienen Dextrano 40 al 10 % y Dextrosa al 5 %, Albúmina de suero humano al 20 % y DMSO al 7,5 %, o Plasmalyte-A al 31,25 %, Dextrosa al 5 %, NaCl al 0,45 %, Dextrano 40 al 10 % y Dextrosa al 5 %, Albúmina de suero humano al 20 % y DMSO al 7,5 % u otros medios de congelación celular adecuados que contienen, por ejemplo, Hespan y PlasmaLyte A, las células se congelan entonces a -80 °C a una velocidad de 1 ° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Se pueden usar otros métodos de congelación controlada, así como congelación incontrolada inmediatamente a -20 °C o en nitrógeno líquido.

CoStAR alogénico

En disposiciones descritas en la presente memoria, la célula efectora inmunitaria puede ser una célula efectora inmunitaria alogénica, por ejemplo, una célula T o una célula NK. Por ejemplo, la célula puede ser una célula T alogénica, por ejemplo, una célula T alogénica que carece de la expresión del receptor de células T endógeno (TCR) y/o antígeno leucocitario humano (HLA), por ejemplo, HLA clase I y/o HLA clase II.

Una célula T que carece de un TCR endógeno funcional puede, por ejemplo, diseñarse por ingeniería de manera que no exprese ningún TCR funcional en su superficie, diseñarse por ingeniería de manera que no exprese una o más subunidades que comprendan un TCR funcional (por ejemplo, diseñarse por ingeniería de manera que no exprese (o muestre expresión reducida) TCR alfa, TCR beta, TCR gamma, TCR delta, TCR épsilon y/o TCR zeta) o diseñarse por ingeniería de manera que produzca muy poco TCR funcional en su superficie. Alternativamente, la célula T puede expresar un TCR sustancialmente deteriorado, por ejemplo, por expresión de formas mutadas o truncadas de una o más de las subunidades del TCR. La expresión "TCR sustancialmente deteriorado" significa que este TCR no incitará una reacción inmunitaria adversa en un huésped.

Una célula T descrita en la presente memoria puede, por ejemplo, diseñarse por ingeniería de manera que no exprese un HLA funcional en su superficie. Por ejemplo, una célula T descrita en la presente memoria, puede diseñarse por ingeniería de manera que la expresión en la superficie celular de HLA, por ejemplo, HLA de clase I y/o HLA de clase II, esté regulada a la baja. En algunas disposiciones, la regulación a la baja de HLA puede lograrse reduciendo o eliminando la expresión de beta-2 microglobulina (B2M).

En algunas disposiciones divulgadas en la presente memoria, la célula T puede carecer de un TCR funcional y un HLA funcional, por ejemplo, HLA de clase I y/o HLA de clase II. Las células T modificadas que carecen de expresión de un TCR y/o HLA funcional se pueden obtener por cualquier medio adecuado, incluyendo una inactivación o desactivación de una o más subunidades de TCR o HLA. Por ejemplo, la célula T puede incluir una inactivación de TCR y/o HLA usando ARNsi, ARNsh, repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), nucleasa efectora similar a activador de la transcripción (TALEN) o endonucleasa de dedo de cinc (ZFN).

En algunas disposiciones, la célula alogénica puede ser una célula que no expresa o expresa a niveles bajos una molécula inhibidora, por ejemplo, una célula diseñada por ingeniería por cualquier método descrito en la presente memoria. Por ejemplo, la célula puede ser una célula que no expresa o expresa a niveles bajos una molécula inhibidora, por ejemplo, que puede disminuir la capacidad de una célula que expresa CoStAR para montar una respuesta efectora inmunitaria. Los ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC clase I, MHC clase II, Gal9, adenosina y TGFR beta. La inhibición de una molécula inhibidora, por ejemplo, mediante la inhibición a nivel de ADN, ARN o proteína, puede optimizar un rendimiento de células que expresan CAR. En disposiciones, se puede usar un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ARNds, por ejemplo, un ARNsi o ARNsh, repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), una nucleasa efectora similar al activador de la transcripción (TALEN) o una endonucleasa de dedo de cinc (ZFN), por ejemplo, como se describe en la presente memoria.

ARNsi y ARNsh para inhibir TCR o HLA endógenos

En algunas disposiciones, la expresión de TCR y/o la expresión de HLA se puede inhibir usando ARNsi o ARNsh que se dirige a un ácido nucleico que codifica un TCR y/o HLA, y/o una molécula inhibidora descrita en la presente memoria (por ejemplo, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEAc Am (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC clase I, MHC clase II, Gal9, adenosina y TGFR beta) en una célula T.

La expresión de ARNsi y ARNsh en las células T puede lograrse usando cualquier sistema de expresión convencional, por ejemplo, tal como un sistema de expresión lentiviral. Se describen ARNsh ejemplares que regulan a la baja la expresión de componentes del TCR, por ejemplo, en la Publicación de EE. UU. No.: 2012/0321667. Se describen ARNsi y ARNsh ejemplares que regulan a la baja la expresión de genes de HLA de clase I y/o HLA de clase II, por ejemplo, en la Publicación de EE. UU. No: US 2007/0036773.

CRISPR para inhibir TCR o HLA

"CRISPR" o "CRISPR para inhibir TCR y/o HLA" como se usa en la presente memoria se refiere a un conjunto de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas, o un sistema que comprende dicho conjunto de repeticiones. "Cas", como se usa en la presente memoria, se refiere a una proteína asociada a CRISPR. Un sistema "CRISPR/Cas" se refiere a un sistema derivado de CRISPR y Cas que se puede utilizar para silenciar o mutar un gen de TCR y/o HLA, y/o una molécula inhibidora descrita en la presente memoria (por ejemplo, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCNl), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC clase I, MHC clase II, GAL9, adenosina y<t>G<f>R beta).

Los sistemas CRISPR/Cas de origen natural se encuentran en aproximadamente el 40 % de los genomas de eubacterias secuenciados y el 90 % de las arqueobacterias secuenciadas. Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172. Este sistema es un tipo de sistema inmunitario procariota que confiere resistencia a elementos genéticos extraños tales como plásmidos y fagos y proporciona una forma de inmunidad adquirida. Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322: 1843-1845.

Activación y expansión de células T

Las células T pueden activarse y expandirse generalmente usando métodos como se describe, por ejemplo, en las Patentes de EE. UU. 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; y la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. 20060121005.

Generalmente, las células T de la invención pueden expandirse por contacto con una superficie que tiene unido a la misma un agente que estimula una señal asociada al complejo CD3/TCR y un ligando que estimula una molécula coestimuladora en la superficie de las células T. En particular, las poblaciones de células T pueden estimularse como se describe en la presente memoria, tal como por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o por contacto con un activador de proteína quinasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de las células T, se usa un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de células T puede ponerse en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de las células T. Para estimular la proliferación de células T CD4+ o células T CD8+, se puede usar un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Los ejemplos de un anticuerpo anti-CD28 incluyen 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, Francia) y pueden usarse otros métodos conocidos comúnmente en la técnica (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med.

190(9): 13191328,1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227 (l-2) :53-63, 1999).

En algunas disposiciones, la expansión se puede realizar usando matraces o recipientes, o recipientes permeables a los gases conocidos por los expertos en la técnica y puede proceder durante 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días, de aproximadamente 7 días a aproximadamente 14 días, de aproximadamente 8 días a aproximadamente 14 días, de aproximadamente 9 días a aproximadamente 14 días, de aproximadamente 10 días a aproximadamente 14 días, de aproximadamente 11 días a aproximadamente 14 días, de aproximadamente 12 días a aproximadamente 14 días o de aproximadamente 13 días a aproximadamente 14 días. En algunas disposiciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 14 días.

En ciertas disposiciones, la expansión puede realizarse usando estimulación de receptores de células T no específica en presencia de interleucina-2 (IL-2) o interleucina-15 (IL-15). El estímulo de receptor de células T no específico puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3, tal como aproximadamente 30 ng/ml de OKT3, un anticuerpo anti-CD3 monoclonal de ratón (disponible comercialmente en Ortho-McNeil, Raritan, N.J. o Miltenyi Biotech, Auburn, Calif.) o UHCT-1 (disponible comercialmente en BioLegend, San Diego, Calif. EE. UU.). Las células CoStAR pueden expandirse in vitro incluyendo uno o más antígenos, incluyendo porciones antigénicas de los mismos, tales como epítopo(s), de un cáncer, que puede expresarse opcionalmente a partir de un vector, tal como un péptido de unión a antígeno leucocitario humano A2 (HLA-A2), por ejemplo, 0,3 pM MART-1:26-35 (27 L) o gpl 00:209-217 (210 M), opcionalmente en presencia de un factor de crecimiento de células T, tal como 300 UI/ml de IL-2 o IL-15. Otros antígenos adecuados pueden incluir, por ejemplo, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, antígeno de cáncer de tirosinasa, MAGE-A3, SSX-2 y VEGFR2, o porciones antigénicas de los mismos. Las células CoStAR también pueden expandirse rápidamente mediante reestimulación con el o los mismos antígenos del cáncer pulsados sobre células presentadoras de antígeno que expresan HLA-A2. Alternativamente, las células CoStAR pueden estimularse adicionalmente con, por ejemplo, linfocitos autólogos, irradiados o con linfocitos alogénicos HLA-A2+ irradiados e IL-2. En algunas realizaciones, la estimulación se produce como parte de la expansión. En algunas realizaciones, la expansión se produce en presencia de linfocitos autólogos irradiados o con linfocitos alogénicos HLA-A2+ irradiados e IL-2.

En ciertas disposiciones, el medio de cultivo celular comprende IL-2. En algunas disposiciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1.000 UI/ml, aproximadamente 1.500 UI/ml, aproximadamente 2.000 UI/ml, aproximadamente 2.500 UI/ml, aproximadamente 3.000 UI/ml, aproximadamente 3.500 UI/ml, aproximadamente 4.000 UI/ml, aproximadamente 4.500 UI/ml, aproximadamente 5.000 UI/ml, aproximadamente 5.500 UI/ml, aproximadamente 6.000 UI/ml, aproximadamente 6.500 UI/ml, aproximadamente 7.000 UI/ml, aproximadamente 7.500 UI/ml, o aproximadamente 8.000 UI/ml, o entre 1.000 y 2.000 UI/ml, entre 2.000 y 3.000 UI/ml, entre 3.000 y 4.000 UI/ml, entre 4.000 y 5.000 UI/ml, entre 5.000 y 6.000 UI/ml, entre 6.000 y 7.000 UI/ml, entre 7.000 y 8.000 UI/ml, o entre 8.000 UI/ml de IL-2.

En ciertas disposiciones, el medio de cultivo celular comprende anticuerpo OKT3. En algunas disposiciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 0,1 ng/ml, aproximadamente 0,5 ng/ml, aproximadamente 1 ng/ml, aproximadamente 2,5 ng/ml, aproximadamente 5 ng/ml, aproximadamente 7,5 ng/ml, aproximadamente 10 ng/ml, aproximadamente 15 ng/ml, aproximadamente 20 ng/ml, aproximadamente 25 ng/ml, aproximadamente 30 ng/ml, aproximadamente 35 ng/ml, aproximadamente 40 ng/ml, aproximadamente 50 ng/ml, aproximadamente 60 ng/ml, aproximadamente 70 ng/ml, aproximadamente 80 ng/ml, aproximadamente 90 ng/ml, aproximadamente 100 ng/ml, aproximadamente 200 ng/ml, aproximadamente 500 ng/ml, aproximadamente 1 pg/ml o entre 0,1 ng/ml y 1 ng/ml, entre 1 ng/ml y 5 ng/ml, entre 5 ng/ml y 10 ng/ml, entre 10 ng/ml y 20 ng/ml, entre 20 ng/ml y 30 ng/ml, entre 30 ng/ml y 40 ng/ml, entre 40 ng/ml y 50 ng/ml, o entre 50 ng/ml y 100 ng/ml de anticuerpo OKT3.

En ciertas disposiciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21 como una combinación durante la expansión. En algunas disposiciones, IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21, así como cualquier combinación de las mismas, pueden incluirse durante la expansión. En algunas disposiciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21 como una combinación durante la expansión. En algunas disposiciones, se pueden incluir IL-2, IL-15 e IL-21, así como cualquier combinación de las mismas.

En ciertas disposiciones, la expansión puede llevarse a cabo en un medio de cultivo celular suplementado que comprende IL-2, OKT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígeno.

En ciertas disposiciones, el medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 500 UI/ml de IL-15, aproximadamente 400 UI/ml de IL-15, aproximadamente 300 UI/ml de IL-15, aproximadamente 200 UI/ml de IL-15, aproximadamente 180 UI/ml de IL-15, aproximadamente 160 UI/ml de IL-15, aproximadamente 140 UI/ml de IL-15, aproximadamente 120 UI/ml de IL-15, o aproximadamente 100 UI/ml de IL-15, o aproximadamente 500 UI/ml de IL-15 a aproximadamente 100 UI/ml de IL-15, o aproximadamente 400 UI/ml de IL-15 a aproximadamente 100 UI/ml de IL-15 o aproximadamente 300 UI/ml de IL-15 a aproximadamente 100 UI/ml de IL-15 o aproximadamente 200 UI/ml de IL-15, o aproximadamente 180 UI/ml de IL-15.

En algunas disposiciones, el medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 20 UI/ml de IL-21, aproximadamente 15 UI/ml de IL-21, aproximadamente 12 UI/ml de IL-21, aproximadamente 10 UI/ml de IL-21, aproximadamente 5 UI/ml de IL-21, aproximadamente 4 UI/ml de IL-21, aproximadamente 3 UI/ml de IL-21, aproximadamente 2 UI/ml de IL-21, aproximadamente 1 lU/ml de IL-21, o aproximadamente 0,5 UI/ml de IL-21, o aproximadamente 20 UI/ml de IL-21 a aproximadamente 0,5 UI/ml de IL-21, o aproximadamente 15 UI/ml de IL-21 a aproximadamente 0,5 UI/ml de IL-21, o aproximadamente 12 UI/ml de IL-21 a aproximadamente 0,5 UI/ml de IL-21, o aproximadamente 10 lU/ml de IL-21 a aproximadamente 0,5 UI/ml de IL-21, o aproximadamente 5 UI/ml de IL-21 a aproximadamente 1 UI/ml de IL-21, o aproximadamente 2 UI/ml de IL-21. En algunas disposiciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1 UI/ml de IL-21 o aproximadamente 0,5 UI/ml de IL-21.

En algunas disposiciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC) son PBMC. En una disposición, la relación de células CoStAR a PBMC y/o células presentadoras de antígeno en la expansión es de aproximadamente 1 a 25, aproximadamente 1 a 50, aproximadamente 1 a 100, aproximadamente 1 a 125, aproximadamente 1 a 150, aproximadamente 1 a 175, aproximadamente 1 a 200, aproximadamente 1 a 225, aproximadamente 1 a 250, aproximadamente 1 a 275, aproximadamente 1 a 300, aproximadamente 1 a 325, aproximadamente 1 a 350, aproximadamente 1 a 375, aproximadamente 1 a 400, o aproximadamente 1 a 500, o entre 1 a 50 y 1 a 300, o entre 1 a 100 y 1 a 200.

En ciertas disposiciones, la señal estimuladora primaria y la señal coestimuladora para la célula T pueden ser proporcionadas por diferentes protocolos. Por ejemplo, los agentes que proporcionan cada señal pueden estar en solución o acoplados a una superficie. Cuando se acoplan a una superficie, los agentes pueden acoplarse a la misma superficie (es decir, en formación "cis") o a superficies separadas (es decir, en formación "trans"). Alternativamente, un agente puede acoplarse a una superficie y el otro agente en solución. En una disposición, el agente que proporciona la señal coestimuladora está unido a una superficie celular y el agente que proporciona la señal de activación primaria está en solución o acoplado a una superficie. En ciertas disposiciones, ambos agentes pueden estar en solución. En una disposición, los agentes pueden estar en forma soluble, y después reticulados a una superficie, tal como una célula que expresa receptores de Fc o un anticuerpo u otro agente de unión que se unirá a los agentes. A este respecto, véanse, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE. UU. No. 20040101519 y 20060034810 para células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) que se contemplan para su uso en la activación y expansión de células T en la presente divulgación.

En una disposición, los dos agentes se inmovilizan sobre perlas, ya sea sobre la misma perla, es decir, "cis", o a perlas separadas, es decir, "trans". A modo de ejemplo, el agente que proporciona la señal de activación primaria es un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y el agente que proporciona la señal coestimuladora es un anticuerpo anti-CD28 o fragmento de unión a antígeno del mismo; y ambos agentes se coinmovilizan en la misma perla en cantidades moleculares equivalentes. En una disposición, se usa una proporción 1:1 de cada anticuerpo unido a las perlas para la expansión de células T CD4+ y el crecimiento de células T. En ciertos aspectos de la presente divulgación, se usa una relación de anticuerpos anti CD3:CD28 unidos a las perlas de manera que se observa un aumento en la expansión de las células T en comparación con la expansión observada usando una relación de 1:1. En una disposición particular, se observa un aumento de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces en comparación con la expansión observada usando una relación de 1:1. En una disposición, la relación de anticuerpo frente a CD3:CD28 unido a las perlas varía de 100:1 a 1:100 y todos los valores enteros intermedios. En una disposición de la presente divulgación, se une más anticuerpo anti-CD28 a las partículas que anticuerpo anti-CD3, es decir, la relación de CD3:CD28 es menor de uno. En ciertas disposiciones de la divulgación, la relación de anticuerpo anti CD28 a anticuerpo anti CD3 unido a las perlas es mayor de 2:1. En una disposición particular, se usa una relación 1:100 de CD3:CD28 de anticuerpo unido a las perlas. En una disposición, se usa una relación 1:75 de CD3:CD28 de anticuerpo unido a las perlas. En una disposición adicional, se usa una relación 1:50 de CD3:CD28 de anticuerpo unido a las perlas. En una disposición, se usa una relación 1:30 de CD3:CD28 de anticuerpo unido a las perlas. En una disposición preferida, se usa una relación 1:10 de CD3:CD28 de anticuerpo unido a las perlas. En una disposición, se usa una relación 1:3 de CD3:CD28 de anticuerpo unido a las perlas. En una disposición más, se usa una relación 3:1 de CD3:CD28 de anticuerpo unido a las perlas.

Pueden usarse relaciones de partículas a células de 1:500 a 500:1 y cualquier valor entero intermedio para estimular células T u otras células diana. Como los expertos en la técnica pueden apreciar fácilmente, la relación de partículas a células puede depender del tamaño de partícula en relación con la célula diana. Por ejemplo, las perlas de pequeño tamaño sólo podrían unirse a unas pocas células, mientras que las perlas más grandes podrían unirse a muchas. En ciertas disposiciones, la relación de células a partículas varía de 1:100 a 100:1 y cualquier valor entero intermedio y, en disposiciones adicionales, la relación comprende de 1:9 a 9:1 y cualquier valor entero intermedio, también se puede usar para estimular las células T. La relación de partículas acopladas anti-CD4 y anti-CD28 a células T que dan como resultado la estimulación de las células T puede variar como se ha indicado anteriormente, sin embargo, ciertos valores preferidos incluyen 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1,6:1,7:1,8:1,9:1, 10:1 y 15:1 siendo una relación preferida al menos 1:1 partículas por célula T. En una disposición, se usa una relación de partículas a células de 1:1 o menos. En una disposición particular, una relación preferida de partícula:célula es 1:5. En disposiciones adicionales, la relación de partículas a células puede variarse dependiendo del día de la estimulación. Por ejemplo, en una disposición, la relación de partículas a células es de 1:1 a 10:1 el primer día y se añaden partículas adicionales a las células cada día o cada dos días después durante hasta 10 días, en relaciones finales de 1:1 a 1:10 (basadas en los recuentos celulares el día de la adición). En una disposición particular, la relación de partículas a células es 1:1 el primer día de estimulación y se ajusta a 1:5 el tercer y quinto días de estimulación. En una disposición, las partículas se añaden diariamente o en días alternos hasta una relación final de 1:1 en el primer día, y 1:5 en el tercer y quinto días de estimulación. En una disposición, la relación de partículas a células es 2:1 el primer día de estimulación y se ajusta a 1:10 el tercer y quinto días de estimulación. En una disposición, las partículas se añaden diariamente o en días alternos hasta una relación final de 1:1 en el primer día, y 1:10 en el tercer y quinto días de estimulación. Un experto en la técnica apreciará que puede ser adecuada una variedad de otras relaciones para su uso en la presente divulgación. En particular, las relaciones variarán dependiendo del tamaño de partícula y del tamaño y tipo de célula. En una disposición, las relaciones más típicas para su uso están en las proximidades de 1:1,2:1 y 3:1 en el primer día.

En disposiciones adicionales de la presente divulgación, las células, tales como células T, se combinan con perlas recubiertas con agente, las perlas y las células se separan posteriormente, y después las células se cultivan. En una disposición alternativa, antes del cultivo, las perlas recubiertas con agente y las células no se separan, sino que se cultivan juntas. En una disposición adicional, las perlas y las células se concentran primero mediante la aplicación de una fuerza, tal como una fuerza magnética, dando como resultado una mayor ligación de marcadores de superficie celular, induciendo de ese modo la estimulación celular.

Preparación de células CoStAR

Se pueden usar herramientas de ingeniería genética basadas o no en virus para generar células T CoStAR, dando como resultado la expresión permanente o transitoria de genes terapéuticos. La administración de genes basada en retrovirus es una tecnología madura bien caracterizada, que se ha usado para integrar permanentemente CAR en el genoma de la célula huésped (Scholler J., por ejemplo, Decadein-long safety and function of retroviral-modified chimeric antigen receptor T cells. Sci. Transí. Med. 2012;4:132ra53; Rosenberg S.A. et al., Gene transfer into humansimmunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. N. Engl. J. Med. 1990;323:570-578).

También se pueden usar métodos de transfección de ADN no virales. Por ejemplo, Singh et al describe el uso del sistema de transposones Sleeping Beauty (SB) desarrollado para diseñar por ingeniería células T CAR (Singh H., et al., Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 2008; 68:2961-2971) y se está usando en ensayos clínicos (véase, por ejemplo, ClinicalTrials.gov: NCT00968760 y NCT01653717). La misma tecnología es aplicable para diseñar por ingeniería células CoStAR.

Se han usado múltiples enzimas SB para administrar transgenes. Mátés describe una transposasa hiperactiva (SB100X) con una mejora de eficiencia de aproximadamente 100 veces en comparación con la transposasa de primera generación. SB100X soportó un 35-50 % de transferencia de genes estable en células CD34(+) humanas enriquecidas en células madre o progenitoras hematopoyéticas. (Mátés L. et al., Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat. Genet. 2009;41:753-761) y múltiples transgenes pueden ser administrados a partir de plásmidos únicos multicistrónicos (por ejemplo, Thokala R. et al., Redirecting specificity of T cells using the Sleeping Beauty system to express chimeric antigen receptors by mix-andmatching of VL and VH domains targeting CD123+ tumors. PLoS ONE. 2016;11:e0159477) o plásmidos múltiples (por ejemplo, Huthon L.V. et al., Tethered IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2016; 113: E7788-E7797). Tales sistemas se usan con los CoStAR de la invención.

Morita et al., describe el sistema de transposones piggyBac para integrar transgenes más grandes (Morita D. et al., Enhanced expression of anti-CD19 chimeric antigen receptor inpiggyBactransposon-engineered T cells. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2017; 8:131-140). Nakazawa et al. describe el uso del sistema para generar células T citotóxicas específicas de EBV que expresan el receptor de antígeno quimérico específico de HER2 (Nakazawa Y et al, PiggyBacmediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor. Mol. Ther. 2011;19:2133-2143). Manuri et al usaron el sistema para generar células T específicas de CD-19 (Manuri P.V.R. et al., piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-line malignancies. Hum. Gene Ther. 2010; 21: 427-437).

La tecnología de transposones es fácil y económica. Un inconveniente potencial es que los protocolos de expansión más largos empleados actualmente pueden dar como resultado la diferenciación de células T, la actividad deteriorada y la pobre persistencia de las células infundidas. Monjezi et al describen el desarrollo de vectores minicírculo que minimizan estas dificultades a través de integraciones de mayor eficiencia (Monjezi R. et al., Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors. Leukemia. 2017; 31: 186-194). Estas tecnologías de transposones se pueden usar para los CoStAR de la invención.

Composiciones farmacéuticas

La presente divulgación también se refiere a una composición farmacéutica que contiene un vector o una célula que expresa CoStAR de la divulgación junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales.

En algunas disposiciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un CoStAR descrito anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas disposiciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que codifica un CoStAR según cualquiera de las disposiciones descritas anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas disposiciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una célula efectora que expresa un CoStAR descrito anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dicha formulación puede, por ejemplo, estar en una forma adecuada para infusión intravenosa.

Como se usa en la presente memoria, por "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente compatible" se entiende un material que no es indeseable biológicamente o de otro modo, por ejemplo, el material puede incorporarse en una composición farmacéutica para administrarse a un paciente sin provocar ningún efecto biológico indeseable significativo o interactuar de una manera perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composición en donde está contenido. Los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables han cumplido preferiblemente los estándares requeridos de prueba toxicológica y de fabricación y/o se incluyen en la Guía de Ingredientes Inactivos preparada por la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos.

Un aspecto de la invención proporciona una población de células T modificadas que expresan un CoStAR recombinante. Una población adecuada puede producirse mediante un método descrito anteriormente.

La población de células T modificadas puede ser para su uso como medicamento. Por ejemplo, una población de células T modificadas como se describe en la presente memoria puede usarse en terapia de inmunoterapia para el cáncer, por ejemplo, terapia adoptiva de células T.

Otras disposiciones proporcionan el uso de una población de células T modificadas como se describe en la presente memoria para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, una población de células T modificadas como se describe en la presente memoria para el tratamiento del cáncer, y un método de tratamiento del cáncer (no reivindicado) puede comprender administrar una población de células T modificadas como se describe en la presente memoria a un individuo que lo necesita.

La población de células T modificadas puede ser autóloga, es decir, las células T modificadas se obtuvieron originalmente del mismo individuo al que se administran posteriormente (es decir, el individuo donante y receptor son el mismo). Una población adecuada de células T modificadas para la administración al individuo puede producirse mediante un método que comprende proporcionar una población inicial de células T obtenidas del individuo, modificar las células T para expresar una PDE de AMPc o un fragmento de la misma y un receptor de antígeno que se une específicamente a células cancerosas en el individuo, y cultivar las células T modificadas.

La población de células T modificadas puede ser alogénica, es decir, las células T modificadas se obtuvieron originalmente de un individuo diferente al individuo al que se administran posteriormente (es decir, el individuo donante y receptor son diferentes). Los individuos donantes y receptores pueden ser HLA coincidentes para evitar la GVHD y otros efectos inmunitarios indeseables. Una población adecuada de células T modificadas para la administración a un individuo receptor puede producirse mediante un método que comprende proporcionar una población inicial de células T obtenidas de un individuo donante, modificar las células T para expresar un CoStAR que se une específicamente a células cancerosas en el individuo receptor, y cultivar las células T modificadas.

Después de la administración (no reivindicada) de las células T modificadas, el individuo receptor puede exhibir una respuesta inmune mediada por células T contra células cancerosas en el individuo receptor. Esto puede tener un efecto beneficioso sobre la afección cancerosa en el individuo.

Las afecciones cancerosas pueden caracterizarse por la proliferación anormal de células cancerosas malignas y pueden incluir leucemias, tales como AML, CML, ALL y CLL, linfomas, tales como linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin y mieloma múltiple, y cánceres sólidos tales como sarcomas, cáncer de piel, melanoma, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello, cáncer esofágico, cáncer de páncreas, cáncer renal, cáncer adrenal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de la vesícula biliar y los tractos biliares, cáncer de tiroides, cáncer de timo, cáncer de hueso y cáncer cerebral, así como cáncer de primario desconocido (CUP).

Las células cancerosas en un individuo, pueden ser inmunológicamente distintas de las células somáticas normales en el individuo (es decir, el tumor canceroso puede ser inmunogénico). Por ejemplo, las células cancerosas pueden ser capaces de incitar una respuesta inmune sistémica en el individuo contra uno o más antígenos expresados por las células cancerosas. Los antígenos tumorales que incitan la respuesta inmunitaria pueden ser específicos para células cancerosas o pueden compartirse por una o más células normales en el individuo.

Un individuo adecuado para el tratamiento como se ha descrito anteriormente puede ser un mamífero, tal como un roedor (por ejemplo, una cobaya, un hámster, una rata, un ratón), murino (por ejemplo, un ratón), canino (por ejemplo, un perro), felino (por ejemplo, un gato), equino (por ejemplo, un caballo), un primate, simio (por ejemplo, un mono o simio), un mono (por ejemplo, tití, babuino), un simio (por ejemplo, gorila, chimpancé, orangután, gibón) o un ser humano.

En disposiciones preferidas, el individuo es un ser humano. En otras disposiciones preferidas, se pueden emplear mamíferos no humanos, especialmente mamíferos que se usan convencionalmente como modelos para demostrar la eficacia terapéutica en seres humanos (por ejemplo, animales murinos, primates, porcinos, caninos o conejos).

Método de tratamiento

La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un CoStAR o una composición que comprende un CoStAR como se divulga en la presente memoria, efectiva para "tratar" una enfermedad o trastorno en un individuo. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva de un CoStAR o composición que comprende un CoStAR como se divulga en la presente puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño o peso del tumor; inhibir (es decir, ralentizar en algún grado y preferentemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en algún grado y preferentemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, en algún grado, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en algún grado uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En la medida en que un CoStAR o composición que comprende un CoStAR como se divulga en la presente memoria puede prevenir el crecimiento y/o matar células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. En algunas disposiciones, la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad inhibidora del crecimiento. En algunas disposiciones, la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad que mejora la supervivencia libre de progresión de un paciente. En el caso de una enfermedad infecciosa, tal como una infección viral, la cantidad terapéuticamente efectiva de un CoStAR o una composición que comprende un CoStAR, como se divulga en la presente memoria, puede reducir el número de células infectadas por el patógeno; reducir la producción o liberación de antígenos derivados de patógenos; inhibir (es decir, ralentizar en algún grado y preferentemente detener) la propagación del patógeno a células no infectadas; y/o aliviar en algún grado uno o más síntomas asociados con la infección. En algunas disposiciones, la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad que extiende la supervivencia de un paciente.

Las células, incluyendo células T y NK, que expresan CoStAR para su uso en los métodos de la presente divulgación pueden crearse ex vivo a partir de sangre periférica propia de un paciente (autóloga), o en el contexto de un trasplante de células madre hematopoyéticas a partir de sangre periférica de donante (alogénica), o sangre periférica de un donante no conectado (alogénica). Alternativamente, las células T o las células NK pueden derivarse de la diferenciación ex vivo de células progenitoras inducibles o células progenitoras embrionarias a células T o células NK. En estos casos, las células T que expresan un CoStAR y, opcionalmente, un CAR y/o TCR, se generan introduciendo ADN o ARN que codifica el CoStAR y, opcionalmente, un CAR y/o TCR, por uno de muchos medios que incluyen la transducción con un vector viral, la transfección con ADN o ARN.

Las células T o NK que expresan un CoStAR de la presente invención y, opcionalmente, que expresan un TCR y/o CAR pueden usarse para el tratamiento de cánceres hematológicos o tumores sólidos.

Un método para el tratamiento de una enfermedad (no reivindicado) se refiere al uso terapéutico de un vector o célula, incluyendo una célula T o NK, de la invención. A este respecto, el vector, o célula T o NK puede administrarse a un sujeto que tiene una enfermedad o afección existente con el fin de disminuir, reducir o mejorar al menos un síntoma asociado con la enfermedad y/o ralentizar, reducir o bloquear la progresión de la enfermedad. El método puede causar o promover la destrucción mediada por células T de células cancerosas. El vector, o célula T o NK según la presente divulgación puede administrarse (no reivindicado) a un paciente con uno o más agentes terapéuticos adicionales. El uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden coadministrarse al paciente. Por "coadministrar" se entiende administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales y el vector, o célula T o NK de la presente invención lo suficientemente cerca en el tiempo como para que el vector, o célula T o NK pueda mejorar el efecto de uno o más agentes terapéuticos adicionales, o viceversa. A este respecto, los vectores o células pueden administrarse en primer lugar y el uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse en segundo lugar, o viceversa. Alternativamente, los vectores o células y el uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse simultáneamente. Un agente terapéutico coadministrado que puede ser útil es la IL-2, ya que actualmente se usa en terapias celulares existentes para reforzar la actividad de las células administradas. Sin embargo, el tratamiento con IL-2 está asociado con problemas de toxicidad y tolerabilidad.

Como se ha mencionado, para la administración a un paciente, las células efectoras CoStAR pueden ser alogénicas o autólogas para el paciente. En ciertas disposiciones, las células alogénicas se modifican genéticamente adicionalmente, por ejemplo, mediante edición génica, para minimizar o prevenir la GVHD y/o la respuesta inmunitaria de un paciente contra las células CoStAR.

Las células efectoras CoStAR se usan para tratar cánceres y enfermedades neoplásicas asociadas con un antígeno diana. Los cánceres y enfermedades neoplásicas que pueden tratarse usando cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria incluyen tumores que no están vascularizados, o todavía no están sustancialmente vascularizados, así como tumores vascularizados. Los cánceres pueden comprender tumores no sólidos (tales como tumores hematológicos, por ejemplo, leucemias y linfomas) o pueden comprender tumores sólidos. Los tipos de cánceres a tratar con las células efectoras CoStAR de la invención incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, blastoma y sarcoma, y ciertas leucemias o neoplasias linfoides, tumores benignos y malignos y malignidades, por ejemplo, sarcomas, carcinomas, y melanomas. También se incluyen tumores/cánceres de adultos y tumores/cánceres pediátricos.

Los cánceres hematológicos son cánceres de la sangre o de la médula ósea. Los ejemplos de cánceres hematológicos (o hematógenos) incluyen leucemias, incluyendo leucemias agudas (tales como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda y mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), leucemias crónicas (tales como leucemia mielocítica crónica (granulocítica), leucemia mielógena crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin (formas indolentes y de alto grado), mieloma múltiple, plasmacitoma, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada, síndrome mielodisplásico, leucemia de células pilosas y mielodisplasia.

Los tumores sólidos son masas anormales de tejido que normalmente no contienen quistes o áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. Diferentes tipos de tumores sólidos se denominan por el tipo de células que los forman (tales como sarcomas, carcinomas y linfomas). Los ejemplos de tumores sólidos, tales como sarcomas y carcinomas, incluyen carcinoma adrenocortical, colangiocarcinoma, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, osteosarcoma y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma carcinoma de colon, cáncer de estómago, neoplasia linfoide, cáncer pancreático, cáncer de mama, cánceres de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándula sudorípara, cáncer de tiroides (por ejemplo, carcinoma medular de tiroides y carcinoma papilar de tiroides), carcinoma de glándula sebácea de feocromocitomas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de conductos biliares, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino (por ejemplo, carcinoma de cuello uterino y displasia de cuello uterino preinvasiva), cáncer colorrectal, cáncer de ano, canal anal o ano-recto, cáncer vaginal, cáncer de la vulva (por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma intraepitelial, adenocarcinoma y fibrosarcoma), cáncer de pene, cáncer orofaríngeo, cáncer esofágico, cánceres de cabeza (por ejemplo, carcinoma de células escamosas), cánceres de cuello (por ejemplo, carcinoma de células escamosas), cáncer testicular (por ejemplo, seminoma, teratoma, carcinoma embrionario, teratocarcinoma, coriocarcinoma, sarcoma, tumor de células de Leydig, fibroma, fibroadenoma, tumores adenomatoides y lipoma), carcinoma de vejiga, cáncer de riñón, melanoma, cáncer del útero (por ejemplo, carcinoma endometrial), cánceres uroteliales (por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células transicionales, adenocarcinoma, cáncer de uréter y cáncer de vejiga urinaria), y tumores del SNC (tales como un glioma (tal como glioma del tallo cerebral y gliomas mixtos), glioblastoma (también conocido como glioblastoma multiforme), astrocitoma, linfoma del SNC, germinoma, meduloblastoma, Schwannoma craniofariogioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma y metástasis cerebrales).

Cuando se indica "una cantidad inmunológicamente efectiva", "una cantidad antitumoral efectiva", "una cantidad efectiva inhibidora del tumor" o "cantidad terapéutica", la cantidad precisa de las composiciones de la presente invención que se van a administrar (no reivindicado) puede ser determinada por un médico teniendo en cuenta las diferencias individuales en edad, peso, tamaño del tumor, grado de infección o metástasis y estado del paciente (sujeto). Generalmente, se puede afirmar que una composición farmacéutica que comprende las células T descritas en la presente memoria se puede administrar en una dosificación de 104109 células/kg de peso corporal, en algunos casos 105106 células/kg de peso corporal, incluyendo todos los valores enteros dentro de esos intervalos. Las composiciones de células T también se pueden administrar múltiples veces a estas dosificaciones. Las células pueden administrarse usando técnicas de infusión que se conocen comúnmente en inmunoterapia (véase, por ejemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988).

Terapias de combinación

Una célula que expresa CoStAR descrita en la presente memoria puede usarse en combinación con otros agentes y terapias conocidos. Administrado "en combinación", como se usa en la presente memoria, significa que se administran dos (o más) tratamientos diferentes al sujeto durante el curso de la afección del sujeto con el trastorno, por ejemplo, los dos o más tratamientos se administran después de que el sujeto haya sido diagnosticado con el trastorno y antes de que el trastorno se haya curado o eliminado o el tratamiento haya cesado por otras razones. En algunas disposiciones (no reivindicadas), la administración de un tratamiento todavía se está produciendo cuando comienza la administración del segundo, de modo que hay solapamiento en términos de administración. Esto se denomina a veces en la presente memoria "administración simultánea" o "concurrente". En otras disposiciones (no reivindicadas), la administración de un tratamiento finaliza antes de que comience la administración del otro tratamiento. En algunas disposiciones (no reivindicadas) de cualquier caso, el tratamiento es más efectivo debido a la administración combinada. Por ejemplo, el segundo tratamiento es más efectivo, por ejemplo, se observa un efecto equivalente con menos del segundo tratamiento, o el segundo tratamiento reduce los síntomas en mayor medida, que lo que se vería si el segundo tratamiento se administrara en ausencia del primer tratamiento, o la situación análoga se observa con el primer tratamiento. En algunas disposiciones (no reivindicadas), la administración es tal que la reducción en un síntoma, u otro parámetro relacionado con el trastorno es mayor que lo que se observaría con un tratamiento administrado en ausencia del otro. El efecto de los dos tratamientos puede ser parcialmente aditivo, totalmente aditivo o mayor que aditivo. La administración puede ser tal que un efecto del primer tratamiento administrado sea aún detectable cuando se administra el segundo.

Una célula que expresa CoStAR descrita en la presente memoria y el al menos un agente terapéutico adicional pueden administrarse (no reivindicado) simultáneamente, en la misma o en composiciones separadas, o secuencialmente. Para la administración secuencial (no reivindicada), la célula que expresa CAR descrita en la presente memoria puede administrarse en primer lugar, y el agente adicional puede administrarse en segundo lugar, o el orden de administración puede invertirse.

La terapia con CoStAR y/u otros agentes terapéuticos, procedimientos o modalidades pueden administrarse (no reivindicados) durante períodos de trastorno activo, o durante un período de remisión o enfermedad menos activa. La terapia con CoStAR se puede administrar (no reivindicado) antes del otro tratamiento, concurrentemente con el tratamiento, después del tratamiento, o durante la remisión del trastorno.

Cuando se administran en combinación (no reivindicado), la terapia y el agente adicional (por ejemplo, segundo o tercer agente), o todos, se pueden administrar en una cantidad o dosis que es mayor, menor o igual que la cantidad o dosificación de cada agente usado individualmente, por ejemplo, como monoterapia. En ciertas disposiciones (no reivindicadas), la cantidad o dosificación administrada de la terapia con CoStAR, el agente adicional (por ejemplo, segundo o tercer agente), o todos, es menor (por ejemplo, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, o al menos un 50 %) que la cantidad o dosificación de cada agente usado individualmente, por ejemplo, como monoterapia. En otras disposiciones (no reivindicadas), la cantidad o dosificación de la terapia con CoStAR, el agente adicional (por ejemplo, segundo o tercer agente), o todos, que da como resultado un efecto deseado (por ejemplo, tratamiento del cáncer) es menor (por ejemplo, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, o al menos un 50 % menor) que la cantidad o dosificación de cada agente usado individualmente, por ejemplo, como monoterapia, requerida para lograr el mismo efecto terapéutico.

En disposiciones adicionales, una célula que expresa CoStAR descrita en la presente memoria puede usarse en un régimen de tratamiento (no reivindicado) en combinación con cirugía, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias de anticuerpos, citoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación, vacuna peptídica, tal como la descrita en Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971.

En ciertos casos, los compuestos de la presente invención se combinan con otros agentes terapéuticos, tales como otros agentes anticancerosos, agentes antialérgicos, agentes antináusea (o antieméticos), aliviadores del dolor, agentes citoprotectores y combinaciones de los mismos.

En una disposición, una célula que expresa CoStAR descrita en la presente memoria puede usarse en combinación con un agente quimioterapéutico. Los agentes quimioterapéuticos ejemplares incluyen una antraciclina (por ejemplo, doxorrubicina (por ejemplo, doxorrubicina liposomal)), un alcaloide de vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina), un agente alquilante (por ejemplo, ciclofosfamida, decarbazina, melfalán, ifosfamida, temozolomida), un anticuerpo de células inmunitarias (por ejemplo, alemtuzamab, gemtuzumab, rituximab, ofatumumab, tositumomab, brentuximab), un antimetabolito (incluyendo, por ejemplo, antagonistas del ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de adenosina desaminasa (por ejemplo, fludarabina)), un inhibidor de mTOR, un agonista de la proteína relacionada con el TNFR inducida por glucocorticoides (GITR), un inhibidor del proteasoma (por ejemplo, aclacinomicina A, gliotoxina o bortezomib), un inmunomodulador tal como talidomida o un derivado de talidomida (por ejemplo, lenalidomida).

Los agentes quimioterapéuticos generales considerados para su uso en terapias de combinación incluyen busulfán (Myleran®), inyección de busulfán (Busulfex®), cladribina (Leustatin®), ciclofosfamida (Cytoxan)® o Neosar®), citarabina, arabinósido de citosina (Cytosar-U®), inyección de liposomas de citarabina (DepoCyt®), hidrocloruro de daunorrubicina (Cerubidine®), inyección de liposomas de citrato de daunorrubicina (DaunoXome®), dexametasona, hidrocloruro de doxorrubicina (Adriamicina®, Rubex®), etopósido (Vepesid®), fosfato de fludarabina (Fludara®), hidroxiurea (Hydrea®), Idarrubicina (Idamicina®), mitoxantrona (Novantrone®), Gemtuzumab Ozogamicina (mylotarg®).

Los agentes quimioterapéuticos generales considerados para su uso en terapias de combinación incluyen anastrozol (Arimidex®), bicalutamida (Casodex®), sulfato de bleomicina (Blenoxano®), busulfán (Myleran®), inyección de busulfán (Busulfex®), capecitabina (Xeloda®), N4-pentoxicarbonil-5-desoxi-5-fluorocitidina, carboplatino (Paraplatino®), carmustina (BiCNU®), clorambucilo (Leukeran®), cisplatino (Platinol®), cladribina (Leustatina®), ciclofosfamida (Cytoxan® o Neosar®), citarabina, arabinósido de citosina (Cytosar-U®), inyección de liposomas de citarabina (DepoCyt®), dacarbazina (DTIC-Dome®), dactinomicina (Actinomicina D, Cosmegan), hidrocloruro de daunorrubicina (Cerubidina®), inyección de liposomas de citrato de daunorrubicina (DaunoXome®), dexametasona, docetaxel (Taxotere®), hidrocloruro de doxorrubicina (Adriamicina®, Rubex®), etopósido (Vepesid®), fosfato de fludarabina (Fludara®), 5-fluorouracilo (Adrucilo®, Efudex®), flutamida (Eulexina®), tezacitibina, gemcitabina (difluorodesoxicitidina), hidroxiurea (Hydrea®), Idarrubicina (Idamicina®), ifosfamida (IFEX®), irinotecán (Camptosar®), L-asparaginasa (ELSPAR®), leucovorina cálcica, melfalán (Alkeran®), 6-mercaptopurina (Purinatol®), metotrexato (Folex®), mitoxantrona (Novantrona®), mylotarg, paclitaxel (Taxol®), fénix (Itrio90/MX-DTPA), pentostatina, polifeprosán 20 con implante de carmustina (Gliadel®), citrato de tamoxifeno (Nolvadex®), tenipósido (Vumon®), 6-tioguanina, tiotepa, tirapazamina (Tirazona®), hidrocloruro de topotecán para inyección (Hycamptin)®), vinblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®), y vinorelbina (Navelbine®).

Los tratamientos pueden evaluarse, por ejemplo, mediante regresión del tumor, reducción del peso o tamaño del tumor, tiempo hasta la progresión, duración de la supervivencia, supervivencia libre de progresión, tasa de respuesta global, duración de la respuesta, calidad de vida, expresión y/o actividad de proteínas. Se pueden emplear enfoques para determinar la eficacia de la terapia, incluyendo, por ejemplo, la medición de la respuesta a través de la imagenología radiológica.

Ejemplos

Ejemplo 1- Producción de células T que expresan CoStAR

Materiales y métodos

Diseño de la construcción - El CoStAR MFE23 consiste en una secuencia de nucleótidos de fragmento de anticuerpo monocatenario derivado de MFE23 con una secuencia líder de oncostatina M1 fusionada a la secuencia de ácido nucleico completa de CD28 humano. La secuencia de nucleótidos de CoStAR se optimizó por codones y el gen se sintetizó por Genewiz Inc. Las construcciones se clonaron en pSF.Lenti (Oxford Genetics) a través de un sitio XbaI y NheI.

Producción lentiviral - La producción lentiviral se realizó usando un sistema de empaquetado de tres plásmidos (Cell Biolabs, San Diego, EE. UU.) mezclando 10 pg de cada plásmido, más 10 pg del plásmido lentiviral pSF.Lenti que contenía el transgén, juntos en RPMI sin suero que contenía CaCl<2>50 mM. La mezcla se añadió gota a gota a una monocapa confluente al 50 % de células 293T en matraces de 75 cm2. Los sobrenadantes virales se recogieron 48 y 72 h después de la transfección, se reunieron y se concentraron usando una solución de concentración de sobrenadante lentiviral LentiPac (GeneCopoeia, Rockville, Maryland, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Los sobrenadantes lentivirales se concentraron 10 veces y se usaron para infectar directamente células T humanas primarias en presencia de 4 pg/ml de polibreno (Sigma-Aldrich, Dorset, Reino Unido). Se aislaron células mononucleares de sangre periférica de donantes sanos normales antes de la activación durante 24 horas con perlas de activación y expansión de células T (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante antes de la adición de sobrenadantes lentivirales.

La transducción celular se evaluó 96 horas después de la infección usando proteína CEA.hFc y anti-hFc-PE secundario, más anti-CD34-APC o por anticuerpos anti-CD34-PE solos. Las células se expandieron después adicionalmente usando alimentadores de PBMC irradiados con emparejamiento erróneo de donantes x10 a una relación 1:20-1:200 en RPMI FCS al 10 % con la adición de 1 pg/ml de PHA y 200 UI/ml de IL-2. Después de 14 días, las células se tiñeron como antes y se almacenaron listas para el ensayo.

Los ensayos de funcionalidad se realizaron mezclando células positivas o negativas para CoStAR con células LoVo o LS174T positivas para CEA de tipo silvestre o diseñadas por ingeniería con OKT3. Brevemente, las células T se mezclaron con células LoVo en proporciones variables en placas de 96 pocillos y se midió IFNy o IL-2 mediante ELISA. Las células restantes se incubaron con una dilución 1:10 de reactivo WST-1 (Sigma, Reino Unido) durante 30 min antes de la lectura de absorbancia a 450 nm. El % de citotoxicidad se determinó usando la siguiente ecuación = 100 -((lectura experimental - células T solas) / (tumor solo)) x 100.

Los ensayos de proliferación se realizaron cargando primero las células T con colorante de proliferación eFluor450 10 pM (eBioscience, Reino Unido) durante 10 min a 37 °C a una concentración de 1 x107 células/ml antes de incubar las células en 5 volúmenes de medio de células T frío durante 5 min en hielo. Las células se lavaron entonces excesivamente para eliminar el colorante no unido y se añadieron a cocultivos que contenían células tumorales. Las células se retiraron a los 2, 6 y 10 días, se añadió una dilución 1:200 de DRAQ7 y las células se analizaron usando un citómetro MACSQuant y el software MACSQuantify.

Los recuentos celulares para los ensayos de proliferación se realizaron tomando células de los pocillos y tiñendo con anticuerpo anti-CD2 PerCP eFluor710 (eBioscience, Reino Unido) durante 20 min en la oscuridad, seguido de tinción con DRAQ7 y los recuentos se realizaron usando un analizador MACSQuant.

Resultados - Se aislaron células T humanas primarias a partir de capas leucocitarias obtenidas de NHSBT. Las células T se aislaron mediante kits de aislamiento mediado por Ficoll y de aislamiento negativo de células T (StemCell Technologies). Las células T aisladas se activaron con perlas de activación y expansión de células T humanas (Invitrogen, Reino Unido). Las células se incubaron con partículas lentivirales concentradas y se expandieron durante varios días. El lentivirus contenía la secuencia de ADN de la construcción MFE.CoStAR.2A.tCD34 (MFE23.scFv fusionada a CD28 humano de longitud completa coexpresada con CD34 humano truncado a través de una secuencia de escisión 2A). Las células transducidas con éxito se expandieron adicionalmente usando alimentadores irradiados como se indica en materiales y métodos. La transducción del donante 1 se midió al 22,69 % (17,15 de CD34+/CoStAR+ más 5,53 % de CD34-/CoStAR+), el donante 2 se midió al 20,73 % y el donante 3 al 13,34 %. Las células se enriquecieron para la expresión de CoStAR usando anticuerpos anti-CD34 para obtener poblaciones de células T mayores del 90 % de positivas para CoStAR.

Para generar un modelo in vitro fisiológicamente relevante para ensayar el impacto de CoStAR sobre la actividad de las células T, se ensayaron las células no transducidas y transducidas frente a las líneas celulares tumorales CEA+ LoVo y LS174T. Para permitir la activación de las células T en respuesta a las líneas tumorales no coincidentes, diseñamos por ingeniería las células tumorales para expresar un fragmento de anticuerpo monocatenario anti-CD3 anclado a la membrana celular por medio de un dominio transmembrana sintético y dividido del gen marcador de GFP usando un elemento IRES para visualizar las células transducidas usando citometría de flujo.

Se generaron clones de células individuales de LoVo y LS174T a partir de transfectantes a granel. Se mezclaron células T transducidas con CoStAR y no transducidas a relaciones efector:diana variables con células LS174T o LoVo no transducidas de tipo silvestre o modificadas con OKT3. Después de 24 horas, se tomó medio de cocultivo para la medición por ELISA de IL-2. Se observó secreción de IL-2 dependiente de la activación a partir de poblaciones de células T tanto CoStAR+ como CoStAR- de tres donantes en respuesta a células LS174T modificadas por ingeniería con OKT3 con solo secreción de IL-2 de fondo observada a partir de células T transducidas y no transducidas en respuesta a células tumorales no modificadas por ingeniería (Fig. 3 A-C). Se encontró secreción de IL-2 potenciada por CoStAR hacia células tumorales modificadas por ingeniería con OKT3 en los tres donantes ensayados. El efecto fue más evidente a relaciones E:T de 8:1 y 16:1 y a relaciones E:T más altas, la secreción de IL-2 fue demasiado baja para medirla con precisión. A relaciones más bajas de efector a diana parecía que la secreción de IL-2 era saturante de células no transducidas. Estas observaciones se repitieron en células LoVo con dos de los tres donantes ensayados contra LS174T con resultados similares (Fig. 3D y E).

Para determinar el impacto de CoStAR sobre la expansión de células T, se mezclaron células T transducidas o no transducidas con células LoVo de tipo silvestre o modificadas con OKT3-GFP, se contó el número de células totales después de 3 días. CoStAR potenció la supervivencia y/o proliferación de células T modificadas por ingeniería en respuesta a LoVo-OKT3, pero no células LoVo de tipo silvestre en presencia de IL-2 (Fig. 4A) y ausencia de IL-2 (Fig. 4B). Para investigar adicionalmente este fenómeno, se realizó un análisis de proliferación celular en células T de dos donantes usando colorante de proliferación para contar el número de ciclos celulares por los que cada población pasaba durante 6 días (Fig. 4C y D). Una proporción mayor de células diseñadas por ingeniería con CoStAR pasó por 5, 6 o 7 ciclos de proliferación durante 6 días en comparación con células no diseñadas por ingeniería en respuesta a LoVo-OKT3, mientras que las células transducidas y no transducidas con CoStAR pasaron por un promedio de aproximadamente 2 ciclos durante la misma duración en respuesta a LoVo de tipo silvestre.

Se generó una variedad de receptores de fusión que consistían en CD28 fusionado a un dominio coestimulador adicional N-terminal. Se eligieron dominios coestimuladores obtenidos de: CD137, CD2, CD29, CD134, CD150, CD40, GITR y el dominio de señalización de la cadena y del receptor de IL-2 (IL2Ry). Se incluyó un receptor tan cercano posible al usado en estudios previos de coestimulación inducible. Este receptor denominado CD28(IEV) está truncado de manera que el motivo C-terminal de CD28 es la tríada de aminoácidos 'IEV'. Las secuencias se generaron de novo por Genewiz y se clonaron en un vector lentiviral bajo un promotor EF1a junto con un gen marcador CD34 separado del CoStAR de fusión por un péptido autoescindible 2A. Se aislaron células T CD8+ primarias usando perlas EasySep (StemCell Technologies) y se activaron con Dynabeads de activación/expansión anti-CD3/anti-CD28 antes de la adición de partículas lentivirales. Después de un corto período de expansión, las células se mezclaron con células LoVo o LoVo-OKT3, con la inclusión de anticuerpos anti-CD107a y brefeldina y monensina, y después de una incubación de 16 horas se fijaron y tiñeron con anticuerpos para el gen marcador (CD34), así como anticuerpos para IL-2, IFN<y>y bcl-xL. El análisis se realizó usando un analizador MACSQuant y software MACSQuantify. La Fig. 5 muestra la respuesta de IL-2 de CD34- (CoStAR no transducido) y CD34+ (CoStAR transducido). El análisis estadístico demostró que todos los receptores ensayados indujeron un aumento significativo en la proporción de células que producían IL-2 cuando albergaban los receptores CoStAR variantes. Se midieron simultáneamente otras tres lecturas: IFN<y>, una citocina liberada en condiciones normales de la señal 1, pero potenciada por la coestimulación; CD107a, un marcador de desgranulación; y bcl-xL, una proteína antiapoptótica regulada al alza por la coestimulación. El acoplamiento de CoStAR potenció todas las funciones efectoras analizadas en grados variables. Los receptores de las fusiones CD28.CD2 y CD28.CD40 parecían incitar la respuesta más robusta de todos los receptores ensayados (véase la Fig. 6)

Ejemplo 2

Se comparó el efecto de CoStAR basados en CD28 y CD28.CD40 sobre la secreción de citoquinas basada en población. Las células T primarias de tres donantes se transdujeron con el CoStAR con CD28(IEV) truncado, CoStAR CD28 de longitud completa o CoStAR CD28.CD40 (que tiene CD28 de longitud completa como se muestra en la SEQ ID NO. 10, pero careciendo de los residuos N y K del extremo N) o se dejó sin transducir. Las células T se enriquecieron para la expresión de CoStAR usando el gen marcador CD34, y después de la expansión las células se mezclaron con células LoVo-OKT3 y la secreción de IL-2 se analizó por ELISA (véase la Fig. 7). Las células no transducidas produjeron en promedio 0,80 ng/ml de IL-2, con CoStAR CD28(IEV) y CD28 de longitud completa que producen 4,6 y 5,0 ng/ml de IL-2, respectivamente. Sin embargo, CD28.CD40 indujo 29,0 ng/ml de IL-2 de promedio en tres donantes, demostrando así un claro beneficio para incorporar CD40 en el CoStAR básico basado en CD28.

A continuación, se analizó el efecto de CoStAR sobre la expansión de células T. Las células T de siete donantes se transdujeron con CoStAR CD28 o CD28.CD40 con scFv anti-CA125 (196-14) o anti-receptor de folato (MOV-19), o un dominio de unión a antígeno del péptido receptor de anti-folato (C7). Se transdujeron células adicionales con un CoStAR CD28 que albergaba un scFv anti-CEA como control no coincidente. Las células se mezclaron después con la línea celular OvCAR3 CA125+/Receptor de folato+/CEA- diseñada por ingeniería para expresar un OKT3 unido a la membrana (OvCAR-OKT3). Se realizaron recuentos de células T después de 7, 14 y 21 días, y se añadió OvCAR-OKT3 reciente los días 7, y 14. Se observó una expansión limitada de las células que albergaban el scFv anti-CA125 (factor de expansión medio: CD28: 15,1; CD28.CD40: 69,1), sin embargo, las células que se dirigen al receptor de folato con un scFv se expandieron tanto en las cohortes de CD28 como de CD28.CD40 (factor de expansión medio: CD28: 186,7; CD28.CD40: 1.295,0). Se observó una expansión más limitada cuando se usó el péptido C7 para dirigirse al receptor de folato (factor de expansión medio: CD28: 71,5; CD28,CD40: 28,0). El receptor de control dirigido a CEA demostró una expansión limitada (factor de expansión medio: 28,0).

Para comprender mejor la sinergia de la señal 1 y señal 2, las células T se modificaron por ingeniería con un TCR modificado de dominio constante murino que reconoce un péptido de CEA (691-699) en el contexto de HLA-A*02, así como el CoStAR CD28 o CD28.CD40 dirigido hacia la proteína CEA de la superficie celular. Como control, las células también se transdujeron con un CoStAR CD28 específico de CA125. Las células T se mezclaron con células H508 HLA-A*02+/CEA+ y la producción de citocinas se analizó mediante tinción de citometría de flujo intracelular. La selección citométrica de flujo se realizó usando anticuerpos dirigidos hacia el dominio constante de TCRp murino (marca las células modificadas por TCR), así como la etiqueta de epítopo DYKDDDDK (SEQ ID NO: 14) (marca las células modificadas por CoStAR). Por tanto, fue posible analizar las células TCR-/CoStAR-, TCR+/CoStAR-, TCR-/CoStAR+ y TCR+/CoStAR+ en cada pocillo de cocultivo. La producción de citocinas se representó gráficamente después en cada subpoblación en las células T CD4+ o CD8+ (Fig. 9). En células CD4+, el CoStAR CD28.CD40 potenció la producción de CD137 y TNFa por encima de la estimulación de TCR solo, sin embargo, la respuesta de TCR en células CD4+ fue pobre debido a la dependencia del TCR en CD8. En las células CD8+, hubo una actividad efectora más robusta con IL-2 y CD107a, en particular, mostrando una inducción más fuerte en los grupos CoStAR CD28.CD40. Para comparar mejor los receptores, se representó gráficamente la actividad efectora en sólo los grupos TCR+/CoStAR+ en células CD4+ y CD8+ (Fig. 10). En las células CD4+, la inducción de CD137 se potenció significativamente por CD28.CD40 en comparación con CEA o CoStAR CD28 de direccionamiento no coincidente. En las células CD8+, la inducción de CD137 aumentó significativamente en comparación con CEA o CoStAR CD28 dirigido de forma no coincidente, mientras que la inducción de CD107a aumentó en comparación con CoStAR de control. Por tanto, CD28.CD40 muestra una actividad efectora potenciada a lo largo de una amplia gama de modelos y actividades efectoras.

Referencias

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Secuencias

SEQ ID NO: 1: El transcrito de la variante de transcrito de ARNm de CD28 humano completo con el marco de lectura abierto resaltado en negrita.

LOCUS NM_006139 lineal de ARNm de 4.900 pb PRI 07-OCT-2016

DEFINICIÓN molécula de CD28 de Homo sapiens (CD28), variante de transcrito 1, ARNm.

ACCESO NM_006139

ORIGEN

1 taaagtcatc aaaacaacgt tatatcctgt gtgaaatgct gcagtcagga tgccttgtgg

61 tUgaglgcc ttgatcalgl gccctaaggg gatggtggcg gtggtggtgg ccgtggatga

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2881 gctattggta ttattgccat atagataaat tatgtataaa aattaaactg ggcaatagcc

2941 taagaagggg ggaatattgt aacacaaatt taaacccact acgcagggat gaggtgctat

3001 aatatgagga ccttttaact tccatcattt tcctgtttct tgaaatagtt tatcttgtaa

3061 tgaaatataa ggcacctccc acttttatgt atagaaagag gtcttttaat ttttttttaa

3121 tgtgagaagg aagggaggag taggaatctt gagattccag atcgaaaata ctgtactttg

3181 gttgattttt aagtgggctt ccattccatg gatttaatca gtcccaagaa gatcaaactc

3241 agcagtactt gggtgctgaa gaactgttgg atttaccctg gcacgtgtgc cacttgccag

3301 cttctlgggc acacagagll cltcaalcca agtlatcaga Itglatllga aaatgacaga

3361 gclggagagt ttltlgaaal ggcaglggca aataaataaa lacllUtlt laaalggaaa

3421 gacttgatct atggtaataa atgattttgt tttctgactg gaaaaatagg cctactaaag

3481 atgaatcaca cttgagatgt ttcttactca ctctgcacag aaacaaagaa gaaatgttat

3541 acagggaagl ccgtltlcac tatlaglalg aaccaagaaa íggltcaaaa acaglgglag

3601 gagcaatgct ttcatagttt cagatatggt agttatgaag aaaacaatgt catttgctgc

3661 tattattgta agagtcttat aattaatggt actcctataa tttttgattg tgagctcacc

3721 tatttgggtt aagcatgcca atttaaagag accaagtgta tgtacattat gttctacata

3781 llcagtgala aaatlaclaa aclaclatal glclgcltla aatUgíact tlaalaltgt

3841 cuilgglal taagaaagal atgclUcag aatagalatg ctlcgcttlg gcaaggaatl

3901 Iggatagaac Ugctattla aaagaggtgt ggggtaaatc cltgtataaa Lclccagttt

3961 agcctttttt gaaaaagcta gactttcaaa tactaatttc acttcaagca gggtacgttt

4021 ctggtttgtt tgcttgactt cagtcacaat ttcttatcag accaatggct gacctctttg

4081 agalgtcagg claggcltac ctatgtgtlc Igtglcatgl gaatgctgag aagtltgaca

4141 gagatccaac tlcagccttg accccatcag tccctcgggt laaclaactg agccaccggl

4201 cctcatggct attttaatga gggtattgat ggttaaatgc atgtctgatc ccttatccca

4261 gccatttgca ctgccagctg ggaactatac cagacctgga tactgatccc aaagtgttaa

4321 atlcaactac algctggaga tlagagalgg Igccaataaa ggacccagaa ccaggatcll

4381 gallgctata gactlaltaa laatccaggt caaagagagl gacacacacl ctclcaagac

4441 ctggggtgag ggagtctgtg ttatctgcaa ggccatttga ggctcagaaa gtctctcttt

4501 cctatagata tatgcatact ttctgacata taggaatgta tcaggaatac tcaaccatca

4561 caggcatgtt cctacctcag ggcctttaca tgtcctgttt actctgtcta gaatgtcctt

4621 ctgtagatga cctggcttgc ctcgtcaccc ttcaggtcct tgctcaagtg tcatcttctc

4681 ccclagtlaa actaccccac accctglclg ctttccllgc UaltlUct ccatagcall

4741 ttaccatctc ttacattaga catttttctt atttatttgt agtttataag cttcatgagg

4801 caagtaactt tgctttgttt cttgctgtat ctccagtgcc cagagcagtg cctggtatat

4861 aataaatatt tattgactga gtgaaaaaaa aaaaaaaaaa'/

SEQ ID NO: 2: La secuencia de la proteína CD28 humana con:

I. el péptido señal resaltado en negrita (este puede delecionarse de la secuencia cuando se usa según la invención); y

II. la región transmembrana subrayada; y

III. la región extracelular se encuentra entre el péptido señal y la región transmembrana y las regiones citoplásmicas siguen la región transmembrana; y

IV. la región en recuadro representa los primeros 5 aminoácidos de la proteína madura que pueden estar presentes o ausentes o mutados en cualquier aspecto de esta invención. Además, 1, 2, 3, 4 o 5 de estos restos (es decir, N, K, I, L o V) pueden delecionrse de la secuencia cuando se usan según la invención.

M LRLLLALNLFPSIQVTG|NKILV|KQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLH KGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYF CKIEVMYPPPYLDNEKSNGT11HVKGKJTLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLL VTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYOPYAPPRDFAAYRS

Las SEQ ID NO: 3 a 12 siguientes son secuencias ejemplares de dominios de señalización de CoStAR que pueden fusionarse a la proteína CD28 humana en la región en recuadro de la SEQ ID NO: 2 (que puede o no estar mutada, pero por simplicidad esquemática se ha dejado en su forma original) con:

I. la región doblemente subrayada representa la región derivada de CD28; y

II. la región subrayada es una segunda región derivada de receptor coestimulador; y

III. la secuencia en cursiva es una tercera región derivada de receptor coestimulador.

Obsérvese que la región en recuadro representa los primeros 5 aminoácidos de la proteína CD28 madura que pueden estar presentes o ausentes o mutados en cualquier aspecto de esta invención. Además, 1,2, 3, 4, o 5 de estos restos (es decir, N, K, I, L o V) pueden delecionarse de la secuencia cuando se usan según la invención.

SEQ ID NO: 3: Variante de CD28 con dominio citoplasmático truncado

SEQ ID NO: 4: Fusión CD28.CD137

NKILVIKOSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSO

OLOVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLONLYVNOTDTYFCKTEVMYPPPYLDNEKSNG

TIIFIVK.GK.HLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLH

SDYMNMTPRRPGPTRKEfY OPY APPRDF A AYRS/Rf SVVKRGRKKLLYIFKOPFMRP V OTTOEEDGCSCRFPEEEEGGCE SEQ ID NO: 5: Fusión CD28.CD134

NKILVIKOSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSO

OTOVYSKTGFNCDGKI,GNF,SVTFYTONI,YVNOTDTYFCKlEVMYPPPYI,DNF,KSNG TIIHVKGKHFrPSPI.FPGPSKPFWVI.VVVGGVFACYSFI.VTVAFIIFWVRSKRSRFFH

SDYMNMTPRRPGPTRKHYOPYAPPRDF AAYRS/RRDORLPPDAHKPPGGGSFRTPIO

EEOADAHSTLAK.I

SEQ ID NO: 6: Fusión CD28.CD2

NKILVKOSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSO

OLOVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLONLYVNOTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNG

TIIHVKGKHFCPSPI.FPGPSKPFWVFVVVGGVFArYSFFVTV AFIIFWVRSKRSRFFH

SDYMNMTPRRPGPTRKHYOPY APPRDF A AYRS/KRKKORSRRNDEELETRAHRVAT

EERGRKPHOIPASTPQNPATSQHPPPPPGHRSOAPSHRPPPPGHRVOHQPQKRPPAPS

GTOVHOOK.GPPLPRPRVOPKPPHGAAENSLSPSSN

SEQ ID NO: 7: Fusión CD28.CD29

N K T T .V lK n<sPM T .V A Y nN A V N T .SrK Y SY N T .F SR F.FB A ST .H K G T .r)SA V F.V rV V V fiN Y Sn

OLOVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLONLYVNOTDTYFCKTEVMYPPPYLDNEKSNG

TlIHVKGKHLrPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLArYSLLVTVAFriFWVRSKRSRLLH SDYMNMTPRRPGPTRKFrYOPYAPPRDFAAYRS/KLLMIIHDRREFAKFEKEKMNAK WDTGENPIYKSAVTTVVNPKYEGKSEQ ID NO: 8: Fusión CD28.GITR

NK1LV K.OSPMLV AYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEV C-VVY GNY SO

OLOVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLONLYVNOTDTYFCKTEVMYPPPYLDNEKSNG

t i if iv k g k h e c p s p i .f p g p s k p f w v e v v v g g v ia c y s e e v t v a f i if w v r s k r s r i .ehSDYMNMTPRRPGPTRKHYOPYAPPRDFAAYRS/QLGLFnWQLRSOCMWPRETOLLL EVPPSTEDARSCOFPEEERGERSAEEKGRLGDLWVSEQ ID NO: 9: Fusión CD28.IL2Ry

NKILVKOSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSO

OLOVYSKTGFNrDG.KLGNESVTFYLONLYVNOTDTYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNG. TTTHVKG.KHr,rPSPT,FPGPSKPFWVT,VVVG.G.VT,ArYSn,VTVAFnFWVRSKRSRU,H

SDYMNMTPRRPGPTRKHYOPYAPPRDFAAYRS/ERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNF

SAWSGVSKGLAESLOPDYSERLCLVSETPPKGGALGEGPGASPCNOHSPYWAPPCYT

LKPETSEQ ID NO: 10: Fusión CD28.CD40

NKILVIKOSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSO

OLOVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLONLYVNOTDTYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNG

TIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLH

SDYMNMTPRRPGPTRKHYOPY APPRDF A AYRS/KKV AKKPTNKAPHPKOEPOEINFP

DDLPGSNT A AP VOETLFf GC OP VT OEDGKE S RIS V OERO

SEQ ID NO: 11: Fusión CD28.CD150

NKILVIKOSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSO

OLO VYSKT GFN CDGKLGNESVTF YLONLYVNOTDTYF CKIEVMYPPPYLDNEK SNG

TIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLAGYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLH

SDYMNMTPRRPGPTRKHY OPYAPPRDFA AYRS/RRRGKTNHY QTTVEKKSLTIYAO

VOKPGPLOKKLDSFPAODPCTTIYVAATEPVPESVOETNSITVYASVTLPES SEQ ID NO: 12: Fusión CD28.CD2.CD40

NKILVKOSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSO

OLOVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLONLYVNOTDTYFCKTEVMYPPPYLDNEKSNG

TIIHVKGKHI,CPSP],FPGPSKPFWVI.VVVGGVI,ACYSI,I,VTVAFIIFWVRSKRSRI,I,H

SDYMNMTPRRPGPTRKFTY OPY APPRDF A AYR&/KRKKORSRRNDEELETR AHRV AT

EERGRKPHOIPASTPONPATSOHPPPPPGHRSOAPSHRPPPPGHRVQHOPOKRPPAPS

GIQVHQQKGPPLPRPRVQPKPPHGAAENSLSPSSNA y F/iKKPTNKA PHPKQEPOEINF PDDLPGSN'JAA P VOIG LHGCQPV'I 'OKDGKESIUSVQERQ

SEQ ID NO: 13: Variante CD28(IEV) con el dominio extracelular truncado

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un receptor coestimulador quimérico (CoStAR) que comprende (i) un dominio de unión a antígeno asociado a enfermedad o tumor; y (ii) un segmento de unión a ligando extracelular de una primera proteína receptora coestimuladora, y (iii) un primer segmento intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de la primera proteína receptora coestimuladora, y (iv) un segundo segmento intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular de una segunda proteína receptora;

en donde la primera proteína receptora coestimuladora es CD28; y en donde la segunda proteína receptora es CD40,

en donde el dominio de unión a antígeno asociado a enfermedad o tumor está unido al segmento de unión al ligando extracelular de la primera proteína receptora coestimuladora, y

en donde el dominio de unión a antígeno asociado a enfermedad o tumor es un dominio de unión a antígeno asociado a cáncer o tumor.

2. Un CoStAR como se reivindica en la reivindicación 1, en donde el receptor coestimulador quimérico comprende la SEQ ID NO: 10.

3. Un CoStAR como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, en donde dicho receptor coestimulador quimérico incluye la proteína receptora coestimuladora CD28 madura completa que carece del péptido señal y hasta 5 aminoácidos en el extremo N de la proteína receptora coestimuladora madura.

4. Un CoStAR como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en donde dicho receptor coestimulador quimérico incluye la proteína receptora coestimuladora CD28 madura completa que carece del péptido señal y 1 o 2 aminoácidos en el extremo N de la proteína receptora coestimuladora madura.

5. Un CoStAR como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en donde el segmento de unión al ligando extracelular de CD28 comprende un truncamiento en los aminoácidos IEV de la SEQ ID NO: 2.

6. El CoStAR de cualquier reivindicación precedente, en donde dicho dominio de unión a antígeno se selecciona de:

I. Un fragmento de anticuerpo monocatenario que se une a un antígeno asociado a tumor que incluye, pero no se limita a, antígeno carcinoembrionario (CEA), 5T4, melanotransferrina (CD228), Her2, EGF<r>, GPC3, proteoglicano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP/CSPG4), CD71, SM5-1, receptor de folato o CA125; o

II. Un fragmento de anticuerpo monocatenario que se une a un complejo de mayor de histocompatibilidad (MHC) de péptido específico de tumor (p); o

III. Un receptor de células T monocatenario específico de antígeno del complejo pMHC específico de tumor (scTCR); o

IV. Un polipéptido de unión a antígeno natural tal como, pero sin limitación, transferrina; o

V. Un dominio que se une a un anticuerpo (por ejemplo, dominios de unión a Fc tales como, pero sin limitarse a, CD16, CD32 o CD64).

7. Una proteína de fusión que comprende un CoStAR según cualquier reivindicación precedente fusionado a una proteína de gen marcador (por ejemplo, etiqueta del epítopo DYKDDDDK (SEQ ID NO: 14), CD34, CD19, etc.), receptor del antígeno quimérico (CAR), un receptor de células T (TCR) u otro receptor de uso inmunoterapéutico para terapia celular adoptiva, que comprende opcionalmente un péptido de autoescisión entre el CoStAR y la proteína de interés.

8. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende la SEQ ID NO: 10 o una variante de la misma que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia a nivel de proteína, en donde la proteína de fusión es un CoStAR.

9. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 8 que opcionalmente también comprende una secuencia que codifica un receptor de antígeno quimérico, un receptor de células T u otro receptor de uso inmunoterapéutico para terapia celular adoptiva, de manera que, cuando el vector se usa para transducir una célula diana, la célula diana coexpresa un CoStAR según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un receptor de antígeno quimérico, receptor de células T u otro receptor de interés inmunoterapéutico.

10. Una célula que expresa un CoStAR según cualquiera de las reivindicaciones 1 -6.

11. Una célula según la reivindicación 10 que coexpresa el CoStAR de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y una POI en la superficie celular.

12. Una célula que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 8.

13. Una célula según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, que es una célula T.

14. Un método para preparar una célula según cualquiera de las reivindicaciones 10-13, que comprende la etapa de transducir o transfectar una célula con un vector según la reivindicación 9.

15. Un método para seleccionar células que expresan una POI, que comprende las siguientes etapas:

I. detectar la expresión del epítopo de POI en la superficie de células transfectadas o transducidas con un vector según la reivindicación 9; y

II. seleccionar células que se identifican como que expresan el epítopo de POI.

16. Un método para preparar una población purificada de células enriquecidas en células que expresan una POI que comprende la etapa de seleccionar células que expresan una POI de una población de células usando un método según la reivindicación 15.

17. Un método según la reivindicación 16, que comprende la transducción o transfección ex vivo de una población de células aisladas de un donante de tejidos o células con:

un vector según la reivindicación 9; y

seleccionar células que expresan la POI de la población de células transducidas/transfectadas mediante un método según la reivindicación 15.

18. La célula de la reivindicación 10 para su uso como medicamento.

19. La célula de la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento del cáncer y/o la transferencia celular adoptiva.

20. El CoStAR de la reivindicación 6, que comprende, además:

(i) un dominio de señalización que comprende o consiste en un CD28 humano de longitud completa de la SEQ ID NO: 2 o una variante del mismo que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia a nivel de proteína en donde dicho CD28 humano de longitud completa no comprende el péptido señal y opcionalmente carece de hasta 5 aminoácidos en el extremo N de la proteína receptora madura una vez que su péptido señal se ha escindido; y

(ii) el dominio intracelular de CD40 humano como se muestra en la SEQ ID NO: 10 o una variante del mismo que tiene al menos un 80 % o 90 % de identidad de secuencia a nivel de proteína, en donde el dominio intracelular de CD40 humano o una variante del mismo tiene actividad funcional como dominio de señalización intracelular de CD40.

21. El CoStAR de la reivindicación 6, en donde el receptor de folato es el receptor de folato alfa.