ES2989165T3

ES2989165T3 - Proteínas de levadura

Info

Publication number: ES2989165T3
Application number: ES19719320T
Authority: ES
Inventors: Rudy Menin; Pauline Spolaore; Isabelle Mouly
Original assignee: Lesaffre et Cie SA
Current assignee: Lesaffre et Cie SA
Priority date: 2018-04-27
Filing date: 2019-04-26
Publication date: 2024-11-25
Anticipated expiration: 2039-04-26
Also published as: KR20210002501A; IL278272B2; EP3784047A1; EP3784047B1; US11602156B2; CA3097196A1; BR112020021753A2; WO2019207111A1; SG11202010543QA; US20230165271A1; MA52349B1; JP7433243B2; FR3080521B1; US20210267230A1; MA52349A; AU2019260558A1; IL278272A; FR3080521A1; JP2021521839A; CN117752009A

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de proteínas de levadura que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una crema de levadura; b) exponer esta crema de levadura a una plasmólisis térmica a una temperatura entre 70 y 95°C durante un periodo de tiempo entre 30 segundos y 4 horas, preferiblemente entre 1 minuto y 3 horas, más preferiblemente entre 40 minutos y 2 horas; b') separar la fracción insoluble y la fracción soluble; c) someter la fracción insoluble a la actividad de al menos una ribonucleasa y una glucanasa, de forma secuencial o simultánea, a una temperatura entre 40 y 65°C, preferiblemente 60°C, durante un periodo de tiempo entre 8 y 24 horas, preferiblemente 18 horas; d) separar la fracción insoluble de la fracción soluble; donde la fracción insoluble recogida en la etapa d) no tiene sabor, presentando un contenido de nucleótidos inferior al 3% y un contenido de proteína verdadera de al menos el 72%. La etapa b') es opcional. En este caso, la totalidad de la composición obtenida tras la plasmólisis térmica de la crema de levadura se somete a actividad enzimática. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de levadura

La presente invención se refiere al campo de las proteínas derivadas de microorganismos, y más concretamente de levaduras, que pueden utilizarse ampliamente para la nutrición, el bienestar y la salud de los seres humanos y los animales.

Bibliografía

Las proteínas son el principal componente de los tejidos humanos y animales. Desde el punto de vista nutricional, las proteínas son hidrolizadas por proteasas y peptidasas en péptidos y aminoácidos. Los aminoácidos aportan al organismo elementos esenciales como el nitrógeno, los hidratos de carbono y el azufre. El organismo no fija el nitrógeno mineral y lo incorpora a las moléculas orgánicas; por tanto, los aminoácidos aportan nitrógeno. Los aminoácidos azufrados aportan el azufre importante para el metabolismo. Los aminoácidos son también elementos esenciales en la síntesis de proteínas, péptidos y sustancias de bajo peso molecular fisiológicamente esenciales, como el glutatión, la creatina, la dopamina, la serotonina y otras. A medida que crece la población mundial, también lo hace la necesidad de proteínas en la alimentación humana y animal. En consecuencia, tenemos que encontrar fuentes adicionales de proteínas y/o alternativas a las proteínas animales. Ya se utilizan proteínas derivadas de plantas (cereales, legumbres) o insectos. La obtención de proteínas a partir de fuentes microbianas implica mecanismos de fermentación conocidos desde hace siglos. Las proteínas microbianas son componentes de la célula entera o de la pared celular, o bien proteínas aisladas. Una de las desventajas de las proteínas de origen microbiano para el consumo humano es el nivel de ácidos nucleicos en los aislados. Este nivel debe ser bajo porque uno de los productos finales del metabolismo del ácido nucleico es el ácido úrico, que el cuerpo humano no descompone porque carece de uricasa, la enzima necesaria para su catabolismo. Otros inconvenientes son el rendimiento de extracción y/o la pureza de las proteínas obtenidas por aislamiento a partir de microorganismos.

Tras la lisis celular, por ejemplo de células de levadura, las proteínas se recuperan tradicionalmente en la fase "noble", es decir, la fase soluble, que corresponde a los extractos de levadura y contiene los compuestos ricos en sabor. Sin embargo, el sabor puede ser una desventaja, dependiendo del uso previsto del extracto proteico obtenido. Tres patentes del mismo equipo tratan de la obtención de extractos concentrados de proteínas. La patente US3867555 divulga un procedimiento para obtener extractos de proteínas con bajo contenido en ácidos nucleicos. Las células se rompen mecánica (alta presión, ultrasonidos) o químicamente (autolisis, enzimas externas) para que las proteínas permanezcan en la fracción soluble. Sin embargo, estas proteínas se mezclan con el resultado de la hidrólisis, es decir, aminoácidos, péptidos y polisacáridos o azúcares simples. Tras centrifugar para separar y desechar la fracción insoluble, se precipitan las proteínas y se utiliza un tratamiento alcalino para hidrolizar los ácidos nucleicos, que se eliminan por filtración. Sin embargo, el rendimiento global de recuperación de las proteínas "no hidrolizadas" es bajo.

La Patente US3887431 divulga el uso de la nucleasa endógena presente en la fracción soluble tras la lisis de la levadura para degradar ácidos nucleicos. Una etapa de concentración al vacío produce tanto un extracto proteico concentrado como un producto con poco sabor y olor.

La Patente US3991215 divulga un procedimiento que, tras la ruptura de las células, aplica un tratamiento de ultra alta temperatura a la fracción citoplasmática soluble para obtener un producto enriquecido en proteínas con bajo contenido en ácido nucleico.

Por último, existen varias formas de mejorar los procedimientos de aislamiento de proteínas a partir de microorganismos, con el objetivo de obtener una mayor pureza, mayores rendimientos y/o extractos de proteínas que puedan utilizarse directamente en nutrición o como complementos alimenticios. Los documentos FR 2207985 A1 y US 4080260 A describen procedimientos de obtención de extractos de proteínas a partir de una fracción soluble.

Resumen de la invención

Contrariamente a las técnicas habituales, los inventores han desarrollado un método para aislar proteínas de microorganismos a partir de la fracción insoluble obtenida tras la lisis de dichos microorganismos. Este nuevo método permite obtener extractos concentrados de proteínas no hidrolizadas con un buen rendimiento, bajos en ácidos nucleicos, olor y sabor.

El procedimiento según la invención comienza con la lisis de las células, preferentemente por plasmólisis térmica, que produce la inactivación de las enzimas de los microorganismos y la liberación de aminoácidos libres, incluido el ácido glutámico, en el medio. A continuación, el conjunto se somete a una enzima de tipo glucanasa y a una enzima de tipo ribonucleasa y luego se somete a una separación al final de la cual la fracción insoluble representa el producto de interés con un contenido en proteína real de al menos el 72 %. Según otro modo de realización de la invención, se lleva a cabo una primera separación después de la fase de plasmólisis térmica y sólo la fracción insoluble que comprende proteínas, polisacáridos y ARN se somete a la acción de una glucanasa y una ribonucleasa, y luego se separa de nuevo para conservar la fracción insoluble rica en proteínas.

El extracto proteico obtenido es inodoro e insípido y pobre en ácidos nucleicos. El extracto proteínico, que aún contiene lípidos de la membrana, puede ser deslipidado por métodos conocidos por los expertos en la materia, como la extracción con un disolvente del tipo hexano o etanol, con CO2 supercrítico o el tratamiento con lipasas o fosfolipasas seguido de la separación de la fase solubilizada.

Las proteínas así obtenidas pueden utilizarse directamente para aplicaciones en nutrición, complementos alimenticios, etc.

Definiciones

Por microorganismo entendemos un organismo vivo invisible a simple vista y visible al microscopio. En el contexto de esta invención, los microorganismos son preferentemente bacterias (microorganismos procariotas) o levaduras (microorganismos eucariotas). Levadura, en singular o plural, es un término genérico que designa a los microorganismos eucariotas capaces de fermentar la materia orgánica. Las levaduras incluyen, entre otros, los génerosSaccharomyces, Candida, PichiayKluyveromyces.

Por crema de levadura, se entiende la suspensión de levadura obtenida después de la multiplicación en la cuba, y después de la centrifugación que separa dicha suspensión del líquido ambiente, también llamado mosto. La multiplicación también puede denominarse cultivo o, por extensión, fermentación. Las proteínas son macromoléculas formadas por una secuencia de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Se encuentran entre los principales constituyentes básicos de todas las células animales y vegetales. Representan hasta el 50 % del peso seco de un ser vivo y constituyen entre el 15 y el 20 % de nuestro aporte energético diario. Los alimentos y las proteínas corporales son las principales fuentes de nitrógeno y aminoácidos, que tienen varias funciones metabólicas importantes: son sustratos para la síntesis de proteínas, precursores de compuestos nitrogenados importantes en el organismo (ácidos nucleicos, óxido nítrico, glutatión...) y sustratos para el metabolismo energético.

En general, en la industria alimentaria, el contenido en proteínas se asimila al contenido en nitrógeno multiplicado por 6,25 (el coeficiente 6,25 procede del contenido medio en nitrógeno de una proteína, que es 100/6,25, es decir, 16 %). Por proteína real entendemos un nivel de proteína más cercano a la realidad, corregido por el sesgo inducido por el nitrógeno no proteico, por ejemplo el nitrógeno de los ácidos nucleicos. Así pues, en forma de fórmula, la tasa de proteína real puede equipararse al nitrógeno total menos el nitrógeno del ácido nucleico y el nitrógeno amoniacal, multiplicado por 6,25. Alternativamente, el nivel de proteína real puede evaluarse midiendo los aminoácidos totales. Las proteínas integrales nativas son proteínas del microorganismo que se encuentran en el estado en el que se encuentran en el microorganismo vivo. Por extensión, las proteínas nativas desnaturalizadas tienen una conformación espacial potencialmente modificada, por plegamiento o coagulación. Las proteínas también pueden hidrolizarse parcial o totalmente.

Por plasmólisis se entiende una ruptura del sello del microorganismo, preferentemente levadura, o su aspecto compartimentado. Hay pérdida de agua tras la permeabilización de la membrana.

Descripción detallada de la invención y métodos de fabricación

La figura 1 muestra los dos modos de realización del procedimiento según la invención.

La figura 1A ilustra el procedimiento en el que no hay una etapa de separación entre la plasmólisis y la hidrólisis enzimática. La figura 1B ilustra el procedimiento en el que se lleva a cabo una separación tras la etapa de plasmólisis y, a continuación, se realiza una hidrólisis enzimática en la fracción insoluble resultante de esta separación.

La figura 2 muestra los respectivos perfiles proteicos de un extracto proteico producido por un procedimiento según la invención, y un extracto proteico denominado convencional producido por un procedimiento conocido para extraer proteínas de la fracción soluble obtenida tras la etapa de plasmólisis.

El procedimiento según la invención puede aplicarse a cualquier tipo de levadura, más específicamente a cualquier levadura con un historial de consumo en nutrición humana o animal. Desde un punto de vista industrial, el procedimiento según la invención se lleva a cabo sobre una crema de levadura como la definida anteriormente, es decir, sobre una suspensión de levadura. Preferiblemente, las levaduras se eligen entre las levaduras de los génerosSaccharomyces, Pichia, Candida, Kluyveromyces, YarrowiaoWickerhamomyces.De manera preferencial, las levaduras se eligen entreSaccharomyces cerevisiae, Pichia jadinii (también conocida como Candida utilis), Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica, Wickerhamomyces anomalus, etc.Estas levaduras contienen entre un 6 y un 11 % de nitrógeno. El nitrógeno se mide por el método Kjeldahl conocido por los expertos en la materia. Como se ha indicado anteriormente, la tasa de proteína real se extrapola a partir de esta dosis de nitrógeno utilizando el coeficiente de multiplicación 6,25.

Las levaduras se cultivan mediante métodos conocidos por el experto en la materia. En el libro de referencia " Yeast technology" de Gerald Reed y Tilak W. Nagodawithana (ISBN 0-442-31892-8) en las páginas 284 a 293. Este cultivo, también conocido como biomasa, se recoge por centrifugación o filtración y puede lavarse. El resultado es una crema de levadura.

A continuación, las células se someten a ruptura mecánica o química mediante métodos conocidos, tales como homogeneización a alta presión, trituración mecánica, desintegración ultrasónica, ciclos repetidos de congelación-descongelación, choque osmótico o lisis enzimática. En un modo preferido de realización de la invención, las levaduras se someten a plasmólisis térmica a una temperatura comprendida entre 70 y 95°C, dependiendo del tipo de levadura. La temperatura está preferentemente comprendida entre 80 y 90°C. Un experto en la materia podrá ajustar la temperatura y/o la duración de la lisis, por ejemplo en función de la resistencia de las células y/o de las enzimas que desee inactivar durante esta etapa. La duración estará comprendida entre 30 segundos y 3 horas, hasta 4 horas, preferiblemente 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 1 hora 30 minutos o 2 horas, hasta 3 o incluso 4 horas. Esta etapa de plasmólisis desnaturaliza la levadura, inactiva las enzimas endógenas y permeabiliza la membrana, liberando una fracción soluble. La fracción soluble comprende esencialmente aminoácidos libres, pequeños péptidos y minerales, incluidos algunos aminoácidos como el ácido glutámico que influyen en el sabor.

En una primera realización de la invención, el conjunto resultante de la etapa de plasmólisis y que contiene la fracción soluble y la fracción insoluble se somete entonces a una o más actividades enzimáticas. El objetivo de esta etapa es solubilizar el mayor número posible de componentes no proteicos, sin atacar a las proteínas. Se prefiere una actividad ribonucleasa (EC 3.1.4.1) y una actividad glucanasa (EC 3.2.1). Las actividades enzimáticas pueden llevarse a cabo de forma secuencial o simultánea. La actividad ribonucleasa transforma el ARN en nucleótidos 5' y lo solubiliza, pasándolo a la fracción soluble. Pueden utilizarse varias ribonucleasas, por ejemplo una mezcla de endo- y exo-nucleasas. Opcionalmente, puede utilizarse una desaminasa para convertir el AMP en IMP, con el fin de potenciar las propiedades aromatizantes de la fracción soluble. La acción de una o varias glucanasas solubiliza los polisacáridos de la pared en oligosacáridos solubles. El tiempo y la temperatura se ajustarán en función de las especificaciones de las enzimas utilizadas. La temperatura estará comprendida entre 40 y 65°C, de manera preferencial 60°C. La duración estará comprendida entre 8 y 24 horas, preferiblemente entre 16 y 24 horas, más preferiblemente 18 horas. Esta etapa enzimática produce una nueva fracción soluble compuesta por nucleótidos, polisacáridos (alrededor del 60 % de carbohidratos totales) y una pequeña proporción de aminoácidos, y una fracción insoluble compuesta principalmente por proteínas.

La última etapa consiste en separar la fracción soluble de la insoluble.

En una segunda realización de la invención, se separan las fracciones solubles e insolubles resultantes de la etapa de plasmólisis. La fracción soluble se aparta y se elimina, y puede utilizarse como extracto de levadura. La fracción insoluble incluye corteza (o paredes), de polímeros, polisacáridos, ARN y proteínas coaguladas por calor. Esta fracción insoluble se retiene. A continuación, se somete a las actividades enzimáticas de ribonucleasa y glucanasa indicadas anteriormente, siguiendo un protocolo de incubación similar (temperatura, tiempo) y separación de las fracciones soluble e insoluble. La fracción soluble final se puede dejar de lado y valorar.

La fracción insoluble final resultante de la digestión enzimática tiene un contenido proteico "verdadero" superior o igual al 70 %, preferentemente superior o igual al 72 %, 80 % y hasta el 85 %. En general, la levadura contiene entre un 50 y un 55 % de proteínas "reales". El procedimiento según la invención permite eliminar numerosos elementos y obtener un producto con una mayor concentración de proteínas. Opcionalmente, la cantidad de lípidos de esta fracción insoluble puede reducirse, bien por la acción de disolventes (etanol, hexano), bien por CO2 supercrítico, bien por la acción de una lipasa o una fosfolipasa. De este modo pueden obtenerse reales purezas proteínicas superiores al 80 %.

Según un modo de realización de la invención, las acciones respectivas de las ribonucleasas y las glucanasas se llevan a cabo secuencialmente, sin importancia del orden. En un modo de realización preferida de la invención, las actividades ribonucleasa y glucanasa se aplican al mismo tiempo.

El producto así obtenido puede liofilizarse, secarse por un método conocido por el experto en la materia, por ejemplo por atomización o al vacío, y conservarse manteniendo sus propiedades y su calidad.

Así, según un modo de realización, la invención se refiere a un procedimiento de obtención de proteínas de levadura que comprende las etapas siguientes:

a) hacer una crema de levadura ;

b) exponer esta crema de levadura a una plasmólisis térmica a una temperatura comprendida entre 70 y 95°C, durante un período comprendido entre 1 minuto y 3 horas, preferentemente entre 40 minutos y 2 horas; c) someter el conjunto a la actividad de al menos una ribonucleasa y una glucanasa, secuencial o simultáneamente, a una temperatura comprendida entre 40 y 65°C durante un período comprendido entre 8 y 24 horas;

d) separar la fracción insoluble de la fracción soluble,

en la que la fracción insoluble recogida en la etapa d) es insípida, tiene un contenido en nucleótidos inferior al 3 % y un contenido en proteína real de al menos el 72 %.

Según otro modo de realización, la invención se refiere a un procedimiento de obtención de proteínas de levadura que comprende las etapas siguientes:

a) hacer una crema de levadura ;

b) exponer esta crema de levadura a una plasmólisis térmica a una temperatura comprendida entre 70 y 95°C, durante un período comprendido entre 1 minuto y 3 horas, preferentemente entre 40 minutos y dos horas; b') separar la fracción insoluble de la fracción soluble;

c) someter la fracción insoluble a la actividad de al menos una ribonucleasa y una glucanasa, secuencial o simultáneamente, a una temperatura comprendida entre 40 y 65°C durante un período comprendido entre 8 y 24 horas;

d) separar la fracción insoluble de la fracción soluble,

En el resto de la presente descripción, la fracción insoluble recogida en la etapa d) también puede denominarse "extracto proteico (de levadura) según la invención".Por el contrario,un extracto proteico de levadura obtenido mediante un procedimiento conocido en la técnica anterior a partir de la fracción soluble resultante de la plasmólisis puede denominarse "extracto proteico convencional".

Según un modo de realización preferida de la invención, la crema de levadura de la etapa a) procede de la fermentación de levaduras seleccionadas entreSaccharomyces cerevisiae, Pichia,preferentementePichia jadinii, Kluyveromyces,preferentementeKluyveromyces marxianusoKluyveromyces lactis, Yarrowia,preferentementeYarrowia lipolytica,oWickerhamomyces,preferentementeWickerhamomyces anomalus.Ventajosamente, la levadura se elige entreSaccharomyces cerevisiae, Pichia jadiniioKluyveromyces marxianus.La levadura preferida esSaccharomyces cerevisiae.

Según un modo de realización preferida de la invención, la etapa a) de plasmólisis térmica se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 80 y 90°C.

Según un modo de realización preferida de la invención, las actividades glucanasa y ribonucleasa se aplican simultáneamente.

Opcionalmente, también puede aplicarse una actividad de desaminasa.

Ventajosamente, la crema de levadura utilizada en la etapa a) contiene levadura enriquecida con selenio. Un cultivo de levadura enriquecido con selenio puede realizarse según un método conocido por el experto, por ejemplo el descrito en la solicitud EP 1478732. Los niveles de selenio en el cultivo de levadura pueden alcanzar entonces las 3.000 ppm o incluso más.

El producto obtenido en la fracción insoluble tiene un contenido en nitrógeno exclusivamente proteico superior o igual al 11,5 % sobre materia seca, es decir, un 72 % de proteínas reales (utilizando el coeficiente de conversión de 6,25 indicado anteriormente). Normalmente, la levadura tiene un contenido máximo de nitrógeno del 11 %, lo que da un 69 % de proteína potencial. La levadura también contiene material nitrogenado no proteico (ácidos nucleicos ARN/ADN). Restando el nitrógeno nucleico del nitrógeno total, la levadura sólo contiene entre un 50 y un 55 % de proteínas. Así, el contenido mínimo de proteínas del 72 % obtenido en la fracción insoluble final es característico del procedimiento según la invención. En esta misma fracción insoluble, el nivel de nucleótidos totales se sitúa entre el 0,8 y el 1,5 %, hasta el 3 %, el nivel de hidratos de carbono totales es del 1 al 8 % (dosificación de antrona mediante un método conocido por los expertos en la materia), los niveles respectivos de glucanos son del 0,2 al 4 %, de mananos del 0,2 al 4 %, de lípidos del 7 al 15 % y de materia mineral del 1 al 7 %.

Puede ser interesante distinguir un extracto proteico de levadura obtenido por el procedimiento según la invención de un extracto según el estado de la técnica, a saber, un extracto proteico obtenido a partir de la fracción soluble después de la lisis de las células y habiendo sufrido una etapa de concentración, que tendría entonces un contenido en proteínas de al menos 72%y posiblemente un contenido en nucleótidos inferior a 3 %.

Para ello, se determinaron los lípidos totales en extractos de proteínas deSaccharomyces cerevisiaemediante un método gravimétrico tras hidrólisis ácida y extracción con hexano utilizando un aparato Soxhlet . Los niveles de lípidos son sistemáticamente superiores al 7 %. Así, la fracción insoluble recogida en la etapa d) de un procedimiento de extracción según la invención también tiene un contenido en lípidos superior al 7 %. En comparación, el contenido en lípidos es inferior al 1 % en un extracto proteico de levadura "clásico". El contenido en lípidos puede variar en función de la especie o cepa de levadura. En general, para un producto industrial, el microorganismo de partida se indica en la ficha técnica. Por lo tanto, los expertos en la materia podrán extrapolar y deducir una combinación de especies y niveles de lípidos en el extracto proteico.

En el caso de un extracto proteico de levadura según la invención que ha sido sometido a una etapa de deslipidación, el nivel de lípidos puede no ser suficiente para distinguir los dos orígenes. Una evaluación del perfil de solubilidad de la proteína del extracto proteico puede completar el análisis comparativo. El porcentaje de solubilidad se determina según la siguiente ecuación:

% de solubilidad =<%N total en sobrenadante>

%N inicial en el medio de reacción

donde %N es el porcentaje de nitrógeno determinado por el método Kjeldahl.

La solubilidad de un extracto proteico según la invención es inferior al 3,5 % en agua.

En comparación, un extracto proteico de levadura "convencional" se considera soluble y comprende sólo entre un 5 y un 10 % de elementos insolubles.

Con el mismo fin, se compararon los perfiles de peso molecular de un extracto proteico de levadura según la invención y de un extracto proteico según la técnica anterior. Un extracto de proteínas de levadura obtenido según la invención no presenta un pico de bajo peso molecular. La mayor parte del perfil proteico se distribuye en torno a 40-45 kDa. Los compuestos más pequeños rondan los 500 Da, correspondientes a péptidos pequeños. En comparación, el perfil de un extracto de proteínas de levadura "clásico" muestra varios picos de peso molecular y una cantidad no despreciable de bajo peso molecular. A continuación, es posible extrapolar a partir de estos perfiles y medir la proporción de

aminoácidos totales - aminoácidos libres

aminoácidos totales

(aminoácidos medidos con un método convencional de medición de aminoácidos en productos alimenticios, por ejemplo el método oficial basado en el Reglamento CE EU152/2009). Esta relación es cercana a 1, siempre superior a 0,9 para un extracto proteico de levadura según la invención, mientras que puede estar entre 0,30 y 0,85 para los extractos proteicos de levadura "convencionales".

El producto obtenido por el procedimiento según la invención se distingue de los extractos de proteínas conocidos por su origen microbiano, es decir, no vegetal y no animal, su alto contenido en proteínas, su bajo contenido en ácidos nucleicos y los lípidos de la membrana celular aún presentes si no se aplica ningún tratamiento de eliminación de lípidos. Además, no tiene sabor. Otra ventaja de su origen microbiano es que procede de una materia prima que no se conoce que sea alergénica.

Una ventaja importante de las proteínas de levadura es su calidad nutricional. Así, el producto obtenido por el procedimiento según la invención es una fuente de proteínas con una ventaja importante: su calidad, representada por la puntuación PDCAAS (Protein Digestibility Corrected AminoAcids Score) que es igual a 1, es decir, similar a la de las proteínas animales de referencia como la caseína y la ovoalbúmina. Evaluar la calidad de las proteínas permite determinar su capacidad para satisfacer las necesidades metabólicas. En consecuencia, cualquier aplicación relacionada con la nutrición y los complementos alimenticios o deportivos puede utilizar un extracto proteico obtenido por el procedimiento según la invención. Las aplicaciones aquí enumeradas no pretenden ser exhaustivas.

En el contexto de la nutrición, la salud y el bienestar humanos, dicho extracto proteico puede utilizarse para el control de peso, como suplemento para deportistas o ancianos, en forma de complemento alimenticio o de barrita o bebida rica en proteínas. A modo de ejemplo, dicho extracto proteico puede utilizarse como suplemento proteico de origen no animal para dietas veganas, por ejemplo en batidos, hamburguesas, nuggets, charcutería vegetal, relleno de raviolis, albóndigas, avena y preparados para condimentar pasta. Los panes o productos de panadería ricos en proteínas también pueden utilizar los extractos proteicos obtenidos por el procedimiento según la invención. Como ya se ha dicho, la ventaja de estos extractos proteicos es que no transmiten el sabor, el amargor o las notas desagradables (off-notes) que caracterizan hoy en día a ciertas proteínas vegetales o de algas. En salud humana, dicho extracto proteico puede utilizarse en nutrición infantil o nutrición clínica, es decir, en nutrición oral o enteral para compensar un desequilibrio nutricional. Ventajosamente, cuando el extracto proteico se obtiene a partir de una crema de levadura enriquecida con selenio, puede utilizarse como complemento alimenticio que estimula la inmunidad y/o mejora la calidad de la piel, el cabello y/o las uñas.

Por último, dicho extracto proteico puede utilizarse para aportar proteínas a los piensos animales. Ventajosamente, cuando el extracto proteico se obtiene a partir de una crema de levadura enriquecida en selenio, el animal se beneficiará de un aporte combinado de proteínas y selenio, siendo dicho selenio biodisponible por estar integrado en las proteínas, en forma de seleno-metionina.

Así, la invención se refiere también a la utilización de un extracto proteico de levadura que tiene un contenido en proteína real de al menos 72 %, obtenido según uno cualquiera de los modos de realización del procedimiento según la invención, como suplemento alimentario para el control del peso, para las personas mayores o para los deportistas, en la utilización de dicho extracto proteico como suplemento proteico no animal en bebidas, productos de panadería o charcutería vegetal, en la utilización de dicho extracto proteico en nutrición clínica, oral o enteral, o en la utilización de dicho extracto proteico en nutrición animal. En otras palabras, según un modo de realización, la invención se refiere a un método de suplementación alimentaria para nutrición humana y/o nutrición animal que comprende las etapas consistentes en :

- obtención de un extracto de proteínas de levadura mediante la realización de uno cualquiera de los métodos del procedimiento de obtención de proteínas de levadura según la invención; y

- administrar dicho extracto proteico respectivamente a un individuo humano como suplemento dietético para el control de peso, para ancianos o para deportistas, y/o a un animal como suplemento proteico.

Como se ha mencionado anteriormente, la fracción soluble final del procedimiento según la invención también puede apartarse y recuperarse. Por su alto contenido en hidratos de carbono totales, puede compararse a un zumo dulce. El contenido total de hidratos de carbono oscila entre el 45 y el 70 %. Estos hidratos de carbono se presentan en forma de glucanos (25 a 40 %) y mananos (25 a 35 %), lo que permite utilizar esta fracción soluble para la inmunoestimulación, en particular en salud animal. Dependiendo del tipo de glucanasa utilizada, también puede liberarse glucosa libre. Esta fracción soluble es rica en nucleótidos totales, más concretamente en 5'-GMP y 5'-IMP cuando el AMP es convertido en IMP por una desaminasa. Por tanto, puede utilizarse como potenciador del sabor. Cuando el AMP no se convierte en IMP, el producto puede utilizarse para enmascarar el amargor o las notas desagradables, como se describe en la solicitud de patente FR1762074. Su composición también lo convierte en un buen sustrato de crecimiento para diversos microorganismos, especialmente bacterias.

Los siguientes ejemplos pueden arrojar luz sobre la presente invención. No puede considerarse que limiten el alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación de un extracto proteico concentrado (>75 %) de Saccharomyces cerevisiae

Realizar una fermentación deSaccharomyces cerevisiaeen condiciones que permitan a la levadura alcanzar un alto contenido en nitrógeno, aproximadamente un 10 % de nitrógeno sobre materia seca. Utilizar la separación centrífuga en el mosto de esta fermentación para obtener una crema de levadura de 16-18 % de materia seca-levadura, luego lavar la crema.

En el laboratorio, realizar la plasmólisis térmica de 3 kg de esta crema lavada rica en nitrógeno: elevar la temperatura de la crema a una temperatura elegida entre 70 y 95°C mediante un intercambiador, luego incubar los 3 kg de crema en un vaso de precipitados sumergido en un baño de agua. Dejar remover y mantener la temperatura de la crema en el vaso de precipitados durante 2 horas. A continuación, bajar la temperatura del medio de reacción a 60°C. Transfiera una fracción a un matraz Erlenmeyer de 500 mL. Sumergir el matraz Erlenmeyer en un baño maría regulado a 60°C. Añadir las enzimas siguientes: 0,2 % (g por 100 g de crema) de una mezcla de dos glucanasas y 0,1 % de una mezcla de endo- y exo-ribonucleasas. Dejar incubar durante 18 h con agitación. Al final de este período de incubación, centrifugar. Desechar la fracción soluble, que contiene nucleótidos libres, polisacáridos y una pequeña proporción de aminoácidos. La fracción insoluble es el extracto de proteínas de levadura. Su composición, medida después de 3 lavados, es la siguiente: 13,0 % de nitrógeno, 3 % de nucleótidos totales y 4,7 % de hidratos de carbono totales, es decir, 77 % de proteínas reales.

Ejemplo 2: Preparación de un extracto proteico concentrado (75 %) a partir de Saccharomyces cerevisiae según una variante del procedimiento 1.

En una variante del procedimiento presentado en el ejemplo 1, la fracción insoluble del sobrenadante que comprende los aminoácidos libres se separa por centrifugación al final de la plasmólisis térmica. A continuación, la fracción insoluble se absorbe en un volumen de agua del grifo equivalente al volumen de sobrenadante desechado y se centrifuga de nuevo. Esta operación se realiza un total de 3 veces. Por último, recuperar 2 kg de fracción insoluble al 16 % de materia seca, que contiene proteínas, polisacáridos y material nucleico. Transferir una fracción a un matraz Erlenmeyer de 500 mL. Sumergir el Erlenmeyer en un baño maría, cuya temperatura se regula a 60°C, y realizar el resto del procedimiento como se describe en el ejemplo anterior.

La composición del extracto proteico finalmente obtenido es la siguiente: 12,2 % de nitrógeno, 1,4 % de nucleótidos totales y 2,9 % de hidratos de carbono totales, es decir, 75 % de proteínas reales.

Ejemplo 3: Preparación de un extracto proteico concentrado (>80 %) de Saccharomyces cerevisiae

Mediante los pasos de plasmólisis térmica, separación centrífuga y lavado, preparar la fracción insolublede Saccharomyces cerevisiaeque contiene proteínas, polisacáridos y material nucleico según el protocolo descrito en el ejemplo 2.

Ajustar el extracto seco de esta fracción al 14 % y el pH al pH óptimo de las enzimas. Incubar 200 g de esta fracción con agitación en un Erlenmeyer sumergido en un baño maría a 60°C durante 18h en presencia de las enzimas siguientes: 0,2 % de un preparado de glucanasa líquida purificada y 0,1 % de una mezcla de endo- y exo-ribonucleasas. Recuperar la fracción insoluble por centrifugación y lavar 3 veces. El extracto proteico así obtenido contiene un 13,6 % de nitrógeno, un 2,4 % de nucleótidos totales y un 4,2 % de hidratos de carbono totales, es decir, un 83 % de proteínas reales.

Ejemplo 4: Preparación rápida de un extracto proteico concentrado (75 %) de Saccharomyces cerevisiae

En una variante del procedimiento presentado en el ejemplo 2, el tiempo de incubación puede reducirse a 8 h. El extracto proteico obtenido contiene un 12,5 % de nitrógeno, un 3 % de nucleótidos totales y un 4,4 % de hidratos de carbono totales, es decir, un 75 % de proteínas reales.

Ejemplo 5: Preparación de un extracto proteico concentrado (80 %) de Saccharomyces cerevisae

En una variante del procedimiento presentado en el ejemplo 2, el extracto proteico se seca antes de ser extraído con cinco volúmenes de etanol, se lava, se deshidrata y se seca de nuevo al vacío. El extracto proteico obtenido contiene un 13,3 % de nitrógeno, un 2 % de nucleótidos totales y un 3,1 % de hidratos de carbono totales, es decir, un 81 % de proteínas reales.

Ejemplo 6: Preparación de un extracto proteico concentrado de Pichia jadinii

Realizar fermentación dePichia jadiniien condiciones que permitan alcanzar un contenido en nitrógeno de la levadura de alrededor del 9 % sobre materia seca. Utilizar la separación centrífuga en el mosto de esta fermentación para obtener una crema de levadura de 11-13 % de materia seca, luego lavar la crema.

En el laboratorio, realizar la plasmólisis térmica de 3 kg de esta crema lavada y rica en nitrógeno a una temperatura comprendida entre 70 y 95°C, durante 2 horas, siguiendo el mismo protocolo que el aplicado a la cepaSaccharomyces cerevisiae.Recuperar la fracción insoluble por centrifugación y lavar 3 veces.

Ajustar el extracto seco de esta fracción al 11-13 % y el pH al pH óptimo de las enzimas. Incubar 200 g de esta fracción con agitación en un Erlenmeyer sumergido en un baño de agua a 60°C durante 18h en presencia de las enzimas siguientes: 0,2 % de un preparado de glucanasa líquida purificada y 0,1 % de una mezcla de endo y exo-ribonucleasas. Recuperar la fracción insoluble por centrifugación y lavar 3 veces. El extracto proteico así obtenido contiene un 11,7 % de nitrógeno, un 1,4 % de nucleótidos totales y un 13,3 % de hidratos de carbono totales, es decir, un 72 % de proteínas reales.

Ejemplo 7: Preparación de un extracto proteico concentrado de Kluyveromyces marxianus.

Realizar una fermentación deKluyveromyces marxianusen condiciones que permitan alcanzar un contenido en nitrógeno de la levadura de alrededor del 8 % sobre materia seca. Utilizar la separación centrífuga en el mosto de esta fermentación para obtener una crema de levadura, luego lavar la crema. Realizar la plasmólisis térmica, centrifugar, lavar la fracción insoluble e incubar con una mezcla enzimática que contenga glucanos y endo- y exo-ribonucleasas según el protocolo descrito anteriormente. Centrifugar de nuevo y lavar la fracción insoluble que contiene las proteínas.

El extracto proteico así obtenido comprende un 11,8 % de nitrógeno, un 1,3 % de nucleótidos totales y un 8,8 % de hidratos de carbono totales, es decir, un 72 % de proteínas reales.

Ejemplo 8: Dosificación de los lípidos totales en un extracto proteico "insoluble" obtenido por un procedimiento según la invención y comparación con el contenido en lípidos de un extracto proteico de levadura "clásico", extraído de la parte soluble de la levadura tras la lisis celular según el estado de la técnica.

El método utilizado es un método gravimétrico tras hidrólisis ácida y extracción con hexano utilizando un aparato Soxhlet. Este método se describe en el Reglamento (CE) n° 152/2009. Los resultados se presentan en la Tabla 1. A partir de tres lotes de extracto proteico obtenido según la invención, estos resultados indican un nivel de lípidos de alrededor de 10 a 11 g por 100 g de extracto. En comparación, un extracto proteico de levadura de la técnica anterior obtenido a partir de la fracción soluble de levadura lisada tendrá un contenido en lípidos inferior a 1 g por 100 g de extracto.

Ejemplo 9: Determinación del perfil de solubilidad de las proteínas.

En una muestra del lote 1 de extracto proteico según la invención (véase el ejemplo 8), se determinó el perfil de solubilidad de la proteína a tres valores diferentes de pH en solución acuosa y utilizando una concentración final de proteína del 2 % (p/v). Tras 60 minutos de solubilización bajo agitación a temperatura ambiente, se recupera el sobrenadante por centrifugación y se determina el contenido de nitrógeno total en el sobrenadante por el método Kjeldahl, de conformidad con la norma NF EN ISO 5983-2. Para cada valor de pH, el porcentaje de solubilidad se determina según la siguiente ecuación :

% de solubilidad =<%N total en sobrenadante>

%N inicial en el medio de reacción

El resultado obtenido es inferior al 3,5 %.

Ejemplo 10: Determinación de los perfiles de peso molecular de un extracto proteico según la invención y de un extracto proteico "convencional" respectivamente.

Como en todo lo anterior, "extracto proteico según la invención" se refiere a un extracto proteico de levadura obtenido a partir de la fracción insoluble de células de levadura lisadas. En cambio, un extracto "clásico" de proteínas de levadura se refiere a las proteínas de levadura obtenidas por extracción de la fracción soluble de células de levadura lisadas. Extracción por métodos conocidos por el experto en la materia.

Como se indica en el ejemplo 9, el extracto proteico según la invención no es soluble en condiciones acuosas. Se han desarrollado condiciones específicas para la solubilización y el análisis mediante cromatografía de exclusión por tamaño. El protocolo es el siguiente (método SEC1 en la figura 2):

- solubilización de 10 mg de la muestra en 5 mL de la fase móvil (agitada durante 48 horas a 90°C),

- análisis de la solución obtenida en una columna Agilent® PLgel 20 pm MIXED-A(2 000 a 40000 000 g/mol, equivalente PS) a 40°C.

Fase móvil : DMSO/LiCI 0,25 M.

Detectores RI (índice de refracción) y UV (280 nm).

El método (método SEC2 en la Figura 2) utilizado para el extracto proteico de levadura "clásico" se ha tomado de la monografía de la OIV (Organisation Internationale du Vin):

- solubilización de la muestra en agua ;

- análisis en columna SUPERDEX 200 10/300 GL (10000 a 600 000 Da, equivalente de proteína globular; 1 000 a 100000 g/mol, equivalente de dextrano).

Fase móvil: tampón fosfato NaCl 0,25 M, pH 7,2

Detección UV a 214, 260 y 280 nm.

Los respectivos perfiles proteicos se muestran en la Figura 2.

El perfil del extracto de proteínas de levadura según la invención se distribuye alrededor de 45 kDa y no muestra ningún pico de peso molecular pequeño (rango 2-10 kDa). En comparación, el perfil de un extracto de proteínas de levadura "clásico" es significativamente diferente, con dos picos claros en el rango de bajo peso molecular, 2-10 kDa, y un perfil general con picos más agudos y distribuidos.

La dosificación de los aminoácidos totales y de los aminoácidos libres mediante el método oficial establecido en el Reglamento CE EU152/2009 permite también determinar la relación

aminoácidos totales - aminoácidos libres

aminoácidos totales

Es muy cercano a 1 (o 100 %) y siempre superior a 0,9 (o 90 %) para un extracto de proteínas de levadura según la invención (determinado sobre los 3 lotes cuyos lípidos se ensayaron en el ejemplo 8). Suele estar entre 0,30 y 0,85 (30 a 85 %) para los extractos de proteínas de levadura "clásicos" del solicitante y los extractos disponibles comercialmente.

Ejemplo 11: Preparación de un extracto proteico concentrado (>75 %) a partir de un cultivo de Saccharomyces cerevisiae enriquecido en selenio.

Un lote de crema de levadura enriquecida con selenio se sometió al procedimiento de extracción de proteínas descrito en el Ejemplo 1 o el Ejemplo 2. El nivel de selenio en esta crema de levadura era cercano a 3200 ppm.

El contenido total de nitrógeno del extracto proteico obtenido fue del 13,5 % y el contenido de proteína real fue del 76,7 %. El contenido total de selenio era de 4750 ppm (mg Se/kg seg). El contenido en seleno-metionina era del 84 % (Eq Se/Se tot). En comparación, la levadura selenizada SelSaf®3000, una fuente de selenio orgánico biodisponible, contiene un 63 % de seleno-metionina.

Claims

REIVINDICACIONES

1.Procedimiento de obtención de proteínas de levadura que comprende las etapas siguientes :

a) hacer una crema de levadura ;

b) exponer esta crema de levadura a una plasmólisis térmica a una temperatura comprendida entre 70 y 95°C durante un período comprendido entre 30 segundos y 4 horas, preferentemente entre 1 minuto y 3 horas, más preferentemente entre 40 minutos y 2 horas ;

c) someter el conjunto a la actividad de al menos una ribonucleasa y una glucanasa, secuencial o simultáneamente, a una temperatura comprendida entre 40 y 65°C, preferentemente 60°C, durante un período comprendido entre 8 y 24 horas, preferentemente 18 horas ;

d) separar la fracción insoluble de la fracción soluble ;

2. Procedimiento de obtención de proteínas de levadura que comprende las etapas siguientes :

a) hacer una crema de levadura ;

b') separar la fracción insoluble de la fracción soluble ;

c) someter la fracción insoluble a la actividad de al menos una ribonucleasa y una glucanasa, secuencial o simultáneamente, a una temperatura comprendida entre 40 y 65°C, preferentemente 60°C, durante un período comprendido entre 8 y 24 horas, preferentemente 18 horas ;

d) separar la fracción insoluble de la fracción soluble ;

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2 en el que también se aplica una actividad desaminasa en la etapa c).

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las levaduras se eligen entre las especiesSaccharomyces, Pichia, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, Wickerhamomyces.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que las levaduras se eligen entreSaccharomyces cerevisiae, Pichia jadinii, Kluyveromyces marxianus.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las enzimas utilizadas en la etapa c) se utilizan simultáneamente.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la fracción insoluble recogida en la etapa d) contiene además un contenido en lípidos superior al 7 %.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7 en el que la fracción insoluble recogida en la etapa d) se trata con etanol, un disolvente o CO2 supercrítico para eliminar lípidos y aumentar el contenido de proteína real al 80 %.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la crema de levadura utilizada en la etapa a) contiene levadura enriquecida con selenio.

10. Uso de un extracto proteico de levadura que tiene un nivel de proteína real de al menos el 72%, obtenido según el proceso objeto de una de las reivindicaciones 1 a 9, en nutrición humana.

11. Uso según la reivindicación 10 como complemento alimenticio para el control de peso, para personas mayores, o para deportistas.

12. Uso según la reivindicación 10 como fuente de proteínas no animales en bebidas, productos de panificación o embutidos vegetales.

13. Uso según la reivindicación 10 en nutrición clínica, oral o enteral.

14. Uso de un extracto proteico de levadura con un contenido en proteína real de al menos el 72 %, obtenido según el procedimiento de una de las reivindicaciones 1 a 9, en nutrición animal.