ES2989112T3 - Composición de coagulación mejorada - Google Patents

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Kong-Nan Zhao
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Abstract

La presente invención se refiere a composiciones de coagulación mejoradas para producir muestras de suero sanguíneo de alta calidad para análisis de analitos, como por ejemplo para análisis patológicos y otros ensayos biológicos. En particular, la presente invención se refiere al uso de activadores de protrombina en combinación con agentes estabilizadores como coloides para producir muestras de suero sanguíneo de alta calidad. La presente invención también se refiere a métodos asociados para preparar composiciones de coagulación, tubos, kits y métodos de diagnóstico, pronóstico y control de la respuesta a la terapia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composición de coagulación mejorada
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones de coagulación mejoradas para producir muestras de suero sanguíneo de alta calidad para pruebas analíticas. En particular, la presente invención se refiere al uso de activadores específicos de protrombina en combinación con agentes estabilizadores específicos para producir muestras de suero sanguíneo de alta calidad para pruebas analíticas, tales como por ejemplo para pruebas patológicas y otros ensayos biológicos. La presente invención también se refiere a procedimientos asociados de preparación de composiciones de coagulación, tubos, kits y procedimientos de diagnóstico, pronóstico y control de la capacidad de respuesta a la terapia.
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
No aplicable.
Declaración sobre la investigación financiada con fondos federales
No aplicable.
Antecedentes de la invención
El suero se produce por lo general permitiendo que una muestra de sangre se coagule y luego centrifugando la muestra para separar el coágulo de sangre, incluyendo las células, del suero. En la actualidad por lo general se utilizan tubos de plástico (en lugar de vidrio) que requieren procoagulantes, también conocidos como activadores del coágulo, para potenciar el procedimiento de coagulación. Los procoagulantes utilizan rutas intrínsecas o extrínsecas para lograr la formación de coágulos.
La formación de coágulos por la ruta intrínseca depende de la superficie, por lo que una mayor densidad de sitios activadores en la superficie potencia el tiempo de coagulación. Por lo general, en los tubos de plástico se utilizan sustancias silíceas tales como vidrio, sílice, caolín, bentonita y tierra de diatomeas para acelerar la formación de coágulos a través de la ruta intrínseca para lograr la activación por contacto. Sin embargo, la coagulación por la ruta intrínseca es relativamente lenta y por lo general requiere entre 30 y 60 minutos.
La activación del coágulo mediante la ruta extrínseca implica una coagulación que se inicia mediante la adición de sustancias extrínsecas a la sangre y que implican una reacción bioquímica de forma dependiente de la concentración. Entre los activadores del coágulo que actúan por la ruta extrínseca figuran el ácido elágico, la trombina, los componentes del veneno de serpiente y la tromboplastina. Aunque estos activadores de coágulos producen una rápida coagulación en 10 a 20 minutos, los coágulos que se forman suelen ser gelatinosos y no se separan fácilmente del suero.
Normalmente se prefiere el suero al plasma para el análisis de analitos, a menos que se necesiten resultados urgentes, en cuyo caso el tiempo de coagulación de un tubo de suero se considera demasiado largo. Incluso con los procoagulantes existentes, en la mayoría de los tubos comerciales el tiempo mínimo de coagulación necesario recomendado por los fabricantes es de 30 minutos para las muestras de sangre de pacientes normales, y mucho más largo (por lo general 60 minutos o más) para las muestras de pacientes que toman agentes terapéuticos anticoagulantes como la heparina. Para las muestras de pacientes procedentes de situaciones de emergencia (servicios de urgencias, cuidados intensivos, quirófanos, etc.) y las muestras de los laboratorios de cateterización, el tiempo es demasiado largo, por lo que a menudo se prefiere el plasma, que puede producirse mucho más rápido, al suero.
El plasma se forma mediante la extracción de sangre en tubos que contienen anticoagulantes, seguida de una centrifugación que puede realizarse inmediatamente después de la extracción para separar las células y obtener de esta manera plasma para su análisis. La heparina de litio es el anticoagulante más utilizado en estos tubos. El citrato, el fluoruro de sodio/oxalato de potasio y el EDTA son otros anticoagulantes que se utilizan en algunos tubos para producir plasma para la estimación de un pequeño número de otros analitos.
El procedimiento de coagulación en la preparación de una muestra de suero consume fibrinógeno y atrapa plaquetas y otras células dentro de una red de fibrina. Tras la centrifugación, el suero se separa del coágulo, ya sea mediante un separador de suero en el dispositivo de recogida o dividiendo en alícuotas el suero en un recipiente secundario, para evitar el contacto con las células. Esta separación permite que la muestra permanezca estable durante largos periodos de tiempo. Esta estabilidad es especialmente importante si las muestras no se analizan inmediatamente, o si es necesario volver a analizarlas o realizar análisis adicionales.
Para algunas muestras de suero, la coagulación permanece incompleta después de los tiempos de espera recomendados. Este problema de coagulación incompleta, o coagulación latente, en las muestras es especialmente frecuente en pacientes con terapia anticoagulante o en muestras recogidas de punciones o cánulas anticoaguladas. Este tipo de sangre puede tardar mucho más en coagular que el tiempo de espera recomendado por el fabricante o, de hecho, puede que nunca llegue a coagular del todo en un tubo de suero estándar (por ejemplo, la sangre de pacientes de cirugía cardíaca que están totalmente heparinizados).
Si una muestra de suero se centrifuga antes de que la coagulación se haya completado, la coagulación puede continuar en el suero, ya que el fibrinógeno restante se convierte en fibrina, dando lugar a coágulos, microcoágulos o formación de cordones de fibrina capaces de causar problemas específicos del analizador o del analito. La formación de microcoágulos y cordones de fibrinógeno durante la preparación de la muestra también puede producirse en los tubos de plasma debido a la falta de inversión oportuna de los tubos de heparina de litio tras la extracción de sangre. Aunque la heparina impide la formación de coágulos, no puede desintegrarlos al entrar en contacto con ellos. Por consiguiente, los coágulos permanecerán en el tubo independientemente del contacto posterior con la heparina. Del mismo modo, la coagulación también puede producirse en otros tubos anticoagulados (por ejemplo, con EDTA). Los tubos de plasma de heparina de litio también pueden permitir la formación de fibrina insoluble como resultado de la estimulación del factor plaquetario 4 (PL4) de los gránulos alfa de las plaquetas durante la agregación plaquetaria, neutralizando así la heparina.
Además, otros factores del paciente, como el estado de la enfermedad y la medicación, pueden disminuir la eficacia de la actividad de la heparina y provocar un aumento de la formación de fibrina. Con el tiempo, la actividad de la heparina en las muestras de sangre con heparina de litio almacenadas disminuye, principalmente debido a la actividad de PL4. La formación de fibrina insoluble se potencia cuando el plasma se almacena a bajas temperaturas.
Incluso los coágulos más pequeños son capaces de producir errores clínicamente significativos y/o atascar los analizadores automáticos. De hecho, este problema es cada vez más frecuente, ya que los volúmenes utilizados en los nuevos analizadores automatizados se reducen continuamente con el paso del tiempo, a lo que se agrega el creciente número de pacientes que toman anticoagulantes. La obstrucción de los analizadores implica la interrupción del flujo de trabajo del laboratorio, y los analizadores están sujetos a tiempos de inactividad y requieren limpieza y pueden requerir la sustitución de las piezas afectadas. De esta manera, para mayor precisión, las muestras deben comprobarse manualmente a ojo o mediante sistemas de detección automatizados, si se dispone de ellos, para asegurarse de que están libres de hebras o coágulos de fibrina. Si hay hebras o coágulos de material insoluble, la muestra debe submuestrearse en un nuevo recipiente y recentrifugarse antes del análisis. Las muestras que presentan una coagulación latente repetida pueden necesitar ser transferidas a un tubo de heparina de litio para detener la coagulación en curso. Estas acciones requieren tiempo adicional. Además, las hebras de fibrina o los coágulos no siempre se detectan (por ejemplo, pueden producirse incluso después de la toma de muestras del analizador), y los consiguientes errores en la toma de muestras pueden llevar a que las decisiones de atención al paciente se tomen sobre la base de resultados inexactos.
Las muestras obtenidas en tubos de plasma, específicamente plasma de heparina de litio, también pueden estar contaminadas con células. Los tubos de gel de heparina de litio al centrifugarse siempre presentarán una pequeña "capa parecida a la capa leucocitaria" encima del gel en el fondo del plasma. Esta capa contiene fibrina, células y estroma celular. El rápido movimiento del gel durante la centrifugación deja algunas células en el plasma. El rápido movimiento del gel y de las células sanguíneas durante la centrifugación hace que el gel forme la barrera entre las células y el plasma y deja algunas células en el plasma. Si la muestra de plasma se mezcla (por ejemplo, durante la submuestra o la manipulación), se volverá turbia debido a la suspensión de material que contiene células y fibrina, lo que disminuye la integridad de la muestra. Además, pueden formarse agregados plaquetarios que también pueden contener fibrina y/o glóbulos blancos. Estos agregados pueden ser lo suficientemente grandes como para ser visibles a simple vista y se han denominado "materia particulada blanca" debido a su típico color blanco, y presentan problemas similares a la coagulación incompleta comentada anteriormente. Por lo tanto, la presencia de células en la muestra puede afectar a las concentraciones de analitos. Determinados analitos (por ejemplo, la glucosa) pueden disminuir por la actividad celular y otros pueden aumentar por la fuga o la lisis celular (por ejemplo, la lactato deshidrogenasa, el potasio o el fosfato).
Aunque generalmente no hay diferencia en la concentración de analitos medidos en tubos de suero o plasma, hay algunas excepciones. Los tubos de plasma que utilizan heparina no son adecuados para el análisis de heparina ni para los ensayos basados en células. Los tubos de plasma de heparina de litio no son adecuados para el análisis de litio. El plasma puede ser poco fiable para pruebas adicionales o repetición de pruebas, debido a la presencia de células y a la formación de fibrina insoluble tras un almacenamiento prolongado a 2-8 °C. Además, algunos tubos de suero o plasma pueden producir resultados inexactos de los niveles de analitos debido a la interacción con agentes procoagulantes o anticoagulantes dentro de los tubos.
También es deseable reducir el tamaño de la muestra necesaria para la prueba, especialmente en pacientes en estado crítico, pacientes que reciben transfusiones de sangre y lactantes, con el fin de reducir el volumen de sangre extraída de un paciente. Por lo tanto, es óptimo poder realizar todas las pruebas necesarias utilizando una muestra tomada en un único tubo de recogida de sangre. Para lograrlo, se han desarrollado procedimientos de ensayo que utilizan volúmenes de muestra muy pequeños (por ejemplo, 2 jl), de modo que por lo general un tubo de suero o plasma se utiliza para al menos 21 pruebas, pero puede utilizarse para entre 50-60 o incluso 70-80 pruebas, dependiendo del volumen de muestra necesario para cada prueba. Sin embargo, cuando existen dudas sobre la exactitud de la medición de un analito concreto en un tubo de suero o plasma, puede ser necesario extraer tanto un tubo de suero como un tubo de plasma del paciente, y al hacerlo se frustra el objetivo de reducir el volumen de sangre extraída al paciente.
Los tubos que contienen trombina se han desarrollado como tubos de coagulación más rápida. La trombina posee actividad tanto procoagulante como proteolítica, y se sabe que tiene una gran especificidad para cortar los enlaces en el fibrinógeno, la proteína C activada (APC) y el Factor Va. Sin embargo, se ha descubierto que los tubos que contienen trombina no pueden utilizarse con todas las muestras de sangre. Se sabe que la trombina es rápida y completamente inhibida por el complejo heparina-antrombina III presente en las muestras de sangre heparinizadas. Por ejemplo, se ha informado de que los tubos BD RST son ineficaces en la coagulación de muestras de pacientes que contienen altas dosis de heparina (véase, por ejemplo, Dimeskiet al.,2010).
Los problemas que surgen del uso de las metodologías actuales para la preparación de suero y plasma a partir de sangre muestran que se requieren mejoras para lograr resultados analíticos oportunos y fiables a partir de una variedad más amplia de muestras de sangre en general.
El documento US 5 089 415 Adescribe un procedimiento para coagular sangre heparizada mediante la adición de protamina, trombina y veneno de serpiente. El documento US 4 265 927 A describe un procedimiento de heparinización de una superficie cargada de un artículo médico destinado a entrar en contacto con la sangre. El libro de texto Surface Engineering of Polymeric Biomaterials, enero de 2013, Smithers Rapra Technology Ltd, ISBN 978-1 84735-658-1 hace referencia en el capítulo 4.1 a la ingeniería de superficies de biomateriales en contacto con la sangre. El documento GB 2433592 A describe ensayos para inhibidores de la trombina. El documento EP 0585504 A1 describe el uso de un activador de protrombina dependiente de fosfolípidos purificado a partir del veneno de serpientes pertenecientes a la familia Elapidae. El documento WO 01/44493 A2 describe un ensayo hematológico en el que se evalúa el potencial de coagulación sanguínea de un fluido corporal. El documento CN 1520880 A describe un fármaco hemostático cinasa de veneno de serpiente que comprende un activador del factor VIII (RVV-X) y un agente sinérgico. J.S. Joseph et al., TOXICON, vol. 40, 2002, páginas 175-183, describen el efecto de los procoagulantes del veneno de sanke en el plasma de las serpientes y sus implicaciones para la cascada de coagulación de las serpientes. M. Eberer et al., International Journal of pharmaceutics, vol. 495, 2015, páginas 692 700, describen el desarrollo de medidas de criopeletización y formulación para mejorar la estabilidad de la proteína del veneno deEchis carinatuspara su uso en la throboelastometría rotacional de diagnóstico.
En respuesta a esta necesidad, se demostró previamente en la solicitud de patente internacional no. PCT/AU2011/001221, publicada como WO 2012/037609, que el uso de activadores de protrombina aislados del veneno de serpiente son capaces de coagular muestras de sangre para producir suero de alta calidad para su uso en procedimientos de pruebas de analitos.
Ahora se ha demostrado que el uso de activadores de protrombina, especialmente aislados del veneno de serpiente, cuando se formulan como una composición de coagulación en combinación con uno o más agentes adicionales tales como un coloide, aumenta significativamente la estabilidad de la composición de coagulación. Esta mayor estabilidad es significativa por la capacidad de fabricar, esterilizar, transportar y almacenar composiciones de coagulación (por ejemplo, en forma de tubo de recogida) sin pérdida significativa de la actividad coagulante en condiciones que anteriormente habrían comprometido la eficacia de tales composiciones. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención son estables tras la esterilización por irradiación, el almacenamiento a temperaturas elevadas y el almacenamiento durante largos periodos de tiempo.
Sumario de la invención
En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una composición de coagulación para preparar una muestra de suero, en la que la composición de coagulación comprende un activador de protrombina y un agente estabilizador. En algunas realizaciones, el agente estabilizador puede ser un coloide según la reivindicación 1.
En un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento de preparación de la composición de coagulación del primer aspecto, en el que el procedimiento comprende proporcionar un activador de protrombina y un agente estabilizador. En algunas realizaciones, el agente estabilizador puede ser un coloide.
En un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un kit para preparar una muestra de suero, en el que el kit comprende una composición de coagulación del primer aspecto. En algunas realizaciones, el agente estabilizador puede ser un coloide.
En un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un recipiente que comprende una composición de coagulación del primer aspecto para preparar una muestra de suero, en el que la composición de coagulación comprende un activador de protrombina y un agente estabilizador. En algunas realizaciones, el agente estabilizador puede ser un coloide. En realizaciones particulares, el recipiente es un tubo de recogida de sangre, el activador de protrombina es OsPa o ecarina y el coloide es gelofusine o albúmina de suero bovino.
En un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento de preparación de una muestra de suero, en el que el procedimiento comprende poner en contacto una muestra de sangre con la composición de coagulación del primer aspecto durante un tiempo y en condiciones suficientes para provocar la coagulación de la muestra de sangre y, opcionalmente, separar el suero de las células coaguladas, preparando así una muestra de suero. Las células coaguladas pueden incluir glóbulos rojos, glóbulos blancos, plaquetas y estroma celular.
En un sexto aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para diagnosticar una enfermedad o afección en un sujeto, en el que el procedimiento comprende proporcionar una muestra de sangre obtenida del sujeto, preparar una muestra de suero a partir de la muestra de sangre de acuerdo con el quinto aspecto de la presente invención, y analizar la muestra de suero para detectar la presencia o ausencia de un analito en la muestra de suero, o un nivel o concentración indicativos de un analito en la muestra de suero, en el que la presencia, ausencia o nivel o concentración indicativos del analito son indicativos de la enfermedad o afección en el sujeto.
En un séptimo aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para proporcionar un pronóstico para un sujeto, en el que el procedimiento comprende proporcionar una muestra de sangre obtenida del sujeto, preparar una muestra de suero a partir de la muestra de sangre de acuerdo con el quinto aspecto de la presente invención, y probar la muestra de suero para detectar la presencia o ausencia de un analito en la muestra de suero, o un nivel o concentración indicativos de un analito en la muestra de suero, en la que la presencia, ausencia o nivel o concentración indicativos del analito son indicativos del pronóstico para el sujeto.
En un noveno aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para controlar la capacidad de respuesta de un sujeto a una terapia, en el que el procedimiento comprende proporcionar una muestra de sangre obtenida del sujeto, preparar una muestra de suero a partir de la muestra de sangre de acuerdo con el quinto aspecto de la presente invención, y probar la muestra de suero para la presencia o ausencia de un analito en la muestra de suero, o para un nivel indicativo o concentración de un analito en la muestra de suero, en el que la presencia, ausencia o nivel indicativo o concentración del analito es indicativo de la capacidad de respuesta del sujeto a la terapia.
Definiciones
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por aquellos expertos en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque en la práctica o ensayo de la presente invención pueden utilizarse procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria, se describen los procedimientos y materiales preferidos. A efectos de la presente invención, a continuación se definen los siguientes términos.
Los artículos "un" y "una" se utilizan en la presente memoria para referirse a uno o a más de uno (es decir, al menos a uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.
Por "aproximadamente" se entiende una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía en un 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % con respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia.
El término "fragmento biológicamente activo", aplicado a fragmentos de una secuencia polinucleotídica o polipeptídica de referencia o de longitud completa, se refiere a un fragmento que tiene al menos aproximadamente 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de la actividad de una secuencia de referencia. Se describen en la presente memoria fragmentos biológicamente activos, incluidos los de al menos aproximadamente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000 nucleótidos o residuos de longitud, que comprenden o codifican una actividad de un polinucleótido o polipéptido de referencia. Los fragmentos biológicamente activos representativos participan generalmente en una interacción, por ejemplo intramolecular o intermolecular. Una interacción intermolecular puede ser una interacción de unión específica o una interacción enzimática (por ejemplo, la interacción puede ser transitoria y se forma o se rompe un enlace covalente). Los fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de longitud completa incluyen péptidos que pueden comprender secuencias de aminoácidos suficientemente similares o derivadas de las secuencias de aminoácidos de un polipéptido (putativo) de longitud completa. Por lo general, los fragmentos biológicamente activos comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de un polipéptido de longitud completa. Es conveniente que el fragmento biológicamente activo no tenga menos de aproximadamente 1 %, 10 %, 25 % o 50 % de la actividad del polipéptido de longitud completa del que se deriva.
Por "secuencia codificante" se entiende cualquier secuencia de ácido nucleico que contribuya al código del producto polipeptídico de un gen. Por el contrario, el término "secuencia no codificante" se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que no contribuye al código del producto polipeptídico de un gen.
A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que las palabras "comprenden", "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de un paso o elemento o grupo de pasos o elementos pero no la exclusión de cualquier otro paso o elemento o grupo de pasos o elementos. De esta manera, el uso del término "que comprende" y similares indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes. Por "que consiste en" se entiende incluido, y limitado a, lo que sigue a la frase "que consiste en". Por lo tanto, la frase "que consiste en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, y que no pueden estar presentes otros elementos. Por "que consiste esencialmente en" se entiende la inclusión de cualquier elemento enumerado después de la frase, y limitado a otros elementos que no interfieran o contribuyan a la actividad o acción especificada en la divulgación para los elementos enumerados. De esta manera, la frase "que consiste esencialmente en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes dependiendo de si afectan o no a la actividad o acción de los elementos enumerados.
Los términos "complementario" y "complementariedad" se refieren a polinucleótidosfes decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por las reglas de apareamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia "A-G-T" es complementaria de la secuencia "T-C-A" La complementariedad puede ser "parcial", en la que sólo algunas de las bases de los ácidos nucleicos coinciden según las reglas de emparejamiento de bases. O bien, puede haber complementariedad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las cadenas de ácidos nucleicos tiene efectos significativos sobre la eficacia y la fuerza de la hibridación entre las cadenas de ácidos nucleicos.
Por "corresponde a" o "correspondiente a" se entiende (a) un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica o complementaria a toda o una parte de una secuencia de polinucleótidos de referencia o que codifica una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos en un péptido o proteína; o (b) un péptido o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos en un péptido o proteína de referencia.
El término "derivable" incluye, y puede utilizarse indistintamente, con los términos "obtenible" y "aislable". Las composiciones u otras materias de la presente invención que son "derivables", "obtenibles" o "aislables" a partir de una fuente o procedimiento particular incluyen no sólo las composiciones u otras materias derivadas, obtenidas o aisladas a partir de esa fuente o procedimiento, sino también las mismas composiciones o materias sin embargo obtenidas o producidas, por ejemplo, mediante la tecnología del ADN recombinante u otros procedimientos de ingeniería genética.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "detectar un analito" significa determinar la presencia, ausencia, cantidad, nivel o concentración de uno o más analitos en una muestra.
Por "gen" se entiende una unidad de herencia que ocupa un locus específico en un cromosoma y consta de secuencias reguladoras transcripcionales y/o translacionales y/o una región codificante y/o secuencias no traducidas (es decir, intrones, secuencias no traducidas 5' y 3').
"Homología" se refiere al número porcentual de ácidos nucleicos o aminoácidos que son idénticos o constituyen sustituciones conservativas. La homología puede determinarse utilizando programas de comparación de secuencias tales como GAP (Devereuxet al.,1984). De este modo, las secuencias de longitud similar o sustancialmente diferente a las citadas en la presente memoria podrían compararse mediante la inserción de brechas en el alineamiento, siendo dichas brechas determinadas, por ejemplo, por el algoritmo de comparación utilizado por GAP.
El término "célula hospedadora" incluye una célula individual o un cultivo celular que puede ser o ha sido receptor de cualquier vector o vectores recombinantes o polinucleótido aislado de la invención. Las células hospedadora incluyen la progenie de una única célula hospedadora, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en complemento total de ADN) a la célula madre original debido a mutaciones y/o cambios naturales, accidentales o deliberados. Una célula hospedadora incluye células transfectadas o infectadasin vivooin vitrocon un vector recombinante o un polinucleótido de la invención. Una célula hospedadora que comprende un vector recombinante de la invención es una célula hospedadora recombinante.
"Hibridación" se utiliza en la presente memoria para indicar el emparejamiento de secuencias complementarias de nucleótidos para producir un híbrido ADN-ADN o un híbrido ADN-ARN. Las secuencias de bases complementarias son aquellas secuencias que están relacionadas por las reglas de emparejamiento de bases. En el ADN, A se empareja con T y C con G. En el<a>R<n>, U se empareja con A y C con G. En este sentido, los términos "coincidencia" y "falta de coincidencia" utilizados en la presente memoria se refieren al potencial de hibridación de nucleótidos emparejados en cadenas de ácido nucleico complementarias. Los nucleótidos emparejados se hibridan eficazmente, tal como el clásico par de bases A-T y G-C mencionado anteriormente. Las discordancias son otras combinaciones de nucleótidos que no se hibridan eficazmente.
Por "aislado" se entiende el material que está sustancial o esencialmente libre de los componentes que normalmente lo acompañan en su estado nativo. Por ejemplo, un "polinucleótido aislado", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un polinucleótido que se ha purificado de las secuencias que lo flanquean en estado natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que se ha separado de las secuencias que normalmente son adyacentes al fragmento. Alternativamente, un "péptido aislado" o un "polipéptido aislado" y similares, tal y como se utilizan en la presente memoria, se refieren al aislamiento y/o purificaciónin vitrode una molécula peptídica o polipeptídica de su entorno celular natural, y de la asociación con otros componentes de la célula, es decir, no está asociada con sustanciasin vivo.
Los términos "derivado de" y "derivable" incluyen, y pueden utilizarse indistintamente con, los términos "obtenido", "obtenible", "aislado" y "aislable". Las composiciones u otras materias de la presente invención que son "derivadas de", "derivables", "obtenidas", "obtenibles", "aisladas" o" aislables" a partir de una fuente o procedimiento particular incluyen no sólo las composiciones u otras materias así derivadas, obtenidas o aisladas a partir de esa fuente o procedimiento, sino también las mismas composiciones o materias, independientemente de su origen o producción. Por ejemplo, un activador de protrombina derivado o derivable del veneno de serpiente puede incluir no sólo un activador de protrombina aislado del veneno de serpiente, sino también el mismo activador de protrombina expresado a partir de un vector u otro sistema de expresión mediante tecnología de ADN recombinante.
El término "oligonucleótido", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un polímero compuesto por una multiplicidad de residuos de nucleótidos (desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o variantes estructurales relacionadas o análogos sintéticos de los mismos) unidos mediante enlaces fosfodiéster (o variantes estructurales relacionadas o análogos sintéticos de los mismos). De esta manera, mientras que el término "oligonucleótido" se refiere por lo general a un polímero nucleotídico en el que los residuos nucleotídicos y los enlaces entre ellos son naturales, se entenderá que el término también incluye en su ámbito diversos análogos, incluidos, pero no limitados a, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), fosforamidatos, fosforotioatos, fosfonatos de metilo, ácidos ribonucleicos 2-O-metilo, y similares. El tamaño exacto de la molécula puede variar en función de la aplicación concreta. Un oligonucleótido es por lo general bastante corto en longitud, generalmente de aproximadamente 10 a 30 residuos de nucleótidos, pero el término puede referirse a moléculas de cualquier longitud, aunque el término "polinucleótido" o "ácido nucleico" se utiliza por lo general para oligonucleótidos grandes.
El término "ligado operablemente", como se utiliza en la presente memoria, significa colocar un gen estructural bajo el control regulador de un promotor, que a su vez controla la transcripción y, opcionalmente, la traducción del gen. En la construcción de combinaciones de promotor heterólogo/gen estructural, generalmente se prefiere situar la secuencia genética o el promotor a una distancia del sitio de inicio de la transcripción del gen que sea aproximadamente la misma que la distancia entre esa secuencia genética o promotor y el gen que controla en su entorno natural; es decir, el gen del que deriva la secuencia genética o el promotor. Como es conocido en la técnica, alguna variación en esta distancia puede ser acomodada sin pérdida de función. Del mismo modo, la posición preferida de un elemento de secuencia reguladora con respecto a un gen heterólogo que se colocará bajo su control se define por la posición del elemento en su entorno natural, es decir, los genes de los que se deriva.
Los términos "paciente", "sujeto" e "individuo" se utilizan indistintamente y se refieren a pacientes, sujetos e individuos humanos o de otros mamíferos e incluyen a cualquiera para el que se desee detectar niveles de analitos o diagnosticar la presencia, ausencia o gravedad de una enfermedad o afección utilizando la invención. No obstante, se entenderá que "paciente" no implica la presencia de síntomas. Los mamíferos adecuados que entran dentro del ámbito de la invención incluyen, pero no se limitan a, primates (por ejemplo humanos, chimpancés), animales de ganadería (por ejemplo ovejas, vacas, caballos, burros, cerdos), animales de laboratorio (por ejemplo conejos, ratones, ratas, cobayas, hámsteres), animales de compañía (por ejemplo gatos, perros) y animales salvajes cautivos (por ejemplo zorros, ciervos, dingos).
El término "polinucleótido" o "ácido nucleico", como se utiliza en la presente memoria, designa ARNm, ARNr, ARNc, ADNc o ADN. El término se refiere por lo general a la forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquiera de los dos tipos de nucleótidos. El término incluye formas de ADN de cadena simple y doble.
Los términos "variante polinucleotídica" y "variante" y similares se refieren a polinucleótidos que muestran una identidad de secuencia sustancial con una secuencia polinucleotídica de referencia o polinucleótidos que hibridan con una secuencia de referencia en condiciones estrictas que se definen a continuación. Estos términos también abarcan los polinucleótidos que se distinguen de un polinucleótido de referencia por la adición, deleción o sustitución de al menos un nucleótido. De acuerdo con lo anterior, los términos "variante de polinucleótido" y "variante" incluyen polinucleótidos en los que se han agregado o suprimido uno o más nucleótidos, o se han sustituido por nucleótidos diferentes. A este respecto, es bien sabido en la técnica que pueden realizarse determinadas alteraciones, incluidas mutaciones, adiciones, deleciones y sustituciones, en un polinucleótido de referencia, de modo que el polinucleótido alterado conserve la función o actividad biológica del polinucleótido de referencia. Los términos "variante polinucleotídica" y "variante" también incluyen las variantes alélicas naturales.
"Polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan en la presente memoria indistintamente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos y a variantes y análogos sintéticos del mismo. De esta manera, estos términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son aminoácidos sintéticos no naturales, tal como un análogo químico de un aminoácido natural correspondiente, así como a los polímeros de aminoácidos naturales.
El término "variante polipeptídica" se refiere a polipéptidos que se distinguen de un polipéptido de referencia por la adición, deleción o sustitución de al menos un residuo de aminoácido. Una variante polipeptídica se distingue de un polipéptido de referencia por una o más sustituciones, que pueden ser conservativas o no conservativas. En determinadas realizaciones, la variante polipeptídica comprende sustituciones conservativas y, a este respecto, se entiende bien en la técnica que algunos aminoácidos pueden cambiarse por otros con propiedades ampliamente similares sin cambiar la naturaleza de la actividad del polipéptido. Las variantes polipeptídicas también abarcan los polipéptidos en los que se han agregado o suprimido uno o más aminoácidos, o se han sustituido por residuos de aminoácidos diferentes.
Por "cebador" se entiende un oligonucleótido que, cuando se empareja con una cadena de ADN, es capaz de iniciar la síntesis de un producto de extensión del cebador en presencia de un agente polimerizante adecuado. El cebador es preferentemente monocatenario para una máxima eficacia en la amplificación, pero puede ser alternativamente bicatenario. Un cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente de polimerización. La longitud del cebador depende de muchos factores, como la aplicación, la temperatura a emplear, las condiciones de reacción de la plantilla, otros reactivos y la fuente de los cebadores. Por ejemplo, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el cebador oligonucleotídico por lo general contiene de 15 a 35 o más residuos de nucleótidos, aunque puede contener menos residuos de nucleótidos. Los cebadores pueden ser polinucleótidos grandes, tales como por ejemplo de aproximadamente 200 residuos de nucleótidos a varios kilobases o más. Los cebadores pueden seleccionarse para que sean "sustancialmente complementarios" a la secuencia de la plantilla a la que están diseñados para hibridarse y servir como sitio para el inicio de la síntesis. Por "sustancialmente complementario" se entiende que el cebador es suficientemente complementario para hibridar con un polinucleótido diana. Es preferible que el cebador no contenga discordancias con la plantilla a la que está diseñado para hibridar, pero esto no es esencial. Por ejemplo, los residuos de nucleótidos no complementarios pueden unirse al extremo 5' del cebador, siendo el resto de la secuencia del cebador complementaria a la plantilla. Alternativamente, se pueden intercalar residuos de nucleótidos no complementarios o un tramo de residuos de nucleótidos no complementarios en un cebador, siempre que la secuencia del cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia de la plantilla para hibridar con ella y formar así una plantilla para la síntesis del producto de extensión del cebador.
"Sonda" se refiere a una molécula que se une a una secuencia o subsecuencia específica u otra fracción de otra molécula. A menos que se indique lo contrario, el término "sonda" por lo general se refiere a una sonda polinucleotídica que se une a otro polinucleótido, a menudo denominado "polinucleótido diana", mediante el apareamiento de bases complementarias. Las sondas pueden unirse a polinucleótidos diana que carezcan de una complementariedad de secuencia completa con la sonda, dependiendo de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Las sondas pueden etiquetarse directa o indirectamente.
El término "recombinante" cuando se usa con referencia, por ejemplo, a una célula, ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector ha sido modificado por la introducción de un ácido nucleico o proteína heteróloga o por la alteración de un ácido nucleico o proteína nativa, o que la célula deriva de una célula así modificada. De acuerdo con lo anterior, las células "recombinantes" expresan genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que, de otro modo, se expresan de forma anormal, se expresan poco o no se expresan en absoluto. Por el término "ácido nucleico recombinante" se entiende un ácido nucleico, originalmente formadoin vitro,en general, por la manipulación de un ácido nucleico, por ejemplo, utilizando polimerasas y endonucleasas, en una forma que no se encuentra normalmente en la naturaleza. De esta manera, se consigue la unión operable de diferentes secuencias. De esta manera, tanto un ácido nucleico aislado, en forma lineal, como un vector de expresión formadoin vitropor ligadura de moléculas de ADN que normalmente no están unidas, se consideran "recombinantes" a los efectos de la presente invención. Se entiende que una vez fabricado un ácido nucleico recombinante y reintroducido en una célula u organismo hospedador, se replicará de forma no recombinante, es decir, utilizando la maquinaria celular invivode la célula hospedadora en lugar de manipulacionesin v itro. Sin embargo, tales ácidos nucleicos, una vez producidos de forma recombinante, aunque posteriormente se repliquen de forma no recombinante, siguen considerándose recombinantes a los efectos de la invención. Del mismo modo, una "proteína recombinante" es una proteína fabricada mediante técnicas recombinantes, es decir, mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante como se ha descrito anteriormente.
El término "resultado de referencia" incluye un resultado tomado del mismo sujeto en un momento diferente, un resultado de un sujeto normal o de un grupo de sujetos normales, o un estándar de referencia utilizado en una prueba analítica.
Por "elemento regulador" o “secuencia reguladora" se entienden las secuencias de ácido nucleico (por ejemplo ADN) necesarias para la expresión de una secuencia codificadora ligada operablemente en una célula hospedadora concreta. Las secuencias reguladoras adecuadas para células procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor y, opcionalmente, una secuencia de accióncis,tal como una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosomas. Las secuencias de control adecuadas para las células eucariotas incluyen promotores, señales de poliadenilación, potenciadores de la transcripción, potenciadores de la traducción, secuencias líderes o finales que modulan la estabilidad del ARNm, así como secuencias diana que dirigen un producto codificado por un polinucleótido transcrito a un compartimento intracelular dentro de una célula o al entorno extracelular.
El término "identidad de secuencia", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la medida en que las secuencias son idénticas nucleótido por nucleótido o aminoácido por aminoácido en una ventana de comparación. De esta manera, se calcula un "porcentaje de identidad de secuencia" comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, I) o el residuo de aminoácido idéntico (por ejemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana), y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. A los efectos de la presente invención, por "identidad de secuencia" se entiende el "porcentaje de coincidencia" calculado por el programa informático DNASIS (versión 2.5 para Windows; disponible en Hitachi Software Engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, EE.UU.) utilizando los valores predeterminados estándar que se utilizan en el material de referencia que acompaña al software.
El término "similitud de secuencia" se refiere al número porcentual de aminoácidos que son idénticos o constituyen sustituciones conservativas, tal como se define en la tabla 2infra.La similitud puede determinarse utilizando programas de comparación de secuencias como GAP (Devereuxet al.,1984). De este modo, las secuencias de longitud similar o sustancialmente diferente a las citadas en la presente memoria podrían compararse mediante la inserción de brechas en el alineamiento, siendo dichas brechas determinadas, por ejemplo, por el algoritmo de comparación utilizado por GAP.
Los términos utilizados para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" tiene una longitud de al menos 12, pero con frecuencia de 15 a 18 y a menudo de al menos 25 unidades monoméricas, incluidos nucleótidos y residuos de aminoácidos. Dado que dos polinucleótidos pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, sólo una parte de la secuencia polinucleotídica completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan por lo general comparando secuencias de los dos polinucleótidos sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencias. Una "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, normalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en la que una secuencia se compara con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se hayan alineado de forma óptima. La ventana de comparación puede incluir adiciones o deleciones (es decir, brechas) de aproximadamente un 20 % o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no incluye adiciones ni deleciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de las secuencias para alinear una ventana de comparación puede llevarse a cabo mediante implementaciones informáticas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7,0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wl, EE.UU.) o por inspección y el mejor alineamiento (es decir, que resulte en el mayor porcentaje de homología sobre la ventana de comparación) generado por cualquiera de los diversos procedimientos seleccionados. También se puede hacer referencia a la familia de programas BLAST, como por ejemplo los divulgados por Altschulet al.,1997. Se puede encontrar una discusión detallada del análisis de secuencias en la Unidad 19.3 de Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley &; Sons Inc, 1994-1998, Capítulo 15.
La frase "agente estabilizador", como se utiliza en la presente memoria, incluye cualquier molécula que sea capaz de contribuir a la estabilidad de una composición de coagulación que comprenda un activador de protrombina, tal como preservando, aumentando, prolongando o potenciando de otro modo la capacidad de una composición de coagulación para coagular la sangre en relación con una unidad de tiempo determinada. Tal estabilización puede, por lo tanto, dar lugar a una composición de coagulación capaz de coagular la sangre en menos tiempo del que tardaría en coagular la sangre en ausencia del agente estabilizador. El tiempo que tarda la composición de coagulación, en combinación con el agente estabilizador, en coagular la sangre puede ser inferior al que tardaría en coagular la sangre en ausencia del agente estabilizador, debido a una serie de factores, incluidos, pero no limitados a, la conservación, el aumento, la prolongación o la potenciación de otro modo de la actividad coagulante de la composición de coagulación por el agente estabilizador, especialmente en circunstancias en las que la actividad coagulante de la composición de coagulación se vería comprometida de otro modo, por ejemplo, debido a la exposición de la composición de coagulación a diversas condiciones ambientales, tal como durante el procedimiento de fabricación de la composición de coagulación, incluida la exposición al calor y a la radiación esterilizante, así como el tiempo y las condiciones de almacenamiento de la composición de coagulación, incluidas la temperatura y la humedad, y además las condiciones de transporte de la composición de coagulación, incluidas la temperatura, la humedad y la presión atmosférica.
"Rigurosidad ", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a las condiciones de temperatura y fuerza iónica, y a la presencia o ausencia de determinados disolventes orgánicos, durante los procedimientos de hibridación y lavado. Cuanto mayor sea la rigurosidad, mayor será el grado de complementariedad entre las secuencias nucleotídicas diana inmovilizadas y las secuencias polinucleotídicas de la sonda marcada que permanecen hibridadas con la diana después del lavado. El término "alta rigurosidad" se refiere a las condiciones de temperatura e iónicas en las que sólo hibridarán las secuencias de nucleótidos que tengan una alta frecuencia de bases complementarias. La rigurosidad requerida depende de la secuencia de nucleótidos y de los diversos componentes presentes durante la hibridación. Generalmente, las condiciones estrictas se seleccionan para que sean aproximadamente 10 a 20 °C inferiores al punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. La Tm es la temperatura (con una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50 % de una secuencia diana se hibrida con una sonda complementaria.
El término"transformación" significa la alteración del genotipo de un organismo, por ejemplo una bacteria, levadura, mamífero, ave, reptil, pez o planta, mediante la introducción de un ácido nucleico extraño o endógeno.
Por “vector" se entiende una molécula polinucleotídica, preferentemente una molécula de ADN derivada, por ejemplo, de un plásmido, bacteriófago, levadura o virus, en la que puede insertarse o clonarse un polinucleótido. Un vector contiene preferentemente uno o más sitios de restricción únicos y puede ser capaz de replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora definida, incluyendo una célula o tejido diana o una célula o tejido progenitor de la misma, o ser integral con el genoma del hospedador definido de forma que la secuencia clonada sea reproducible. De acuerdo con lo anterior, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido lineal o circular cerrado, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedadora, se integra en el genoma y se replica junto con el cromosoma o cromosomas en los que se ha integrado. Un sistema vectorial puede comprender un único vector o plásmido, dos o más vectores o plásmidos, que juntos contienen el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula hospedadora, o un transposón. La elección del vector dependerá por lo general de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la que se va a introducir el vector. En el presente caso, el vector es preferentemente un vector viral o derivado de un virus, que es operablemente funcional en células animales y preferentemente de mamíferos. Tal vector puede derivar de un poxvirus, un adenovirus o una levadura. El vector también puede incluir un marcador de selección, tal como un gen de resistencia a los antibióticos, que puede utilizarse para la selección de transformantes adecuados. Ejemplos de tales genes de resistencia son conocidos para los expertos en la técnica e incluyen el gennptlIque confiere resistencia a los antibióticos kanamicina y G418 (Geneticin®) y el gen hph que confiere resistencia al antibiótico higromicina B.
Los términos "de tipo salvaje" y "de origen natural" se utilizan indistintamente para referirse a un gen o producto génico que tiene las características de ese gen o producto génico cuando se aísla de una fuente de origen natural. Un gen o producto génico de tipo salvaje (por ejemplo, un polipéptido) es el que se observa con mayor frecuencia en una población y, por tanto, se designa arbitrariamente como la forma "normal" o "de tipo salvaje" del gen.
La referencia a cualquier estado de la técnica en esta memoria descriptiva no es, y no debe tomarse como un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que el estado de la técnica forma parte del conocimiento general común del experto en la técnica.
Breve descripción del listado de secuencias
SEQ ID NO: 1 es una secuencia polipeptídica para la ecarina deEchis carinatus.
SEQ ID NO: 2 es una secuencia polipeptídica parcial de la basparina del veneno deBothrops asper.
SEQ ID NO: 3 es una secuencia polipeptídica parcial de la carinactivasa-1 del veneno deEchis carinatus(preparada como se describe en Yamada, D.,et al.,(1996)) - subunidad de 62 kDa.
SEQ ID NO: 4 es una secuencia polipeptídica parcial de la multactivasa del veneno deEchis multisquamatus(preparada como se describe en Yamada, D.,et al.,(1997)).
SEQ ID NO: 5 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor V del PtPA (o pseutarina C) dePseudonaja textilis.
SEQ ID NO: 6 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor V del PtPA (o pseutarina C) dePseudonaja textilis.
SEQ ID NO: 7 es una secuencia polipeptídica para el componente similar al Factor V del PtPA (o pseutarina C) dePseudonaja textilis.
SEQ ID NO: 8 es una secuencia polipeptídica para el componente similar al Factor V del PtPA (o pseutarina C) dePseudonaja textilis.
SEQ ID NO: 9 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor V de OsPA (u oscutarina C) deOxyuranus scutellatus.
SEQ ID NO: 10 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor V-de OsPA(u oscutarina C) deOxyuranus scutellatus scutellatus.
SEQ ID NO: 11 es una secuencia polipeptídica para el componente similar al Factor V de OsPA (u oscutarina C) deOxyuranus scutellatus scutellatus.
SEQ ID NO: 12 es una secuencia polipeptídica para el componente similar a Factor V de OsPA (u oscutarina C) deOxyuranus scutellatus.
SEQ ID NO: 13 es una secuencia polipeptídica para el componente similar a Factor V de OsPA (u oscutarina C) deOxyuranus scutellatus.
SEQ ID NO: 14 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor V-de la omicarina C deOxyuranus microlepidotus.
SEQ ID NO: 15 es una secuencia de nucleótidos que codifica el factor V deHomo sapiens.
SEQ ID NO: 16 es una secuencia polipeptídica del factor V deHomo sapiens.
SEQ ID NO: 17 es una secuencia de nucleótidos que codifica el factor V deBos Taurus.
SEQ ID NO: 18 es una secuencia polipeptídica del factor V deBos Taurus.
SEQ ID NO: 19 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor X-de PtPA (o pseutarina C) dePseudonaja textilis.
SEQ ID NO: 20 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor X-de PtPA (o pseutarina C) dePseudonaja textilis.
SEQ ID NO: 21 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor X-de PtPA (o pseutarina C) dePseudonaja textilis.
SEQ ID NO: 22 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor X-de PtPA (o pseutarina C) dePseudonaja textilis textilis.
SEQ ID NO: 23 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor X-de PtPA (o pseutarina C) dePseudonaja textilis textilis.
SEQ ID NO: 24 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor X-de PtPA (o pseutarina C) dePseudonaja textilis.
SEQ ID NO: 25 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor X-de PtPA (o pseutarina C) dePseudonaja textilis.
SEQ ID NO: 26 es una secuencia polipeptídica para el componente similar al Factor X del PtPA (o pseutarina C) dePseudonaja textilis.
SEQ ID NO: 27 es una secuencia polipeptídica para el componente similar al Factor X del PtPA (o pseutarina C) dePseudonaja textilis.
SEQ ID NO: 28 es una secuencia polipeptídica para el componente similar al Factor X de PtPA (o pseutarina C) dePseudonaja textilis textilis.
SEQ ID NO: 29 es una secuencia polipeptídica para el componente similar al Factor X de PtPA (o pseutarina C) dePseudonaja textilis textilis.
SEQ ID NO: 30 es una secuencia polipeptídica para el componente similar al Factor X del PtPA (o pseutarina C) dePseudonaja textilis.
SEQ ID NO: 31 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor X-de OsPA(u oscutarina C) deOxyuranus scutellatus.
SEQ ID NO: 32 es una secuencia polipeptídica para el componente similar al Factor X de OsPA (u oscutarina C) deOxyuranus scutellatus.
SEQ ID NO: 33 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor X de la omicarina C deOxyuranus microlepidotus.
SEQ ID NO: 34 es una secuencia polipeptídica del componente similar al Factor X-de la omicarina C deOxyuranus microlepidotus.
SEQ ID NO: 35 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor X-de la porfarina D dePseudechis porphyriacus.
SEQ ID NO: 36 es una secuencia polipeptídica del componente similar al Factor X-de la porfarina D dePseudechis porphyriacus.
SEQ ID NO: 37 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor de la hopsarina D deHoplocephalus stephensii.
SEQ ID NO: 38 es una secuencia polipeptídica del componente similar al Factor X de la lupulina D deHoplocephalus stephensii.
SEQ ID NO: 39 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor X de la notecarina D deNotechis scutatus.
SEQ ID NO: 40 es una secuencia polipeptídica del componente similar al Factor X de la notecarina D deNotechis scutatus.
SEQ ID NO: 41 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor X de la trocarina D deTropidechis carinatus.
SEQ ID NO: 42 es una secuencia polipeptídica del componente similar al Factor X de la trocarina D deTropidechis carinatus.
SEQ ID NO: 43 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor X del activador de protrombina deDemansia vestigiata.
SEQ ID NO: 44 es una secuencia polipeptídica del componente similar al Factor X del activador de protrombina deDemansia vestigiata.
SEQ ID NO: 45 es una secuencia de nucleótidos que codifica el componente similar al Factor X del activador de protrombina deDemansia vestigiata.
SEQ ID NO: 46 es una secuencia polipeptídica del componente similar al Factor X del activador de protrombina deDemansia vestigiata.
SEQ ID NO: 47 es una secuencia de nucleótidos que codifica el factor X deHomo sapiens.
SEQ ID NO: 48 es una secuencia polipeptídica del factor X deHomo sapiens.
SEQ ID NO: 49 es una secuencia de nucleótidos que codifica el factor X deBos Taurus.
SEQ ID NO: 50 es una secuencia polipeptídica del factor X deBos Taurus.
SEQ ID NO: 51 es una secuencia polipeptídica parcial de la carinactivasa-1 del veneno deEchis carinatus(preparada como se describe en Yamada, D.,et al.,(1996)) -subunidad de 17 kDa.
SEQ ID NO: 52 es una secuencia polipeptídica parcial de la carinactivasa-1 del veneno deEchis carinatus(preparada como se describe en Yamada, D.,et al.,(1996)) -subunidad de 14 kDa.
SEQ ID NO: 53 es una secuencia polipeptídica de la forma no depurada de la ecarina de tipo salvaje del veneno deEchis carinatus.
SEQ ID NO: 54 es una secuencia polipeptídica para la ecarina del veneno deEchis carinatus,en la que se ha eliminado el péptido señal y se ha insertado un sitio de proteasa TEV ENLYFQS en el límite entre el propéptido y el dominio maduro.
SEQ ID NO: 55 es una secuencia polipeptídica de la forma madura de la ecarina de tipo salvaje del veneno deEchis carinatus.
SEQ ID NO: 56 es una secuencia polipeptídica para una forma mutante de ecarina del veneno deEchis carinatus, en la que se ha eliminado el péptido señal y se ha insertado un sitio de proteasa TEV ENLYFQS en el límite entre el propéptido y el dominio maduro, y se ha introducido una mutación P396S.
SEQ ID NO: 57 es una secuencia polipeptídica de la forma madura de una ecarina mutante P396S del veneno deEchis carinatus.
Breve descripción de las figuras
La presente invención se describirá ahora, a modo de ejemplo únicamente, con referencia a las siguientes figuras. La figura 1 muestra patrones de gel SDS-PAGE de rFv (carril 2), cinco muestras de OsPA (carriles 3, 4, 5, 6 y 7) separadas por diferentes geles y Fxa purificado (carril 8). Los marcadores están en el carril 1.
La figura 2 muestra las trazas tromboelastográficas de la coagulación de sangre entera recalcificada por alícuotas de 31 ng de cada una de las diez preparaciones de OsPA. Las 10 trazas superpuestas de la izquierda (coagulación rápida) representan las diez preparaciones, mientras que las trazas etiquetadas Ca representan duplicados de la coagulación por calcio solo.
La figura 3 muestra la cromatografía de 1,05 gramos de veneno deOxyuranus scutellatusutilizando Superdex ™200 (columna de gel: 5 cm de diámetro, 95 cm de longitud) (17 de abril de 2012).
La figura 4 muestra la curva de actividad coagulante en sangre entera de la fracción concentrada de OsPA purificada en resina Superdex.
La figura 5 muestra un diagrama que representa un gráfico del Thrombelastograph® durante la coagulación de la sangre entera (del manual del TEG ® Haemostasis Analyser 5000 Series).
La figura 6 muestra las curvas de progreso para el ensayo S-2222 utilizando OsPA combinado (17/4/12) (A) y curva estándar (B).
La figura 7 muestra la actividad coagulante en sangre entera del OsPA recién diluido comparada con la del OsPA secado en desecador. Los datos D0 corresponden a muestras líquidas recién diluidas de OsPA agregadas a tubos de recogida de sangre; los datos D1 corresponden a muestras secadas durante una noche a temperatura ambiente en tubos de recogida de sangre en un desecador al vacío.
La figura 8 muestra los tiempos de coagulación de la sangre entera en tubos de recogida de sangre que contenían OsPA recién diluido y en tubos similares en los que el OsPA se había secado utilizando un Genevac.
La figura 9 muestra la estabilidad del OsPA seco en Gelofusine a temperatura ambiente durante 211 días en el tiempo de coagulación de la sangre entera. Serie de la izquierda: controles utilizando 1 |jg de OsPA recién diluido en tampón ph 7,4; serie del medio: muestras de prueba en las que se secó 1 jg de OsPA en presencia de Gelofusine (20 jl); serie de la derecha: tiempos de coagulación de muestras de sangre recalcificada sin OsPA.
La figura 10 muestra gráficos lineales con los datos de la figura 9. A: todos los puntos de cero a 211 días; B: puntos de cero a 65 días.
Figura 11. Tiempos de coagulación (medias de duplicados) para la coagulación de sangre entera citratada recalcificada por OsPA en tubos de recogida de sangre tras su almacenamiento a temperatura ambiente hasta 195 días. Serie de la izquierda: controles utilizando 10 g de OsPA recién diluido en tampón de acetato de amonio 0,1 M pH 6,8; serie del medio: muestras de prueba en las que se secó 1 jg de OsPA en presencia de 0,5% p/v de albúmina de suero bovino y 0,5% p/v de dextrano; serie de la derecha: tiempos de coagulación de muestras de sangre recalcificada sin OsPA.
La figura 12 muestra gráficos lineales de los tiempos de coagulación para los tubos de control fresco y OsPA/BSA/dextrano. Datos de la figura 11.
La figura 13 muestra los tiempos de coagulación en segundos de la sangre citratada recalcificada tras incubación a 50 C. Código de identificación de las muestras: ‘B’ = tubo BD; 7 ’ = pH 7,4; ‘F’ = OsPA recién diluido, sin secar; ‘DR’ =<secado y conservado a temperatura ambiente; ‘D50’ = secado y conservado a 50 C; ‘0, 1, 2 o 5’ = 0, 1, 2 o 5>Dg<de>OsPA. Las barras verticales representan el almacenamiento durante cero, uno y siete días.
Figura 14. Tiempos de coagulación en segundos para sangre entera citratada recalcificada tras incubación a 50 °C. Código de identificación de las muestras: 'B' = tubo BD; '6' = pH 6,0; 'F' = OsPA recién diluido, sin secar; 'DR' = secado y conservado a temperatura ambiente; 'D50' = secado y conservado a 50 °C; '0, 1, 2 o 5' = 0, 1, 2 o 5 jg de OsPA. Las barras verticales representan el almacenamiento durante cero, uno y siete días.
La figura 15 muestra los tiempos de coagulación en segundos de la sangre citratada recalcificada tras incubación a 50 °C. Código de identificación de las muestras: 'G' = tubo Greiner; '7' = pH 7,4; 'F' = OsPA recién diluido, sin secar; 'DR' = secado y conservado a temperatura ambiente; 'D50' = secado y conservado a 50 °C; '0, 1' = 0 o 1 jg de OsPA. Las barras verticales representan el almacenamiento durante cero, 1, 3, 7, 14 y 30 días, respectivamente.
La figura 16 muestra los tiempos de coagulación en segundos de la sangre citratada recalcificada tras incubación a 50 °C. Código de identificación de las muestras: 'G' = tubo Greiner; '6' = pH 6,0; 'F' = OsPA recién diluido, sin secar; 'DR' = secado y conservado a temperatura ambiente; 'D50' = secado y conservado a 50 °C; '0 o 1' = 0 o 1 jg de OsPA. Las barras verticales representan el almacenamiento durante cero, 1, 3, 7, 14 y 30 días, respectivamente.
La figura 17 muestra gráficos lineales de los datos de la figura 15.
La figura 18 muestra gráficos lineales para los datos de la figura 16.
La figura 19A muestra los tiempos de coagulación en el ensayo de coagulación de sangre entera para los tubos indicados anteriormente y para los controles frescos y el control desprovisto de OsPA. Los tubos irradiados se trataron con radiación gamma de 15 kGy. Cada barra representa la media de dos estimaciones.
La figura 19B muestra los tiempos de coagulación en el ensayo de coagulación de sangre entera para los tubos indicados anteriormente y para los controles frescos y el control desprovisto de OsPA. Los tubos irradiados se trataron con radiación gamma de 15kGy. Cada barra representa la media de dos estimaciones (BD y GBO son códigos de dos tubos de plástico diferentes para la extracción de sangre). Todos los tubos, salvo los controles, se formularon con trehalosa disuelta en gelofusine.
La figura 19C muestra los tiempos de coagulación para los tubos como se indica arriba y para los controles frescos y el control desprovisto de OsPA. Los tubos irradiados se trataron con radiación gamma de 15 kGy. Cada barra representa la media de dos estimaciones (BD y GBO son códigos de dos tubos de plástico diferentes para la extracción de sangre). Todos los tubos, salvo los controles, se formularon con trehalosa disuelta en gelofusine.
La figura 20 muestra los tiempos de coagulación en sangre entera para los tubos que contienen ecarina y para los controles frescos y el control desprovisto de OsPA. Los tubos irradiados se trataron con radiación gamma de 25 kGy y se almacenaron a temperatura ambiente durante 212 días. Todos los tubos, salvo los controles, se formularon con gelofusine. La figura 21 muestra la actividad del OsPA seco en diferentes formulaciones de azúcar y otros en tubos de plástico de recogida de sangre lisos a 50 °C en la coagulación de sangre entera recalcificada.
La figura 22 muestra la actividad del OsPA seco en diferentes formulaciones de azúcar y otras en tubos de plástico de recogida de sangre lisos a temperatura ambiente en la coagulación de sangre entera recalcificada.
La figura 23 muestra la actividad del OsPA seco formulado en gelofusine y lactulosa 6 y 10 % en tubos de recogida de sangre lisos a temperatura ambiente en la coagulación de sangre entera recalcificada.
La figura 24 muestra la actividad de la ecarina desecada en diferentes formulaciones de azúcar y otras en tubos de plástico de recogida de sangre lisos a temperatura ambiente en la coagulación de sangre entera recalcificada.
Descripción detallada
Los presentes inventores han descubierto que la estabilidad de las composiciones de coagulación que comprenden activadores de protrombina aumenta significativamente cuando se formulan en combinación con uno o más agentes adicionales, tales como un coloide. Esta mayor estabilidad es significativa por la capacidad de fabricar, esterilizar, transportar y almacenar composiciones de coagulación (por ejemplo, en forma de tubo de recogida) sin pérdida significativa de la actividad coagulante en condiciones que anteriormente habrían comprometido la eficacia de tales composiciones. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención son estables tras la esterilización por radiación, el almacenamiento a altas temperaturas y el almacenamiento durante largos periodos de tiempo. Los estudios de respuesta a la dosis y de intervalo para determinar la dosis eficaz de OsPA a utilizar en el procedimiento de secado por pulverización del tubo de coagulación tenían como objetivo lograr la coagulación de la sangre entera en aproximadamente 5 minutos. Está claramente demostrado que concentraciones de OsPA de 0,1-1,0 ug en 4 ml de sangre no anticoagulada lo conseguirán. Los estudios ilustran en primer lugar en el ejemplo 1 que el activador de protrombina del veneno de Taipán de Costa (OsPA) altamente purificado, un activador de protrombina del Grupo C, puede purificarse a partir de veneno de Taipán (Os) crudo mediante cromatografía de filtración en gel, por ejemplo, en una columna Superdex 200, cuya actividad puede determinarse por coagulación en sangre entera citratada recalcificada o mediante la prueba cromogénica S-2222 diseñada para la detección del Factor Xa, o mediante la prueba cromogénica S-2238 diseñada para la prueba de la trombina. El ejemplo 1 también detalla cómo las fracciones que contienen OsPA pueden concentrarse utilizando, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon y prepararse como una solución de glicerol al 50 % para su almacenamiento a largo plazo a -20 °C. La solución madre de glicerol puede dializarse y liofilizarse como se detalla en el ejemplo 1. La ecarina utilizada en los ejemplos (extraída del veneno deEchis Carinatus)se adquirió comercialmente y se ensayó como se detalla en el ejemplo 1.
Para obtener resultados comparables entre experimentos, se desarrollaron procedimientos normalizados. El ejemplo 2 detalla un procedimiento normalizado de preparación de tubos de extracción de sangre con solución activadora de protrombina y componentes de la formulación, que incluye un tensioactivo normalizado para recubrir el fondo del tubo y procedimientos normalizados de secado del tubo. El ejemplo 3 detalla los protocolos de irradiación estándar para aproximarse a los procedimientos de esterilización que se encuentran en la fabricación comercial de tubos de extracción de sangre. Las muestras de sangre que se utilizarán en la evaluación de los tubos de recogida de sangre se probaron utilizando procedimientos estándar, como se detalla en el ejemplo 4, garantizando la normalidad de los parámetros de coagulación y, por lo tanto, la idoneidad para su uso en las pruebas. Las pruebas de rendimiento de coagulación del OsPA u otros activadores de protrombina se realizaron utilizando procedimientos estándar como se detalla en el ejemplo 5, incluyendo un ensayo de coagulación plasmática, evaluación visual de la coagulación, tromboerlastografía (TEG) y ensayos cromogénicos. Las normas para las pruebas de estabilidad y la medición de analitos del suero resultante también se incluyen en el ejemplo 5, completando las descripciones de las pruebas estándar.
Las formulaciones para mejorar la estabilidad del OsPA en un tubo de recogida de sangre se divulgan en el ejemplo 6, que compara las condiciones de secado del tubo con y sin el uso de tensioactivos y un coloide, BSA. Se ha demostrado que la presencia de tensioactivo y de coloide BSA cuando se seca con el procedimiento Genevac, secado al vacío, proporciona una mejor actividad de coagulación (reducción del tiempo de coagulación). Los datos del ejemplo 6 también demuestran una mejora con la adición de 0,1 % de BSA al OsPA sin tensioactivo en tubos, sin embargo la eficacia óptima se consigue con la adición de un recubrimiento tensioactivo. Todos los ejemplos posteriores utilizan un recubrimiento tensioactivo en el tubo. El ejemplo 7 continúa este programa experimental mostrando una disminución de la actividad de coagulación a partir de T0 cuando la formulación del ejemplo 6 se almacenó a 25 °C durante un período de 85 días. El ejemplo 8 se basa en los ejemplos 6 y 7 probando una serie de agentes adicionales para potenciar la estabilidad de la formulación, incluidos los coloides BSA (a una concentración más alta) y Dextrano. Se demuestra que tanto la BSA (0,5 %) como el dextrano (0,5 %), aumentan la estabilidad del OsPA a 25°C durante 99 días en comparación con el tampón solo, con 1 |jg de OsPA capaz de coagular la sangre en aproximadamente 5 min. El ejemplo 9 utiliza el coloide gelofusine (gelatina succinilada al 4 %) y consigue la estabilidad de 1 jg de OsPA tras 211 días de almacenamiento a 25 °C (con un tiempo de coagulación de 5 minutos). También se incluyen datos utilizando sangre fresca en tubos con esta formulación. Se demostró que la gelofusine tenía un mayor efecto sobre la estabilidad que la BSA al 0,5 % o el dextrano al 0,5 %, pero todos los coloides conferían mayor estabilidad que el tampón. El ejemplo 10 muestra que una combinación de 0,5 % de Dextrano y 0,5 % de BSA da estabilidad durante 195 días a 25°C, y mayor estabilidad a 99 días que cualquiera de los dos coloides por separado, como se ilustra en el ejemplo 8. En el ejemplo 11, la formulación de gelofusine se mantuvo estable a 50 °C durante 30 días, lo que indica que se puede conseguir una estabilidad a más largo plazo. La irradiación gamma, tal como se utiliza en la esterilización de tubos comerciales, se probó con tubos OsPA en el ejemplo 12 utilizando las formulaciones BSA/Dextrano y gelofusine y también una formulación con gelofusine y un azúcar no reductor (trehalosa), exponiendo todas las muestras a una dosis de 15kGy. Se demostró que el OsPA formulado con BSA/dextrano y gelofusine mantenía la actividad por encima del valor de referencia tras la irradiación, y que el efecto protector aumentaba en el caso de la gelofusine con la adición de trehalosa. Otro activador de la protrombina, la ecarina, se ensayó con éxito con la formulación de gelofusine y trehalosa. El ejemplo 13 expuso la ecarina formulada con 4 % de gelofusine a 25 kGy de irradiación gamma, demostrando la retención de un % significativo de actividad coagulante. No hubo diferencias significativas en la actividad de coagulación entre los tubos que habían sido irradiados en T0 y los que no lo habían sido tras 212 días de almacenamiento a temperatura ambiente. El ejemplo 14 probó OsPA formulado con gelofusine y una gama de azúcares y agentes adicionales a temperatura ambiente y 50 °C y mostró que las formulaciones de gelofusine y trehalosa/sacarosa permitían tiempos de coagulación aceptables después de 10 semanas a 50 °C y a temperatura ambiente durante más de 12 m. Aunque con datos de estabilidad más limitados, la lactulosa resulta prometedora como otro azúcar estabilizante. En el ejemplo 15 se probó la Ecarina formulada con gelofusine y una gama de azúcares y agentes adicionales a temperatura ambiente y se demostró que las formulaciones de gelofusine y trehalosa/sacarosa permitían tiempos de coagulación aceptables después de más de 12 m a temperatura ambiente. El ejemplo 16 ilustra que la presencia de gelofusine en los tubos de recogida de sangre no tiene ningún efecto en el análisis de analitos.
En resumen, los ejemplos demuestran los procedimientos de extracción para OsPA y las formulaciones necesarias para lograr una estabilidad comercialmente aceptable (retención de la actividad de coagulación) para activadores de protrombina tales como OsPA o ecarina en un tubo de recogida de sangre con exposición a tiempo de almacenamiento, temperatura e irradiación. A este respecto, se demostraron claramente las propiedades de mejora de la estabilidad de los coloides, en particular, la gelofusine o la BSA solas o en combinación con agentes adicionales.
Activadores de la protrombina
La presente invención se basa en parte en el hallazgo de que la estabilidad de las composiciones de coagulación que comprenden activadores de protrombina como se definen en las reivindicaciones aumenta significativamente cuando se formulan en combinación con uno o más agentes adicionales, tales como un coloide.
En algunas realizaciones, el activador de protrombina es un activador de protrombina exógeno. Como se utiliza en la presente memoria, un "activador de protrombina exógeno" significa un activador de protrombina obtenido de una fuente distinta de la muestra de sangre a partir de la cual se va a preparar la muestra de suero.
Los activadores de protrombina utilizados en la presente invención pueden comprender formas de activadores de protrombina de tipo salvaje o natural, recombinantes, mutantes o genéticamente modificados, incluidos los obtenidos, derivados o derivables de cualquier organismo adecuado, incluido el activador de protrombina de serpiente, humano, bovino y bacteriano.
En algunas realizaciones de la presente invención, el activador de protrombina es un activador de protrombina de serpiente. Convenientemente, el activador de protrombina es un activador de protrombina de veneno de serpiente. Los activadores de la protrombina del veneno de serpiente se clasifican generalmente en cuatro grupos (A, B, C y D) en función de su estructura, función y necesidades de cofactores.
En realizaciones particulares, el activador de protrombina del veneno de serpiente es un activador de protrombina del grupo A. Los activadores de protrombina del grupo A son metaloproteinasas formadas por tres dominios: una metaloproteinasa, una desintegrina y un dominio rico en Cys. El dominio metaloproteinasa contiene la secuencia consenso HEXXHXXGXXH, correspondiente al sitio activo quelante del zinc. Estos activadores de la protrombina se encuentran al menos en varios venenos de víboras, e incluyen la ecarina del veneno deEchis carinatusy la basparina del venenode Bothrops aspervenom.
En realizaciones particulares, el activador de protrombina del veneno de serpiente es un activador de protrombina del grupo B. Los activadores de protrombina del grupo B son metaloproteinasas formadas por dos subunidades unidas de forma no covalente: una metaloproteinasa y un dímero disulfuro similar a una lectina de tipo C. Estos activadores de la protrombina se encuentran en varios venenos de víbora, e incluyen la carinactivasa-1 y la carinactivasa-2 del veneno de Echiscarinatusy la multactivasa del veneno deEchis multisquamatus.
En realizaciones particulares, el activador de protrombina del veneno de serpiente es un activador de protrombina del grupo C. Los activadores de protrombina del grupo C son proteasas de serina y se parecen al complejo factor Xafactor Va de los mamíferos. La pseutarina C (o PtPA) y la oscutarina C (u OsPA) son activadores de protrombina del grupo C procedentes de los venenos dePseudonaja textilisyOxyuranus scutellatus,respectivamente. La omicarina C es el activador de protrombina del veneno deOxyuranus microlepidotus.
En realizaciones particulares, el activador de protrombina del veneno de serpiente es un activador de protrombina del grupo D. Los activadores de protrombina del grupo D son proteasas de serina y funcionalmente similares al factor Xa de mamíferos. La porfarina D (dePseudechis porphyriacus),la notecarina D (deNotechis scutatus scutatus),la trocarina D (deTropidechis carinatus),la hopsarina D (deHoplocephalus stephensi)y la notenarina D (deNotechis aterniger)son todos activadores de la protrombina del grupo D.
Una revisión de los activadores de protrombina de serpiente se proporciona en Kini, R. M. (2005), y de los específicamente procedentes del veneno de los elápidos australianos (activadores de protrombina de los grupos C y D) se proporciona en St. (2005), cuyo contenido se recoge íntegramente en la presente memoria. Estas dos revisiones utilizan la clasificación de los activadores de protrombina de serpiente en los grupos A-D descrita anteriormente. Esta clasificación sustituye al sistema de clasificación anterior que utilizaba los grupos I-III (el grupo I abarca los grupos A y B; el grupo II es ahora el grupo D y el grupo III es ahora el grupo C), y a veces los grupos adicionales IV (activadores del veneno de serpiente que escinden los enlaces peptídicos de la protrombina pero no convierten la protrombina en un producto enzimáticamente activo,es decir,trombina o meizotrombina) y V (activadores bacterianos de la protrombina) descritos en artículos de revisión anteriores, como Rosing, J.et al.(1991) y Rosing, J.et al.(1992). Para una explicación sobre el cambio del sistema de clasificación, véase Kini, R, M.,et al.(2001).
En realizaciones específicas, el activador de protrombina de serpiente se obtiene de la FamiliaElapidae,ejemplos ilustrativos de los cuales incluyen especies de los génerosDemansia, Hoplocephalus, Notechis, Oxyuranus, Pseudechis, Pseudonaja, Rhinoplocephalus,yTropidechisincluyendo pero no limitado aDemansia vestigiata, Hoplocephalus stephensii, Notechis ater humphreysi, Notechis ater niger,Notechis aterserventyi, Notechis defers, Notechis humphreysi, Notechis niger,Notechis occidentalis,Notechis scutatus,Notechis scutatus scutatus,Notechis serventyi,Oxyuranus microlepidotus, Oxyuranus scutellatus, Pseudechis porphyriacus, Pseudonaja affinis, Pseudonaja inframaculata, Pseudonaja nuchalis, Pseudonaja textilis, Rhinoplocephalus nigrescensy Tropidechis carinatus.
En realizaciones específicas, el activador de protrombina de serpiente se obtiene de la familiaViperidae,ejemplos ilustrativos de la cual incluyen especies de los génerosBotrhops, EchisyTrimeresurus,incluyendo pero no limitado aBothrops alternatus, Bothrops asper, Bothrops atrox,Bothropsatrox asper, Bothrops brasili, Bothrops castelnaudi, Bothrops columbiensis, Bothrops erythromelas, Bothrops fonsecai, Bothrops itapetiningae, Bothrops jararaca, Bothrops neuwiedi, Bothrops venezuelensis, Echis carinatus, Echis coloratus, Echis multisquamatusy Trimeresurus okinavensis.
En realizaciones específicas, el activador de protrombina de serpiente se obtiene de la FamiliaColubridae,ejemplos ilustrativos de la cual incluyen especies de los génerosDispholidus, RhabdophisyThelotornis,incluyendo pero no limitado aDispholidus typus, Rhabdophis tigrinus tigrinus, Thelotornis kirtlandii,yThelotornis capensis.
En algunas realizaciones, el activador de protrombina de serpiente procede o se obtiene del veneno de serpiente. La purificación y caracterización del PtPA a partir del veneno de serpiente P.textilisse describe en Masci (1986) y Masciet al.,(1988), y el OsPA a partir del veneno de O.scutellatusse describe en Speijeret al.,(1986). La purificación y caracterización de la ecarina del veneno deEchis carinatusse describe en Morita, Tet al.(1981) y Nishida, Set al.(1995), de la carinactivasa del veneno deEchis carinatusse describe en Yamada, Det al.(1996), de la multactivasa deEchis multisquamatusse describe en Yamada, D. etal.,(1997), y de la notecarina deNotechis scutatusse describe en Tans, Get al.,(1985).
En determinadas realizaciones, el activador de protrombina es un activador de protrombina de mamífero. Los activadores de protrombina de mamíferos incluyen los derivados de sangre y/o tejidos humanos y los derivados de sangre y/o tejidos bovinos o versiones recombinantes de estas proteínas
En determinadas realizaciones, el activador de protrombina es un activador de protrombina bacteriano. Entre los activadores bacterianos de la protrombina se encuentran los procedentes deStaphylococcus aureus, Peptococcus indolicus, Bacteroides melaninogenicus,yPseudomonas aeruginosa(Rosing, J.et al.(1991).
Como apreciarán los expertos en la técnica, el activador de protrombina puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en uno o más polipéptidos. En algunas realizaciones, el activador de protrombina comprende, consiste esencialmente en o consiste en un único polipéptido. En otras realizaciones, el activador de protrombina comprende, consiste esencialmente en, o consiste en más de un polipéptido, incluyendo pero no limitado a complejos de polipéptidos. Cuando el activador de protrombina comprenda, consista esencialmente o consista en más de un polipéptido, cada polipéptido podrá proceder de organismos del mismo género o de géneros diferentes, y/o de la misma especie o de especies diferentes.
el activador de protrombina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las establecidas en SEQ Id NOs: 1, 55, 53, 54, 56, 57, 11, 12, 13, 32, 2, 3, 4, 7, 8, 16, 18, 26, 27, 28, 29, 30, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51 o 52 o comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las establecidas en los SEQ Id NOs: 9, 10, 31, 5, 6, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 o 49.
En algunas realizaciones, el activador de protrombina es derivado o derivable del veneno de serpiente.
En algunas realizaciones, el activador de protrombina es un activador de protrombina de serina proteasa del Grupo C parecido al complejo factor Xa-factor Va de mamíferos.
En realizaciones particulares, el activador de protrombina se selecciona del grupo que consiste en Pseutarin C (o PtPA) y oscutarin C (u OsPA) derivado o derivable de los venenos dePseudonaja textilisyOxyuranus scutellatus,respectivamente.
En una realización preferida, el activador de protrombina es oscutarin C (u OsPA) derivado o derivable del veneno deOxyuranus scutellatus.
En una realización particularmente preferida, el activador de protrombina comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ Id NOs: 11, 12, 13 o 32, o comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las establecidas en SEQ Id NOs: 9, 10 o 31.
El activador de protrombina puede comprender la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NOs: 1, 55, 53, 54, 56, 57.
Activadores quiméricos de protrombina y polipéptidos de fusión
La presente invención también describe el uso de activadores de protrombina que comprenden un polipéptido quimérico. Como se utiliza en la presente memoria, un "polipéptido quimérico" incluye un primer componente polipeptídico que comprende un polipéptido obtenido de un primer organismo unido a un segundo componente polipeptídico obtenido de un segundo organismo. En algunas manifestaciones, el primer organismo y el segundo son de géneros diferentes. En otras manifestaciones, el primer organismo y el segundo organismo son especies diferentes del mismo género. En determinadas manifestaciones, el activador de protrombina comprende un polipéptido quimérico que se asemeja a un complejo factor Xa-factor Va, en el que el primer polipéptido comprende un polipéptido similar al factor Xa y el segundo polipéptido comprende un polipéptido similar al factor Va. En determinadas manifestaciones específicas, el primer polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las establecidas en SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 y 50, o comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las establecidas en SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 y 49, y el segundo polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las establecidas en SEQ ID NOs: 7, 8, 11, 12, 13, 16 y 18, o comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las establecidas en SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 14, 15 y 17.
La presente invención también describe el uso de activadores de protrombina que comprenden un polipéptido de fusión. Como se utiliza en la presente memoria, un "polipéptido de fusión" incluye un primer componente polipeptídico unido a un segundo componente polipeptídico. El primer componente polipeptídico puede obtenerse de un primer organismo y el segundo componente polipeptídico puede obtenerse de un segundo organismo. En algunas manifestaciones, el primer organismo y el segundo son de géneros diferentes. En otras manifestaciones, el primer organismo y el segundo organismo son especies diferentes del mismo género. El primer componente polipeptídico o el segundo componente polipeptídico del polipéptido de fusión puede corresponder a la totalidad o a una porción (por ejemplo, un fragmento como se describe en la presente memoria) de una secuencia de aminoácidos de tipo salvaje o natural. El segundo componente polipeptídico puede fusionarse al N-terminal o al C-terminal del primer componente polipeptídico.
Fragmentos de polipéptidos de tipo salvaje o naturales
En la presente memoria se describen fragmentos de un polipéptido de longitud completa de tipo salvaje o de origen natural, en los que el activador de protrombina presenta actividad activadora de protrombina.
Por lo general, fragmentos de un polipéptido de longitud completa pueden participar en una interacción, por ejemplo una interacción intramolecular o intermolecular. Tales fragmentos incluyen péptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 51, y 52 y péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente similares o derivadas de las secuencias de aminoácidos de un polipéptido (putativo) de longitud completa, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOs: 1, 7, 8, 11, 12, 13, 16, 18, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 53, 54, 55, 56 y 57, o las secuencias de aminoácidos codificadas por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las establecidas en SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 y 49, que incluye menos aminoácidos que un polipéptido de longitud completa, y presentan una actividad de dicho polipéptido.
Variantes de activadores naturales de protrombina (polipéptido)
La presente invención también describe activadores de protrombina que comprenden polipéptido(s) que es/son variante(s) del polipéptido(s) de tipo salvaje o de origen natural. Los activadores de protrombina que comprenden uno o más polipéptidos variantes descritos en la presente invención son biológicamente activos, es decir, siguen teniendo actividad activadora de protrombina.
Tales activadores de protrombina "variantes" incluyen polipéptidos derivados del polipéptido nativo, en los que los polipéptidos se derivan del (de los) polipéptido(s) nativo(s) correspondiente(s) mediante deleción (denominada truncamiento) o adición de uno o más aminoácidos al extremo N-terminal y/o C-terminal del (de los) polipéptido(s) nativo(s); deleción o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios del (de los) polipéptido(s) nativo(s); o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios del (de los) polipéptido(s) nativo(s). Estas variantes de los activadores de la protrombina pueden deberse, por ejemplo, a polimorfismos genéticos o a la manipulación humana.
Otros ejemplos no limitantes de polipéptidos variantes incluyen polipéptido precursor o polipéptido en forma zimógena formas procesadas de un polipéptido de longitud completa o precursor o polipéptido en forma zimógena.
Las variantes de un polipéptido de tipo salvaje o de origen natural tendrán 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de similitud o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del polipéptido de tipo salvaje o natural, incluidas, pero no se limitan a, las secuencias de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16, 18, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 53 y 55 o las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47 y 49, según lo determinado por los programas de alineación de secuencias descritos en la presente memoria utilizando parámetros predeterminados. Una variante de un polipéptido de tipo salvaje o de origen natural puede diferir de ese polipéptido generalmente en 200, 100, 50 o 20 residuos de aminoácidos o, convenientemente, en tan solo 1-15 residuos de aminoácidos, tan solo 1-10, tales como 6-10, tan solo 5, tan solo 4, 3, 2, o incluso 1 residuo de aminoácido. En algunas manifestaciones, un polipéptido variante difiere de las secuencias correspondientes en SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16, 18, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 53 y 55 o las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 o 49, en al menos 1 pero en menos de 15, 10 o 5 residuos de aminoácidos. En otras manifestaciones, difiere de las secuencias correspondientes en SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16, 18, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 53 y 55, o las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47 o 49, en al menos un residuo pero menos del 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de los residuos.
Un polipéptido que no forme parte de la invención puede alterarse de diversas maneras, incluyendo sustituciones de aminoácidos, deleciones, truncamientos e inserciones. Los procedimientos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar variantes de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido mediante mutaciones en el ADN. Los procedimientos de mutagénesis y alteración de secuencias de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Kunkel (1985), Kunkel et a l ., (1987), la Patente de los Estados Unidos 4,873,192, Watsonet al.,(1987) y las referencias citadas en ellos. En el modelo de Dayhoffet al(1978) se puede encontrar orientación sobre las sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan a la actividad biológica de la proteína de interés. Los procedimientos de cribado de productos génicos de bibliotecas combinatorias realizadas por mutaciones puntuales o truncamiento, y de cribado de bibliotecas de ADNc para productos génicos que tengan una propiedad seleccionada son conocidos en la técnica. Tales procedimientos son adaptables para el cribado rápido de las bibliotecas de genes generadas por mutagénesis combinatoria de polipéptidos. La mutagénesis recursiva de conjunto (REM), una técnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, puede utilizarse en combinación con los ensayos de cribado para identificar variantes polipeptídicas; véase, por ejemplo, Arkinet al.(1992) y Delagraveet al.(1993). Las sustituciones conservativas, tales como el intercambio de un aminoácido por otro con propiedades similares, pueden ser deseables, como se explica con más detalle a continuación.
Los polipéptidos variantes pueden contener sustituciones conservativas de aminoácidos en diversos lugares a lo largo de su secuencia, en comparación con una secuencia de aminoácidos madre (por ejemplo natural o de referencia).
Una "sustitución conservativa de aminoácidos" es aquella en la que el residuo de aminoácido se sustituye por un residuo de aminoácido con una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos con cadenas laterales similares, que en general pueden subclasificarse como sigue:
Ácido: El residuo tiene una carga negativa debido a la pérdida del ion H a pH fisiológico y el residuo es atraído por la solución acuosa para buscar las posiciones superficiales en la conformación de un péptido en el que está contenido cuando el péptido está en medio acuoso a pH fisiológico. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral ácida incluyen el ácido glutámico y el ácido aspártico.
Básico: El residuo tiene una carga positiva debida a la asociación con el ion H a pH fisiológico o dentro de una o dos unidades de pH del mismo (por ejemplo, histidina) y el residuo es atraído por la solución acuosa para buscar las posiciones superficiales en la conformación de un péptido en el que está contenido cuando el péptido está en medio acuoso a pH fisiológico. Entre los aminoácidos con cadena lateral básica se encuentran la arginina, la lisina y la histidina.
Cargado: Los residuos están cargados a pH fisiológico y, por lo tanto, incluyen aminoácidos con cadenas laterales ácidas o básicas (es decir, ácido glutámico, ácido aspártico, arginina, lisina e histidina).
Hidofóbico: Los residuos no están cargados a pH fisiológico y el residuo es repelido por la solución acuosa para buscar las posiciones interiores en la conformación de un péptido en la que está contenido cuando el péptido está en medio acuoso. Entre los aminoácidos que tienen una cadena lateral hidrofóbica se encuentran la tirosina, la valina, la isoleucina, la leucina, la metionina, la fenilalanina y el triptófano.
Neutro/polar: Los residuos no están cargados a pH fisiológico, pero el residuo no es suficientemente repelido por las soluciones acuosas como para que busque posiciones internas en la conformación de un péptido en el que está contenido cuando el péptido está en medio acuoso. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral neutra/polar incluyen la asparagina, la glutamina, la cisteína, la histidina, la serina y la treonina.
Esta descripción también caracteriza a determinados aminoácidos como "pequeños", ya que sus cadenas laterales no son lo suficientemente grandes, aunque carezcan de grupos polares, para conferirles hidrofobicidad. A excepción de la prolina, los aminoácidos "pequeños" son los que tienen cuatro carbonos o menos cuando al menos un grupo polar está en la cadena lateral y tres carbonos o menos cuando no. Entre los aminoácidos con una cadena lateral pequeña se encuentran la glicina, la serina, la alanina y la treonina. El aminoácido secundario codificado genéticamente prolina es un caso especial debido a sus conocidos efectos sobre la conformación secundaria de las cadenas peptídicas. La estructura de la prolina difiere de la de todos los demás aminoácidos naturales en que su cadena lateral está unida al nitrógeno del grupo a-amino, así como al a-carbono. Varias matrices de similitud de aminoácidos (por ejemplo, la matriz PAM120 y la matriz PAM250 divulgadas, por ejemplo, por Dayhoffet al.(1978) y por Gonnetet al.(1992)), sin embargo, incluyen la prolina en el mismo grupo que la glicina, la serina, la alanina y la treonina. De acuerdo con lo anterior, la prolina se clasifica como aminoácido "pequeño".
El grado de atracción o repulsión requerido para la clasificación como polar o no polar es arbitrario y, por lo tanto, los aminoácidos específicamente contemplados por la invención se han clasificado como uno u otro. La mayoría de los aminoácidos que no se nombran específicamente pueden clasificarse en función de su comportamiento conocido.
Los residuos de aminoácidos pueden además subclasificarse como cíclicos o no cíclicos, y aromáticos o no aromáticos, clasificaciones autoexplicativas con respecto a los grupos sustituyentes de la cadena lateral de los residuos, y como pequeños o grandes. El residuo se considera pequeño si contiene un total de cuatro átomos de carbono o menos, incluido el carbono carboxilo, siempre que esté presente un sustituyente polar adicional; tres o menos en caso contrario. Los residuos pequeños son, por supuesto, siempre no aromáticos. En función de sus propiedades estructurales, los residuos de aminoácidos pueden clasificarse en dos o más clases. Para los aminoácidos proteicos de origen natural, la subclasificación según este esquema se presenta en la tabla 1.
Tabla 1: Subclasificación de aminoácidos
La sustitución conservativa de aminoácidos también incluye agrupaciones basadas en cadenas laterales. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos con cadenas laterales alifáticas es la glicina, la alanina, la valina, la leucina y la isoleucina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales alifáticas-hidroxiladas es la serina y la treonina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales amidas es la asparagina y la glutamina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales aromáticas es la fenilalanina, la tirosina y el triptófano; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales básicas es la lisina, la arginina y la histidina; y un grupo de aminoácidos con cadenas laterales azufradas es la cisteína y la metionina. Por ejemplo, es razonable esperar que la sustitución de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina, o una sustitución similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado no tenga un efecto importante sobre las propiedades del polipéptido variante resultante. Para determinar si un cambio de aminoácido da lugar a un polipéptido funcional, basta con evaluar su actividad. Las sustituciones conservativas se muestran en la tabla 2 bajo el epígrafe de sustituciones ejemplares y preferidas. Las sustituciones de aminoácidos incluidas en el ámbito de la invención se llevan a cabo, en general, seleccionando sustituciones que no difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la espina dorsal del péptido en el área de la sustitución, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Una vez introducidas las sustituciones, las variantes pueden cribar por su actividad biológica.
Tabla 2: Sustituciones de aminoácidos ejemplares y preferidas
Alternativamente, los aminoácidos similares para realizar sustituciones conservativas pueden agruparse en tres categorías basadas en la identidad de las cadenas laterales. El primer grupo incluye el ácido glutámico, el ácido aspártico, la arginina, la lisina, la histidina, todos ellos con cadenas laterales cargadas; el segundo grupo incluye la glicina, la serina, la treonina, la cisteína, la tirosina, la glutamina, la asparagina; y el tercer grupo incluye la leucina, la isoleucina, la valina, la alanina, la prolina, la fenilalanina, el triptófano, la metionina, como se describe en Zubay, G.
(1993).
De esta manera, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un polipéptido se sustituye por lo general por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Alternativamente, las mutaciones pueden introducirse aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante de un gen polipeptídico, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden examinarse para una actividad del polipéptido original para identificar mutantes que conserven esa actividad. Tras la mutagénesis de las secuencias codificantes, el péptido codificado puede expresarse recombinantemente y puede determinarse la actividad del péptido. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede ser alterado de la secuencia de tipo salvaje de un polipéptido sin abolir o alterar sustancialmente una o más de sus actividades. Convenientemente, la alteración no altera sustancialmente una de estas actividades, por ejemplo, la actividad es al menos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,
36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,
98 o 99% del tipo salvaje. Un residuo de aminoácido "esencial" es un residuo que, cuando se altera con respecto a la secuencia de tipo salvaje de un polipéptido de referencia, provoca la abolición de una actividad de la molécula parental de tal manera que menos del 20 % de la actividad de tipo salvaje está presente.
De acuerdo con lo anterior, la presente invención también describe variantes de las secuencias polipeptídicas naturales o sus fragmentos biológicamente activos, en las que las variantes se distinguen de la secuencia natural por la adición, deleción o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos. En general, las variantes mostrarán al menos aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,
46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de similitud con una secuencia polipeptídica parental o de referencia como, por ejemplo, la establecida en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16,
18, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 y 57 o la secuencia polipeptídica parental o de referencia como, por ejemplo, codificada por la secuencia nucleotídica establecida en SEQ ID NO: 5, 6,
9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 o 49. Deseablemente, las variantes tendrán al menos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 7 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuen con una secuencia polipeptídica original como, por ejemplo, la establecida en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 13,
16, 18, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 y 57 o la secuencia polipeptídica original como, por ejemplo, codificada por la secuencia nucleotídica establecida en s Eq ID NO: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17,
19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47 o 49. Además, se contemplan secuencias que difieren de las secuencias nativas u originales mediante la adición, deleción o sustitución de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más aminoácidos, pero que conservan las propiedades del polipéptido parental. Los polipéptidos también incluyen polipéptidos que están codificados por polinucleótidos que hibridan en condiciones de rigurosidad como las definidas en la presente memoria, especialmente en condiciones de rigurosidad elevada, con secuencias polinucleotídicas codificantes parentales, o con la cadena no codificante de las mismas, como se describe a continuación. Las secuencias polinucleotídicas parentales ilustrativas se exponen en
SEQ ID NO: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 y 49.
Como se describe en la presente memoria, los polipéptidos variantes difieren de una secuencia de referencia en al menos uno pero en menos de 50, 40, 30, 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3 o 2 residuo(s) de aminoácido. Otros polipéptidos variantes difieren de las secuencias correspondientes de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16, 18, 26, 27, 28, 29,
30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 y 57, o las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41,
43, 45, 47 o 49, en al menos un 1 % pero menos del 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de los residuos. (Si esta comparación requiere alineación, las secuencias deben alinearse para obtener la máxima similitud. las secuencias "en bucle" procedentes de deleciones o inserciones, o de emparejamiento incorrecto, se consideran diferencias). Las diferencias son, convenientemente, diferencias o cambios en un residuo no esencial o una sustitución conservativa.
Las variantes de una proteína pueden identificarse mediante el cribado de bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes de truncamiento, de una proteína. Las bibliotecas o fragmentos, por ejemplo, N terminal, C terminal o fragmentos internos, de una secuencia codificante de una proteína pueden utilizarse para generar una población variada de fragmentos para el cribado y posterior selección de variantes de una proteína.
Se conocen en la técnica procedimientos para el cribado de productos génicos de bibliotecas combinatorias hechas por mutación puntual o truncamiento, y para el cribado de bibliotecas de ADNc en busca de productos génicos que tengan una propiedad seleccionada. Tales procedimientos son adaptables para el cribado rápido de las bibliotecas de genes generadas por mutagénesis combinatoria de proteínas.
Algunas variantes del activador de protrombina de serpiente ecarina se describen en la Patente de los Estados Unidos n.° 6,413,737.
Variantes de los activadores naturales de la protrombina (nucleótidos)
La presente invención también describe activadores de protrombina que comprenden polipéptido(s) que está(n) codificado(s) por variante(s) del polinucleótido(s) de tipo salvaje o de origen natural que codifica(n) el (los) polinucleótido(s) de tipo salvaje o de origen natural.
Las variantes de un polinucleótido de tipo salvaje o de origen natural tendrán al menos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % (y todos los porcentajes enteros parciales intermedios) de similitud o identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de tipo salvaje o natural, incluidas, entre otras, las secuencias codificadas por las secuencias de SEQ ID NOs: 1,2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16, 18, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 y 57 o las secuencias de SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 y 49, o un complemento de los mismos, según lo determinado por los programas de alineación de secuencias descritos en otra parte del presente documento utilizando parámetros predeterminados.
Las secuencias nucleotídicas ejemplares que codifican los polipéptidos abarcan genes de longitud completa así como porciones de las secuencias nucleotídicas de longitud completa o sustancialmente completa de los genes o sus transcritos o copias de ADN de estos transcritos. Las porciones de una secuencia nucleotídica pueden codificar porciones o segmentos polipeptídicos que conservan la actividad biológica del polipéptido nativo. Una porción de una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento biológicamente activo de un polipéptido puede codificar al menos aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 300 o 400 residuos de aminoácidos contiguos, o casi hasta el número total de aminoácidos presentes en un polipéptido de longitud completa.
También se contemplan variantes de las secuencias de nucleótidos. Las variantes del ácido nucleico pueden ser naturales, tales como las variantes alélicas (mismo locus), homólogas (locus diferente) y ortólogas (organismo diferente), o no naturales. Estas variantes naturales pueden identificarse mediante técnicas de biología molecular bien conocidas, como por ejemplo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación conocidas en la técnica. Las variantes no naturales pueden obtenerse mediante técnicas de mutagénesis, incluidas las aplicadas a polinucleótidos, células u organismos. Las variantes pueden contener sustituciones de nucleótidos, deleciones, inversiones e inserciones. Las variaciones pueden producirse tanto en las regiones codificantes como en las no codificantes. Las variaciones pueden producir sustituciones de aminoácidos tanto conservativas como no conservativas (en comparación con el producto codificado). Para las secuencias de nucleótidos, las variantes conservativas incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de referencia. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente, tales como las generadas, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio, pero que aún codifican un polipéptido. Generalmente, las variantes de una secuencia de nucleótidos particular tendrán al menos aproximadamente 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con esa secuencia nucleotídica particular, según lo determinado por los programas de alineación de secuencias descritos en otra parte del presente documento utilizando parámetros por defecto.
Las secuencias de nucleótidos pueden utilizarse para aislar secuencias y alelos correspondientes de otros organismos, en particular de otras serpientes. Existen procedimientos fácilmente disponibles en la técnica para la hibridación de secuencias de ácidos nucleicos. Las secuencias codificantes de otros organismos pueden aislarse según técnicas bien conocidas basadas en su identidad de secuencia con las secuencias codificantes aquí expuestas. En estas técnicas, toda o parte de la secuencia codificante conocida se utiliza como una sonda que se hibrida selectivamente con otras secuencias codificantes presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonado o fragmentos de ADNc (es decir, bibliotecas genómicas o de ADNc) de un organismo elegido (por ejemplo, una serpiente). En consecuencia, la presente invención también contempla polinucleótidos que hibridan con secuencias de nucleótidos de referencia, o con sus complementos, en las condiciones de rigurosidad que se describen a continuación. Como se utiliza en la presente memoria, el término "híbrida en condiciones de baja rigurosidad, media rigurosidad, alta rigurosidad o muy alta rigurosidad" describe las condiciones de hibridación y lavado.
En Ausubelet al.,(1992), secciones 6.3.1-6.3.6, se puede encontrar orientación para realizar reacciones de hibridación. En dicha referencia se describen procedimientos acuosos y no acuosos, pudiendo utilizarse cualquiera de ellos. La referencia en la presente memoria a condiciones de baja rigurosidad incluye y abarca desde al menos aproximadamente 1 % v/v hasta al menos aproximadamente 15 % v/v de formamida y desde al menos aproximadamente 1 M hasta al menos aproximadamente 2 M de sal para la hibridación a 42 °C, y desde al menos aproximadamente 1 M hasta al menos aproximadamente 2 M de sal para el lavado a 42 °C. Las condiciones de baja rigurosidad también pueden incluir 1 % de albúmina de suero bovino (BSA), 1 mM de EDTA, 0,5 M de NaHPO4 (pH 7,2), 7 % de SDS para hibridación a 65 °C, y (i) 2 x SSC, 0,1 % de SDS; o (ii) 0,5 % de BSA, 1 mM de EDTA, 40 mM de NaHPO4 (pH 7,2), 5 % de SDS para lavado a temperatura ambiente. Una realización de condiciones de baja rigurosidad incluye la hibridación en 6 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguida de dos lavados en 0,2 x SSC, 0,1 % de SDS al menos a 50 °C (la temperatura de los lavados puede aumentarse a 55 °C para condiciones de baja rigurosidad). Las condiciones de rigurosidad media incluyen y abarcan desde al menos aproximadamente 16 % v/v hasta al menos aproximadamente 30 % v/v de formamida y desde al menos aproximadamente 0,5 M hasta al menos aproximadamente 0,9 M de sal para la hibridación a 42 °C, y desde al menos aproximadamente 0,1 M hasta al menos aproximadamente 0,2 M de sal para el lavado a 55 °C. Las condiciones de rigurosidad media también pueden incluir 1 % de Albúmina de Suero Bovino (BSA), 1 mM de EDTA, 0,5 M de NaHPO4 (pH 7,2), 7 % de SDS para hibridación a 65 °C, y (i) 2 x SSC, 0,1 % de SDS; o (ii) 0,5 % de BSA, 1 mM de EDTA, 40 mM de NaHPO4 (pH 7,2), 5 % de SDS para lavado a 60-65 °C. Una realización de condiciones de rigurosidad media incluye hibridación en 6 x SSC a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o más lavados en 0,2 x SSC, 0,1 % de SDS a 60 °C. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen y abarcan desde al menos aproximadamente 31 % v/v hasta al menos aproximadamente 50 % v/v de formamida y desde aproximadamente 0,01 M hasta aproximadamente 0,15 M de sal para hibridación a 42 °C, y desde aproximadamente 0,01 M hasta aproximadamente 0,02 M de sal para lavado a 55 °C. Las condiciones de alta rigurosidad también pueden incluir 1 % de BSA, 1 mM de EDTA, 0,5 M de NaHPO4 (pH 7,2), 7 % de SDS para la hibridación a 65 °C, y (i) 0,2 x SSC, 0,1 % de SDS; o (ii) 0,5 % de BSA, 1 mM de EDTA, 40 mM de NaHPO4 (pH 7,2), 1 % de SDS para el lavado a una temperatura superior a 65 °C. Una realización de condiciones de alta rigurosidad incluye la hibridación en 6 x SSC a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o más lavados en 0,2 x SSC, 0,1 % de SDS a 65 °C.
En determinadas realizaciones, un polipéptido está codificado por un polinucleótido que hibrida con una secuencia nucleotídica divulgada en condiciones de baja, media, alta o muy alta rigurosidad. Una realización de condiciones de muy alta rigurosidad incluye hibridación a 0,5 M de fosfato de sodio, 7 % de SDS a 65 °C, seguida de uno o más lavados a 0,2 x SSC, 1 % de SDS a 65 °C.
Otras condiciones de rigurosidad son bien conocidas en la técnica y un destinatario experto reconocerá que pueden manipularse diversos factores para optimizar la especificidad de la hibridación. La optimización de la rigurosidad de los lavados finales puede servir para garantizar un alto grado de hibridación. Para ejemplos detallados, véase Ausubel etal.,(1992) en las páginas 2.10.1 a 2.10.16 y Sambrook, J.et al.(2001), secciones 1.101 a 1.104.
Mientras que los lavados rigurosos se realizan por lo general a temperaturas de aproximadamente 42 °C a 68 °C, un experto en la técnica apreciará que otras temperaturas pueden ser adecuadas para condiciones rigurosas. La velocidad máxima de hibridación se produce normalmente entre 20 °C y 25 °C por debajo de la Tm de formación de un híbrido ADN-ADN. Es bien conocido en la técnica que la Tm es la temperatura de fusión, o temperatura a la que se disocian dos secuencias polinucleotídicas complementarias. Los procedimientos para estimar la Tm son bien conocidos en la técnica (véase Ausubelet al., supraen la página 2.10.8). En general, la Tm de un dúplex de ADN perfectamente emparejado puede predecirse como una aproximación mediante la fórmula:
Tm = 81,5 16,6 (Iog10 M) 6,41 (% G+C}-0,63 (% de formamida} - (600/long¡tud)
en la que: M es la concentración de Na+, preferentemente en el intervalo de 0,01 molar a 0,4 molar; % G+C es la suma de bases guanina y citosina como porcentaje del número total de bases, dentro del intervalo entre 30 % y 75 % G+C; % de formamida es el porcentaje de concentración de formamida por volumen; longitud es el número de pares de bases en el dúplex de ADN. La Tm de un ADN dúplex disminuye aproximadamente 1 °C con cada aumento del 1 % en el número de pares de bases mal emparejadas al azar. El lavado se realiza generalmente a Tm -15 °C para una alta rigurosidad, o a Tm -30 °C para una rigurosidad moderada.
En un ejemplo de procedimiento de hibridación, una membrana (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa o una membrana de nailon) que contiene ADN inmovilizado se hibrida durante la noche a 42 °C en un tampón de hibridación (50 % de formamida desionizada, 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt (0,1 % de ficoll, 0,1 % de polivinilpirollidona y 0,1 % de albúmina de suero bovino), 0,1 % de SDS y 200 mg/ml de ADN de espermatozoide de salmón desnaturalizado) que contiene sonda marcada. A continuación, la membrana se somete a dos lavados secuenciales de rigurosidad media (es decir, 2 x SSC, 0,1 % de SDS durante 15 min a 45 °C, seguidos de 2 x SSC, 0,1 % de SDS durante 15 min a 50 °C), seguidos de dos lavados secuenciales de rigurosidad más alta (es decir, 0,2 x SSC, 0,1%de SDS durante 12 min a 55 °C, seguidos de 0,2 x SSC y 0,1 % de SDS durante 12 min a 65-68 °C).
Preparación de activadores de protrombina
Los activadores de protrombina pueden prepararse mediante cualquier procedimiento adecuado conocido para los expertos en la técnica. Por ejemplo, los activadores de protrombina pueden producirse por cualquier procedimiento conveniente, como purificando o aislando el polipéptido a partir de reservorios naturales, incluidos, pero no se limitan а, el veneno de serpiente, la sangre y los productos derivados de la sangrefpor ejemplo, suero). Alternativamente, los activadores de protrombina utilizados en la presente invención pueden producirse mediante tecnología de ADN recombinante, u otras formas de ingeniería genética, incluyendo, por ejemplo, el uso de bacterias, insectos, levaduras, mamíferos u otros sistemas de expresión.
Los procedimientos de purificación incluyen la cromatografía de afinidad, incluida la cromatografía de afinidad de lectinas (por ejemplo, aglutinina de germen de trigo), la cromatografía de intercambio aniónico/catiónico o cualquier otra técnica de separación, por ejemplo, técnicas de aislamiento de etiquetas Hex-His. La identidad y pureza del activador de protrombina derivado puede determinarse, por ejemplo, mediante electroforesis SDS-poliacrilamida o cromatográficamente, tal como por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Por ejemplo, la purificación y caracterización de la pseutarina C (también abreviada como PtPA) a partir del veneno de serpiente Ptextilisse describe en Masci (1986) y Masciet al.(1988), y la oscutarina C (OsPA) del veneno de O.scutellatusse describe en Speijeret al.(1986). La purificación de la ecarina a partir del veneno deE. carinatusse describe en Morita, Tet al.(1981).
Alternativamente, los activadores de protrombina pueden producirse a partir de células de glándulas de veneno en cultivo utilizando procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo por ejemplo el procedimiento descrito en Yamanouye, N.,et al.(2007), que describe el cultivo primario de células secretoras de la glándula venenosa deBothrops jararacapara la producción de venenoin vitro.
Alternativamente, los activadores de protrombina pueden sintetizarse mediante síntesis química, por ejemplo, utilizando síntesis en solución o síntesis en fase sólida como se describe, por ejemplo, en el Capítulo 9 de Atherton y Shephard (1989) y en Robergeet al.(1995).
Alternativamente, los activadores de protrombina pueden prepararse mediante técnicas recombinantes. Por ejemplo, los activadores de protrombina utilizados en la invención pueden prepararse mediante un procedimiento que incluya los pasos de: (a) preparar una construcción que comprenda una secuencia polinucleotídica que codifique un polipéptido y que esté ligada operablemente a un elemento regulador; (b) introducir la construcción en una célula hospedadora; (c) cultivar la célula hospedadora para expresar el polipéptido; (d) aislar el polipéptido de la célula hospedadora. Si el activador de protrombina comprende un complejo o dos polipéptidos, entonces el activador de protrombina puede prepararse mediante un procedimiento que incluya los pasos de: (a) preparar una construcción que comprenda una secuencia polinucleotídica que codifique un primer polipéptido y que esté ligada operablemente a un elemento regulador; (b) introducir la construcción en una célula hospedadora; (c) cultivar la célula hospedadora para expresar el primer polipéptido; (d) aislar el polipéptido de la célula hospedadora; repetir los pasos (a) a (d) para un segundo polipéptido; y enlazar el primer polipéptido y el segundo polipéptido. Los procedimientos anteriores son igualmente aplicables a la preparación de activadores de protrombina que sean fragmentos, variantes, formas mutantes o formas quiméricas de activadores de protrombina de tipo salvaje. En ejemplos ilustrativos, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido codifica al menos una porción biológicamente activa de las secuencias establecidas en SEQ ID NO: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, o una variante de los mismos.
Los activadores de protrombina recombinantes pueden prepararse convenientemente utilizando protocolos estándar como los descritos, por ejemplo, en Sambrook, J.et al.(2001), en particular los capítulos 16 y 17, y Ausubelet al.(1992), en particular los capítulos 10 y 16. Por ejemplo, la producción recombinante del factor V de serpiente y del factor X de serpiente, que pueden utilizarse para producir activadores de protrombina de los grupos C y D, se describe en Filippovic, I. etal(2005) y Bos, M. H. A.et al(2009). Un procedimiento ilustrativo para la producción recombinante de ecarina y variantes de ecarina se proporciona en Yonemura, H.et al.(2004) y en la Patente de los Estados Unidos б, 413,737.
Coloides
La presente invención incluye en un aspecto la formulación de una composición de coagulación que comprende un activador de protrombina y un agente estabilizador tal como un coloide según las reivindicaciones.
Los coloides representan uno de los tres tipos principales de mezclas, siendo los otros dos las soluciones y las suspensiones. Un coloide suele tener partículas de entre 1 y 1000 nanómetros de diámetro, y las partículas pueden permanecer distribuidas uniformemente por todo el coloide. De acuerdo con lo anterior, un coloide implica la dispersión uniforme de una sustancia en otra. Por lo tanto, las dispersiones coloidales permanecen dispersas y no se depositan en el fondo de un recipiente. La sustancia que se dispersa se encuentra en la fase dispersa, mientras que la sustancia en la que se dispersa se encuentra en la fase continua.
Si las dimensiones de la sustancia en la fase dispersa son inferiores a 1 nanómetro, la mezcla se denomina solución. Si las dimensiones de la sustancia en la fase dispersa son superiores a 1000 nanómetros, la mezcla se denomina suspensión.
Un procedimiento común para clasificar los coloides se basa en la fase de la sustancia dispersa y en qué fase está dispersa. Usando esta clasificación, los tipos de coloides incluyen soluciones, emulsiones, espumas y aerosoles, donde una solución es una suspensión coloidal con partículas sólidas en un líquido, una emulsión es un líquido disperso en otro, una espuma es donde las partículas de gas están atrapadas en un líquido o sólido, y un aerosol contiene pequeñas partículas de líquido o sólido dispersas en un gas. Cuando el medio de dispersión es el agua, el sistema colodial puede denominarse hidrocoloide. La tabla 3 ejemplifica diferentes tipos de coloides.
Tabla 3: Coloides ejemplares
(continuación)
Los coloides se utilizan frecuentemente en la reanimación con fluidos de pacientes críticos o en cuidados intensivos. El déficit de volumen de líquidos en un paciente puede ser el resultado de una pérdida excesiva de líquidos, de una ingesta insuficiente de líquidos o de una combinación de ambas, incluyendo, por ejemplo, la pérdida de sangre, los vómitos, la diarrea y la deshidratación. Los coloides se utilizan normalmente como expansores del volumen plasmático en el tratamiento del shock circulatorio. Los coloides tienen moléculas grandes que no atraviesan fácilmente las paredes capilares y quedan retenidas en los vasos sanguíneos. Por lo tanto, se puede restablecer el volumen vascular, estabilizar la hemodinámica circulatoria y mantener la perfusión tisular cuando se produce una hemorragia grave. Ejemplos comunes de coloides son los sustitutos plasmáticos Gelofusine® y Haemaccel® que consisten en una gelatina fluida modificada, y que promueven la diuresis osmótica. Estos coloides tienen una vida media de varias horas, proporcionan una reposición de volumen a largo plazo y suelen ser isooncóticos con la sangre, a la que por lo general sustituyen volumen por volumen. Otros tipos de coloides utilizados en la reanimación con fluidos son los coloides a base de dextrano, los coloides a base de almidón, tales como Voluven® y Volulyte®, y los coloides a base de albúmina, tales como la albúmina humana. La polivinilpirrolidona (PVP) y otros polímeros sintéticos también se clasifican como coloides.
Los coloides a base de gelatina se han utilizado como sustitutos del plasma durante casi 100 años. Son más útiles como sustitutos de volumen, con un efecto de volumen de aproximadamente el 80 %. Sin embargo, presentan un mayor riesgo de reacciones anafilácticas o anafilactoides. El coloide a base de gelatina Gelofusine® es gelatina succinilada al 4 % p/v en solución salina. Se prepara generalmente por hidrólisis y succinilación de colágeno bovino, con 40 g/L de gelatina, 154 mmol/L de sodio, 120 mmol/l de cloruro, un Mw medio de 30.000, un Mn promedio de 22.600, un pH de 7,4+/-0,3, una viscosidad relativa a 37 °C de 1,9, un punto isoléctrico de pH 4,5+/-0,3, una presión osmótica del coloide de 453 mm H2O, un punto de gel de 0 °C, una osmolaridad de 274 mOsm/L y una semivida de aproximadamente 4 horas. Otros coloides a base de gelatina disponibles en el mercado son Geloplasma® (una gelatina succinilada) e Isoplex® (una gelatina fluida modificada ligada a la urea).
Los coloides a base de albúmina presentan varias ventajas, como la ausencia de riesgo de transmisión de enfermedades derivadas del procedimiento de fabricación, la ausencia de restricciones de volumen, la baja alergenicidad, la ausencia de nefrotoxicidad significativa y la ausencia de coagulopatía intrínseca. Sin embargo, los coloides a base de albúmina son significativamente más caros que los cristaloides, los coloides a base de almidón y los coloides a base de gelatina para la reposición de volumen. La albúmina sérica bovina se utiliza en aplicaciones de laboratorio tal como patrón de concentración de proteínas y nutriente en cultivos celulares y microbianos, y es económica.
Además de los coloides, los cristaloides también pueden utilizarse en la reanimación con fluidos. Los cristaloides son soluciones salinas equilibradas que atraviesan libremente las paredes capilares. Se componen de agua y electrolitos y están diseñados para permanecer en el compartimento intravascular durante menos tiempo que los coloides.
Algunos ejemplos comunes son la solución salina normal y los preparados de lactato de sodio, tales como las soluciones de Hartmann y Ringer-Lactato. Los cristaloides son útiles para mantener el equilibrio de líquidos, por ejemplo durante el postoperatorio, cuando el paciente no puede beber, o para reponer el volumen intravascular tras una pérdida repentina de sangre.
La presente invención demuestra que la estabilidad de una composición de coagulación que comprende un activador de protrombina mejora significativamente cuando se agrega a la composición un agente estabilizador como un coloide.
En algunas realizaciones, el coloide a base de gelatina se selecciona del grupo que comprende o consiste en un coloide de gelatina succinilada o un coloide de gelatina fluida modificada ligada a urea. En determinadas realizaciones, el coloide de gelatina succinilada se selecciona del grupo que comprende o está formado por Gelofusine® o Geloplasma®. En otras realizaciones, el coloide de gelatina fluida modificada con urea es Haemaccel®. En realizaciones preferidas, el coloide de gelatina succinilada es Gelofusine®.
El coloide a base de albúmina es la Albúmina de Suero Bovino.
Composiciones
La presente invención proporciona composiciones de coagulación que comprenden un activador de protrombina y un agente estabilizador tal como un coloide.
En realizaciones particulares, la proporción entre el activador de protrombina y el coloide (p/p) está comprendida entre
1:100 y 1:800.
La cantidad de la composición debe ser suficiente para coagular eficazmente una muestra de sangre y producir una muestra de suero separando el suero de las células coaguladas. En una realización preferida, el tiempo necesario para coagular la muestra de sangre es inferior a 5 minutos
Las composiciones descritas en la presente memoria pueden lograr la coagulación en un tiempo ventajosamente rápido después del almacenamiento o transporte a temperaturas inferiores a -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, --29, -30, -31, -32, -33, -34, -35, -36, -37, -38, -39, -40, -41, -42, -43, -44, -45, -46, - 47, -48, -49, -50, -51, -52, -53, --55, -56, -57, -58, -59, -60, -61, -62, -63, -64, -65, -66, -67, -68, -69, -70, -71, -72, -73, -74, -75, -76, -77, -78, -79, --81, -82, -83, -84, -85, -86, -87, -88, -89, -90, -91, -92, -93, - 94, -95, -96, -97, -98 o -99 grados Celsius o más de 20,
21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,
52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,
83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 grados Celsius. En particular, las composiciones son capaces de lograr la coagulación en un tiempo ventajosamente rápido después del almacenamiento o transporte a temperatura ambiente o a temperaturas de 20, 21,22, 23, 24 o 25 grados Celsius o más. Las composiciones descritas en la presente memoria son capaces de lograr la coagulación en un tiempo ventajosamente rápido tras el almacenamiento a temperaturas elevadas de 50 grados Celsius o más.
En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención son capaces de lograr la coagulación en un tiempo ventajosamente rápido después del almacenamiento durante un periodo de tiempo de más de 20, 21, 22, 23,
24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54,
55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,
86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220,
230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450,
460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680,
690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910,
920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 o 3000 o más días, o cualquier número de días comprendido entre los enteros indicados. En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención son capaces de lograr la coagulación en un tiempo ventajosamente rápido después del almacenamiento durante un período de tiempo de más de 200 días.
Las composiciones descritas en la presente memoria son capaces de lograr la coagulación en un tiempo ventajosamente rápido después de la esterilización de las composiciones por irradiación. En algunos casos, la esterilización se realiza mediante exposición a haces de electrones u óxido de etileno. En casos particulares, la irradiación es irradiación gamma y la cantidad de irradiación a la que se someten las composiciones es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 kGy. Preferentemente, la irradiación es gamma y la cantidad de irradiación a la que se someten las composiciones está en un intervalo de aproximadamente 15 kGy a aproximadamente 25 kGy. Más preferentemente, la irradiación es gamma y la cantidad de irradiación a la que se someten las composiciones es de aproximadamente 15kGy.
En algunas realizaciones, la composición puede secarse por pulverización o adherirse de otro modo a una superficie interna de un recipiente adecuado para recoger la sangre de un sujeto. En otras realizaciones, la composición puede proporcionarse en una forma aislada, adecuada para su adición a una muestra de sangre tomada previamente de un sujeto. En otras realizaciones más, la composición puede suministrarse en un recipiente de reacción, al que se agrega una muestra de sangre previamente extraída de un sujeto. En realizaciones adicionales, la composición puede suministrarse en forma acuosa, por ejemplo, en un recipiente tal como un tubo de coagulación de sangre, al que se agrega una muestra de sangre.
La cantidad de activador de protrombina utilizada en las composiciones de la presente invención dependerá de una variedad de factores, incluido el sujeto sometido a prueba y la gravedad de cualquier afección asociada; por ejemplo, la actividad del activador de protrombina y/o coloide, la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo y la dieta del paciente, y cualquier fármaco utilizado por el sujeto, junto con otros factores relacionados bien conocidos en la técnica, tales como si el sujeto ya tiene prescritos anticoagulantes como heparina o warfarina. Por lo tanto, un experto en la técnica sería capaz, mediante experimentación rutinaria, de determinar una cantidad eficaz del activador de protrombina que sería necesaria para coagular una muestra de sangre y proporcionar una muestra de suero para el análisis de analitos. La cantidad de activador de protrombina puede determinarse para garantizar una coagulación sanguínea adecuada en un grupo de pacientes concreto, como pacientes con sangre normal para lograr una coagulación rápida, o para garantizar una coagulación sanguínea adecuada de un grupo de pacientes más amplio que incluya, por ejemplo, pacientes en terapia con anticoagulante.
La composición puede usarse como parte de un tubo de stat, por ejemplo, para uso en troponinas, o en combinación con procedimientos cardíacos y/o cateterización, o en combinación con hemodiálisis, o como parte de un tubo estándar de extracción de sangre.
En algunas realizaciones, la cantidad de activador de protrombina utilizada en las composiciones de la presente invención es de aproximadamente 2 |jg a aproximadamente 10 jg de activador de protrombina.
La composición de coagulación puede medirse en unidades mediante un ensayo basado en un sustrato de péptido pnitoanilida o sustrato de trombina. En particular, el OsPAcomprende 0,001-0,2 unidades, según se mide en la hidrólisis del sustrato cromogénico S-2222 o S2238 en un ensayo estándar.
También pueden utilizarse tensioactivos como parte de la composición de coagulación para proporcionar una barrera física entre los componentes sanguíneos y la pared de un recipiente que contenga la composición, tal como un tubo de recogida de sangre. La presencia de un tensioactivo no afecta al mecanismo de coagulación.
Por lo tanto, la composición también puede incorporar cualquier tensioactivo adecuado, tal como un tensioactivo aniónico, catiónico o no iónico, tal como ésteres de sorbitán o derivados polioxietilénicos de los mismos. También pueden ser tensioactivos adecuados el dodecil sulfato de sodio (SDS), el lauril sulfato de amonio, el lauril sulfato de sodio y el myreth sulfato de sodio. Los tensioactivos se utilizan habitualmente para disminuir la adsorción inespecífica y requieren una cuidadosa selección y optimización. Los tensioactivos también pueden mejorar el flujo sanguíneo, distribuir los activadores de coágulos y evitar que las proteínas, los RBC y las plaquetas se adhieran a las paredes de los tubos. También pueden incluirse agentes de suspensión tales como gomas naturales, derivados de la celulosa o materiales inorgánicos tales como sílices silicáceas, y otros ingredientes tales como la lanolina.
En una realización preferida, el tensioactivo es un tensioactivo hirofílico. En otra realización, el tensioactivo puede ser un tensioactivo hidrofóbico. Tanto los tensioactivos hidrofílicos como los hidrofóbicos pueden tener una eficacia similar a la hora de reducir las interacciones entre las proteínas de la sangre y las células sanguíneas, y las paredes de recipientes tales como los tubos de recogida de sangre lisos . En una realización preferida, el tensioactivo puede ser un polímero de polisilano hirofílico, tal como Dow Corning 7-9245.
Las composiciones pueden prepararse según procedimientos conocidos por los expertos en la técnica y pueden incluir portadores, excipientes o diluyentes adicionales. Los portadores, excipientes y diluyentes deben ser "aceptables" en términos de compatibilidad con los demás ingredientes de la composición, y no perjudiciales para la formación de una muestra de suero que posea determinadas características ventajosas, tales como una menor concentración de fibrinógeno, menos microcoágulos, menos células, que pueda almacenarse durante periodos de tiempo más largos si es necesario y que dé lugar a resultados de analitos más reproducibles. Tales portadores, excipientes y diluyentes pueden utilizarse para mejorar aún más la integridad y la semivida de las composiciones de la presente invención.
También pueden utilizarse portadores tales como polivinilpirrolidona (PVP), carboximetilcelulosa, alcohol polivinílico y óxido de polietileno para permitir la adición de composiciones de coagulación a los tubos. Tales portadores permiten una rápida suspensión del activador de coágulos en la sangre, de modo que los portadores se disuelven tanto en el suero como en los coágulos a medida que se inicia la coagulación. La PVP y los tensioactivos hidrosolubles también pueden liberar activadores del coágulo en las muestras de sangre para reducir la necesidad de mezclarlas.
Ejemplos adicionales de portadores o diluyentes aceptables son agua desmineralizada o destilada; solución salina; aceites vegetales tales como aceite de cacahuete, aceite de cártamo, aceite de oliva, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceites de sésamo, aceite de arachis o aceite de coco; aceites de silicona, incluidos los polisiloxanos, tales como el metilpolisiloxano, el fenilpolisiloxano y el metilfenilpolisolpoxano; siliconas volátiles; aceites minerales tales como la parafina líquida, la parafina blanda o el escualano derivados de la celulosa, tales como metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica o hidroxipropilmetilcelulosa; alcanosoles inferiores, por ejemplo etanol o isopropanol; aralcanoles inferiores; polialquilenglicoles o alquilenglicoles inferiores, tales como polietilenglicol, polipropilenglicol, etilenglicol, propilenglicol, 1,3-butilenglicol o glicerina; ésteres de ácidos grasos, tales como palmitato de isopropilo, miristato de isopropilo u oleato de etilo; polivinilpirolidona; agar; goma tragacanto o goma acacia, y vaselina.
Portadores adicionales que pueden incluirse en las composiciones de la presente invención incluyen azúcares no reductores tales como la sacarosa y azúcares reductores tales como la lactulosa. Tales portadores, así como los alcoholes de azúcar tales como el manitol, el xilitol, el glicerol y el sorbitol, también son útiles para su inclusión en las composiciones de la presente invención, ya que pueden actuar como antioxidantes y estabilizadores potenciales.
En algunas realizaciones, la composición de coagulación puede comprender veneno de serpiente, incluyendo pero no limitado a veneno de serpiente crudo. En algunas otras realizaciones, la composición de coagulación puede comprender un preparado de activador de protrombina preparado por purificación parcial o total del veneno de serpiente. Tales preparaciones pueden prepararse por cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, incluidos los procedimientos cromatográficos y de filtración en gel, incluidos los descritos en la presente memoria y en otros lugares. En algunas otras realizaciones, la composición de coagulación puede comprender un activador de protrombina purificado o un activador de protrombina aislado. Los activadores de protrombina purificados y aislados pueden prepararse por cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, incluidos los descritos en la presente memoria y en otros lugares. En otras realizaciones más, el activador de protrombina puede producirse de forma recombinante, en las que el activador de protrombina se deriva del veneno de serpiente.
La capacidad de las composiciones aquí definidas para activar la protrombina a trombina puede iniciarse o mejorarse con la adición de cofactores, incluyendo pero sin limitarse a calcio, fosfolípido(s) y polipéptidos que comprenden actividad FVa, así como otros agentes de coagulación o coagulantes. En una realización, la composición de coagulación se produce inicialmente desprovista de cofactores, o donde los cofactores se proporcionan por separado a la composición de coagulación, por ejemplo, donde la composición de coagulación y los cofactores se distribuyen en lugares separados en la superficie interior de un recipiente tal como un tubo de recogida de sangre. Cuando el tubo se llena total o parcialmente con sangre del paciente, los cofactores entran en contacto con la sangre e inician o mejoran la reacción de coagulación con el activador de protrombina.
Los agentes de coagulación o coagulantes se clasifican como agentes de coagulación intrínsecos o agentes de coagulación extrínsecos según la cascada sanguínea estimulada (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 6,686,204). Los agentes de coagulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, tierra de diatomeas, micropartículas o partículas de silicatos inorgánicos, microsílice, micropartículas de vidrio, ácido elágico, trombina, heparinasa, tromboplastina, batroxobina, hidroiapatita, caolín, partículas de caolín, protrombina (incluida la protrombina microparticulada), fibrinógeno y colágeno despolimerizado.
En algunas realizaciones, la composición comprende un activador reversible de protrombina, que puede permanecer inhibido por un agente adicional hasta que se desee la activación del procedimiento de coagulación. Tales agentes adicionales pueden incluir inhibidores de la proteasa tales como el clorhidrato de benzamidina, el diclorhidrato de aminobenzamidina, el diclorhidrato de antipaina, la aprotinina, el EGTA o el hemisulfato de leupeptina, todos ellos disponibles comercialmente, por ejemplo, en Carl Roth GmbH & Co KG, o en Sigma-Aldrich Co. LLC.
En algunas realizaciones, la composición comprende un activador de protrombina, un coloide y un tensioactivo. En una realización particular, la composición comprende un activador de protrombina derivado o derivable del veneno de serpiente, un coloide a base de gelatina o albúmina y un tensioactivo. En realizaciones preferidas, la composición comprende un activador de protrombina del grupo C derivado o derivable del veneno de serpiente o una versión recombinante del mismo, un coloide a base de gelatina o albúmina y un tensioactivo hirofílico. En una realización particularmente preferida, la composición comprende el activador de protrombina del Grupo C oscutarina C (OsPa) derivado de o derivable del veneno deOxyuranus scutellatus,el coloide a base de gelatina Gelofusine®, siendo 4 % p/v gelatina succinilada en solución salina y conteniendo 40 g/L de gelatina, 154 mmol/L de sodio, 120 mmol/l de cloruro, y un tensioactivo hidrofílico.
Recipientes
La presente invención contempla cualquier recipiente adecuado para preparar una muestra de suero adecuada. Muchos recipientes adecuados son bien conocidos en la técnica, incluidos los descritos en la Patente de los Estados Unidos n.° 4,227,620; la Patente de los Estados Unidos n.° 4,256,120; la Patente de los Estados Unidos n.° 6,416,717; la Patente de los Estados Unidos n.° 6,592,613; la Patente de los Estados Unidos n.° 6,686,204; la Patente de los Estados Unidos n.° 7,488,287; la Patente de los Estados Unidos n.° 7,699,828; la Patente Europea n.° 0628 816; y los recipientes disponibles comercialmente, incluidos los utilizados en los ejemplos de la presente memoria descriptiva.
En algunas realizaciones, los recipientes utilizados de acuerdo con la presente invención son tubos, incluidos tubos de vidrio o de plástico. Entre los plásticos adecuados se encuentran el cloruro de polivinilo, el polipropileno, el tereftalato de polietileno y el poliestireno.
Los recipientes pueden ser evacuados y el extremo sellado con un septo o tapa perforable apropiada. Esto permite utilizar una aguja de doble punta en la que un extremo se introduce en la vena del paciente y el otro extremo de la aguja perfora el tabique o la tapa que cubre el extremo del tubo, de modo que el vacío del tubo extrae la muestra de sangre a través de la aguja hacia el interior del tubo.
Los recipientes pueden ser de cualquier tamaño adecuado. En algunas realizaciones, los recipientes están diseñados para contener una muestra de sangre de entre 50 pl y 10 ml. Los recipientes están diseñados para contener al menos 50 pl, 70 pl, 100 pl, 150 pl, 200 pl, 250 pl, 300 pl, 350 pl, 400 pl, 450 pl, 500 pl, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 8 ml o 10 ml de muestra de sangre. En una realización particular, los recipientes contienen una muestra de sangre de 4 ml que proporciona una concentración final de activador de protrombina en la muestra de sangre de 4 ml de 25 ng/ml a 2,5 pg/ml.
En algunas realizaciones, los recipientes contienen una composición de coagulación que comprende, consiste esencialmente o consiste en un activador de protrombina y un agente adicional como un coloide.
En algunas realizaciones, la composición de coagulación puede estar contenida dentro del recipiente antes de que la muestra de sangre se agregue al recipiente. En algunas realizaciones, la composición de coagulación puede añadirse al recipiente después de agregar la muestra de sangre al recipiente. Cuando la composición de coagulación está contenida en el recipiente antes de que se agregue la muestra de sangre, puede haberse agregado al recipiente por cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. En algunas realizaciones, la composición de coagulación se disuelve en un disolvente adecuado y, a continuación, se agrega al recipiente y se seca sobre la superficie interior del recipiente. El disolvente puede ser un tampón neutro. La composición de coagulación en solución puede secarse en la superficie interior del recipiente por pulverización, liofilización, secado térmico o por cualquier otro procedimiento adecuado conocido en la técnica. En algunas realizaciones, la composición de coagulación se seca sobre la superficie interior de un recipiente, tal como un tubo de recogida de sangre, mediante un chorro de aire caliente calentado a 60 °C-70 °C. En otras realizaciones, la composición de coagulación se disuelve en un disolvente adecuado y se agrega al recipiente sin secar, de modo que el recipiente contenga una solución acuosa que comprenda la composición de coagulación. El disolvente puede ser un tampón neutro. En otras realizaciones, la composición de coagulación se pone en contacto con la superficie interior de un recipiente, tal como un tubo de recogida de sangre, mediante atomización o aerosolización.
En algunas realizaciones, las microesferas se recubren con la composición de coagulación y estas microesferas se agregan al recipiente. Las microesferas pueden ser de vidrio o de resina sintética, incluidas las de poliestireno y propileno. Las microesferas pueden tener forma esférica. En algunas realizaciones, el diámetro medio de las microesferas está comprendido entre 0,1 mm y 1 mm.
En una realización particular, el activador de protrombina se seca rápidamente sobre una superficie interior de un recipiente utilizando un vacío suave a 37 °C, por ejemplo, utilizando una máquina Gene-Vac. En una realización particular, el activador de proitrombina se seca rápidamente mediante un chorro de aire caliente a 50 °C o más directamente en un recipiente tal como un tubo de recogida de sangre.
En algunas realizaciones, el recipiente permite separar el suero de las células coaguladas después de que se haya producido la coagulación. En algunas realizaciones, el recipiente comprende o contiene un gel separador de suero que proporciona una barrera entre las células coaguladas y la muestra de suero. En algunas realizaciones, el recipiente tiene una forma y un material adecuados para permitir la centrifugación para separar o ayudar a mantener la separación de las células coaguladas y la muestra de suero. En algunas realizaciones, la muestra de suero se separa de las células coaguladas, o las células coaguladas se separan de la muestra de suero. Por ejemplo, tales realizaciones son compatibles con el uso de tubos de separación de suero y tubos separadores de plasma disponibles en el mercado.
En algunas realizaciones, el recipiente puede comprender uno o más componentes adicionales. Los otros componentes pueden incluir, por ejemplo, uno o más cofactores, uno o más tensioactivos y/o uno o más agentes de coagulación además de la composición de coagulación.
En una realización preferida, los recipientes son tubos Greiner Bio-One White Top o Red Top, o tubos de extracción de sangre venosa Becton Dickinson. Tales tubos de recogida preferidos están hechos de tereftalato de polietileno y pueden no tener ningún aditivo, o pueden estar recubiertos con un tensioactivo, y contener sílice como activador del coágulo, un separador de gel y un tapón de goma recubierto de silicona.
Muestras de suero
Como se ha discutido anteriormente, la presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que los activadores de protrombina, cuando se formulan en combinación con un agente adicional tal como un coloide, dan como resultado una composición de coagulación que tiene una estabilidad mejorada, preservando así la actividad de coagulación y mejorando la calidad de las muestras de suero para su uso en inmunoensayos o detección de analitos, que puede ser en un laboratorio, en el punto de atención o en una situación clínica o de investigación. Una muestra de suero adecuada para la detección de analitos es una muestra de calidad adecuada, como se describe en la presente memoria, y/o una muestra preparada en un tiempo adecuado, tal y como se describe en la presente memoria.
Un factor importante en la preparación de una muestra de suero adecuada para detectar analitos es el grado en que el procedimiento de coagulación elimina el fibrinógeno del suero. El suero que contiene fibrinógeno residual o fibrinógeno parcialmente degradado, o fibrina como resultado de una coagulación incompleta, puede dar lugar a problemas de precisión analítica debido a la formación de precipitados (microcoágulos o cordones), a la coagulación latente tras la centrifugación y al almacenamiento del suero. Por consiguiente, la coagulación completa o casi completa es fundamental para garantizar la máxima calidad del suero y la precisión de los resultados de las pruebas.
Se describe en la presente memoria el uso de una composición de coagulación que comprende, consiste esencialmente o consiste en un activador de protrombina y un coloide en la preparación de un suero para detectar un analito, donde el suero comprende < 30 pg/ml de fibrinógeno o productos relacionados con fibrinógeno/fibrina. Preferentemente, el suero comprende 25 pg/ml, < 20 pg/ml, < 15 pg/ml, < 10 pg/ml, < 8 pg/ml, o < 6 pg/ml de fibrinógeno 0 productos relacionados con el fibrinógeno/fibrina.
El suero puede comprender < 30 %, < 20 %, < 10 %, < 9 %, <8 %, < 7 %, < 6 %, < 5 %, < 4 %, < 3 %, < 2 %, < 1 %, < 0,5 %, < 0,2 %, < 0,1 % de fibrinógeno o productos relacionados con el fibrinógeno/fibrina presentes en la muestra original a partir de la cual se produjo el suero.
Los niveles de fibrinógeno y/o productos relacionados con el fibrinógeno/fibrina pueden detectarse mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, incluido un inmunoensayo en sándwich utilizando anticuerpos de MP Biomedicals y preparados de fibrinógeno estándar adquiridos en NIBSC, Potters Bar, Hertsfordshire, Londres, Reino Unido.
Otro factor importante en la preparación de una muestra de suero adecuada para la detección de analitos es la actividad o el número de células o restos celulares que permanecen en el suero tras la coagulación. La presencia de células puede tener dos efectos durante el almacenamiento y el análisis de suero o plasma. En primer lugar, las células pueden lisarse, liberando contenido celular (por ejemplo, potasio, lactato deshidrogenasa) al suero o al plasma. Esto puede dar lugar a diferencias significativas entre las mediciones realizadas inmediatamente después de la centrifugación y las mediciones tras un periodo de almacenamiento. En segundo lugar, las células siguen siendo metabólicamente activas y pueden consumir cantidades significativas de nutrientes (por ejemplo, glucosa) y liberar productos metabólicos (por ejemplo, lactato) durante el almacenamiento. Incluso pueden observarse cambios en las muestras de muchos tubos cuando las muestras se almacenan durante el tiempo de coagulación habitual recomendado de 30 minutos cuando las muestras proceden de participantes sanos. El grado de contaminación celular es, por lo tanto, un importante criterio de calidad de las muestras de suero y una importante ventaja de utilizar suero frente a plasma.
En la presente memoria se describen muestras de suero que contienen menos del 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 % de células en la muestra de sangre a partir de la cual se ha preparado.
Como se describe en la presente memoria, la muestra de suero comprende un cambio de la actividad de lactato deshidrogenasa o concentración de fosfato (por lo general medido en U/L y mmol/L respectivamente) de < 25 %, < 20 %, <; 15 % o < 10 % durante un período de 24 horas, 12 horas, 8 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora o 30 minutos. La muestra de suero también puede comprender un cambio de concentración de glucosa o de potasio (ambos medidos por lo general en mmol/L) de < 5 %, < 4 %, < 3 %, < 2 %, < 1 %, < 0,5 %, o < 0,1 % durante un periodo de 24 horas, 12 horas, 8 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora o 30 minutos (por ejemplo, desde el momento de preparar la muestra de suero). Los procedimientos para medir la actividad de la lactato deshidrogenasa son bien conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Dimeski, G.,et al.(2004).
La concentración de hemoglobina de una muestra de suero también puede utilizarse para determinar si la muestra de suero es adecuada para detectar analitos. De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones, la muestra de suero comprende una concentración de hemoglobina de < 150 mg/L, < 100 mg/L, < 90 mg/L, < 80 mg/L, < 70 mg/L, < 60 mg/L, < 50 mg/L, < 40 mg/L, < 30 mg/L, < 20 mg/L, o < 10 mg/L.
Como muestra para pruebas, el suero es usualmente preferido sobre el plasma a menos que se requieran resultados urgentes y de esta manera el tiempo de coagulación para un tubo de suero se considere demasiado largo. Otro inconveniente de la prolongación del tiempo de coagulación es que puede dar lugar a cambios clínicamente significativos en la concentración de analitos debido a la actividad celular en la muestra de sangre, siendo este problema más pronunciado en la leucocitosis (Dimeski and Bird 2009).
De esta manera, en algunas realizaciones, la presente invención proporciona un procedimiento para producir una muestra de suero para detectar un analito de interés, el procedimiento comprende poner en contacto una muestra de sangre con una composición de coagulación que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un activador de protrombina y un coloide como se define en la presente memoria, donde la muestra de suero se prepara en 25, 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 1, o 0,5 minutos desde el contacto con la composición de coagulación.
Muestras de sangre
Como se ha discutido en la presente memoria, existe el deseo de proporcionar una composición de coagulación que sea adecuada para producir una muestra de suero a partir de la mayoría, si no todas, las muestras de sangre, o un recipiente que comprenda una composición de coagulación que coagule la mayoría, si no todas las muestras de sangre, en un tiempo adecuado; es decir, en un periodo de tiempo que permita realizar pruebas de analitos consistentes con las necesidades clínicas de un paciente.
Ejemplos de diferentes tipos de muestras de sangre para las que se pueden desear pruebas incluyen sangre fresca de individuos sanos, sangre citratada, sangre con EDTa agregado, sangre de pacientes en tratamiento anticoagulante tales como heparina, warfarina, citrato, anticoagulantes orales de las clases inhibidor del Factor Xa (por ejemplo rivoroxabán) o inhibidor directo de la trombina (por ejemplo dabigatrán), pacientes que toman agentes antitrombóticos, incluida la aspirina, pacientes trombocitopénicos (pacientes con recuento bajo de plaquetas) y pacientes con PTT prolongado.
En algunas realizaciones, la muestra de sangre es una muestra de sangre entera. En algunas otras realizaciones, la muestra de sangre es una muestra de suero derivada de una muestra de sangre entera. Las muestras de suero ejemplares en este caso incluyen muestras de suero en las que se desea una muestra de suero de mejor calidad, incluidas aquellas en las que la cantidad de fibrinógeno o productos relacionados con el fibrinógeno/fibrina y/o la cantidad de células o material celular en la muestra de suero y/o la cantidad de hemoglobina se consideran demasiado elevadas para que la muestra de suero sea una muestra adecuada para detectar analitos. Por ejemplo, la muestra de suero puede presentar microcoágulos o coagulación latente. En algunas otras realizaciones, la muestra de sangre es una muestra de plasma derivada de una muestra de sangre entera. Por ejemplo, la muestra de plasma puede presentar microcoágulos o formación de fibrina insoluble, o coagulación latente.
Detección de analitos
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona además procedimientos para detectar un analito, el procedimiento comprende analizar una muestra de suero preparada por el procedimiento de la presente invención para detectar la presencia o cantidad del analito de interés.
En realizaciones específicas, la muestra de suero preparada por el procedimiento de la presente invención es adecuada para más de una prueba de analito, de modo que la muestra de suero puede utilizarse para detectar más de un analito. Como se comenta en la presente memoria, a menudo un clínico deseará que se realice más de una prueba analítica en una muestra de sangre de un paciente, y no es infrecuente que una muestra de suero se utilice para al menos 20 pruebas, o incluso más, a veces entre 50-60 o incluso 70-80 pruebas. Los expertos en la técnica apreciarán que, en determinadas realizaciones, la presente invención prevé la producción de una muestra de suero cuyo volumen y calidad son suficientes para permitir la realización de todas las pruebas analíticas deseadas en una muestra de suero. La ventaja es que se reduce tanto el volumen de sangre que hay que extraer al sujeto como el tiempo necesario para realizar las pruebas analíticas.
A continuación se describen pruebas ilustrativas de analitos. Los procedimientos para realizar estas pruebas de analitos pueden realizarse de varias maneras y son bien conocidos en la técnica.
Troponina: Esta prueba mide los niveles de Troponina T y/o Troponina I en una muestra de suero o plasma, en la que aproximadamente niveles elevados pueden ser indicativos de infarto agudo de miocardio.
Sodio (Na+): Esta prueba mide la cantidad de sodio en una muestra de suero o plasma. El sodio desempeña un papel importante en el equilibrio de sal y agua en el organismo. Los niveles bajos de sodio pueden indicar una ingesta excesiva de agua, insuficiencia cardíaca, insuficiencia renal o pérdida de sodio del organismo debido a diarreas o vómitos. Unos niveles elevados de sodio pueden indicar un consumo excesivo de sal o una ingesta insuficiente de agua.
Potasio (K+): Esta prueba mide la cantidad de potasio en una muestra de suero o plasma. Los niveles de potasio demasiado elevados (hiperpotasemia) pueden ser el resultado de una enfermedad renal, diabetes, cetoacidosis o fármacos que disminuyen la cantidad de potasio excretado por el organismo. Los niveles de potasio demasiado bajos (hipopotasemia) pueden deberse a la deshidratación, por ejemplo por diarrea o vómitos, o a una sudoración excesiva. Los niveles de potasio también pueden ser bajos como consecuencia de la toma de fármacos que hacen que los riñones pierdan potasio, por ejemplo los diuréticos. Los niveles de potasio suelen controlarse en los pacientes que toman diuréticos o medicamentos para el corazón, los que padecen hipertensión arterial o enfermedad renal, los que sufren acidosis y alcalosis críticas y los que reciben diálisis renal o terapia intravenosa por goteo.
Cloruro (Cl-): Esta prueba mide la cantidad de cloruro en suero o plasma. El cloruro suele medirse para evaluar si existe un desequilibrio electrolítico en el paciente. Un nivel bajo de cloruro y normal de sodio y un nivel elevado de bicarbonato pueden ser indicativos de vómitos o pérdida de líquido gástrico.
Bicarbonato (HCOs-): Esta prueba mide la cantidad de tres formas de dióxido de carbono (bicarbonato, ácido carbónico y dióxido de carbono disuelto) en suero o plasma. El tampón bicarbonato/ácido carbónico es el más importante en el plasma, siendo muy eficaz en la regulación del pH corporal. Esta prueba se realiza a menudo para determinar el estado metabólico ácido/base. La concentración de tampón está regulada por los riñones. Puede observarse un nivel elevado en respuesta a una pérdida de cloruro (vómitos), a un tratamiento diurético, a un exceso de mineralocorticoides o de glucocorticoides (por ejemplo, en la enfermedad de Cushing). Un nivel bajo puede deberse a la producción de ácidos orgánicos, como ocurre en la cetoacidosis diabética, a la reducción de la excreción de ácidos en la insuficiencia renal, a la pérdida excesiva de bicarbonato (enfermedad renal), a la diarrea y a tóxicos tales como el abuso de metanol.
Glucosa: Esta prueba mide la cantidad de glucosa en suero o plasma. Los niveles de glucosa suelen analizarse en aquellos pacientes que presentan síntomas de glucemia elevada (hiperglucemia) o hipoglucemia, en las embarazadas y en los diabéticos.
Urea: Esta prueba mide la cantidad de urea en suero o plasma. Esta prueba puede ayudar a evaluar la función renal y controlar la eficacia de la diálisis.
Creatinina: Esta prueba mide la cantidad de creatinina en suero o plasma. Esta prueba es fundamental para ayudar a evaluar la función renal y controlar el tratamiento de la enfermedad renal.
Urato: Esta prueba mide la cantidad de urato (o ácido úrico) en suero o plasma. Los niveles elevados de ácido úrico pueden ser un signo de gota. Los niveles de ácido úrico también se controlan en pacientes sometidos a quimioterapia o radioterapia para detectar síndromes de lisis tumoral.
Proteína total (TP): Esta prueba mide la cantidad total de proteínas en suero o plasma. Aunque los resultados de una prueba de proteínas totales no indicarán una enfermedad específica, un nivel alto o bajo de proteínas suele indicar que es necesario realizar pruebas adicionales para determinar si existe algún problema. Las pruebas de proteínas totales suelen utilizarse para detectar determinados trastornos hepáticos, renales, mieloma múltiple y estado de hidratación.
Albúmina (Alb): Esta prueba mide la cantidad de albúmina en suero o plasma. Los niveles de albúmina se miden a menudo para detectar enfermedades hepáticas o renales, o para evaluar el estado nutricional, especialmente en pacientes hospitalizados.
Bilirrubina total: Esta prueba mide la cantidad de bilirrubina en suero o plasma. Los niveles de bilirrubina se miden para detectar y controlar trastornos hepáticos, tales como la ictericia, o enfermedades hepáticas, tales como la cirrosis. Los niveles de bilirrubina también se miden en los bebés para ayudar a detectar determinados trastornos genéticos raros y evitar daños cerebrales en los bebés con ictericia.
Fosfatasa alcalina (ALP): Esta prueba mide la cantidad de fosfatasa alcalina en suero o plasma. Esta prueba suele realizarse para cribar o controlar el tratamiento de un trastorno hepático u óseo.
Gamma-glutamil transferasa (GGT): Esta prueba mide la cantidad de gamma-glutamil transferasa en suero o plasma. Esta prueba se utiliza para detectar enfermedades hepáticas y abuso de alcohol. También puede utilizarse para determinar si un nivel elevado de ALP se debe a una enfermedad hepática u ósea.
Alanina aminotransferasa (ALT): Esta prueba mide la cantidad de alanina aminotransferasa en suero o plasma. Esta prueba se utiliza para detectar enfermedades hepáticas.
Aspartato aminotransferasa (AST): Esta prueba mide la cantidad de aspartato aminotransferasa en suero o plasma. Esta prueba se utiliza para detectar daños hepáticos, musculares y otras afecciones, ya que la enzima está presente en muchos órganos y células de tejidos.
Lactato deshidrogenasa (LDH): Esta prueba mide la cantidad de lactato deshidrogenasa en suero o plasma. Esta prueba suele utilizarse para identificar la causa y la localización del daño tisular en el organismo, la isquemia tisular, y para controlar su evolución.
Creatina cinasa (CK): Esta prueba mide la cantidad de creatina cinasa en suero o plasma. La creatina cinasa se mide en pacientes con dolor torácico o dolor o debilidad muscular para determinar si han sufrido un infarto de miocardio y si se han dañado otros músculos del cuerpo.
Calcio total (TCa): Esta prueba mide la cantidad de calcio en suero o plasma. Los niveles de calcio suelen medirse en pacientes con enfermedades renales, óseas o nerviosas, o cuando se presentan síntomas de aumento o disminución significativa del calcio.
Fosfato: Esta prueba mide la cantidad de fosfato en suero o plasma. Los niveles de fosfato pueden medirse como consecuencia de un resultado anormal de los niveles de calcio. Los niveles de fosfato también pueden medirse en pacientes con trastornos renales, diabetes no controlada o cuando el paciente toma suplementos de calcio o fosfato.
Magnesio (Mg2+): Esta prueba mide la cantidad de magnesio en suero o plasma. Esta prueba puede realizarse si el paciente presenta síntomas de exceso o falta de magnesio, como debilidad, irritabilidad, arritmia cardiaca, náuseas o diarrea. Los niveles de magnesio también pueden medirse si se han detectado niveles anormales de calcio o potasio.
Lipasa: Esta prueba mide la cantidad de lipasa en suero o plasma. Esta prueba por lo general se usa para diagnosticar pancreatitis u otras enfermedades pancreáticas.
Colesterol: Esta prueba mide la cantidad de colesterol en suero o plasma. Los niveles de colesterol se miden para detectar el riesgo de desarrollar enfermedades cardiacas.
Triglicéridos: Esta prueba mide la cantidad de triglicéridos en suero o plasma. En cuanto a los niveles de colesterol, esta prueba por lo general se usa para detectar el riesgo de desarrollar enfermedades cardiacas.
Lipoproteína de alta densidad (HDL): Esta prueba mide la cantidad de colesterol HDL en suero o plasma. Esta prueba por lo general se usa para determinar el riesgo de padecer enfermedades cardiacas.
Hierro (Fe2+): Esta prueba mide la cantidad de hierro en suero o plasma. El hierro se mide para comprobar si un paciente tiene niveles bajos o altos de hierro. Los niveles bajos de hierro pueden causar anemia, y suelen deberse a hemorragias prolongadas o abundantes, embarazo o crecimiento rápido (en niños). Los niveles elevados de hierro pueden deberse a una afección genética o a transfusiones sanguíneas prolongadas.
Transferrina: Esta prueba mide la cantidad de transferrina en suero o plasma. La transferrina es una proteína plasmática que transporta el hierro a través de la sangre hasta el hígado, el bazo y la médula ósea. De esta manera, el nivel de transferrina en sangre se analiza para determinar la causa de la anemia, examinar el metabolismo del hierro (por ejemplo, en la anemia ferropénica) y determinar la capacidad de transporte de hierro de la sangre.
Proteína C reactiva (PCR): Esta prueba mide la cantidad de proteína C reactiva en suero o plasma. Esta prueba se utiliza para identificar la presencia de inflamación, determinar su gravedad y controlar la respuesta al tratamiento.
Cortisol: Esta prueba mide la cantidad de cortisol en suero o plasma. Los niveles de cortisol se miden para ayudar a diagnosticar el síndrome de Cushing o la enfermedad de Addison.
Tiroxina libre: Esta prueba mide la cantidad de tiroxina libre en suero o plasma. La prueba suele utilizarse para diagnosticar hipotiroidismo o hipertiroidismo.
Hormona estimulante de la tiroides (TSH): Esta prueba mide la cantidad de hormona estimulante del tiroides en suero o plasma. La prueba por lo general se usa para detectar, diagnosticar y controlar trastornos tiroideos.
Ferritina: Esta prueba se utiliza para medir la ferritina en suero o plasma. Los niveles bajos de ferritina son indicativos de una carencia de hierro. Los niveles elevados son indicativos de sobrecarga de hierro, tal como en la hematocromatosis.
Índice hemolítico: La prueba del índice hemolítico mide el grado de lisis de los hematíes. La hemólisis es la interferencia más frecuente en un laboratorio de bioquímica. La prueba se utiliza predominantemente para detectar la hemólisisin vitroy la idoneidad de la muestra para la notificación de determinados analitos o de todos ellos, así como en la detección de anemias hemolíticas (esferocitosis hereditaria, hemólisis espontánea, deficiencia enzimática de los RBC). La hemólisis o índice hemolítico (concentración de hemoglobina libre en suero o plasma) es estimada actualmente por todos los analizadores de química general. El valor se utiliza entonces como guía para determinar qué analitos y a qué nivel de hemólisis pueden verse afectados o no (Dimeskiet al.2005).
Índice ictérico: La prueba del índice ictérico devuelve un valor que indica el nivel relativo de bilirrubina en una muestra problema mediante un procedimiento puramente espectrofotométrico. Se utiliza para determinar la idoneidad de la muestra para la notificación de determinados analitos y para la comprobación cruzada de la exactitud de los resultados de bilirrubina en casos poco frecuentes de interferencia con los procedimientos fotométricos de estimación de la bilirrubina total. Se ha demostrado que el índice ictérico es útil para detectar la interferencia de paraproteínas cancerígenas (precipitación y falsa bilirrubina total elevada) con el procedimiento de la bilirrubina total de Roche (Sheppardet al.,2005), en el que el índice ictérico no se ha visto afectado. La bilirrubina puede interferir con algunos ensayos de creatinina a altas concentraciones (por ejemplo >200 j M/L) como se discute en Dimeskiet al.,2008.
Índice de lipemia: El índice de lipemia se ha empleado para predecir posibles interferencias en los ensayos debidas a la lipemia (Dimeski 2009).
Además de las pruebas de analitos anteriores, se pueden realizar otros ensayos utilizando una muestra de suero o plasma mediante diferentes técnicas analíticas, como inmunoensayos, incluidos inmunoensayos enzimáticos competitivos, no competitivos, inversos o en sándwich.
Procedimientos de diagnóstico, pronóstico y seguimiento de la respuesta al tratamiento
La presente invención proporciona procedimientos para diagnosticar una enfermedad o afección en un sujeto, en los que los procedimientos comprenden proporcionar una muestra de sangre del sujeto, preparar una muestra de suero a partir de la muestra de sangre poniendo en contacto la muestra de sangre con una composición de coagulación de la presente invención, y analizar la muestra de suero para detectar la presencia o ausencia de un analito en la muestra de suero, o un nivel o concentración indicativos de un analito en la muestra de suero, en los que la presencia, ausencia o nivel o concentración indicativos del analito son indicativos de la enfermedad o afección en el sujeto.
La presente invención también proporciona procedimientos para proporcionar un pronóstico para un sujeto, en los que los procedimientos comprenden proporcionar una muestra de sangre del sujeto, preparar una muestra de suero a partir de la muestra de sangre poniendo en contacto la muestra de sangre con una composición de coagulación de la presente invención, y analizar la muestra de suero para detectar la presencia o ausencia de un analito en la muestra de suero, o un nivel o concentración indicativos de un analito en la muestra de suero, en los que la presencia, ausencia o nivel o concentración indicativos del analito son indicativos del pronóstico para el sujeto.
La presente invención proporciona además procedimientos para controlar la capacidad de respuesta de un sujeto a una terapia, en los que los procedimientos comprenden proporcionar una muestra de sangre del sujeto, preparar una muestra de suero a partir de la muestra de sangre poniendo en contacto la muestra de sangre con una composición de coagulación de la presente invención, y analizar la muestra de suero para detectar la presencia o ausencia de un analito en la muestra de suero, o un nivel o concentración indicativos de un analito en la muestra de suero, en los que la presencia, ausencia o nivel o concentración indicativos del analito son indicativos de la capacidad de respuesta del sujeto a la terapia.
En algunas realizaciones, los procedimientos de la presente invención implican comparar el resultado de la prueba de analitos con un intervalo de referencia o límite de corte para obtener el diagnóstico.
La enfermedad o afección puede ser cualquier enfermedad o afección susceptible de diagnóstico, pronóstico o capacidad de respuesta a la terapia, utilizando una muestra de suero, incluyendo pero sin limitarse a, las enfermedades o afecciones descritas anteriormente con referencia a diferentes pruebas de analitos.
En algunas realizaciones, los procedimientos pueden comprender el diagnóstico de la presencia o ausencia de una enfermedad o condición no presentada previamente por el sujeto. En otras realizaciones, los procedimientos pueden comprender el diagnóstico de la presencia, ausencia o gravedad de una enfermedad o afección que el sujeto haya presentado previamente. Los procedimientos pueden incluir la referencia a un resultado obtenido del sujeto en un momento anterior. Alternativamente, el resultado de referencia puede ser una referencia analítica estándar.
Los procedimientos descritos en la presente memoria se realizan en una instalación de pruebas tal como un laboratorio de patología. En algunos casos, se trata de procedimientos "en el punto de atención". Como se utiliza en la presente memoria, un "procedimiento en el punto de atención" significa que el procedimiento se realiza en el lugar de atención al paciente o cerca de él. Los procedimientos en el punto de atención son cada vez más populares en hospitales y otros entornos en los que es necesario obtener resultados rápidamente. Esto se consigue a menudo mediante el uso de instrumentos y kits de pruebas transportables, portátiles y manuales.
Las ventajas de las pruebas en el punto de atención incluyen la capacidad de obtener resultados analíticos rápidos junto a la cama del paciente en los hospitales, especialmente en situaciones de emergencia, y la capacidad de obtener resultados analíticos en casa, en consultas médicas, zonas remotas, etc. (por ejemplo, utilizando pequeños volúmenes de sangre arterial, venosa o capilar).
Los dispositivos para procedimientos de punto de atención actualmente disponibles en el mercado incluyen el i-Stat (Abbott Diagnostics), el dispositivo de prueba rápida Retro-STATUS HIV/CD4350 (Millenium Biotechnology, Inc.) y la prueba Triage PLGF (Alere International).
Kits
La presente invención proporciona kits para preparar una muestra de suero, en los que el kit comprende un activador de protrombina y un coloide.
Los kits de la presente invención facilitan el empleo de los procedimientos de la presente invención. Por lo general, los kits para llevar a cabo un procedimiento de la invención contienen todos los reactivos y medios necesarios para llevar a cabo el procedimiento. Por ejemplo, en una realización, el kit puede comprender una composición de coagulación de la presente invención y, opcionalmente, medios para realizar la detección del analito, tales como dispositivos para procedimientos de punto de atención como se define en la presente memoria.
Por lo general, los kits descritos en la presente memoria también comprenderán uno o más recipientes. En el contexto de la presente invención, un kit compartimentado incluye cualquier kit en el que los compuestos o composiciones estén contenidos en recipientes separados, y puede incluir pequeños recipientes de vidrio, recipientes de plástico o tiras de plástico o papel. Tales recipientes pueden permitir la transferencia eficaz de compuestos o composiciones de un compartimento a otro evitando la contaminación cruzada de las muestras, así como la adición de agentes o soluciones de cada recipiente de un compartimento a otro de forma cuantitativa. En una realización preferida, el uno o más recipientes que componen el kit es un tubo de recogida de sangre.
Por lo general, un kit de la presente invención también incluirá instrucciones para usar los componentes del kit para llevar a cabo los procedimientos apropiados.
Los procedimientos y kits de la presente invención son igualmente aplicables a cualquier animal, incluyendo seres humanos, por ejemplo incluyendo primates no humanos, equinos, bovinos, ovinos, caprinos, lepóridos, aviares, felinos y caninos. De acuerdo con lo anterior, para la aplicación a diferentes especies, puede ser aplicable un único kit de la invención, o alternativamente pueden requerirse diferentes kits, por ejemplo que contengan compuestos o composiciones específicas para cada especie individual.
Los procedimientos y kits de la presente invención encuentran aplicación en cualquier circunstancia en la que sea deseable producir una muestra de suero.
Ejemplos
Un requisito para utilizar activadores de protrombina en composiciones de coagulación es que la actividad del activador de protrombina permanezca estable a lo largo del tiempo, y en condiciones variables tales como la exposición al calor y/o la irradiación esterilizante. Por ejemplo, si se va a utilizar un activador de protrombina en una composición de coagulación en combinación con un recipiente tal como un tubo de recogida de sangre, la actividad coagulante del activador de protrombina debe conservarse durante el almacenamiento del activador de protrombina tras la purificación o producción recombinante y antes de la producción del tubo.
Además, los tubos de recogida de sangre disponibles comercialmente se fabrican por lo general en grandes cantidades en una línea de producción, donde el producto puede ser un tubo de plástico que contiene aditivos como un procoagulante, un tensioactivo y un gel espaciador. El contenido de los tubos suele secarse, sellarse al vacío y esterilizarse. Cuando el procoagulante es un activador de protrombina, el activador de protrombina debe por lo tanto ser capaz de mantener su actividad tras los procedimientos de secado, sellado al vacío y esterilización (por ejemplo, mediante irradiación). Por lo general, la estabilidad debe demostrarse en un amplio intervalo de temperaturas, tal como se describe en la presente memoria. En determinadas realizaciones, la estabilidad a temperatura ambiente debe permitir una vida útil de al menos 6 meses, preferentemente superior a 12 meses, y más preferentemente superior a 18 meses.
Ejemplo 1 - Activadores de la protrombina: Aislamiento y caracterización
En mamíferos, el complejo protrombina-activadorin vivoconsiste por lo general en una serina proteasa, Factor Xa, y un cofactor proteico, Factor Va, complejados en una membrana fosfolipídica en presencia de iones calcio (Jackson and Suttie, 1977). El factor Xa por sí solo activa la protrombina, pero de forma ineficaz. En presencia del Factor Va, de iones de calcio y de fosfolípido, la activación de la protrombina se potencia en varios órdenes de magnitud.
Es bien sabido que los venenos de muchas serpientes causan una rápida coagulación de la sangre. El primer informe de un complejo activador de protrombina en el veneno de serpiente fue el de Speijeret al(1986), que informaron del descubrimiento de un complejo activador de protrombina del veneno deOxyuranus scutellatus(Taipán costero) con al menos cuatro cadenas polipeptídicas, dos de las cuales parecían representar un componente similar al Factor Va y dos, unidas por un enlace disulfuro, que representaban un componente similar al Factor Xa.
La metodología utilizada en el presente estudio para la purificación del activador de protrombina es esencialmente la descrita previamente por Masciet al1988 y Masciet al2000. En resumen, se purificaron 10 gramos de veneno (comprado a Venom Supplies Pty Ltd, South Australia) en lotes de 1 gramo utilizando un procedimiento de cromatografía en columna de un solo paso que implicaba redisolver el veneno en una resina de filtración en gel adecuada (por ejemplo, Sephacryl S300, Superdex 200). A continuación, se determinó la actividad de la fracción concentrada que contenía OsPA en ensayos de coagulación con sangre entera citratada recalcificada y plasma citratado recalcificado, así como utilizando el sustrato espectrofotométrico diseñado para el Factor Xa, S-2222.
Ejemplo 1.1 - Purificación de activadores de protrombina
Las resinas Sephacryl S-300, Superdex 200, Toyopearl H55S y Toyopearl H65S se adquirieron en GE Healthcare Sydney y Toyo, Japón. Una suspensión de cada resina se diluyó al 150 % con tampón de columna, 0,05 M tris-HCl, pH 7,4, que contenía 0,1 M NaCl y 0,01 % de azida sódica. Las columnas de vidrio (de 5,0 * 95 cm; o de 2,5 * 95 cm) se envasaron con cada resina a 4 °C en una cámara frigorífica. Las columnas se equilibraron durante la noche a un caudal de 1 ml/min y la absorbancia a 280 nm se controló hasta que se estabilizó a cero (un mínimo de 10 volúmenes de tampón de columna entre análisis).
El veneno de taipán costero (Oxyuranus scutellatus, Os) (Venom Supplies Pty Ltd, South Australia) se compró en lotes de 2 * 5 gramos y el proveedor comercial, Venom Supplies confirmó que ambos lotes de 5 gramos procedían del mismo lote de ordeño de veneno. Se reconstituyeron lotes de aproximadamente 1,0-1,5 gramos de veneno de Os en 45 ml de tampón de columna en un baño de agua a 37 °C hasta su completa disolución. Esto llevó aproximadamente 30 minutos. Se hizo una dilución 1/50 de la solución de veneno de Os y se midió y registró A280 para la concentración total de proteínas. De la solución madre, se almacenaron a -20 °C alícuotas de 2 * 1,0 ml, 1 * 0,5 ml en glicerol al 50 % y una dilución 1/50. El resto de los 40-42 ml de solución de veneno de Os se cargaron en una columna de filtración de gel equilibrada. La cromatografía se desarrolló durante 24 horas a un caudal de 0,8-1,0 ml/min. Las fracciones se recogieron utilizando un colector de fracciones LKB Redirac en modo de base de tiempo que recogía fracciones de 8 10 ml. La absorbancia a 280 nm (A280) del eluyente se controló de forma continua utilizando un sistema de control Alex de doble canal UV (A280 nm) y un registrador de doble pluma que ajustaba el intervalo de escala completa en 2,48 y 1,24 unidades de absorbancia.
Las fracciones que contenían actividad de coagulación OsPAse identificaron mediante ensayo utilizando el ensayo de coagulación de plasma citratado recalcificado y el ensayo de actividad hidrolítica cromogénica S-2222, como se describe a continuación. Las fracciones con alta actividad coagulante específica se agruparon y concentraron como se describe a continuación.
Ejemplo 1.2 - Concentración y almacenamiento de OsPA
Las fracciones de las cromatografías Superdex 200, Sephacryl S300 y Toyopearl H55S y Toyopearl H65S que contenían coagulación plasmática y actividad hidrolítica S-2222 se agruparon (designadas "fracciones OsPA combinadas") para su caracterización. La concentración de proteínas se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm de las fracciones de OsPA combinadas y utilizando un coeficiente de absorción de 1,0 para una solución de 1 mg/ml para calcular la concentración de proteínas en mg/ml.
La concentración de las fracciones de OsPA combinadas se llevó a cabo utilizando una celda presurizada Amicon Modelo 402 utilizando una membrana YM 10 (punto de corte mol 10,000 Da) a una concentración de 2-4 mg/ml. En los experimentos iniciales, la pérdida de proteínas en el paso de concentración fue del 20-25 %. En experimentos posteriores, se agregó un 5 % de glicerol a las fracciones combinadas que contenían OsPA antes de concentrarlas, con el fin de reducir las pérdidas debidas a la unión de proteínas. Cuando se utilizó glicerol al 5 %, la pérdida de proteínas en el paso de concentración fue del 0-5 %. A continuación, se agregó glicerol de alta pureza a la solución concentrada de OsPA para alcanzar una concentración de glicerol del 50 %. La solución de OsPA/glicerol se mezcló suavemente para evitar la formación de espuma hasta que la solución fue homogénea y luego se almacenó en un frasco de vidrio oscuro cubierto de Alfoil a -20 °C. La concentración de proteína de la solución de OsPA/glicerol se determinó utilizando una dilución 1/10 y midiendo la absorbancia a 280 nm. OsPA Lote 17-Abr-2012 se utiliza para todos los experimentos.
La tabla 4 muestra los datos de caracterización de 10 preparaciones diferentes demostrando que los diferentes procedimientos de aislamiento producen preparaciones funcionalmente similares que son adecuadas y todas capaces de producir suero de alta calidad como puede inferirse del sustrato cromogénico S-2222.
Tabla 4. Datos de caracterización de los preparados activadores de la protrombina
(continuación)
La tabla 4 proporciona información cuantitativa sobre las diez preparaciones de OsPA descritas anteriormente en términos de perfiles de elución y patrones de bandas SDS PAGE. En resumen, (1) el rendimiento de proteína en las preparaciones de OsPA utilizando Sephacryl o Superdex fue de 126 ± 17 mg por gramo de veneno seco, (2) la actividad de coagulación plasmática de un gramo de veneno fue de (1,031± 0.194)*106 unidades, (3) la actividad de coagulación plasmática en cuatro preparaciones Sephacryl o Superdex fue de 526,417 ± 44433 unidades, lo que da un rendimiento de aproximadamente 52 % de la actividad de coagulación plasmática total de la muestra de veneno cargada en la columna, y (4) las dos corridas Toyopearl 65S dieron recuperaciones más altas de actividad (60 % y 75 %) con muy poca purificación entre la fracción activadora de protrombina y la fracción de taipoxina.
La figura 1 muestra los patrones de bandas obtenidos utilizando muestras de seis preparaciones de OsPA, incluyendo una almacenada desde 1989. En todos los casos, existe un patrón de bandas muy consistente en la región de alto peso molecular. La única diferencia clara es la presencia de una mayor cantidad de material de bajo peso molecular en el preparado Toyopearl. Esto es coherente con la resolución mucho más pobre de las fracciones de veneno lograda utilizando la cromatografía Toyopearl.
La coagulación de la sangre entera por muestras de cada una de estas diez preparaciones (siendo las fracciones concentradas de OsPA almacenadas en glicerol al 50 %, derivadas de cada preparación) fue estudiada por tromboelastografía. Las trazas se muestran en la figura 2 y los parámetros de cada traza en la tabla 5.
Tabla 5: Datos tromboelastográficos de 10 preparaciones de OsPA
Todas las preparaciones de OsPA causaron una rápida y completa coagulación como lo muestran los valores de R, K y ángulo (velocidad) y los valores de MA (fuerza de coagulación).
En base a los resultados obtenidos, la preparación de OsPA designada 17/4/2012 se utilizó en todos los experimentos de dosificación y estabilidad. El perfil de elución cromatográfica Superdex 200 para esta preparación se muestra en la figura 3 y el patrón de bandas SDS PAGE en la figura 1. La comparación del perfil de elución y del patrón de bandas de esta preparación muestra que se trata de una preparación típica. Como se muestra en la tabla 1, las fracciones combinadas que componen esta preparación contenían 159 mg, lo que equivale a 151 mg por gramo de veneno. La actividad específica en el ensayo de coagulación del plasma fue de 3534 U/mg y la actividad total recuperada fue de 534.987 U por gramo de veneno seco, un rendimiento del 59 %. Estas cifras concuerdan en general con los valores medios alcanzados en varias preparaciones, como se indica en la tabla 1. La actividad específica de 3534 U/mg muestra que 1 |jg de OsPA, tal como se utilizó en muchos de los experimentos de dosificación y estabilidad, contenía 3,5 unidades de coagulación plasmática. Los parámetros de coagulación de la sangre entera mediante este preparado figuran en la tabla 5.
Los resultados para el ensayo del veneno y la preparación 17/4/2012 OsPA contra el sustrato selectivo del Factor Xa S-2222 se muestran en la tabla 6.
Tabla 6. Datos del ensayo S-2222 para la preparación OsPA del 17/4/2012
Ejemplo 1.3 - Perfiles de elución tras cromatografía en gel
Las soluciones que contenían aproximadamente 1-1,5 g de veneno de O.scutellatus(preparadas disolviendo el veneno liofilizado) se sometieron a cromatografía de filtración en gel como sigue: en Sephacryl 300 (una vez); en Superdex 200 (6 veces), en Toyopearl HW55-S (una vez) y en Toyopearl HW65-S (dos veces). La figura 3 muestra el perfil de elución del veneno de O.scutellatusutilizando Superdex™ 200 (columna de gel: 5 cm de diámetro, 95 cm de longitud).
Ejemplo 1.4 - SDS-Page
Se prepararon geles NuView Precast Mini Gels (#NB10-420, 4-20 %) SDS PAGE con tampón de muestra no reductor Tris-Glicina (#BG-145) (NuSep), y un tampón de muestra reductor con 5 % de p - mercaptoetanol. Tras cinco minutos de incubación, se transfirió una alícuota de 40 j l de cada muestra a un volumen equivalente de tampón reductor de muestras. A continuación, las muestras se incubaron durante 10 minutos a 100 °C en un bloque térmico. Se cargaron en los geles alícuotas de 25 j l de cada muestra y 12 j l del marcador de peso molecular teñido previamente (#SM0671 Page Ruler Prestained Protein Ladder, Fermentas, Hanover, MD, EE.UU.). Los geles se desarrollaron a 100 V utilizando un aparato Mini-Protein II Cell PAGE (Bio-Rad) hasta que el frente del colorante alcanzó el fondo del gel. Los geles se tiñeron con Coomassie Brilliant BlueG (#B-0770, Sigma) (0,25 % p/v de Coomassie Brilliant Blue G, 45 % de metanol y 10 % de ácido acético), y el exceso de tinte se eliminó con una solución decolorante (45 % de metanol, 45 % de agua y 10 % de ácido acético).
Ejemplo 1.5 - Almacenamiento del OsPA liofilizado como polvo liofilizado
Además del almacenamiento del OsPA purificado en glicerol al 50 %, el OsPA puede ser producido como una proteína liofilizada que puede ser almacenada a -20 °C. Esto puede lograrse mediante conversión a partir de la solución madre de OsPA con glicerol al 50 % o directamente a partir del concentrado de OsPA directamente de la columna.
Tubos de diálisis (23 mm de ancho, 12 kDa de corte) de 30 cm de largo fueron remojados en agua destilada conteniendo 1 mM de EDTA y 0,2 % de azida sódica durante 1-2 horas. A continuación, los tubos se lavaron con agua destilada 10 veces y cada pieza se llenó con 80 ml de BSA al 10 % en H2O con un 0,2 % de azida sódica y se almacenó en agua destilada a 4 °C durante 8 semanas. Se garantiza que el tubo esté siempre sumergido. Antes de su utilización, se retiró la solución de BSA y se lavó el interior del tubo con 100 volúmenes de agua destilada.
Agregar caldo de glicerol OsPA (2,0 mg/ml en 50 % de glicerol-Tris HCL 0,05 M pH 7,4) en cada tubo, luego agregar 10 % de BSA a una concentración final de 1 % y 10 % de azida sódica a una concentración final de 0,2 % y atar el tubo. El OsPA en tubo de diálisis se dializó en tampón hepes 0,02 M pH 7,4 (tampón de diálisis) a 250-300 veces el volumen de dializado a 4 °C durante toda la noche con agitación magnética lenta y continua para obtener una concentración final aproximada de glicerol de 10-15 mM. Esta proporción asegura que la concentración final de glicerol en la sangre (4 ml) en un tubo de recogida con OsPA es inferior a 0,1 mM.
Una vez alcanzado el equilibrio (es decir, 24 horas a 4 °C), el OsPA dializado se retiró cuidadosamente del tubo. El OsPA se repartió en frascos de vidrio oscuro pretratados y secados con tensioactivo (2,41 g/L) con 10 mg de OsPA por frasco. La suspensión de OsPA/BSA recuperada se congeló utilizando hielo seco como preparación para la liofilización. La liofilización se llevó a cabo utilizando un liofilizador Christ según el ejemplo 2 con un ajuste de 0,08 m Torr y -60 C durante 24 horas.
Después de la liofilización, se reconstituyó un frasco de muestra del OsPA con 5 ml de Gelofusine para obtener una concentración de OsPA de 1.0-2.0 mg/ml Se estableció una curva de concentración estándar de OsPA sin dializar a 0,125, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5, 2,0 y 3,0 jg para determinar la recuperación del OsPA dializado y liofilizado. Se utilizaron cuatro diluciones diferentes de OsPAs dializados y liofilizados para el ensayo de coagulación de sangre entera recalcificada. Se calculó la recuperación del OsPA en los dos pasos y los resultados mostraron que se recuperó aproximadamente el 100 % del OsPA en los pasos de diálisis y secado por congelación.
El OsPA liofilizado ha sido almacenado exitosamente con retención de actividad por 6 meses a - 20 C.
Nótese que el OsPA utilizado en los ejemplos proviene de existencias de glicerol al 50 %.
Ejemplo 1.6 Caracterización de la ecarina
La ecarina aislada del veneno deEchis carinatusse obtuvo de Sigma Aldrich Número de Catálogo EC0504 en un vial de 45-55 Unidades como polvo liofilizado. El contenido proteico se determinó mediante el ensayo proteico de Lowry (Ensayo de proteína BioRAD DC número de catálogo 500-01116) como 110-110 mg/vial. La ecarina se almacenó a -20 C.
La ecarina del veneno deEchis carinatuses el reactivo primario en la prueba del tiempo de coagulación de la ecarina (ECT), que se utiliza para controlar la anticoagulación y la inhibición de la trombina. Una unidad se define como la cantidad necesaria para activar la protrombina para producir una unidad de actividad amidolítica a pH 8,4 a 37 °C. Una unidad amidolítica hidrolizará 1,0 jm o l de N-p-tosil-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilida por minuto a pH 8,4 a 37 °C . La actividad de la ecarina se determina mediante ensayos cromotográficos según el ejemplo 5.
Ejemplo 2 - Preparación de los tubos
Los tubos utilizados en el presente estudio fueron tubos de plástico lisos de tapa blanca Greiner (Código # 456001, Greiner Bio-One GmbH, Austria) o tubos de plástico lisos de tapa roja Becton Dickinson (Código # 3276916, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, EE. UU.).
El ejemplo 6 ilustra que la presencia de un tensioactivo en la formulación del tubo es beneficiosa para la liberación óptima de la pared del tubo y, por consiguiente, de la actividad del activador de protrombina. Aunque en este ejemplo, la adición de un portador coloide (en este caso 0,1 % de BSA) a los tubos sin tensioactivo demuestra un beneficio en comparación con los tubos sin BSA y sin tensioactivo, la actividad es óptima en todos los casos con la adición de un tensioactivo. De ahí que los tubos de los ejemplos se hayan fabricado con la adición de un tensioactivo.
Para preparar los tubos, se agregaron 20 pl de solución tensioactiva al tubo como formulación líquida, seguido de un agitado en vórtex durante 10 segundos para asegurar que el fondo del tubo quedaba recubierto. Este procedimiento imitaba el procedimiento de pulverización comercial que suelen emplear los fabricantes de tubos. A continuación, los tubos se secaron en un desecador de vacío durante toda la noche o utilizando un secador de centrífuga GeneVac. A continuación, se disolvieron 20 pL de activador de protrombina en tampón u otra formulación (según el ejemplo 1) y se agregaron al tubo, tras lo cual se secaron por centrifugación al vacío utilizando un Genevac Z-22 durante 30 minutos a 0,1 T de vacío a 29-30 °C. Los tubos se volvieron a tapar con la tapa original, se envolvieron en film transparente para protegerlos del polvo y la humedad y se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se necesitaron.
Alternativamente, las muestras de tubo se secaron al aire durante la noche sin la tapa a una temperatura ambiente controlada. A continuación, los tubos se volvieron a tapar con la tapa original, se envolvieron en film transparente para protegerlos del polvo y la humedad y se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se necesitaron.
La liofilización se realizó utilizando un liofilizador Christ. Las muestras se secaron a 0,01 T de vacío a -60 °C durante 1 hora. A continuación, los tubos se volvieron a tapar con la tapa original, se envolvieron en film transparente para protegerlos del polvo y la humedad y se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se necesitaron.
Ejemplo 3 - Irradiación
Se procedió a la irradiación de los tubos preparados para garantizar la esterilidad del producto final. La irradiación puede realizarse mediante exposición a radiación gamma o tecnología de haz de electrones (haz-E). En el presente estudio, la irradiación se llevó a cabo en una instalación comercial que utiliza un sistema Gammacel 220 (GC220) de irradiación gamma.
Los tubos de recogida de sangre que contenían las composiciones de coagulación preparadas se colocaron en un equipo de calibración (GC220) y, a continuación, en la cámara de irradiación GC220 y se sometieron a irradiación gamma (Cobalto -60). Basándose en la tasa de dosis conocida en este equipo de calibración, el producto se irradió durante el tiempo previsto para garantizar que se alcanzaba la dosis requerida. Los resultados se expresan como dosis diana (kGv); dosis real; (kGv) y tiempo de irradiación.
La trazabilidad y la incertidumbre de la medición se validaron de la siguiente manera. Los dosímetros se calibraron en un campo de radiación de cobalto-60, en el que la tasa de dosis se determinó a partir de mediciones de dosímetros de referencia realizadas en condiciones similares. Las mediciones del dosímetro de referencia son trazables a la norma australiana de dosis absorbida. Esta irradiación se realizó basándose en la tasa de dosis de referencia determinada en el campo de radiación calibrado.
La incertidumbre global asociada a la tasa de dosis de referencia incluye tanto la incertidumbre de calibración del lote de dosímetros como la incertidumbre debida a la variación dentro del lote, y se calculó en un 2,0 %. Esta incertidumbre ampliada se basó en la incertidumbre estándar multiplicada por un factor de cobertura de dos, lo que proporciona un nivel de confianza de aproximadamente el 95 %. La evaluación de la incertidumbre se llevó a cabo de acuerdo con la Guía ISO para la Expresión de la Incertidumbre en la Medición. Los sistemas de gestión de la calidad cumplían las siguientes licencias y normas: Licencia TGA No.1182; ISO 13485:2003 (excluidos diseño y desarrollo) de ISO 9001:2008. El sistema de gestión de la calidad también se ajusta a los principios de las siguientes normas y directrices: RSO 11137 Mejores prácticas internacionales de dosimetría (normas ISO 17025 e ISO/ASTM de dosimetría para el tratamiento de las radiaciones).
Ejemplo 4 - Procedimientos normalizados de evaluación de muestras de sangre
La sangre entera citratada recogida para todos los ejemplos se tomó tanto de individuos sanos como de pacientes que seguían terapias anticoagulantes orales, con consentimiento escrito. Los parámetros de coagulación utilizados fueron: tiempo de protrombina (PT), tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) y concentración plasmática de fibrinógeno.
También se midió el número de plaquetas en un analizador hematológico Sysmex XE-5000 (Sysmex, Kobe Japón): Los parámetros normales de coagulación son: PT: 10-12 segundos; aPTT: 30-35 segundos; concentración plasmática de fibrinógeno 1,5-2,5 g/L y recuento de plaquetas 150-450 * 109 por ml de sangre.
Los pacientes que recibieron terapia con warfarina oral fueron controlados mediante el cociente internacional normalizado (INR). El INR se determinó trazando la proporción entre la PT de los pacientes que recibieron terapias con anticoagulantes y la de los individuos sanos. El iNr para una terapia eficaz con warfarina es de 2,0-3,0.
La sangre entera citratada de individuos sanos se agrupó en aproximadamente n=50 o se utilizó individualmente. Los individuos sanos donaron -500 ml de sangre que se probaron para determinar el tiempo de coagulación de la sangre entera recalcificada, el PT, el aPTT, la concentración de fibrinógeno y el recuento de plaquetas.
Se midió el tiempo de recalcificación de la sangre entera en cada ejemplo y se registraron los datos para cada lote de sangre entera citratada. El tiempo normal de recalcificación de la sangre entera oscila entre 15 - 20 minutos. Las muestras colectivas o individuales con perfil de coagulación normal o de pacientes anticoagulados eran adecuadas para su uso en pruebas de coagulación sanguínea.
En algunos ejemplos se utilizó sangre fresca, tomando muestras individuales o múltiples directamente de voluntarios sin citratación/recalcificación. Se comprobó el perfil normal de coagulación de las muestras mediante el uso de un tubo de control en paralelo a los tubos sometidos a prueba. En algunos estudios, también se citó sangre del mismo voluntario y se analizó en paralelo incluyendo mediciones de TEG según el ejemplo 5.
Ejemplo 5 - Evaluación del rendimiento de la composición de la coagulación
Ejemplo 5.1 - Ensayo de coagulación del plasma
Se realizó un ensayo de coagulación de plasma citratado recalcificado utilizando un instrumento Hyland-Clotek según lo descrito por Austen et al (1975). Para cada grupo de experimentos se utilizó plasma citratado combinado recién extraído de voluntarios normales. El volumen de ensayo fue de 250 pl. Se agregó plasma humano normal citratado (100 pL) a un tubo de coagulación de vidrio (1 ml) con 100 pL de tampón Hepes 0,2 M y NaCl 0,1 M (pH 7,4). Las muestras se colocaron en el bloque de calentamiento a 37 °C de una máquina de coagulación de plasma Hyland-Clotek, y después de al menos 1 min, se agregaron 25 pl de CaCh 0,2 M (hasta una concentración final de 20 mM) (cuando fue necesario), seguidos inmediatamente por 20 pl de una solución que contenía actividad OsPA, momento en el que se puso en marcha el temporizador.
Las concentraciones de OsPA, basadas en la concentración de proteína y un peso molecular para el complejo Factor V-Factor Xa de 250.000, oscilaron entre 0,01 pM y 1,9 pM. El plasma citratado por lo general contiene 20 mM de citrato (como citrato trisódico) y, tras la dilución, la concentración de citrato en la mezcla de reacción era de 8 mM, lo que da una concentración neta de calcio (exceso molar sobre citrato) en la mezcla de reacción de 12 mM. El tiempo de coagulación se registró en segundos. Cada ensayo se realizó por duplicado.
La figura 4 muestra curvas estándar, trazando el tiempo de coagulación contra la cantidad de proteína de la fracción OsPA del 17 de abril de 2012.
Ejemplo 5.2 - Evaluación visual de la coagulación
Se colocó en una botella de plástico en una campana de riesgo biológico sangre normal citratada combinada con un PT = 10-12 segundos; un aPTT = 35-40 segundos; una concentración de fibrinógeno = 1,5-4,0 g/L y un recuento de plaquetas de 150-400 *109 /ml. Se utilizaron tubos Greiner de tapa blanca o tubos BD de tapa roja lisos que contenían tensioactivo hirofílico secado al vacío (20 pl de 2,41 g/L de tensioactivo en agua de ósmosis inversa). Además, se agregó a los tubos OsPA o ecarina, con o sin Gelofusine (20 pl). El OsPA o la ecarina se agregaron como solución húmeda o como composición secada con Genevac/desecador de vacío, a la que se agregaron 50 pl de cloruro cálcico 1 M. A continuación, se dispensaron 3,95 ml de sangre citratada con una pipeta Gilson P5000 en los tubos y se puso en marcha el temporizador. Los tubos se volvieron a tapar inmediatamente y se inclinaron suavemente por inversión. Dos investigadores tomaron muestras de sangre por duplicado. Los tubos que contenían sangre se invirtieron continuamente hasta que se observó un grumo inicial de coágulo, momento en el que se registró el tiempo como "tiempo de inicio de la coagulación". Cuando se observó un coágulo sólido en la inversión, el tiempo se registró como "tiempo de coagulación completado".
Ejemplo 5.3 - Ensayo de tromboelastografía (TEG)
Los procedimientos operativos para la máquina de trombelastografía (TEG) y los parámetros generados de cada ensayo se proporcionan en el Manual Operativo del TEG® Haemostasis Analyser 5000 series (Haemscope Corporation, IL, EE. UU.) y el software que lo acompaña.
Cada mezcla de reacción se preparó directamente en un vaso desechable hecho a propósito (Cat no. 6211, Haemscope Corporation) y consistió en un volumen máximo de 360 pL. La sangre citratada entera fue un componente de todos los ensayos y se mantuvo a un volumen constante de 320 pl.
Se agregaron otros componentes en el siguiente orden: 1. Diluciones OsPA, 2. Calcio cuando esté presente (concentración final 20 mM = 3,6 pL de solución 2 M), y Sangre total citratada (320 pL), dando un exceso de calcio sobre citrato de aproximadamente 10 mM en función del hematocrito de la mezcla de 10 muestras de sangre.
La figura 5 muestra un diagrama de un trazo de un experimento de trombelastografía. Cada prueba se controló hasta que se estableció el valor de amplitud máxima (MA). Los gráficos se generaron con el software complementario del TEG. El analizador TEG® mide la elasticidad de cizallamiento de un coágulo a medida que se forma o la lisis. Los parámetros relevantes calculados por el software complementario fueron: R - Tiempo de reacción. Tiempo transcurrido desde el inicio de la toma de una muestra hasta la primera formación de coágulos detectable. Este es el punto en el que la mayoría de los ensayos tradicionales de coagulación del plasma alcanzan su punto final, medido en segundos; Ángulo - a. Medida de la rapidez de la acumulación y reticulación de la fibrina (refuerzo del coágulo); MA -Amplitud máxima. Rigidez o resistencia máxima (módulo de cizallamiento máximo) del coágulo desarrollado; A -Amplitud. La anchura de la traza en cualquier punto y es igual a MA hasta que se establece MA; G - La resistencia del módulo elástico de cizallamiento (SEMS). Este valor puede calcularse a partir del valor de amplitud máxima mediante la relación G = 5000*MA/(100-MA).
La amplitud del perfil del Trombelastograma a intervalos de 5 segundos se registró y recuperó utilizando la función 'Lysis Tracker' del software TEG. A continuación, estos datos se utilizaron para calcular los parámetros cinéticos de la formación del coágulo y la lisis. Se registraron los parámetros de cada muestra y se calculó el promedio de las réplicas. El error estándar se determinó calculando primero la desviación estándar y dividiendo después este valor por la raíz cuadrada del número de réplicas.
Ejemplo 5.4 - Ensayo cromogénico/S-2222
El S-2222 es un sustrato cromogénico a base de péptidos que libera p—nitroanilina en la hidrólisis, que puede medirse a 405 nm. El S-2222 fue diseñado para ser específico para la hidrólisis por el Factor Xa.
Utilizando un espectrofotómetro, la mezcla de ensayo en la célula tenía un volumen total de 1 ml, compuesto por: (1) 900 |jL de tampón Hepes, pH 7,4; (2) 50 j L de S-2222 (solución 3 mM en agua), dando una concentración inicial de sustrato de 150<j>M; y 50<j>L de activador de protrombina, tal como OsPA. Se diluyó hasta una concentración final de trabajo de 10 nM. El coeficiente de extinción molar A405 para la p—nitroanilina es de 9600 M-1, y el espectrofotómetro proporciona la velocidad de aumento de A405 en unidades de absorbancia/s.
La figura 6 muestra curvas de progreso para la liberación de p-nitroanilina a diferentes concentraciones de OsPA (usando la fracción de OsPA designada 17/04/2012). Las curvas de progreso son lineales. Una nueva representación gráfica de la tasa frente a la cantidad de OsPA fue lineal y constituyó la curva estándar para este ensayo. A partir de la tasa, y la cantidad de activador de protrombina en el ensayo, se puede calcular una actividad específica del activador de protrombina, como Unidades/ml de proteína donde 1 Unidad (U) es la cantidad de proteína requerida para hidrolizar 1 micromol de S-2222 por minuto en el ensayo estándar.
Ejemplo 5.5 - Ensayo cromogénico/S-2238 en dos etapas
Otro ensayo cromogénico que puede utilizarse es el S-2238, un sustrato cromogénico a base de péptidos que liberap-nitroanilina en la hidrólisis, que se mide a 405 nm. El S-2238 fue diseñado para ser específico de la hidrólisis por trombina (Factor Ila). El ensayo depende del muestreo de alícuotas cronometradas de una mezcla de ensayo de primera etapa (protrombina y activador) en una mezcla de ensayo de segunda etapa que contiene S-2238 para medir la trombina producida en la primera etapa.
El ensayo se realiza en una placa de microtitulación de 96 pocillos y las absorbancias se leen en un lector de placas. La mezcla de ensayo de la primera etapa tenía un volumen total de 100 uL, compuesto por: (1) 25<j>L de tampón Hepes, pH 7,4, 5mM CaCl2, 0,1 % de BSA; (2) 25 uL de activador (0,25 ug OsPA/ml); (3) y 50 uL de protrombina (2 uM) para iniciar la reacción.
A intervalos de 5 minutos, se agregan 10 uL de la mezcla de ensayo de la primera etapa a 90 uL de S22380,2 mM en un pocillo adyacente de la microplaca y se controla la absorbancia durante 2 minutos. El coeficiente de extinción efectivo A405 para la p-nitroanilina en estas condiciones se determinó como 2271 M-1, utilizando patrones de pnitroanilina. Este factor se utiliza para convertir la tasa de aumento en unidades de absorbancia/s a umol S2238 hidrolizado por segundo.
Se produjeron curvas de progreso lineal cuyas pendientes dan la tasa de hidrólisis de S2238 en la etapa 1. Estos valores se convierten en concentraciones de trombina mediante la ecuación de Michaelis-Menten sustituida por los valores bibliográficos de kcat y Km(Sonder SA and Fenton JW, Clin.Chem. 1986, 32 (6), 934-937A). Una nueva representación gráfica de estas concentraciones de trombina frente al tiempo de muestreo también fue lineal, cuya pendiente da la concentración de activador de protrombina en el ensayo de la etapa 2 como Unidades/ml, donde 1 Unidad (U) es la cantidad de activador necesaria para hidrolizar 1 micromol de protrombina por minuto en el ensayo estándar (eg) (9,98e-6 umol/min). También se demostró la linealidad de la tasa de producción de trombina frente a la concentración de OsPA, cuya pendiente da la actividad específica del activador de protrombina como unidades/mg de proteína (por ejemplo,) (5,0e-3 unidades/mg).
Ejemplo 5.6 - Prueba de estabilidad
Para determinar la estabilidad de las formulaciones en condiciones de uso, las muestras se almacenaron en las siguientes condiciones: (1) para las pruebas de estabilidad refrigerada: 4 °C en un ambiente refrigerado (cámara frigorífica controlada por termostato); (2) para las pruebas de estabilidad a temperatura ambiente, definida como 25 °C (23,5 - 26,5 °C) las muestras se almacenaron a temperatura ambiente; (3) para las pruebas de estabilidad acelerada: 50 °C en un horno con termostato (49-51 °C).
Ejemplo 5.7 - Medición de analitos
El siguiente panel de analitos se midió en suero preparado como se describe en la presente memoria . El equipo utilizado fue un analizador de química general Beckman DxC800 y un analizador de inmunoensayo Beckman Dxl800 (Beckman Coulter, Brea, CA, EE.UU.):
Ejemplo 6. Estabilidad de las composiciones de coagulación en relación con las condiciones de secado y el tensioactivo
Ejemplo 6.1 - Introducción
Este experimento pretendía investigar los efectos de las condiciones de secado y el uso de tensioactivos sobre el tiempo de coagulación. En este ejemplo, se colocaron muestras de activador de protrombina recién diluido (OsPA, 0,25|jg o 1|jg) en tubos de recogida de sangre lisos de tapa blanca Greiner (Código #456001) (+/- tensioactivo hirofílico (20 j de 2,41 g/L en agua); /- 0,1 % de BSA) en tampón HEPES. Estos tubos se prepararon según el ejemplo 2, luego se probaron con 4 ml de sangre de un grupo de 50 donantes sanos o pacientes individuales según el ejemplo 4 y se sometieron al ensayo visual de coagulación y al análisis TEG según el ejemplo 5. Antes de los experimentos de coagulación de la sangre, los tubos se secaron mediante un desecador al vacío o Genevac según el ejemplo 2. Todos los pasos se llevaron a cabo a temperatura ambiente.
Ejemplo 6.2 - Resultados y discusión
Los resultados de la figura 7 muestran la actividad coagulante en sangre entera del OsPA recién diluido comparada con la del OsPA secado en desecador al vacío. Los datos D0 corresponden a muestras líquidas recién diluidas de OsPA agregadas a tubos de recogida de sangre. Los datos D1 corresponden a muestras secadas durante una noche a temperatura ambiente en tubos de recogida de sangre en un desecador al vacío según el ejemplo 2. Al comparar las columnas oscuras (D0), se observa el efecto de incluir un tensioactivo y BSA en las muestras frescas. Para las muestras de sangre de control (sin OsPA), la adición de tensioactivo y/o BSA al tubo antes de la sangre no tuvo ningún efecto significativo sobre el tiempo de coagulación medido mediante los Ensayos Estándar de Coagulación según el ejemplo 5. Para las muestras que contenían 0,25 jg de OsPA, la presencia de tensioactivo redujo el tiempo de coagulación de 330 a 132 segundos; con 1 jg de OsPA, los valores fueron de 180 y 72,5 segundos respectivamente. La BSA sola también redujo sustancialmente los tiempos de coagulación (pero no tanto como el tensioactivo), pero el efecto de la BSA y el tensioactivo no fue aditivo. Sin querer atarnos a la teoría, la explicación probable de los efectos del tensioactivo es que impide la unión del OsPA a la superficie del tubo de tal forma que no puede funcionar.
La comparación de las columnas a cuadros y oscuras en la figura 7 (D0 y D1) para cada conjunto de condiciones muestra el efecto del secado en un desecador al vacío como se llevó a cabo según el ejemplo 2 en comparación con una muestra de OspA recién diluida. En general, hubo una pérdida de actividad coagulante causada por el procedimiento de secado. Por ejemplo, utilizando 1 jg de OsPA, el secado aumentó el tiempo de coagulación de 180 a 255 segundos en ausencia de tensioactivo y de 72,5 a 127,5 s en presencia de tensioactivo. La presencia de tensioactivos y BSA por separado o conjuntamente dio lugar a menores tiempos de coagulación al secarse, pero las pérdidas siguieron siendo considerables. En todos los casos, los tubos con tensioactivo coagularon más rápidamente que los tubos sin tensioactivo. Por ejemplo, una muestra húmeda de 1 jg de OspA sin tensioactivo coaguló en 180 segundos, y con la adición de un tensioactivo en 72 segundos. El mismo tubo con el OsPA disuelto en un 0,1 % de BSA y sin tensioactivo agregado coaguló en 97 segundos. Este patrón se repite en las muestras húmedas y secas y muestra que, aunque coloides tales como la BSA pueden mejorar la actividad si el activador de protrombina en un medio tubular, la adición de un tensioactivo es óptima.
Los resultados de la figura 8 implicaron el uso de un secador al vacío Genevac según el ejemplo 2, que logró un secado más rápido de la muestra de OsPA que el desecador al vacío utilizado en la figura 7. El tiempo de secado fue de 30 min para un volumen total de 50 j l según el ejemplo 2. La figura 8 muestra que las muestras secadas tuvieron los mismos tiempos de coagulación que las correspondientes muestras frescas. También se incluyeron controles HEPES. Este experimento demuestra que el secado en un Genevac permitió conservar el 100 % de la actividad coagulante. De acuerdo con lo anterior, en la mayoría de los experimentos posteriores se utilizó el secado Genevac para preparar los tubos de recogida de sangre que contenían OsPA seco.
La figura 8 también muestra que las muestras mantuvieron la actividad, evidenciada por el tiempo de coagulación, después del almacenamiento a temperatura ambiente durante 8 días.
Ejemplo 7 - Estabilidad de las composiciones de coagulación en función del tiempo de almacenamiento
Ejemplo 7.1 - Introducción
Este experimento pretendía investigar los efectos del tiempo de almacenamiento sobre el tiempo de coagulación. Las muestras de activador de protrombina recién diluido (OsPA, 0,25 jg o 1 jg ) se colocaron en tubos de recogida de sangre lisos de tapa blanca Greiner (Código #456001) (+/- tensioactivo hirofílico (20 jL de 2,41 g/l en agua); /-0,1 % de BSA) en tampón HEPES. A continuación, los tubos se secaron utilizando un secador de vacío Genevac según el ejemplo 2 y se almacenaron a temperatura ambiente en un entorno seco según el ejemplo 2 durante un máximo de 85 días. Los ensayos de coagulación de sangre entera se realizaron según el ejemplo 5 semanal utilizando sangre citratada, extraída según el ejemplo 4. Tras el almacenamiento, los tubos se utilizaron para el ensayo de coagulación sanguínea mediante los análisis visual de coagulación y TEG (véase el ejemplo 5). Todos los pasos se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Cada semana se realizaron controles utilizando OsPA recién diluido en forma líquida, así como controles utilizando únicamente tampón Hepes.
Ejemplo 7.2 - Resultados
La tabla 7 muestra una pérdida de actividad coagulante en el día 85 para las muestras de 0,25 jg y 1 jg de OsPA. La pérdida de actividad se produce en algún momento entre el día 15 y el día 22.
Ejemplo 7.3 - Conclusión
De la tabla 7, se puede ver que los tubos de control usando OsPA líquido recién preparado dieron consistentemente los tiempos de coagulación esperados a lo largo de los 85 días del experimento (véanse las filas 1, 2, 5 y 6). En el caso de las muestras secas, los tiempos de coagulación se mantuvieron estables durante las tres primeras mediciones (días 1, 8 y 15). Sin embargo, se produjo un marcado aumento del tiempo de coagulación a los 22 días y esta pérdida de actividad coagulante continuó hasta el día 85 (véanse las filas 3, 4, 5 y 6). Por lo tanto, este ejemplo demostró una pérdida gradual de la actividad del OsPA cuando se formuló sólo con tensioactivo a lo largo del tiempo, cuando los tubos de recogida de sangre que contenían OsPA se almacenaron a temperatura ambiente.
Ejemplo 8 - Estabilidad de las composiciones de coagulación en relación con el tiempo de almacenamiento y otros aditivos
Ejemplo 8.1 - Introducción
Este experimento tenía como objetivo investigar los efectos sobre el tiempo de coagulación de diez reactivos conocidos por estabilizar las proteínas en algunas condiciones. Se colocaron muestras de activador de protrombina recién diluido (OsPA, 0,25 |jg o 1 |jg /- acetato de amonio pH 6,8) en tubos de recogida de sangre lisos de tapa blanca Greiner (Código #456001) (+ /-tensioactivo hirofílico (20 j l de 2,41 g/L en agua) /- 0,5 % de BSA; y otros posibles agentes estabilizadores: /- 0,1 % de PEG; /- 0,5 % de Prionex®; /-1 mM de Glicina/Arginina; /-534 nm de Textilinina; /-1 mM de citrato trisódico; /- 0,5 % de manitol; /- 0,5 % de sorbitol; /- 0,5 % de dextrano; /-0,5 % de gelatina) en tampón HEPES. Los tubos se prepararon según el ejemplo 2, se secaron con un Genevac® y se almacenaron a temperatura ambiente en un entorno seco durante un máximo de 99 días. Los ensayos de coagulación de la sangre entera se realizaron semanalmente utilizando sangre citratada, preparada según el ejemplo 4. Tras el almacenamiento, los tubos se utilizaron para el ensayo de coagulación de la sangre mediante el procedimiento de coagulación visual según el ejemplo 5. Todos los pasos se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Cada semana se realizaron controles utilizando OsPA recién diluido en forma líquida, así como controles utilizando únicamente tampón Hepes.
Ejemplo 8.2 - Resultados
La tabla 8 muestra una pérdida de actividad coagulante en el día 85 para las muestras de 1 jg de OsPA. La pérdida de actividad se produce en algún momento entre el día 15 y el día 22.
Tabla 8. Coagulación de sangre entera citratada recalcificada en tubos de recogida de sangre secos que contienen OsPA
La tabla 8 muestra los resultados del experimento que abarca el almacenamiento hasta 99 días (más de 3 meses) a temperatura ambiente. Las cifras indicadas corresponden al número de segundos necesarios para la formación del coágulo. La BSA y el dextrano por separado estabilizaron la actividad de coagulación sanguínea del OsPA en comparación con el tampón solo. Por ejemplo, tras 99 días de almacenamiento, el tiempo de coagulación de los tubos OsPA/BSA y OsPA/dextrano fue de 380 y 310 segundos, respectivamente, en comparación con el control fresco (95 segundos), OsPA solo (510 segundos) y el control sin OsPA (710 segundos). Este resultado demostró la capacidad de 1 jg de OsPA para coagular 4 ml de sangre entera citratada recalcificada en aproximadamente 5 minutos tras su almacenamiento a temperatura ambiente durante tres meses, con dextrano o BSA. Otros reactivos que proporcionaron cierto grado de estabilización fueron el sorbitol, Prionex®, la gelatina y el manitol.
Ejemplo 9 - Estabilidad de las composiciones de coagulación en relación con el tiempo de almacenamiento, la temperatura y la adición del coloide Gelofusine
Ejemplo 9.1 - Introducción
Buscando mejorar aún más la estabilidad de la actividad coagulante de los activadores de protrombina secos tales como OsPa, se probó el extensor de plasma Gelofusine. El coloide Gelofusine (B. Braun) es una solución estéril de gelatina succinilada (4 % p/v) en solución salina isotónica, de bajo coste y fácilmente disponible.
Este experimento pretendía investigar los efectos de un coloide proteico como estabilizador para preservar la función del tiempo de coagulación a lo largo del tiempo. Los tubos se prepararon según el ejemplo 2, en el que el coloide se enrolló sobre la superficie interior del tubo. Se colocaron muestras de activador de protrombina recién diluido (OsPA, 1 |jg /- acetato de amonio pH 6,8) en 20 jL de Gelofusine pH 7,4 en tubos de recogida de sangre lisos de tapa blanca Greiner (Código #456001) (+/- tensioactivo hirofílico (20 jL de 2,41 g/L en agua). A continuación, los tubos se secaron con un Genevac® según el ejemplo 2 y se almacenaron a temperatura ambiente durante un máximo de 211 días (Figuras 9 y 10). La sangre entera preparada según el ejemplo 4 se utilizó en ensayos de coagulación de sangre entera y se evaluó en este ejemplo mediante el procedimiento de Evaluación Visual de la Coagulación según el ejemplo 5. Después del almacenamiento y en cada punto temporal, las muestras de sangre (citratada, combinadas) se dividieron en alícuotas en los tubos con un volumen final de 4 ml, y el tubo que contenía la muestra se sometió al ensayo estándar de coagulación de sangre entera según el ejemplo 5. Todos los pasos se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se realizaron controles utilizando OsPA recién diluido en forma líquida en cada punto temporal, además de los controles apropiados que carecían de OsPA.
Además, 12 tubos fueron probados usando sangre fresca según el ejemplo 4 con Evaluación Visual de Coagulación realizada según el ejemplo 5. Los tubos se prepararon según el ejemplo 2, con muestras de activador de protrombina recién diluido (OsPA, 1 jg en 20 jL de Gelofusine pH 7,4) colocadas en tubos de recogida de sangre Becton Dickinson lisos (Código #3276916) tensioactivo hirofílico (20 jL de 2,41 g/L en agua). A continuación, los tubos se secaron con un Genevac® como en el ejemplo 2. El tiempo de coagulación visual en T0 fue de 158,9 /- 95 segundos, comparable a los experimentos con sangre citratada en tubos lisos BD.
Ejemplo 9.2 - Resultados y discusión
Los resultados se muestran en las figuras 9 (histograma) y 10 (gráficos lineales). Después de siete meses (211 días) a temperatura ambiente, el tiempo de coagulación utilizando 1 jg de OsPA de 4 ml de sangre fue de 265 segundos, en comparación con 84 segundos para el control fresco y 950 segundos para el control de muestra de sangre citratada recalcificada sin adiciones. Se observó una excelente estabilidad hasta los 121 días, pero después se produjo una pérdida de actividad entre las mediciones de 121 y 157 días. La pendiente del gráfico de la línea 'OsPAseco' es de 1,0 segundos/día si se consideran todos los puntos temporales y de 0,79 segundos/día si sólo se consideran los puntos del día 1 al 121.
A continuación, se compararon las tasas de pérdida de actividad coagulante en el ejemplo 10 y en el presente ejemplo. Las tasas iniciales de pérdida de actividad fueron de 1,67 segundos por día en el ejemplo 10 (presencia de BSA y dextrano) y de 0,79 segundos por día en el ejemplo 9 (presencia de Gelofusine como coloide ejemplar). Si se consideran todos los puntos de datos de cada ensayo, las tasas correspondientes fueron 1,29 en el ejemplo 11 y 1,0 en el ejemplo 10. Estos datos muestran, por tanto, que los coloides dextrano, BSA y Gelofusine son eficaces para estabilizar el OsPA, siendo la Gelofusine la que parece tener el mayor efecto de las muestras analizadas.
Ejemplo 10 - Estabilidad de las composiciones de coagulación en relación con el tiempo de almacenamiento, la temperatura y la adición de BSA y dextrano
Ejemplo 10.1 - Introducción
Este experimento tenía como objetivo investigar los efectos de BSA y Dextrano combinados como estabilizador para preservar la función de coagulación a lo largo del tiempo (Figuras 11 y 12). Los tubos se prepararon según el ejemplo 2. Se colocaron muestras de activador de protrombina recién diluido (OsPA, 1 jg en 20 jL de solución de acetato de amonio que contenía /- 0,5 % de dextrano, /- 0,5 % de BSA pH 6,8) en tubos de recogida de sangre lisos de tapa blanca Greiner (Código #456001) (+/- tensioactivo hirofílico (20 j de 2,41 g/l en agua) Los tubos se secaron a continuación utilizando un Genevac® según el ejemplo 2 y se almacenaron a temperatura ambiente durante un máximo de 195 días según el ejemplo 5. La sangre entera preparada según el ejemplo 4 se utilizó en ensayos de coagulación de sangre entera, evaluados en este ejemplo mediante el procedimiento de Evaluación Visual de la Coagulación según el ejemplo 5. Tras el almacenamiento y en cada punto temporal, las muestras de sangre (citratada, combinadas) se dividieron en alícuotas en los tubos, con un volumen final de 4 ml y el tubo que contenía la muestra se sometió al ensayo estándar de coagulación de sangre entera según el ejemplo 5. Todos los pasos se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se realizaron controles utilizando OsPA recién diluido en forma líquida en cada punto temporal, además de los controles apropiados que carecían de OsPA.
Ejemplo 10.2 - Resultados y discusión
La figura 11 muestra los resultados del experimento que abarca el almacenamiento de hasta 195 días (aproximadamente 6,5 meses) a temperatura ambiente en forma de histograma, y la figura 12 muestra los gráficos lineales correspondientes. La comparación de estos resultados con los de la tabla 8 muestra que la BSA y el dextrano juntos proporcionaron una mayor estabilización que cualquiera de los dos materiales por separado. Tras 6,5 meses de almacenamiento, el tiempo de coagulación de los tubos con OsPA/BSA/dextrano fue de 247 segundos, en comparación con el control fresco (83 segundos) y el control sin OsPA(957 segundos). La pendiente del gráfico lineal de la figura 12 que incluye todos los puntos temporales es de 1,29 segundos por día (aumento del tiempo de coagulación por día). Si se excluyen los cuatro últimos puntos temporales, la pendiente es de 1,67 segundos por día (R2 = 0,87).
Ejemplo 11 - Estabilidad de las composiciones de coagulación en relación con la temperatura y la adición del coloide Gelofusine
Ejemplo 11.1 - Introducción
El objetivo de este estudio fue determinar la estabilidad de la actividad de coagulación de la sangre entera del OsPA desecado en Gelofusine cuando se almacena a 50 °C. La degradación forzada a una temperatura de almacenamiento superior a la normal se ha utilizado a menudo para obtener datos de estabilidad más rápidamente que almacenando las muestras durante un periodo definido a la temperatura de almacenamiento elevada. La tasa de pérdida de actividad a la temperatura más alta puede extrapolarse a la temperatura normal de almacenamiento, por ejemplo, utilizando la ecuación de Arrhenius.
Además de probar la estabilidad cuando el OsPA se secó en Gelofusine a pH 7,4, también se determinó el efecto de ajustar el pH de la Gelofusine a 6,0. La razón para estudiar el efecto de un pH más bajo fue investigar la posibilidad de que el componente Factor Xa del OsPA sea capaz de catalizar la proteólisis del OsPA con la pérdida concomitante de actividad. La actividad catalítica del OsPA es menor a pH 6,0 que a pH 7,4.
Los tubos se prepararon según el ejemplo 2. Se prepararon dos juegos de muestras, uno con tubos de recogida de sangre lisos de tapa blanca Greiner (código #456001) y otro con tubos de recogida de sangre lisos de tapa roja BD (código 3276916). Para cada juego de muestras, se colocó en los tubos el activador de protrombina recién diluido (OsPA, 1 |jg, 2 |jg o 5 |jg) /- tensioactivo hidrofílico (20 j l de 2,41 g/L en agua) /- 50 j l de Gelofusine al 4 % p/v; y se tamponó a pH 7,4 o pH 6,0. A continuación, los tubos se secaron con un Genevac® según el ejemplo 2 y se almacenaron a temperatura ambiente hasta 211 días según el ejemplo 2. La sangre entera preparada según el ejemplo 4 se utilizó en ensayos de coagulación de sangre entera, evaluados en este ejemplo mediante el procedimiento de Evaluación Visual de la Coagulación según el ejemplo 5. Tras el almacenamiento y en cada punto temporal, las muestras de sangre (citratada, combinada) se dividieron en alícuotas en los tubos, con un volumen final de 4 ml y el tubo que contenía la muestra se sometió al ensayo estándar de coagulación de sangre entera según el ejemplo 5. Todos los pasos se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se realizaron controles utilizando OsPA recién diluido en forma líquida en cada punto temporal, además de los controles apropiados que carecían de OsPA.
Ejemplo 11.2 - Resultados y discusión
Las figuras 13 y 14 muestran los resultados del ensayo de estabilidad a 50 °C con tubos BD. Las figuras 15-18 muestran los resultados con tubos Greiner.
Basándose en estos resultados, el experimento correspondiente en tubos Greiner se modificó para utilizar una sola cantidad de OsPA(1jg). Los resultados de las figuras 15 (pH 7,4) y 18 (pH 6,0) mostraron que el OsPA era mucho más estable en los tubos Greiner que en los tubos BD (compárense las figuras 13 y 15 y las figuras 14 y 16). De acuerdo con lo anterior, el experimento se prolongó durante 30 días en lugar de los 7 días del experimento de BD.
Después de 30 días, el tiempo de coagulación para el tubo a 50 °C fue de 153,5 segundos comparado con 117,5 segundos para el tubo mantenido a temperatura ambiente y 83,5 segundos para el control fresco (Figura 16). La comparación de los datos de las figuras 15 y 16 muestra también que el ajuste del pH a 6 tuvo un pequeño efecto beneficioso (véanse las figuras 13 y 14).
Los resultados de la figura 13 muestran que mantener los tubos BD conteniendo OsPA a 50 °C condujo a una pérdida progresiva de actividad, de tal manera que un alto porcentaje de la actividad original se había perdido a los 7 días. Se obtuvieron resultados similares utilizando 1,2 o 5 jg de OsPA, salvo que se perdió un porcentaje mayor de la actividad original en los tubos de 5 jg que en los de 2 jg , que a su vez perdieron más actividad que los de 1 jg . Este resultado es coherente con sugerencias anteriores de que la actividad proteolítica del OsPA puede dar lugar a la autodegradación, que se produciría más rápidamente a concentraciones más altas. Otra posible razón de esta dependencia de la concentración de la pérdida de actividad es que la cantidad de Gelofusine por tubo era la misma en todos los tubos mientras que la cantidad de OsPA variaba de 1-5 jg . Una mayor proporción de Gelofusine y OsPA puede proporcionar una mejor protección. La figura 14 muestra que se obtuvieron resultados similares cuando el pH de la Gelofusine se ajustó de 7,4 a 6,0 antes de agregar el OsPA y secar. Sin embargo, la comparación de los tiempos de coagulación tras 1 y 7 días de almacenamiento a 50 °C sugiere que la pérdida de actividad fue ligeramente más lenta a pH 6 que a pH 7,4. Esto también encaja con la hipótesis de la "pérdida de actividad proteolítica".
Los resultados muestran claramente que la pérdida de actividad fue mayor en los tubos BD que en los Greiner. Una posible razón es que el tensioactivo utilizado puede no haber sido adecuado para el tipo de plástico de los tubos BD. Cabe señalar que la tasa de pérdida de actividad en los tubos Greiner a 50 °C no fue mucho mayor que la tasa de pérdida en el experimento correspondiente a temperatura ambiente. Esto puede deberse a un exceso de humedad en la película a menor temperatura. Debe tenerse en cuenta que los tubos de extracción de sangre producidos comercialmente se sellan al vacío, lo que puede limitar la cantidad de humedad dentro de la película superficial.
Los tiempos de coagulación de las figuras 15 y 16 se trazaron como gráficos lineales en un intento de determinar la tasa de pérdida de actividad a 50 °C, según las figuras 17 y 18, respectivamente. La pendiente de la línea de mejor ajuste para los datos a 50 °C de la figura 17 fue un aumento del tiempo de coagulación de 1,86 segundos por día de almacenamiento. La pendiente correspondiente para el almacenamiento a temperatura ambiente del ejemplo 9 fue de 0,79 segundos por día (basada en la tasa inicial).
Ejemplo 12 - Estabilidad de las composiciones de coagulación frente a la irradiación
Ejemplo 12.1 - Introducción
La irradiación se utiliza rutinariamente en la producción comercial de tubos estándar de recogida de sangre como medio de esterilización. El objetivo de este experimento era investigar el efecto sobre la OsPAde la irradiación gamma a una dosis industrial relevante de 15 kGy. El experimento se realizó en dos partes: Primera parte: OsPA con gelofusine, Parte 2: OsPA y ecarina derivada del veneno de serpiente con gelofusine y trehalosa.
En la parte 1, los tubos se prepararon según el ejemplo 2. El activador de protrombina recién diluido (OsPA, 1 |jg o 5 |jg) se colocó en tubos de recogida de sangre Greiner White top (código 456001) tensioactivo hirofílico (20 j l de 2,41 g/L en agua) y 50 j l de gelofusine al 4 % p/v; tampón Hepes pH 7,4 o tampón Hepes pH 7,4 0,5 % de dextrano 0,5 % de BSA. A continuación, los tubos se secaron utilizando un desecador de vacío según el ejemplo 2 y se almacenaron a temperatura ambiente mientras se realizaba la irradiación según el ejemplo 3. Se fabricaron ocho tubos con cada formulación, siendo cuatro tubos para irradiación según el ejemplo 3 y cuatro tubos para ser almacenados a temperatura ambiente según el ejemplo 2.
Los tubos que se van a irradiar fueron enviados a la instalación de irradiación el día 1 después de su preparación. Tras la irradiación con 15 kGy, los tubos se devolvieron y se probaron el día 8. La irradiación se realizó según el ejemplo 3 en la instalación de irradiación Gammacell 220 (ANSTO, Building 23, New Illawarra Road, Lucas Heights, NSW 2234, Australia) a 1,92 kGy/h durante 7,88 horas a 23,4 °C durante 7,88 horas, administrando una dosis total de 15,1 kGy.
Para la parte 2, los tubos se prepararon como en el ejemplo 2, incluyendo el recubrimiento con tensioactivo hidrofílico. El activador de protrombina (OsPA o ecarina), se preparó diluyendo soluciones concentradas en Gelofusine que contenía 6 % o 10 % de trehalosa. Se colocaron alícuotas de 20 j l que contenían 1 jg o 5 jg de OsPA o 2 UI de ecarina en tubos lisos de tapa blanca Greiner (número de código 456001) y tubos de tapa roja BD sin aditivo (número de código 366408). A continuación, los tubos se secaron con un Genevac según el ejemplo 2 y se almacenaron a temperatura ambiente mientras se realizaba la irradiación según el ejemplo 3. Se fabricaron treinta y dos tubos que contenían OsPA y ocho tubos que contenían ecarina, siendo veinte tubos para irradiación según el ejemplo 3 y veinte tubos para ser almacenados a temperatura ambiente según el ejemplo 2.
Los tubos que se van a irradiar se enviaron de nuevo a la instalación de irradiación el día 1 después de la preparación. Tras la irradiación el día 8 con 15 kGy, se devolvieron los tubos y se probaron el día 20. La irradiación se realizó según el ejemplo 3 en la instalación de irradiación Gammacell 220 (ANSTO, Building 23, New Illawarra Road, Lucas Heights, NSW 2234, Australia) a 1,92 kGy/h durante 7,88 horas a 23,4 °C durante 7,88 horas, administrando una dosis total de 15,1 kGy.
La sangre entera preparada según el ejemplo 4 se utilizó en ensayos de coagulación de sangre entera, evaluados en este ejemplo por el procedimiento de Evaluación Visual de la Coagulación según el ejemplo 5. Todos los pasos se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se realizaron controles utilizando OsPA recién diluido en forma líquida, además de controles apropiados desprovistos de OsPA. Todos los tubos con sangre coagulada se centrifugaron después de 35 minutos. Se tomaron imágenes del suero de tubos individuales y se recogió para realizar pruebas de analitos bioquímicos.
Ejemplo 12.2 - Parte 1 Resultados y discusión
Los resultados de la figura 19 muestran que la irradiación con 15 kGy condujo a una pérdida de la mayor parte de la actividad de coagulación en todas las muestras con 1 jg de OsPA. La gelofusine proporcionó una protección significativa de la actividad de coagulación, es decir, los tubos conservaron un -20 % de la actividad de los tubos no irradiados, mientras que en el tampón Hepes solo se perdió casi toda la actividad. Tanto el Dextrano como la BSA en el tampón Hepes y la Gelofusine protegieron la actividad de coagulación, pero la Gelofusine lo hizo en mayor medida. También hubo cierta pérdida de actividad en los tubos que habían sido secados y almacenados a temperatura ambiente pero no irradiados (Figura 19A), lo que concuerda con experimentos anteriores que mostraron pérdida de actividad cuando las muestras fueron secadas al vacío. Esto no afectó significativamente a los resultados en los tubos de Gelfusine ni en los tubos que contenían Hepes con BSA y dextrano. Sin embargo, con Hepes solo, los tubos que contenían 1 |jg de OsPA perdieron la mayor parte de la actividad sin irradiación, confirmando pruebas anteriores.
La dependencia de la concentración de los tiempos de coagulación mostrada en la figura 4 permite hacer una estimación de la cantidad de actividad de coagulación que se ha perdido debido a la irradiación. Por ejemplo, el tiempo de coagulación de los tubos irradiados que contenían 5 jg de OsPA fue de 134 segundos (Figura 19a). El tiempo de coagulación en un tubo que contenía 0,3 jg de OsPA fue de 137 segundos (Figura 4). Por lo tanto, la actividad de los 5 jg de OsPA después de la irradiación fue aproximadamente la misma que la actividad de 0,3 jg de OsPA fresco. Del mismo modo, 1 jg de OsPA irradiado en Gelofusine dio un tiempo de coagulación de 733 segundos en comparación con 744 segundos para 0,05 jg de OsPA fresco.
Ejemplo 12.3 - Parte 2 Resultados y discusión
La figura 19B muestra los resultados de los ensayos con tubos OsPA formulados con Gelofusine y 6 % o 10 % de trehalosa. Los resultados muestran que la irradiación con 15 kGy provocó cierta pérdida de la actividad de coagulación en todas las muestras en el día 12 después de la irradiación. Sin embargo, la Gelofusine que contenía 6 % y 10 % de trehalosa proporcionó una protección significativa de la actividad coagulante del OsPA en comparación con los resultados mostrados en la figura 19A. Además, el tiempo de coagulación de 1 jg de OsPA desecado en Gelofusine con un 10 % de trehalosa fue de aproximadamente 5 min tras la irradiación.
Los resultados de la figura 19C muestran que la irradiación con 15 kGy no afectó la actividad coagulante de la ecarina a 2 IU secada en Gelofusine conteniendo 10 % de trehalosa.
Ejemplo 13 - Estabilidad de las composiciones de coagulación frente a la irradiación II
Este experimento tuvo como objetivo investigar el efecto sobre OsPA de la irradiación gamma a una dosis industrialmente relevante de 25 kGy con tubos formulados con Ecarina. El experimento se realizó en dos partes: Primera parte: Ecarina con gelofusine, parte 2: Estabilidad a temperatura ambiente de los tubos irradiados.
En la parte 1, los tubos se prepararon según el ejemplo 2. Ecarina 2U recién diluida se colocó en tubos de recogida de sangre Greiner White top (Código# 456001) tensioactivo hirofílico (20 jL de 2,41 g/L en agua) y 20 jL de Gelofusine al 4 % p/v. A continuación, los tubos se secaron con un Genevac según el ejemplo 2 y se almacenaron a temperatura ambiente mientras se realizaba la irradiación según el ejemplo 3.
Los tubos que se van a irradiar fueron enviados a la instalación de irradiación el día 1 después de su preparación. Tras la irradiación con 25 kGy, los tubos se devolvieron y se probaron el día 7. La irradiación se realizó según el ejemplo 3 en la instalación de irradiación Gammacell 220 (ANSTO, Building 23, New Illawarra Road, Lucas Heights, NSW 2234, Australia)
Para la parte 2, los tubos con y sin tratamiento de irradiación se almacenaron a temperatura ambiente según el ejemplo 2.
La sangre entera preparada según el ejemplo 4 se utilizó en ensayos de coagulación de sangre entera, evaluados en este ejemplo por el procedimiento de Evaluación Visual de la Coagulación según el ejemplo 5. Todos los pasos se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se realizaron controles utilizando OsPA recién diluido en forma líquida, además de controles apropiados desprovistos de OsPA. Todos los tubos con sangre coagulada se centrifugaron después de 35 minutos.
Ejemplo 13.1 - Resultados y discusión
Los resultados de la figura 20 muestran que la irradiación con 25 kGy condujo a una pérdida menor de la actividad de coagulación en el día 7 en muestras con 2U de Ecarina (123 segundos) en comparación con las secas y no irradiadas (119 segundos). Tras 212 días a temperatura ambiente, se observó de nuevo una diferencia menor entre los tubos irradiados y los no irradiados (264 segundos frente a 254 segundos). Este ejemplo ilustra que el activador de protrombina Ecarina en una formulación apropiada exhibe estabilidad en presencia de irradiación y tras su posterior almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente.
Ejemplo 14 - Estabilidad de las composiciones de coagulación en relación con el tiempo de almacenamiento, la temperatura y otros aditivos II
Ejemplo 14.1 - Introducción
Se llevaron a cabo experimentos para determinar si la estabilidad del OsPA cuando se almacena o transporta a temperatura ambiente y a temperaturas elevadas tales como a 50 °C podría mejorarse mediante el uso de azúcares y otros aditivos. Los tubos se prepararon según el ejemplo 2. Se colocó OsPA 1 jg recién diluido en tubos de recogida de sangre lisos de tapa blanca Greiner (Código #456001) (+ tensioactivo hirofílico (20 jL de 2,41 g/L en agua) /- 20 jL de Gelofusine al 4 % p/v, y conteniendo 10 % de trehalosa, manosa, sacarosa y sorbitol, 1 mM de benzamidina y 0,1 mM de EDTA. En la parte 1, los tubos se secaron a continuación utilizando un desecador de vacío según el ejemplo 2 y se almacenaron a 50 °C durante un máximo de 71 días (véase la figura 21). En la parte 2, los tubos se secaron a continuación utilizando un desecador de vacío según el ejemplo 2 y se almacenaron a temperatura ambiente durante un máximo de 392 días (véase la figura 22). En la parte 3, se prepararon tubos adicionales según el ejemplo 2 utilizando OsPA 1 |jg colocado en tubos de recogida de sangre lisos de tapa roja BD(Código #3276916) (+ tensioactivo hidrofílico (20 jL de 2,41 g/L en agua) 20 jL de Gelofusine al 4 % p/v, y conteniendo 6 o 10 % de lactulosa. En la parte 3, los tubos se secaron a continuación con un secador de vacío Genevac según el ejemplo 2 y se almacenaron a temperatura ambiente durante 22 días (véase la figura 23).
La sangre entera preparada según el ejemplo 4 se utilizó en ensayos de coagulación de sangre entera, y se evaluó mediante el procedimiento de Evaluación Visual de la Coagulación según el ejemplo 5. Tras el almacenamiento, las muestras de sangre (citratada, combinadas) se dividieron en alícuotas en tubos, con un volumen final de 4 ml. A continuación, los tubos que contenían las muestras se sometieron al ensayo estándar de coagulación de sangre entera según el ejemplo 5. Todos los pasos se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se realizaron controles utilizando OsPA recién diluido en cada punto temporal, además de controles apropiados desprovistos de activador de protrombina.
Ejemplo 14.2 - Parte 1 - Resultados y discusión.
La figura 21 muestra una evolución temporal en la cual se encontró una pérdida mayor de actividad con OsPA a los 7 días en todas las muestras cuando las muestras fueron secadas en un secador al vacío. El almacenamiento posterior a 50 °C no produjo más pérdida de actividad. De hecho, algunas muestras mostraron una recuperación parcial de la actividad. Es posible que la pérdida inicial de actividad se debiera a un secado incompleto de las muestras, de modo que la presencia de humedad fuera la causa de la pérdida inicial de actividad. La muestra que contenía trehalosa tuvo un tiempo de coagulación de 367 segundos después de 10 semanas a 50 °C y los otros azúcares alrededor de 580 600 segundos después del mismo periodo. Esto es muy alentador, suponiendo que pueda evitarse la pérdida inicial de actividad, y sugiere que agentes tales como los coloides con aditivos estabilizadores pueden estabilizar eficazmente la actividad de los activadores de protrombina cuando se almacenan a temperaturas elevadas durante largos periodos de tiempo.
Ejemplo 14.3 - Parte 2 - Resultados y discusión.
La figura 22 ilustra que aunque el procedimiento de secado conduce a una disminución de la actividad en T0, el almacenamiento posterior a temperatura ambiente durante 392 días mostró una retención de la actividad en 425 segundos en las muestras formuladas con Trehalosa y sacarosa. Las formulaciones con otros aditivos parecían tener un efecto negativo sobre la actividad de coagulación. Esto también es muy alentador, suponiendo que pueda evitarse la pérdida inicial de actividad, y sugiere que agentes tales como los coloides con aditivos estabilizadores pueden estabilizar eficazmente la actividad de los activadores de protrombina cuando se almacenan a temperaturas comercialmente relevantes durante largos periodos de tiempo.
Ejemplo 14.4 Parte 3 - Resultados y discusión
La figura 23 ilustra que la lactulosa cuando es formulada con gelofusine parece tener un efecto protector del procedimiento de secado en T0. Aunque sólo se almacenó durante 22 días a temperatura ambiente, los resultados muestran una mejora en el tiempo de coagulación con un 10% de lactulosa, lo que indica que puede haber un efecto estabilizador en el OsPA durante largos periodos de tiempo.
Ejemplo 15: Estabilidad de las composiciones de coagulación en relación con el tiempo de almacenamiento, la temperatura y otros aditivos III
Ejemplo 15.1 - Introducción
Se llevaron a cabo experimentos para determinar si la estabilidad de la Ecarina cuando se almacena o transporta a temperatura ambiente podía potenciarse mediante el uso de azúcares y otros aditivos. Los tubos se prepararon según el ejemplo 2. Ecarina 1U recién diluida se colocó en tubos de recogida de sangre lisos de tapa blanca Greiner (Código #456001) (+ tensioactivo hirofílico (20 jL de 2,41 g/L en agua) /- 20 jL de Gelofusine al 4 % p/v, y conteniendo un 10 % de trehalosa, manosa, sacarosa y sorbitol, 1 mM de benzamidina y 0,1 mM de EDTA. A continuación, los tubos se secaron en un desecador de vacío según el ejemplo 2 y se almacenaron a temperatura ambiente durante un máximo de 392 días (véase la figura 23)
La sangre entera citratada y recalcificada preparada según el ejemplo 4 se utilizó en ensayos de coagulación de sangre entera, y se evaluó mediante el procedimiento de Evaluación Visual de la Coagulación según el ejemplo 5. Tras el almacenamiento, las muestras de sangre (citratada, combinadas) se dividieron en alícuotas en tubos, con un volumen final de 4 ml. A continuación, los tubos que contenían las muestras se sometieron al ensayo estándar de coagulación de sangre entera según el ejemplo 5. Todos los pasos se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se realizaron controles utilizando OsPA recién diluido en cada punto temporal, además de controles apropiados desprovistos de activador de protrombina.
Ejemplo 15.2 - Resultados y discusión.
La figura 24 ilustra que aunque el procedimiento de secado conduce a una disminución de la actividad en T0, el almacenamiento posterior a temperatura ambiente durante 392 días mostró una retención de la actividad en 350 segundos en las muestras formuladas con trehalosa y sacarosa. Las formulaciones con otros aditivos parecían tener un efecto negativo sobre la actividad de coagulación, aunque no tanto como en el ejemplo 13 cuando se utilizó OspA como activo. Esto también es muy alentador, suponiendo que pueda evitarse la pérdida inicial de actividad, y sugiere que agentes como los coloides con aditivos estabilizadores pueden estabilizar eficazmente la actividad de los activadores de protrombina cuando se almacenan a temperaturas comercialmente relevantes durante largos periodos de tiempo.
Ejemplo 16 - Efecto de la gelofusine en la detección del analito
Ejemplo 16.1 - Introducción
Este estudio pretendía determinar si la adición de gelofusine a los tubos de recogida de sangre tenía algún efecto clínicamente significativo sobre la capacidad de detectar una serie de analitos bioquímicos.
Las siguientes muestras de tubo se prepararon según el ejemplo 2 en los siguientes tubos: Tubo lisos de tapa blanca Greiner (número de código 456001, tubo de suero de tapa roja Greiner (número de código 456092), tubo liso de tapa roja BD (número de código #3276916) y tubo BD sin aditivo (número de código 366408): (1) Tubo liso Greiner con OsPAen tampón Hepes tensioactivo hirofílico A, (2) Tubo liso Greiner con OsPA+ gelofusine tensioactivo hirofílico A, (3) Tubo liso BD con OsPAen tampón Hepes tensioactivo hidrofóbico; (4) Tubo BD liso con OsPA+ gelofusine tensioactivo hidrofóbico, (5) Tubo de suero Greiner, (6) Tubo de suero Greiner gelofusine, (7) Tubo de suero Greiner OsPAen tampón Hepes, (8) Tubo de suero Greiner OsPA gelofusine, (9) Tubo de suero BD, (10) Tubo de suero BD gelofusine, (11) Tubo de suero BD OsPAen tampón Hepes, y (12) Tubo de suero BD OsPA+gelofusine.
Cada una de estas muestras de tubo se utilizó entonces para detectar una gama de analitos como se muestra en la tabla 9. Los analitos se probaron según el ejemplo 5.
Ejemplo 16.2 - Resultados y discusión
Los resultados se muestran en la tabla 9. El OsPA agregado sobre los tubos de suero comercial (tanto los tubos Greiner 7 y 8 como los tubos BD 11 y 12) mantuvo la detección normal de los analitos. La adición de gelofusine no tuvo ninguna repercusión clínica en ninguno de los analitos medidos. Por lo tanto, la adición de gelofusine a los tubos de recogida de sangre no parece tener ninguna repercusión en la capacidad de detección de analitos.
Tabla 9 - Detección de analitos con Gelofusine en tubos de extracción de sangre
(continuación)
Referencias
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40. EP 0628816
41. US 4,227,620
42. US 4,256,120
43. US 4,873,192
44. US 6,187,553
45. US 6,413,737
46. US 6,416,717
47. US 6,592,613
48. US 6,686,204
49. US 7,488,287
50. US 7,699,828
51. US 8,586,323

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1.Una composición de coagulación para preparar una muestra de suero, en la que la composición de coagulación comprende un activador de protrombina y un coloide, en la que el activador de protrombina comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NOs: 1, 55, 53, 54, 56, 57, 11, 12, 13, 32, 2, 3, 4, 7, 8, 16, 18, 26, 27, 28, 29, 30, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51 o 52, o comprende la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las establecidas en SEQ ID NOs: 9, 10, 31, 5, 6, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 o 49, y en la que el coloide es un coloide a base de gelatina o albúmina de suero bovino.
2. La composición de coagulación de la reivindicación 1, en la que el activador de protrombina es ecarina, oscutarina C (OsPA) o pseutarina C (PtPA).
3. La composición de coagulación de la reivindicación 1 o 2, en la que el activador de protrombina comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NOs: 1, 55, 53, 54, 56, 57.
4. La composición de coagulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el activador de protrombina se obtiene o produce mediante tecnología de ADN recombinante u otros procedimientos de ingeniería genética.
5. La composición de coagulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el coloide es un coloide a base de gelatina, opcionalmente en la que el coloide a base de gelatina es gelatina succinilada al 4 % p/v en solución salina.
6. La composición de coagulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además un tensioactivo, opcionalmente en la que el tensioactivo es un tensioactivo hirofílico.
7. La composición de coagulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la composición de coagulación:
(a) comprende una proporción entre el activador de protrombina y el coloide en el intervalo de apoximadamente 1:100 a 1:800 aproximadamente; o
(b) comprende desde aproximadamente 0,2 |jg hasta aproximadamente 10 |jg de activador de protrombina; y/o
(c) permanece estable y activa durante un periodo de hasta 18 meses; y/o
(d) permanece estable y activa durante un período de hasta 18 meses cuando se almacena a temperatura superior a la ambiente; y/o
(e) permanece estable y activa durante un periodo de hasta 18 meses tras la esterilización por irradiación; y/o
(f) se seca sobre la superficie interior de un recipiente, opcionalmente en el que el secado tiene lugar a una temperatura superior a la temperatura ambiente; y/o
(g) es capaz de separar las células coaguladas del suero en 5 minutos o menos.
8. Un procedimiento de preparación de la composición de coagulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o de la reivindicación 7, en el que el procedimiento comprende:
(a) proporcionar un activador de protrombina y un coloide, en el que el coloide es un coloide a base de gelatina o albúmina de suero bovino y, opcionalmente, un tensioactivo;
(b) poner en contacto el activador de protrombina y el coloide, y opcionalmente el tensioactivo, con una superficie interior de un recipiente; y
(c) secar el activador de protrombina en la superficie interior del recipiente a una temperatura superior a la temperatura ambiente, preparando así una composición de coagulación.
9. Un recipiente que comprende la composición de coagulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en las que el recipiente comprende un tubo de recogida de sangre, opcionalmente en las que el recipiente es un tubo de recogida de sangre.
10. Un kit para preparar una muestra de suero, en el que el kit comprende la composición de coagulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o el recipiente de la reivindicación 9.
11. Un procedimientoin vitrode preparación de una muestra de suero, en el que el procedimiento comprende poner en contacto una muestra de sangre con la composición de coagulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o el recipiente de la reivindicación 9 durante un tiempo y en condiciones suficientes para provocar la coagulación de la muestra de sangre, y opcionalmente, separar el suero de las células coaguladas, preparando así una muestra de suero.
12. Un procedimientoin vitropara diagnosticar una enfermedad o afección en un sujeto, en el que el procedimiento comprende:
(a) proporcionar una muestra de sangre obtenida del sujeto;
(b) preparar una muestra de suero a partir de la muestra de sangre, poniendo en contacto la muestra de sangre con la composición de coagulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o el recipiente de la reivindicación 9 durante un tiempo y en condiciones suficientes para provocar la coagulación de la muestra de sangre y, opcionalmente, separar la muestra de suero de las células coaguladas; y
(c) probar la muestra de suero para detectar la presencia o ausencia de un analito en la muestra de suero, o un nivel o concentración indicativos de un analito en la muestra de suero
en el que la presencia, ausencia o nivel indicativo o concentración del analito es indicativo de la enfermedad o afección en el sujeto.
13. Un procedimientoin vitropara proporcionar un pronóstico para un sujeto, en el que el procedimiento comprende:
(a) proporcionar una muestra de sangre obtenida del sujeto;
(b) preparar una muestra de suero a partir de la muestra de sangre, poniendo en contacto la muestra de sangre con la composición de coagulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o el recipiente de la reivindicación 9 durante un tiempo y en condiciones suficientes para provocar la coagulación de la muestra de sangre y, opcionalmente, separar la muestra de suero de las células coaguladas; y
(c) probar la muestra de suero para detectar la presencia o ausencia de un analito en la muestra de suero, o un nivel o concentración indicativos de un analito en la muestra de suero
en el que la presencia, ausencia o nivel indicativo o concentración del analito es indicativo del pronóstico para el sujeto.
14. Un procedimientoin vitropara controlar la capacidad de respuesta de un sujeto a una terapia, en el que el procedimiento comprende:
(a) proporcionar una muestra de sangre obtenida del sujeto;
(b) preparar una muestra de suero a partir de la muestra de sangre, poniendo en contacto la muestra de sangre con la composición de coagulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o el recipiente de la reivindicación 9 durante un tiempo y en condiciones suficientes para provocar la coagulación de la muestra de sangre y, opcionalmente, separar la muestra de suero de las células coaguladas; y
(c) probar la muestra de suero para detectar la presencia o ausencia de un analito en la muestra de suero, o un nivel o concentración indicativos de un analito en la muestra de suero
en el que la presencia, ausencia o nivel indicativo o concentración del analito es indicativo de la capacidad de respuesta del sujeto a la terapia.
15. El recipiente de la reivindicación 9, en el que el activador de protrombina es:
(a) ecarina y el coloide es gelatina succinilada al 4 % (p/v) en solución salina;
(b) ecarina y el coloide es albúmina sérica bovina;
(c) OsPAy el coloide es gelatina succinilada al 4 % (p/v) en solución salina; o
(d) OsPAy el coloide es albúmina de suero bovino.
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Chan et al. Adhesion of blood clots can be enhanced when copolymerized with a macromer that is crosslinked by coagulation factor XIIIa
Luyendyk et al. Factor XIII: Driving (Cross) Links in Hemostasis, Thrombosis, and Disease
Iyengar Trypsin-kinase in blood
Lämmle et al. History of Thrombotic Thrombocytopenic Purpura and the von Willebrand Factor–Cleaving Protease, ADAMTS13
Class et al. Inventors: Paul Masci (St. Lucia, AU) John De Jersey (St. Lucia, AU) Martin Lavin (St. Lucia, AU) Julie Phillips (St. Lucia, AU) Assignees: THE UNIVERSITY OF QUEENSLAND
Sreeremya Urokinase-An Overview