CN116223821A - 血小板聚集功能检测试剂及其应用 - Google Patents

血小板聚集功能检测试剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及体外检测技术领域，尤其涉及血小板聚集功能检测试剂及其应用。本发明提供的血小板聚集功能检测试剂包括纤维蛋白激活剂和ADP试剂，纤维蛋白激活剂采用新型的高纯度猪真皮胶原蛋白多肽组分Prionex，与甘氨酸联合使用显著提高纤维蛋白激活剂的稳定性，采用血小板抑制剂替罗非班，与PEG6000联合使用，提高了检测结果准确性和对抗血小板聚集药物的灵敏度；ADP试剂采用壳聚糖，提高了活性和稳定性，能够广泛应用于血小板聚集功能的临床诊断。

Description

血小板聚集功能检测试剂及其应用
技术领域
本发明涉及体外检测技术领域，尤其涉及血小板聚集功能检测试剂及其应用。
背景技术
血小板是从骨髓成熟的巨核细胞胞浆裂解脱落下来的小块胞质，为圆盘型，主要功能是凝血和止血，修补破损的血管。血小板在生理止血过程中的功能活动大致可以分为两个阶段:第一阶段主要是创伤发生后，血小板迅速黏附于创伤处，并聚集成团,形成较松软的止血栓子；第二段主要是促进血凝并形成坚实的止血栓子。大量研究表明，血小板的激活和聚集是体内血栓形成的始动因素，亦是血栓形成过程中最关键的成分之一。因此，血小板聚集功能检测不仅可对血栓性疾病和出血性疾病的诊断和治疗进行评估，还可以对抗血小板聚集药物的临床效果进行初步评估，具有很好的临床指导性。
血小板聚集最重要的途径之一是ADP途径。ADP是人体内最重要的诱导血小板聚集的物质：一方面，ADP与血小板膜受体P2Y1受体结合后，与Gq蛋白耦联激活磷酯酶C，使Ca2+从细胞外流入细胞内，细胞内Ca2+浓度的升高激活了蛋白激酶C，引起血小板变形和聚集；另一方面，ADP与血小板P2Y12膜受体结合，与Gi蛋白耦联，抑制腺苷酸环化酶AC的活化，降低了血小板中cAMP的水平，诱发血小板的聚集。血栓弹力图检测(thromboelastography，TEG)以全血作为检测样本，能够反映血液凝固动态变化(包括纤维蛋白的形成速度，溶解状态和凝状的坚固性，弹力度)的指标，并能进行连续监测，准确的描述患者的凝血概况，从而迅速判断患者是否存在凝血功能异常并分析形成原因。
氯吡格雷是一种常见的抑制血小板聚集的药物，用于预防和治疗因血小板高聚集引起的心、脑及其他动脉循环障碍疾病，其作用原理是氯吡格雷能够经肝脏细胞色素P450酶代谢形成活性物质，不可逆地与血小P2Y12膜受体结合，阻断ADP对腺苷酸环化酶AC的抑制作用，促进舒血管物质磷酸蛋白VASP的磷酸化，抑制GPIIb/Ⅲa膜受体的活化，从而抑制血小板聚集。然而，不同个体的血小板对氯吡格雷反应存在变异，约5％-10％的患者用药后仍发生血栓形成，约4％-30％的患者出现氯吡格雷抵抗。因此，我们需要一种精准高效的检测血小板聚集功能的方法，从而有针对性地采取个性化抗血小板治疗。
但目前国内市场上的血小板聚集功能检测试剂普遍存在稳定性较差，检测结果多假阳性等问题。为了解决这些问题，大部分厂家采取的方案都是向检测试剂中加入糖类或聚合物类冻干保护剂。此外，为了避免由于外界因素导致血小板激活的现象，有的厂家在纤维蛋白激活剂中加入了血小板抑制剂，但是并未充分考虑诊断试剂对抗血小板药物的不同反应性，因此，目前市场上仍需开发一种稳定性好、测值准确度高、灵敏性好的ADP激活途径的血小板聚集功能检测试剂盒。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种血小板聚集功能检测试剂及其应用。本发明提供了纤维蛋白激活剂和ADP试剂稳定性好、对抗血小板聚集药物灵敏的血小板聚集功能检测试剂，及其在血栓弹力仪中的应用。
本发明提供了血小板聚集功能检测试剂，包括纤维蛋白激活剂和ADP试剂；
所述纤维蛋白激活剂中各组分的工作浓度为：巴曲酶10～100BU/mL、HFXIIIa 50～500U/mL、氯化钠0.1％～1.5％(w/v)、Prionex 0.5％～2.0％(w/v)、海藻糖0.1％～1.0％(w/v)、氨基酸0.1％～1.5％(w/v)、表面活性剂1％～10％(w/v)、血小板抑制剂0.001％～10％(w/v)、Tris 10～100mmol/L，以及防腐剂0.0001％～0.05％(w/v)；
所述ADP试剂中各组分的工作浓度为：二磷酸腺苷或二磷酸腺苷钠盐2～200μmol/L、氯化钠0.1％～1.5％(w/v)、海藻糖0.2％～2.0％(w/v)、壳聚糖0.005％～0.1％(w/v)，以及防腐剂0.005％～0.1％(w/v)。
本发明所述w/v为质量体积比，单位为g/mL。
具体的，本发明所述的工作浓度为纤维蛋白激活剂和ADP试剂在实际应用中的最佳浓度，其存储形式可以是冻干粉，也可以是1～100倍的母液，例如10倍、20倍或50倍的母液，本发明对此不做限定。
本发明提供的血小板聚集功能检测试剂稳定性好、检测结果准确度高、灵敏性好，所述血小板聚集功能检测试剂与血栓弹力仪配合使用，以全血为样本，进行相关凝血指标的检测。
本发明提供的检测试剂中，所述氨基酸选自甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、缬氨酸中至少一种；
所述表面活性剂选自PEG6000、PEG8000、吐温80中至少一种；
所述血小板抑制剂选自替罗非班、阿昔单抗、依替非巴肽、替格瑞洛中至少一种；
所述二磷酸腺苷钠盐选自二磷酸腺苷钠、二磷酸腺苷二钠、二磷酸腺苷二钠盐中至少一种。
具体的，本发明提供的检测试剂中所述纤维蛋白激活剂中各组分的工作浓度为：巴曲酶50BU/mL、HFXIIIa 200U/mL、氯化钠0.6％(w/v)、Prionex 1.0％(w/v)、海藻糖0.6％(w/v)、氨基酸0.5％(w/v)、表面活性剂1.0％(w/v)、血小板抑制剂0.005％(w/v)、Tris20mmol/L，以及防腐剂0.0005％(w/v)；
所述ADP试剂中各组分的工作浓度为：包括二磷酸腺苷或二磷酸腺苷钠盐150μmol/L、氯化钠0.9％(w/v)、海藻糖1.0％(w/v)、壳聚糖0.02％(w/v)，以及防腐剂0.005％(w/v)。
具体的，所述氨基酸为甘氨酸，所述表面活性剂为PEG6000，所述血小板抑制剂为替罗非班，所述防腐剂为庆大霉素。
在一些实施例中，Prionex和甘氨酸联合使用可以提高纤维蛋白激活剂的稳定性；替罗非班和PEG6000联合使用可以避免检测结果假阳性，提高对抗血小板聚集药物的灵敏度，检测所得MA值与药物浓度的相关系数达到0.996；壳聚糖可以提高ADP试剂的活性和稳定性。
本发明提供的检测试剂，所述纤维蛋白激活剂中各组分的工作浓度为：巴曲酶50BU/mL、HFXIIIa 200U/mL、氯化钠0.6％(w/v)、Prionex1.0％(w/v)、海藻糖0.6％(w/v)、甘氨酸0.5％(w/v)、PEG60001.0％(w/v)、替罗非班0.005％(w/v)、Tris 20mmol/L，以及庆大霉素0.0005％(w/v)；
所述ADP试剂中各组分的工作浓度为：二磷酸腺苷150μmol/L、氯化钠0.9％(w/v)、海藻糖1.0％(w/v)、壳聚糖0.02％(w/v)，以及庆大霉素0.005％(w/v)。
本发明提供的所述纤维蛋白激活剂的pH值为7.0～8.0。
在一些实施例中，所述纤维蛋白激活剂的pH值为7.5。
本发明提供了所述检测试剂在制备血小板聚集功能检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了血小板聚集功能检测试剂盒，其包括所述检测试剂以及氯化钙、枸橼酸钠、肝素。
在一些实施例中，所述氯化钙的浓度为0.2mol/L、所述枸橼酸钠的浓度为0.109mol/mL、所述肝素的浓度为不低于14.5IU/mL。
本发明还提供了血小板聚集功能检测试剂盒的使用方法，包括所述检测试剂的使用，步骤包括：
S1、复溶纤维蛋白激活剂和ADP试剂，检测加入枸橼酸钠和氯化钙的血液样本的血凝强度数据；
S2、检测加入纤维蛋白激活剂和肝素的血液样本的血凝强度数据；
S3、检测加入纤维蛋白激活剂、ADP试剂和肝素的血液样本的血凝强度数据；
在一些实施例中，所述血小板聚集功能检测试剂盒的使用方法包括如下所示步骤：
1、复温检测试剂到室温，分别在纤维蛋白激活剂和ADP试剂瓶中加入蒸馏水50μL和100μL，摇晃使其充分混匀。
2、打开应用软件，输入患者信息，选择对应的测试类型，在血栓弹力图仪3个通道上装载样品杯。
3、加入1mL枸橼酸化的血液至枸橼酸钠全血激活剂管中，并上下颠倒混匀5次。
4、吸取20μL氯化钙加入通道1样品杯底，吸取340μL上述枸橼酸钠全血激活剂激活的血样至该杯中，点击按键开始测试。
5、吸取10μL复溶好的纤维蛋白激活剂，分别加入通道2、通道3样品杯底，吸取10μL复溶好的ADP试剂加入通道3样品杯底。
6、在通道2、3的样品杯中分别加入360μL肝素化的血液，并吹吸混匀3次，加样后迅速点击按键开始测试。
7、测试完成后，在测试界面点击“停止”，在数据界面选中3个杯子的检测结果，点击“ADP抑制率”，得到血小板抑制率。
本发明还提供了所述检测试剂的制备方法，包括将所述纤维蛋白激活剂和ADP试剂的所有组分分别混合后真空冷冻干燥得到所述检测试剂的冻干粉。
本发明提供的方案中，Prionex具有优异的稳定蛋白质的特性，和甘氨酸联合使用提高了纤维蛋白激活剂的稳定性；替罗非班和PEG6000联合使用避免了检测结果假阳性，提高了对抗血小板聚集药物的灵敏度；壳聚糖能够促进血小板的聚集，并释放出活性物质，且与ADP具有协同作用，能够提高ADP试剂的活性和稳定性。
本发明提供的血小板聚集功能检测试剂能够以全血为样本，定量和定性检测服用了血小板抑制药物的病人的血小板聚集功能，对于血小板抑制药物的临床效果具有指导意义。
具体实施方式
本发明提供了血小板聚集功能检测试剂及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
制备例1纤维蛋白激活剂和ADP试剂的制备
1、纤维蛋白激活剂的制备
成分：10～100BU/mL巴曲酶、50～500U/mLHFXIIIa、0.1％～1.5％(w/v)NaCl、0.5％～2.0％(w/v)Prionex、0.1％～1.5％(w/v)Gly、1％～10％(w/v)PEG6000、0.1％～1.0％(w/v)海藻糖、0.0001％～0.05％(w/v)庆大霉素、0.001％～10％(w/v)替罗非班，以及10～100mmol/LTris。
制备方法：(1)按配方量取Tris和NaCl，加入纯化水充分溶解，调pH值至7.5；
(2)按配方量取Prionex、Gly、PEG6000、海藻糖加入步骤(1)中的缓冲液中，搅拌使其充分溶解；
(3)按配方量取巴曲酶和HFXIIIa加入步骤(2)的溶液中，调pH值至7.5；
(4)按配方量取庆大霉素和替罗非班加入步骤(3)的溶液中，充分溶解得到纤维蛋白激活剂；
(5)将步骤(4)得到的纤维蛋白激活剂按照每瓶50μL分装，真空冷冻干燥得到纤维蛋白激活剂冻干粉。
2、ADP试剂的制备
成分：2～200μmol/L二磷酸腺苷(ADP)、0.1％～1.5％(w/v)NaCl、0.2％～2.0％(w/v)海藻糖、0.005％～0.1％(w/v)庆大霉素，以及0.005％～0.1％(w/v)壳聚糖。
制备方法：(1)按配方量取NaCl、海藻糖、庆大霉素、壳聚糖，加入纯化水充分溶解；
(2)按配方量取二磷酸腺苷加入步骤(1)的缓冲液中，搅拌使其充分溶解；
(3)将步骤(2)得到的ADP试剂按照每瓶100μL分装，真空冷冻干燥得到ADP试剂冻干粉。
实施例1纤维蛋白激活剂和ADP试剂的优化
1、纤维蛋白激活剂的优化
1.1、纤维蛋白激活剂的不同组分
组分1：25BU/mL巴曲酶、300U/mL HFXIIIa、0.9％(w/v)NaCl、50mM Tris(pH7.0)。
组分2：40BU/mL巴曲酶、250U/mL HFXIIIa、0.9％(w/v)NaCl、1.0％(w/v)Prionex、1.0％(w/v)Gly、50mM Tris(pH 7.0)。
组分3：50BU/mL巴曲酶、200U/mL HFXIIIa、0.3％(w/v)NaCl、0.5％(w/v)Prionex、0.5％(w/v)Gly、1.0％(w/v)海藻糖、20mM Tris(pH 7.0)。
组分4：50BU/mL巴曲酶、100U/mL HFXIIIa、0.6％(w/v)NaCl、2.0％(w/v)Prionex、0.5％(w/v)Gly、0.6％(w/v)海藻糖、0.005％(w/v)庆大霉素、0.05％(w/v)替罗非班、20mM Tris(pH 7.5)。
组分5：50BU/mL巴曲酶、200U/mL HFXIIIa、0.6％(w/v)NaCl、1.0％(w/v)Prionex、5.0％(w/v)Gly、0.3％(w/v)海藻糖、0.005％(w/v)庆大霉素、0.005％(w/v)替罗非班、20mM Tris(pH 7.5)。
组分6：50BU/mL巴曲酶、200U/mL HFXIIIa、0.6％(w/v)NaCl、1.0％(w/v)Prionex、2.0％(w/v)Gly、0.3％(w/v)海藻糖、0.0005％(w/v)庆大霉素、5.0％(w/v)PEG6000、0.005％(w/v)替罗非班、20mM Tris(pH 7.5)。
组分7：50BU/mL巴曲酶、200U/mL HFXIIIa、0.6％(w/v)NaCl、1.0％(w/v)Prionex、0.5％(w/v)Gly、0.6％(w/v)海藻糖、0.0005％(w/v)庆大霉素、1.0％(w/v)PEG6000、0.005％(w/v)替罗非班、20mM Tris(pH 7.5)。
1.2、纤维蛋白激活剂最优组分的筛选
用组分1-7对同一人的血液样本(肝素抗凝)进行检测，以最早进口、检测原理与本发明相似的某进口试剂为比对试剂。结果见表1。
相对偏差(％)＝[(实施例均值-比对试剂均值)/比对试剂均值]*100％
表1
Figure BDA0003946259930000071
结果表明，组分7各参数检测结果与比对试剂相对偏差最小，因此本发明纤维蛋白激活剂优选组分7。
2、ADP试剂的优化
2.1、ADP试剂的不同组分
组分8：100μM ADP、0.9％(w/v)NaCl、2.0％(w/v)海藻糖。
组分9：200μM ADP、0.3％(w/v)NaCl、2.0％(w/v)海藻糖、0.05％(w/v)庆大霉素。
组分10：150μM ADP、0.9％(w/v)NaCl、1.0％(w/v)海藻糖、0.05％(w/v)庆大霉素、0.02％(w/v)壳聚糖。
组分11：100μM ADP、0.6％(w/v)NaCl、0.5％(w/v)海藻糖、0.005％(w/v)庆大霉素、0.05％(w/v)壳聚糖。
组分12：150μMADP、0.9％(w/v)NaCl、1.0％(w/v)海藻糖、0.005％(w/v)庆大霉素、0.02％(w/v)壳聚糖。
2.2、ADP试剂最优组分的筛选
用组分8-12对同一人的血液样本(肝素抗凝)进行检测，以某进口试剂为比对试剂。结果见表2。
相对偏差(％)＝[(实施例均值-比对试剂均值)/比对试剂均值]*100％
表2
Figure BDA0003946259930000081
结果表明，组分12各参数检测结果与比对试剂相对偏差最小，因此本发明ADP试剂优选组分12。
实施例2准确性检测
用组分3和组分7对同一人的血液样本(肝素抗凝)分别进行10次检测。结果见表3。
表3
Figure BDA0003946259930000082
Figure BDA0003946259930000091
结果表明，在10次检测中，组分3出现了3次假阳性结果(编号3、5、8)；而组分7没有出现假阳性，且检测所得各参数值的CV都在10％以内，证明替罗非班和PEG6000联合使用可以避免检测结果假阳性，提高测量结果准确性。
实施例3相关性检验
用组分7和组分12对同一人的血液样本(肝素抗凝，且加入不同浓度的双嘧达莫)进行检测，以某进口试剂为比对试剂。结果见表4(MA表示血凝强度)。
表4
双嘧达莫浓度 本发明试剂ADP杯MA(mm) 比对试剂ADP杯MA(mm)
0μg/mL 58.0 56.0
1μg/mL 51.1 49.1
2μg/mL 47.3 48.1
3μg/mL 43.4 42.6
4μg/mL 37.4 34.3
5μg/mL 32.5 30.5
相关系数(r) 0.996 0.985
结果表明，本发明纤维蛋白激活剂和ADP试剂与抗血小板聚集药物双嘧达莫的浓度具有较好的相关性，相关系数r为0.996，超过比对试剂，可以准确评估患者服用药物的效果，同时指导临床用药剂量。
实施例4稳定性检验
将本发明试剂和比对试剂均置于2-8℃环境中10天，定时取样对同一人的血液样本(肝素抗凝)进行检测。结果见表5。
表5
Figure BDA0003946259930000101
结果表明，本发明纤维蛋白激活剂和ADP试剂在10天内稳定性较好，检测所得MA值的相对极差都在10％以内，远优于比对试剂。
实施例5精密度检验
用同批血小板聚集功能检测试剂对同一人的血液样本(枸橼酸钠和肝素抗凝，且加入一定量的双嘧达莫)进行10次检测，检测结果见表6。
检测方法如下：
1复温检测试剂到室温，分别在纤维蛋白激活剂和ADP试剂瓶中加入蒸馏水50μL和100μL，摇晃使其充分混匀。
2打开应用软件，输入患者信息，选择对应的测试类型。
3在血栓弹力图仪3个通道上装载样品杯。
4加入1mL枸橼酸化的血液至枸橼酸钠全血激活剂管中，并上下颠倒混匀5次。
5吸取20μL氯化钙加入通道1样品杯底，吸取340μL上述枸橼酸钠全血激活剂激活的血样至该杯中，点击按键开始测试。
6吸取10μL复溶好的纤维蛋白激活剂，分别加入通道2、通道3样品杯底。
7吸取10μL复溶好的ADP试剂加入通道3样品杯底。
8在通道2、3的样品杯中分别加入360μL肝素化的血液，并吹吸混匀3次，加样后迅速点击按键开始测试。
9测试完成后，在测试界面点击“停止”，卸去样品杯，按医疗废物处理。
10在数据界面选中3个杯子的检测结果，点击“ADP抑制率”，得到血小板抑制率。
血小板抑制率计算公式如下：
Figure BDA0003946259930000111
其中，MA(ADP)为肝素抗凝全血加入纤维蛋白激活剂和血小板激活剂(ADP)测得的血凝强度；MA(纤)为肝素抗凝全血只加入纤维蛋白激活剂测得的血凝强度；MA(总)为枸橼酸钠抗凝全血加入枸橼酸钠全血激活剂测得的血凝强度。
表6
Figure BDA0003946259930000112
结果表明，本发明试剂盒检测所得MA值的CV都在5％以内，且血小板抑制率的CV也在5％以内，说明本发明血小板聚集功能检测试剂盒的检测精密度良好。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.血小板聚集功能检测试剂，其特征在于，其包括纤维蛋白激活剂和ADP试剂；
所述纤维蛋白激活剂中各组分的工作浓度为：巴曲酶10～100BU/mL、HFXIIIa 50～500U/mL、氯化钠0.1％～1.5％(w/v)、Prionex 0.5％～2.0％(w/v)、海藻糖0.1％～1.0％(w/v)、氨基酸0.1％～1.5％(w/v)、表面活性剂1％～10％(w/v)、血小板抑制剂0.001％～10％(w/v)、Tris10～100mmol/L，以及防腐剂0.0001％～0.05％(w/v)；
所述ADP试剂中各组分的工作浓度为：二磷酸腺苷或二磷酸腺苷钠盐2～200μmol/L、氯化钠0.1％～1.5％(w/v)、海藻糖0.2％～2.0％(w/v)、壳聚糖0.005％～0.1％(w/v)，以及防腐剂0.005％～0.1％(w/v)。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述氨基酸选自甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、缬氨酸中至少一种；
所述表面活性剂选自PEG6000、PEG8000、吐温80中至少一种；
所述血小板抑制剂选自替罗非班、阿昔单抗、依替非巴肽、替格瑞洛中至少一种；
所述二磷酸腺苷钠盐选自二磷酸腺苷钠、二磷酸腺苷二钠、二磷酸腺苷二钠盐中至少一种。
3.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述纤维蛋白激活剂中各组分的工作浓度为：巴曲酶50BU/mL、HFXIIIa 200U/mL、氯化钠0.6％(w/v)、Prionex 1.0％(w/v)、海藻糖0.6％(w/v)、氨基酸0.5％(w/v)、表面活性剂1.0％(w/v)、血小板抑制剂0.005％(w/v)、Tris 20mmol/L，以及防腐剂0.0005％(w/v)；
所述ADP试剂中各组分的工作浓度为：包括二磷酸腺苷或二磷酸腺苷钠盐150μmol/L、氯化钠0.9％(w/v)、海藻糖1.0％(w/v)、壳聚糖0.02％(w/v)，以及防腐剂0.005％(w/v)。
4.根据权利要求1～3任一项所述的检测试剂，其特征在于，所述氨基酸为甘氨酸，所述表面活性剂为PEG6000，所述血小板抑制剂为替罗非班，所述防腐剂为庆大霉素。
5.根据权利要求1～4任一项所述的检测试剂，其特征在于，所述纤维蛋白激活剂中各组分的工作浓度为：巴曲酶50BU/mL、HFXIIIa 200U/mL、氯化钠0.6％(w/v)、Prionex1.0％(w/v)、海藻糖0.6％(w/v)、甘氨酸0.5％(w/v)、PEG60001.0％(w/v)、替罗非班0.005％(w/v)、Tris 20mmol/L，以及庆大霉素0.0005％(w/v)；
所述ADP试剂中各组分的工作浓度为：二磷酸腺苷150μmol/L、氯化钠0.9％(w/v)、海藻糖1.0％(w/v)、壳聚糖0.02％(w/v)，以及庆大霉素0.005％(w/v)。
6.根据权利要求1～5任一项所述的检测试剂，其特征在于，所述纤维蛋白激活剂的pH值为7.0～8.0。
7.权利要求1～6任一项所述检测试剂在制备血小板聚集功能检测试剂盒中的应用。
8.血小板聚集功能检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1～6任一项所述检测试剂以及氯化钙、枸橼酸钠、肝素。
9.权利要求8所述血小板聚集功能检测试剂盒的使用方法，其特征在于，其包括以下步骤：
S1、复溶纤维蛋白激活剂和ADP试剂，检测加入枸橼酸钠和氯化钙的血液样本的血凝强度数据；
S2、检测加入纤维蛋白激活剂和肝素的血液样本的血凝强度数据；
S3、检测加入纤维蛋白激活剂、ADP试剂和肝素的血液样本的血凝强度数据。
10.权利要求1～6任一项所述检测试剂的制备方法，其特征在于，其包括将所述纤维蛋白激活剂和ADP试剂的所有组分分别混合后真空冷冻干燥得到所述检测试剂的冻干粉。
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