ES2971434T3

ES2971434T3 - Tratamiento de la hiperbilirrubinemia

Info

Publication number: ES2971434T3
Application number: ES21151019T
Authority: ES
Inventors: Federico Mingozzi; Giuseppe Ronzitti; Fanny Collaud; Andrés Muro; Giulia Bortolussi
Original assignee: Int Centre For Genetic Engineering And Biotechnology; Genethon; International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology
Current assignee: Int Centre For Genetic Engineering And Biotechnology; Genethon; International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology
Priority date: 2014-04-25
Filing date: 2015-04-27
Publication date: 2024-06-05
Anticipated expiration: 2035-04-27
Also published as: FI3851537T3; WO2015162302A3; CN114395559A; JP7349931B2; US20190374619A1; WO2015162302A2; JP2022088645A; DK3851537T3; EP3134530A2; EP3851537A1; EP3134530B1; CN106459932A; US20230414724A1; JP6730193B2; EP3546585A1; AU2015250770B2; CA3205555A1; AU2015250770A1; US10471132B2; EP3851537B1

Abstract

La invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico útil en el tratamiento de la hiperbilirrubinemia, en particular en el tratamiento del síndrome de Crigler-Najjar. Más particularmente, la secuencia de ácido nucleico de la presente invención es una secuencia codificante de UGT1A1 con codones optimizados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento de la hiperbilirrubinemia

Campo de la invención

La invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico útil en el tratamiento de la hiperbilirrubinemia, en particular en el tratamiento del síndrome de Crigler-Najjar. Más en particular, la secuencia de ácido nucleico de la presente invención es una secuencia codificante de UGT1A1 humana con codones optimizados.

Antecedentes de la invención

El síndrome de Crigler-Najjar (CN) es un trastorno autosómico recesivo con hiperbilirrubinemia no conjugada grave debido a la deficiencia de la isoenzima 1A1 de la bilirrubina UDP-glucuronosiltransferasa (UGT1A1) codificada por el gen UGT1A1 (OMIM #218800). La prevalencia del CN es de aproximadamente 1/1000000 de individuos al nacer, lo que hace del CN una enfermedad ultrarara. La terapia actual para el CN se basa en la fototerapia para prevenir elevaciones de los niveles de bilirrubina sérica. Para la forma leve de la enfermedad, también conocida como CN tipo II, se puede usar fenobarbital para reducir la bilirrubinemia. Sin embargo, los pacientes están potencialmente expuestos al riesgo de picos de bilirrubina en sangre potencialmente mortales y el trasplante de hígado sigue siendo el único tratamiento curativo. En su forma más grave, la enfermedad es letal debido al daño neurológico inducido por la bilirrubina a menos que se aplique fototerapia desde el nacimiento. A pesar de la disponibilidad de una terapia, el CN sigue siendo una necesidad médica no cubierta por varias razones, incluida la pérdida de eficacia de la fototerapia durante el crecimiento, el cumplimiento deficiente debido a la limitación de la fototerapia en sí (que debe realizarse durante 10-12 horas cada día) y la aparición de cambios patológicos en el hígado con el tiempo, que puede requerir un trasplante de hígado.

Existen diferentes modelos animales de la enfermedad, incluida la rata Gunn natural y un modelo de ratónknock-inmás reciente de las enfermedades desarrollado por el Dr. Muro en el ICGEB en Trieste, Italia, que porta la misma mutación presente en la rata Gunn (Bortolussiet al.,2012). Las ratas Gunn presentan niveles elevados de bilirrubina sérica y presentan hipoplasia cerebelosa; Los ratones CN tienen un fenotipo mucho más grave, mueren poco después del nacimiento si no se trata rápidamente con fototerapia o terapia génica (Bortolussiet al.,2012).

Estudios previos destinados a desarrollar una terapia basada en genes para CN demostraron que se podría lograr eficacia terapéutica utilizando vectores AAV administrados en el hígado (Bortolussiet al.,2012; Seppenet al.,2006). No obstante, todavía existe la necesidad de una estrategia terapéutica más eficiente.

El síndrome de Gilbert (o GS; OMIM #218800) es un trastorno genético del hígado y la causa hereditaria más común de aumento de bilirrubina. Se encuentra hasta en el 3-12 % de la población. El GS también es causado por mutaciones en el gen UGT1A1. Por lo tanto, también se implementarían ventajosamente estrategias terapéuticas destinadas a reducir la hiperbilirrubinemia en el tratamiento del GS.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un vector AAV que comprende una secuencia de ácido nucleico que es una secuencia codificante de UGT1A1 con codones optimizados derivada del ADNc de UGT1A1 humano. La secuencia codificante UGT1A1 con codones optimizados tiene un mayor contenido de GC y tiene un número reducido de marcos de lectura abiertos alternativos en comparación con la secuencia codificante humana de tipo salvaje de SEQ ID NO:1. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de la invención da como resultado un aumento de al menos un 2, 3, 4, 5 o 10 % del contenido de GC en la secuencia UGT1 Al en comparación con la secuencia de la secuencia de UGT1A1 humana de tipo salvaje. En una realización particular, la secuencia de ácido nucleico de la invención da como resultado un aumento del 2, 3, 4 o, más preferentemente, 5 % o 10 % (preferentemente 5 %) del contenido de GC en la secuencia UGT1 Al en comparación con la secuencia de la secuencia UGT1A1 humana de tipo salvaje. La secuencia de ácido nucleico de la invención que codifica una proteína UGT1A1 humana con codones optimizados es "sustancialmente idéntica", esto es, un 90 % idéntica, preferentemente aproximadamente un 95 % idéntica, aún más preferentemente aproximadamente un 97 %, 98 % o incluso 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 3. En una realización particular, la invención se refiere a un vector AAV que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína UGT1 Al humana con codones optimizados, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:3.

Ventajosamente, el ácido nucleico con codones optimizados de la invención proporciona una reducción mejorada de los niveles de bilirrubina y/o una inmunogenicidad disminuida.

La invención también se refiere a un vector AAV que comprende una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de la invención. La construcción de ácido nucleico puede corresponder a un casete de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de la invención, unida operativamente a una o más secuencias de control de la expresión u otras secuencias que mejoran la expresión de un transgén. En la técnica se conocen secuencias tales como, tales como promotores, potenciadores, intrones, señales de poliA, etc. Concretamente, el casete de expresión puede incluir un promotor. El promotor puede ser un promotor ubicuo o específico de tejido, en particular un promotor específico del hígado. Más particularmente, el promotor es un promotor específico del hígado tal como el promotor de alfa-1 antitripsina (hAAT) (SEQ ID NO:4), el promotor de transtiretina, el promotor de albúmina, el promotor de la globulina fijadora de tiroxina (TBG), etc. En la técnica se conocen otros promotores útiles específicos del hígado, por ejemplo, los que figuran en la base de datos de promotores de genes específicos del hígado compilada por el Laboratorio Cold Spring Harbor (http://rulai.cshl.edu/LSPD/). Los promotores ubicuos representativos incluyen el potenciador de citomegalovirus/promotor de beta-actina (CAG), el potenciador/promotor del citomegalovirus (CMV), el promotor de PGK, el promotor temprano de SV40, etc. En una realización particular, el promotor está asociado a una secuencia potenciadora tal como la región de control ApoE, tal como la región de control de ApoE humana (o locus del gen de la apolipoproteína E/C-I humana, región de control hepático HCR-1 - Número de acceso a Genbank U32510, mostrado en la SEQ ID NO: 11). En una realización particular, una secuencia potenciadora tal como la secuencia ApoE está asociada a un promotor específico del hígado tal como los enumerados anteriormente, y en particular tal como el promotor hAAT.

En una realización particular, la construcción de ácido nucleico comprende un intrón, en particular un intrón colocado entre el promotor y la secuencia codificante. Se puede introducir un intrón para aumentar la estabilidad del ARNm y la producción de la proteína. En una realización particular, la construcción de ácido nucleico comprende un intrón de beta globina b2 (o HBB2) humana, un intrón del factor IX de coagulación (FIX), un intrón SV40 o un intrón de beta-globina de pollo. En una realización particular, la construcción de ácido nucleico de la invención contiene un intrón modificado (en particular un intrón HBB2 o FIX modificado) diseñado para disminuir el número de, o incluso eliminar totalmente, marcos de lectura abiertos (ARF) alternativos encontrados en dicho intrón. Preferentemente, se eliminan los ARF cuya longitud abarca más de 50 pb y tienen un codón de terminación en marco con un codón de iniciación. Los ARF se pueden eliminar modificando la secuencia del intrón. Por ejemplo, la modificación puede llevarse a cabo mediante sustitución de inserción o deleción de nucleótidos, preferentemente mediante sustitución de nucleótidos. Como ilustración, uno o más nucleótidos, en particular un nucleótido, en un codón de iniciación ATG o GTG presente en la secuencia del intrón de interés puede reemplazarse, dando como resultado un codón que no es de iniciación. Por ejemplo, un ATG o un GTG puede ser sustituido por un CTG, que no es un codón de iniciación, dentro de la secuencia del intrón de interés.

El intrón HBB2 clásico usado en construcciones de ácidos nucleicos se muestra en la SEQ ID NO:5. Por ejemplo, este intrón HBB2 puede modificarse eliminando codones de iniciación (codones ATG y GTG) dentro de dicho intrón. En una realización particular, el intrón HBB2 modificado comprendido en la construcción tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:6. El intrón de FIX clásico utilizado en construcciones de ácido nucleico se deriva del primer intrón de FIX humano y se muestra en la SEQ ID NO:7. El intrón FIX puede modificarse eliminando los codones de iniciación (codones ATG y GTG) dentro de dicho intrón. En una realización particular, el intrón FIX modificado comprendido en la construcción de la invención tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:8. El intrón clásico de beta globina de pollo usado en construcciones de ácido nucleico se muestra en la SEQ ID NO:9. El intrón de beta globina de pollo puede modificarse eliminando los codones de iniciación (codones ATG y GTG) dentro de dicho intrón. En una realización particular, el intrón de beta globina de pollo modificado comprendido en la construcción de la invención tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 10.

Los inventores han demostrado que tal intrón modificado, en particular un intrón HBB2 o FIX modificado, tiene propiedades ventajosas y puede mejorar significativamente la expresión del transgén. Adicionalmente, disminuyendo el número de ARF dentro del intrón incluido dentro de la construcción de la invención, se cree que la inmunogenicidad de la construcción también disminuye.

Por tanto, la divulgación también se refiere a un intrón destinado a ser utilizado en un casete de expresión y que se modifica para aumentar la eficacia de la expresión de un transgén colocado en el casete. Concretamente, la divulgación se refiere a un intrón modificado derivado de un intrón conocido, pero donde se ha reducido el número de ARF o donde se han eliminado por completo los ARF. En una realización particular, la divulgación se refiere a un intrón HBB2 modificado con un número reducido de ARF, o sin ARF. En una realización particular adicional, el intrón HBB2 modificado es el que se muestra en LA SEQ ID NO:6. En otra realización, la divulgación se refiere a un intrón FIX modificado con un número reducido de ARF, o sin ARF. En una realización particular adicional, el intrón FIX modificado es el que se muestra en LA SEQ ID NOR. En otra realización, la divulgación se refiere a un intrón de beta-globina de pollo modificado con un número reducido de ARF, o sin ARF. En una realización particular adicional, el intrón de betaglobina de pollo modificado es el que se muestra en LA SEQ ID NO: 10. Un aspecto adicional de la divulgación se refiere a una construcción de ácido nucleico, un vector tal como un vector viral, en particular un vector AAV y una célula que comprende el intrón modificado de la divulgación. La construcción de ácido nucleico puede incluir secuencias de control de LA expresión adicionales, tales como un promotor y/o un potenciador, como los descritos en el presente documento y otros. El intrón modificado como se desvela en el presente documento aumenta la eficacia de la expresión de un transgén colocado en la construcción de ácido nucleico, tal como un gen de interés como un gen terapéutico. En el contexto de este aspecto de la divulgación, un "gen terapéutico" generalmente se refiere a un gen que codifica una proteína terapéutica que es útil en el tratamiento de una afección patológica. El gen terapéutico, cuando se expresa, confiere un efecto beneficioso sobre la célula o tejido en el que está presente, o en un paciente en el que se expresa el gen. Ejemplos de efectos beneficiosos incluyen la mejora de un signo o síntoma de una afección o enfermedad, la prevención o inhibición de una condición o enfermedad o la concesión de una característica deseada. Los genes terapéuticos incluyen genes que corrigen parcial o totalmente una deficiencia genética en el paciente. Concretamente, el gen terapéutico puede ser, sin limitación, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína útil en terapia génica para aliviar las deficiencias causadas por la falta, niveles defectuosos o subóptimos de dicha proteína en una célula o tejido de un sujeto. Por consiguiente, la presente divulgación se refiere a una construcción de ácido nucleico, un vector tal como un vector viral, en particular un vector AAV, y una célula que comprende el intrón modificado de la divulgación, y que comprende además un gen terapéutico de interés, para su uso en terapia génica. La presente divulgación se puede aplicar en general para la terapia de cualquier enfermedad que pueda tratarse mediante la expresión de un gen terapéutico en una célula o tejido de un sujeto. Estas incluyen, por ejemplo, enfermedades proliferativas (cánceres, tumores, displasias, etc.), enfermedades infecciosas; enfermedades virales (inducidas, por ejemplo, por los virus de la hepatitis B o C, VIH, herpes, retrovirus, etc.); enfermedades genéticas (fibrosis quística, distroglicanopatías, miopatías tales como miopatía muscular de Duchenne; miopatía miotubular; hemofilias; anemia falciforme, enfermedad de células falciformes, anemia de Fanconi; diabetes; esclerosis lateral amiotrófica, enfermedades mononeuronas, tal como atrofia muscular espinal, atrofia muscular espinobulbar o enfermedad de Charcot-Marie-Tooth; artritis; inmunodeficiencias combinadas graves (tales como RS-SCID, ADA-SCID o X-SCID), síndrome de Wiskott-Aldrich, trombocitopenia ligada al cromosoma X, neutropenia congénita ligada al cromosoma X, enfermedad granulomatosa crónica, etc.), enfermedades cardiovasculares (reestenosis, isquemia, dislipidemia, hipercolesterolemia homocigótica familiar, etc.), o enfermedades neurológicas (enfermedades psiquiátricas, enfermedades neurodegenerativas, tales como Parkinson o Alzheimer, enfermedad de Huntington, adicciones (por ejemplo, al tabaco, alcohol o drogas), epilepsia, enfermedad de Canavan, adrenoleucodistrofia, etc.), enfermedades oculares, tales como retinitis pigmentosa, amaurosis congénita de Leber, neuropatía óptica hereditaria de Leber, enfermedad de Stargardt; enfermedades por almacenamiento lisosomal, tales como el síndrome de San Filippo; hiperbilirrubinemia, tal como CN de tipo I o II o síndrome de Gilbert, enfermedad de Pompe, etc. Como se ha mencionado anteriormente, y se desarrolla más detalladamente en la siguiente divulgación, para efectuar la expresión de un transgén tal como un gen terapéutico en una célula huésped receptora, preferentemente está ligado operativamente a un promotor, ya sea su propio promotor o un promotor heterólogo. En la técnica se conoce un gran número de promotores adecuados, cuya elección depende del nivel deseado de expresión del producto codificado por el gen terapéutico; si se quiere expresión constitutiva, expresión específica de célula o de tejido, etc. La construcción de ácido nucleico que comprende el intrón modificado, el vector que comprende dicha construcción de ácido nucleico o la célula que comprende dicha construcción o dicho vector puede usarse además en terapia génica o celular cuando el gen de interés es un gen terapéutico como se ha definido anteriormente.

En una realización particular, la construcción de ácido nucleico de la invención es un casete de expresión que comprende, en la orientación de 5' a 3', un promotor opcionalmente precedido por un potenciador, la secuencia codificante de UGT1A1 con codones optimizados de la invención, y una señal de poliadenilación. En una realización particular, la construcción de ácido nucleico de la invención es un casete de expresión que comprende, en la orientación de 5' a 3', un promotor opcionalmente precedido por un potenciador, (tal como la región de control de ApoE), un intrón (en particular un intrón como se ha definido anteriormente), la secuencia codificante de UGT1A1 con codones optimizados de la invención, y una señal de poliadenilación. En una realización particular adicional, la construcción de ácido nucleico de la invención es un casete de expresión que comprende, en la orientación de 5' a 3', un potenciador tal como la región de control de ApoE, un promotor, un intrón (en particular un intrón como se ha definido anteriormente), la secuencia codificante de UGT1A1 con codones optimizados de la invención, y una señal de poliadenilación.

La invención se refiere a un vector AAV que comprende una secuencia de ácido nucleico como se divulga en el presente documento. Concretamente, el vector de la invención es un vector adecuado para su uso en terapia génica. Más en particular, el vector AAV es un vector AAV adecuado para terapia génica dirigida a células o tejido hepático. La construcción de ácido nucleico de la invención también contiene secuencias adecuadas para producir un vector AAV eficaz, como se conoce bien en la técnica. El vector viral es un vector AAV, tal como un vector AAV adecuado para transducir células o tejidos hepáticos, más particularmente un vector AAV-1, -2, -5, -6, -7, -8, -9, -rh10, -rh74, -dj, etc., o un vector retroviral, tal como un vector lentiviral. En una realización adicional, el vector AAV comprende un genoma que es monocatenario o bicatenario autocomplementario. Preferentemente para la práctica de la presente invención, el genoma del AAV es monocatenario. Como se conoce en la técnica, dependiendo del vector viral específico considerado para su uso, se introducirán secuencias adecuadas en la construcción de ácido nucleico de la invención para obtener un vector viral funcional. Las secuencias adecuadas incluyen ITR de AAV para un vector AAV. Como tal, la invención también se refiere a un casete de expresión como se ha descrito anteriormente, flanqueado por un ITR a cada lado.

En una realización particularmente preferida, la invención se refiere a un vector AAV que comprende, en un genoma monocatenario o bicatenario autocomplementario (por ejemplo, un genoma monocatenario), la construcción de ácido nucleico de la invención. En una realización particular, la construcción de ácido nucleico comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:3. En una realización, el vector AAV es un vector AAV8. En una realización particular adicional, dicho ácido nucleico está unido de manera operativa a un promotor, especialmente un promotor ubicuo o específico del hígado. Según una variante de realización específica, el promotor es un promotor ubicuo tal como el promotor potenciador de citomegalovirus/beta actina de pollo (CAG), el potenciador/promotor del citomegalovirus (CMV), el promotor de PGK y el promotor temprano de SV40. En una variante específica, el promotor ubicuo es el promotor de CAG. De acuerdo con otra variante, el promotor es un promotor específico del hígado tal como el promotor de alfa-1 antitripsina (hAAT), el promotor de la transtiretina, el promotor de la albúmina y el promotor de la globulina fijadora de tiroxina (TBG). En una variante específica, el promotor específico del hígado es el promotor específico del hígado hAAT de SEQ ID NO:4. En una realización particular adicional, la construcción de ácido nucleico comprendida en el genoma del vector AAV de la invención comprende además un intrón como se ha descrito anteriormente, tal como un intrón colocado entre el promotor y la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína UGT1A1. Los intrones representativos que pueden incluirse dentro de la construcción de ácido nucleico introducida dentro del genoma del vector AAV incluyen, sin limitación, el intrón de beta globina b2 (o HBB2) humana, el intrón FIX y el intrón de beta-globina de pollo. Dicho intrón dentro del genoma del vector AAV puede ser un intrón clásico (o no modificado) o un intrón modificado diseñado para disminuir el número de, o incluso eliminar totalmente, marcos de lectura abiertos alternativos (ARF) dentro de dicho intrón. Los intrones modificados y no modificados que pueden usarse en la práctica de esta realización donde el ácido nucleico de la invención se introduce dentro de un vector AAV se describen detalladamente anteriormente. En una realización particular, el vector del AAV, en particular el vector AAV8, de la invención incluye dentro de su genoma un intrón modificado (u optimizado) tal como el intrón HBB2 modificado de SEQ ID NO:7, el intrón FIX modificado de SEQ ID NO: 8 y el intrón de beta-globina de pollo modificado de SEQ ID NO: 10.

La presente invención también se refiere a una célula, por ejemplo una célula hepática, que se transforma con una secuencia de ácido nucleico de la invención. Las células de la invención pueden administrarse al sujeto que las necesite mediante inyección en el hígado o en el torrente sanguíneo de dicho sujeto. En una realización particular, la invención implica introducir la secuencia de ácido nucleico de la invención en células hepáticas, en particular en células hepáticas del sujeto a tratar, y administrar dichas células hepáticas en las que se ha introducido al sujeto el ácido nucleico.

La invención también proporciona una composición farmacéutica, que comprende un vector AAV de la invención o una célula de la invención, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La divulgación también se refiere a un método para el tratamiento de una hiperbilirrubinemia causada por una mutación en el gen UGT1A1, que comprende una etapa de administración del ácido nucleico, el vector, la composición farmacéutica o la célula de la invención a un sujeto que la necesite. En una realización particular, la hiperbilirrubinemia es el síndrome CN de tipo I o II, o síndrome de Gilbert.

La invención también se refiere al ácido nucleico, el vector, la composición farmacéutica o la célula de la invención para su uso como medicamento.

La invención también se refiere al vector AAV, la composición farmacéutica o la célula de la invención, para su uso en un método para el tratamiento de una hiperbilirrubinemia causada por una mutación en el gen UGT1A1, en particular en un método para el tratamiento del síndrome de CN de tipo I o II, o del síndrome de Gilbert.

La divulgación se refiere además al uso del ácido nucleico, el vector, la composición farmacéutica o la célula de la invención, en la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de una hiperbilirrubinemia causada por una mutación en el gen UGT1A1, en particular para el tratamiento del síndrome de CN de tipo I o II, o del síndrome de Gilbert.

Descripción detallada de la invención

El término "UGT1A1" se refiere al ADNc de la UDP-glicosiltransferasa 1 familia 1 de tipo salvaje, deHomo sapiens,polipéptido A, (UGT1 Al) mostrado en la SEQ ID NO: 1 (número de acceso NM_000463.2, que es la secuencia de referencia para el CDS del ARNm para UGT1A1 humana; referencia OMIM 191740).

La expresión "codón optimizado" significa que un codón que expresa un sesgo hacia el ser humano (es decir, es común en genes humanos pero poco común en otros genes de mamíferos o genes de no mamíferos) se cambia a un codón sinónimo (un codón que codifica el mismo aminoácido) que no exprese un sesgo hacia el ser humano. Por lo tanto, el cambio de codón no da como resultado ningún cambio de aminoácido en la proteína codificada.

La secuencia mostrada en la SEQ ID NO:3 es una realización preferida de la secuencia de ácido nucleico con codones optimizados de la invención.

El cambio en la secuencia de ADN que se deriva de la optimización de codones en la SEQ ID NO:2 y la SEQ ID NO:3 da como resultado un aumento de aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 10 % del contenido de GC en la secuencia de UGT1A1, respectivamente.

La invención también abarca una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína UGT1A1 humana con codones optimizados que es "sustancialmente idéntica", es decir, un 90 % idéntica, incluso más preferentemente aproximadamente un 95 % idéntica, aún más preferentemente aproximadamente un 97 %, 98 % o incluso 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 3.

"Idéntica/o" se refiere a la identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico. Cuando una posición en las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma base, por ejemplo, si en cada una de las dos moléculas de ADN, una posición está ocupada por adenina, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones coincidentes compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias coinciden, entonces las dos secuencias son idénticas en un 60 %. En general, se realiza una comparación cuando se alinean dos secuencias para proporcionar la máxima identidad. Se podrían usar diversas herramientas bioinformáticas conocidas por el experto en la técnica para alinear secuencias de ácidos nucleicos tales como BLAST o FASTA.

La expresión "inmunogenicidad disminuida" aplicado a la secuencia codificante UGT1A1 con codones optimizados o al intrón modificado de la invención significa que este gen con codones optimizados o intrón modificado comprende un número reducido de marcos de lectura abiertos alternativos (o ARF) potenciales en el intrón, o la secuencia codificante, o en ambos, limitando así el número de posibles subproductos de proteínas de traducción, en particular del ARNm codificado, en comparación con el ADNc de tipo salvaje u otras variantes de ADNc de UGT1A1. Concretamente, los ARF disminuidos son aquellos cuya longitud abarca más de 50 pb y tienen un codón de terminación en marco con un codón de iniciación.

En el contexto de la presente invención, la expresión "terapia génica" se refiere al tratamiento de un sujeto que implica la administración de un gen/ácido nucleico en las células de un individuo con el fin de tratar una enfermedad. La administración del gen generalmente se logra usando un vehículo de administración, también conocido como vector. Se pueden emplear vectores virales y no virales para administrar un gen a las células de un paciente. En la presente invención, se utilizan vectores AAV, en particular un vector AAV8.

Se apreciará que el ácido nucleico de la invención puede incluir una o más señales de poliadenilación, normalmente localizadas en el extremo 3' de la molécula.

El vector para administrar el ácido nucleico de la invención es un vector AAV. El virus adenoasociado (AAV) del parvovirus humano es un dependovirus que es naturalmente defectuoso para la replicación y que es capaz de integrarse en el genoma de la célula infectada para establecer una infección latente. La última propiedad parece ser única entre los virus de mamíferos porque la integración se produce en un sitio específico en el genoma humano, denominado AAVS1, ubicado en el cromosoma 19 (19q13.3-qter).

Por lo tanto, los AAV han hecho surgir un interés considerable como un vector potencial para la terapia génica humana. Entre las propiedades favorables para el virus están su falta de asociación con cualquier enfermedad humana, su capacidad para infectar tanto células que se dividen como las que no y el amplio intervalo de estirpes celulares derivadas de diferentes tejidos que se pueden infectar.

Entre los serotipos de AAV aislados de primates humanos o no humanos (NHP) y bien caracterizados, el serotipo 2 humano es el primer AAV desarrollado como vector de transferencia génica. Otros serotipos de AAV utilizados actualmente incluyen AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAVrh74 y AAVdj, etc. Además, también pueden ser útiles las variantes de ingeniería no naturales y AAV quiméricos.

Los virus AAV pueden diseñarse utilizando técnicas de biología molecular convencionales, haciendo posible optimizar estas partículas para la administración celular específica de secuencias de ácido nucleico, para minimizar la inmunogenicidad, para ajustar la estabilidad y la vida útil de las partículas, para una degradación eficiente, para una administración precisa al núcleo.

Los fragmentos de AAV deseables para ensamblar en vectores incluyen las proteínas del capuchón, incluyendo vp1, vp2, vp3 y las regiones hipervariables, las proteínas rep, incluyendo rep 78, rep 68, rep 52 y rep 40, y las secuencias que codifican estas proteínas. Estos fragmentos pueden utilizarse fácilmente en diversos sistemas de vectores y células huésped.

Los vectores recombinantes basados en AAV que carecen de la proteína Rep se integran con baja eficacia en el genoma del huésped y están presentes principalmente como episomas circulares estables que pueden persistir durante años en las células diana.

Como alternativa al uso de serotipos naturales de AAV, se pueden utilizar serotipos artificiales de AAV en el contexto de la presente invención, incluidos, sin limitación, AAV con una proteína de la cápside de origen no natural. Una cápside artificial de este tipo puede generarse mediante cualquier técnica adecuada, usar una secuencia de AAV seleccionada (por ejemplo, un fragmento de una proteína de la cápside vp1) en combinación con secuencias heterólogas que pueden obtenerse de porciones no contiguas del serotipo de AAV seleccionado diferente, porciones no contiguas del mismo serotipo de AAV, de una fuente viral no AAV, o de una fuente no viral. Un serotipo artificial de AAV puede ser, sin limitación, una cápside quimérica de AAV, una cápside de AAV recombinante o una cápside de AAV "humanizada".

En consecuencia, la presente invención se refiere a un vector AAV que comprende el ácido nucleico de la invención, que es una secuencia codificante de UGT1A1 con codones optimizados. En el contexto de la presente invención, el vector AAV comprende una cápside de AAV capaz de transducir las células diana de interés, en particular hepatocitos. De acuerdo con una realización particular, el vector AAV es del serotipo AAV-1, -2, -5, -6, -7, -8, -9, -rh10, -rh74, -dj, etc. En una realización particular adicional, el vector AAV es un vector pseudotipado, es decir, su genoma y cápside derivan de AAV de diferentes serotipos. Por ejemplo, el vector AAV pseudotipado puede ser un vector cuyo genoma deriva del serotipo AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, rh10, rh74, o dj, y cuya cápside deriva de otro serotipo. Por ejemplo, el genoma del vector pseudotipado puede derivar del serotipo AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, rh10, rh74 o dj, y su cápside deriva del serotipo AAV8 o AAV9, en particular del serotipo AAV8.

En otra realización, la cápside es una cápside modificada. En el contexto de la presente invención, una "cápside modificada" puede ser una cápside quimérica o una cápside que comprende una o más proteínas de la cápside de VP variantes derivadas de una o más proteínas de la cápside de VP de AAV de tipo salvaje.

En una realización particular, el vector AAV es un vector quimérico, es decir, su cápside comprende proteínas de la cápside VP derivadas de al menos dos serotipos de AAV diferentes, o comprende al menos una proteína VP quimérica que combina regiones o dominios de la proteína VP derivados de al menos dos serotipos de AAV. Ejemplos de dichos vectores quiméricos de AAV útiles para transducir células hepáticas se describen en Shenet al.,Molecular Therapy, 2007 y en Tenneyet al.,Virology, 2014. Por ejemplo, un vector quimérico de AAV puede derivar de la combinación de una secuencia de la cápside de AAV8 con una secuencia del serotipo AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, rh10, rh74 o dj. En otra realización, la cápside del vector AAV comprende una o más proteínas variantes de la cápside VP como las descritas en el documento WO2015013313, en particular las variantes de la cápside RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4 y RHM15-6, que presentan un alto tropismo hepático.

En otra realización, la cápside modificada también puede derivarse de modificaciones de la cápside insertadas mediante PCR propensa a errores y/o inserción de péptidos (por ejemplo, como se describe en Bartelet al.,2011). Además, las variantes de la cápside pueden incluir cambios de un solo aminoácido, tales como mutantes de tirosina (por ejemplo, como se describe en Zhonget al.,2008)

Además, el genoma del vector AAV puede ser un genoma monocatenario o bicatenario autocomplementario (McCarty et al., Gene Therapy, 2003). Los vectores AAV bicatenarios autocomplementarios se generan eliminando el sitio de resolución terminal (trs) de una de las repeticiones terminales AAV. Estos vectores modificados, cuyo genoma replicante tiene la mitad de la longitud del genoma AAV de tipo silvestre tienen la tendencia a empaquetar dímeros de a Dn . En una realización preferida, el vector AAV implementado en la práctica de la presente invención tiene un genoma monocatenario y además, preferentemente, comprende una cápside AAV8, AAV2 o AAV5, más preferentemente una cápside AAV8.

Aparte de los sistemas de administración específicos incorporados a continuación en los ejemplos, se conocen diversos sistemas de administración y pueden utilizarse para administrar el ácido nucleido de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar la secuencia codificante de UGT1A1 con codones optimizados, endocitosis mediada por receptor, construcción de un ácido nucleico terapéutico como parte de un vector retroviral u otro, etc. Los métodos de administración del ácido nucleico incluyen, entre otras, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y vías orales. La secuencia de ácido nucleico de la invención, ya sea vectorizada o no, se puede administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección en bolo, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la invención en el hígado del sujeto mediante cualquier vía adecuada. Además, se puede utilizar ADN desnudo, tales como minicírculos y transposones, para la administración o vectores lentivirales. Además, también se pueden usar tecnologías de edición de genes, tales como nucleasas con dedos de cinc, meganucleasas, TALEN y CRISPR para administrar la secuencia codificante de la invención.

En una realización específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente en la zona que necesite tratamiento, es decir, el hígado. Esto se puede conseguir, por ejemplo, mediante un implante, siendo dicho implante de un material poroso, material no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas elásticas o fibras.

En otra realización, el ácido nucleico de la invención se puede administrar en una vesícula, en particular un liposoma

En aun otra realización, el ácido nucleico de la invención puede administrarse en un sistema de liberación controlada.

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el vector de la invención o la célula de la invención. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutica (el vector o célula de la invención) y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales y seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Dichos transportadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos aquellos de origen en el petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También se pueden emplear soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos, en particular para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares.

La composición, si se desea, también pueden contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes o agentes tamponadores del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La formulación oral puede incluir transportadores convencionales, tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. En "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin se describen ejemplos de transportadores farmacéuticos adecuados. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente efectiva de la terapéutica, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de transportador para proporcionar al sujeto la forma de administración adecuada. En una realización particular, el vector o célula de la invención se formula en una composición que comprende solución salina tamponada con fosfato y complementada con seroalbúmina humana al 0,25 %. En otra realización particular, el ácido nucleico, el vector o célula de la invención se formula en una composición que comprende Ringer lactato y un tensioactivo no iónico, tal como Pluronic F68 a una concentración final del 0,01 0,0001 %, tal como a una concentración del 0,001 %, en peso de la composición total. La formulación puede comprender además seroalbúmina, en particular seroalbúmina humana, tal como seroalbúmina humana al 0,25 %. En la técnica se conocen otras formulaciones apropiadas para almacenamiento o administración, en particular a partir del documento WO 2005/118792 o Allayet al.,2011.

En una realización preferida, la composición se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Habitualmente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico y estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lignocaína para, aliviar el dolor en el sitio de la inyección.

La cantidad del agente terapéutico (es decir, un vector o célula) de la invención que será eficaz en el tratamiento del síndrome de CN puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayosin vivoy/oin vitropara ayudar a predecir los intervalos de dosificación óptimos. La dosis exacta que se va a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la enfermedad y debe decidirse de acuerdo con el criterio del facultativo y las circunstancias de cada paciente. La dosis del ácido nucleico, el vector o la célula administrada al sujeto que lo necesita variará en función de varios factores, que incluyen, sin limitación, la vía de administración, la enfermedad específica tratada, la edad del sujeto o el nivel de expresión necesario para requerir el efecto terapéutico. El experto en la técnica puede determinar fácilmente, en función de sus conocimientos en este campo, el intervalo de dosificación requerido en función de estos factores y otros. En el caso de un tratamiento que comprenda la administración de un vector viral, tal como un vector AAV, al sujeto, las dosis típicas del vector son de al menos 1x108 genomas vectoriales por kilogramo de peso corporal (gv/kg), tal como al menos 1x109 gv/kg, al menos 1x1010 gv/kg, al menos 1x1011 gv/kg, al menos 1x1012 gv/kg, al menos 1x1013 gv/kg o al menos 1x1014 gv/kg.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 incluye gráficos que muestran los niveles de ARN mensajero observados en células Huh-7 transfectadas con plásmido que expresa UGT1A1 de tipo salvaje o secuencias de UGT1A1 con dos codones optimizados (panel A) y la cuantificación mediante transferencia Western de la proteína UGT1A1 en las mismas muestras (panel B). ).

La Figura 2 incluye gráficos que muestran el efecto de diferentes optimizaciones de intrones en la expresión de luciferasa (panel A) y el efecto de la optimización de HBB2 en el nivel de expresión de proteínas y ARN de UGT1A1 (panel B).

La Figura 3 es una fotografía de un gel de transferencia Western que muestra la expresión de la proteína UGT1A1 a partir de dos vectores que contienen una secuencia codificante de UGT1A1 con codones optimizados y que contienen el intrón HBB2 de tipo salvaje (UGT1A1 2.0) u optimizado (UGT1A1 2.1).

La Figura 4 es una representación esquemática del análisisin silicodel marco de lectura alternativo (ARF) dentro de los vectores UGT1A1 (A) de tipo salvaje y UGT1A1 v2.1 (B) con codones optimizados.

La Figura 5 es un gráfico que muestra los niveles de bilirrubina total (BT) medidos cada semana después de la inyección de un vector UGT1A1 con codones optimizados o de PBS en diferentes cepas de ratas.

La Figura 6 es un gráfico que muestra los niveles de bilirrubina total (BT) medidos cada semana después de la inyección de una dosis más baja de vector UGT1A1 con codones optimizados (en comparación con los datos indicados en la figura 5) o de PBS en diferentes cepas de ratas.

La Figura 7 incluye (A) un gráfico que muestra los niveles de bilirrubina total (BT) medidos cada semana después de la inyección de los tres vectores UGT1A1 (en comparación con los datos indicados en la figura 8); (B) una fotografía de una transferencia Western de extractos de hígado obtenidos de ratas tratadas con los tres vectores y su cuantificación relativa; y (C) un gráfico que presenta la evaluación a largo plazo de la eficacia de AAV8-v2.1 UGT1A1 cuatro meses después de la inyección en animales machos y hembras.

La Figura 8 es un gráfico que muestra la capacidad de diferentes construcciones para corregir la hiperbilirrubinemia grave (bilirrubina total, expresada como mg/dl) en el modelo de ratón del síndrome de Crigler-Najjar. Se indican animales no tratados (NOT<r>).

Intervalos: a lo largo de la presente divulgación, se pueden presentar diversos aspectos de la invención en un formato de intervalo. Ha de comprenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad, y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. En consecuencia, se debe considerar que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los posibles subintervalos, así como valores numéricos individuales en ese intervalo. Por ejemplo, debe considerarse que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 ha divulgado específicamente subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Esto es aplicable independientemente de la amplitud del intervalo.

Sin más descripción, se cree que un experto en la materia puede, utilizando la descripción anterior y los siguientes ejemplos ilustrativos, fabricar y utilizar los compuestos de la presente invención y practicar los métodos reivindicados.

Ejemplos

La invención se describe con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos experimentales y las figuras adjuntas. Estos ejemplos se proporcionan solo con fines ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

Material y métodos

Optimización de codones y construcción de vectores AAV:

Se sometió a UGT1A1 a optimización de codones según varios algoritmos diferentes. Además, la eliminación de los sitios de iniciación de la transcripción crípticos se implementó en toda la construcción. Las construcciones resultantes se introdujeron en plásmidos de expresión o se empaquetaron en vectores de serotipo 8 de AAV y se analizaronin vitroein vivo(ratas y ratones) para determinar la potencia.

A lo largo de esta parte experimental se utilizan las siguientes abreviaturas para estas construcciones:

- SV.0: transgén UGT1A1 de tipo salvaje y el intrón HBB2 de tipo salvaje (SEQ ID NO:5);

- SV: transgén UGT1A1 de tipo salvaje y la versión optimizada del intrón HBB2 con algunos ARF eliminados (SEQ ID NO:6);

- v2 (o v2.0): comprende el transgén UGT1A1 con codones optimizados versión 2.0 (SEQ ID NO:2) y el intrón HBB2 de tipo salvaje (SEQ ID NO:5);

- v2.1: comprende la versión 2.0 del transgén UGT1A1 con codones optimizados (SEQ ID NO:2) y una versión optimizada del intrón HBB2 con algunos ARF eliminados (SEQ ID NO:6);

- v3: comprende la versión 3 del transgén UGT1A1 con codones optimizados (SEQ ID NO:3), con una versión optimizada del intrón HBB2 con algunos ARF eliminados (SEQ ID NO:6).

- AAV8-hAAT-wtUGT1A1: vector AAV8 que contiene la construcción SV, bajo el control de un promotor de hAAT del transgén UGT1A1 de tipo salvaje;

- AAV8-hAAT-coUGT1A1v2: vector AAV8 que contiene la construcción v2, bajo el control de un promotor de hAAT; - AAV8-hAAT-coUGT1A1v2.1: vector AAV8 que contiene la construcción v2.1, bajo el control de un promotor de hAAT; - AAV8-hAAT-coUGT1A1v3: vector AAV8 que contiene la construcción v3, bajo el control de un promotor DE hAAT de tipo salvaje.

Ensayo in vitro:

La línea celular de hepatocitos humanos Huh7 se transdujo con una multiplicidad de infección (MOI) creciente de 0, 5000 (5), 10000 (10) o 25000 (25) o se transfectó con los vectores plasmídicos indicados y lipofectamina. Cuarenta y ocho horas después de que se recolectaran las células de transducción, se prepararon extractos lisados y microsomales y se cargaron en una transferencia Western, donde se utilizó un anticuerpo policlonal contra UGT1 humana para detectar la proteína. Como control de la carga se utilizó la proteína calnexina expresada constitutivamente.

Una parte de las células utilizadas para la preparación microsomal se ha utilizado para la extracción de ARNm con trizol. El ARNm extraído se trató con ADNasa, se retrotranscribió y se analizó mediante RT-PCR con cebadores oligonucleotídicos específicos para la secuencia UGT1A1. Para la normalización se han utilizado cebadores oligonucleotídicos específicos para la fosfatasa alcalina sérica humana.

Análisis in silico:

El análisis del marco de lectura alternativo (ARF) se realizó en la cadena codificante de las dos secuencias UGT1A1 con la herramienta de análisis ORF presente en el software VectorNTI (Life Technologies). Se utilizaron sitios de iniciación y terminación clásicos para células eucariotas (respectivamente ATG como sitio de iniciación y TAA TGA TAG como sitios de terminación). Se consideraron ARF cuando su longitud abarca más de 50 pb y tienen un codón de terminación en marco con el de iniciación.

Animales:

A ratas Gunn, que presentan una deficiencia en el gen UGT1A1, se les inyectaron vectores a una edad de 6-8 semanas. Los vectores se administraron a través de la vena de la cola en un volumen de 0,5 ml. Se recogieron muestras de suero semanalmente para controlar los niveles de bilirrubina total (BT). Se utilizaron como controles animales afectados no tratados y compañeros de camada sanos o de tipo salvaje.

Los ratones conugtlmutante en el fondo C57B1/6 se han generado previamente (Bortolussiet al.,2012). Se utilizaron compañeros de camada SV como control. Los ratones se estabularon y manipularon de acuerdo con las pautas institucionales y los procedimientos experimentales aprobados por el Comité de Ética local y las autoridades reguladoras pertinentes, con pleno respeto a la Directiva de la UE 2010/63/UE para la experimentación con animales. La mutación genética en el gen Ugt1a se transfirió a la cepa de ratón FVB/NJ. Los animales utilizados en este estudio eran al menos un 99,8 % de ratones C57B1/6 o antecedentes genéticos FVB/NJ, obtenidos después de más de 9 retrocruzamientos con ratones C57B1/6 y FVB/NJ, respectivamente. Los ratones se mantuvieron en un ambiente con temperatura controlada con un ciclo de luz y oscuridad de 12/12 horas. Recibieron una dieta estándar y aguaad libitum.Los vectores fueron inyectados por vía intraperitoneal el día 2 (P2) después del nacimiento y los niveles de bilirrubina se analizaron 4 semanas después de la inyección del vector.

Dosis de AAV:

Las dosis de vector administradas se indicaron en las leyendas de las figuras.

Preparación de suero para ratas:

Se recogieron muestras de sangre semanalmente mediante punción en el seno retroorbitario, en jeringas secas. La sangre se centrifugó a 8000 rpm a 4 °C, se alicuotó y se congeló a -20 °C.

Preparación de plasma para ratones:

Se recogieron muestras de sangre 4 semanas después de la inyección en compañeros de camada mutantes y SV mediante punción cardíaca en jeringas recolectoras con EDTA. La sangre se centrifugó a 2500 rpm, se recogió el plasma, se alicuotó y se congeló a -80 °C. Todos los procedimientos se realizaron con poca luz para evitar la degradación de la bilirrubina.

Determinación de bilirrubina para ratas:

La determinación de bilirrubina total en suero se realizó utilizando el kit de ensayo de bilirrubina (Abnova, ref. KA1614), según lo descrito por los fabricantes. Se utilizó un volumen de 50 pl de suero para realizar el análisis. Los valores de absorbancia a 530 nm se obtuvieron utilizando un lector multiplaca (PerkinElmer EnSpire)

Determinación de bilirrubina para ratones:

La determinación de bilirrubina total en plasma se realizó utilizando el kit de reactivos de bilirrubina total y directa (kits BQ, San Diego, CA), como lo describen los fabricantes con modificaciones menores: la reacción se redujo y se realizó en un volumen final de 300 pl (en lugar de 6000 pl), con sólo 10 pl de plasma. Tres patrones comerciales de referencia de bilirrubina (Suero Control I, Suero Control II y Calibrador de Bilirrubina, Diazyme Laboratories, Poway, CA, EE. UU.) se incluyeron en cada conjunto de análisis como control de calidad. Los valores de absorbancia a 560 nm se obtuvieron utilizando un lector multiplaca (Perkin Elmer Envision Plate Reader, Waltman, MA, EE.UU.).

Transferencia Western en extractos de hígado:

El hígado ultracongelado obtenido de los animales inyectados con cualquiera de los tres vectores se ha homogeneizado rápidamente. Se han utilizado homogeneizados para la preparación de microsomas. Luego se cargaron extractos microsomales en una transferencia Western, donde se utilizó un anticuerpo policlonal contra UGT1 humana para detectar la proteína. Se cuantificaron las bandas de proteínas.

Resultados

Se produjeron versiones optimizadas con codones de la secuencia codificante de UGT1A1 humana y se introdujeron en un plásmido de expresión. Las dos secuencias codificantes de UGT1A1 optimizadas (secuencias v2 y v3) y la secuencia de tipo salvaje, se transfectaron en células Huh-7. Los resultados obtenidos se indican en la Figura 1. Este experimento muestra que las dos secuencias optimizadas con codones se traducen de manera más eficiente que la secuencia de tipo salvaje en células humanasin vitro.

En el panel A de la figura 2 se muestran los niveles de luciferasa producidos en células Huh-7 mediante transfección con plásmidos que expresan luciferasa bajo el control transcripcional del promotor hAAT. Se han clonado diferentes secuencias intrónicas en el extremo 5' de la secuencia codificante de la luciferasa. Dos de ellos, a saber, los intrones HBB2 y FIX, se optimizaron mediante la eliminación de ARF en la secuencia realizada reemplazando un nucleótido en codones ATG identificados en la secuencia de tipo salvaje de dichos intrones. La expresión de la construcción optimizada en una línea celular hepática indica que la eliminación de ARF de las secuencias intrónicas aumentó la expresión de luciferasain vitroen ambos casos, siendo el intrón HBB2 optimizado particularmente potente. En el panel B se compararon dos plásmidos, ambos expresan UGT1A1 bajo el control transcripcional del promotor hAAT. La versión V2.0 contiene el intrón HBB2 de tipo salvaje, mientras que la versión 2.1 contiene la versión optimizada. Los datos mostrados indican que el plásmido v2.1 expresa un 50 % más de UGT1A1 que v2.0 sin ningún aumento en los niveles de ARNm.

Se probaron los vectores AAV8 versión 2.0 y 2.1 UGT1A1 optimizados con codones (UGT1A1 2.0 y UGT1A1 2.1, respectivamente)in vitro.Los vectores UGT1A1 2.0 y UGT1A 12.1 se diferencian únicamente por el hecho de que contienen el intrón HBB2 de tipo salvaje (SEQ ID NO:5) o un intrón HBB2 modificado donde se han eliminado los ARF (SEQ ID NO:6), respectivamente. Los resultados obtenidos se indican en la Figura 3. Este experimento muestra que la versión 2.1 del vector UGT1A1 con codones optimizados es más potente que la versión 2.0 en células humanasin vitro.

La Figura 4 muestra el resultado del análisisin silicodel marco de lectura alternativo (ARF) dentro de los vectores UGT1A1 (A) de tipo salvaje y v2.1 (B) con codones optimizados. El vector v2.1 tiene sólo un número limitado de ARF en comparación con la secuencia de tipo salvaje y en su mayoría en orientación inversa con respecto al promotor. Además, en la figura 4 se puede ver que los ARF9 y 10 que normalmente están presentes en el intrón HBB2 (usado en la construcción UGT1A1 de tipo salvaje representada en A) se han eliminado del intrón HBB2 modificado de SEQ ID NO:6 introducido en el vector UGT1A1v2.1 optimizado.

A continuación, el vector AAV8-hAAT-coUGT1A1v2.1 con codones optimizados se administró en una dosis de 5 x 1012 gv/kg. La inyección del vector en la vena de la cola se realizó en ratas Gunn homocigotas de 6 semanas de edad (UGT1A1 -/-). En el gráfico de la figura 5 se muestran los niveles de bilirrubina total (BT) medidos cada semana, después de las inyecciones y en ratas Gunn de tipo salvaje a las que se inyectó PBS (SV, línea gris), heterocigotas (UGT1A1+/-, línea discontinua) y homocigotas (línea negra). Todos los datos se expresan como la media ± SE. La inyección del vector con codones optimizados dio como resultado la corrección completa del fenotipo de la enfermedad.

También se administró el vector AAV8-hAAT-UGT1A1v2.1 a una dosis de 5 x 1011 gv/kg. El vector se administró mediante inyección en la vena de la cola en ratas Gunn homocigotas de 6 semanas de edad (UGT1A1 -/-). En el gráfico de la figura 6 se muestran los niveles de bilirrubina total (BT) medidos cada semana, después de las inyecciones y en ratas Gunn de tipo salvaje a las que se inyectó PBS (SV, línea gris), heterocigotas (UGT1A 1+/-, línea discontinua) y homocigotas (línea negra). Todos los datos se expresan como la media ± SE. La inyección del vector con codones optimizados dio como resultado la corrección completa del fenotipo de la enfermedad.

Los dos vectores con codones optimizados (v2.1 y v3) y el de tipo salvaje AAV8-hAAT-UGT1A1, se administraron además a una dosis de 5 x 1011 gv/kg. La inyección del vector en la vena de la cola se ha realizado en ratas Gunn homocigotas de 6 semanas de edad (UGT1A1). En el gráfico de la figura 7A se muestran los niveles de bilirrubina total (BT) medidos cada semana, después de las inyecciones. Todos los datos se expresan como la media ± SE. Como se muestra en la figura 7, panel A, la inyección de los tres vectores dio como resultado la corrección completa del fenotipo de la enfermedad. Dos meses después de la inyección, se sacrificó a los animales y se cuantificó el nivel de proteína UGT1A1 mediante transferencia Western en homogeneizados de hígado. En el panel B se muestran las fotografías de la transferencia Western con un anticuerpo específico para la proteína UGT1A1. La cuantificación de las bandas mostró un aumento en la cantidad de proteína UGT1A1 en ratas tratadas con AAV8-hAAT-coUGT1A1v2.1 aunque la diferencia no es significativa debido a la alta variabilidad de los niveles de expresión observados en los diferentes animales.

Se ha evaluado la eficacia a largo plazo en ratas Gunn de dos meses de edad a las que se les inyectó 5 x 1012 gv/kg de vector AAV8-v2.1 UGT1A1. Cuatro meses después de la inyección, el nivel promedio de bilirrubina en sangre es de 1,75mg/dl (nivel inicial en DO: 7,49, reducción del 77%) en ratas macho y 0,85 mg/dl (nivel inicial en DO: 6,15 mg/dl, reducción del 86 %) en ratas hembra. Este resultado, que indica una corrección a largo plazo del fenotipo, es particularmente sorprendente en comparación con un estudio anterior de Pastoreetal.,que indicaron una reducción en ratas hembra de solo el 50 % de los niveles basales de bilirrubina utilizando una construcción diferente. En conjunto, los datos mostrados indican que el proceso de la invención aplicado a AAV8-hAAT-coUGT1A1v2.1 dio como resultado un vector con una eficaciain vivomejor en comparación con otros vectores desarrollados para curar el síndrome de CN.

También se analizó la eficacia de la corrección de la bilirrubina total en el modelo de ratón con síndrome de Crigler-Najjar. La Figura 8 es un gráfico que muestra los niveles de bilirrubina total (BT) 1 mes después de la inyección. A los animales se les inyectó el día 2 después del nacimiento (P2) una dosis de 3E10 gv/ratón.

Se utilizaron como controles animales afectados no tratados y mantenidos vivos con fototerapia durante 15 días (NOTR (PT)).

Este experimento muestra que el vector de la versión 2.1 proporciona el nivel más alto de corrección de BT de todos los vectores. Todos los valores se expresan como la media ± SD. Cada punto representa un solo animal.

BIBLIOGRAFÍA

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Zhonget al.,Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Jun 3;105(22):7827-32

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un vector AAV que comprende una secuencia de ácido nucleico que es una secuencia codificante de UGT1A1 con codones optimizados, en donde la secuencia codificante optimizada tiene un contenido de GC aumentado y tiene un número reducido de marcos de lectura abiertos alternativos en comparación con la secuencia codificante de tipo salvaje de SEQ ID NO:1, en donde dicha secuencia de ácido nucleico comprende:

- una secuencia de nucleótidos idéntica al menos en un 90 % a la secuencia de SEQ ID NO:3 o

- la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3.

2. El vector AAV de acuerdo con la reivindicación 1, que es un vector AAV autocomplementario monocatenario o bicatenario.

3. El vector AAV de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el vector AAV tiene una cápside derivada de AAV, tal como una cápside AAV -1 -2, -5, -6, -7, -8, -9, -rh10, -rh74, -dj o tiene una cápside quimérica, preferentemente una cápside AAV8.

4. El vector AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un vector AAV pseudotipado.

5. El vector AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho ácido nucleico está comprendido en una construcción de ácido nucleico.

6. El vector AAV de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha construcción nucleica es un casete de expresión que comprende dicha secuencia de ácido nucleico unida operativamente a un promotor.

7. El vector AAV de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el promotor es un promotor específico de hígado.

8. El vector AAV de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en donde el promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor hAAT, promotor de alfa-1 antitripsina (hAAT), el promotor de la transtiretina, el promotor de la albúmina y el promotor de la globulina fijadora de tiroxina (TBG).

9. El vector AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde dicha construcción nucleica comprende además un intrón, en particular seleccionado del grupo que consiste en un intrón de beta globina b2 (o HBB2) humana, un intrón FIX y un intrón de beta-globina de pollo.

10. El vector AAV de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el intrón es un intrón modificado con ARF reducidos o sin ARF, preferentemente un intrón HBB2 modificado, un intrón FIX modificado o un intrón de beta-globina de pollo modificado, más preferentemente el intrón HBB2 modificado mostrado en la SEQ ID NO: 6, el intrón FIX modificado que se muestra en la SEQ ID NO: 8, o el intrón de beta-globina de pollo modificado que se muestra en la SEQ ID NO: 10.

11. Una célula transformada con el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. La célula de acuerdo con la reivindicación 11, que es una célula hepática o una célula muscular.

13. Una composición farmacéutica, que comprende el vector AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o la célula de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. El vector AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, la célula de acuerdo con la reivindicación 11 o 12 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13, para su uso como un medicamento.

15. El vector AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para su uso en terapia génica.

16. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o la célula de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13, para su uso en un método para el tratamiento del síndrome de Crigler-Najjar de tipo I o II o del síndrome de Gilbert.