ES2966573T3

ES2966573T3 - Epipirona A como agente antimicrobiano

Info

Publication number: ES2966573T3
Application number: ES11818451T
Authority: ES
Inventors: Cody Calder; Stephen Ford; Andrew Selwood; Ginkel Roel Van; Alistair Wilkins
Original assignee: Biotelliga Holdings Ltd
Current assignee: Biotelliga Holdings Ltd
Priority date: 2010-08-20
Filing date: 2011-08-22
Publication date: 2024-04-23
Anticipated expiration: 2031-08-22
Also published as: AU2011292510B2; CN103167802A; US20160021881A1; CA2808489C; JP5956439B2; WO2012023865A1; CN105640941A; CA2808489A1; KR101903200B1; US20120108526A1; US8889636B2; JP2013539466A; KR20140023864A; EP2605654A4; CN103167802B; EP2605654C0; EP2605654A1; AU2011292510A1; EP2605654B1; US20140357580A1

Abstract

Compuestos antimicrobianos de Epicoccum purpurascens (sin. E. negrum) para uso contra patógenos de plantas y hongos. Se aisló un metabolito de color amarillo organza, se dilucida la estructura como un pequeño grupo de compuestos Epipirona AC y se demostró actividad fungicida contra patógenos vegetales, por ejemplo Botrytis cinerea y Lecanicillium muscarium. Se proporcionan composiciones agrícolas y farmacéuticas, y también se proporciona su uso en el tratamiento de infecciones microbianas en un animal o planta. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Epipirona A como agente antimicrobiano

Declaración de solicitudes correspondientes

Esta solicitud se basa en la especificación Provisional presentada en relación con el número de solicitud de patente de Nueva Zelanda 587490.

Campo técnico

La presente invención se refiere generalmente al uso de un compuesto de fórmula (I) o una sal, tautómero, estereoisómero, hidrato o solvato del mismo en el tratamiento de una infección fúngica en una planta o parte de la planta de la misma y métodos relacionados. En particular, aunque no exclusivamente, se describe en el presente documento un exudado fúngico aislado de la cepa fúngica filamentosaEpicoccum purpurasens(sin.Epicocclum nigrum)para su uso como fungicida natural.

Antecedentes de la técnica

Los hongos pueden causar graves daños en cultivos en crecimiento o cosechados, particularmente cultivos de frutas o vegetales. Los fungicidas también se usan para tratar infecciones fúngicas en animales.

Tradicionalmente el método principal del control de crecimiento de hongos ha sido el uso de productos químicos fungicidas producidos sintéticamente. Estos fungicidas sintéticos tienen frecuentemente una alta toxicidad para seres humanos y otros organismos. Debido a esto, el uso de fungicidas sintéticos se ha vuelto más restringido debido a la preocupación pública de su toxicidad.

El uso de fungicidas naturales como alternativa a los productos químicos sintéticos se está volviendo más atractivo debido a una mejor biodegradación y, por lo tanto, al potencial de una menor toxicidad tanto para el medio ambiente como para los consumidores de los cultivos cosechados.

Epicoccum purpurascens(sIn. E.nigrum)es un hongo filamentoso saprofítico asociado normalmente con tejidos vegetales y suelo senescentes. Produce altas concentraciones de productos secundarios que incluyen un pigmento que proporciona al medio que se hace crecer en un color amarillo/naranja (dependiente del pH). Un pigmento naranja, denominado orevactaeno se aisló deE. purpurascensy su estructura descrita (Shu, Y.Z., y col., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1997 7(17): p. 2295-2298; véase la Figura 1). Se encontró que orevactaeno inhibe la unión de la proteína reguladora del VIH-1 y su sitio de unión a ARN viral. Se ha descubierto que tiene una modesta actividad antifúngica contraCandidia albbans(MIC 250 pg/mL). Se determinó que la estructura de orevactaeno era la que se muestra en la Figura 1.

También se aislaron varios metabolitos fúngicos deE. purpurasenspor Kemami Wangun como se describe en una disertación 2006 [Kemami Wangun, H., V, 2006, Friedrich-Schiller: Universidad de Jena]. Se aisló un aceite amarillo y se identificó como orevactaeno.

Otros compuestos biológicamente activos secretados por otras cepas deE. purpurasensse han caracterizado incluyendo flavipina que demostró actividad antimicrobiana contra bacterias y hongos (Brown AE. y col., Soil Boil. 1987 Biochem. 19: 657-664 y Burge WR. Y col., 1976 J. Agric. Food Chem. 24: 555-559), y epicoccamidas (Wangun HVK. Y col., 2007 J. Nat. Prod. 70: 1800-1803; Wright AD. Y col., 2003 Org. Biomol. Chem. 1: 507-510) y tiornicina (Frederick CB. Y col., 1981 Biochem. 20: 2436-2438) que ha demostrado tener actividad contra el cáncer. Además, JP2002047281 describe una galactopiranosa (compuesto I, § 53) producido porE. purpurasensy el uso de la galactopiranosa como inhibidor de la telomerasa. Kanai A. y col. 2003 Org. Lett. 5(16): 2837-2839 y Kanai A. y col.

2007 Chem. Pharm. Bull. 55(3):495-599 describen estudios sintéticos contra el inhibidor de la telomerasa D 8646-2-6, aislado de un cultivo deE. purpurascens.

El uso potencial deE. purpurasensse ha informado de cepas como control biológico para el crecimiento fúngico en cultivos (Bhuiyan SA. y col., 2003 Plant Path. 52: 60-67; Mari M. y col., 2007 J. Sci. Food Agric. 87: 1271-1277; Szandala ES y Backhouse D 2001 Aust. Plant Path. 30: 165-170), sin embargo, no se ha mostrado ninguna demostración de un agente de control eficaz debido a un crecimiento y actividad insatisfactoria de cepas de E.purpurascensen condiciones ambientales. Es un objeto de la presente invención abordar los problemas anteriores o al menos proporcionar al público una elección útil.

No se hace admisión de que cualquier referencia citadas en esta memoria descriptiva constituya la técnica anterior. La discusión de las referencias declara lo que sus autores afirman, y los solicitantes reservan el derecho a desafiar la precisión y pertinencia de los documentos citados. Se entenderá claramente que, aunque en la presente memoria se hace referencia a varias publicaciones de la técnica anterior, esta referencia no constituye una admisión de que cualquiera de estos documentos forme parte del conocimiento general común en la técnica, en Nueva Zelanda o en cualquier otro país.

A lo largo de esta memoria descriptiva, se entenderá que la palabra “ comprender” , o variaciones de las mismas, tales como “ comprende” o “ que comprende” , implica la inclusión de un elemento, número entero o etapa indicado, o grupo de elementos enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción que sigue a continuación que se proporciona únicamente a modo de ejemplo.

Descripción de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un uso de un compuesto de fórmula (I):

o una sal, tautómero, estereoisómero, hidrato o solvato del mismo en el tratamiento de una infección fúngica en una planta o parte de la planta de la misma, en donde

R se selecciona del grupo que consiste en:

• C-α-D-galactofuranosa; C-β-D-galactofuranosa; C-α-L-galactofuranosa; or C-β-L-galactofuranosa; C-β-D-galactopiranosa; y C-β-L-galactopiranosa.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para prevenir, eliminar o inhibir una infección fúngica en una planta o parte de la planta de la misma, que comprende la etapa de:

• aplicar a la planta o parte de planta de la misma una cantidad eficaz de tratamiento de una composición que comprende:

• un compuesto de fórmula (I):

o una sal, tautómero, estereoisómero, hidrato o solvato agrícolamente aceptable del mismo, en donde

R se selecciona del grupo que consiste en:

• C-β-D-galactopiranosa; C-α-D-galactofuranosa; C-β-D-galactofuranosa; C-β-L-galactopiranosa; C-α-L-galactofuranosa; y C-β-L-galactofuranosa.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método para prevenir, tratar o mejorar una infección fúngica en una planta o parte de la planta de la misma, que comprende administrar una composición o una solución antimicrobiana a una planta o parte de planta que necesita dicha prevención, tratamiento o mejora, la composición o solución antimicrobiana que comprende:

• un portador agrícolamente aceptable y

• un compuesto antifúngico de fórmula (I):

o una sal, tautómero, estereoisómero, hidrato o solvato del mismo, en donde

R se selecciona del grupo que consiste en:

En la presente descripción se describe una composición agrícola que comprende:

• un portador agrícolamente aceptable y

• un compuesto antimicrobiano de fórmula (I):

en donde

R se selecciona del grupo que consiste en:

• C-β-D-galactopiranosa; C-α-D-galactofuranosa; C-β-D-galactofuranosa; C-β-L-galactopiranosa; C-α-L-galactofuranosa; C-β-L-galactofuranosa; o piranosa relacionada; y

una sal, un derivado, un tautómero, un estereoisómero, un hidrato, un solvato o un análogo del azúcar del mismo. También se describe en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende:

• un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable; y

• un compuesto antimicrobiano de fórmula (I):

en donde

R se selecciona del grupo que consiste en:

• C-6-D-galactopiranosa; C-α-D-galactofuranosa; C-β-D-galactofuranosa; C-β-L-galactopiranosa; C-α-L-galactofuranosa; C-β-L-galactofuranosa; o piranosa relacionada; y

una sal, un derivado, un tautómero, un estereoisómero, un hidrato, un solvato, un análogo de azúcar, un profármaco del mismo.

Preferentemente, la composición está en forma de polvo.

En la presente descripción se describe el uso de un compuesto de fórmula (I):

en donde

R se selecciona del grupo que consiste en:

una sal, un derivado, un tautómero, un estereoisómero, un hidrato, un solvato o un análogo del azúcar del mismo en la fabricación de una composición para el tratamiento de una infección microbiana en una planta o una parte de la planta de la misma.

Preferentemente, la infección microbiana es una infección fúngica.

Preferentemente, la parte de la planta es una planta de cultivo de frutas o una planta de cultivo vegetal.

En la presente descripción se describe el uso de un compuesto de fórmula (I):

en donde

R se selecciona del grupo que consiste en:

una sal, un derivado, un tautómero, un estereoisómero, un hidrato, un solvato, un análogo de azúcar o un profármaco del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la infección microbiana en un animal o una parte animal del mismo.

Preferentemente, el animal es un ser humano.

En el presente documento se describe un método para prevenir, eliminar o inhibir una infección microbiana en una planta o parte de la planta de la misma, que comprende la etapa:

un compuesto de fórmula (I):

en donde

R se selecciona del grupo que consiste en:

una sal, derivado, tautómero, estereoisómero, hidrato, solvato o análogo de azúcar agrícolamente aceptable del mismo.

Preferentemente, el método también comprende la etapa de:

• aplicar a la planta o parte de la planta de la misma una cantidad eficaz de tratamiento de la composición para prevenir o inhibir el crecimiento deBotrytisoLecanicillium.

Preferentemente, la parte de la planta es una fruta o una verdura.

Breve descripción de los dibujos

Otros aspectos de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción que se proporciona solo a modo de ejemplo y con referencia a los dibujos adjuntos en los que:

Figura 1 muestra la estructura química del compuesto conocido orevactaeno;

Figura 2a muestra la estructura química de epipirona A;

Figura 2B muestra la estructura química de los compuestos relacionados con la que se muestra en la Figura 1 en forma de epipirona B y epipirona C;

Figura 3A muestra un espectro de masas para el ion negativo utilizado en la elucidación de la estructura química del compuesto mostrado en la Figura 1;

Figura 3B muestra un espectro de masas para el ion positivo utilizado en la elucidación de la estructura química del compuesto mostrado en la Figura 1;

Figura 4A muestra una disociación inducida por colisión (CID) para el ion negativo utilizado en la elucidación de la estructura química del compuesto mostrado en la Figura 1;

Figura 4B muestra un espectro de disociación inducida por colisión (CID) para el ion positivo utilizado en la elucidación del compuesto mostrado en la Figura 1;

Figura 5A muestra una ruta de fragmentación de iones positivos usados en la elucidación de la estructura química del compuesto mostrado en la Figura 1;

Figura 5B muestra una vía de fragmentación por iones negativos usados en la elucidación de la estructura química del compuesto mostrado en la Figura 1;

Figura 6 muestra un esquema de reacción para la acetilación de los hidroxilos que se usa en la elucidación de la estructura química del compuesto mostrado en la Figura 1; y

Figura 7 muestra un esquema de reacción para la acetilación de los hidroxilos que se usan en la elucidación del compuesto mostrado en la Figura 1;

Figura 8 muestra un cromatograma y un barrido de espectro UV de un extracto de etanol de un cultivo deEpicoccum purpurasens(sin. Cepa E.nigrum SF7489)usando el método de HPLC 1;

Figura 9 muestra un cromatograma y un barrido de espectro UV del extracto de etanol y el cultivo de la Figura 8 usando el método de HPLC 2;

Figura 10 muestra un cromatograma y un barrido del espectro UV de un extracto básico del cultivo de la Figura 8 usando el método de HPLC 1;

Figura 11 muestra un cromatograma y un barrido del espectro UV de un extracto básico del cultivo de la Figura 8 usando el método de HPLC 2;

Figura 12 muestra un cromatograma y un barrido de espectro UV de un extracto ácido del cultivo de la Figura 8 usando el método de HPLC 1; y

Figura 13 muestra un cromatograma y un barrido del espectro UV de un extracto ácido del cultivo de la Figura 8 mediante el uso del método de HPLC 2.

Mejores modos para llevar a cabo la invención

Extracción e identificación del ingrediente activo; Experimento 1

Se configuró un método de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC - High Performance Liquid Chromatography) con detección de matriz de diodos para controlar el pigmento durante la purificación. Se usó el mismo método de HPLC para el análisis de espectroscopía de masas de cromatografía líquida (LCMS).

Se preparó un cultivo de cuatro litros deEpicoccum purpurasens.El cultivo se centrifugó para separar el micelio del sobrenadante acuoso. El análisis por HPLC mostró que un 90 % de epipirona A (como se muestra en la Figura 2A) estaba presente en el micelio y, por lo tanto, se desechó el sobrenadante acuoso. Se liofilizaron los 600 g de micelio para proporcionar 59 g de un polvo marrón. El polvo marrón se extrajo varias veces con metanol produciendo 11,6 g de aceite rojo. El aceite rojo se disolvió en 200 mL de borato de sodio al 0,1 % (pH 9) y se extrajo dos veces con 200 mL de acetato de etilo para eliminar los compuestos neutros y básicos. Todas las fracciones se verificaron por HPLC, no se había extraído epipirona A en la capa de acetato de etilo.

La capa acuosa se acidificó con ácido fosfórico al 85 % a pH 3 y se extrajo el epipirona A con 200 mL de acetato de etilo. Se añadió un poco de etanol para facilitar la separación de las dos capas. El acetato de etilo se retiró por evaporación rotatoria y el peso del residuo seco fue de 1,6 g. El residuo se disolvió en 40 mL de agua que contenía 100 |JL de NH4OH al 25 %.

Una columna empaquetada con resina polimérica Strata x 110 mm x 38 mm se acondicionó con metanol, seguido de acetonitrilo al 60 % (ajustado a pH 2,5 con H3PO4 de dilución) y acetonitrilo al 30 % (pH 2,5). Se diluyeron 2 mL de extracto de 40 mL que contenía epipirona A con 18 mL de acetonitrilo al 30 % (pH 2,5) y se cargaron en la columna. La columna se eluyó con vacío usando el siguiente gradiente de etapa:

200 mL de acetonitrilo al 30 % (pH 2,5)

200 mL de acetonitrilo al 40 % (pH 2,5)

500 mL de acetonitrilo al 50 % (pH 2,5)

700 mL de acetonitrilo al 55 % (pH 2,5)

Las fracciones se recogieron una vez que la banda naranja comenzó a eluir, esto comenzó con un 55 % de acetonitrilo (pH 2,5). En total se recogieron cinco fracciones. Se añadió acetato de etilo a cada una de las cinco fracciones y el pigmento naranja se movió a la capa de acetato de etilo. El análisis por HPLC reveló que el 75 % de epipirona A (aproximadamente 9,6 mg) estaba en las dos primeras fracciones, estas se combinaron y se secaron.

Se acondicionó una columna de 1 g de SPE Si-1 SPE con 10 mL de cloroformo. El residuo seco (que contenía aproximadamente 9,6 mg de epipirona) se disolvió en 5 mL de 5:95 metanol/cloroformo y se cargó en la columna de sílice. La columna fue eluida con 5:95 metanol/cloroformo seguido de 10:90 metanol/cloroformo. Se recogieron un total de nueve fracciones y se analizaron por HPLC. Las fracciones 6 y 7 se combinaron y se secaron en purga por N2. El residuo se disolvió en metanol al 50 % y se cargó en una columna SPE X SPE de 1 g. La columna se lavó con 20 mL de metanol/agua 3:7 para eliminar las partículas finas de sílice y el epipirona A se eluyó con 15 mL de metanol. El metanol se eliminó en porga por N2 y el residuo se colocó bajo alto vacío en un secador libre durante 48 h para eliminar el disolvente residual. El residuo pesó 5,4 mg.

Evaluación de la Pureza

El análisis por HPLC durante la purificación de epipirona A reveló la presencia de al menos dos compuestos estrechamente relacionados epipirona B y epipirona C (como se muestra en la Figura 2B). Además (HPLCDAD), cromatografía líquida con espectroscopía de masas (LC-MS) y resonancia magnética nuclear (RMN).

Los compuestos epipirona B y epipirona C son isómeros a y p-furanosida.

Extracción e identificación del ingrediente activo; Experimento 2

Extracción de etanol

Un cultivo de cepa deEpicoccum nigrumSF7489 se centrifugó a 3000 g durante 10 min para separar el micelio del caldo líquido. El micelio (1200 g) se extrajo dos veces con un total de 1,2L de etanol mediante homogeneización con un mezclador manual. El sólido se eliminó por centrifugación y se retuvo el sobrenadante etanólico. Tanto el caldo líquido que se separó originalmente del micelio como el extracto de etanol de micelio se analizaron por HPLC para identificar y medir las concentraciones del pigmento amarillo usando dos métodos de HPLC diferentes 1 y 2 como a continuación para la comparación (resultados mostrados en la Figura 8 y Figura 9 respectivamente).

Aproximadamente el 15 % del pigmento amarillo estaba en caldo de cultivo líquido. El caldo líquido se combinó con el extracto de etanol para dar 3,6 L de extracto. Se preparó una dilución de 10 veces de esta muestra para el análisis de HPLC. El extracto de etanol se dividió en dos porciones iguales. Se extrajo una porción y se cuantificó usando el método 1 y una porción usando el método 2.

Método de HPLC 1:

Fase móvil A - Ácido acético al 0,1 %; Fase móvil B - Acetonitrilo; Columna - Ascents C8 Express 2,7 pm 50 x 2,1 mm; flujo - 0,5 mL/min; Volumen de inyección - 1 pl; horno de columna -15 °C; Gradiente - 30 % de B a 70 % B durante 5 min, después devolvió a 30 % durante 1 min y se reequilibró durante 2 minutos; Detector - Barrido con matriz de fotodiodos 250-500 nm de cromatograma de extracto a 437 nm.

Se usó un extinción co-eficaz que se estableció a partir de epipirona pura en el método 1 para cuantificar la concentración del compuesto en las diversas muestras.

Método de HPLC 2:

Fase móvil A - NH<4>OH en agua pH10; Fase móvil:B - 1:4 isopropanol/metanol; Columna - Fenomenex Gemini C18 5 pm 150 x 2 mm; Flujo - 2 mL/min; volumen de inyección - 1 pl; horno de columna -15 °C; gradiente - 25 % B a 100 % B durante 12 min, mantenido durante 1 min, después devolvió a condiciones iniciales; 2 min y re-equilibrado para 5 min; Detector - barrido matris de fotodiodos 190-500 nm cromatograma de extracto a 428 nm.

Debido a que no había un extinción de la extinción del método 2, solo se observó en áreas de pico relativas.

Método de HPLC 2:

Extracción de ácido

El volumen del extracto se redujo por evaporación rotatoria hasta 0,8 L. A continuación, se acidificó hasta pH 2,5 con ácido fosfórico. La adición del ácido precipitó el pigmento a medida que el compuesto protonado no es soluble en agua. Después, la solución acidificada se centrifugó a 3000 g durante 10 min. El sobrenadante se probó mediante el método de HPLC 1 (resultado mostrado en la Figura 10) y el método de HPLC 2 (resultado mostrado en la Figura 10) y se encontró que contenía aproximadamente 10 mg del pigmento. El sólido se redisolvió en 80 mL de tampón fosfato 50 mM pH 7,4. Se preparó una dilución de 200 veces de esta muestra para el análisis de HPLC. El resto de la muestra se almacenó a -20 °C.

Extracción de base

El pH de la otra porción del extracto se ajustó a pH10 con NH4OH y se evaporó hasta sequedad por evaporación rotatoria. Esta muestra se disolvió en 80 mL de tampón fosfato 50 mM pH 7,4. Se preparó una dilución de 200 veces de esta muestra para el análisis por HPLC (los resultados del método 1 de HPLC se muestran en la Figura 12 y el método 2 de HPLC los resultados mostrados en la Figura 13). El resto de la muestra se almacenó a -20 °C.

Peso seco de sólidos de cultivo

El micelio extraído con etanol se secó a temperatura ambiente durante la noche, después se secó adicionalmente en un horno a 100 °C durante 3 horas para eliminar el disolvente residual. El peso del micelio seco fue de 16g. El extracto de etanol de la extracción de base se pesó después de la evaporación rotatoria, el extracto pesó 13g. Este fue el extracto solo la mitad del extracto total, por lo tanto el peso total de sólidos en el caldo extracto de etanol fue 26g. El peso total de sólido de 2,5 L de cultivo fue de 42 g que funciona para que fuera 16,8 g de sólidos por litro de cultivo. El peso total del pigmento de color amarillo puro llamado epipirona o epicoccano u orevactaeno extraído de 2,5 L de cultivo fue 250 mg, esto es equivalente a 100 mg/L, esto es consistente con los rendimientos de extracción previa.

Esto significa que la concentración aproximada de epipirona es 0,01 % en el cultivo líquido o 0,6 % del peso seco.

Conclusión

El análisis mediante ambos métodos de HPLC encontró que el pigmento amarillo en el extracto de etanol original y en ambos extractos de muestra ácido y base comparten propiedades cromatográficas y espectrales idénticas. Ambas extracciones produjeron la misma cantidad de este pigmento (120 mg y 130 mg). Por lo tanto, se concluyó que el método de extracción no es crítico ya que ambos métodos produjeron el mismo compuesto y la misma cantidad de compuesto.

Este resultado es similar a las concentraciones de un pigmento similar, beta caroteno, en zanahorias. La concentración de beta caroteno en zanahorias frescas es aproximadamente 0,0008 % y 0,1 % de peso seco. La concentración de caroteno se obtuvo de Wikipedia http://en.wikipedia.org/wiki/Carrots y el contenido de agua de las zanahorias se obtuvo de la Universidad de Kentucky http://www.ca.uky.edu/enri/pubs/enri129.pdf.

Elucidación estructural del ingrediente activo

Espectroscopía de RMN

Para el análisis de RMN, la muestra purificada como se describió anteriormente se disolvió en CD3OD.

Las estructuras del ácido 3,5,7,9,11,13-tetradecahexaenoico, 2-(2,4-dimetilhexiliden)-14-(3-β-D-galactopiranosil-4-hidroxi-2-oxo-2H-pirano -6-il)-4-metil (epipirona A), ácido 3,5,7,9,11,13-tetradecahexaenoico, 2-(2,4-dimetilhexiliden)-14-(3-a-D-galactofuranosil- 4-hidroxi-2-oxo-2H-piran-6-il)-4-metil (epipirona B) y ácido 3,5,7,9,11,13-tetradecahexaenoico, 2-(2,4-dimetilhexiliden)- 14-(3-β-D-galactofuranosil-4-hidroxi-2-oxo-2H-piran-6-il)-4-metil (epipirona C) se elucidaron utilizando 1H, 13C, mejora sin distorsión mediante transferencia de polarización (135DEPT), correlación cuántica simple heteronuclear (HSQC), correlación de enlaces múltiples heteronucleares (HMBC), espectroscopia de correlación (COSY), espectroscopia de correlación total (TOCSY), espectroscopia de efecto overhauser de marco giratorio (ROESY), espectroscopia de efecto overhauser nuclear (NOESY), espectroscopia selectiva de correlación total (SELTOCSY) y experimentos de espectroscopia selectiva de efecto overhauser de marco giratorio (SELROESY). Los datos de<r>M<n>se presentan en la Tabla 1 a continuación.

Los desplazamientos químicos en CD3OD para epipirona A fueron similares a los indicados por Shu y col. para orevactaeno en DMSO-d6. Algunos de los cambios químicos de 1H fueron significativamente diferentes, esto se explica por el disolvente utilizado para el análisis (CD3OD vs DMSO-d6).

El espectro de HMBC muestra las conectividades entre H1' y C1, C2, C3, C2', C3' y R5'. La correlación entre H1' y R5' muestra que los dos átomos están dentro de 2-3 longitudes de unión. Los desplazamientos químicos de C1' a C6' son consistentes con un solo enlace de oxígeno para cada carbono y, por lo tanto, C1' y R5' se conectan más probablemente por el enlace éter. Estas observaciones mostraron que el residuo de pirósido estaba unido a C2 en el anillo de pirona a través de C en lugar de un enlace O-piranósido.

Las constantes de acoplamiento de H1'-H2'y H2'-H3' grandes del orden 9-10 Hz son consistentes con la estructura de piranósido propuesta. Los experimentos de ROESY selectivos 1D muestran correlaciones entre H1' y H3', H1' y H5', así como H3' y H5'. Se usaron experimentos 1D-SELTOCSY con diferentes tiempos de mezcla para confirmar los desplazamientos químicos y las rutas de correlación de H1' a H6'. En combinación, estos experimentos mostraron que el anillo de piranosa está en la confirmación preferida de la silla y el 4'-OH está orientado axialmente mientras que el acoplamiento H1'-H-2' (J = 9,7 Hz) muestra que la unidad de C-piranosa es beta unida a la pirona. Estos hallazgos condujeron a la identificación de la estructura de epipirona A como p-C-D-galactopiranosida.

Las estructuras también podrían asignarse a los dos isómeros menores epipirona B y epipirona C presentes en la misma muestra. Sobre la base de las correlaciones HMBC y ROESY se encontró que eran antagonistas a y p de C-D-galactofuranosidas en lugar del compuesto de piranosida epipirona A (véase la Tabla 2).

Espectrometría de masas

En modo iónico negativo, se observó un ion molecular fuerte [M-H]-m/z 611,3 con una pequeña pérdida de CO2 (44 amu) m/z 567,3 pico (Figura 3A). En modo de iones positivos, un [M+H] m/z 613,3 y un [M+Na] m/z 635,3 fueron los iones moleculares predominantes observados (Figura 3B).

Experimentos de disociación inducida por colisión (CID) en modo de iones negativos revelaron los fragmentos prominentes m/z 403, 447, 491 y 521 (Figura 4A) y en iones positivos una serie de pérdidas de agua y m/z 569, 545, 539, 515 y 485 (Figura 4B). Las vías de fragmentación propuestas de epipirona A tanto en modo iónico positivo como negativo se muestran en la Figura 5. La vía de fragmentación propuesta muestra que el anillo de pirona está intacto y es consistente con la estructura propuesta de epipirona A.

Química de la reacción en microescala

Experimento de acetilación

Una submuestra de compuesto epipirona A se disolvió en una mezcla de 900 pL de diclorometano, 50 pL de anhídrido acético y 50 pL de piridina. La reacción se controló mediante barrido de iones positivos LC-MS. El análisis de la muestra mostró una mezcla de compuestos acetilados con la adición de 2 a 5 acetatos que indican la presencia de al menos cinco hidroxilos. Esto es consistente con la estructura propuesta de epipirona A (Figura 5).

Experimento de metilación

Una submuestra de compuesto epipirona A se disolvió en 200 pL de MeOH 5 pL de H2SO4. La reacción se controló mediante barrido de iones positivos LC-MS. La esterificación fue lenta a temperatura ambiente, por lo que la muestra se calentó a 50 °C durante 2 horas, lo que dio como resultado una conversión del 60 % en un solo éster metílico. Esto indica que un carboxílico está presente y es consistente con la estructura propuesta de epipirona A (Figura 6).

Para los fines de la memoria descriptiva, la realización preferida de la estructura del compuesto epipirona A 4-hidroxi-6-(11',15',17'-trimetil-13'-carboxi-nonadeca-1',3',5',7',9',11',13'-hepteno)-2-pirona-1-C-galactopiranosida se denominó epipirona A.

Demostración de actividad biológica: Ensayo de estimulación con extracto de Epicoccum nigrum

Materiales

Una muestra deEpicoccum purpurasens(sin.nigrumcepa SF7489) se preparó extrayendo 1 L de cultivo con 1 L de etanol, después los sólidos se eliminaron por filtración y el líquido se retiró por evaporación rotatoria. El residuo se resuspendió en 25 mL de agua. Se diluyó una submuestra y se analizó mediante HPLC para determinar la concentración de Epipirona. Se midió que la concentración de Epipirona era de 3,4 mg/mL.

La solución de 25 mL se dividió en alícuotas en 5 viales y se congeló.

Método

Botrytis cinereacepa ICMP 16221 se cultivó en PDA (agar de dextrosa de patata) para obtener esporas.

Botrytis cinereacepa ICMP 16221 se cultivó en PDA (agar de dextrosa de patata) para obtener esporas.Lecanicillium muscariumK4 V1 se cultivó en SA (Sabourard Agar) para obtener esporas. Se introdujo Epipirona en soluciones de esporas de 2 ml del B.cinereayL. muscariuma las siguientes concentraciones en tubos de ensayo esterilizados, se incubaron durante 48 horas a 26 °C. A continuación, las soluciones se examinaron bajo el microscopio para signos de germinación de esporas.

1. Control: Solución de esporas sin Epipirona;

2. Neto: Soluciones de esporas mezcladas con concentración de extracto sin diluir de Epipirona (3,4 mg/mL = 3400 mg/L);

3. Solución de esporas diluida a la concentración de Epipirona 1000 mg/L;

4. Solución de esporas diluida a la concentración de Epipirona 500 mg/L;

5. Solución de esporas diluida a la concentración de Epipirona 250 mg/L; y

6. Soluciones de esporas diluidas a la concentración de Epipirona 125 mg/L.

Resultados

El grado de crecimiento de esporas en cada uno de los 6 tubos de ensayo se muestra en la tabla a continuación:

Conclusión

La inhibición del crecimiento de esporas se demostró con concentraciones de Epipirona de más de 250 mg/L.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Uso de un compuesto de fórmula (I):

o una sal, tautómero, estereoisómero, hidrato o solvato del mismo en el tratamiento de una infección fúngica en una planta o parte de la planta de la misma, en donde R se selecciona del grupo que consiste en: •C-α-D-galactofuranosa; C-β-D-galactofuranosa; C-α-L-galactofuranosa; C-β-L-galactofuranosa; C-β-D-galactopiranosa; y C-β-L-galactopiranosa.
2. El uso según la reivindicación 1, en donde la parte de la planta es una planta de cultivo de frutas o una planta de cultivo vegetal.
3. Un método para prevenir, eliminar o inhibir una infección fúngica en una planta o parte de la planta de la misma, que comprende la etapa de: •aplicar a la planta o parte de planta de la misma una cantidad eficaz de tratamiento de una composición que comprende: •un compuesto de fórmula (I):

o una sal, tautómero, estereoisómero, hidrato o solvato agrícolamente aceptable del mismo, en donde R se selecciona del grupo que consiste en: •C-6-D-galactopiranosa; C-α-D-galactofuranosa; C-β-D-galactofuranosa; C-β-L-galactopiranosa; C-α-L-galactofuranosa; y C-β-L-galactofuranosa.
4. El método según la reivindicación 3, en donde el método también comprende la etapa de: •aplicar a la planta o parte de la planta de la misma una cantidad eficaz de tratamiento de la composición para prevenir o inhibir el crecimiento deBotrytisoLecanicillium.
5. El método según la reivindicación 4, en donde la parte de la planta es una fruta o una verdura.
6. Un método para prevenir, tratar o mejorar una infección fúngica en una planta o parte de la planta de la misma, que comprende administrar una composición o una solución antimicrobiana a una planta o parte de la planta que necesita dicha prevención, tratamiento o mejora, la composición o solución antimicrobiana que comprende: •un portador agrícolamente aceptable y •un compuesto antifúngico de fórmula (I):

o una sal, tautómero, estereoisómero, hidrato o solvato del mismo, en donde R se selecciona del grupo que consiste en: •C-β-D-galactopiranosa; C-α-D-galactofuranosa; C-β-D-galactofuranosa; C-P-L-galactopiranosa; C-α-L-galactofuranosa; y C-β-L-galactofuranosa.