RO126736B1 - Tulpini de botrytis cinerea producătoare de elicitori fungici, produs pentru imunizarea plantelor de căpşun contra agenţilor putregaiului cenuşiu şi metodă de aplicare - Google Patents

Description

Invenția se referă la trei tulpini fitopatogene virulente de Botrytis cinerea, care se dezvoltă simultan în mediu lichid de creștere, la compoziția unui produs pentru imunizarea plantelor de căpșun, și la metoda de aplicare a acestuia în tratamentul preventiv al putregaiului cenușiu la căpșun.

Prezența căpșunelor ca produse alimentare, la nivel mondial, s-a redus în fiecare an din cauza bolilor, a întârzierilor de creștere și a reducerii numărului de fructe la plantele infectate.

Clasic, combaterea bolilor la plantele de căpșun a constat în acoperirea lor cu substanțe toxice care au împiedicat dezvoltarea agenților patogeni, în special a fungilor, care pătrund în plantă direct și/sau prin deschiderile naturale, cum ar fi stomatele. Ulterior, s-au aplicat fungicide chimice sistemice pentru a distruge infecțiile fungice ale plantelor de căpșun. Majoritatea substanțelor chimice folosite în combaterea bolilor la căpșun sunt dăunătoare mediului și sunt toxice numai pentru o gamă limitată de agenți patogeni. O protecție mai largă a culturii de căpșun s-a realizat prin aplicarea de substanțe chimice multiple sau reaplicarea produselor în timpul unui sezon de creștere, în cazul în care produsele chimice sunt spălate. Astfel acestea se acumulează în sol și în produsele alimentare destinate consumului uman, cu efecte în domeniul patologiei umane, dar și al poluării mediului.

O altă modalitate clasică de a controla agenții patogeni constă în utilizarea de soiuri de căpșun rezistente la boli, dar soiurile rezistente la boli nu au randament sau calitate superioară celor nerezistente. în plus, agenții patogeni reprezintă tulpini distincte și, din această cauză, un soi de căpșun are un spectru de rezistență redus. Sensibilitatea la boli a plantelor de căpșun nu este sinonimă însă cu absența mecanismelor de rezistență din codul lor genetic.

Cercetările recente au stabilit faptul că plantele au capacitatea de a dezvolta rezistență sistemică la boli, rezistență care poate fi indusă. Sub multe aspecte sistemul de apărare al plantelor este comparabil cu răspunsul în cazul vaccinării la oameni, deoarece căile de semnalizare s-au conservat în timpul evoluției acestora.

Plantele au dezvoltat în timp procese sofisticate de activare a mecanismelor de inducere a imunității sistemice. Răspunsul de rezistență sistemică în plante poate fi împărțit în linii mari în rezistență sistemică dobândită și rezistență sistemică indusă. Deși sunt fiecare eficace împotriva unei game largi de agenți patogeni, răspunsurile lor sunt specifice pentru diferite clase de agenți patogeni. Fiecare cascadă de semnalizare este indusă și transmisă prin combinații ale diferitelor molecule de semnalizare.

Sistemul de apărare al plantei presupune o interacțiune complexă pentru recunoașterea anticipată a evenimentelor patogene generatoare de semnale care sunt recunoscute și transmise de la locul de inoculare intra- și intercelular către întreaga plantă. Aceste semnale declanșează o serie de reacții de apărare indusă, cu scopul de a bloca sau chiar de a ucide agentul patogen invadator. Multe dintre reacțiile de apărare ale plantelor sunt controlate la nivel genetic, motiv pentru care multe studii au fost realizate în acest domeniu. Spre exemplu, sunt documente în care creșterea rezistenței plantei s-a realizat pe baza procedeelor de manipulare genetică: DE 4234131 (A1), US 2002004944 (A1), US 20030192075, DE 202006009259 (U1), MX 200700090 (A), US 20100011468 și US 2010122374 (A1).

Rezistența sistemică a fost indusă la cereale (orz, porumb, ovăz, orez și grâu), cucurbitacee (castravete și pepene verde), leguminoase (fasole, mazăre și soia), solanacee (piper, cartofi, tutun și roșii), fructe (pere, struguri, piersici, prune și mere) și alte plante (sfeclă, cafea, ridiche, garoafă), pentru a proteja plantele de o varietate de agenți patogeni pe frunze și rădăcină.

RO 126736 Β1

Rezistența la boli poate fi indusă în plantele de căpșun aparent sensibile, prin 1 inoculare cu formele avirulente, hipovirulente de agenți patogeni ai plantelor, metaboliți sau compuși extrași din biomasa fungică, prin inocularea restricționată cu agenții lor patogeni sau 3 cu agenți patogeni nespecifici.

Detectarea agentului patogen are loc cât mai aproape posibil de suprafața plantei. 5 De la locul atacului, semnale secundare sunt răspândite peste tot în plantă. Activarea poate fi mediată prin mecanisme multiple ce asigură rezistența la boli. Primele reacții ale unei 7 celule de plantă atacată constau în producerea de radicali de oxigen activ și autodistrugerea completă a unui număr limitat de celule din jurul unei infecții localizate. Informațiile cele mai 9 numeroase privind această succesiune de semnale se referă la prezența semnalelor electrice, a acidul salicilic, a fitoalexinelor. Produsele de degradare a peretelui celular al 11 agentului patogen care atacă, precum și fragmente din celula vegetală aflată sub atac sunt printre cele mai bune semnale de alarmă descrise. 13

Reacțiile de apărare, care sunt activate de semnalele de alarmă primite, acoperă un spectru larg de substanțe chimice, biochimice, dar și mecanice. Componentele rezistenței 15 sistemice induse includ atât acumularea de agenți antimicrobieni, cât și formarea unor bariere fizice. Astfel, se manifestă procesele de lignificare, suberificare, de formare a calozei, 17 acumulări de aglutinine, apar inhibitori enzimatici, glicoproteine și hidxoxiprolină, în zonele distale punctului în care un agent patogen încearcă să pătrundă în plantă. Un alt mecanism 19 al inducerii rezistenței sistemice în plante este considerat cel de formare a enzimelor hidrolitice (cum ar fi chitinazele, P-1,3-glucanazele, proteazele), a altor proteine legate de 21 patogeneză, precum peroxidazele. Chitinazele plantei sunt raportate a fi inhibitori potențiali ai creșterii fungice și, în combinație cu β-1,3-glucanaza, atacă o serie de ciuperci. Prezența 23 chitinazelor și a β-1,3-glucanazelor poate fi indusă coordonat într-un număr de țesuturi ale plantei de atacul agentului patogen, cât și de prezența moleculelor semnal. 25

S-a cercetat proprietatea de a acționa asupra sistemelor naturale de apărare ale plantelor de către substanțele chimice anorganice reprezentate de mercur, cupru, ionii de 27 aluminiu, acizii arahidonic, fosforic, salicilic, fulvici și humici, iar dintre cele organice, oligozaharidele de origine vegetală, reprezentate de oligoglucani, oligochitină, oligochitosan, 29 oligogalacturonide, enzime de tipul celulazei, polipeptide, glicoproteine și aminoacizi. Rezultatele sunt prezentate în lucrările autorilor: Boiler et al. (1995; Annu Rev Plant Physiol 31 Mol Biol.), Darvill și Albersheim (1984, Annu Rev Plant Physiol), Cote etal. (1994, Plant Mol Biol), Pearce et al. (1982, Physiol Plant Pathol), Ren et al. (1992, Physiol Plant), Boland et 33 al. (1997, FEBS), Kldsener et al. (1999, FEBS), Anderson et al. (1989), Ebel et al. (1995, Can. J.), Boiler etal. (1995, Annu Rev Physiol Plant Mol Biol), Coleman etal. (1992, Physiol 35 Mol Plant Pathol), Kogel et al. (1988, Physiol Mol Plant Pathol), Baker et al. (1993, Plant Physiol), Hanson et al. (2000, Phytopat), Benhamou et al. (2000, Plant Physiol.), Parker et 37 al.( 1991, Mol-PlantMicrobInteract), Nurnbergeretal. (1994, Ce//), Sacks etal. (1995, Genet Gen Mol), Pearce et al. (1993, J. Biol Chem), Boissy et al. (1996, Structure), Ricci et al. 39 (1992, Plant Pathol), Kamoun et al. (1994, Appl Environ Microbiol), Wit et al. (1997, MolPlant Microb Interact), Kamoun et al. (1993, Mol-Plant Microb Interact), Siegrist et al. (2000, 41

Physiol Mol Plant Pathol).

Cercetările informaționale privind efectele unor tipuri de molecule semnal 43 (oligopeptide, acid ganoderic, oligozaharide, glicoproteine, lipide, melanine, acid manuronic, glucoză, galactoză, difenil eter de acid β-aminobutiric sau acid β-amino valeric, xantan, β 45 oligo 1-3 glucani etc.) asupra plantelor, mediile speciale de creștere a fungilor, compușii rezultați în plantă în urma acțiunii moleculelor semnal, modul de aplicare a produselor sau 47 tipul de patogeni asupra cărora se manifestă efectul sunt exemplificate în cadrul unor

RO 126736 Β1 documente precum: US 5830919, US 5888501 (A), US 6387847, US 2004033902 (A1),

US 2006148710 (A1), US 20060178270, UA 29953 (U), CN 101358179 (A), CN 101353676 (A),

FR 2922412 (A1) și US 7682615.

US 6326016 prezintă un agent de inducere a rezistenței plantelor împotriva microorganismelor fitopatogene, prin utilizarea unui extract din biomasa fungică a unui microorganism nepatogen.

G. Cogălniceanu, M. Mitoi, F. Helepciuc, M. Matei, S. Matei, în lucrarea Biochemical changes induced in regenerants ofFragaria XAnanassa Duch. by the in vitro treatment with fungal elicitors, Romanian Biotechnological Letters, voi. 15, nr. 4, pp. 5512-5518, august 2010 - prezintă tratarea in vitro a unor plante de căpșun cu elicitori fungici obținuți:

a) din tulpina de Botrytis cinerea BcF1 (E1),

b) dintr-un amestec de tulpini de Botrytis cinerea BcF1, BcF7, BcS1 și BcP2 (E2),

c) dintr-un amestec de tulpini de Trichoderma viride și Penicilium chrysogenum (E3) sau

d) dintr-un amestec de tulpini de Botrytis cinerea,Trichoderma viride și Penicilium chrysogenum BcF1, BcF7, BcS1, BcP2, TvP456, TvP1, ThP8, PcA2 (E4).

FR 2799935 A1 descrie un procedeu de stimulare a reacției de apărare naturală a plantelor, de exemplu, împotriva Botrytis. Căpșunele nu sunt menționate în mod explicit. Acest procedeu cuprinde aplicarea la nivelul frunzelor, rădăcinii sau prin injectarea plantelor cu cel puțin o enzimă de tip celulază, P-1,3-glucanază, xilanază, galactanază, manază, chitinază, sau cu o peptidă neenzimatică, ce se obțin pornind de la microorganisme fungice (de exemplu, Trichoderma, Penicillium sau Aspergilus) sau bacteriene.

V. Repka, Early defence response induced by two disctinct elicitors derived from Botrytis cinerea, Biologia Plantarum, voi. 50, nr. 1, pp. 94-106, 2006 - dezvăluie o tulpină de Botrytis cinerea izolată din vie, din care sunt obținuți doi elicitori: cinereină și botrycină.

Prin această invenție se urmărește problema combaterii bolilor la plantele de căpșun cu produse nepoluante pentru mediu, cât și îmbogățirea arsenalului ecologic utilizatîn creșterea randamentului acestor culturi.

în comparație cu rezultatele obținute în diferite cercetări în domeniul inducerii rezistenței sistemice la plante, prezenta invenție își propune să ofere o compoziție de molecule semnal care să crească capacitatea de reacție a plantelor de căpșun prin stimularea receptorilor specifici implicați în declanșarea reacției sistemice de apărare a plantei față de fitopatogenul Botrytis cinerea.

Moleculele semnal provin de la trei tulpini noi de Botrytis cinerea, extrem de virulente, nemodificate genetic,care, conform invenției, sunt:

Tulpina de Botrytis cinerea, BcS1, depozitată cu numărul P999 la Microbial Străin Collection of Latvia, University of Latvia, pe 13.09.2010, care prezintă colonii alb cenușii lânoase cu rari scleroți negri pe mediul Czapek, colonii cenușii cu numeroși scleroți negri pe mediul cu cartof, dextroză, agar, conidiofori bruni, septați, lungi, ramificați intercalar sau apical, conidii netede, neseptate, hialine spre galben brun obovoide cu hilul protuberant și capacitatea de a produce enzime cu rol elicitor de tip chitinaze, P-1,3-glucanaze, poli-fenol oxidaze, fenil-alanina-amoniu liaze și peroxidaze.

Tulpina de Botrytis cinerea, BcP2, depozitată cu numărul P1000 la Microbial Străin Collection of Latvia, University of Latvia, pe 13.09.2010, care prezintă colonii dense lănoase, cenușiu închis cu numeroși scleroți negri, conidiofori înalți, subțiri, bruni, septați, netezi, cu ramificații intercalare care poartă capete conidiale, conidii netede, neseptate, hialine spre brun deschis, ovoide sau subgloboase, hilul slab protuberant și capacitatea de a produce enzime cu rol elicitor de tip chitinaze, P-1,3-glucanaze, poli-fenol oxidaze, fenil-alaninaamoniu liaze și peroxidaze.

RO 126736 Β1

Tulpina de Botrytis cinerea BcF7, depozitată cu numărul P1001 la Microbial Străin 1

Collection of Latvia, University of Latvia, pe 13.09.2010, care prezintă colonii hialine inițial, deschise la culoare în centru, lânoase și cu nuanțe brune spre margini, cu scleroți negri 3 dezvoltați în număr moderat, conidiofori înalți, bruni, netezi, septați, ramificați neregulat, cu capete conidiale apicale și intercalare, conidii brune deschis, netede, neseptate, elipsoidale 5 până la obovoide, cu hil protuberant și capacitatea de a produce enzime cu rol elicitor de tip chitinaze, β-1,3- glucanaze, poli-fenol oxidaze, fenil-alanina-amoniu liaze și peroxidaze. 7

Produsul pentru inducerea reacției de apărare a plantelor de căpșun împotriva fitopatogenului Botrytis cinerea este un ultrafiltrat format din exometaboliții cu rol elicitor din 9 domeniul molecular 5000...2000 kDa, care sunt eliberați în mediul de creștere de către amestecul tulpinilor fungice de Botrytis cinerea BcS1, BcP2, BcF7, în prezența biomasei 11 vegetale de căpșun, și conține: 1,06...22,67 mg/l proteine solubile totale, 1,98...19,39 mg/l glucide reducătoare totale, 0,01...0,4485 pg/l flavonoide totale, 39,42...336,51 mg/l polifenoli 13 totali, 0,637...0,513 U/ml pectin liază, 0,423...0,627 U/ml chitinază, 0,012...1,98 U/ml celulază, 0,018-0,940 U/ml carboximetilcelulază, 1,109...7,092 U/ml β-1,3 glucanază, 15

456.19.. .467.79 mmol/100 ml conținut total aminoacizi, 28,81...38,54 nmoli/100 ml asparagină, 28,55...30,56 nmoli/100 ml glutamină, 40,92...61,28 nmoli/100 ml serină, 17

5.66.. .13.21 nmoli/100 ml histidină, 22,98...45,25 nmoli/100 ml glicină,

25.21.. .43.04 nmoli/100 ml treonină, 35,71...50,12 nmoli/100 ml alanină,19

99.93.. .126.24 nmoli/100 ml arginină, 7,37...9,24 nmoli/100 ml tirozină,

38,06...38,78 nmoli/100 ml valină, 9,67...19,43 nmoli/100 ml metionină,21

11.59.. .31.29 nmoli/100 ml fenilalanină, 14,43...19,44 nmoli/100 ml izoleucină,

21,00...29,03 nmoli/100 ml leucină, 0,99...17,45 nmoli/100 ml lizină.23

Metoda de aplicare a produsului constă în aceea că se administrează preventiv pe plantă sau în sol, în 4 tratamente succesive, de două ori cu produsul concentrat la un interval 25 de 4 zile și de două ori cu produsul diluat la 50% la un interval de 2 zile, câte 40...60 ml/m², prin pulverizare fină cu grad de dispersie de 60...80 μ pe plantă, sau în apa de irigație, iar 27 după aplicarea tratamentului nu este necesară repetarea lui în cursul sezonului de vegetație.

Invenția prezintă următoarele avantaje:29

- tulpinile utilizate în realizarea produsului sunt noi, nu sunt modificate genetic, prezintă o relativă stabilitate genetică;31

- stabilitatea genetică a tulpinilor selecționate permite obținerea unui produs cu proprietăți constante în condițiile menținerii parametrilor fizico-chimici;33

- izolatele au fost obținute de pe produse naturale diferite, asigurându-se și prezența unor particularități genetice;35

- tulpinile utilizate produc exometaboliți care intră în compoziția produsului și sunt compuși biotici, naturali, care nu prezintă efect inhibitor asupra microbiotei filosferice sau 37 edafosferice, nu modifică biodiversitatea specifică de la aceste niveluri, sunt netoxici pentru plantă, nepoluanți pentru mediu; 39

- nu introduce specii noi în biotop;

- producerea compușilor specifici cu rol de semnal inductor la căpșun este numai 41 rezultatul stimulării în cultură a caracteristicilor de concurență și virulență tulpinală;

- compușii activi obținuți, prin diversitate și complexitate, se adresează unui spectru 43 larg al receptorilor implicați în inducerea mecanismelor de rezistență sistemică la căpșun;

- aplicarea produsului de inducere a reacției sistemice de apărare a plantei nu 45 necesită condiții speciale, nu necesită rănirea plantei, iar căile de pătrundere în plantă sunt cele naturale, utilizate și în procesele fiziologice normale de respirație, transpirație, absorbție; 47

RO 126736 Β1

- aplicarea produsului se face prin dispersie avansată, fapt ce permite acoperirea unor suprafețe mari, un consum eficient, pierderi reduse, inducerea reacției imune fiind posibilă atât în cazul admnistrării pe plantă, cât și în sol;

- produsul conține cantități foarte mici de compuși activi, dar care sunt suficiente pentru a sensibiliza membrana citoplasmatică;

- nu utilizează biomasa fungică și nici procedee tehnice de prelucrare a acesteia;

- efectul produsului asupra plantei este sistemic, se menține în timp, schimbarea gradului de umiditate în sol sau în atmosferă neinfluențând decât parțial reacția plantei sub acest aspect, ca urmare, nu este necesară repetarea aplicării lui după precipitații;

- aplicarea produsului nu influențează calitatea biologică a fructelor de căpșun, ci capacitatea de rezistență la infectare a fructelor depozitate, în absența aplicării de conservanți, deci asigură protecția pentru planta întreagă, cu efecte care se extind post-recoltare;

- produsul prezintă compatibilitate ecologică cu alte produse care îndeplinesc cerințele de obținere a etichetei de utilizare în agricultura ecologică;

- asigură protecție împotriva agenților patogeni care nu pot fi controlați prin metode clasice, în special este util față de acei patogeni care prezintă rezistență la pesticidele chimice;

- produsul funcționează prin intermediul mecanismelor de bază ale plantei mai bine decât printr-un atac direct asupra organismului patogen, și fără efecte asupra organismelor nepatogene;

- aplicarea lui poate fi asociată cu strategiile clasice (fungicide) pentru a oferi o mai bună acoperire protectivă;

- asigură compatibilitatea cu aplicațiile de reintrare în circuit din agricultura durabilă.

Prezentarea pe scurt a figurilor:

- fig. 1 - tulpina BcS1 de Botrytis cinerea în cultură;

- fig. 2 - tulpina BcP2 de Botrytis cinerea în cultură;

- fig. 3 - tulpina BcF7 de Botrytis cinerea în cultură;

- fig. 4 - procentul de atac din totalul suprafeței foliare la soiul Elsanta în experiența de evaluare a efectului aplicării pe plantă a filtratului E2;

- fig. 5 - nivelul activității enzimelor POX și PAL în plantele de căpșun cultivate în seră, pentru evidențierea efectului produsului pe bază de elicitori fungici. Variante experimentale: M1 - martor căpșun Marmolada; P1 - tratament pe plantă; P2 - tratament la sol; M2 - martor căpșun Elsanta; P3 - tratament pe plantă; P4 - tratament la sol; P5 - căpșun Marmolada - tratament pe plantă cu E1; P6 - căpșun Marmolada - tratament la sol cu E1; P7 - căpșun Elsanta - tratament pe plantă cu E1; P8 - căpșun Elsanta - tratament la sol cu E1; P9 - căpșun Marmolada - tratament pe plantă cu E2; P10 - căpșun Marmolada - tratament la sol cu E2; P11 - căpșun Elsanta - tratament pe plantă cu E2; P12 - căpșun Elsanta tratament la sol cu E2; P13 - căpșun Marmolada - tratament pe plantă cu E3; P14 - căpșun Marmolada - tratament la sol cu E3; P15 - căpșun Elsanta - tratament pe plantă cu E3; P16 căpșun Elsanta - tratament la sol cu E3; P17 - căpșun Marmolada - tratament pe plantă cu E4; P18 - căpșun Marmolada - tratament la sol cu E4; P19 - căpșun Elsanta - tratament pe plantă cu E4; P20 - căpșun Elsanta - tratament la sol cu E4;

- fig. 6 - procentul de atac din totalul suprafeței foliare la soiul Senga Sengana în experiența de câmp pentru evaluarea efectului aplicării pe planta (A) și în sol (B) a filtratului E2, simplu și în combinație cu fungicide.

Prezenta invenție se ilustrează prin următoarele exemple:

Exemplul 1. Plantele nemodificate genetic reacționează la atacul patogenilor în funcție de tipul și intensitatea “semnalelor pe care aceștia le emit.

RO 126736 Β1

Pentru obținerea unor semnale puternice au fost selectate, din peste 38 de tulpini 1 fungice, 3 izolate pe baza gradului ridicat de infectivitate al plantelor și al fructelor de căpșun, stabilit în urma testelor în laborator și în condiții controlate. 3

Tulpinile selectate provin din medii diferite (sol agricol aflat sub cultură de căpșun, fructe, plante de Eustoma grandiflorum), asigurându-se și unele particularități genetice. 5 Selecția tulpinilor nemodificate genetic aduce avantajul unei relative stabilități genetice în timp, în condițiile utilizării lor. 7

Calitățile tulpinilor selecționate influențează caracteristicile finale ale produsului prin influența indusă în timpul creșterii în cultură. 9

Tulpinile fungice selecționate de Botrytis cinerea sunt: BcS1, BcP2, BcF7.

Botrytis cinerea, tulpina BcS1, a fost izolată din sol agricol aflat sub cultură de 11 căpșun, de la Băiculești, județul Argeș. încadrarea taxonomică a tulpinii de Botrytis cinerea este Filum Ascomycota, subfilum Pezizomycotina, clasa Leotiomycetes, ordinul Helotiales, 13 familia Sclerotiniaceae, genul Botryotinia, specia Botrytiscinerea sau Botryotinia cinerea (De Bary) Whetzel (fig. 1, tulpina BcS1 de Botrytis cinerea). 15

Descriere:

Tulpina BcS1 este depozitată cu numărul P999 la Microbial Străin Collection of 17 Latvia, University of Latvia, pe 13.09.2010.

Ciuperca, incubată pe PDA la 25°C, dezvoltă colonii lânoase de culoare alb cenușie, 19 cu numeroși scleroți negri. Rata de creștere este de 0,935 mm/h.

Prezintă conidiofori bruni, netezi lungi septați, cu grosimi de 10,91...14,31 pm, 21 ramificați intercalar sau cel mai adesea apical.

Celulele conidiogene terminale umflate produc simultan numeroase blastoconidii pe 23 denticuli scurți. Conidiile netede, neseptate, hialine până la galben-maronii au formă obovoidă, cu hilul protuberant și dimensiuni de 9,70...14,86 x 8,09...10,74 pm. 25

Scleroții negri au diametrul de 2...5 mm și formă variabilă.

Originea izolatul este un sol agricol din județul Argeș, România.27

Testele au dovedit capacitatea de a produce enzime: chitinaze (0,001 ...0,015 U/ml),

P-1,3-glucanaze (2,46...21,16 U/ml), poli-fenol oxidaze (0,100...0,120 U/ml), fenil-alanin- 29 amoniuliaze (0,317...0,811 U/ml) și peroxidaze (0,129...0,398 U/ml).

Denumirea taxonomică:31

Botrytis cinerea Pers, ex Fr, stadiul conidial al Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel SYN. Sclerotinia fuckeliana (de Bary) Fuckel33

Mediu:

Cultivarea pe PDA (cartofi-dextroză-agar), Merk, ord. no. 10130.0500, 39 g/l mediu 35 de cultură, pH 5,6 ± 0,2, autoclavat 15 min la 121°C.

Condițiile de depozitare:37

Culturi pure în eprubete cu mediul PDA înclinat, la 2...5°C.

Condiții de testare a viabilității:39

Incubare pe mediul de cultură PDA, pH 5,6 ± 0,2 la 22...25°C.

Botrytis cinerea, tulpina BcP2, a fost izolată de pe plante de Eustoma grandiflorum. 41 încadrarea taxonomică a tulpinii de Botrytis cinerea este Filum Ascomycota, subfilum Pezizomycotina, clasa Leotiomycetes, ordinul Helotiales, familia Sclerotiniaceae, genul 43 Botryotinia, specia Botrytis cinerea sau Botryotinia cinerea (De Bary) Whetzel (fig. 2, Tulpina BcP2 de Botrytis cinerea). 45

Descriere:

Tulpina BcP2 este depozitată cu numărul P1000 la Microbial Străin Collection of 47 Latvia, University of Latvia, pe 13.09.2010.

RO 126736 Β1

Coloniile pe mediul PDA la 25°C sunt dense, lânoase, inițial deschise la culoare, apoi gri închis, cu numeroși scleroți negri cu aranjament caracteristic. Rata de creștere este de 1,180 mm/h.

Conidioforii bruni, cu pereți netezi, suntseptati, au până la 2 mm lungime, grosimea de 12,77...16,88 pm, cu ramificații intercalate care poartă capete conidiale.

Conidiile neseptate, netede, hialine până la brune deschis, ovale sau subgloboase, mici, au hilul protuberant și dimensiuni de 9,63...13,28 x 5,97...10,25 pm.

Scleroții de culoare închisă sunt bine dezvoltați și au 2...7 mm în diametru.

Originea izolatului este din plante de Eustoma grandiflorum din România.

Testele au dovedit capacitatea de a produce enzimele: chitinaze (0,005...0,019 U/ml), P-1,3-glucanaze (10,31...21,47 U/ml), poli-fenol oxidaze (0,100...0,200 U/ml), fenil-alaninamoniu liaze (0,278...0,538 U/ml) și peroxidaze (0,386...0,906 U/ml).

Denumirea taxonomică:

Botrytis cinerea Pers, ex Fr, stadiul conidial al Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel SYN. Sclerotinia fuckeliana (de Bary) Fuckel.

Mediu:

Cultivarea pe PDA (cartofi-dextroză-agar), Merk, ord. no. 10130.0500, 39 g/l mediu de cultură, pH 5,6 ± 0,2, autoclavat 15 min la 121°C.

Condițiile de depozitare:

Culturi pure în eprubete cu mediul PDA înclinat, la 2...5°C.

Condiții de testare a viabilității:

Incubare pe mediul de cultură PDA, pH 5,6 ± 0,2, la 22-25°C.

Botrytis cinerea, tulpina BcF7, a fost izolată de pe fruct de căpșun din soiul Senga Sengana, aflat în condiții de depozitare. încadrarea taxonomică a tulpinii de Botrytis cinerea este Filum Ascomycota, subfilum Pezizomycotina, clasa Leotiomycetes, ordinul Helotiales, familia Sclerotiniaceae, genul Botryotinia, specia Botrytis cinerea sau Botryotinia Cinerea (De Bary) Whetzel (fig. 3, Tulpina BcF7 de Botrytis cinerea).

Descriere:

Tulpina BcF7 este depozitată cu numărul P1001 la Microbial Străin Collection of Latvia, University of Latvia, pe 13.09.2010.

Coloniile dezvoltate pe mediul PDA la 25°C inițial sunt hialine, ulterior devenind gri spre brun, rarefiate și mai slab colorate în centru, cu nuanțe pronunțat brune spre margini. Scleroții închiși la culoare se dezvoltă într-un număr moderat. Rata de creștere pe PDA este de 0,885 mm/h.

Conidioforii suntînalți, bruni, septați, cu pereți netezi, neregulat ramificați, care poartă capete conidiale intercalate și apicale.

Conidiile brune deschis, netede, neseptate, elipsoidale până la obovoide au hilul protuberant și dimensiuni de 12,39...19,15 x 8,72...14,76 pm.

Scleroții negri variază ca formă și au diametre de 2...7 mm.

Originea izolatului este pe fructe de căpșun bolnave din România.

Testele au dovedit capacitatea de a produce enzime; chitinaze (0,005...0,017 U/ml), P-1,3-glucanaze (13,71 ...21,17 U/ml), poli-fenol oxidaze (0,140...0,240 U/ml), fenil-alaninaamoniu liaze (0,236...0,413 U/ml) și peroxidaze (0,334...0,391 U/ml).

Denumirea taxonomică:

Botrytis cinerea Pers, ex Fr, stadiul conidial al Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel SYN. Sclerotinia fuckeliana (de Bary) Fuckel

Mediu:

Cultivarea pe PDA (cartofi-dextroză-agar), Merk, ord. no. 10130.0500, 39 g/l mediu de cultură, pH 5,6 ± 0,2, autoclavat 15 min la 121°C.

RO 126736 Β1

Condițiile de depozitare: 1

Culturi pure în eprubete cu mediul PDA înclinat, la 2...5°C.

Condiții de testare a viabilității: 3

Incubare pe mediul de cultură PDA, pH 5,6 ± 0,2, la 22...25°C.

Prezenta invenție se referă, de asemenea, la un produs pentru imunizarea plantelor 5 de căpșun contra agentului putregaiului cenușiu. în realizarea produsului de stimulare a reacției de apărare a plantelor de căpșun, o primă etapă este reprezentată de cultivarea 7 celor 3 tulpini fungice de Botrytis cinerea în laborator, pentru obținerea de preinocul, urmată de pregătirea mediului lichid de creștere. 9

Pentru realizarea preinoculului, în laborator se pregătesc tulpinile fungice de colecție BcS1, BcF7 și BcP2 de Botrytis cinerea, care sunt cultivate pe mediul solid PDA (cartofi- 11 dextroză-agar), Merk, ord. no. 10130.0500, 39 g/l mediu de cultură, pH 5,6 ± 0,2, autoclavat 15 min la 121 °C, repartizat în eprubete cu mediu înclinat. 13

Pentru creștere, tulpinile sunt incubate la termostat la 27°C timp de 30 de zile.

Fiecare cultură pe mediul agarizat este reluată în apă deionizat sterilă, într-o cantitate 15 reprezentând 0,16% (v/v) din volumul vasului de creștere, și având în soluție o concentrație de 10⁷... 10⁹ ufc/ml. Culturile reluate în apă sterilă și prezentând caracteristicile menționate 17 sunt utilizate pentru inocularea mediului lichid de creștere, prin introducerea succesivă a lor, în condiții sterile, în vasul de creștere. 19

Producerea de exometaboliți cu rol elicitor a fost redusă în condițiile utilizării mediilor și a condițiilor clasice de creștere a fungilor, astfel că a devenit necesară realizarea unui 21 mediu de creștere care să stimuleze dezvoltarea fungilor și, implicit, creșterea concentrației de compuși moleculari cu efect elicitor, dar și stabilirea parametrilor optimi pentru stimularea 23 producerii acestora.

în acest sens, prin creșterea simultană a celortrei izolate fungice, cât și prin prezența 25 biomasei vegetale de căpșun în mediul de creștere lichid, s-a stimulat atât competiția intertulpinală, cât și mecanismele biochimice interne ale tulpinilor implicate în atacul asupra 27 plantei țintă, cu efecte asupra potențării proceselor de sinteză și de eliminare a exometaboliților. Pentru creșterea celor 3 tulpini fungice (BcS1, BcF7 și BcP2) de Botrytis 29 cinerea, am optat pentru cultura lor pe mediu lichid, biomasa fungică dezvoltându-se atât la suprafață, cât și în profunzimea lui. 31

Pentru prepararea mediului lichid a fost preferată apadeionizată. Mediul realizat este utilizat pentru efectul combinat asupra creșterii și a metabolismului tulpinilor fungice de 33 Botrytis. S-a preferat prepararea unui mediu proaspăt, pentru a se evita un impact tehnologic asupra compoziției naturale a acestuia. Nu au fost utilizate antibiotice. Nu au fost utilizați 35 stimulatori de creștere fungică. A fost evitată utilizarea cartofilor noi.

Preparare: 9 kg cartofi spălați, decojiți și tăiați în cuburi de 12 mm. Se cântăresc 37 cuburile de cartof și se fierb în apă deionizată, în vase de sticlă (metal smălțuit, inox) timp de 30 min. Se strecoară prin tifon. Se adaugă zaharoza 20 g/l și se amestecă până la 39 dizolvare. Se adaugă biomasă vegetală 3 g/l. Biomasa vegetală se introduce sub formă de pulbere provenită din material vegetal (frunze de căpșun), uscat în prealabil la termostat la 41 60°C. Se completează în final până la 18 I cu apă deionizată, pentru a se compensa evaporarea. Mediul lichid se toarnă în bioreactoare sau vase de creștere din inox, 43 hipoaerate, prevăzute cu sistem de agitare magnetică a conținutului. Vasul de creștere se umple cu mediu lichid până la 72...75% din volumul interior. 45

După realizarea mediului s-a efectuat imediat ajustarea pH-ului la 5,6±0,2 cu soluții molare de HCI și NaOH. 47

Nu a fost realizată clarificarea mediului lichid datorită efectului nefavorabil asupra tulpinilor fungice ale fitopatogenului. 49

RO 126736 Β1

Sterilizarea la cald s-a realizat cu vapori de apă, în autoclav, sub presiune, 20 min la 12ΓΟ, 1,1 at. Prin controlul procesului de sterilizare s-a urmărit corelarea dintre temperatură și presiune, pentru a evita supraîncălzirea și formarea compușilor toxici din zaharuri.

Volume variabile ale mediului de creștere de până la 18 l/vas nu au influențat caracteristicile finale ale produsului.

Mediul lichid inoculat cu cele 3 tulpini fungice selectate pentru producerea de elicitori este menținut în termostat la întuneric și la temperatura de 25...27°C, pentru o perioadă de 21 de zile. Mediul este agitat prin intermediul unui agitator magnetic la intervale de 12 h, pentru o durată de 5...7 min.

Inocularea mediului s-a realizat la 24 h după sterilizare, dar acesta poate fi și păstrat la 2...4°C până la maximum 10 zile până la inoculare.

Inocularea și transferul izolatelor fungice pure din eprubete s-a realizat individual pentru fiecare tulpină fungică.

Pentru a verifica eficiența purificării fungilor izolați, utilizați la inocularea mediului de creștere, au fost realizate în paralel inoculări pe medii favorabile dezvoltării bacteriilor (Mediul Topping).

în scopul asigurării unui impact cât mai redus asupra structurilor moleculare, s-au utilizat procedee succesive de filtrare a mediului lichid de creștere, până la separări fracționale și selectarea intervalului în care greutățile moleculare ale amestecului de compuși prezintă activitate elicitoare și induc reacția de apărare a plantei.

Cultura simultană în mediu lichid a celor 3 tulpini aparținând fitopatogenului Botrytis, cu respectarea condițiilor menționate anterior, determină eliberarea în mediu a unui amestec complex de exometaboliți specifici neuniformi ca structură și greutate moleculară, și care stimulează reacția naturală de apărare a plantelor de căpșun.

Fracțiile moleculare în care compușii cu efect elicitor sunt prezenți și activi s-au obținut prin trecerea succesivă a mediului de creștere fungică prin procedee de filtrare, microfiltrare și ultrafiltrare tangențială, obținându-se filtratul E2 (E2). în afară de filtratul E2 provenit de la tulpinile Bc S1, Bc P2 și BcF7 de Botrytis tinerea, s-au obținut, prin același procedeu, filtratele E1 - provenit de la o singură tulpină de Botrytis tinerea, E3 - provenit de la tulpini de fungi antagoniști, și E4 - provenit de la tulpini de Botrytis tinerea, și fungi antagoniști, pentru compararea efectului elicitor al compozițiilor rezultate.

Filtrarea și microfiltrarea s-au realizat printr-o baterie succesivă de cartușe filtrante, care au acoperit o arie moleculară de separare a compușilor fără efect elicitor din mediul de cultură lichid, din domeniul 10...10³ μ până la 1... 10 μ, respectiv, pentru particule grosiere și fine din mediul de cultură fungică.

Procedeul de ultrafiltrare aplicat a permis separarea compușilor moleculari din domeniul 10³...10¹ μ sau 1O...1O⁴Â, responsabili de stabilirea caracterului elicitor. Domeniului molecular căruia îi aparțin compușii din mediul lichid de creștere fungică, ce manifestă efect elicitor asupra plantelor de căpșun, este cuprins între 5000 Da și 2000 kDa. Pentru ultrafiltrarea mediului lichid de creștere s-a utilizat un sistem SEPA CF II OSMONICS, INC. ca unitate de filtrare tangențială, cu membrane de polietersulfon ce permit reținerea compușilor cu greutăți moleculare de peste 5000 Da și sub 2000 kDa, cu o suprafață de 140 x 190 mm, capacitate de 70 ml/min, presiunea maximă de 69 bar (1000 psi).

Filtratul colectat s-a depozitat la 4°C în vase de plastic închise etanș, sau la o temperatură ambientală sub 15°C, condiții în care prezintă stabilitate timp de 1...3 luni.

Nu s-au format complexe moleculare între diverși compuși prezenți în filtrat, care să poată altera structura și rolul lor elicitor.

Absența oricăror elemente de înmulțire fungice sau bacteriene constituie o condiție necesară a acestui produs.

RO 126736 Β1

Compoziția filtratului reprezintă de fapt compoziția produsul final (filtratul E2) utilizat 1 în inducerea rezistenței sistemice a plantelor de căpșun față de agentul fitopatogen Botrytis cinerea. 3

Modificări în procedura de obținere prin filtrare pot duce la modificări severe ale activității moleculelor elicitoare și/sau posibile reacții adverse fitotoxice. 5

Compoziția produsului cuprinde, ca ingrediente active: proteine solubile, glucide reducătoare, fiavonoide, polifenoli, enzime (pectin liaza, chitinaza, celulaza,7 carboximetilcelulaza, P-1,3-glucanaza) și aminoacizi (asparagina, glutamina, serina, histidina, glicina, treonina, alanina, arginina, tirozina, valina, metionina, fenilalanina,9 izoleucina, leucina, lizina) determinate conform metodologiei clasice: 1,06...22,67 mg/l proteine solubile totale, 1,98...19,39 mg/l glucide reducătoare totale, 0,01...0,4485 μ g/l11 fiavonoide totale, 39,42...336,51 mg/l polifenoli totali, 0,637...0,513 U/ml pectin liază, 0,423...0,627 U/ml chitinază, 0,012...1,98 U/ml celulază, 0,018...0,940 U/ml 13 carboximetilcelulază, 1,109...7,092 U/ml β-1,3 glucanază, 456,19...467,79 mmol/100 ml conținut total aminoacizi, 28,81 ...38,54 nmoli/100 ml asparagină, 28,55...30,56 nmoli/100 ml 15 glutamină, 40,92...61,28 nmoli/100 ml serină, 5,66...13,21 nmoli/100 ml histidină,

22.98.. .45.25 nmoli/100 ml glicină, 25,21...43,04 nmoli/100 ml treonină,17

35.71.. .50.12 nmoli/100 ml alanină, 99,93...126,24 nmoli/100 ml arginină,

7.37.. .9.24 nmoli/100 ml tirozină, 38,06...38,78 nmoli/100 ml valină, 9,67...19,43 nmoli/100 ml19 metionină, 11,59...31,29 nmoli/100 ml fenilalanină, 14,43...19,44 nmoli/100 ml izoleucină, 21,00...29,03 nmoli/100 ml leucină, 0,99...17,45 nmoli/100 ml lizină.21

Produsul a fost condiționat prin tratare cu CaCO₃ în proporție de 1%.

Prezenta invenție se referă, de asemenea, la metodele de aplicare a produsului 23 pentru imunizarea plantelor.

Tratamentul cu produsul fungic, pentru stimularea reacției de apărare a plantelor de 25 căpșun, se face prin aplicare prin pulverizare fină, cu ajutorul unui atomizor cu o dispersie de 60...80 μ a particulelor, la o distanță de peste 50 cm deasupra plantelor, în zilele 1 și 4 27 de la începerea tratamentului, la un volum de filtrat de 40...60 ml/m² suprafață de cultură, urmată de aplicarea diluată cu apă a produsului în raportul fiItrat:apă 1:2, respectiv, la 50% 29 din concentrația inițială a produsului, pentru tratamentele din zilele 6 și 8 de la începerea tratamentului. 31

Pentru aplicarea în sol se mențin aceleași intervale între tratamente și concentrații ale filtratului, dar în funcție de caracteristicile tipului de sol, a capacității pentru apă în câmp 33 și în funcție de necesitățile hidrice ale tipului de cultură, se estimează numărul de plante și se introduc cantități corespunzătoare de produs în apa de udare. 35

Nu este necesară repetarea tratamentului dacă ulterioraparfenomene meteorologice nefavorabile. 37

Produsul prevede, de asemenea, posibilitatea utilizării în paralel și a tratamentelor cu fungicide specifice căpșunului, având, ca substanță activă, fenhexamid, iprodion, captan, 39 dicloran și metil tiofanat.

Fungicidele care pot fi utilizate suplimentar după aplicarea produsului de inducere a 41 rezistenței plantelor de căpșun sunt: Teldor 500 SC - 1,70 l/ha, Rovral 500 SC - 2,2 l/ha, Captan 50 WP - 6,75 Kg/ha, Botran 75 W - 0,98 kg/ha, Topsin M 70 - 1,70 kg/ha. în zilele 43 1 și 4 de la începerea tratamentului se pulverizează fin Captan + Teldor (1/1), iar în zilele 6 și 8, Captan + Botran (1/1), pentru pulverizările pe plantă, iar în sol, în zilele 1 și 4, Topsin 45 M + Rovral (1/1), și Topsin M în zilele 6 și 8 de la începerea tratamentului.

Concentrația în glucide la care filtratul este aplicat pentru a induce rezistență la plante 47 este de 0,02 g/l echivalenți de glucoză. Produsul obținut poate să fie ambalat și transportat sub formă lichidă, în containere cu volume diferite, de către utilizatorul final. 49

RO 126736 Β1

Produsul prevede posibilitatea diluării compoziției pentru inducerea rezistenței plantelor împotriva microorganismelor fitopatogene, ingredientele active ale produsului se pot asocia cu un diluant acceptabil în agricultură (apa).

Nu se recomandă utilizarea produsului pentru tratamente la căpșun, împreună cu agenți tensioactivi de tipul sulfonat de naftalină, sulfat de alchil alchilfenol etoxilat etc. în cazul aplicărilor prin dispersie.

Nu se aplică produsul în diluții mai mari decât cele prevăzute în metoda de utilizare. Nu se concentrează produsul prin tratamente termice.

Produsul nu conține aditivi de tipul inhibitorilor, agenților de îmbunătățire a aderenței la plante, antispumanților sau coloranților.

Aplicarea produsului este deosebit de eficientă în prevenirea apariției de focare produse de agenții patogeni fungici din genul Botrytis îr\ cultura căpșunului.

Exemplu 2. Evoluția stării fitosanitare a culturilor de căpșun la tratamentul cu produsul fungic cu efect elicitor, în condiții controlate în cadrul experiențelor organizate în vase de vegetație în seră s-au folosit două soiuri de căpșun, semirezistent- Marmolada, respectiv, rezistent Elsanta la fitopatogenul Botrytis cinerea. Variantele experimentale au cuprins: martor Marmolada, martor Elsanta, tratament chimic cu fungicide de contact (ziua 1 Captan + Teldor, ziua 4 Captan + Teldor, ziua 6 Captan + Batron, ziua 8 Captan + Batron), tratament chimic cu fungicide sistemice la sol (ziua 1 - Topsin + Rovral, ziua 4 - Topsin + Rovral, ziua 6 - Topsin M, ziua 8 - Topsin M). Tratamente cu filtratele E1, E2, E3 și E4 au fost aplicate pe plantă și la sol în zilele 1, 4, 6 și 8 de la începerea tratamentului. La 48 h de la terminarea tratamentului a fost inoculat patogenul Botrytis cinerea.

S-au recoltat plantele de căpșun inoculate cu patogeni (variantele martor; tratate chimic la plantă și la sol; tratate cu extractele E1, E2, E3 și E4 în câte 3 repetiții din fiecare variantă).

Plantarea stolonilorde căpșun s-a efectuat în ghivece cu 3 kg sol/ghiveci. Vasele de vegetație au fost așezate în seră, pentru monitorizarea cât mai bună a factorilor de mediu. Factorii de vegetație, lumină, temperatură, umiditate au fost înregistrați zilnic.

Asupra plantelor s-au efectuat observații și determinări atât în timpul perioadei de vegetație, cât și la recoltarea pentru analize a materialului biologic, care au cuprins: dinamica creșterii în înălțime a plantelor de căpșun; dinamica formării numărului de frunze; ritmul de creștere a plantelor; evoluția petelor de boală în timpul perioadei de vegetație, înainte și după inocularea cu patogeni la 24 h, 48 h, 72 h și la 7 zile; suprafața foliară; numărul de frunze total pe plantă; numărul de frunze sănătoase și afectate; procentul de frunze afectate față de numărul total de frunze; procentul de atac față de suprafața foliară. La probele recoltate s-a evaluat masa plantelor, înălțimea plantelor, numărul de frunze. Pentru aprecierea rezultatelor s-a efectuat interpretarea statistică a datelor.

Monitorizarea stării fitosanitare a plantelor tratate cu filtratele E1, E2, E3 și E4 care ulterior au fost infectate experimental cu Botrytis a arătat faptul că, în privința numărului de frunze afectate la soiul Elsanta, se remarcă variantele tratate cu produsul E2 la plantă și sol, cu cel mai mic procent de frunze afectate, de 3,45%, respectiv, 4%. La soiul Marmolada, variantele tratate cu E1 și E3 au prezentat cei mai mic procent de frunze afectate (tratament la plantă), iar la tratamentul la sol se remarcă varianta tratată cu E2. La soiul Elsanta, după 48 h de la inocularea cu patogen, la varianta martor s-au remarcat pete, procentul de atac fiind de 0,57% din totalul suprafeței foliare, iar după 7 zile valoarea fiind de 25,75%. Cei mai mic procent de atac s-a remarcat la varianta tratată cu E2 la plantă, de 0,23% (fig. 4). Analiza varianței pentru dimensiunea petelor după 7 zile de la aplicarea inoculului la soiul Elsanta

RO 126736 Β1 (tabelul 1) arată o reducere foarte semnificativă a valorilor de la varianta tratată cu E2 aplicat 1 foliar. La soiul Marmolada procentul cel mai mic de atac din totalul suprafeței foliare s-a remarcat pentru varianta tratată cu E2 la sol. 3

Tabelul 1 5

Analiza variantei pentru dimensiunea petelor după 7 zile de la aplicarea inoculului cu patogen la solul Elsanta

Varianta experimentală soiul Elsanta	Tratament pe plantă	Tratament la sol
Valori relative	Dif.	Se m- nif.	Valori relative	Dif.	Semnif.
	cm2	cm2	%		cm2	cm2	%
V1 martor	105,28	0,00	100,00	Mt	105,47	0,00	100,00	Mt
V2 tratat chimic	27,90	-77,38	26,50	OO	83,33	-22,15	79,00	N
V3 tratat cu E1	4,67	-100,61	4,44	OO	4,67	-100,81	4,43	OO
V4 tratat cu E2	1,00	-104,28	0,95	OOO	1,00	-104,47	0,95	OO
V5 tratat cu E3	39,67	-65,61	37,68	O	39,67	-65,81	37,61	O
V6 tratat cu E4	14,00-	-91,27	13,30	OO	13,67	-91,81	12,96	OO
DL5% = 49,510 DL1% = 70,470 DL0,1% = 101,910	DL5% = 51,140 DL1% = 72,790 DL0,1% = 105,260
Semnif. exp. **	Semnif. exp. **

Exemplul 3. Influența aplicării produsului fungic asupra compoziției biochimice a 23 plantelor de căpșun cultivate în condiții controlate

Materialul biologic a constat din două varietăți de plante de căpșun, Elsanta și 25 Marmolada. Plantele supuse experimentelor au fost crescute în seră, în condițiile descrise la exemplul 2. 27

Plantele au fost testate pentru evaluarea efectului aplicării unor tratamente cu produsul fungic E2 pe plantă și în sol, asupra activității unor enzime legate de patogenitate 29 precum: peroxidaza (POX) și fenilalanin-amonium-liaza (PAL) cu rol important în sistemul de apărare al plantelor. 31 în acest sens au fost realizate variante experimentale de tratament chimic și cu filtrate fungice aplicate pe plante și în sol: martor, tratament chimic cu fungicide și cu filtratele: (E1) -33 cu o tulpină de Botrytis cinerea, (E2) Botrytis cinerea tulpinile - BcS1, BcP2, BcF7, (E3) cu tulpini antagoniste și (E4) cu tulpini de Botrytis și de antagoniști.35

Pentru obținerea omogenatului, de la fiecare variantă experimentală s-au prelevat frunze tinere, care au fost cântărite (circa 500 mg) și mojarate cu nisip de cuarț.37

Dozarea activității peroxidazelor (POX) s-a realizat prin extracția enzimatică în tampon Tris-HCI 20 mM, pH = 8, conținând: 10 mM NaHCO₃, 10 mM Mg Cl₂, 0,1 mM Na₂ EDTA, 39 10 mM β-mercaptoetanol, 10% sucroză, 0,1% Triton X-100, la4°C, timp de 4 h. Omogenatul a fost supus apoi centrifugării timp de 10 min la 12000 rot/min. Supernatantul obținut a fost 41 supus dozării enzimatice. Activitatea enzimatică a peroxidazelor s-a determinat prin incubarea enzimeiîn prezența H₂O₂3% și gaiacol 30 mM. S-a înregistrat spectrofotometric modificarea 43

RO 126736 Β1

DO_2g0nm la intervale de 1 min, timp de 5 min. O unitate de activitate enzimatică reprezintă modificarea densității optice cu 0,1 unități/min. Activitatea peroxidazică a fost exprimată în unități/ml enzimă.

Dozarea activității L-fenilalanin-amonium-liazei (PAL) s-a realizat prin extracția enzimatică în 5 ml tampon borat de sodiu 0,1 M (pH = 7,0) ce conține 0,1 g polivinilpirolidonă (PVP). Omogenatul a fost centrifugat la 10000 rpm timp de 35 min la 4°C, iar supernatantul obținut a fost supus dozării. Amestecul de reacție a fost compus din 0,4 ml extract enzimatic, 0,5 ml tampon boratO,1 M (pH = 8,8) și 0,5 ml de L-fenilalanină 12 mM. Amestecul de reacție a fost incubat apoi pe baia de apă la 30°C, timp de 30 min. Ca punct de referință, s-a realizat un amestec ce a constat din 0,4 ml extract enzimatic și 1 ml tampon borat. Activitatea PAL a fost determinată spectrofotometric prin înregistrarea ratei de conversie a L-fenilalaninei la acid trans-cianaminic, la DO_290nm. Coeficientul de extincție utilizat pentru calcularea cantității de acid trans-cianaminic formată a fost de 9630 M^_1 (Dickerson și colab., 1984). Activitatea enzimatică a fost exprimată în unități/ml enzimă.

Analiza parametrilor biochimici după aplicarea tratamentelor pe plantă sau la nivelul solului a arătat faptul că, la genotipurile de căpșun testate, soiurile Elsanta și Marmolada, activitatea POX (enzimă implicată în sistemul de răspuns antioxidativ) nu este indusă de tratamentul chimic cu fungicide. în ceea privește activitatea L-fenilalanin-amonium-liazei PAL (o enzimă cu rol important în reacțiile de apărare a plantelor), la genotipurile de căpșun s-au înregistrat diferențe valorice atât între genotipuri, cât și ca urmare a modului de aplicare a tratamentului.

La plantele de căpșun din soiurile Marmolada și Elsanta tratate pe plantă sau la sol cu câte 4 tipuri de extracte fungice diferite, analizele comparative ale rezultatelor obținute au relevat faptul că există diferențe semnificative în ceea ce privește inducerea activității POX, diferențe apărute atât ca urmare a modului de aplicare a tratamentelor (plantă/sol), cât și datorită tipului de filtrat utilizat și a genotipului testat. Valori crescute ale activității POX induse de tratamentul cu E2 au fost înregistrate la ambele soiuri testate, comparativ cu martorii și cu tratamentele chimice cu fungicide, iarîn privința modului de administrare, după aplicarea filtratului fungic E2 pe plantă comparativ cu administrarea în sol. Activitatea L-fenilalanin-amonium-liazei (PAL) evaluată la căpșun a înregistrat valori crescute la ambele soiuri testate, după tratamentul pe plantă cu filtratul E2 de Botrytis cinerea la tulpinile Bc S1, Bc P2, Bc F7 și cu filtratul E3 aplicat la sol (fig. 5).

Exemplul 4. Influența aplicării produsului fungic asupra microflorei filosferice și rizosferice a plantelor de căpșun cultivate în condiții controlate în rizosferă, numărul de fungi exprimat în unități formatoare de colonii (ufc/g sol uscat) s-a determinat prin însămânțarea diluțiilor de sol pe mediul PDA, incubare 14 zile și numărarea coloniilor rezultate. Au fost identificați taxonii care alcătuiesc micocenozele edafice, pe baza caracteristicilor morfologice evidențiate de examinarea prin microscopie optică a preparatelor lamă-lamelă efectuate.

Pentru studierea influenței filtratului E2 aplicat pe frunze și în sol asupra cenozelor fungice din filosferă, comparativ cu filtratele E1, E3 și E4, cu tratamentele chimice cu fungicide, și cu martorul din experiențele organizate în seră, de la plantele de căpșun, soiurile Marmolada și Elsanta, s-au recoltat câte 3 frunze/vas/repetiție, în total 9 frunze/variantă experimentală. S-au decupat pătrate cu latura de 1 cm din zona mijlocie a părții drepte a foliolelor, care au fost agitate timp de 30 min în eprubete cu ser fiziologic steril, din care au fost efectuate însămânțări pe mediul PDA, în plăci Petri de 10 cm diametru. După incubare la 25°C, timp de 5...7 zile, acestea au fost examinate pentru determinarea densității fungilor exprimată în ufc/cm² de suprafață foliară, și stabilirea apartenenței taxonomice a coloniilor dezvoltate.

RO 126736 Β1

S-a calculat abundența relativă (A%) pentru fiecare taxon fungic, și s-au încadrat 1 genurile identificate în 3 clase de abundență.

După administrarea filtratelor și, respectiv, a fungicidelor, la 14 zile de la tratamente, 3 s-a realizat infectarea experimentală a plantelor de căpșun cu inocul de Botrytis cinerea.

Probele de sol prelevate la încheierea ciclului experimental în seră au fost analizate 5 prin metoda însămânțării granulelor de 5 mm diametru pe mediul suport apă-agar cu streptomicină și incubare timp de 5 zile. Plăcile Petri (3/variantă experimentală) au fost 7 examinate prin microscopie optică, pentru identificarea taxonilor dezvoltați și înregistrarea prezenței acestora în probe. Ulterior, s-a estimat numărul mediu de colonii și frecvența 9 fiecărui taxon, aceștia fiind încadrați în 3 grupe de constanță care dau statutul de taxon constant, accesoriu și accidental. 11

Din punct de vedere microbiologic, solul utilizat în experimentele descrise la exemplul 2 conține un număr mare de bacterii și fungi, o microfloră diversificată, dar puțini antagoniști 13 naturali, ceea ce îl recomandă pentru aplicarea de produse cu rol elicitor.

După aplicarea tratamentelor cu filtrate, tiparul de reacție a fost relativ asemănător, 15 în sensul unei reduceri a numărului de taxoni la E1 și E3, și păstrării unei diversități mai mari la E2 și E4. Se evidențiază menținerea slabă a răspunsului la E3 aplicat în sol. 17

Datele obținute ilustrează comparativ compoziția cenozelor fungice din filosfera plantelor de căpșun - soiul semirezistent Marmolada, din experiențele organizate în seră, 19 repartizarea taxonilor în 3 clase, după abundența relativă (ponderea în comunitate), precum și densitatea fungilor raportată la unitatea de suprafață foliară (tabelul 2). 21

Tratamentele chimice cu fungicide de contact administrate prin pulverizare au distrus total microfloră filosferică, la această variantă nefiind izolat niciun taxon. 23

Rezultatele studiului acelorași parametri la soiul rezistent Elsanta sunt analizate după administrarea filtratelor și, respectiv, după ce s-a realizat infectarea experimentală a plantelor 25 cu inocul de Botrytis cinerea (tabelul 3).

Dacă, la aplicarea filtratelor, situația era relativ similară cu cea a martorului în privința 27 numărului de specii care alcătuiau cenoza filosferică, după inocularea cu Botrytis cinerea s-a înregistrat un răspuns heterogen al fungilor la prezența patogenului, numărul de genuri care 29 alcătuiesc cenoza filosferică variand între 1 și 6.

Genul Botrytis s-a dezvoltat cu o pondere de 50% la martor, ca urmare a inițierii de 31 infecții provocate de germinarea propagulelor din inocul, unde este codominant alături de Aspergillus. Acesta din urmă se dezvoltă în număr mare pe țesuturile îmbătrânite ale 33 frunzelor, dominând cenozele la 7 din cele 11 variante experimentale. Restul genurilor au abundențe scăzute. Ca urmare a infecțiilor dezvoltate, densitatea fungilor la martor a fost de 35 900 ufc/cm² suprafață foliară, superioară tuturor celorlalte tratamente.

Spre deosebire de martor, variantele tratate cu filtrate cu rol elicitor și fungicide nu 37 conțin genul Botrytis. Acesta apare cu statut accesoriu în solul martor de la soiul de căpșun Marmolada, și accidental la tratamentele cu fungicide și la administrarea în sol a filtratului 39 E1, prezența sa datorându-se fie inoculării efectuate experimental, fie caracteristicilor de imunitate ale soiului semirezistent. Restul filtratelor, indiferent de modul de administrare, 41 opresc proliferarea patogenului în sol. La soiul rezistent Elsanta (tabelul 4), acesta apare doar la martor cu statut de taxon accidental, fiind oprit, de asemenea, în dezvoltare de toate 43 tratamentele aplicate (chimice și cele cu filtrate fungice).

Compararea datelor referitoare la sol cu cele anterioare, prezentate pentru filosferă, 45 arată o diversitate specifică mai mare în cazul solului, și o stabilitate mai mare a cenozelor fungice la variantele experimentale tratate cu produsul fungic E2 cu rol imunostimulant. 47

RO 126736 Β1

Tabelul 2

Microflora filosferică la experiența în seră cu căpșun - soiul Marmolada

Nr.

Taxoni identificați

Gfacfosporium fflrizopus

Myrottieciufn

Trichoderma

PenidBium

Attemaria

AwetrfiasdfUOT

Fusarium

AspergiSus

VerticiBum

Paeatonyces

Nr.ufcfcm² suprafața fbiara 90

270 120

150 M

150

4» 150

180 ^a=67-ioo%

E=Sa^4-66% ||jj||||||A=0-33%

Tabelul 3

Microflora filosferică la experiența în seră cu căpșun - soiul Elsanta

RO 126736 Β1

Tabelul 4

Microflora edafosferică la experiența în seră cu căpșun - soiul Elsanta

At.· ί ț £ >fj.n ί ?

i tur:*¹ x../;·?

T * o r} c (*mh î g ik 4/·/(>'., . .·; - ·· > 7tr: țjf i; ;/: rr' fi ,2 Λ: ΎΤ/ΠΓ>Γ>!(//ΤΓ i t) ς.7Γ»(//77

Afrt t» ;·,»*·'>·:*<:f-t };'·>

.tf.-vțtrr ·#) : ’r i^:i i:’ η·

Exemplul 5. Efectul produsului fungic asupra plantelor de căpșun din soiul Senga Sengana în câmpul experimental 23

S-a folosit soiul de căpșun Senga Sengana, sensibil la Botrytis, cultivat în câmp.

Perioada de desfășurare a experienței a fost mai-iulie 2010. Variantele experimentale au 25 cuprins variante de tratament (Factor A - tratamente aplicate) cu a1 - martor, a2 - tratament chimic, a3 - extract fungic E2, a4 - extract fungic E4, a5 - extract fungic E2 + tratament 27 chimic, a6 - extract fungic E4 + tratament chimic, și variante de aplicare (Factor B - modul de aplicare) cu b1 - aplicare pe plantă, b2 - aplicare în sol. Pentru tratamentul chimic s-au 29 utilizat fungicide de contact și sistemice (Captan 50 WP - conc. 6,75 kg/ha, Teldor - conc.

1,70 kg/ha, Batron- conc. 0,98 kg/ha, Topsin M - conc. 1,70 kg/ha, Rovral - conc. 2,2 kg/ha). 31 Tratamentul pentru variantele cu fungicide de contact cuprinde, pentru zilele 1 și 4 de la începerea tratamentului, combinația Captan + Teldor (1/1) pulverizat fin, și pentru zilele 33 6 și 8, combinația Captan + Batron (1/1), iar pentru tratamentul cu fungicide sistemice în zilele 1 și 4, combinația Topsin M + Rovral (1/1), introdus în sol, și pentru zilele 6 și 8, Topsin 35 M. Cantitatea de soluție folosită la tratament cu extractele fungice E2 și E4: 40...60 ml de lichid pulverizat/plantă, cu un grad de dispersie de 60...80 μ, sau aplicat în sol. 37 în cazul variantelor de tratament combinat (extracte fungice și fungicide) s-a aplicat succesiv tratamentul cu extracte și ulterior tratamentul cu fungicid. 39

S-a efectuat monitorizarea parametrilor biometrici și de caracterizare a stării fîtosanitare a plantelor, ca: evoluția petelor de boală în timpul perioadei de vegetație; 41 suprafața foliară; numărul de frunze și fructe sănătoase și afectate; procentul de frunze afectate, față de numărul total de frunze; procentul de atac, față de suprafața foliară. 43 Compararea rezultatelor s-a efectuat cu ajutorul analizei statistice a datelor.

S-a remarcat faptul că plantele martor netratate chimic la sol au prezentat un număr 45 de frunze afectate mai mare, comparativ cu cele tratate cu E2 și E4 la plantă și la sol, și cu fungicide (tabelul 5). La variantele tratate cu E2 la plantă și la sol s-a observat procentul cel 47 mai mic de frunze afectate. Variantele tratate cu produsul E2 și E4, precum și cele cu

RO 126736 Β1 tratament chimic pe plantă au prezentat pete de atac pe frunze în număr foarte redus. Frunzele au fost afectate înainte de tratament, iar procesul de extindere a petelor de necroză a fost semnificativ redus după tratament, la variantele tratate chimic la plantă și la cele tratate cu E2 și E4 la plantă și la sol. Procentul de frunze afectate a fost mai mare la plantele la care am efectuat tratamentul la sol, comparativ cu variantele la care am aplicat tratamentul pe partea vegetativă. S-a remarcat faptul că varianta martor a prezentat cel mai mare procent de frunze afectate, iar extinderea petelor a fost foarte rapidă, comparativ cu variantele tratate chimic sau cu E2 si E4, atât la plante, cât și la sol.

Din analiza statistică a datelor (tabelul 6) se poate aprecia faptul că cel mai mare procent de fructe afectate a fost observat la martor (27,66%), ritmul de extindere a petelor a fost foarte rapid în intervalul de monitorizare (7 zile), diferențele fiind semnificative între martor și variantele cu filtrate fungice sau cu tratamente combinate (filtrat + tratament chimic). Fructele recoltate din variantele tratate cu produsul E2 s-au păstrat bine în condiții de depozitare, cu 3...4 zile mai mult decât cele tratate cu fungicide sau netratate.

Tabelul 5

Analiza variantei pentru procentul de frunze afectate - soiul Seaga Sengana

Varianta experimentală soiul Senga Sengana	Tratament pe plantă	Tratament pe sol
Valori relative	Dif. buc	%	Semnif.	Valori relative	Dif. buc	%	Semnif.
buc		buc
V1 martor	22,35	0,00	100	Mt	22,35	0,00	100	Mt
V2 tratam, chimic	4,05	-18,30	18,12	OOO	14,59	-7,76	65,28	OOO
V3 tratament E2	0,53	-21,82	2,37	OOO	0,94	-21,41	4,21	OOO
V4 tratament E4	0,86	-21,49	3,85	OOO	0,97	-21,38	4,34	OOO
V5 E2+trat.chimic	1,02	-21,33	4,56	OOO	1,64	-20,71	7,34	OOO
V6 E4+trat.chimic	1,56	-20,79	6,98	OOO	3,8	-18,55	17,00	OOO
Media	5,06	-17,29	22,65	OOO	7,38	-14,97	33,03	OOO
DL5% =2,290 DL1% = 3,00 DL 0,1% = 6,130	DL5% = 1,990 DL 1% = 3,120 DL 0,1% = 5,310
Semnif. exp. ***	Semnif. exp. ***

RO 126736 Β1

Tabelul 6 1

Analiza varianței pentru procentul de fructe afectate - soiul Senga Sengana 3

Varianta experimentală soiul Senga Sengana	Tratament pe plantă	Tratament pe sol
Valori relative	Dif.	%	Semnif.	Valori relative	Dif.	%	Semnif.
buc.	buc.	buc.	buc.
V1 martor	27,66	0	100,00	Mt	27,66	0	100,00	Mt
V2 tratament chimic	11,45	-16,21	41,40	OOO	8,85	-18,81	32,00	OOO
V3 tratament E2	4,11	-23,55	14,86	OOO	5,60	-22,96	20,25	OOO
V4 tratament E4	3,02	-24,65	10,90	OOO	3,25	-24,41	11,75	OOO
V5 E2+tratament chimic	3,33	-24,33	12,04	OOO	5,87	-21,79	21,22	OOO
V6 E4+tratament chimic	3,81	-23,85	13,77	OOO	4,83	-22,83	17, 46	OOO
Media	8,90	-18,76	32,16	OOO	9,34	-18,32	33,78	OOO
DL 5% = 1,480					DL5% =	1,480
DL 1% =2,330					DL1% =	2,320
DL 01% = 3,970					DL 0,1%	= 3,960
Semnif. exp. ***	Semnif. exp. ***

Claims (5)

1. Revendicări

   1. Tulpină de Botrytis cinerea BcS1, depozitată cu numărul P999 la Microbial Străin Collection of Latvia, University of Latvia, pe 13.09.2010, care prezintă colonii alb cenușii lânoase, cu rari scleroți negri pe mediul Czapek, colonii cenușii cu numeroși scleroți negri pe mediul cu cartof, dextroză, agar, conidiofori bruni, septați, lungi, ramificați intercalar sau apical, conidii netede, neseptate, hialine spre galben brun, obovoide cu hilul protuberant și capacitatea de a produce enzime cu rol elicitor de tip chitinaze, P-1,3-glucanaze, poli-fenol oxidaze, fenil-alanina-amoniu liaze și peroxidaze.
2. 2. Tulpină de Botrytis cinerea BcP2, depozitată cu numărul P1000 la Microbial Străin Collection of Latvia, University of Latvia, pe 13.09.2010, care prezintă colonii dense lânoase, cenușiu închis cu numeroși scleroți negri, conidiofori înalți, subțiri, bruni, septați, netezi, cu ramificații intercalare, care poartă capete conidiale, conidii netede, neseptate, hialine spre brun deschis, ovoide sau subgloboase, hilul slab protuberant și capacitatea de a produce enzime cu rol elicitor de tip chitinaze, P-1,3-glucanaze, poli-fenol oxidaze, fenil-alaninaamoniu liaze și peroxidaze.
3. 3. Tulpină de Botrytis cinerea BcF7, depozitată cu numărul P1001 la Microbial Străin Collection of Latvia, University of Latvia, pe 13.09.2010, care prezintă colonii hialine inițial, deschise la culoare în centru, lânoase și cu nuanțe brune spre margini, cu scleroți negri dezvolați în număr moderat, conidiofori înalți, bruni, netezi, septați, ramificați neregulat, cu capete conidiale apicale și intercalare, conidii brun deschis, netede, neseptate, elipsoidale până la obovoide, cu hi I protuberant și capacitatea de a produce enzime cu rol elicitor de tip chitinaze, P-1,3-glucanaze, poli-fenol oxidaze, fenil-alanina-amoniu liaze și peroxidaze.
4. 4. Produs pentru imunizarea plantelor de căpșun împotriva fitopatogenului Botrytis cinerea, caracterizat prin aceea că este un ultrafiltrat format din exometaboliți cu rol elicitor din domeniul molecular 5000...2000 kDa, care sunt eliberați în mediul de creștere de către amestecul tulpinilor definite la revendicările 1, 2 și 3, în prezența biomasei vegetale de căpșun, și conține: 1,06...22,67 mg/l proteine solubile totale, 1,98...19,39 mg/l glucide reducătoare totale, 0,01...0,4485 pg/l flavonoide totale, 39,42...336,51 mg/l polifenoli totali, 0,637...0,513 U/ml pectin liază, 0,423...0,627 U/ml chitinază, 0,012...1,98 U/ml celulază, 0,018...0,940 U/ml carboximetilcelulază, 1,109...7,092 U/ml β-1,3 glucanază,

   456.19.. .467.79 mmol/100 ml conținut total aminoacizi, 28,81...38,54 nmoli/100 ml asparagină, 28,55...30,56 nmoli/100 ml glutamină, 40,92...6 1,28 nmoli/100 ml serină,
5. 5.66.. .13.21 nmoli/100ml histidină, 22,98...45,25 nmoli/100 ml glicină,

   25.21.. .43.04 nmoli/100 ml treonină, 35,71...50,12 nmoli/100 ml alanină,

   99.93.. .126.24 nmoli/100 ml arginină, 7,37...9,24 nmoli/100 ml tirozină, 38,06...38,78 nmoli/100ml valină, 9,67...19,43 nmoli/100 ml metionină,

   11.59.. .31.29 nmoli/100 ml fenilalanină, 14,43...19,44 nmoli/100 ml izoleucină, 21,00...29,03 nmoli/100 ml leucină, 0,99...17,45 nmoli/100 ml lizină.

   5. Metodă de aplicare a produsului definit la revendicarea 4, în care produsul se aplică preventiv pe plantă sau în sol, se administrează în 4 tratamente succesive, de două ori cu produsul concentrat, la un interval de 4 zile, și de două ori cu produsul diluat la 50%, la un interval de 2 zile, câte 40...60 ml/m², prin pulverizare fină cu grad de dispersie de

   60.. .80 μ pe plantă, sau în apa de irigație, iar după aplicarea tratamentului nu este necesară repetarea lui în cursul sezonului de vegetație.