CN108165589B - 一种真菌花色苷类红素及其发酵制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种真菌花色苷类红素及其发酵制备方法，属于天然产物开发技术领域，发酵制备方法采用黑附球菌LS10H为发酵菌体，以液体培养基进行发酵并采用乙醇水溶液浸提取的方法制备真菌花色苷类红素，并对提取的真菌花色苷类红素进行性能测试，测试表明提取真菌花色苷类红素易溶于水，对光照不敏感，真菌色素为一类花色苷色素，含有但不仅限于分子量分别为596.2、576.2、522.2和536.2的物质，本发明采用生物发酵制备的真菌花色苷类红素具有发酵工艺简单，色素产量高，发酵过程易于控制且不易染菌等特点。

Description

一种真菌花色苷类红素及其发酵制备方法
技术领域
本发明属于天然产物技术领域，涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种真菌花色苷类红素及其发酵制备方法。
背景技术
合成色素由于致癌性等问题逐渐被限制或禁止在食品中使用，天然色素已被广泛应用于食品着色与动物和植物组织提取相比，利用微生物发酵制备天然色素具有经济、高效和不受地理、季节或气候影响等优势，是天然色素的重要来源之一。花色苷是植物体内花青素与各种单糖结合而形成的糖苷，广泛分布于鲜花、水果和蔬菜之中，花色苷类色素是一种水溶性的天然色素，具有安全、无毒的食品应用特点。此外，花色苷类色素在体内还具有抗氧化、清除自由基、抗肿瘤和调节免疫功能等生理作用。目前的花色苷类色素主要从天然的水果和花卉中提取，其生产受到自然作物的生长季节和储存等因素的制约。
随着技术的发展，微生物尤其是丝状真菌色素逐渐受到了广泛的关注，针对真菌色素的研究亦成为天然色素研究领域的热点问题，真菌，尤其是接合菌类（ascomycetous）和担子菌类（basidiomycetous）可以产生多种颜色范围广泛天然色素，黑附球菌属（Epicoccum Link）微生物是一类安全、不产生物毒素、具有良好应用前景的食品天然着色剂生产菌株，目前在附球菌属中发现的色素主要有类胡萝卜色素（Carotenoids）、黄柄曲菌素（Flavipin）、色满酮类（Chromanone）、聚酮类色素（Orevactaene）以及吡啶酮类色素（Epipyridone）等；黑附球菌是一种内生真菌，属半知菌纲，壳霉目，杯霉科，黑附球菌属，在自然界分布较广。在研究应用当中，黑附球菌及其孢子主要被应用于生物防治和天然色素的发酵生产，如中国专利申请号201110253331.2公开了一种黑附球菌DB3及其在过氧化物脱胶制备纺织用亚麻、大麻、黄麻或红麻纤维工艺中的应用，Yue-Zhong Shu等在1997年首次报道了黑附球菌可发酵产生一种新型的多烯（烃）聚酮类色素，但目前国内利用黑附球菌发酵产色素的专利还比较罕见。
发明内容
根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种真菌花色苷类红素及其发酵制备方法，为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种真菌花色苷类红素发酵制备方法，具体步骤如下：
1）种子培养：将黑附球菌在PDA培养基中进行划线培养，培养3-4天后使用无菌水洗下菌丝体，制得菌丝体悬液，即为发酵用种子液；
2）发酵：取种子液接种于液态发酵培养基中，于28-32℃、180-220r/min条件下培养1-3d后，然后将发酵条件设为10-25℃、120-240r/min，继续培养2-5d；
3）乙醇提取色素：发酵结束后，离心分离菌体和发酵液，然后向湿菌体中加入浓度为50%-100%的乙醇溶液，混合均匀后，在20-40℃下浸取30-60min，离心除去菌体，得含乙醇提取液。
优选的，所述PDA培养基的组分为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，去离子水1000mL，pH6.7-7.2。
优选的，所述液态发酵培养基的组分为葡萄糖10-30g/L，蛋白胨0.5-1.5g/L，NaCl0.5-1g/L，K2HPO4 0.2-0.5g/L，MgSO4 0.3-0.6g/L，FeSO4 0.005-0.015g/L，pH3-7。
优选的，所述离心条件为转速4000r/min，离心时间30min。
优选的，所述乙醇溶液的添加量为10 mL/g。
优选的，所述黑附球菌为黑附球菌LS10H已被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.13871；保藏日期：2017年06月06日，保藏地点：中国科学院微生物研究所。
一种真菌花色苷类红素，采用所述真菌花色苷类红素发酵制备方法制备而成。
优选的，所述真菌花色苷类红素在发酵过程中能分泌至细胞外并稳定的存在于发酵基质中。
优选的，所述真菌花色苷类红素分别在270-290nm、300-320nm、335-345nm和440-500nm波长范围内有特征性吸收峰。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1.本发明采用黑附球菌LS10H发酵制备真菌花色苷类红素，具有发酵工艺简单，色素产量高，发酵过程易于控制且不易染菌等特点。
2.本发明采用黑附球菌LS10H发酵制备真菌花色苷类红素，提取的真菌花色苷类红素的水溶液或乙醇溶液呈玫瑰红色，色泽鲜艳、亮丽，在天然食品色素添加剂中具有良好的应用前景。
3.本发明采用黑附球菌LS10H发酵制备真菌花色苷类红素，提取的真菌花色苷类红素具有优良的理化性质，具有对光照不敏感、在高温条件下稳定性好，且产物分离和提取过程简单且提取成本低。
附图说明
图1为实施例中不同温度条件下黑附球菌LS10H液态发酵真菌花色苷类红素产量图；
图2为实施例中不同摇床转速条件黑附球菌LS10H液态发酵真菌花色苷类红素产量图。
具体实施方式
下面通过对实施例的描述，作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
实施例1
本实施例采用黑附球菌LS10H液态发酵制备花色苷类红素：
1）种子培养：将黑附球菌LS10H在由马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，去离子水1000mL构成的pH为7的PDA培养基中进行划线培养，培养3天后使用10mL无菌水洗下菌丝体8cm2，制得菌丝体悬液，即为发酵用种子液；
2）发酵：取5mL上述菌丝体悬液接种于35mL由葡萄糖25g/L，蛋白胨1g/L，NaCl0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L构成的pH为5.5，经121℃灭菌20min冷却的液体培养基，于30℃,摇床转速200r/min下培养3天，将发酵培养物分别于10℃、15℃、20℃和25℃温度，摇床转速200r/min下继续培养3d；
3）乙醇提取色素：发酵结束后，在4000r/min离心30min，分离菌体和发酵液，然后向湿菌体中加入浓度为60%的乙醇溶液，乙醇的添加量为根据湿菌体的量而定，添加量为10mL/g，将两者混合均匀后，在25℃下浸取30min，在4000r/min离心30min后，得真乙醇提取液，直接吸取2.5mL发酵液或乙醇提取液并转移至1cm比色皿中，于室温条件下在450nm波长处测定光吸收值OD450，以未接种的发酵培养基作为空白对照，在上述发酵条件下，真菌花色苷类红素溶液总色素的含量以450nm处的光密度OD450表示，在10℃、15℃、20℃和25℃温度下获得的OD450分别为1.73、2.82、3.26和2.04，发酵液中色素的OD450分别为1.41、2.24、2.32和1.36，约分别占色素总含量的81.5%、79.4%、71.2%和66.7%，如图1所示。
实施例2
本实施例采用黑附球菌LS10H液态发酵制备花色苷类红素：
1）种子培养：将黑附球菌LS10H在由马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，去离子水1000mL构成的pH为7的PDA培养基中进行划线培养，培养3天后使用10mL无菌水洗下菌丝体8cm2，制得菌丝体悬液，即为发酵用种子液；
2）发酵：取5mL上述菌丝体悬液接种于35mL由葡萄糖25g/L，蛋白胨1g/L，NaCl0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L构成的pH为5.5，经121℃灭菌20min冷却的液体培养基，于30℃,摇床转速200r/min下培养3天，将发酵培养物分别于20℃温度，摇床转速分别为120r/min、160r/min、200r/min和240r/min条件下继续培养3d；
3）乙醇提取色素：发酵结束后，在4000r/min离心30min，分离菌体和发酵液，然后向湿菌体中加入浓度为60%的乙醇溶液，乙醇的添加量为根据湿菌体的量而定，添加量为10mL/g，将两者混合均匀后，在25℃下浸取30min，在4000r/min离心30min后，得乙醇提取液，直接吸取2.5mL发酵液或乙醇提取液并转移至1cm比色皿中，于室温条件下在450nm波长处测定光吸收值OD450，以未接种的发酵培养基作为空白对照，在上述发酵条件下，发酵液和菌体提取液中色素的总含量以450nm处的光密度OD450表示，在120r/min、160r/min、200r/min和240r/min条件下均有大量色素产生，在120r/min、160r/min、200r/min和240r/min条件下获得的OD450分别为0.62、2.31、3.26和2.82，发酵液中色素的OD450分别为0.38、1.55、2.32和2.11，约分别占色素总含量的61.3%、67.1%、71.2%和74.8%，如图2所示。
实施例3
真菌花色苷类红素分子量的测定：
将实施例1中发酵所得色素的提纯样品采用仪器WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS进行测定。采用Waters Acquity UPLC BEH C18柱(2.1mm x 50mm)分离，Waters AcquityPDA检测和质谱检测器，检测波长为200-700nm，时间为15min。流动相A相为90%异丙醇；B相为40%乙腈。柱温为45℃，流速为0.3 mL/min，进样量为5μL，梯度洗脱程序见表1。
表1 LC-MS洗脱程序
Figure DEST_PATH_IMAGE1
采用质谱条件：离子化方式为ESI+，毛细管电压为3.5 kV，锥孔电压为30V，脱溶剂气温度为400℃，脱溶剂气流速为700L/Hr，碰撞能量为6 eV，质量范围为50-1000，检测电压为1800V。测定结果显示该真菌色素为一类花色苷色素，含有但不仅限于分子量分别为596.2、576.2、522.2和536.2的物质。
实施例4
真菌花色苷类红素的温度稳定性测定：
使用去离子水配制OD值450nm为1.0的真菌花色苷类红素水溶液，将上述色素溶液置100℃水浴中保温，期间每隔5min取样并测定OD值450nm，计为At，则该色素的热稳定性以色素残留率（%）表示，色素残留率按公式（1）计算。
公式（1）：色素残留率（%）=At*100%
在上述条件下测定得到该真菌花色苷类红素对热的稳定性如表2所示。
表2色素的热稳定性
Figure DEST_PATH_IMAGE2
实验数据表明，真菌花色苷类红素在100℃条件下非常稳定，在沸水浴中煮沸40min后色素残留率为94%。
上面结合具体实施例对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种真菌花色苷类红素发酵制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）种子培养：将黑附球菌在PDA培养基中进行划线培养，培养3-4天后使用无菌水洗下菌丝体，制得菌丝体悬液，即为发酵用种子液；
（2）发酵：取种子液接种于液态发酵培养基中，于28-32℃、180-220r/min条件下培养1-3d后，然后将发酵条件设为10-25℃、120-240r/min，继续培养2-5d，所述液态发酵培养基pH为5.5；
（3）乙醇提取色素：发酵结束后，离心分离菌体和发酵液，然后向湿菌体中加入浓度为50%-100%的乙醇溶液，混合均匀后，在20-40℃下浸取30-60min，离心除去菌体，得含乙醇提取液；
所述黑附球菌为黑附球菌LS10H已被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.13871，保藏日期：2017年06月06日，保藏地点：中国科学院微生物研究所。
2.根据权利要求1所述的真菌花色苷类红素发酵制备方法，其特征在于，所述PDA培养基的组分为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，去离子水1000mL，pH为7。
3.根据权利要求1所述的真菌花色苷类红素发酵制备方法，其特征在于，所述液态发酵培养基的组分为葡萄糖10-30g/L，蛋白胨0.5-1.5g/L，NaCl 0.5-1g/L，K2HPO4 0.2-0.5g/L，MgSO4 0.3-0.6g/L，FeSO4 0.005-0.015g/L。
4.根据权利要求1所述的真菌花色苷类红素发酵制备方法，其特征在于，所述离心条件为转速4000r/min，离心时间30min。
5.根据权利要求1所述的真菌花色苷类红素发酵制备方法，其特征在于，所述乙醇溶液的添加量为10 mL/g。
6.一种真菌花色苷类红素，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述真菌花色苷类红素发酵制备方法制备而成。
7.根据权利要求6所述的真菌花色苷类红素，其特征在于，所述真菌花色苷类红素在发酵过程中能分泌至细胞外并稳定的存在于发酵基质中。
8.根据权利要求6所述的真菌花色苷类红素，其特征在于，所述真菌花色苷类红素分别在270-290nm、300-320nm、335-345nm和440-500nm波长范围内有特征性吸收峰。
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