ES2966030T3 - Anticuerpos anti-VEGFR-2/KDR humanos - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a anticuerpos que se unen a VEGFR-2. Los anticuerpos se usan para tratar enfermedades neoplásicas, trastornos hiperproliferativos y trastornos angiogénicos y pueden usarse solos o en combinación con otros agentes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-VEGFR-2/KDR humanos

Campo de la invención

La invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos que se unen a VEGFR-2. Los anticuerpos pueden utilizarse para tratar enfermedades neoplásicas y trastornos hiperproliferativos, y pueden utilizarse solos o en combinación con otros agentes.

Antecedentes de la invención

La angiogénesis es un proceso muy complejo de desarrollo de nuevos vasos sanguíneos que implica la proliferación, migración e infiltración tisular de células endoteliales capilares a partir de vasos sanguíneos preexistentes, el ensamblaje celular en estructuras tubulares, la unión de los conjuntos tubulares recién formados a sistemas vasculares de circuito cerrado, y la maduración de los vasos capilares recién formados.

La angiogénesis es importante en los procesos fisiológicos normales, incluido el desarrollo embrionario, el crecimiento folicular y la cicatrización de heridas. La angiogénesis indebida también conduce a la neovascularización en enfermedades neoplásicas y no neoplásicas, como la degeneración macular asociada a la edad, la retinopatía diabética y el glaucoma neovascular. El tratamiento antiangiogénico dirigido contra el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) con ranibizumab (Lucentis) ha demostrado ser eficaz para retrasar la progresión de la DMAE. Sin embargo, la neovascularización es compleja y es probable que contribuyan múltiples mecanismos angiogénicos. Sigue siendo necesario desarrollar agentes y terapias para tratar las enfermedades asociadas a la neovascularización.

Se han divulgado anticuerpos anti-VEGFR2 en Witteet al.(1998), Cancer Metastasis, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Países Bajos, vol. 17, n.° 2, páginas 155-161 y Goldmannet al.(2007), The FASEB Journal, vol. 21, n.° 4, páginas 1003-1012.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una molécula de anticuerpo que codifica un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une al VEGFR2 humano, que comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 4 y un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona entre el grupo que consiste en scFv, Fab, F(ab')<2>, anticuerpo biespecífico, diacuerpo y triacuerpo.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A-C muestran las secuencias de la región variable de la cadena pesada humana, la cadena ligera lambda y la cadena ligera kappa, respectivamente, de anticuerpos anti-VEGFR2 de la invención identificados por presentación en fagos.

La figura 2 muestra la unión de anticuerpos al hVEGFR2 (parte superior) y a una construcción que contiene los dominios 2 y 3 del hVEGFR2 (centro). El panel inferior muestra el bloqueo del ligando (VEGF<165>).

La figura 3 muestra que los mAb 101 y 102 inhiben la fosforilación estimulada por el VEGFA del VEGFR2, AKT y MAPK en células endoteliales de aorta porcina (PAE) que sobreexpresan KDR (VEGFR2 humano).

La figura 4 muestra la unión a hVEGFR2 y el bloqueo del ligando VEGF<165>por los mAb 104, 105, 106 y 108. Se obtuvieron resultados similares para los mAb 103, 107, 109 y 110 en un experimento independiente. Estos mAb contienen el dominio variable de cadena pesada de Mab101, recombinado con diferentes dominios variables de cadena ligera.

La figura 5 muestra que el mAb 106 de la invención y el mAb 105 inhiben la fosforilación de VEGFR2 estimulada por VEGFA, AKT y MAPK en células endoteliales de aorta porcina (PAE) que sobreexpresan KDR (VEGFR2 humano).

Descripción detallada

En un aspecto, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico como se definen en las reivindicaciones que codifican anticuerpos dirigidos contra VEGFR2 novedosos o fragmentos de unión a antígeno de dichos anticuerpos, que son eficaces para inhibir la transducción de señales dependiente de VEGFR2. Como se utiliza en el presente documento, "inhibir un receptor" significa disminuir y/o inactivar la actividad cinasa intrínseca del receptor para transducir una señal. Un ensayo fiable para la inhibición de VEGFR2 es la reducción de la fosforilación del receptor.

La presente divulgación no está limitada por ningún mecanismo en particular de inhibición del VEGFR2. El mecanismo seguido por un anticuerpo no es necesariamente el mismo que el seguido por otro. Algunos mecanismos posibles incluyen la prevención de la unión del ligando del VEGF al dominio de unión extracelular del VEGFR2, y la prevención de la dimerización u oligomerización de los receptores. Sin embargo, no se pueden descartar otros mecanismos.

Los anticuerpos son proteínas que reconocen y se unen a un antígeno o sustancia específica. Los anticuerpos descritos en el presente documento se unen preferentemente a KDR al menos con la misma fuerza que el ligando natural. La afinidad, representada por la constante de equilibrio de disociación de un antígeno con un anticuerpo(Kd),mide la fuerza de unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión de anticuerpos. La avidez es la medida de la fuerza de unión entre un anticuerpo y su antígeno. La avidez está relacionada tanto con la afinidad entre un determinante antigénico y un sitio de unión al antígeno en el anticuerpo, como con el número de sitios de unión (valencia) por anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo monovalente (por ejemplo, Fab) tiene un sitio de unión para un epítopo concreto. Un anticuerpo IgG tiene dos sitios de unión a antígeno. Los valores típicos de K (el recíproco de la constante de disociación Kd) son de 105 a 1011 litros/mol. Se considera que cualquier K inferior a 104 litros/mol indica una unión inespecífica.

Los anticuerpos codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención inhiben la activación del VEGFR2. Una medida de la inhibición de VEGFR2 es la reducción de la actividad tirosina cinasa del receptor. La inhibición de la tirosina cinasa puede determinarse utilizando métodos bien conocidos, como la medición del nivel de autofosforilación del receptor. La inhibición del VEGFR2 también puede observarse a través de la inhibición o regulación de eventos de fosforilación de sustratos naturales o sintéticos del VEGFR2 y otros componentes de la vía de transducción de señales del VEGFR2. La fosforilación puede detectarse, por ejemplo, utilizando un anticuerpo específico para la fosfotirosina en un ensayo ELISA o en una transferencia de western. Se describen algunos ensayos de actividad tirosina cinasa en Paneket al.,J. Pharmacol. Exp. Thera., 283: 1433-44 (1997) y Batleyet al.,Life Sci., 62: 143-50 (1998).

También pueden utilizarse ensayosin vivo.Por ejemplo, la inhibición de la tirosina cinasa receptora puede observarse mediante ensayos mitogénicos utilizando líneas celulares estimuladas con el ligando del receptor en presencia y ausencia del inhibidor. Por ejemplo, puede utilizarse células HUVEC (ATCC) estimuladas con VEGF para analizar la inhibición del VEGFR. Otro método consiste en comprobar la inhibición de la proliferación de células tumorales que expresan VEGF, usando, por ejemplo, células tumorales humanas inyectadas en un ratón. Véase, la patente estadounidense 6.365.157 (Rockwellet al.).

La invención proporciona ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-VEGFR2 y también se refiere a composiciones que comprenden dichos anticuerpos. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

Como se describe en el presente documento, empleando bibliotecas de presentación en fagos de Fab, se identificaron dos anticuerpos neutralizantes que se unen al VEGFR2 humano, bloquean la unión del ligando VEGFA al hVEGFR2, e inhiben la fosforilación de VEGFR2 y la transducción de señales posteriores estimuladas por VEGFA. La tabla 1 indica las secuencias de aminoácidos de las CDR y los dominios variables de los anticuerpos. Las Kd del mAb 101 y el mAb 102 son de aproximadamente 6,6 mM y 1,7 nM, respectivamente.

La cadena pesada del mAb 101 se reorganizó con genes de cadena ligera<k>(biblioteca de<k>) y genes de cadena ligera A (biblioteca de A). Se encontraron 20 variantes únicas de cadena ligera A mediante el barrido de la biblioteca de A frente al VEGFR2 humano y el VEGFR2 de ratón. Se encontraron 22 variantes únicas de la cadena ligera k mediante el análisis de la biblioteca de<k>frente al VEGFR2 humano y el VEGFR2 de ratón. La tabla 2 indica las secuencias de aminoácidos de las CDR y los dominios variables de las cadenas ligeras. Las Kd de los mAb 105, 106 y 107 se aumentaron aproximadamente 10 veces (0,24 nM, 0,22 nM, y 0,12 nM, respectivamente). Al igual que el anticuerpo precursor, estos anticuerpos se unen al VEGFR2 y bloquean la unión de VEGFA al VEGFR2, e inhiben la fosforilación del VEGFR2 estimulada por VEGFA, AKT y M<a>PK. (Fig. 4).

Varios de estos anticuerpos, incluidos los mAb 138, 139, 140 y 146, también reaccionan de forma cruzada con VEGFR2 de ratón. Estos anticuerpos también inhibieron la fosforilación de VEFGR2 estimulada por VEGFA y las moléculas de transducción de señales posteriores, incluida MAPK.

En el presente documento se describe un anticuerpo dirigido contra VEGFR2 aislado y fragmentos de unión a VEGFR2 del mismo, que comprende una, dos o tres CDR de cadena pesada y una, dos o tres CDR de cadena ligera, seleccionadas entre las secuencias expuestas en la tabla 1 y la tabla 2. En un anticuerpo descrito en el presente documento, cuando se selecciona más de una CDR de las secuencias presentadas en la tabla 1 y la tabla 2, no es necesario que las diferentes CDR se seleccionen a partir del mismo anticuerpo monoclonal presentado en dichas tablas, pero puede seleccionarse entre dos o más dominios de variables de anticuerpos presentados en las tablas. Las realizaciones específicas incluyen, pero sin limitación, las siguientes. Un anticuerpo aislado dirigido contra VEGFR2 descrito en el presente documento comprende una, dos o tres CDR de cadena pesada que tienen la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3. Un anticuerpo descrito en el presente documento comprende una, dos o tres CDR de cadena ligera que tienen la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7. Un anticuerpo descrito en el presente documento comprende una, dos o tres CDR de cadena ligera que tienen secuencias como las expuestas en la tabla 1 o 2. Algunos ejemplos no limitantes incluyen una región variable de cadena ligera que comprende una o más de la SEQ ID NO: 25, la SEQ ID NO: 26 y la SEQ ID NO: 27, una o más de la SEQ ID NO: 29, la SEQ ID NO: 30 y la SEQ ID NO: 31, o una o más de la SeQ ID NO: 33, la SEQ ID NO: 34 y la SEQ ID NO: 35. Un anticuerpo dirigido contra VEGFR2 descrito en el presente documento comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 12. Un anticuerpo dirigido contra VEGFR2 descrito en el presente documento comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 31 o la SEQ ID NO: 35. En el presente documento se describen anticuerpos que comprenden uno de los dominios variables de cadena pesada mencionados anteriormente y uno de los dominios variables de cadena ligera mencionados anteriormente. Como se describe en el presente documento, los anticuerpos dirigidos contra VEGFR2 o fragmentos de unión de los mismos comprenden una o más CDR o uno o más dominios variables con una secuencia de aminoácidos al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 %, idéntica a las secuencias de las CDR y el dominio variable expuestas en la tabla 1 o 2.

"Identidad" se refiere al número o porcentaje de posiciones idénticas compartidas por dos secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. "Sustancialmente idéntica" significa una secuencia de aminoácidos que solo difiere por sustituciones conservadoras de aminoácidos, por ejemplo, sustitución de un aminoácido por otro de la misma clase (por ejemplo, valina por glicina, arginina por lisina, etc.) o por una o más sustituciones, deleciones o inserciones no conservadoras localizadas en posiciones de la secuencia de aminoácidos que no destruyen la función de la proteína. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos es al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 85 % y lo más preferentemente al menos un 90 % similar a otra secuencia de aminoácidos. Los métodos y programas informáticos para determinar la similitud de secuencias están a disposición del público, entre los que se incluyen, pero sin limitación, el paquete de programas GCG (Devereuxet al.,Nucleic Acids Research 12: 387, 1984), B<l>A<s>TP, BLASTN, FASTA (Altschulet al.,J. Mol. Biol.

215:403 (1990), y el programa ALIGN (versión 2.0). También puede utilizarse el algoritmo de Smith Waterman bien conocido para determinar la similitud. El programa BLAST está disponible de forma pública en el NCBI y otras fuentes (Manual BLAST, Altschul,et al.,NCBI NLM NIH, Bethesda, Md. 20894; BLAST 2.0 en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Al comparar secuencias, estos métodos tienen en cuenta diversas sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones. Las sustituciones conservativas incluyen generalmente sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina.

Los anticuerpos descritos en el presente documento también incluyen aquellos cuyas características de unión se han mejorado mediante mutación directa, métodos de maduración de la afinidad, presentación en fagos o reordenamiento de cadenas. La afinidad y la especificidad pueden modificarse o mejorarse mutando las CDR y buscando sitios de unión al antígeno con las características deseadas. Las CDR se mutan de diversos modos. Una forma es aleatorizar restos individuales o combinaciones de restos para que en una población de sitios de unión a antígenos por lo demás idénticos, los veinte aminoácidos se encuentren en posiciones determinadas. Como alternativa, se inducen mutaciones en una serie de restos de CDR mediante métodos de PCR propensa a errores (véase, p. ej., Hawkinset al.,J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)). Por ejemplo, los vectores de presentación en fagos que contienen genes de la región variable de las cadenas pesada y ligera pueden propagarse en cepas mutantes deE. coli(véase, p. ej., Lowet al.,J. Mol. Biol., 250: 359-368 (1996)). Estos métodos de mutagénesis son ilustrativos de los diversos métodos conocidos por los expertos en la materia.

Para minimizar la inmunogenia de los anticuerpos que se unen a los receptores de VEGF, la presente invención proporciona anticuerpos que comprenden secuencias humanas de dominio variable y constante. Los anticuerpos pueden ser o pueden combinarse con miembros de cualquier clase de inmunoglobulina, tales como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, y las subclases de los mismos. La clase de anticuerpo puede seleccionarse para optimizar las funciones efectoras (por ejemplo, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)) de los anticuerpos naturales.

En el presente documento también se divulgan usos de los fragmentos de anticuerpo de unión a VEGFR2. Un Fv es el fragmento más pequeño que contiene un dominio variable completo de cadena pesada y ligera, incluidos los seis bucles hipervariables (CDR). Al carecer de dominios constantes, los dominios variables están asociados de forma no covalente. Las cadenas pesada y ligera pueden conectarse en una única cadena polipeptídica (un "Fv monocatenario" o "scFv") utilizando un enlazador que permite que los dominios V<h>y V<l>se asocien para formar un sitio de unión al antígeno. En una realización de la invención, el enlazador es (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3. Dado que los fragmentos scFv carecen de los dominios constantes de los anticuerpos completos, son considerablemente más pequeños que los anticuerpos completos. Los fragmentos scFv también están exentos de las interacciones del dominio variable de cadena pesada con otras moléculas biológicas, que en ciertas realizaciones pueden no ser deseadas.

También pueden utilizarse fragmentos de un anticuerpo que contiene V<h>, V<l>, y opcionalmente C<l>, C<h>1, u otros dominios constantes. Los fragmentos monovalentes de anticuerpos generados por digestión con papaína se denominan Fab y carecen de la región bisagra de la cadena pesada. Los fragmentos generados por digestión con pepsina, denominados F(ab')<2>, conservan la bisagra de cadena pesada y son divalentes. Dichos fragmentos también pueden producirse recombinantemente. Se conocen en la técnica muchos fragmentos diferentes de anticuerpos de unión a antígenos útiles, e incluyen, sin limitación, diacuerpos, triacuerpos, anticuerpos de dominio único y otras formas monovalentes y multivalentes.

En el presente documento también se describen proteínas de unión a antígeno multivalentes, que pueden estar en forma, sin limitación, de anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y proteínas que comprendan total o parcialmente porciones de unión a antígeno de anticuerpos. Las proteínas multivalentes de unión a antígenos pueden ser monoespecíficas, biespecíficas o multiespecíficas. El término especificidad se refiere al número de tipos diferentes de determinantes antigénicos a los que puede unirse una molécula concreta. Si una molécula de inmunoglobulina se une a un solo tipo de determinante antigénico, la molécula de inmunoglobulina es monoespecífica. Si la molécula de inmunoglobulina se une a diferentes tipos de determinantes antigénicos, la molécula de inmunoglobulina es multiespecífica.

Por ejemplo, un anticuerpo monocatenario multivalente biespecífico permite el reconocimiento de dos tipos diferentes de epítopos. Ambos epítopos pueden estar en el mismo antígeno (por ejemplo, VEGFR2). Como alternativa, un epítopo puede estar en un antígeno (por ejemplo, VEGFR2), y el segundo epítopo en un antígeno diferente.

Como se describe en el presente documento, un anticuerpo multivalente monocatenario incluye un fragmento variable de cadena ligera unido a un fragmento variable de cadena pesada (similar a un scFv), que además está unido por otro enlazador peptídico a al menos otro dominio de unión a antígeno. Normalmente, el enlazador peptídico está compuesto por unos quince restos de aminoácidos. Preferentemente, el número de dominios V<l>y V<h>es equivalente. Por ejemplo, un anticuerpo bivalente monocatenario puede representarse de la siguiente manera: V<l>-L1-V<h>-L2-V<l>-L3-V<h>o V<l>-L<1>-V<h>-L<2>-VH-L<3>-VL o V<h>-L1-V<l>-L2-V<h>-L3-V<l>o V<h>-L<1>-VL-L<2>-VL-L<3>-VH. Los anticuerpos monocatenarios multivalentes que son trivalentes o superiores tienen uno o más fragmentos de anticuerpo unidos a un anticuerpo monocatenario bivalente mediante enlazadores peptídicos adicionales. Un ejemplo de anticuerpo trivalente monocatenario es: Vl-L<1>-Vh -L<2>-Vl-Li-Vh -L<2>-Vl-Li-Vh.

Dos anticuerpos monocatenarios pueden combinarse para formar un diacuerpo, también conocido como dímero bivalente. Los diacuerpos tienen dos cadenas. Cada cadena del diacuerpo incluye un dominio V<h>conectado a un dominio V<l>por un enlazador corto de unos 5-10 restos de aminoácidos, p. ej., (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)<2>. Dichos enlazadores son lo suficientemente cortos como para impedir el emparejamiento intracadena entre dominios de la misma cadena, impulsando así el emparejamiento entre cadenas entre dominios complementarios de cadenas diferentes y recreando dos sitios de unión a antígeno. La estructura del diacuerpo es rígida y compacta, con sitios de unión al antígeno en extremos opuestos de la molécula. Los diacuerpos pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.

Puede combinarse tres anticuerpos monocatenarios para formar un triacuerpo, también conocidos como trímeros trivalentes. Como se describe en el presente documento, los triacuerpos se construyen con el extremo carboxilo de un dominio Vl o Vh fusionado directamente al extremo amínico de un dominio Vh o Vl, es decir, sin secuencia enlazadora. El triacuerpo tiene tres cabezas Fv con los polipéptidos dispuestos de manera cíclica, de cabeza a cola. Una posible conformación de la molécula de triacuerpo es planar, con tres sitios de unión ubicados en un plano en un ángulo de 120 grados entre sí. Los triacuerpos pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o triespecíficos.

Debe entenderse que los anticuerpos anti-VEGFR2 de la invención, cuando se utilizan en un mamífero con fines de profilaxis o tratamiento, se administrarán en forma de una composición que comprende adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden también comprender cantidades mínimas de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que mejoran el periodo de validez o la eficacia de los anticuerpos.

En los métodos descritos en el presente documento, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo codificado por una molécula de ácido nucleico de la invención a un mamífero que lo necesite. El término "administrar", como se usa en el presente documento, significa suministrar los anticuerpos a un mamífero por cualquier método que pueda lograr el resultado buscado. Pueden administrarse, por ejemplo, por vía intravenosa o intramuscular. Aunque los anticuerpos humanos son particularmente útiles para la administración a seres humanos, también pueden administrarse a otros mamíferos. El término "mamífero", como se usa en el presente documento, pretende incluir, pero sin limitación, seres humanos, animales de laboratorio, mascotas domésticas y animales de granja. "Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de anticuerpo que, cuando se administra a un mamífero, es eficaz para producir el efecto terapéutico deseado, tal como inhibir la actividad cinasa. Por ejemplo, dependiendo de la enfermedad, para un anticuerpo, esto puede requerir 0,1, 1,0, 3,0, 6,0 o 10,0 mg/Kg. Para una IgG con una masa molecular de 150.000 g/mol (dos sitios de unión), estas dosis corresponden aproximadamente a 18 nM, 180 nM, 540 nM, 1,08 pM y 1,8 pM de sitios de unión para un volumen de sangre de 5 l.

Los anticuerpos codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención son útiles para inhibir el crecimiento tumoral, la angiogénesis asociada al crecimiento tumoral, u otra patología asociada con la angiogénesis. Entre los tumores que pueden tratarse se encuentran los tumores primarios, tumores metastásicos y tumores refractarios. Los tumores refractarios incluyen tumores que no responden o que son resistentes al tratamiento solo con agentes quimioterapéuticos, solo con anticuerpos, solo con radiación o combinaciones de los mismos. Los tumores refractarios también engloban los tumores que parecen ser inhibidos por el tratamiento con dichos agentes, pero que reaparecen hasta cinco años, a veces hasta diez años o más después de interrumpir el tratamiento. Los anticuerpos son eficaces para tratar tumores vascularizados y tumores no vascularizados, o aún no sustancialmente vascularizados.

Por consiguiente, algunos ejemplos de tumores sólidos que pueden tratarse son carcinoma de mama, carcinoma de pulmón, carcinoma colorrectal, carcinoma pancreático, glioma y linfoma. Algunos ejemplos de este tipo de tumores son tumores epidermoides, tumores escamosos, tales como tumores de cabeza y cuello, tumores colorrectales, tumores prostáticos, tumores mamarios, tumores pulmonares, incluidos tumores pulmonares microcíticos y no microcíticos, tumores pancreáticos, tumores tiroideos, tumores ováricos y tumores hepáticos. Otros ejemplos son el sarcoma de Kaposi, neoplasias del SNC, neuroblastomas, hemangioblastomas capilares, meningiomas y metástasis cerebrales, melanoma, carcinomas y sarcomas gastrointestinales y renales, rabdomiosarcoma, glioblastoma, preferentemente glioblastoma multiforme y leiomiosarcoma. Algunos ejemplos de cánceres de piel vascularizados para los que los antagonistas de esta invención son eficaces incluyen carcinoma epidermoide, carcinoma basocelular y cánceres de piel que pueden tratarse suprimiendo el crecimiento de queratinocitos malignos, como los queratinocitos malignos humanos.

Algunos ejemplos de tumores no sólidos incluyen leucemia, mieloma múltiple y linfoma. Algunos ejemplos de leucemias incluyen leucemia mielógena aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia eritrocítica o leucemia monocítica. Algunos ejemplos de linfomas incluyen linfoma de Hodgkin y linfoma no hodgkiniano.

Los anticuerpos codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención también pueden utilizarse para tratar o prevenir patologías caracterizadas por una angiogénesis excesiva, que implican, por ejemplo, vascularización y/o inflamación, tales como ateroesclerosis, artritis reumatoide (RA), hemangiomas, angiofibromas y psoriasis. Otros ejemplos no limitantes de enfermedad angiogénica no neoplásica son la retinopatía del prematuro (fibroplásica retrolental), rechazo de injerto de córnea, diabetes mellitus insulinodependiente, esclerosis múltiple, miastenia grave, enfermedad de Crohn, nefritis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, pancreatitis aguda, rechazo de aloinjertos, inflamación alérgica, dermatitis de contacto y reacciones de hipersensibilidad retardadas, enteropatía inflamatoria, choque séptico, osteoporosis, artrosis, defectos cognitivos inducidos por la inflamación neuronal, síndrome de Osler-Weber, restinosis e infecciones fúngicas, parasitarias y víricas, incluidas infecciones por citomegalovirus.

Entre las enfermedades oculares caracterizadas por una angiogénesis excesiva se encuentra el glaucoma neovascular, la retinopatía proliferativa, incluida la retinopatía proliferativa diabética y la degeneración macular. Los anticuerpos codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención pueden utilizarse para tratar enfermedades y trastornos oculares. Los anticuerpos codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención pueden utilizarse para tratar la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), que se presenta en forma "seca" y "húmeda". La forma "húmeda" de la DMAE provoca pérdida de visión debido al crecimiento anormal de vasos sanguíneos (neovascularización). El sangrado, las fugas y la cicatrización de estos vasos sanguíneos retinianos acaban provocando daños irreversibles en los fotorreceptores. La forma seca es el resultado de la atrofia de la capa epitelial pigmentaria de la retina, que causa la pérdida de visión a través de la pérdida de fotorreceptores (bastones y conos) en la parte central del ojo. Los anticuerpos codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención pueden utilizarse para tratar la neovascularización coroidea (NVC). La neovascularización coroidea es un proceso en el que crecen nuevos vasos sanguíneos en la coroides, a través de la membrana de Bruch e invaden el espacio subretiniano, y es un síntoma de, entre otras causas, degeneración macular asociada a la edad, miopía y traumatismos oculares. Los anticuerpos codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención pueden utilizarse para tratar el edema macular diabético (EMD). Los anticuerpos codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención pueden utilizarse para tratar el edema macular secundario a la oclusión de la rama venosa de la retina (OVRR) o a la oclusión de la vena central de la retina (OVCR). Otras enfermedades tratables son, sin limitación, neovascularización del iris, uveítis, glaucoma neovascular y retinitis del prematuro (ROP). El método de tratamiento puede ser profiláctico, por ejemplo, para evitar la neovascularización corneal tras un trasplante de córnea, o para modular el proceso de cicatrización en la cirugía de trabeculectomía.

Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención pueden administrarse ventajosamente con segundos agentes a pacientes que los necesiten. Por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra VEGFR-2 se administra a un sujeto con un agente antineoplásico. Un anticuerpo dirigido contra VEGFR-2 puede administrarse a un sujeto con un segundo inhibidor de la angiogénesis. Un anticuerpo dirigido contra VEGFR-2 puede administrarse con un agente antiinflamatorio o un inmunodepresor.

Los agentes antineoplásicos incluyen agentes quimioterapéuticos citotóxicos, moléculas pequeñas dirigidas y moléculas biológicas, y radiación. Algunos ejemplos no limitantes de agentes quimioterápicos incluyen cisplatino, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, irinotecán, mecloretamina (mostaza nitrogenada), estreptozocina, ciclofosfamida, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), doxorrubicina (adriamicina), daunorrubicina, procarbazina, mitomicina, citarabina, etopósido, metotrexato, 5-fluorouracilo, vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotere), aldesleucina, asparaginasa, busulfán, carboplatino, cladribina, dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiurea, ifosfamida, interferón alfa, leuprolida, megestrol, melfalán, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargasa, pentostatina, pipobromano, plicamicina, estreptozocina, tamoxifeno, tenipósido, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostaza de uracilo, vinorelbina, clorambucilo, taxol y combinaciones de los mismos.

Las pequeñas moléculas y moléculas biológicas dirigidas incluyen, sin limitación, inhibidores de componentes de las vías de transducción de señales, tales como moduladores de tirosina cinasas e inhibidores de receptores de tirosina cinasas, y agentes que se unen a antígenos específicos de tumores. Algunos ejemplos no limitantes de receptores de factores de crecimiento implicados en la tumorigénesis son los receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), factor de crecimiento insulínico (IGFR), factor de crecimiento nervioso (NGFR), y factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), y receptores de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico, incluidos EGFR (erbB1), He R2 (erbB2), erbB3, y erbB4.

Los antagonistas del EGFR inducen anticuerpos que se unen al EGFR o a un ligando del EGFR, e inhiben la unión del ligando y/o la activación del receptor. Por ejemplo, el agente puede bloquear la formación de dímeros o heterodímeros del receptor con otros miembros de la familia del EGFr . Algunos ligandos para el EGFR incluyen, por ejemplo, EGF, TGF-a, anfirregulina, eGF ligado a la heparina (HB-EGF) y betarecululina. Un antagonista del EGFR puede unirse externamente a la porción extracelular del EGFR, que pueden inhibir o no la unión del ligando, o internamente al dominio tirosina cinasa. Los antagonistas del EGFR incluyen además agentes que inhiben la transducción de señales dependiente del EGFR, por ejemplo, inhibiendo la función de un componente de la vía de transducción de señales del EGFR. Algunos ejemplos de antagonistas del EGFR que se unen al EGFR incluyen, sin limitación, moléculas biológicas, tales como anticuerpos (y sus equivalentes funcionales) específicos para el EGFR, y moléculas pequeñas, tales como inhibidores sintéticos de la cinasa que actúan directamente sobre el dominio citoplasmático del EGFR.

Algunos inhibidores biológicos y de moléculas pequeñas incluyen inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), incluidos gefitinib, erlotinib y cetuximab, inhibidores de HER2 (p. ej., trastuzumab, trastuzumab emtansina (trastuzumab-DM1; T-DM1) y pertuzumab), anticuerpos anti-VEGF y fragmentos (p. ej., bevacizumab), anticuerpos que inhiben CD20 (por ejemplo, rituximab, ibritumomab), anticuerpos anti-VEGFR (p. ej., ramucirumab (IMC-1121B), IMC-1C11 y CDP791), anticuerpos anti-PDGFR e imatinib. Los inhibidores de cinasa de molécula pequeña pueden ser específicos para una tirosina cinasa concreta o ser inhibidores de dos o más cinasas. Por ejemplo, el compuesto N-(3,4-dicloro-2-fluorofenil)-7-({[(3aR,6aS)-2-metiloctahidrociclopenta[c]pirrol-5-il]metil}oxi)-6-(metiloxi)quinazolin-4-amina (también conocido como XL647, EXEL-7647 y KD-019) es un inhibidorin vitrode varias tirosina cinasas receptoras (RTK), incluidas EGFR, EphB4, KDR (VEGFR), Flt4 (VEGFR3) y ErbB2, y también es un inhibidor de la SRC cinasa, que participa en las vías que provocan la falta de respuesta de los tumores a determinados TKI. Como se divulga en el presente documento, el tratamiento de un sujeto que lo necesita puede comprender la administración de un inhibidor de la rho-cinasa de fórmula I y la administración de KD-019.

Dasatinib (BMS-354825; Bristol-Myers Squibb, Nueva York) es otro inhibidor de Src competitivo en el sitio de ATP, biodisponible por vía oral. El dasatanib también se dirige contra Bcr-Abl (aprobado por la FDA para su uso en pacientes con leucemia mielógena crónica (CML) o leucemia linfoblástica aguda (LLA) con cromosoma Filadelfia positivo (Ph+)), así como contra c-Kit, PDGFR, c-FMS, EphA2 y SFK. Otros dos inhibidores orales de la tirosina cinasa Src y Bcr-Abl son bosutinib (s K i-606) y saracatinib (AZD0530).

Mientras que el VEGFR2 media la mayoría de los efectos posteriores del VEGF en la angiogénesis, puede ser ventajoso administrar un segundo inhibidor de la angiogénesis. Los anticuerpos anti-VEGFR-2 codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención pueden administrarse con anticuerpos que neutralizan otros receptores implicados en el crecimiento tumoral o la angiogénesis.

Algunos ejemplos no limitantes de agentes de unión a VEGF incluyen anticuerpos de VEGF y trampas de VEGF (es decir, dominios de unión a ligando de receptores de VEGF. Dos ejemplos de anticuerpos (incluidos los fragmentos de anticuerpos de unión al VEGF) son el bevacizumab (Avastin), un anticuerpo que se une al VEGF-A, y ranibizumab (Lucentis), un Fab derivado del bevacizumab. En general, una trampa de VEGF es una proteína que comprende dominios de unión a VEGF de una o más proteínas receptoras de VEGF. Las trampas de VEGF incluyen, sin limitación, VEGFR-1 soluble, neuropilina 1 soluble (NRP1), VEGFR-3 soluble (que se une a VEGF-C y VEGF-D) y aflibercept (Zaltrap; Eylea; VEGF Trap R1R2), compuesto por segmentos de los dominios extracelulares de los receptores humanos del factor de crecimiento endotelial vascular VEGFR1 y VEGFR2 fusionados a la región constante (Fc) de IgG1 humana. Conbercept (KH902) es una proteína de fusión que contiene el dominio extracelular 2 de VEG<f>R-1 (Flt-1) y el dominio extracelular 3, 4 de VEGFR-2 (KDR) fusionados a la porción Fc de IgG1 humana. En la patente estadounidense 8.216.575 se describen varias trampas de VEGF que contienen dominios KDR y FLT-1 similares a Ig en diversas combinaciones. Las DARPin (acrónimo de designed ankyrin repeat proteins, proteínas de repetición de anquirina diseñadas) son proteínas miméticas de anticuerpos modificadas genéticamente que suelen presentar una unión a la proteína diana muy específica y de alta afinidad. DARPin® MP0112 es un inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y ha entrado en ensayos clínicos para el tratamiento de la degeneración macular húmeda y del edema macular diabético.

La expresión de VEGF se puede dirigir. Por ejemplo, el inhibidor del VEGF PTC299 se dirige al VEGF de forma post-transcripcional mediante la unión selectiva de las regiones 5' y 3' no traducidas (UTR) del ARN mensajero (ARNm) del VEGF, impidiendo así la traducción del VEGF. El pegaptanib (Macugen) es un aptámero de ARN dirigido contra el VEGF-165.

El factor de crecimiento placentario (PIGF) se ha relacionado con la angiogénesis patológica. El PIGF está estructuralmente relacionado con el VEGF y también es un ligando del VEGFR-1. Por consiguiente, las trampas de VEGF que comprenden el dominio extracelular de VEGFR1 (véase más arriba) son útiles para dirigirse a PIGF. Los agentes antiangiogénicos incluyen además los que se unen al receptor VEGFR-1/Flt-1. Las proteínas de unión a antígenos que se unen al dominio extracelular del VEGFR-1 pueden bloquear la unión de uno o ambos de sus ligandos, VEGf y PIGF, y/o neutralizar la activación de VEGFR-1 inducida por VEGF o PIGF.

El PDGF está compuesto por cuatro cadenas polipeptídicas que forman los homodímeros PDGF-AA, BB, CC y DD, así como el heterodímero PDGF-AB. Los receptores de PDGF (PDGFR) a y p median las funciones del PDGF. Concretamente, el PDGFRa se une a PDGF-AA, -BB, -AB y -CC, mientras que el PDGFRp interactúa con -BB y -DD. Algunos ejemplos no limitantes de agentes de unión a PDGF incluyen anticuerpos anti-PDGF y trampas de PDGF. Entre los agentes dirigidos contra el PDGF se encuentra Fovista™ (E10030, Ophthotech), un aptámero pegilado dirigido a PDGF-B, y AX102 (Senninoet al.,2007, Cancer Res. 75(15):7359-67), un aptámero de oligonucleótidos de ADN que se une a PDGF-B.

Algunos agentes dirigidos contra los receptores del PDGF incluyen ramucirumab (IMC-3G3, igGi humana) un anticuerpo anti-PDGFRa, crenolanib (CP-868596), un inhibidor selectivo de PDGFRa (CI<50>= 0,9 nM) y PDGFRp (CI<50>= 1,8 nM), y nilotinib (Tasigna®), un inhibidor de PDGFRa y PDGFRp y otras tirosina cinasas.

Algunos inhibidores de la angiogénesis incluyen agentes intracelulares que bloquean la transducción de señales mediada por, por ejemplo, VEGF, PDGF, ligandos de los receptores de VEGF o PDGF, o el complemento. Algunos agentes intracelulares inhibidores de la angiogénesis incluyen los siguientes, sin limitación. sunitinib (Sutent; SU11248) es un inhibidor panespecífico de molécula pequeña de VEGFR1-VEGFR3, PDGFRa y PDGFRp, receptor del factor de células madre (cKIT), Flt-3 y receptor del factor estimulante de colonias-1 (CSF-1R). Axitinib (AG013736; Inlyta) es otro inhibidor de molécula pequeña de tirosina cinasa que inhibe VEGFR-1-VEGFR-3, PDGFR y cKIT. Cediranib (AZD2171) es un inhibidor de VEGFR-1-VEGFR-3, PDGFRp y cKIT. El sorafenib (Nexavar) es otro inhibidor de molécula pequeña de varias proteínas tirosina cinasas, incluidas VEGFR, PDGFR y Raf cinasas. Pazopanib (Votrient; (GW786034) inhibe al VEGFR-1, -2 y -3, cKIT y P<d>G<f>R. Foretinib (GSK1363089; XL880) inhibe al VEGFR<2>y MET, al igual que el cabozantinib (Cometriq; XL184). Ponatinib (Iclusig; AP24534) inhibe al VEGFR, PDGFR y c kit. Tivozanib (Av -951 ) inhibe al VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3 a concentraciones picomolares. CP-547632 es un potente inhibidor de las cinasas VEGFR-2 y del factor básico de crecimiento de fibroblastos (FGF). E-3810 ((6-(7-((1-aminociclopropil) metoxi)-6-metoxiquinolin-4-iloxi)-N-metil-1-naftamida) inhibe el VEGFR-1, -2, y -3 y las cinasas FGFR-1 y -2 en el intervalo nanomolar. El brivanib (BMS-582664) es un inhibidor del VEGFR-2 que también inhibe la señalización del receptor de FGF. CT-322 (Adnectin) es una pequeña proteína basada en un dominio de fibronectina humana que se une al VEGFR2 e inhibe su activación. Vandetanib (Caprelas; Zactima; ZD6474) es un inhibidor de VEGFR<2>, EGFR y RET. X-82 (Xcovery) es una indolinona de molécula pequeña inhibidora de la señalización a través de los receptores del factor de crecimiento VEGFR y PDGFR.

Los anticuerpos anti-VEGFR codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención pueden coadministrarse con inhibidores de la metaloproteinasa de matriz. Las metaloproteasas de matriz (MMP), tales como MMP-14, MMP-16 y MMP-24, escinden componentes de la matriz extracelular (MEC) y de las membranas basales, permitiendo así que las células cancerosas penetren y se infiltren en la matriz estromal subyacente. Además, una serie de receptores de factores de crecimiento, moléculas de adhesión celular, quimiocinas, citocinas, ligandos apoptóticos y factores angiogénicos son sustratos de las MMP. Por tanto, la actividad de las MMP puede causar la activación de factores de crecimiento, la supresión de la apoptosis de las células tumorales, la destrucción de los gradientes de quimiocinas desarrollados por la respuesta inmunitaria del hospedador o la liberación de factores angiogénicos. Las MMP pueden facilitar el crecimiento tumoral al promover la liberación de factores de proliferación celular como los factores de crecimiento similares a la insulina que están unidos a proteínas de unión específicas (IGFBP) (Maneset al.,1997 J. Biol. Chem. 272: 25706-25712).

Las colagenasas, incluida MMP-2, se han encontrado en concentraciones elevadas en el melanoma y en los cánceres de colon, mama, pulmón, próstata y vejiga. Normalmente, estas concentraciones elevadas se correlacionan con un tumor de mayor grado y con invasividad. Las concentraciones de MMP-2 están significativamente elevadas en el suero de pacientes con cáncer de pulmón metastásico, y en aquellos pacientes con concentraciones elevadas, disminuye la respuesta a la quimioterapia. MMP-14, que escinde la proMMP-2 para liberar la MMP-2 activa, está elevada en numerosos tipos de cáncer y puede contribuir al crecimiento de los tumores, la embolia tumoral y la movilidad, invasividad y metástasis del cáncer (por ejemplo, tumores del SNC (por ejemplo, gliomas), cáncer de cabeza y cuello, cáncer de la cavidad bucal, cáncer de laringe, condrosarcoma, cáncer de mama). Las MMP-16 y<m>MP-24 también están elevadas en numerosos tipos de cáncer y pueden contribuir tanto al crecimiento de tumores como a la invasividad y metástasis del cáncer (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de laringe, cáncer de ovario, carcinoma testicular, melanoma, tumores cerebrales (por ejemplo, astrocitomas, glioblastomas, gliomas).

Los anticuerpos anti-VEGFR codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención pueden coadministrarse con antagonistas de MMP-14, incluidos, entre otros, los anticuerpos anti-MMP-14 divulgados en las patentes estadounidenses 7.745.587 y 8.106.168. El anticuerpo puede ser el anticuerpo monoclonal humano DX-2400 (Dyax Corp). La coadministración con dicho anticuerpo es adecuada para el tratamiento de carcinomas humanos, entre los que se incluyen, pero sin limitación, de cuello uterino, estómago, pulmón, mama, colon, cabeza y cuello, tumores cerebrales malignos y melanoma.

Un anticuerpo dirigido contra el VEGFR2 codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención puede administrarse en combinación con uno o más adyuvantes adecuados, tales como, por ejemplo, citocinas (IL-10 e IL-13, por ejemplo) u otros estimuladores inmunitarios. Debería apreciarse, sin embargo, que la administración de solo un anticuerpo anti-KDR es suficiente para prevenir, inhibir o reducir la progresión del tumor de forma terapéuticamente eficaz.

Los antiinflamatorios e inmunosupresores incluyen fármacos esteroideos como los glucocorticoides (por ejemplo, la dexametasona), FK506 (tacrolimus), ciclosporina, fingolimod, interferón, tal como IFNp o IFNy, una proteína fijadora del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), como infliximab (Remicade), etanercept (Enbrel), o adalimumab (Humira), y ácido micofenólico.

Un anticuerpo codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención y un segundo agente pueden administrarse como sigue: docetaxel para tumores sólidos, incluidos el cáncer de mama y los cánceres renales y de las vías urinarias, paclitaxel (tumores sólidos, adenocarcinoma gástrico), FOLFRI (es decir irinotecán, ácido folínico, 5-fluorouracilo) para el cáncer colorrectal, capecitabina (cáncer de mama), FOLFOX (es decir, oxaliplatino, leucovorina, 5-fluorouracilo) (cánceres gástrico, esofágico y gastroesofágico), eribulina (cáncer de mama), FOLFIRI (es decir, irinotecán, levofolinato, 5-fluorouracilo) (carcinoma colorrectal), carboplatino (CPNM), mitoxantrona y prednisona (cáncer de próstata), OFF (oxaliplatino ácido folínico, 5-florouracilo) (cáncer colorrectal), irinotecán y cetuximab (cáncer colorrectal), y dacarbazina (melanona maligno).

Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención pueden conjugarse con un agente, p. ej., un fármaco citotóxico, enzima citotoxina o radioisótopo. Este método incluye la administración de la proteína de unión sola o unida a un agente (por ejemplo, un fármaco citotóxico), a un sujeto que necesita dicho tratamiento. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra el VEGFR2 o los fragmentos del mismo pueden utilizarse para administrar nanopartículas que contienen agentes, tales como toxinas, a células o tejidos asociados al VEGFR2, p. ej., tumores.

Las proteínas de unión a VEGFR2 pueden utilizarse directamentein vivopara eliminar las células que expresan antígenos mediante citotoxicidad natural dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Las proteínas de unión descritas en el presente documento pueden incluir el dominio efector de unión al complemento, tales como las porciones Fc de IgG1, -2 o -3 o porciones correspondientes de IgM que se unen al complemento.

Cuando se administra un anticuerpo dirigido contra VEGFR-2 con un segundo agente, los agentes primero y segundo pueden administrarse secuencial o simultáneamente. Cada agente puede administrarse en dosis únicas o múltiples, y las dosis pueden administrarse en cualquier pauta, lo que incluye, sin limitación, dos veces al día, cada día, cada semana, cada dos semanas y cada mes.

En el presente documento también se divulga la administración complementaria. La administración complementaria significa que se administra un segundo agente a un paciente, además de un primer agente que ya se está administrando, para tratar una enfermedad o un síntoma de la enfermedad. La administración complementaria puede incluir la administración de un segundo agente a un paciente en el que la administración del primer agente no trató, o no trató suficientemente, la enfermedad o el síntoma de la enfermedad. La administración complementaria también puede incluir la administración del segundo agente a un paciente cuya enfermedad ha sido tratada eficazmente mediante la administración del primer agente.

Un anticuerpo o un fragmento del mismo codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención puede administrarse mediante inyección, una molécula pequeña puede administrarse por vía oral. El anticuerpo puede administrarse semanalmente o una o dos veces al mes y la molécula pequeña se administra cada día.

Un anticuerpo o un fragmento del mismo codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención puede administrarse por inyección, y un inhibidor de ROCK2 se administra por vía oral. Los agentes pueden administrarse una vez al día. Cuando un inhibidor de ROCK, o un anticuerpo dirigido contra VEGFR2 se administran a un sujeto para tratar una enfermedad ocular, puede administrarse al sujeto un antagonista del TGF-p para reducir o prevenir la cicatrización. Por ejemplo, cuando se administra un inhibidor de ROCK para tratar un trastorno ocular, también se administra un antagonista del TGF-p. Como se describe en el presente documento, cuando se administra un antagonista del VEGF a un sujeto para tratar un trastorno ocular, también se administra un antagonista del TGF-p. Como se describe en el presente documento, cuando un inhibidor de ROCK y un antagonista de VEGF se administran a un sujeto para tratar un trastorno ocular, también se administra un antagonista del TGF-p. En las enfermedades oculares que implican neovascularización, la fuga de nuevos vasos sanguíneos va seguida de la formación de cicatrices (por ejemplo, cicatriz discoide). También se describe en el presente documento la administración de un antagonista de TGF-p, así como un antagonista de VEGF y un inhibidor de ROCK2 a un sujeto para tratar la neovascularización en enfermedades oculares.

Algunos antagonista de TGF-p útiles incluyen, sin limitación, los siguientes: (i) anticuerpos anti-TGF-p y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, tales como el anticuerpo pan-TGF-p GC-1008 (Genzyme), el anticuerpo anti-TGF-p<1>metelimumab (CAT-192) (Cambridge Antibody Technology), y fragmentos de unión a antígeno de dichos anticuerpos, (ii) receptores solubles de TGF-p o fragmentos de unión a ligando de los mismos, tales como P144, un péptido sintético que abarca los aminoácidos 730-743 del dominio de unión a ligando membranoproximal del receptor de TGF-p tipo III (Esparza-Lópezet al.,2001, J. Biol. Chem. 276(18): 14588-96), y una fusión receptor TGF-p tipo II - Fc (IgGi) (Smith, J.et al.,1999, Circulation Res. 84: 1212-22), (iii) péptidos que se unen a los receptores de TGF-p que bloquean una o más isoformas de TGF-p, tales como los péptidos de 25 aminoácidos del TGF-p<1>, TGF-p<2>, y TGF-p3 divulgados por Huanget al.,1997, J. Biol. Chem. 272:27155-59, que se unen a los receptores de TGF-p, y (iv) agentes antisentido que inhiben la síntesis de TGF-p, tales como trabedersen (Antisense Pharma GmbH), un oligonucleótido que inhibe la síntesis de TGF-02. Se divulgan antagonistas adicionales en los documentos WO2006/052568, WO 02/094833, WO 04/048382, WO 04/048381, WO 04/050659, WO 04/021989, WO 04/026871 y WO 04/026307.

Una dosis de un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención puede administrarse a un sujeto cada día, en días alternos, cada dos días, cada tres días, una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana o una vez cada dos semanas. Dos, tres o cuatro dosis de un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención pueden administrarse a un sujeto cada día, cada dos días, cada tres días, una vez a la semana o una vez cada dos semanas. Una o más dosis de un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención puede administrarse durante 2 días, 3 días, 5 días, 7 días, 14 días o 21 días. Una dosis de un anticuerpo o un fragmento del mismo codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención puede administrarse durante 1 mes, 1,5 meses, 2 meses, 2,5 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses o más.

Algunos métodos de administración incluyen, pero sin limitación, administración parenteral, intradérmica, intravítrea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, oral, sublingual, intranasal, intracerebral, intravaginal, transdérmica, transmucosa, rectal, por inhalación o tópica, particularmente en los oídos, nariz, ojos o piel. El modo de administración se deja al arbitrio del médico. En la mayoría de los casos, la administración dará como resultado la liberación de un compuesto al torrente sanguíneo. Para el tratamiento de enfermedades oculares, se prefiere la administración intravítrea de agentes biológicos.

Puede ser deseable administrar localmente un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención. Esto puede conseguirse, por ejemplo, y no a modo de limitación, mediante infusión local, aplicación tópica, mediante inyección, mediante un catéter o mediante un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluidas membranas, tales como membranas elásticas, o fibras. En dichos casos, puede dirigirse selectivamente a un tejido local sin liberación sustancial de un compuesto al torrente sanguíneo.

También puede emplearse administración pulmonar, p. ej., mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente aerosolizante, o mediante infusión en un tensioactivo pulmonar de fluorocarbono o sintético. Como se describe en el presente documento, un compuesto se formula en forma de supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales, tales como triglicéridos.

Como se describe en el presente documento, se suministra un compuesto en una vesícula, concretamente un liposoma (véase Langer, 1990, Science 249:1527 - 1533; Treatet al.,en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Bacterial infection, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, págs. 353 - 365 (1989); Lopez Berestein, anteriormente citado, págs. 317-327; véase, en general, la cita anterior).

Como se describe en el presente documento, un compuesto se administra en un sistema de liberación controlada (véase, p. ej., Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, citado anteriormente, vol. 2, págs. 115 -138 (1984)). Algunos ejemplos de sistemas de liberación controlada que pueden utilizarse se analizan en la revisión de Langer, 1990, Science 249:1527 - 1533. Como se describe en el presente documento, puede utilizarse una bomba (véase Langer, anteriormente citado; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwaldet al.,1980, Surgery 88:507; Saudeket al.,1989, N. Engl. J. Med. 321:574). Como se describe en el presente documento, pueden utilizarse materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem.

23:61; véase también Levyet al.,1985, Science 228:190; Duringet al.,1989, Ann. Neurol. 25:351; Howardet al.,1989, J. Neurosurg. 71:105).

Ejemplos

Ejemplo 1

Identificación de anticuerpos que se unen a los dominios 2 y 3 del VEGFR y bloquean la unión del ligando.

Dos anticuerpos que se unen al VEGFR2 humano y lo neutralizan, identificados en la tabla 1, se aislaron a partir de bibliotecas de presentación en fagos de Fab. Los anticuerpos bloquean la unión del ligando VEGFA al hVEGFR2 (Fig. 2). Los anticuerpos también se unen a las células endoteliales de aorta porcina (PAE) que expresan KDR, e inhiben la fosforilación de VEGFR2 estimulada por VEGFA, AKT y MAPK. (Fig. 3). La tabla 1 indica las secuencias de aminoácidos de las CDR y los dominios variables de los anticuerpos. LasKddel mAb 101 y el mAb 102 son de aproximadamente 6,6 mM y 1,7 nM, respectivamente.

La cadena pesada del mAb 101 se reorganizó con genes de cadena ligera<k>(biblioteca de<k>) y genes de cadena ligera A (biblioteca de A). Se encontraron 20 variantes únicas de cadena ligera A mediante el barrido de la biblioteca de A frente al VEGFR2 humano y el VEGFR2 de ratón. Se encontraron 22 variantes únicas de la cadena ligera k mediante el análisis de la biblioteca de k frente al VEGFR2 humano y el VEGFR2 de ratón. La tabla 2 indica las secuencias de aminoácidos de las CDR y los dominios variables de las cadenas ligeras. Las Kd de los mAb 105, 106 y 107 se aumentaron aproximadamente 10 veces (0,24 nM, 0,22 nM, y 0,12 nM, respectivamente) (tabla 3). Estos anticuerpos, y el anticuerpo Mab101 del que proceden, se unen a los dominios 2 y 3 del VEGFR y a construcciones que contienen dichos dominios.

Al igual que el anticuerpo precursor, estos anticuerpos se unen al VEGFR2 y bloquean la unión de VEGFA al VEGFR2 (Fig. 4), e inhiben la fosforilación del VEGFR2 estimulada por VEGFA, AKT y MAPK (Fig. 5).

Varios de estos anticuerpos, incluidos los mAb 138, 139, 140 y 146, también reaccionan de forma cruzada con VEGFR2 de ratón.

Los mAb 138, 139 y 140 inhibieron la fosforilación del VEFGR2 estimulada por VEGFA y las moléculas de transducción de señales posteriores, incluida MAPK.

Ejemplo 2

Inhibición del crecimiento tumoral in vivo

Se irradian ratones NOD-SCID de 6 a 8 semanas de edad, del mismo sexo (hembras), con 3,5 Gy de una fuente de rayos gamma de 137Cs a una tasa de dosis de aproximadamente 0,9 Gy/min y se inoculan por vía intravenosa con 2 x 107 células HL60. T res días después de la inoculación del tumor, se tratan los grupos de ratones dos veces a la semana con diversas dosis del mAb 106 y se registra el tiempo de supervivencia.

Todos los ratones no tratados murieron al cabo de aproximadamente dos semanas. Incluso con la alta carga tumoral, el tiempo de supervivencia de los ratones tratados con 10 mg/kg de mAb 106 se prolonga hasta 28 días.

Ejemplo 3

Tratamiento del cáncer de colon en un paciente humano

Se dividen pacientes humanos diagnosticados de cáncer de colon en grupos de tratamiento y se les administra la pauta quimioterapéutica convencional. Se tratan dos grupos de pacientes semanalmente con 5 mg/kg/semana o 15 mg/kg/semana durante 4 meses. A un grupo de control se le administra únicamente la pauta quimioterapéutica convencional. La carga tumoral se evalúa periódicamente mediante imagen por resonancia magnética (RM). En comparación con el grupo control, se espera que los pacientes que recibieron tratamientos semanales con los anticuerpos muestren reducciones significativas en el crecimiento o tamaño tumoral, mayor retraso hasta la progresión o supervivencia prolongada en comparación con los pacientes que no reciben el tratamiento con anticuerpos.

Claims (2)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que se une al VEGFR2 humano, que comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 4 y un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 32.

2. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se selecciona entre el grupo que consiste en scFv, Fab, F(ab')<2>, anticuerpo biespecífico, diacuerpo y triacuerpo.