JP2015533126A - ヒト抗ｖｅｇｆｒ２／ｋｄｒ抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＶＥＧＦＲ‐２に結合する抗体に関する。抗体は、腫瘍性疾患および過剰増殖性障害を治療するために用いられ、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて用いられ得る。

Description

本発明は、ＶＥＧＦＲ‐２に結合する抗体に関する。抗体は、腫瘍性疾患および過剰増殖性障害を治療するために用いられ、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて用いられ得る。

本出願は、２０１２年１０月５日出願のＵＳ６１／７１０,４２０に対して優先権を主張し、その全体が参照により本発明に組み込まれる。

血管新生は、潜在する血管すなわち細胞集合体から環状構造への毛細管内皮細胞の増殖および遊走と毛細管内皮細胞による組織の浸潤、新たに形成する管状集合体の閉回路血管系への参加、ならびに新たに形成された毛細血管の成熟を含む、高度に複雑な新しい血管の成長プロセスである。

血管新生は、胚発生、卵胞発育および創傷治癒を含む通常の生理学的プロセスにおいて重要である。過度の血管新生は、腫瘍性疾患、ならびに加齢性黄班変性、糖尿病性網膜症および血管新生緑内障における新血管形成に繋がる。ラニビズマブ（ルセンティス）により血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的とする抗血管新生治療が、ＡＭＤの進行を遅らせるのに効果があることが示されてきた。しかしながら、新血管形成は複雑であり、複数の血管新生機構が寄与している可能性がある。新血管形成に関連する疾患を治療するための薬剤および治療法を開発する必要性が残されている。

本発明はＶＥＧＦＲ‐２（ＫＤＲ）に結合するヒト抗体、およびヒト抗体の断片を提供する。一部の実施形態においては、抗体は、ＶＥＧＦＲ‐２へのリガンド結合（たとえば、ＶＥＧＦ‐Ａ、ＶＥＧＦ‐Ｃ、ＶＥＧＦ‐ＤまたはＶＥＧＦ‐Ｅ）を遮断する。一部の実施形態においては、抗体はＶＥＧＦＲ‐２の活性化を中和する。抗体は、たとえば、固形および非固形腫瘍ならびに過剰増殖性疾患を含む腫瘍性疾患を治療するために用いられる。したがって、本発明は、ＫＤＲの活性化の中和方法、腫瘍関連血管新生の抑制を含む腫瘍増殖の抑制方法、および血管新生関連疾患の治療方法を提供する。本発明は、ＶＥＧＲ受容体に結合するヒト抗体または抗体の断片を有するキットを提供する。

一実施形態において、本発明は、ＣＤＲ‐１Ｈ、ＣＤＲ‐２ＨおよびＣＤＲ‐３Ｈ配列を有する単離された重鎖可変領域を提供し、
（ｉ）ＣＤＲ‐１Ｈ配列はＧＦＴＦＳＷＹＸ₁ＭＸ₂（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５）であり、ここで、Ｘ₁はＶまたはＩ、Ｘ₂はＧまたはＬであり、
（ｉｉ）ＣＤＲ‐２Ｈ配列はＳＩＸ₁Ｘ₂ＳＧＧＸ₃ＴＸ₄ＹＡＤＳＶＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６）であり、ここで、Ｘ₁はＹまたはＧであり、Ｘ₂はＰまたはＳであり、Ｘ₃はＡまたはＦであり、Ｘ₄はＮまたはＤであり、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ‐３Ｈ配列はＧＮＹＦＤＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）またはＧＬＡＡＰＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）である。

一実施形態において、本発明は、ＣＤＲ‐１Ｌ、ＣＤＲ‐２ＬおよびＣＤＲ‐３Ｌを有する単離された軽鎖可変領域を提供し、
（ｉ）ＣＤＲ‐１Ｌ配列は、Ｘ₁ＧＸ₂Ｘ₃ＬＸ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇Ｘ₈Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８７）であり、ここで、Ｘ₁はＳ、ＱまたはＴであり、Ｘ₂はＤ、ＥまたはＱであり、Ｘ₃はＫ、Ｓ、Ｎ、ＩまたはＡであり、Ｘ₄はＧまたはＲであり、Ｘ₅はＤ、Ｓ、Ｈ、ＥまたはＮであり、Ｘ₆はＥ、Ｙ、Ｑ、ＲまたはＮであり、Ｘ₇はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ₈はＡまたはＳであり、もしくはＳＧＳＸ₁ＳＮＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇Ｘ₈（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８８）であり、ここで、Ｘ₁はＳまたはＴであり、Ｘ₂はＩまたはＬであり、Ｘ₃はＥまたはＧであり、Ｘ₄はＴ、ＳまたはＮであり、Ｘ₅はＮまたはＹであり、Ｘ₆はＴ、Ｐ、ＡまたはＹであり、Ｘ₇はＶまたはＬであり、Ｘ₈はＮ、ＩまたはＹであり、もしくはＸ₁ＧＸ₂ＳＸ₃ＤＸ₄ＧＸ₅ＹＤＹＶＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８９）であり、ここで、Ｘ₁はＡまたはＴであり、Ｘ₂はＳまたはＴであり、Ｘ₃はＨ、ＳまたはＮであり、Ｘ₄はＩまたはＶであり、Ｘ₅はＳまたはＡであり、
（ｉｉ）ＣＤＲ‐２Ｌ配列は、Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９０）であり、ここで、Ｘ₁はＱ、Ｄ、Ｔ、Ｙ、ＳまたはＡであり、Ｘ₂はＤ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＶであり、Ｘ₃はＤ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＹであり、Ｘ₄はＱ、Ｋ、ＮまたはＬであり、Ｘ₅はＲまたはＬであり、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ‐３Ｌ配列は、ＱＸ₁ＷＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇Ｘ₈（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１）であり、ここで、Ｘ₁はＡまたはＴであり、Ｘ₂はＤまたはＧであり、Ｘ₃はＲでありまたはアミノ酸を含まず、Ｘ₄はＳ、ＦまたはＮであり、Ｘ₅はＳ、ＴまたはＮであり、Ｘ₆はＳ、ＴまたはＰであり、Ｘ₇はＡ、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＹであり、Ｘ₈はＶまたはＬであり、もしくはＡＸ₁ＷＤＤＸ₂ＬＸ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９２）であり、ここで、Ｘ₁はＡ、ＳまたはＴであり、Ｘ₂はＮまたはＳであり、Ｘ₃はＮ、ＩまたはＧであり、Ｘ₄はＧまたはＳであり、Ｘ₅はＰ、ＷまたはＶであり、Ｘ₆はＶまたはＬであり、もしくはＭＹＳＴＩＴＸ₁ＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３）であり、ここで、Ｘ₁はＡまたはＴである。

一実施形態において、本発明は、ＣＤＲ‐１Ｌ、ＣＤＲ‐２ＬおよびＣＤＲ‐３Ｌを有する単離された軽鎖可変領域を提供し、
（ｉ）ＣＤＲ‐１Ｌ配列は、ＲＡＳＸ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇ＹＸ₈Ｘ₉（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４）であり、ここで、Ｘ₁はＱ、ＥまたはＨであり、Ｘ₂はＳ、ＲまたはＮであり、Ｘ₃はＶ、ＩまたはＬであり、Ｘ₄はＳ、Ｒ、ＧまたはＮであり、Ｘ₅はＳまたはＮであり、Ｘ₆はＳ、Ｎ、ＷまたはＤであり、Ｘ₇はＧでありまたはアミノ酸を含まず、Ｘ₈はＬまたはＦであり、Ｘ₉はＡ、Ｇ、ＭまたはＳであり、
（ｉｉ）ＣＤＲ‐２Ｌ配列は、ＧＡＳＸ₁ＲＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５）であり、ここで、Ｘ₁はＳ、Ｔ、ＩまたはＮであり、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ‐３Ｌ配列は、ＱＱＸ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇Ｘ₈（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６）であり、ここで、Ｘ₁はＦまたはＹであり、Ｘ₂はＤ、ＧまたはＹであり、Ｘ₃はＳ、ＴまたはＮであり、Ｘ₄はＳ、ＬまたはＷであり、Ｘ₅はＰでありまたはアミノ酸を含まず、Ｘ₆はＰまたはＴであり、Ｘ₇はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、ＷまたはＹであり、Ｘ₈はＴまたはＳである。

本発明の実施形態においては、抗体は、表２に示す抗体である。本発明の実施形態においては、抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を有する重鎖可変ドメインを有する。本発明の実施形態においては、抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８を有する軽鎖可変ドメインを有する。本発明の他の実施形態においては、抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２を有する軽鎖可変ドメインを有する。

本発明の実施形態においては、抗体は、細胞に有効量の抗体に接触させることを含む、ＶＥＧＦＲ２の活性化を中和する方法で用いられる。

本発明の他の実施形態においては、抗体は、有効量の抗体を投与することを含む、被験体における血管新生の阻害方法で用いられる。そのような実施形態においては、抗体は、ｒｈｏ関連キナーゼ２（ＲＯＣＫ２）アンタゴニストの有効量が投与される。

本発明の他の実施形態においては、抗体は、有効量の抗体を投与することを含む、被験体における新生物の治療方法または腫瘍成長の低減方法で用いられる。そのような実施形態においては、抗体は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニストの有効量が投与される。そのような実施形態においては、抗体は、有効量の、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体（ｆｌｔ‐１）アンタゴニストが投与される。そのような実施形態においては、抗体は、有効量の、ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）アンタゴニストが投与される。さらに他のそのような実施形態においては、抗体は、有効量の、マトリックスメタロプロテアーゼアンタゴニストが投与される。

図１Ａ〜１Ｃは、ファージディスプレイにより同定された本発明の抗ＶＥＧＦＲ２抗体の、ヒト重鎖、λ軽鎖およびκ軽鎖可変領域配列のそれぞれを示す。 図１Ａ〜１Ｃは、ファージディスプレイにより同定された本発明の抗ＶＥＧＦＲ２抗体の、ヒト重鎖、λ軽鎖およびκ軽鎖可変領域配列のそれぞれを示す。 図１Ａ〜１Ｃは、ファージディスプレイにより同定された本発明の抗ＶＥＧＦＲ２抗体の、ヒト重鎖、λ軽鎖およびκ軽鎖可変領域配列のそれぞれを示す。 図２は、hＶＥＧＦＲ２（上部）に対する本発明の抗体の結合、ならびにhＶＥＧＦＲ２（中央部）のドメイン２および３を含む構成を示す。下部の図は、リガンド（ＶＥＧＦ₁₆₅）遮断を示す。 図３は、本発明のＭａｂ１０１および１０２が、ＫＤＲを過剰に発現するブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞においてＶＥＧＦＲ２、ＡＫＴおよびＭＡＰＫのＶＥＧＦＡ刺激リン酸化を阻止することを示す（ヒトＶＥＧＦＲ２）。 図４は、hＶＥＧＦＲ２への結合、およびＭａｂ１０４、１０５、１０６および１０８によるＶＥＧＦ₁₆₅リガンド遮断を示す。同様の結果は、別個の実験におけるＭａｂ１０３、１０７、１０９および１１０に対しても得られた。これらのＭａｂは、異なる軽鎖可変ドメインと再結合した、Ｍａｂ１０１の重鎖可変ドメインを含む。 図５は、本発明のＭａｂ１０５および１０６が、ＫＤＲを過剰に発現するブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞においてＶＥＧＦＲ２、ＡＫＴおよびＭＡＰＫのＶＥＧＦＡ刺激リン酸化を阻止することを示す（ヒトＶＥＧＦＲ２）。

一態様においては、本発明は、ＶＥＧＦＲ２依存性シグナル伝達を阻止するのに有効である、新規のＶＥＧＦＲ２抗体またはそのような抗体の抗原結合断片を提供する本発明が使用される。本明細書で使用されるように、“受容体を阻止する”は、シグナルを伝達する受容体の内在性キナーゼ活性を低減させるおよび／または非活性化させることを意味する。ＶＥＧＦＲ２阻止のための信頼できるアッセイは受容体リン酸化の還元である。

本発明は、ＶＥＧＦＲ２阻止の任意の特定の機構によって限定されない。１つの抗体が後続する機構は、他の抗体が後続する機構と必ずしも同じではない。一部の有効な機構は、ＶＥＧＦＲ２の細胞外結合ドメインへのＶＥＧＦリガンドの結合を防止すること、および受容体の二量化またはオリゴマー化を防止することを含む。しかしながら、他のメカニズムは除外されない。

抗体は、特定の抗原または物質を認識して、これに結合するタンパク質である。好適な実施形態においては、本発明の抗体は、少なくとも天然リガンドのように強くＫＤＲに結合する。抗原の抗体との解離についての平衡定数により表される親和性（Ｋｄ）は、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合強度の指標となる。結合活性は、抗体のその抗原との結合の強さの指標である。結合活性は、抗原決定基と抗体における抗体結合部位との間の親和性、および抗体毎の結合部位の数（価数）の両方に関連する。たとえば、一価の抗体（たとえば、Ｆａｂ）は、特定のエピトープのための１つの結合部位を有する。ＩｇＧ抗体は２つの抗原結合部位を有する。典型的なＫの値（解離定数Ｋ_dの逆数）は１０⁵乃至１０¹¹ｌ／ｍоｌである。１０⁴ｌ／ｍоｌより小さい任意のＫは非特異的である結合を示すとみなされる。

本発明の抗体はＶＥＧＦＲ２の活性化を阻止する。ＶＥＧＦＲ２阻止の１つの指標は、低減された受容体のチロシンキナーゼ活性である。チロシンキナーゼ阻止性は、受容体の自己リン酸化レベルを測定することなどの既知の方法を用いて決定され得る。ＶＥＧＦＲ２の阻止性は、自然または合成ＶＥＧＦＲ２基質およびＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路の他の成分のリン酸化イベントの阻止性または調節性、を介しても観測され得る。リン酸化は、たとえば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはウェスタンブロットにおけるホスホチロシンに特定の抗体を用いて、検出され得る。チロシンキナーゼ活性のための一部のアッセイについては、文献Ｐａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａ．，２８３：１４３３−４４（１９９７）およびＢａｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，６２：１４３−５０（１９９８）に記載されている。

生体内アッセイも利用し得る。たとえば、受容体チロシンキナーゼ阻止は、阻害剤の存在下および非存在下において受容体リガンドにより刺激された細胞系統を用いる分裂促進アッセイにより観測され得る。たとえば、ＶＥＧＦにより刺激されたＨＵＶＥＣ細胞（ＡＴＣＣ）が、ＶＥＧＦＲ阻止性を測定するように用いられ得る。他の方法は、たとえば、マウスに注入されたヒト腫瘍細胞を用いて、ＶＥＧＦ発現腫瘍細胞増殖の阻止ための試験を含む。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，３６５,１５７（Ｒｏｃｋｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）を参照されたい。

本発明は、抗ＶＥＧＦＲ２抗体であって、そのような抗体をコードする核酸およびそのような抗体を有する組成物を有する抗ＶＥＧＦＲ２抗体を提供する。一実施形態においては、本発明は、ＣＤＲ‐１Ｈ、ＣＤＲ‐２ＨおよびＣＤＲ‐３Ｈ配列を有する単離された抗体重鎖可変領域を提供し、
（ｉ）ＣＤＲ‐１Ｈ配列はＧＦＴＦＳＷＹＸ₁ＭＸ₂（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５）であり、ここで、Ｘ₁はＶまたはＩであり、Ｘ₂はＧまたはＬであり、
（ｉｉ）ＣＤＲ‐２Ｈ配列はＳＩＸ₁Ｘ₂ＳＧＧＸ₃ＴＸ₄ＹＡＤＳＶＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６）であり、ここで、Ｘ₁はＹまたはＧであり、Ｘ₂はＰまたはＳであり、Ｘ₃はＡまたはＦであり、Ｘ₄はＮまたはＤであり、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ‐３Ｈ配列はＧＮＹＦＤＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）またはＧＬＡＡＰＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）である。

一実施形態において、本発明は、ＣＤＲ‐Ｌ１、ＣＤＲ‐Ｌ２およびＣＤＲ‐Ｌ３を有する単離された軽鎖可変領域を提供し、
（ｉ）ＣＤＲ‐Ｌ１配列は、Ｘ₁ＧＸ₂Ｘ₃ＬＸ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇Ｘ₈Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８７）であり、ここで、Ｘ₁はＳ、ＱまたはＴであり、Ｘ₂はＤ、ＥまたはＱであり、Ｘ₃はＫ、Ｓ、Ｎ、ＩまたはＡであり、Ｘ₄はＧまたはＲであり、Ｘ₅はＤ、Ｓ、Ｈ、ＥまたはＮであり、Ｘ₆はＥ、Ｙ、Ｑ、ＲまたはＮであり、Ｘ₇はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ₈はＡまたはＳであり、もしくは、ＳＧＳＸ₁ＳＮＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇Ｘ₈（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８８）であり、ここで、Ｘ₁はＳまたはＴであり、Ｘ₂はＩまたはＬであり、Ｘ₃はＥまたはＧであり、Ｘ₄はＴ、ＳまたはＮであり、Ｘ₅はＮまたはＹであり、Ｘ₆はＴ、Ｐ、ＡまたはＹであり、Ｘ₇はＶまたはＬであり、Ｘ₈はＮ、ＩまたはＹであり、もしくは、Ｘ₁ＧＸ₂ＳＸ₃ＤＸ₄ＧＸ₅ＹＤＹＶＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８９）であり、ここで、Ｘ₁はＡまたはＴであり、Ｘ₂はＳまたはＴであり、Ｘ₃はＨ、ＳまたはＮであり、Ｘ₄はＩまたはＶであり、Ｘ₅はＳまたはＡであり、
（ｉｉ）ＣＤＲ‐Ｌ２配列は、Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９０）であり、ここで、Ｘ₁はＱ、Ｄ、Ｔ、Ｙ、ＳまたはＡであり、Ｘ₂はＤ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶであり、Ｘ₃はＤ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＹであり、Ｘ₄はＱ、Ｋ、ＮまたはＬであり、Ｘ₅はＲまたはＬであり、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ‐Ｌ３配列は、ＱＸ₁ＷＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇Ｘ₈（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１）であり、ここで、Ｘ₁はＡまたはＴであり、Ｘ₂はＤまたはＧであり、Ｘ₃はＲでありまたはアミノ酸を含まず、Ｘ₄はＳ、ＦまたはＮであり、Ｘ₅はＳ、ＴまたはＮであり、Ｘ₆はＳ、ＴまたはＰであり、Ｘ₇はＡ、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＹであり、Ｘ₈はＶまたはＬであり、もしくは、ＡＸ₁ＷＤＤＸ₂ＬＸ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９２）であり、ここで、Ｘ₁はＡ、ＳまたはＴであり、Ｘ₂はＮまたはＳであり、Ｘ₃はＮ、ＩまたはＧであり、Ｘ₄はＧまたはＳであり、Ｘ₅はＰ、ＷまたはＶであり、Ｘ₆はＶまたはＬであり、もしくは、ＭＹＳＴＩＴＸ₁ＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３）であり、ここで、Ｘ₁はＡまたはＴである。

一実施形態において、本発明は、ＣＤＲ‐Ｌ１、ＣＤＲ‐Ｌ２およびＣＤＲ‐Ｌ３を有する単離された軽鎖可変領域を提供し、
（ｉ）ＣＤＲ‐Ｌ１配列は、ＲＡＳＸ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇ＹＸ₈Ｘ₉（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４）であり、ここで、Ｘ₁はＱ、ＥまたはＨであり、Ｘ₂はＳ、ＲまたはＮであり、Ｘ₃はＶ、ＩまたはＬであり、Ｘ₄はＳ、Ｒ、ＧまたはＮであり、Ｘ₅はＳまたはＮであり、Ｘ₆はＳ、Ｎ、ＷまたはＤであり、Ｘ₇はＧでありまたはアミノ酸を含まず、Ｘ₈はＬまたはＦであり、Ｘ₉はＡ、Ｇ、ＭまたはＳであり、
（ｉｉ）ＣＤＲ‐Ｌ２配列は、ＧＡＳＸ₁ＲＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５）であり、ここで、Ｘ₁はＳ、Ｔ、ＩまたはＮであり、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ‐Ｌ３配列は、ＱＱＸ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇Ｘ₈（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６）であり、ここで、Ｘ₁はＦまたはＹであり、Ｘ₂はＤ、ＧまたはＹであり、Ｘ₃はＳ、ＴまたはＮであり、Ｘ₄はＳ、ＬまたはＷであり、Ｘ₅はＰでありまたはアミノ酸を含まず、Ｘ₆はＰまたはＴであり、Ｘ₇はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、ＷまたはＹであり、Ｘ₈はＴまたはＳである。

本発明の実施形態においては、抗体は、上記の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域ＣＤＲ配列を有する重鎖可変領域を有する抗体が提供されている。

ＶＥＧＦＲ２結合抗体配列の非限定的実施例を提供する。本明細書に記載しているように、ヒトＦａｂファージディスプレイライブラリーから、ヒトＶＥＧＦＲ２に結合し、ｈＶＥＧＦＲ２へのリガンドＶＥＧＦＡの結合を遮断し、ＶＥＧＦＡにより刺激されたＶＥＧＦＲ２リン酸化および下流シグナル伝達を阻止する２つの中和抗体が示された。表１は、ＣＤＲのアミノ酸配列および抗体の抗体可変ドメインを示す。Ｍａｂ１０１およびＭａｂ１０２のＫ_dｓはそれぞれ、約６．６ｍＭおよび１．７ｎＭである。

Ｍａｂ１０１の重鎖は、κ軽鎖遺伝子（κライブラリー）およびλ軽鎖遺伝子（λライブラリー）により再配列された。２０個の一意のλ軽鎖可変部が、ヒトＶＥＧＦＲ２およびマウスＶＥＧＦＲ２の両方に対してλライブラリーをパニングすることにより認識された。２２個の一意のκ軽鎖可変部が、ヒトＶＥＧＦＲ２およびマウスＶＥＧＦＲ２の両方に対してκライブラリーをパニングすることにより認識された。表２は、ＣＤＲのアミノ酸配列および軽鎖の可変ドメインを示す。Ｍａｂ１０５、１０６および１０７のＫ_dｓは約１０倍（それぞれ、０．２４ｎＭ、０．２２ｎＭおよび０．１２ｎＭ）に増加した。親抗体のように、これらの抗体は、ＶＥＧＦＲ２に結合し、且つＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦＡの結合を遮断し、ＶＥＧＦＲ２、ＡＫＴおよびＭＡＰＫのＶＥＧＦＡ刺激化リン酸化を阻止する（図４）。

Ｍａｂ１３８、１３９、１４０および１４６を含む複数の抗体も、マウスＶＥＧＦＲ２と交差反応する。これらの抗体も、ＶＥＧＦＲ２、およびＭＡＰＫを含む下流シグナル伝達分子のＶＥＧＦＡ刺激リン酸化を阻止した。

本発明は、表１および表２に示す配列から選択された１つ、２つまたは３つの重鎖ＣＤＲおよび１つ、２つまたは３つの軽鎖ＣＤＲを有する、単離されたＶＥＧＦＲ２抗体と、単離されたＶＥＧＦＲ２抗体のＶＥＧＦＲ２結合断片とを提供する。本発明の抗体においては、２つ以上のＣＤＲが表１および表２に提示された配列から選択されるとき、異なるＣＤＲは、それらの表に提示された同じモノクローナル抗体から選択される必要はないが、それらの表に提示された２つまたはそれ以上の抗体可変ドメインから選択され得る。特定の実施形態は以下を含むが、それに限定されない。本発明の実施形態においては、単離されたＶＥＧＦＲ２抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を有する１つ、２つまたは３つの重鎖ＣＤＲを有する。本発明の実施形態においては、抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を有する１つ、２つまたは３つの軽鎖ＣＤＲを有する。他の実施形態においては、抗体は、表１または表２に示した配列を有する１つ、２つまたは３つの軽鎖ＣＤＲを有する。非限定的実施例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７の１つまたは複数、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１の１つまたは複数、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５の１つまたは複数を有する軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態においては、ＶＥＧＦＲ２抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２を有する重鎖可変ドメインを有する。特定の実施形態においては、ＶＥＧＦＲ２抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５を有する軽鎖可変ドメインを有する。特定の実施形態においては、抗体は、上記重鎖可変ドメインの１つおよび上記軽鎖可変ドメインの１つを有する。特定の実施形態においては、ＶＥＧＦＲ２抗体またはその結合断片は、表１または２に示したＣＤＲおよび可変ドメイン配列と同じく、もしくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列を伴って、１つまたは複数のＣＤＲもしくは１つまたは複数の可変ドメインを有する。

“同一性”とは、２つの配列最適な配列のために導入する必要がある隙間の数及び各々の隙間の長さを考慮して、２つのアミノ酸または核酸配列により共有される同じ位置の数又は割合をいう。“実質的に同じ”は、保存的アミノ酸置換、たとえば同じクラスのアミノ酸を１つのアミノ酸で置換えること（たとえば、グリシンをバリンで、リジンをアルギニンで置き換えること）によって、またはタンパク質の機能を壊さないアミノ酸配列の位置に位置する１つまたは複数の非保存的置換、欠失または挿入によってのみ異なるアミノ酸配列を意味する。好適には、アミノ酸配列は、他のアミノ酸配列に対して少なくも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、および最も好ましくは少なくとも９０％類似する。ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７，１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）およびＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に含むが、それらに限定されない配列類似性を決定する方法およびコンピュータプログラムが一般に入手可能である。既知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、類似性を決定するために用いてもよい。ＢＬＡＳＴプログラムは、ＮＣＢＩおよび他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ，２０８９４；ＢＬＡＳＴ ２．０ ａｔ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．nlm.ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）から一般に入手可能である。配列の比較において、これらの方法は、種々の置換、欠失および他の改変を明らかにする。保存的置換は、典型的には、次の置換基であって、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、トリオニン、レジン、アルギニン、フェニルアラニンおよびチロシン内の置換を含む。

本発明の抗体は、結合特性が直接突然変異、親和性成熟方法、ファージディスプレイまたは鎖シャッフルにより改善されてきた抗体を含む。親和性および特異性は、ＣＤＲを成熟化させることおよび所望の特性を有する抗原結合部位をスクリーニングすることにより改変または改善されてもよい。ＣＤＲは種々の様式で突然変異される。一様式では、その他の点で同じ抗原結合部位の集団において、２０個のアミノ酸すべてが特定の部位で認識されるように、個々の残基または残基の組み合わせをランダム化するようにする。または、突然変異は、変異性ＰＣＲ方法（たとえば、Ｈａｗｋｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，J.Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９−８９６（１９９２）を参照されたい）によりＣＤＲの範囲全体で引き起こされる。たとえば、重鎖および軽鎖可変領域遺伝子を含むファージディスプレイベクターは、Ｅ．ｃｏｉｌ（たとえば、Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０：３５９−３６８（１９９６）を参照されたい）の突然変異誘発遺伝子株内で増殖され得る。突然変異誘発のこれらの方法については、当業者に知られている複数の方法が例示されている。

ＶＥＧＦ受容体に結合する抗体の免疫原性を最小化するように、本発明は、ヒト可変および定常ドメイン配列を有する抗体を提供する。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥおよびそれらのサブクラスなどの任意の免疫原性クラスのメンバーであり得、またはそれらを結合し得る。抗体クラスは、自然抗体のエフェクター機能（たとえば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を最適化するように選択され得る。

本発明の特定の実施形態は、ＶＥＧＦＲ２結合抗体断片の使用を含む。Ｆｖは、６つのハイパーバリアブルループ（ＣＤＲ）すべてを含む完全重鎖および軽鎖可変ドメインを含む最小断片である。定常ドメインを欠くと可変ドメインは非共有結合される。重鎖および軽鎖は、Ｖ_HおよびＶ_Lドメインを、抗原結合部位を構成するように会合可能とするリンカーを用いて、単一ポリペプチド鎖（“単一鎖Ｆ_V”または“ｓｃＦ_V”）に結合され得る。本発明の実施形態においては、リンカーは（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）₃である。ｓｃＦ_V断片は全体的な抗体の定常ドメインを欠くために、ｓｃＦＶ断片は全体的な抗体よりかなり小さい。ｓｃＦＶ断片にはまた、特定の実施形態において不所望であり得る、他の生体分子との通常の重鎖定常ドメイン相互作用がない。

Ｖ_H、Ｖ_Lを、および任意にＣ_L、Ｃ_H１を、または他の定常ドメインを含む抗体の断片を用いてもよい。Ｆａｂと呼ばれるパパイン分解によって生成される一価の断片は重鎖ヒンジ領域欠き、Ｆ（ａｂ’）₂と呼ばれる、ペプシン分解により生成される断片は、重鎖ヒンジを保持し、二価である。そのような断片はまた、組み換えにより生成されてもよい。他の多くの有用な光源結合抗体断片が当業界では周知であり、ダイアボディ、トリアボディ、単一ドメイン抗体ならびに他の一価および多価形態を含むが、それらに限定されない。

本発明は、さらに、抗体、抗体の抗原結合断片、および抗体の抗体結合部分のすべてまたは一部を有するタンパク質の形態にあるがそれに限定されない多価抗原結合タンパク質を提供する。多価抗原結合タンパク質は、単一特異性、二重特異性または多重特異性でもよい。用語“特異性”は、特定の分子が結合し得る種々の種類の抗原決定基の数のことをいう。免疫グロブリン分子が一種類のみの抗原決定基に結合する場合、免疫グロブリン分子は単一特異性である。免疫グロブリン分子が種々の種類の抗原決定基に結合する場合、免疫グロブリン分子は多重特異性である。

たとえば、二重特異性多価単鎖抗体は、2つの異なる種類のエピトープの認識を可能にする。両方のエピトープは同じ抗原（たとえば、ＶＥＧＦＲ２）上にあってもよい。または、１つのエピトープは１つの抗体（たとえば、ＶＥＧＦＲ２）上にあってもよく、第2のエピトープは他の抗体上にあってもよい。

一実施形態においては、多価単鎖抗体は、少なくとも１つの他の抗原結合ドメインへの他のペプチドリンカーによりさらに連結された、可変重鎖断片に連結された可変軽鎖断片（ｓｃＥｖと同様）を含む。典型的には、ペプチドリンカーは、約１５個のアミノ酸残基から成る。好適な実施形態においては、Ｖ_LおよびＶ_Hドメインの数は等しい。たとえば、二価単鎖抗体は、次のような、Ｖ_L−Ｌ₁−Ｖ_H−Ｌ₂−Ｖ_L−Ｌ₃−Ｖ_HまたはＶ_L−Ｌ₁−Ｖ_H−Ｌ₂−Ｖ_H−Ｌ₃−Ｖ_LまたはＶ_H−Ｌ₁−Ｖ_L−Ｌ₂−Ｖ_H−Ｌ₃−Ｖ_LまたはＶ_H−Ｌ₁−Ｖ_L−Ｌ₂−ＶＬ−Ｌ₃−Ｖ_Hであり得る。三価またはそれ以上である多価単鎖抗体は、不可的ペプチドリンカーにより二価単鎖抗体に接合した１つまたは複数の抗体断片を有する。三価単鎖抗体の一実施例はＶ_L−Ｌ₁−Ｖ_H−Ｌ₂−Ｖ_L−Ｌ₁−Ｖ_H−Ｌ₂−Ｖ_L−Ｌ₁−Ｖ_Hである。

２つの単鎖抗体は、二価ダイマーとしても知られているダイアボディを構成するように結合され得る。ダイアボディは２つの鎖を有する。ダイアボディの各鎖は、約５乃至１０個のアミノ酸残基、たとえば、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）₂の短いリンカーによりＶ_Lドメインに接続されたＶ_Hドメインを含む。そのようなリンカーは、同じ鎖におけるドメイン間の鎖ないペアリングを防止し、ゆえに、異なる鎖における相補的ドメイン間の鎖ないペアリングを促進して、２つの抗原結合部位を再度生成する。ダイアボディ構造は、分子の反対側端部にある抗原結合部位を伴って、硬くかつ小さくまとまっている。

３つの単鎖抗体は、三価トリマーとしても知られているように、トリアボディを構成するように結合され得る。一部の実施形態においては、トリアボディは、例えば、リンカー配列がないというように、Ｖ_LまたはＶ_Hドメインのアミノ末端に直接融合されたＶ_LまたはＶ_Hドメインのカルボキシ末端により構成される。トリアボディは、環状で完全な様式で配置されたポリペプチドを有する３つのＦｖ頭部を有する。トリアボディ分子の有効な配座は、互いから１２０°の角度で平面内に位置した３つの結合部位を伴って、平面的である。トリアボディは、単一特異性、二重特異性または三重特異性でもよい。

予防または治療目的で哺乳動物において用いられる、本発明の抗ＶＥＧＦＲ２抗体は、医学的に許容される担体を付加的に有する組成物の形態で投与されることが理解できる。適切な医学的に許容される担体は、たとえば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールまたはそれらの組み合わせのうちの１つまたは複数を含む。医学的に許容される担体は、抗体の保存可能期間または有効性を向上させる、少量の湿潤剤、乳化剤、防腐剤または緩衝剤などの補助物質をさらに含んでもよい。

本発明の方法においては、本発明の抗体の治療有効量が、治療が必要な哺乳動物に投与される。本明細書で用いている用語“投与する”は、求められる結果を達成し得る何れかの方法により哺乳動物に本発明の抗体を与えることを意味する。これらの抗体は、たとえば、静脈内にまたは筋肉内に投与されてもよい。本発明のヒト抗体は、人間に投与するために特に有用であるが、それはまた、他の哺乳動物に投与されてもよい。本明細書で用いている用語“哺乳動物”は、人間、実験動物、家庭用ペットおよび家畜を含むように意図されているが、それらに限定されない。“治療有効量”は、哺乳動物に投与されるときに、キナーゼ活性を阻止するなどの所望の治療効果をもたらすのに有効である、本発明の抗体の量を意味する。たとえば、疾患に応じて、抗体について、この量として、０．１，１．０，３．０、６．０または１０．０ｍｇ／ｋｇを必要としてもよい。１５０,０００ｇ／ｍоｌｅの分子量を有するＩｇＧ（２つの結合部位）のためには、これらの量は、５ｌの血液の容量については、結合部位の約１８ｎＭ、１８０ｎＭ、５４０ｎＭ、１．０８μＭおよび１．８μＭに相当する。

本発明の抗体は、腫瘍成長、腫瘍成長に関連する血管新生、または血管新生に関連する他の病態を阻止するために有用である。治療され得る腫瘍は、原発性腫瘍、転移性腫瘍および難治療性腫瘍を含む。難治療性腫瘍は、化学療法剤のみ、抗体のみ、放射線のみまたはそれらの組み合わせを用いる治療に対して、反応しないまたは耐性がある腫瘍を含む。難治療性腫瘍は、そのような薬剤による治療により阻止されたように見えたが、治療をやめた後、５年以内に、ときどき１０年以内に、またはそれ以上で再発する腫瘍も含む。抗体は、血管化した腫瘍、および、血管化していない、または未だに実質的には血管化していない腫瘍の治療に有効である。

適宜に治療することが可能である固形腫瘍の例としては、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、神経膠腫およびリンパ腫がある。そのような腫瘍の一部の例には、類上皮腫、頭部および頸部の腫瘍のような、扁平上皮腫瘍、大腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、小細胞および非小細胞の肺腫瘍を含む肺腫瘍、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍および肝臓腫瘍がある。他の例には、カポジ肉腫、中枢神経系腫瘍、神経芽細胞腫、毛細血管芽細胞腫および髄膜腫、脳転移、黒色腫、消化管癌および腎癌および肉腫、横紋筋肉腫、好ましくは多形性膠芽腫である膠芽細胞腫、ならびに平滑筋肉腫がある。本発明のアンタゴニストが有効である血管化皮膚癌の例には、ヒト悪性ケラチン生成細胞などの悪性ケラチン生成細胞の成長を抑制することにより治療し得る扁平上皮細胞癌、基底細胞癌および皮膚癌がある。

非固形腫瘍の例には、白血病、多発性骨髄腫およびリンパ腫がある。白血病の一部の例には、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、赤芽球性白血病または単球性白血病がある。リンパ腫の一部の例には、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫がある。

本発明の抗体は、例えば、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ（ＲＡ）、血管腫、血管線維腫および乾癬を含む過度の血管新生によって特徴付けられる病態を治療または抑制するようにも用いられ得る。非新生物血管新生疾患の他の非限定的例には、未熟児網膜症（水晶体後部線維増殖症）、角膜移植拒絶反応、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、クローン病、自己免疫性腎炎、原発性胆汁性肝硬変症、急性膵炎、移植拒絶反応、アレルギー性炎、接触性皮膚炎および遅延型過敏反応、炎症性大腸炎、敗血症性ショック、骨粗しょう症、変形性関節症、神経細胞炎症による認知欠陥、オスラー ウェーバー症候群、再狭窄、ならびに真菌性感染、寄生性感染およびサイトメガロウイルス性感染を含むウイルス性感染がある。

過剰な血管新生により特徴付けられる眼疾患には、血管新生緑内障、増殖性糖尿病網膜症を含む増殖性網膜症、および黄斑変性症がある。本発明は、眼疾患および障害を治療するための方法および組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、“乾燥”形態および“滲出”形態で生じる加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療を提供する。ＡＭＤの“滲出”形態は、血管成長（新血管形成）により失明をもたらす。これらの網膜血管からの出血、漏出および網膜血管の瘢痕化は、結局は、光受容体に不可逆的な損傷をもたらす。乾燥形態は、網膜色素上皮層の萎縮に起因し、眼の中央部における光受容体（錐体および桿体）を失うことにより、失明をもたらす。他の実施形態においては、本発明は、脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）を治療する方法を提供する。脈絡膜新血管形成は、新しい血管がブルッフ膜を介して脈絡膜で成長し、網膜下腔に侵入するプロセスであり、数ある原因の中でも特に、加齢性黄斑変性症、近視および眼外傷の症状である。他の実施形態においては、本発明は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）を治療する方法を提供する。他の実施形態においては、本発明は、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）または網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）に続発する黄斑浮腫を治療する方法を提供する。本発明により治療可能な他の疾患には、虹彩血管新生、ブドウ膜炎、血管新生緑内障および未熟児網膜症（ＲＯＰ）があるが、それらに限定されない。治療方法は、たとえば、角膜移植後の角膜血管新生を回避するため、または線維柱帯切除手術における創傷治癒プロセスを調節するための治療方法などの予防であり得る。

本発明の抗体および抗原結合断片は、必要とする患者に第２の薬剤と共に有利に投与され得る。たとえば、一部の実施形態においては、本発明のＶＥＧＦＲ２抗体は、抗新生物薬剤と共に被検体に投与される。一部の実施形態においては、ＶＥＧＦＲ２抗体は、第２のアンタゴニスト抑制剤と共に被検体に投与される。一部の実施形態においては、本発明のＶＥＧＦＲ２抗体は、抗炎症剤または免疫抑制剤と共に投与される。

抗新生物薬剤には、細胞傷害性化学療法剤、標的とされた低分子および生体分子、ならびに放射線がある。非限定的な化学療法剤には、抗癌剤、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、イリノテカン、メクロレタミン（ナイトロジェン・マスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルマスティン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タクソール）、ドセタキセル（タキソテール）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、ダカルバジン、フロクスウリジン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、インターフェロンアルファ、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、タクソールおよびそれらの組み合わせがある。

標的の低分子および生体分子には、チロシンキナーゼのモジュレーターおよび受容体チロシンキナーゼの抑制剤、ならびに腫瘍特異的抗原に結合する薬剤があるが、それらに限定されない。腫瘍形成に関係する成長因子受容体の非限定的実施例は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦＲ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦＲ）、神経成長因子（ＮＧＦＲ）および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦＲ）の受容体、ならびにＥＧＦＲ（ｅｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ｅｒｂＢ２）、ｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４を含む上皮成長因子受容体ファミリーの受容体である。

ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲにまたはＥＧＦＲリガンドに結合し、リガンド結合および／または受容体活性化を抑制する抗体を含む。たとえば、その薬剤は、他のＥＧＦＲファミリーメンバーを有する受容体ダイマーまたはヘテロダイマーの形成を阻止する。ＥＧＦＲのためのリガンドは、たとえば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−αアンフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）およびベタレキュルリンを含む。ＥＧＦＲアンタゴニストは、リガンドの結合を阻止するまたはしない、ＥＧＦＲの細胞外部分に外部で、もしくはチロシンキナーゼドメインに内部で結合し得る。ＥＧＦＲアンタゴニストは、たとえば、ＥＦＧＲシグナル伝達経路の成分の機能を阻止することにより、ＥＧＦＲ依存性シグナル伝達を阻止する薬剤をさらに含む。ＥＧＦＲと結合するＥＧＦＲアンタゴニストの実施例は、ＥＧＦＲに特異的である抗体（および抗体の機能的等価物）などの生体分子、およびＥＧＦＲの細胞質ドメインに直接作用する合成キナーゼ阻害剤などの低分子を含むが、それらに限定されない。

低分子および生体阻害剤としては、ゲフィチニブ、エルロチニブおよびセツキシマブを含む上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の阻害剤、ＨＥＲ２（たとえば、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン（トラスツズマブ‐ＤＭ１；Ｔ‐ＤＭ１）およびペルツズマブ）の阻害剤、抗ＶＥＧＦ抗体および断片（たとえば、ベバシズマブ）、ＣＤ２０（たとえば、リツキシマブ、イブリツモマブ）を阻止する抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体（たとえば、ラムシルマブ（ＩＭＣ‐１１２１Ｂ）、ＩＭＣ‐１Ｃ１１およびＣＤＰ７９１）、抗ＰＤＧＦＲ抗体、ならびにイマチニブを含む。低分子キナーゼ阻害剤は、特定のチロシンキナーゼに特異的であり得、また２つまたはそれ以上のキナーゼの阻害剤であり得る。たとえば、化合物Ｎ‐（３，４‐ジクロロ‐２‐フルオロフェニル）‐７‐（｛［（３ａＲ，６ａＳ）‐２‐メチルオクタハイドロシクロペンタ［ｃ］ピロール‐５‐イル］メチル｝オキシ）‐６‐（メチルオキシ）キナゾリン‐４‐アミン（または、ＸＬ６４７、ＥＸＥＬ‐７６４７およびＫＤ‐０１９として知られている）は、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＢ４、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ）、Ｆｌｔ4（ＶＥＧＦＲ３）およびＥｒｂＢ２を含む複数の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の体外阻害剤であり、また、特定のＴＫＩに対する腫瘍の非反応性をもたらす経路に関与する、ＳＲＣキナーゼの阻害剤である。本発明の実施形態においては、必要な被検体の治療は、式Ｉのρキナーゼ阻害剤の投与およびＫＤ‐０１９の投与を含む。

ダサチニブ（ＢＭＳ‐３５４８２５；Ｂｒｉｓｔｏｌ‐Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）は、他の経口投与可能なＡＴＰ部位競合Ｓｒｃ阻害剤である。ダサチニブは、Ｂｃｒ‐Ａｂｌ（慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）またはフィラデルフィア染色体陽性（Ｐｈ＋）の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の患者において使用するためにＦＤＡに認可された）ならびにｃ‐Ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲ、ｃ‐ＦＭＳ、ＥｐｈＡ２およびＳＦＫも標的にする。他の２つのＳｒｃおよびＢｃｒ‐Ａｂｌの経口チロシンキナーゼは、ボスチニブ（ＳＫＩ‐６０６）およびｓａｒａｃａｔｉｎｉｂ（ＡＺＤ０５３０）である。

ＶＥＧＦＲ２は、血管新生においてＶＥＧＦの下流効果の大部分を媒介する一方、第２の血管新生阻害剤を投与することは有利であり得る。本発明の抗ＶＥＧＦＲ２抗体は、腫瘍成長または血管新生に関与する他の受容体を中和する抗体が投与されてもよい。

ＶＥＧＦ結合剤の非限定的実施例は、ＶＥＧＦ抗体およびＶＥＧＦトラップ（例えば、ＶＥＧＦ受容体のリガンド結合ドメイン）を含む。抗体（ＶＥＧＦ結合抗体断片を含む）の２つの実施例は、ベバシズマブ（アバスチン）、すなわちＶＥＧＦ‐Ａに結合する抗体、および、ラニビズマブ（ルセンティス）、すなわちベバシズマブからもたらされるＦａｂである。一般に、ＶＥＧＦトラップは、１つまたは複数のＶＥＧＦ受容体タンパク質のＶＥＧＦ結合ドメインを有するタンパク質である。ＶＥＧＦトラップは、可溶性ＶＥＧＦＲ‐１、可溶性ニューロピリン１（ＮＲＰ１）、可溶性ＶＥＧＦＲ‐３（ＶＥＧＦ‐ＣおよびＶＥＧＦ‐Ｄに結合する）、ならびに、ヒトＩｇＧ１の一定領域（Ｆｃ）に対して融合されたヒト血管内皮成長因子受容体ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインのセグメントから成るアフリバーセプト（Ｚａｌｔｒａｐ；Ｅｙｌｅａ；ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ Ｒ１Ｒ２）を含むが、それらに限定されない。コンバセプト（ＫＨ９０２）は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に対して融合されたＶＥＧＦＲ‐１（Ｆｌｔ‐１）の細胞外ドメイン２およびＶＥＧＦＲ‐２の細胞外ドメイン３、４を含む融合タンパク質である。ＫＤＲおよびＦＬＴ‐１ Ｉｇ様ドメインを含む複数のＶＥＧＦトラップが種々の組み合わせで、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ ８，２６１，５７５に開示されている。ＤＡＲＰｉｎｓ（デザインされたアンキリン反復タンパク質のためのアクロニム）は、かなり特異的で、高い親和性の標的タンパク質結合を典型的に示す、遺伝子組み換え抗体模倣タンパク質である。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ＭＰ０１１２は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）阻害剤であり、滲出型黄斑変性および糖尿病黄斑浮腫の治療のための治験に入った。

本発明によって、ＶＥＧＦ発現を標的にし得る。たとえば、ＶＥＧＦ阻害剤ＰＴＣ２９９はＶＥＧＦメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を選択的に結合し、それにより、ＶＥＧＦの翻訳を防止することにより転写後にＶＥＧＦを標的にする。ペガプタニブ（マクジェン）は、ＶＥＧＦ‐１６５に対して方向付けられたＲＮＡアプタマーである。

胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）は、病的血管新生に関与してきた。ＰＩＧＦは、ＶＥＧＦに構造的に関連し、また、ＶＥＧＦＲ‐１に対するリガンドである。その結果、ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインを有するＶＥＧＦトラップ（上記を参照されたい）は、ＰＩＧＦを標的にするのに有用である。抗血管新生剤はさらに、ＶＥＧＦＲ‐１／Ｆｌｔ‐１受容体に結合する薬剤を含む。特定の実施形態においては、ＶＥＧＦＲ‐１の細胞外ドメインに結合する抗原結合タンパクは、そのリガンド、すなわち、ＶＥＧＦおよびＰＩＧＦの１つまたは両方による結合を遮断し、および／または、ＶＥＧＦＲ‐１のＶＥＧＦ誘発またはＰＩＧＦ誘発活性化を中和する。

ＰＤＧＦは、ホモ二量体ＰＤＧＦ‐ＡＡ、ＢＢ、ＣＣおよびＤＤおよびＰＤＧＦ−ＡＢヘテロ二量体を形成する４つのポリペプチド鎖から成る。ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）‐αおよびβはＰＤＧＦ機能を媒介する。具体的には、ＰＤＧＦＲαはＰＤＧＦ‐ＡＡ、‐ＢＢ、‐ＡＢおよび‐ＣＣに結合し、ＰＤＧＦＲβは‐ＢＢおよび‐ＤＤと相互作用する。非限定的なＰＤＧＦ結合剤の実施例は、抗ＰＤＧＦ抗体およびＰＤＧＦトラップを含む。ＰＤＧＦを標的にする薬剤は、Ｆｏｖｉｓｔａ（登録商標）（Ｅ１００３０、Ｏｐｈｔｈｏｔｅｃｈ）、ＰＤＧＦ‐ＢおよびＡＸ１０２（Ｓｅｎｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７５（１５）：７３５９−６７）を標的にするペグ化した（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）アプタマー、ＰＤＧＦ‐Ｂに結合するＤＮＡオリゴヌクレオチドアプタマーを含む。

ＰＤＧＦ受容体を標的にする薬剤は、ラムシルマブ（ＩＭＣ‐３Ｇ３、ヒトＩｇＧ₁）、抗ＰＤＧＦＲα抗体、クレノラニブ（ＣＰ‐８６８５９６）、ＰＤＧＦα（ＩＣ₅₀＝０．９ｎＭ）およびＰＤＧＦＲβ（ＩＣ₅₀＝１．８ｎＭ）、ならびにＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβおよび他のチロシンキナーゼの阻害剤を含む。

血管新生阻害剤は、たとえば、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦまたはＰＤＧＦ受容体のリガンド、または補体により媒介されたシグナル伝達を遮断する細胞内薬剤を含む。血管新生阻害剤を阻止する細胞内薬剤は次の薬剤を含むが、それらに限定されない。スニチニブ（スーテント；ＳＵ１１２４８）は、ＶＥＧＦＲ１‐ＶＥＧＦＲ３、ＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβ、幹細胞因子受容体（ｃＫＩＴ）、Ｆｌｔ‐３およびコロニー刺激因子‐１受容体（ＣＳＦ‐１Ｒ）のｐａｎｓｐｅｃｉｆｉｃ低分子阻害剤である。アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６；インライタ）は、ＶＥＧＦＲ１‐ＶＥＧＦＲ３、ＰＤＧＦＲおよびｃＫＩＴを阻止する他の低分子チロシンキナーゼ阻害剤である。セディラニブ（ＡＺＤ２１７１）は、VＥＧＦＲ１‐ＶＥＧＦＲ３、ＰＤＧＦＲβおよびｃＫＩＴを阻害剤である。ソラフェニブ（ネクサバール）は、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲおよびＲａｆキナーゼを含む複数のチロシンタンパク質キナーゼの他の低分子阻害剤である。パゾパニブ（ヴォトリエント；ＧＷ７８６０３４）は、ＶＥＧＦＲ‐１、‐２および‐３、ｃＫＩＴならびにＰＤＧＦＲを阻止する。フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９；ＸＬ８８０）は、カボザンチニブ（コメトリク；ＸＬ１８４）が阻止するように、ＶＥＧＦＲ２およびＭＥＴを阻止する。ポナチニブ（イクルシグ；ＡＰ２４５３４）は、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲおよびｃＫＩＴを阻止する。チボザニブ（ＡＶ‐９５１）は、ピコモル濃度でＶＥＧＦＲ‐１、ＶＥＧＦＲ‐２およびＶＥＧＦＲ‐３を阻止する。ＣＰ‐５４７６３２は、ＶＥＧＦＲ‐２および基本的線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）キナーゼの強力な阻害剤である。Ｅ‐３８１０（（６‐（７‐（（１‐アミノシクロプロピル）メトキシ）‐６‐メトキシキノリン‐４‐イルオキシ）‐Ｎ‐メチル‐１‐ナフトアミド）は、ナノモル領域におけるＶＥＧＦＲ‐１、‐２および‐３、ならびにＦＧＦＲ‐１および‐２キナーゼを阻止する。ブリバニブ（ＢＭＳ‐５８２６６４）は、ＦＧＦ受容体シグナリングも阻止するＶＥＧＦＲ‐２阻害剤である。ＣＴ‐３２２（アドネクチン）は、ヒトフィブロネクチンドメインに基づく小さいタンパク質であり、ＶＥＧＦＲ２の活性化に結合して、その活性化を阻止する。バンデタニブ（Ｃａｐｒｅｌａｓ；Ｚａｃｔｉｍａ；ＺＤ６４７４）は、ＶＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲおよびＲＥＴチロシンキナーゼの阻害剤である。Ｘ‐８２（Ｘｃｏｖｅｒｙ）は、成長因子受容体ＶＥＧＦＲおよびＰＤＧＦＲを介するシグナリングの低分子インドリノン阻害剤である。

特定の実施形態においては、本発明の抗ＶＥＧＦＲ抗体が、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤と同時投与される。ＭＭＰ‐１４、ＭＭＰ‐１６およびＭＭＰ‐２４などのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および基底膜の成分を開裂し、それにより、癌細胞が下部間質マトリックスに侵入して浸潤するようにする。さらに、複数の成長因子受容体、細胞接着分子、ケモカイン、アポトーシスリガンドおよび血管新生因子が、ＭＭＰの基質である。ゆえに、ＭＭＰ活性は、成長因子の活性化、腫瘍細胞アポトーシスの抑制、宿主免疫応答により作られたケモカイン勾配の破壊、または血管新生因子の放出をもたらす可能性がある。ＭＭＰは、特定の結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）に結合されるインスリン様成長因子などの細胞増殖因子の放出を促進することにより、腫瘍成長を容易にする（Ｍａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２５７０６−２５７１２）。

神経膠腫ＭＭＰ‐２を含むコラゲナーゼが、黒色腫において、ならびに結腸、乳房、肺、前立腺および膀胱の癌において高いレベルで認識されてきた。通常、これらの高いレベルは、より高い腫瘍の程度および侵襲性と相関する。ＭＭＰ‐２のレベルは、転移性肺癌により患者の血清中でかなり高くなり、その高レベルの患者において、化学療法への応答性が低下する。活性ＭＭＰ‐２を放出するようにプロＭＭＰ‐２を放出するＭＭＰ‐１４は、多数の癌で高くなり、腫瘍の成長、腫瘍塞栓症、癌（たとえば、ＣＮＳ腫瘍（たとえば、神経膠腫）、頭頸部癌、口腔癌、喉頭癌、軟骨肉腫、乳癌）の移動性、侵襲性および転移性に寄与し得る。ＭＭＰ‐１６およびＭＭＰ‐２４はまた、多数の癌で高くなり、腫瘍の成長ならびに癌（たとえば、乳癌、喉頭癌、卵巣癌、精巣癌、黒色腫、脳腫瘍（たとえば、星状細胞腫、膠芽細胞腫、神経膠腫）の侵襲性および転移性の両方に寄与する。

特定の実施形態においては、本発明の抗ＶＥＧＦＲ抗体は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ７，７４５，５８７および８，１０６、１６８に開示された抗ＭＭＰ‐１４抗体を含むが、それに限定されないＭＭＰ‐１４アンタゴニストと同時投与される。一実施形態においては、抗体はヒトモノクローナル抗体ＤＸ‐２４００（Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ）である。そのような抗体との同時投与は、子宮頸部、胃、肺、胸部、頭頸部、悪性脳腫瘍および黒色腫を含むが、それらに限定されないヒト癌の治療に適切である。

他の実施形態においては、本発明のＶＥＧＦＲ２抗体は、たとえば、サイトカイン（たとえば、ＩＬ‐１０およびＩＬ‐１３）または他の免疫促進剤などの１つまたは複数の適切な補助剤と組み合わせて投与され得る。しかしながら、抗ＫＤＲ抗体のみの投与が、治療効果のある様式で腫瘍の進行を防止、阻止または低下させるのに十分であることが認められる必要がある。

抗炎症および免疫抑制剤は、グルココルチコイド（たとえば、デキサメタゾン）、ＦＸ５０６（タクロリムス）、シクロスポリン、フィンゴリモド、ＩＦＮβまたはＩＦＮγなどのインターフェロン、インフリキシマブ（レミケード）などの腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）結合タンパク質、エタネルセプト（エンブレル）またはアダリムマブ（ヒュミラ）およびミコフェノール酸を含むステロイド剤を含む。

特定の実施形態は、本発明の抗体と、次の第２の薬剤であって、乳癌、尿路および腎臓癌を含む固形腫瘍のためのドセタキセル、パクリタキセル（固形腫瘍、胃腺癌）、結腸直腸癌のためのＦＯＬＦＲＩ(例、イリノテカン、フォリン酸、５‐フルオロウラシル)カペシタビン(乳がん)ＦＯＬＦＯＸ（例、、オキサリプラチン、ロイコボリン、５‐フルオロウラシル）（胃、食道、胃食道癌）、エリブリン（乳癌）、ＦＯＬＦＩＲＩ（すなわち、イリノテカン、レボホリナート、５‐フルオロウラシル）（結腸直腸癌）、カルボプラチン（ＮＳＣＬＣ）、ミトキサントロンおよびプレドニゾン（前立腺癌）、ＯＦＦ（オキサリプラチンフォリン酸、５‐フルオロウラシル）（結腸直腸癌）、イリノテカンおよびセツキシマブ（結腸直腸癌）、およびダカルバジン（悪性黒色腫）の第２の薬剤と、を投与することを含む。

本発明の抗体および抗原結合断片は、薬剤、たとえば、細胞毒性薬、細胞毒素酵素または放射性同位体に接合され得る。この方法は、そのような治療を必要とする被検体に、結合タンパク質のみを、または、薬剤（たとえば、細胞毒性薬）に加えられた結合タンパク質を、投与することを含む。たとえば、ＶＥＧＦＲ２抗体またはその断片は、ＶＥＧＦＲ２関連細胞または組織、たとえば、腫瘍に、毒素などのナノ粒子を含む薬剤を供給するのに用いられてもよい。

ＶＥＧＦＲ２結合タンパク質は、自然補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して抗原発現細胞を除去するように直接、生体内で用いられ得る。本明細書で記載している結合タンパク質は、ＩｇＧ１、‐２または‐３からのＦｃ部分、または補体を結合するＩｇＭの対応する部分などの補体結合エフェクタードメインを含み得る。

本発明のＶＥＧＦＲ‐２抗体が第２の薬剤と共に投与されるとき、これらの第１の薬剤および第２の薬剤は、連続的にまたは同時に投与され得る。各薬剤は、一回の投与量でまたは複数回の投与量で投与され得、この投与量は、1日に2回、毎日、毎週、２週間毎、毎月を含む任意のスケジュールで投与され得るが、それらに限定されない。

本発明は補助投与も含む。補助投与とは、第２の薬剤が、疾患または疾患症状を治療するためにすでに投与された第１の薬剤に加えて、患者に投与されることを意味する。一部の実施形態においては、補助投与は、第１の薬剤の投与が疾患または疾患症状を治療できなかった、または十分に治療できなかった患者に対して第２の薬剤を投与することを含む。他の実施形態においては、補助投与は、第１の薬剤により疾患が効果的に治療できた患者への第２の薬剤の投与を含む。

本発明の一実施形態においては、抗体または抗体の抗原結合断片は注射により投与され、低分子は経口で投与される。そのような一実施形態においては、抗体は、週毎に、または毎月一回または二回、投与され、低分子は毎日投与される。

本発明の実施形態においては、抗体または抗体の抗原結合断片は注射により投与され、ＲＯＣＫ２阻害剤は経口で投与される。好適な実施形態においては、これらの薬剤は一日に一回投与される。本発明によって、ＲＯＣＫ阻害剤またはＶＥＧＦＲ２抗体が眼疾患を治療するために被検体に投与されるとき、ＴＧＦ‐βアンタゴニストが、瘢痕化を低減または防止するように被検体に投与され得る。たとえば、本発明の実施形態においては、ＲＯＣＫ阻害剤が眼疾患を治療するために投与されるとき、ＴＧＦ‐βアンタゴニストも投与される。他の実施形態においては、ＶＥＧＦ阻害剤が眼疾患を治療するために被検体に投与されるとき、ＴＧＦ‐βアンタゴニストも投与される。他の実施形態においては、ＲＯＣＫ阻害剤およびＶＥＧＦアンタゴニストが眼疾患を治療するために被検体に投与されるとき、ＴＧＦ‐βアンタゴニストも投与される。新血管形成を含む眼疾患においては、新しい血管からの漏出は、瘢痕形成（たとえば、円板状瘢痕）により後続される。本発明は、眼疾患における新血管形成を治療するための被検体へのＴＧＦ‐βアンタゴニストならびにＶＥＧＦアンタゴニストおよびＲＯＣＫ2阻害剤の投与を含む。

有用なＴＧＦ‐βアンタゴニストは、以下の、（ｉ）パン‐ＴＧＦ‐β抗体ＧＣ‐１００８（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、抗ＴＧＦ‐β₁抗体ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ（ＣＡＴ‐１９２）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、およびこれらの抗体の抗原結合断片、などの抗ＴＧＦ‐β抗体と抗原結合断片（ｉｉ）Ｐ１４４、ＴＧＦ‐βタイプＩＩＩ受容体（Ｅｓｐａｒｚａ‐Ｌoｐｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（１８）：１４５８８−９６）の膜近傍リガンド結合ドメインからの合成ペプチド包囲アミノ酸７３０−７４３、およびタイプＩＩ ＴＧＦ‐β受容体‐Ｆｃ（ＩｇＧ₁）融合（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓ．８４：１２１２−２２）、(ｉｉｉ) ＴＧＦ‐β受容体に結合する、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２７１５５−５９に開示されたＴＧＦ‐β₁、ＴＧＦ‐β₂およびＴＧＦ‐β₃からの２５アミノ酸ペプチドなどのＴＧＦ‐βの１つまたは複数のアイソフォームを遮断するＴＧＦ‐β受容体に結合するペプチド、および（ｉｖ）トラベデルセン（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ）などのＴＧＦ‐β合成を阻止するアンチセンス薬剤、ＴＧＦ‐β２の合成を阻止するオリゴヌクレオチド、を含むが、それらに限定されない。追加的なアンタゴニストについては、ＷＯ２００６／０５２５６８、ＷＯ０２／０９４８３３、ＷＯ０４／０４８３８２、ＷＯ０４／０４８３８１、ＷＯ０４／０５０６５９、ＷＯ０４／０２１９８９、ＷＯ０４／０２６８７１およびＷＯ０４／０２６３０７に開示されている。

特定の実施形態においては、化合物または組成物のある投与量が、毎日、一日おきに、２〜３日おきに、３日毎に、一週間に一回、一週間に二回、一週間に三回または二週間に一回、被験者に投与される。他の実施形態においては、化合物または組成物の２つ、３つまたは４つの投与量が、毎日、２〜３日おきに、３日毎に、一週間に一回、一週間に二回または二週間に一回、被験者に投与される。一部の実施形態においては、化合物または組成物の投与量が、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間または２１日間、投与される。特定の実施形態においては、化合物または組成物の投与量が、１ヶ月、１．５ヶ月、２ヶ月、２．５ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月またはそれ以上、投与される。

投与方法は、非経口の、皮内の、硝子体内の、筋肉内の、腹腔内の、静脈内の、皮下の、鼻腔内の、硬膜外の、経口の、舌下の、鼻腔内の、脳内の、膣内の、経皮的な、経粘膜的な、直腸の、吸入の、もしくは、耳、鼻、眼または皮膚に対して局所的な、個別的なものであるが、それらに限定されない。投与の様式は、実行者の裁量に任される。殆どの実施例においては、投与は、血流への化合物の放出をもたらす。眼疾患の治療のためには、生物学的薬剤の硝子体内投与が好ましい。

特定の実施形態においては、化合物を局所的に投与することが望ましい。これは、たとえば、限定的ではなく、局所注入、局所適用、注射、カテーテル、インプラントにより達成され、前記インプラントは、サイラスティック膜または繊維などの多孔性、非多孔性または膠様物質であってもよい。そのような実施例においては、投与は、血流への化合物の実質的な放出を伴わずに、局所的組織を選択的に標的にしてもよい。

肺内投与も、たとえば、吸入器または噴霧器を用いて、およびエアロゾル化薬剤の処方、もしくは、フッ化炭素または合成肺表面活性剤のかん流により採用され得る。特定の実施形態においては、トリグリセリドなどの従来の結合剤および賦形剤を伴って、坐薬としての化合物が考案されている。

他の実施形態においては、化合物は、小胞、特にリポソーム内に供給される（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｌｏｐｅｚ‐Ｂｅｒｅｓｔｅｒｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３‐３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｉｂｉｄ．，ｐｐ．３１７‐３２７；一般に同箇所を参照されたい）。

他の実施形態においては、化合物は、制御された放出システムで供給される（たとえば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５‐１３８（１９８４）を参照されたい）。Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３により、その記載において議論されている制御された放出システムの実施例が使用されてもよい。一実施形態においては、ポンプが使用されてもよい（Ｌａｎｇｅｒ，ｓｕｐｒａ；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照されたい）。他の実施形態においては、高分子材料を用い得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．）,ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照されたい、また、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照されたい）。

上記の投与スケジュールは、例示目的のみのために提供されていて、限定的とみなされるべきではない。当業者は、すべての投与量が本発明の範囲内にあることを容易に理解することができるであろう。

本明細書で開示している本発明の原理におけるバリエイションは、当業者によりなされ得ることが理解および予測されるべきであり、そのような変形は本発明の範囲内に含まれるべきであることが意図されている。

本明細書の全体を通して、種々の文献を参照している。それらの文献は、それらの全体を参照することにより本明細書に含まれ、本発明が関連する従来技術を十分に明らかにしている。以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、本発明の範囲を限定するとみなされるべきではない。

実施例１
ＶＥＧＦＲドメイン２および３を結合して、リガンド結合を遮断する抗体の同定

表１で同定された、ヒトＶＥＧＦＲ２に結合し、このヒトＶＥＧＦＲ２を中和する２つの抗体が、ヒトＦａｂファージディスプレイライブラリーから単離された。これらの抗体は、ｈＶＥＧＦＲ２へのリガンドＶＥＧＦＡの結合を遮断する（図２）。抗体はまた、ＫＤＲを発現するブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞に結合し、ＶＥＧＦＲ２、ＡＫＴおよびＭＡＰＫのＶＥＧＦＡ刺激リン酸化を阻止する（表３）。表１は、ＣＤＲのアミノ酸配列および抗体の可変ドメインを示す。Ｍａｂ１０１およびＭａｂ１０２のＫ_dｓはそれぞれ、約６．６ｍＭおよび１．７ｎＭである。

Ｍａｂ１０１の重鎖が、κ軽鎖遺伝子（κライブラリ）およびλ軽鎖遺伝子（λライブラリ）と入れ替えられた。２０個の一意のλ軽鎖可変部が、ヒトＶＥＧＦＲ２およびマウスＶＥＧＦＲ２の両方に対してλライブラリーをパンすることにより認識された。２２個の一意のκ軽鎖可変部が、ヒトＶＥＧＦＲ２およびマウスＶＥＧＦＲ２の両方に対してκライブラリーをパニングすることにより認識された。表２は、ＣＤＲのアミノ酸配列および軽鎖の可変ドメインを示す。Ｍａｂ１０５、１０６および１０７のＫ_dｓはそれぞれ、約１０倍（それぞれ、０．２４ｎＭ、０．２２ｎＭおよび０．１２ｎＭ）である（表３）。これらの抗体、およびそれらが導き出された抗体 Ｍａb１０１は、ＶＥＧＦＲのドメイン２および３、ならびにそれらのドメインを含む構成物に結合する。

親抗体のように、これらの抗体は、ＶＥＧＦＲ２に結合し、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦＡの結合を遮断し（図４）、ＶＥＧＦＲ２、ＡＫＴおよびＭＡＰＫのＶＥＧＦＡ刺激リン酸化を阻止する（図５）。

Ｍａｂ１３８、１３９、１４０および１４６を含む複数の抗体も、マウスＶＥＧＦＲ２と交差反応する。
Ｍａｂ１３８、１３９および１４０は、ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦＡ刺激リン酸化、およびＭＡＰＫを含む下流シグナル伝達分子を阻止した。
実施例２
生体内腫瘍成長の阻止

生後６乃至８週の性別をマッチングした（メスの）ＮＯＤ‐ＳＣＩＤマウスが、約０．９Ｇｙ／ｍｉｎの線量率において¹³⁷Ｃｓガンマ線源から３．５Ｇｙで照射され、２ｘ１０⁷個のＨＬ６０細胞が静脈内に接種された。腫瘍接種３日後、マウスのグループは、Ｍａｂ１０６の種々の投与量で週に２回処理され、生存時間について記録された。

処理されなかった全てのマウスは約２週間で死んだ。高い腫瘍の負荷を伴っているのに、１０ｍｇ／ｋｇのＭａｂ１０６で処理されたマウスの生存時間は、２８日まで延びた。
実施例３
人間の患者における結腸癌の治療

結腸癌と診断された人間の被検体が、複数の治療グループに分けられ、標準的な化学療法的養生法が与えられた。２つの患者グループが、４ヶ月間、毎週５ｍｇ／ｋｇ／週または１５ｍｇ／ｋｇ／週の処理をされた。制御グループは、標準的な化学療法的養生法のみが与えられた。腫瘍負荷が、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）により定期的に評価された。制御グループと比較して、毎週、抗体治療を受けた患者は、腫瘍の成長または腫瘍の大きさにおいてかなりの低減を示し、抗体治療を受けなかった患者に比較して、進行の遅延または生存期間の延長がもたらされると予想される。

Claims (24)

1. ＣＤＲ‐１Ｈ、ＣＤＲ‐２ＨおよびＣＤＲ‐３Ｈ配列を有する、重鎖可変ドメインを有するヒトＶＥＧＦＲ２を結合する、単離された抗体または該抗体の断片であって、
   （ｉ）前記ＣＤＲ‐１Ｈ配列はＧＦＴＦＳＷＹＸ₁ＭＸ₂（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５）であり、ここで、Ｘ₁はＶであり、Ｘ₂はＧまたはＬであり、
   (ｉｉ)ＣＤＲ‐２Ｈ配列はＳＩＸ₁Ｘ₂ＳＧＧＸ₃ＴＸ₄ＹＡＤＳＶＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６）であり、ここで、Ｘ₁はＹまたはＧであり、Ｘ₂はＰまたはＳであり、Ｘ₃はＡまたはＦであり、Ｘ₄はＮまたはＤであり、
   （ｉｉｉ）ＣＤＲ‐３Ｈ配列はＧＮＹＦＤＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）またはＧＬＡＡＰＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）である
   前記抗体。
2. 前記抗体は、ＣＤＲ‐１Ｌ、ＣＤＲ‐２ＬおよびＣＤＲ‐３Ｌを有し、
   （ｉ）ＣＤＲ‐１Ｌ配列は、Ｘ₁ＧＸ₂Ｘ₃ＬＸ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇Ｘ₈Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８７）であり、ここで、Ｘ₁はＳ、ＱまたはＴであり、Ｘ₂はＤ、ＥまたはＱであり、Ｘ₃はＫ、Ｓ、Ｎ、ＩまたはＡであり、Ｘ₄はＧまたはＲであり、Ｘ₅はＤ、Ｓ、Ｈ、ＥまたはＮであり、Ｘ₆はＥ、Ｙ、Ｑ、ＲまたはＮであり、Ｘ₇はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ₈はＡまたはＳであり、もしくはＳＧＳＸ₁ＳＮＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇Ｘ₈（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８８）であり、ここで、Ｘ₁はＳまたはＴであり、Ｘ₂はＩまたはＬであり、Ｘ₃はＥまたはＧであり、Ｘ₄はＴ、ＳまたはＮであり、Ｘ₅はＮまたはＹであり、Ｘ₆はＴ、Ｐ、ＡまたはＹであり、Ｘ₇はＶまたはＬであり、Ｘ₈はＮ、ＩまたはＹであり、もしくはＸ₁ＧＸ₂ＳＸ₃ＤＸ₄ＧＸ₅ＹＤＹＶＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８９）であり、ここで、Ｘ₁はＡまたはＴであり、Ｘ₂はＳまたはＴであり、Ｘ₃はＨ、ＳまたはＮであり、Ｘ₄はＩまたはＶであり、Ｘ₅はＳまたはＡであり、
   （ｉｉ）ＣＤＲ‐２Ｌ配列は、Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９０）であり、ここで、Ｘ₁はＱ、Ｄ、Ｔ、Ｙ、ＳまたはＡであり、Ｘ₂はＤ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＶであり、Ｘ₃はＤ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＹであり、Ｘ₄はＱ、Ｋ、ＮまたはＬであり、Ｘ₅はＲまたはＬであり、
   （ｉｉｉ）ＣＤＲ‐３Ｌ配列は、ＱＸ₁ＷＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇Ｘ₈（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１）であり、ここで、Ｘ₁はＡまたはＴであり、Ｘ₂はＤまたはＧであり、Ｘ₃はＲでありまたはアミノ酸を含まず、Ｘ₄はＳ、ＦまたはＮであり、Ｘ₅はＳ、ＴまたはＮであり、Ｘ₆はＳ、ＴまたはＰであり、Ｘ₇はＡ、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＹであり、Ｘ₈はＶまたはＬであり、もしくはＡＸ₁ＷＤＤＸ₂ＬＸ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９２）であり、ここで、Ｘ₁はＡ、ＳまたはＴであり、Ｘ₂はＮまたはＳであり、Ｘ₃はＮ、ＩまたはＧであり、Ｘ₄はＧまたはＳであり、Ｘ₅はＰ、ＷまたはＶであり、Ｘ₆はＶまたはＬであり、もしくはＭＹＳＴＩＴＸ₁ＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３）であり、ここで、Ｘ₁はＡまたはＴである
   請求項１に記載の前記抗体。
3. 前記抗体は、ＣＤＲ‐１Ｌ、ＣＤＲ‐２ＬおよびＣＤＲ‐３Ｌを有し、
   （ｉ）ＣＤＲ‐１Ｌ配列は、ＲＡＳＸ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇ＹＸ₈Ｘ₉（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４）であり、ここで、Ｘ₁はＱ、ＥまたはＨであり、Ｘ₂はＳ、ＲまたはＮであり、Ｘ₃はＶ、ＩまたはＬであり、Ｘ₄はＳ、Ｒ、ＧまたはＮであり、Ｘ₅はＳまたはＮであり、Ｘ₆はＳ、Ｎ、ＷまたはＤであり、Ｘ₇はＧでありまたはアミノ酸を含まず、Ｘ₈はＬまたはＦであり、Ｘ₉はＡ、Ｇ、ＭまたはＳであり、
   （ｉｉ）ＣＤＲ‐２Ｌ配列は、ＧＡＳＸ₁ＲＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５）であり、ここで、Ｘ₁はＳ、Ｔ、ＩまたはＮであり、
   （ｉｉｉ）ＣＤＲ‐３Ｌ配列は、ＱＱＸ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇Ｘ₈（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６）であり、ここで、Ｘ₁はＦまたはＹであり、Ｘ₂はＤ、ＧまたはＹであり、Ｘ₃はＳ、ＴまたはＮであり、Ｘ₄はＳ、ＬまたはＷであり、Ｘ₅はＰでありまたはアミノ酸を含まず、Ｘ₆はＰまたはＴであり、Ｘ₇はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、ＷまたはＹであり、Ｘ₈はＴまたはＳである
   請求項１に記載の前記抗体。
4. 前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を有するＣＤＲ‐１Ｈと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を有するＣＤＲ‐２Ｈと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を有するＣＤＲ‐３Ｈとを有する、請求項１に記載の前記抗体。
5. 前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を有するＣＤＲ‐１Ｌと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６を有するＣＤＲ‐２Ｌと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を有するＣＤＲ‐３Ｌとを有する、請求項１に記載の前記抗体。
6. 前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を有する重鎖可変ドメインを有する、請求項１に記載の前記抗体。
7. 前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８を有する軽鎖可変ドメインを有する、請求項１に記載の前記抗体。
8. 前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９を有するＣＤＲ‐１Ｈと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０を有するＣＤＲ‐２Ｈと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１を有するＣＤＲ‐３Ｈとを有する、請求項１に記載の抗体。
9. 前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３を有するＣＤＲ‐１Ｌと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４を有するＣＤＲ‐２Ｌと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５を有するＣＤＲ‐３Ｌとを有する、請求項１に記載の前記抗体。
10. 前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２を有する重鎖可変ドメインを有する、請求項１に記載の前記抗体。
11. 前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６を有する軽鎖可変ドメインを有する、請求項１に記載の前記抗体。
12. 前記抗体は、表２に示す抗体の一である、請求項１に記載の前記抗体。
13. 前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５を有するＣＤＲ‐１Ｌと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６を有するＣＤＲ‐２Ｌと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７を有するＣＤＲ‐３Ｌとを有する、請求項１に記載の前記抗体。
14. 前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８を有する軽鎖可変ドメインを有する、請求項１に記載の前記抗体。
15. 前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９を有するＣＤＲ‐１Ｌと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０を有するＣＤＲ‐２Ｌと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１を有するＣＤＲ‐３Ｌとを有する、請求項１に記載の前記抗体。
16. 前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２を有する軽鎖可変ドメインを有する、請求項１に記載の前記抗体。
17. 前記抗体は、ｈＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合を遮断する、請求項１乃至１６のいずれか一項に記載のすべての前記抗体。
18. 請求項１乃至１６の何れか一項に記載の抗体の有効量を有する細胞に接することを含むＶＥＧＦＲ２の活性化を中和する方法。
19. 請求項１乃至１６の何れか一項に記載の抗体の有効量を投与することを含む血管新生を阻止する方法。
20. 請求項１乃至１６の何れか一項に記載の抗体の有効量を投与することを含む腫瘍成長を低減する方法。
21. 表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニストの有効量を投与することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
22. ｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体（ｆｌｔ‐１）アンタゴニストの有効量を投与することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
23. ｒｈｏ関連キナーゼ２（ＲＯＣＫ２）アンタゴニストの有効量を投与することをさらに有する、請求項２０に記載の方法。
24. マトリックスメタロプロテアーゼアンタゴニストの有効量を投与することをさらに有する、請求項２０に記載の方法。