ES2959119T3 - Método de uso de ciclodextrina - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para usar ciclodextrina para tratar, inhibir, prevenir, mejorar o curar la diabetes o afecciones relacionadas con la diabetes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método de uso de ciclodextrina

Antecedentes de la invención

Esta invención generalmente se relaciona con una composición farmacéutica para reducir el colesterol en la membrana plasmática y celular para su uso en el tratamiento, inhibición, prevención o mejora de una condición, o un síntoma de dicha condición, dicha condición siendo nefropatía diabética/enfermedad renal diabética.

La obesidad, síndrome metabólico, prediabetes y diabetes representan una epidemia mundial con un costo importante de atención médica, ya que todas estas condiciones médicas prevalentes son factores de riesgo principales para la morbilidad y mortalidad cardiovascular.

Se ha establecido que los niveles elevados de colesterol plasmático y, en particular, los niveles de colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL, por sus siglas en inglés), desempeñan un papel importante en el desarrollo de la enfermedad coronaria, accidente cerebrovascular, enfermedad vascular periférica, enfermedad renal, aterosclerosis e hipertensión. Los ensayos clínicos han demostrado que la disminución de las concentraciones de colesterol en el plasma tiene un impacto importante en la morbilidad y mortalidad cardiovascular. Por lo tanto, el control terapéutico de la hipercolesterolemia sistémica es de importancia crítica en el manejo clínico y el tratamiento de la obesidad, síndrome metabólico, prediabetes y diabetes.

Si bien la corrección de la hipercolesterolemia sistémica en los trastornos vasculares relacionados se ha estudiado ampliamente, no se han estudiado estrategias para reducir la acumulación local de colesterol en la membrana plasmática y a nivel celular en los órganos objetivo de la obesidad, síndrome metabólico, prediabetes y diabetes.

La acumulación de colesterol en pacientes con obesidad, síndrome metabólico o diabetes se ha descrito en varios órganos, tales como páncreas, músculo, hígado, vasos sanguíneos, riñones, aunque las consecuencias funcionales de la acumulación de colesterol local en estos órganos aún están por establecerse.

Tanto en la enfermedad renal clínica como experimental, por ejemplo, la acumulación renal de colesterol se correlaciona con el desarrollo de glomeruloesclerosis, y los riñones de ratas diabéticas se caracterizan por la acumulación de colesterol. La acumulación excesiva de colesterol puede ser perjudicial para la función celular a través de varios mecanismos, que incluyen una modulación del citoesqueleto de actina celular, una modulación de la respuesta de los podocitos a varios factores circulantes (insulina, IGF (por sus siglas en inglés), VEGF (por sus siglas en inglés), cualquier factor de crecimiento, apolipoproteínas, adipocinas, hormonas endocrinas), una modulación de citocinas inflamatorias producidas localmente, quimiocinas y sus receptores, integrinas, una modulación de la respuesta inmunitaria (tal como la mediada a través de TLR (por sus siglas en inglés) y moléculas coestimuladoras como B7-1-CD80, por sus siglas en inglés), o una modulación de las rutas de muerte celular pro- y antiapoptótica.

Asimismo, recientemente hemos demostrado un papel importante de las enzimas relacionadas con los esfingolípidos (fosfodiesterasa 3b similar a la esfingomielinasa ácida, SMPDL3b, por sus siglas en inglés) como moduladores de la función de los podocitos, que son células renales bastante afectadas en la diabetes. Similarmente, los glicoesfingolípidos se acumulan en el riñón de las ratas diabéticas. Sin embargo, aún no hay datos disponibles que muestren un efecto benéfico de la eliminación del colesterol en la membrana plasmática o celular en enfermedades proteinúricas u otras enfermedades relacionadas con el riñón, tales como la enfermedad renal diabética.

Por lo tanto, lo que se necesita es una composición farmacéutica que pueda modular la acumulación del colesterol en la membrana plasmática o celular observado en la enfermedad. Tal composición puede ser útil en una estrategia preventiva y terapéutica para el tratamiento, inhibición o mejora de tales condiciones como la diabetes, prediabetes, síndrome metabólico, obesidad o síntomas de las mismas.

Las ciclodextrinas (CD, por sus siglas en inglés) son oligosacáridos cíclicos que contienen 6 o más unidades de D-(+) glucopiranosa que están unidas por enlaces glucosídicos a, p o<y>-(1,4). Se ha demostrado que las ciclodextrinas son capaces de formar complejos con una variedad de moléculas hidrofóbicas debido a su estructura única. Los derivados de la ciclodextrina se usan ampliamente en laboratorios de investigación, por ejemplo, para eliminar el colesterol de las células cultivadas, y son bien conocidos en la industria farmacéutica por su capacidad para solubilizar fármacos.

Las ciclodextrinas no derivatizadas se usan a lo largo de la industria alimentaria para fabricar productos sin colesterol, tales como mantequilla, huevos y productos lácteos sin grasa. La hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HPpCD, por sus siglas en inglés) es reconocida como un material GRAS (generalmente reconocido como seguro, por sus siglas en inglés) para su uso en productos alimenticios en países asiáticos y europeos, y está siendo considerada para una certificación similar en los Estados Unidos. Millones de personas en todo el mundo están expuestas a pequeñas cantidades de compuestos de ciclodextrina todos los días en alimentos, cosméticos y productos para el hogar. Los derivados de CD están disponibles comercialmente por CTD Holdings Inc. (http://cyclodex.com/). Los estudios farmacológicos han sugerido que la capacidad de agotamiento del colesterol a partir de los derivados de CD es aproximadamente 20 veces superior a la capacidad de agotamiento del colesterol a partir de las estatinas.

Además de esta exposición común a las ciclodextrinas, también se ha reconocido la seguridad y eficacia potenciales para el uso de CD en terapias. Por ejemplo, en abril de 2009, la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) aprobó un protocolo de nuevo fármaco en investigación (IND, por sus siglas en inglés) que permitía a los gemelos con una rara enfermedad del colesterol que destruye el cerebro, llamada trastorno de Niemann Pick, someterse a infusiones intravenosas semanales de HPpCD en su torrente sanguíneo. Sin embargo, investigaciones subsecuentes descubrieron que la hidroxipropil-beta-ciclodextrina no cruza del torrente sanguíneo al cerebro. Y el 23 de septiembre de 2010, la FDA otorgó la aprobación de una solicitud de IND para introducir Trappsol® Cyclo™ (HPpCD) en los cerebros de gemelas idénticas de seis años que murieron de Niemann Pick Tipo C (NPC, por sus siglas en inglés).

Un resumen de la presentación de IND para esta indicación y vía de administración está disponible públicamente en la dirección (http://addiandcassi.com/wordpress/wp-content/uploads/2009/09/Hydroxy-Propyl-Beta-Cyclodextrin-HPBCD-Summary.pdf).

C. Tanget al.:Diabetes reduces the cholesterol exporter ABCA1 in mouse macrophages and kidneys,JOURNAL OF LIPID RESEARCH,vol. 51, no. 7, 2010, pp. 1719-1728, XP055268069 describe los efectos de la diabetes tipo 1 en los niveles de ARNm y de proteína de ABCA1 (por sus siglas en inglés) en macrófagos y tejidos de ratón.

Lo que no se ha descrito previamente son los usos de CD y derivados de CD para reducir el colesterol celular o los lípidos de la obesidad, síndrome metabólico, prediabetes y diabetes, o cualquier complicación relacionada.

Ventajosamente, ahora se ha descubierto que los compuestos de ciclodextrina no actúan al afectar la ruta de síntesis del colesterol (al igual que las estatinas), sino principalmente al aumentar los mecanismos de flujo que llevan a la acumulación de colesterol.

Este descubrimiento permite que los compuestos de ciclodextrina se usen más ampliamente para la prevención y la cura de la obesidad, síndrome metabólico, prediabetes y diabetes, o cualquier complicación relacionada. Aún más, los derivados de la ciclodextrina o cualquier agente reductor del colesterol celular que pertenezca a una clase de compuestos distintos de las estatinas (tales como picolinato de cromo, agonistas del receptor X del hígado) también se pueden usar en una composición como se describe en la presente.

Una estrategia novedosa para modular el colesterol celular incluye la modulación de enzimas relacionadas con esfingolípidos como SMPDL3B (fosfodiesterasa 3b similar a la esfingomielinasa ácida), que hemos demostrado que modula el contenido de colesterol celular y la función celular.

Breve descripción de la invención

Esta invención generalmente se relaciona con una composición farmacéutica para reducir el colesterol en la membrana plasmática y celular para su uso en el tratamiento, inhibición, prevención o mejora de una condición, o un síntoma de dicha condición, dicha condición siendo nefropatía diabética/enfermedad renal diabética.

Más específicamente, una composición de la invención puede inhibir un mecanismo de flujo de entrada celular o aumentar un mecanismo de flujo de salida celular relacionado con la acumulación de colesterol, incluyendo, la modulación de una enzima esfingolípida para reducir la acumulación de colesterol celular. La composición también puede interferir con una ruta de síntesis del colesterol celular.

Preferiblemente, un compuesto útil del método en cuestión es una ciclodextrina o un derivado de una ciclodextrina. Más preferiblemente, la ciclodextrina o derivado de la misma es hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HPpCD).

La invención en cuestión contempla además composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento, prevención o mejora de una condición o síntoma, como se describe. Las composiciones de acuerdo con la invención comprenden, como principio farmacéutico activo (API, por sus siglas en inglés), al menos una ciclodextrina como se describe en la presente invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para administración inyectable. Preferiblemente, una composición de la invención comprende hidroxipropil-p-ciclodextrina (HPpCD) o un análogo, derivado, isómero o sal de la misma.

Las composiciones de la invención pueden comprender dos o más principios activos, en donde los principios activos pueden ser dos o más compuestos retinoides, o pueden incluir uno o más compuestos retinoides en combinación con un compuesto no retinoide. Los principios activos se pueden administrar secuencialmente o concomitantemente.

La composición farmacéutica de la invención se puede administrar en una cantidad efectiva del compuesto, tal como una ciclodextrina o derivado de una ciclodextrina, por una vía común de administración, tales como intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (sistémica), subcutánea, transdérmica, oral, rectal, inhalada, tópica, e intranasal. Una vía preferida de administración es la subcutánea.

Los rangos de dosificación para administrar un compuesto de acuerdo con la invención en cuestión comprenden de aproximadamente 2-20 mg/kg/día a aproximadamente 4.000 mg/kg/tres a cinco veces a la semana (con un total de hasta aproximadamente 20.000 mg/kg/semana), y se pueden administrar de al menos dos veces a la semana a aproximadamente tres veces al día.

Preferiblemente, la composición de la invención se administra como un único principio activo, en donde más de un compuesto de la misma clase de compuestos se considera un único principio. Por ejemplo, la administración de HPpCD más un derivado de HPpCD, ambos en la clase de ciclodextrinas, se considera un único principio activo o una única ciclodextrina para los fines de la invención en cuestión. Típicamente, el compuesto se administra como una composición que comprende el principio activo y al menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Alternativamente, se puede usar más de un principio farmacéutico activo, en donde la composición comprende dos principios activos, cada uno de una clase diferente de compuestos, en donde al menos uno de los compuestos es una ciclodextrina. Por ejemplo, la presente invención puede comprender la administración de un primer principio activo que comprende una o más ciclodextrinas o derivados de las mismas, y un segundo principio activo que no sea una ciclodextrina o derivado de la misma, y preferiblemente un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Para los propósitos de la invención en cuestión, un excipiente farmacéuticamente aceptable puede incluir un conservante.

El segundo principio activo se puede seleccionar entre un agente antidiabético, un inhibidor de la biosíntesis del colesterol, un inhibidor de la absorción de colesterol, un captador de ácidos biliares, niacina o un derivado de niacina, un fibrato, una proteína colesteriléster transferasa, y un inhibidor de la acetil-coenzima A acetiltransferasa o un biológico. Alternativamente, el segundo principio activo se puede seleccionar entre un agente inmunosupresor, insulina, sulfonilurea, gliptina, metformina, tiazolidindiona, un sensibilizador a la insulina, un análogo de la incretina, un inhibidor de DPP4 (por sus siglas en inglés), un agente interferente de VEG (por sus siglas en inglés), un factor de crecimiento, un antiinflamatorio, un derivado de la vitamina D, un bloqueador del sistema RAS (por sus siglas en inglés), y un bloqueador de aldosterona.

También se describe, pero no se reivindica, un método para el tratamiento, inhibición, prevención o mejora de una condición, o un síntoma o condición secundaria causada por la acumulación de colesterol celular o membrana plasmática de una célula. Estas condiciones se enlistan anteriormente y se incorporan en la presente como referencia. Esto puede comprender la administración a un paciente que padece de la condición, o síntoma o condición secundaria, una cantidad efectiva de un compuesto que reduce la acumulación celular de colesterol al afectar un mecanismo de flujo de entrada celular o un mecanismo de flujo de salida celular relacionado con la acumulación de colesterol. Esto puede incluir la modulación de una enzima esfingolípida para reducir la acumulación de colesterol celular, y puede incluir además la interferencia con una ruta de síntesis del colesterol celular.

Además, la invención en cuestión comprende una composición para el tratamiento, inhibición, prevención o mejora de un síntoma o condición relacionada causada por la acumulación celular de colesterol, en donde la composición comprende una cantidad efectiva de al menos una ciclodextrina o derivado de ciclodextrina, y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

La composición puede comprender además un segundo principio farmacéutico activo que no es una ciclodextrina o un derivado de una ciclodextrina. El segundo principio activo puede ser un agente antidiabético, un inhibidor de la biosíntesis del colesterol, un inhibidor de la absorción de colesterol, un captador de ácidos biliares, niacina o un derivado de niacina, un fibrato, una proteína colesteriléster transferasa, y un inhibidor de la acetil-coenzima A acetiltransferasa o un biológico.

Alternativamente, el segundo principio activo puede ser un agente inmunosupresor, insulina, sulfonilurea, gliptina, metformina, tiazolidindiona, un sensibilizador a la insulina, un análogo de la incretina, un inhibidor de DPP4, un agente interferente de VEG, un factor de crecimiento, un antiinflamatorio, un derivado de la vitamina D, un bloqueador del sistema RAS, y un bloqueador de aldosterona.

En el uso comercial, la composición es útil como un kit de partes en relación con un producto o artículo de fabricación que comprende la composición, como está contenida en un contenedor, en donde el contenedor se empaqueta con instrucciones escritas para el uso del compuesto o composición de acuerdo con un método para el tratamiento de una condición causada por, o un síntoma resultante de, la acumulación celular de lípidos, como se describe en la presente.

Un kit de partes preferido comprende un compuesto o composición de la invención, e instrucciones escritas que indican su uso en el tratamiento de la acumulación de colesterol celular, o una condición o un síntoma asociado con la acumulación de colesterol celular.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra los resultados de experimentos que ilustran que la CD mejora la diabetesin vivo,específicamente, el 1-colesterol se agotó por la inyección subcutánea de hidroxipropil-beta-ciclodextrina (CD) al revertir la diabetes y la obesidad en animales de experimentación, y al mejorar la función de las células de los islotes humanosex vivo.

La figura 2 muestra los resultados de experimentos que ilustran que la CD protege de la enfermedad renal diabéticain vivo,específicamente, el 2-colesterol se agotó por la inyección subcutánea de hidroxipropil-beta-ciclodextrina (CD) y mejora la albuminuria, el peso del riñón, y los atributos histológicos de la enfermedad renal diabética.

La figura 3 es una tabla que resume la seguridad de la CD en ratones BTBR (por sus siglas en inglés) tratados por cinco meses (desde la edad de 4 semanas hasta la edad de 24 semanas) con la administración subcutánea de tres inyecciones semanales de hidroxipropil-p-ciclodextrina, ilustrando específicamente que el 3-colesterol se agotó por la inyección subcutánea de hidroxipropil-beta-ciclodextrina (CD), y fue seguro incluso cuando se administró a dosis muy altas de 4.000 mg/kg de peso corporal.

La figura 4 ilustra que la acumulación de 4-colesterol ocurre en podocitos expuestos a los sueros de pacientes con diabetes y enfermedad renal diabética (DKD+, por sus siglas en inglés), cuando se compara con controles sanos normales, y con pacientes con diabetes sin enfermedad renal (DKD-).

La figura 5 muestra que la CD protege a los podocitos de los cambios observados después de la exposición a sueros DKD+, ilustrando específicamente que el agotamiento del colesterol con CD previene varios cambios fenotípicos, como la aparición de protuberancias celular, la acumulación de colesterol y la apoptosis celular, observados en células renales normales (podocitos humanos) expuestas a los sueros de pacientes con enfermedad renal diabética.

La figura 6 muestra que la expresión de enzimas relacionadas con esfingolípidos, por ejemplo, SMPDL3b, aumenta en la diabetes en órganos objetivo, tal como el riñón, y causa daño dependiente de lípidos.

Descripción detallada de la invención

Se sabe que los niveles elevados de colesterol, y en particular el colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL), en el plasma desempeñan un papel importante en el desarrollo de complicaciones microvasculares y macrovasculares de la diabetes. Sin embargo, los tratamientos actualmente disponibles para reducir los niveles de colesterol en pacientes tienen como objetivo reducir el LDL plasmático al bloquear la síntesis del colesterol en el hígado (estatinas), al prevenir la reabsorción del colesterol en el sistema circulatorio (resinas de ácidos biliares, inhibidores de la absorción de colesterol), o al aumentar el colesterol HDL (por sus siglas en inglés), (fibratos, derivados de niacina, inhibidor de la proteína colesteriléster transferasa [CETP, por sus siglas en inglés]). Ninguno de los medicamentos usados actualmente tiene como objetivo reducir el colesterol en la membrana plasmática y celular, a excepción de los agonistas del receptor x hepático (LXR, por sus siglas en inglés), que aún no se ha encontrado que sean seguros en humanos.

Esta invención generalmente se relaciona con una composición farmacéutica para reducir el colesterol en la membrana plasmática y celular para su uso en el tratamiento, inhibición, prevención o mejora de una condición, o un síntoma de dicha condición, dicha condición siendo nefropatía diabética/enfermedad renal diabética.

También se describe, pero no se reivindica, el tratamiento de trastornos metabólicos que se pueden seleccionar de una lista que comprende: diabetes (tipo 1 o tipo 2), prediabetes, obesidad, síndrome metabólico, enfermedad renal diabética, neuropatía diabética, retinopatía diabética, complicación microvascular relacionada con la diabetes, complicaciones macrovasculares relacionadas con la diabetes, aterosclerosis, enfermedad vascular periférica, enfermedades de las arterias coronarias, insuficiencia cardíaca congestiva, hipertrofia cardíaca, infarto de miocardio, disfunción endotelial e hipertensión, evento cerebrovascular, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, ataque cardíaco, accidentes cardiovasculares, hígado graso, esteatohepatitis, NASH (por sus siglas en inglés), resistencia a la insulina.

El fármaco usado para prevenir, tratar, curar o revertir los trastornos relacionados con los riñones es cualquier fármaco que reduce el contenido de colesterol en la membrana plasmática y celular de la célula.

La composición de la presente invención puede ser administrada a un individuo en una variedad de maneras. Las vías de administración incluyen, vía intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (sistémica), subcutánea (sola o en combinación con fármacos que facilitan la administración de un volumen relativamente grande de fármacos subcutáneos), transdérmica, oral, rectal, inhalada, tópica e intranasal. El fármaco se puede administrar junto con otros agentes o componentes biológicamente activos como portadores, diluyentes, excipientes y vehículos farmacéuticamente aceptables.

Una ciclodextrina descrita en la presente se puede formular en una composición farmacéutica. En un aspecto, un compuesto se puede combinar con al menos un portador farmacéuticamente aceptable para producir una composición farmacéutica, preparada usando técnicas conocidas en la técnica. En un aspecto, una composición se prepara al mezclar el compuesto con un portador farmacéuticamente aceptable. Dependiendo de los componentes que se vayan a mezclar, los componentes pueden o no interactuar química o físicamente entre sí.

Las composiciones proporcionadas en la presente se pueden formular para incluir al menos una ciclodextrina, junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, incluidos excipientes, tales como diluyentes, aglutinantes y similares, y pueden incluir aditivos, tales como agentes estabilizadores, conservantes, agentes solubilizantes y amortiguadores, como se desee.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluir portadores, espesantes, diluyentes, amortiguadores, conservantes, agentes tensioactivos, y similares, además del principio activo. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir más de un principio activo, tal como un compuesto retinoide de acuerdo con la invención, y uno o más agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, anestésicos, o similares. Los portadores farmacéuticos aceptables son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Estos serían típicamente portadores estándar para la administración a humanos, incluyendo soluciones, tales como agua estéril, solución salina, y soluciones amortiguadoras con pH fisiológico.

La composición farmacéutica se puede formular para su administración de varias maneras dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico, o dependiendo del área a tratar. La administración puede ser tópica, incluyendo oftalmológicamente, vaginalmente, rectalmente, intranasalmente, aplicada a la superficie de la piel, o similar, como sería fácilmente entendido por aquellos con conocimientos ordinarios en la técnica.

En el uso práctico, una composición proporcionada de la presente invención se puede combinar como el principio activo en una mezcla con un portador farmacéutico o vehículo de acuerdo con las técnicas convencionales de composiciones farmacéuticas. El portador usado puede depender de la forma de dosificación deseada para la administración, por ejemplo, administración oral, parenteral (incluyendo intravenosa), uretral, vaginal, nasal, dérmica, tópica, transdérmica, pulmonar, pulmonar profunda, inhalada, bucal, sublingual, o similar.

Si está en una solución acuosa, como se prefiera, una composición de ciclodextrina proporcionada se puede amortiguar adecuadamente por medio de una solución salina, acetato, fosfato, citrato, acetato u otros agentes amortiguadores, que pueden tener un pH fisiológicamente aceptable, generalmente de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 7. También se puede emplear una combinación de agentes amortiguadores, tales como solución salina amortiguada con fosfato, una solución salina y acetato, y similares. En el caso de la solución salina, se puede emplear una solución salina al 0,9 %. En el caso de acetato, fosfato, citrato, acetato y similares, se puede emplear una solución de 50 mM. Además de los agentes amortiguadores, se puede emplear un conservante adecuado para prevenir o limitar el crecimiento de bacterias y otros microorganismos. Uno de esos conservantes que se puede emplear es cloruro de benzalconio al 0,05 %.

Las preparaciones para la administración incluyen soluciones, suspensiones, y emulsiones, acuosas o no acuosas estériles. Los ejemplos de portadores acuosos o no acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones, o suspensiones, incluyendo solución salina y medios amortiguadores. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, lactato de Ringer, o aceites fijos.

Los vehículos intravenosos pueden ser reabastecedores de fluidos y nutrientes, reabastecedores de electrolitos (tales como los basados en la dextrosa de Ringer), y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, y gases inertes y similares.

Las formulaciones para administración tópica pueden incluir ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos y polvos. Los portadores farmacéuticos convencionales, las bases acuosas, en polvo o aceitosas, los espesantes y similares pueden ser necesarios o deseables. Se apreciará que las cantidades preferidas reales del compuesto activo en un caso específico variarán de acuerdo con el compuesto específico que se use, las composiciones particulares formuladas, el modo de aplicación, y del sitio particular y del mamífero que esté siendo tratado.

Al preparar las composiciones para la forma de dosificación oral, se pueden emplear medios farmacéuticos típicos, tales como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes aromatizantes, conservantes, colorantes y similares en el caso de preparaciones líquidas orales, tales como, por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones; o portadores tales como almidones, azúcares, celulosa microcristalina, diluyentes, agentes granulantes, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegradores y similares en el caso de preparados sólidos orales, tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas duras y blandas y tabletas.

Para formulaciones de administración sólida, se puede emplear cualquiera de una variedad de aditivos espesantes, de relleno, de carga y portadores, tales como almidones, azúcares, ácidos grasos y similares. Los excipientes de formulación pueden incluir polivinilpirrolidona, gelatina, hidroxicelulosa, acacia, polietilenglicol, manitol, cloruro de sodio y citrato de sodio. Para la inyección u otras formulaciones de administración líquida, se prefiere agua con al menos uno o más componentes amortiguadores, y también se pueden emplear agentes estabilizantes, conservantes y agentes solubilizantes.

También se contempla que los compuestos proporcionados de la presente invención pueden estar en forma seca y particulada. En ciertas realizaciones, las partículas están entre aproximadamente 0,5 y 6,0 |jm, de modo tal que las partículas tienen suficiente masa para asentarse en la superficie del pulmón y no ser exhaladas, pero son lo suficientemente pequeñas como para que no se depositen en las superficies de las vías respiratorias antes de llegar al pulmón. Se puede usar cualquiera de una variedad de técnicas diferentes para hacer micropartículas de polvo seco, que incluyen, pero no se limitan a, micromolienda, secado por atomización y aerosol de congelación rápida seguido de liofilización.

Para las formulaciones farmacéuticas, también se contempla que se puede emplear cualquiera de una variedad de formulaciones y aditivos de liberación medida, liberación lenta o liberación prolongada, de modo tal que la dosis se pueda formular de modo tal que se efectúe el suministro de un compuesto proporcionado a lo largo de un período de tiempo, comúnmente conocido como formulaciones de liberación controlada, retardada, prolongada, lenta o sostenida. Por ejemplo, se puede incluir gelatina, carboximetilcelulosa de sodio y/u otros excipientes celulósicos para proporcionar formulaciones de liberación prolongada o más lenta, especialmente para administración por inyección subcutánea e intramuscular.

Siempre que las ciclodextrinas de la presente invención se puedan administrar terapéuticamente por medio de una inyección, típicamente una inyección subcutánea o intramuscular, tal como en el músculo glúteo o deltoides, de una formulación inyectable de liberación prolongada. En una realización, un compuesto proporcionado de la presente invención está formulado con un PEG (por sus siglas en inglés, tal como polietilenglicol) 3350, y opcionalmente uno o más excipientes y conservantes adicionales, que incluyen, pero no se limitan a, excipientes tales como sales, polisorbato 80, hidróxido de sodio o ácido clorhídrico para ajustar el pH, y similares.

La formulación puede ser tal que se requiera una aplicación, administración o inyección diaria, semanal, mensual o de otra base periódica, dependiendo de la concentración y cantidad de un compuesto proporcionado, la tasa de biodegradación de un polímero usado en la formulación y otros factores conocidos por los expertos en la técnica.

En otra realización, el fármaco usado para prevenir, tratar, curar o revertir los trastornos relacionados con los riñones es la ciclodextrina o cualquiera de sus derivados o análogos.

En otra realización, la ciclodextrina se usa para prevenir, tratar o reducir la hiperglucemia (en ayunas o postprandial) en pacientes.

La presente divulgación también se refiere a métodos para reducir el contenido de colesterol en la membrana plasmática o celular en cualquier célula de cualquier órgano como una herramienta para prevenir, tratar, curar o revertir la obesidad, síndrome metabólico, prediabetes y los trastornos relacionados con la diabetes.

En una realización, el contenido de colesterol en la membrana plasmática o celular se reduce en cualquier célula del cuerpo como una herramienta para prevenir, tratar, curar o revertir la obesidad, síndrome metabólico, prediabetes y los trastornos renales relacionados con la diabetes. Un compuesto o composición de la invención puede emplear una ciclodextrina para el tratamiento, inhibición, prevención, reducción o reversión de la acumulación de colesterol celular o en la membrana plasmática de una célula de un órgano central o periférico afectado por la diabetes o que es responsable del desarrollo de la diabetes.

Como se describe, pero no se reivindica, el contenido de colesterol en la membrana plasmática o celular se reduce en las células beta pancreáticas para prevenir, tratar, curar o revertir la liberación de insulina estimulada por la glucosa, la inflamación local o sistémica y/o el ataque autoinmunitario a los islotes pancreáticos.

Como se describe, pero no se reivindica, la ciclodextrina o sus derivados se pueden usar para agotar al menos parcialmente las células del colesterol de la membrana plasmática solos o en combinación con otros fármacos actualmente usados o en estudio para la prevención y tratamiento de la diabetes, tales como agentes inmunosupresores, insulina, sulfonilureas, gliptinas, metformina, TZD (por sus siglas en inglés) o cualquier sensibilizador a la insulina, análogos de incretina e inhibidores de DPP4, agentes interferentes de VEGF y otros factores de crecimiento, medicamentos antiinflamatorios, derivados de la vitamina D, bloqueadores del sistema RAS y de la aldosterona.

La hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HPpCD) puede ser segura cuando se administra a ratones en una dosis que está en el rango de de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 mg/kg/día y se puede administrar en cantidades de hasta aproximadamente 4.000 mg/kg/tres a cinco veces a la semana (con un total de hasta aproximadamente 20.000 mg/kg/semana).

La hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HPpCD) puede ser segura cuando se administra por vía subcutánea en dosis tan altas como 4.000 mg/kg/tres veces a la semana.

La ciclodextrina, sus derivados o cualquier otro fármaco para reducir el colesterol en la membrana plasmática o celular se puede usar en combinación con un inhibidor de la biosíntesis del colesterol, como un inhibidor de la HMG-CoA (por sus siglas en inglés) reductasa. Los fármacos inhibidores de la HMG-CoA reductasa incluyen fármacos, tales como simvastatina, atorvastatina, lovastatina, rosuvastatina, mevastatina, pravastatina, fluvastatina, pitavastatina, rosuvastatina, cerivastatina, rivastatina, itavastatina, o ZD-4522.

La ciclodextrina, sus derivados o cualquier otro fármaco para reducir el colesterol en la membrana plasmática o celular se puede usar en combinación con un inhibidor de la absorción de colesterol, tal como ezetimiba, SCH-48461.

La ciclodextrina, sus derivados o cualquier otro fármaco para reducir el colesterol en la membrana plasmática o celular se puede usar en combinación con captadores de ácidos biliares y resinas (colestipol, colestilán, colextrano, colestiramina, colesevelam).

La ciclodextrina, sus derivados o cualquier otro fármaco para reducir el colesterol en la membrana plasmática o celular se puede usar en combinación con niacina y derivados de niacina, tales como niceritrol, nicofuranosa, niacina, alcohol nicotinílico, acipimox.

La ciclodextrina, sus derivados o cualquier otro fármaco para reducir el colesterol en la membrana plasmática o celular se puede usar en combinación con fibratos, tales como fenobrato, simfibrato, ronifibrato, ciprofibrato, clinofibrato, clofibrida, etofibrato, clofibrato, bezafibrato, clofibrato de aluminio, gemfibrozilo.

La ciclodextrina, sus derivados o cualquier otro fármaco para reducir el colesterol celular o en la membrana plasmática se puede usar en combinación con inhibidores de la proteína de transferencia de éster de colesterilo (CETP), tales como dalcetrapib, torcetrapib, anacetrapib.

La ciclodextrina, sus derivados o cualquier otro fármaco para reducir el colesterol en la membrana plasmática o celular se puede usar en combinación con inhibidores de la acetil-coenzima A acetiltransferasa (ACAT, por sus siglas en inglés), (tal como avasimibe) o inhibidores del transporte de triglicéridos microsomales.

Estos tratamientos combinados también pueden ser efectivos para el tratamiento o control de uno o más de obesidad, síndrome metabólico, prediabetes y trastornos relacionados con la diabetes seleccionados del grupo que consiste en aterosclerosis, resistencia a la insulina, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, dislipidemia, LDL alto, y HDL bajo.

Ejemplos

Los resultados experimentales mostraron que el aumento del colesterol en asociación con la regulación negativa del transportador de casetes de unión a ATP ABCA1 ocurre en podocitos humanos normales expuestos a los sueros de pacientes con diabetes tipo 1 y albuminuria (DKD+) en comparación con pacientes diabéticos con normoalbuminuria (DKD-) y duración similar de diabetes y perfil lipídico. La regulación glomerular negativa de ABCA1 se confirmó en biopsias de pacientes con DKD temprana (n = 70) en comparación con donadores vivos normales (n = 32).

La inducción del flujo de colesterol con ciclodextrina (CD) pero no la inhibición de la síntesis del colesterol con simvastatina previno la lesión de podocitos observadain vitrodespués de la exposición a sueros de pacientes. La administración subcutánea de CD a ratones diabéticos BTBR-ob/ob (por sus siglas en inglés) fue segura y redujo la albuminuria, la expansión mesangial, el peso del riñón, y el contenido de colesterol cortical. Esto fue seguido por una mejora de la insulina en ayunas, glucosa en sangre, peso corporal, tolerancia a la glucosain vivo,la mejora de la liberación de insulina estimulada por glucosa en islotes humanosin vitro.

Nuestros datos sugieren que el deterioro del transporte inverso del colesterol caracteriza la DKD clínica y experimental, e influye negativamente en la función de los podocitos. El tratamiento con CD es seguro y efectivo para preservar la función de los podocitosin vitroein vivo,para mejorar las células beta pancreáticas humanasex vivoy para mejorar el control metabólico de la diabetesin vivo.

Usamos un ensayo basado en células previamente establecido en el cual los podocitos humanos diferenciados se exponen a sueros de pacientes al 4 % por 24 horas para identificar nuevas rutas y objetivos en la DKD. Los podocitos expuestos a los sueros de pacientes con DKD mostraron un aumento de la acumulación de colesterol en asociación con la regulación negativa de la expresión de ABCA1 que es independiente del colesterol circulante. De hecho, se ha descrito una deposición excesiva de colesterol en glomérulos de modelos de roedores de T1D y T2D (por sus siglas en inglés) y puede contribuir al desarrollo y progresión de DKD.

Diseño y métodos de investigación

Sueros de pacientes y biopsias renales. Se obtuvieron muestras de suero de diez controles sanos y veinte pacientes con T1D del Estudio Finlandés de Nefropatía Diabética (FinnDiane). La T1D se definió como el inicio de la diabetes antes de los 40 años de edad y el tratamiento permanente con insulina iniciado dentro de 1 año del diagnóstico. La tasa de excreción urinaria de albúmina (AER, por sus siglas en inglés) se definió como AER normal (< 30mg/24 h), microalbuminuria (> 30 < 300 mg/24 h), y macroalbuminuria (> 300 mg/24 h). Los valores de glucosa en ayunas se midieron usando un dispositivo Hemocue (Hemocue, Finlandia). Los lípidos en suero se determinaron con un analizador Konelab (Thermo Scientific, Finlandia). Otros análisis bioquímicos se realizaron en un laboratorio hospitalario acreditado (HUSLAB, Helsinki). Para los perfiles de expresión de ARNm glomerular, se obtuvieron muestras de biopsia renal de 70 indios del sudoeste de América después de obtener el consentimiento informado. Se obtuvieron biopsias renales humanas de donadores vivos sanos (n = 32) antes del trasplante, nefropatía membranosa (n = 21) y glomeruloesclerosis focal y segmentaria (n = 18) del Banco Europeo de ADNc Renal.

Análisis de microarreglos y PCR. Para experimentosin vitro,se usó la tecnología Illumina para estudiar la expresión de ARNm en podocitos humanos expuestos a cuatro grupos independientes de sueros de 2-3 pacientes cada uno (control, DKD-, y DKD+). Los perfiles de expresión de ARNm glomerular se realizaron con arreglos de Affymetrix GeneChip como se describe.

Cultivo de podocitos humanos. Los podocitos humanos se cultivaron y diferenciaron como se describió anteriormente y se privó del suero en 0,2 % de FBS (por sus siglas en inglés) antes de los experimentos. Cuando se usaron sueros de pacientes, las células privadas se expusieron a sueros de pacientes al 4 % por 24 horas. Para los experimentos de tratamiento con insulina, se adicionaron 100 nmol de insulina al medio de cultivo por 15 minutos después de la exposición a los sueros de pacientes. Para los experimentos de tratamiento con ciclodextrina o estatinas, los podocitos humanos privados de suero se trataron previamente por 1 hora con 5 mM de metil-beta-ciclodextrina (CD, Sigma) o simvastatina (1 |jM, Sigma).

Tinción por inmunofluorescencia. Las células cultivadas en portaobjetos de cámara se fijaron con PFA (por sus siglas en inglés) al 4 % por 30 minutos a 37 °C y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1 %, seguido de la exposición a anticuerpos anti-fosfo-caveolina de ratón (pY14, BD Biosciences), anti-RhoA-activa (New East Biosciences), o anticuerpos anti-vimentina (Sigma). La detección de fluorescencia se realizó usando anticuerpos secundarios de Alexa Fluor (Invitrogen). Para la determinación del colesterol, se realizó la tinción de filipina (Sigma) como se describe. La actina F se visualizó por la faloidina rodamina (Invitrogen). Se estudiaron doscientas células consecutivas por condición. Los portaobjetos se prepararon con medios de montaje enriquecidos con DAPI (por sus siglas en inglés, Vectashield) y se analizaron por microscopía confocal.

Análisis de apoptosis. La apoptosis se valoró usando el kit de ensayo colorimétrico Caspasa-3/CPP32 (Biovision) de acuerdo con la descripción del fabricante. La actividad de la caspasa 3 se normalizó al número de células y se expresó como cambio de veces con respecto a los controles.

Determinación del contenido de colesterol. El colesterol esterificado se determinó como diferencia entre el colesterol total y el libre usando un ensayo enzimático, y se normalizó al contenido de proteína celular. El contenido celular de las gotas de lípidos se determinó usando Rojo aceite O (ORO, por sus siglas en inglés). Las células se fijaron y permeabilizaron como se describió anteriormente, se lavaron en PBS (por sus siglas en inglés) y en isopropanol al 60 %, seguido de incubación en ORO (ORO al 0,5 % en isopropanol, 1:3 diluido) por 15 min a temperatura ambiente, y se contratiñó con hematoxilina por 1 min. La fracción de células ORO positivas sobre doscientas células consecutivas se calculó por microscopía de campo brillante.

Inmunotransferencia tipo Western y luminex. La recolección de lisado celular y la inmunotransferencia tipo Western se realizó como se describió anteriormente. Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo conejo-policlonalanti-MYD88 (señalización celular), anticuerpo conejo-policlonal-antifosforilado (Y473) o anti-total-AKT (señalización celular), anticuerpo ratón-monoclonal-anti-RhoA (Santa Cruz), o anticuerpo ratón-monoclonal-anti-GAPDH (6C5, Calbiochem), (por sus siglas en inglés, respectivamente). Se usó anticuerpo Anti-ratón-IgG-HRP secundario o/y anticuerpo anti-conejo-IgG-HRP conjugado (Promega). La adquisición de imágenes se realizó usando el generador de imágenes quimioluminiscentes SRX-101A (Konica Minolta medical imaging, EE. UU.), y la densitometría de banda se analizó usando el software ImageJ (NIH, por sus siglas en inglés). Alternativamente, la AKT fosforilada/total se cuantificó usando la tecnología luminex como se informó anteriormente.

PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). El ARN de podocitos se extrajo usando el RNAeasy Mini Kit (Qiagen). La transcripción inversa se realizó usando el kit de transcriptasa inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems) de acuerdo con los protocolos del fabricante. La qRT-PCR se realizó en el sistema de p Cr en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems) usando PerfeCTa® SYBR® Green FastMix (Quanta Biosciences). La expresión génica relativa se determinó como 2A-ACt, siendo ACt la diferencia entre el valor umbral del ciclo (Ct) del gen objetivo y GAPDH. Para el análisis de expresión semicuantitativa, se realizó una PCR y se analizó por electroforesis en gel. Las intensidades del producto de amplificación se determinaron usando el software ImageJ (NIH), los valores se normalizaron y se expresaron como cambios de veces en la expresión génica sobre GAPDH. Se usaron los siguientes cebadores: hABCA1-F, AACAGTTTGTGGCCCTTTTG; hABCA1-R, AGTTCCAGGCTGGGGTACTT; hLDL-R-F, TCACTCCATCTCAAGCATCG; hLDL-R-R, GGTGGTCCT CT CACACCAGT; hHMG-CoA-R-F, GGCATTTGACAGCACTAGCA; hHMG-CoA-R-R, GCT GGAAT GACAGCTT CACA; hGAPDH-F, GT CAGT GGT GGACCT GACCT; hGAPDH-R, ensayo de cebador QuantiTect-Hs_ABCA1-SG (Qiagen); mAbca1-F, GGACATGCACAAGGTCCTGA; mAbca1-R, CAGAAAATCCTGGAGCTTCAAA.

Tratamiento y análisis de ratones BTBR-ob/ob. Los ratones BTBR-ob/ob se compraron a Jackson Laboratories. Los ratones se inyectaron por vía subcutánea con 4.000 mg/kg con CD o solución salina como se informó anteriormente, tres veces a la semana por 5 meses. Se recolectó orina y el peso corporal y la glucemia (OneTouch) se determinaron semanalmente. Se analizaron seis ratones por grupo. Todos los procedimientos con animales se aprobaron por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés). Después de la perfusión salina isotónica, se extirpó el riñón derecho para la determinación del contenido de colesterol y la extracción del ARNm. Un polo renal izquierdo se incrustó en OCT (por sus siglas en inglés), un segundo polo se fijó en PFA al 4 % y se incrustó en parafina para el análisis histológico. Las muestras de sangre se analizaron para CBC, panel de lípidos, AST, ALT, fosfatasa alcalina, GGT y BUN (por sus siglas en inglés, respectivamente) en las instalaciones de Comparative Laboratory Core Facility de la Universidad de Miami. La creatinina en suero se determinó por espectrometría de masas en tándem en el UAB-UCSD O'Brien Core Center, Universidad de Alabama en Birmingham, usando los métodos descritos anteriormente. El contenido de albúmina en orina se midió por ELISA (Bethyl Laboratories). La creatinina urinaria se valoró por un ensayo basado en el método de Jaffe (Stanbio). Los valores se expresan como jg de albúmina/mg de creatinina. La insulina en plasma en ayunas se determinó por ELISA (Mercodia, SW). Las pruebas de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT, por sus siglas en inglés) se realizaron 4 meses después del tratamiento; después de 5 horas de ayuno, la glucosa en sangre se registró al inicio y hasta 180 minutos después de un bolo de glucosa (1,5 g/kg). Para la sensibilidad a la insulina, la glucemia se monitoreó al inicio y hasta 150 minutos después de la inyección intraperitoneal de 4 mU/g de insulina de acción corta. Los islotes humanos de cuatro aislamientos diferentes se pretrataron con 0,5 mM de CD durante una hora y se perfundieron como se describió anteriormente para determinar la liberación de insulina en respuesta a la glucosa y KCI.

Histología, evaluación de la expansión mesangial y área de superficie glomerular. Se realizó tinción periódica de ácido Shiff (PAS, por sus siglas en inglés) de secciones de tejido de 4 |jm de espesor. Veinte glomérulos por sección se analizaron para la expansión mesangial por análisis semicuantitativo (escala 0-4) realizado por dos investigadores independientes ciegos. La superficie glomerular se delineó en cada glomérulo encontrado y el área superficial media se calculó como se describe.

Se realizó una inmunotransferencia tipo Western de SMPDL3b como se informó anteriormente. La sobreexpresión y el silenciamiento de líneas celulares de SMPDL3b también se informaron anteriormente y ahora se usan para la determinación del contenido de colesterol y la expresión de RhoA como se describió anteriormente.

Análisis estadístico. Los datos se muestran como medias y desviaciones estándar. Se realizaron de cuatro a 8 experimentos independientes para estudiosin vitro.Se usaron seis ratones por grupo para experimentosin vivo.El análisis estadístico se realizó con ANOVA de una vía. Cuando el ANOVA de una vía mostró significación estadística, los resultados se compararon por la prueba-t después de la corrección de Tukey para comparaciones múltiples. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos en p < 0,05.

Resultados

Mediciones de laboratorio clínico y población de pacientes. Se estudiaron 30 sujetos masculinos divididos en tres grupos en función de las características clínicas en el momento de la recolección de las muestras de suero. Los sujetos del estudio incluyeron:

1) 10 pacientes con T1D, normoalbuminuria y creatinina normal, definidos como pacientes sin enfermedad renal diabética (DKD-),

2) 10 pacientes con T1D, albuminuria y creatinina alterada, definidos como pacientes con enfermedad renal diabética (DKD+),

3) 10 controles sanos (C).

Los tres grupos no fueron significativamente diferentes para la edad, colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL y triglicéridos. Todos los pacientes estaban tomando agentes para bloquear el sistema renina-angiotensina-aldosterona. La duración de la diabetes, la glucosa plasmática en ayunas y la HbA1 C (por sus siglas en inglés) no fueron significativamente diferentes entre los pacientes con DKD+ y DKD-. La tasa media estimada de filtración glomerular (TFGe, por sus siglas en inglés) fue de 101 mL/min/1,73 m2 en D<k>D-, 97 mL/min/1,73 m2 en C, y 43 mL/min/1,73 m2 en el grupo de DKD+. Los sueros recolectados siete años antes de cinco de los pacientes con DKD (TFGe media 98 mL/ min/1,73 m2) se usaron en experimentos seleccionados.

Los podocitos expuestos a sueros DKD+ tienen una firma característica de ADNc. El ARN se extrajo de podocitos diferenciados cultivados en presencia de sueros de pacientes como informamos anteriormente. El análisis de microarreglos de ADNc reveló que las principales rutas alteradas en los podocitos tratados con DKD+ en comparación con los podocitos tratados con DKD- incluían genes involucrados en la remodelación de actina, señalización de insulina, señalización de citocinas (principalmente a través de TLR4, TNF^ e IL1 □, por sus siglas en inglés, respectivamente) y apoptosis. Validamos estos hallazgos a nivel de proteína demostrando por inmunotransferencia tipo Western que en los podocitos tratados con DKD+, la expresión de MyD88 aumentó, la capacidad de la insulina para fosforilar AKT se vio afectada, y la cantidad de caspasa 3 escindida aumentó.

Los podocitos humanos normales expuestos a sueros de pacientes con DKD exhiben aparición de protuberancias celulares. Los podocitos expuestos a los sueros de pacientes con DKD experimentaron una pronunciada remodelación del citoesqueleto de actina con desacoplamiento localizado del citoesqueleto de la membrana plasmática (aparición de protuberancias), que fue evidente tanto en la tinción de faloidina (F-actina) como en las imágenes de campo claro, y que fue muy diferente de lo que hemos descrito en glomeruloesclerosis focal y segmentaria. El análisis cuantitativo de la aparición de protuberancias celulares (porcentaje de células con protuberancias de un total de 200 células consecutivas analizadas) reveló este fenotipo en 80 % de las células expuestas a sueros DKD+, pero en solamente 20 % de las células expuestas a sueros DKD-, y 5 % en los controles. La aparición de protuberancias celulares se acompañó por la redistribución de RhoA activa en el sitio de las protuberancias celulares y por un aumento de RhoA total. La aparición de protuberancias celulares no fue una consecuencia de la reducción de la TFG en el grupo de DKD+, ya que los sueros históricos recolectados de cinco de los pacientes con T1D y TFG normal que finalmente desarrollaron DKD causaron el mismo grado de aparición de protuberancias celulares en podocitos cultivados que los sueros de los mismos pacientes recolectados en promedio 7 □ 2 años después, cuando los pacientes tenían una DKD establecida con macroalbuminuria y baja TFG.

Alteración del transporte inverso del colesterol en podocitos expuestos a sueros DKD+ y en glomérulos de pacientes con diabetes temprana. Como la inflamación, la resistencia a la insulina, la apoptosis y la remodelación del citoesqueleto están vinculadas por la acumulación intracelular de lípidos en la patogénesis de la esteatohepatitis no alcohólica (síndrome NASH), y se ha descrito acumulación de colesterol en la corteza de los riñones de ratones con DKD, se ha explorado si los podocitos cultivados en presencia de sueros de pacientes con DKD acumulan colesterol intracelular. Pudimos demostrar un mayor número de células positivas para ORO y filipina en las células tratadas con DKD- y DKD+, más aún en las células tratadas con DKD+. El análisis cuantitativo del colesterol total, libre y esterificado reveló un aumento significativo del colesterol esterificado en las células tratadas con DKD+ en comparación con las células tratadas con sueros de sujetos control. Este aumento probablemente se debió a un deterioro del flujo de colesterol, ya que la expresión del receptor de LDL y la HMG-CoA reductasa no se modificó, mientras que la expresión del ARNm de ABCA1 se redujo negativamente en los podocitos tratados con DKD+. Posteriormente estudiamos la expresión de ARNm de genes relacionados con lípidos en glomérulos de 70 pacientes adicionales con T2D y DKD temprana en comparación con 32 donadores vivos normales, y demostramos una regulación negativa significativa de ABCA1 en DKD. Curiosamente, la regulación negativa de la expresión del ARNm de ABCA1 fue una característica de DKD solamente, ya que ABCA1 no se reguló en otras enfermedades glomerulares proteinúricas, tales como la nefropatía membranosa (MN, por sus siglas en inglés, n = 21) y la glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GFS, por sus siglas en inglés, n = 18).

La ciclodextrina protege los podocitosin vitro.Como la exposición de podocitos en cultivo con sueros DKD+ causó la acumulación de colesterol total en asociación con la disminución de la expresión de ABCA1, un transportador responsable de la salida de colesterol, pasamos a probar la hipótesis de que la ciclodextrina protegería a los podocitos de la remodelación del citoesqueleto de actina y de la aparición de protuberancias celulares observada después de la exposición a los sueros de pacientes con DKD. Pudimos demostrar que la CD redujo el número de células positivas a filipina y preservó la localización de la caveolina fosforilada en los sitios de adhesión focal. El análisis cuantitativo del colesterol mostró que la CD previno la acumulación de colesterol total y esterificado en los podocitos tratados con DKD+. Asimismo, la prevención de la acumulación intracelular de colesterol con CD también previno la apoptosis inducida por DKD+, la resistencia a la insulina y la expresión de MyD88. El bloqueo de la HMG-CoA reductasa con simvastatina en podocitos no protegió de la remodelación del citoesqueleto de actina inducida por DKD+.

La administración subcutánea de CD protege a los ratones BTBR-ob/ob del desarrollo de DKD. Los ratones BTBR (negro y marrón, braquiúrico)-ob/ob (deficiencia de leptina) se han descrito como un modelo de ratón de DKD progresiva. Después de establecer una dosis y un modo de administración basado en estudios toxicológicos preliminares, tratamos ratones BTBR de 4 semanas de edad con administración subcutánea de tres inyecciones semanales de hidroxipropil-pciclodextrina (CD, 4.000 mg/kg de peso corporal) por cinco meses. Aunque no se observaron cambios en las tasas de excreción de albúmina hasta 2 meses después del inicio del tratamiento en ratones homocigotos, a los 3 meses se observó una regulación negativa significativa de las relaciones de albúmina/creatinina en las muestras de orina puntuales de la mañana (p < 0,001) en ratones tratados con CD tal compararlos con los ratones BTBR-ob/ob no tratados. Esta disminución persistió hasta el sacrificio (5 meses después del inicio del tratamiento. En el sacrificio, los ratones tratados con CD mostraron una reducción del peso del riñón. La CD no afectó la expresión del ARNm de ABCA1 en la corteza renal, pero resultó en una reducción significativa del colesterol total. El nitrógeno ureico en sangre (BUN) y la creatinina no se vieron afectados significativamente por el tratamiento con CD. Sin embargo, el tratamiento con CD resultó en una reducción de la expansión mesangial sin afectar el área de superficie glomerular.

Después de cuatro meses de tratamiento, también observamos una reducción del peso corporal, que se acompañó de una mejoría concomitante de la glucemia aleatoria. Además, los sueros recolectados en el sacrificio demostraron una mejora significativa de la insulina plasmática en ayunas y la glucosa plasmática en ayunas. La IPGTT realizada una semana antes del sacrificio mejoró en ratones homocigotos tratados con CD en comparación con los controles homocigotos. Como se observó una mejoría a pesar de una prueba similar de sensibilidad a la insulina, analizamos el efecto de la CD de dosis baja en la función de cuatro preparaciones diferentes de células de islotes humanos. Se observó una mejora significativa en la liberación de insulina estimulada por glucosa en los islotes humanos tratados con CD en comparación con los islotes humanos no tratados. Para determinar si el efecto benéfico de la CD sobre la función de las células de los islotes se asoció con la modulación de la expresión de ABCA1 en los islotes pancreáticos, realizamos una tinción de inmunofluorescencia usando un anticuerpo policlonal ABCA1 de conejo (regalo del Dr. A. Mendez) y determinamos la expresión de ABCA1 como intensidad media de fluorescencia por páncreas analizado. El páncreas de ratones BTBR-ob/ob homocigotos se caracterizó por una expresión de ABCA1 significativamente disminuida en comparación con los compañeros de camada heterocigotos (p < 0,001) y el tratamiento con CD aumentó significativamente la expresión de ABCA1 en el páncreas de BTBR-ob/ob homocigotos (p < 0,001) y en BTBR-ob/+ heterocigotos (p < 0,01). Como la anemia hemolítica y la toxicidad hepática se han descrito al usar otros derivados de la ciclodextrina en roedores y humanos, y debido a que administramos dosis altas de CD por un período de 5 meses, estudiamos hemoglobina, aspartato aminotransferasa (AST), alanina transaminasa (ALT) y gamma-glutamiltransferasa (GGT) en el sacrificio. No se observaron anomalías debidas a la administración crónica de CD que indicaran que el uso crónico de CD no se acompaña de efectos secundarios adversos (ver Tabla).

La eficacia y/o seguridad de la invención en cuestión se puede ilustrar con referencia a las figuras adjuntas a la presente, cuyas leyendas se proporcionan a continuación:

La figura 1 muestra una serie de paneles, (a) a (i) que ilustran los resultados de experimentos o estudios realizados que apoyan que la CD mejora la diabetesin vivo.Refiriéndose específicamente a cada uno de los paneles de la figura 1, (a, b) CD administrada a ratones BTBR-ob/ob homocigotos y heterocigotos por vía subcutánea tres veces a la semana (n = 6 por grupo) dio lugar a una reducción significativa del peso corporal (media ± DE) a partir de los cuatro meses después del inicio del tratamiento. *p < 0,05, **p < 0,01. (c) CD administrada a ratones BTBR-ob/ob homocigotos dio lugar a una reducción significativa de la glucemia aleatoria (media ± DE) a partir de los cuatro meses después del inicio del tratamiento. (d, e) Análisis de gráficos de barras (media ± DE) de las concentraciones plasmáticas de insulina y glucosa en ayunas. La insulina plasmática en ayunas (**p < 0,01; ***p < 0,001)(d) y la glucosa plasmática en ayunas (**p < 0,01) (e) aumentaron significativamente en ratones homocigotos en comparación con los controles heterocigotos. El aumento se previno por el tratamiento con CD (##p < 0,01). (f) IPGTT realizada a los 5 meses después del inicio del tratamiento con CD mostró una mejor tolerancia a la glucosa en ratones BTBR-ob/ob tratados con CD en comparación con ratones BTBR-ob/ob no tratados. (g) El tratamiento con CD no afectó la sensibilidad a una dosis única de insulina de acción corta (4 mU/g) en ratones BTBR-ob/ob. (h) Experimento representativo de perfusión y análisis de gráficos de barras del área bajo la curva (ABC) que demuestra el efecto de 0,5 mM de CD sobre la liberación de insulina estimulada por glucosa en islotes pancreáticos humanos de cuatro donadores independientes (**p < 0,01). (i) La tinción de inmunofluorescencia para ABCA1 revela un aumento de la expresión de ABCA1 en el páncreas de ratones BTBR-ob/ob tratados con CD en comparación con los compañeros de camada no tratados (Figuras 6i, izquierda). Análisis de gráfico de barras (Figura 6i, derecha) que muestra que el páncreas aislado de ratones homocigotos BTBR-ob/ob se caracteriza por una disminución significativa de la expresión de ABCA1 en comparación con los compañeros de camada heterocigotos (###p < 0,001). El tratamiento con CD aumentó significativamente la expresión de ABCA1 en el páncreas de ratones BTBR-ob/ob homocigotos (***p < 0,001) y BTBR ob/+ heterocigotos (**p < 0,01).

La figura 2 muestra los paneles (a) a (i) que sostienen que la CD protege de la enfermedad renal diabéticain vivo.(a) CD administrada a ratones BTBR-ob/ob homocigotos y heterocigotos por vía subcutánea tres veces a la semana (n = 6 por grupo) dio lugar a una reducción en las relaciones de albúmina/creatinina (media ± DE) a partir de los 3 meses después del inicio del tratamiento. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. (b) El peso del riñón (media ± DE) aumentó significativamente en ratones homocigotos (***p < 0,001), y tal aumento se previno por el tratamiento con CD (##p < 0,01). (c) Análisis de gráficos de barras (media ± DE) del efecto de la CD en la expresión del ARNm de ABCA1 en las cortezas renales de ratones BTBR-ob/ob homocigotos y heterocigotos. (d) Análisis de gráficos de barras (media ± DE) del efecto de la CD sobre el contenido de colesterol total en las cortezas renales de ratones homocigotos y heterocigotos BTBR-ob/ob. (e, f) Análisis de gráficos de barras (media ± DE) que muestra que las concentraciones en suero de BUN y creatinina permanecen sin cambios después del tratamiento con CD de los ratones. Las mediciones se realizaron en el suero obtenido de los ratones en el sacrificio. g) Tinción PAS representativa de secciones renales de ratones BTBR-ob/ob homocigotos y heterocigotos después de cinco meses de tratamiento con CD o vehículo. (h, i) Análisis de gráficos de barras (media ± DE) de los puntajes para la expansión mesangial (h) y del área de superficie glomerular (i) en secciones renales teñidas con PAS de ratones homocigotos y heterocigotos BTBR-ob/ob después de cinco meses de tratamiento con CD o vehículo, que se valoraron por dos investigadores independientes ciegos. *p < 0,05 al comparar DKD+ contra C. #p < 0,05 al comparar ratones tratados con CD contra no tratados.

La figura 3 es una tabla que ilustra la seguridad de la CD en ratones BTBR de 4 semanas de edad tratados después de la administración subcutánea de tres inyecciones semanales de hidroxipropil-p-ciclodextrina (CD, 4.000 mg/kg de peso corporal) por cinco meses. Como se ha demostrado que los derivados de CD más antiguos y tóxicos causan anemia y toxicidad hepática, probamos el efecto de la administración a largo plazo de altas dosis de hidroxi propil-p-ciclodextrina en ratones diabéticos y control.

En los paneles (a) a (i) de la figura 4, los resultados muestran que la acumulación de colesterol ocurre en podocitos expuestos a sueros DKD+ (a) tinción representativa de Rojo aceite O de podocitos expuestos a sueros DKD+ en comparación con sueros C y DKD-. Las flechas negras apuntan a manchas de gran acumulación de gotas de lípidos. b) Tinción representativa de filipina (naranja) y tinción de caveolina fosforilada (verde) de podocitos expuestos a sueros DKD+ en comparación con C y DKD-. c) Análisis cuantitativo de gráficos de barras (media ± DE) de células positivas para Rojo aceite O en podocitos expuestos a las reservas de sueros de 10 pacientes con DKD-, DKD+ o a grupos de sueros de controles, demostrando que la exposición a sueros DKD- y DKD+ causa una acumulación significativa de gotas de lípidos en podocitos humanos cultivados. *p < 0,05, ***p < 0,001. (d, e, f) Análisis de gráficos de barras (media ± DE) de colesterol total (Col. total), colesterol libre (Col. libre) y colesterol esterificado (Col. est.) determinado por la reacción enzimática en podocitos expuestos a grupos de sueros DKD+ en comparación con C y DKD-. *p < 0,05. (g, h, i) Análisis cuantitativo de PCR-RT (media ± DE) del receptor LDL, HMG-CoA reductasa y expresión de ABCA1 en podocitos expuestos a sueros de pacientes individuales. ***p < 0,001. (j) Análisis transcripcional de la expresión génica glomerular de genes relacionados con lípidos en 70 pacientes con DKD temprana, 21 pacientes con nefropatía membranosa (MN) y 18 pacientes con glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GFS) en comparación con 32 donadores vivos. Los números reflejan el cambio de veces en la enfermedad en comparación con los donadores vivos.

Los paneles (a) a (f) de la figura 5 muestran eso. La CD protege a los podocitos de los cambios observados después de la exposición a sueros DKD+. (a) Imágenes confocales representativas de faloidina (rojo) y caveolina fosforilada (verde) de podocitos humanos normales expuestos a sueros DKD+ en comparación con sueros C y DKD- en presencia (CD) o ausencia (control) de CD. Se usó DAPI (azul) para identificar núcleos (b, c) Análisis de gráficos de barras (media ± DE) del efecto de la CD sobre el colesterol total (B) y esterificado (C) en CD tratados (+) contra podocitos no tratados (-) expuestos a sueros DKD+ en comparación con sueros C y DKD-. *p < 0,05 al comparar DKD+ contra C. #p < 0,05 al comparar podocitos tratados con CD contra no tratados en el mismo grupo. (d, e, f) Análisis de gráfico de barras (media ± DE) de Caspasa 3 escindida, fosforilación de AKT estimulada por insulina y expresión de MyD88 en podocitos tratados con CD (+) contra no tratados (-) expuestos a sueros DKD+ en comparación con sueros C y DKD-. *p < 0,05 y **p < 0,01 al comparar DKD+ contra C. #p < 0,05 al comparar podocitos tratados con CD contra no tratados en el mismo grupo.

Los paneles (a) a (f) de la figura 6 ilustran que la expresión de enzimas relacionadas con esfingolípidos, es decir, SMPDL3b, aumenta en la diabetes en órganos objetivo como el riñón y causa daño dependiente de lípidos. (a) Análisis transcripcional de la expresión génica glomerular de SMPDL3b en 12 pacientes con DKD en comparación con 32 donadores vivos. Los números reflejan el cambio de veces en la enfermedad en comparación con los donadores vivos. *p < 0,05 (b) inmunotransferencia tipo Western representativa y análisis de gráfico de barras relativo para la expresión de la proteína SMPDL3b en podocitos humanos normales cultivados en presencia de sueros de controles sanos (C) o pacientes diabéticos con DKD de la misma edad y sexo (DKD+) o pacientes diabéticos sin DKD (pero con la misma duración de la diabetes y perfil de lípidos plasmáticos), p < 0,05. (c, d) Tinción representativa de Rojo aceite O y análisis de gráfico de barras de Rojo aceite O, colesterol, triglicéridos y fosfolípidos en podocitos humanos normales y en podocitos que sobreexpresan SMPDL3b (SMPDL3b OE, por sus siglas en inglés) cultivados en medios normales (control) o en medios suplementado con TNFa. *p < 0,05 al comparar los tratados con TNFα o SMPDL3b OE con los controles. ### p,0,001 al comparar la tinción de Rojo aceite O en SMPDL3b OE versus control de vector vacío (EV, por sus siglas en inglés) (□) Tinción representativa de faloidina que demuestra la remodelación del citoesqueleto de actina en podocitos humanos normales expuestos a sueros DKD+, un fenómeno que se previno en células donde se silenció SMPDL3b (SMPDL3b KD, por sus siglas en inglés). (f) Análisis representativo de inmunotransferencia tipo Western y gráfico de barras que demuestra que los podocitos humanos SMPDL3b KD son resistentes al aumento de la expresión de RhoA observado después de la exposición a sueros DKD+. *p < 0,05.

Conclusiones

La 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina (2-HPpCD), un fuerte aceptor del colesterol, es una manera efectiva de captar el colesterol y proteger cualquier célula afectada por la diabetes, prediabetes, síndrome metabólico y obesidad del daño dependiente del colesterolin vivoein vitro.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para reducir el contenido de colesterol celular o membrana plasmática de una célula para su uso en el tratamiento, inhibición, prevención o mejora de una condición, o un síntoma de dicha condición, dicha condición es nefropatía diabética/enfermedad renal diabética, dicha composición comprende al menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable y:

a) una cantidad efectiva de hidroxipropil-beta-ciclodextrina que reduce el contenido de colesterol celular al inhibir el flujo de entrada celular o aumenta el flujo de salida celular del colesterol, y

b) opcionalmente, un segundo principio farmacéutico activo que no es una ciclodextrina.

2. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la célula es un podocito.

3. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la hidroxipropil-beta-ciclodextrina se administra al paciente de aproximadamente 2-20 mg/kg/día a aproximadamente 4.000-20.000 mg/kg/semana.

4. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la hidroxipropil-beta-ciclodextrina se administra de al menos una vez a la semana a aproximadamente tres veces al día.

5. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la hidroxipropil-beta-ciclodextrina está formulada para su administración por una vía seleccionada entre intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (sistémica), subcutánea, transdérmica, oral, rectal, inhalada, tópica e intranasal.

6. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la vía de administración es subcutánea.

7. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende hidroxi propil-betaciclodextrina, un segundo principio farmacéutico activo que no es una ciclodextrina, y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el segundo principio activo se selecciona de un agente antidiabético, un inhibidor de la biosíntesis del colesterol, un inhibidor de la absorción de colesterol, un captador de ácidos biliares, niacina o un derivado de niacina, un fibrato, una proteína colesteriléster transferasa, y un inhibidor de la acetil-coenzima A acetiltransferasa, un agonista del receptor X hepático, un biológico, un agente inmunosupresor, un sensibilizador a la insulina, un análogo de la incretina, un inhibidor de DPP4, un agente interferente de VEG, un factor de crecimiento, un antiinflamatorio, un derivado de la vitamina D, un bloqueador del sistema RAS, y un bloqueador de aldosterona.

9. Un kit de partes, que comprende una composición de acuerdo con la reivindicación 1 en un contenedor, dicha composición comprende hidroxipropil-beta-ciclodextrina, para su uso en el tratamiento de una condición causada por, o un síntoma resultante de, la acumulación celular de colesterol, en donde dicha condición es nefropatía diabética/enfermedad renal diabética.

10. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el segundo principio activo se selecciona de niacina o un derivado de niacina, insulina, sulfonilurea, gliptina, metformina, tiazolidindiona, y picolinato de cromo.