KR20180035787A

KR20180035787A - 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20180035787A
Application number: KR1020187000766A
Authority: KR
Inventors: 베르나두스 니콜라스 마키엘스; 앨런 달링
Original assignee: 브이테스, 인코포레이티드
Priority date: 2015-06-10
Filing date: 2016-06-09
Publication date: 2018-04-06
Also published as: US20220288106A1; US11918601B2; US11517585B2; US11744848B2; EA201792487A1; US11406657B2; US20170296572A1; US20220280550A1; US11541074B2; US11510940B2; HK1247856A1; US11938144B2; AU2016276774A1; US20210015846A1; US20220280554A1; US20220280551A1; US10258641B2; US20160361345A1; BR112017026287A2; CL2017003152A1

Abstract

본 발명은 하나 이상의 히드록실 위치에서 히드록시프로필기에 의해 치환된 베타-시클로덱스트린 분자의 혼합물로서, 상기 혼합물은 약학적으로 활성인 성분으로 사용하기 위해 선택적으로, 치환되지않은 베타-시클로덱스트린 분자를 포함하는, 혼합물; 상기 혼합물의 제조 방법; 뇌척수강내 또는 뇌실내 투여에 적합한 약학적 조성물에 사용하기 위한 상기 혼합물의 검정 방법; 상기 혼합물을 포함하는 뇌척수강내 또는 뇌실내 투여에 적합한 약학적 조성물; 및 니만-픽 질병 C형의 치료를 위한 약학적 조성물의 사용 방법을 제공한다.

Description

히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 조성물 및 방법

1. 관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2016년 6월 3일 출원된 미국 가출원 제62/345,721호; 2016년 5월 3일 출원된 제62/331,385호; 2016년 3월 29일 출원된 제62/314,765호; 2016년 3월 15일 출원된 제62/308,736호; 2016년 1월 8일 출원된 제62/276,728호; 2015년 12월 4일 출원된 제62/263,599호; 2015년 11월 2일 출원된 제62/249,876호; 2015년 10월 23일 출원된 제62/245,974호; 2015년 7월 6일 출원된 제62/189,114호; 2015년 6월 12일 출원된 제62/175,075호; 및 2015년 6월 10일 출원된 제62/173,889호의 이익을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 참고문헌으로 통합된다.

2. 연방 후원 연구 또는 개발에 관한 진술

본 발명은 보건복지부(Agency of the Department of Health and Human Services)의 기관인 국립 보건원(National Institutes of Health)과의 협동 연구 개발 협약(Cooperative Research and Development Agreement)의 수행으로 창안되었다. 미국 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가지고 있다.

3. 배경기술

니만-픽(Niemann-Pick) 질병 C형(NPC)은 NPC1 또는 NPC2 유전자내 상염색체 열성 돌연변이에 의해 유발되는 리소좀성 지질축적 장애이다. 증상은 전형적으로 주산기에 시작하여 일생동안 진행된다. 이 장애에는 종종 소뇌운동실조증, 구음 장애, 발작, 수직 주시마비, 운동 장애, 연하 곤란, 정신병 증상 및 진행성 치매와 같은 신경 증상뿐만 아니라 간, 비장 또는 폐와 같은 다른 기관의 전신 증상이 포함된다. NPC는 GM2 및 GM3 강글리오사이드와 같은 다른 지질의 뇌 축적시에도 발생하지만 세포 콜레스테롤 수송 결함으로 기술되어 있다(Vanier, 2010, Orphanet Journal of Rare Diseases, vol. 5:16). 다른 임상 발표 및 질병 경과로 인해, NPC1 질병은 전형적으로 유아기 발병(2세 미만), 후기영아기 발병(2세 ~ 6세 미만), 청소년기 발병(6세 ~ 15세 미만) 및 청소년/성인 발병(> 15세)으로 카테고리화된다.

인간에서 NPC를 치료하려는 노력은 정화 메카니즘을 통해, 예를 들어, N-부틸데옥시노지리마이신(미글루스타트(miglustat), Zavesca　)에 의한 글리코스핑고지질 합성을 억제하는 것과 같은 기질감소요법, 또는 전체 지질 축적, 특히 콜레스테롤 및 글리코스핑고지질의 축적을 개선시키는 것에 초점을 맞추어왔다.

2-히드록시프로필-베타-시클로덱스트린은 세포의 원형질 막으로부터 콜레스테롤을 추출하는 관련 시클로덱스트린의 이전 보고(Rodal, S. K. et al., 1999, Molecular Biology of the Cell, vol. 10, pages 961-974)와 마찬가지로, NPC 세포내 과잉의 콜레스테롤 축적을 감소시키는 것으로 나타났다(Abi-Mosleh, L. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2009, vol. 106 (46), pages 19316-19321). 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린은 또한 NPC의 동물 모델에서 유익한 효과를 갖는 것으로 관찰되었다. 예를 들어, 2-히드록시프로필-베타-시클로덱스트린을 포함하는 조성물은 Npc1 녹아웃 마우스의 간 및 뇌에서 콜레스테롤의 결함있는 리소좀 수송을 역전시키는 것으로 보고되었으며, 처리하지 않은 것에 비해 상기 변이체의 수명을 연장시켰다(Liu, B. et al., 2009, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, vol. 106 (7), pages 2377-2382; Davidson et al., 2009, PLoS One 4:e6951).

여러가지 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 조성물은 미국, 브라질 및 일본의 인간 NPC 환자에게 특별 사용 면제하에 다양한 징후 및 증상의 개선에 대한 일화적인 보고와 함께 투여되었다. 그러나, 안전성 및 효능을 측정하기 위한 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 조성물의 블라인드 임상 시험은 완료되지 않았다(Ottinger, E.A. et al., 2014, Current Topics in Medicinal Chemistry, vol. 14 (3), pages 330-339). 일화적인 보고서에서 관찰자 편견이 있을 것을 고려하면, 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린이 임상적 이점을 제공한다는 것을 확인하기 위해 관리화 임상 연구가 필요하다.

NPC의 효과적인 치료는 유아기부터 시작된 만성 뇌척수강내 또는 뇌실내 투여를 필요로 할 것이며, 인간 환자에서 이전에 사용된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 비경구용 조성물은 유아 및 어린이의 뇌척수액에 직접 만성 투여하기에 부적절한 불순물: 내이신경 독성이 있다고 여겨지는 프로필렌 글리콜, 히드록시프로필 치환체를 갖지 않고, 침전물을 형성하고, 급성 독성을 갖는 것으로 알려진 베타-시클로덱스트린 분자(Muller and Brauns, 1985, International Journal of Pharmaceutics, vol. 26, pages 77-88); 및 매우 염증성인 세균성 내독소를 함유한다. 따라서, 고순도의 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 약학적 조성물이 필요하다.

또한, 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 기존의 모든 비경구용 조성물은 상이한 정도의 히드록시프로필 치환체를 갖는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 종의 복합 혼합물을 함유한다. 혼합물 내 상기 종의 비율은 여러 공급사에 따라 크게 다르며, 단일 공급사의 배치(batch)간에도 다양하다. 이러한 상이한 종들이 복합 혼합물의 약물학적 효과에 어떻게 기여하는지는 알려지지 않았다. 따라서, 상기 종의 보다 정확하게 정의되고 정확하게 제어된 혼합물 또는 지문(fingerprints)을 갖는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 약학적 조성물이 필요하다.

마지막으로, 불순물이 적으며, 특정하고 구조적으로-한정된 조성물을 갖는, 만성 뇌척수강내 또는 뇌실내 투여에 적합한 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 약학적 조성물을 GMP 조건하에 상업적 규모로 제조하는 방법이 필요하다.

4. 요약

본 발명자들은 기존의 비경구용 조성물인 Kleptose® HPB(Roquette)를 사용하여 2-히드록시프로필 베타-시클로덱스트린("HPBCD")을 뇌척수강내 투여함으로써 NPC 1형 질병 환자가 치료되는 I상 임상 시험의 초기 데이터를 분석하였다. NIH에 의해 진행된 상기 비-무작위, 오픈-라벨, 단일-기관 연구에서, Kleptose® HPB는 증가하는 투여량으로 환자의 약물-미투여(drug-naive) 코호트에 요추 주사를 통해 투여된다. 일부 분석에서, 본 발명자들은 개별 IND하에 다른 기관에서 뇌척수강내 Kleptose® HPB로 치료받는 3명의 환자의 데이터도 포함시켰다.

본 발명의 분석은 Kleptose® HPB의 뇌척수강내 투여가 NPC 1형 질병에서 치료적 이점을 제공한다는 것을 확인하였다. 표준 집계 결과 측정법, NPC 임상 중증도 척도를 사용하여, 치료되지 않은 질병의 자연 경과(natural history)가 연구된 환자의 코호트에서 0/13명에 비해 7/15명의 환자에서 질병이 안정적이거나 개선되는 것으로 관찰되었다. 데이터의 사후 분석을 통해 알 수 있는 새로운 복합물 종점(endpoint)을 사용하여, 11/15명의 연구대상 환자가 안정적이거나 질병이 개선된 것으로 나타난데 비해, 4/13명만 자연 경과 코호트에서 안정된 질병을 가짐을 발견하였다.

그러나, 보다 상세한 분석에 따르면, HPBCD의 뇌척수강내 투여가 NPC 1형 질병의 특정 징후 및 증상을 개선시키지만, 다른 증상의 진행을 둔화시키고 역설적으로 다른 증상의 진행을 촉진시키는 것으로 나타났다. 특히, Kleptose® HPB를 뇌척수강내 투여받는 환자에서 청력 손실이 가속화된 것으로 보인다. Kleptose® HPB의 대표적인 배치에 대한 본 발명의 분석은 이 비경구용 제품이 상이한 치환도를 갖는 베타-시클로덱스트린 분자의 복합 혼합물을 포함함을 나타냈으며, 관찰된 개선, 진행의 둔화 및 다양한 임상 영역의 진행 가속화에 상기 종들 중 어느 것이 기여하는지는 알려지지 않았다.

HPBCD를 뇌척수액에 장시간동안 및 더 빈번하게 투여하면서 직접 투여될 임상 시험을 준비하기 위해, 본 발명자들은 추정된 내이신경 독소인 프로필렌 글리콜; 히드록시프로필 치환체를 갖지 않고 침전물을 형성하는 것으로 알려져 있는 베타-시클로덱스트린 분자; 및 매우 염증성인 세균성 내독소의 수준을 감소시키는 방법을 개발하였다. 이 방법은 특정 불순물을 감소시키는데 성공적이었지만, 알루미나를 이용한 흡수 크로마토그래피가 단독으로 또는 용매 침전과 함께 사용하여 조성의 지문 또한 변경하여, 단일 히드록시프로필 치환을 갖는 베타-시클로덱스트린 분자(DS-1)의 양을 실질적으로 감소시키고, 2개의 히드록시프로필기를 갖는 베타-시클로덱스트린 분자(DS-2)의 양을 감소시켰음을 관찰하였다. 낮은 치환도(의도한 바와 같이 DS-0; 의도하지 않은 DS-1 및 DS-2)를 갖는 분자의 보급 감소는 혼합물의 평균 치환도(DS_a)를 증가시켰다.

Kleptose® HPB로부터의 지문의 변화에도 불구하고, 놀랍게도, 체외 유전자 발현 프로파일링 실험에 의해 평가된 바와 같이, 콜레스테롤 대사 및 수송에 관여하는 것으로 알려진 유전자의 발현에는 변화가 없었다. 이 발견은 장시간동안 NPC 질병을 갖는 환자의 CSF에 뇌척수강내 또는 뇌실내 경로에 의해, 선택적으로 보다 빈번하게 투여하면서, 보다 고도로 정제되고 조성이 다른 HPBCD 조성물을 투여할 수 있게 하여, 치료 효과 및 안전성을 향상시킬 것이다.

따라서, 제1 양태에서, 하나 이상의 히드록실 위치에서 히드록시프로필기에 의해 치환된 베타-시클로덱스트린 분자의 혼합물, 치환되지 않은 시클로덱스트린 분자를 포함하는 혼합물이 선택적으로 제공된다. 혼합물은 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린("DS-0") 및 1개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-1")을 합하여 1 % 미만; 3개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-3"), 4개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-4"), 5개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-5"), 및 6개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린('DS-6")을 합하여 85 %이상; 및 9개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-9") 및 10개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-10")을 합하여 1% 미만을 포함하고, 각각은 전자분무 MS 스펙트럼의 피크 높이에 의해 측정되었다.

특정 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 0.1% 미만은 집합적으로 DS-0 및 DS-1이다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 0.01% 미만은 집합적으로 DS-0 및 DS-1이다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 87% 이상이 집합적으로 DS-3, DS-4, DS-5 및 DS-6이다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 90% 이상이 집합적으로 DS-3, DS-4, DS-5 및 DS-6이다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 0.1% 미만은 집합적으로 DS-9 및 DS-10이다. 특정 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 0.01% 미만은 집합적으로 DS-9 및 DS-10이다.

또 다른 양태에서, 혼합물은 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린("DS-0") 및 1개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-1")을 합하여 1% 미만, 및 9개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-9") 및 10개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-10")을 합하여 1 % 미만을 포함하고, 상기 각각은 전자분무 MS 스펙트럼의 피크 높이에 의해 측정된 바와 같으며, 상기 혼합물의 평균 몰 치환도("MS")는 0.50 내지 0.80의 범위이다.

특정 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 0.1% 미만은 집합적으로 DS-0 및 DS-1이다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 0.01% 미만은 집합적으로 DS-0 및 DS-1이다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 0.1% 미만은 집합적으로 DS-9 및 DS-10이다. 특정 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 0.01% 미만은 집합적으로 DS-9 및 DS-10이다. 다양한 구현예에서, MS는 0.60 내지 0.70의 범위에 있다. 이들 실시예들 중 일부에서, MS는 0.64 내지 0.68의 범위에 있다. 특정 구현예에서, MS는 약 0.66-0.67이다.

또 다른 양태에서, 본원에 기술된 베타-시클로덱스트린 혼합물 및 약학적으로 허용가능한 희석제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.

일부 구현예에서, 조성물은 USP 히드록시프로필 베타덱스(Betadex) 논문에 개시된 HPLC 방법으로 측정한 바와 같이, 0.5% 이하의 프로필렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 개시된 HPLC 방법으로 측정한 바와 같이, 0.01% 이하의 프로필렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 베타-시클로덱스트린 혼합물 1 g 당 내독소(endotoxin) 5 EU 이하(no more than, "NMT")를 포함한다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 베타-시클로덱스트린 혼합물 1 g 당 내독소 1.5 EU NMT를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 따라 측정된 1 ppm 이하의 프로필렌 옥사이드를 포함한다.

전형적인 구현예에서, 약학적 조성물은 뇌척수강내 또는 뇌실내 투여를 위해 적합하다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 약 300 내지 약 450 mOsm/kg의 삼투압 농도를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 10 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 베타-시클로덱스트린 혼합물을 포함한다.

또 다른 양태에서, 약학적 조성물은 하나 이상의 히드록실 위치에서 히드록시프로필기에 의해 치환된 베타-시클로덱스트린 분자의 혼합물을 포함하고, 상기 혼합물은 선택적으로, 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린 분자 및 뇌척수강내, 뇌실내, 또는 정맥내 투여를 위해 약학적으로 허용가능한 희석제를 포함한다. 상기 조성물은, 베타-시클로덱스트린 혼합물 1g 당 내독소 5 EU 이하("NMT"), USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 개시된 HPLC 방법으로 측정한 바와 같이 프로필렌 글리콜 0.5% 이하, 및 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 따라 측정된 1 ppm 이하의 프로필렌 옥사이드를 포함한다.

일부 구현예에서, 조성물은 베타-시클로덱스트린 혼합물 1 g 당 내독소 1.5 EU NMT를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 개시된 HPLC 방법으로 측정한 바와 같이, 0.01% 이하의 프로필렌 글리콜을 포함한다. 특정 구현예에서, 혼합물은 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린("DS-0"), 1개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-1") 및 2개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-2")을 합하여 3% 미만; 5개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-5"), 6개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린('DS-6") 및 7개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린('DS-7")을 합하여 65% 이상; 및 9개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-9") 및 10개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-10")을 합하여 3% 미만; 포함하며, 이는 전자분무 MS 스펙트럼의 피크 높이에 의해 측정되었다.

또 다른 양태에서, 니만-픽 질병 C형을 치료하는 방법이 제공되며, 이 방법은 치료적 유효량의 약학적 조성물을 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.

전형적인 구현예에서, 조성물은 뇌척수강내 또는 뇌실내 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 약 300 mg 내지 약 2000 mg의 베타-시클로덱스트린 혼합물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 매달 1회, 2개월마다 1회, 또는 3개월마다 1회 투여된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 약 900 mg 내지 약 1800 mg의 베타-시클로덱스트린 혼합물을 2주마다 1회 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 약 900 mg의 베타-시클로덱스트린 혼합물을 2주마다 1회 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 타우(tau) 단백질, 아밀로이드 펩타이드, 신경미세섬유경 단백질(neurofilament light protein; NFL), 신경 교원섬유 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP), 스테롤, 옥시스테롤, 키토트리오시다제 활성, 칼빈딘, 리소좀-관련 막 단백질 1(LAMP-1), GM2 또는 GM3 강글리오사이드, 스핑고신 및 스핑고신-1-포스페이트(S1P) 중 하나 이상의 뇌척수액내 수준을 조절하기에 충분한 양의 베타-시클로덱스트린 혼합물을 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 7-케토콜레스테롤, 7β-히드록시콜레스테롤, 24S-히드록시콜레스테롤, 25-히드록시콜레스테롤, 27-히드록시콜레스테롤, 및 콜레스탄-3β,5α,6β-트리올 중 하나 이상의 혈장내 수준을 조절하기에 충분한 양의 베타-시클로덱스트린 혼합물을 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 방법은 3β-설폭시-7β-N-아세틸글루코사미닐-5-콜렌-24-오익산(SNAG-Δ⁵-CA), 글리신-접합된 3β-설폭시-7β-N-아세틸글루코사미닐-5-콜렌-24-오익산(SNAG-Δ⁵-CG) 및 타우린-접합된 3β-설폭시-7β-N-아세틸글루코사미닐-5-콜렌-24-오익산(SNAG-Δ⁵-CT) 중 하나 이상의 소변내 수준을 조절하기에 충분한 양의 베타-시클로덱스트린 혼합물을 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 방법은 보행, 소근육 운동, 인지, 언어능력, 연하, 안구운동, 기억력, 청력 및 발작으로부터 선택된 NPC 중증도 척도의 하나 이상의 영역 점수를 유지 또는 감소시키기에 충분한 양으로 베타-시클로덱스트린 혼합물을 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물을 제조하는 방법이 제시되며, 이는 Kleptose® HBP를 알루미나상의 흡수 크로마토그래피로 처리하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 알루미나상의 흡착 크로마토그래피 및 용매 침전의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 용매 침전은 침전제로서 아세톤과 함께 물을 사용하여 수행된다. 다른 구현예에서, 용매 침전은 침전제로서 아세톤과 함께 메탄올을 사용하여 수행된다.

또 다른 양태에서, 베타-시클로덱스트린 분자의 혼합물은 하나 이상의 히드록실 위치에서 히드록시프로필기에 의해 치환되며, 선택적으로, 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린 분자를 포함하는 상기 혼합물은 Kleptose® HBP를 알루미나 상의 흡수 크로마토그래피 및 용매 침전의 조합으로 처리함으로써 제조된다.

또 다른 양태에서, 하나 이상의 히드록실 위치에서 히드록시프로필기에 의해 치환된 베타-시클로덱스트린 분자의 혼합물을 검정하는 방법으로서, 뇌척수강내 또는 뇌실내 투여를 위한 약학적 조성물에 사용하기 위한 것으로, 상기 혼합물이 선택적으로, 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린 분자를 포함하는 방법이 제공된다. 이 방법은 (a) 혼합물의 전자분무 MS 분석을 수행하는 단계; (b) 피크 높이를 측정하는 단계; 및 (c) 피크 높이에 기초하여 혼합물 전체에서 각 베타-시클로덱스트린 종의 백분율을 계산하는 단계를 포함한다. 혼합물이 집합적으로 1% 미만의 DS-0 및 DS-1; 집합적으로 85% 이상의 DS-3, DS-4, DS-5 및 DS-6; 및 집합적으로 1% 미만의 DS-9 및 DS-10을 포함하는 경우, 혼합물은 사용하기에 적합한 것이다 - 즉, 사용하기에 충분한 품질을 갖는다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린 분자 및 하나 이상의 히드록실 위치에서 히드록시프로필기에 의해 치환된 베타-시클로덱스트린 분자의 혼합물을 약학적 활성 성분으로서 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 상기 혼합물은 약 3 내지 약 7의 베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필기의 평균 수("DSa")를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은 0.5% 이하의 프로필렌 글리콜, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 1 g 당 1.5 EU 이하("NMT")의 내독소를 포함하며, 혼합물의 1% 이하가 히드록시프로필기에 의해 치환되지 않는다("DS-0"). 다양한 바람직한 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물은 약 0.58 내지 약 0.68 범위의 평균 몰 치환도(MS)(DSa는 약 4.06 내지 4.76의 범위)를 갖는다. 이들 바람직한 구현예 중 일부에서, 혼합물은 0.58 내지 0.68의 MS(4.06 내지 4.76의 DSa)를 가지고, 일부 구현예에서 약 0.63의 MS를 갖는다. 다양한 바람직한 구현예에서, 혼합물은 약 0.65 내지 약 0.68의 평균 몰 치환도(MS)(DSa 4.6 내지 4.7)를 가지며, 일부 구현예에서는 약 0.67의 평균 몰 치환도를 갖는다.

일부 구현예에서, 혼합물 중의 베타-시클로덱스트린은 하기 구조식의 글루코스 단위로 구성된다:

여기에서, R¹, R² 및 R³은 각각의 경우 독립적으로 -H 또는 -HP이고, HP는 하나 이상의 히드록시프로필기를 포함한다.

일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 당 HP의 평균 발생 횟수는 약 3 내지 약 7이다.

일부 구현예에서, 결합된 R¹ 및 R²의 총 발생의 적어도 15%는 HP이다.

일부 구현예에서, R³의 발생의 적어도 30%는 HP이다.

일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 적어도 70%가 집합적으로 약 4 내지 약 6의 베타-시클로덱스트린 당 HP의 평균 발생 횟수를 갖는다.

일부 구현예에서, DSa는 약 3 내지 약 4이다. 일부 구현예에서, DSa는 3.3 ± 0.3이다. 일부 구현예에서, DSa는 3.7 ± 0.3이다.

일부 구현예에서, DSa는 약 3.5 내지 약 4.5이다. 일부 구현예에서, DSa는 3.8 ± 0.3이다. 일부 구현예에서, DSa는 4.2 ± 0.3이다.

일부 구현예에서, DSa는 약 4 내지 약 5이다. 일부 구현예에서, DSa는 4.3 ± 0.3이다. 일부 구현예에서, DSa는 4.7 ± 0.3이다.

일부 구현예에서, DSa는 약 4.5 내지 약 5.5이다. 일부 구현예에서, DSa는 4.8 ± 0.3이다. 일부 구현예에서, DSa는 5.2 ± 0.3이다.

일부 구현예에서, DSa는 약 5 내지 약 6이다. 일부 구현예에서, DSa는 5.3 ± 0.3이다. 일부 구현예에서, DSa는 5.7 ± 0.3이다.

일부 구현예에서, DSa는 약 5.5 내지 약 6.5이다. 일부 구현예에서, DSa는 5.8 ± 0.3이다. 일부 구현예에서, DSa는 6.2 ± 0.3이다.

일부 구현예에서, DSa는 약 6 내지 약 7이다. 일부 구현예에서, DSa는 6.3 ± 0.3이다. 일부 구현예에서, DSa는 6.7 ± 0.3이다.

일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 적어도 70%가 DSa ± 1 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 적어도 90%가 DSa ± 1 이내의 DS를 갖는다.

일부 구현예에서, 히드록시프로필기는 구조식 [CH₂CH(CH₃)O]_nH의 히드록시프로필 사슬로서 베타-시클로덱스트린의 히드록실 위치에서 치환되고, 상기 식에서 n≥1이고, 베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필 사슬의 평균 수는 약 3 내지 7이다. 일부 구현예에서, 히드록시프로필 사슬의 적어도 70%는 n=1을 갖는다. 일부 구현예에서, 히드록시프로필 사슬의 30% 미만은 n=2이다. 일부 구현예에서, 히드록시프로필 사슬의 10% 미만은 n>2이다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필 사슬의 평균 수는 약 4 내지 약 6이다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 적어도 70%는 집합적으로 약 4 내지 약 6의 베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필 사슬의 평균 수를 갖는다.

일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 약학적 조성물은 약학적 활성 성분의 1 g 당 약 10 국제단위(International Units, IU) 미만, 예컨대 약 6 IU 미만, 약 3 IU 미만, 또는 약 1.5 IU 미만의 내독소를 함유한다. 내독소의 수준은 투구게 변형세포 용해물 테스트(Limulus amoebocyte lysate test)에 의해 측정된다.

일부 구현예에서, 약학적 활성 성분은 약 2 중량% 미만, 예컨대 약 1 중량% 미만의 치환되지않은 베타-시클로덱스트린을 함유한다.

일부 구현예에서, 약학적 활성 성분은 약 0.5 중량% 미만, 예컨대 약 0.2 중량% 미만의 프로필렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜 올리고머를 함유한다.

일부 구현예에서, 약학적 활성 성분은 약 1 ppm 미만의 프로필렌 옥사이드를 함유한다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 약학적 활성 성분을 포함하며, 1 mL의 증류수 내 약학적 활성 성분의 20%(w/v) 용액은 약 24시간 후에 UV 분광법으로 측정했을 때 실온에서 에스테르화되지 않은 콜레스테롤 적어도 2 mg, 예컨대 적어도 3 mg, 적어도 4 mg, 또는 적어도 5 mg을 가용화한다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 Trappsol® Cyclo보다 낮은 내이신경 독성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 내이신경 독성은 Corti 1 세포의 하우스 이어 인스티튜트 기관(House Ear Institute-organ of corti 1, HEI-OC1)에서의 독성에 의해 생체외에서 측정된다. 일부 양태에서, 내이신경 독성은 마우스, 래트, 고양이, 개 또는 인간과 같은 대상에서 뇌간청각 유발검사(BAER)에 의해 생체내에서 측정된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 뇌척수강내 또는 뇌실내 투여에 적합하다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 약 300 내지 약 450 mOsm/kg의 삼투압을 갖는다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 약학적 활성 성분을 포함한다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물의 유일한 약학적 활성 성분은 Kleptose® HBP, Kleptose® HP, Trappsol® Cyclo, 또는 Cavasol® W7 HP Pharma를 정제함으로써 수득된다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물의 유일한 약학적 활성 성분은 Kleptose® HBP를 정제함으로써 수득된다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물의 유일한 약학적 활성 성분은 Trappsol®Cyclo를 정제함으로써 수득된다. 일부 구현예에서, 정제는 친수성 또는 소수성 상호작용 또는 친화도 정제를 포함하며, HPLC 또는 겔 크로마토그래피에 의한 정제와 같은 크로마토그래피 방법을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 치료를 필요로하는 대상에게, 본원에 기술된 치료적으로 유효량의 약학적 조성물을 예를 들어 뇌척수강내 또는 뇌실내 투여에 의해 투여하는 단계를 포함하는 니만-픽 질병 C형을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 약 300 내지 약 3000 mg의 약학적 활성 성분을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 매주, 2주마다, 3주마다, 매월마다, 2개월마다 또는 3개월마다 발생한다. 예를 들어, 상기 방법은 2주마다 약 600 내지 약 1800 mg의 약학적 활성 성분을 대상에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 타우 단백질, 아밀로이드 펩타이드, 신경미세섬유경 단백질(NFL), 신경 교원섬유 산성 단백질(GFAP), 스테롤, 옥시스테롤, 키토트리오시다제 활성, 칼빈딘, 리소좀-관련 막 단백질 1(LAMP-1), GM2 또는 GM3 강글리오사이드, 스핑고신 및 스핑고신-1-포스페이트(S1P) 중 하나 이상의 뇌척수액내 수준을 조절하기에 충분한 양의 약학적 활성 성분을 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 7-케토콜레스테롤, 7-히드록시콜레스테롤, 24S-히드록시콜레스테롤, 25-히드록시콜레스테롤, 27-히드록시콜레스테롤, 콜레스테인-3β,5α,6β-트리올 중 하나 이상의 혈장내 수준을 조절하기에 충분한 양의 약학적 활성 성분을 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 방법은 3 -설폭시-7 -N-아세틸글루코사미닐-5-콜렌-24-오익산(SNAG-Δ⁵-CA), 글리신-접합된 3 -설폭시-7 -N-아세틸글루코사미닐-5-콜렌-24-오익산(SNAG-Δ⁵-CG) 및 타우린-접합된 3 -설폭시-7 -N-아세틸글루코사미닐-5-콜렌-24-오익산(SNAG-Δ⁵-CT) 중 하나 이상의 소변내 수준을 조절하기에 충분한 양의 약학적 활성 성분을 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 방법은 보행, 소근육 운동, 인지, 언어능력, 연하, 안구운동, 기억력, 청력 및 발작으로부터 선택된 NPC 중증도 척도의 하나 이상의 영역 점수를 유지 또는 감소시키는 단계를 추가로 포함한다.

도 1은 Yanjanin et al., "Linear Clinical Progression, Independent of Age of Onset, in Niemann-Pick Disease, Type C," Am. J. Med. Genet. Part　B 153B:132-140 (2010)에 따른 표준 NPC 임상 중증도 척도에 기여하는 임상 영역을 도시한다.
도 2는 실시예 1에 기술된 I상 임상 시험의 초기 분석 결과를 요약한다.
도 3은 실시예 1에 기술된 I상 임상 시험의 추가 분석을 요약한다.
도 4는 기준선으로부터의 변화를 사용하여 I상 임상 시험 데이터의 분석을 요약한다.
도 5는 전체 NPC 점수를 사용하여 I상 임상 시험의 초기 결과를 요약한다.
도 6은 청력 영향이 제거된 I상 임상 시험의 초기 결과를 요약한다.
도 7은 새로운 "NPC 복합물" 종점(Endpoint) 또는 중증도 점수에 기여하는 임상 영역을 요약한다.
도 8은 새로운 NPC 복합물 종점을 사용한 I상 임상 시험의 초기 결과를 요약한다.
도 9는 CD-스크린 방법을 사용한 대표적인 HPLC 크로마토그램을 도시한다.
도 10은 CD 스크린 방법에서 상이한 용매를 사용하는 비교 HPLC 크로마토그램을 도시한다. 상부 트레이스: 메탄올; 하부 트레이스: 아세토니트릴.
도 11은 CD-스크린 컬럼을 사용하여 상이한 치환도(DS)를 갖는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 질량분석 추출형 이온 크로마토그램(mass spectrometry extracted ion chromatogram)을 도시한다.
도 12는 LiChrosphere C18 역상 컬럼을 사용한 대표적인 HPLC 크로마토그램을 도시한다.
도 13은 LiChrosphere C18 역상 크로마토그래피 방법에서 상이한 용매를 사용하는 비교 HPLC 크로마토그램을 도시한다. 상부 트레이스: 메탄올; 하부 트레이스: 아세토니트릴.
도 14는 LiChrosphere C18 컬럼을 사용하여 상이한 치환도(DS)를 갖는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 질량분석 추출형 이온 크로마토그램을 도시한다.
도 15는 HILIC 컬럼에서 상이한 용매를 사용하는 비교 HPLC 크로마토그램을 도시한다. 상부 트레이스: 물 구배 중 79% 아세토니트릴; 하부 트레이스: 75% 아세토니트릴.
도 16은 HILIC 컬럼을 사용하여 상이한 치환도(DS)를 갖는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 질량분석 추출형 이온 크로마토그램을 도시한다.
도 17은 실리카겔 컬럼을 사용한 대표적인 HPLC 크로마토그램을 도시한다.
도 18은 실리카 겔 컬럼을 사용하여 상이한 치환도(DS)를 갖는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 질량분석 추출형 이온 크로마토그램을 도시한다.
도 19는 상업용 Kleptose® HPB　(Roquette, 배치(batch) E0223)(상부 트레이스(trace))에 대하여, 및 D-리모넨(하부 트레이스)과의 복합체에 의한 정제 후, 오버레이 HPLC 트레이스를 나타낸다. X-축은 분으로 보유 시간을 표시한다
도 20은 상업용 Kleptose® HPB(Roquette, 배치 E0223)와 비교하여 물/아세톤 혼합물(상부 트레이스)을 사용하여 용매 침전 후에 수득된 샘플에 대한 HPLC 트레이스를 도시한다.
도 21은 상업용 Kleptose® HPB　(Roquette, 배치 E0223)(상부 트레이스)에 대하여, 및 수지 및 숯 처리(하부 트레이스)에 의한 정제 후, 오버레이 HPLC 트레이스를 도시한다. X-축은 분으로 보유 시간을 표시한다
도 22는 상업용 Kleptose® HPB　(Roquette, 배치 E0223)(상부 트레이스)에 대하여, 및 알루미나 정화에 의한 정제 후, 오버레이 HPLC 트레이스를 도시한다. 하부 트레이스는 알루미나 정화 후 정제된 여과액에 대한 데이터를 나타내며; 중간 트레이스는 알루미나 정화 후 정제된 1차 헹굼에 대한 데이터를 나타낸다. X-축은 분으로 보유 시간을 표시한다
도 23은 Kleptose® HPB　의 알루미나 크로마토그래피로부터 얻은 분획 A 내지 H(E 제외) 각각에 대한 비교 HPLC 트레이스를 나타낸다. 분획 A 내지 H는 각각 샘플 5.4.3.2.2A 내지 5.4.3.2.2H에 대응한다(E 제외). X-축은 분으로 보유 시간을 표시한다.
도 24는 Kleptose® HPB　의 알루미나 크로마토그래피에 의한 정제로부터 수집된 분획 A 내지 H 각각의 불순물 함량의 백분율을 나타낸 그래프를 도시한다. x-축 상의 A 내지 H는 각각 샘플 5.4.3.2.2A 내지 5.4.3.2.2H에 해당한다. Y-축은 불순물 함유율을 나타낸다. PG% = 프로필렌 글리콜 백분율(대각선으로 정렬된 막대); 총 기타 불순물% = 총 시클로덱스트린-관련 불순물의 백분율(검은색 막대); BCD% = 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린의 백분율(중공 막대); HPBCD DS-1% = 단일치환된 베타-시클로덱스트린의 백분율(역 대각선 막대).
도 25는 프로필렌 글리콜(측정되는 불순물) 및 에틸렌 글리콜(내부 표준)을 확인하는 Kleptose® HPB　의 예시적인 기체 크로마토그램을 도시한다. X-축은 분으로 시간을 표시하며; y-축은 응답을 표시한다.
도 26은 프로필렌 글리콜 유도체의 예시적인 기체 크로마토그램을 도시한다. X-축은 분으로 시간을 표시하며; y-축은 밀리볼트로 응답을 표시한다.
도 27은 가스 크로마토그래피 샘플에서 프로필렌 글리콜 농도를 측정하기 위한 보정 그래프를 도시한다. PG/EG = 지시된 대로 에틸렌 글리콜에 대한 프로필렌 글리콜의 비율.
도 28은 유럽 약전(European Pharmacopeial) 방법을 사용하여 Kleptose HPB®(4.1의 DS_a)의 예시적인 ¹H NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 29는 제1 실험실로부터의 전자분무 MS 스펙트럼 데이터를 나타내며, 도 29a는 Kleptose® HPB 스펙트럼을 도시하고, 도 29b는 Trappsol® Cyclo™의 스펙트럼을 도시한다. 각각의 피크에서 히드록시프로필 모이어티의 수를 확인하기 위해 스펙트럼에 수를 더했다.
도 30은 제2 실험실로부터의 전자분무 MS 데이터를 나타내며, 도 30a는 Kleptose® HPB의 스펙트럼을 도시하고, 도 30b는 Trappsol® Cyclo™의 스펙트럼을 도시한다.
도 31은 2개의 다른 실험실에서 수행한 Kleptose® HPB의 3개의 다른 롯트로부터의 전자분무 MS 데이터를 비교한다.
도 32는 도 31에 도시된 Kleptose 데이터를 생성하는데 사용된 것과 동일한 조건을 사용하여, 2개의 상이한 실험실에 의해, Trappsol® Cyclo™의 2개의 상이한 롯트로부터의 전자분무 MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 33은 1090 내지 1230 m/z 사이에서 피크를 나타내는 도 29 내지 32와 비교하여 Y-축이 확장된 전자분무 MS 스펙트럼을 도시한다. 도 33a는 Trappsol® Cyclo^TM로부터 얻은 스펙트럼이다. 도 33b는 Kleptose® HPB로부터 얻은 스펙트럼이다.
도 34는 Kleptose® HPB와 Trappsol® Cyclo™ 사이의 차이점을 추가로 비교한 전자분무 MS 데이터를 나타내며, 도 34a는 Kleptose® HPB 스펙트럼을 도시하고, 도 34b는 Trappsol® Cyclo™의 스펙트럼을 도시한다. 각각의 피크에서 히드록시프로필 모이어티의 수를 확인하기 위해 스펙트럼에 수를 더했다.
도 35는 Kleptose® HPB와 Trappsol® Cyclo™ 사이의 995 내지 1095 m/z의 부가적인 MS 스펙트럼 차이를 나타내고, 도 35a는 Kleptose® HPB 스펙트럼을 도시하고, 도 35b는 Trappsol® Cyclo™의 스펙트럼을 도시한다.
도 36은 치환 지문에 미치는 알루미나 흡착에 의한 정제의 효과를 나타내는 전자분무 MS 데이터를 나타낸다. 도 36a는 Kleptose® HPB 출발 물질로부터의 스펙트럼을 도시하고, 도 36b는 배치 CYL-4063으로부터의 스펙트럼을 나타내며, 이는 알루미나상에서의 흡수 크로마토그래피와 용매 침전(물-아세톤)의 조합에 의해 정제되었다.
도 37은 Kleptose® HPB 농도(0.1 mM 내지 10 mM)의 범위로 처리된 GM18453 및 GM05659 세포에서 선택된 콜레스테롤 항상성-관련 유전자 발현의 배수 변화를 나타낸다.
도 38은 4개의 상이한 조성물: STD(Kleptose® HPB "표준(standard)"); AC(알루미나 크로마토그래피( a lumina c hromatography)로 정제된 Kleptos® HPB); SP(용매 침전( s olvent p recipitation)에 의해 정제된 Kleptose® HPB); 및 AP(알루미나 크로마토그래피 및 용매 침전( a lumina c hromatography 및 s olvent p recipitation)으로 정제된 Kleptose® HPB)에 대해, 처리시에 발현이 통계적으로 유의미한 차이(p <0.001)가 있는 콜레스테롤 항상성 유전자의 서브셋의, NPC1 돌연변이에 대해 동형접합성인, GM18453 세포내 발현의 배수 변화를 도시한다.
도 39는 GM18453 세포를 각각 Kleptose® HPB에 의해, 및 알루미늄 흡착을 포함하는 공정으로 정제된 Kleptose® HPB 배치에 의해 처리한 경우, 통계적으로 유의미한, 가장 영향을 많이 받는 생물학적 경로를 도시한다.
도 40은 크로마토그래피로 분리된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 종의 치환도를 나타내도록 주석처리된, Kleptose® HPB 배치의 예비 CD-스크린 크로마토그래피 분리로부터 수득된 다양한 분획의 크로마토그램을 도시한다.
도 41은 히드록시프로필 치환도에 의한 신호를 확인하도록 주석처리된, Kleptose® HPB, "L" 분획, "M" 분획 및 "H" 분획의 전자분무 MS 스펙트럼을 도시하며, 도 41a는 Kleptose® HPB 배치 E0245를 나타내며; 도 41b는 "L" 분획(분획 2 단독)을 나타내며; 도 41c는 "M" 분획(분획 4-15의 풀)을 나타내며; 도 41d는 "H" 분획(분획 16-24의 풀)을 도시한다.
도 42는 1.0 mM의 "L", "M" 및 "H" 분획을 갖는 NPC 세포의 처리에 의해 가장 영향을 받는 10개의 생물학적 경로를 통계적 유의성의 내림차순으로 나타낸다.
도 43은 분획 "A" 내지 "F" 및 "K"를 생성하기 위해 모아진 수치 분획을 나타내도록 주석처리되고, 크로마토그래피 분리된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 종의 치환도를 나타내도록 주석처리된, Kleptose® HPB(배치 E0245)의 배치의 제조식 알루미늄 흡착 크로마토그래피 분리로부터 얻은 다양한 분획의 크로마토그램을 나타낸다.
도 44는 상이한 정제 방법 후의 HPBCD 혼합물의 크로마토그램을 도시하며, 도 44a는 방법 II-IX 후의 정제된 HPBCD 혼합물의 크로마토그램을 나타내고, 도 44b는 방법 X 및 XI 후의 정제된 HPBCD 혼합물의 크로마토그램을 나타낸다.
도 45는 18개월에 NPC I상 임상 시험 데이터에 대해 수행된 분석을 요약한다.
도 46은 18개월에 I상 임상 시험 데이터의 연간 변화율을 나타낸다.
도 47은 18개월에 I상 임상 시험 데이터의 기준선으로부터의 평균 변화를 나타낸다.
도 48은 18개월에 I상 임상 시험 데이터의 응답자 분석을 나타낸다.
도 49는 청력에 대한 치료의 영향을 보여준다.
도 50은 청력에 대한 치료의 영향을 요약한 것이다.

6. 발명의 상세한 설명

6.1. 실험적 관찰

하기 실시예 1에서 후술하는 바와 같이, 본 발명자들은 NPC 1형 질병 환자가 기존의 비경구용 조성물인 Kleptose® HPB(Roquette)를 사용하여 2-히드록시프로필 베타-시클로덱스트린("HPBCD")의 뇌척수강내 투여에 의해 치료되는, NIH에 의해 수행되는 I상 임상 시험으로부터의 초기 데이터를 분석하였다. 상기 비-무작위, 오픈-라벨, 단일-기관 연구에서, Kleptose® HPB는 증가하는 투여량으로 환자의 약물-미투여 코호트에 요추 주사를 통해 투여된다. 일부 분석에서, 본 발명자들은 개별 IND하에 다른 기관에서 뇌척수강내 Kleptose® HPB로 치료받는 3명의 환자의 데이터도 포함시켰다.

본 발명의 분석은 Kleptose® HPB의 뇌척수강내 투여가 NPC 1형 질병에서 치료적 이점을 제공한다는 것을 확인하였다. 표준 집계 결과 측정법, NPC 임상 중증도 척도(Yanjanin et al., "Linear Clinical Progression, Independent of Age of Onset, in Niemann-Pick Disease, Type C," Am. J. Med. Genet. Part　B 153B:132-140 (2010) 참조; 또한, 본원의 도 1 및 표 1 참조)를 사용하여, 치료되지 않은 질병의 자연 경과가 연구된 환자의 0/13명에 비해 7/15명의 환자가 질병이 안정적이거나 개선되는 것으로 관찰되었다(도 5 참조). 데이터의 사후 분석(도 7)을 통해 알 수 있는 새로운 복합물 종점을 사용하여, 11/15명의 연구대상 환자가 안정적이거나 질병이 개선된 것으로 나타난데 비해, 4/13명만 자연 경과 코호트에서 안정된 질병을 가짐을 발견하였다(도 8 참조). 특정 분석에서, 본 발명자들은 청력 및 청성뇌간반응(ABR)이 제거된 NPC 임상 중증도 점수를 사용했다.

그러나, 보다 상세한 분석에 따르면, HPBCD의 뇌척수강내 투여가 NPC 1형 질병의 특정 징후 및 증상을 개선시키지만, 다만 다른 증상의 진행을 둔화시킬뿐 역설적으로 다른 증상의 진행을 촉진시키는 것으로 나타났다. 특히, Kleptose® HPB를 뇌척수강내 투여받는 환자에서 청력 손실이 가속화된 것으로 보인다(예를 들어, 도 2, 3, 4 참조).

이하 실시예 3에서 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명자들은 다양한 크로마토그래피 방법에 의해 Kleptose® HPB의 대표적인 배치를 분석하였다. 이들 분석 결과, 상기 비경구용 제품이 상이한 치환도를 갖는 베타-시클로덱스트린 분자의 복합 혼합물을 포함한다는 것이 밝혀졌으며(도 11, 14, 16, 18 참조), 관찰된 개선, 진행의 둔화 및 다양한 임상 영역의 진행 가속화에 상기 종들 중 어느 것이 기여하는지는 알려지지 않았다.

실시예 5에 기술된 전자분무 질량 분석법을 사용하는 추가의 분석은 다른 상업적으로 이용가능한 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 조성물, Trappsol® Cyclo™의 치환 지문과 비교하여, 실시예 1에 기술된 I상 임상 시험에서 사용된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 조성물, Kleptose® HPB의 치환 지문에 유의미한 차이가 있음을 입증하였다. 본 발명자들은 Kleptose® HPB가 치환 지문에서 낮은 롯트 간(lot-to-lot) 변동성과 낮은 수준의 불순물, 특히 프로필렌 글리콜을 함유함을 발견했다. 대조적으로, 본 발명자들은 Trappsol® Cyclo™가 치환 지문에 있어서 높은 롯트 간 변동성과 추정된 내이신경 독소인 프로필렌 글리콜의 유의미하게 높은 수준을 나타낸다는 것을 발견했다.

실시예 6 및 7에 기술된 바와 같이, HPBCD가 뇌척수액에 장기간동안 및 더 빈번하게 투여하면서 직접 투여될 임상 시험을 준비하기 위해, 본 발명자들은 추정된 내이신경 독소인 프로필렌 글리콜, 히드록시프로필 치환을 갖지 않고 침전물을 형성하는 것으로 알려져 있는 베타-시클로덱스트린 분자, 및 매우 염증성인 세균성 내독소의 수준을 감소시키는 방법을 개발하였다. 이 방법이 특정 불순물을 감소시키는데 성공적이었지만, 알루미나를 이용한 흡수 크로마토그래피가 단독으로 또는 용매 침전과 함께 사용하여 조성의 지문 또한 변경시켜, 단일 히드록시프로필 치환을 갖는 베타-시클로덱스트린 분자(DS-1)의 양을 실질적으로 감소시키고, 및 2개의 치환을 갖는 베타-시클로덱스트린 분자(DS-2)의 양을 감소시켰음을 관찰하였다(실시예 7; 표 20 참조). 낮은 치환도(의도한 바와 같이 DS-0; 의도하지 않은 DS-1 및 DS-2)를 갖는 분자의 보급 감소는 혼합물의 평균 치환도(DS_a)를 증가시켰다.

실시예 8에 상술되고, 도 35-38에 요약된 바와 같이, 알루미늄 흡착을 이용하여 추가로 정제된 Kleptose® HPB 및 Kleptose® HPB의 배치(batch)를 사용한 유전자 발현 프로파일링 실험은 NPC1 돌연변이에 대해 동형접합체인 세포에 대한 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물의 활성이 히드록시프로필 치환의 정도가 다른 종에 의해 별도로 기여되는 활성의 복합체임을 입증한다. Kleptose® HPB와 비교하여 조성 지문의 변화에도 불구하고, 놀랍게도, 콜레스테롤 대사 및 수송에 관여하는 것으로 알려진 유전자의 발현에는 변화가 없었다. 이 발견은 치료 효과와 안전성이 증가된 NPC 질병 환자의 CSF로 뇌척수강내 또는 뇌실내로의 경로에 의해 장기간동안 투여되는, 신규의, 보다 고도로 정제되고 조성이 다른 HPBCD 조성물을 허용할 것이다.

6.2. 약학적 조성물

본 발명은 하나 이상의 히드록실 위치에서 히드록시프로필기에 의해 치환된 베타-시클로덱스트린 분자의 혼합물을 약학적 활성 성분으로 포함하고, 상기 혼합물이 선택적으로, 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린 분자를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

6.2.1. 약학적 활성 성분

약학적 활성 성분은 하나 이상의 히드록실 위치에서 히드록시프로필기에 의해 치환된 베타-시클로덱스트린 분자의 혼합물이며, 상기 혼합물은 선택적으로, 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린 분자를 포함한다. 용어 "약학적 활성 성분"은 본원에서 "활성 약학적 성분"과 동의어로 사용된다.

6.2.1.1. 평균 치환도

본원에서 사용된 바와 같이, "하나 이상의 히드록실 위치에서 히드록시프로필기에 의해 치환된"은 베타-시클로덱스트린 분자의 하나 이상의 히드록실기의 수소가 히드록시프로필기 또는 히드록시프로필 올리고머로 치환되는 것을 지칭한다. 예를 들어, "하나 이상의 히드록실 위치에서 히드록시프로필기에 의해 치환된"은 베타-시클로덱스트린 분자상의 하나 이상의 O-H 결합 내에 하나 이상의 -CH₂CH(CH₃)O-치환기가 삽입되어 하나 이상의 에테르 결합을 생성하는 것을 지칭할 수 있다.

베타-시클로덱스트린 혼합물 중의 무수글루코스 단위 당 히드록시프로필기의 수는 "몰 치환" 또는 "MS"이며, 히드록시프로필 베타덱스(USP NF 2015)상의 USP 논문("USP 히드록시프로필 베타덱스 논문")에 개시된 과정에 따라 측정되며, 상기 논문은 여기에 참고로 전문인용된다. 본 명세서에서, 용어 "평균 몰 치환" 또는 "MS_a"는 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에서 사용된 바와 같이 "MS"와 동의어로 사용되며, "글루코스 단위"라는 용어는 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에서 사용된 바와 같이 "무수글루코스 단위"와 동의어로 사용된다.

본원에서 사용된, "치환도" 또는 "DS"는 베타-시클로덱스트린 분자상에서 직접 또는 간접적으로 치환된 히드록시프로필기의 총 수를 지칭한다. 예를 들어, 각각 하나의 히드록시프로필기로 치환된 글루코스 단위를 함유하는 베타-시클로덱스트린 분자는 DS=7을 갖는다. 다른 예에서, 7개의 글루코스 단위 중 단지 하나만이 히드록시프로필기로 치환되고, 히드록시프로필기가 또다른 히드록시프로필기로 자체 치환된 베타-시클로덱스트린 분자(예를 들어, 2개의 히드록시프로필기를 포함하는 HP의 단일 발생을 갖는 베타-시클로덱스트린)는 DS=2를 갖는다.

본원에서 사용된 "평균 치환도", "평균 DS" 또는 "DS_a"로도 알려진 "베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필기의 평균 개수"는 베타-시클로덱스트린의 군집내 히드록시프로필기의 총 수를 베타-시클로덱스트린 분자의 수로 나눈 값을 지칭한다. 예시적인 예에서, 각각 하나의 히드록시프로필기로 치환된 글루코스 단위를 함유하는 베타-시클로덱스트린 및 2개의 히드록시프로필기로 각각 치환된 글루코스 단위를 함유하는 베타-시클로덱스트린의 균등부분 혼합물은 DS_a=10.5(DS=7 및 DS=14인 균등부분 베타-시클로덱스트린의 평균)를 갖는다. 또다른 예시적인 예에서, 7개의 글루코스 단위 중 하나만이 히드록시프로필기(즉, DS=1)로 치환된 33.3% 베타-시클로덱스트린 및, 각각 하나의 히드록시프로필기에 의해 치환된 글루코스 단위를 함유하는 66.7% 베타-시클로덱스트린(즉, DS=7)의 혼합물은 DS_a=5.0을 갖는다.

DS_a는 MS에 7을 곱함으로써 결정된다. 본원에서 사용되는 DS_a는 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 정의된 바와 같이 "치환도"와 동의어로 사용된다.

일부 구현예에서, 혼합물내 베타-시클로덱스트린은 하기 구조식의 글루코스 단위로 구성된다:

여기에서, R¹, R² 및 R³은 각각의 경우 독립적으로 -H 또는 -HP이고, HP는 1개 이상의 히드록시프로필기를 포함한다.

일부 구현예에서, HP는 1개의 히드록시프로필기를 포함한다. 일부 구현예에서, HP는 본질적으로 1개의 히드록시프로필기로 구성된다. 일부 구현예에서, HP는 1개의 히드록시프로필기로 구성된다.

일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 당 HP의 평균 발생 수는 약 3 내지 약 7, 예를 들어 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 4, 약 4 내지 약 7, 약 4 내지 약 6, 약 4 내지 약 5, 약 5 내지 약 7, 약 5 내지 약 6, 또는 약 6 내지 약 7이다.

일부 구현예에서, R³=HP의 총 발생은 R¹=HP 또는 R²=HP의 총 발생보다 크다. 특정 구현예에서, R³=HP의 총 발생은 R¹=HP 및 R²=HP의 총합 발생보다 크다.

일부 구현예에서, 조합된 R¹ 및 R²의 총 발생의 약 5% 이상, 예를 들어, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 또는 약 45% 이상이 HP이다.

일부 구현예에서, 조합된 R¹ 및 R²의 총 발생의 약 95% 이하, 예를 들어, 약 90% 이하, 약 85% 이하, 약 80% 이하, 약 75% 이하, 약 70% 이하, 약 65% 이하, 약 60% 이하, 약 55% 이하 또는 약 50% 이하가 HP이다.

일부 구현예에서, HP인 조합된 R¹ 및 R²의 백분율은 약 5% 내지 약 95%, 예컨대 약 10% 내지 약 95%, 약 15% 내지 약 95%, 약 20% 내지 약 95%, 약 25% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 95%, 약 35% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 45% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 55% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 약 65% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 95%, 약 75% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 95%; 예컨대 약 5% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 90%, 약 15% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 35% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 45% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 55% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 65% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 75% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 90%; 예컨대 약 5% 내지 약 85%, 약 10% 내지 약 85%, 약 15% 내지 약 85%, 약 20% 내지 약 85%, 약 25% 내지 약 85%, 약 30% 내지 약 85%, 약 35% 내지 약 85%, 약 40% 내지 약 85%, 약 45% 내지 약 85%, 약 50% 내지 약 85%, 약 55% 내지 약 85%, 약 60% 내지 약 85%, 약 65% 내지 약 85%, 약 70% 내지 약 85%, 약 75% 내지 약 85%, 약 80% 내지 약 85%; 예컨대 약 5% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 80%, 약 15% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 25% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 35% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 45% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 55% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 65% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 80%; 예컨대 약 5% 내지 약 75%, 약 10% 내지 약 75%, 약 15% 내지 약 75%, 약 20% 내지 약 75%, 약 25% 내지 약 75%, 약 30% 내지 약 75%, 약 35% 내지 약 75%, 약 40% 내지 약 75%, 약 45% 내지 약 75%, 약 50% 내지 약 75%, 약 55% 내지 약 75%, 약 60% 내지 약 75%, 약 65% 내지 약 75%, 약 70% 내지 약 75%; 예컨대 약 5% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 70%, 약 15% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 25% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 35% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 45% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 55% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 70%; 예컨대 약 5% 내지 약 65%, 약 10% 내지 약 65%, 약 15% 내지 약 65%, 약 20% 내지 약 65%, 약 25% 내지 약 65%, 약 30% 내지 약 65%, 약 35% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 65%, 약 45% 내지 약 65%, 약 50% 내지 약 65%, 약 55% 내지 약 65%, 약 60% 내지 약 65%; 예컨대 약 5% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 60%, 약 15% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 25% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 35% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 45% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 60%; 예컨대 약 5% 내지 약 55%, 약 10% 내지 약 55%, 약 15% 내지 약 55%, 약 20% 내지 약 55%, 약 25% 내지 약 55%, 약 30% 내지 약 55%, 약 35% 내지 약 55%, 약 40% 내지 약 55%, 약 45% 내지 약 55%, 약 50% 내지 약 55%; 예컨대 약 5% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 25% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 35% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 45% 내지 약 50%; 예컨대 약 5% 내지 약 45%, 약 10% 내지 약 45%, 약 15% 내지 약 45%, 약 20% 내지 약 45%, 약 25% 내지 약 45%, 약 30% 내지 약 45%, 약 35% 내지 약 45%, 약 40% 내지 약 45%; 예컨대 약 5% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 25% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 40%; 예컨대 약 5% 내지 약 35%, 약 10% 내지 약 35%, 약 15% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 35%, 약 25% 내지 약 35%, 약 30% 내지 약 35%; 예컨대 약 5% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 30%; 예컨대 약 5% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 25%, 약 15% 내지 약 25%, 약 20% 내지 약 25%; 예컨대 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 20%; 예컨대 약 5% 내지 약 15%, 약 10% 내지 약 15%; 또는 약 5% 내지 약 10%이다.

일부 구현예에서, R³의 발생의 약 5% 이상, 예를 들어, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 또는 약 50% 이상이 HP이다.

일부 구현예에서, R³의 발생의 약 95% 이하, 예를 들어, 약 90% 이하, 약 85% 이하, 약 80% 이하, 약 75% 이하, 약 70% 이하, 약 65% 이하, 약 60% 이하, 또는 약 55% 이하가 HP이다.

일부 구현예에서, HP인 R³의 발생률은 약 20% 내지 약 90%, 예를 들어, 약 25% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 35% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 45% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 55% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 65% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 75% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 85%, 약 25% 내지 약 85%, 약 30% 내지 약 85%, 약 35% 내지 약 85%, 약 40% 내지 약 85%, 약 45% 내지 약 85%, 약 50% 내지 약 85%, 약 55% 내지 약 85%, 약 60% 내지 약 85%, 약 65% 내지 약 85%, 약 70% 내지 약 85%, 약 75% 내지 약 85%, 약 80% 내지 약 85%, 약 20% 내지 약 80%, 약 25% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 35% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 45% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 55% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 65% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 75%, 약 25% 내지 약 75%, 약 30% 내지 약 75%, 약 35% 내지 약 75%, 약 40% 내지 약 75%, 약 45% 내지 약 75%, 약 50% 내지 약 75%, 약 55% 내지 약 75%, 약 60% 내지 약 75%, 약 65% 내지 약 75%, 약 70% 내지 약 75%, 약 20% 내지 약 70%, 약 25% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 35% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 45% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 55% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 65%, 약 25% 내지 약 65%, 약 30% 내지 약 65%, 약 35% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 65%, 약 45% 내지 약 65%, 약 50% 내지 약 65%, 약 55% 내지 약 65%, 약 60% 내지 약 65%, 약 20% 내지 약 60%, 약 25% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 35% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 45% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 55%, 약 25% 내지 약 55%, 약 30% 내지 약 55%, 약 35% 내지 약 55%, 약 40% 내지 약 55%, 약 45% 내지 약 55%, 약 50% 내지 약 55%, 약 20% 내지 약 50%, 약 25% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 35% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 45% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 45%, 약 25% 내지 약 45%, 약 30% 내지 약 45%, 약 35% 내지 약 45%, 약 40% 내지 약 45%, 약 5% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 25% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 35%, 약 25% 내지 약 35%, 약 30% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 30%, 또는 약 20% 내지 약 25%의 범위이다.

일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 약 70% 이상, 예를 들면, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상 또는 약 95% 이상은 집합적으로 약 4 내지 약 7, 예를 들면, 약 4 내지 약 6, 약 4 내지 약 5, 약 5 내지 약 7, 약 5 내지 약 6, 또는 약 6 내지 약 7의 베타-시클로덱스트린 당 HP의 평균 발생 수를 갖는다.

일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 당 HP의 평균 발생 수가 집합적으로 약 4 내지 약 7, 예를 들어, 약 4 내지 약 6, 약 4 내지 약 5, 약 5 내지 약 7, 약 5 내지 약 6, 또는 약 6 내지 약 7인 베타-시클로덱스트린의 백분율은 약 50% 내지 약 99%, 예컨대 약 55% 내지 약 99%, 약 60% 내지 약 99%, 약 65% 내지 약 99%, 약 70% 내지 약 99%, 약 75% 내지 약 99%, 약 80% 내지 약 99%, 약 85% 내지 약 99%, 약 90% 내지 약 99%, 약 95% 내지 약 99%; 예컨대 약 50% 내지 약 97%, 예컨대 약 55% 내지 약 97%, 약 60% 내지 약 97%, 약 65% 내지 약 97%, 약 70% 내지 약 97%, 약 75% 내지 약 97%, 약 80% 내지 약 97%, 약 85% 내지 약 97%, 약 90% 내지 약 97%, 약 95% 내지 약 97%; 예컨대 약 50% 내지 약 95%, 약 55% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 약 65% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 95%, 약 75% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 95%; 예컨대 약 50% 내지 약 90%, 약 55% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 65% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 75% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 90%; 예컨대 약 50% 내지 약 85%, 약 55% 내지 약 85%, 약 60% 내지 약 85%, 약 65% 내지 약 85%, 약 70% 내지 약 85%, 약 75% 내지 약 85%, 약 80% 내지 약 85%; 예컨대 약 50% 내지 약 80%, 약 55% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 65% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 80%; 예컨대 약 50% 내지 약 75%, 약 55% 내지 약 75%, 약 60% 내지 약 75%, 약 65% 내지 약 75%, 약 70% 내지 약 75%; 예컨대 약 50% 내지 약 70%, 약 55% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 70%; 예컨대 약 50% 내지 약 65%, 약 55% 내지 약 65%, 약 60% 내지 약 65%; 예컨대 약 50% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 60%; 또는 예컨대 약 50% 내지 약 55%의 범위이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 치환되지않은 베타-시클로덱스트린 분자 및 하나 이상의 히드록실 위치에서 히드록시프로필기에 의해 치환된 베타-시클로덱스트린 분자의 혼합물을 약학적 활성 성분으로서 포함하며, 상기 혼합물은 약 3 내지 약 7의 베타-시클로덱스트린 분자 당 히드록시프로필기의 평균 수(DS_a)를 갖는다.

일부 구현예에서, DS_a는 약 3 내지 약 5, 예컨대 약 3 내지 약 4이다. 일부 구현예에서, DS_a는 3.3 ± 0.3, 3.5 ± 0.3 또는 3.7 ± 0.3이다. 다른 구현예에서, DS_a는 3.2 ± 0.2, 3.3 ± 0.2, 3.4 ± 0.2, 3.5 ± 0.2, 3.6 ± 0.2, 3.7 ± 0.2 또는 3.8 ± 0.2이다. 다른 구현예에서, DS_a는 3.1 ± 0.1, 3.2 ± 0.1, 3.3 ± 0.1, 3.4 ± 0.1, 3.5 ± 0.1, 3.6 ± 0.1, 3.7 ± 0.1, 3.8 ± 0.1 또는 3.9 ± 0.1이다.

일부 구현예에서, DS_a는 약 3.5 내지 약 5.5, 예컨대 약 3.5 내지 약 4.5이다. 일부 구현예에서, DS_a는 3.8 ± 0.3, 4.0 ± 0.3 또는 4.2 ± 0.3이다. 다른 구현예에서, DS_a는 3.7 ± 0.2, 3.8 ± 0.2, 3.9 ± 0.2, 4.0 ± 0.2, 4.1 ± 0.2, 4.2 ± 0.2 또는 4.3 ± 0.2이다. 다른 구현예에서, DS_a는 3.6 ± 0.1, 3.7 ± 0.1, 3.8 ± 0.1, 3.9 ± 0.1, 4.0 ± 0.1, 4.1 ± 0.1, 4.2 ± 0.1, 4.3 ± 0.1 또는 4.4 ± 0.1이다.

일부 구현예에서, DS_a는 약 4 내지 약 6, 예컨대 약 4 내지 약 5이다. 일부 구현예에서, DS_a는 4.3 ± 0.3, 4.5 ± 0.3 또는 4.7 ± 0.3이다. 다른 구현예에서, DS_a는 4.2 ± 0.2, 4.3 ± 0.2, 4.4 ± 0.2, 4.5 ± 0.2, 4.6 ± 0.2, 4.7 ± 0.2 또는 4.8 ± 0.2이다. 다른 구현예에서, DS_a는 4.1 ± 0.1, 4.2 ± 0.1, 4.3 ± 0.1, 4.4 ± 0.1, 4.5 ± 0.1, 4.6 ± 0.1, 4.7 ± 0.1, 4.8 ± 0.1 또는 4.9 ± 0.1이다.

일부 구현예에서, DS_a는 약 4.5 내지 약 6.5, 예컨대 약 4.5 내지 약 5.5이다. 일부 구현예에서, DS_a는 4.8 ± 0.3, 5.0 ± 0.3 또는 5.2 ± 0.3이다. 다른 구현예에서, DS_a는 4.7 ± 0.2, 4.8 ± 0.2, 4.9 ± 0.2, 5.0 ± 0.2, 5.1 ± 0.2, 5.2 ± 0.2 또는 5.3 ± 0.2이다. 다른 구현예에서, DS_a는 4.6 ± 0.1, 4.7 ± 0.1, 4.8 ± 0.1, 4.9 ± 0.1, 5.0 ± 0.1, 5.1 ± 0.1, 5.2 ± 0.1, 5.3 ± 0.1 또는 5.4 ± 0.1이다.

일부 구현예에서, DS_a는 약 5 내지 약 7, 예컨대 약 5 내지 약 6이다. 일부 구현예에서, DS_a는 5.3 ± 0.3, 5.5 ± 0.3 또는 5.7 ± 0.3이다. 다른 구현예에서, DS_a는 5.2 ± 0.2, 5.3 ± 0.2, 5.4 ± 0.2, 5.5 ± 0.2, 5.6 ± 0.2, 5.7 ± 0.2 또는 5.8 ± 0.2이다. 다른 구현예에서, DS_a는 5.1 ± 0.1, 5.2 ± 0.1, 5.3 ± 0.1, 5.4 ± 0.1, 5.5 ± 0.1, 5.6 ± 0.1, 5.7 ± 0.1, 5.8 ± 0.1 또는 5.9 ± 0.1이다.

일부 구현예에서, DS_a는 약 5.5 내지 약 6.5이다. 일부 구현예에서, DS_a는 5.8 ± 0.3, 6.0 ± 0.3 또는 6.2 ± 0.3이다. 다른 구현예에서, DS_a는 5.7 ± 0.2, 5.8 ± 0.2, 5.9 ± 0.2, 6.0 ± 0.2, 6.1 ± 0.2, 6.2 ± 0.2 또는 6.3 ± 0.2이다. 다른 구현예에서, DS_a는 5.6 ± 0.1, 5.7 ± 0.1, 5.8 ± 0.1, 5.9 ± 0.1, 6.0 ± 0.1, 6.1 ± 0.1, 6.2 ± 0.1, 6.3 ± 0.1 또는 6.4 ± 0.1이다.

일부 구현예에서, DS_a는 약 6 내지 약 7이다. 일부 구현예에서, DS_a는 6.3 ± 0.3, 6.5 ± 0.3 또는 6.7 ± 0.3이다. 다른 구현예에서, DS_a는 6.2 ± 0.2, 6.3 ± 0.2, 6.4 ± 0.2, 6.5 ± 0.2, 6.6 ± 0.2, 6.7 ± 0.2 또는 6.8 ± 0.2이다. 다른 구현예에서, DS_a는 6.1 ± 0.1, 6.2 ± 0.1, 6.3 ± 0.1, 6.4 ± 0.1, 6.5 ± 0.1, 6.6 ± 0.1, 6.7 ± 0.1, 6.8 ± 0.1 또는 6.9 ± 0.1이다.

일부 구현예에서, DS_a는 약 4.1 ± 15%, 약 4.2 ± 15%, 약 4.3 ± 15%, 약 4.4 ± 15%, 또는 약 4.5 ± 15%, 예컨대 약 4.1 ± 10%, 약 4.2 ± 10%, 약 4.3 ± 10%, 약 4.4 ± 10% 또는 약 4.5 ± 10%, 예컨대 약 4.1 ± 5%, 약 4.2 ± 5%, 약 4.3 ± 5%, 약 4.4 ± 5%, 약 4.5 ± 5%이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, DS_a는 약 4.31 ± 10%, 약 4.32 ± 10%, 약 4.33 ± 10%, 약 4.34 ± 10%, 약 4.35 ± 10%, 약 4.36 ± 10% 또는 약 4.37 ± 10%, 예컨대 약 4.31 ± 5%, 약 4.32 ± 5%, 약 4.33 ± 5%, 약 4.34 ± 5%, 약 4.35 ± 5%, 약 4.36 ± 5% 또는 약 4.37 ± 5%이다. 특정 구현예에서, DS_a는 약 4.34 ± 10%, 예컨대 약 4.34 ± 5%이다.

일부 구현예에서, DS_a는 약 4.3 ± 15%, 약 4.4 ± 15%, 약 4.5 ± 15%, 약 4.6 ± 15%, 또는 약 4.7 ± 15%, 예컨대 약 4.3 ± 10%, 약 4.4 ± 10%, 약 4.5 ± 10%, 약 4.6 ± 10%, 또는 약 4.7 ± 10%, 예컨대 약 4.3 ± 5%, 약 4.4 ± 5%, 약 4.5 ± 5%, 약 4.6 ± 5%, 또는 약 4.7 ± 5%이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, DS_a는 약 4.47 ± 10%, 약 4.48 ± 10%, 약 4.49 ± 10%, 약 4.50 ± 10%, 약 4.51 ± 10%, 약 4.52 ± 10% 또는 약 4.53 ± 10%, 예컨대 약 4.47 ± 5%, 약 4.48 ± 5%, 약 4.49 ± 5%, 약 4.50 ± 5%, 약 4.51 ± 5%, 약 4.52 ± 5%, 또는 약 4.53 ± 5%이다. 특정 구현예에서, DS_a는 약 4.50 ± 10%, 예컨대 약 4.50 ± 5%이다.

일부 구현예에서, DS_a는 약 6.1 ± 15%, 약 6.2 ± 15%, 약 6.3 ± 15%, 약 6.4 ± 15%, 또는 약 6.5 ± 15%, 예컨대 약 6.1 ± 10%, 약 6.2 ± 10%, 약 6.3 ± 10%, 약 6.4 ± 10%, 또는 약 6.5 ± 10%, 예컨대 약 6.1 ± 5%, 약 6.2 ± 5%, 약 6.3 ± 5%, 약 6.4 ± 5%, 약 6.5 ± 5%이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, DS_a는 약 6.34 ± 10%, 약 6.35 ± 10%, 약 6.36 ± 10%, 약 6.37 ± 10%, 약 6.38 ± 10%, 약 6.39 ± 10%, 또는 약 6.40 ± 10%, 예컨대 약 6.34 ± 5%, 약 6.35 ± 5%, 약 6.36 ± 5%, 약 6.37 ± 5%, 약 6.38 ± 5%, 약 6.39 ± 5%, 또는 약 6.40 ± 5%이다. 특정 구현예에서, DS_a는 약 6.37 ± 10%, 예컨대 약 6.37 ± 5%이다.

일부 구현예에서, DS_a는 약 6.3 ± 15%, 약 6.4 ± 15%, 약 6.5 ± 15%, 약 6.6 ± 15%, 또는 약 6.7 ± 15%, 예컨대 약 6.3 ± 10%, 약 6.4 ± 10%, 약 6.5 ± 10%, 약 6.6 ± 10%, 또는 약 6.7 ± 10%, 예컨대 약 6.3 ± 5%, 약 6.4 ± 5%, 약 6.5 ± 5%, 약 6.6 ± 5%, 또는 약 6.7 ± 5%이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, DS_a는 약 6.50 ± 10%, 약 6.51 ± 10%, 약 6.52 ± 10%, 약 6.53 ± 10%, 약 6.54 ± 10%, 약 6.55 ± 10%, 또는 약 6.56 ± 10%, 예컨대 약 6.50 ± 5%, 약 6.51 ± 5%, 약 6.52 ± 5%, 약 6.53 ± 5%, 약 6.54 ± 5%, 약 6.55 ± 5%, 또는 약 6.56 ± 5%이다. 특정 구현예에서, DS_a는 약 6.53 ± 10%, 예컨대 약 6.53 ± 5%이다.

치환되지 않은 베타-시클로덱스트린 분자 및 하나 이상의 히드록실 위치에서 히드록시프로필기에 의해 치환된 베타-시클로덱스트린 분자의 혼합물 내에서 치환도의 분포는 다양할 수 있다. 예를 들어, 각각 하나의 히드록시프로필기로 치환된 글루코스 단위를 함유하는 베타-시클로덱스트린 및 2개의 히드록시프로필기로 각각 치환된 글루코스 단위를 함유하는 베타-시클로덱스트린의 균등부분 혼합물은 DS_a=10.5(DS=7 및 DS=14인 균등부분 베타-시클로덱스트린의 평균)를 갖는다. DS_a=10.5이지만, 이 실시예에서는 혼합물 내에 DS=10 또는 DS=11을 갖는 베타-시클로덱스트린이 없다. 다른 경우 베타-시클로덱스트린 혼합물 내의 대부분의 베타-시클로덱스트린은 DS_a에 가까운 DS를 갖는다.

본 발명의 일부 구현예에서, 상기 혼합물 내의 베타-시클로덱스트린의 약 50% 이상, 예를 들어, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 97% 이상은 DS_a ± Xσ 이내의 DS를 가지며, 여기서 σ는 표준 편차이고, X는 1, 2 또는 3이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 혼합물 내의 베타-시클로덱스트린의 약 50% 이상, 예를 들어, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 97% 이상이 DS_a ± 1σ 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 70% 이상이 DS_a ± 1σ 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 90% 이상이 DS_a ± 1σ 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 95% 이상이 DS_a ± 1σ 이내의 DS를 갖는다.

일부 구현예에서, 혼합물 내의 베타-시클로덱스트린의 약 50% 이상, 예를 들어, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 97% 이상이 DS_a ± 2σ 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 70% 이상이 DS_a ± 2σ 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 90% 이상이 DS_a ± 2σ 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 95% 이상이 DS_a ± 2σ 이내의 DS를 갖는다.

일부 구현예에서, 혼합물 내의 베타-시클로덱스트린의 약 50% 이상, 예를 들어, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 97% 이상이 DS_a ± 3σ 내에서 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 70% 이상이 DS_a ± 3σ 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 90% 이상이 DS_a ± 3σ 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 95% 이상이 DS_a ± 3σ 이내의 DS를 갖는다.

일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 약 50% 이상, 예를 들어, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 97% 이상이 DS_a ± 1 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 70% 이상은 DS_a ± 1 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 90% 이상은 DS_a ± 1 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 95% 이상은 DS_a ± 1 이내의 DS를 갖는다.

일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 약 50% 이상, 예를 들어, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 97% 이상이 DS_a ± 0.8 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 70% 이상은 DS_a ± 0.8 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 90% 이상은 DS_a ± 0.8 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 95% 이상은 DS_a ± 0.8 이내의 DS를 갖는다.

일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 약 50% 이상, 예를 들어, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 97% 이상이 DS_a ± 0.6 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 70% 이상이 DS_a ± 0.6 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 90% 이상이 DS_a ± 0.6 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 95% 이상이 DS_a ± 0.6 이내의 DS를 갖는다.

일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 약 50% 이상, 예를 들어, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 97% 이상이 DS_a ± 0.5 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 70% 이상이 DS_a ± 0.5 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 90% 이상이 DS_a ± 0.5 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 95% 이상이 DS_a ± 0.5 이내의 DS를 갖는다.

일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 약 50% 이상, 예를 들어, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 97% 이상이 DS_a ± 0.4 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 70% 이상이 DS_a ± 0.4 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 90% 이상이 DS_a ± 0.4 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 95% 이상이 DS_a ± 0.4 이내의 DS를 갖는다.

일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 약 50% 이상, 예를 들어, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 97% 이상이 DS_a ± 0.3 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 70% 이상이 DS_a ± 0.3 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 90% 이상이 DS_a ± 0.3 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 95% 이상이 DS_a ± 0.3 이내의 DS를 갖는다.

일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 약 50% 이상, 예를 들어, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 97% 이상이 DS_a ± 0.2 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 70% 이상이 DS_a ± 0.2 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 90% 이상이 DS_a ± 0.2 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 95% 이상이 DS_a ± 0.2 이내의 DS를 갖는다.

일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 약 50% 이상, 예를 들어, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 97% 이상이 DS_a ± 0.1 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 70% 이상이 DS_a ± 0.1 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 90% 이상이 DS_a ± 0.1 이내의 DS를 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 95% 이상이 DS_a ± 0.1 이내의 DS를 갖는다.

일부 구현예에서, MS는 0.40 내지 0.80, 예컨대 0.41 내지 0.79, 0.42 내지 0.78, 0.43 내지 0.77, 0.44 내지 0.76, 0.45 내지 0.75, 0.46 내지 0.74, 0.47 내지 0.73, 0.48 내지 0.72, 0.49 내지 0.71, 0.50 내지 0.70, 0.51 내지 0.69, 0.52 내지 0.68, 0.53 내지 0.67, 0.54 내지 0.66, 0.55 내지 0.65, 0.56 내지 0.64, 0.57 내지 0.63, 0.58 내지 0.62, 또는 0.59 내지 0.61의 범위이다.

특정 구현예에서, MS는 약 0.40, 약 0.41, 약 0.42, 약 0.43, 약 0.44, 약 0.45, 약 0.46, 약 0.47, 약 0.48, 약 0.49, 약 0.50, 약 0.51, 약 0.52, 약 0.53, 약 0.54, 약 0.55, 약 0.56, 약 0.57, 약 0.58, 약 0.59, 약 0.60, 약 0.61, 약 0.62, 약 0.63, 약 0.64, 약 0.65, 약 0.66, 약 0.67, 약 0.68, 약 0.69, 약 0.70, 약 0.71, 약 0.72, 약 0.73, 약 0.74, 약 0.75, 약 0.76, 약 0.77, 약 0.78, 약 0.79 또는 약 0.80이다.

특정 구현예에서, MS는 약 0.571 - 0.686(DS_a 약 4.0 내지 약 4.8)이다. 상기 구현예들 중 일부에서, MS는 약 0.58 내지 약 0.68의 범위에 있다. 현재 바람직한 실시예에서, MS는 0.58 - 0.68의 범위에 있다.

다양한 구현예에서, MS는 약 0.55 이상이다. 특정 구현예에서, MS는 적어도 약 0.56, 0.57, 0.58, 0.59 또는 0.60 이상이다. 특정 구현예에서, MS는 약 0.70 이하이다. 특정 구현예에서, MS는 약 0.69, 0.68, 0.67, 0.66 또는 0.65 이하이다.

히드록시프로필기는 모노머로서 베타-시클로덱스트린에 결합될 수 있거나, 또는 그 자체로 하나 이상의 추가 히드록시프로필기에 순차적으로 결합되어, 이후에 베타-시클로덱스트린에 결합되는 히드록시프로필 올리고머를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 히드록시프로필기는 구조식 [CH₂CH(CH₃)O]_nH의 히드록시프로필 사슬로서 베타-시클로덱스트린의 히드록실 위치에서 치환되고, 상기 식에서 n≥1이고, 베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필 사슬의 평균 수는 약 3 내지 약 7, 예를 들어, 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 4, 약 4 내지 약 7, 약 4 내지 약 6, 약 4 내지 약 5, 약 5 내지 약 7, 약 5 내지 약 6, 또는 6 내지 약 7이다. 일부 구현예에서, n은 1, 2, 3 또는 4이다.

예시적인 일례에서, 구조식 -CH₂CH(CH₃)OH의 히드록시프로필 사슬은 히드록시프로필 사슬에서 하나의 히드록시프로필기(즉, n=1)를 포함한다. 또 다른 예시적인 예에서, 구조식 -[CH₂CH(CH₃)0]₃H의 히드록시프로필 사슬은 히드록시프로필 사슬에서 3개의 히드록시프로필기(즉, n=3)를 포함한다.

특정 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필 사슬의 평균 수는 3.3 ± 0.3, 3.4 ± 0.3, 3.6 ± 0.3 또는 3.8 ± 0.3이다. 다른 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필 사슬의 평균 수는 4.0 ± 0.3, 4.2 ± 0.3, 4.4 ± 0.3, 4.6 ± 0.3 또는 4.8 ± 0.3이다. 다른 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필 사슬의 평균 수는 5.0 ± 0.3, 5.2 ± 0.3, 5.4 ± 0.3, 5.6 ± 0.3 또는 5.8 ± 0.3이다. 그리고 다른 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필 사슬의 평균 수는 6.0 ± 0.3, 6.2 ± 0.3, 6.4 ± 0.3, 6.6 ± 0.3 또는 6.7 ± 0.3이다.

일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필 사슬의 평균 수는 3.2 ± 0.2, 3.3 ± 0.2, 3.4 ± 0.2, 3.5 ± 0.2, 3.6 ± 0.2, 3.7 ± 0.2 또는 3.8 ± 0.2이다. 다른 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필 사슬의 평균 수는 4.0 ± 0.2, 4.1 ± 0.2, 4.2 ± 0.2, 4.3 ± 0.2, 4.4 ± 0.2, 4.5 ± 0.2, 4.6 ± 0.2, 4.7 ± 0.2 또는 4.8 ± 0.2이다. 다른 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필 사슬의 평균 수는 5.0 ± 0.2, 5.1 ± 0.2, 5.2 ± 0.2, 5.3 ± 0.2, 5.4 ± 0.2, 5.5 ± 0.2, 5.6 ± 0.2, 5.7 ± 0.2 또는 5.8 ± 0.2이다. 그리고 다른 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필 사슬의 평균 수는 6.0 ± 0.2, 6.1 ± 0.2, 6.2 ± 0.2, 6.3 ± 0.2, 6.4 ± 0.2, 6.5 ± 0.2, 6.6 ± 0.2, 6.7 ± 0.2 또는 6.8 ± 0.2이다.

일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필 사슬의 평균 수는 3.1 ± 0.1, 3.2 ± 0.1, 3.3 ± 0.1, 3.4 ± 0.1, 3.5 ± 0.1, 3.6 ± 0.1, 3.7 ± 0.1, 3.8 ± 0.1, 또는 3.9 ± 0.1이다. 다른 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필 사슬의 평균 수는 4.0 ± 0.1, 4.1 ± 0.1, 4.2 ± 0.1, 4.3 ± 0.1, 4.4 ± 0.1, 4.5 ± 0.1, 4.6 ± 0.1, 4.7 ± 0.1, 4.8 ± 0.1, 또는 4.9 ± 0.1이다. 다른 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필 사슬의 평균 수는 5.0 ± 0.1, 5.1 ± 0.1, 5.2 ± 0.1, 5.3 ± 0.1, 5.4 ± 0.1, 5.5 ± 0.1, 5.6 ± 0.1, 5.7 ± 0.1, 5.8 ± 0.1, 또는 5.9 ± 0.1이다. 그리고 다른 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필 사슬의 평균 수는 6.0 ± 0.1, 6.1 ± 0.1, 6.2 ± 0.1, 6.3 ± 0.1, 6.4 ± 0.1, 6.5 ± 0.1, 6.6 ± 0.1, 6.7 ± 0.1, 6.8 ± 0.1, 또는 6.9 ± 0.1이다.

일부 구현예에서, 히드록시프로필 사슬의 약 50% 이상, 예를 들어 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 97% 이상은 n=1을 갖는다. 일부 구현예에서, 히드록시프로필 사슬의 70% 이상은 n=1을 갖는다. 일부 구현예에서, 히드록시프로필 사슬의 90% 이상은 n=1을 갖는다.

일부 구현예에서, n=1인 히드록시프로필 사슬의 백분율은 약 50% 내지 약 99%, 예컨대 약 55% 내지 약 99%, 약 60% 내지 약 99%, 약 65% 내지 약 99%, 약 70% 내지 약 99%, 약 75% 내지 약 99%, 약 80% 내지 약 99%, 약 85% 내지 약 99%, 약 90% 내지 약 99%, 약 95% 내지 약 99%; 예컨대 약 50% 내지 약 97%, 예컨대 약 55% 내지 약 97%, 약 60% 내지 약 97%, 약 65% 내지 약 97%, 약 70% 내지 약 97%, 약 75% 내지 약 97%, 약 80% 내지 약 97%, 약 85% 내지 약 97%, 약 90% 내지 약 97%, 약 95% 내지 약 97%; 예컨대 약 50% 내지 약 95%, 약 55% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 약 65% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 95%, 약 75% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 95%; 예컨대 약 50% 내지 약 90%, 약 55% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 65% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 75% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 90%; 예컨대 약 50% 내지 약 85%, 약 55% 내지 약 85%, 약 60% 내지 약 85%, 약 65% 내지 약 85%, 약 70% 내지 약 85%, 약 75% 내지 약 85%, 약 80% 내지 약 85%; 예컨대 약 50% 내지 약 80%, 약 55% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 65% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 80%; 예컨대 약 50% 내지 약 75%, 약 55% 내지 약 75%, 약 60% 내지 약 75%, 약 65% 내지 약 75%, 약 70% 내지 약 75%; 예컨대 약 50% 내지 약 70%, 약 55% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 70%; 예컨대 약 50% 내지 약 65%, 약 55% 내지 약 65%, 약 60% 내지 약 65%; 예컨대 약 50% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 60%; 또는 예컨대 약 50% 내지 약 55% 범위이다.

일부 구현예에서, 히드록시프로필 사슬의 약 50% 미만, 예컨대 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5% 또는 약 3%는 n=2를 갖는다. 일부 구현예에서, 히드록시프로필 사슬의 30% 미만은 n=2를 갖는다. 일부 구현예에서, 히드록시프로필 사슬의 10% 미만은 n=2를 갖는다.

일부 구현예에서, n=2인 히드록시프로필 사슬의 백분율은 약 5% 내지 약 50%, 예컨대 약 10% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 50%, 약 20% 약 50%, 약 25% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 35% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 45% 내지 약 50%; 약 5% 내지 약 45%, 약 10% 내지 약 45%, 약 15% 내지 약 45%, 약 20% 내지 약 45%, 약 25% 내지 약 45%, 약 30% 내지 약 45%, 약 35% 내지 약 45%, 약 40% 내지 약 45%; 약 5% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 25% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 40%; 약 5% 내지 약 35%, 약 10% 내지 약 35%, 약 15% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 35%, 약 25% 내지 약 35%, 약 30% 내지 약 35%; 예컨대 약 5% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 30%; 예컨대, 약 5% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 25%, 약 15% 내지 약 25%, 약 20% 내지 약 25%; 예컨대 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 20%; 약 5% 내지 약 15%, 약 10% 내지 약 15%; 또는 약 5% 내지 약 10%이다.

일부 구현예에서, 히드록시프로필 사슬의 약 50% 미만, 예컨대 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5% 또는 약 3%는 n> 2를 갖는다. 일부 구현예에서, 히드록시프로필 사슬의 10% 미만은 n> 2를 갖는다.

일부 구현예에서, n> 2인 히드록시프로필 사슬의 백분율은 약 5% 내지 약 50%, 예컨대 약 10% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 50%, 약 20% 약 50%, 약 25% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 35% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 45% 내지 약 50%; 약 5% 내지 약 45%, 약 10% 내지 약 45%, 약 15% 내지 약 45%, 약 20% 내지 약 45%, 약 25% 내지 약 45%, 약 30% 내지 약 45%, 약 35% 내지 약 45%, 약 40% 내지 약 45%; 약 5% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 25% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 40%; 약 5% 내지 약 35%, 약 10% 내지 약 35%, 약 15% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 35%, 약 25% 내지 약 35%, 약 30% 내지 약 35%; 예컨대 약 5% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 30%; 예컨대, 약 5% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 25%, 약 15% 내지 약 25%, 약 20% 내지 약 25%; 예컨대 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 20%; 약 5% 내지 약 15%, 약 10% 내지 약 15%; 또는 약 5% 내지 약 10%이다.

일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필 사슬의 평균 수는 약 4 내지 약 6이다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 약 60% 이상, 예컨대 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상 또는 약 97% 이상은 집합적으로, 약 4 내지 약 6의 베타-시클로덱스트린 당 평균 히드록시프로필 사슬 수를 갖는다. 일부 구현예에서, 약 4 내지 약 6의 베타-시클로덱스트린 당 히드록시프로필 사슬의 평균 수를 집합적으로 갖는 베타-시클로덱스트린의 백분율은 약 60 내지 약 97%, 예컨대 약 65% 내지 약 97%, 약 70% 내지 약 97%, 약 75% 내지 약 97%, 약 80% 내지 약 97%, 약 85% 내지 약 97%, 약 90% 내지 약 97%; 예컨대 약 60% 내지 약 95%, 약 65% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 95%, 약 75% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 95%; 예컨대 약 60% 내지 약 90%, 약 65% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 75% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 90%; 예컨대 약 60% 내지 약 85%, 약 65% 내지 약 85%, 약 70% 내지 약 85%, 약 75% 내지 약 85%, 약 80% 내지 약 85%; 예컨대 약 60% 내지 약 80%, 약 65% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 80%; 예컨대 약 60% 내지 약 75%, 약 65% 내지 약 75%, 약 70% 내지 약 75%; 예컨대 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 70%; 또는 예컨대 약 60% 내지 약 65%이다.

6.2.1.2. 치환 지문

6.2.1.2.1. DS-0

전형적인 구현예에서, 전자분무 MS 스펙트럼의 피크 높이에 의해 측정되는 바와 같이, 약학적 활성 성분은 약 2% 미만, 예컨대 약 1.5% 미만, 약 1.4% 미만, 약 1.3% 미만, 약 1.2% 미만, 약 1.1% 미만, 약 1.0% 미만, 약 0.9% 미만, 약 0.8% 미만, 약 0.7% 미만, 약 0.6% 미만, 약 0.5% 미만, 약 0.4% 미만, 약 0.3% 미만, 약 0.2% 미만, 약 0.1% 미만, 약 0.09% 미만, 약 0.08% 미만, 약 0.07% 미만, 약 0.06% 미만 또는 약 0.05% 미만의 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린("DS-0"; "BCD")을 함유한다.

전형적인 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 1% 이하("NMT")는 전자분무 MS 스펙트럼의 피크 높이에 의해 측정되는 바와 같이, 히드록시프로필기로 치환되지 않는다(BCD).

일부 구현예에서, 약학적 활성 성분 중의 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린의 수준은 약 0.05% 내지 약 2%, 예컨대 약 0.05% 내지 약 1.5%, 약 0.05% 내지 약 1.4%, 약 0.05% 내지 약 1.3%, 약 0.05% 내지 약 1.2%, 약 0.05% 내지 약 1.1%, 약 0.05% 내지 약 1.0%, 약 0.05% 내지 약 0.8%, 약 0.05% 내지 약 0.6%, 약 0.05% 내지 약 0.5%, 약 0.05% 내지 약 0.4%, 약 0.05% 내지 약 0.3%, 약 0.05% 내지 약 0.2%, 약 0.05% 내지 약 0.1%, 약 0.05% 내지 약 0.07%, 약 0.07% 내지 약 1.5%, 약 0.07% 내지 약 1.4%, 약 0.07% 내지 약 1.3%, 약 0.07% 내지 약 1.2%, 약 0.07% 내지 약 1.1%, 약 0.07% 내지 약 1.0%, 약 0.07% 내지 약 0.8%, 약 0.07% 내지 약 0.6%, 약 0.07% 내지 약 0.5%, 약 0.07% 내지 약 0.4%, 약 0.07% 내지 약 0.3%, 약 0.07% 내지 약 0.2%, 약 0.07% 내지 약 0.1%, 약 0.1% 내지 약 1.5%, 약 0.1% 내지 약 1.4%, 약 0.1% 내지 약 1.3%, 약 0.1% 내지 약 1.2%, 약 0.1% 내지 약 1.1%, 약 0.1% 내지 약 1.0%, 약 0.1% 내지 약 0.8%, 약 0.1% 내지 약 0.6%, 약 0.1% 내지 약 0.5%, 약 0.1% 내지 약 0.4%, 약 0.1% 내지 약 0.3%, 약 0.1% 내지 약 0.2%, 약 0.2% 내지 약 1.5%, 약 0.2% 내지 약 1.4%, 약 0.2% 내지 약 1.3%, 약 0.2% 내지 약 1.2%, 약 0.2% 내지 약 1.1%, 약 0.2% 내지 약 1.0%, 약 0.2% 내지 약 0.8%, 약 0.2% 내지 약 0.6%, 약 0.2% 내지 약 0.5%, 약 0.2% 내지 약 0.4%, 약 0.2% 내지 약 0.3%, 약 0.3% 내지 약 1.5%, 약 0.3% 내지 약 1.4%, 약 0.3% 내지 약 1.3%, 약 0.3% 내지 약 1.2%, 약 0.3% 내지 약 1.1%, 약 0.3% 내지 약 1.0%, 약 0.3% 내지 약 0.8%, 약 0.3% 내지 약 0.6%, 약 0.3% 내지 약 0.5%, 약 0.3% 내지 약 0.4%, 약 0.4% 내지 약 1.5%, 약 0.4% 내지 약 1.4%, 약 0.4% 내지 약 1.3%, 약 0.4% 내지 약 1.2%, 약 0.4% 내지 약 1.1%, 약 0.4% 내지 약 1.0%, 약 0.4% 내지 약 0.8%, 약 0.4% 내지 약 0.6%, 약 0.4% 내지 약 0.5%, 약 0.5% 내지 약 1.5%, 약 0.5% 내지 약 1.4%, 약 0.5% 내지 약 1.3%, 약 0.5% 내지 약 1.2%, 약 0.5% 내지 약 1.1%, 약 0.5% 내지 약 1.0%, 약 0.5% 내지 약 0.8%, 약 0.5% 내지 약 0.6%, 약 0.6% 내지 약 1.5%, 약 0.6% 내지 약 1.4%, 약 0.6% 내지 약 1.3%, 약 0.6% 내지 약 1.2%, 약 0.6% 내지 약 1.1%, 약 0.6% 내지 약 1.0%, 약 0.6% 내지 약 0.8%, 약 0.8% 내지 약 1.5%, 약 0.8% 내지 약 1.4%, 약 0.8% 내지 약 1.3%, 약 0.8% 내지 약 1.2%, 약 0.8% 내지 약 1.1%, 약 0.8% 내지 약 1.0%, 약 1.0% 내지 약 1.5%, 약 1.0% 내지 약 1.4%, 약 1.0% 내지 약 1.3%, 약 1.0% 내지 약 1.2%, 약 1.0% 내지 약 1.1%, 약 1.1% 내지 약 1.5%, 약 1.1% 내지 약 1.4%, 약 1.1% 내지 약 1.3%, 약 1.1% 내지 약 1.2%, 약 1.2% 내지 약 1.5%, 약 1.2% 내지 약 1.4%, 약 1.2% 내지 약 1.3%, 약 1.3% 내지 약 1.5%, 약 1.3% 내지 약 1.4%, 또는 약 1.4% 내지 약 1.5% 범위이다.

다양한 구현예에서, 조성물은 베타-시클로덱스트린 혼합물의 약 0.01% 이하의 BCD, 약 0.02% 이하의 BCD, 약 0.03% 이하의 BCD, 약 0.04% 이하의 BCD, 또는 약 0.05% 이하의 BCD를 포함한다.

6.2.1.2.2. DS-1

전형적인 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 4% 미만은 전자분무 MS 스펙트럼의 피크 높이에 의해 측정되는 바와 같이, 단지 하나의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-1")이다.

다양한 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 3.9% 미만, 3.8% 미만, 3.7% 미만, 3.6% 미만 또는 3.5% 미만이 DS-1이다. 특정 구현예에서, 약학적 활성 성분은 3.5%, 3.4%, 3.3%, 3.2%, 3.1% 또는 3.0% 미만의 DS-1을 포함한다. 특정 구현예에서, 약학적 활성 성분은 2.9%, 2.8%, 2.7%, 2.6%, 2.5%, 2.4%, 2.3%, 2.2%, 2.1% 또는 2.0% 미만의 DS-1을 포함한다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 분자의 혼합물은 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1% 또는 1.0% 미만의 DS-1을 포함한다. 현재 바람직한 구현예에서, 약학적 활성 성분은 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.1% 미만의 DS-1, 심지어 약 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03% 미만의 DS-1을 포함한다. 특정 바람직한 구현예에서, 조성물은 0.03% 미만, 심지어 0.02% 미만의 DS-1을 포함한다.

현재 바람직한 구현예에서, 조성물은 약 0.05% 미만의 BCD 및 약 0.03% 미만의 DS-1을 포함한다.

6.2.1.2.3. DS-2

다양한 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물은 전자분무 MS 스펙트럼의 피크 높이에 의해 측정된 바와 같이, 2개의 히드록시프로필기로 치환된 낮은 백분율의 베타-시클로덱스트린("DS-2")을 갖는다.

다양한 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 3.9% 미만, 3.8% 미만, 3.7% 미만, 3.6% 미만 또는 3.5% 미만이 DS-2이다. 특정 구현예에서, 약학적 활성 성분은 3.5%, 3.4%, 3.3%, 3.2%, 3.1% 또는 3.0% 미만의 DS-2를 포함한다. 특정 구현예에서, 약학적 활성 성분은 2.9%, 2.8%, 2.7%, 2.6%, 2.5%, 2.4%, 2.3%, 2.2%, 2.1% 또는 2.0% 미만의 DS-2를 포함한다. 일부 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 분자의 혼합물은 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1% 또는 1.0% 미만의 DS-2를 포함한다. 현재 바람직한 구현예에서, 약학적 활성 성분은 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.1% 미만의 DS-2, 심지어 약 0.09% 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03% 미만의 DS-2를 포함한다. 특정 바람직한 구현예에서, 조성물은 0.03% 미만, 심지어 0.02% 미만의 DS-2를 포함한다.

6.2.1.2.4. DS-3

전형적인 구현예에서, 혼합물은 전자분무 MS 스펙트럼의 피크 높이에 의해 측정된 바와 같이, 총 혼합물의 백분율로서 3개의 히드록시프로필 치환을 갖는 10% 이상의 베타-시클로덱스트린 분자("DS-3")를 포함한다. 다양한 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 적어도 20%, 적어도 21%, 적어도 22%, 적어도 23%, 적어도 24%, 또는 적어도 25%가 DS-3이다.

다양한 구현예에서, 혼합물은 총 혼합물의 백분율로서 DS-3의 30% 이하, 예컨대 29% 이하, 28% 이하, 27% 이하, 26% 이하, 25% 이하, 24% 이하, 23% 이하, 22% 이하, 21% 이하, 20% 이하, 19% 이하, 18% 이하, 17% 이하, 16 이하% 또는 15% 이하를 함유한다.

특정 구현예에서, 전체 혼합물 중 DS-3의 백분율은 10% 내지 30%, 예컨대 11% 내지 29%, 12% 내지 28%, 13% 내지 27%, 14% 내지 26%, 15% 내지 25%, 16% 내지 24%, 17% 내지 23%, 18% 내지 22% 또는 19% 내지 21% 범위이다.

다양한 구현예에서, 혼합물은 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24% 또는 약 25% DS-3을 포함한다.

6.2.1.2.5. DS-4

전형적인 구현예에서, 혼합물은 전자분무 MS 스펙트럼의 피크 높이에 의해 측정된 바와 같이, 총 혼합물의 백분율로서 4개의 히드록시프로필 치환체를 갖는 20% 이상의 베타-시클로덱스트린 분자("DS-4")를 포함한다. 다양한 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 적어도 21%, 적어도 22%, 적어도 23%, 적어도 24%, 적어도 25%, 적어도 26%, 적어도 27%, 적어도 28%, 적어도 29%, 적어도 30%, 적어도 31%, 적어도 32%, 적어도 33%, 적어도 34%, 또는 적어도 35%가 DS-4이다.

다양한 구현예에서, 혼합물은 총 혼합물의 백분율로서 DS-4의 40% 이하, 예컨대 39% 이하, 38% 이하, 37% 이하, 36% 이하, 35% 이하, 34% 이하, 33% 이하, 32% 이하, 31% 이하, 30% 이하, 29% 이하, 28% 이하, 27% 이하, 26 이하% 또는 25% 이하를 포함한다.

특정 구현예에서, 전체 혼합물 중 DS-4의 백분율은 20% 내지 40%, 예컨대 21% 내지 39%, 22% 내지 38%, 23% 내지 37%, 24% 내지 36%, 25% 내지 35%, 26% 내지 34%, 27% 내지 33%, 28% 내지 32% 또는 29% 내지 31%이다.

다양한 구현예에서, 혼합물은 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34% 또는 약 35% DS-4를 포함한다.

6.2.1.2.6. DS-5

전형적인 구현예에서, 혼합물은 전자분무 MS 스펙트럼의 피크 높이에 의해 측정된 바와 같이, 총 혼합물의 백분율로서 5개의 히드록시프로필 치환을 갖는 15% 이상의 베타-시클로덱스트린 분자("DS-5")를 포함한다. 다양한 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 적어도 20%, 적어도 21%, 적어도 22%, 적어도 23%, 적어도 24%, 적어도 25%, 적어도 26%, 적어도 27%, 적어도 28%, 적어도 29%, 또는 적어도 30%가 DS-5이다.

다양한 구현예에서, 혼합물은 총 혼합물의 백분율로서, DS-5의 35% 이하, 예컨대 34% 이하, 33% 이하, 32% 이하, 31% 이하, 30% 이하, 29% 이하, 28% 이하, 27% 이하, 26% 이하, 25% 이하, 24% 이하, 23% 이하, 22% 이하, 21 이하% 또는 20% 이하를 포함한다.

특정 구현예에서, 전체 혼합물 중 DS-5의 비율은 15% 내지 35%, 예컨대 16% 내지 34%, 17% 내지 33%, 18% 내지 32%, 19% 내지 31%, 20% 내지 30%, 21% 내지 29%, 22% 내지 28%, 23% 내지 27% 또는 24% 내지 26%의 범위이다.

다양한 구현예에서, 혼합물은 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29% 또는 약 30% DS-5를 포함한다.

6.2.1.2.7. DS-6

전형적인 구현예에서, 혼합물은 전자분무 MS 스펙트럼의 피크 높이에 의해 측정된 바와 같이 총 혼합물의 백분율로서 6개의 히드록시프로필 치환을 갖는 5% 이상의 베타-시클로덱스트린 분자("DS-6")를 포함한다. 다양한 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 또는 적어도 20%가 DS-6이다.

다양한 구현예에서, 혼합물은 총 혼합물의 비율로서 DS-6의 25% 이하, 예컨대 24% 이하, 23% 이하, 22% 이하, 21% 이하, 20% 이하, 19% 이하, 18% 이하, 17% 이하, 16% 이하, 15% 이하, 14% 이하, 13% 이하, 12% 이하, 11 이하% 또는 10% 이하를 함유한다.

특정 구현예에서, 전체 혼합물 중 DS-6의 비율은 5% 내지 25%, 예를 들어 6% 내지 24%, 7% 내지 23%, 8% 내지 22%, 9% 내지 21%, 10% 내지 20%, 11% 내지 19%, 12% 내지 18%, 13% 내지 17% 또는 14% 내지 16%의 범위이다.

다양한 구현예에서, 혼합물은 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16% 또는 약 17% DS-6를 포함한다.

6.2.1.2.8. DS-7

전형적인 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 10% 미만은 전자분무 MS 스펙트럼의 피크 높이에 의해 측정된 바와 같이 총 혼합물의 백분율로서 7개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-7")이다. 다양한 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만은 DS-7이다.

특정 구현예에서, 전체 혼합물 중 DS-7의 비율은 1% 내지 10%, 예컨대 2% 내지 9%, 3% 내지 8%, 4% 내지 7%, 또는 5% 내지 6%의 범위이다.

다양한 구현예에서, 혼합물은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2% 또는 약 1% DS-7을 포함한다.

6.2.1.2.9. DS-8

전형적인 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물은 전자분무 MS 스펙트럼의 피크 높이에 의해 측정된 바와 같이, 총 혼합물의 백분율로서 8개의 히드록시프로필기로 치환된 2% 미만의 베타-시클로덱스트린("DS-8")을 포함한다. 다양한 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 1.5% 미만, 1.4% 미만, 1.3% 미만, 1.2% 미만, 1.1% 미만, 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 0.09% 미만, 0.08% 미만, 0.07% 미만, 0.06% 미만 0.05% 미만, 0.04% 미만, 0.03% 미만, 0.02% 미만 또는 0.01% 미만이 DS-8이다.

특정 구현예에서, 전체 혼합물 중 DS-8의 백분율은 0.01% 내지 2%, 예컨대 0.02% 내지 1.9%, 0.03% 내지 1.8%, 0.04% 내지 1.7%, 0.05% 내지 1.6%, 0.06% 내지 1.5%, 0.07% 내지 1.4%, 0.08% 내지 1.3%, 0.09% 내지 1.2%, 0.1% 내지 1.1%, 0.2% 내지 1%, 0.3% 내지 0.9%, 0.4% 내지 0.8%, 또는 0.5 내지 0.7%이다.

다양한 구현예에서, 혼합물은 약 1.5%, 약 1.4%, 약 1.3%, 약 1.2%, 약 1.1%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 약 0.1%, 약 0.09%, 약 0.08%, 약 0.07%, 약 0.06%, 약 0.05%, 약 0.04%, 약 0.03%, 약 0.02%, 또는 약 0.01% DS-8을 포함한다.

6.2.1.2.10. DS-9

전형적인 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 1% 이하는 전자분무 MS 스펙트럼에 의해 측정된 바와 같이, 전체 혼합물의 백분율로서, 9개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-9")이다. 다양한 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 0.9% 이하, 0.8% 이하, 0.7% 이하, 0.6% 이하, 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.2 이하 0.1% 이하, 0.09% 이하, 0.08% 이하, 0.07% 이하, 0.06% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.03% 이하, 0.02% 이하 또는 0.01% 이하가 DS-9이다.

6.2.1.2.11. DS-10

전형적인 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물의 1% 이하는 전자분무 MS 스펙트럼에 의해 측정된 바와 같이, 전체 혼합물의 백분율로서, 10개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-10")이다. 다양한 구현예에서, 베타-시클로덱스트린의 0.9% 이하, 0.8% 이하, 0.7% 이하, 0.6% 이하, 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.2% 이하, 0.1% 이하, 0.09% 이하, 0.08% 이하, 0.07% 이하, 0.06% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.03% 이하, 0.02% 이하 또는 0.01% 이하가 DS-10이다.

6.2.1.2.12. 프로필

다양한 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물은 전체 혼합물의 백분율로서 집합적으로 총 75% 이상의 DS-3, DS-4, DS-5 및 DS-6을 함유한다. 특정 구현예에서, 혼합물 중 베타-시클로덱스트린의 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 또는 적어도 98%는 집합적으로 DS-3, DS-4, DS-5 및 DS-6이다.

다양한 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물은 전체 혼합물의 백분율로서 약 75% 내지 약 98%, 약 76% 내지 약 97%, 약 77% 내지 약 96%, 약 78% 내지 약 95%, 약 79% 내지 약 94%, 약 80% 내지 약 93%, 약 81% 내지 약 92%, 약 82% 내지 약 91%, 약 83% 내지 약 90%, 약 84% 내지 약 89%, 약 85% 내지 약 88%, 또는 약 86% 내지 약 87% 범위의 DS-3, DS-4, DS-5 및 DS-6을 집합적으로 포함한다.

전형적인 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물은 전체 혼합물의 백분율로서 집합적으로 총 25% 이상의 DS-5 및 DS-6를 포함한다. 특정 구현예에서, 혼합물 중의 베타-시클로덱스트린의 적어도 26%, 적어도 27%, 적어도 28%, 적어도 29%, 적어도 30%, 적어도 31%, 적어도 32%, 적어도 33%, 적어도 34%, 적어도 35%, 적어도 36%, 적어도 37%, 적어도 38%, 적어도 39%, 적어도 40%, 적어도 41%, 적어도 42%, 적어도 43%, 적어도 44%, 적어도 45%, 적어도 46%, 적어도 47%, 적어도 48%, 적어도 49% 또는 적어도 50%는 DS-5 및 DS-6이다.

다양한 구현예에서, 베타-시클로덱스트린 혼합물은 전체 혼합물의 백분율로서 집합적으로 약 25% 내지 약 50% 범위, 예컨대 약 26% 내지 약 49%, 약 27 중량% 내지 약 48 중량%, 약 28 중량% 내지 약 47 중량%, 약 29 중량% 내지 약 46 중량%, 약 30 중량% 내지 약 45 중량%, 약 31 중량% 내지 약 44 중량%, 약 32 중량% 내지 약 43 중량%, 약 33% 내지 약 42%, 약 34% 내지 약 41%, 약 35% 내지 약 40%, 약 36% 내지 약 39% 또는 약 37% 내지 약 38% 범위의 DS-5 및 DS-6을 포함한다.

다양한 구현예에서, 전체 혼합물의 백분율로서 가장 큰 유병율을 갖는 베타-시클로덱스트린 종은 DS-4이다.

6.2.1.3. 시작 물질

특정 구현예에서, 본 발명은 Kleptose® HBP, Kleptose® HP, Trappsol® Cyclo 및 Cavasol® W7 HP Pharma로부터 선택되는 하나 이상의 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 제품을 정제함으로써 단일의 약학적 활성 성분이 수득되는 약학적 조성물을 기술한다.

Kleptose® HBP 및 Kleptose® HP는 프랑스, Lestrem 소재의 Roquette Pharma로부터 입수할 수 있는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 제품이다. Kleptose® HBP는 DS_a가 약 4.3인 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 비경구용 내독소-조절된 조성물이다. Kleptose® HP는 Kleptose® HBP보다 높은 DS_a를 갖는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 내독소-조절된 조성물이다. Trappsol® Cyclo는 DS_a가 약 6.37인 비경구용 히드록시프로필 베타 시클로덱스트린이며, CTD Holdings, Inc., Alachua, Florida, USA의 한 부분인 Sphingo Biotechnology, Inc.에서 분말 또는 멸균액 형태로 사용가능하다. Cavasol® W7 HP Pharma는 독일 Munchen 소재의 Wacker Chemie AG에서 입수할 수 있는 약 4.1 내지 약 5.1의 DS_a, 예를 들어 약 4.5의 DS_a를 갖는 약학용 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린이다.

예시적인 예에서, 약학적 조성물은 Kleptose® HBP를 정제함으로써 유일한 약학적 활성 성분이 수득되는 조성물이다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 친수성 상호 작용, 예를 들어 HPLC 정제 또는 친화도 정제, 예를 들어 친화도 크로마토그래피에 의해 Kleptose® HBP(Roquette)를 정제함으로써 유일한 약학적 활성 성분이 수득된 것이다. 다양한 구현예에서, 약학적 활성 성분은 본원의 실시예 6, 7 및 9에 기술된 과정들 중 하나 이상에 의해 Kleptose® HBP(Roquette)를 정제함으로써 수득된다.

다양한 구현예에서, 정제는 증가된 활성, 예를 들어 에스테르화되지 않은 콜레스테롤에 대한 증가된 활성을 갖는 Kleptose® HBP의 일부분 또는 분획을 제공한다.

다른 구현예에서, 약학적 조성물은 친수성 상호 작용, 예를 들어 HPLC 정제 또는 친화도 정제, 예를 들어, 친화도 크로마토그래피에 의해 Trappsol® Cyclo(CTD)를 정제함으로써 유일한 약학적 활성 성분이 수득된 것이다. 다양한 구현예에서, 약학적 활성 성분은 본원의 실시예 6, 7 및 9에 기술된 과정 중 하나 이상을 사용하여 알루미나 상에서 흡수 크로마토그래피로 Trappsol® Cyclo를 정제함으로써 수득된다.

일부 구현예에서, Trappsol® Cyclo(CTD)로부터 정제된 약학적 조성물은 하나 이상의 히드록실 위치에서 히드록시프로필기에 의해 치환된 베타-시클로덱스트린 분자의 혼합물을 포함하고, 상기 혼합물은 선택적으로, 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린 분자 및, 뇌척수강내, 뇌실내 또는 정맥내 투여를 위해 약학적으로 허용가능한 희석제를 포함한다. 상기 조성물은 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 개시된 HPLC 방법으로 측정한 바와 같이, 베타-시클로덱스트린 혼합물 1g 당 내독소 5 EU 이하("NMT"), 프로필렌 글리콜 0.5% 이하, 및 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 따라 측정된 1 ppm 이하 프로필렌 옥사이드를 포함한다.

일부 구현예에서, Trappsol® Cyclo(CTD)로부터 정제된 약학적 조성물은 베타-시클로덱스트린 혼합물 1 g 당 내독소 1.5 EU NMT를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 개시된 HPLC 방법으로 측정한 바와 같이, 0.01% 이하의 프로필렌 글리콜을 포함한다.

특정 구현예에서, Trappsol® Cyclo(CTD)로부터 정제된 약학적 활성 성분은 전자분무 MS 스펙트럼의 피크 높이에 의해 측정된 바와 같이, 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린("DS-0"), 1개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-1") 및 2개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-2")을 합하여 5% 미만, 예컨대 4.5% 미만, 4% 미만, 3.5% 미만, 3% 미만, 2.5% 미만, 2% 미만, 1.5% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만 또는 0.1% 미만을 포함한다.

특정 구현예에서, Trappsol® Cyclo(CTD)로부터 정제된 약학적 활성 성분은 전자분무 MS 스펙트럼의 피크 높이에 의해 측정된 바와 같이, 5개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-5"), 6개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-6") 및 7개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린('DS-7")을 합하여 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상 또는 90% 이상을 포함한다.

특정 구현예에서, Trappsol® Cyclo(CTD)로부터 정제된 약학적 활성 성분은 전자분무 MS 스펙트럼의 피크 높이에 의해 측정된 바와 같이, 9개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-9") 및 10개의 히드록시프로필로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-10")을 합하여 5% 미만, 예컨대 4.5% 미만, 4% 미만, 3.5% 미만, 3% 미만, 2.5% 미만, 2% 미만, 1.5% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만 또는 0.1% 미만을 포함한다.

또다른 구현예에서, 약학적 조성물은 Cavasol® W7 HP를 친수성 상호 작용, 예를 들어 HPLC 정제 또는 친화도 정제, 예를 들어 친화도 크로마토그래피에 의해 정제함으로써 유일한 약학적 활성 성분이 수득된 것이다. 다양한 구현예에서, 약학적 활성 성분은 본원의 실시예 6, 7 및 9에 기술된 하나 이상의 과정에 의해 Cavasol® W7 HP를 정제함으로써 수득된다.

특정 구현예에서, Kleptose® HBP, Kleptose® HP, Trappsol® Cyclo, 및 Cavasol® W7 HP Pharma로부터 선택된 하나 이상의 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 제품을 정제하는 방법은 복합체 형성, 침전 및 흡착 크로마토그래피 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 정제는 하나의 방법, 예를 들어 흡착 크로마토그래피를 포함한다. 일부 구현예에서, 정제는 둘 이상의 방법, 예를 들어 흡착 크로마토그래피와 조합한 침전을 포함한다. 정제가 조합되어 사용되는 둘 이상의 방법을 포함하는 경우, 상기 방법은 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 제품을 정제하기 위해 임의의 순서로 조합될 수 있다. 예시적인 예에서, Kleptose® HBP 또는 Trappsol® Cyclo를 먼저 흡착 크로마토그래피에 적용한 다음, 크로마토그래피 단계로부터의 하나 이상의 선택된 분획을 침전 용매 시스템으로부터 용매 침전시켜 추가의 정제를 수행할 수 있다. 다른 예로서, Kleptose® HBP는 우선 침전 용매 시스템에서 용매 침전을 거친 다음, 침전물을 흡착 크로마토그래피에 적용하여 추가 정화를 수행할 수 있다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 제품, 예를 들어 Kleptose® HBP 또는 Trappsol® Cyclo의 정제는 치환되지 않은(DS=0) 및/또는 단일치환된(DS=1) 베타-시클로덱스트린의 제거로 인해 DS_a를 증가시킨다. 예시적인 예에서, DS_a=4.34를 갖는 Kleptose® HBP의 상업용 샘플은 0.6%의 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린(DS=0) 및 3.68%의 단일 치환된 베타-시클로덱스트린(DS=1)을 함유한다. DS=0 및 DS=1 종을 제거한 후의 DS_a는 하기 수학식을 사용하여 계산할 수 있다:

x(0) + y(1) + z(DS_a) = 4.34

x + y + z = 1

상기 식에서, x = 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린의 분획; y = 단일 치환된 베타-시클로덱스트린의 분획; z = DS≥≥2인 베타-시클로덱스트린의 분획이다. 이 경우, DS=0 및 DS=1인 베타-시클로덱스트린 제거 후 생성된 샘플의 DS_a는 4.5이다.

따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 Kleptose® HBP, Kleptose® HP, Trappsol® Cyclo, 및 Cavasol® W7 HP Pharma, 특히 Kleptose® HBP 또는 Trappsol® Cyclo로부터 선택되는 하나 이상의 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 제품을 정제하는 방법을 제공하며, 상기 정제 방법은 프로필렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜 올리고머의 양(예를 들어, 용매 침전에 의함) 및/또는 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린(DS=0)의 양 및/또는 단일 치환된 베타-시클로덱스트린(DS=1)(예를 들어, 흡착 크로마토그래피에 의함)의 양을 감소시킨다. 생성물 내 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린(DS=0)의 양 및/또는 단일 치환된 베타-시클로덱스트린(DS=1)의 양이 감소된 상기 특정 구현예에서, 정제된 생성물은 증가된 DS_a를 나타낸다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 Kleptose® HBP, Kleptose® HP, Trappsol® Cyclo, 및 Cavasol® W7 HP Pharma, 특히 Kleptose® HBP 또는 Trappsol® Cyclo로부터 선택되는 하나 이상의 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 제품의 DS_a를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 예를 들어, 본원에 기술된 하나 이상의 정제 단계, 예컨대 흡착 크로마토그래피에 따라, 생성물 내 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린(DS=0) 및/또는 단일 치환된 베타-시클로덱스트린(DS=1)의 양을 감소시키는 단계를 포함한다.

상기 논의된 바와 같이 Kleptose® HBP, Kleptose® HP, Trappsol® Cyclo 및 Cavasol® W7 HP Pharma가 각각 보고된 DS_a를 가졌지만, DS_a는 평균치이며, 따라서 이들 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 제품 각각은 다양한 DS 값을 갖는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 활성 성분은 본원에 기술된 DS_a를 갖는 하나 이상의 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 분획 중 하나 이상으로부터 상기 제품을 분리함으로써 수득된다.

6.2.2. 내독소 수준

특정 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 낮은 수준의 세균성 내독소를 함유한다. 낮은 수준의 세균성 내독소는 개시된 약학적 조성물이 보다 높은 수준의 내독소를 갖는 다른 조성물로 안전하게 수행될 수 있는 것보다 더 긴 기간동안 및 더 높은 수준으로, 특정 경로, 예를 들어 뇌척수강내 또는 뇌실내 투여를 통해 투여될 수 있게 한다.

본원에 사용된 바와 같이, "IU"는 미국 약전(USP) 내독소 단위("EU")로도 알려진 세균성 내독소의 국제 단위를 지칭한다. 조성물내 세균성 내독소(IU; 동의어로 EU)의 수준은 "<85> Bacterial Endotoxins Test," the United States Pharmacopeial Convention, Interim Revision Announcement dated April 1, 2011 ("USP Endotoxin Monograph")에 개시된 과정에 따라, 투구게 변형세포 용해물 테스트에 의해 측정되며, 이는 본원에 참고문헌으로 통합된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 약학적 활성 성분 1 g 당 약 10 IU 미만, 예를 들어 약 6 IU, 약 5 IU, 약 4 IU, 약 3 IU, 약 2 IU, 약 1.5 IU, 약 1.2 IU, 약 1 IU, 약 0.8 IU, 약 0.6 IU, 약 0.5 IU, 약 0.4 IU, 약 0.3 IU, 약 0.2 IU, 약 0.1 IU, 약 0.07 IU 또는 약 0.05 IU 미만의 내독소를 함유한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 베타-시클로덱스트린 혼합물 1 g 당 약 0.05 IU 내지 약 10 IU, 예를 들어 약 0.05 IU 내지 약 6 IU, 약 0.05 IU 내지 약 5 IU, 약 0.05 IU 내지 약 4 IU, 약 0.05 IU 내지 약 3 IU, 약 0.05 IU 내지 약 2 IU, 약 0.05 IU 내지 약 1.5 IU, 약 0.05 IU 내지 약 1.2 IU, 약 0.05 IU 내지 약 1 IU, 약 0.05 IU 내지 약 0.8 IU, 약 0.05 IU 내지 약 0.6 IU, 약 0.05 IU 내지 약 0.5 IU, 약 0.05 IU 내지 약 0.4 IU, 약 0.05 IU 내지 약 0.3 IU, 약 0.05 IU 내지 약 0.2 IU, 또는 약 0.05 IU 내지 약 0.1 IU 내독소의 범위의 세균성 내독소의 수준을 함유한다.

특정 구현예에서, 약학적 조성물은 베타-시클로덱스트린 혼합물 g 당 5 이하("NMT")의 EU, 베타-시클로덱스트린 혼합물 g 당 4 NMT의 EU, 베타-시클로덱스트린 혼합물 g 당 3 NMT의 EU, 또는 베타-시클로덱스트린 혼합물 g 당 2 NMT의 EU를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은 1.5 EU/g NMT의 베타-시클로덱스트린 혼합물을 포함한다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 베타-시클로덱스트린 혼합물 g 당 1.4 NMT의 EU, 베타-시클로덱스트린 혼합물 g 당 1.3 NMT의 EU, 베타-시클로덱스트린 혼합물 g 당 1.2 NMT의 EU, 베타-시클로덱스트린 혼합물 g 당 1.1 NMT의 EU 또는 베타-시클로덱스트린 혼합물 g 당 1.0 NMT의 EU를 포함한다.

6.2.3. 공정 불순물

히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 혼합물을 포함하는 약학적 조성물은 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 합성으로 인해 발생하는 불순물을 함유할 수 있다. 이러한 불순물은 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린 및 프로필렌 옥사이드와 같은 미반응 시작 물질 및 프로필렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜 올리고머와 같은 반응 부산물을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 이러한 불순물 중 하나 이상이 감소된 수준을 나타낸다.

6.2.3.1. 프로필렌 글리콜

일부 구현예에서, 약학적 활성 성분은 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 따라 측정된, 약 1% 미만, 예컨대 약 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6% 또는 0.5% 미만의 프로필렌 글리콜을 포함한다. 다양한 구현예에서, 약학적 활성 성분은 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 따라 측정된, 약 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.1% 미만의 프로필렌 글리콜을 포함한다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 따라 측정된, 약 0.09% 미만, 0.08% 미만, 0.07% 미만 또는 약 0.05% 미만의 프로필렌 글리콜을 포함한다. 현재 바람직한 구현예에서, 약학적 활성 성분은 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 따라 측정된, 0.5% 이하의 프로필렌 글리콜을 포함한다.

일부 구현예에서, 약학적 활성 성분은 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 따라 측정된, 약 0.05% 내지 약 1%, 예컨대 약 0.05% 내지 약 0.8%, 약 0.05% 내지 약 0.6%, 약 0.05% 내지 약 0.5%, 약 0.05% 내지 약 0.4%, 약 0.05% 내지 약 0.3%, 약 0.05% 내지 약 0.2%, 약 0.05% 내지 약 0.1%, 약 0.05% 내지 약 0.07%, 약 0.07% 내지 약 1%, 약 0.07% 내지 약 0.8 중량%, 약 0.07 중량% 내지 약 0.6 중량%, 약 0.07 중량% 내지 약 0.5 중량%, 약 0.07 중량% 내지 약 0.4 중량%, 약 0.07 중량% 내지 약 0.3 중량%, 약 0.07 중량% 내지 약 0.2 중량%, 약 0.07 중량% 내지 약 0.1%, 약 0.1% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 0.8%, 약 0.1% 내지 약 0.6%, 약 0.1% 내지 약 0.5%, 약 0.1% 내지 약 0.4%, 약 0.1% 내지 약 0.3%, 약 0.1% 내지 약 0.2%, 약 0.2% 내지 약 1%, 약 0.2% 내지 약 0.8%, 약 0.2% 내지 약 0.6%, 약 0.2% 내지 약 0.5%, 약 0.2% 내지 약 0.4%, 약 0.2% 내지 약 0.3%, 약 0.3% 내지 약 1%, 약 0.3% 내지 약 0.8%, 약 0.3% 내지 약 0.6%, 약 0.3% 내지 약 0.5%, 약 0.3% 내지 약 0.4%, 약 0.4% 내지 약 1%, 약 0.4% 내지 약 0.8%, 약 0.4% 내지 약 0.6%, 약 0.4% 내지 약 0.5%, 약 0.5% 내지 약 1%, 약 0.5% 내지 약 0.8%, 약 0.5% 내지 약 0.6%, 약 0.6% 내지 약 1%, 약 0.6% 내지 약 0.8%, 또는 약 0.8% 내지 약 1.0%의 프로필렌 글리콜을 포함한다.

일부의 구현예에 있어서, 약학적 활성 성분은 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 따라 측정된, 약 0.01% 미만의 프로필렌 글리콜 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 활성 성분은 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 따라 측정된, 약 0.2% 미만의 프로필렌 글리콜 이량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적으로 활성인 성분은 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 따라 측정된, 약 0.2% 미만의 프로필렌 글리콜 삼량체를 포함한다.

6.2.3.2. 프로필렌 산화물

일부 구현예에서, 약학적 활성 성분은 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 따라 측정된, 약 1 ppm 미만, 예컨대 약 0.8 ppm 미만, 약 0.6 ppm 미만, 약 0.5 ppm 미만, 약 0.4 ppm 미만, 약 0.3 ppm 미만, 약 0.2 ppm 미만, 약 0.1 ppm 미만, 약 0.07 ppm 미만, 또는 약 0.05 ppm 미만의 프로필렌 옥사이드를 함유한다. 예를 들어, 약학적 활성 성분은 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 따라 측정된, 약 1, 약 0.8, 약 0.6, 약 0.5, 약 0.4, 약 0.3, 약 0.2, 약 0.1, 약 0.07 또는 약 0.05 ppm의 프로필렌 옥사이드를 가질 수 있다.

일부 구현예에서, 약학적 활성 성분은 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 따라 측정된, 약 0.05 내지 약 1 ppm, 예컨대 약 0.05 내지 약 0.8, 약 0.05 내지 약 0.6, 약 0.05 내지 약 0.5, 약 0.05 내지 약 0.4, 0.05 내지 약 0.3, 0.05 내지 약 0.2, 약 0.05 내지 약 0.1, 약 0.1 내지 약 1, 약 0.1 내지 약 0.8, 약 0.1 내지 약 0.6, 약 0.1 내지 약 0.5, 약 0.1 내지 약 0.4, 약 0.1 내지 약 0.3, 약 0.1 내지 약 0.2, 약 0.2 내지 약 1, 약 0.2 내지 약 0.8, 약 0.2 내지 약 0.6, 약 0.2 내지 약 0.5, 약 0.2 내지 약 0.4, 약 0.2 내지 약 0.3, 약 0.3 내지 약 1, 약 0.3 내지 약 0.8, 약 0.3 내지 약 0.6, 약 0.3 내지 약 0.5, 약 0.3 내지 약 0.4, 약 0.4 내지 약 1, 약 0.4 내지 약 0.8, 약 0.4 내지 약 0.6, 약 0.4 내지 약 0.5, 약 0.5 내지 약 1, 약 0.5 내지 약 0.8, 약 0.5 내지 약 0.6, 약 0.6 내지 약 1, 약 0.6 내지 약 0.8, 또는 약 0.8 내지 약 1 ppm의 범위의 프로필렌 옥사이드의 양을 갖는다.

6.2.4. 기타 조성 특성

본 발명의 약학적 활성 성분 및, 선택적으로, 하나 이상의 부가적인 치료제, 예컨대 섹션 4.3.3에 기술된 복합 치료제를 포함하는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 조성물이 본원에 제공된다.

특정 구현예에서, 약학적 조성물은 약 100 mg 내지 약 2000 mg, 예컨대 약 100 내지 약 1800, 약 100 내지 약 1600, 약 100 내지 약 1500, 약 100 내지 약 1200, 약 100 내지 약 1000, 약 100 내지 약 800, 약 100 내지 약 600, 약 100 내지 약 500, 약 100 내지 약 400, 약 100 내지 약 300, 약 100 내지 약 200, 약 200 내지 약 2000, 약 200 내지 약 1800, 약 200 내지 약 1600, 약 200 내지 약 1500, 약 200 내지 약 1200, 약 200 내지 약 1000, 약 200 내지 약 800, 약 200 내지 약 600, 약 200 내지 약 500, 약 200 내지 약 400, 약 200 내지 약 300, 약 300 내지 약 2000, 약 300 내지 약 1800, 약 300 내지 약 1600, 약 300 내지 약 1500, 약 300 내지 약 1200, 약 300 내지 약 1000, 약 300 내지 약 800, 약 300 내지 약 600, 약 300 내지 약 500, 약 300 내지 약 400, 약 400 내지 약 2000, 약 400 내지 약 1800, 약 400 내지 약 1600, 약 400 내지 약 1500, 약 400 내지 약 1200, 약 400 내지 약 1000, 약 400 내지 약 800, 약 400 내지 약 600, 약 400 내지 약 500, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1800, 약 500 내지 약 1600, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1200, 약 500 내지 약 1000, 약 500 내지 약 800, 약 500 내지 약 600, 약 600 내지 약 2000, 약 600 내지 약 1800, 약 600 내지 약 1600, 약 600 내지 약 1500, 약 600 내지 약 1200, 약 600 내지 약 1000, 약 600 내지 약 800, 약 800 내지 약 2000, 약 800 내지 약 1800, 약 800 내지 약 1600, 약 800 내지 약 1500, 약 800 내지 약 1200, 또는 약 800 내지 약 1000 mg의 약학적 활성 성분을 포함한다. 예를 들어, 약학적 조성물은 약 100, 약 200, 약 300, 약 400, 약 500, 약 600, 약 800, 약 1000, 약 1200, 약 1400, 약 1500, 약 1600, 약 1800 또는 약 2000 mg의 약학적 활성 성분을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 투여용 약학적 조성물, 예를 들어, 뇌척수강내 투여에 적합한 약학적 조성물은 약 10 내지 약 200 mg/mL, 예컨대 약 10 내지 약 180, 약 10 내지 약 150, 약 10 내지 약 120, 약 10 내지 약 100, 약 10 내지 약 80, 약 10 내지 약 60, 약 10 내지 약 50, 약 10 내지 약 40, 약 10 내지 약 30, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 200, 약 20 내지 약 180, 약 20 내지 약 150, 약 20 내지 약 120, 약 20 내지 약 100, 약 20 내지 약 80, 약 20 내지 약 60, 약 20 내지 약 50, 약 20 내지 약 40, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 200, 약 30 내지 약 180, 약 30 내지 약 150, 약 30 내지 약 120, 약 30 내지 약 100, 약 30 내지 약 80, 약 30 내지 약 60, 약 30 내지 약 50, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 200, 약 40 내지 약 180, 약 40 내지 약 150, 약 40 내지 약 120, 약 40 내지 약 100, 약 40 내지 약 80, 약 40 내지 약 60, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 200, 약 50 내지 약 180, 약 50 내지 약 150, 약 50 내지 약 120, 약 50 내지 약 100, 약 50 내지 약 80, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 200, 약 60 내지 약 180, 약 60 내지 약 150, 약 60 내지 약 120, 약 60 내지 약 100, 약 60 내지 약 80, 약 80 내지 약 200, 약 80 내지 약 180, 약 80 내지 약 150, 약 80 내지 약 120, 약 80 내지 약 100, 약 100 내지 약 200, 약 100 내지 약 180, 약 100 내지 약 150, 약 100 내지 약 120, 약 120 내지 약 200, 약 120 내지 약 180, 약 120 내지 약 150, 약 150 내지 약 200, 약 150 내지 약 180, 또는 약 180 내지 약 200 mg/mL의 약학적 활성 성분을 갖는다. 예를 들어, 약학적 조성물은 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190 또는 약 200 mg/mL의 약학적 활성 성분의 농도를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 뇌척수강내 투여용 약학적 조성물은 약 200 mg/mL의 약학적 활성 성분의 농도를 갖는다.

특정 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 동물에게 투여될 때 낮은 수준의 내이신경 독성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 Trappsol® Cyclo보다 낮은 독성을 나타낸다. 이 독성은 House Ear Institute of Corti 1(HEI-OC1) 세포내 독성에 의해 생체외에서, 또는 마우스, 래트, 고양이, 개, 원숭이, 침팬지, 또는 인간과 같은 동물의 뇌간 청각 유발반응(brainstem auditory evoked response)에 의해 생체내에서 평가될 수 있다. 예를 들어, Leigh-Paffenroth, E. et al. "Objective Measures of Ototoxicity," Sept. 2005, vol. 9, No. 1, pages 10-16, in Perspectives on Hearing and Hearing Disorders: Research and Diagnostics, Special Interest Division 6 of the American Speech-Language-Hearing Association을 참조하며, 이는 본원에 참고문헌으로 전문통합된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물, 예를 들어, 뇌척수강내 투여에 적합한 약학적 조성물은 약 300 내지 약 450 mOsm/kg, 예를 들어, 약 300 내지 약 400, 약 300 내지 약 350, 약 350 내지 약 450, 또는 약 350 내지 약 400 mOsm/kg 범위의 삼투질농도를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 300, 약 320, 약 350, 약 380, 약 400, 약 420 또는 약 450 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는다.

본원에 기술된 바와 같은 약학적 조성물, 예를 들어 뇌척수강내 또는 뇌실래 투여에 적합한 약학적 조성물에 적합한 희석제는 등장성 염수 용액을 포함한다. 뇌척수강내 투여에 적합한 약학적 조성물과 같은 조성물은 Elliotts B® 용액(Lukare Medical, LLC, Scotch Plains, New Jersey, USA로부터의 완충된 뇌척수강 전해질/덱스트로스 주사)으로 희석될 수 있다.

일부 구현예에서, 주사용 약학적 조성물은 활성 약학적 성분(베타-시클로덱스트린 분자의 혼합물)을 물에 용해시키고, 0.9% w/v로 염화나트륨을 첨가하고, 0.01N 수산화 나트륨에 의해 필요에 따라 pH를 6.0-8.0으로 조정함으로써 제조된다. 그후, 약학적 조성물을 바이알에 멸균 여과하고 오토클레이브한다. 제품은 안정적이며, 15-25℃에서 보관할 수 있다.

조성물은 통상적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 통상 포함하는 멸균된 약학적 조성물의 일부로서 공급될 것이다. 이 조성물은 (원하는 투여 방법에 따라 다른) 임의의 적합한 형태일 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물은 수용액으로 제제화될 수 있고, 뇌척수강내 주사 또는 뇌척수강내 주입에 의해 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 투여량 당 본 발명의 약학적 활성 성분의 양을 함유하는 단위 투여 형태를 포함한다. 이러한 단위는 예를 들어 제한없이, 약 5 mg 내지 약 5 g, 예를 들어 5 mg 내지 약 4 g, 5 mg 내지 약 3 g, 5 mg 내지 약 2 g, 5 mg 내지 약 1 g, 약 50 mg 내지 약 5 g, 약 50 mg 내지 약 4 g, 약 50 mg 내지 약 3 g, 약 50 mg 내지 약 2 g, 약 50 mg 내지 약 1 g, 약 200 mg 내지 약 5 g, 약 200 g 내지 약 4 g, 약 200 g 내지 약 3 g, 약 200 mg 내지 약 2 g, 약 200 mg 내지 약 1 g, 약 400 mg 내지 약 5 g, 약 400 mg 내지 약 4 g, 약 400 mg 내지 약 3g, 약 400mg 내지 약 2g, 약 400mg 내지 약 1g, 약 500mg 내지 약 5g, 약 500mg 내지 약 4g, 약 500mg 내지 약 3g, 약 500mg 내지 약 2g, 약 500mg 내지 약 1g, 약 600 ㎎ 내지 약 5 g, 약 600 ㎎ 내지 약 4 g, 약 600 ㎎ 내지 약 3 g, 약 600 ㎎ 내지 약 2 g, 약 600 ㎎ 내지 약 1 g, 약 800 ㎎ 내지 약 5 g, 약 800 mg 내지 약 4 g, 약 800 mg 내지 약 3 g, 약 800 mg 내지 약 2 g, 약 800 mg 내지 약 1 g, 약 1 g 내지 약 5 g, 약 1g 내지 약 4g, 약 1g 내지 약 3g, 약 1g 내지 약 2g, 약 1200mg 내지 약 5g, 약 1200mg 내지 약 4g, 약 1200mg 내지 약 3g, 약 1200 ㎎ 내지 약 2 g, 약 1400 mg 내지 약 5 g, 약 1400 mg 내지 약 4 g, 약 1400 mg 내지 약 3 g, 약 1400 mg 내지 약 2 g, 약 1600 mg 내지 약 5 g, 약 1600 mg 내지 약 4 g, 약 1600 mg 내지 약 3 g, 약 1600 mg 내지 약 2 g, 약 1800 mg 내지 약 5 g, 약 1800 mg 내지 약 4 g, 약 1800 mg 내지 약 3 g, 또는 약 1800 mg 내지 약 2 g의 약학적 활성 성분을 함유할 수 있다. 특정 구현예는 약 900 mg, 약 1200 mg 및 약 1800 mg의 약학적 활성 성분을 함유하는 단위 투여량을 포함한다.

특정 구현예에서, 단위 투여량은 약 200 mg 내지 약 900 mg의 본 발명의 약학적 활성 성분, 예컨대 약 200 mg, 약 250 mg, 약 300 mg, 약 350 mg, 약 400 mg, 약 450 mg, 약 500 mg, 약 550 mg, 약 600 mg, 약 650 mg, 약 700 mg, 약 750 mg, 약 800 mg, 약 850 mg 또는 약 900 mg의 약학적 활성 성분을 함유할 수 있다.

본 발명의 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물의 약학적 조성물은 원하는 순도를 갖는 약학적 활성 성분을 통상적으로 당 분야에 사용되는 선택적인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(이들은 모두 본원에서 "담체"로 지칭됨), 즉 완충제, 안정화제, 방부제, 등장성화제(isotonifiers), 비이온성 세제, 산화 방지제 및 기타 여러가지 첨가제와 혼합함으로써 동결건조 제형 또는 수용액으로서 저장하기 위해 제조될 수 있다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980)을 참조한다.

일부 구현예에서, 완충제는 약 2 mM 내지 약 50 mM, 예컨대 약 2 내지 약 40, 약 2 내지 약 30, 약 2 내지 약 20, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 50, 약 10 내지 약 40, 약 10 내지 약 30, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 50, 약 20 내지 약 40, 약 20 내지 약 30, 또는 약 40 내지 약 50 mM과 같은 생리학적 조건에 근사한 범위의 pH를 유지하는 것을 돕는데 사용된다. 예를 들어, 하나 이상의 완충제는 약 2, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45 또는 약 50 mM의 농도로 존재할 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 완충제는 유기산 및 무기산 및 그의 염들, 예컨대 시트레이트 완충액(예를 들어, 모노소듐 시트레이트-모노소듐 숙시네이트 혼합물, 숙신산-소듐 히드록사이드 혼합물, 숙신산-디소듐 숙시네이트 혼합물 등), 타르트레이트 완충액(예를 들어, 타르타르산-소듐 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-포타슘 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-소듐 히드록사이드 혼합물 등), 푸마레이트 완충액(예를 들어, 푸마르산-모노소듐 푸마레이트 혼합물, 푸마르산-디소듐 푸마레이트 혼합물, 모노소듐 푸마레이트-디소듐 푸마레이트 혼합물 등), 글루코네이트 완충액(예를 들어, 글루콘산-소듐 글리코네이트 혼합물, 글루콘산-소듐 히드록사이드 혼합물, 글루콘산-포타슘 글리우코네이트(glyuconate) 혼합물 등), 옥살레이트 완충액(예를 들어, 옥살산-소듐 옥살레이트 혼합물, 옥살산-소듐 히드록사이드 혼합물, 옥살산-포타슘 옥살레이트 혼합물 등), 락테이트 완충액(예를 들어, 락트산-소듐 락테이트 혼합물, 락트산-소듐 히드록사이드 혼합물, 락트산-포타슘 락테이트 혼합물 등) 및 아세테이트 완충액(예를 들어, 아세트산-소듐 아세테이트 혼합물, 아세트산-소듐 히드록사이드 혼합물 등)을 포함한다. 또한, 인산 완충액, 히스티딘 완충액 및 트리메틸아민 염, 예컨대 트리스(Tris)가 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 방부제는 0.01% 내지 1%(w/v), 예컨대 0.1% 내지 1%, 0.2% 내지 1%, 0.3% 내지 1%, 0.5% 내지 1%, 0.01% 내지 0.5%, 0.02% 내지 0.5%, 0.05% 내지 0.5%, 0.1% 내지 0.5%, 0.2% 내지 0.5% 또는 0.05% 내지 0.2%(w/v) 범위의 양으로 미생물 성장을 지연시키도록 첨가된다. 예를 들어, 약 0.02%, 약 0.05%, 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.5%, 약 0.8%(w/v)의 방부제가 첨가될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 방부제는 페놀, 벤질 알콜, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤잘코늄 할라이드(예를 들어, 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드), 헥사메토늄 클로라이드 및 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올 및 3-펜탄올을 포함한다.

일부 구현예에서 때때로 "안정화제"로 알려진 등장화제가 본 발명의 액체 조성물의 등장성을 보장하기 위해 첨가되고, 다가 당 알콜, 예를 들어 3가 이상의 당 알콜, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 크실리톨, 솔비톨 및 만니톨을 포함한다. 안정화제는 벌크 제제로부터, 치료제를 용해시키거나, 변성 또는 용기 벽에 대한 부착을 방지하는 데 도움이 되는 첨가제까지의 기능으로 다양할 수 있는 광범위한 범주의 부형제를 지칭한다. 전형적인 안정화제는 다가 당 알콜(상기 열거됨); 아미노산, 예컨대 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등, 유기 당류 또는 당 알콜 예컨대, 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 리비톨, 미오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등(시클리톨, 예컨대 이노시톨 포함); 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 황함유 환원제, 예컨대 요소, 글루타티온, 티옥트산, 소듐 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 소듐 티오 설페이트; 저분자량 폴리펩타이드(예를 들어, 10 잔기 이하의 펩타이드); 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예컨대 폴리비닐피롤리돈 모노사카라이드, 예컨대 크실로스, 만노스, 프룩토스, 글루코스; 이당류, 예컨대 락토스, 말토스, 수크로스 및 삼당류, 예컨대 라피노스; 및 다당류, 예컨대 덱스트란일 수 있다. 일부 구현예에서, 안정화제는 약학적 활성 성분의 0.1 내지 10,000 중량부, 예컨대 약학적 활성 성분의 0.1 내지 1,000, 0.2 내지 2,000, 0.5 내지 5,000, 1 내지 10,000, 또는 1 내지 1,000 중량부로 존재한다. 예를 들어, 안정화제는 약학적 활성 성분의 약 0.2, 약 0.5, 약 1, 약 5, 약 10, 약 20, 약 50, 약 100, 약 200, 약 500, 약 1,000, 약 2,000, 약 5,000 또는 약 8,000 중량부로 존재할 수 있다.

일부 구현예에서, 이온성 계면활성제가 첨가되어 치료제를 가용화하는 것 뿐만 아니라 활성 성분을 교반-유도된 응집으로부터 보호하는 것을 돕는다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제 또는 세제("습윤제"로도 알려짐)가 첨가되어 치료제를 가용화하는 것뿐만 아니라 활성 성분을 교반-유도된 응집으로부터 보호하는 것을 돕는다. 적합한 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트(20, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), 플루로닉(Pluronic) 폴리올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르(TWEEN®-20, TWEEN®-80 등)를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 예컨대 약 0.05 mg/mL 내지 약 0.2 mg/mL, 약 0.07 mg/mL 내지 약 0.2 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 0.3 mg/mL, 또는 약 0.1 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL의 범위로 존재한다. 예를 들어, 비-이온성 계면활성제는 약 0.05, 약 0.07, 약 0.08, 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.8 또는 약 1.0 mg/mL로 존재할 수 있다.

추가의 여러 부형제는 벌크제(예를 들어, 전분), 킬레이트제(예를 들어, EDTA), 산화방지제(예를 들어, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E) 및 공용매를 포함한다.

일부 구현예에서, 본원의 약학적 조성물은 또한 치료제, 예를 들어, 본원의 약학적 활성 성분(본원에 기술된 베타-시클로덱스트린의 혼합물) 이외에 제2 치료제의 조합을 함유한다. 적합한 조합 치료제의 예가 하기 섹션 4.3.3에 제공되어 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 수성 매질에서 지질을 가용화시킨다. 수성 매질은 예를 들어 증류수 또는 탈이온수일 수 있거나, 대상의 신체 내의 수성 환경, 예를 들어 혈액, 뇌척수액 또는 림프액일 수 있다. 조성물의 가용화 능력은 전형적으로 용액의 UV 투과 특성, 예를 들어 UV 분광법 또는 HPLC에 의해 모니터링될 때, 용액내 현탁액의 형성과 관련된 투과율의 감소에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 가용화된 지질은 에스테르화되지 않은 또는 에스테르화된 콜레스테롤; 콜레스테롤 대사물, 예를 들어 7-케토콜레스테롤, 7β-히드록시콜레스테롤, 24S-히드록시콜레스테롤, 25-히드록시콜레스테롤, 27-히드록시콜레스테롤 및 콜레스탄-3β,5α,6β-트리올; 스핑고지질; 당지질; 세라미드; 강글리오시드, 예를 들어, GM2((2S,3R,4E)-3-히드록시-2-(옥타데카노일아미노)옥타데세-4-엔-1-일 2-아세트아미도-2-데옥시-β-D-갈락토피라노실-(1→4-[5-아세트아미도-3,5-디데옥시-D-글리세로-α-D-갈락토-논-2-울로피라노노실-(2→3)]-β-D-갈락토피라노실-(1→4)-β-D-글루코피라노시드) 또는 GM3(모노시알로디헥소실강글리오사이드); 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 부피당 중량("중량/부피" 또는 "w/v") 용액은 일정 부피의 물에 용해된 용질의 중량을 지칭한다. 예시적인 예에서, 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 10%(w/v) 용액은 10 mL의 수용액에 1 g의 용질을 갖는다. 다른 예에서, 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 20%(w/v) 용액은 1 mL의 수용액에 200 mg의 용질을 갖는다.

일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 활성 성분의 20%(w/v) 용액 1 mL는 약 24시간 후, 예를 들어 UV 분광법에 의해 측정될 때 실온의 증류수 중 에스테르화되지 않은 콜레스테롤 2 mg 이상, 예컨대 3 mg 이상, 4 mg 이상, 5 mg 이상, 6mg 이상, 7mg 이상, 8mg 이상 또는 10mg 이상을 가용화한다. 일부 구현예에서 약 200 mg의 약학적 활성 성분은 약 24시간 후에 측정될 때 실온의 증류수 중 에스테르화되지 않은 콜레스테롤의 2 mg 이상, 예컨대 3 mg 이상, 4 mg 이상, 5 mg 이상, 6 mg 이상, 7 mg 이상, 8 mg 이상, 또는 10mg 이상을 가용화한다.

6.3. 치료 방법

본 발명은 니만-픽 질병을 갖는 대상에게 본 명세서에 기술된 치료적 유효량의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 니만-픽 질병 C1형(NPC1) 또는 니만-픽 질병 C2형(NPC2)와 같은 니만-픽 질병 C형(NPC)을 치료하는 방법을 제공한다.

본원에 사용된 "대상"은 마우스, 래트, 고양이, 개, 소, 돼지, 말과 같은 포유 동물이다. 일부 구현예에서, 포유 동물은 원숭이, 침팬지 또는 인간과 같은 영장류이다. 예를 들어, 대상은 인간 대상, 즉 인간 환자일 수 있다. 특정 구현예에서, 환자는 소아 환자 또는 성인 환자이다. 소아 환자는 유아기 발병(2세 미만), 후기영아기 발병(2세 이상 6세 미만), 유소년 발병(6세 내지 15세 미만) 및 청소년기 발병(15세 이상)으로 특성화되는 소아 환자를 포함한다.

용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 섹션 4.3.4에서 기술된 바와 같이 기준선과 비교하여, 하나 이상의 지질 바이오마커 또는 치료 효과의 수준을 유리하게 조절하도록 본원에 기술된 약학적 조성물을 투여하는 것을 지칭한다. 예시적인 치료 단계는 섹션 4.3.4.2에서 정의된 NPC 중증도 척도의 하나 이상의 영역 점수가 이전 기준치와 비교하여 감소된, 본원에 기술된 약학적 조성물의 반복 투여를 포함한다.

용어 "유지하다", "유지하는" 또는 "유지"는 섹션 4.3.4에서 기술된 바와 같이 하나 이상의 생물학적 효과의 기준선 수준을 일정하게 유지하기 위해 본원에 기술된 약학적 조성물을 투여하는 것을 지칭한다. 투여 유지 단계는 위약을 투여하는 경우 또는 투여가 없는 경우와 비교하여 NPC의 진행을 예방할 수 있다. 유지 단계의 실례는 섹션 4.3.4.2에서 정의된 NPC 중증도 척도의 하나 이상의 영역 점수가 기준치와 동일한 수준으로 유지되는 본 명세서에 기술된 약학적 조성물의 반복 투여이다.

6.3.1. 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 약학적 조성물의 투여

일부 구현예에서, 상기 방법은 투여마다 대상에게 약 200 내지 약 3000 mg, 예컨대 약 200 내지 약 2800, 약 200 내지 약 2600, 약 200 내지 약 2500, 약 200 내지 약 2400, 약 200 내지 약 2200, 약 200 내지 약 2000, 약 200 내지 약 1800, 약 200 내지 약 1600, 약 200 내지 약 1500, 약 200 내지 약 1200, 약 200 내지 약 1100, 약 200 내지 약 1000, 약 200 내지 약 800, 약 200 내지 약 700, 약 200 내지 약 600, 약 200 내지 약 500, 약 200 내지 약 400, 약 200 내지 약 300; 약 300 내지 약 3000, 약 300 내지 약 2800, 약 300 내지 약 2600, 약 300 내지 약 2500, 약 300 내지 약 2400, 약 300 내지 약 2200, 약 300 내지 약 2000, 약 300 내지 약 1800, 약 300 내지 약 1600, 약 300 내지 약 1500, 약 300 내지 약 1200, 약 300 내지 약 1100, 약 300 내지 약 1000, 약 300 내지 약 800, 약 300 내지 약 700, 약 300 내지 약 600, 약 300 내지 약 500, 약 300 내지 약 400; 예컨대 약 400 내지 약 3000, 약 400 내지 약 2800, 약 400 내지 약 2600, 약 400 내지 약 2500, 약 400 내지 약 2400, 약 400 내지 약 2200, 약 400 내지 약 2000, 약 400 내지 약 1800, 약 400 내지 약 1600, 약 400 내지 약 1500, 약 400 내지 약 1200, 약 400 내지 약 1100, 약 400 내지 약 1000, 약 400 내지 약 800, 약 400 내지 약 700, 약 400 내지 약 600, 약 400 내지 약 500; 예컨대 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2800, 약 500 내지 약 2600, 약 500 내지 약 2500, 약 500 내지 약 2400, 약 500 내지 약 2200, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1800, 약 500 내지 약 1600, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1200, 약 500 내지 약 1100, 약 500 내지 약 1000, 약 500 내지 약 800, 약 500 내지 약 700, 약 500 내지 약 600; 예컨대 약 600 내지 약 3000, 약 600 내지 약 2800, 약 600 내지 약 2600, 약 600 내지 약 2500, 약 600 내지 약 2400, 약 600 내지 약 2200, 약 600 내지 약 2000, 약 600 내지 약 1800, 약 600 내지 약 1600, 약 600 내지 약 1500, 약 600 내지 약 1200, 약 600 내지 약 1100, 약 600 내지 약 1000, 약 600 내지 약 800, 약 600 내지 약 700; 예컨대 약 700 내지 약 3000, 약 700 내지 약 2800, 약 700 내지 약 2600, 약 700 내지 약 2500, 약 700 내지 약 2400, 약 700 내지 약 2200, 약 700 내지 약 2000, 약 700 내지 약 1800, 약 700 내지 약 1600, 약 700 내지 약 1500, 약 700 내지 약 1200, 약 700 내지 약 1100, 약 700 내지 약 1000, 약 700 내지 약 800; 예컨대 약 800 내지 약 3000, 약 800 내지 약 2800, 약 800 내지 약 2600, 약 800 내지 약 2500, 약 800 내지 약 2400, 약 800 내지 약 2200, 약 800 내지 약 2000, 약 800 내지 약 1800, 약 800 내지 약 1600, 약 800 내지 약 1500, 약 800 내지 약 1200, 약 800 내지 약 1100, 약 800 내지 약 1000; 예컨대 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2800, 약 1000 내지 약 2600, 약 1000 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2400, 약 1000 내지 약 2200, 약 1000 내지 약 2000, 약 1000 내지 약 1800, 약 1000 내지 약 1600, 약 1000 내지 약 1500, 약 1000 내지 약 1200, 약 1000 내지 약 1100; 예컨대 약 1100 내지 약 3000, 약 1100 내지 약 2800, 약 1100 내지 약 2600, 약 1100 내지 약 2500, 약 1100 내지 약 2400, 약 1100 내지 약 2200, 약 1100 내지 약 2000, 약 1100 내지 약 1800, 약 1100 내지 약 1600, 약 1100 내지 약 1500, 약 1100 내지 약 1200; 예컨대 약 1200 내지 약 3000, 약 1200 내지 약 2800, 약 1200 내지 약 2600, 약 1200 내지 약 2500, 약 1200 내지 약 2400, 약 1200 내지 약 2200, 약 1200 내지 약 2000, 약 1200 내지 약 1800, 약 1200 내지 약 1600, 약 1200 내지 약 1500; 예컨대 약 1500 내지 약 3000, 약 1500 내지 약 2800, 약 1500 내지 약 2600, 약 1500 내지 약 2500, 약 1500 내지 약 2400, 약 1500 내지 약 2200, 약 1500 내지 약 2000, 약 1500 내지 약 1800, 약 1500 내지 약 1600; 예컨대 약 1600 내지 약 3000, 약 1600 내지 약 2800, 약 1600 내지 약 2600, 약 1600 내지 약 2500, 약 1600 내지 약 2400, 약 1600 내지 약 2200, 약 1600 내지 약 2000, 약 1600 내지 약 1800; 예컨대 약 1800 내지 약 3000, 약 1800 내지 약 2800, 약 1800 내지 약 2600, 약 1800 내지 약 2500, 약 1800 내지 약 2400, 약 1800 내지 약 2200, 약 1800 내지 약 2000; 예컨대 약 2000 내지 약 3000, 약 2000 내지 약 2800, 약 2000 내지 약 2600, 약 2000 내지 약 2500, 약 2000 내지 약 2400, 약 2000 내지 약 2200; 예컨대 약 2200 내지 약 3000, 약 2200 내지 약 2800, 약 2200 내지 약 2600, 약 2200 내지 약 2500, 약 2200 내지 약 2400; 예컨대 약 2400 내지 약 3000, 약 2400 내지 약 2800, 약 2400 내지 약 2600, 약 2400 내지 약 2500; 예컨대 약 2500 내지 약 3000, 약 2500 내지 약 2800, 약 2500 내지 약 2600; 예컨대 약 2600 내지 약 3000, 약 2600 내지 약 2800; 또는 약 2800 내지 약 3000 mg의 약학적 활성 성분을 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 투여 계획은 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 1개월에 1회, 2개월마다 1회 또는 3개월마다 1회 투여로 구성된다. 예를 들어, 상기 방법은 투여마다 투여 대상에게 약 200, 약 300, 약 400, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 약 1000, 약 1200, 약 1400, 약 1500, 약 1600, 약 1800, 약 2000, 약 2200, 약 2400, 약 2500 또는 약 3000 mg의 약학적 활성 성분을 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 투여는 투여 당 단일 투여량으로 일어난다. 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 분할된 투여량으로 투여되며, 전체 투여량은 투여 당 2회 투여, 3회 투여 또는 심지어 4회 투여로, 예를 들어 1주일, 2주일, 1개월, 2개월 등에 걸쳐, 특히 2주에 걸쳐 분할 투여된다. 또한, 조성물은 치료되는 질환, 투여 경로 및 대상의 연령, 체중 및 상태에 따라 연속적으로, 또는 임의의 유효 범위 또는 값으로 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 뇌척수강내 또는 뇌실내 투여에 적합하다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물의 뇌척수강내 투여는 뇌척수강내 포트를 통한 것이다. 이러한 특정 구현예에서, 포트는 Celsite® 포트(B. Braun Medical, France)이다. 특정 구현예에서, 뇌척수강내 투여는 뇌척수강내 저속 볼루스(1 내지 2분, 투여된 용량에 따라 다름) 요추 천자 주입(최대 투여속도 = 4.5 mL/분)으로서 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 요추 천자 기술은 Whiteacre 또는 Sprotte 바늘과 같은 비-절단 바늘의 사용, 경막 섬유에 평행한 삽입 및 바늘을 제거하기 전에 탐침(stylet)을 교체하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 주사하기 전에, 투여될 부피와 동량의 CSF 유체를 제거한다.

또 다른 예시적인 예에서, 뇌실내 투여는 오마야(Ommaya) 저장소를 통해 이루어질 수 있다.

본원에 기술된 NPC의 치료를 위해, 약학적 활성 성분인 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물의 유효량은 약 0.001 내지 약 1000 mg/kg, 예컨대 약 0.1 내지 약 1000, 약 1 내지 약 1000, 약 10 내지 약 1000, 약 20 내지 약 1000, 약 50 내지 약 1000, 약 100 내지 약 1000, 약 200 내지 약 1000, 약 300 내지 약 1000, 약 400 내지 약 1000, 약 500 내지 약 1000, 약 600 내지 약 1000, 약 800 내지 약 1000; 예컨대 약 0.1 내지 약 800, 약 1 내지 약 800, 약 10 내지 약 800, 약 20 내지 약 800, 약 50 내지 약 800, 약 100 내지 약 800, 약 200 내지 약 800, 약 300 내지 약 800, 약 400 내지 약 800, 약 500 내지 약 800, 약 600 내지 약 800; 예컨대 약 0.1 내지 약 600, 약 1 내지 약 600, 약 10 내지 약 600, 약 20 내지 약 600, 약 50 내지 약 600, 약 100 내지 약 600, 약 200 내지 약 600, 약 300 내지 약 600, 약 400 내지 약 600, 약 500 내지 약 600; 예컨대 약 0.1 내지 약 500, 약 1 내지 약 500, 약 10 내지 약 500, 약 20 내지 약 500, 약 50 내지 약 500, 약 100 내지 약 500, 약 200 내지 약 500, 약 300 내지 약 500, 약 400 내지 약 500; 예컨대 약 0.1 내지 약 400, 약 1 내지 약 400, 약 10 내지 약 400, 약 20 내지 약 400, 약 50 내지 약 400, 약 100 내지 약 400, 약 200 내지 약 400, 약 300 내지 약 400; 예컨대 약 0.1 내지 약 300, 약 1 내지 약 300, 약 10 내지 약 300, 약 20 내지 약 300, 약 50 내지 약 300, 약 100 내지 약 300, 약 200 내지 약 300; 예컨대 약 0.1 내지 약 200, 약 1 내지 약 200, 약 10 내지 약 200, 약 20 내지 약 200, 약 50 내지 약 200, 약 100 내지 약 200; 예컨대 약 0.1 내지 약 100, 약 1 내지 약 100, 약 10 내지 약 100, 약 20 내지 약 100, 약 50 내지 약 100; 예컨대 약 0.1 내지 약 50, 약 1 내지 약 50, 약 10 내지 약 50, 약 20 내지 약 50; 예컨대 약 0.1 내지 약 20, 약 1 내지 약 20, 약 10 내지 약 20; 예컨대 약 0.1 내지 약 10, 약 1 내지 약 10; 또는 약 0.1 내지 약 1 mg/kg의 범위일 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 NPC의 증상을 감소시키기 위해, 매주, 2주마다, 3주마다, 또는 매달마다 투여하는 치료 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 질병의 정상 상태를 유지하기 위해, 매 3주마다, 매 달마다, 2개월마다 또는 3개월마다 투여하는 유지 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 볼루스(bolus)로서 투여되고, 이어서 지속적인 유지 투여량이 투여된다.

특정 구현예에서, 약학적 조성물은 뇌척수강내 또는 뇌실내 투여를 통해 매달 투여된다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 뇌척수강내 또는 뇌실내 투여를 통해 연속적으로 투여된다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 900 mg의 약학적 활성 성분이 초기 용량으로 환자에게 투여되는 치료 단계, 및 900 mg 미만의 약학적 활성 성분이 뇌척수강내 투여에 의해 격주로 투여되는 유지 단계를 포함한다.

6.3.2. 다수의 투여 경로

일부 구현예에서, 상기 방법은 다수의 투여 경로를 사용하여 약학적 활성 성분을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 약학적 활성 성분을 (i)뇌척수강내 또는 뇌실내 투여에 의해 투여하고, (ii) 정맥내 투여하는 단계를 포함한다. 이들 구현예는 중추 신경계 및 말초 기관 모두에서 콜레스테롤 축적을 효과적으로 감소시킬 수 있다.

일부 구현예에서, 정맥내 투여는 환자에게 6 내지 8시간에 걸쳐 정맥내 주입에 의해 약 200 mg/kg 내지 약 4000 mg/kg의 베타-시클로덱스트린 혼합물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 정맥내 투여는 환자에게 6 내지 8시간에 걸쳐 정맥내 주입에 의해 약 500 mg/kg 내지 약 4000 mg/kg의 베타-시클로덱스트린 혼합물을 투여하는 단계를 포함한다.

전형적인 구현예에서, 약학적 조성물은 약 200 mg/mL의 베타-시클로덱스트린 혼합물을 포함한다. 특정 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 약 250 mg/mL의 베타-시클로덱스트린 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 3일에 1회, 매주 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 매달 1회, 2개월마다 1회, 또는 3개월마다 1회 투여된다. 특정 구현예에서, 정맥내 투여는 출생 직후에 시작된다. 특정 다른 구현예에서, 정맥내 투여는 뇌척수강내(또는 뇌실내) 투여가 개시된 후에 시작된다. 일부 구현예에서, 환자의 간 부피, 비장 부피 및/또는 간 효소 활성을 모니터링하여 치료의 효능을 측정하고, 투여 스케줄을 조정한다.

6.3.3. 복합 요법

하기 기술된 것은 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 약학적 조성물을 선택적으로 사용할 수 있는 복합 요법이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 복합 방법은 대상에 2종 이상의 약제를 투여하는 단계를 포함하는데, 약제 중 제1 약제는 본원에 기술된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물(예를 들어, 본원에 기술된 약학적 조성물에서)이며, 추가 약제(들)은 복합 치료제이다. 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물 및 복합 치료제(들)은 동시에(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 약학적 조성물로), 순차적으로 또는 개별적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 복합 요법은 부가 효과 이상, 즉 예를 들어 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물 및 복합 치료제가 각각이 개별적으로 투여될 때 그로부터의 이익의 예상되는 합보다 큰 치료 효과를 제공하는 상승 효과를 얻을 수 있다.

일부 구현예에서, 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물 및 복합 치료제는 동시에 또는 연속적으로 동시에 투여된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물 및 복합 치료제는 같은 날, 예를 들어, 동일한 대상 방문동안 대상에게 투여되는 경우 연속적으로 투여된다고 한다. 연속적인 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8시간 간격으로 발생할 수 있다. 대조적으로, 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물 및 복합 치료제는 대상에게 상이한 날 투여되는 경우 개별적으로 투여되는 것으로 알려져 있으며, 예를 들어 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물 및 복합 치료제는 1일, 2일 또는 3일, 1주, 2주 또는 1개월 간격으로 투여될 수 있다. 본원의 방법에서, 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물의 투여는 복합 치료제의 투여를 선행하거나 또는 수반할 수 있다.

비-제한적인 예로서, 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물 및 복합 치료제는 일정 기간 동안 동시에 투여될 수 있고, 이어서 제2 기간에 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물 및 복합 치료제가 번갈아 투여된다.

히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물 및 복합 치료제의 투여의 잠재적인 상승 작용으로 인해, 상기 약제는 하나 또는 둘 모두의 약제가 단독으로 투여되는 경우 치료 효과가 없는 양으로 치료적으로 유효한 복합으로서 투여될 수 있다.

특정 구현예에서, 복합 치료제는 비타민 E 또는 이의 유도체, 효소 대체 요법, 스테로이드, 글루코실 트랜스퍼라제 효소억제제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제 또는 분자 샤페론 활성제이다.

비타민 E 또는 비타민 E 유도체는 알파-토코페롤, 델타-토코페롤 및 토코페롤 유도체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 비타민 E 유도체는 에스테르화된 토코페롤, 예를 들어, 토코페릴 아세테이트 및 화학적으로 관련이 있는 토코페롤 유도체, 예컨대 PCT 공개공보 제WO 2014/078573호에 기술된 것을 포함하며, 이는 본원에 참고문헌으로 전문통합된다.

효소 대체 요법은 아갈시다제(agalsidase) 베타(Fabrazyme®), 이미글루세라제(imiglucerase)(Cerezyme®), 베라글루세라제(verlaglucerase) 알파(VPRIV^TM), 탈리글루세라제(taliglucerase)(Elelyso^TM), 알글루코시다제(alglucosidase) 알파(Myozyme® 또는 Lumizyme®), 라로니다제(laronidase)(Aldurazyme®), 이두르설파제(idursulfase) 정맥주사(Elaprase®), 및 갈설파제(galsulfase)(Naglazyme^TM)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

스테로이드는 알로프레그나놀론(allopregnanolone) 및 가낙솔론(ganaxolone)과 같은 신경 스테로이드를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

글루코실 트랜스퍼라제 효소억제제는 글루코세라미드 신타제 억제제, 예컨대 미글루스타트(Miglustat)(Zavesca®)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

HDAC 억제제는 비로노스타트(vironostat), 로미뎁신(romidepsin), 트리코스타틴(trichostatin) A, 발프로에이트(valproate), 부티레이트, 트라폭신(trapoxins) 및 아피시딘(apicidin)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

분자 샤페론 활성제는 아리모클로몰(arimoclomol)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

6.3.4. 방법의 생물학적 효과

6.3.4.1. 바이오마커에 미치는 효과

일부 구현예에서, NPC를 치료하는 방법은 하나 이상의 신체 기관, 예를 들어 뇌에 축적되어, 질병 증상을 야기하는, 에스테르화되지 않은 콜레스테롤 또는 강글리오사이드와 같은 하나 이상의 지질의 수준을 유지 또는 조절하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 지질의 수준을 조절하는 단계는 하나 이상의 지질 수준을 낮추는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법의 효능은 치료 시작 전(기준선 수준) 및 치료 시작 후 하나 이상의 지질의 축적 수준을 측정함으로써 측정된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 지질의 수준을 기준선 수준에 대해 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 97%까지 낮춘다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 지질의 수준을 기준선 수준에 대해 20% ± 5%, 25% ± 5%, 30% ± 5%, 35% ± 5%, 40% ± 5%, 45% ± 5%, 50% ± 5%, 55% ± 5%, 60% ± 5%, 65% ± 5%, 70% ± 5%, 75% ± 5%, 80% ± 5%, 85% ± 5%, 90% ± 5%, 또는 95% ± 5%까지 낮춘다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 지질의 수준을 기준선 수준에 대해 20% ± 3%, 25% ± 3%, 30% ± 3%, 35% ± 3%, 40% ± 3%, 45% ± 3%, 50% ± 3%, 55% ± 3%, 60% ± 3%, 65% ± 3%, 70% ± 3%, 75% ± 3%, 80% ± 3%, 85% ± 3%, 90% ± 3%, 95% ± 3%, 또는 97% ± 3%까지 낮춘다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 지질의 수준을 기준선 수준에 대해 20% ± 2%, 25% ± 2%, 30% ± 2%, 35% ± 2%, 40% ± 2%, 45% ± 2%, 50% ± 2%, 55% ± 2%, 60% ± 2%, 65% ± 2%, 70% ± 2%, 75% ± 2%, 80% ± 2%, 85% ± 2%, 90% ± 2%, 95% ± 2%, 또는 97% ± 2%까지 낮춘다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 지질의 수준을 기준선 수준에 대해 약 20% 이상, 예컨대 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 97% 이상까지 낮춘다.

일부 구현예에서, 본 방법은 하나 이상의 지질의 수준을 기준선 수준에 대해 약 20% 내지 약 97%, 예컨대 약 20% 내지 약 95%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 85%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 75%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 65%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 55%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 45%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 25%; 예컨대 약 25% 내지 약 97%, 약 25% 내지 약 95%, 약 25% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 85%, 약 25% 내지 약 80%, 약 25% 내지 약 75%, 약 25% 내지 약 70%, 약 25% 내지 약 65%, 약 25% 내지 약 60%, 약 25% 내지 약 55%, 약 25% 내지 약 50%, 약 25% 내지 약 45%, 약 25% 내지 약 40%, 약 25% 내지 약 35%, 약 25% 내지 약 30%; 예컨대 약 30% 내지 약 97%, 약 30% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 85%, 약 30% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 75%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 65%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 55%, 약 30% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 45%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 35%; 예컨대 약 35% 내지 약 97%, 약 35% 내지 약 95%, 약 35% 내지 약 90%, 약 35% 내지 약 85%, 약 35% 내지 약 80%, 약 35% 내지 약 75%, 약 35% 내지 약 70%, 약 35% 내지 약 65%, 약 35% 내지 약 60%, 약 35% 내지 약 55%, 약 35% 내지 약 50%, 약 35% 내지 약 45%, 약 35% 내지 약 40%; 예컨대 약 40% 내지 약 97%, 약 40% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 85%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 75%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 55%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 45%; 예컨대 약 45% 내지 약 97%, 약 45% 내지 약 95%, 약 45% 내지 약 90%, 약 45% 내지 약 85%, 약 45% 내지 약 80%, 약 45% 내지 약 75%, 약 45% 내지 약 70%, 약 45% 내지 약 65%, 약 45% 내지 약 60%, 약 45% 내지 약 55%, 약 45% 내지 약 50%; 예컨대 약 50% 내지 약 97%, 약 50% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 85%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 75%, 약 50% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 65%, 약 50% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 55%; 예컨대 약 55% 내지 약 97%, 약 55% 내지 약 95%, 약 55% 내지 약 90%, 약 55% 내지 약 85%, 약 55% 내지 약 80%, 약 55% 내지 약 75%, 약 55% 내지 약 70%, 약 55% 내지 약 65%, 약 55% 내지 약 60%; 예컨대 약 60% 내지 약 97%, 약 60% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 85%, 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 75%, 약 60% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 65%; 예컨대 약 65% 내지 약 97%, 약 65% 내지 약 95%, 약 65% 내지 약 90%, 약 65% 내지 약 85%, 약 65% 내지 약 80%, 약 65% 내지 약 75%, 약 65% 내지 약 70%; 예컨대 약 70% 내지 약 97%, 약 70% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 85%, 약 70% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 75%; 예컨대 약 75% 내지 약 97%, 약 75% 내지 약 95%, 약 75% 내지 약 90%, 약 75% 내지 약 85%, 약 75% 내지 약 80%; 예컨대 약 80% 내지 약 97%, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 85%; 예컨대 약 85% 내지 약 97%, 약 85% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 90%; 예컨대 약 90% 내지 약 97%, 약 90% 내지 약 95%, 또는 약 95% 내지 약 97% 범위까지 낮춘다.

NPC 환자에서, 하나 이상의 지질의 축적 수준을 측정하는 것은 뇌척수액(CSF), 혈장 또는 소변의 샘플에서 하나 이상의 바이오마커를 모니터링함으로써 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, CSF는 하나 이상의 지질의 배설 수준을 직접 측정하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 지질 수준의 변화에 의해 조절된 하류 단백질 바이오 마커가 모니터링된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 타우 단백질, 아밀로이드 펩타이드, 신경미세섬유경 단백질(NFL), 신경 교원섬유 산성 단백질(GFAP), 스테롤, 옥시스테롤, 키토트리오시다제 활성, 칼빈딘, 리소좀-관련 막 단백질 1(LAMP-1), GM2 또는 GM3 강글리오사이드, 스핑고신 및 스핑고신-1-포스페이트(S1P) 중 하나 이상의 뇌척수액내 수준을 조절, 예컨대 기준선 수준에 대해 낮은 수준으로 조절하기에 충분한 양의 약학적 활성 성분을 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 혈장 샘플은 치료 시작 전후에 혈액에 존재하는 하나 이상의 지질, 예를 들어, 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 대사물질의 수준을 측정하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 방법은 7-케토콜레스테롤, 7β-히드록시콜레스테롤, 24S-히드록시콜레스테롤, 25-히드록시콜레스테롤, 27-히드록시콜레스테롤, 및 콜레스테인-3β,5α,6β-트리올 중 하나 이상의 혈장내 수준을 조절, 예컨대 기준선 수준에 대해 낮은 수준으로 조절하기에 충분한 양의 약학적 활성 성분을 투여하는 단계를 포함한다.

3β-설폭시-7β-N-아세틸글루코사미닐-5-콜렌-24-오익산(SNAG-Δ⁵-CA), 글리신-접합된 3β-설폭시-7β-N-아세틸글루코사미닐-5-콜렌-24-오익산(SNAG-Δ⁵-CG) 및 타우린-접합된 3β-설폭시-7β-N-아세틸글루코사미닐-5-콜렌-24-오익산(SNAG-Δ⁵-CT)과 같은 대사물질과 같은 다른 지질을 모니터링하는 것은 NPC1 환자의 소변에서 유용한 바이오마커를 제공할 수 있다고 보고되어 있다(Maekawa, M. et al. "Focused metabolomics using liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry for analysis of urinary conjugated cholesterol metabolites from patients with Niemann-Pick disease type C and 3β-hydroxysteroid dehydrogenase deficiency." Annals of Clinical Biochemistry OnlineFirst, published March 2, 2015). 일부 구현예에서, 본 방법은 3β-설폭시-7β-N-아세틸글루코사미닐-5-콜렌-24-오익산(SNAG-Δ⁵-CA), 글리신-접합된 3β-설폭시-7β-N-아세틸글루코사미닐-5-콜렌-24-오익산(SNAG-Δ⁵-CG) 및 타우린-접합된 3β-설폭시-7β-N-아세틸글루코사미닐-5-콜렌-24-오익산(SNAG-Δ⁵-CT) 중 하나 이상의 소변내 수준을 조절, 예컨대 기준선 수준에 비해 낮은 수준으로 조절하기에 충분한 양의 약학적 활성 성분을 투여하는 단계를 포함한다.

6.3.4.2. 치료적 효과

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 NPC의 하나 이상의 증상에 유익한 효과를 갖는다.

NPC 질병 진행을 특성화하고 정량화하는 하나의 방법은 9가지 주요 영역(보행, 인지, 안구운동, 소근육 운동, 청력, 기억력, 발작, 언어능력 및 연하) 및 8가지 부 영역(청성뇌간 반응, 행동, 젤라스틱 탈력발작(guelastic cataplexy), 실금, 기면발작, 정신질환, 호흡기 질환)에서 임상 징후 및 증상을 측정하는 NPC 중증도 척도를 사용하여 수행된다(Yanjanin et al., "Linear Clinical Progression, Independent of Age of Onset, in Niemann-Pick Disease, Type C," Am. J. Med. Genet. Part　B 153B:132-140 (2010))("Yanjanin 2010"). 전반적인 임상적 중증도 점수(또는 "전체 점수")는 주요 영역 및 부 영역 각각의 모든 평가의 집계이며, 모든 개별 영역 점수의 합에 의해 결정된다. 하기 표 1을 참조하며; 또한 도 1도 참조한다.

[표 1]

* 점수는 상기 두 하위섹션내에서 덧붙임

** PTA = 청력도에서 보고된 순수 톤 평균

일부 구현예에서, 본 방법은 보행, 소근육 운동, 인지, 언어능력, 연하, 안구운동, 기억력, 청력, 발작, 청성뇌간 반응, 행동, 젤라스틱 탈력발작, 반사항진(hyperreflexia), 실금, 기면발작, 정신질환, 호흡기 질환으로부터 선택된 NPC 중증도 척도의 하나 이상의 영역 점수를 유지 또는 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 보행, 소근육 운동, 인지, 언어능력, 연하, 안구운동, 기억력, 청력 및 발작 중에서 선택된 NPC 중증도 척도의 하나 이상의 영역 점수를 유지 또는 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 보행, 소근육 운동, 인지, 언어능력, 연하, 기억력 및 발작 중에서 선택된 NPC 중증도 척도의 하나 이상의 영역 점수를 유지 또는 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 보행, 소근육 운동, 인지 및 연하로부터 선택된 NPC 중증도 척도의 하나 이상의 영역 점수를 유지 또는 감소시키는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 환자의 상태를 개선시키는 치료는 기준선 점수와 비교하여, NPC 중증도 척도의 하나 이상의 영역의 점수를 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 점수 감소는 기준선 점수와 비교하여, 약 20% 내지 약 95%, 예컨대 약 30% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 약 70% 내지 95%, 약 80% 내지 95%, 약 90% 내지 95%; 예컨대 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%; 예컨대 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%; 예컨대 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%; 예컨대, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%; 예컨대 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%; 예컨대 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%; 또는 약 20% 내지 약 30% 범위일 수 있다. 예를 들어, 점수의 감소는 기준선 점수와 비교하여, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 95%일 수 있다.

일부 구현예에서, 본 방법은 하나 이상의 영역의 점수를 기준선 수준에 대해, 20% ± 5%, 25% ± 5%, 30% ± 5%, 35% ± 5%, 40% ± 5%, 45% ± 5%, 50% ± 5%, 55% ± 5%, 60% ± 5%, 65% ± 5%, 70% ± 5%, 75% ± 5%, 80% ± 5%, 85% ± 5%, 90% ± 5%, 또는 95% ± 5%까지 감소시킨다.

일부 구현예에서, 본 방법은 하나 이상의 영역의 점수를 기준선 수준에 대해, 20% ± 3%, 25% ± 3%, 30% ± 3%, 35% ± 3%, 40% ± 3%, 45% ± 3%, 50% ± 3%, 55% ± 3%, 60% ± 3%, 65% ± 3%, 70% ± 3%, 75% ± 3%, 80% ± 3%, 85% ± 3%, 90% ± 3%, 95% ± 3%, 또는 97% ± 3%까지 감소시킨다.

일부 구현예에서, 본 방법은 하나 이상의 영역의 점수를 기준선 수준에 대해, 20% ± 2%, 25% ± 2%, 30% ± 2%, 35% ± 2%, 40% ± 2%, 45% ± 2%, 50% ± 2%, 55% ± 2%, 60% ± 2%, 65% ± 2%, 70% ± 2%, 75% ± 2%, 80% ± 2%, 85% ± 2%, 90% ± 2%, 95% ± 2%, 또는 97% ± 2%까지 감소시킨다.

일부 구현예에서, 환자의 상태를 개선시키는 치료는 기준선 전체 점수와 비교하여, NPC 중증도 척도의 전체 점수를 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 전체 점수의 감소는 기준선 전체 점수와 비교하여 약 20% 내지 약 97%, 예컨대 약 25% 내지 약 97%, 약 30% 내지 약 97%, 약 35% 내지 약 97%, 약 40% 내지 약 97%, 약 45% 내지 약 97%, 약 50% 내지 약 97%, 약 55% 내지 약 97%, 약 60% 내지 약 97%, 약 65% 내지 약 97%, 약 70% 내지 약 97%, 약 75% 내지 약 97%, 약 80% 내지 약 97%, 약 85% 내지 약 97%, 약 90% 내지 약 97%; 예컨대 약 20% 내지 약 95%, 약 25% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 95%, 약 35% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 45% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 55% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 약 65% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 95%, 약 75% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 95%; 예컨대 약 20% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 35% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 45% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 55% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 65% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 75% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 90%; 예컨대 약 20% 내지 약 85%, 약 25% 내지 약 85%, 약 30% 내지 약 85%, 약 35% 내지 약 85%, 약 40% 내지 약 85%, 약 45% 내지 약 85%, 약 50% 내지 약 85%, 약 55% 내지 약 85%, 약 60% 내지 약 85%, 약 65% 내지 약 85%, 약 70% 내지 약 85%, 약 75% 내지 약 85%, 약 80% 내지 약 85%; 예컨대 약 20% 내지 약 80%, 약 25% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 35% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 45% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 55% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 65% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 80%; 예컨대 약 20% 내지 약 75%, 약 25% 내지 약 75%, 약 30% 내지 약 75%, 약 35% 내지 약 75%, 약 40% 내지 약 75%, 약 45% 내지 약 75%, 약 50% 내지 약 75%, 약 55% 내지 약 75%, 약 60% 내지 약 75%, 약 65% 내지 약 75%, 약 70% 내지 약 75%; 예컨대 약 20% 내지 약 70%, 약 25% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 35% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 45% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 55% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 70%; 예컨대 약 20% 내지 약 65%, 약 25% 내지 약 65%, 약 30% 내지 약 65%, 약 35% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 65%, 약 45% 내지 약 65%, 약 50% 내지 약 65%, 약 55% 내지 약 65%, 약 60% 내지 약 65%; 예컨대 약 20% 내지 약 60%, 약 25% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 35% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 45% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 60%; 예컨대 약 20% 내지 약 55%, 약 25% 내지 약 55%, 약 30% 내지 약 55%, 약 35% 내지 약 55%, 약 40% 내지 약 55%, 약 45% 내지 약 55%, 약 50% 내지 약 55%; 예컨대 약 20% 내지 약 50%, 약 25% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 35% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 45% 내지 약 50%; 예컨대 약 20% 내지 약 45%, 약 25% 내지 약 45%, 약 30% 내지 약 45%, 약 35% 내지 약 45%, 약 40% 내지 약 45%; 예컨대 약 20% 내지 약 40%, 약 25% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 40%; 예컨대 약 20% 내지 약 35%, 약 25% 내지 약 35%, 약 30% 내지 약 35%; 예컨대 약 20% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 30%; 또는 예컨대 약 20% 내지 약 25%의 범위이다. 예를 들어, NPC 중증도 척도의 전체 점수 감소는 기준선 전체 점수와 비교하여, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 97%일 수 있다.

일부 구현예에서, 본 방법은 전체 점수를 기준선 전체 수준에 대해, 20% ± 5%, 25% ± 5%, 30% ± 5%, 35% ± 5%, 40% ± 5%, 45% ± 5%, 50% ± 5%, 55% ± 5%, 60% ± 5%, 65% ± 5%, 70% ± 5%, 75% ± 5%, 80% ± 5%, 85% ± 5%, 90% ± 5%, 또는 95% ± 5%까지 감소시킨다.

일부 구현예에서, 본 방법은 전체 점수를 기준선 전체 수준에 대해, 20% ± 3%, 25% ± 3%, 30% ± 3%, 35% ± 3%, 40% ± 3%, 45% ± 3%, 50% ± 3%, 55% ± 3%, 60% ± 3%, 65% ± 3%, 70% ± 3%, 75% ± 3%, 80% ± 3%, 85% ± 3%, 90% ± 3%, 95% ± 3% 또는 97% ± 3%까지 감소시킨다.

일부 구현예에서, 본 방법은 전체 점수를 기준선 전체 수준에 대해, 20% ± 2%, 25% ± 2%, 30% ± 2%, 35% ± 2%, 40% ± 2%, 45% ± 2%, 50% ± 2%, 55% ± 2%, 60% ± 2%, 65% ± 2%, 70% ± 2%, 75% ± 2%, 80% ± 2%, 85% ± 2%, 90% ± 2%, 95% ± 2% 또는 97% ± 2%까지 감소시킨다.

일부 구현예에서, 환자의 상태를 일정하게 유지하는 유지 단계는 기준선 점수와 비교된 범위 내에서 NPC 중증도 척도의 영역 점수를 유지하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 점수의 유지는 기준선 수준에서 점수의 약 15% 이내, 예컨대 약 10% 또는 약 5% 내의 점수를 지칭한다.

일부 구현예에서, 본 방법은 기준선 점수에 대해, 5% ± 3%, 10% ± 3% 또는 15% ± 3% 이내의 점수를 생성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 기준선 점수에 대해, 5% ± 2%, 10% ± 2% 또는 15% ± 2% 이내의 점수를 생성한다.

일부 구현예에서, 환자의 상태를 일정하게 유지하는 유지 단계는 기준선 전체 점수와 비교된 범위 내에서 NPC 중증도 척도의 전체 점수를 유지하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 전체 점수의 유지는 기준선 수준에서 전체 점수의 약 15% 이내, 예컨대 약 10% 또는 약 5% 내의 전체 점수를 지칭한다.

일부 구현예에서, 본 방법은 기준선 전체 점수에 대해, 5% ± 3%, 10% ± 3% 또는 15% ± 3% 이내의 전체 점수를 생성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 기준선 전체 점수에 대해, 5% ± 2%, 10% ± 2% 또는 15% ± 2% 이내의 전체 점수를 생성한다.

본 발명의 방법의 효능을 특성화하기 위해 사용될 수 있는 다른 측정치는, 치료후 맹검된 임상의 임상진료 변화의 전역 인상(CGI-Clinician) 또는 간병인의 임상진료 변화의 전역 인상(CGI-Caregiver)을 포함하는 전역 영역, 정기적인 업 앤드 고(Timed Up and Go, TUG) 테스트, 9-홀 페그 테스트(9-HPT), 및 삶의 질 등급, 예컨대 미국 국립 보건원 PROMIS-PRO(Patient Reported Outcomes Measurement Information System-Patient Reported Outcomes) 간병인의 삶의 질 등급을 포함한다.

본 발명의 방법은 임상적 부작용의 특성 및 중증도; 청각 검사, 예를 들어 BAER 검사; 임상 시험, 예를 들어 혈액학, 임상 화학, 응고, 요 검사, CSF 분석; 생체 신호; 물리적 및 신경학적 검사 결과; 및 심전도 중 하나 이상을 포함하는 임상 안전 척도에 의해 특성화될 수 있다.

6.3.5. 다른 리소좀 축적 장애 치료

실시예 8(섹션 5.8.2.5 참조)에서 입증된 바와 같이, 본원에 기술된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물은 자가포식(autophagy)과 관련된 유전자에 유의미한 효과를 가지며, 이는 본원에 기술된 약학적 활성 성분 및 약학적 조성물이 특정 다른 리소좀 축적 장애에 있는 결점의 결과를 개선하는데 효과적일 것임을 입증한다.

따라서, 또 다른 양태에서, NPC 이외의 리소좀성 축적 장애를 갖는 대상에게 본원에 기술된 치료적 유효량의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 니만-픽 질병 C형(NPC) 이외의 리소좀성 축적 장애의 치료 방법이 제시된다.

다양한 구현예에서, 리소좀 축적 장애는 아스파르틸글루코스아민뇨증, 월만병, 시스틴증, 다논병, 파브리병, 파버병, 푸코사이드 축적증, 고셔병, GM1-강글리오사이드증 유형 I/II/III, GM2-강글리오사이드증, 알파-만노사이드축적증 유형 I/II, 베타-만노사이드축적증, 이염성 백질이영양증, 사이알리도시스 유형 I/II, 뮤코지질증 유형 IV, 샤이에(Scheie) 증후군, 헌터 증후군, 산필립포(Sanfilippo) 증후군 A, 산필립포 증후군 B, 산필립포 증후군 C, 산필립포 증후군 D, 갈락토시알리도시스(Galatosialidosis) 유형 I/II, 크라베병, 샌드호프병, 보그트-스필마이어 병, 헐러 증후군, 니만-픽 유형 C 이외의 니만-픽 질병, I-세포병(뮤코지질증 II), 슈도-헐러 다발성이영양증, 모르키오(Morquio) 증후군, 마로토-라미(Maroteaux-Lamy) 증후군, 슬라이(sly) 증후군, 뮤코다당질 축적증 유형 IX, 다발성 설파타제 결핍증, 바텐 병, 테이-삭스 병, 폼페 병, 바텐 병, 바텐 병, 후기 영아기, 노던 뇌전증, 농축이골증, 쉰들러 병, 시알루리아(Sialuria) 및 살라 병으로부터 선택된다.

특정 구현예에서, 리소좀성 축적 장애는 테이-삭스 병, 스핑고지질증, 고셔병, 뮤코지질증, 갈락토시알리도시스, 살라 병, 시스틴증, 다논병, 파브리병, 파버병, 리포푸신증, 폼페병, 강글리오사이드증, ISSD, 크라베병, NPC 이외의 니만-픽 질병, 이염성 뇌백질이영양증, 헐러 병, 샤이에 병, 헌터 병, 산필립포 병, 샌드호프 병, 쉰들러 병, 바텐 병 또는 월만 병이다.

추가의 구현예에서, 리소좀성 축적 장애는 NPC 이외의 니만-픽 질병, 테이-삭스 병, 파브리 병, 파버 병, 산필립포 병, 바텐 병 또는 월만 병이다.

7. 실시예

하기 실시예는 예시 및 실례로서 제공되는 것이지 제한되는 것은 아니다.

7.1. 실시예 1: 니만-픽 질병 유형 C의 I상 임상 시험

하기 프로토콜에 따라 시판되는 비경구 등급 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물을 사용하여 NIH에 의해 1상 임상 시험을 개시하였다.

7.1.1. 프로토콜

NIH에 의해 진행된 본 제1상, 비-무작위, 공개-라벨 단일-기관 연구에서, 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린(Kleptose® HPB, Roquette)이 요추 주사를 통해 척수강 내로 3명의 환자의 약물-미접촉(naive) 코호트에 각각 200 mg의 초기 용량으로 투여한 후 300, 400 mg 및 900 mg으로 증가시키면서 투여되었다. 코호트의 모든 환자(코호트 당 3명의 환자)는 매월 최소 2회 HP-Beta-CD를 접종받고, 용량-확대는 안전성 및 생화학 데이터에 근거한다. 이후의 용량 확대는 300 mg까지 증가시키면서 수행한다. 안전성은 부작용(AEs), 청력 평가, 임상 검사, 바이탈 사인, 신체 검사, 흉부 X-레이 및 심전도(ECGs)에 의해 평가된다. 생화학적 유효성은 혈장 24(S)-HC에서의 기준선으로부터의 변화에 의해 측정된다. PK는 혈장 HP-베타-CD에 대해 평가된다.

7.1.2. 의약품(Kleptose® HPB)

본 제I상 임상 시험에서 사용된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 제품은 약 4.34 ± 10%의 DS_a를 갖는 Kleptose® HPB(Roquette, France)였다.

7.1.3. 선정 기준

환자 적격성 선정 기준은 다음과 같았다:

1) 성별과 인종에 관계없이 등록 시점에 2세 이상 25세 이하의 나이.

2) 다음 중 하나를 기반으로 NPC1을 진단함:

a) 2개의 NPC1 돌연변이;

b) 양성 필리핀(filipin) 염색 및 적어도 하나의 NPC1 돌연변이;

c) 다음 중 하나와 복합된 수직 핵 심근 마비(VSNGP):

i) 하나의 NPC1 돌연변이

ii) 양성 필리핀 염색 및 NPC2 돌연변이 없음.

3) NPC1의 신경학적 징후가 적어도 하나있는 환자. 예를 들어, 청력 상실, 수직 핵상 주시 마비, 운동 실조증, 치매, 근육 긴장 이상, 발작, 구음 장애 또는 연하 곤란증을 갖지만, 이에 한정되지는 않음.

4) 평가 및 후속 조치를 위해 NIH CC로 반복적으로 이동할 수 있는 능력.

5) 미글루스타트(miglustat)를 복용하는 경우, 환자는 기준선 평가 이전에 3개월 이상 일정량의 복용 약제를 섭취했어야 하며, 시험 지속 동안 그 투여량 수준을 기꺼이 유지해야함.

6) 연령에 적합한 종합 비타민을 제외하고 모든 비-처방 보충제를 중단할 의향.

7) 생식연령의 여성은 시험 지속 동안 효과적인 피임법을 기꺼이 사용해야함.

8) 연속 혈액 및 뇌척수액(CSF) 수집을 포함한 임상 시험의 모든 측면에 참여할 의향.

7.1.4. 제외 기준

환자 적합성 제외 기준은 다음과 같았다:

1) 등록 시점에 2세 미만 또는 25세 초과.

2) 체중이 생리 식염수 또는 약물 투여시 0.2 EU/kg을 초과하는 내독소 수준을 초래할 경우 피험자는 제외될 것임.

3) 이 프로토콜의 요구 사항을 준수하는 환자의 능력을 저해하는 NPC1의 심각한 증상.

4) 신경학적으로 무증상인 환자.

5) NPC1을 치료하기 위해 임의의 형태의 시클로덱스트린을 투여받은 환자. 부형제로서 시클로덱스트린을 함유하고 있는 다른 의학적 징후에 대한 다른 약물 제제로 치료하면 환자를 제외하지 않을 것임.

6) 시클로덱스트린 또는 제형의 성분에 대한 과민 반응의 병력.

7) 연구 중 언제든지 임신 또는 모유 수유.

8) CNS 감염 의심 또는 임의의 전신 감염이 있는 환자.

9) 요추 천자를 수행하는 능력에 영향을 줄 수 있는 척추 기형.

10) 요추 부위의 피부 감염.

11) 절대 호중구 수(ANC)가 1,500 미만인 호중구 감소증.

12) 혈소판 감소증(혈소판 수가 75,000/mm³ 미만).

13) CSF의 순환 장애의 증거.

14) 마취 사용금지사유.

15) 항 응혈제의 사전 사용 또는 임상 출혈 위험이 증가하거나 출혈 위험이 2 INR 이상인 출혈 장애의 병력/존재.

16) 황달 또는 우상 사구체 통증의 증상이 있는 급성 간 질환의 임상 증거가있는 환자.

17) 빈혈의 존재는 나이와 성별에 대해 정상보다 2 표준 편차 이하로 정의됨.

18) 18세 이상의 대상의 경우, eGFR은 CKD-EPI 크레아티닌(Creatinine) 2009 방정식을 이용하여 NIH CC 실험실에서 자동으로 계산되고, 보고된다. eGFR이 60 mL/분/1.73 m² 이하인 경우 18세 이상의 대상은 제외된다. 18세 미만의 대상의 경우, NKDEP 계산기가 활용된다(http://www.nkdep.nih.gov/lab-evaluation/gfr-calculators/children-conventional-unit.shtml). 결과는 > 75 mL/분/1.73 m² 이하로 보고된다. eGFR이 75 15 mL/분/1.73 m²이하이면 18세 미만의 대상은 제외된다.

19) 미국 비뇨기과 학회(American Urological Association, AUA)에 의해 정의된 단일 요 검사에 대한 혈뇨는 적절하게 수집된 요 검사실 표본에서 요로 퇴적물의 미세한 평가에 대해 고출력장 당 5개 이상의 적혈구(또는> 25/micro L). 2개의 연속적인 소변 표본이 AUA에 정의된 바와 같이 혈뇨에 음성이라면 환자는 제외되지 않을 것이다.

20) 환자의 일차 의료 제공자 또는 NIH 신장학 자문관 또는 정상적인 요 단백 크레아티닌 비율의 문맥 및 임상 증상(부종, 고혈압)이 없는 경우로 평가되고 양성으로 분류되지 않는 한 단백뇨(요분석시 1+ 단백질).

21) 활동성 폐 질환, 산소 필요량 또는 임상적으로 중요한, 혈액 산소 포화도 감소, 폐 치료 또는 적극적인 흡입이 필요한 병력.

22) 순음 역치 평가(500 Hz 내지 8000 Hz)를 포함한 행동 청력 평가를 완료할 수 없는 환자는 내이신경 독성을 모니터링하고 OAE는 기준선에서 안정적으로 얻을 수 없다.

23) 등록 전 2개월 동안 빈도, 유형 또는 지속 기간이 안정하지 않은 지속적인 경련 환자, 등록 전 2개월 동안 항 경련제의 복용량을 변경해야 하는 환자(체중에 따른 조절 제외) 또는 발작을 조절하기 위해 3가지 이상의 항 경련제가 필요한 환자.

24) 연구자의 견해로는 프로토콜을 준수할 수 없거나 잠재적으로 참여 위험을 증가시킬 수 있는 특정 건강 문제가 있는 환자.

7.1.5. 임상 데이터의 초기 분석

Kleptose® HPB("I-IND")의 뇌척수강내 투여를 사용하는 또 다른 기관의 개별 IND로부터의 추가 데이터를 갖는 본 연구의 초기 데이터를 하기와 같이 분석하였다.

7.1.5.1. 초기 데이터 분석 요약

본 발명자는 NIH 대상 및 다른 기관의 I-IND 연구로부터의 3명의 대상을 포함하는 데이터 세트에서 NPC 임상의 중증도 점수 및 주요 영역의 변화율을 조사하기 위해 분석을 수행하였다. 주요 결과는 다음과 같다:

표 2 및 표 3(하기 참조)을 비교할 때, 약물 투여량은 NPC 임상 중증도 점수 및 그 영역의 변화율에 영향을 미치고, 청력에서 가장 큰 변화가 관찰된다.

시클로덱스트린은 일반적으로 NPC 임상의 중증도 점수 및 그의 구성 요소의 감소율을 감소시킨다(표 4)(아래). 이는 안구 운동, 청력 및 발작을 제외한 모든 구성 요소에 해당된다.

시클로덱스트린과 NIH 자연 경과 연구를 NIH 대상자와의 비교(표 5)를 제한할 때, 상기 패턴은 안구 운동을 제외하고 느린 속도로 감소하는 시클로덱스트린 그룹과도 일치한다.

제I상 임상 시험 데이터의 초기 분석으로부터의 결과를 도 2 및 도 3에 요약하였다.

7.1.5.2. 분석 방법

하기 분석의 목적은 Kleptose® HPB로 뇌척수강내 치료를 받는, 12명의 NIH 1상 연구 대상("CDA"로 시작하는 식별) 및 다른 기관의 3명의 대상("I-IND"로 시작하는 식별)에서 시간에 따른 변화를 이해하는 것이었다. 하기 결과는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린을 투여받은 15명의 대상에 기반을 둔다. 대상인 CDA113과 CDA114는 아직 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 투여량을 받지 않았기 때문에 다음 분석에 포함되지 않았다. 15명의 대상 중 4명은 기준선 및 6개월(대상 CDA110, CDA111, CDA112 및 I-IND-3)에서 이용가능한 자료를 가지고 있으며; 나머지 11명은 기준선, 6개월 및 12개월(CDA101-CDA109, I-IND-1)에서 이용가능한 데이터를 가지고있다.

시간에 따른 변화의 추정 기울기를 얻기 위해 선형 혼합 모델을 사용했다. "선형 혼합 모델"에서 혼합된 단어는 모델에 "고정" 효과와 "무작위" 효과가 모두 포함되어 있음을 나타내는데 사용된다. 모델의 "무작위" 부분은 각 주제에 대한 반복 측정값 또는 데이터의 종단 특성을 설명한다. 모델의 "고정된" 부분은 시간의 경과에 따른 평균 변화량, 즉 변화의 기울기를 제공한다. 이 방법은 모든 수집된 데이터를 사용하고 상호작용 용어가 그룹의 다른 변화율을 탐색할 수 있기 때문에 유리하다. 이 모델은 구조화되지 않은 상관 행렬을 가정하여 적합하며, 이는 여러 측정 간의 상관 관계에 대한 가정이 없었으며, 각 상관 관계가 추정됨을 의미한다. 미래의 분석에서 투여량과 같은 공변량의 영향을 조사하기 위해 아래 모델에 공변량을 추가할 수 있다.

본 분석에서 제시된 각각의 모델에 대한 회귀 분석을 계산하고, 아웃라이어/영향 관찰이 확인된 모델을 재구성하여 잠재 아웃라이어/영향 관찰을 식별하기 위해 Cook's D를 사용하였다(주의: 아웃라이어/영향 관찰은 0.4 이상의 Cook's D 값을 갖는 관찰로 정의됨). 잠재적인 아웃라이어를 식별하기 위한 결과와 공변량을 포함하기 때문에 Cook's D를 관심있는 진단으로 선택했다. 아웃라이어가 식별되면, 두 세트의 모델이 제시되며, 제시된 첫 번째 모델은 전체 데이터 세트를 기반으로 하는 반면, 두 번째 모델 세트는 아웃라이어를 제거한 데이터를 기반으로 한다. 이 분석을 위해 기준치가 아닌 I-IND-1 대상자의 모든 값을 제거했다. 이 값들은 표 2와 표 3의 마지막 두 열에 있다. 이 두 분석 결과는 1상 연구에서 15명의 비교적 작은 샘플 크기와 (전체 데이터 세트가 포함된 경우) 모델에 포함된 총 41회의 관찰 결과로 상당히 다를 수 있다.

또한, NIH 자연 경과 데이터 세트에 대한 1상 연구 대상의 비교를 위해 동일한 접근법을 사용하였다. NIH 자연 경과 데이터 세트는 Yanjanin et al., "Linear Clinical Progression, Independent of Age of Onset, in Niemann-Pick Disease, Type C," Am. J. Med. Genet. Part　B 153B:132-140 (2010)에 기술되어 있다.

본원에서 제시된 분석을 위해, 시클로덱스트린을 투여받은 대상에게 기본 모델을 적합하게 하였다(표 2에 제시). 이 분석을 위해, 본 발명자들은 1년 동안 해당 NPC 결과에 예상되는 변화를 제시한다. 표 3에서, 본 발명자들은 받은 투여량을 제어하면서 시간 경과에 따른 평균 변화에 대한 결과를 제시한다. 표 4와 표 5는 NIH 자연 경과 연구에서 유사한 연령대의 대상과 시클로덱스트린 대상을 비교하는 모델을 제시한다. 제시된 결과는 두 그룹 사이의 기울기의 동등성을 테스트하기 위한, 두 그룹의 추정된 기울기 및 p-값이다.

7.1.5.3. 시클로덱스트린을 투여받은 대상의 시간 경과에 따른 변화

표 2는 적어도 하나의 투여량의 시클로덱스트린을 투여받은 15명의 대상에 대한 전체 NPC 점수 및 각각의 성분에 대한 평균 기울기를 나타낸다. 이 결과는 1년 동안의 결과 변화율에 대한 정보를 제공한다. 이 비율은 이전의 분석에서 제시된 전체 자연 경과 인구에서 관찰된 것보다 작다. 참고: 총 31점, 청력 제거 후 총점 31점, 보행이 4점, 연하가 3점, 소근육 운동이 4점, 및 인지가 4점인 1명의 I-IND 대상에 대한 기준선 데이터를 삭제했다. 이 대상은 시간이 지남에 따라 개선되었다. 또한 1명의 NIH 대상자는 이 영역에서 5의 높은 값으로 인해 안구 운동 분석에 아웃라이어였다. 전체 데이터 세트에 대한 분석은 2열과 3열에 개시되어 있으며, 아웃라이어를 제거하여 얻은 결과는 4열과 5열에 개시된다.

[표 2]

표 3은 모델의 일부로서 투여량을 포함하는 분석 결과를 포함한다. 이 모델은 약물 투여량에 대한 정보를 제공한다. 청력을 볼 때 이것의 효과에 유의한다. 투여량이 모델에 포함되면, 시간 경과에 따른 변화의 기울기는 더 이상 중요하지 않다.

[표 3]

7.1.5.4. 자연 경과 연구에서 1상 및 I-IND 연구의 대상과 대응하는 대상의 비교

시클로덱스트린의 효과를 더 잘 이해하기 위해, NIH 자연 경과 연구에서 1상 및 I-IND 연구의 대상과 비교가능한 연령의 대상을 비교했다. 이 비교를 위해 본 발명자들은 데이터 세트를 데이터의 단일 시점 이상으로 6세에서 26세 사이의 대상으로 제한했다. 모델에서 치료 그룹 상호작용 용어로 시간, 치료 그룹 및 시간이 혼합된 모델에 적합하다. 하기 표 4는 이 분석의 결과를 보여준다.

표 4에 제시된 결과는 안구 운동 및 청력 서브영역을 제외하고 자연 경과 인구와 비교하여 시클로덱스트린 그룹의 더 느린 변화 속도와 일치한다.

[표 4]

7.1.5.5. 자연 경과 연구에서 1상 연구의 대상과 대응하는 대상의 비교

NIH 집단 내에서 시클로덱스트린의 효과를 더 잘 이해하기 위해서, 본 발명자들은 자연 경과 연구에서 1상 연구의 대상과 비교 연령의 대상을 비교했다. 이 비교를 위해 본 발명자들은 데이터 세트를 1개 이상의 시점 데이터를 가지고 있으며, 6세에서 26세 사이의 대상으로 제한했다. 모델에서 치료 그룹 상호작용 용어로 시간, 치료 그룹 및 시간이 혼합된 모델에 적합했다. 하기 표는 표 4의 결과와 유사한 이러한 분석의 결과를 나타낸다. 발작 결과는 몇 가지 아웃라이어에 의해 다소 불안정함을 유의한다. 전체 데이터 세트 결과만 표시된다. 안구 운동을 제외하고, 시클로덱스트린 그룹의 모든 비율은 자연 경과 연구에서 관찰된 것보다 작다.

[표 5]

7.1.5.6. 미글루스타트를 사용한 적이 있는 대상만 비교하는 분석

아래에 제시된 결과는 기간 동안 미글루스타트를 사용한 대상을 포함한다. 여기에는 자연 경과 연구에서 8명, 1상 연구에서 14명이 포함된다. 그후, 표 4에 제시된 분석을 이 모집단에 다시 적용한다. 상기 결과를 하기 표 6에 나타낸다.

[표 6]

하기 표 7은 NIH 대상만을 포함하는 결과를 나타낸다. 이 비교를 위해 I-IND의 3명의 대상이 제거된다. 여기 제시된 결과는 위의 표 5에 제시된 결과와 유사하다. 두 집단의 차이는 자연 경과 연구의 5명의 NIH 대상과 1상 연구의 1명의 NIH 대상이 어느 시점에서도 미글루스타트 사용을 보고하지 않았기 때문에 인구 집단에서 제거되었다는 점이다.

[표 7]

7.1.6. 임상 데이터의 추가 분석

동일한 NIH 임상 시험 데이터세트에서 추가 분석을 수행하였지만, 대조 데이터 세트에 포함된 4개의 데이터 포인트는 상기한 분석에 포함되지 않았다. 이들 분석은 도 4, 5, 6 및 8에 요약되어있다.

7.2. 실시예 2: 의약품의 표준 분석

실시예 I에 기술된 I상 임상 시험에서 사용된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 제품은 약 4.34 ± 10%의 DSa를 갖는 Kleptose® HPB(Roquette, France)였다. 제조업체에서 수행한 두 가지 예시적인 Kleptose® HPB 롯트의 표준 분석은 하기 4 페이지에 개시되어 있다.

7.3. 실시예 3: 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물의 HPLC 분리

상업적으로 입수가능한 비경구 등급 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 약학적 조성물인 Kleptose® HPB에서 시클로덱스트린 혼합물의 복잡도를 평가하기 위해 다양한 크로마토그래피 방법을 사용하였으며, 이의 배치는 I상 임상 시험에서 사용하였다.

7.3.1. CD-스크린 컬럼

유럽 약전 논문 1804(히드록시프로필 베타덱스)(2009년 1월 1 일 개정)의 HPLC 방법을 상업용 Kleptose® HBP　(Roquette)에서 성분을 분리하는데 사용하였다.

HPLC 조건: 정지상: CD-스크린, 입자 크기 5 ㎛(ChiroQuest), 컬럼:l=250 mm, Ø=4.0 mm; 온도: 30℃. 이동상: 이동상 A: 물; 이동상 B: 물:메탄올(10:90 V/V). 유속: 1.0 mL/분; 검출: Alltech 3300 증발 광-산란 검출기; 운반 기체: 질소; 유속: 1.5 L/분; 증발기 온도: 70℃; 주입: 20 μL.

구배 프로그램(유럽 약전 방법):

[표 8]

도 9는 CD-스크린 HPLC 방법에서 Kleptose® HBP(DS_a=4.2) 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 결과를 나타낸다. DS의 수가 증가하는 순서대로 종이 용리되었다. 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린은 약 5분에 용리되었으며, 단일 치환된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린은 약 6분에 용리되었다. 도 10은 메탄올 및 아세토니트릴 용매 구배(메탄올에 의한 구배: 0분 30% B, 40분 100% B; 아세토니트릴에 의한 구배: 0-5분 18% B, 25분 40%의 B. 다른 방법 변수들은 변경되지 않음)를 갖는 CD-스크린 컬럼을 사용한 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 비교 크로마토그램을 도시한다. 체류 시간은 용매 세기 및 이동상의 극성에 따라 달라졌다.

질량 분광법 검출법: 6460 삼중 4극 질량 분광계를 갖는 Agilent 1260 HPLC. Agilent 제트 스트림(Jet Stream) 전자분무 이온화(ESI) 공급원, 음극 모드, m/z 500-3000; 단편파 전압: 35V, 공급원 파라미터: 가스 온도: 300℃, 가스 유속: 13 L/분, 네뷸라이저: 60 psi, 차단 가스(sheath gas) 유속: 11 L/분, 차단 가스 온도(히터): 400℃, 모세관 전압: 3500V. HPLC-MS 측정을 위해 이동상에 물 대신에 포름산 암모늄 완충액(0.1M, pH=6.0)을 적용하였다.

도 11은 HPLC-MS 분석으로부터 샘플의 추출된 이온 크로마토그램을 나타낸다. BCD = 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린; DSx = x의 DS를 갖는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린. 예를 들어, "DS3"은 DS=3인 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린을 지칭한다.

7.3.2. 역상 C18 크로마토그래피

Kleptose® HBP(Roquette)(섹션 5.3.1에서 사용된 것과 동일한 배치)를 분석하였다. 분석 컬럼(4mm × 250mm)에 LiChroprep RP18 실리카 겔을 채웠다. 실험 조건 중 한 세트는 다음을 포함했다: 정지상: LiChroprep RP18 실리카 겔, 입자 크기 25-40 μm(Merck), 컬럼: l=250 mm, Ø=4.0 mm; 온도: 30℃. 이동상: 이동상 A: 물; 이동상 B: 물:메탄올 R(10:90 V/V). 구배 프로그램은 다음 조건을 사용했다: 10% 이동상 B 구배의 0분 내지 100% 이동상 B의 20분. 유속:1.0 mL/분; 검출: Alltech 3300 증발 광-산란 검출기; 운반 기체: 질소; 유속: 1.5 L/분; 증발기 온도: 70℃.

도 12는 LiChrosphere C18 정지상 상의 Kleptose® HPB(DS_a=4.2)의 전형적인 HPLC 크로마토그램을 도시한다. 도 13은 메탄올 및 아세토니트릴 용매 구배를 갖는 LiChrosphere C18 컬럼을 사용하는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 비교 크로마토그램을 나타낸다. (메탄올에 의한 구배: 0분 10% B, 15분 30% B, 40분 80% B. 아세토니트릴에 의한 구배: 0분 5% B, 40분 80% B. 다른 방법 변수들은 변하지 않았다)

섹션 5.3.1에 기술된 바와 같은 질량 분광분석 조건을 사용하였다. 도 14는 HPLC-MS 분석으로부터 상이한 DS를 갖는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 추출된 이온 크로마토그램을 도시한다.

7.3.3. 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)

친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)는 역상 크로마토그래피에서 전형적으로 사용되는 용리액으로 친수성 고정상을 사용한다. 이 접근법은 극성이 증가하는 순서로 피분석물이 용리될 수 있도록 액체-액체 파티션 크로마토그래피 원리를 사용한다. 본원에 기술된 방법은 실리카 겔의 표면에 결합된 아미노프로필기를 함유하는 아미노 컬럼을 사용하였다.

Kleptose® HBP(Roquette)(섹션 5.3.1에서 사용된 것과 동일한 배치)를 분석하였다. HPLC 조건: 정지상: Nucleosil NH2, 입자 크기 5 μm(Macherey Nagel), 컬럼: l=250 mm, Ø=4.0 mm; 온도: 30℃. 이동상: 이동상 A: 아세토니트릴-물(80:20 V/V); 이동상 B: 물. 유속: 1.0 mL/분; 검출: Agilent 385 증발 광-산란 검출기; 운반 기체: 질소; 유속: 1.2L/분; 증발기 온도: 50℃; 네뷸라이저 온도: 30℃.

도 15는 Nucleosil NH2 컬럼상에서 HILIC 방법을 사용하여 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린을 분리하는 것을 나타낸다.

질량 분석 조건은 섹션 5.3.1에서 기술된 것과 동일하였다. 도 16은 HPLC-MS 분석으로부터 상이한 DS를 갖는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 추출된 이온 크로마토그램을 나타낸다. BCD = 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린; DSx = x의 DS를 갖는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린. 예를 들어, "DS3"은 DS=3인 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린을 지칭한다. 이 HPLC 방법에서, 보다 높은 DS 치환된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린이 먼저 용리된다.

7.3.4. 실리카 겔 크로마토그래피

Kleptose® HBP　(Roquette)(섹션 5.3.1에서 사용된 것과 동일한 배치)를 분석하였다. HPLC 방법: 정지상: LiChrosphere Si-60, 입자 크기 5 μm(Merck), 컬럼: l=250 mm, Ø=4.0 mm; 온도: 30℃. 이동상: 이동상 A: 아세토니트릴-0.1M 포름산 암모늄 pH=7.5(80:20 V/V); 이동상 B: 0.1M 포름산 암모늄 pH=7.5. 유속: 1.0 mL/분; 검출: Agilent 385 증발 광-산란 검출기; 운반 기체: 질소; 유속: 1.2L/분; 증발기 온도: 50℃; 네뷸라이저 온도: 30℃.

도 17은 LiChrosphere Si 60 컬럼을 사용하여 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 성분을 분리한 것을 나타낸다. 이 예에서, 샘플은 검출을 용이하게 하기 위해 베타-시클로덱스트린으로 스파이크되었다.

질량 분석 조건은 섹션 5.3.1에서 기술된 것과 동일하였다. 도 18은 상이한 DS를 갖는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 추출된 이온 크로마토그램을 나타낸다. BCD = 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린; DSx = x의 DS를 갖는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린. 예를 들어, "DS3"은 DS=3인 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린을 지칭한다. 이 HPLC 방법에서, 보다 높은 DS 치환된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린이 먼저 용리된다.

7.4. 실시예 4: 개선된 분석 방법

7.4.1. 가스 크로마토그래피

히드록시프로필베타덱스내 프로필렌 글리콜(PG) 함량을 측정하기 위한 공식적인 유럽 약전 논문 방법은 HPBCD에 비하여 단지 약 0.5%의 정량 한계를 갖는다. 따라서, 좀 더 민감한 분석 방법이 필요했고, 수정된 샘플 제조에 의한 개선된 방법이 개발되었다(유럽 약전 히드록시프로필베타덱스 분석과 비교됨, 논문 번호: 1804, 2009년 1월 1일 개정). 이 방법은 (HPBCD에 대하여) 0.01% 수준에서 PG를 정량화하는데 사용되었으며, 이는 유럽 약전 방법의 검출 한계보다 훨씬 더 민감하다.

이 방법의 조건은 다음과 같다: 장치: 가스 크로마토 그래프: Shimadzu GC-17A; 검출기: 화염 이온화 검출기(FID); 주입기: Shimadzu AOC-5000 자동 주입기; 소프트웨어:Shimadzu Class-VP 7.4 버전; 가스: 운반 가스: 헬륨(99.999%), 기타 가스: 질소(99.999%), 합성 공기(99.999%), 수소(Whatman 수소 발생기로부터).

컬럼: Supelco Supercowax-10(30 m × 0.32 mm × 1.0 μm)

프로필렌 글리콜 보유시간 ~ 6.35분; 내부 표준 에틸렌 글리콜 보유 시간 ~ 7.15분.

5개의 보정 점: HPBCD와 관련된 0.01%, 0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2% PG에 상응하는 0.1 내지 2mg/mL.

보정 모액을 약 200 mg의 프로필렌 글리콜 용액으로부터 제조하고, 10 mL 눈금 유리 플라스크에 정확하게 칭량하고, 정제된 물로 표선까지 채웠다(표 14). 하기 표에 나열된 농도를 얻기 위해, 적절한 희석을 수행하였다. 일단 표적 농도(하기 표 14 참조)가 달성되면, 이 용액으로부터 1 mL, 내부 표준 용액(IST) 100 μL, NaCl 500 mg 및 물 1 mL를 크루 캡 바이알에 첨가하고, 용액을 1 mL 디클로로메탄(DCM)으로 추출하였다. 샘플을 유기상으로부터 수확하고, 직접 주입하였다.

[표 14]

5개의 평행 측정(요구조건: RSD < 5% - PG 및 EG의 면적비의 RSD)을 수행함으로써 시스템 적합성을 결정하는데 보정 용액 KAL2를 사용하였다.

추출 블랭크 샘플: 1 mL의 DCM을 0.1 mL의 IST 용액, 500 mg의 NaCl 및 2 mL의 증류수에 첨가한 다음, 0.5분 동안 격렬하게 교반하고, 방치하였다. 상 분리 후, 약 0.2 mL의 DCM 상을 바이알에 넣었다.

샘플 제조: 크루 캡 바이알내 1.0 g의 HPBCD 샘플, 0.1 mL의 IST 용액, 500 mg의 NaCl 및 2 mL의 증류수에 DCM 1 mL를 첨가하고, 0.5분 동안 격렬하게 교반하고, 방치하였다. 상을 분리한 후 약 0.2 mL의 DCM 상을 바이알에 넣었다. 약 0.18% PG를 함유하는 Kleptose®HPB　(Roquette) 샘플의 대표 크로마토그램을 도 25에 나타내었다.

HPBCD 샘플의 프로필렌 글리콜(PG) 함량은 PG/EG 피크 영역의 함수로서 프로필렌 글리콜/에틸렌 글리콜(PG/EG) 중량-농도 비율(mg/mL)을 나타내는 검량 곡선을 플로팅하여 계산하였다. HPBCD 샘플에서, 알려지지 않은 매개 변수는 다른 세 가지 요인 및 보정 곡선의 방정식에서 유도된 PG 함량이다.

2-치환된 및 3-치환된 유도체로부터 모노프로필렌 글리콜을 분리하는 방법의 적합성이 도 26에 도시되어 있다. 과치환된 글리콜은 여러 개의 피크를 나타냈으며, 더 높은 비점으로 인해 나중에 용출되었다. 디프로필렌 글리콜 및 트리프로필렌 글리콜 함량을 시작 물질 및 최종 샘플에서 시험하였다.

상기 방법의 선형성은 표 14에 기술된 바와 같이 HPBCD와 관련된 0.01%, 0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2% PG에 상응하는 0.1 내지 2 mg/mL의 PG 농도의 5개의 샘플을 시험함으로써 입증되었다. 각각의 샘플은 방법의 정확성을 평가하기 위해 3회 분석되었다. 표 15는 정밀도 및 선형도 분석의 실험 데이터를 요약하고 있다. 보정 세트의 선형도 곡선은 도 27에 도시된다.

[표 15]

표 15의 데이터는 이 방법이 0.01-0.2% PG 함량 범위에서 선형임을 보여주었다.

7.4.2. 분석 HPLC

잔류 BCD(치환되지 않은 베타-시클로덱스트린) 함량, 치환도 1의 HPBCD 분획 및 BCD 이외의 시클로덱스트린(CD) 관련 불순물의 합을 유럽 약전 7.8(히드록시프로필베타덱스, 논문 번호: 1804, 2009년 1월 1일 개정) 및 섹션 5.3.1에 기술된 HPLC 방법으로 측정하였다. 물질의 분포 지문도 동일한 방법으로 기록하였다.

7.4.3. NMR

¹H-NMR 스펙트럼으로부터 무수글루코스 단위의 C1 탄소(아노머성 양성자)에 결합된 양성자로부터의 신호 및 히드록시프로필기의 메틸기의 3개의 양성자로부터의 신호의 비로부터 평균 치환도(DS_a)를 계산하였다.

~ 1.2 ppm에서의 메틸기로부터의 이중 피크 면적(A) 및 + 5 ppm 내지 + 5.4 ppm의 아노머성 양성자 신호의 피크 면적(B)을 ¹H NMR로부터 측정하였다. 예시적인 스펙트럼은 도 28에 도시된다. 참고로, 아노머성 양성자의 피크 면적은 7.0으로 설정되었는데, 이는 7개의 양성자가 베타-시클로덱스트린 유도체에서 피크를 제공하기 때문이다. 기준 피크의 할당 후, DS_a=A/3의 식을 사용하여 평균 치환도를 계산하였다.

7.4.4. 콜레스테롤 가용화 분석

시험관내 콜레스테롤 가용화 분석은 하기와 같이 수행하였다. 증류수내 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물 시험 용액을 실온에서 교반하고, 과량의 에스테르화되지 않은 콜레스테롤을 첨가하여 콜레스테롤의 양이 용해되지 않도록 한다. 24시간 후, 고체를 여과해 내고, 용액에 존재하는 콜레스테롤을 HPLC 방법으로 측정한다.

HPLC 조건: 분석 컬럼: Nucleosil 120, C8, 5㎛, 100mm × 4.0mm(Macherey Nagel); 컬럼 온도: 40℃; 이동상: 아세토니트릴:물=78:22; 유속: 1.5 mL/분; 주입량: 20 μL; 검출기:UV 210 nm; 정지 시간: 5분.

아세트니트릴/이소프로판올(75:25) 10 ㎖에 콜레스테롤 10 ㎎을 칭량하여 옮겨 콜레스테롤의 모액을 제조한다. 모액을 HPLC 이동상으로 10배 희석(0.1 mg/mL의 농도가 되도록)하여 콜레스테롤의 기준 용액을 제조한다.

용해도 실험을 위한 샘플을 아세토니트릴로 2배로 여과한 후 희석하고, 필요하다면 추가의 HPLC 이동상을 추가의 희석에 사용한다.

용해된 콜레스테롤의 농도는 하기 식으로 결정된다:

콜레스테롤 농도(mg/mL) = (면적S/면적R) × 농도R

면적 _S = 샘플 용액의 크로마토그램으로부터 콜레스테롤의 피크 면적

면적 _R = 기준 용액의 크로마토그램으로부터 콜레스테롤의 피크 면적

농도_R= 보정 표준 용액 내 SBECD-WS의 농도(mg/mL).

7.5. 실시예 5: 전자분무 MS 분석

상기 실시예 2에서 논의된 바와 같이, Kleptose® HPB는 평균 몰 치환도가 0.58 내지 0.68(DS_a 4.06 - 4.76)이고, 2개의 대표적인 배치는 0.62(DS_a 4.34)의 평균 치환도를 갖는다. 다른 제조사에서 입수할 수 있는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 조성물인 Trappsol® Cyclo™는 약 0.91(DS_a 6.37)의 보다 높은 보고된 평균 몰 치환도를 갖는다.

전자분무 질량 분석은 2개의 상이한 실험실에 의해 Kleptose® HPB 및 Trappsol® Cyclo^TM(CTD Holdings, Inc.)("Trappsol®")의 상업적으로 입수가능한 샘플에서 수행되었다.

제1 실험실에서 사용된 방법은 다음과 같다. 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린("HPBCD") 샘플 약 50 μg을 물 내 80% 메탄올 중 1% 포름산 1 mL에 용해시켰다. 이 HPBCD 용액을 API-4000 질량 분석기(Applied Biosystems)에 주입하였다. m/z 1100에서 2000까지의 MS 스캐닝에 양이온 전자분무 모드를 적용되었다. MS 스펙트럼(10-15개의 평균 스캔)을 기록했다. β-시클로덱스트린의 프로필렌 옥사이드 부가 생성물의 각 시그널 높이를 측정하고, HPBCD의 프로필렌 옥사이드 부가물 집단을 개별 시그널 높이의 합으로부터 계산하였다. Analyst 1.51 소프트웨어(Applied Biosystems)를 MS 조작에 사용하였다. 도 29에 도시된 바와 같이, 제1 실험실의 전자분무 MS 데이터는 평균 몰 치환의 차이가 Kleptose® HPB(도 29a) 및 Trappsol®(도 29b)에서 히드록시프로필 치환의 현저히 상이한 정도 및 분포에 의해 유발된다는 것을 입증한다. 각각의 피크에서 히드록시프로필 모이어티의 수를 확인하기 위해 스펙트럼에 수를 더했다.

제2 실험실에서 사용된 방법은 다음과 같다. 샘플을 물 1mL 당 1 mg으로 준비하고, 전자분무를 위해 1:1 물:아세토니트릴에서 ~ 5 μM로 희석하였다. 600 nL/분의 직접 주입 속도(150℃에서 차단 가스 및 1500 V의 Vcap 전위에 의한 5 L/분의 유속)로 Agilent 나노분무(Nanospray) 공급원을 사용하여 이온이 형성되었다. ESI 공급원과 이온 이동도 드리프트 튜브 사이의 계면내 전위는 최적의 신호 강도를 위해 조정되었다. 스펙트럼은 드리프트 튜브를 가로질러 단일 전위에서 3분 동안 축적되었고, 전자분무 플륨(plume)에서 이온의 다중 등급들 사이의 이온 이동도 분리를 명확하게 보여주었다. 사용된 분석기는 선형, 저전압 이온 이동도 질량 분석기인 Agilent 6560이었으며, 이온 깔때기 기술을 사용하여 MS 샘플링 오리피스에서 IM 드리프트 튜브를 수용하는 Agilent Q-TOF의 실질적으로 수정된 버전으로 간주될 수 있다. 도 30에 도시된 제2 실험실로부터의 전자분무 MS 데이터는 치환 지문(도 30a(Kleptose® HPB)와 30b(Trappsol®)을 비교함)의 차이를 확인한다. 데이터는 또한 전자분무 MS가 충분히 견고하여 분석 실험 도구에 의해 반복적으로 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 조성을 핑거프린트할 수 있는 다른 연구소에 의해 정기적으로 사용될 수 있는 분석 도구임을 확인했다.

도 31은 2개의 상이한 실험실(도 31a 및 31b, 제2 실험실; 도 31c, 제1 실험실)에 의해 수행된 3개의 상이한 Kleptose® HPB로부터의 전자분무 MS 데이터를 비교하고, 치환 지문이 롯트들간에 거의 동일함을 입증한다. 치환 지문의 낮은 롯트-대-롯트 변이성은 상기 실시예 2에서 논의된 바와 같이, 평균 몰 치환이 Kleptose® HPB의 2개의 예시적인 롯트 사이에서 동일하다는 관찰과 일치한다. 도 32는 도 31 및 도 31b에 도시된 Kleptose®데이터를 생성하는데 사용된 것과 동일한 조건을 사용하는 2개의 상이한 실험실(도 32a, 제1 실험실; 도 32b, 제2 실험실)에 의한 Trappsol®의 2개의 상이한 롯트로부터의 전자분무 MS 스펙트럼을 나타낸다. 도 31a 및 31b를 참조하고, Trappsol® 치환 지문에 상당한 롯트 간 변동성이 있음을 입증한다.

도 33은 1090 내지 1230 m/z 사이의 피크를 나타내기 위해, 제2 실험실에서 Y-축이 도 29 및 도 32와 비교하여 확장된 전자분무 MS 스펙트럼을 도시한다. 도 33a는 Trappsol®으로부터 얻은 스펙트럼이다. 도 33b는 Kleptose® HPB로부터 얻은 스펙트럼이다. 스펙트럼은 Trappsol®에는 상당한 수준의 프로필렌 글리콜이 존재하지만(프로필렌 글리콜 피크는 도 33a에 표지됨), Kleptose® HPB에는 존재하지 않는다는 것을 보여준다. Kleptose® HPB는 작지만 검출가능한 양의 치환되지 않은 시클로덱스트린을 가지고 있으며, 도 33b에서 표지된 피크로 도시된다.

도 34는 Kleptose® HPB와 Trappsol® 샘플 사이의 추가적인 차이점을 보여준다: 1) DS는 두 샘플간에 현저히 다르다. Trappsol®은 축 방향과 적도 방향의 히드록실을 모두 포함해야 하는 응축 반응을 보여준다; 2) 두 샘플의 주요 이온은 고형물에 존재하는 암모니아로부터의 NH₄ ⁺ 예증이다. 각 DS에는 MH⁺ 이온도 존재한다; 3) 각 주요 이온에 대한 동위원소 클러스터는 암모늄 부가물의 이중 하전된 동족이량체를 나타낸다. Trappsol®의 경우 양성자화된 이온의 이중 하전된 이량체가 또한 관찰된다; 4) 두 물질 모두 양성자와 암모늄 둘 모두의 예증으로부터 이중으로 하전된 동족이량체를 나타낸다; 5) m/z 1530에서 DS6-DS7의 경우에 대해 언급된 이중 하전된 이형이량체는 두 물질 모두에서 형성되지만, Kleptose® HPB보다 Trappsol®에서 훨씬 강렬하다; 6) 이러한 모든 차이는 80% ACN에서 2.5 μM 농도로 유지되었다. 이것은 이량체가 강한 분자간 결합을 가지고 있음을 나타낸다.

도 35는 Kleptose® HPB와 Trappsol® 샘플 간의 추가적인 차이점이 호모-기원 및 헤테로-기원의 3중 하전된 이형이량체 형태임을 보여준다. 이것들은 Trappsol®에서 더 강한 강도를 나타내며, Kleptose® HPB에서는 사실상 발견되지 않는다.

요약하면, 전자분무 MS 분석은 상업적으로 입수가능한 Trappsol® Cyclo™인 상이한 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 치환 지문과 비교하여, 실시예 1에 기술된 I상 임상 시험에서 사용된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 조성물인 Kleptose® HPB의 치환 지문에서의 상당한 차이를 입증한다. Kleptose® HPB는 치환 지문에 낮은 롯트간(Lot-to-lot) 변이성 및 낮은 수준의 불순물, 특히 프로필렌 글리콜을 갖는다. 대조적으로, Trappsol®은 치환 지문에서의 높은 롯트간 변이성과 추정된 내이신경 독소인 프로필렌 글리콜의 상당히 높은 수준을 나타낸다. Trappsol®은 또한 동종기원 및 헤테로-기원의 3중 하전된 시클로덱스트린 이량체를 나타내며, 이들은 Kleptose® HPB에 존재하지 않는다.

7.6. 실시예 6: 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 조성물의 정제

Kleptose® HBP에서 프로필렌 글리콜(PG) 및 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린(DS=0) 불순물을 추가로 저감시키는 능력에 대하여, 3가지 정제 방법(복합체화, 침전 및 흡착)을 조사하였다.

7.6.1. 유기 화합물과의 복합체화/연합화

실험예 5.6.1A: HPBCD(Kleptose®HBP　(Roquette)) 1.0 g를 물(10 mL)에 용해시켰다. p-크실렌(시험 # 5.6.1.1) 또는 톨루엔(시험 # 5.6.1.2)(1.0 mL)을 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 24시간 동안, 5-7℃에서 1시간 동안 교반하였다. 오팔색 용액을 0.45 μm의 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인 필터를 통해 여과하고, 여과액을 40℃에서 건조 증발시켰다.

시험 # 5.6.1.1: 0.7g; 수율:70%.

시험 # 5.6.1.2: 0.8g; 수율:80%.

실험 5.6. 1B: HPBCD(Kleptose HBP®(Roquette)) 2.0g을 물(4mL)에 용해시켰다. D-리모넨(시험 # 5.6.1.3, 0.04 mL, ~ 10 당량) 또는 L-멘톨(시험 # 5.6.1.4, 0.04 g, ~ 10 당량) 또는 벤질 알코올(시험 # 5.6.1.5, 0.03 mL, ~ 10 당량) 또는 콜레스테롤(시험 # 5.6.1.6, 0.1g, ~ 10 당량)을 상기 용액에 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 72시간 동안 교반하였다. 용액을 5℃에서 4시간 동안 유지시켰다.

시험 # 5.6.1.4 및 시험 # 5.6.1.5는 투명한 용액으로 남아 있었으며, 침전물은 형성되지 않았다.

시험 # 5.6.1.3 및 시험 # 5.6.1.6은 침전물을 형성하였다. 시험 # 5.6.1.3 및 시험 # 5.6.1.6의 용액을 각각 0.45 μm의 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인 필터로 여과하고, 여과액을 40℃에서 건조될 때까지 증발시켰다.

시험 # 5.6.1.3: 2.1 g; 수율: 105%.

시험 # 5.6.1.6: 1.4 g; 수율: 70%.

선택적인 복합체 형성 또는 소분자와의 연합으로부터 유도된 샘플에 대한 결과가 표 9에 요약되어있다.

[표 9]

시험 # 5.6.1.1, # 5.6.1.2 및 # 5.6.1.3은 상업적 Kleptose® HBP와 비교하여 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린 함량이 감소함을 보여주었다. 또한, 시험 # 5.6.1.3의 D-리모넨은 단일 치환된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린("HPBCD DS=1") 및 다른 시클로덱스트린-관련 불순물(도 19 참조)의 수준이 감소함을 보여주었다. 도 19는 보유 시간 ~5분의 불순물 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린(BCD), 보유 시간 ~6분의 단일 치환된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린(DS-1) 및 보유 시간 ~7.4분의 DS=2(DS-2)를 갖는 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린을 나타낸다.

7.6.2. 침전

일반적인 방법: HPBCD(Kleptose HBP®(Roquette)) 1.0 g를 5 mL 또는 2 mL 용매(S)에 용해시키고, 50 mL 또는 20 mL 침전제(PA)에 침전시켰다. 여과된 고체 물질을 3 mL PA로 3회 세정하였다. 시험 # 5.6.2.11의 경우 예외: HPBCD 1.0g을 물(2 mL)에 용해시키고, 클로로포름(3×10mL)으로 추출하였다. 유기상을 결합하고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 경사 분리하고, 40℃에서 건조될 때까지 증발시켰다. 각 시험 준비는 표 10에 요약되어 있다.

[표 10]

용매 침전 실험의 분석 결과가 표 11에 요약되어 있다.

[표 11]

표 11에 개시된 바와 같이, 침전은 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 샘플내 프로필렌 글리콜의 수준을 감소시켰다. 침전제로서 각각 아세톤, 아세토니트릴 또는 클로로포름과 함께 메탄올을 사용하는 시험 # 5.6.2.10, 5.6.2.2 및 5.6.2.3은 프로필렌 글리콜 수준을 각각 92%, 81% 및 22%까지 감소시킬 수 있었다. 침전제로서 각각 아세톤 또는 아세토니트릴과 함께 물을 사용하는 시험 # 5.6.2.7.2 및 5.6.2.8.2는 프로필렌 글리콜 수준을 > 95% 감소시켰다(도 20 참조, 시험 # 5.6.2.7.2 대 Kleptose HPB®). 대조적으로, 물과 클로로포름을 사용하는 시험 # 5.6.2.11은 상업용 Kleptose HPB®와 비교하여 프로필렌 글리콜 수준을 크게 변화시키지 않았다.

7.6.3. 흡착

7.6.3.1. 알루미나에 의한 정화

HPBCD(Kleptose HPB®(Roquette)) 2.0 g을 메탄올(8mL, 시험 # 5.6.3.1.1) 또는 에탄올(8mL, 시험 # 5.6.3.1.2)에 용해시키고, 실온에서 알루미나(2.0 g, 산화 알루미늄 90 표준화, Merck)로 0.5시간 동안 교반하였다. 알루미나를 여과하고, 메탄올 또는 에탄올(3 × 2 mL) 및 물(3 × 2 mL)로 세척 하였다. 여과액(SZ)과 첫 번째 헹굼용 용매(M1[메탄올] 또는 E1[에탄올])를 40℃에서 건조될때까지 증발시켰다.

시험 번호 5.6.3.1.1: 샘플 5.6.3.1.1 - SZ: 1.6g; 수율: 80%.

시험 번호 5.6.3.1.1: 샘플 5.6.3.1.1 - M1: 0.2g; 수율: 10%.

시험 번호 5.6.3.1.2: 샘플 5.6.3.1.2 - SZ: 1.5g; 수율: 75%.

시험 번호 5.6.3.1.2: 샘플 5.6.3.1.2 - E1: 0.2g; 수율: 10%

7.6.3.2. 알루미나 상의 크로마토그래피

시험 번호 5.6.3.2.1: HPBCD(Kleptose HBP®(Roquette)) 2.0 g을 메탄올(2mL)에 용해시키고, 메탄올, 유속: 3 mL/분, 1 분/분획, 30 분획에 의해 알루미나(10g, 산화 알루미늄 90 표준화됨, Merck)를 통해 크로마토그래피하였다. 컬럼을 유속:10 mL/분의 물로 20분(W) 세척하였다. 다음 분획을 조합하고, 40℃에서 건조될 때까지 증발시켰다:

샘플 5.6.3.2.1A: 제2 분획: 0.5g, 수율: 25%.

샘플 5.6.3.2.1B: 제3-8 분획: 1.1g, 수율: 55%.

샘플 5.6.3.2.1C: 제9-14 분획: 0.2g, 수율: 10%.

샘플 5.6.3.2.1D: 제15-W 분획: 0.2g, 수율: 10%.

시험 # 5.6.3.2.2: HPBCD(Kleptose HBP®(Roquette)) 5.0 g을 메탄올(10 mL)에 용해시키고, 알루미나(200 g, 산화 알루미늄 90 표준화됨, Merck)를 통해 다음 용매 구배: 100% 메탄올, 유속: 5mL/분, 3분/분획, 제1-30 분획; 80% 메탄올, 20% 물, 5 mL/분, 3분/분획, 제31-43 분획; 50% 메탄올-물, 5 mL/분, 3분/분획, 제44-60 분획; 100% 물, 5 mL/분, 3분/분획, 제61-70 분획; 세척(W): 100% 물, 10 mL/분, 30분에 의해 크로마토그래피하였다.

하기 분획을 조합하고, 건조될 때까지 40℃에서 증발시켰다:

샘플 5.6.3.2.2A: 제0-5 분획: 0.1g, 수율: 2%.

샘플 5.6.3.2.2B: 제6-10 분획: 0.6g, 수율: 12%.

샘플 5.6.3.2.2C: 제11-16 분획: 0.5g, 수율: 10%.

샘플 5.6.3.2.2D: 제17-45 분획: 1.1g, 수율: 22%.

샘플 5.6.3.2.2E: 제46-51 분획: 0.5g, 수율: 10%.

샘플 5.6.3.2.2F: 제52-56 분획: 0.9g, 수율: 18%.

샘플 5.6.3.2.2G: 제57-66 분획: 0.5g, 수율: 10%.

샘플 5.6.3.2.2H: 제67-W 분획: 1.3g, 수율: 26%.

7.6.4. 음이온 교환 수지

시험 # 5.6.3.3: HPBCD 1.0g을 물(10 mL)에 용해시키고 0.1N NaOH로 pH를 10-12(일반적인 pH 종이로 측정, Merck pH1-14)로 설정하였다. 상기 용액을 음이온 교환 수지(Purolite, 상품 코드:47111) 5.0 g과 14시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 여과액을 양이온 교환 수지(Purolite, 상품 코드:15131)로 중화시키고, 목탄으로 처리하였다. 고체 샘플을 40℃에서 건조할 때까지 증발시켜 분리하여, 샘플 5.6.3.3을 얻었다. 수율: 0.9 g, 90%.

흡착으로부터 샘플의 특성화

[표 12]

[표 13]

표 12 및 표 13의 데이터의 그래픽 표현이 도 21-24에 도시되어 있다. 분획 A 내지 H는 각각 샘플 5.6.3.2.2A 내지 5.6.3.2.2H에 대응한다. 음이온 교환 수지에 이어 차콜 처리가 불순물의 일부를 감소시키는 역할을 하는 반면(시험 # 5.6.3.3,도 21), 알루미늄 산화물 흡착은 CD 관련 불순물 수준을 감소시키는데 효과적이라는 것이 밝혀졌으며(시험 # 5.6.3.1, 도 22), 크로마토그래피(도 23)에 적용될 때 더욱 그렇다. 또한, 도 21-23은 보유 시간 ~5분에 불순물 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린(BCD)뿐만 아니라 보유 시간 ~6분에 단일 치환된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린(DS-1) 및 보유 시간 ~7.4분에 DS=2인 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린(DS-2)를 나타낸다. 시험 # 5.6.3.2.2에서 수집된 8개의 분획(A 내지 H)은 도 24에 도시된다. 분획 B-D는 매우 낮은 농도로 목적 불순물인 프로필렌 글리콜 및 BCD를 함유하였다. BCD는 분획 A-G의 정량화 한계 이하로 감소되었다. 이와 함께, DS-1 HPBCD 함량은 분획 A-F에서 0.15% 미만이었으며(96% 이상 감소); CD-관련 기타 불순물은 분획 B-D에서 현저하게 감소하였다. 이러한 발견에 근거하여, Al₂O₃ 기반 크로마토그래피는 HPBCD에서 CD 관련 불순물을 효율적으로 제거하는데 적합하다고 판단되었다.

7.7. 실시예 7: 대규모의 정제

II상 임상 시험을 준비하기 위해, Kleptose® HBP내 프로필렌 글리콜(PG) 및 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린(DS=0) 불순물을 감소시키는 능력에 대해 3가지 정제 방법(침전, 알루미나 흡착, 및 침전과 알루미나 흡수의 조합)을 대규모로 조사하였다. 불순물을 HPBCD(Kleptose® HBP(Roquette)) 10g 배치 상에서 수행하였으며; 침전도 또한 30g 배치 상에서 수행하였다. 10g 배치로부터 얻어진 결과를 표 16, 17 및 18에 나타내었다. 30g 배치로부터 수득한 결과를 표 19에 나타내었다.

7.7.1. 용매 침전

HPBCD 10 g을 제조하는 동안, 아세톤과 함께 물로부터 침전을 수행하였다. HPBCD를 절반 당량의 물에 용해시키고(물 10ml 내에 HPBCD 20g), 아세톤 5배량(100ml)에 붓고, 디캔팅 후 아세톤 2배량(40ml)으로 3회 세척하였다. 용해는 초음파와 교반을 사용하여 30-60분 소요된다. 침전물의 접착제 성질은 여과하기 전에 아세톤으로 3회 세척함으로써 감소되었다. 수율은 87-93%였다.

30g 규모에서 HPBCD의 용해를 위해 물 대신에 메탄올을 사용하였다. HPBCD 43 g을 43 ml의 메탄올에 용해시키고, 이어서 430 ml의 아세톤에 부었다. 침전물을 아세톤(43 ml)으로 3회 세척한 후 여과하기 용이했다. 수율은 99%였다. GC 결과에 근거하여, 정제 과정에서 메탄올을 사용하는 것이 물을 사용하는 것보다 더 빠르고 수율이 좋았다.

7.7.2. 알루미나 상의 크로마토그래피

HPBCD를 메탄올에 용해시켜 약 1 mg/ml 용액을 수득하였다. 예를 들어, HPBCD 10.0g을 메탄올(10mL)에 용해시키고, 5 mL/분의 유속을 갖는 알루미나(알루미나 패킹 220 g의 180 cm³ 컬럼)를 통해 크로마토그래피하고, 총 8-20개의 분획으로 10분마다 수확하였다. 용리액은 100% 메탄올이었다. 정제된 HPBCD 10 g을 제조하기 위해, 출발 물질 20-22g을 순수한 생성물에 대해 70-75% 수율로 사용하였다.

7.7.3. 알루미나 상의 크로마토그래피 및 용매 침전의 조합

조합 프로토콜에 대해, 상기한 바와 같은 용매 침전 후에 10.0 g HPBCD 배치에 대해 상기 알루미나 상의 크로마토그래피를 수행하였다.

[표 16]

[표 17]

[표 18]

[표 19]

표 20은 3개의 정제 방법으로부터의 결과를 비교한다.

[표 20]

7.7.4. 치환 지문에 대한 정제의 효과

알루미나 상의 흡수 크로마토그래피 및 용매 침전(물-아세톤)의 조합에 의해, 분취량의 Kleptose® HPB의 모 롯트(parent lot) 상에서 정제된, 배치 CYL-4063의 분취량에 대해 실시예 5(제2 실험실)에 기술된 바와 같이 전자분무 MS 분석을 본질적으로 수행하였다. 스펙트럼은 도 36에서 비교되며, 도 36a는 시작 물질로부터의 스펙트럼을 도시하고, 도 36b는 정제된 배치로부터 스펙트럼을 도시한다. 알 수 있듯이, 정제는 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린 분자("DS-0"), 단일 히드록시프로필 치환체를 갖는 거의 모든 시클로덱스트린 분자("DS-1")를 제거하고, 2개의 히드록시프로필 치환체를 갖는 시클로덱스트린 분자("DS-2")의 농도를 감소시킨다. 이 스펙트럼은 또한 보다 고도로 치환된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 종인 DS3, DS4, DS5, DS6 및 DS7의 상대적 비율 및 그에 따른 분포가 거의 변화가 없음을 시사한다.

본 발명자들은 Kleptose® HPB("EOxxx")의 14개의 배치 및 정제된 배치 CYL-4063의 피크 분포를 정량화하였다. 각 피크의 신호 및 각 피크가 전체 신호에 기여하는 백분율은 표 21에 요약되어 있다.

[표 21]

7.8. 실시예 8: 유전자 발현 프로파일에 대한 정제의 효과

실시예 7에서 논의된 바와 같이, 대규모의 정제 노력은 추정된 내이신경 독소인 프로필렌 글리콜, 침전물을 형성하는 것으로 알려진, 히드록시프로필 치환체를 갖지 않는 베타-시클로덱스트린 분자(DS-0), 및 매우 염증성인 세균성 내독소를 감소시키는데 성공적이었다. 그러나, 알루미나를 이용한 흡수 크로마토그래피는 단독으로 사용되든지 또는 용매 침전과 함께 사용되든지, DS-1 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 양을 실질적으로 감소시키는 조성 프로파일 또는 지문을 크게 변경시켰으며, 알루미나에 의한 흡수 크로마토그래피와 용매 침전의 조합에 의해 정제된, 전자분무 MS로 분석된 배치내에서, DS-2 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린의 양을 감소시키면서 Kleptose® HPB(DS3, DS4, DS5, DS6, DS7)에 존재하는 보다 고도로 치환된 종의 존재 및 비율에 거의 영향을 주지 않는다.

조성 지문의 이러한 실질적인 변경의 잠재적인 약리학적 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 유전자 발현 프로파일링을 수행하였다.

7.8.1. 재료 및 방법

7.8.1.1. 세포

Coriell Medical Institute로부터 GM18453 세포(NPC1 돌연변이에 대해 동형접합체) 및 야생형 GM05659 세포를 수득하였다. 세포주를 10% FBS, DMEM 및 100 유닛/ml의 페니실린 및 스트렙토마이신에서 배양하였다. 시클로덱스트린 치료 전에 500,000 세포/웰을 10 ug/ml 미토마이신과 동기화시켰다. 히드록시프로필 시클로덱스트린(HPCDs)을 연구에 사용된 농도 범위(0.1mM 내지 10mM)로 PBS에 용해시켰다.

7.8.1.2. RNA 제조 및 전체 전사체 분석

NPC1(GM18453) 및 야생형 세포(GM05659)를 용해시키고 Trizol® 시약(Invitrogen)을 사용하여 RNA를 추출하였다. 이어서, 세포를 DNAse I(Qiagen) 처리하였다. Qubit 분광 광도계와 Nano Drop ND-1000을 사용하여 샘플의 순도와 농도를 체크하고, Agilent 2100 생물분석기(Bioanalyzer)를 사용하여 RNA 완전성(RIN)을 평가했다. 제조자의 지시에 따라 RiboMinus^TM 진핵생물 키트(Invitrogen)를 사용하여, 추출된 mRNA를 농축시켰다. RNA의 최종 정량은 반응 당 10 ㎍이었다. Clontech SMARTer 가닥 RNA-Seq Kit를 사용하여 생성된 cDNA 라이브러리를 150-250 bp 범위에서 크기-선택하고, Illumina에서 제공한 프로토콜에 따라 시퀀싱하였다. 75 bp의 순방향 및 35개의 역방향 프라이머를 갖는 HiSeq 2000 플랫폼을 사용하여 샘플을 시퀀싱하였다.

7.8.1.3. RNA-Seq 데이터 분석

cDNA 라이브러리의 시퀀싱은 샘플 당 20941134 내지 42375128 쌍의 판독을 초래하였다. 맵핑 품질을 높이기 위해 염기 리드(read)를 50개의 염기 쌍으로 트리밍했다. Bowtie 버전 1.0.0을 사용하는 TopHat v2.1.0을 사용하여 모든 색상-간격의 리드가 인간 기준 게놈(Ensembl, 릴리스 73)에 정렬되었다. 유전자 발현 수준 평가를 위한 RPKM 값(백만 매핑된 리드값 당 전사물의 킬로베이스 당 리드값)은 Cufflinks v2.0.2로 계산되었으며, Ensembl(릴리스 73)에서 다운로드한 단백질 코딩 유전자의 유전자 주석을 사용하여 Illumina BaseSpace Core Apps에서 미처리 개수(raw count)를 회수하였다. edgeR과 함께 미처리 수에 대해 차등 발현/배수 변화가 추정되었다. 모든 프로그램은 TopHat이 새로운 접합점을 찾지 않도록 설정된 기본 매개 변수와 함께 사용되었다.

TIBCO Spotfire(버전 6.5)를 사용하여 각 유전자의 배수 변화를 시각화하였다. 트리맵과 막대 그래프의 조합을 사용하여 차등 유전자 발현 변화를 표시했다. 10mM HPCD 치료에 대한 전체 전사체 변화를 보려면 막대 그래프 보기가 가장 최적인 것으로 나타났다.

7.8.1.4. RNA Seq 분석 검증 분석

원료 RNA Seq 염기 리드(read)를 콜레스테롤 항상성 유전자의 선택된 세트에 대해 직접 계산분석하여, Kleptose® HPB 처리에 대한 반응성을 확립하였다. 선택된 유전자는 하기 표 22에 열거되어있다.

[표 22]

7.8.1.5. 대사 경로 분석

모든 시클로덱스트린 세포 처리를 분석하여 18453 NPC1 세포주에서 영향을 받는 주요 대사 경로를 결정하였다. 독창성 경로 분석(Ingenuity Pathway Analysis) 소프트웨어를 사용하여, 유전자 ID, 배수 변화 및 유전자 당 p-값을 사용하여 볼케이노 산란 플롯(Volcano scatter plot)을 생성했다. 이 플롯은 다양한 치료를 위해 상향 조절된 유전자와 하향 조절된 유전자를 나타낸다. 그후, 유전자 그룹은 특정 대사 경로(-log10(pACCC)) 대 그들의 차등 발현 수준(-Dlog10(pORA))을 교란시키는 능력에 대해 가중치를 부여받는다. 경로를 교란시키는 유전자 구성원의 확률론적 맵핑은 다른 유전자 회원들이 다른 경로를 교란시키는데 참여하는 것을 반드시 배제하지는 않는다.

이 데이터는 유전자 및 게놈의 교토 백과사전(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG) 데이터베이스(Release 73.0 +/03-16, Mar 15)(Kanehisa et al., 2000; Kanehisa et al., 2002), 유전자 온톨로지 컨소시엄 데이터베이스로부터의 유전자 온톨로지(2014-9월 19일)(Ashburner et al., 2000; Gene Ontology Consortium, 2001), miRBase(Release 21) 및 TARGETSCAN(TargetScan Release 6.2(2015년 3월 업데이트됨)) 데이터베이스로부터의 miRNA(Griffiths-Jones et al., 2008; Kozomara and Griffiths-Jones, 2014; Friedman et al., 2009; Grimson et al., 2007) 및 KEGG 데이터베이스로부터의 질병(Release 73.0+/03-16, 3월 15일)(Kanehisa et al., 2000;Kanehisa et al., 2002)로부터 얻은 경로의 맥락에서 분석되었다.

독창성 경로 분석(Qiagen)은 (Draghici et al., 2007; Tarca et al., 2009, Khatri et al., 2007)에 의해 제안된 영향 분석을 사용하여 경로를 평가한다. 영향 분석은 2개의 증거 유형: i) 주어진 경로에서 차등 발현된(DE) 유전자의 과발현 및 ii) 측정된 발현 변화를 경로 토폴로지 전반에 전파함으로써 계산된 경로의 교란을 사용한다. 이러한 양태는 두개의 독립적인 확률 값, 즉 고유한 전역 p 값으로 조합된, pORA와 pAcc에 의해 포착된다. 유전자와 그의 상호작용으로 구성된 경로 토폴로지는 KEGG 데이터베이스에서 얻어진다(Kanehisa et al., 2000; Kanehisa et al., 2010; Kanehisa et al., 2012; Kanehisa et al., 2014).

제1 확률, pORA는 우연히 관찰된 것보다 크거나 같은, 주어진 경로에서 다수의 DE 유전자를 얻을 확률을 나타낸다(Draghici et al., 2003; Draghici 2011). 실험에서 N개의 유전자가 측정되고, 주어진 경로에 M개의 논문이 있다고 간주한다. DE 유전자의 선험적 선택에 기초하여, M 유전자 중 K가 차등 발현되는 것으로 밝혀졌다. 주어진 경로에서 x 차등 발현된 유전자를 정확히 관찰할 확률은 초기하 분포에 기초하여 계산된다: 초기하는 이산 분포이므로, 우연히 주어진 경로에서 x 미만의 유전자를 관찰할 확률은 1 또는 2 또는 ... 또는 x-1 유전자를 경로 상에 갖는 확률을 합계내어 계산될 수 있다:

관찰된 경로보다 크거나 동일한 주어진 경로상의 다수의 DE 유전자를 얻는 과다-재현 p 값을 계산하기 위해, 독창성 경로(Ingenuity Pathway) 도구는 pORA = p(x) = 1-p(x-1)로 계산한다:

제2 확률, pAcc는 각 경로에서 측정된 교란의 양에 기초하여 계산된다. 교란 인자는 하기를 사용하여 경로상의 각 유전자에 대해 계산된다:

도시된 방정식에서, 용어 ΔE(g)는 유전자 g의 부호있는 정규화된 측정된 발현 변화를 나타내고, α(g)는 유전자의 유형에 기초한 선험적 중량이다. 제2 항은 각 유전자 N(u)의 하류 유전자의 수로 정규화된, 표적 유전자 g의 바로 상류에 있는 모든 유전자 u의 교란 인자의 합이다. β의 값은 유전자 g와 u 사이의 상호작용의 강도를 정량화한다. β의 부호는 상호작용: 신호와 같은 활성화를 위한 플러스, 및 신호와 같은 억제를 위한 마이너스의 유형을 나타낸다. 이어서 독창성 경로 분석은 교란 인자 PF(g)와 관찰된 로그 배수 변화 사이의 차이인, 각 유전자 Acc(g)의 레벨에서 총 교란 누적을 계산한다:

모든 교란 누적은 경로상의 모든 유전자에 대해 상기 수학식(상기 참조)을 결합함으로써 얻어지는 선형 방정식의 시스템을 해결함으로써 동시에 계산된다. 모든 유전자 교란 누적이 계산되면, 독창성 경로는 경로의 전체 누적치를 유전자의 모든 절대 누적치의 합계로 계산한다. 우연히 더 큰 총 누적량(pAcc)을 얻는 것의 중요성은 부트스트랩을 통해 평가된다.

두 가지 유형의 증거, pORA 및 pAcc는 피셔 법을 사용하여 하나의 최종 p-값으로 조합된다. 이 p-값은 FDR 및 Bonferroni를 사용하여 다중 비교를 위해 보정된다. Bonferroni는 이 두 가지 중에서 가장 단순하고 보수적인 것이다(Bonferroni, 1935; Bonferroni, 1936). 그것은 총 비교 횟수로 계량된 각 비교 대상에 더 엄격한 임계치를 부과함으로써 거짓 발견률을 감소시킨다. FDR은 더 많은 위양성(false positive)을 발견할 정도로 보다 강력하다(Benjamini and Hochberg, 1995; Benjamini and Yekutieli, 2001). 이는 위양성의 전체 백분율이 선택한 임계값 미만인 것을 보장한다.

7.8.2. 결과

7.8.2.1. 분석 검증

전체 전사체(full transcriptome) 분석을 수행하기 전에, GM18453 및 GM05659 세포를 일정 농도의 Kleptose® HPB 농도(0.1 mM 내지 10 mM)로 처리하고, 선택된 콜레스테롤 항상성-관련 유전자에 대한 효과를 평가하였다.

그 결과를 하기 표 23에 도표화하여, 도 37에 그래프로 나타내었다. 결과는 배수 변화(log(FC))로 표현된다.

[표 23]

결과는 동형접합체 NPC1 세포에 대한 Kleptose® HPB의 용량-의존적 영향을 입증하고, 시험된 3가지 농도의 용량-의존적 영향을 입증하였으며, 1.0mM Kleptose® HPB가 의미있는 데이터를 제공하기에 적당하다.

7.8.2.2. 정제된 조성물 분석

7.8.2.2.1. 미리-선택된 콜레스테롤 항상성 유전자의 발현에 미치는 효과

실시예 7에서 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 알루미나로의 흡착을 포함하는 정제 프로토콜이 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물의 치환 지문을 현저히 변화시킨다는 것을 발견했다. 이러한 변화가 조성물의 약리학적 효과를 변화시키는 방법을 평가하기 위해, (i) 다양한 정제된 조성물 및 (ii) NPC1 돌연변이에 대하여 동형접합체인 GM18453 세포내 Kleptose® HPB의 콜레스테롤 항상성 유전자의 발현에 미치는 효과를 비교하였다.

놀랍게도, 본 발명자들은 차이점을 발견하지 못했다.

도 38은 4개의 상이한 조성물: STD(Kleptose® HPB "표준(standard)"); AC(Kleptos® HPB 알루미나 크로마토그래피( a lumina c hromatography)로 정제됨); SP(Kleptose® HPB 용매 침전( s olvent p recipitation)에 의해 정제됨); 및 AP(Kleptose® HPB 알루미나 크로마토그래피 및 용매 침전( a lumina c hromatography 및 s olvent p recipitation)으로 정제됨)에 대해, 처리시에 발현이 통계적으로 유의미한 차이(p <0.001)가 있는 콜레스테롤 항상성 유전자의 서브셋의, NPC1 돌연변이에 대해 동형접합성인, GM18453 세포내 발현의 배율 변화를 도시한다. 정제 프로토콜 및 각각의 조성물에 대한 세부 사항은 실시예 7을 참조한다.

시험된 임의의 농도에서 정제된 조성물 중 어느 것도 알루미나-정제된 조성물에서 저 DS 종의 제거에도 불구하고, 모체 조성물인 Kleptose® HPB("STD")와는 효과가 상이하지 않았다. 그러므로, 콜레스테롤 항상성에 미치는 영향인, 조성물의 관련 약리학적 활성이 Kleptose® HPB에 존재하는 보다 고도로 치환된 종에 존재하는 것으로 나타났는데, 이는 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린 분자(DS-0)와 단일 치환된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린(DS-1)의 제거 및 2-치환된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린(DS-2)의 실질적인 감소는 NPC1 세포에서 콜레스테롤 항상성 유전자의 발현을 변경시키는 조성물의 능력에 대해 분명한 효과를 나타내지 않았기 때문이다.

7.8.2.2.2. 전체 게놈 분석

상기 분석에서, 본 발명자들은 NPC1 돌연변이에 의해 야기된 일차 결함과 관련하여 사전-선택된 유전자의 발현 변화를 평가하고, 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린으로 치료할 때 발현이 통계적으로 유의미하게 상이한, 사전 선택된 유전자의 서브셋의 발현에 대한 효과를 비교하였다. 저 DS 종의 제거가 관련 약리학적 활성에 큰 영향을 미치지 않는다는 관찰을 확인하고, 조성물 간의 가능한 차이를 탐색하기 위해, 본 발명자들은 전체 게놈 분석을 수행하여, 가장 영향을 받은 생물학적 경로를 통계적 근거로 치료에 의해 확인했다.

본 발명자들은 1.0 mM Kleptose® HPB 및 1.0 mM 정제된 배치 CYL-4063으로 처리된 NPC1 세포의 전체 게놈 경로 분석을 수행하였다. 실시예 7에 상세히 기술된 바와 같이, CYL-4063은 Kleptose® HPB로부터 알루미나 상의 흡수 크로마토그래피 및 용매 침전의 조합에 의해 제조하였다. 실시예 7의 표 21에 나타낸 바와 같이, 정제는 저 DS 종의 유병율을 현저히 감소시켰으며, Kleptose® HPB에서 16.2%의 DS-0, DS-1 및 DS-2의 평균 집단 함유량에 비해, CYL-4063의 시클로덱스트린 종의 단지 3.2%만이 0, 1 및 2개의 치환체를 갖는다.

도 39에 도시하는 바와 같이, 1.0 mM Kleptose® HPB로 치료한 결과 통계적으로 가장 유의하게 영향을 받는 것으로 밝혀진 상위 4개의 경로 중 3개는 1.0 mM CYL-4063으로 치료한 결과 통계적으로 가장 많이 영향을 받는 상위 4개 경로에도 포함된다: erbB 신호전달 경로, MAPK 신호전달 경로, 및 GnRH 신호전달 경로. 이러한 결과는 CYL-4063에서 저 DS 종을 제거함에도 불구하고, GM 18453 세포에서 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 혼합물의 전반적인 활성이 거의 교란되지 않음을 확인시켜준다.

또한, 본 발명자들은 이들 세포에서 NPC1 돌연변이에 의해 야기된 일차 결함에 직접 영향을 받는 경로인 스테로이드 생합성 경로가 1.0 mM CYL-4063으로 치료할 때 두 번째로 가장 유의하게 영향을 받은 경로이지만, 1.0 mM Kleptose® HPB로로 치료할 경우에는 단지 여섯 번째로 유의하게 영향을 받은 경로이다. 이러한 결과는 콜레스테롤 항상성에 대한 조성물의 효과가 정제된 조성물에보다 많은 농도로 존재하는, 보다 고도로 치환된 시클로덱스트린 종에 상주한다는 가설과 일치한다.

7.8.2.3. 상이한 치환 정도를 갖는 분획의 활성

상이한 히드록시프로필 치환 정도를 갖는 시클로덱스트린 종의 상이한 기여를 직접 평가하기 위해, 본 발명자들은 Kleptose® HPB의 배치를 각각 낮은, 중간 및 높은 히드록시프로필 치환도를 갖는 3개의 풀로 분획화하고, NPC1 세포내 유전자 발현에 대한 상기 풀링된 분획의 효과를 시험하였다.

7.8.2.3.1. 방법

(a) 분획화

분획을 Kleptose® HPB 배치 E0245로부터 제조하였다. E0245 시작 물질 중 베타-시클로덱스트린 종의 분포는 하기 표 24의 관련 부분에서 발췌된 표 21(실시예 7)에 나타내었다.

[표 24]

Kleptose® HPB(배치 E0245) 15g 샘플을 상기 실시예 5.3.1에 기술된 바와 같이 필수적으로 CD-스크린 컬럼 상에서 분리하고, 분획을 수집하였다. 도 40은 크로마토그래피적으로 분리된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 종의 치환도를 나타내기 위해 주석달린 예비 CD-스크린 크로마토그래피 분리로부터 수득된 다양한 분획의 크로마토그램을 도시한다.

분획 2가 저 치환도를 갖는 분획, "L"(CYL-4103)로 선택된다. 중간 정도의 치환도를 갖는 분획, 분획 "M"(CYL-4104)은 분획 4-15의 풀이다. 높은 치환도를 갖는 분획, 분획 "H"(CYL 4105)는 분획 16-24의 풀이다. 도 41은 (A) 히드록시프로필 치환도에 의해 신호를 확인하기 위해 주석달린 Kleptose® HPB 배치 E0245; (B) "L" 풀링된 분획; (C) "M" 풀링된 분획; (D) "H" 풀링된 분획의 전자분무 MS 스펙트럼을 도시한다.

(b) 발현 프로파일링

NPC 세포주 GM18453(500,000개 세포/웰)을 1.0mM의 "L", "M" 및 "H" 분획과 병행하여 처리하였다. RNA를 각 처리로부터 분리하고, 종래의 방법에 따라 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. cDNA 라이브러리의 서열 분석은 샘플 당 28891287 내지 50245721 쌍의 판독 결과를 얻었다. 맵핑 품질을 높이기 위해, 기본 리드를 50개의 염기 쌍으로 트리밍하였다. Bowtie 버전 1.0.0을 사용하는 TopHat v2.1.0을 사용하여 모든 색상-간격의 리드가 인간 기준 게놈(Ensembl, 릴리스 73)에 정렬되었다. 유전자 발현 수준에 대한 RPKM(백만 맵핑된 리드값 당 전사체의 킬로베이스 당 리드) 값은 Cufflinks v2.0.2로 계산되었으며, Ensembl(릴리스 73)에서 다운로드한 단백질 코딩 유전자의 유전자 주석을 사용하여 Illumina BaseSpace Core Apps으로 미처리 수를 회수하였다. edgeR과 함께 미처리 수에 대해 차등 발현/배수 변화가 추정되었다. TopHat이 새로운 접합점을 찾지 않도록 설정된 기본 매개 변수와 함께 모든 프로그램을 사용하였다. TIBCO Spotfire(버전 7.0)를 사용하여 각 유전자에 대한 배율 변화를 시각화했다. 트리맵과 막대 그래프의 조합을 사용하여 차등 유전자 발현 변화를 표시했다.

비교를 위해, Kleptose® HPB 및 분획화되지 않은 정제 배치 CYL-4077(실시예 7 참조)을 사용하여 유사한 분석을 수행하였다.

7.8.2.3.2. 결과

본 발명자들은 전체 게놈 전사체 분석을 수행하여, "L", "M" 및 "H" 분획으로 처리함으로써 통계적인 기준에 가장 영향을 받은 10개의 생물학적 경로를 확인하였다.

도 42는 1.0 mM의 "L", "M" 및 "H" 분획에 의한 NPC 세포의 처리에 의해 가장 영향을 받는 10개의 생물학적 경로를 통계적 유의성의 내림차순으로 나타낸 것이다. 우리의 초기 관찰과 일치하여, "L" 분획은 스테로이드 생합성 경로에서 유전자의 발현에 통계적으로 유의한 변화를 일으키지 않았다. 현저히 대조적으로, 스테로이드 생합성 경로는 NPC1 세포를 "M" 분획으로 처리했을 때 통계적으로 가장 영향을 받은 생물학적 경로이다. "M" 분획은 주로 3, 4, 5 및 6개의 히드록시프로필 치환체(DS3, DS4, DS5 및 DS6)를 갖는 베타-시클로덱스트린 종으로 구성된다. 주로 DS5, DS6 및 DS7을 포함하는 "H" 분획은 또한 콜레스테롤 생합성 경로의 유전자 발현을 변화시키고, 콜레스테롤 생합성 경로는 두 번째로 유의한 경로로 나타난다.

상기 결과는 콜레스테롤 항상성을 회복시키는 능력이 보다 높은 히드록시프로필 치환도를 갖는 Kleptose® HPB에 존재하는 시클로덱스트린 종에 상주한다는 직접적인 증거를 제공한다.

7.8.2.4. 미분획화 조성물에 대한 분획의 비교

상이한 히드록시프로필 치환도를 갖는 시클로덱스트린의 종이 NPC 세포내 유전자 발현에 차별적으로 영향을 미친다는 본 발명자들의 관찰에 따른 결과는, 조성물 전체의 약리학적 활성이 조성 지문(compositional fingerprint), 즉 조성물내에 존재하는 차별적으로 히드록시프로필화된 종의 상대적인 비율에 좌우되어야 한다는 점이다.

본 발명자들은 (i) 분획화되지않은 Kleptose® HPB, (ii) 알루미나 상의 흡수 크로마토그래피 및 선택적인 용매 침전에 의해 Kleptose® HPB로부터 정제된 분획되지 않은 CYL-4077, (iii) "L" 분획, (iv) "M" 분획 또는 (v) "H" 분획 중 하나의 1.0 mM으로 NPC 세포를 처리한 후, 특이 유전자-특이 유전자(즉, GeneID) 기준으로 유전자 발현 변화를 비교함으로써 상기 가설을 확인하였다.

본 발명자들은 1.0 mM의 Kleptose® HPB에 의해 발현이 유의하게 영향을 받는 유전자의 64%가 1.0 mM의 정제된 배치(배치 CYL-4077)에 의한 처리에 의해 유의미한 영향을 받는다는 것을 관찰했다.

이 공유된 백분율은 1.0 mM Kleptose® HPB를 사용한 처리 및 "L", "M" 및 "H" 분획 중 어느 하나의 1.0 mM에 의해 유의미한 영향을 받는 유전자의 백분율보다 현저히 높다(각각 37%, 43% 및 48%).

유사하게, Kleptose® HPB 및 CYL-4077 모두에 의해 영향을 받는 유전자의 64% 공유 동일성은 1.0 mM CYL-4077 및 "L", "M" 및 "H" 분획 중 어느 하나의 1.0 mM에 의한 처리에 의해 발현이 유의미하게 영향을 받는 유전자의 백분율보다 현저히 높다(각각 41%, 38% 및 44%).

7.8.2.5. 자가포식(autophage)과 관련된 유전자

히드록시프로필 베타-시클로덱스트린은 NPC 질병에 축적되는 단백지질 응집체의 자가포식 제거를 향상시키는 것으로 입증되었다.(Song et al., 2014, J. Biol. Chem. vol. 289(14), pages 10211-10222). 따라서 본 발명자들은 자가포식 관련 유전자의 발현에 대한 1.0 mM과 10.0 mM의 Kleptose® HPB, CYL-4077 및, 각각의 "H", "M" 및 "L" 분획 중 각각에 의해 치료한 GM18453 NPC 세포에서의 효과를 분석했다.

표 25는 치료시 발현 변화가 통계적으로 유의미한(p <0.05), 모든 자가포식 유전자를 나타내며, 1.0 mM 농도가 자가포식-관련 유전자에 거의 영향을 미치지 않았음을 증명한다.

[표 25]

표 26은 치료시 발현 변화가 10.0 mM 농도에서 통계적으로 유의미한(p <0.05) 모든 자가포식 유전자를 나타낸다.

[표 26]

10.0mM을 사용한 결과는 Kleptose® HPB 및 CYL-4077이 자가포식에 관여하는 유전자의 발현에 유사한 효과를 가지며, 이러한 효과가 보다 높은 치환도를 갖는 종에 의해 기여되며, "L" 분획은 "H" 분획 및 "M" 분획과 비교하여, 자가포식에 관여하는 유전자의 발현에 가장 적은 효과를 갖는 분획임을 추가로 입증한다.

7.8.3. 고찰

유전자 발현 프로파일 실험을 사용하여, 비경구 등급 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 조성물, Kleptose® HPB가 NPC1 돌연변이에 대하여 동형접합성인 세포내 콜레스테롤 항상성 유전자의 발현 수준을 복원할 수 있고, 자가포식-관련 유전자의 발현을 증가시킬 수 있음을 입증했다. 이 데이터는 Kleptose® HPB의 뇌척수강내 투여가 NPC 질병 환자에서 증상의 진행을 안정화시키거나 늦추는데 효과적이라는 것을 입증하는 I상 인간 임상 시험의 데이터와 일치한다. 임상 데이터와의 상관 관계는 유전자 발현 분석이 시험관내 효능 측정을 제공할 수 있음을 보여준다.

전자분무 MS는 Kleptose® HPB가 재현가능한 비율로 상이한 수준의 히드록시프로필화를 갖는 베타-시클로덱스트린 분자를 함유하는 복합 혼합물임을 입증한다.

Kleptose® HPB로부터 공정 관련 및 다른 불순물을 제거하기 위해 개발한 정제 공정은 낮은 치환도를 갖는 베타-시클로덱스트린 종을 우발적으로 제거하여 조성적 지문을 변경시킨다. 유전자 발현 프로파일 실험은 조성적 지문의 이러한 변화에도 불구하고 NPC 돌연변이에 대하여 동형접합성인 세포에서 콜레스테롤 생합성 경로의 유전자 발현을 정상화시키는 조성물의 능력에 큰 변화가 없음을 입증했다.

이들 데이터는 관련 약리 활성이 주로 정제 동안 제거된 것보다 큰 치환도를 갖는 종에 의해 기여된다는 것을 제시하였다.

본 발명자들은 복합체 혼합물을 낮은("L"), 중간("M") 및 높은("H") 정도의 히드록시프로필 치환을 갖는 베타-시클로덱스트린 종을 갖는 풀로 분획하고, NPC 세포에서의 유전자 발현에 미치는 효과를 평가함으로써 상기 간섭을 확인하였다. 결과들은 "L" 분획이 콜레스테롤 생합성 경로 또는 자가포식에서 유전자의 발현에 명백한 영향을 미치지 않는 반면, "M" 및 "H" 분획은 콜레스테롤 생합성 및 자가포식 유전자의 발현에 유의한 영향을 미친다는 것을 입증하였다. 상기 실험은 조성물 전체의 약리학적 활성이 상이한 정도의 히드록시프로필 치환을 갖는 베타-시클로덱스트린 종에 의해 별도로 기여된 활성의 복합체이고; 전체적인 약리학적 활성이 조성적 지문, 즉 조성물내에 존재하는 차별적으로 히드록시프로필화된 종의 상대적 비율에 의존한다는 것을 추가로 입증하였다.

조성물 전체의 약리학적 활성이 상이한 히드록시프로필 치환도를 갖는 베타-시클로덱스트린에 의해 별도로 기여되는 활성의 복합체이지만, 우연히도 본 발명자들의 정제 공정에 의해 제거되는 종, 낮은 히드록시프로필 치환도를 갖는 종들은 NPC 질병의 치료와 약리학적으로 관련이 있는 혼합물의 특정 활성에 거의 기여하지 않는다. 이 발견은 신규하고, 보다 고도로 정제되고, 조성적으로 구분되는 HPBCD 조성물을 허용할 것이며, 치료 효과와 안전성을 높이면서 장기간동안 NPC 질병 환자의 CSF에 대한 뇌척수강내 또는 뇌실내로의 경로로 투여되도록 개발한다.

7.9. 실시예 9: 대안적인 제조식 분획 방법론

실시예 8에서 논의된 바와 같이, 크로마토그래피 분리를 위한 CD-스크린 컬럼을 사용한 유전자 발현 프로파일링 실험에 사용하기 위해 상이한 평균 치환도를 갖는 3개의 분획을 제조하였다.

대안적으로 본 발명자들은 또한, 상기 실시예 5.7.2에 기술된 바와 같이, 알루미나 컬럼을 사용하여 Kleptose® HPB(배치 E0245)의 분획을 제조하였다. 샘플을 알루미나 컬럼에 적용하고, 100% 메탄올로 등량적으로 용리시켰다. 도 43은 분획 "A" 내지 "F" 및 "K"를 생성하기 위해 풀링된 수치 분획을 나타내도록 주석달린, 및 크로마토그래피로 분리된 히드록시프로필 베타-시클로덱스트린 종의 치환도를 나타내기 위해 추가로 주석달린 다양한 분획의 크로마토그램을 도시한다.

실험 변수는 DS2 및 DS3 HPBCD의 손실을 최소화하면서, Kleptose® HPB로부터 가능한한 많은 치환되지 않은 BCD 및 DS1 HPBCD를 제거하도록 더욱 최적화되었다. 정제 방법의 세부 사항은 다음과 같이 기술된다:

각 시험된 방법(방법 II-XI)에 대한 동일 변수:

알루미나 컬럼 210 g;

30 ml/분 유속;

100 초/분획;

60 초 지연 시간.

용리액으로서 MeOH 단독:

방법 II. Kleptose 21 g, 30 분획, 용리액: 100% MeOH 등용매 용리, 수율:7 9.4%

방법 III. Kleptose 10.5 g, 30 분획, 용리액: 100% MeOH 등용매 용리, 수율: 72.3%

방법 IV. Kleptose 15 g, 30 분획, 용리액: 100% MeOH 등용매 용리, 수율: 77.7%

용리액으로서 MeOH + 물:

방법 V. Kleptose 10.4g, 30 분획, 용리액: 100% MeOH 등용매 용출(수율 73.8%) + 30 분획, 100% MeOH 등용매 용리(60 분획의 총 수율: 75.9%) + 30 분획, 각 단계 사이에 짧은(100초) 전이 구배 용리를 갖는 3-단계 등용매 용리(90, 80, 70% MeOH, 각 15분), 90 분획의 총 수율: 83.1%

방법 VI. Kleptose 10.5 g, 용리액: MeOH + 물, 75 분획, 20분 100 → 80% MeOH 구배 용출, 106분 80% MeOH 등용매 용리, 수율: 82.8%

방법 VII. 방법 VI과 동일하지만, 80% 대신 70% MeOH, 수율:91.2%

방법 VIII. Kleptose 10.5 g, 용리액: MeOH + 물, 75% MeOH 등용매 용리, 30 분획, 수율: 86.4%

방법 IX. Kleptose 10.6 g, 용리액: MeOH + 물, 70% MeOH 등용매 용리, 30 분획, 수율: 89.2%

용리액으로서 EtOH(96% 순도) + 물:

방법 X. Kleptose 10.5g, 30 분획, 용리액: 100% EtOH 등용매 용리(수율: 27.6%) + 30 분획, 70% EtOH 등용매 용리, 60 분획의 총 수율: 82.1%

방법 XI. Kleptose 10.5 g, 60 분획, 용리액: 80% EtOH 등용매 용리, 수율 82.3%

또한, 도 44는 상이한 정제 방법 이후의 HPBCD 혼합물의 크로마토그램을 나타낸다. 정제 후 혼합물 내 DS2/DS1의 비율을 표 27에 요약하였다.

[표 27]

7.10. 실시예 10: 18개월에 NPC I상 임상 시험

추가 분석은 니만-픽 질병 유형 C에 대한, 18개월째 효능 결과를 포함한 I상 임상 시험 데이터를 바탕으로 실시되었다. 결과를 도 45-50에 나타내었다. 도 45에 요약된 바와 같이, 연간 슬로프, 기준선에서의 변화 및 응답자 분석을 사용하여 18개월 I상 임상 시험 데이터를 분석했다. 연간 변화율에서, 18개월 치료 결과는 HPBCD 혼합물이 질병 치료 요법임을 나타낸다(도 46). HPBCD 혼합물은 NPC 환자의 기준선으로부터 질병의 지속적인 개선 또는 안정화를 보여준다(도 47). HPBCD 혼합물 치료는 또한 응답자의 비율이 커질수록 안정적이거나 개선되는 것으로 나타났다(도 48). 청력에 대한 치료의 영향은 주로 고주파 범위에서 발생하며, 그 영향은 보청기로 보정할 수 있다(도 49). 도 50은 청력에 대한 치료의 영향과 관련하여 현재까지의 결론을 요약한 것이다.

8. 균등물 및 참고문헌에 의한 통합

본원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 기타 문헌은 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 또는 기타 문헌이 모든 목적을 위해 참조로 통합되도록 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 인용된다.

다양한 특정 실시예가 도시되고 기술되었지만, 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않고 다양한 변화가 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

Claims

하나 이상의 히드록실 위치에서 히드록시프로필기에 의해 치환된 베타-시클로덱스트린 분자의 혼합물로서, 상기 혼합물은 선택적으로, 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린 분자를 포함하며,
전자분무 MS 스펙트럼의 피크 높이에 의해 측정될 때,
상기 혼합물은 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린("DS-0") 및 1개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-1")을 합하여 1% 미만을 포함하며;
상기 혼합물은 3개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-3"), 4개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-4"), 5개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-5"), 및 6개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린('DS-6")을 합하여 85% 이상을 포함하며;
상기 혼합물은 9개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-9") 및 10개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-10")을 합하여 1% 미만을 포함하는, 혼합물.
제1항에 있어서, 상기 베타-시클로덱스트린 혼합물의 0.1% 미만이 DS-0 및 DS-1의 합인, 혼합물.
제2항에 있어서, 상기 베타-시클로덱스트린 혼합물의 0.01% 미만이 DS-0 및 DS-1의 합인, 혼합물.
제1항에 있어서, 상기 베타-시클로덱스트린 혼합물의 87% 이상이 DS-3, DS-4, DS-5 및 DS-6의 합인, 혼합물.
제4항에 있어서, 상기 베타-시클로덱스트린 혼합물의 90% 이상이 DS-3, DS-4, DS-5 및 DS-6의 합인, 혼합물.
제1항에 있어서, 상기 베타-시클로덱스트린 혼합물의 0.1% 미만이 DS-9 및 DS-10의 합인, 혼합물.
제6항에 있어서, 상기 베타-시클로덱스트린 혼합물의 0.01% 미만이 DS-9 및 DS-10의 합인, 혼합물.
하나 이상의 히드록실 위치에서 히드록시프로필기에 의해 치환된 베타-시클로덱스트린 분자의 혼합물로서, 상기 혼합물은 선택적으로, 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린 분자를 포함하며,
전자분무 MS 스펙트럼의 피크 높이에 의해 측정될 때,
상기 혼합물은 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린("DS-0") 및 1개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-1")을 합하여 1% 미만을 포함하고;
상기 혼합물은 집합적으로 9개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-9") 및 10개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-10")을 합하여 1% 미만을 포함하며; 그리고
상기 혼합물의 평균 몰 치환도("MS")는 0.50 내지 0.80의 범위인, 혼합물.
제8항에 있어서, 상기 베타-시클로덱스트린 혼합물의 0.1% 미만이 DS-0 및 DS-1의 합인, 혼합물.
제9항에 있어서, 상기 베타-시클로덱스트린 혼합물의 0.01% 미만이 DS-0 및 DS-1의 합인, 혼합물.
제8항에 있어서, 상기 베타-시클로덱스트린 혼합물의 0.1% 미만이 DS-9 및 DS-10의 합인, 혼합물.
제11항에 있어서, 상기 베타-시클로덱스트린 혼합물의 0.01% 미만이 DS-9 및 DS-10의 합인, 혼합물.
제8항에 있어서, 상기 MS는 0.60 내지 0.70의 범위에 있는, 혼합물.
제13항에 있어서, 상기 MS는 0.64 내지 0.68의 범위에 있는, 혼합물.
제14항에 있어서, 상기 MS는 약 0.66-0.67인, 혼합물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 베타-시클로덱스트린 혼합물 및 약학적으로 허용가능한 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
제16항에 있어서, 상기 조성물이 베타-시클로덱스트린 혼합물 1 g 당 내독소(endotoxin) 5 EU 이하(no more than("NMT"))를 포함하는, 약학적 조성물.
제17항에 있어서, 상기 조성물이 베타-시클로덱스트린 혼합물 1 g 당 내독소 NMT 1.5 EU를 포함하는, 약학적 조성물.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 USP 히드록시프로필 베타덱스(USP Hydroxypropyl Betadex) 논문에 개시된 HPLC 방법으로 측정될 때, 0.5% 이하의 프로필렌 글리콜을 포함하는, 약학적 조성물.
제19항에 있어서, 상기 조성물이 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 개시된 HPLC 방법으로 측정될 때, 0.01% 이하의 프로필렌 글리콜을 포함하는, 약학적 조성물.
제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 따라 측정된 1 ppm 이하의 프로필렌 옥사이드를 포함하는, 약학적 조성물.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 뇌척수강내 또는 뇌실내 투여를 위해 적합한, 약학적 조성물.
제22항에 있어서, 상기 조성물이 약 300 내지 약 450 mOsm/kg의 삼투질 농도를 갖는, 약학적 조성물.
제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 조성물이 약 10 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 베타-시클로덱스트린 혼합물을 포함하는, 약학적 조성물.
하나 이상의 히드록실 위치에서 히드록시프로필기에 의해 치환된 베타-시클로덱스트린 분자의 혼합물을 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 혼합물은 선택적으로, 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린 분자 및 뇌척수강내, 뇌실내, 또는 정맥내 투여를 위해 약학적으로 허용가능한 희석제를 포함하며,
상기 조성물은 베타-시클로덱스트린 혼합물 1g 당 내독소 5 EU 이하("NMT")를 포함하며;
상기 조성물은 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 개시된 HPLC 방법으로 측정될 때, 프로필렌 글리콜 0.5% 이하를 포함하고;
상기 조성물은 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 따라 측정될 때 1 ppm 이하의 프로필렌 옥사이드를 포함하는, 약학적 조성물.
제25항에 있어서, 상기 조성물이 베타-시클로덱스트린 혼합물 1 g 당 내독소 NMT 1.5 EU를 포함하는, 약학적 조성물.
제25항에 있어서, 상기 조성물이 USP 히드록시프로필 베타덱스 논문에 개시된 HPLC 방법으로 측정될 때, 0.01% 이하의 프로필렌 글리콜을 포함하는, 약학적 조성물.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
전자분무 MS 스펙트럼의 피크 높이에 의해 측정될 때,
상기 혼합물은 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린("DS-0"), 1개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-1") 및 2개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-2")을 합하여 3% 미만을 포함하며;
상기 혼합물은 5개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-5"), 6개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린('DS-6") 및 7개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린('DS-7")을 합하여 65% 이상을 포함하며;
상기 혼합물은 9개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-9") 및 10개의 히드록시프로필기로 치환된 베타-시클로덱스트린("DS-10")을 합하여 3% 미만을 포함하는, 약학적 조성물.
치료적 유효량의 제16항 내지 제28항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 니만-픽 질병 C형 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 니만-픽 질병 C형을 치료하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 투여는 뇌척수강내 또는 뇌실내 투여에 의해 이루어지는, 방법.
제29항 또는 제30항에 있어서, 약 300 mg 내지 약 2000 mg의 베타-시클로덱스트린 혼합물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 매달 1회, 2개월마다 1회, 또는 3개월마다 1회 이루어지는, 방법.
제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 약 900 mg 내지 약 1800 mg의 베타-시클로덱스트린 혼합물을 2주마다 1회 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제33항에 있어서, 상기 방법은 약 900 mg의 베타-시클로덱스트린 혼합물을 2주마다 1회 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 타우(tau) 단백질, 아밀로이드 펩타이드, 신경미세섬유경 단백질(neurofilament light protein; NFL), 신경 교원섬유 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP), 스테롤, 옥시스테롤, 키토트리오시다제 활성, 칼빈딘, 리소좀-관련 막 단백질 1(LAMP-1), GM2 또는 GM3 강글리오사이드, 스핑고신 및 스핑고신-1-포스페이트(S1P) 중 하나 이상의 뇌척수액내 수준을 조절하기에 충분한 양의 베타-시클로덱스트린 혼합물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 7-케토콜레스테롤, 7-케토콜레스테롤, 7β-히드록시콜레스테롤, 24S-히드록시콜레스테롤, 25-히드록시콜레스테롤, 27-히드록시콜레스테롤, 및 콜레스탄-3β,5α,6β-트리올 중 하나 이상의 혈장내 수준을 조절하기에 충분한 양의 베타-시클로덱스트린 혼합물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 3β-설폭시-7β-N-아세틸글루코사미닐-5-콜렌-24-오익산(SNAG-Δ⁵-CA), 글리신-접합된 3β-설폭시-7β-N-아세틸글루코사미닐-5-콜렌-24-오익산(SNAG-Δ⁵-CG) 및 타우린-접합된 3β-설폭시-7β-N-아세틸글루코사미닐-5-콜렌-24-오익산(SNAG-Δ⁵-CT) 중 하나 이상의 소변내 수준을 조절하기에 충분한 양의 베타-시클로덱스트린 혼합물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 보행, 소근육 운동, 인지, 언어능력, 연하, 안구운동, 기억력, 청력 및 발작으로부터 선택된 NPC 중증도 척도의 하나 이상의 영역 점수를 유지 또는 감소시키기에 충분한 양으로 베타-시클로덱스트린 혼합물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 베타-시클로덱스트린 혼합물의 제조방법으로서, 상기 방법은 Kleptose® HBP를 알루미나상의 흡수 크로마토그래피로 처리하는 단계를 포함하는, 방법.
제39항에 있어서, Kleptose® HBP를 용매 침전에 의해 처리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제40항에 있어서, 상기 용매 침전은 침전제로서 아세톤과 함께 물을 사용하여 수행되는, 방법.
제40항에 있어서, 상기 용매 침전은 침전제로서 아세톤과 함께 메탄올을 사용하여 수행되는, 방법.
하나 이상의 히드록실 위치에서 히드록시프로필기에 의해 치환된 베타-시클로덱스트린 분자의 혼합물로서, 상기 혼합물이 선택적으로, 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린 분자를 포함하고, 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된, 혼합물.
하나 이상의 히드록실 위치에서 히드록시프로필기에 의해 치환된 베타-시클로덱스트린 분자의 혼합물을 검정하는 방법으로서,
상기 혼합물은 선택적으로, 치환되지 않은 베타-시클로덱스트린 분자를 포함하며, 뇌척수강내 또는 뇌실내 투여를 위한 약학적 조성물에 사용하기 위한 것으로, 상기 방법은
a) 혼합물의 전자분무 MS 분석을 수행하는 단계;
b) 모든 피크의 높이를 측정하는 단계; 및
c) 혼합물 전체에서 각 베타-시클로덱스트린 종의 백분율을 계산하는 단계를 포함하며,
상기 혼합물이
집합적으로 1% 미만의 DS-0 및 DS-1;
집합적으로 85% 이상의 DS-3, DS-4, DS-5 및 DS-6;
집합적으로 1% 미만의 DS-9 및 DS-10을 포함하는 경우, 상기 혼합물은 사용하기에 적합한 것인, 방법.