EA033892B1

EA033892B1 - Композиции гидроксипропил-бета-циклодекстринов и способы

Info

Publication number: EA033892B1
Application number: EA201792487A
Authority: EA
Inventors: Бернардус Николас Махилсе; Аллан Дарлинг
Original assignee: Втесс, Инк.
Priority date: 2015-06-10
Filing date: 2016-06-09
Publication date: 2019-12-05
Also published as: US11744849B2; US11744848B2; US20230201247A1; US20220280554A1; US20230226101A1; BR112017026287A2; US20220280550A1; US20220273697A1; CA2988529A1; EP3307278A1; US11918601B2; US20170042932A1; US11406657B2; US20220280552A1; MX2017015879A; US11517585B2; US11633423B2; US10709730B2; US20170296572A1; US10933083B2

Abstract

В описании предложены смеси молекул бета-циклодекстринов, замещенных в одном или более гидроксильных положениях гидроксипропильными группами, необязательно содержащие незамещенные молекулы бета-циклодекстрина, для применения в качестве фармацевтически активного ингредиента; способы получения таких смесей; способы оценки соответствия таких смесей требованиям для применения в фармацевтической композиции, подходящей для интратекального или интрацеребровентрикулярного введения; фармацевтические композиции, подходящие для интратекального или интрацеребровентрикулярного введения, содержащие такие смеси; и способы применения фармацевтических композиций для лечения болезни Ниманна-Пика типа С.

Description

1. Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительных заявок на патент США №№ 62/345721, поданной 3 июня 2016 г.; 62/331385, поданной 3 мая 2016 г.; 62/314765, поданной 29 марта 2016 г.; 62/308736, поданной 15 марта 2016 г.; 62/276728, поданной 8 января 2016 г.; 62/263599, поданной 4 декабря 2015 г.; 62/249876, поданной 2 ноября 2015 г.; 62/245974, поданной 23 октября 2015 г.; 62/189114, поданной 6 июля 2015 г.; 62/175075, поданной 12 июня 2015 г.; и 62/173889, поданной 10 июня 2015 г., каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки во всей ее полноте.

2. Положение, относящееся к исследованию или разработке, финансируемым из федерального бюджета

Данное изобретение было создано в рамках выполнения Соглашения о проведении совместных исследований и разработок с Национальными институтами здравоохранения США, Агентством Министерства здравоохранения и социального обеспечения США. Правительство Соединенных Штатов имеет определенные права на данное изобретение.

3. Уровень техники

Болезнь Ниманна-Пика типа С (БНПС) представляет собой лизосомную болезнь накопления липидов, вызываемую аутосомными рецессивными мутациями либо в гене NPC1, либо в гене NPC2. Ее симптомы обычно проявляются в перинатальном периоде и прогрессируют в течение жизни. Указанное нарушение часто включает неврологические симптомы, такие как мозжечковая атаксия, дизартрия, судороги, вертикальный паралич взора, нарушение двигательной функции, дисфагия, психотические эпизоды и прогрессирующая деменция, а также системные симптомы в других органах, таких как печень, селезенка или легкие. БНПС характеризуется как нарушение транспорта холестерина в клетке, хотя в головном мозге также происходит накопление других липидов, таких как ганглиозиды GM2 и GM3 (Vanier, 2010, Orphanet Journal of Rare Diseases, vol. 5: 16). В связи с различными клиническими проявлениями и течением заболевания БНПС1 обычно классифицируют как заболевание с началом в раннем детском возрасте (< 2 лет), началом в позднем детском возрасте (от 2 до <6 лет), началом в подростковом возрасте (от 6 до <15 лет) и началом в юношеском/взрослом возрасте (>15 лет).

Попытки лечения БНПС у людей были сосредоточены на субстрат-редуцирующей терапии, такой как подавление синтеза гликосфинголипидов, например, с применением N-бутилдеоксиноджиримицина (миглустат, Завеска®), или на уменьшении степени накопления липидов в целом, в частности накопления холестерина и гликосфинголипидов, посредством воздействия на механизмы выведения.

Было показано, что 2-гидроксипропил-бета-циклодекстрины снижают избыточное накопление холестерина в клетках, имеющих мутацию в генах NPC (Abi-Mosleh, L. et al., Proceedings of National Academy of Sciences USA, 2009, vol. 106 (46), p. 19316-19321), что соответствует предшествующему сообщению о родственных циклодекстринах, способствующих выведению холестерина из цитоплазматической мембраны клеток (Rodal, S.K. et al., 1999, Molecular Biology of Cell, vol. 10, p. 961-974). Также было обнаружено, что гидроксипропил-бета-циклодекстрины оказывают благоприятное действие в моделях БНПС у животных. Например, сообщалось, что композиция, содержащая 2-гидроксипропил-бетациклодекстрины, восстанавливает нарушенный лизосомальный транспорт холестерина в печени и головном мозге мышей, нокаутных по гену Npc1, и приводит к увеличению продолжительности жизни этих мутантов по сравнению с продолжительностью жизни при отсутствии лечения (Liu, В. et al., 2009, Proceedings of National Academy of Sciences USA, vol. 106 (7), p. 2377-2382; Davidson et al., 2009, PLoS One 4:e6951).

Различные композиции гидроксипропил-бета-циклодекстринов вводили пациентам с БНПС в Соединенных Штатах, Бразилии и Японии в рамках разрешения на применение из соображений гуманности, при этом сообщения о некотором улучшении различных признаков и симптомов были единичными. Однако слепые клинические исследования композиций гидроксипропил-бета-циклодекстринов для определения безопасности и эффективности не были завершены (Ottinger, E.A. et al., 2014, Current Topics in Medicinal Chemistry, vol. 14 (3), p. 330-339). С учетом вероятности систематической ошибки наблюдателя в указанных единичных сообщениях существует потребность в контролируемых клинических исследованиях для подтверждения того, что гидроксипропил-бета-циклодекстрин обеспечивает клинический эффект.

Эффективное лечение БНПС потребует длительного интратекального или интрацеребровентрикулярного введения, начиная с младенчества, а композиции гидроксипропил-бета-циклодекстринов для парентерального применения, ранее используемые для введения пациентам-людям, содержат примеси, что делает их непригодными для длительного введения непосредственно в спинномозговую жидкость (СМЖ) младенцев и детей: пропиленгликоль, который считают ототоксичным; молекулы бетациклодекстрина, не имеющие гидроксипропильных заместителей, которые, как известно, образуют осадки и обладают острой токсичностью (Muller and Brauns, 1985, International Journal of Pharmaceutics, vol. 26, p. 77-88), и бактериальный эндотоксин, который обладает высокой провоспалительной активностью. Следовательно, существует потребность в фармацевтических композициях гидроксипропил-бетациклодекстринов более высокой степени чистоты.

- 1 033892

Кроме того, все существующие композиции гидроксипропил-бета-циклодекстринов для парентерального применения содержат сложные смеси соединений гидроксипропил-бета-циклодекстрина, имеющих различную степень замещения гидроксипропилом. Соотношения этих соединений в смеси значительно различаются у разных поставщиков и варьируют даже между партиями одного поставщика. Неизвестно, какой вклад эти различные соединения вносят в фармакологические эффекты сложной смеси. Следовательно, существует потребность в фармацевтических композициях гидроксипропил-бетациклодекстринов, содержащих более точно определенные и тщательно контролируемые смеси таких соединений или характеризуемых характеристическими спектрами таких соединений.

Наконец, существует потребность в способах получения в промышленном масштабе в условиях, соответствующих требованиям GMP, фармацевтических композиций гидроксипропил-бетациклодекстринов, подходящих для длительного интратекального или интрацереброваскулярного введения, содержащих низкие концентрации примесей и имеющих конкретный и структурно определенный состав.

4. Краткое описание

Авторы настоящего изобретения проанализировали исходные данные клинического исследования I фазы, в котором пациенты с болезнью НПС 1 типа получают лечение посредством интратекального введения 2-гидроксипропил-бета-циклодекстрина (ГПБЦД) с применением существующей композиции для парентерального применения Kleptose® HPB (Roquette). В этом нерандомизированном открытом одноцентровом исследовании, проводимом Национальным институтом здравоохранения (NIH), Kleptose® HPB вводят когортам пациентов, ранее не получавших медикаментозного лечения, в возрастающих дозах путем люмбальной инъекции. В некоторые из своих исследований авторы настоящего изобретения также включали данные от трех пациентов, которым интратекально вводили Kleptose® HPB в качестве индивидуальных новых исследуемых лекарственных средств (INDs) в другом учреждении.

Исследования авторов настоящего изобретения подтвердили, что интратекальное введение Kleptose® HPB обеспечивает терапевтический эффект при болезни НПС 1 типа. Используя стандартный суммарный показатель эффективности, клиническую шкалу тяжести БНПС, у 7/15 пациентов наблюдали стабильное заболевание или улучшение течения заболевания в сравнении с 0/13 в когорте пациентов, у которых изучали естественное течение заболевания при отсутствии лечения. Используя новую комбинированную конечную точку, основанную на ретроспективном анализе результатов, авторы настоящего изобретения обнаружили, что 11/15 пациентов в исследовании демонстрировали стабильное заболевание или улучшение течения заболевания в отличие от только 4/13, демонстрировавших стабильное заболевание, в когорте с естественным течением заболевания.

Более подробный анализ, однако, показал, что в то время как интратекальное введение ГПБЦД улучшает некоторые признаки и симптомы болезни НПС 1 типа, оно лишь замедляет прогрессирование других и, как оказалось, парадоксальным образом ускоряет прогрессирование других симптомов. В частности, у пациентов, получавших Kleptose ® HPB интратекально, по-видимому, была ускорена потеря слуха. Проведенный авторами настоящего изобретения анализ отдельных партий Kleptose ® HPB показал, что этот продукт для парентерального применения содержит сложную смесь молекул бетациклодекстринов, имеющих различную степень замещения, и неизвестно, какое из этих соединений вносит вклад в наблюдаемое улучшение, замедление прогрессирования и ускорение прогрессирования различных клинических проявлений.

Для подготовки к клиническим исследованиям, в которых ГПБЦД вводится непосредственно в спинномозговую жидкость в течение более длительных периодов времени и с более частым введением, авторы настоящего изобретения разработали способы снижения уровня пропиленгликоля, который предположительно является ототоксином; молекул бета-циклодекстрина, не имеющих гидроксипропильных заместителей, которые, как известно, образуют осадки, и бактериального эндотоксина, который обладает высокой провоспалительной активностью. Хотя разработанные способы были эффективны для снижения указанных примесей, авторы настоящего изобретения обнаружили, что абсорбционная хроматография на оксиде алюминия, используемая отдельно или в комбинации с осаждением растворителем, также изменяла характеристический спектр состава, по существу уменьшая количество молекул бетациклодекстрина, содержащих единственный гидроксипропильный заместитель (DS-1), и уменьшая количество молекул бета-циклодекстрина, содержащих две гидроксипропильные группы (DS-2). Снижение содержания молекул с низкой степенью замещения (DS-0, как и предполагалось, и DS-1 и DS-2, непреднамеренно) увеличивало среднюю степень замещения (DS_a) смеси.

Неожиданно, несмотря на изменение характеристического спектра Kleptose® HPB, согласно оценке в экспериментах по определению профиля экспрессии генов in vitro не наблюдалось изменений в экспрессии генов, которые, как известно, вовлечены в метаболизм и транспорт холестерина. Это открытие позволит вводить более высокоочищенную и определенную по составу композицию ГПБЦД посредством интратекального или интрацереброваскулярного пути в СМЖ пациентов с болезнью НПС в течение более длительных периодов времени, необязательно с более частым введением, с обеспечением терапевтического эффекта и повышенной безопасности.

- 2 033892

Соответственно в первом аспекте предложены смеси молекул бета-циклодекстринов, замещенных гидроксипропильными группами в одном или более гидроксильных положениях, необязательно содержащие незамещенные молекулы бета-циклодекстрина. Смесь содержит менее 1% незамещенного бетациклодекстрина (DS-0) и бета-циклодекстрина, замещенного одной гидроксипропильной группой (DS-1), в совокупности; по меньшей мере 85% бета-циклодекстрина, замещенного тремя гидроксипропильными группами (DS-3), бета-циклодекстрина, замещенного четырьмя гидроксипропильными группами (DS-4), бета-циклодекстрина, замещенного пятью гидроксипропильными группами (DS-5), и бета-циклодекстрина, замещенного шестью гидроксипропильными группами (DS-6), в совокупности; и менее 1% бета-циклодекстрина, замещенного девятью гидроксипропильными группами (DS-9), и бета-циклодекстрина, замещенного десятью гидроксипропильными группами (DS-10), в совокупности, как установлено по высоте пика на спектре, полученном методом масс-спектрометрии (МС) с ионизацией электрораспылением.

В некоторых вариантах реализации менее 0,1% смеси бета-циклодекстринов представляет собой DS-0 и DS-1 в совокупности. В некоторых вариантах реализации менее 0,01% смеси бетациклодекстринов представляет собой DS-0 и DS-1 в совокупности. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 87% смеси бета-циклодекстринов представляет собой DS-3, DS-4, DS-5 и DS-6 в совокупности. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 90% смеси бета-циклодекстринов представляет собой DS-3, DS-4, DS-5 и DS-6 в совокупности. В некоторых вариантах реализации менее 0,1% смеси бета-циклодекстринов представляет собой DS-9 и DS-10 в совокупности. В некоторых вариантах реализации менее 0,01% смеси бета-циклодекстринов представляет собой DS-9 и DS-10 в совокупности.

В другом аспекте смесь содержит менее 1% незамещенного бета-циклодекстрина (DS-0) и бетациклодекстрина, замещенного одной гидроксипропильной группой (DS-1), в совокупности и менее 1% бета-циклодекстрина, замещенного девятью гидроксипропильными группами (DS-9), и бетациклодекстрина, замещенного десятью гидроксипропильными группами (DS-10), в совокупности, как установлено по высоте пика на спектре, полученном методом МС с ионизацией электрораспылением, и смесь имеет среднее молярное замещение (МЗ) в диапазоне от 0,50 до 0,80.

В некоторых вариантах реализации менее 0,1% смеси бета-циклодекстринов представляет собой DS-0 и DS-1 в совокупности. В некоторых вариантах реализации менее 0,01% смеси бетациклодекстринов представляет собой DS-0 и DS-1 в совокупности. В некоторых вариантах реализации менее 0,1% смеси бета-циклодекстринов представляет собой DS-9 и DS-10 в совокупности. В некоторых вариантах реализации менее 0,01% смеси бета-циклодекстринов представляет собой DS-9 и DS-10 в совокупности. В различных вариантах реализации МЗ находится в диапазоне от 0,60 до 0,70. В некоторых из этих вариантов реализации МЗ находится в диапазоне от 0,64 до 0,68. В некоторых вариантах реализации МЗ составляет примерно 0,66-0,67.

В другом аспекте предложены фармацевтические композиции, содержащие смесь бетациклодекстринов, описанную в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый разбавитель.

В некоторых вариантах реализации композиция содержит не более 0,5% пропиленгликоля, где указанное содержание измерено методом ВЭЖХ, приведенным в статье Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс. В некоторых вариантах реализации композиция содержит не более 0,01% пропиленгликоля, где указанное содержание измерено методом ВЭЖХ, приведенным в статье Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит не более (НБ) 5 ЕЭ эндотоксинов на 1 г смеси бета-циклодекстринов. В конкретных вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит НБ 1,5 ЕЭ эндотоксинов на 1 г смеси бета-циклодекстринов. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит не более 1 ppm пропиленоксида, где указанное содержание определено в соответствии со статьей Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс.

В типичных вариантах реализации фармацевтическая композиция является подходящей для интратекального или интрацеребровентрикулярного введения. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция имеет осмоляльность от примерно 300 до примерно 450 мОсм/кг. В некоторых вариантах реализации композиция содержит от примерно 10 до примерно 200 мг/мл смеси бетациклодекстринов.

В другом аспекте фармацевтическая композиция содержит смесь молекул бета-циклодекстринов, замещенных в одном или более гидроксильных положениях гидроксипропильными группами, необязательно содержащую незамещенные молекулы бета-циклодекстрина, и разбавитель, который является фармацевтически приемлемым для интратекального, интрацеребровентрикулярного или внутривенного введения. Композиция содержит не более (НБ) 5 ЕЭ эндотоксинов на 1 г смеси бета-циклодекстринов, не более 0,5% пропиленгликоля, где указанное содержание измерено методом ВЭЖХ, приведенным в статье Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс, и не более 1 ppm пропиленоксида, где указанное содержание определено в соответствии со статьей Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс.

В некоторых вариантах реализации композиция содержит НБ 1,5 ЕЭ эндотоксинов на 1 г смеси бета-циклодекстринов. В некоторых вариантах реализации композиция содержит не более 0,01% пропиленгликоля, где указанное содержание измерено методом ВЭЖХ, приведенным в статье Фармакопеи

- 3 033892

США на гидроксипропилбетадекс. В некоторых вариантах реализации смесь содержит менее 3% незамещенного бета-циклодекстрина (DS-0), бета-циклодекстрина, замещенного одной гидроксипропильной группой (DS-1), и бета-циклодекстрина, замещенного двумя гидроксипропильными группами (DS-2), в совокупности; по меньшей мере 65% бета-циклодекстрина, замещенного пятью гидроксипропильными группами (DS-5), бета-циклодекстрина, замещенного шестью гидроксипропильными группами (DS-6), и бета-циклодекстрина, замещенного семью гидроксипропильными группами (DS-7), в совокупности; и менее 3% бета-циклодекстрина, замещенного девятью гидроксипропильными группами (DS-9), и бета-циклодекстрина, замещенного десятью гидроксипропильными группами (DS-10), в совокупности, как установлено по высоте пиков на спектре, полученном методом МС с ионизацией электрораспылением.

В другом аспекте предложены способы лечения болезни Ниманна-Пика типа С, включающие введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции.

В типичных вариантах реализации композицию вводят интратекально или путем интрацеребровентрикулярного введения. В некоторых вариантах реализации способ включает введение пациенту от примерно 300 до примерно 2000 мг смеси бета-циклодекстринов. В некоторых вариантах реализации композицию вводят один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в месяц, один раз в два месяца или один раз в три месяца. В некоторых вариантах реализации способ включает введение пациенту от примерно 900 до примерно 1800 мг смеси бета-циклодекстринов один раз в две недели. В некоторых вариантах реализации способ включает введение пациенту примерно 900 мг смеси бетациклодекстринов один раз в две недели.

В некоторых вариантах реализации способ включает введение количества смеси бетациклодекстринов, достаточного для модулирования уровня в спинномозговой жидкости одного или более из: белка тау, амилоидного пептида, легкого белка нейрофиламентов (NFL), глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), стерола, оксистерола, активности хитотриозидазы, кальбиндина, белка лизосомальной мембраны 1 (LAMP-1), ганглиозидов GM2 или GM3, сфингозина и сфингозин-1-фосфата (S1P).

В некоторых вариантах реализации способ включает введение количества смеси бетациклодекстринов, достаточного для модулирования уровня в плазме одного или более из: 7кетохолестерола, 7в-гидроксихолестерола, 24в-гидроксихолестерола, 25-гидроксихолестерола, 27гидроксихолестерола и холестан-3в,5а,6в-триола.

В некоторых вариантах реализации способ включает введение количества смеси бетациклодекстринов, достаточного для модулирования уровня в моче одной или более из 3в-сульфокси-7в№ацетилглюкозаминил-5-холен-24-овой кислоты (SNAG-A⁵-CA). конъюгированной с глицином 3βсульфокси-73-№ацетилглюкозаминил-5-холен-24-овой кислоты (SNAG-A5-CG) и конъюгированной с таурином 33-сульфокси-7в-№ацетилглюкозаминил-5-холен-24-овой кислоты (SNAG-A5-CT).

В некоторых вариантах реализации способ включает введение смеси бета-циклодекстринов в количестве, достаточном для поддержания или снижения значений одного или более используемых для оценки параметров согласно шкале тяжести БНПС, выбранных из ходьбы, мелкой моторики, когнитивной деятельности, речи, глотания, движения глаз, памяти, слуха и судорог.

В другом аспекте представлен способ получения смеси бета-циклодекстринов, включающий обработку Kleptose® HBP с помощью абсорбционной хроматографии на оксиде алюминия.

В некоторых вариантах реализации способ включает комбинацию абсорбционной хроматографии на оксиде алюминия и осаждения растворителем. В некоторых вариантах реализации осаждение растворителем проводят с использованием воды с ацетоном в качестве осаждающего агента. В других вариантах реализации осаждение растворителем проводят с использованием метанола с ацетоном в качестве осаждающего агента.

В другом аспекте смеси молекул бета-циклодекстрина, замещенных в одном или более гидроксильных положениях гидроксипропильными группами, необязательно содержащие незамещенные молекулы бета-циклодекстрина, получают путем обработки Kleptose® HBP с помощью комбинации абсорбционной хроматографии на оксиде алюминия и осаждения растворителем.

В дополнительном аспекте предложены способы определения соответствия смеси молекул бетациклодекстрина, замещенных в одном или более гидроксильных положениях гидроксипропильными группами, необязательно содержащей незамещенные молекулы бета-циклодекстрина, требованиям для применения в фармацевтической композиции для интратекального или интрацеребровентрикулярного введения. Способ включает (а) проведение анализа смеси методом МС с ионизацией электрораспылением; (b) измерение высоты пиков и (c) расчет процентного содержания каждого типа соединения бетациклодекстрина в общей смеси, основанный на высоте пиков. Смесь соответствует требованиям для применения - то есть обладает качеством, достаточным для применения, - в случае, если смесь содержит менее 1% DS-0 и DS-1 в совокупности; по меньшей мере 85% DS-3, DS-4, DS-5 и DS-6 в совокупности и менее 1% DS-9 и DS-10 в совокупности.

- 4 033892

В другом аспекте в настоящем описании предложена фармацевтическая композиция, содержащая в качестве фармацевтически активного ингредиента смесь незамещенных молекул бета-циклодекстрина и молекул бета-циклодекстрина, замещенных в одном или более гидроксильных положениях гидроксипропильными группами, содержащая среднее число гидроксипропильных групп на бета-циклодекстрин (DS_a), составляющее от примерно 3 до примерно 7. В предпочтительных вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит не более 0,5% пропиленгликоля, не более (НБ) 1,5 ЕЭ эндотоксина на 1 г смеси бета-циклодекстринов и не более 1% смеси не содержит гидроксипропильного заместителя (DS-0). В различных предпочтительных вариантах реализации смесь бета-циклодекстринов имеет среднее молярное замещение (МЗ) в диапазоне примерно 0,58-примерно 0,68 (DS_a в диапазоне примерно 4,06-4,76). В некоторых из этих предпочтительных вариантов реализации смесь имеет МЗ, составляющее 0,58-0,68 (DS_a составляет 4,06-4,76), и в некотором варианте реализации МЗ, составляющее примерно 0,63. В различных предпочтительных вариантах реализации смесь имеет среднее молярное замещение (МЗ) в диапазоне от примерно 0,65 до примерно 0,68 (DS_a 4,6-4,7), а в некоторых вариантах реализации среднее молярное замещение, составляющее примерно 0,67.

В некоторых вариантах реализации бета-циклодекстрины в смеси состоят из остатков глюкозы, имеющих структуру

OR³ где R¹, R² и R³ независимо для каждого случая представляют собой -Н или -HP, где HP содержит одну или более гидроксипропильных групп.

В некоторых вариантах реализации среднее количество HP на бета-циклодекстрин составляет от примерно 3 до примерно 7.

В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 15% из всего количества случаев, когда R¹ и R² присутствуют одновременно, представляют собой HP.

В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 30% из числа R³ представляют собой HP.

В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 70% бета-циклодекстринов в совокупности имеют среднее количество HP на бета-циклодекстрин от примерно 4 до примерно 6.

В некоторых вариантах реализации DS_a составляет от примерно 3 до примерно 4. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 3,3 ± 0,3. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 3,7 ± 0,3.

В некоторых вариантах реализации DS_a составляет от примерно 3,5 до примерно 4,5. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 3,8 ± 0,3. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 4,2 ± 0,3.

В некоторых вариантах реализации DS_a составляет от примерно 4 до примерно 5. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 4,3 ± 0,3. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 4,7 ± 0,3.

В некоторых вариантах реализации DS_a составляет от примерно 4,5 до примерно 5,5. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 4,8 ± 0,3. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 5,2 ± 0,3.

В некоторых вариантах реализации DS_a составляет от примерно 5 до примерно 6. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 5,3 ± 0,3. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 5,7 ± 0,3.

В некоторых вариантах реализации DS_a составляет от примерно 5,5 до примерно 6,5. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 5,8 ± 0,3. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 6,2 ± 0,3.

В некоторых вариантах реализации DS_a составляет от примерно 6 до примерно 7. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 6,3 ± 0,3. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 6,7 ± 0,3.

В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 70% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 1. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 90% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 1.

В некоторых вариантах реализации гидроксипропильные группы в гидроксильных положениях бета-циклодекстринов замещены гидроксипропильными цепями, имеющими структуру [CH₂CH(CH₃)O]_nH, где n > 1 и среднее число гидроксипропильных цепей на бета-циклодекстрин составляет от примерно 3 до примерно 7. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 70% гидроксипропильных цепей имеют n = 1. В некоторых вариантах реализации менее 30% гидроксипропильных цепей имеют n = 2. В некоторых вариантах реализации менее 10% гидроксипропильных цепей имеют n > 2. В некоторых вариантах реализации среднее число гидроксипропильных цепей на бета-циклодекстрин составляет от примерно 4 до примерно 6. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 70% бета-циклодекстринов в совокупности имеют среднее число гидроксипропильных цепей на бета-циклодекстрин, составляющее от примерно 4 до примерно 6.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция, раскрытая в настоящем описании, содержит менее примерно 10 международных единиц (ME), например менее примерно 6, менее

- 5 033892 примерно 3 или менее примерно 1,5 ME эндотоксинов на 1 г фармацевтически активного ингредиента. Уровень эндотоксинов определяют с помощью реакции с лизатом амебоцитов мечехвоста.

В некоторых вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент содержит менее примерно 2 мас.%, например менее примерно 1 мас.% незамещенного бета-циклодекстрина.

В некоторых вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент содержит менее примерно 0,5 мас.%, например менее примерно 0,2 мас.% пропиленгликоля или олигомеров пропиленгликоля.

В некоторых вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент содержит менее примерно 1 ppm пропиленоксида.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит фармацевтически активный ингредиент, где 20% (мас./об.) раствор фармацевтически активного ингредиента в 1 мл дистиллированной воды солюбилизирует по меньшей мере 2 мг, например по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 мг неэтерифицированного холестерина при комнатной температуре согласно измерению с помощью спектрометрии в УФ-диапазоне через примерно 24 ч.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция проявляет более низкую ототоксичность, чем Trappsol® Cyclo. В некоторых вариантах реализации ототоксичность определяют in vitro посредством определения токсичности в отношении клетки кортиева органа (House Ear Institute-organ of Corti 1) (HEI-OC1). В некоторых вариантах реализации ототоксичность определяют in vivo с помощью теста акустических стволовых вызванных потенциалов (АСВП) у субъекта, такого как мышь, крыса, кошка, собака или человек.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция является подходящей для интратекального или интрацеребровентрикулярного введения.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция имеет осмоляльность от примерно 300 до примерно 450 мОсм/кг.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит от примерно 10 до примерно 200 мг/мл фармацевтически активного ингредиента.

В некоторых вариантах реализации единственный фармацевтически активный ингредиент фармацевтической композиции получают очисткой Kleptose® HBP, Kleptose® HP, Trappsol® Cyclo или Cavasol® W7 HP Pharma. В некоторых вариантах реализации единственный фармацевтически активный ингредиент фармацевтической композиции получают очисткой Kleptose® HBP. В некоторых вариантах реализации единственный фармацевтически активный ингредиент фармацевтической композиции получают очисткой Trappsol® Cyclo. В некоторых вариантах реализации очистка включает гидрофильное или гидрофобное взаимодействие или аффинную очистку и может включать хроматографические способы, такие как очистка с помощью ВЭЖХ или гель-проникающей хроматографии.

В настоящем описании также предложен способ лечения болезни Ниманна-Пика типа С, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту, например, путем интратекального или интрацеребровентрикулярного введения, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах реализации способ включает введение пациенту от примерно 300 до примерно 3000 мг фармацевтически активного ингредиента. В некоторых вариантах реализации введение осуществляют каждую неделю, каждые две недели, каждые три недели, каждый месяц, каждые два месяца или каждые три месяца. Например, способ может включать введение субъекту от примерно 600 до примерно 1800 мг фармацевтически активного ингредиента каждые две недели.

В некоторых вариантах реализации способ включает введение количества фармацевтически активного ингредиента, достаточного для модулирования уровня в спинномозговой жидкости одного или более из: белка тау, амилоидного пептида, легкого белка нейрофиламентов (NFL), глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), стерола, оксистерола, активности хитотриозидазы, кальбиндина, белка лизосомальной мембраны 1 (LAMP-1), ганглиозидов GM2 или GM3, сфингозина и сфингозин-1-фосфата (S1P).

В некоторых вариантах реализации способ включает введение количества фармацевтически активного ингредиента, достаточного для модулирования уровня в плазме одного или более из: 7кетохолестерола, 7в-гидроксихолестерола, 24Б-гидроксихолестерола, 25-гидроксихолестерола, 27гидроксихолестерола и холестан-3в,5а,6в-триола.

В некоторых вариантах реализации способ включает введение количества фармацевтически активного ингредиента, достаточного для модулирования уровня в моче одной или более из 3-сульфокси-7-№ ацетилглюкозаминил-5-холен-24-овой кислоты (SNAG-A5-CA). конъюгированной с глицином 3сульфокси-7-№ацетилглюкозаминил-5-холен-24-овой кислоты (SNAG-A5-CG) и конъюгированной с таурином 3-сульфокси-7-№ацетилглюкозаминил-5-холен-24-овой кислоты (SNAG-A5-CT).

В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает поддержание или снижение значений одного или более используемых для оценки параметров согласно шкале тяжести БНПС, выбранных из ходьбы, мелкой моторики, когнитивной деятельности, речи, глотания, движения глаз, памяти, слуха и судорог.

- 6 033892

5. Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показаны клинические параметры, вносящие вклад в стандартную клиническую шкалу тяжести БНПС, в соответствии с Yanjanin et al., Linear Clinical Progression, Independent of Age of Onset, in Niemann-Pick Disease, Type C, Am. J. Med. Genet. Part В 153В: 132-140 (2010).

На фиг. 2 обобщены результаты первоначального анализа клинического исследования фазы I, описанного в примере 1.

На фиг. 3 обобщены результаты последующего анализа клинического исследования фазы I, описанного в примере 1.

На фиг. 4 обобщены результаты анализа клинического исследования фазы I с использованием изменения относительно исходных значений.

На фиг. 5 обобщены предварительные результаты клинического исследования фазы I с использованием общих оценок БНПС.

На фиг. 6 обобщены предварительные результаты клинического исследования фазы I без учета влияния на слух.

На фиг. 7 обобщены клинические параметры, вносящие вклад в новую комбинированную конечную точку БНПС или оценку тяжести;

На фиг. 8 обобщены предварительные результаты клинического исследования фазы I с использованием новой комбинированной конечной точки БНПС.

На фиг. 9 изображена типичная хроматограмма ВЭЖХ с использованием метода анализа производных циклодекстрина (CD-screen).

На фиг. 10 изображены сравнительные хроматограммы ВЭЖХ с использованием разных растворителей в методе анализа производных циклодекстрина. Верхняя кривая: метанол; нижняя кривая: ацетонитрил.

На фиг. 11 изображены экстрагированные ионные хроматограммы гидроксипропил-бетациклодекстринов, имеющих различную степень замещения (DS), полученные методом массспектрометрии с использованием колонки для анализа производных циклодекстрина.

На фиг. 12 изображена типичная хроматограмма ВЭЖХ с использованием колонки с обращенной фазой LiChrosphere C18.

На фиг. 13 изображены сравнительные хроматограммы ВЭЖХ с использованием разных растворителей в методе хроматографии с обращенной фазой на LiChrosphere С18. Верхняя кривая: метанол; нижняя кривая: ацетонитрил.

На фиг. 14 изображены экстрагированные ионные хроматограммы гидроксипропил-бетациклодекстринов, имеющих различную степень замещения (DS), полученные методом массспектрометрии с использованием колонки LiChrosphere С18.

На фиг. 15 изображены сравнительные хроматограммы ВЭЖХ с использованием разных растворителей на колонке HILIC. Верхняя кривая: градиент ацетонитрила в воде до 79%; нижняя кривая: 75% ацетонитрил.

На фиг. 16 изображены экстрагированные ионные хроматограммы гидроксипропил-бетациклодекстринов, имеющих различную степень замещения (DS), полученные методом массспектрометрии с использованием колонки HILIC.

На фиг. 17 изображена типичная хроматограмма ВЭЖХ с использованием колонки с силикагелем.

На фиг. 18 изображены экстрагированные ионные хроматограммы гидроксипропил-бетациклодекстринов, имеющих различную степень замещения (DS), полученные методом массспектрометрии с использованием колонки с силикагелем.

На фиг. 19 показаны наложенные кривые хроматограмм для коммерческого препарата Kleptose HPB® (Roquette, партия Е0223) (верхняя кривая) и после очистки посредством комплексообразования с D-лимоненом (нижняя кривая). На оси X представлено время удерживания в минутах.

На фиг. 20 показаны хроматограммы ВЭЖХ для образца, полученного после осаждения растворителем с использованием смеси вода/ацетон (верхняя кривая) в сравнении с коммерческим препаратом Kleptose HPB® (Roquette, партия Е0223).

На фиг. 21 показаны наложенные кривые хроматограмм для коммерческого препарата Kleptose HPB® (Roquette, партия Е0223) (верхняя кривая) и после очистки на смоле и обработки активированным углем (нижняя кривая). На оси X представлено время удерживания в минутах.

На фиг. 22 показаны наложенные кривые хроматограмм для коммерческого препарата Kleptose HPB® (Roquette, партия Е0223) (верхняя кривая) и после очистки с помощью оксида алюминия. На нижней кривой показаны данные для очищенного фильтрата после очистки с помощью оксида алюминия; на центральной кривой показаны данные для очищенного 1-го промывочного раствора после очистки с помощью оксида алюминия. На оси X представлено время удерживания в минутах.

На фиг. 23 показаны сравнительные хроматограммы ВЭЖХ для каждой из фракций от A до H (за исключением Е), полученных при хроматографии Kleptose® HPB на оксиде алюминия. Фракции от A до H соответствуют образцам с 5.4.3.2.2A по 5.4.3.2.2H соответственно (за исключением Е). На оси X пред

- 7 033892 ставлено время удерживания в минутах.

На фиг. 24 показан график процентного содержания примесей в каждой из фракций от A до H, собранных при очистке Kleptose® HPB с помощью хроматографии на оксиде алюминия. Отметки A-H на оси х соответствуют образцам с 5.4.3.2.2A по 5.4.3.2.2H соответственно. На оси Y показано процентное содержание примесей. ПГ% = процент пропиленгликоля (столбцы с диагональной штриховкой); общее содержание других примесей % = процент от общего количества примесей, связанных с циклодекстрином (черные столбцы); БЦД% = процент незамещенного бета-циклодекстрина (столбцы без штриховки); ГПБЦД DS-1% = процент монозамещенных бета-циклодекстринов (столбцы с обратной диагональной штриховкой).

На фиг. 25 изображен пример газовой хроматограммы Kleptose HPB® для определения пропиленгликоля (примесь, подлежащая измерению) и этиленгликоля (внутренний стандарт). На оси X представлено время удерживания в минутах; на оси y представлен ответ.

На фиг. 26 изображены примеры газовых хроматограмм производных пропиленгликоля. На оси X представлено время удерживания в минутах; на оси y представлен ответ в милливольтах.

На фиг. 27 изображен калибровочный график для определения концентраций пропиленгликоля в образцах для газовой хроматографии. ПГ/ЭГ = отношение пропиленгликоля к этиленгликолю, как указано.

На фиг. 28 изображен пример спектра ¹H ЯМР для Kleptose HPB® (DS_a составляет 4,1), полученный с применением метода согласно Европейской фармакопее.

На фиг. 29 представлены данные спектров, полученных методом МС с ионизацией электрораспылением, из первой лаборатории, на фиг. 29A показан спектр Kleptose® HPB, а на фиг. 29B показан спектр Trappsol® Cyclo™. Числа добавляли к спектрам для идентификации количества гидроксипропильных фрагментов в каждом пике.

На фиг. 30 представлены данные, полученные методом МС с ионизацией электрораспылением, из второй лаборатории, на фиг. 30A показан спектр Kleptose® HPB, а на фиг. 30B показан спектр Trappsol® Cyclo™.

На фиг. 31 приведено сравнение данных для трех различных партий Kleptose® HPB, полученных методом МС с ионизацией электрораспылением, выполненным двумя различными лабораториями.

На фиг. 32 представлены данные спектров для двух различных партий Trappsol® Cyclo™, полученных методом МС с ионизацией электрораспылением в двух различных лабораториях с использованием тех же условий, которые использовали для получения данных для Kleptose, показанных на фиг. 31.

На фиг. 33 показаны спектры, полученные методом МС с ионизацией электрораспылением, на которых ось Y была расширена по сравнению с фиг. 29-32, чтобы показать пики между m/z 1090 и 1230. Фиг. 33A представляет собой спектр, полученный для Trappsol® Cyclo™. Фиг. 33B представляет собой спектр, полученный для Kleptose® HPB.

На фиг. 34 приведены данные, полученные методом МС с ионизацией электрораспылением, для дополнительного сравнения различий между Kleptose® HPB и Trappsol® Cyclo™, на фиг. 34A показан спектр Kleptose® HPB, а на фиг. 34B показан спектр Trappsol® Cyclo™. Числа добавляли к спектрам для идентификации количества гидроксипропильных фрагментов в каждом пике.

На фиг. 35 представлены дополнительные различия в спектрах МС между Kleptose® HPB и Trappsol® Cyclo™ между m/z 995 и 1095, на фиг. 35A показан спектр Kleptose® HPB, а на фиг. 35B показан спектр Trappsol® Cyclo™.

На фиг. 36 представлены данные, полученные методом МС с ионизацией электрораспылением, демонстрирующие влияние очистки с помощью адсорбции на оксиде алюминия на характеристический спектр замещения. На фиг. 36A показан спектр исходного материала Kleptose® HPB, а на фиг. 36B представлен спектр препарата партии CYL-4063, который очищали с помощью комбинации абсорбционной хроматографии на оксиде алюминия и осаждения растворителем (вода-ацетон).

На фиг. 37 показаны изменения в экспрессии выбранных генов, связанных с гомеостазом холестерина, в клетках GM18453 и GM05659, обработанных Kleptose® HPB в диапазоне концентраций (от 0,1 до 10 мМ).

На фиг. 38 показана кратность изменений экспрессии в клетках GM18453, гомозиготных по мутации NPC1, подмножества генов гомеостаза холестерина, экспрессия которых статистически значимо отличалась (р < 0,001) после обработки, для четырех различных композиций: СТД (стандартный препарат Kleptose® HPB); XA (Kleptose® HPB, очищенная с помощью хроматографии на оксиде алюминия); OP (Kleptose® HPB, очищенная путем осаждения растворителем) и AO (Kleptose® HPB, очищенная с помощью хроматографии на оксиде алюминия и осаждения растворителем).

На фиг. 39 показаны биологические пути, подвергшиеся наибольшему влиянию, расположенные согласно статистической значимости, когда клетки GM18453 обрабатывают соответственно Kleptose® HPB и порцией Kleptose® HPB, очищенной способом, который включает адсорбцию на алюминии.

На фиг. 40 показаны хроматограммы различных фракций, полученных при препаративном хромато

- 8 033892 графическом разделении с использованием метода анализа производных циклодекстрина партии Kleptose® HPB, снабженные примечаниями, чтобы показать степень замещения хроматографически разделенных соединений гидроксипропил-бета-циклодекстринов.

На фиг. 41 показаны спектры, полученные методом МС с ионизацией электрораспылением, для Kleptose® HPB, фракции L, фракции M и фракции H, снабженные примечаниями, чтобы идентифицировать сигналы по степени гидроксипропильного замещения, на фиг. 41А показана Kleptose® HPB партии Е0245; на фиг. 41B показана фракция L (фракция 2 отдельно); на фиг. 41C показана фракция M (объединенные фракции 4-15); а на фиг. 41D показана фракция H (объединенные фракции 16-24).

На фиг. 42 показаны 10 биологических путей, подвергшихся наибольшему влиянию при обработке клеток NPC с применением 1,0 мМ фракций L, M и H, расположенных в порядке снижения статистической значимости.

На фиг. 43 показаны хроматограммы различных фракций, полученные при препаративном адсорбционно-хроматографическом разделении на алюминии пробы Kleptose® HPB (партия Е0245), снабженные примечаниями, чтобы показать пронумерованные фракции, объединенные для получения фракций A-F и K, и снабженные примечаниями, чтобы показать степень замещения хроматографически разделенных соединений гидроксипропил-бета-циклодекстринов.

На фиг. 44 показаны хроматограммы смеси ГПБЦД после применения различных способов очистки, на фиг. 44A показаны хроматограммы очищенной смеси ГПБЦД после применения способов II-IX, а на фиг. 44B показаны хроматограммы очищенной смеси ГПБЦД после применения способов X и XI.

На фиг. 45 обобщены результаты анализа, проведенного для данных БНПС клинического исследования I фазы за 18 месяцев.

На фиг. 46 показан годовой показатель изменения данных клинического исследования I фазы за 18 месяцев.

На фиг. 47 показано среднее изменение относительно исходных значений данных клинического исследования I фазы за 18 месяцев.

На фиг. 48 показан анализ данных пациентов клинического исследования I фазы, ответивших на лечение, за 18 месяцев.

На фиг. 49 показано влияние лечения на слух.

На фиг. 50 обобщено влияние лечения на слух.

6. Подробное описание

6.1. Экспериментальные наблюдения.

Как подробно описано ниже в примере 1, авторы настоящего изобретения проанализировали исходные данные клинического исследования I фазы, проводимого Национальным институтом здравоохранения, в котором пациенты с болезнью НПС 1 типа получают лечение посредством интратекального введения 2-гидроксипропил-бета-циклодекстрина (ГПБЦД) с применением существующей композиции для парентерального применения Kleptose® HPB (Roquette). В этом нерандомизированном открытом одноцентровом исследовании Kleptose® HPB вводят когортам пациентов, ранее не получавших медикаментозного лечения, в возрастающих дозах путем люмбальной инъекции. В некоторые из своих исследований авторы настоящего изобретения также включали данные от трех пациентов, которым интратекально вводили Kleptose® HPB в качестве индивидуальных новых исследуемых лекарственных средств (INDs) в другом учреждении.

Исследования авторов настоящего изобретения подтвердили, что интратекальное введение Kleptose® HPB обеспечивает терапевтический эффект при болезни НПС 1 типа. Используя стандартный суммарный показатель эффективности, клиническую шкалу тяжести БНПС (см. Yanjanin et al., Linear Clinical Progression, Independent of Age of Onset, in Niemann-Pick Disease, Type C, Am. J. Med. Genet. Part В 153B:132-140 (2010); см. также фиг. 1 и табл. 1 в настоящем описании), у 7/15 пациентов наблюдали стабильное заболевание или улучшение течения заболевания в сравнении с 0/13 в когорте пациентов, у которых изучали естественное течение заболевания при отсутствии лечения (см. фиг. 5). Используя новую комбинированную конечную точку, основанную на ретроспективном анализе результатов (фиг. 7), авторы настоящего изобретения обнаружили, что 11/15 пациентов в исследовании демонстрировали стабильное заболевание или улучшение течения заболевания, в отличие от только 4/13, демонстрировавших стабильное заболевание, в когорте с естественным течением заболевания (см. фиг. 8). В некоторых из своих исследований авторы настоящего изобретения использовали клиническую оценку тяжести БНПС без учета слуха и акустических стволовых потенциалов (АСП).

Более подробный анализ, однако, показал, что в то время как интратекальное введение ГПБЦД улучшает некоторые признаки и симптомы болезни НПС 1 типа, оно лишь замедляет прогрессирование других и, как оказалось, парадоксальным образом ускоряет прогрессирование других симптомов. В частности, потеря слуха, по-видимому, была ускорена у пациентов, получавших Kleptose® HPB интратекально (см., например, фиг. 2-4).

Как подробно изложено ниже в примере 3, авторы настоящего изобретения проанализировали отдельные партии Kleptose® HPB с помощью различных хроматографических методов. Эти исследования

- 9 033892 показали, что данный продукт для парентерального применения содержит сложную смесь молекул бетациклодекстринов, имеющих различную степень замещения (см., например, фиг. 11, 14, 16, 18); неизвестно, какое из этих соединений вносит вклад в наблюдаемое улучшение, замедление прогрессирования и ускорение прогрессирования различных клинических проявлений.

Дополнительный анализ с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, описанный в примере 5, показал, что существуют существенные различия в характеристическом спектре замещения композиции гидроксипропил-бета-циклодекстринов, применяемой в клиническом исследовании фазы I, описанном в примере 1, Kleptose® HPB, по сравнению с характеристическим спектром замещения другой поставляемой на рынок композиции гидроксипропил-бета-циклодекстринов, Trappsol® Cyclo™. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что Kleptose® HPB имеет низкую вариабельность в характеристическом спектре замещения от партии к партии и низкое содержание примесей, в частности пропиленгликоля. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что Trappsol® Cyclo™, напротив, проявляет высокую вариабельность в характеристическом спектре замещения от партии к партии и имеет значительно более высокое содержание пропиленгликоля, предполагаемого ототоксина.

Для подготовки к клиническим исследованиям, в которых Г11БЦД вводят непосредственно в спинномозговую жидкость в течение более длительных периодов времени и с более частым введением, авторы настоящего изобретения разработали способы снижения уровня пропиленгликоля, который является предполагаемым ототоксином; молекул бета-циклодекстрина, не имеющих гидроксипропильных заместителей, которые, как известно, образуют осадки, и бактериального эндотоксина, который обладает высокой провоспалительной активностью, как описано в примерах 6 и 7. Хотя разработанные способы были эффективны для снижения указанных примесей, авторы настоящего изобретения обнаружили, что абсорбционная хроматография на оксиде алюминия, используемая отдельно или в комбинации с осаждением растворителем, также изменяла характеристический спектр состава, по существу уменьшая количество молекул бета-циклодекстрина, содержащих единственный гидроксипропильный заместитель (DS-1), и уменьшая количество молекул бета-циклодекстрина, содержащих две гидроксипропильные группы (DS-2) (см. пример 7; табл. 20). Снижение содержания молекул с низкой степенью замещения (DS-0, как и предполагалось, и DS-1 и DS-2, непреднамеренно) увеличивало среднюю степень замещения (DS_a) смеси.

Как подробно описано ниже в примере 8 и обобщено на фиг. 35-38, эксперименты по определению профиля экспрессии генов с применением Kleptose® HPB и пробы Kleptose® HPB, дополнительно очищенной с использованием адсорбции на алюминии, показали, что активность смеси гидроксипропилбета-циклодекстринов в отношении клеток, гомозиготных по мутации NPC1, представляет собой совокупность активностей, отдельно проявляемых соединениями, имеющими различную степень гидроксипропильного замещения. Несмотря на изменение в характеристическом спектре композиции по сравнению с Kleptose® HPB, неожиданно не наблюдалось изменений в экспрессии генов, которые, как известно, вовлечены в метаболизм и транспорт холестерина. Это открытие позволит вводить новую, более высокоочищенную и определенную по составу композицию ГПБЦД посредством интратекального или интрацереброваскулярного пути в СМЖ пациентов с болезнью НПС в течение более длительных периодов времени с обеспечением терапевтического эффекта и повышенной безопасности.

6.2. Фармацевтические композиции.

В настоящем описании предложена фармацевтическая композиция, содержащая в качестве фармацевтически активного ингредиента смесь молекул бета-циклодекстрина, замещенных в одном или более гидроксильных положениях гидроксипропильными группами, необязательно включающую незамещенные молекулы бета-циклодекстрина.

6.2.1. Фармацевтически активный ингредиент.

Фармацевтически активный ингредиент представляет собой смесь молекул бета-циклодекстринов, замещенных в одном или более гидроксильных положениях гидроксипропильными группами, необязательно включающую незамещенные молекулы бета-циклодекстрина. Термин фармацевтически активный ингредиент использован в настоящем описании в качестве синонима термина активный фармацевтический ингредиент.

6.2.1.1. Средняя степень замещения.

В контексте настоящего описания замещенный в одном или более гидроксильных положениях гидроксипропильными группами относится к замещению водорода одной или более гидроксильных групп молекулы бета-циклодекстрина гидроксипропильной группой или олигомером гидроксипропила. Например, замещенный в одном или более гидроксильных положениях гидроксипропильными группами может относиться к введению одного или более заместителей -CH₂CH(CH₃)O- в одну или более связей O-H в молекуле бета-циклодекстрина, приводящему к образованию одной или более эфирных связей.

Число гидроксипропильных групп на ангидроглюкозный остаток в смеси бета-циклодекстринов представляет собой молярное замещение, или МЗ, и определено в соответствии со способами, приведенными в статье Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс (USP NF 2015) (статья Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс), включенной в настоящее описание посредством ссылки во всей ее

- 10 033892 полноте. В контексте настоящего описания термин среднее молярное замещение, или МЗ_ср, использован в качестве синонима для термина МЗ, поскольку этот термин использован в статье Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс, и термин остаток глюкозы использован в качестве синонима для термина ангидроглюкозный остаток, поскольку этот термин использован в статье Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс.

В контексте настоящего описания степень замещения, или DS, относится к общему числу гидроксипропильных групп, являющихся непосредственными или опосредованными заместителями в молекуле бета-циклодекстрина. Например, молекула бета-циклодекстрина, содержащая остатки глюкозы, каждый из которых замещен одной гидроксипропильной группой, имеет DS = 7. В другом примере молекула бета-циклодекстрина, в которой только один из семи остатков глюкозы замещен гидроксипропильной группой, и сама эта гидроксипропильная группа замещена другой гидроксипропильной группой (например, бета-циклодекстрин с единственным HP, который содержит две гидроксипропильные группы), имеет DS = 2.

В контексте настоящего описания среднее число гидроксипропильных групп на бетациклодекстрин, также известное как средняя степень замещения, средняя DS или DS_a, относится к общему числу гидроксипропильных групп в совокупности бета-циклодекстринов, деленному на число молекул бета-циклодекстринов. В качестве иллюстративного примера, смесь равных частей бетациклодекстринов, содержащих остатки глюкозы, каждый из которых замещен одной гидроксипропильной группой, и бета-циклодекстринов, содержащих остатки глюкозы, каждый из которых замещен двумя гидроксипропильными группами, имеет DS_a = 10,5 (среднее равных частей бета-циклодекстринов с DS = 7 и DS = 14). В другом иллюстративном примере смесь 33,3% бета-циклодекстринов, в которых только один из семи остатков глюкозы замещен гидроксипропильной группой (т.е. DS =1) и 66,7% бетациклодекстринов, содержащих остатки глюкозы, каждый из которых замещен одной гидроксипропильной группой (т.е. DS = 7), имеет DS_a = 5,0.

DS_a определяется умножением МЗ на 7. В контексте настоящего описания DS_a использована в качестве синонима для термина степень замещения, поскольку этот термин определен в статье Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс.

OR³

где R¹, R² и R³ независимо для каждого случая представляют собой -H или -HP, где HP содержит одну или более гидроксипропильных групп.

В некоторых вариантах реализации HP содержит одну гидроксипропильную группу. В некоторых вариантах реализации HP, по существу, состоит из одной гидроксипропильной группы. В некоторых вариантах реализации HP состоит из одной гидроксипропильной группы.

В некоторых вариантах реализации среднее количество HP на бета-циклодекстрин составляет от примерно 3 до примерно 7, например от примерно 3 до примерно 6, от примерно 3 до примерно 5, от примерно 3 до примерно 4, от примерно 4 до примерно 7, от примерно 4 до примерно 6, от примерно 4 до примерно 5, от примерно 5 до примерно 7, от примерно 5 до примерно 6 или от примерно 6 до примерно 7.

В некоторых вариантах реализации общее количество случаев, когда R³ = HP, больше, чем общее количество случаев, когда R¹ = HP или R² = HP. В некоторых вариантах реализации общее количество случаев, когда R³ = HP, больше, чем общее количество случаев, когда одновременно R¹ = HP и R² = HP.

В некоторых вариантах реализации в по меньшей мере примерно 5%, например по меньшей мере примерно 10, по меньшей мере примерно 15, по меньшей мере примерно 20, по меньшей мере примерно 25, по меньшей мере примерно 30, по меньшей мере примерно 35, по меньшей мере примерно 40 или по меньшей мере примерно 45% из всего количества случаев R¹ и R² одновременно представляют собой HP.

В некоторых вариантах реализации не более чем примерно в 95%, например не более чем примерно в 90, не более чем примерно в 85, не более чем примерно в 80, не более чем примерно в 75, не более чем примерно в 70, не более чем примерно в 65, не более чем примерно в 60, не более чем примерно в 55 или не более чем примерно в 50% из всего количества случаев R¹ и R² одновременно представляют собой HP.

В некоторых вариантах реализации процентное содержание R¹ и R², которые одновременно представляют собой HP, составляет от примерно 5 до примерно 95%; например от примерно 10 до примерно 95%, от примерно 15 до примерно 95%, от примерно 20 до примерно 95%, от примерно 25 до примерно

95%, от примерно 30 до примерно 95%, от примерно 35 до примерно 95%, от примерно 40 до примерно

95%, от примерно 45 до примерно 95%, от примерно 50 до примерно 95%, от примерно 55 до примерно

95%, от примерно 60 до примерно 95%, от примерно 65 до примерно 95%, от примерно 70 до примерно

95%, от примерно 75 до примерно 95%, от примерно 80 до примерно 95%, от примерно 85 до примерно

95%, от примерно 90 до примерно 95%; например от примерно 5 до примерно 90%, от примерно 10 до примерно 90%, от примерно 15 до примерно 90%, от примерно 20 до примерно 90%, от примерно 25 до примерно 90%, от примерно 30 до примерно 90%, от примерно 35 до примерно 90%, от примерно 40 до примерно 90%, от примерно 45 до примерно 90%, от примерно 50 до примерно 90%, от примерно 55 до примерно 90%, от примерно 60 до примерно 90%, от примерно 65 до примерно 90%, от примерно 70 до примерно 90%, от примерно 75 до примерно 90%, от примерно 80 до примерно 90%, от примерно 85 до примерно 90%; например от примерно 5 до примерно 85%, от примерно 10 до примерно 85%, от примерно 15 до примерно 85%, от примерно 20 до примерно 85%, от примерно 25 до примерно 85%, от примерно 30 до примерно 85%, от примерно 35 до примерно 85%, от примерно 40 до примерно 85%, от примерно 45 до примерно 85%, от примерно 50 до примерно 85%, от примерно 55 до примерно 85%, от примерно 60 до примерно 85%, от примерно 65 до примерно 85%, от примерно 70 до примерно 85%, от примерно 75 до примерно 85%, от примерно 80 до примерно 85%; например от примерно 5 до примерно 80%, от примерно 10 до примерно 80%, от примерно 15 до примерно 80%, от примерно 20 до примерно 80%, от примерно 25 до примерно 80%, от примерно 30 до примерно 80%, от примерно 35 до примерно 80%, от примерно 40 до примерно 80%, от примерно 45 до примерно 80%, от примерно 50 до примерно 80%, от примерно 55 до примерно 80%, от примерно 60 до примерно 80%, от примерно 65 до примерно 80%, от примерно 70 до примерно 80%, от примерно 75 до примерно 80%; например от примерно 5 до примерно 75%, от примерно 10 до примерно 75%, от примерно 15 до примерно 75%, от примерно 20 до примерно

75%, от примерно 25 до примерно 75%, от примерно 30 до примерно 75%, от примерно 35 до примерно

75%, от примерно 40 до примерно 75%, от примерно 45 до примерно 75%, от примерно 50 до примерно

75%, от примерно 55 до примерно 75%, от примерно 60 до примерно 75%, от примерно 65 до примерно

75%, от примерно 70 до примерно 75%; например от примерно 5 до примерно 70%, от примерно 10 до примерно 70%, от примерно 15 до примерно 70%, от примерно 20 до примерно 70%, от примерно 25 до примерно 70%, от примерно 30 до примерно 70%, от примерно 35 до примерно 70%, от примерно 40 до примерно 70%, от примерно 45 до примерно 70%, от примерно 50 до примерно 70%, от примерно 55 до примерно 70%, от примерно 60 до примерно 70%, от примерно 65 до примерно 70%; например от примерно 5 до примерно 65%, от примерно 10 до примерно 65%, от примерно 15 до примерно 65%, от примерно 20 до примерно 65%, от примерно 25 до примерно 65%, от примерно 30 до примерно 65%, от примерно 35 до примерно 65%, от примерно 40 до примерно 65%, от примерно 45 до примерно 65%, от примерно 50 до примерно 65%, от примерно 55 до примерно 65%, от примерно 60 до примерно 65%; например от примерно 5 до примерно 60%, от примерно 10 до примерно 60%, от примерно 15 до примерно 60%, от примерно 20 до примерно 60%, от примерно 25 до примерно 60%, от примерно 30 до примерно 60%, от примерно 35 до примерно 60%, от примерно 40 до примерно 60%, от примерно 45 до примерно 60%, от примерно 50 до примерно 60%, от примерно 55 до примерно 60%; например от примерно 5 до примерно 55%, от примерно 10 до примерно 55%, от примерно 15 до примерно 55%, от примерно 20 до примерно 55%, от примерно 25 до примерно 55%, от примерно 30 до примерно 55%, от примерно 35 до примерно 55%, от примерно 40 до примерно 55%, от примерно 45 до примерно 55%, от примерно 50 до примерно 55%; например от примерно 5 до примерно 50%, от примерно 10 до примерно 50%, от примерно 15 до примерно 50%, от примерно 20 до примерно 50%, от примерно 25 до примерно 50%, от примерно 30 до примерно 50%, от примерно 35 до примерно 50%, от примерно 40 до примерно 50%, от примерно 45 до примерно 50%; например от примерно 5 до примерно 45%, от примерно 10 до примерно 45%, от примерно 15 до примерно 45%, от примерно 20 до примерно 45%, от примерно 25 до примерно 45%, от примерно 30 до примерно 45%, от примерно 35 до примерно 45%, от примерно 40 до примерно 45%; например от примерно 5 до примерно 40%, от примерно 10 до примерно 40%, от примерно 15 до примерно 40%, от примерно 20 до примерно 40%, от примерно 25 до примерно 40%, от примерно 30 до примерно 40%, от примерно 35 до примерно 40%; например от примерно 5 до примерно 35%, от примерно 10 до примерно 35%, от примерно 15 до примерно 35%, от примерно 20 до примерно 35%, от примерно 25 до примерно 35%, от примерно 30 до примерно 35%; например от примерно 5 до примерно 30%, от примерно 10 до примерно 30%, от примерно 15 до примерно 30%, от примерно 20 до примерно 30%, от примерно 25 до примерно 30%; например от примерно 5 до примерно 25%, от примерно 10 до примерно 25%, от примерно 15 до примерно 25%, от примерно 20 до примерно 25%; например от примерно 5 до примерно 20%, от примерно 10 до примерно 20%, от примерно 15 до примерно 20%; например от примерно 5 до примерно 15%, от примерно 10 до примерно 15% или от примерно 5 до примерно 10%.

В некоторых вариантах реализации в по меньшей мере примерно 5%, например по меньшей мере примерно 10, по меньшей мере примерно 15, по меньшей мере примерно 20, по меньшей мере примерно 25, по меньшей мере примерно 30, по меньшей мере примерно 35, по меньшей мере примерно 40, по меньшей мере примерно 45 или по меньшей мере примерно 50% случаев R³ представляет собой HP.

В некоторых вариантах реализации не более чем примерно в 95%, например не более чем примерно в 90, не более чем примерно в 85, не более чем примерно в 80, не более чем примерно в 75, не более чем примерно в 70, не более чем примерно в 65, не более чем примерно в 60 или не более чем примерно в 55% случаев R³ представляет собой HP.

В некоторых вариантах реализации процент случаев, когда R³ представляет собой HP, составляет от

- 12 033892 примерно 20 до примерно 90%, например от примерно 25 до примерно 90%, от примерно 30 до примерно 90%, от примерно 35 до примерно 90%, от примерно 40 до примерно 90%, от примерно 45 до примерно

90%, от примерно 50 до примерно 90%, от примерно 55 до примерно 90%, от примерно 60 до примерно

90%, от примерно 65 до примерно 90%, от примерно 70 до примерно 90%, от примерно 75 до примерно

90%, от примерно 80 до примерно 90%, от примерно 85 до примерно 90%, от примерно 20 до примерно

85%, от примерно 25 до примерно 85%, от примерно 30 до примерно 85%, от примерно 35 до примерно

85%, от примерно 40 до примерно 85%, от примерно 45 до примерно 85%, от примерно 50 до примерно

85%, от примерно 55 до примерно 85%, от примерно 60 до примерно 85%, от примерно 65 до примерно

85%, от примерно 70 до примерно 85%, от примерно 75 до примерно 85%, от примерно 80 до примерно

85%, от примерно 20 до примерно 80%, от примерно 25 до примерно 80%, от примерно 30 до примерно

80%, от примерно 35 до примерно 80%, от примерно 40 до примерно 80%, от примерно 45 до примерно

80%, от примерно 50 до примерно 80%, от примерно 55 до примерно 80%, от примерно 60 до примерно

80%, от примерно 65 до примерно 80%, от примерно 70 до примерно 80%, от примерно 75 до примерно

80%, от примерно 20 до примерно 75%, от примерно 25 до примерно 75%, от примерно 30 до примерно

75%, от примерно 35 до примерно 75%, от примерно 40 до примерно 75%, от примерно 45 до примерно

75%, от примерно 50 до примерно 75%, от примерно 55 до примерно 75%, от примерно 60 до примерно

75%, от примерно 65 до примерно 75%, от примерно 70 до примерно 75%, от примерно 20 до примерно

70%, от примерно 25 до примерно 70%, от примерно 30 до примерно 70%, от примерно 35 до примерно

70%, от примерно 40 до примерно 70%, от примерно 45 до примерно 70%, от примерно 50 до примерно

70%, от примерно 55 до примерно 70%, от примерно 60 до примерно 70%, от примерно 65 до примерно

70%, от примерно 20 до примерно 65%, от примерно 25 до примерно 65%, от примерно 30 до примерно

65%, от примерно 35 до примерно 65%, от примерно 40 до примерно 65%, от примерно 45 до примерно

65%, от примерно 50 до примерно 65%, от примерно 55 до примерно 65%, от примерно 60 до примерно

65%, от примерно 20 до примерно 60%, от примерно 25 до примерно 60%, от примерно 30 до примерно

60%, от примерно 35 до примерно 60%, от примерно 40 до примерно 60%, от примерно 45 до примерно

60%, от примерно 50 до примерно 60%, от примерно 55 до примерно 60%, от примерно 20 до примерно

55%, от примерно 25 до примерно 55%, от примерно 30 до примерно 55%, от примерно 35 до примерно

55%, от примерно 40 до примерно 55%, от примерно 45 до примерно 55%, от примерно 50 до примерно

55%, от примерно 20 до примерно 50%, от примерно 25 до примерно 50%, от примерно 30 до примерно

50%, от примерно 35 до примерно 50%, от примерно 40 до примерно 50%, от примерно 45 до примерно

50%, от примерно 20 до примерно 45%, от примерно 25 до примерно 45%, от примерно 30 до примерно

45%, от примерно 35 до примерно 45%, от примерно 40 до примерно 45%, от примерно 5 до примерно

40%, от примерно 10 до примерно 40%, от примерно 15 до примерно 40%, от примерно 20 до примерно

40%, от примерно 25 до примерно 40%, от примерно 30 до примерно 40%, от примерно 35 до примерно

40%, от примерно 20 до примерно 35%, от примерно 25 до примерно 35%, от примерно 30 до примерно

35%, от примерно 20 до примерно 30%, от примерно 25 до примерно 30% или от примерно 20 до примерно 25%.

В некоторых вариантах реализации по меньшей мере примерно 70%, например по меньшей мере примерно 75, по меньшей мере примерно 80, по меньшей мере примерно 85, по меньшей мере примерно 90 или по меньшей мере примерно 95% бета-циклодекстринов в совокупности имеют среднее количество HP на бета-циклодекстрин, составляющее от примерно 4 до примерно 7, например от примерно 4 до примерно 6, от примерно 4 до примерно 5, от примерно 5 до примерно 7, от примерно 5 до примерно 6 или от примерно 6 до примерно 7.

В некоторых вариантах реализации процентное содержание бета-циклодекстринов, которые в совокупности имеют среднее количество HP на бета-циклодекстрин, составляющее от примерно 4 до примерно 7, например от примерно 4 до примерно 6, от примерно 4 до примерно 5, от примерно 5 до примерно 7, от примерно 5 до примерно 6 или от примерно 6 до примерно 7, составляет от примерно 50 до примерно 99%; например от примерно 55 до примерно 99%, от примерно 60 до примерно 99%, от примерно 65 до примерно 99%, от примерно 70 до примерно 99%, от примерно 75 до примерно 99%, от примерно 80 до примерно 99%, от примерно 85 до примерно 99%, от примерно 90% до примерно 99%, от примерно 95% до примерно 99%; например от примерно 50 до примерно 97%, например от примерно 55 до примерно 97%, от примерно 60 до примерно 97%, от примерно 65 до примерно 97%, от примерно 70 до примерно 97%, от примерно 75 до примерно 97%, от примерно 80 до примерно 97%, от примерно 85 до примерно 97%, от примерно 90% до примерно 97%, от примерно 95% до примерно 97%; как то от примерно 50 до примерно 95%, от примерно 55 до примерно 95%, от примерно 60 до примерно 95%, от примерно 65 до примерно 95%, от примерно 70 до примерно 95%, от примерно 75 до примерно 95%, от примерно 80 до примерно 95%, от примерно 85 до примерно 95%, от примерно 90% до примерно 95%; например от примерно 50 до примерно 90%, от примерно 55 до примерно 90%, от примерно 60 до примерно 90%, от примерно 65 до примерно 90%, от примерно 70 до примерно 90%, от примерно 75 до примерно 90%, от примерно 80 до примерно 90%, от примерно 85 до примерно 90%; например от примерно 50 до примерно 85%, от примерно 55 до примерно 85%, от примерно 60 до примерно 85%, от примерно 65 до примерно 85%, от примерно 70 до примерно 85%, от примерно 75 до примерно 85%, от примерно

- 13 033892 до примерно 85%; например от примерно 50 до примерно 80%, от примерно 55 до примерно 80%, от примерно 60 до примерно 80%, от примерно 65 до примерно 80%, от примерно 70 до примерно 80%, от примерно 75 до примерно 80%; например от примерно 50 до примерно 75%, от примерно 55 до примерно 75%, от примерно 60 до примерно 75%, от примерно 65 до примерно 75%, от примерно 70 до примерно 75%; например от примерно 50 до примерно 70%, от примерно 55 до примерно 70%, от примерно 60 до примерно 70%, от примерно 65 до примерно 70%; например от примерно 50 до примерно 65%, от примерно 55 до примерно 65%, от примерно 60 до примерно 65%; например от примерно 50 до примерно 60%, от примерно 55 до примерно 60% или, например, от примерно 50 до примерно 55%.

В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции согласно настоящему описанию содержат в качестве фармацевтически активного ингредиента смесь незамещенных молекул бетациклодекстрина и молекул бета-циклодекстрина, замещенных в одном или более гидроксильных положениях гидроксипропильными группами, где смесь имеет среднее число гидроксипропильных групп на молекулу бета-циклодекстрина (DS_a), составляющее от примерно 3 до примерно 7.

В некоторых вариантах реализации DS_a составляет от примерно 3 до примерно 5, например от примерно 3 до примерно 4. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 3,3 ± 0,3, 3,5 ± 0,3 или 3,7 ± 0,3. В других вариантах реализации DS_a составляет 3,2 ± 0,2, 3,3 ± 0,2, 3,4 ± 0,2, 3,5 ± 0,2, 3,6 ± 0,2, 3,7 ± 0,2 или 3,8 ± 0,2. В других вариантах реализации DS_a составляет 3,1 ± 0,1, 3,2 ± 0,1, 3,3 ± 0,1, 3,4 ± 0,1, 3,5 ± 0,1, 3,6 ± 0,1, 3,7 ± 0,1, 3,8 ± 0,1 или 3,9 ± 0,1.

В некоторых вариантах реализации DS_a составляет от примерно 3,5 до примерно 5,5, например от примерно 3,5 до примерно 4,5. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 3,8 ± 0,3, 4,0 ± 0,3 или

4,2 ± 0,3. В других вариантах реализации DS_a составляет 3,7 ± 0,2, 3,8 ± 0,2, 3,9 ± 0,2, 4,0 ± 0,2, 4,1 ± 0,2,

4.2 ± 0,2 или 4,3 ± 0,2. В других вариантах реализации DS_a составляет 3,6 ± 0,1, 3,7 ± 0,1, 3,8 ± 0,1, 3,9 ± 0,1, 4,0 ± 0,1, 4,1 ± 0,1, 4,2 ± 0,1, 4,3 ± 0,1 или 4,4 ± 0,1.

В некоторых вариантах реализации DSa составляет от примерно 4 до примерно 6, например от примерно 4 до примерно 5. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 4,3 ± 0,3, 4,5 ± 0,3 или 4,7 ± 0,3. В других вариантах реализации DS_a составляет 4,2 ± 0,2, 4,3 ± 0,2, 4,4 ± 0,2, 4,5 ± 0,2, 4,6 ± 0,2, 4,7 ± 0,2 или 4,8 ± 0,2. В других вариантах реализации DS_a составляет 4,1 ± 0,1, 4,2 ± 0,1, 4,3 ± 0,1, 4,4 ± 0,1, 4,5 ± 0,1, 4,6 ± 0,1, 4,7 ± 0,1, 4,8 ± 0,1 или 4,9 ± 0,1.

В некоторых вариантах реализации DSa составляет от примерно 4,5 до примерно 6,5, например от примерно 4,5 до примерно 5,5. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 4,8 ± 0,3, 5,0 ± 0,3 или

5.2 ± 0,3. В других вариантах реализации DS_a составляет 4,7 ± 0,2, 4,8 ± 0,2, 4,9 ± 0,2, 5,0 ± 0,2, 5,1 ± 0,2,

5.2 ± 0,2 или 5,3 ± 0,2. В других вариантах реализации DS_a составляет 4,6 ± 0,1, 4,7 ± 0,1, 4,8 ± 0,1, 4,9 ± 0,1, 5,0 ± 0,1, 5,1 ± 0,1, 5,2 ± 0,1, 5,3 ± 0,1 или 5,4 ± 0,1.

В некоторых вариантах реализации DS_a составляет от примерно 5 до примерно 7, например от примерно 5 до примерно 6. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 5,3 ± 0,3, 5,5 ± 0,3 или 5,7 ± 0,3. В других вариантах реализации DS_a составляет 5,2 ± 0,2, 5,3 ± 0,2, 5,4 ± 0,2, 5,5 ± 0,2, 5,6 ± 0,2, 5,7 ± 0,2 или 5,8 ± 0,2. В других вариантах реализации DS_a составляет 5,1 ± 0,1, 5,2 ± 0,1, 5,3 ± 0,1, 5,4 ± 0,1, 5,5 ± 0,1, 5,6 ± 0,1, 5,7 ± 0,1, 5,8 ± 0,1 или 5,9 ± 0,1.

В некоторых вариантах реализации DS_a составляет от примерно 5,5 до примерно 6,5. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 5,8 ± 0,3, 6,0 ± 0,3 или 6,2 ± 0,3. В других вариантах реализации DS_a составляет 5,7 ± 0,2, 5,8 ± 0,2, 5,9 ± 0,2, 6,0 ± 0,2, 6,1 ± 0,2, 6,2 ± 0,2 или 6,3 ± 0,2. В других вариантах реализации DS_a составляет 5,6 ± 0,1, 5,7 ± 0,1, 5,8 ± 0,1, 5,9 ± 0,1, 6,0 ± 0,1, 6,1 ± 0,1, 6,2 ± 0,1, 6,3 ± 0,1 или 6,4 ± 0,1.

В некоторых вариантах реализации DS_a составляет от примерно 6 до примерно 7. В некоторых вариантах реализации DS_a составляет 6,3 ± 0,3, 6,5 ± 0,3 или 6,7 ± 0,3. В других вариантах реализации DS_aсоставляет 6,2 ± 0,2, 6,3 ± 0,2, 6,4 ± 0,2, 6,5 ± 0,2, 6,6 ± 0,2, 6,7 ± 0,2 или 6,8 ± 0,2. В других вариантах реализации DS_a составляет 6,1 ± 0,1, 6,2 ± 0,1, 6,3 ± 0,1, 6,4 ± 0,1, 6,5 ± 0,1, 6,6 ± 0,1, 6,7 ± 0,1, 6,8 ± 0,1 или 6,9 ± 0,1.

В некоторых вариантах реализации DS_a составляет примерно 4,1 ± 15%, примерно 4,2 ± 15%, примерно 4,3 ± 15%, примерно 4,4 ± 15% или примерно 4,5 ± 15%, например примерно 4,1 ± 10%, примерно

4.2 ± 10%, примерно 4,3 ± 10%, примерно 4,4 ± 10% или примерно 4,5 ± 10%, например примерно 4,1 ± 5%, примерно 4,2 ± 5%, примерно 4,3 ± 5%, примерно 4,4 ± 5% или примерно 4,5 ± 5%. Например, в некоторых вариантах реализации DS_a составляет примерно 4,31 ± 10%, примерно 4,32 ± 10%, примерно 4,33 ± 10%, примерно 4,34 ± 10%, примерно 4,35 ± 10%, примерно 4,36 ± 10% или примерно 4,37 ± 10%, например примерно 4,31 ± 5%, примерно 4,32 ± 5%, примерно 4,33 ± 5%, примерно 4,34 ± 5%, примерно 4,35 ± 5%, примерно 4,36 ± 5% или примерно 4,37 ± 5%. В конкретных вариантах реализации DS_a составляет примерно 4,34 ± 10%, например примерно 4,34 ± 5%.

В некоторых вариантах реализации DS_a составляет примерно 4,3 ± 15%, примерно 4,4 ± 15%, примерно 4,5 ± 15%, примерно 4,6 ± 15% или примерно 4,7 ± 15%, например примерно 4,3 ± 10%, примерно

- 14 033892

4.4 ± 10%, примерно 4,5 ± 10%, примерно 4,6 ± 10% или примерно 4,7 ± 10%, например примерно 4,3 ± 5%, примерно 4,4 ± 5%, примерно 4,5 ± 5%, примерно 4,6 ± 5% или примерно 4,7 ± 5%. Например, в некоторых вариантах реализации DS_a составляет примерно 4,47 ± 10%, примерно 4,48 ± 10%, примерно 4,49 ± 10%, примерно 4,50 ± 10%, примерно 4,51 ± 10%, примерно 4,52 ± 10% или примерно 4,53 ± 10%, например примерно 4,47 ± 5%, примерно 4,48 ± 5%, примерно 4,49 ± 5%, примерно 4,50 ± 5%, примерно

4.51 ± 5%, примерно 4,52 ± 5% или примерно 4,53 ± 5%. В конкретных вариантах реализации DS_a составляет примерно 4,50 ± 10%, например примерно 4,50 ± 5%.

В некоторых вариантах реализации DS_a составляет примерно 6,1 ± 15%, примерно 6,2 ± 15%, примерно 6,3 ± 15%, примерно 6,4 ± 15% или примерно 6,5 ± 15%, например примерно 6,1 ± 10%, примерно

6,2 ± 10%, примерно 6,3 ± 10%, примерно 6,4 ± 10% или примерно 6,5 ± 10%, например примерно 6,1 ± 5%, примерно 6,2 ± 5%, примерно 6,3 ± 5%, примерно 6,4 ± 5% или примерно 6,5 ± 5%. Например, в некоторых вариантах реализации DS_a составляет примерно 6,34 ± 10%, примерно 6,35 ± 10%, примерно 6,36 ± 10%, примерно 6,37 ± 10%, примерно 6,38 ± 10%, примерно 6,39 ± 10% или примерно 6,40 ± 10%, например примерно 6,34 ± 5%, примерно 6,35 ± 5%, примерно 6,36 ± 5%, примерно 6,37 ± 5%, примерно 6,38 ± 5%, примерно 6,39 ± 5% или примерно 6,40 ± 5%. В конкретных вариантах реализации DS_a составляет примерно 6,37 ± 10%, например примерно 6,37 ± 5%.

В некоторых вариантах реализации DS_a составляет примерно 6,3 ± 15%, примерно 6,4 ± 15%, примерно 6,5 ± 15%, примерно 6,6 ± 15% или примерно 6,7 ± 15%, например примерно 6,3 ± 10%, примерно

6.4 ± 10%, примерно 6,5 ± 10%, примерно 6,6 ± 10% или примерно 6,7 ± 10%, например примерно 6,3 ± 5%, примерно 6,4 ± 5%, примерно 6,5 ± 5%, примерно 6,6 ± 5% или примерно 6,7 ± 5%. Например, в некоторых вариантах реализации DS_a составляет примерно 6,50 ± 10%, примерно 6,51 ± 10%, примерно

6.52 ± 10%, примерно 6,53 ± 10%, примерно 6,54 ± 10%, примерно 6,55 ± 10% или примерно 6,56 ± 10%, например примерно 6,50 ± 5%, примерно 6,51 ± 5%, примерно 6,52 ± 5%, примерно 6,53 ± 5%, примерно 6,54 ± 5%, примерно 6,55 ± 5% или примерно 6,56 ± 5%. В конкретных вариантах реализации DS_a составляет примерно 6,53 ± 10%, например примерно 6,53 ± 5%.

Распределение степени замещения внутри смеси незамещенных молекул бета-циклодекстрина и молекул бета-циклодекстрина, замещенных в одном или более гидроксильных положениях гидроксипропильными группами, может варьировать. Например, смесь равных частей бета-циклодекстринов, содержащих остатки глюкозы, каждый из которых замещен одной гидроксипропильной группой, и бетациклодекстринов, содержащих остатки глюкозы, каждый из которых замещен двумя гидроксипропильными группами, имеет DS_a = 10,5 (среднее равных частей бета-циклодекстринов с DS = 7 и DS = 14). Несмотря на то, что DS_a = 10,5, в этом примере в смеси нет бета-циклодекстринов, имеющих DS = 10 или DS = 11. В других случаях большинство бета-циклодекстринов в смеси бета-циклодекстринов имеют DS, близкую к DS_a.

В некоторых вариантах реализации согласно настоящему описанию по меньшей мере примерно 50%, например по меньшей мере примерно 55, примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, примерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 95 или примерно 97% бета-циклодекстринов в смеси имеют DS в диапазоне DS_a ± Xa, где σ представляет собой стандартное отклонение и X равен 1, 2 или 3. Например, в некоторых вариантах реализации по меньшей мере примерно 50%, например по меньшей мере примерно 55, примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, примерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 95 или примерно 97% бета-циклодекстринов в смеси имеют DS в диапазоне DSa ± 1σ. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 70% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 1σ. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 90% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 1σ. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 95% бетациклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 1σ.

В некоторых вариантах реализации по меньшей мере примерно 50%, например по меньшей мере примерно 55, примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, примерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 95 или примерно 97% бета-циклодекстринов в смеси имеют DS в диапазоне DS_a ± 2σ. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 70% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 2σ. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 90% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 2σ. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 95% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 2σ.

В некоторых вариантах реализации по меньшей мере примерно 50%, например по меньшей мере примерно 55, примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, примерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 95 или примерно 97% бета-циклодекстринов в смеси имеют DS в диапазоне DSa ± 3σ. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 70% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 3σ. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 90% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 3σ. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 95% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 3σ.

- 15 033892

В некоторых вариантах реализации по меньшей мере примерно 50%, например по меньшей мере примерно 55%, примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95% или примерно 97% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a± 1. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 70% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 1. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 90% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ±1. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 95% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 1.

В некоторых вариантах реализации по меньшей мере примерно 50%, например по меньшей мере примерно 55, примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, примерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 95 или примерно 97% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 0,8. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 70% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DSa ± 0,8. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 90% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 0,8. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 95% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DSa ± 0,8.

В некоторых вариантах реализации по меньшей мере примерно 50%, например по меньшей мере примерно 55, примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, примерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 95 или примерно 97% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 0,6. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 70% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DSa ± 0,6. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 90% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 0,6. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 95% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DSa ± 0,6.

В некоторых вариантах реализации по меньшей мере примерно 50%, например по меньшей мере примерно 55, примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, примерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 95 или примерно 97% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ±0,5. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 70% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DSa ± 0,5. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 90% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 0,5. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 95% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DSa ± 0,5.

В некоторых вариантах реализации по меньшей мере примерно 50%, например по меньшей мере примерно 55, примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, примерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 95 или примерно 97% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 0,4. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 70% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 0,4. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 90% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 0,4. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 95% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DSa ± 0,4.

В некоторых вариантах реализации по меньшей мере примерно 50%, например по меньшей мере примерно 55, примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, примерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 95 или примерно 97% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 0,3. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 70% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 0,3. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 90% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 0,3. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 95% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DSa ± 0,3.

В некоторых вариантах реализации по меньшей мере примерно 50%, например по меньшей мере примерно 55, примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, примерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 95 или примерно 97% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 0,2. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 70% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 0,2. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 90% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 0,2. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 95% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DSa ± 0,2.

В некоторых вариантах реализации по меньшей мере примерно 50%, например по меньшей мере примерно 55, примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, примерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 95 или примерно 97% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 0,1. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 70% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 0,1. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 90% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 0,1. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 95% бета-циклодекстринов имеют DS в диапазоне DS_a ± 0,1.

В некоторых вариантах реализации МЗ варьирует от 0,40 до 0,80, например от 0,41 до 0,79, от 0,42 до 0,78, от 0,43 до 0,77, от 0,44 до 0,76, от 0,45 до 0,75, от 0,46 до 0,74, от 0,47 до 0,73, от 0,48 до 0,72, от 0,49 до 0,71, от 0,50 до 0,70, от 0,51 до 0,69, от 0,52 до 0,68, от 0,53 до 0,67, от 0,54 до 0,66, от 0,55 до 0,65, от 0,56 до 0,64, от 0,57 до 0,63, от 0,58 до 0,62 или 0,59 до 0,61.

- 16 033892

В некоторых вариантах реализации МЗ составляет примерно 0,40, примерно 0,41, примерно 0,42, примерно 0,43, примерно 0,44, примерно 0,45, примерно 0,46, примерно 0,47, примерно 0,48, примерно 0,49, примерно 0,50, примерно 0,51, примерно 0,52, примерно 0,53, примерно 0,54, примерно 0,55, примерно 0,56, примерно 0,57, примерно 0,58, примерно 0,59, примерно 0,60, примерно 0,61, примерно 0,62, примерно 0,63, примерно 0,64, примерно 0,65, примерно 0,66, примерно 0,67, примерно 0,68, примерно 0,69, примерно 0,70, примерно 0,71, примерно 0,72, примерно 0,73, примерно 0,74, примерно 0,75, примерно 0,76, примерно 0,77, примерно 0,78, примерно 0,79 или примерно 0,80.

В некоторых вариантах реализации МЗ составляет примерно 0,571-0,686 (DS_a от примерно 4,0 до примерно 4,8). В некоторых из этих вариантов реализации МЗ находится в диапазоне от примерно 0,58 до примерно 0,68. В предпочтительных в настоящее время вариантах реализации МЗ находится в диапазоне 0,58-0,68.

В различных вариантах реализации МЗ составляет по меньшей мере примерно 0,55. В некоторых вариантах реализации МЗ составляет по меньшей мере примерно 0,56, 0,57, 0,58, 0,59 или 0,60. В некоторых вариантах реализации МЗ составляет не более примерно 0,70. В конкретных вариантах реализации МЗ составляет не более примерно 0,69, 0,68, 0,67, 0,66 или 0,65.

Г идроксипропильные группы могут быть связаны с бета-циклодекстринами в форме мономеров или сами могут быть последовательно связаны с одной или более дополнительными гидроксипропильными группами с образованием олигомеров гидроксипропила, которые затем присоединяются к бетациклодекстринам. В некоторых вариантах реализации гидроксипропильные группы в гидроксильных положениях бета-циклодекстринов замещены гидроксипропильными цепями, имеющими структуру -[CH₂CH(CH₃)O]_nH, где n > 1 и среднее число гидроксипропильных цепей на бета-циклодекстрин составляет от примерно 3 до примерно 7, например от примерно 3 до примерно 6, от примерно 3 до примерно 5, от примерно 3 до примерно 4, от примерно 4 до примерно 7, от примерно 4 до примерно 6, от примерно 4 до примерно 5, от примерно 5 до примерно 7, от примерно 5 до примерно 6 или от примерно 6 до примерно 7. В некоторых вариантах реализации n равно 1, 2, 3 или 4.

В одном иллюстративном примере гидроксипропильная цепь, имеющая структуру -CH₂CH(CH₃)OH, содержит одну гидроксипропильную группу в гидроксипропильной цепи (т.е. n = 1). В другом иллюстративном примере гидроксипропильная цепь, имеющая структуру -[CH₂CH(CH₃)O]₃H, содержит три гидроксипропильные группы в гидроксипропильной цепи (т.е. n = 3).

В некоторых вариантах реализации среднее число гидроксипропильных цепей на бетациклодекстрин составляет 3,3 ± 0,3, 3,4 ± 0,3, 3,6 ± 0,3 или 3,8 ± 0,3. В других вариантах реализации среднее число гидроксипропильных цепей на бета-циклодекстрин составляет 4,0 ± 0,3, 4,2 ± 0,3, 4,4 ± 0,3, 4,6 ± 0,3 или 4,8 ± 0,3. В других вариантах реализации среднее число гидроксипропильных цепей на бетациклодекстрин составляет 5,0 ± 0,3, 5,2 ± 0,3, 5,4 ± 0,3, 5,6 ± 0,3 или 5,8 ± 0,3. А в других вариантах реализации среднее число гидроксипропильных цепей на бета-циклодекстрин составляет 6,0 ± 0,3, 6,2 ± 0,3,

6,4 ± 0,3, 6,6 ± 0,3 или 6,7 ± 0,3.

В некоторых вариантах реализации среднее число гидроксипропильных цепей на бетациклодекстрин составляет 3,2 ± 0,2, 3,3 ± 0,2, 3,4 ± 0,2, 3,5 ± 0,2, 3,6 ± 0,2, 3,7 ± 0,2 или 3,8 ± 0,2. В других вариантах реализации среднее число гидроксипропильных цепей на бета-циклодекстрин составляет 4,0 ± 0,2, 4,1 ± 0,2, 4,2 ± 0,2, 4,3 ± 0,2, 4,4 ± 0,2, 4,5 ± 0,2, 4,6 ± 0,2, 4,7 ± 0,2 или 4,8 ± 0,2. В других вариантах реализации среднее число гидроксипропильных цепей на бета-циклодекстрин составляет 5,0 ± 0,2, 5,1 ± 0,2, 5,2 ± 0,2, 5,3 ± 0,2, 5,4 ± 0,2, 5,5 ± 0,2, 5,6 ± 0,2, 5,7 ± 0,2 или 5,8 ± 0,2. А в других вариантах реализации среднее число гидроксипропильных цепей на бета-циклодекстрин составляет 6,0 ± 0,2, 6,1 ± 0,2, 6,2 ± 0,2, 6,3 ± 0,2, 6,4 ± 0,2, 6,5 ± 0,2, 6,6 ± 0,2, 6,7 ± 0,2 или 6,8 ± 0,2.

В некоторых вариантах реализации среднее число гидроксипропильных цепей на бетациклодекстрин составляет 3,1 ± 0,1, 3,2 ± 0,1, 3,3 ± 0,1, 3,4 ± 0,1, 3,5 ± 0,1, 3,6 ± 0,1, 3,7 ± 0,1, 3,8 ±0,1 или 3,9 ± 0,1. В других вариантах реализации среднее число гидроксипропильных цепей на бетациклодекстрин составляет 4,0 ± 0,1, 4,1 ± 0,1, 4,2 ± 0,1, 4,3 ± 0,1, 4,4 ± 0,1, 4,5 ± 0,1, 4,6 ±0,1, 4,7 ±0,1, 4,8 ±0,1 или 4,9 ± 0,1. В других вариантах реализации среднее число гидроксипропильных цепей на бетациклодекстрин составляет 5,0 ± 0,1, 5,1 ± 0,1, 5,2 ± 0,1, 5,3 ± 0,1, 5,4 ± 0,1, 5,5 ± 0,1, 5,6 ± 0,1, 5,7 ± 0,1, 5,8 ± 0,1 или 5,9 ± 0,1. А в других вариантах реализации среднее число гидроксипропильных цепей на бетациклодекстрин составляет 6,0 ± 0,1, 6,1 ± 0,1, 6,2 ± 0,1, 6,3 ± 0,1, 6,4 ± 0,1, 6,5 ± 0,1, 6,6 ± 0,1, 6,7 ± 0,1, 6,8 ± 0,1 или 6,9 ± 0,1.

В некоторых вариантах реализации по меньшей мере примерно 50%, например примерно 55, примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, примерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 95 или примерно 97% гидроксипропильных цепей имеют n = 1. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 70% гидроксипропильных цепей имеют n = 1. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 90% гидроксипропильных цепей имеют n = 1.

В некоторых вариантах реализации процентное содержание гидроксипропильных цепей, имеющих n = 1, составляет от примерно 50 до примерно 99%, например от примерно 55 до примерно 99%, от при

- 17 033892 мерно 60 до примерно 99%, от примерно 65 до примерно 99%, от примерно 70 до примерно 99%, от примерно 75 до примерно 99%, от примерно 80 до примерно 99%, от примерно 85 до примерно 99%, от примерно 90% до примерно 99%, от примерно 95% до примерно 99%; например от примерно 50 до примерно 97%, например от примерно 55 до примерно 97%, от примерно 60 до примерно 97%, от примерно 65 до примерно 97%, от примерно 70 до примерно 97%, от примерно 75 до примерно 97%, от примерно 80 до примерно 97%, от примерно 85 до примерно 97%, от примерно 90% до примерно 97%, от примерно 95% до примерно 97%; например от примерно 50 до примерно 95%, от примерно 55 до примерно 95%, от примерно 60 до примерно 95%, от примерно 65 до примерно 95%, от примерно 70 до примерно 95%, от примерно 75 до примерно 95%, от примерно 80 до примерно 95%, от примерно 85 до примерно 95%, от примерно 90% до примерно 95%; например от примерно 50 до примерно 90%, от примерно 55 до примерно 90%, от примерно 60 до примерно 90%, от примерно 65 до примерно 90%, от примерно 70 до примерно 90%, от примерно 75 до примерно 90%, от примерно 80 до примерно 90%, от примерно 85 до примерно 90%; например от примерно 50 до примерно 85%, от примерно 55 до примерно 85%, от примерно 60 до примерно 85%, от примерно 65 до примерно 85%, от примерно 70 до примерно 85%, от примерно 75 до примерно 85%, от примерно 80 до примерно 85%; например от примерно 50 до примерно 80%, от примерно 55 до примерно 80%, от примерно 60 до примерно 80%, от примерно 65 до примерно 80%, от примерно 70 до примерно 80%, от примерно 75 до примерно 80%; например от примерно 50 до примерно 75%, от примерно 55 до примерно 75%, от примерно 60 до примерно 75%, от примерно 65 до примерно 75%, от примерно 70 до примерно 75%; например от примерно 50 до примерно 70%, от примерно 55 до примерно 70%, от примерно 60 до примерно 70%, от примерно 65 до примерно 70%; например от примерно 50 до примерно 65%, от примерно 55 до примерно 65%, от примерно 60 до примерно 65%; например от примерно 50 до примерно 60%, от примерно 55 до примерно 60% или, например, от примерно 50 до примерно 55%.

В некоторых вариантах реализации менее примерно 50%, например примерно 45, примерно 40, примерно 35, примерно 30, примерно 25, примерно 20, примерно 15, примерно 10, примерно 5 или примерно 3% гидроксипропильных цепей имеют n = 2. В некоторых вариантах реализации менее 30% гидроксипропильных цепей имеют n = 2. В некоторых вариантах реализации менее 10% гидроксипропильных цепей имеют n = 2.

В некоторых вариантах реализации процентное содержание гидроксипропильных цепей, имеющих n = 2, составляет от примерно 5 до примерно 50%, например от примерно 10 до примерно 50%, от примерно 15 до примерно 50%, от примерно 20 до примерно 50%, от примерно 25 до примерно 50%, от примерно 30 до примерно 50%, от примерно 35 до примерно 50%, от примерно 40 до примерно 50%, от примерно 45% до примерно 50%; например от примерно 5 до примерно 45%, от примерно 10 до примерно 45%, от примерно 15 до примерно 45%, от примерно 20 до примерно 45%, от примерно 25 до примерно 45%, от примерно 30 до примерно 45%, от примерно 35 до примерно 45%, от примерно 40 до примерно 45%; например от примерно 5 до примерно 40%, от примерно 10 до примерно 40%, от примерно 15 до примерно 40%, от примерно 20 до примерно 40%, от примерно 25 до примерно 40%, от примерно 30 до примерно 40%, от примерно 35 до примерно 40%; например от примерно 5 до примерно 35%, от примерно 10 до примерно 35%, от примерно 15 до примерно 35%, от примерно 20 до примерно 35%, от примерно 25 до примерно 35%, от примерно 30 до примерно 35%; например от примерно 5 до примерно 30%, от примерно 10 до примерно 30%, от примерно 15 до примерно 30%, от примерно 20 до примерно 30%, от примерно 25 до примерно 30%; например от примерно 5 до примерно 25%, от примерно 10 до примерно 25%, от примерно 15 до примерно 25%, от примерно 20 до примерно 25%; например от примерно 5 до примерно 20%, от примерно 10 до примерно 20%, от примерно 15 до примерно 20%; например от примерно 5 до примерно 15%, от примерно 10 до примерно 15% или от примерно 5 до примерно 10%.

В некоторых вариантах реализации менее примерно 50%, например примерно 45, примерно 40, примерно 35, примерно 30, примерно 25, примерно 20, примерно 15, примерно 10, примерно 5 или примерно 3% гидроксипропильных цепей имеют n > 2. В некоторых вариантах реализации менее 10% гидроксипропильных цепей имеют n > 2.

В некоторых вариантах реализации процентное содержание гидроксипропильных цепей, имеющих n > 2, составляет от примерно 5 до примерно 50%, например от примерно 10 до примерно 50%, от примерно 15 до примерно 50%, от примерно 20 до примерно 50%, от примерно 25 до примерно 50%, от примерно 30 до примерно 50%, от примерно 35 до примерно 50%, от примерно 40 до примерно 50%, от примерно 45 до примерно 50%; например от примерно 5 до примерно 45%, от примерно 10 до примерно 45%, от примерно 15 до примерно 45%, от примерно 20 до примерно 45%, от примерно 25 до примерно 45%, от примерно 30 до примерно 45%, от примерно 35 до примерно 45%, от примерно 40 до примерно 45%; например от примерно 5 до примерно 40%, от примерно 10 до примерно 40%, от примерно 15 до примерно 40%, от примерно 20 до примерно 40%, от примерно 25 до примерно 40%, от примерно 30 до примерно 40%, от примерно 35 до примерно 40%; например от примерно 5 до примерно 35%, от примерно 10 до примерно 35%, от примерно 15 до примерно 35%, от примерно 20 до примерно 35%, от примерно 25 до примерно 35%, от примерно 30 до примерно 35%; например от примерно 5 до примерно 30%, от примерно 10 до примерно 30%, от примерно 15 до примерно 30%, от примерно 20 до примерно 30%, от

- 18 033892 примерно 25 до примерно 30%; например от примерно 5 до примерно 25%, от примерно 10 до примерно 25%, от примерно 15 до примерно 25%, от примерно 20 до примерно 25%; например от примерно 5 до примерно 20%, от примерно 10 до примерно 20%, от примерно 15 до примерно 20%; например от примерно 5 до примерно 15%, от примерно 10 до примерно 15% или, например, от примерно 5 до примерно 10%.

В некоторых вариантах реализации среднее число гидроксипропильных цепей на бетациклодекстрин составляет от примерно 4 до примерно 6. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере примерно 60%, например по меньшей мере примерно 65%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95% или по меньшей мере примерно 97% бета-циклодекстринов в совокупности имеют среднее число гидроксипропильных цепей на бетациклодекстрин от примерно 4 до примерно 6. В некоторых вариантах реализации процентное содержание бета-циклодекстринов, которые в совокупности имеют среднее число гидроксипропильных цепей на бета-циклодекстрин от примерно 4 до примерно 6, составляет от примерно 60 до примерно 97%, например от примерно 65 до примерно 97%, от примерно 70 до примерно 97%, от примерно 75 до примерно 97%, от примерно 80 до примерно 97%, от примерно 85 до примерно 97%, от примерно 90% до примерно 97%; например от примерно 60 до примерно 95%, от примерно 65 до примерно 95%, от примерно 70 до примерно 95%, от примерно 75 до примерно 95%, от примерно 80 до примерно 95%, от примерно 85 до примерно 95%, от примерно 90% до примерно 95%; например от примерно 60 до примерно 90%, от примерно 65 до примерно 90%, от примерно 70 до примерно 90%, от примерно 75 до примерно 90%, от примерно 80 до примерно 90%, от примерно 85 до примерно 90%; например от примерно 60 до примерно 85%, от примерно 65 до примерно 85%, от примерно 70 до примерно 85%, от примерно 75 до примерно 85%, от примерно 80 до примерно 85%; например от примерно 60 до примерно 80%, от примерно 65 до примерно 80%, от примерно 70 до примерно 80%, от примерно 75 до примерно 80%; например от примерно 60 до примерно 75%, от примерно 65 до примерно 75%, от примерно 70 до примерно 75%; например от примерно 60 до примерно 70%, от примерно 65 до примерно 70% или, например, от примерно 60 до примерно 65%.

6.2.1.2. Характеристические спектры замещения 6.2.1.2.1. DS-0.

В типичных вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент содержит менее примерно 2%, например менее примерно 1,5, менее примерно 1,4, менее примерно 1,3, менее примерно1,2, менее примерно 1,1, менее примерно 1,0, менее примерно 0,9, менее примерно 0,8, менее примерно0,7, менее примерно 0,6, менее примерно 0,5, менее примерно 0,4, менее примерно 0,3, менее примерно0,2, менее примерно 0,1, менее примерно 0,09, менее примерно 0,08, менее примерно 0,07, менее примерно

0,06 или менее примерно 0,05% незамещенного бета-циклодекстрина (DS-0; НЦД), как установлено по высоте пика на спектре, полученном методом МС с ионизацией электрораспылением.

В типичных вариантах реализации не более (НБ) 1% смеси бета-циклодекстринов не замещено гидроксипропильной группой (НЦД), как установлено по высоте пика на спектре, полученном методом МС с ионизацией электрораспылением.

В некоторых вариантах реализации содержание незамещенных бета-циклодекстринов в фармацевтически активном ингредиенте составляет от примерно 0,05 до примерно 2%, например от примерно 0,05 до примерно 1,5%, от примерно 0,05 до примерно 1,4%, от примерно 0,05 до примерно 1,3%, от примерно 0,05 до примерно 1,2%, от примерно 0,05 до примерно 1,1%, от примерно 0,05 до примерно 1,0%, от примерно 0,05 до примерно 0,8%, от примерно 0,05 до примерно 0,6%, от примерно 0,05 до примерно 0,5%, от примерно 0,05 до примерно 0,4%, от примерно 0,05 до примерно 0,3%, от примерно 0,05 до примерно 0,2%, от примерно 0,05 до примерно 0,1%, от примерно 0,05 до примерно 0,07%, от примерно 0,07 до примерно 1,5%, от примерно 0,07 до примерно 1,4%, от примерно 0,07 до примерно 1,3%, от примерно 0,07 до примерно 1,2%, от примерно 0,07 до примерно 1,1%, от примерно 0,07 до примерно 1,0%, от примерно 0,07 до примерно 0,8%, от примерно 0,07 до примерно 0,6%, от примерно 0,07 до примерно 0,5%, от примерно 0,07 до примерно 0,4%, от примерно 0,07 до примерно 0,3%, от примерно 0,07 до примерно 0,2%, от примерно 0,07 до примерно 0,1%, от примерно 0,1 до примерно 1,5%, от примерно 0,1 до примерно 1,4%, от примерно 0,1 до примерно 1,3%, от примерно 0,1 до примерно 1,2%, от примерно 0,1 до примерно 1,1%, от примерно 0,1 до примерно 1,0%, от примерно 0,1 до примерно 0,8%, от примерно 0,1 до примерно 0,6%, от примерно 0,1 до примерно 0,5%, от примерно 0,1 до примерно 0,4%, от примерно 0,1 до примерно 0,3%, от примерно 0,1 до примерно 0,2%, от примерно 0,2 до примерно 1,5%, от примерно 0,2 до примерно 1,4%, от примерно 0,2 до примерно 1,3%, от примерно 0,2 до примерно 1,2%, от примерно 0,2 до примерно 1,1%, от примерно 0,2 до примерно 1,0%, от примерно 0,2 до примерно 0,8%, от примерно 0,2 до примерно 0,6%, от примерно 0,2 до примерно 0,5%, от примерно 0,2 до примерно 0,4%, от примерно 0,2 до примерно 0,3%, от примерно 0,3 до примерно 1,5%, от примерно 0,3 до примерно 1,4%, от примерно 0,3 до примерно 1,3%, от примерно 0,3 до примерно 1,2%, от примерно 0,3 до примерно 1,1%, от примерно 0,3 до примерно 1,0%, от примерно 0,3 до примерно 0,8%, от примерно 0,3 до примерно 0,6%, от примерно 0,3 до примерно 0,5%, от примерно 0,3 до примерно 0,4%, от примерно 0,4 до примерно 1,5%, от примерно 0,4 до примерно 1,4%, от примерно 0,4 до при

- 19 033892 мерно 1,3%, от примерно 0,4 до примерно 1,2%, от примерно 0,4 до примерно 1,1%, от примерно 0,4 до примерно 1,0%, от примерно 0,4 до примерно 0,8%, от примерно 0,4 до примерно 0,6%, от примерно 0,4 до примерно 0,5%, от примерно 0,5 до примерно 1,5%, от примерно 0,5 до примерно 1,4%, от примерно 0,5 до примерно 1,3%, от примерно 0,5 до примерно 1,2%, от примерно 0,5 до примерно 1,1%, от примерно 0,5 до примерно 1,0%, от примерно 0,5 до примерно 0,8%, от примерно 0,5 до примерно 0,6%, от примерно 0,6 до примерно 1,5%, от примерно 0,6 до примерно 1,4%, от примерно 0,6 до примерно 1,3%, от примерно 0,6 до примерно 1,2%, от примерно 0,6 до примерно 1,1%, от примерно 0,6 до примерно 1,0%, от примерно 0,6 до примерно 0,8%, от примерно 0,8 до примерно 1,5%, от примерно 0,8 до примерно 1,4%, от примерно 0,8 до примерно 1,3%, от примерно 0,8 до примерно 1,2%, от примерно 0,8 до примерно 1,1%, от примерно 0,8 до примерно 1,0%, от примерно 1,0 до примерно 1,5%, от примерно 1,0 до примерно 1,4%, от примерно 1,0 до примерно 1,3%, от примерно 1,0 до примерно 1,2%, от примерно 1,0 до примерно 1,1%, от примерно 1,1 до примерно 1,5%, от примерно 1,1 до примерно 1,4%, от примерно 1,1 до примерно 1,3%, от примерно 1,1 до примерно 1,2%, от примерно 1,2 до примерно 1,5%, от примерно 1,2 до примерно 1,4%, от примерно 1,2 до примерно 1,3%, от примерно 1,3 до примерно 1,5%, от примерно 1,3 до примерно 1,4% или от примерно 1,4% до примерно 1,5%.

В различных вариантах реализации композиция содержит не более примерно 0,01, не более примерно 0,02, не более примерно 0,03, не более примерно 0,04 или не более примерно 0,05% НЦД в смеси бета-циклодекстринов.

6.2.1.2.2. DS-1.

В типичных вариантах реализации менее 4% смеси бета-циклодекстринов представляет собой бетациклодекстрин, замещенный только одной гидроксипропильной группой (DS-1), как установлено по высоте пика на спектре, полученном методом МС с ионизацией электрораспылением.

В различных вариантах реализации менее 3,9, менее 3,8, менее 3,7, менее 3,6 или менее 3,5% смеси бета-циклодекстринов представляет собой DS-1. В некоторых вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент содержит менее 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1 или 3,0% DS-1. В конкретных вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент содержит менее 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1 или 2,0% DS-1. В некоторых вариантах реализации смесь молекул бета-циклодекстрина содержит менее 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,1 или 1,0% DS-1. В предпочтительных в настоящее время вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент содержит менее 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 или 0,1% DS-1, даже менее примерно 0,09, 0,08, 0,07, 0,06, 0,05, 0,04, 0,03% DS-1. В некоторых предпочтительных вариантах реализации композиция содержит менее 0,03%, даже настолько малое количество, как 0,02% DS-1.

В предпочтительных в настоящее время вариантах реализации композиция содержит менее примерно 0,05% НЦД и менее примерно 0,03% DS-1.

6.2.1.2.3. DS-2.

В различных вариантах реализации смесь бета-циклодекстринов имеет низкое процентное содержание бета-циклодекстрина, замещенного двумя гидроксипропильными группами (DS-2), определенное по высоте пика на спектре, полученном методом МС с ионизацией электрораспылением.

В различных вариантах реализации менее 3,9, менее 3,8, менее 3,7, менее 3,6 или менее 3,5% смеси бета-циклодекстринов представляет собой DS-2. В некоторых вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент содержит менее 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1 или 3,0% DS-2. В конкретных вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент содержит менее 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1 или 2,0% DS-2. В некоторых вариантах реализации смесь молекул бета-циклодекстринов содержит менее 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,1 или 1,0% DS-2. В предпочтительных в настоящее время вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент содержит менее 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 или 0,1% DS-2, даже менее примерно 0,09, 0,08, 0,07, 0,06, 0,05, 0,04, 0,03% DS-2. В некоторых предпочтительных вариантах реализации композиция содержит менее 0,03%, даже настолько малое количество, как 0,02% DS-2.

6.2.1.2.4. DS-3.

В типичных вариантах реализации смесь содержит по меньшей мере 10% молекул бетациклодекстринов, имеющих три гидроксипропильных заместителя (DS-3) в процентном содержании в общей смеси, как установлено по высоте пика на спектре, полученном методом МС с ионизацией электрораспылением. В различных вариантах реализации по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24 или по меньшей мере 25% смеси бета-циклодекстринов представляет собой DS-3.

В различных вариантах реализации смесь содержит не более 30%, например не более 29, не более 28, не более 27, не более 26, не более 25, не более 24, не более 23, не более 22, не более 21, не более 20, не более 19, не более 18, не более 17, не более 16 или не более 15% DS-3 в процентном содержании в общей смеси.

В некоторых вариантах реализации процентное содержание DS-3 в общей смеси варьирует от 10 до

- 20 033892

30%, например от 11 до 29%, от 12 до 28%, от 13 до 27%, от 14 до 26%, от 15 до 25%, от 16 до 24%, от 17 до 23%, от 18 до 22% или от 19 до 21%.

В различных вариантах реализации смесь содержит примерно 15, примерно 16, примерно 17, примерно 18, примерно 19, примерно 20, примерно 21, примерно 22, примерно 23, примерно 24 или примерно 25% DS-3.

6.2.1.2.5. DS-4.

В типичных вариантах реализации смесь содержит по меньшей мере 20% молекул бетациклодекстринов, имеющих четыре гидроксипропильных заместителя (DS-4), в процентном содержании в общей смеси, как установлено по высоте пика на спектре, полученном методом МС с ионизацией электрораспылением. В различных вариантах реализации по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 31, по меньшей мере

32, по меньшей мере 33, по меньшей мере 34 или по меньшей мере 35% смеси бета-циклодекстринов представляют собой DS-4.

В различных вариантах реализации смесь содержит не более 40%, например не более 39, не более 38, не более 37, не более 36, не более 35, не более 34, не более 33, не более 32, не более 31, не более 30, не более 29, не более 28, не более 27, не более 26 или не более 25% DS-4 в процентном содержании в общей смеси.

В некоторых вариантах реализации процентное содержание DS-4 в общей смеси варьирует от 20 до 40%, например от 21 до 39%, от 22 до 38%, от 23 до 37%, от 24 до 36%, от 25 до 35%, от 26 до 34%, от 27 до 33%, от 28 до 32% или от 29 до 31%.

В различных вариантах реализации смесь содержит примерно 25, примерно 26, примерно 27, примерно 28, примерно 29, примерно 30, примерно 31, примерно 32, примерно 33, примерно 34 или примерно 35% DS-4.

6.2.1.2.6. DS-5.

В типичных вариантах реализации смесь содержит по меньшей мере 15% молекул бетациклодекстринов, имеющих пять гидроксипропильных заместителей (DS-5) в процентном содержании в общей смеси, как установлено по высоте пика на спектре, полученном методом МС с ионизацией электрораспылением. В различных вариантах реализации по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29 или по меньшей мере 30% смеси бета-циклодекстринов представляет собой DS-5.

В различных вариантах реализации смесь содержит не более 35%, например не более 34, не более

33, не более 32, не более 31, не более 30, не более 29, не более 28, не более 27, не более 26, не более 25, не более 24, не более 23, не более 22, не более 21 или не более 20% DS-5 в процентном содержании в общей смеси.

В некоторых вариантах реализации процентное содержание DS-5 в общей смеси варьирует от 15 до 35%, например от 16 до 34%, от 17 до 33%, от 18 до 32%, от 19 до 31%, от 20 до 30%, от 21 до 29%, от 22 до 28%, от 23 до 27% или от 24 до 26%.

В различных вариантах реализации смесь содержит примерно 20, примерно 21, примерно 22, примерно 23, примерно 24, примерно 25, примерно 26, примерно 27, примерно 28, примерно 29 или примерно 30% DS-5.

6.2.1.2.7. DS-6.

В типичных вариантах реализации смесь содержит по меньшей мере 5% молекул бетациклодекстринов, имеющих шесть гидроксипропильных заместителей (DS-6), в процентном содержании в общей смеси, как установлено по высоте пика на спектре, полученном методом МС с ионизацией электрораспылением. В различных вариантах реализации по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20% смеси бета-циклодекстринов представляет собой DS-6.

В различных вариантах реализации смесь содержит не более 25%, например не более 24, не более 23, не более 22, не более 21, не более 20, не более 19, не более 18, не более 17, не более 16, не более 15, не более 14, не более 13, не более 12, не более 11 или не более 10% DS-6 в процентном содержании в общей смеси.

В некоторых вариантах реализации процентное содержание DS-6 в общей смеси варьирует от 5 до 25%, например от 6 до 24%, от 7 до 23%, от 8 до 22%, от 9 до 21%, от 10 до 20%, от 11 до 19%, от 12 до 18%, от 13 до 17% или от 14 до 16%.

В различных вариантах реализации смесь содержит примерно 7, примерно 8, примерно 9, примерно 10, примерно 11, примерно 12, примерно 13, примерно 14, примерно 15, примерно 16 или примерно 17% DS-6.

- 21 033892

6.2.1.2.8. DS-7.

В типичных вариантах реализации менее 10% смеси бета-циклодекстринов представляет собой бета-циклодекстрин, замещенный семью гидроксипропильными группами (DS-7), в процентном содержании в общей смеси, как установлено по высоте пика на спектре, полученном методом МС с ионизацией электрораспылением. В различных вариантах реализации менее 9, менее 8, менее 7, менее 6, менее 5, менее 4, менее 3, менее 2 или менее 1% смеси бета-циклодекстринов представляет собой DS-7.

В некоторых вариантах реализации процентное содержание DS-7 в общей смеси варьирует от 1 до 10%, например от 2 до 9%, от 3 до 8%, от 4 до 7% или от 5 до 6%.

В различных вариантах реализации смесь содержит примерно 10, примерно 9, примерно 8, примерно 7, примерно 6, примерно 5, примерно 4, примерно 3, примерно 2 или примерно 1% DS-7.

6.2.1.2.9. DS-8.

В типичных вариантах реализации смесь бета-циклодекстринов содержит менее 2% бетациклодекстрина, замещенного восемью гидроксипропильными группами (DS-8), в процентном содержании в общей смеси, как установлено по высоте пика на спектре, полученном методом МС с ионизацией электрораспылением. В различных вариантах реализации менее 1,5, менее 1,4, менее 1,3, менее 1,2, менее 1,1, менее 1, менее 0,9, менее 0,8, менее 0,7, менее 0,6, менее 0,5, менее 0,4, менее 0,3, менее 0,2, менее 0,1, менее 0,09, менее 0,08, менее 0,07, менее 0,06, менее 0,05, менее 0,04, менее 0,03, менее 0,02 или менее 0,01% бета-циклодекстринов представляет собой DS-8.

В некоторых вариантах реализации процентное содержание DS-8 в общей смеси варьирует от 0,01 до 2%, например от 0,02 до 1,9%, от 0,03 до 1,8%, от 0,04 до 1,7%, от 0,05 до 1,6%, от 0,06 до 1,5%, от 0,07 до 1,4%, от 0,08 до 1,3%, от 0,09 до 1,2%, от 0,1 до 1,1%, от 0,2 до 1%, от 0,3 до 0,9%, от 0,4 до 0,8% или от 0,5 до 0,7%.

В различных вариантах реализации смесь содержит примерно 1,5, примерно 1,4, примерно 1,3, примерно 1,2, примерно 1,1, примерно 1, примерно 0,9, примерно 0,8, примерно 0,7, примерно 0,6, примерно 0,5, примерно 0,4, примерно 0,3, примерно 0,2, примерно 0,1, примерно 0,09, примерно 0,08, примерно 0,07, примерно 0,06, примерно 0,05, примерно 0,04, примерно 0,03, примерно 0,02 или примерно 0,01% DS-8.

6.2.1.2.10. DS-9.

В типичных вариантах реализации не более 1% смеси бета-циклодекстринов представляет собой бета-циклодекстрин, замещенный девятью гидроксипропильными группами (DS-9), в процентном содержании в общей смеси, как установлено по высоте пика на спектре, полученном методом МС с ионизацией электрораспылением. В различных вариантах реализации не более 0,9, не более 0,8, не более 0,7, не более 0,6, не более 0,5, не более 0,4, не более 0,3, не более 0,2, не более 0,1, не более 0,09, не более 0,08, не более 0,07, не более 0,06, не более 0,05, не более 0,04, не более 0,03, не более 0,02 или не более 0,01% бета-циклодекстрина представляет собой DS-9.

6.2.1.2.11. DS-10.

В типичных вариантах реализации не более 1% смеси бета- представляет собой бетациклодекстрин, замещенный десятью гидроксипропильными группами (DS-10), в процентном содержании в общей смеси, как установлено по высоте пика на спектре, полученном методом МС с ионизацией электрораспылением. В различных вариантах реализации не более 0,9, не более 0,8, не более 0,7, не более 0,6, не более 0,5, не более 0,4, не более 0,3, не более 0,2, не более 0,1, не более 0,09, не более 0,08, не более 0,07, не более 0,06, не более 0,05, не более 0,04, не более 0,03, не более 0,02 или не более 0,01% бета-циклодекстрина представляет собой DS-10.

6.2.1.2.12. Профиль.

В различных вариантах реализации смесь бета-циклодекстринов содержит по меньшей мере 75% DS-3, DS-4, DS-5 и DS-6 в совокупности, в процентном содержании в общей смеси. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 76, по меньшей мере 77, по меньшей мере 78, по меньшей мере 79, по меньшей мере 80, по меньшей мере 81, по меньшей мере 82, по меньшей мере 83, по меньшей мере 84, по меньшей мере 85, по меньшей мере 86, по меньшей мере 87, по меньшей мере 88, по меньшей мере 89, по меньшей мере 90, по меньшей мере 91, по меньшей мере 92, по меньшей мере 93, по меньшей мере 94, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97 или по меньшей мере 98% бетациклодекстрина в смеси представляет собой DS-3, DS-4, DS-5 и DS-6 в совокупности.

В различных вариантах реализации смесь бета-циклодекстринов содержит DS-3, DS-4, DS-5 и DS-6 в совокупности, в процентном содержании в общей смеси в диапазоне от примерно 75 до примерно 98%, например от примерно 76 до примерно 97%, от примерно 77 до примерно 96%, от примерно 78 до примерно 95%, от примерно 79 до примерно 94%, от примерно 80 до примерно 93%, от примерно 81 до примерно 92%, от примерно 82 до примерно 91%, от примерно 83 до примерно 90%, от примерно 84 до примерно 89%, от примерно 85 до примерно 88% или от примерно 86 до примерно 87%.

В типичных вариантах реализации смесь бета-циклодекстринов содержит по меньшей мере 25% DS-5 и DS-6 в совокупности, в процентном содержании в общей смеси. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 31, по меньшей мере 32, по меньшей мере 33, по меньшей мере 34, по мень

- 22 033892 шей мере 35, по меньшей мере 36, по меньшей мере 37, по меньшей мере 38, по меньшей мере 39, по меньшей мере 40, по меньшей мере 41, по меньшей мере 42, по меньшей мере 43, по меньшей мере 44, по меньшей мере 45, по меньшей мере 46, по меньшей мере 47, по меньшей мере 48, по меньшей мере 49 или по меньшей мере 50% бета-циклодекстрина в смеси представляет собой DS-5 и DS-6 в совокупности.

В различных вариантах реализации смесь бета-циклодекстринов содержит DS-5 и DS-6 в совокупности, в процентном содержании в общей смеси в диапазоне от примерно 25 до примерно 50%, например от примерно 26 до примерно 49%, от примерно 27 до примерно 48%, от примерно 28 до примерно 47%, от примерно 29 до примерно 46%, от примерно 30 до примерно 45%, от примерно 31 до примерно 44%, от примерно 32 до примерно 43%, от примерно 33 до примерно 42%, от примерно 34 до примерно 41%, от примерно 35 до примерно 40%, от примерно 36 до примерно 39% или от примерно 37 до примерно 38%.

В различных вариантах реализации бета-циклодекстриновые соединения, имеющие наибольшее процентное содержание в общей смеси, представляют собой DS-4.

6.2.1.3. Исходный материал.

В некоторых вариантах реализации в настоящем описании описана фармацевтическая композиция, где единственный фармацевтически активный ингредиент получают очисткой одного или более продукта гидроксипропил-бета-циклодекстрина, выбранного из Kleptose® HBP, Kleptose® HP, Trappsol® Cyclo и Cavasol® W7 HP Pharma.

Kleptose® HBP и Kleptose® HP представляют собой продукты гидроксипропил-бетациклодекстрина, реализуемые Roquette Pharma, Лестрем, Франция. Kleptose® HBP представляет собой композицию гидроксипропил-бета-циклодекстринов для парентерального применения с контролируемым содержанием эндотоксина с DS_a, составляющей примерно 4,3. Kleptose® HP представляет собой композицию гидроксипропил-бета-циклодекстринов с контролируемым содержанием эндотоксина с более высокой DS_a, чем у Kleptose® HBP. Trappsol® Cyclo представляет собой композицию гидроксипропил-бета-циклодекстринов для парентерального применения с DS_a, составляющей примерно 6,37, и реализуется Sphingo Biotechnology, Inc., подразделением CTD Holdings, Inc., Алачуа, Флорида, США, в форме порошка или стерильной жидкости. Cavasol® W7 HP Pharma представляет собой композицию гидроксипропил-бета-циклодекстринов для парентерального применения с DS_a от примерно 4,1 до примерно 5,1, например DS_a, составляющей примерно 4,5, реализуемую Wacker Chemie AG, Мюнхен, Германия.

В иллюстративном примере фармацевтическая композиция представляет собой фармацевтическую композицию, в которой единственный фармацевтически активный ингредиент получают очисткой Kleptose® HBP. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция представляет собой фармацевтическую композицию, в которой единственный фармацевтически активный ингредиент получают очисткой Kleptose® HBP (Roquette) с помощью гидрофильного взаимодействия, например, с помощью очистки ВЭЖХ или аффинной очистки, например аффинной хроматографии. В различных вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент получают очисткой Kleptose® HBP (Roquette) с помощью одного или более способов, описанных в примерах 6, 7 и 9 в настоящем описании.

В различных вариантах реализации очистка обеспечивает получение порции или фракции Kleptose® HBP, имеющей повышенную активность, например повышенную аффинность к неэтерифицированному холестерину.

В других вариантах реализации фармацевтическая композиция представляет собой фармацевтическую композицию, в которой единственный фармацевтически активный ингредиент получают очисткой Trappsol® Cyclo (CTD) с помощью гидрофильного взаимодействия, например, с помощью очистки ВЭЖХ или аффинной очистки, например аффинной хроматографии. В различных вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент получают очисткой Trappsol® Cyclo с помощью абсорбционной хроматографии на оксиде алюминия с помощью одного или более способов, описанных в примерах 6, 7 и 9 в настоящем описании.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция, полученная очисткой Trappsol® Cyclo (CTD), содержит смесь молекул бета-циклодекстрина, замещенных в одном или более гидроксильных положениях гидроксипропильными группами, необязательно включающую незамещенные молекулы бета-циклодекстрина, и разбавитель, который является фармацевтически приемлемым для интратекального, интрацеребровентрикулярного или внутривенного введения. Композиция содержит не более (НБ) 5 ЕЭ эндотоксинов на 1 г смеси бета-циклодекстринов, не более 0,5% пропиленгликоля, где указанное содержание измерено методом ВЭЖХ, приведенным в статье Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс, и не более 1 ppm пропиленоксида, где указанное содержание определено в соответствии со статьей Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция, полученная очисткой Trappsol® Cyclo (CTD), содержит НБ 1,5 ЕЭ эндотоксинов на 1 г смеси бета-циклодекстринов. В некоторых вариантах реализации композиция содержит не более 0,01% пропиленгликоля, где указанное содержание измерено методом ВЭЖХ, приведенным в статье Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс.

- 23 033892

В некоторых вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент, полученный очисткой Trappsol® Cyclo (CTD), содержит менее 5%, например менее 4,5, менее 4, менее 3,5, менее 3, менее 2,5, менее 2, менее 1,5, менее 1, менее 0,5 или менее 0,1% незамещенного бета-циклодекстрина (DS-0), бета-циклодекстрина, замещенного одной гидроксипропильной группой (DS-1), и бета-циклодекстрина, замещенного двумя гидроксипропильными группами (DS-2), в совокупности, как установлено по высоте пиков на спектре, полученном методом МС с ионизацией электрораспылением.

В некоторых вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент, полученный очисткой Trappsol® Cyclo (CTD), содержит по меньшей мере 50%, например по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85 или по меньшей мере 90% бета-циклодекстрина, замещенного пятью гидроксипропильными группами (DS-5), бета-циклодекстрина, замещенного шестью гидроксипропильными группами (DS6), и бета-циклодекстрина, замещенного семью гидроксипропильными группами (DS-7), в совокупности, как установлено по высоте пиков на спектре, полученном методом МС с ионизацией электрораспылением.

В некоторых вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент, полученный очисткой Trappsol® Cyclo (CTD), содержит менее 5%, например менее 4,5, менее 4, менее 3,5, менее 3, менее 2,5, менее 2, менее 1,5, менее 1, менее 0,5 или менее 0,1% бета-циклодекстрина, замещенного девятью гидроксипропильными группами (DS-9), и бета-циклодекстрина, замещенного десятью гидроксипропильными группами (DS-10), в совокупности, как установлено по высоте пиков на спектре, полученном методом МС с ионизацией электрораспылением.

В остальных других вариантах реализации фармацевтическая композиция представляет собой фармацевтическую композицию, в которой единственный фармацевтически активный ингредиент получают очисткой Cavasol® W7 с помощью гидрофильного взаимодействия, например, с помощью очистки ВЭЖХ или аффинной очистки, например аффинной хроматографии. В различных вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент получают очисткой Cavasol® W7 HP с помощью одного или более способов, описанных в примерах 6, 7 и 9 в настоящем описании.

В некоторых вариантах реализации очистка одного или более продуктов гидроксипропил-бетациклодекстрина, выбранных из Kleptose® HBP, Kleptose® HP, Trappsol® Cyclo и Cavasol® W7 HP Pharma, включает одно или более из комплексообразования, осаждения и адсорбционной хроматографии. В некоторых вариантах реализации очистка включает один способ, например адсорбционную хроматографию. В некоторых вариантах реализации очистка включает два или более способов, например осаждение в комбинации с адсорбционной хроматографией. В случае, когда очистка включает два или более способов, используемых в комбинации, способы могут быть объединены в любом порядке для очистки продукта гидроксипропил-бета-циклодекстрина. В иллюстративном примере Kleptose® HBP или Trappsol® Cyclo сначала могут быть подвергнуты адсорбционной хроматографии, затем одна или более выбранных после хроматографической стадии фракций могут быть подвергнуты осаждению растворителем из системы растворителей для осаждения для обеспечения дополнительной очистки. В альтернативном примере Kleptose® HBP сначала может быть подвергнута осаждению растворителем из системы растворителей для осаждения, затем осадки могут быть подвергнуты адсорбционной хроматографии для обеспечения дополнительной очистки.

В некоторых вариантах реализации очистка одного или более продуктов гидроксипропил-бетациклодекстрина, например Kleptose® HBP или Trappsol® Cyclo, приводит к повышению DS_a вследствие удаления незамещенных (DS = 0) и/или монозамещенных (DS = 1) бета-циклодекстринов. В иллюстративном примере коммерческий образец Kleptose® HBP, имеющий DS_a = 4,34, содержит 0,6% незамещенных бета-циклодекстринов (DS = 0) и 3,68% монозамещенных бета-циклодекстринов (DS = 1). DS_aпосле удаления соединений с DS = 0 и DS = 1 может быть вычислена с использованием следующих уравнений:

х(0) + у(1) + z(DS_a) = 4,34 х + у + z = 1 где x = фракция незамещенных бета-циклодекстринов; y = фракция монозамещенных бетациклодекстринов; z = фракция бета-циклодекстринов с DS > 2. В данном случае DS_a полученного образца после удаления бета-циклодекстринов, имеющих DS = 0 и DS = 1, составляет 4,5.

Соответственно в некоторых вариантах реализации в настоящем описании предложен способ очистки одного или более продуктов гидроксипропил-бета-циклодекстрина, выбранных из Kleptose® HBP, Kleptose® HP, Trappsol® Cyclo и Cavasol® W7 HP Pharma, в частности Kleptose® HBP или Trappsol® Cyclo, причем указанный способ очистки снижает количество пропиленгликоля или олигомеров пропиленгликоля (например, путем осаждения растворителем) и/или количество незамещенного бетациклодекстрина (DS = 0) и/или количество монозамещенного бета-циклодекстрина (DS = 1) (например, с помощью адсорбционной хроматографии) в продукте. В некоторых из таких вариантов реализации, в которых количество незамещенного бета-циклодекстрина (DS = 0) и/или количество монозамещенного бета-циклодекстрина (DS = 1) в продукте снижено, очищенный продукт имеет повышенную DS_a. Таким

- 24 033892 образом, в некоторых вариантах реализации в настоящем описании предложен способ повышения DS_aодного или более продуктов гидроксипропил-бета-циклодекстрина, выбранных из Kleptose® HBP, Kleptose® HP, Trappsol® Cyclo и Cavasol® W7 HP Pharma, в частности Kleptose® HBP или Trappsol® Cyclo, причем указанный способ включает снижение количества незамещенного бета-циклодекстрина (DS = 0) и/или монозамещенного бета-циклодекстрина (DS = 1) в продукте, например, согласно одной или более стадиям очистки, описанным в настоящем описании, таким как адсорбционная хроматография.

Хотя каждый из Kleptose® HBP, Kleptose® HP, Trappsol® Cyclo и Cavasol® W7 HP Pharma имеет указанную DS_a, согласно обсуждению выше DS_a представляет собой среднее значение, и таким образом каждый из этих продуктов гидроксипропил-бета-циклодекстрина состоит из гидроксипропил-бетациклодекстринов с различными значениями DS. В некоторых вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент, описанный в настоящем описании, получен с помощью выделения из одного или более из этих продуктов одной или более фракций гидроксипропил-бета-циклодекстрина с DS_a, описанной в настоящем описании.

6.2.2. Уровни эндотоксина.

В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции согласно настоящему описанию содержат низкий уровень бактериальных эндотоксинов. Низкий уровень бактериальных эндотоксинов позволяет вводить описанные фармацевтические композиции посредством определенных путей, например путем интратекального или интрацеребровентрикулярного введения, в течение более длительных периодов времени и в более высоких дозах, чем это может быть безопасно выполнено с применением других композиций, имеющих более высокие уровни эндотоксинов.

В контексте настоящего описания ME относится к международным единицам бактериального эндотоксина, также известным как единицы эндотоксина (ЕЭ) согласно Фармокопеи Соединенных Штатов (USP). Уровень бактериальных эндотоксинов (ME, в качестве синонима для ЕЭ) в композиции определяют с помощью реакции с лизатом амебоцитов мечехвоста в соответствии со способами, приведенными в <85> Тесте на бактериальные эндотоксины фармокопейной конвенцией Соединенных Штатов, Interim Revision Announcement, от 1 апреля 2011 г. (статья USP на эндотоксин), включенном в настоящее описание посредством ссылки во всей его полноте.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит менее примерно 10 ME, например менее примерно 6, примерно 5, примерно 4, примерно 3, примерно 2, примерно 1,5, примерно 1,2, примерно 1, примерно 0,8, примерно 0,6, примерно 0,5, примерно 0,4, примерно 0,3, примерно 0,2, примерно 0,1, примерно 0,07 или примерно 0,05 ME эндотоксина на 1 г фармацевтически активного ингредиента. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит уровень бактериального эндотоксина в диапазоне от примерно 0,05 до примерно 10 ME, например от примерно 0,05 до примерно 6 ME, от примерно 0,05 до примерно 5 ME, от примерно 0,05 до примерно 4 ME, от примерно 0,05 до примерно 3 ME, от примерно 0,05 до примерно 2 ME, от примерно 0,05 до примерно 1,5 ME, от примерно 0,05 до примерно 1,2 ME, от примерно 0,05 до примерно 1 ME, от примерно 0,05 до примерно 0,8 ME, от примерно 0,05 до примерно 0,6 ME, от примерно 0,05 до примерно 0,5 ME, от примерно 0,05 до примерно 0,4 ME, от примерно 0,05 до примерно 0,3 ME, от примерно 0,05 до примерно 0,2 ME или от примерно 0,05 до примерно 0,1 ME эндотоксина на 1 г смеси бета-циклодекстринов.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит не более (НБ) 5 ЭЕ/г смеси бета-циклодекстринов, НБ 4 ЭЕ/г смеси бета-циклодекстринов, НБ 3 ЭЕ/г смеси бетациклодекстринов или не более 2 ЭЕ/г смеси бета-циклодекстринов. В предпочтительных вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит НБ 1,5 ЭЕ/г смеси бета-циклодекстринов. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит НБ 1,4 ЭЕ/г смеси бета-циклодекстринов, НБ 1,3 ЭЕ/г смеси бета-циклодекстринов, НБ 1,2 ЭЕ/г смеси бета-циклодекстринов, НБ 1,1 ЭЕ/г смеси бета-циклодекстринов или НБ 1,0 ЭЕ/г смеси бета-циклодекстринов.

6.2.3. Технологические примеси.

Фармацевтические композиции, содержащие смеси гидроксипропил-бета-циклодекстринов, могут содержать примеси, возникающие в результате синтеза гидроксипропил-бета-циклодекстринов. Такие примеси могут содержать непрореагировавшие исходные вещества, такие как незамещенные бетациклодекстрины и пропиленоксид, и побочные продукты реакции, такие как пропиленгликоль и олигомеры пропиленгликоля. В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции, описанные в настоящем описании, демонстрируют пониженные уровни одной или более из таких примесей.

6.2.3.1. Пропиленгликоль.

В некоторых вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент содержит менее примерно 1%, например менее примерно 0,9, 0,8, 0,7, 0,6 или 0,5%, пропиленгликоля, где указанные содержания определены в соответствии со статьей Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс. В различных вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент содержит менее примерно 0,4, 0,3, 0,2 или 0,1% пропиленгликоля, где указанные содержания определены в соответствии со статьей Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит менее примерно 0,09, 0,08, 0,07% или менее примерно 0,05% пропиленгликоля, где ука

- 25 033892 занные содержания определены в соответствии со статьей Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс. В предпочтительных в настоящее время вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент содержит не более 0,5% пропиленгликоля, где указанные содержания определены в соответствии со статьей Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс.

В некоторых вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент содержит от примерно 0,05 до примерно 1% пропиленгликоля, например от примерно 0,05 до примерно 0,8%, от примерно 0,05 до примерно 0,6%, от примерно 0,05 до примерно 0,5%, от примерно 0,05 до примерно 0,4%, от примерно 0,05 до примерно 0,3%, от примерно 0,05 до примерно 0,2%, от примерно 0,05 до примерно 0,1%, от примерно 0,05 до примерно 0,07%, от примерно 0,07 до примерно 1%, от примерно 0,07 до примерно 0,8%, от примерно 0,07 до примерно 0,6%, от примерно 0,07 до примерно 0,5%, от примерно 0,07 до примерно 0,4%, от примерно 0,07 до примерно 0,3%, от примерно 0,07 до примерно 0,2%, от примерно 0,07 до примерно 0,1%, от примерно 0,1 до примерно 1%, от примерно 0,1 до примерно 0,8%, от примерно 0,1 до примерно 0,6%, от примерно 0,1% до примерно 0,5%, от примерно 0,1 до примерно 0,4%, от примерно 0,1 до примерно 0,3%, от примерно 0,1 до примерно 0,2%, от примерно 0,2 до примерно 1%, от примерно 0,2 до примерно 0,8%, от примерно 0,2 до примерно 0,6%, от примерно 0,2 до примерно 0,5%, от примерно 0,2 до примерно 0,4%, от примерно 0,2 до примерно 0,3%, от примерно 0,3 до примерно 1%, от примерно 0,3 до примерно 0,8%, от примерно 0,3 до примерно 0,6%, от примерно 0,3 до примерно 0,5%, от примерно 0,3 до примерно 0,4%, от примерно 0,4 до примерно 1%, от примерно 0,4 до примерно 0,8%, от примерно 0,4 до примерно 0,6%, от примерно 0,4 до примерно 0,5%, от примерно 0,5 до примерно 1%, от примерно 0,5 до примерно 0,8%, от примерно 0,5 до примерно 0,6%, от примерно 0,6 до примерно 1%, от примерно 0,6 до примерно 0,8% или от примерно 0,8 до примерно 1,0%, где указанные содержания определены в соответствии со статьей Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс.

В некоторых вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент содержит менее примерно 0,01% мономеров пропиленгликоля, где указанное содержание определено в соответствии со статьей Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс. В некоторых вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент содержит менее примерно 0,2% димеров пропиленгликоля, где указанное содержание определено в соответствии со статьей Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс. В некоторых вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент содержит менее примерно 0,2% тримеров пропиленгликоля, где указанное содержание определено в соответствии со статьей Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс.

6.2.3.2. Пропиленоксид.

В некоторых вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент содержит менее примерно 1 ppm, например менее примерно 0,8, менее примерно 0,6, менее примерно 0,5, менее примерно 0,4, менее примерно 0,3, менее примерно 0,2, менее примерно 0,1, менее примерно 0,07 или менее примерно 0,05 ppm пропиленоксида, где указанные содержания определены в соответствии со статьей Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс. Например, фармацевтически активный ингредиент может содержать примерно 1, примерно 0,8, примерно 0,6, примерно 0,5, примерно 0,4, примерно 0,3, примерно 0,2, примерно 0,1, примерно 0,07 или примерно 0,05 ppm пропиленоксида, где указанные содержания определены в соответствии со статьей Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс.

В некоторых вариантах реализации фармацевтически активный ингредиент содержит количества пропиленоксида в диапазоне от примерно 0,05 до примерно 1 ppm, такие как от примерно 0,05 до примерно 0,8, от примерно 0,05 до примерно 0,6, от примерно 0,05 до примерно 0,5, от примерно 0,05 до примерно 0,4, от примерно 0,05 до примерно 0,3, от примерно 0,05 до примерно 0,2, от примерно 0,05 до примерно 0,1, от примерно 0,1 до примерно 1, от примерно 0,1 до примерно 0,8, от примерно 0,1 до примерно 0,6, от примерно 0,1 до примерно 0,5, от примерно 0,1 до примерно 0,4, от примерно 0,1 до примерно 0,3, от примерно 0,1 до примерно 0,2, от примерно 0,2 до примерно 1, от примерно 0,2 до примерно 0,8, от примерно 0,2 до примерно 0,6, от примерно 0,2 до примерно 0,5, от примерно 0,2 до примерно 0,4, от примерно 0,2 до примерно 0,3, от примерно 0,3 до примерно 1, от примерно 0,3 до примерно 0,8, от примерно 0,3 до примерно 0,6, от примерно 0,3 до примерно 0,5, от примерно 0,3 до примерно 0,4, от примерно 0,4 до примерно 1, от примерно 0,4 до примерно 0,8, от примерно 0,4 до примерно 0,6, от примерно 0,4 до примерно 0,5, от примерно 0,5 до примерно 1, от примерно 0,5 до примерно 0,8, от примерно 0,5 до примерно 0,6, от примерно 0,6 до примерно 1, от примерно 0,6 до примерно 0,8 или примерно 0,8 до примерно 1 ppm, где указанные содержания определены в соответствии со статьей Фармакопеи США на гидроксипропилбетадекс.

6.2.4. Другие характеристики композиций.

В настоящем описании предложены композиции гидроксипропил-бета-циклодекстринов, содержащие фармацевтически активный ингредиент согласно настоящему описанию и, необязательно, один или более дополнительных терапевтических агентов, таких как комбинация терапевтических агентов, описанная в разделе 4.3.3.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит от примерно 100 до примерно 2000 мг, например от примерно 100 до примерно 1800, от примерно 100 до примерно 1600, от примерно 100 до примерно 1500, от примерно 100 до примерно 1200, от примерно 100 до примерно 1000,

- 26 033892 от примерно 100 до примерно 800, от примерно 100 до примерно 600, от примерно 100 до примерно 500, от примерно 100 до примерно 400, от примерно 100 до примерно 300, от примерно 100 до примерно 200, от примерно 200 до примерно 2000, от примерно 200 до примерно 1800, от примерно 200 до примерно 1600, от примерно 200 до примерно 1500, от примерно 200 до примерно 1200, от примерно 200 до примерно 1000, от примерно 200 до примерно 800, от примерно 200 до примерно 600, от примерно 200 до примерно 500, от примерно 200 до примерно 400, от примерно 200 до примерно 300, от примерно 300 до примерно 2000, от примерно 300 до примерно 1800, от примерно 300 до примерно 1600, от примерно 300 до примерно 1500, от примерно 300 до примерно 1200, от примерно 300 до примерно 1000, от примерно 300 до примерно 800, от примерно 300 до примерно 600, от примерно 300 до примерно 500, от примерно 300 до примерно 400, от примерно 400 до примерно 2000, от примерно 400 до примерно 1800, от примерно 400 до примерно 1600, от примерно 400 до примерно 1500, от примерно 400 до примерно 1200, от примерно 400 до примерно 1000, от примерно 400 до примерно 800, от примерно 400 до примерно 600, от примерно 400 до примерно 500, от примерно 500 до примерно 2000, от примерно 500 до примерно 1800, от примерно 500 до примерно 1600, от примерно 500 до примерно 1500, от примерно 500 до примерно 1200, от примерно 500 до примерно 1000, от примерно 500 до примерно 800, от примерно 500 до примерно 600, от примерно 600 до примерно 2000, от примерно 600 до примерно 1800, от примерно 600 до примерно 1600, от примерно 600 до примерно 1500, от примерно 600 до примерно 1200, от примерно 600 до примерно 1000, от примерно 600 до примерно 800, от примерно 800 до примерно 2000, от примерно 800 до примерно 1800, от примерно 800 до примерно 1600, от примерно 800 до примерно 1500, от примерно 800 до примерно 1200 или от примерно 800 до примерно 1000 мг фармацевтически активного ингредиента. Например, фармацевтическая композиция может содержать примерно 100, примерно 200, примерно 300, примерно 400, примерно 500, примерно 600, примерно 800, примерно 1000, примерно 1200, примерно 1400, примерно 1500, примерно 1600, примерно 1800 или примерно 2000 мг фармацевтически активного ингредиента.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция для введения, например фармацевтическая композиция, подходящая для интратекального введения, имеет концентрацию от примерно 10 мг/мл до примерно 200 мг/мл, такую как от примерно 10 до примерно 180, от примерно 10 до примерно 150, от примерно 10 до примерно 120, от примерно 10 до примерно 100, от примерно 10 до примерно 80, от примерно 10 до примерно 60, от примерно 10 до примерно 50, от примерно 10 до примерно 40, от примерно 10 до примерно 30, от примерно 10 до примерно 20, от примерно 20 до примерно 200, от примерно 20 до примерно 180, от примерно 20 до примерно 150, от примерно 20 до примерно 120, от примерно 20 до примерно 100, от примерно 20 до примерно 80, от примерно 20 до примерно 60, от примерно 20 до примерно 50, от примерно 20 до примерно 40, от примерно 20 до примерно 30, от примерно 30 до примерно 200, от примерно 30 до примерно 180, от примерно 30 до примерно 150, от примерно 30 до примерно 120, от примерно 30 до примерно 100, от примерно 30 до примерно 80, от примерно 30 до примерно 60, от примерно 30 до примерно 50, от примерно 30 до примерно 40, от примерно 40 до примерно 200, от примерно 40 до примерно 180, от примерно 40 до примерно 150, от примерно 40 до примерно 120, от примерно 40 до примерно 100, от примерно 40 до примерно 80, от примерно 40 до примерно 60, от примерно 40 до примерно 50, от примерно 50 до примерно 200, от примерно 50 до примерно 180, от примерно 50 до примерно 150, от примерно 50 до примерно 120, от примерно 50 до примерно 100, от примерно 50 до примерно 80, от примерно 50 до примерно 60, от примерно 60 до примерно 200, от примерно 60 до примерно 180, от примерно 60 до примерно 150, от примерно 60 до примерно 120, от примерно 60 до примерно 100, от примерно 60 до примерно 80, от примерно 80 до примерно 200, от примерно 80 до примерно 180, от примерно 80 до примерно 150, от примерно 80 до примерно 120, от примерно 80 до примерно 100, от примерно 100 до примерно 200, от примерно 100 до примерно 180, от примерно 100 до примерно 150, от примерно 100 до примерно 120, от примерно 120 до примерно 200, от примерно 120 до примерно 180, от примерно 120 до примерно 150, от примерно 150 до примерно 200, от примерно 150 до примерно 180 или примерно 180 до примерно 200 мг/мл фармацевтически активного ингредиента. Например, фармацевтическая композиция может иметь концентрацию, составляющую примерно 10, примерно 20, примерно 30, примерно 40, примерно 50, примерно 60, примерно 70, примерно 80, примерно 90, примерно 100, примерно 110, примерно 120, примерно 130, примерно 140, примерно 150, примерно 160, примерно 170, примерно 180, примерно 190 или примерно 200 мг/мл фармацевтически активного ингредиента. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция для интратекального введения имеет концентрацию, составляющую примерно 200 мг/мл фармацевтически активного ингредиента.

В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции, описанные в настоящем описании, демонстрируют низкий уровень ототоксичности в случае введения животному. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция проявляет более низкую ототоксичность, чем Trappsol® Cyclo. Ототоксичность может быть оценена in vitro посредством определения токсичности в отношении клетки кортиева органа (House Ear Institute-organ of Corti 1) (HEI-OC1) или in vivo с помощью исследования акустических стволовых вызванных потенциалов (АСВП) у животного, такого как мышь, крыса, кошка, собака, обезьяна, шимпанзе или человек; см., например, источник Leigh-Paffenroth, E. et al. Ob

- 27 033892 jective Measures of Ototoxicity, Sept. 2005, vol. 9, No. 1, p. 10-16, in Perspectives on Hearing and Hearing Disorders: Research and Diagnostics, Special Interest Division 6 of the American Speech-Language-Hearing Association, включенный в настоящее описание посредством ссылки во всей его полноте.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция, например фармацевтическая композиция, подходящая для интратекального введения, имеет осмоляльность в диапазоне от примерно 300 до примерно 450 мОсм/кг, например от примерно 300 до примерно 400, от примерно 300 до примерно 350, от примерно 350 до примерно 450 или от примерно 350 до примерно 400 мОсм/кг. В некоторых вариантах реализации композиция имеет осмоляльность, составляющую примерно 300, примерно 320, примерно 350, примерно 380, примерно 400, примерно 420 или примерно 450 мОсм/кг.

Подходящие разбавители для фармацевтических композиций согласно настоящему описанию, например фармацевтических композиций, подходящих для интратекального или интрацеребровентрикулярного введения, включают изотонический солевой раствор. Композиции, такие как фармацевтическая композиция, подходящая для интратекального введения, также могут быть разбавлены раствором Elliotts В® (электролит для интратекального применения, содержащий буферный раствор/инъекция декстрозы, поставляемый Lukare Medical, LLC, Scotch Plains, Нью-Джерси, США).

В некоторых вариантах реализации фармацевтическую композицию для инъекций получают путем растворения активного фармацевтического ингредиента (смесь молекул бета-циклодекстрина) в воде, добавления хлорида натрия до 0,9% мас./об, и при необходимости доведения рН до 6,0-8,0 с помощью 0,01н. гидроксида натрия. Затем фармацевтическую композицию подвергают стерилизующей фильтрации во флаконы и автоклавируют. Продукт стабилен и может храниться при температуре 15-25°С.

Композиции обычно поставляют в составе стерильной фармацевтической композиции, которая обычно включает фармацевтически приемлемый носитель. Эта композиция может быть в любой подходящей форме (в зависимости от желаемого способа введения). Например, фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде водного раствора и введена путем интратекальной инъекции или интратекальной инфузии.

В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции включают формы с однократными дозами, которые содержат количество фармацевтически активного ингредиента согласно настоящему описанию в расчете на дозу. Такая единичная форма может содержать, например, но без ограничения, от примерно 5 мг до примерно 5 г, например от 5 мг до примерно 4 г, от 5 мг до примерно 3 г, от 5 мг до примерно 2 г, от 5 мг до примерно 1 г, от примерно 50 мг до примерно 5 г, от примерно 50 мг до примерно 4 г, от примерно 50 мг до примерно 3 г, от примерно 50 мг до примерно 2 г, от примерно 50 мг до примерно 1 г, от примерно 200 мг до примерно 5 г, от примерно 200 мг до примерно 4 г, от примерно 200 мг до примерно 3 г, от примерно 200 мг до примерно 2 г, от примерно 200 мг до примерно 1 г, от примерно 400 мг до примерно 5 г, от примерно 400 мг до примерно 4 г, от примерно 400 мг до примерно 3 г, от примерно 400 мг до примерно 2 г, от примерно 400 мг до примерно 1 г, от примерно 500 мг до примерно 5 г, от примерно 500 мг до примерно 4 г, от примерно 500 мг до примерно 3 г, от примерно 500 мг до примерно 2 г, от примерно 500 мг до примерно 1 г, от примерно 600 мг до примерно 5 г, от примерно 600 мг до примерно 4 г, от примерно 600 мг до примерно 3 г, от примерно 600 мг до примерно 2 г, от примерно 600 мг до примерно 1 г, от примерно 800 мг до примерно 5 г, от примерно 800 мг до примерно 4 г, от примерно 800 мг до примерно 3 г, от примерно 800 мг до примерно 2 г, от примерно 800 мг до примерно 1 г, от примерно 1 г до примерно 5 г, от примерно 1 г до примерно 4 г, от примерно 1 г до примерно 3 г, от примерно 1 г до примерно 2 г, от примерно 1200 мг до примерно 5 г, от примерно 1200 мг до примерно 4 г, от примерно 1200 мг до примерно 3 г, от примерно 1200 мг до примерно 2 г, от примерно 1400 мг до примерно 5 г, от примерно 1400 мг до примерно 4 г, от примерно 1400 мг до примерно 3 г, от примерно 1400 мг до примерно 2 г, от примерно 1600 мг до примерно 5 г, от примерно 1600 мг до примерно 4 г, от примерно 1600 мг до примерно 3 г, от примерно 1600 мг до примерно 2 г, от примерно 1800 мг до примерно 5 г, от примерно 1800 мг до примерно 4 г, от примерно 1800 мг до примерно 3 г или от примерно 1800 мг до примерно 2 г фармацевтически активного ингредиента. Конкретные варианты реализации включают однократные дозы, которые содержат примерно 900 мг, примерно 1200 мг и примерно 1800 мг фармацевтически активного ингредиента.

В некоторых вариантах реализации однократные дозы могут содержать между примерно 200 и примерно 900 мг фармацевтически активного ингредиента согласно настоящему описанию, например примерно 200, примерно 250, примерно 300, примерно 350, примерно 400, примерно 450, примерно 500, примерно 550, примерно 600, примерно 650, примерно 700, примерно 750, примерно 800, примерно 850 или примерно 900 мг фармацевтически активного ингредиента.

Фармацевтические композиции смесей гидроксипропил-бета-циклодекстринов согласно настоящему описанию могут быть получены для хранения в форме лиофилизированных составов или водных растворов путем смешивания фармацевтически активного ингредиента, имеющего желаемую степень чистоты, с, необязательно, фармацевтически-приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами, обычно применяемыми в данной области техники (все из которых упомянуты в настоящем описании как носители), т.е. буферные агенты, стабилизирующие агенты, консерванты, изотонирующие добавки, неионогенные детергенты, антиоксиданты и прочие другие добавки; см. Re

- 28 033892 mington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980).

В некоторых вариантах реализации буферные агенты используют для поддержания рН в диапазоне, приближенном к физиологическим условиям, от примерно 2 до примерно 50 мМ, например от примерно 2 до примерно 40, от примерно 2 до примерно 30, от примерно 2 до примерно 20, от примерно 2 до примерно 10, от примерно 10 до примерно 50, от примерно 10 до примерно 40, от примерно 10 до примерно 30, от примерно 10 до примерно 20, от примерно 20 до примерно 50, от примерно 20 до примерно 40, от примерно 20 до примерно 30 или от примерно 40 до примерно 50 мМ. Например, один или более буферных агентов могут присутствовать в концентрации, составляющей примерно 2, примерно 5, примерно 10, примерно 15, примерно 20, примерно 25, примерно 30, примерно 35, примерно 40, примерно 45 или примерно 50 мМ. Подходящие буферные агенты для применения согласно настоящему описанию включают как органические, так и неорганические кислоты и их соли, такие как цитратные буферные растворы (например, смесь однозамещенного цитрата натрия-двузамещенного цитрата натрия, смесь лимонной кислоты-трехзамещенного цитрата натрия, смесь лимонной кислоты-однозамещенного цитрата натрия и т.д.), сукцинатные буферные растворы (например, смесь янтарной кислоты-однозамещенного сукцината натрия, смесь янтарной кислоты-гидроксида натрия, смесь янтарной кислоты-двузамещенного сукцината натрия и т.д.), буферные растворы тартрата (например, смесь винной кислоты-тартрата натрия, смесь винной кислоты-тартрата калия, смесь винной кислоты-гидроксида натрия и т.д.), буферные растворы фумарата (например, смесь фумаровой кислоты-однозамещенного фумарата натрия, смесь фумаровой кислоты-двузамещенного фумарата натрия, смесь однозамещенного фумарата натрия-двузамещенного фумарата натрия и т.д.), буферные растворы глюконата (например, смесь глюконовой кислотыглюконата натрия, смесь глюконовой кислоты-гидроксида натрия, смесь глюконовой кислоты-глюконата калия и т.д.), оксалатный буферный раствор (например, смесь щавелевой кислоты-оксалата натрия, смесь щавелевой кислоты-гидроксида натрия, смесь щавелевой кислоты-оксалата калия и т.д.), лактатные буферные растворы (например, смесь молочной кислоты-лактата натрия, смесь молочной кислотыгидроксида натрия, смесь молочной кислоты-лактата калия и т.д.) и ацетатные буферные растворы (например, смесь уксусной кислоты-ацетата натрия, смесь уксусной кислоты-гидроксида натрия и т.д.). Дополнительно могут быть использованы фосфатные буферные растворы, буферные растворы гистидина и соли триметиламина, такие как Трис.

В некоторых вариантах реализации для замедления микробного роста добавляют консерванты в количествах в диапазоне 0,01-1% (мас./об.), таких как 0,1-1%, 0,2-1%, 0,3-1%, 0,5-1%, 0,01-0,5%, 0,02-0,5%, 0,05-0,5%, 0,1-0,5%, 0,2-0,5% или 0,05-0,2% (мас./об.). Например, может быть добавлен консервант в количестве, составляющем примерно 0,02, примерно 0,05, примерно 0,1, примерно 0,2, примерно 0,5, примерно 0,8% (мас./об.). Подходящие консерванты для применения согласно настоящему описанию включают фенол, бензиновый спирт, мета-крезол, метилпарабен, пропилпарабен, хлорид октадецилдиметилбензиламмония, галогениды бензалкония (например, хлорид, бромид и иодид), хлорид гексаметония и алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол и 3 -пентанол.

В некоторых вариантах реализации изотонические добавки, иногда упоминаемые как стабилизаторы, добавляют для обеспечения изотоничности жидких композиций согласно настоящему описанию, и изотонические добавки включают многоатомные сахароспирты, например трехатомные или высшие сахароспирты, такие как глицерин, эритрит, арабит, ксилит, сорбит и маннит. Стабилизаторы относятся к широкой категории вспомогательных веществ, функции которых могут варьировать от объемообразующего агента до добавки, которая солюбилизирует терапевтический агент или помогает предотвратить денатурацию или прилипание к стенке емкости. Типичные стабилизаторы могут представлять собой многотомные сахароспирты (перечисленные выше); аминокислоты, такие как аргинин, лизин, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аланин, орнитин, L-лейцин, 2-фенилаланин, глутаминовая кислота, треонин и т.д., органические сахара или сахароспирты, такие как лактоза, трегалоза, стахиоза, маннит, сорбит, ксилит, рибит, мионизит, галактит, глицерин и тому подобное, включая циклиты, такие как инозитол; полиэтиленгликоль; полимеры аминокислот; серосодержащие восстановители, такие как мочевина, глутатион, тиоктовая кислота, тиогликолят натрия, тиоглицерин, α-монотиоглицерин и тиосульфат натрия; полипептиды с низкой молекулярной массой (например, пептиды из 10 или менее остатков); белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, бычий сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как моносахариды поливинилпирролидона, такие как ксилоза, манноза, фруктоза, глюкоза; дисахариды, такие как лактоза, мальтоза, сахароза и трисахариды, такие как раффиноза; и полисахариды, такие как декстран. В некоторых вариантах реализации стабилизаторы присутствуют в диапазоне от 0,1 до 10000 мас.ч. на массовую часть фармацевтически активного ингредиента, например от 0,1 до 1000, от 0,2 до 2000, от 0,5 до 5000, от 1 до 10000 или от 1 до 1000 мас.ч. на массовую часть фармацевтически активного ингредиента. Например, стабилизаторы могут присутствовать в количестве примерно 0,2, примерно 0,5, примерно 1, примерно 5, примерно 10, примерно 20, примерно 50, примерно 100, примерно 200, примерно 500, примерно 1000, примерно 2000, примерно 5000 или примерно 8000 мас.ч. на массовую часть фармацевтически активного ингредиента.

В некоторых вариантах реализации ионогенные поверхностно-активные вещества добавляют для облегчения солюбилизации терапевтического агента, а также для защиты активного ингредиента от агре

- 29 033892 гации, вызванной взбалтыванием. В некоторых вариантах реализации неионогенные поверхностноактивные вещества или детергенты (также упоминаемые как смачивающие агенты) добавляют для облегчения солюбилизации терапевтического агента, а также для защиты активного ингредиента от агрегации, вызванной взбалтыванием. Подходящие неионогенные поверхностно-активные вещества включают полисорбаты (20, 80 и т.д.), полиоксамеры (184, 188 и т.д.), поверхностно-активные многоатомные спирты, моноэфиры полиоксиэтиленсорбитана (TWEEN®-20, TWEEN®-80 и т.д.). В некоторых вариантах реализации неионогенные поверхностно-активные вещества присутствуют в диапазоне от примерно 0,05 до примерно 1,0 мг/мл, например от примерно 0,05 до примерно 0,2 мг/мл, от примерно 0,07 до примерно 0,2 мг/мл, от примерно 0,1 до примерно 0,3 мг/мл или от примерно 0,1 до примерно 0,5 мг/мл. Например, неионогенные поверхностно-активные вещества могут присутствовать в количествах примерно 0,05, примерно 0,07, примерно 0,08, примерно 0,1, примерно 0,2, примерно 0,3, примерно 0,4, примерно 0,5, примерно 0,6, примерно 0,8 или примерно 1,0 мг/мл.

Прочие дополнительные вспомогательные вещества включают объемообразующие агенты (например, крахмал), хелатирующие агенты (например, ЭДТА), антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, метионин, витамин Е) и сорастворители.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция согласно настоящему описанию также содержит комбинацию терапевтических агентов, например второй терапевтический агент помимо фармацевтически активного ингредиента согласно настоящему описанию (смеси бета-циклодекстринов, описанной в настоящем описании). Примеры подходящей комбинации терапевтических агентов приведены ниже в разделе 4.3.3.

В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции, описанные в настоящем описании, солюбилизируют липиды в водной среде. Водная среда может представлять собой, например, дистиллированную воду или деионизированную воду или может представлять собой водную среду, например кровь, спинномозговую жидкость или лимфатическую жидкость, в теле субъекта. Солюбилизирующая способность композиций обычно может быть измерена с помощью пропускающих свойств раствора в УФ-области, контролируемых, например, с помощью спектрометрии в УФ-области или ВЭЖХ, с корреляцией между уменьшением пропускания и формированием суспензии в растворе. В некоторых вариантах реализации солюбилизируемые липиды включают неэтерифицированный или этерифицированный холестерин; метаболиты холестерина, например 7-кетохолестерол, 7в-гидроксихолестерол, 24Sгидроксихолестерол, 25-гидроксихолестерол, 27-гидроксихолестерол и холестан-3в,5а,6в-триол; сфинголипиды; гликолипиды; церамиды; ганглиозиды, например GM2 ((2S,3R,4E)-3-гидрокси-2(октадеканоиламино)-октадек-4-ен-1-ил 2-ацетамидо-2-деокси-в-О-галактопиранозил-(1^4)-[5ацетамидо-3,5-дидеокси-П-глицеро-а-О-галактонон-2-улопиранонозил-(2^3)]-в-П-галактопиранозил(1^4)-в-О-глюкопиранозид) или GM3 (моносиалодигексозилганглиозид) или любую их комбинацию.

В контексте настоящего описания масса на объем (масса/объем или мас./об.) раствора относится к массе растворенного вещества, растворенного в объеме воды. В иллюстративном примере 10% (мас./об.) раствор гидроксипропил-бета-циклодекстринов содержит 1 г растворенного вещества в 10 мл водного раствора. В другом примере 20% (мас./об.) раствор гидроксипропил-бета-циклодекстринов содержит 200 мг растворенного вещества в 1 мл водного раствора.

В некоторых вариантах реализации 1 мл 20% (мас./об.) раствора фармацевтически активного ингредиента, описанного в настоящем описании, солюбилизирует по меньшей мере 2 мг, например по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 10 мг неэтерифицированного холестерина в дистиллированной воде при комнатной температуре, при измерении, например, с помощью спектрометрии в УФ-области, через примерно 24 ч. В некоторых вариантах реализации примерно 200 мг фармацевтически активного ингредиента солюбилизирует по меньшей мере 2 мг, например по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 10 мг неэтерифицированного холестерина в дистиллированной воде при комнатной температуре при измерении через примерно 24 ч.

6.3. Способы лечения.

В настоящем описании предложены способы лечения болезни Ниманна-Пика типа C (БНПС), такой как болезнь Ниманна-Пика типа C1 (БНПС1) или болезнь Ниманна-Пика типа C2 (БНПС2), включающие введение субъекту с болезнью Ниманна-Пика терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции согласно настоящему описанию.

В контексте настоящего описания субъект представляет собой млекопитающее, такое как мышь, крыса, кошка, собака, корова, свинья, лошадь. В некоторых вариантах реализации млекопитающее представляет собой примата, такого как обезьяна, шимпанзе или человек. Например, субъект может представлять собой субъекта, являющегося человеком, т.е. пациента, являющегося человеком. В некоторых вариантах реализации пациент представляет собой педиатрического пациента или взрослого пациента. Педиатрические пациенты, являющиеся людьми, включают педиатрических пациентов с заболеванием, характеризующимся началом в раннем детском возрасте (в возрасте менее 2 лет), началом в позднем дет

- 30 033892 ском возрасте (в возрасте от 2 до менее чем 6 лет), началом в подростковом возрасте (в возрасте от 6 до менее чем 15 лет) и началом в юношеском возрасте (в возрасте 15 или более лет).

Термины вводить, введение или лечение относятся к введению фармацевтической композиции, описанной в настоящем описании, для того, чтобы полезным образом модулировать уровень одного или более липидных биомаркеров или терапевтических эффектов, как описано в разделе 4.3.4, по сравнению с исходным уровнем. Типичная фаза лечения включает повторное введение фармацевтической композиции, описанной в настоящем описании, где значение одного или более используемых для оценки параметров согласно шкале тяжести БНПС, как определено в разделе 4.3.4.2, снижается по сравнению с предшествующим исходным значением.

Термины поддерживать, поддерживающий или поддержание относятся к введению фармацевтической композиции, описанной в настоящем описании, для поддержания постоянного исходного уровня одного или более биологических эффектов, как описано в разделе 4.3.4. Поддерживающая фаза введения может предотвратить прогрессирование БНПС по сравнению с отсутствием введения или введением плацебо. Иллюстративный пример поддерживающей фазы представляет собой повторное введение фармацевтической композиции, описанной в настоящем описании, где значение одного или более используемых для оценки параметров согласно шкале тяжести БНПС, как определено в разделе 4.3.4.2, сохраняется на том же уровне, что исходное значение.

6.3.1. Введение фармацевтических композиций гидроксипропил-бета-циклодекстринов.

В некоторых вариантах реализации способ включает введение субъекту от примерно 200 до примерно 3000 мг, например от примерно 200 до примерно 2800, от примерно 200 до примерно 2600, от примерно 200 до примерно 2500, от примерно 200 до примерно 2400, от примерно 200 до примерно 2200, от примерно 200 до примерно 2000, от примерно 200 до примерно 1800, от примерно 200 до примерно 1600, от примерно 200 до примерно 1500, от примерно 200 до примерно 1200, от примерно 200 до примерно 1100, от примерно 200 до примерно 1000, от примерно 200 до примерно 800, от примерно 200 до примерно 700, от примерно 200 до примерно 600, от примерно 200 до примерно 500, от примерно 200 до примерно 400, от примерно 200 до примерно 300; примерно 300 до примерно 3000, от примерно 300 до примерно 2800, от примерно 300 до примерно 2600, от примерно 300 до примерно 2500, от примерно 300 до примерно 2400, от примерно 300 до примерно 2200, от примерно 300 до примерно 2000, от примерно 300 до примерно 1800, от примерно 300 до примерно 1600, от примерно 300 до примерно 1500, от примерно 300 до примерно 1200, от примерно 300 до примерно 1100, от примерно 300 до примерно 1000, от примерно 300 до примерно 800, от примерно 300 до примерно 700, от примерно 300 до примерно 600, от примерно 300 до примерно 500, от примерно 300 до примерно 400; например от примерно 400 до примерно 3000, от примерно 400 до примерно 2800, от примерно 400 до примерно 2600, от примерно 400 до примерно 2500, от примерно 400 до примерно 2400, от примерно 400 до примерно 2200, от примерно 400 до примерно 2000, от примерно 400 до примерно 1800, от примерно 400 до примерно 1600, от примерно 400 до примерно 1500, от примерно 400 до примерно 1200, от примерно 400 до примерно 1100, от примерно 400 до примерно 1000, от примерно 400 до примерно 800, от примерно 400 до примерно 700, от примерно 400 до примерно 600, от примерно 400 до примерно 500; например от примерно 500 до примерно 3000, от примерно 500 до примерно 2800, от примерно 500 до примерно 2600, от примерно 500 до примерно 2500, от примерно 500 до примерно 2400, от примерно 500 до примерно 2200, от примерно 500 до примерно 2000, от примерно 500 до примерно 1800, от примерно 500 до примерно 1600, от примерно 500 до примерно 1500, от примерно 500 до примерно 1200, от примерно 500 до примерно 1100, от примерно 500 до примерно 1000, от примерно 500 до примерно 800, от примерно 500 до примерно 700, от примерно 500 до примерно 600; например от примерно 600 до примерно 3000, от примерно 600 до примерно 2800, от примерно 600 до примерно 2600, от примерно 600 до примерно 2500, от примерно 600 до примерно 2400, от примерно 600 до примерно 2200, от примерно 600 до примерно 2000, от примерно 600 до примерно 1800, от примерно 600 до примерно 1600, от примерно 600 до примерно 1500, от примерно 600 до примерно 1200, от примерно 600 до примерно 1100, от примерно 600 до примерно 1000, от примерно 600 до примерно 800, от примерно 600 до примерно 700; например от примерно 700 до примерно 3000, от примерно 700 до примерно 2800, от примерно 700 до примерно 2600, от примерно 700 до примерно 2500, от примерно 700 до примерно 2400, от примерно 700 до примерно 2200, от примерно 700 до примерно 2000, от примерно 700 до примерно 1800, от примерно 700 до примерно 1600, от примерно 700 до примерно 1500, от примерно 700 до примерно 1200, от примерно 700 до примерно 1100, от примерно 700 до примерно 1000, от примерно 700 до примерно 800; например от примерно 800 до примерно 3000, от примерно 800 до примерно 2800, от примерно 800 до примерно 2600, от примерно 800 до примерно 2500, от примерно 800 до примерно 2400, от примерно 800 до примерно 2200, от примерно 800 до примерно 2000, от примерно 800 до примерно 1800, от примерно 800 до примерно 1600, от примерно 800 до примерно 1500, от примерно 800 до примерно 1200, от примерно 800 до примерно 1100, от примерно 800 до примерно 1000; например от примерно 1000 до примерно 3000, от примерно 1000 до примерно 2800, от примерно 1000 до примерно 2600, от примерно 1000 до примерно 2500, от примерно 1000 до примерно 2400, от примерно 1000 до примерно 2200, от примерно 1000 до примерно 2000, от примерно 1000 до примерно 1800, от примерно 1000 до примерно 1600, от примерно 1000 до примерно 1500, от примерно

- 31 033892

1000 до примерно 1200, от примерно 1000 до примерно 1100; например от примерно 1100 до примерно 3000, от примерно 1100 до примерно 2800, от примерно 1100 до примерно 2600, от примерно 1100 до примерно 2500, от примерно 1100 до примерно 2400, от примерно 1100 до примерно 2200, от примерно 1100 до примерно 2000, от примерно 1100 до примерно 1800, от примерно 1100 до примерно 1600, от примерно 1100 до примерно 1500, от примерно 1100 до примерно 1200; например от примерно 1200 до примерно 3000, от примерно 1200 до примерно 2800, от примерно 1200 до примерно 2600, от примерно 1200 до примерно 2500, от примерно 1200 до примерно 2400, от примерно 1200 до примерно 2200, от примерно 1200 до примерно 2000, от примерно 1200 до примерно 1800, от примерно 1200 до примерно 1600, от примерно 1200 до примерно 1500; например от примерно 1500 до примерно 3000, от примерно 1500 до примерно 2800, от примерно 1500 до примерно 2600, от примерно 1500 до примерно 2500, от примерно 1500 до примерно 2400, от примерно 1500 до примерно 2200, от примерно 1500 до примерно 2000, от примерно 1500 до примерно 1800, от примерно 1500 до примерно 1600; например от примерно 1600 до примерно 3000, от примерно 1600 до примерно 2800, от примерно 1600 до примерно 2600, от примерно 1600 до примерно 2500, от примерно 1600 до примерно 2400, от примерно 1600 до примерно 2200, от примерно 1600 до примерно 2000, от примерно 1600 до примерно 1800; например от примерно 1800 до примерно 3000, от примерно 1800 до примерно 2800, от примерно 1800 до примерно 2600, от примерно 1800 до примерно 2500, от примерно 1800 до примерно 2400, от примерно 1800 до примерно 2200, от примерно 1800 до примерно 2000; например от примерно 2000 до примерно 3000, от примерно 2000 до примерно 2800, от примерно 2000 до примерно 2600, от примерно 2000 до примерно 2500, от примерно 2000 до примерно 2400, от примерно 2000 до примерно 2200; например от примерно 2200 до примерно 3000, от примерно 2200 до примерно 2800, от примерно 2200 до примерно 2600, от примерно 2200 до примерно 2500, от примерно 2200 до примерно 2400; например от примерно 2400 до примерно 3000, от примерно 2400 до примерно 2800, от примерно 2400 до примерно 2600, от примерно 2400 до примерно 2500; например от примерно 2500 до примерно 3000, от примерно 2500 до примерно 2800, от примерно 2500 до примерно 2600; например от примерно 2600 до примерно 3000, от примерно 2600 до примерно 2800 или от примерно 2800 до примерно 3000 мг, фармацевтически активного ингредиента на одно введение.

В некоторых вариантах реализации схема введения состоит из введения один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в месяц, один раз в два месяца, или один раз в три месяца. Например, способ может включать введение субъекту примерно 200, примерно 300, примерно 400, примерно 500, примерно 600, примерно 700, примерно 800, примерно 900, примерно 1000, примерно 1200, примерно 1400, примерно 1500, примерно 1600, примерно 1800, примерно 2000, примерно 2200, примерно 2400, примерно 2500 или примерно 3000 мг фармацевтически активного ингредиента на одно введение.

В некоторых вариантах реализации введение производят в однократной дозе на одно введение. В других вариантах реализации фармацевтическую композицию вводят в отдельных дозах, с общей дозой, разделенной на две дозы, три дозы или даже четыре дозы на одно введение, например, в течение недели, двух недель, месяца, двух месяцев и т.д., в частности в течение двух недель. Композицию также могут вводить непрерывно или в любом эффективном диапазоне или значении в нем в зависимости от состояния, подлежащего лечению, пути введения и возраста, массы и состояния субъекта.

В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции согласно настоящему описанию являются подходящими для интратекального или интрацеребровентрикулярного введения. В некоторых вариантах реализации интратекальное введение фармацевтической композиции осуществляют через интратекальный порт. В некоторых из этих вариантов реализации порт представляет собой порт Celsite® (В. Braun Medical, Франция). В некоторых вариантах реализации интратекальное введение включает введение путем медленной интратекальной болюсной (1-2 мин, в зависимости от вводимого объема) инъекции с помощью люмбальной пункции (максимальная скорость введения = 4,5 мл/мин). В некоторых вариантах реализации выполнение люмбальной пункции включает использование нережущей иглы, такой как игла Whiteacre или Sprotte, введение параллельно волокнам твердой мозговой оболочки и замену стилета перед удалением иглы. В некоторых вариантах реализации перед инъекцией удаляют объем спинномозговой жидкости, равный объему, подлежащему введению.

В другом иллюстративном примере интрацеребровентрикулярное введение может представлять собой введение с помощью резервуара Оммайя.

Для лечения БНПС, описанной в настоящем описании, эффективная доза фармацевтически активного ингредиента, смеси гидроксипропил-бета-циклодекстринов, может составлять от примерно 0,001 до примерно 1000 мг/кг, например от примерно 0,1 до примерно 1000, от примерно 1 до примерно 1000, от примерно 10 до примерно 1000, от примерно 20 до примерно 1000, от примерно 50 до примерно 1000, от примерно 100 до примерно 1000, от примерно 200 до примерно 1000, от примерно 300 до примерно 1000, от примерно 400 до примерно 1000, от примерно 500 до примерно 1000, от примерно 600 до примерно 1000, от примерно 800 до примерно 1000; например от примерно 0,1 до примерно 800, от примерно 1 до примерно 800, от примерно 10 до примерно 800, от примерно 20 до примерно 800, от примерно 50 до примерно 800, от примерно 100 до примерно 800, от примерно 200 до примерно 800, от примерно 300 до

- 32 033892 примерно 800, от примерно 400 до примерно 800, от примерно 500 до примерно 800, от примерно 600 до примерно 800; например от примерно 0,1 до примерно 600, от примерно 1 до примерно 600, от примерно 10 до примерно 600, от примерно 20 до примерно 600, от примерно 50 до примерно 600, от примерно 100 до примерно 600, от примерно 200 до примерно 600, от примерно 300 до примерно 600, от примерно 400 до примерно 600, от примерно 500 до примерно 600; например от примерно 0,1 до примерно 500, от примерно 1 до примерно 500, от примерно 10 до примерно 500, от примерно 20 до примерно 500, от примерно 50 до примерно 500, от примерно 100 до примерно 500, от примерно 200 до примерно 500, от примерно 300 до примерно 500, от примерно 400 до примерно 500; например от примерно 0,1 до примерно 400, от примерно 1 до примерно 400, от примерно 10 до примерно 400, от примерно 20 до примерно 400, от примерно 50 до примерно 400, от примерно 100 до примерно 400, от примерно 200 до примерно 400, от примерно 300 до примерно 400; например от примерно 0,1 до примерно 300, от примерно 1 до примерно 300, от примерно 10 до примерно 300, от примерно 20 до примерно 300, от примерно 50 до примерно 300, от примерно 100 до примерно 300, от примерно 200 до примерно 300; например от примерно 0,1 до примерно 200, от примерно 1 до примерно 200, от примерно 10 до примерно 200, от примерно 20 до примерно 200, от примерно 50 до примерно 200, от примерно 100 до примерно 200; например от примерно 0,1 до примерно 100, от примерно 1 до примерно 100, от примерно 10 до примерно 100, от примерно 20 до примерно 100, от примерно 50 до примерно 100; например от примерно 0,1 до примерно 50, от примерно 1 до примерно 50, от примерно 10 до примерно 50, от примерно 20 до примерно 50; например от примерно 0,1 до примерно 20, от примерно 1 до примерно 20, от примерно 10 до примерно 20; например от примерно 0,1 до примерно 10, от примерно 1 до примерно 10 или от примерно 0,1 до примерно 1 мг/кг.

В некоторых вариантах реализации способ включает фазу лечения, где введение осуществляют каждую неделю, каждые две недели, каждые три недели или каждый месяц для уменьшения симптомов БНПС.

В некоторых вариантах реализации способ включает поддерживающую фазу, где введение осуществляют каждые три недели, каждый месяц, каждые два месяца или каждые три месяца для поддержания стабильного состояния заболевания.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическую композицию вводят в форме болюса, затем в постоянной поддерживающей дозе.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическую композицию вводят ежемесячно путем интратекального или интрацеребровентрикулярного введения. В некоторых вариантах реализации фармацевтическую композицию вводят непрерывно путем интратекального или интрацеребровентрикулярного введения.

В некоторых вариантах реализации способ включает фазу лечения, где пациенту вводят 900 мг фармацевтически активного ингредиента в качестве начальной дозы, и поддерживающую фазу, где менее 900 мг фармацевтически активного ингредиента вводят один раз в две недели путем интратекального введения.

6.3.2. Комплексные пути введения.

В некоторых вариантах реализации способ включает введение фармацевтически активного ингредиента с использованием комплексных путей введения. В некоторых вариантах реализации способ включает введение фармацевтически активного ингредиента (i) интратекально или путем интрацеребровентрикулярного введения и (ii) внутривенно. Эти варианты реализации полезны для снижения накопления холестерина как в центральной нервной системе, так и в периферических органах.

В некоторых вариантах реализации внутривенное введение включает введение пациенту от примерно 200 до примерно 4000 мг/кг смеси бета-циклодекстринов путем внутривенной инфузии в течение от 6 до 8 ч. В некоторых вариантах реализации внутривенное введение включает введение пациенту от примерно 500 до примерно 4000 мг/кг смеси бета-циклодекстринов путем внутривенной инфузии в течение от 6 до 8 ч.

В типичных вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит примерно 200 мг/мл смеси бета-циклодекстринов. В некоторых других вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит примерно 250 мг/мл смеси бета-циклодекстринов. В некоторых вариантах реализации фармацевтическую композицию вводят один раз в три дня, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в месяц, один раз в два месяца или один раз в три месяца. В некоторых вариантах реализации внутривенное введение начинают вскоре после рождения. В некоторых других вариантах реализации внутривенное введение начинают после начала интратекального (или интрацеребровентрикулярного) введения. В некоторых вариантах реализации контролируют объем печени, объем селезенки и/или активность ферментов печени пациента для определения эффективности лечения, а также для коррекции схемы введения.

6.3.3. Комбинированная терапия.

Ниже описаны способы комбинированной терапии, в которых необязательно могут быть применены фармацевтические композиции гидроксипропил-бета-циклодекстринов согласно настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации комбинированные способы согласно настоящему описанию

- 33 033892 включают введение субъекту по меньшей мере двух агентов, первый из которых представляет собой смесь гидроксипропил-бета-циклодекстринов, описанную в настоящем описании (например, в фармацевтической композиции, описанной в настоящем описании), а дополнительный агент (агенты) представляет собой комбинируемый терапевтический агент. Смесь гидроксипропил-бета-циклодекстринов и комбинируемый терапевтический агент (агенты) могут быть введены совместно (например, в фармацевтической композиции, описанной в настоящем описании), последовательно или отдельно.

Способы комбинированной терапии согласно настоящему описанию могут приводить к эффекту, превышающему аддитивный эффект, то есть синергетическому эффекту, например, обеспечивая терапевтическую пользу, превышающую ожидаемую суммарную пользу смеси гидроксипропил-бетациклодекстринов и комбинируемого терапевтического агента, когда каждый из них вводят индивидуально.

В некоторых вариантах реализации смесь гидроксипропил-бета-циклодекстринов и и комбинируемый терапевтический агент вводят одновременно, или совместно, или последовательно. В контексте настоящего описания считают, что смесь гидроксипропил-бета-циклодекстринов и комбинируемый терапевтический агент вводят последовательно, если их вводят субъекту в течение одного дня, например, в течение одного визита субъекта. Последовательное введение может быть осуществлено через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 ч. Напротив, считают, что смесь гидроксипропил-бета-циклодекстрина и комбинируемый терапевтический агент вводят отдельно, если их вводят субъекту в разные дни, например смесь гидроксипропил-бета-циклодекстринов и комбинируемый терапевтический агент могут быть введены с 1дневным, 2-дневным или 3-дневным, 1-недельным, 2-недельным или месячным интервалами. В способах согласно настоящему описанию введение смеси гидроксипропил-бета-циклодекстринов может предшествовать введению или следовать за введением комбинируемого терапевтического агента.

В качестве неограничивающего примера смеси гидроксипропил-бета-циклодекстринов и комбинируемый терапевтический агент могут быть введены одновременно в течение определенного периода времени с последующим вторым периодом времени, в котором введение смеси гидроксипропил-бетациклодекстрина и комбинируемого терапевтического агента чередуется.

Ввиду потенциального синергетического эффекта введения смеси гидроксипропил-бетациклодекстринов и комбинируемого терапевтического агента такие агенты можно вводить в виде терапевтически эффективной комбинации в количествах, которые не являются терапевтически эффективными при отдельном введении одного или обоих из этих агентов.

В некоторых вариантах реализации комбинируемый терапевтический агент представляет собой витамин Е или его производное, средство ферментозаместительной терапии, стероид, ингибитор ферментов глюкозилтрансфераз, ингибитор гистоновой деацетилазы (HDAC) или активатор молекулярных шаперонов.

Витамин Е или производные витамина Е включают, но не ограничиваются ими, альфа-токоферол, дельта-токоферол и производные токоферола. В некоторых вариантах реализации производные витамина Е включают этерифицированные токоферолы, например токоферилацетат, и химически родственные производные токоферола, такие как описано в публикации РСТ № WO 2014/078573, включенной в настоящее описание посредством ссылки во всей ее полноте.

Средства ферментозаместительной терапии включают, но не ограничиваются ими, агалсидазу бета (Фабразим (Fabrazyme®)), имиглюцеразу (Церезим (Cerezyme®)), велаглюцеразу альфа (ВПРИВ (VPRIV™)), талиглюцеразу (Элелисо (Elelyso™)), алглюкозидазу альфа (Миозим (Myozyme®) или Люмизим (Lumizyme®)), ларонидазу (Альдуразим (Aldurazyme®)), внутривенную идурсульфазу (Элапразу (Elaprase®)) и галсульфазу (Наглазим (Naglazyme™)).

Стероиды включают, но не ограничиваются ими, нейростероиды, такие как аллопрегнанолон и ганаксолон.

Ингибиторы ферментов глюкозилтрансфераз включают, но не ограничиваются ими, ингибиторы глюкоцерамидсинтазы, такие как миглустат (Завеска (Zavesca®)).

Ингибиторы HDAC включают, но не ограничиваются ими, вориностат, ромидепсин, трихостатин А, вальпроат, бутират, трапоксины и апицидин.

Активаторы молекулярных шаперонов включают аримокломол, но не ограничиваются им.

6.3.4. Биологические эффекты способов.

6.3.4.1. Действие на биомаркеры.

В некоторых вариантах реализации способы лечения БНПС включают поддержание или модулирование уровней одного или более липидов, таких как неэтерифицированный холестерин или ганглиозиды, которые накапливаются в одном или более органах тела, например в головном мозге, и обусловливают симптомы заболевания. В некоторых вариантах реализации модулирование уровней одного или более липидов включает снижение уровней одного или более липидов. В некоторых вариантах реализации эффективность способов определяют с помощью измерения уровня накопления одного или более липидов до (исходный уровень) и после начала лечения. Например, в некоторых вариантах реализации описанные способы снижают уровни одного или более липидов на примерно 20, примерно 25, примерно 30, при

- 34 033892 мерно 35, примерно 40, примерно 45, примерно 50, примерно 55, примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, примерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 95 или примерно 97% относительно исходного уровня.

В некоторых вариантах реализации описанные способы снижают уровни одного или более липидов на 20 ± 5%, 25 ± 5%, 30 ± 5%, 35 ± 5%, 40 ± 5%, 45 ± 5%, 50 ± 5%, 55 ± 5%, 60 ± 5%, 65 ± 5%, 70 ± 5%, 75 ± 5%, 80 ± 5%, 85 ± 5%, 90 ± 5% или 95 ± 5% относительно исходного уровня.

В некоторых вариантах реализации описанные способы снижают уровни одного или более липидов на 20 ± 3%, 25 ± 3%, 30 ± 3%, 35 ± 3%, 40 ± 3%, 45 ± 3%, 50 ± 3%, 55 ± 3%, 60 ± 3%, 65 ± 3%, 70 ± 3%, 75 ± 3%, 80 ± 3%, 85 ± 3%, 90 ± 3%, 95 ± 3% или 97 ± 3% относительно исходного уровня.

В некоторых вариантах реализации описанные способы снижают уровни одного или более липидов на 20 ± 2%, 25 ± 2%, 30 ± 2%, 35 ± 2%, 40 ± 2%, 45 ± 2%, 50 ± 2%, 55 ± 2%, 60 ± 2%, 65 ± 2%, 70 ± 2%, 75 ± 2%, 80 ± 2%, 85 ± 2%, 90 ± 2%, 95 ± 2% или 97 ± 2% относительно исходного уровня.

В некоторых вариантах реализации описанные способы снижают уровни одного или более липидов на по меньшей мере примерно 20%, например по меньшей мере примерно 25, примерно 30, примерно 35, примерно 40, примерно 45, примерно 50, примерно 55, примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, примерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 95 или примерно 97% относительно исходного уровня.

В некоторых вариантах реализации описанные способы снижают уровни одного или более липидов в диапазоне от примерно 20 до примерно 97%, например от примерно 20 до примерно 95%, от примерно 20 до примерно 90%, от примерно 20 до примерно 85%, от примерно 20 до примерно 80%, от примерно до примерно 75%, от примерно 20 до примерно 70%, от примерно 20 до примерно 65%, от примерно до примерно 60%, от примерно 20 до примерно 55%, от примерно 20 до примерно 50%, от примерно до примерно 45%, от примерно 20 до примерно 40%, от примерно 20 до примерно 35%, от примерно до примерно 30%, от примерно 20 до примерно 25%; например от примерно 25 до примерно 97%, от примерно 25 до примерно 95%, от примерно 25 до примерно 90%, от примерно 25 до примерно 85%, от примерно 25 до примерно 80%, от примерно 25 до примерно 75%, от примерно 25 до примерно 70%, от примерно 25 до примерно 65%, от примерно 25 до примерно 60%, от примерно 25 до примерно 55%, от примерно 25 до примерно 50%, от примерно 25 до примерно 45%, от примерно 25 до примерно 40%, от примерно 25 до примерно 35%, от примерно 25 до примерно 30%; например от примерно 30 до примерно 97%, от примерно 30 до примерно 95%, от примерно 30 до примерно 90%, от примерно 30 до примерно

85%, от примерно 30 до примерно 80%, от примерно 30 до примерно 75%, от примерно 30 до примерно

70%, от примерно 30 до примерно 65%, от примерно 30 до примерно 60%, от примерно 30 до примерно

55%, от примерно 30 до примерно 50%, от примерно 30 до примерно 45%, от примерно 30 до примерно

40%, от примерно 30 до примерно 35%; например от примерно 35 до примерно 97%, от примерно 35 до примерно 95%, от примерно 35 до примерно 90%, от примерно 35 до примерно 85%, от примерно 35 до примерно 80%, от примерно 35 до примерно 75%, от примерно 35 до примерно 70%, от примерно 35 до примерно 65%, от примерно 35 до примерно 60%, от примерно 35 до примерно 55%, от примерно 35 до примерно 50%, от примерно 35 до примерно 45%, от примерно 35 до примерно 40%; например от примерно 40 до примерно 97%, от примерно 40 до примерно 95%, от примерно 40 до примерно 90%, от примерно 40 до примерно 85%, от примерно 40 до примерно 80%, от примерно 40 до примерно 75%, от примерно 40 до примерно 70%, от примерно 40% до примерно 65%, от примерно 40 до примерно 60%, от примерно 40 до примерно 55%, от примерно 40 до примерно 50%, от примерно 40 до примерно 45%; например от примерно 45 до примерно 97%, от примерно 45 до примерно 95%, от примерно 45 до примерно 90%, от примерно 45 до примерно 85%, от примерно 45 до примерно 80%, от примерно 45 до примерно 75%, от примерно 45 до примерно 70%, от примерно 45 до примерно 65%, от примерно 45 до примерно 60%, от примерно 45 до примерно 55%, от примерно 45 до примерно 50%; например от примерно 50 до примерно 97%, от примерно 50 до примерно 95%, от примерно 50 до примерно 90%, от примерно 50 до примерно 85%, от примерно 50 до примерно 80%, от примерно 50 до примерно 75%, от примерно 50 до примерно 70%, от примерно 50 до примерно 65%, от примерно 50 до примерно 60%, от примерно 50 до примерно 55%; например от примерно 55 до примерно 97%, от примерно 55 до примерно 95%, от примерно 55 до примерно 90%, от примерно 55 до примерно 85%, от примерно 55 до примерно 80%, от примерно 55 до примерно 75%, от примерно 55 до примерно 70%, от примерно 55 до примерно 65%, от примерно 55 до примерно 60%; например от примерно 60 до примерно 97%, от примерно 60 до примерно 95%, от примерно 60 до примерно 90%, от примерно 60 до примерно 85%, от примерно 60 до примерно 80%, от примерно 60 до примерно 75%, от примерно 60 до примерно 70%, от примерно 60 до примерно 65%; например от примерно 65 до примерно 97%, от примерно 65 до примерно 95%, от примерно 65 до примерно 90%, от примерно 65 до примерно 85%, от примерно 65 до примерно 80%, от примерно 65 до примерно 75%, от примерно 65 до примерно 70%; например от примерно 70 до примерно 97%, от примерно 70 до примерно 95%, от примерно 70 до примерно 90%, от примерно 70 до примерно 85%, от примерно 70 до примерно 80%, от примерно 70 до примерно 75%; например от примерно 75 до примерно 97%, от примерно 75 до примерно 95%, от примерно 75 до примерно 90%, от примерно 75 до примерно

- 35 033892

85%, от примерно 75 до примерно 80%; например от примерно 80 до примерно 97%, от примерно 80 до примерно 95%, от примерно 80 до примерно 90%, от примерно 80 до примерно 85%; например от примерно 85 до примерно 97%, от примерно 85 до примерно 95%, от примерно 85 до примерно 90%; например от примерно 90 до примерно 97%, от примерно 90 до примерно 95% или от примерно 95 до примерно 97% относительно исходного уровня.

У пациентов с БНПС измерение уровня накопления одного или более липидов может быть осуществлено с помощью контроля одного или более биомаркеров в образце спинномозговой жидкости (СМЖ), плазмы или мочи. В некоторых вариантах реализации СМЖ используют для прямого определения уровня выведения одного или более липидов. В некоторых вариантах реализации контролируют биомаркер, который представляет собой подконтрольный белок, уровень которого модулируется вследствие изменения уровней одного или нескольких липидов. В некоторых вариантах реализации способ включает введение количества фармацевтически активный ингредиента, достаточного для модулирования, например снижения относительно исходного, уровня в спинномозговой жидкости одного или более из: белка тау, амилоидного пептида, легкого белка нейрофиламентов (NFL), глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), стерола, оксистерола, активности хитотриозидазы, кальбиндина, белка лизосомальной мембраны 1 (LAMP-1), ганглиозидов GM2 или GM3, сфингозина и сфингозин-1-фосфата (S1P).

В некоторых вариантах реализации образцы плазмы используют для определения уровней одного или более липидов, например холестерина или метаболитов холестерина, присутствующих в крови до и после начала лечения. В некоторых вариантах реализации способ включает введение количества фармацевтически активного ингредиента, достаточного для модулирования, например снижения относительно исходного, уровня в плазме одного или более из 7-кетохолестерола, 7в-гидроксихолестерола, 24Sгидроксихолестерола, 25-гидроксихолестерола, 27-гидроксихолестерола и холестан-3в,5а,6в-триола.

Контроль других липидов, таких как метаболиты, подобные 33-сульфокси-73-№ ацетилглюкозаминил-5-холен-24-овой кислоте (SNAG-A5-CA), конъюгированной с глицином 3βсульфокси-7в-№ацетилглюкозаминил-5-холен-24-овой кислоте (SNAG-A5-CG) и конъюгированной с таурином 3в-сульфокси-7в-№ацетилглюкозаминил-5-холен-24-овой кислоте (SNAG-A5-CT), о которых сообщалось, что они присутствуют в моче пациентов с БНПС1, может обеспечить пригодные для применения биомаркеры (Maekawa, M. et al. Focused metabolomics using liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry foranalysis of urinary conjugated cholesterol metabolitesfrom patients with Niemann-Pick disease type С and 3e-hydroxysteroid dehydrogenase deficiency. Annals of Clinical Biochemistry OnlineFirst, published March 2, 2015). В некоторых вариантах реализации способ включает введение количества фармацевтически активного ингредиента, достаточного для модулирования, например снижения относительно исходного, уровня в моче одной или более из: 3в-сульфокси-7в-№ ацетилглюкозаминил-5-холен-24-овой кислоты (SNAG-A5-CA), конъюгированной с глицином 3βсульфокси-7в-№ацетилглюкозаминил-5-холен-24-овой кислоты (SNAG-A5-CG) и конъюгированной с таурином 3в-сульфокси-7в-№ацетилглюкозаминил-5-холен-24-овой кислоты (SNAG-A5-CT).

6.3.4.2. Терапевтические эффекты.

В некоторых вариантах реализации способы согласно настоящему описанию оказывают благоприятное действие в отношении одного или более симптомов БНПС.

Одной из мер для характеристики и количественной оценки прогрессирования болезни НПС является использование шкалы тяжести БНПС, которая определяет клинические признаки и симптомы девяти основных используемых для оценки параметров (ходьбы, когнитивной деятельности, движения глаз, мелкой моторики, слуха, памяти, судорог, речи и глотания) и восьми второстепенных используемых для оценки параметров (акустических стволовых потенциалов, поведения, геластической катаплексии, гиперрефлексии, недержания, нарколепсии, психических и респираторных нарушений) (Yanjanin et al., Linear Clinical Progression, Independent of Age of Onset, in Niemann-Pick Disease, Type C, Am. J. Med. Genet. Part B 153B:132-140 (2010)) (Yanjanin 2010). Общая оценка клинической тяжести (или общая оценка) представляет собой совокупность всех значений каждого из основных и второстепенных используемых для оценки параметров и определяется суммой значений всех значений, используемых для оценки индивидуальных параметров, см. табл. 1 ниже; см. также фиг. 1.

- 36 033892

Таблица 1

Шкала клинической тяжести БНПС (согласно Yanjanin, 2010)

Движение глаз	Значение	Ходьба	Значение
Нормальное движение глаз	0	Нормальная	0
Легкий вертикальный надъядерный паралич взора (ВНПВ), обнаруженный только	1	Неловкость	1
врачом Функциональный ВНПВ,	2	Атаксическая походка без	2
отмеченный семьей, или		посторонней помощи или
компенсация движениями головы		отсутствие ходьбы к 18
		месяцам
Общий ВНПВ, могут	3	Ходьба с посторонней	4
присутствовать аномальные		помощью или отсутствие
горизонтальные саккады		ходьбы к 24 месяцам
Общая офтальмоплегия	5	Перемещение в инвалидной	5
(вертикальные и горизонтальные саккады отсутствуют)		коляске
Речь	Значение	Глотание	Значение
Нормальная речь	0	Нормальное, дисфагия отсутствует	0
Легкая дизартрия (легко	1	Кашель во время еды	1
понимаемая)		Перемежающаяся дисфагия *
		жидкостей	+1
Тяжелая дизартрия (затруднена для	2	твердой пищи	+1
понимания)		Дисфагия* жидкостей	+2
		твердой пищи	+2
Невербальные/функциональные	3	Назогастральный зонд или	4
навыки коммуникации при		желудочный зонд для
необходимости		дополнительного питания
Минимальная коммуникация	5	Питание только через назогастральный зонд или	5
		желудочный зонд
Мелкая моторика	Значение	Когнитивная деятельность	Значение
Нормальная	0	Нормальная	0
Незначительная	1	Легкая задержка в обучении в	1
дисметрия/дистония (независимые		степени, соответствующей
моторные навыки)		возрасту

- 37 033892

Легкая дисметрия/дистония (не	2	Умеренная задержка в	3
нуждается или нуждается в		обучении, индивидуальный
небольшой помощи, способен		план обучения или
принимать пищу без затруднений)		измененные условия труда
Умеренная дисметрия/дистония	4	Тяжелая задержка/остановка,	4
(ограниченная мелкая моторика,		больше не посещает школу
затруднения при приеме пищи)		или не способен больше
		работать, некоторая утрата когнитивной функции
Тяжелая дисметрия/дистония	5	Минимальная когнитивная	5
(ограниченная общая моторика, нуждается в помощи для действий по уходу за собой)		функция
Слух (нейросенсорный)	Значение	Память	Значение
Нормальная слух (слуховой порог (СП) для всех тонов <15 дБ)	0	Нормальная	0
Потеря слуха на высоких частотах	1	Легкая утрата	1
(СП с РТА** < 15 дБ, СП > 15 дБ		кратковременной и
на высоких частотах)		долговременной памяти Умеренная утрата кратковременной и долговременной памяти (может заблудиться)	2
Незначительная - легкая потеря	2	Затруднения при выполнении	3
слуха (СП с РТА 16-44 дБ)		команд
Умеренная потеря слуха (СП с	3	Неспособен выполнять	4
РТА 45-70 дБ)		команды или утрата кратковременной и долговременной памяти
Тяжелая потеря слуха (СП с РТА	4
71- 90 дБ) Глубокая потеря слуха (СП с РТА	5	Минимальная память	5
>90 дБ)
Судороги	Значение
Судороги отсутствуют в анамнезе Единичный судорожный приступ в	0 1
анамнезе
Редкие судороги	2
Судороги, хорошо	3
контролируемые медикаментами Судороги, сложно контролируемые медикаментами	5
Модификаторы	Значение	Модификаторы	Значение
Геластическая катаплексия		Г иперрефлексия
Отсутствие в анамнезе	0	Отсутствует	0
Определена в анамнезе	+1	Легкая (3+)	+1
Частая (каждый месяц)	+2	Тяжелая (+ клонус)	+2
Нарколепсия		Недержание
Отсутствие в анамнезе	0	Нарушения отсутствуют	0
Определена в анамнезе	+1	Периодическое	+1
Частая (каждый месяц)	+2	Частое	+2
Поведение		Акустические стволовые потенциалы (АСП)
Нарушения отсутствуют	0	Нормальные	0
СДВГ в анамнезе, агрессивен	+1	Аномальные	+1
Опасен для себя/других	+2	Отсутствуют	+2
Психиатрические		Дыхание
нарушения отсутствуют	0	Нарушения отсутствуют	0
Легкая форма депрессии в	+1	Пневмония в анамнезе	+1
анамнезе
Большая депрессия, галлюцинации	+2	Пневмония > 2 раз/год или с	+2
или психотические эпизоды в		активным терапевтическим
анамнезе		вмешательством

* Значение является аддитивным в пределах этих двух подпунктов.

** РТА (pure tone average) = среднее значение чистого тона, представленное на аудиограмме.

В некоторых вариантах реализации способ включает поддержание или снижение значений одного или более используемых для оценки параметров согласно шкале тяжести БНПС, выбранных из ходьбы, мелкой моторики, когнитивной деятельности, речи, глотания, движения глаз, памяти, слуха, судорог, акустических стволовых потенциалов, поведения, геластической катаплексии, гиперрефлексии, недержания, нарколепсии, психических и респираторных нарушений. В некоторых вариантах реализации способ включает поддержание или снижение значений одного или более используемых для оценки параметров согласно шкале тяжести БНПС, выбранных из ходьбы, мелкой моторики, когнитивной деятельности, речи, глотания, движения глаз, памяти, слуха и судорог. В некоторых вариантах реализации способ включает поддержание или снижение значений одного или более используемых для оценки параметров согласно шкале тяжести БНПС, выбранных из ходьбы, мелкой моторики, когнитивной деятельности,

- 38 033892 речи, глотания, памяти и судорог. В некоторых вариантах реализации способ включает поддержание или снижение значений одного или более используемых для оценки параметров согласно шкале тяжести БНПС, выбранных из ходьбы, мелкой моторики, когнитивной деятельности и глотания.

В некоторых вариантах реализации лечение, которое улучшает состояние пациента, включает снижение значений одного или более используемых для оценки параметров согласно шкале тяжести БНПС в сравнении с исходной оценкой. В некоторых вариантах реализации снижение значения составляет от примерно 20 до примерно 95%, например от примерно 30 до примерно 95%, от примерно 40 до примерно 95%, от примерно 50 до примерно 95%, от примерно 60 до примерно 95%, от примерно 70 до примерно 95%, от примерно 80 до примерно 95%, от примерно 90% до примерно 95%; например от примерно 30 до примерно 90%, от примерно 40 до примерно 90%, от примерно 50 до примерно 90%, от примерно 60 до примерно 90%, от примерно 70 до примерно 90%, от примерно 80 до примерно 90%; например от примерно 20 до примерно 80%, от примерно 30 до примерно 80%, от примерно 40 до примерно 80%, от примерно 50 до примерно 80%, от примерно 60 до примерно 80%, от примерно 70 до примерно 80%; например от примерно 20 до примерно 70%, от примерно 30 до примерно 70%, от примерно 40 до примерно 70%, от примерно 50 до примерно 70%, от примерно 60 до примерно 70%; например от примерно 20 до примерно 60%, от примерно 30 до примерно 60%, от примерно 40 до примерно 60%, от примерно 50 до примерно 60%; например от примерно 20 до примерно 50%, от примерно 30 до примерно 50%, от примерно 40 до примерно 50%; например от примерно 20 до примерно 40%, от примерно 30 до примерно 40% или от примерно 20 до примерно 30% в сравнении с исходной оценкой. Например, снижение оценки может составлять примерно 20, примерно 30, примерно 40, примерно 50, примерно 60, примерно 70, примерно 80, примерно 90 или примерно 95% в сравнении с исходной оценкой.

В некоторых вариантах реализации описанные способы снижают значение одного или более используемых для оценки параметров на 20 ± 5%, 25 ± 5%, 30 ± 5%, 35 ± 5%, 40 ± 5%, 45 ± 5%, 50 ± 5%, 55 ± 5%, 60 ± 5%, 65 ± 5%, 70 ± 5%, 75 ± 5%, 80 ± 5%, 85 ± 5%, 90 ± 5% или 95 ± 5% относительно исходного уровня.

В некоторых вариантах реализации описанные способы значение одного или более используемых для оценки параметров на 20 ± 3%, 25 ± 3%, 30 ± 3%, 35 ± 3%, 40 ± 3%, 45 ± 3%, 50 ± 3%, 55 ± 3%, 60 ± 3%, 65 ± 3%, 70 ± 3%, 75 ± 3%, 80 ± 3%, 85 ± 3%, 90 ± 3%, 95 ± 3% или 97 ± 3% относительно исходного уровня.

В некоторых вариантах реализации описанные способы снижают значение одного или более используемых для оценки параметров на 20% ± 2%, 25% ± 2%, 30% ± 2%, 35% ± 2%, 40 ± 2%, 45 ± 2%, 50 ± 2%, 55 ± 2%, 60 ± 2%, 65 ± 2%, 70 ± 2%, 75 ± 2%, 80 ± 2%, 85 ± 2%, 90 ± 2%, 95 ± 2% или 97 ± 2% относительно исходного уровня.

В некоторых вариантах реализации лечение, которое улучшает состояние пациента, включает снижение общей оценки согласно шкале тяжести БНПС в сравнении с исходной общей оценкой. В некоторых вариантах реализации снижение общей оценки составляет от примерно 20 до примерно 97%, например от примерно 25 до примерно 97%, от примерно 30 до примерно 97%, от примерно 35 до примерно

97%, от примерно 40 до примерно 97%, от примерно 45 до примерно 97%, от примерно 50 до примерно

97%, от примерно 55 до примерно 97%, от примерно 60 до примерно 97%, от примерно 65 до примерно

97%, от примерно 70 до примерно 97%, от примерно 75 до примерно 97%, от примерно 80 до примерно

97%, от примерно 85 до примерно 97%, от примерно 90% до примерно 97%; например от примерно 20 до примерно 95%, от примерно 25 до примерно 95%, от примерно 30 до примерно 95%, от примерно 35 до примерно 95%, от примерно 40 до примерно 95%, от примерно 45 до примерно 95%, от примерно 50 до примерно 95%, от примерно 55 до примерно 95%, от примерно 60 до примерно 95%, от примерно 65 до примерно 95%, от примерно 70 до примерно 95%, от примерно 75 до примерно 95%, от примерно 80 до примерно 95%, от примерно 85 до примерно 95%, от примерно 90% до примерно 95%; например от примерно 20 до примерно 90%, от примерно 25 до примерно 90%, от примерно 30 до примерно 90%, от примерно 35 до примерно 90%, от примерно 40 до примерно 90%, от примерно 45 до примерно 90%, от примерно 50 до примерно 90%, от примерно 55 до примерно 90%, от примерно 60 до примерно 90%, от примерно 65 до примерно 90%, от примерно 70 до примерно 90%, от примерно 75 до примерно 90%, от примерно 80 до примерно 90%, от примерно 85 до примерно 90%; например от примерно 20 до примерно 85%, от примерно 25 до примерно 85%, от примерно 30 до примерно 85%, от примерно 35 до примерно

85%; например от примерно 20 до примерно 80%, от примерно 25 до примерно 80%, от примерно 30 до примерно 80%, от примерно 35 до примерно 80%, от примерно 40 до примерно 80%, от примерно 45 до примерно 80%, от примерно 50 до примерно 80%, от примерно 55 до примерно 80%, от примерно 60 до примерно 80%, от примерно 65 до примерно 80%, от примерно 70 до примерно 80%, от примерно 75 до примерно 80%; например от примерно 20 до примерно 75%, от примерно 25 до примерно 75%, от примерно 30 до примерно 75%, от примерно 35 до примерно 75%, от примерно 40 до примерно 75%, от при

- 39 033892 мерно 45 до примерно 75%, от примерно 50 до примерно 75%, от примерно 55 до примерно 75%, от примерно 60 до примерно 75%, от примерно 65 до примерно 75%, от примерно 70 до примерно 75%; например от примерно 20 до примерно 70%, от примерно 25 до примерно 70%, от примерно 30 до примерно 70%, от примерно 35 до примерно 70%, от примерно 40 до примерно 70%, от примерно 45 до примерно 70%, от примерно 50 до примерно 70%, от примерно 55 до примерно 70%, от примерно 60 до примерно 70%, от примерно 65 до примерно 70%; например от примерно 20 до примерно 65%, от примерно 25 до примерно 65%, от примерно 30 до примерно 65%, от примерно 35 до примерно 65%, от примерно 40 до примерно 65%, от примерно 45 до примерно 65%, от примерно 50 до примерно 65%, от примерно 55 до примерно 65%, от примерно 60 до примерно 65%; например от примерно 20 до примерно 60%, от примерно 25 до примерно 60%, от примерно 30 до примерно 60%, от примерно 35 до примерно 60%, от примерно 40 до примерно 60%, от примерно 45 до примерно 60%, от примерно 50 до примерно 60%, от примерно 55 до примерно 60%; например от примерно 20 до примерно 55%, от примерно 25 до примерно 55%, от примерно 30 до примерно 55%, от примерно 35 до примерно 55%, от примерно 40 до примерно 55%, от примерно 45 до примерно 55%, от примерно 50 до примерно 55%; например от примерно 20 до примерно 50%, от примерно 25 до примерно 50%, от примерно 30 до примерно 50%, от примерно 35 до примерно 50%, от примерно 40 до примерно 50%, от примерно 45 до примерно 50%; например от примерно 20 до примерно 45%, от примерно 25 до примерно 45%, от примерно 30 до примерно 45%, от примерно 35 до примерно 45%, от примерно 40 до примерно 45%; например от примерно 20 до примерно 40%, от примерно 25 до примерно 40%, от примерно 30 до примерно 40%, от примерно 35 до примерно 40%; например от примерно 20 до примерно 35%, от примерно 25 до примерно 35%, от примерно 30 до примерно 35%; например от примерно 20 до примерно 30%, от примерно 25 до примерно 30% или, например от примерно 20 до примерно 25% в сравнении с исходной общей оценкой. Например, снижение общей оценки согласно шкале тяжести БНПС может составлять примерно 20, примерно 25, примерно 30, примерно 35, примерно 40, примерно 45, примерно 50, примерно 55, примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, примерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 95 или примерно 97 в сравнении с исходной общей оценкой.

В некоторых вариантах реализации описанные способы снижают общую оценку на 20 ± 5%, 25 ± 5%, 30 ± 5%, 35 ± 5%, 40 ± 5%, 45 ± 5%, 50 ± 5%, 55 ± 5%, 60 ± 5%, 65 ± 5%, 70 ± 5%, 75 ± 5%, 80 ± 5%, 85 ± 5%, 90 ± 5% или 95 ± 5% относительно исходного общего уровня.

В некоторых вариантах реализации описанные способы снижают общую оценку на 20 ± 3%, 25 ± 3%, 30 ± 3%, 35 ± 3%, 40 ± 3%, 45 ± 3%, 50 ± 3%, 55 ± 3%, 60 ± 3%, 65 ± 3%, 70 ± 3%, 75 ± 3%, 80 ± 3%, 85 ± 3%, 90 ± 3%, 95 ± 3% или 97 ± 3% относительно исходного общего уровня.

В некоторых вариантах реализации описанные способы снижают общую оценку на 20 ± 2%, 25 ± 2%, 30 ± 2%, 35 ± 2%, 40 ± 2%, 45 ± 2%, 50 ± 2%, 55 ± 2%, 60 ± 2%, 65 ± 2%, 70 ± 2%, 75 ± 2%, 80 ± 2%, 85 ± 2%, 90 ± 2%, 95 ± 2% или 97 ± 2% относительно исходного общего уровня.

В некоторых вариантах реализации поддерживающая фаза, в которой состояние пациента поддерживают постоянным, включает поддержание значения используемого для оценки параметра согласно шкале тяжести БНПС в диапазоне значений, сопоставимых с исходным значением. В некоторых вариантах реализации поддержание значения относится к значению в пределах примерно 15%, например в пределах примерно 10 или примерно 5% от значения на исходном уровне.

В некоторых вариантах реализации описанные способы приводят к значению, которое находится в пределах 5 ± 3%, 10 ± 3% или 15 ± 3% относительно исходного значения. В некоторых вариантах реализации описанные способы приводят к значению, которое находится в пределах 5 ± 2%, 10 ± 2% или 15 ± 2% относительно исходного значения.

В некоторых вариантах реализации поддерживающая фаза, в которой состояние пациента поддерживают постоянным, включает поддержание общей оценки согласно шкале тяжести БНПС в диапазоне значений, сопоставимых с исходной общей оценкой. В некоторых вариантах реализации поддержание общей оценки относится к общей оценке в пределах примерно 15%, например в пределах примерно 10 или примерно 5% от общей оценки на исходном уровне.

В некоторых вариантах реализации описанные способы приводят к общей оценке, которая находится в пределах 5 ± 3%, 10 ± 3% или 15 ± 3% относительно исходной общей оценки. В некоторых вариантах реализации описанные способы приводят к общей оценке, которая находится в пределах 5 ± 2%, 10 ± 2% или 15 ± 2% относительно исходной общей оценки.

Другие меры, которые могут быть применены для характеристики эффективности способов согласно настоящему описанию, включают глобальную область, включающую слепую общую клиническую оценку изменений врачом (CGI-Clinician) или общую клиническую оценку изменений лицом, осуществляющим уход (CGI-Caregiver) после лечения, тест на время Встань и иди (TUG), тест с 9 отверстиями и стержнями (9-HPT), показатели качества жизни, такие как оценка Национальных институтов здравоохранения США PROMIS-PRO (Система информации об оценке исходов пациентами - исходы по оценке пациентов) качества жизни лицом, осуществляющим уход.

Способы согласно настоящему описанию могут быть охарактеризованы клиническими мерами без

- 40 033892 опасности, которые включают одно или более из: характеристики и тяжести клинических неблагоприятных явлений; аудиологического тестирования, например, с помощью теста АСВП; клинических лабораторных исследований, например гематологии, клинической химии, коагуляции, анализа мочи, анализа СМЖ; показателей жизненно важных функций; результатов физического и неврологического обследования и электрокардиограмм.

6.3.5. Лечение других лизосомных болезней накопления.

Как показано в примере 8 (см. раздел 5.8.2.5), смеси гидроксипропил-бета-циклодекстринов, описанные в настоящем описании, оказывают значительное влияние на гены, связанные с аутофагией, демонстрируя, что фармацевтически активный ингредиент и фармацевтические композиции, описанные в настоящем описании, будут эффективны в улучшении некоторых последствий нарушений при других лизосомных болезнях накопления.

Соответственно в другом аспекте представлены способы для лечения лизосомных болезней накопления, отличных от болезни Ниманна-Пика типа С (БНПС), включающие введение субъекту, имеющему лизосомную болезнь накопления, отличную от БНПС, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, как описано в настоящем описании.

В различных вариантах реализации лизосомная болезнь накопления выбрана из аспартилглюкозаминурии, болезни Вольмана, цистиноза, болезни Данона, болезни Фабри, болезни Фарбера, фукозидоза, болезни Гоше, GM1-ганглиозидоза типов I/II/III, GM2-ганглиозидоза, альфа-маннозидоза типов I/II, бетаманнозидоза, метахроматической лейкодистрофии, сиалидоза типов I/II, муколипидоза типа IV, синдрома Шейе, синдрома Хантера, синдрома Санфилиппо А, синдрома Санфилиппо В, синдрома Санфилиппо С, синдрома Санфилиппо D, галактосиалидоза типов I/II, болезни Краббе, болезни Сандхоффа, болезни Шпильмейера-Фогта, синдрома Херлера, болезни Ниманна-Пика, отличной от болезни Ниманна-Пика типа С, болезни I-клеток (муколипидоза типа II), псевдополидистрофии Гурлер, синдрома Моркио, синдрома Марото-Лами, синдрома Слая, мукополисахаридоза типа IX, множественной сульфатазной недостаточности, болезни Баттена, болезни Тея-Сакса, болезни Помпе, болезни Баттена, болезни Баттена позднего детского возраста (late infantile), северной эпилепсии, пикнодизостоза, болезни Шиндлера, сиалурии и болезни Салла.

В некоторых вариантах реализации лизосомная болезнь накопления представляет собой болезнь Тея-Сакса, сфинголипидозы, болезнь Гоше, муколипидоз, галактосиалидоз, болезнь Салла, цистиноз, болезнь Данона, болезнь Фабри, болезнь Фарбера, липофусцинозы, болезнь Помпе, ганглиозидоз, болезни накопления сиаловой кислоты детского возраста (ISSD), болезнь Краббе, болезнь Ниманна-Пика, отличную от БНПС, лейкодистрофию, болезнь Гурлер, болезнь Шейе, болезнь Хантера, болезнь Санфилиппо, болезнь Сандхоффа, болезнь Шиндлера, болезнь Баттена или болезнь Вольмана.

В дополнительном варианте реализации лизосомная болезнь накопления представляет собой болезнь Ниманна-Пика, отличную от БНПС, болезнь Тея-Сакса, болезнь Фабри, болезнь Фарбера, болезнь Санфилиппо, болезнь Баттена или болезнь Вольмана.

7. Примеры

Следующие примеры представлены в качестве пояснения и иллюстрации, а не ограничения.

7.1. Пример 1. Клиническое исследование фазы I для болезни Ниманна-Пика типа C.

Клиническое исследование фазы I было инициировано NIH с применением поставляемых на рынок смесей гидроксипропил-бета-циклодекстринов для парентерального введения в соответствии со следующим протоколом.

7.1.1. Протокол.

В этом нерандомизированном открытом одноцентровом исследовании фазы I, проводимом NIH, гидроксипропил-бета-циклодекстрин (Kleptose® HPB, Roquette) вводят когортам, каждая из которых состоит из 3 пациентов, ранее не получавших медикаментозного лечения, интратекально путем люмбальной инъекции в начальных дозах, составляющих 200 мг, с последующим повышением до 300, 400 и 900 мг. Все пациенты в когорте (три пациента на когорту) получают ГП-бета-ЦД один раз в месяц в количестве по меньшей мере двух доз, и решение об увеличении дозы основывается на безопасности и биохимических данных. Последующие повышения дозы осуществляют с приращениями до 300 мг. Безопасность оценивают на основании неблагоприятных явлений (НЯ), аудиологической оценки, клинических лабораторных исследований, показателей жизненно важных функций, физического обследования, рентгенограммы грудной клетки, электрокардиограмм (ЭКГ). Биохимическую эффективность измеряют на основании изменений 24^)-ГХ в плазме относительно исходных значений. Фармакокинетику (ФК) оценивают для ГП-бета-ЦД в плазме.

7.1.2. Лекарственный продукт (Kleptose® HPB).

Продукт гидроксипропил-бета-циклодекстринов, который применяли в этом клиническом исследовании фазы I, представлял собой Kleptose® HPB (Roquette, Франция) с DS_a, составляющей примерно 4,34 ± 10%.

7.1.3. Критерии включения.

Критериями правомерности включения пациента являлось следующее.

- 41 033892

1) Возраст старше или равен 2 и менее или равен 25 годам на момент включения, любого пола и любой этнической принадлежности.

2) Диагноз БНПС1, основанный на одном из следующего:

a) две мутации NPC1;

b) положительный результат теста на окраску филиппином и по меньшей мере одна мутация NPC1;

c) вертикальный надъядерный паралич взора (ВНПВ) в комбинации с любым:

i) одна мутация NPC1 или ii) положительный результат теста на окраску филиппином и отсутствие мутаций NPC2.

3) Пациенты по меньшей мере с одним неврологическим проявлением БНПС1. Например, но не ограничиваясь ими, потерей слуха, вертикальным надъядерным параличом взора, атаксией, деменцией, дистонией, судорогами, дизартрией или дисфагией.

4) Возможность неоднократно прибывать в КЦ NIH для оценки и последующего наблюдения.

5) В случае приема миглустата пациент должен принимать постоянную дозу лекарственного средства в течение не менее 3 месяцев до исходной оценки и должен быть готов поддерживать этот уровень дозы на протяжении всего исследования.

6) Готовность прекратить прием всех безрецептурных добавок, за исключением поливитаминов, соответствующих возрасту.

7) Женщины репродуктивного возраста должны быть готовы использовать эффективный способ контрацепции на протяжении всего исследования.

8) Готовность участвовать во всех аспектах дизайна исследования, включая периодическое взятие крови и СМЖ.

7.1.4. Критерии исключения.

Критериями правомерности исключения пациента являлось следующее.

1) Возраст младше 2 или старше 25 лет при включении в исследование.

2) Субъекты исключаются, если их масса может привести к уровню эндотоксина, превышающему 0,2 ЭЕ/кг при введении солевого раствора или лекарственного средства.

3) Тяжелые проявления БНПС1, которые мешали бы способности пациента соблюдать требования данного протокола.

4) Пациенты без неврологических симптомов.

5) Пациенты, получавшие любую форму циклодекстрина при попытке лечения БНПС1. Лечение с применением другого лекарственного препарата по другому медицинскому показанию, содержащего циклодекстрин в качестве вспомогательного вещества, не приводит к исключению пациента.

6) Реакции гиперчувствительности к циклодекстрину или компонентам состава в анамнезе.

7) Беременность или грудное вскармливание в любое время во время исследования.

8) Пациенты с подозрением на инфекцию ЦНС или любую системную инфекцию.

9) Деформация позвоночника, которая могла бы повлиять на возможность проведения люмбальной пункции.

10) Инфекция кожи в поясничной области.

11) Нейтропения, определяемая как абсолютное количество нейтрофилов (АКН) менее 1500.

12) Тромбоцитопения (количество тромбоцитов менее 75000 на 1 мм³).

13) Подтверждение нарушения циркуляции СМЖ.

14) Противопоказания к анестезии.

15) Предшествующее применение антикоагулянтов или анамнез/наличие нарушения свертываемости крови с повышенным риском клинического кровотечения или MHO более 2.

16) Пациенты с клиническим подтверждением острого заболевания печени, имеющие симптомы желтухи или боль в правом верхнем квадранте.

17) Наличие анемии, определяемое как два стандартных отклонения ниже нормы согласно возрасту и полу.

18) Для субъектов в возрасте 18 лет и старше СКФ автоматически рассчитывается и сообщается лабораторией КЦ NIH с использованием формулы CKD-EPI-креатинин 2009. Субъектов в возрасте 18 лет или старше исключают, если СКФ менее или равна 60 мл/мин/1,73 м². Для субъектов в возрасте < 18 лет используют калькулятор NKDEP (http://www.nkdep.nih.gov/lab-evaluation/gfr-calculators/childrenconventional-unit.shtml). Результаты представляют как > 75 мл/мин /1,73 м² или ниже. Субъектов в возрасте < 18 лет исключают, если СКФ менее или равна 75,15 мл/мин/1,73 м².

19) Гематурия по одному анализу мочи, определенная Американской ассоциацией урологов (AUA) как пять или более красных клеток крови в поле зрения под большим увеличением (или > 25/мкл) при микроскопической оценке осадка мочи из образца мочи для анализа, собранного надлежащим образом. Пациент не будет исключен, если 2 последующих образца мочи будут иметь отрицательный результат анализа на гематурию в соответствии с определением AUA.

20) Протеинурия (белок 1+ при анализе мочи), если только она не оценена и не классифицирована как доброкачественная первичным медицинским учреждением пациента или консультантом NIH по нефрологии или в контексте нормального отношения белок-креатинин в моче и при отсутствии клинических

- 42 033892 симптомов (отека, гипертонии).

21) Активное заболевание легких, потребность в кислороде или клинически значимый анамнез сниженного насыщения крови кислородом, легочная терапия или необходимость активного дренажа.

22) Пациенты, неспособные пройти поведенческую аудиологическую оценку, включая оценку порога чистого тона (от 500 до 8000 Гц) для контроля ототоксичности, и для которых не может быть надежно получена ОАЭ (отоакустическая эмиссия) на исходном уровне.

23) Пациенты с продолжающимися судорогами, которые нестабильны по частоте, типу или продолжительности в течение 2-месячного периода перед включением, которым требуется изменение дозы противоэпилептических лекарственных средств (отличных от корректировки на массу) в течение 2месячного периода перед включением или которым требуется 3 или более противоэпилептических лекарственных средств для контроля судорог.

24) Пациенты, которые по мнению исследователей не могут соблюдать протокол или имеют определенные проблемы со здоровьем, которые потенциально могли бы увеличить риск участия.

7.1.5. Первоначальный анализ клинических данных.

Первоначальные данные этого исследования наряду с дополнительными данными по индивидуальным IND в другой организации, где также используют интратекальное введение Kleptose® HPB (IIND), анализировали следующим образом.

7.1.5.1. Обобщенный анализ первоначальных данных.

Авторы изобретения провели анализ, чтобы изучить скорость изменения оценки клинической тяжести БНПС и ее основных проявлений в совокупности данных, которые включают как субъектов NIH, так и трех субъектов из исследования I-IND в другой организации. Основные выводы перечислены ниже.

При сравнении табл. 2 и 3 (см. ниже) доза препарата влияет на скорость изменения оценки клинической тяжести БНПС и ее проявлений с наиболее глубокими изменениями, наблюдаемыми для слуха.

Циклодекстрин в целом понижает скорость снижения оценки клинической тяжести БНПС и ее компонентов (табл. 4) (ниже). Это справедливо для всех компонентов, за исключением движения глаз, слуха и судорог.

При ограничении до сравнения циклодекстрина с исследованием NIH естественного течения для субъектов NIH (табл. 5) распределение также согласуется с тем, что снижение в группе циклодекстрина происходит с меньшей скоростью, за исключением движения глаз.

Результаты первоначального анализа данных клинических исследований фазы I обобщены на фиг. 2 и 3.

7.1.5.2. Методы анализа.

Цель анализа, приведенного ниже, заключалась в том, чтобы понять изменения с течением времени у двенадцати субъектов исследования NIH фазы 1 (идентификаторы которых начинаются с CDA) и трех субъектов из другого исследовательского центра, также получающих лечение с интратекальным применением Kleptose® HPB (идентификаторы которых начинаются с I-IND). Следующие результаты относятся к 15 субъектам, получавшим гидроксипропил-бета-циклодекстрин. Субъекты CDA113 и CDA114 не включены в следующий анализ, поскольку они еще не получили дозу гидроксипропил-бетациклодекстрина. Четыре (4) из 15 субъектов имеют доступные данные на исходном уровне и через 6 месяцев (субъекты CDA110, CDA111, CDA112 и I-IND-3); остальные 11 субъектов имеют доступные данные на исходном уровне через 6 и 12 месяцев (CDA101-CDA109, I-IND-1).

Авторы настоящего изобретения использовали линейную смешанную модель для получения углового коэффициента изменений с течением времени. Слово смешанная в линейной смешанной модели использовано для обозначения того факта, что модель включает как фиксированные, так и случайные эффекты. Случайная часть модели учитывает повторные измерения для каждого субъекта, или лонгитудинальный характер данных. Фиксированная часть модели предоставляет оценку среднего изменения за период времени, которое представляет собой угловой коэффициент изменения. Такой подход является целесообразным, поскольку он задействует все собранные данные, а эффект взаимодействия позволяет исследовать разные скорости изменения в группах. Эта модель представляет собой сглаживание с учетом неструктурированной корреляционной матрицы, что означает, что не было сделано никаких предположений о корреляции между множественными измерениями и каждая корреляция была оценена. В будущем анализе к приведенным ниже моделям могут быть добавлены ковариаты для исследования эффектов ковариат, таких как доза.

Авторы настоящего изобретения вычислили диагностические критерии регрессии для каждой модели, представленной в этом анализе, и использовали расстояние Кука (Cook's D) для идентификации потенциальных выбросов/выделяющихся наблюдений, перестраивая модели, где были идентифицированы выбросы/выделяющеся наблюдения (примечание: выброс/выделяющееся наблюдение определено как наблюдение со значением расстояния Кука, составляющим 0,4 или более). Авторы настоящего изобретения выбрали расстояние Кука в качестве исследуемого диагностического критерия, поскольку оно включает как исход, так и любые ковариаты для выявления потенциальных выбросов. Когда выбросы идентифицированы, представляют два набора моделей; первая представленная модель основана на полном

- 43 033892 наборе данных, в то время как второй набор моделей основан на данных с удаленными выбросами. Для этого анализа авторы настоящего изобретения удалили все значения субъекта I-IND-1, а не только исходное значение. Эти значения представлены в последних двух колонках табл. 2 и 3. Следует заметить, что результаты, полученные из этих двух анализов, могут быть совершенно различными вследствие относительно небольшого размера выборки из 15 субъектов в исследовании фазы 1 и в общей сложности 41 наблюдения, включенного в модели (когда включен полный набор данных).

Авторы настоящего изобретения также использовали тот же подход для сравнения субъектов фазы 1 с набором данных NIH для естественного течения. Набор данных NIH для естественного течения описан в источнике Yanjanin et al., Linear Clinical Progression, Independent of Age of Onset, in Niemann-Pick Disease, Type C, Am. J. Med. Genet. Part B 153B:132-140(2010).

Для анализа, представленного в настоящем описании, авторы настоящего изобретения построили эталонные модели для субъектов, получавших циклодекстрин (представлены в табл. 2). Для этого анализа авторами настоящего изобретения представлено расчетное изменение соответствующего исхода БНПС за период времени, составляющий один год. В табл. 3 авторами настоящего изобретения пред ставлены результаты для среднего изменения за период времени, в течение которого контролировали получаемую дозу. В табл. 4 и 5 представлены модели, в которых сравнивают субъектов, получавших циклодекстрин, с субъектами сопоставимого возраста в исследовании NIH для естественного течения. Представленные результаты представляют собой угловой коэффициент для каждой из двух групп и pзначение для проверки равенства угловых коэффициентов между двумя группами.

7.1.5.3. Изменения с течением времени у субъектов, получающих циклодекстрин.

В табл. 2 представлен средний угловой коэффициент для общей оценки БНПС и каждого из ее компонентов для 15 субъектов, которые получали по меньшей мере одну дозу циклодекстрина. Эти результаты предоставляют информацию о скорости изменения исхода в течение одного года. Эти скорости меньше, чем те, которые наблюдали в полной популяции естественного течения, которая была представлена в предыдущем анализе. Примечание: авторы настоящего изобретения удалили исходные данные для одного субъекта I-IND, имевшего общую оценку, составляющую 31, общую оценку, составляющую 31 без учета слуха, значение параметра ходьбы 4, глотания 3, мелкой моторики 4 и когнитивной деятельности 4. В целом, с течением времени состояние этого субъекта улучшилось. Кроме того, значение для одного субъекта NIH представляло собой выброс в анализе движения глаз вследствие того, что данное значение было высоким и составляло 5 для этого параметра. Анализ для полного набора данных представлен в колонках 2 и 3, а результаты, полученные при удалении выбросов, представлены в колонках 4 и 5.

Таблица2

Среднее изменение за период времени (в годах) для оценки БНПС и ее компонентов для субъектов в исследованиях фазы 1

Оценка БНПС_______Ср. изменение за р-_________Ср. изменение за период р-________ период времени в значение времени в годах без учета значение годах (ст. ошибка) субъекта I-IND-1 (ст. ошибка)

Общая оценка	0,74	(0,59)	0,22	1,16	(0,42)	0,01
Общая оценка без учета слуха	0,31	(0,62)	0,62	0,89	(0,44)	0,06
Общая оценка без учета слуха и АСП^а	-0,02	(0,64)	0,97	0,61	(0,46)	0,19
Ходьба	0,001	(0,16)	0,99	0,19	(0,Ю)	0,07
Мелкая	0,002	(0,08)	0,98	0,002	(0,09)	0,98
моторика
Когнитивная	-0,04	(0,06)	0,47	-0,05	(0,06)	0,47
деятельность
Глотание	-0,10	(0,27)	0,71	0,15	(0,19)	0,43
Движение глаз^ь	0,24	(0,17)	0,18	0,26	(0,12)	0,66
Речь	-0,16	(0,15)	0,29	-0,08	(0,15)	0,57
Слух	0,44	(0,18)	0,02	-0,29	(0,15)	0,07
Память	-0,04	(0,13)	0,77	0,05	(0,12)	0,69
Судороги	Модель нестабильна	-	-		-

Примечания:

a. После удаления одного дополнительного выброса получали 0,20 (0,35) и р-значение 0,57.

b. После удаления оценки движения глаз, составляющей 5, получали 0,05 (0,13) и р-значение

0,67 (CDA105).____________________________________________________________________________

Табл. 3 содержит результаты анализа, которые включают дозу в качестве части модели. Эти модели предоставляют информацию о влиянии дозы лекарственного средства. Следует обратить внимание на это влияние в отношении слуха. Когда доза включена в модель, угловой коэффициент для изменения с тече нием времени уже не является значимым.

- 44 033892

Таблица 3

Среднее изменение за период времени (в годах) для оценки БНПС и ее компонентов . для субъектов в исследованиях фазы 1 с учетом дозы

	Ср. изменение за	Ср. изменение за период времени в годах без учета
Показатель	период времени в	р-	субъекта I-IND-1
БНПС	годах (ст. ошибка)	значение (ст. ошибка)		р-значение
Общая оценка³	1,79	(1,59)	0,27	0,81	(1,12)	0,48
Общая оценка без учета слуха^ь	1,50	(1,67)	0,38	0,61	(1,18)	0,61
Общая оценка без учета слуха и АСП^С	0,93	(1,73)	0,60	0,07	(1,21)	0,95
Ходьба Мелкая	0,41 -0,10	(0,43) (0,22)	0,35 0,65	0,19 -0,10	(0,26) (0,24)	0,47 0,69
моторика

	0,13	(0,15)	0,41	0,14	(0,16)	0,38
деятельность³
Глотание	0,49	(0,70)	0,49	0,10	(0,50)	0,85
Движение	0,16	(0,45)	0,73	0,20	(0,47)	0,68
глаз^е
Речь	-0,09	(0,39)	0,83	-0,16	(0,38)	0,68
Слух	0,40	(0,49)	0,43	0,27	(0,40)	0,52
Память	-0,22	(0,35)	0,59	-0,33	(0,31)	0,30
Судороги	Модель нестабильна	-		-	-
Примечания:
a. После удаления одного дополнительного выброса получали 1,09 (0,85) с р-значением 0,22. b. После удаления одного дополнительного выброса получали 0,91 (0,90) с р-значением 0,32. c. После удаления одного дополнительного выброса получали 0,38 (0,92) с р-значением 0,42.
d. Дополнительные выбросы после удаления	I-IND-1; однако	модель не сходится после
удаления этих выбросов.
е. После удаления оценки	движения	глаз субъекта CDA105	за 1 год, составляющей 5,
получали 0,30 (0,32) с р-значением 0,37.

7.1.5.4. Сравнение субъектов фазы 1 и I-IND с соответствующими субъектами в исследовании есте ственного течения.

Для лучшего понимания эффекта циклодекстрина авторы настоящего изобретения сравнили субъектов в исследованиях фазы 1 и I-IND с субъектами сравнимого возраста NIH в исследовании естественного течения. Для этого сравнения авторы настоящего изобретения ограничили набор данных до субъектов возрастом от 6 до 26 лет, для которых были получены результаты более чем в один момент времени. Авторы настоящего изобретения построили смешанную модель со временем, группой лечения и временем по эффекту взаимодействия групп лечения в модели. Результаты этого анализа представлены ниже в табл. 4.

Результаты, представленные в табл. 4, согласуются с более медленной скоростью изменения в группе циклодекстрина в сравнении с популяцией естественного течения за исключением подпунктов движения глаз и слуха.

Таблица 4 Среднее изменение за период времени отдельно для применения циклодекстринов у субъектов NIH фазы 1, NIH естественного течения и I-IND

Ср. изменение за
Оценка БНПС	Ср. изменение за период времени в годах (ст. ошибка) для группы циклодекстрина	период времени в годах (ст. ошибка) для исследования естественного течения	p-значение для различия в угловых коэффициентах между двумя группами
Общая оценка	0,74	(0,67)	2,53	(0,27)	0,02
Общая оценка без учета слуха	0,31	(0,68)	2,36	(0,27)	0,01
Общая оценка без учета слуха иАСП	-0,02	(0,69)	2,23	(0,28)	0,004
Ходьба	0,001	(0,18)	0,27	(0,07)	0,18
Мелкая	0,03	(0,Ю)	0,11	(0,04)	0,34

- 45 033892

моторика
Когнитивная	-0,04	(0,16)	0,31	(0,06)	0,04
деятельность
Речь	-0,16	(0,13)	0,09	(0,05)	0,09
Движение глаз	0,22	(0,16)	0,08	(0,06)	0,42
Глотание	-0,11	(0,23)	0,20	(0,09)	0,22
Слух	0,44	(0,16)	0,17	(0,06)	0,13
Память	-0,04	(0,12)	0,18	(0,05)	0,10
Судороги	не определено	не определено	не определено

7.1.5.5. Сравнение субъектов фазы 1 с соответствующими субъектами в исследовании естественного течения.

Для лучшего понимания эффекта циклодекстрина в пределах популяции NIH авторы настоящего изобретения сравнили субъектов в исследованиях фазы 1 с субъектами сравнимого возраста в исследовании естественного течения. Для этого сравнения авторы настоящего изобретения ограничили набор данных до субъектов возрастом от 6 до 26 лет, для которых были получены результаты более чем в один момент времени. Авторы настоящего изобретения построили смешанную модель со временем, группой лечения и временем по эффекту взаимодействия групп лечения в модели. В таблице ниже представлены результаты этого анализа, которые аналогичны результатам в табл. 4. Следует обратить внимание, что исход судорог несколько нестабилен вследствие нескольких выбросов. Представлены результаты только полного набора данных. За исключением движения глаз, все значения показателей в группе циклодекстрина меньше, чем в исследовании естественного течения.

Таблица 5

Среднее изменение с течением времени отдельно для применения циклодекстринов у субъектов NIH фазы 1 и NIH естественного течения

Показатель	Ср. изменение за период времени в годах (ст. ошибка) для группы	Ср. изменение за период времени в годах (ст. ошибка) для для исследования	p-значение для различия в угловых коэффициентах между
БНПС	циклодекстринов	естественного течения	двумя группами
Общая оценка	1,16	(0,68)	2,53	(0,24)	0,06
Общая оценка	1,06	(0,66)	2,36	(0,24)	0,08
без учета слуха
Общая оценка	0,86	(0,68)	2,23	(0,24)	0,06
без учета слуха
иАСП
Ходьба	0,21	(0,18)	0,27	(0,06)	0,78
Мелкая	0,06	(0,П)	0,11	(0,04)	0,66
моторика
Когнитивная	-0,05	(0,18)	0,31	(0,07)	0,07
деятельность
Речь	-0,10	(0,14)	0,09	(0,05)	0,24
Движение глаз	0,32	(0,18)	0,08	(0,06)	0,21
Глотание	0,17	(0,21)	0,20	(0,08)	0,88
Слух^а	0,11	(0,12)	0,17	(0,04)	0,66
Память	0,06	(0,13)	0,18	(0,05)	0,38
Судороги	не определено	не определено	не определено

Примечания:

а. В этой модели были обнаружены и удалены выбросы для получения меньших значений углового коэффициента в группе естественного течения.

7.1.5.6. Анализ, включающий сравнение только тех субъектов, которые когда-либо применяли миг лустат.

Результаты, представленные ниже, включают субъектов, которые применяли миглустат в течение периода времени. Они включают восемь субъектов из исследования естественного течения и 14 субъектов из исследования фазы 1. Авторы настоящего изобретения повторили анализы, представленные в табл. 4, для этой популяции. Эти результаты представлены в табл. 6 ниже.

- 46 033892

Таблица 6

Среднее изменение за период времени отдельно для применения циклодекстринов у субъектов NIH фазы 1 и NIH естественного течения, сообщивших о применении миглустата

Ср. изменение за период времени в

Ср. изменение за годах (ст. ошибка) p-значение для различия период времени в годах для для исследования в угловых

Показатель (ст. ошибка) для группы естественного коэффициентах между

БНПС	циклодекстринов	течения	двумя группами
Общая оценка	0,71	(0,67)	2,58	(0,24)	0,01
Общая оценка	0,59	(0,66)	2,39	(0,23)	0,01
без учета слуха
Общая оценка	0,37	(0,67)	2,25	(0,24)	0,01
без учета слуха
иАСП
Ходьба	0,12	(0,16)	0,26	(0,06)	0,38
Мелкая	0,06	(0,Ю)	0,08	(0,04)	0,89
моторика
Когнитивная	-0,07	(0,21)	0,33	(0,07)	0,09
деятельность
Речь	-0,23	(0,14)	0,08	(0,05)	0,05
Движение глаз	0,12	(0,П)	0,05	(0,04)	0,55
Глотание	0,07	(0,22)	0,20	(0,08)	0,58
Слух	0,13	(0,14)	0,19	(0,05)	0,68
Память	0,06	(0,15)	0,21	(0,05)	0,38

Судороги не определено не определено не определено

Ниже в табл. 7 представлены результаты, которые включают только субъектов NIH. Три субъекта исследования I-IND удалены из этого сравнения. Результаты, представленные здесь, аналогичны результатам, представленным выше в табл. 5. Разница между двумя популяциями заключается в том, что пять субъектов NIH в исследовании естественного течения и один субъект NIH в исследовании фазы 1 были удалены из популяции, поскольку эти субъекты сообщили, что не применяли миглустат ни в какой пери од времени.

Таблица 7 Среднее изменение за период времени отдельно для применения циклодекстринов у субъектов как NIH фазы 1, так и I-IND, сообщивших о применении миглустата

Ср. изменение за период времени в
	Ср. изменение за	годах (ст. ошибка)	p-значение для различия
	период времени в годах	для для исследования	в угловых
Показатель	(ст. ошибка) для группы	естественного	коэффициентах между
БНПС	циклодекстринов	течения	двумя группами
Общая оценка	0,34 (0,67)	2,58 (0,27)	0,004
Общая оценка	-0,13 (0,68)	2,39 (0,27)	0,001

без учета слуха Общая оценка без учета слуха иАСП	-0,49	(0,69)	2,25	(0,28)	0,001
Ходьба	-0,10	(0,17)	0,26	(0,07)	0,06
Мелкая	0,002	(0,Ю)	0,08	(0,04)	0,48
моторика
Когнитивная	-0,04	(0,17)	0,33	(0,07)	0,06
деятельность
Речь	-0,27	(0,13)	0,08	(0,05)	0,01
Движение глаз	0,05	(0,П)	0,05	(0,04)	0,97
Глотание	-0,21	(0,24)	0,20	(0,Ю)	0,13
Слух	0,48	(0,18)	0,19	(0,07)	0,15
Память	-0,04	(0,14)	0,21	(0,06)	0,10
Судороги	не определено	не определено	не определено

7.1.6. Дополнительный анализ клинических данных.

Дополнительный анализ проводили на том же наборе данных клинических исследований NIH, но с 4 точками данных, включенными в набор контрольных данных, которые не были включены в анализ, описанный выше. Этот анализ обобщен на фиг. 4-6 и 8.

7.2. Пример 2. Стандартный анализ лекарственного продукта.

Продукт гидроксипропил-бета-циклодекстрина, используемый в клиническом исследовании фазы I, описанном в примере I, представлял собой Kleptose® HPB (Roquette, Франция) с DS_a, составляющей

- 47 033892 примерно 4,34 ± 10%. Стандартный анализ иллюстративных партий Kleptose® HPB, выполненный производителем, представлен на следующих 4 страницах.

Субстанция KLEPTOSE® HPB (иллюстративная партия 1).

Определение:

ГИДРОКСИПРОПИЛ БЕТА ДЕКС представляет собой частично замещенный полигидроксипропиловый эфир бетадекса.

CAS п°: 128446-35-5

EINECS: 420-920-1

INCI: ГИДРОКСИПРОПИЛ-ЦИКЛОДЕКСТРИН

Спецификация.

А) Описание.

ВНЕШНИЙ ВИД Белый или почти белый аморфный или кристаллический порошок.

РАСТВОРИМОСТЬ Легко растворим в воде и пропиленгликоле.

В) Подлинность.

ИСПЫТАНИЕ НА ПОДЛИННОСТЬ А ИСПЫТАНИЕ НА ПОДЛИННОСТЬ В

EP-USP/NF

См. испытание

С) Анализ.

ИК-СПЕКТРОСКОПИЯ	EP-USP/NF	Соответствует
ВНЕШНИЙ ВИД РАСТВОРА	EP-USP/NF	Прозрачный,
		бесцветный
ПРОВОДИМОСТЬ	EP-USP/NF	200 мкСм/см макс.
СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ПРИМЕСИ
-ПРИМЕСЬ А: БЕТА-ЦИКЛОДЕКСТРИН	ЕР	1,5	% макс.
-ПРИМЕСЬ А: БЕТА-ЦИКЛОДЕКСТРИН	USP/NF	1,5	% макс.
-ПРИМЕСЬ В: ПРОПАН-1,2-ДИОЛ	ЕР	2,5	% макс.
-ПРИМЕСЬ В: ПРОПАН-1,2-ДИОЛ	USP/NF	2,5	% макс.
-СУММА ПРИМЕСЕЙ, ОТЛИЧНЫХ ОТ А	ЕР	1,0	% макс.
-ЛЮБАЯ ДРУГАЯ ПРИМЕСЬ	USP/NF	0,25	% макс.
-ОБЩЕЕ СОДЕРЖАНИЕ ДРУГИХ	USP/NF	1	% макс.
ПРИМЕСЕЙ
ТЯЖЕЛЫЕ МЕТАЛЛЫ	EP-USP/NF	20 ppm макс.
ПОТЕРЯ В МАССЕ ПРИ	EP-USP/NF	10,0	% макс.
ВЫСУШИВАНИИ
МОЛЯРНОЕ ЗАМЕЩЕНИЕ	EP-USP/NF	0,40-	1,50
ПРОПИЛЕНОКСИД (**)	USP/NF	0,0001	%
МИКРОБНАЯ КОНТАМИНАЦИЯ:
-ОБЩЕЕ ЧИСЛО АЭРОБНЫХ	EP-USP/NF	100 КОЕ/г макс.
МИКРООРГАНИЗМОВ
-ОБЩЕЕ ЧИСЛО ДРОЖЖЕЙ И	EP-USP/NF	100 КОЕ/г макс.

ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ * Сведения о соответствии - испытание не проводилось. ** План мониторинга.

EP-USP/NF EP-USP/NF

ESHCERICHIA SALMONELLA

Отсутствие в 10 г

Отсутствие в 10 г.

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОКСИНЫ

Характерные значения:

НОМИНАЛЬНОЕ ЗНАЧЕНИЕ

МОЛЯРНОГО ЗАМЕЩЕНИЯ

МОЛЯРНОЕ ЗАМЕЩЕНИЕ (МЗ)

EP-USP/NF

МЕ/г макс.

0,62

0,58-0,68

ВНУТРЕННИЕ ТРЕБОВАНИЯ К СПЕЦИФИЧЕСКИМ ПРИМЕСЯМ:

ПРИМЕСЬ А: БЕТА-ЦИКЛОДЕКСТРИН

ПРИМЕСЬ В: ПРОПАН-1,2-ДИОЛ

ЛЮБАЯ ДРУГАЯ ПРИМЕСЬ

РАЗМЕР ЧАСТИЦ:

ОСТАТОК НА 315 мкм

ОСТАТОК НА 100 мкм

собственная методика	1,0	% макс.
(/сот)
собственная методика (/сот)	0,5	% макс.
собственная методика (/сот)	ОД	% макс.
Сито
	20	% макс.
	50	% макс.

Комментарии.

Способы, используемые Roquette, могут представлять собой способы согласно ЕР или USP или внутренние валидированные способы, которые были сопоставлены с фармакопейной статьей.

Данная субстанция подходит для применения для получения препаратов для парентерального вве дения.

Соответствие.

Действующая фармакопея: Е.Р. (1804) и U.S.P/N.F.

Хранение.

Хранение:

хранить в хорошо закрытых контейнерах;

гигроскопичный продукт: для применения в помещении в контролируемых условиях.

- 48 033892

Дата повторного контроля.

Через 3 года в оригинальной упаковке.

* Сведения о соответствии - испытание не проводилось. ** План мониторинга.

Субстанция KLEPTOSE® HPB (иллюстративная партия 2). Определение.

ГИДРОКСИПРОПИЛБЕТАДЕКС представляет собой частично замещенный полигидроксипропиловый эфир бетадекса.

CAS п°: 128446-35-5

EINECS: 420-920-1

INCI: ГИДРОКСИПРОПИЛ-ЦИКЛОДЕКСТРИН

Спецификация.

А) Описание.

B) Подлинность.

ИСПЫТАНИЕ НА ПОДЛИННОСТЬ A EP-USP/NF

ИСПЫТАНИЕ НА ПОДЛИННО СТЬ В EP-USP/NF

C) Анализ.

ИК-СПЕКТРОСКОПИЯ EP-USP/NF

ВНЕШНИЙ ВИД РАСТВОРА EP-USP/NF

ПРОВОДИМОСТЬ EP-USP/NF

См. испытание

Соответствует

Прозрачный, бесцветный 200 мкСм/см макс.

СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ПРИМЕСИ

ПРИМЕСЬ А: БЕТА-ЦИКЛО ДЕКСТРИН	EP-USP/NF	1,0	% макс.
ПРИМЕСЬ В: ПРОПАН-1,2-ДИОЛ	EP-USP/NF	0,50	% макс.
ЛЮБАЯ ДРУГАЯ ПРИМЕСЬ	EP-USP/NF	0,1	% макс.
ОБЩЕЕ СОДЕРЖАНИЕ ДРУГИХ	EP-USP/NF	1,0	% макс.
ПРИМЕСЕЙ
ТЯЖЕЛЫЕ МЕТАЛЛЫ	EP-USP/NF	20 ppm макс.
ПОТЕРЯ В МАССЕ ПРИ	EP-USP/NF	10,0	% макс.
ВЫСУШИВАНИИ
МОЛЯРНОЕ ЗАМЕЩЕНИЕ	EP-USP/NF	0,40-	1,50
ПРОПИЛЕНОКСИД (**)	EP-USP/NF	1 ppm макс.

Субстанция KLEPTOSE® HPB (иллюстративная партия 2).

МИКРОБНАЯ КОНТАМИНАЦИЯ:
ОБЩЕЕ ЧИСЛО АЭРОБНЫХ	EP-USP/NF	100 КОЕ/г макс
МИКРООРГАНИЗМОВ
ОБЩЕЕ ЧИСЛО ДРОЖЖЕЙ И	EP-USP/NF	100 КОЕ/г макс
ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ
ESHCERICHIA	EP-USP/NF	Отсутствие в 10 г.
SALMONELLA	EP-USP/NF	Отсутствие в 10 г.
БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОКСИНЫ	EP-USP/NF	10 МЕ/ г макс

0,62

Характерные значения:

НОМИНАЛЬНОЕ ЗНАЧЕНИЕ МОЛЯРНОГО ЗАМЕЩЕНИЯ МОЛЯРНОЕ ЗАМЕЩЕНИЕ (М3)

0,58-0,68

РАЗМЕР ЧАСТИЦ:

ОСТАТОК НА 315 мкм

ОСТАТОК НА 100 мкм

Сито ώ макс макс

Комментарии.

Соответствие.

Действующая фармакопея: Е.Р. (1804) и U.S.P/N.F.

Хранение.

Хранение:

хранить в хорошо закрытых контейнерах;

Дата повторного контроля.

Через 3 года в оригинальной упаковке.

* Сведения о соответствии - испытание не проводилось.

** План мониторинга.

7.3. Пример 3. Разделение смесей гидроксипропил-бета-циклодекстринов методом ВЭЖХ.

Для оценки компонентного состава смеси циклодекстринов в поставляемой на рынок фармацевти

- 49 033892 ческой композиции гидроксипропил-бета-циклодекстринов для парентерального введения Kleptose® HPB, партии которой применяли в клиническом исследовании фазы I, использовали различные хроматографические методы.

7.3.1. Колонка для анализа производных циклодекстрина (CD-Screen).

Для разделения компонентов поставляемой на рынок Kleptose HBP® (Roquette) использовали метод ВЭЖХ согласно статье номер 1804 Европейской фармакопеи (гидроксипропилбетадекс) (редакция от 1 января 2009 г.).

Условия ВЭЖХ: неподвижная фаза: CD-Screen, размер частиц 5 мкм (ChiroQuest), колонка: 1 = 250 мм, 0 = 4,0 мм; температура: 30°С. Подвижная фаза: подвижная фаза А: вода; подвижная фаза В: вода:метанол (10:90 об./об.). Скорость потока: 1,0 мл/мин; детекция: испарительный детектор светорассеяния Alltech 3300; газ-носитель: азот; скорость потока: 1,5 л/мин; температура испарителя: 70°С; объем вводимой пробы: 20 мкл.

Программа градиента (метод согласно Европейской фармакопее).

Таблица 8

Время (мин)	Подвижная фаза А (% об./об.)	Подвижная фаза В (% об./ЭД)
0-5	52	48
5-15	52 —> 0	48 100
15-20	0	100

На фиг. 9 приведены результаты ВЭЖХ с использованием метода анализа производных циклодекстрина (метод CD-Screen) для анализа гидроксипропил-бета-циклодекстрина Kleptose® HBP (DS_a = 4,2). Соединения выходили в порядке возрастания DS. Незамещенный бета-циклодекстрин выходил на примерно 5 мин, тогда как монозамещенный гидроксипропил-бета-циклодекстрин выходил на примерно 6 мин. На фиг. 10 изображены сравнительные хроматограммы гидроксипропил-бета-циклодекстринов с использованием колонки CD-Screen и градиентов растворителей - метанола и ацетонитрила (градиент метанола: 0 мин - 30% В, 40 мин - 100% В; градиент ацетонитрила: 0-5 мин - 18% В, 25 мин - 40% В. Другие параметры метода оставались неизменными). Время удерживания варьировали в зависимости от силы растворителя и полярности подвижной фазы.

Масс-спектрометрические методы детекции: ВЭЖХ хроматограф Agilent 1260 с тройным квадрупольным масс-спектрометром Triple Quadrupole mass spectrometer 6460.

Источник ионизации электрораспылением (ESI) Agilent Jet Stream, режим отрицательно заряженных ионов, m/z 500-3000; напряжение фрагментора: 35 В, параметры источника: температура газа: 300°С, расход газа: 13 л/мин, распылитель: примерно 0,41 МПа (60 psi), расход продувочного газа: 11 л/мин, температура продувочного газа (нагревателя): 400°С, напряжение на капилляре: 3500 В. Для измерений методом ВЭЖХ-МС в подвижной фазе вместо воды использовали буферный раствор формиата аммония (0,1 М, рН 6,0).

На фиг. 11 изображена экстрагированная ионная хроматограмма образца, полученная при анализе методом ВЭЖХ-МС. НЦД = незамещенный бета-циклодекстрин; DSx = гидроксипропил-бетациклодекстрины со значением DS, равным x. Например, DS3 относится к гидроксипропил-бетациклодекстринам, имеющим DS = 3.

7.3.2. Хроматография на колонке С18 с обращенной фазой.

Анализировали Kleptose® HBP (Roquette) (ту же партию, которую использовали в разделе 5.3.1). Аналитическую колонку (4x250 мм) наполняли силикагелем LiChroprep RP18. Один набор условий для исследования включал следующие: неподвижная фаза: силикагель LiChroprep RP18, размер частиц 25-40 мкм (Merck), колонка: 1 = 250 мм, 0 = 4,0 мм; температура: 30°С. Подвижная фаза: подвижная фаза А: вода; подвижная фаза В: вода:метанол R (10:90 об./об.). В программе градиента использовали следующие условия: градиент от 0 мин при 10% подвижной фазы В до 20 мин при 100% подвижной фазы В. Скорость потока: 1,0 мл/мин; детекция: испарительный детектор светорассеяния Alltech 3300; газ-носитель: азот; скорость потока: 1,5 л/мин; температура испарителя: 70°С.

На фиг. 12 показана типичная хроматограмма ВЭЖХ Kleptose® HPB (DS_a = 4,2) на неподвижной фазе LiChrosphere C18. На фиг. 13 показаны сравнительные хроматограммы гидроксипропил-бетациклодекстринов с использованием колонки LiChrosphere C18 с градиентом растворителей - метанола и ацетонитрила. (Градиент метанола: 0 мин - 10% В, 15 мин - 30% В, 40 мин - 80% В. Градиент ацетонитрила: 0 мин - 5% В, 40 мин - 80% В. Другие параметры метода оставались неизменными.)

Использовали условия масс-спектрометрии, описанные в разделе 5.3.1. На фиг. 14 показана экстрагированная ионная хроматограмма гидроксипропил-бета-циклодекстринов, имеющих различные DS, полученная при анализе методом ВЭЖХ-МС.

7.3.3. Жидкостная хроматография гидрофильных взаимодействий (HILIC).

В жидкостной хроматографии гидрофильных взаимодействий (HILIC) используют гидрофильные неподвижные фазы с элюентами, обычно используемыми в обращенно-фазовой хроматографии. В этом

- 50 033892 подходе используются принципы жидкостно-жидкостной распределительной хроматографии, вследствие чего аналиты выходят в порядке возрастания полярности. В способах, описанных в настоящем описании, использовали аминоколонку, содержащую аминопропильные группы, связанные с поверхностью силикагеля.

Анализировали Kleptose® HBP (Roquette) (ту же партию, которую использовали в разделе 5.3.1). Условия ВЭЖХ: неподвижная фаза: Nucleosil NH2, размер частиц 5 мкм (Macherey Nagel), колонка: 1 = 250 мм, 0 = 4,0 мм; температура: 30°С. Подвижная фаза: подвижная фаза А: ацетонитрил-вода (80:20 об./об.); подвижная фаза В: вода. Скорость потока: 1,0 мл/мин; детекция: испарительный детектор светорассеяния Agilent 385; газ-носитель: азот; скорость потока: 1,2 л/мин; температура испарителя: 50°С; температура распылителя: 30°С.

На фиг. 15 показано разделение гидроксипропил-бета-циклодекстринов с использованием метода HILIC на колонке Nucleosil NH2.

Условия масс-спектрометрии были такими же, как описано в разделе 5.3.1. На фиг. 16 показана экстрагированная ионная хроматограмма гидроксипропил-бета-циклодекстринов, имеющих различные DS, полученная при анализе методом ВЭЖХ-МС. НЦД = незамещенный бета-циклодекстрин; DSx = гидроксипропил-бета-циклодекстрины со значением DS, равным x. Например, DS3 относится к гидроксипропил-бета-циклодекстринам, имеющим DS = 3. В этом методе ВЭЖХ замещенные гидроксипропилбета-циклодекстрины с большей DS выходили первыми.

7.3.4. Хроматография на силикагеле.

Анализировали Kleptose® HBP (Roquette) (ту же партию, которую использовали в разделе 5.3.1). Метод ВЭЖХ: неподвижная фаза: LiChrosphere Si-60, размер частиц 5 мкм (Merck), колонка: 1 = 250 мм, 0 = 4,0 мм; температура: 30°С. Подвижная фаза: подвижная фаза А: ацетонитрил - 0,1 М формиат аммония с рН 7,5 (80:20 об./об.); подвижная фаза В: 0,1 М формиат аммония с рН 7,5. Скорость потока: 1,0 мл/мин; детекция: испарительный детектор светорассеяния Agilent 385; газ-носитель: азот; скорость потока: 1,2 л/мин; температура испарителя: 50°С; температура распылителя: 30°С.

На фиг. 17 показано разделение компонентов гидроксипропил-бета-циклодекстринов с использованием колонки LiChrosphere Si 60. В этом случае образец содержал добавку бета-циклодекстрина для облегчения детекции.

Условия масс-спектрометрии были такими же, как описано в разделе 5.3.1. На фиг. 18 показана экстрагированная ионная хроматограмма гидроксипропил-бета-циклодекстринов, имеющих различные DS. НЦД = незамещенный бета-циклодекстрин; DSx = гидроксипропил-бета-циклодекстрины со значением DS, равным x. Например, DS3 относится к гидроксипропил-бета-циклодекстринам, имеющим DS = 3. В этом методе ВЭЖХ замещенные гидроксипропил-бета-циклодекстрины с большей DS выходили первыми.

7.4. Пример 4. Усовершенствованные аналитические методы.

7.4.1. Газовая хроматография.

Включенный в статью Европейской фармакопеи способ определения содержания пропиленгликоля (ПГ) в гидроксипропилбетадексе имеет предел количественной оценки лишь примерно 0,5% относително ГПБЦД. Соответственно был необходим более чувствительный аналитический способ, и был разработан усовершенствованный способ с модифицированной подготовкой образца (по сравнению с анализом гидроксипропилбетадекса согласно Европейской фармакопее, номер статьи: 1804, редакция от 1 января 2009 г.). Этот способ использовали для количественной оценки ПГ на уровне 0,01% (относительно ГПБЦД), что свидетельствует о гораздо большей чувствительности относительно предела обнаружения способом согласно Европейской фармакопее.

Условия способа были следующими: инструменты: газовый хроматограф: Shimadzu GC-17A; детектор: пламенно-ионизационный детектор (ПИД); инжектор: автоматический инжектор Shimadzu AOC5000; программное обеспечение: Shimadzu Class-VP версия 7.4; газы: газ-носитель: гелий (99,999%), другие газы: азот (99,999%), синтетический воздух (99,999%), водород (полученный с использованием генератора водорода Whatman).

Колонка: Supelco Supercowax-10 (30 м х 0,32 мм х 1,0 мкм)

Скорость (°С/мин) Температура (°C): время (мин):

- 1500

20010 ⁴⁰ 2401

Время удерживания пропиленгликоля ~6,35 мин; время удерживания внутреннего стандарта этиленгликоля ~7,15 мин.

Пять калибровочных точек: в диапазоне от 0,1 до 2 мг/мл, что соответствует 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2% ПГ относительно ГПБЦД.

Исходные калибровочные растворы получали из растворов, содержащих примерно 200 мг пропиленгликоля, точную навеску помещали в градуированную стеклянную колбу объемом 10 мл и наполняли очищенной водой до метки (табл. 14). Для получения концентраций, перечисленных ниже в таблице,

- 51 033892 выполняли необходимое разбавление. После достижения целевой концентрации (см. табл. 14 ниже) 1 мл этого раствора, 100 мкл раствора внутреннего стандарта (ВСТ), 500 мг NaCl и 1 мл воды добавляли во флакон с завинчивающейся крышкой и подвергали раствор экстракции 1 мл дихлорметана (ДХМ). Образцы отбирали из органической фазы и вводили в том же виде.

Таблица 14

Получение калибровочных образцов для ГХ
Образец	Исходный раствор	Разбавление	Получение образца	Экстракция с применением
Целевая концентрация ВСТ: 50 мг/мл	250 мг этиленгликоля (ЭГ) / 5 мл воды	Не применимо	Не применимо	Не применимо
КАЛ1 Целевая концентрация ПГ: 0,1 мг/мл	200 мг ПГ/ 10 мл воды	50 мкл / 10 мл воды	100 мкл ВСТ + 1 мл КАЛ 1 + 500 мг NaCl + 1 мл воды	1 мл ДХМ
КАЛ2 Целевая концентрация ПГ: 0,2 мг/мл	200 мг ПГ/ 10 мл воды	100 мкл / 10 мл воды	100 мкл ВСТ + 1 мл КАЛ 2 + 500 мг NaCl + 1 мл воды	1 мл ДХМ
КАЛЗ Целевая концентрация ПГ: 0,5 мг/мл	200 мг ПГ/ 10 мл воды	250 мкл / 10 мл воды	100 мкл ВСТ + 1 мл КАЛ 3 + 500 мг NaCl + 1 мл воды	1 мл ДХМ
КАЛ4 Целевая концентрация ПГ: 1,0 мг/мл	200 мг ПГ/ 10 мл воды	500 мкл / 10 мл воды	100 мкл L ВСТ + 1 мл КАЛ 4 + 500 _MrNaCl+ 1 мл воды	1 мл ДХМ
КАЛ5 Целевая концентрация ПГ: 2,0 мг/мл	200 мг ПГ/ 10 мл воды	1 мл/10 мл воды	100 мкл ВСТ + 1 мл КАЛ 5 + 500 мг NaCl + 1 мл воды	1 мл ДХМ

Калибровочный раствор КАЛ2 использовали для определения пригодности системы путем проведения пяти параллельных измерений (требования: OCO<5% - OCO отношения площадей ПГ и ЭГ).

Контрольный образец для экстракции: 1 мл ДХМ добавляли к 0,1 мл раствора ВСТ, 500 мг NaCl и 2 мл дистиллированной воды, затем энергично перемешивали в течение 0,5 мин и оставляли на некоторое время. После разделения фаз примерно 0,2 мл фазы ДХМ помещали во флакон.

Получение образца: 1 мл ДХМ добавляли к 1,0 г образца ГПБЦД, 0,1 мл раствора ВСТ, 500 мг NaCl и 2 мл дистиллированной воды во флаконе с завинчивающейся крышкой, энергично перемешивали в течение 0,5 мин и оставляли на некоторое время. После разделения фаз примерно 0,2 мл фазы ДХМ помещали во флакон. Типичная хроматограмма образца Kleptose НРБ® (Roquette), содержащего ~0,18% ПГ, изображена на фиг. 25.

Содержание пропиленгликоля (ПГ) в образцах ГПБЦД рассчитывали, построив калибровочную кривую, отображающую отношение массовых концентраций (в мг/мл) пропиленгликоля/этиленгликоля (ПГ/ЭГ) в зависимости от площади пиков ПГ/ЭГ. В образцах ГПБЦД неизвестным параметром было содержание ПГ, которое получали из других трех факторов и уравнения калибровочной кривой.

Пригодность способа для отделения монопропиленгликоля от его ди- и тризамещенных производных показана на фиг. 26. Более замещенные гликоли обусловливали появление нескольких пиков и выходили позднее вследствие более высоких температур кипения. Содержание ди- и трипропиленгликоля определяли в исходном продукте и в конечных образцах.

Линейность способа была подтверждена путем исследования пяти образцов ПГ в диапазоне концентраций от 0,1 до 2 мг/мл, что соответствует 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2% ПГ относительно ГПБЦД, как описано в табл. 14. Каждый образец анализировали в трех повторностях для оценки точности способа. В табл. 15 обобщены экспериментальные данные анализа точности и линейности. Кривая линейности калибровочного набора изображена на фиг. 27.

Таблица 15

Экспериментальная и статистическая оценка точности и линейности способа

КАЛ2 ПГ/ЭГ

КАЛЗ ПГ/ЭГ

КАЛ4 ПГ/ЭГ

КАЛ5 ПГ/ЭГ

Образец КАЛ1

ПГ/ЭГ (площадь) (площадь) (площадь) (площадь) (площадь)

I	0,1372	0,3252	0,7359	1,6351	2,9511
II	0,1520	0,3168	0,7052	1,5245	3,2239
III	0,1688	0,2839	0,6601	1,4519	2,9009
среднее 0,153	0,309	0,700	1,537	3,029
ст. откл. 0,016	0,022	0,038	0,092	0,180
ОСО	10,4	7,1	5,4	6,0	5,9

Угловой коэффициент регрессия

0,9966

0,9988

0.9986

7,6382

7,6551

7.2976

ПГ = пропиленгликоль;

ЭГ = этиленгликоль;

ОСО = относительное стандартное отклонение.

- 52 033892

Данные в табл. 15 свидетельствуют о том, что способ являлся линейным в диапазоне содержания ПГ 0,01-0,2%.

7.4.2. Аналитическая ВЭЖХ.

Содержание остаточного НЦД (незамещенного бета-циклодекстрина), фракции ГПБЦД со степенью замещения 1 и суммы родственных циклодекстрину (ЦД) примесей, отличных от НЦД, определяли методом ВЭЖХ согласно Европейской фармакопее 7.8 (гидроксипропилбетадекс, статья номер: 1804, редакция от 1 января 2009 г.) и описанию в разделе 5.3.1. Характеристические спектры распределения веществ регистрировали тем же методом.

7.4.3. ЯМР.

Среднюю степень замещения (DS_a) рассчитывали из отношения сигнала от трех протонов метильной группы в составе гидроксипропильной группы и сигнала от протона, связанного с углеродом C1 (аномерного протона) ангидроглюкозных остатков в спектре ¹И-ЯМР.

В спектре ¹И ЯМР измеряли площади пиков дублета метильных групп при ~1,2 ppm (A) и сигналов аномерных протонов между +5 ppm и +5,4 ppm (В). Типичный спектр показан на фиг. 28. В качестве эталона площадь пика аномерных протонов принимали равной 7,0, поскольку 7 протонов обусловливают наличие этого пика у производных бета-циклодекстрина. После установления эталонного пика среднюю степень замещения рассчитывали с использованием выражения: DS_a = A/3.

7.4.4. Анализ солюбилизации холестерина.

Анализ солюбилизации холестерина in vitro проводили следующим образом. Исследуемый раствор смеси гидроксипропил-бета-циклодекстринов в дистиллированной воде перемешивали при комнатной температуре, после чего добавляли избыточное количество неэтерифицированного холестерина таким образом, что часть холестерина оставалась нерастворенной. Через 24 ч твердую фазу отфильтровывали и измеряли холестерин, присутствующий в растворе, методом ВЭЖХ.

Условия ВЭЖХ: аналитическая колонка: Nucleosil 120, C8, 5 мкм, 100 х 4,0 мм (Macherey Nagel); температура колонки: 40°С; подвижная фаза: ацетонитрил:вода = 78:22; скорость потока: 1,5 мл/мин; объем вводимой пробы: 20 мкл; детектор: УФ 210 нм; время остановки: 5 мин.

Исходный раствор холестерина получали посредством взвешивания и переноса 10 мг холестерина в 10 мл ацетонитрила/изопропанола (75:25). Эталонный раствор холестерина получали посредством разбавления исходного раствора подвижной фазой ВЭЖХ в десять раз (для получения концентрации 0,1 мг/мл).

После фильтрации образцы для экспериментов по растворимости разбавляли ацетонитрилом в два раза, а для дополнительного разбавления, если необходимо, использовали дополнительную порцию подвижной фазы ВЭЖХ.

Концентрацию растворенного холестерина определяли с помощью следующих уравнений.

Концентрация холестерина (мг/мл) = (Площадъи/Площадъэ) х Конц.э Площадъи = площадь пика холестерина на хроматограмме исследуемого раствора Площадъэ = площадь пика холестерина на хроматограмме эталонного раствора Конц.э = концентрация водорастворимого сульфобутилового эфира бетациклодекстрина (SBECD-WS) в стандартном калибровочном растворе (мг/мл).

7.5. Пример 5. Анализ методом МС с ионизацией электрораспылением.

Как обсуждалось выше в примере 2, Kleptose® ИРВ имеет среднее молярное замещение, составляющее 0,58-0,68 (DS_a 4,06-4,76), две типичные партии имеют среднее молярное замещение, составляющее 0,62 (DS_a 4,34). Trappsol® Cyclo™, композиция гидроксипропил-бета-циклодекстринов, реализуемая различными производителями, имеет более высокое заявленное среднее молярное замещение, составляющее примерно 0,91 (DSa 6,37).

Анализ методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением выполняли для образцов, поставляемых на рынок Kleptose® ИРВ и Trappsol® Cyclo™ (CTD Holdings, Inc.) (Trappsol ®) двумя различными лабораториями.

Методы, используемые первой лабораторией, были следующими. Примерно 50 мкг образца гидроксипропил-бета-циклодекстринов (ГПБЦД) растворяли в 1 мл 1% муравьиной кислоты в 80% метаноле в воде. Этот раствор ГПБЦД вводили в масс-спектрометр API-4000 (Applied Biosystems). Для МС сканирования m/z от 1100 до 2000 применяли режим электрораспыления положительно заряженных ионов. Регистрировали спектры МС (10-15 средних сканирований). Измеряли высоту каждого сигнала продуктов присоединения пропиленоксида к бета-циклодекстрину и совокупность аддуктов пропиленоксида в ГПБЦД рассчитывали по сумме высот отдельных сигналов. Для работы МС использовали программное обеспечение Analyst 1.51 (Applied Biosystems). Как показано на фиг. 29, данные МС с ионизацией электрораспылением из первой лаборатории демонстрируют, что различия в среднем молярном замещении обусловлены заметными различиями в степени и распределении гидроксипропильного замещения в Kleptose® ИРВ (фиг. 29A) и Trappsol® (фиг. 29В). Числа добавляли к спектрам для идентификации количества гидроксипропильных фрагментов в каждом пике.

Методы, используемые второй лабораторией, были следующими. Образцы для электрораспыления были получены в концентрации 1 мг/мл в воде и разбавлены до ~5 мкМ в воде:ацетонитриле 1:1. Ионы

- 53 033892 были получены с использованием источника Agilent Nanospray source со скоростью прямого введения 600 нл/мин (температура продувочного газа 150°С и скорость потока 5 л/мин при напряжении на капилляре 1500 В). Потенциалы на границе раздела между источником ионизации электрораспылением и пролетной трубкой для измерения подвижности ионов были отрегулированы для оптимальной интенсивности сигналов. Спектры накапливались в течение 3 мин при одном потенциале пролетной трубки и явно демонстрировали разделение подвижности ионов между несколькими классами ионов в потоке электроспрея. Используемый анализатор представлял собой Agilent 6560, линейный масс-спектрометр подвижности ионов со слабым магнитным полем, и его можно рассматривать как, по существу, модифицированную версию Agilent Q-TOF с пролетной трубкой для измерения подвижности ионов, размещенной вблизи отверстия для ввода проб для МС, с использованием технологии ионной воронки. Данные МС с ионизацией электрораспылением из второй лаборатории, показанные на фиг. 30, подтверждают различие в характеристических спектрах замещения (в сравнении с фиг. 30A (Kleptose® HPB) и фиг. 30B (Trappsol®)). Указанные данные также подтверждают, что МС с ионизацией электрораспылением является достаточно надежным аналитическим инструментом, который может быть использован обычным образом различными лабораториями для получения воспроизводимых характеристических спектров композиций гидроксипропил-бета-циклодекстринов.

На фиг. 31 приведено сравнение данных для трех различных партий Kleptose® HPB, полученных методом МС с ионизацией электрораспылением, выполненным двумя различными лабораториями (фиг. 31A и фиг. 31B, вторая лаборатория; фиг. 31C, первая лаборатория), и продемонстрировано, что характеристические спектры замещения почти одинаковы между партиями. Низкая вариабельность от партии к партии в характеристическом спектре замещения согласуется с наблюдением, что среднее молярное замещение было одинаковым между двумя иллюстративными партиями Kleptose® HPB, как обсуждалось выше в примере 2. На фиг. 32 представлены спектры для двух различных партий Trappsol®, полученные методом МС с ионизацией электрораспылением двумя различными лабораториями (фиг. 32A, первая лаборатория; фиг. 32B, вторая лаборатория) с использованием тех же условий, которые использовали для получения данных для Kleptose, показанных на фиг. 31A и фиг. 31B, и продемонстрировано, что в характеристическом спектре замещения Trappsol® имеется значительная вариабельность от партии к партии.

На фиг. 33 показаны спектры, полученные методом МС с ионизацией электрораспылением второй лабораторией, на которых ось Y была расширена по сравнению с фиг. 29-32, чтобы показать пики между m/z 1090 и 1230. Фиг. 33A представляет собой спектр, полученный для Trappsol®. Фиг. 33B представляет собой спектр, полученный для Kleptose® HPB. Спектры свидетельствуют о наличии значительного содержания пропиленгликоля в Trappsol® (пики пропиленгликоля отмечены на фиг. 33A), но не в Kleptose® HPB. Kleptose® HPB содержит малое, но определеяемое количество незамещенного циклодекстрина, демонстрируемое пиком, отмеченным на фиг. 33B.

На фиг. 34 показаны дополнительные различия между образцами Kleptose® HPB и Trappsol® 1) DS значительно различается между двумя образцами; для Trappsol® показаны реакции конденсации, которые должны включать как аксиальные, так и экваториальные гидроксилы; 2) основные ионы обоих образцов представляют собой продукты присоединения NH₄ ⁺ вследствие наличия аммония в твердой фазе; для каждого значения DS также присутствуют ионы MH+; 3) изотопные кластеры для каждого из основных ионов демонстрируют наличие двухзарядных гомодимеров аддуктов аммония. В случае Trappsol® также наблюдают двухзарядные димеры протонированных ионов; 4) для обоих исследуемых продуктов наблюдают двухзарядные гомодимеры вследствие присоединения как протона, так и аммония; 5) двухзарядные гетеродимеры, наблюдаемые в случаях DS6-DS7 при m/z 1530, формируются в обоих исследуемых продуктах, но обладают намного большей интенсивностью в Trappsol®, чем в Kleptose® HPB; 6) все эти различия сохранялись при концентрациях 2,5 мкМ в 80% ацетонитриле. Это указывает на то, что димеры образуют сильные межмолекулярные связи.

На фиг. 35 представлены дополнительные различия между образцами Kleptose® HPB и Trappsol® в форме трехзарядных димеров как гомо-, так и гетеропроисхождения. Они имеют большую интенсивность в Trappsol® и практически отсутствуют в Kleptose® HPB.

В целом, анализ методом МС с ионизацией электрораспылением демонстрирует значительные отличия в характеристическом спектре замещения композиции гидроксипропил-бета-циклодекстринов, примененной в клиническом исследовании фазы I, описанном в примере 1, Kleptose® HPB, по сравнению с характеристическим спектром замещения другой композиции гидроксипропил-бетациклодекстринов, которая представляет собой поставляемый на рынок Trappsol® Cyclo™. Kleptose® HPB имеет низкую вариабельность в характеристическом спектре замещения от партии к партии и низкое содержание примесей, в частности пропиленгликоля. Trappsol®, напротив, проявляет высокую вариабельность в характеристическом спектре замещения от партии к партии и имеет значительно более высокое содержание пропиленгликоля, предполагаемого ототоксина. В Trappsol® также продемонстрировано наличие трехзарядных димеров циклодекстринов как гомо-, так и гетеропроисхождения, которые отсутствуют в Kleptose® HPB.

- 54 033892

7.6. Пример 6. Очистка композиций гидроксипропил-бета-циклодекстринов.

Исследовали три способа очистки (комплексообразование, осаждение и адсорбцию) в отношении их способности обеспечивать дополнительное снижение содержания примесей пропиленгликоля (ПГ) и незамещенного бета-циклодекстрина (DS = 0) в Kleptose® HBP.

7.6.1. Комплексообразование/связывание с органическими соединениями.

Эксперимент 5.6.1А: 1,0 г ГПБЦД (Kleptose HBP® (Roquette)) растворяли в воде (10 мл). К растворам добавляли п-ксилол (опыт № 5.6.1.1) или толуол (опыт № 5.6.1.2) (1,0 мл) и перемешивали смеси в течение 24 ч при комнатной температуре и 1 ч при 5-7°С. Опалесцирующие растворы фильтровали через мембранный фильтр из ацетата целлюлозы с диаметром пор 0,45 мкм и фильтраты упаривали при 40°С до сухого состояния.

Опыт № 5.6.1.1: 0,7 г; выход: 70%.

Опыт № 5.6.1.2: 0,8 г; выход: 80%.

Эксперимент 5.6.1В: 2,0 г ГПБЦД (Kleptose HBP® (Roquette)) растворяли в воде (4 мл). К раствору добавляли D-лимонен (опыт № 5.6.1.3, 0,04 мл, ~10 экв.) или L-ментол (опыт № 5.6.1.4, 0,04 г, ~10 экв.) или бензиловый спирт (опыт № 5.6.1.5, 0,03 мл, ~10 экв.) или холестерин (опыт № 5.6.1.6, 0,1 г, ~10 экв.) и перемешивали смесь в течение 72 ч при комнатной температуре. Растворы выдерживали при 5°С в течение 4 ч.

В опыте № 5.6.1.4 и опыте № 5.6.1.5 растворы оставались прозрачными, осадок не образовывался.

В опыте № 5.6.1.3 и опыте № 5.6.1.6 образовывался осадок. Каждый из растворов из опыта № 5.6.1.3 и опыта № 5.6.1.6 фильтровали через мембранный фильтр из ацетата целлюлозы с диаметром пор 0,45 мкм и фильтраты упаривали при 40°С до сухого состояния.

Опыт № 5.6.1.3: 2,1 г; выход: 105%. Опыт № 5.6.1.6: 1,4 г; выход: 70%.

Результаты для образцов, полученных в результате избирательного комплексообразования или связывания с малыми молекулами, обобщены в табл. 9.

Таблица 9

Анализ образцов ГПБЦД после избирательного комплексообразования или связывания

Испытание	Kleptose® НРВ	Опыт №5.6.1.1 (и-ксилол)	Опыт №5.6 Л .2 (толуол)	Опыт №5.6 Л .3 (D-лимонен)	Опыт №5.6 Л .6 (L-ментол)
Содержание пропиленгликоля	0,18%	н/о	н/о	н/о	н/о
Содержание незамещенного βциклодекстрина	0,60%	0,38%	0,54%	0,21%	0,60%
Содержание ГПБЦД с DS = 1	3,68%	3,14%	3,25%	2,61%	3,42%
Другие примеси, родственные циклодекстрину	0,23%	0,23%	0,19%	0,14%	0,24%

н/о = Не определено.

В опытах №№ 5.6.1.1, 5.6.1.2 и 5.6.1.3 было показано снижение содержания незамещенного бетациклодекстрина в сравнении с поставляемой на рынок Kleptose® HBP. Помимо этого, для D-лимонена в опыте № 5.6.1.3 было показано снижение содержания монозамещенного гидроксипропил-бетациклодекстрина (ГПБЦД DS = 1) и других примесей, родственных циклодекстрину (см. фиг. 19). На фиг. 19 показаны примеси незамещенного бета-циклодекстрина (НЦД) при времени удерживания ~5 мин, монозамещенных гидроксипропил-бета-циклодекстринов (DS-1) при времени удерживания ~6 мин и гидроксипропил-бета-циклодекстринов, имеющих DS = 2 (DS-2) при времени удерживания ~7,4 мин.

7.6.2. Осаждение.

Общий способ: 1,0 г ГПБЦД (Kleptose HBP® (Roquette)) растворяли в 5 или 2 мл растворителя (Р) и осаждали в 50 или 20 мл осаждающего агента (ОА). Отфильтрованную твердую фазу 3 раза промывали 3 мл ОА. Исключением был опыт № 5.6.2.11: 1,0 г ГПБЦЦ растворяли в воде (2 мл) и экстрагировали хлороформом (3x10 мл). Органические фазы объединяли, сушили над Na₂SO₄, декантировали и упаривали при 40°С до сухого состояния. Подготовка к каждому опыту приведена в табл. 10.

- 55 033892

Таблица 10

Получение образцов для осаждения

Опыт №	Раствор итель (Р)	Количе ство Р (мл)	Осаждающий агент (ОА)	Количес тво ОА (мл)	Выход (%)	Комментарии
5.6.2.1	метанол	5	ацетон	50	92	Растворители и осаждающие агенты имели квалификацию «технический»; отфильтрованную твердую фазу сушили на воздухе при комнатной температуре
5.6.2.2	ацетонитрил	96
5.6.2.3	хлороформ	78
5.6.2.4	2	ацетон	95
5.6.2.5	ацетонитрил	98
5.6.2.6	хлороформ	98
5.6.2.7	вода	ацетон	99
5.6.2.8	ацетонитрил	99
5.6.2.9	хлороформ	3x10	96	экстракция
5.6.2.4.2	метанол	ацетон	50	90	Растворители и осаждающие агенты квалификацию «для ВЭЖХ» или «для ГХ»; отфильтрованную твердую фазу сушили сушили под вакуумом при комнатной температуре
5.6.2.5.2	ацетонитрил	94
5.6.2.7.2	вода	ацетон	84
5.6.2.8.2	ацетонитрил	91
5.6.2.10	метанол	ацетон	20	92
5.6.2.11	вода	хлороформ	н/о

н/о = Не определено.

Аналитические результаты экспериментов по осаждению растворителем обобщены в табл. 11. Таблица 11

Сравнительный анализ образцов ГПБЦД, очищенных с помощью осаждения

Испытание	Kleptose® HPB	Опыт 5.6.2.10	Опыт 5.6.2.2	Опыт 5.6.2.3	Опыт 5.6.2.7.2	Опыт 5.6.2.8.2	Опыт 5.6.2.11
Пропиленгликоль	0,18%	0,015%	0,035%	0,14%	<0,01%	<0,01%	0,18%
β-циклодекстрин	0,60%	н/о	н/о	н/о	н/о	н/о	н/о
ГПБЦД с DS=1	3,68%	н/о	н/о	н/о	н/о	н/о	н/о
Общее содержание других примесей, родственных циклодекстрину	0,23%	н/о	н/о	н/о	н/о	н/о	н/о

н/о = Не определено.

Как показано в табл. 11, осаждение снижало уровень пропиленгликоля в образцах гидроксипропилбета-циклодекстринов. В опытах №№ 5.6.2.10, 5.6.2.2 и 5.6.2.3 с использованием метанола в комбинации с ацетоном, ацетонитрилом или хлороформом в качестве осаждающих агентов соответственно удавалось снизить содержание пропиленгликоля на 92, 81 и 22% соответственно. В опытах №№ 5.6.2.7.2 и 5.6.2.8.2 с использованием воды в комбинации с ацетоном или ацетонитрилом в качестве осаждающих агентов соответственно содержание пропиленгликоля было снижено на > 95% (см. фиг. 20, где приведено сравнение опыта № 5.6.2.7.2 с Kleptose HPB®). Для сравнения, в опыте № 5.6.2.11 с использованием воды и хлороформа не наблюдали значительного изменения содержания пропиленгликоля по сравнению с поставляемой на рынок Kleptose HPB®.

7.6.3. Адсорбция.

7.6.3.1. Очистка с помощью оксида алюминия.

2,0 г ГПБЦД (Kleptose HBP® (Roquette)) растворяли в метаноле (8 мл, опыт № 5.6.3.1.1) или этаноле (8 мл, опыт № 5.6.3.1.2) и перемешивали в течение 0,5 ч с оксидом алюминия (2,0 г, оксид алюминия 90 стандартизированный, Merck) при комнатной температуре. Оксид алюминия отфильтровывали, промывали метанолом или этанолом (3x2 мл) и водой (3x2 мл). Фильтраты (SZ) и первые промывочные растворители (M1 [метанол] или E1 [этанол]) упаривали при 40°С до сухого состояния.

Опыт №5.6.3.1.1: образец 5.6.3.1.1-SZ: 1,6 г; выход: 80%.

Опыт №5.6.3.1.1: образец 5.6.3.1.1-М1: 0,2 г; выход: 10%.

Опыт №5.6.3.1.2: образец 5.6.3.1.2-SZ: 1,5 г; выход: 75 %. Опыт №5.6.3.1.2: образец 5.6.3.1.2-Е1: 0,2 г; выход: 10 %.

7.6.3.2. Хроматография на оксиде алюминия.

Опыт № 5.6.3.2.1: 2,0 г ГПБЦД (Kleptose HBP® (Roquette)) растворяли в метаноле (2 мл) и пропускали через оксид алюминия (10 г, оксид алюминия 90 стандартизированный, Merck) в метаноле, скорость потока: 3 мл/мин, 1 мин/фракцию, 30 фракций. Колонку промывали водой, скорость потока: 10 мл/мин, 20 мин (П). Следующие фракции объединяли и упаривали при 40°С до сухого состояния.

- 56 033892

Образец 5.6.3.2.1А: фракция 2: 0,5 г, выход: 25 %.

Образец 5.6.3.2.1В: фракции 3-8: 1,1 г, выход: 55 %. Образец 5.6.3.2.1С: фракции 9-14: 0,2 г, выход: 10 %. Образец 5.6.3.2.1D: фракции 15-П: 0,2 г, выход: 10 %.

Опыт № 5.6.3.2.2: 5,0 г ГПБЦД (Kleptose HBP® (Roquette)) растворяли в метаноле (10 мл) и пропускали через оксид алюминия (200 г, оксид алюминия 90 стандартизированный, Merck) со следующим градиентом растворителя: 100% метанола, скорость потока: 5 мл/мин, 3 мин/фракцию, фракции 1-30; 80% метанола, 20% воды, 5 мл/мин, 3 мин/фракцию, фракции 31-43; 50% метанола-воды, 5 мл/мин, 3 мин/фракцию, фракции 44-60; 100% воды, 5 мл/мин, 3 мин/фракцию, фракции 61-70; промывка (П): 100% воды, 10 мл/мин, 30 мин.

Следующие фракции объединяли и упаривали при 40°С до сухого состояния.

Образец 5.6.3.2.2А: фракции 0-5: 0,1 г, выход: 2 %.

Образец 5.6.3.2.2В: фракции 6-10: 0,6 г, выход: 12 %.

Образец 5.6.3.2.2С: фракции 11-16: 0,5 г, выход: 10 %. Образец 5.6.3.2.2D: фракции 17-45: 1,1 г, выход: 22 %. Образец 5.6.3.2.2Е: фракции 46-51: 0,5 г, выход: 10 %. Образец 5.6.3.2.2F: фракции 52-56: 0,9 г, выход: 18 %. Образец 5.6.3.2.2G: фракции 57-66: 0,5 г, выход: 10 %. Образец 5.6.3.2.2Н: фракции 67-П: 1,3 г, выход: 26 %.

7.6.4. Анионообменная смола.

Опыт № 5.6.3.3: 1,0 г ГПБЦД растворяли в воде (10 мл), устанавливали рН от 10 до 12 (измеряли с помощью универсальной индикаторной бумаги, Merck, рН 1-14) с помощью 0,1н. NaOH. Раствор перемешивали с 5,0 г анионообменной смолы (Purolite, код продукта: 47111) в течение 14 ч. Смолу отфильтровывали, фильтрат нейтрализовали с помощью катионообменной смолы (Purolite, код продукта: 15131) и обрабатывали активированным углем. Твердый образец выделяли упариванием при 40°С до сухого состояния для получения образца 5.6.3.3, выход: 0,9 г, 90%.

Характеристика образцов после адсорбции

Таблица 12

Сравнительный анализ образцов ГПБЦД, очищенных с помощью избирательной адсорбции

Образец	Kleptose ® HPB	5.6.3.1.1 -SZ	5.6.3.1.2 -SZ	5.6.3.2.1 А	5.6.3.2.1 в	5.6.3.2.1 С	5.6.3. 3
Пропиленгликол ь	0,18%	н/о	н/о	0,10%	0,18%	н/о	0,15%
β-циклодекстрин	0,60%	0,13%	0,33%	0,14%	0,12%	0,23%	0,36%

ГПБЦД DS=1	3,68%	2,11%	2,45%	1,74%	2,16%	4,74%	2,69%
Общее содержание других примесей, родственных циклодекстрину	0,23%	0,1%	0,15%	0,06%	0,06%	0,12%	0,19%

н/о = Не определено.

Таблица 13

Сравнительный анализ образцов ГПБЦД, очищенных с помощью избирательной адсорбции (хроматографии)

Образец	Kleptos е®НРВ	5.6.3.2.2
А	в	С	D	Е	F	G	Н
Пропилен- гликоль	0,18%	н/о	0,26%	0,06%	0,31%	0,16%	0,05%	0,05%	0,03%
бета-цикл одекстрин	0,60%	<0,05 %	<0,05 %	<0,05 %	<0,05 %	<0,05 %	<0,05 %	<0,05 %	1,53%
ГПБЦД с DS=1	3,68%	<0,05 %	0,05%	<0,05 %	<0,05 %	0,07%	0,14 %	0,49%	10,79 %
Общее содержание других примесей, родственных циклодекстри ну	0,23%	0,38%	<0,05 %	<0,05 %	0,08%	0,23%	0,20%	0,51%	1,18%

н/о = Не определено.

Графическое представление данных табл. 12 и 13 изображено на фиг. 21-24. Фракции от A до H соответствуют образцам от 5.6.3.2.2A до 5.6.3.2.2H соответственно. В то время как анионообменная смола с последующей обработкой активированным углем служила для снижения содержания некоторых примесей (опыт № 5.6.3.3, фиг. 21), было обнаружено, что адсорбция на оксиде алюминия эффективна для

- 57 033892 снижения содержания примесей, родственных циклодекстрину (опыт № 5.6.3.1, фиг. 22), особенно при применении в хроматографии (фиг. 23). На фиг. 21-23 показаны примеси незамещенного бетациклодекстрина (НЦД) при времени удерживания ~5 мин, а также монозамещенных гидроксипропилбета-циклодекстринов (DS-1) при времени удерживания ~6 мин и гидроксипропил-бетациклодекстринов, имеющих DS = 2 (DS-2), при времени удерживания ~7,4 мин. Восемь фракций (от A до H), собранных в опыте № 5.6.3.2.2, изображены на фиг. 24. Фракции B-D содержали целевые примеси, пропиленгликоль и НЦД, в чрезвычайно низких концентрациях. Во фракциях A-G содержание НЦД было снижено ниже предела количественного определения. Одновременно содержание ГПБЦД DS-1 составляло менее 0,15% во фракциях A-F (96% или большее снижение) и содержание других примесей, родственных ЦД, было значительно снижено во фракциях B-D. На основании этих результатов хроматографию на основе Al₂O₃ считали подходящей для эффективного удаления примесей, родственных ЦД, из ГПБЦД.

7.7. Пример 7. Очистка в большем масштабе.

Для подготовки к клиническому исследованию фазы II исследовали три способа очистки (осаждение, адсорбция на оксиде алюминия и сочетание осаждения и абсорбции на оксиде алюминия) в отношении их способности обеспечивать снижение содержания примесей пропиленгликоля (ПГ) и незамещенного бета-циклодекстрина (DS = 0) в Kleptose® HBP в большем масштабе. Проводили очистку партий ГПБЦД (Kleptose® HBP (Roquette)) массой 10 г; также проводили осаждение партии массой 30 г. Результаты, полученные для партий массой 10 г, приведены в табл. 16-18. Результаты, полученные для партии массой 30 г, приведены в табл. 19.

7.7.1. Осаждение растворителем.

В процессе получения 10 г ГПБЦД проводили осаждение из воды с ацетоном. ГПБЦД растворяли в половине эквивалентного количества воды (20 г ГПБЦД в 10 мл воды), выливали в пятикратный объем (100 мл) ацетона и три раза промывали двойным объемом (40 мл) ацетона после декантации. Растворение занимает 30-60 мин при использовании ультразвука и перемешивания. Липкая консистенция осадка была уменьшена трехкратным промыванием ацетоном перед фильтрованием. Выход составлял 87-93%.

В масштабе 30 г для растворения ГПБЦД вместо воды использовали метанол. 43 г ГПБЦД растворяли в 43 мл метанола и затем выливали в 430 мл ацетона. После трехкратного промывания ацетоном (43 мл) осадок легко фильтровался. Выход составлял 99%. Согласно результатам ГХ использование метанола во время очистки ускоряло очистку и обеспечивало лучший выход, чем использование воды.

7.7.2. Хроматография на оксиде алюминия.

ГПБЦД растворяли в метаноле, получая растворы с концентрацией примерно 1 мг/мл. Например, 10,0 г ГПБЦД растворяли в метаноле (10 мл) и пропускали через оксид алюминия (колонка объемом 180 см³, наполненная 220 г оксида алюминия) в метаноле, скорость потока 5 мл/мин, фракции собирали каждые 10 минт с общим количеством фракций 8-20. Элюент представлял собой 100% метанол. Для получения 10 г очищенных ГПБЦД использовали 20-22 г исходных продуктов с выходом чистого продукта 7075%.

7.7.3. Комбинация хроматографии на оксиде алюминия и осаждения растворителем.

Для протокола комбинации после описанного выше осаждения растворителем следовала описанная выше хроматография на оксиде алюминия для партий ГПБЦД массой 10,0 г.

Таблица 16

Анализ образцов ГПБЦД, очищенных с помощью осаждения растворителем (ID партии: CYL-4061)

Испытание	Анализ	Результат
Подлинность	ВЭЖХ, ЯМР	соответствует
Средняя степень замещения	ЯМР	4,2
Содержание незамещенного βциклодекстрина	ВЭЖХ	0,6%
ГПБЦД DS-1	ВЭЖХ	3,7%
Общее содержание других примесей, родственных циклодекстрину	ВЭЖХ	0,08%
Содержание пропиленгликоля	ГХ	0,01%
Содержание дипропиленгликоля	ГХ	< 0,2%
Содержание трипропиленгликоля	ГХ	< 0,2%
Способность к солюбилизации холестерина (при концентрации ЦД 50 мг/мл)	ВЭЖХ	23 мг/мл
Растворимость (в 100 см³ растворителя при 25° Цельсия)		Метанол: > 60 г Этанол: > 60 г

- 58 033892

Таблица 17

Анализ образцов ГПБЦД, очищенных с помощью абсорбционной хроматографии на оксиде алюминия (ID партии: CYL-4062)

Испытание	Анализ	Результат
Подлинность	ВЭЖХ, ЯМР	соответствует
Средняя степень замещения	ЯМР	н/о
Содержание незамещенного βциклодекстрина	ВЭЖХ	< 0,05%
ГПБЦД DS-1	ВЭЖХ	0,1%
Общее содержание других примесей, родственных циклодекстрину	ВЭЖХ	0,05%
Содержание пропиленгликоля	гх	0,05%
Содержание дипропиленгликоля	гх	< 0,2%
Содержание трипропиленгликоля	гх	< 0,2%
Способность к солюбилизации холестерина (при концентрации ЦД 50 мг/мл)	ВЭЖХ	27 мг/мл
Растворимость (в 100 см³ растворителя при 25° Цельсия)		Метанол: > 60 г Этанол: > 60 г

Таблица 18

Анализ образцов ГПБЦД, очищенных с помощью комбинации абсорбционной хроматографии на оксиде алюминия и осаждения растворителем (ID партии: CYL-4063)

Испытание	Анализ	Результат
Подлинность	ВЭЖХ, ЯМР	соответствует
Средняя степень замещения	ЯМР	4,6
Содержание незамещенного βциклодекстрина	ВЭЖХ	< 0,05%
ГПБЦД DS-1	ВЭЖХ	0,02%
Общее содержание других примесей, родственных циклодекстрину	ВЭЖХ	< 0,05%
Содержание пропиленгликоля	гх	<0,01%
Содержание дипропиленгликоля	гх	< 0,2%
Содержание трипропиленгликоля	гх	< 0,2%
Способность к солюбилизации холестерина (при концентрации ЦД 50 мг/мл)	ВЭЖХ	22 мг/мл
Растворимость (в 100 см³ растворителя при 25° Цельсия)		Метанол: > 60 г Этанол: > 60 г

Таблица 19 Анализ образцов ГПБЦД (30 г), очищенных с помощью комбинации абсорбционной хроматографии на оксиде алюминия и осаждения растворителем (ID партии: CYL-4077)

Испытание	Анализ	Результат
Подлинность	ВЭЖХ, ЯМР	соответствует
Средняя степень замещения	ЯМР	4,7
Содержание незамещенного β-циклодекстрина	ВЭЖХ	< 0,02%
ГПБЦД DS-1	ВЭЖХ	0,12%
Общее содержание других примесей, родственных циклодекстрину	ВЭЖХ	< 0,02%
Содержание пропиленгликоля	гх	< 0,02%
Способность к солюбилизации холестерина (при концентрации ЦД 50 мг/мл)	ВЭЖХ	22 мг/мл
Растворимость (в 100 см³ растворителя при 25° Цельсия)		Метанол: > 60 г Этанол: > 60 г

В табл. 20 приведено сравнение результатов 3 способов очистки.

- 59 033892

Таблица 20

Сравнение способов очистки

	Kleptose ®НРВ	осаждение растворителе м	абсорбционна я хроматограф ия на оксиде алюминия	комбинация абсорбционно й хроматографи и на оксиде алюминия и осаждения растворителе м (водаацетон) (Юг)	комбинация абсорбционно й хроматографи и на оксиде алюминия и осаждения растворителе м(метанолацетон) (30г)
		ID партии: (CYL-4061)	ID партии: (CYL-4062)	ID партии: (CYL-4063)	ID партии: (CYL-4077)
Испытание
Подлинность		соответствуе т	соответствует	соответствует	соответствует
Средняя степень замещения	4,34	4,2	не определена	4,6	4,7
Содержание незамещенного βциклодекстрина	0,60%	0,6%	< 0,05%	< 0,05%	< 0,02%
ГПБЦДО8-1	3,68%	3,7%	0,1%	0,02%	0,12%
Общее содержание других примесей, родственных циклодекстрину	0,23%	0,08%	0,05%	< 0,05%	< 0,02%
Содержание пропиленгликоля	0,18%	0,01%	0,05%	<0,01%	< 0,02%
Содержание дипропиленгликол я		< 0,2%	< 0,2%	< 0,2%
Содержание трипропиленглико ля		< 0,2%	< 0,2%	< 0,2%
Способность к солюбилизации холестерина (при концентрации ЦД 50 мг/мл)		23 мг/мл	27 мг/мл	22 мг/мл	22 мг/мл
Растворимость (в 100 см³растворителя при 25° Цельсия)		Метанол: >60 г Этанол: >60 г	Метанол: >60 г Этанол: >60 г	Метанол: >60 г Этанол: >60 г	Метанол: >60 г Этанол: >60 г

7.7.4. Влияние очистки на характеристический спектр замещения.

Анализ методом МС с ионизацией электрораспылением проводили, по существу, как описано в примере 5 (вторая лаборатория) для аликвоты партии CYL-4063, очищенной с помощью комбинации абсорбционной хроматографии на оксиде алюминия и осаждения растворителем (вода-ацетон), и для аликвоты исходной партии Kleptose® HPB. Сравнение спектров приведено на фиг. 36, на фиг. 36А показан спектр исходного продукта и на фиг. 36В показан спектр очищенной партии. Как можно видеть, очистка устраняет незамещенные молекулы бета-циклодекстрина (DS-0), почти все молекулы циклодекстрина с единственным гидроксипропильным заместителем (DS-1) и снижает концентрацию молекул циклодекстрина, содержащих два гидроксипропильных заместителя (DS-2). Спектры также предполагают небольшое изменение относительных долей и, таким образом, распределение более высокозамещенных производных гидроксипропил-бета-циклодекстрина, DS3, DS4, DS5, DS6 и DS7.

Авторы настоящего изобретения количественно оценили распределение пиков 14 партий Kleptose® HPB (EOxxx) и очищенной партии CYL-4063. Сигнал каждого пика и процентное содержание каждого пика, вносящее свой вклад в общий сигнал, обобщены в табл. 21.

- 60 033892

Таблица 21 Количественное представление распределения пиков

ID партии	m/z 1152 (DS-0)	m/z 1210 (DS-1)	m/z 1268 (DS-2)	m/z 1326 (DS3)	m/z 1384 (DS4)	m/z 1442 (DS5)	m/z 1500 (DS6)	m/z 1558 (DS7)	m/z 1618 (DS8)	Общий сигнал	DS-2 /DS-1
ЕО190	8271	40791	139700	321271	418999	312241	154341	50521	0	1446134	3,4
0,6%	2,8%	9,7%	22,2%	29,0%	21,6%	10,7%	3,5%	0,0%	100,0%
ЕО194	0	74463	261482	581280	683474	493534	235243	78741	0	2408217	3,5
0,0%	3,1%	10,9%	24,1%	28,4%	20,5%	9,8%	3,3%	0,0%	100,0%
ЕО197	14510	67730	211808	438806	488923	334509	155845	52450	0	1764582	3,1
0,8%	3,8%	12,0%	24,9%	27,7%	19,0%	8,8%	3,0%	0,0%	100,0%
ЕО199	14595	80072	258738	547035	604472	417563	202219	67725	8196	2200613	3,2
0,7%	3,6%	11,8%	24,9%	27,5%	19,0%	9,2%	3,1%	0,4%	100,0%
ЕО230	9783	51565	178426	349066	380442	264898	125560	41141	0	1400879	3,5
0,7%	3,7%	12,7%	24,9%	27,2%	18,9%	9,0%	2,9%	0,0%	100,0%
ЕО234	12101	64237	210693	427987	486218	329743	152141	49506	0	1732625	3,3
0,7%	3,7%	12,2%	24,7%	28,1%	19,0%	8,8%	2,9%	0,0%	100,0%
ЕО240	10871	55903	187803	365483	390189	270539	127936	42957	0	1451681	3,4
0,7%	3,9%	12,9%	25,2%	26,9%	18,6%	8,8%	3,0%	0,0%	100,0%
ЕО242	7678	31064	101220	192348	192221	128433	60981	23856	0	737801	3,3
1,0%	4,2%	13,7%	26,1%	26,1%	17,4%	8,3%	3,2%	0,0%	100,0%
ЕО253	11527	53739	174134	335106	358419	254261	119699	44125	0	1351010	3,2
0,9%	4,0%	12,9%	24,8%	26,5%	18,8%	8,9%	3,3%	0,0%	100,0%
ЕО265	0	40533	128930	263039	296342	203297	98477	32960	0	1063578	3,2
ID партии	m/z 1152 (DS-0)	m/z 1210 (DS-1)	m/z 1268 (DS-2)	m/z 1326 (DS3)	m/z 1384 (DS4)	m/z 1442 (DS5)	m/z 1500 (DS6)	m/z 1558 (DS7)	m/z 1618 (DS8)	Общий сигнал	DS-2 /DS-1
	0,0%	3,8%	12,1%	24,7%	27,9%	19,1%	9,3%	3,1%	0,0%	100,0%
ЕО270	18518	101531	340195	681274	764792	530914	241841	82688	0	2761754	3,4
0,7%	3,7%	12,3%	24,7%	27,7%	19,2%	8,8%	3,0%	0,0%	100,0%
ЕО277	15144	69571	229585	488128	540927	377689	178205	59435	8755	1967438	3,3
0,8%	3,5%	11,7%	24,8%	27,5%	19,2%	9,1%	3,0%	0,4%	100,0%
ЕО237	27395	143476	478761	988885	1124832	769561	363246	123518	0	4019673	3,3
0,7%	3,6%	11,9%	24,6%	28,0%	19,1%	9,0%	3,1%	0,0%	100,0%
ЕО245	0	295840	965902	1907408	2345018	1807732	880668	285778	0	8488345	3,3
0,0%	3,5%	11,4%	22,5%	27,6%	21,3%	10,4%	3,4%	0,0%	100,0%

Средне е	0,6%	3,6%	12,0%	24,5%	27,6%	19,3%	9,2%	3,1%	0,1%	100,0%	3,3
со.	0,3%	0,3%	1,0%	1,0%	0,7%	1,1%	0,7%	0,2%	0,1%		0,1

CYL- 4063	0	0	258436	1401875	2525377	2328043	1223567	409420	35622	8182339	h/o
0,0%	0,0%	3,2%	17,1%	30,9%	28,5%	15,0%	5,0%	0,4%	100,0%

7.8. Пример 8. Влияние очистки на профили экспрессии генов.

Как обсуждалось в примере 7, попытки очистки в больших масштабах были успешны в отношении снижения содержания пропиленгликоля, который является предполагаемым ототоксином; молекул бетациклодекстрина, не имеющих гидроксипропильных заместителей (DS-0), которые, как известно, образуют осадки; и бактериального эндотоксина, обладающего высокой провоспалительной активностью. Однако авторы настоящего изобретения наблюдали, что абсорбционная хроматография на оксиде алюминия, независимо от того, используют ли ее отдельно или в комбинации с осаждением растворителем, также приводит к значительному изменению в профиле или характеристическом спектре композиции, по существу снижая количество гидроксипропил-бета-циклодекстрина DS-1 и - в партии, проанализированной методом МС с ионизацией электрораспылением, которую предварительно очищали с помощью комбинации абсорбционной хроматографии на оксиде алюминия и осаждения растворителем, - снижая количество гидроксипропил-бета-циклодекстрина DS-2 наряду с небольшим очевидным влиянием на наличие и соотношение в большей степени замещенных соединений, содержащихся в Kleptose® HPB (DS3, DS4, DS5, DS6, DS7).

Для оценки потенциальных фармакологических эффектов этого существенного изменения в характеристическом спектре композиции авторы настоящего изобретения выполняли определение профиля экспрессии генов.

7.8.1. Материалы и методы.

7.8.1.1. Клетки.

Клетки GM18453 (гомозиготные по мутации NPC1) и клетки GM05659 дикого типа были получены из Медицинского Института Кориелла (Coriell Medical Institute). Линии клеток культивировали в 10% ЭБС, среде DMEM и 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина. Перед обработкой циклодекстринами клетки в концентрации 500000 клеток/лунку подвергали синхронизации с применением 10 мкг/мл митомицина. Гидроксипропил-циклодекстрины (ГПЦД) растворяли в ФСБ в диапазоне концентраций, используемом в исследовании (от 0,1 до 10 мМ).

- 61 033892

7.8.1.2. Получение РНК и анализ полного транскриптома.

Клетки NPC1 (GM18453) и клетки дикого типа (GM05659) лизировали и экстрагировали РНК с помощью реагента Trizol® (Invitrogen). Затем клетки подвергали обработке ДНКазой I (Qiagen). Чистоту и концентрацию образцов проверяли с помощью спектрофотометра Qubit и инструмента Nano Drop ND1000, а целостность РНК (RIN) оценивали с использованием биоанализатора Agilent 2100. Экстрагированную мРНК обогащали с использованием набора RiboMinus™ Eukaryote (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Конечное количество РНК составляло 10 мкг на реакцию. Библиотеки кДНК, полученные с использованием набора SMARTer Stranded RNA-Seq Kit (Clontech), были выбраны по размеру в диапазоне 150-250 п.о. и секвенированы в соответствии с протоколом, предоставленным Illumina. Образцы секвенировали с помощью платформы HiSeq 2000 с использованием прямого праймера размером 75 п.о. и обратного праймера размером 35 п.о.

7.8.1.3. Анализ результатов секвенирования РНК.

Секвенирование библиотек кДНК приводило к получению 20941134-42375128 парных чтений на образец. Для улучшения качества картирования парные чтения были обрезаны до 50 пар оснований. Все чтения в формате color-space были выравнены на референсный геном человека (Ensembl, релиз 73) с использованием программного обеспечения TopHat v2.1.0, использующего Bowtie версии 1.0.0. Значения RPKM (количество чтений на тысячу нуклеотидов транскрипта на миллион картированных чтений) для оценки уровней экспрессии генов рассчитывали с помощью программного обеспечения Cufflinks v2.0.2, a исходные подсчеты были получены с помощью приложений Illumina BaseSpace Core Apps с использованием генных аннотаций генов, кодирующих белки, загруженных из Ensembl (релиз 73). Дифференциальную экспрессию/кратность изменения оценивали по исходным подсчетам с помощью программного обеспечения edgeR. Все программы использовали с их параметрами по умолчанию, a TopHat настраивали таким образом, чтобы не находить новые сайты соединения.

Кратность изменения для каждого гена визуализировали с помощью программного обеспечения TIBCO Spotfire (версии 6.5). Для отображения изменений дифференциальной экспрессии генов использовали комбинацию древовидной карты и гистограмм. Для просмотра изменений полного транскриптома при обработке 10 мМ ГПЦД показания гистограмм были оптимальными.

7.8.1.4. Анализ валидации результатов секвенирования РНК.

Исходные парные чтения нуклеотидов секвенирования РНК подвергали прямому компьютерному анализу на наличие выбранного набора генов гомеостаза холестерина для установления реакции на обработку Kleptose® HPB. Выбранные гены перечислены ниже в табл. 22.

Таблица 22

Гены гомеостаза холестерина, выбранные для анализа ответа генов в клетках GM18453 и GM05659

ID гена	Классификация
A1DOB	транспорт холестерина
ABACA1	транспорт холестерина
ABCG1	транспорт холестерина
ABCG2	транспорт холестерина
АСАТ	этерификация холестерина
ANKFY1	лизосомальный
АРОА1	метаболизм липидов
АРОЕС1	метаболизм липидов
CEL	транспорт липидов
СЕТР	перенос эфиров холестерина
СН25Н	транспорт липидов
DHCR7	сборка липопротеинов
FDFT1	синтез холестерина
GGPS1	синтез холестерина
IDI1	синтез холестерина
LIPA	метаболизм липидов
MVD	синтез холестерина
SC4MOL	синтез холестерина
SC5DL	синтез холестерина
SOAT2	сборка липопротеинов
SREBF2	синтез холестерина

7.8.1.5. Анализ метаболических путей.

Результаты всех обработок клеток циклодекстринами анализировали для определения затронутых ключевых метаболических путей в линии клеток 18453 NPC1. ID гена, кратность изменения и р-значение

- 62 033892 для каждого гена использовали для получения графиков рассеяния для большого массива данных с использованием программного обеспечения Ingenuity Pathway Analysis. На этих графиках были продемонстрированы активируемые и подавляемые при различных обработках гены. Затем для групп генов оценивали вероятность их способности изменять определенные метаболические пути (-log 10 (pACCC)) по сравнению с их дифференциальными уровнями экспрессии (-Dlog10(pORA). Вероятностное картирование элементов гена, которые могут изменять пути, не обязательно исключает вовлеченность других элементов гена в изменение других путей.

Эти данные были проанализированы в контексте путей, полученных из базы данных Энциклопедии генов и геномов Киото (KEGG) (релиз 73.0+/03-16 марта 2015 г.) (Kanehisa et al., 2000; Kanehisa et al., 2002), онтологии генов из базы данных Консорциума генной онтологии (19 сентября 2014 г.) (Ashburner et al., 2000; Gene Ontology Consortium, 2001), микроРНК из miRBase (релиз 21) и баз данных TARGETSCAN (TargetScan релиз 6.2 (обновлен в марте 2015 г.)) (Griffiths-Jones et al., 2008; Kozomara and Griffiths-Jones, 2014; Friedman et al., 2009; Grimson et al., 2007) и заболеваний из базы данных KEGG (релиз 73.0+/03-16 марта 2015 г.) (Kanehisa et al., 2000; Kanehisa et al., 2002).

Программа Ingenuity Pathway Analysis (Qiagen) оценивает пути с помощью факторного анализа, предложенного в источнике (Draghici et al., 2007; Tarca et al., 2009, Khatri et al., 2007). В факторном анализе используют два типа доказательств: i) преобладание дифференциально экспрессируемых (DE) генов в данном пути и ii) изменение этого пути, вычисленное посредством распространения измеренных изменений экспрессии по топологии пути. Эти аспекты охватываются двумя независимыми значениями вероятности, pORA и pAcc, которые затем объединяют в единое совокупное р-значение. Топологии путей, состоящие из генов и их взаимодействий, получают из базы данных KEGG (Kanehisa et al., 2000; Kanehisa et al., 2010; Kanehisa et al., 2012; Kanehisa et al., 2014).

Первая вероятность, pORA, представляет собой вероятность получения числа генов DE, принадлежащих данному пути, большего или равного случайно наблюдаемому числу (Draghici et al., 2003; Draghici 2011). Предположим, что в эксперименте проведено определение для N генов, причем M из них принадлежат данному пути. Основываясь на предшествующем отборе генов DE, было обнаружено, что K из M генов являются дифференциально экспрессируемыми. Вероятность наблюдения точно x дифференциально экспрессируемых генов, принадлежащих данному пути, вычисляют на основе гипергеометрического распределения: поскольку гипергеометрическое распределение является дискретным распределением, вероятность случайного наблюдения менее чем x генов, принадлежащих данному пути, может быть вычислена посредством суммирования вероятностей получения 1 или 2 или... или x-1 генов, принадлежащих данному пути:

Для вычисления избыточного p-значения для получения числа генов DE, принадлежащих данному пути, большего или равного наблюдаемому числу, инструмент Ingenuity Pathway вычисляет pORA = p(x) = 1-p(x-1):

pjx-l) = P(X=I)+P(X=2)+.„+P(X=x-J) = У-----------“ (к)

Вторую вероятность, pAcc, рассчитывают на основе количества изменений, измеренных для каждого пути. Фактор изменения вычисляют для каждого гена, принадлежащего данному пути, используя

В приведенном уравнении член AE(g) представляет собой имеющее знак нормированное измеренное изменение экспрессии гена g, а a(g) представляет собой априорное значение, основанное на типе гена. Второй член представляет собой сумму факторов изменений всех генов u, расположенных непосред ственно выше целевого гена g, нормированное на число нижерасположенных генов для каждого такого гена N (u). Величина β характеризует силу взаимодействия между генами g и u. Знак β представляет собой тип взаимодействия: плюс для сигналов, подобных активации, и минус для сигналов, подобных ингибированию. Следовательно, Ingenuity Pathway Analysis вычисляет полное накопление изменений на уровне каждого гена Acc(g) как разность между фактором изменения PF(g) и наблюдаемым логарифмом кратности изменений:

(5) Accfg,) = PF(_gi) Все накопления изменений вычисляют одновременно путем решения системы линейных уравнений, возникающей в результате объединения приведенного выше уравнения (см. выше) для всех генов

- 63 033892 данного пути. После вычисления всех накоплений изменений Ingenuity Pathway вычисляет общее накопление для пути как сумму абсолютных накоплений для всех генов. Значимость случайного получения большего значения общего накопления (pAcc) оценивается посредством самонастройки.

Два типа доказательств, pORA и pAcc, объединяют в одно окончательное р-значение с использованием метода Фишера. Затем это p-значение корректируют для множественных сравнений с помощью ожидаемой доли ложных отклонений (false discovery rate, FDR) и поправки Бонферрони (Bonferroni). Метод Бонферрони является самым простым и более консервативным из двух (Bonferroni, 1935; Bonferroni, 1936). Он уменьшает частоту ложных обнаружений путем наложения более жесткого порога на каждое сравнение, взвешенное по общему числу сравнений. FDR является более мощным в отношении обнаружения большего числа ложных положительных результатов (Benjamini and Hochberg, 1995; Benjamini and Yekutieli, 2001). Это гарантирует, что общий процент ложных положительных результатов ниже выбранного порогового значения.

7.8.2. Результаты.

7.8.2.1. Валидация анализа.

Перед проведением исследований полного транскриптома клетки GM18453 и GM05659 обрабатывали Kleptose® HPB в диапазоне концентраций (от 0,1 до 10 мМ) и оценивали влияние на выбранные гены, связанные с гомеостазом холестерина.

Результаты приведены ниже в табл. 23 и изображены на фиг. 37. Результаты выражены в виде кратности изменений (КИ) (log(RM)).

Таблица 23

Обработка клеток GM05659 и GM18453c применением Kleptose® HPB

ID гена	Классификация гена	необработанны е клетки GM05659 (дикого типа)	необработанны eGM18453	0,1 мМ GM1845 3	1,0мМ GM1845 3	10,0 мМ GM1845 3
A1DOB	транспорт холестерина	1,723	0,721	0,6332	2,016	2,558
ABACA1	транспорт холестерина	1,115	0,403	0,345	1,7634	4,569
ABCG1	транспорт холестерина	1,316	0,805	0,717	1,23	3,109
ABCG2	транспорт	1,432	1,222	1,101	1,893	2,467

- 64 033892

ID гена	Классификация гена	необработанны е клетки GM05659 (дикого типа)	необработанны eGM18453	0,1 мМ GM1845 3	1,0мМ GM1845 3	10,0 мМ GM1845 3
	холестерина
АСАТ	этерификация холестерина	1,742	1,124	1,112	2,371	2,4322
ANKFY1	лизосомальный	1,823	0,957	0,786	2,254	2,279
АРОА1	метаболизм липидов	2,672	1,459	1,93447	2,7346	4,9437
АРОЕС1	метаболизм липидов	1,217	1,081	0,9996	1,5988	2,1115
CEL	транспорт липидов	2,045	1,038	1,006	1,989	3,229
СЕТР	перенос эфиров холестерина	1,789	1,106	1,4803	2,005	3,7633
ХОЛЕСТЕР ИН25Н	транспорт липидов	1,643	0,845	1,2246	2,007	1,788
DHCR7	сборка липопротеинов	1,821	0,677	0,4668	1,634	1,228
FDFT1	синтез холестерина	1,145	0,781	0,8491	0,9572	1,117
GGPS1	синтез холестерина	1,509	1,512	1,432	1,648	1,589
IDI1	синтез холестерина	2,28	1,402	1,227	2,766	3,444
LIPA	метаболизм липидов	1,607	0,917	0,893	1,339	1,7232
MVD	синтез холестерина	1,7224	1,593	1,5423	1,6772	2,1077
SC4MOL	синтез холестерина	1,837	1,71	1,6632	1,8905	1,9436
SC5DL	синтез холестерина	2,734	1,893	2,2911	3,244	4,131
SOAT2	сборка липопротеинов	1,436	0,533	0,6021	0,9978	1,639
SREBF2	синтез холестерина	1,6044	0,821	0,5299	1,7541	1,9444

Результаты демонстрируют дозозависимое действие Kleptose® HPB на клетки, гомозиготные по мутации NPC1, и дополнительно демонстрируют, что из трех исследованных концентраций 1,0 мМ Kleptose® HPB подходит для получения значимых данных.

7.8.2.2. Анализ очищенных композиций.

7.8.2.2.1. Влияние на экспрессию предварительно выбранных генов гомеостаза холестерина.

Как обсуждалось в примере 7, авторы настоящего изобретения обнаружили, что протоколы очистки, которые включают адсорбцию на оксиде алюминия, значительно изменяют характеристический спектр замещения смеси гидроксипропил-бета-циклодекстринов. Для оценки того, насколько это изменение изменяет фармакологическое действие композиции, авторы настоящего изобретения сравнили действие (i) очищенных различным образом композиций и (ii) Kleptose® HPB на экспрессию генов гомеостаза холестерина в клетках GM18453, гомозиготных по мутации NPC1.

К своему удивлению, авторы настоящего изобретения не обнаружили различий.

На фиг. 38 показана кратность изменений экспрессии в клетках GM18453, гомозиготных по мутации NPC1, подмножества генов гомеостаза холестерина, экспрессия которых статистически значимо отличалась (р < 0,001) после обработки, для четырех различных композиций: СТД (стандартный препарат Kleptose® HPB); AC (Kleptose® HPB, очищенная с помощью хроматографии на оксиде алюминия); OP (Kleptose® HPB, очищенная путем осаждения растворителем) и AO (Kleptose® HPB, очищенная с помощью хроматографии на оксиде алюминия и осаждения растворителем); см. пример 7 для получения подробных сведений о протоколах очистки и соответствующих композициях.

Ни одна из очищенных композиций в любой из исследуемых концентраций, по существу, не отличалась от исходной композиции, Kleptose® HPB (СТД), несмотря на отсутствие соединений с низким значением DS в композициях, очищенных на оксиде алюминия. Таким образом, представляется, что со

- 65 033892 ответствующая фармакологическая активность композиции - ее действие на гомеостаз холестерина - относится к более замещенным соединениям, содержащимся в Kleptose® HPB, поскольку удаление незамещенных молекул бета-циклодекстрина (DS-0), монозамещенных гидроксипропил-бетациклодекстринов (DS-1) и существенное снижение содержания дизамещенных гидроксипропил-бетациклодекстринов (DS-2) не оказывало заметного влияния на способность композиции изменять экспрессию генов гомеостаза холестерина в клетках NPC1.

7.8.2.2.2. Анализ полного генома.

В анализе, описанном выше, авторы настоящего изобретения оценивали изменения экспрессии генов, которые были предварительно выбраны как соответствующие первичному дефекту, вызванному мутацией NPC1, и сравнивали влияние на экспрессию только того подмножества предварительно выбранных генов, экспрессия генов которого статистически значимо отличалась после обработки гидроксипропил-бета-циклодекстрином. Для подтверждения наблюдения, что удаление соединений с низким значением DS не оказывает заметного влияния на соответствующую фармакологическую активность, и для дополнительного изучения возможных различий между композициями авторы настоящего изобретения выполнили анализ полного генома для определения на основе статистических расчетов биологических путей, подвергшихся наибольшему воздействию при обработке.

Авторы настоящего изобретения выполнили анализ путей полного генома клеток NPC1, обработанных 1,0 мМ Kleptose®HPB и 1,0 мМ очищенной партии CYL-4063. Как подробно описано в примере 7, CYL-4063 получали из Kleptose® HPB с помощью комбинации абсорбционной хроматографии на оксиде алюминия и осаждения растворителем. Как показано в табл. 21 в примере 7, очистка значительно снижала долю соединений с низким значением DS, причем только 3,2% циклодекстриновых соединений в CYL-4063 имели 0, 1 и 2 заместителя в совокупности, по сравнению со средним общим содержанием DS0, DS-1 и DS-2 в Kleptose® HPB, составляющим 16,2%.

Как показано на фиг. 39, три из четырех важнейших путей, определенных как статистически наиболее значительно затронутые обработкой 1,0 мМ Kleptose® HPB, также входят в число четырех важнейших путей, статистически наиболее значительно затронутых обработкой 1,0 мМ CYL-4063, и это сигнальный путь erbB, сигнальный путь MARK и сигнальный путь GnRH. Эти результаты подтверждают малое изменение общей активности смеси гидроксипропил-бета-циклодекстринов в клетках GM 18453, несмотря на удаление из CYL-4063 соединений с низким значением DS.

Кроме того, авторы настоящего изобретения наблюдали также, что путь биосинтеза стероидов, непосредственно затронутый первичным дефектом, вызванным мутацией NPC1 в этих клетках, является вторым путем, наиболее значимо затронутым после обработки 1,0 мМ CYL-4063, но только шестым, наиболее статистически значимо затронутым обработкой 1,0 мМ Kleptose® HPB. Эти результаты согласуются с гипотезой о том, что влияние композиции на гомеостаз холестерина относится к более замещенным соединениям циклодекстринов, содержащихся в очищенной композиции в более высоких концентрациях.

7.8.2.3. Активность фракций, имеющих различную степень замещения.

Для того чтобы непосредственно оценить неравный вклад соединений циклодекстрина, имеющих различную степень гидроксипропильного замещения, авторы настоящего изобретения провели фракционирование партии Kleptose® HPB с получением трех объединенных фракций, имеющих соответственно низкую, среднюю и высокую степень гидроксипропильного замещения, и исследовали действие этих объединенных фракций на экспрессию генов в клетках NPC1.

7.8.2.3.1. Способы.

(а) Фракционирование.

Фракции получали из Kleptose® HPB партии Е0245. Распределение соединений бетациклодекстрина в исходном продукте Е0245 представлено в табл. 21 (пример 7), выдержка из соответствующей части - в табл. 24 ниже.

Таблица 24

Количественное представление распределения пиков

ID партии	m/z 1152 (DS-0)	m/z 1210 (DS-1)	m/z 1268 (DS-2)	m/z 1326 (DS3)	m/z 1384 (DS4)	m/z 1442 (DS5)	m/z 1500 (DS6)	m/z 1558 (DS7)	m/z 1618 (DS8)	Общий сигнал
ЕО245	0	295840	965902	190740 8	234501 8	180773 2	880668	285778	0	848834 5
0,0%	3,5%	11,4%	22,5%	27,6%	21,3%	10,4%	3,4%	0,0%	100,0%

Образец Kleptose® HPB (партии Е0245) массой 15 г разделяли на колонке CD-screen, по существу, как описано выше в примере 5.3.1, и собирали фракции. На фиг. 40 показаны хроматограммы различных фракций, полученных путем препаративного хроматографического разделения методом CD-Screen, снабженные примечаниями для демонстрации степени замещения хроматографически разделенных соединений гидроксипропил-бета-циклодекстринов.

Фракция 2 была выбрана в качестве фракции с низкой степенью замещения, L (CYL-4103). Фракция, содержащая соединения со средней степенью замещения, M (CYL-4104), представляет собой объединенные фракции 4-15. Фракция, имеющая высокую степень замещения, H (CYL-4105), представля

- 66 033892 ет собой объединенные фракции 16-24. На фиг. 41 показаны спектры, полученные методом МС с ионизацией электрораспылением, для (A) Kleptose® HPB партии Е0245, снабженные примечаниями для идентификации сигналов по степени гидроксипропильного замещения; (B) объединенной фракции L; (C) объединенной фракции M и (D) объединенной фракции H.

(b) Определение профиля экспрессии.

Линию клеток NPC GM18453 (500000 клеток на лунку) параллельно обрабатывали 1,0 мМ фракций L, M и H. После каждой обработки выделяли РНК с последующим получением библиотек кДНК в соответствии с предыдущими методами. Секвенирование библиотек кДНК приводило к получению 28891287-50245721 парных чтений на образец. Для улучшения качества картирования парные чтения были обрезаны до 50 пар оснований. Все чтения в формате color-space были выравнены на референсный геном человека (Ensembl, релиз 73) с использованием программного обеспечения TopHat v2.1.0, использующего Bowtie версии 1.0.0. Значения RPKM (количество чтений на тысячу нуклеотидов транскрипта на миллион картированных чтений) для оценки уровней экспрессии генов рассчитывали с помощью программного обеспечения Cufflinks v2.0.2, а исходные подсчеты были получены с помощью приложений Illumina Base Space Core Apps с использованием генных аннотаций генов, кодирующих белки, загруженных из Ensembl (релиз 73). Дифференциальную экспрессию/кратность изменения оценивали по исходным подсчетам с помощью программного обеспечения edgeR. Все программы использовали с их параметрами по умолчанию, a TopHat настраивали таким образом, чтобы не находить новые сайты соединения. Кратность изменения для каждого гена визуализировали с помощью программного обеспечения TIBCO Spotfire (версии 7.0). Для отображения изменений дифференциальной экспрессии генов использовали комбинацию древовидной карты и гистограмм.

Для сравнения аналогичные исследования проводили с применением Kleptose® HPB и нефракционированной очищенной партии CYL-4077 (см. пример 7).

7.8.2.3.2. Результаты.

Авторы настоящего изобретения провели анализ транскриптома полного генома, чтобы определить на основе статистических расчетов 10 биологических путей, подвергшихся наибольшему воздействию при обработке фракциями L, M и H.

На фиг. 42 показаны 10 биологических путей, подвергшихся наибольшему воздействию при обработке клеток NPC 1,0 мМ фракций L, M и H, расположенных в порядке снижения статистической значимости. В соответствии с предыдущими наблюдениями авторов настоящего изобретения фракция L не вызывала статистически значимых изменений в экспрессии генов пути биосинтеза стероидов. Совершенно противоположным образом путь биосинтеза стероидов является биологическим путем, наиболее статистически значимо затронутым при обработке клеток NPC1 фракцией M. Фракция M в основном состоит из бета-циклодекстриновых соединений, содержащих 3, 4, 5 и 6 гидроксипропильных заместителей (DS3, DS4, DS5 и DS6). Фракция H, содержащая в основном DS5, DS6 и DS7, также приводит к изменениям в экспрессии генов пути биосинтеза холестерина, причем путь биосинтеза холестерина является вторым наиболее значимым путем.

Эти результаты предоставляют прямые доказательства того, что способность восстанавливать гомеостаз холестерина относится к содержащимся в Kleptose® HPB соединениям циклодекстринов, которые имеют более высокую степень гидроксипропильного замещения.

7.8.2.4. Сравнение фракций с нефракционированными композициями.

Следствием наблюдения авторов настоящего изобретения, что соединения циклодекстрина, имеющие различную степень гидроксипропильного замещения, избирательно влияют на экспрессию генов в клетках NPC, является то, что общая фармакологическая активность композиции в целом должна зависеть от характеристического спектра композиции, то есть от относительных долей в различной степени гидроксипропилированных соединений, содержащихся в композиции.

Авторы настоящего изобретения подтвердили эту гипотезу путем сравнения изменений экспрессии генов на основании изменений от конкретного гена к конкретному гену (то есть на основании ID гена) после обработки клеток NPC 1,0 мМ либо (i) нефракционированной Kleptose® HPB, либо (ii) нефракционированной CYL-4077, которую предварительно выделяли из Kleptose® HPB с помощью абсорбционной хроматографии на оксиде алюминия и избирательного осаждения растворителем, либо (iii) фракции L, (iv) фракции M или (v) фракции H.

Авторы настоящего изобретения наблюдали, что 64% генов, экспрессия которых подвержена значительному влиянию Kleptose® HPB в концентрации 1,0 мМ, также подвержены значительному влиянию при обработке очищенной партией (партия CYL-4077) в концентрации 1,0 мМ.

Это общее процентное содержание значительно выше, чем процентное содержание генов, экспрессия которых подвержена значительному влиянию при обработке как 1,0 мМ Kleptose® HPB, так и 1,0 мМ любой одной из фракций L, M и H (37, 43 и 48% соответственно).

Аналогично, 64% общей идентичности генов, подверженных влиянию как Kleptose® HPB, так и CYL-4077, значительно выше, чем процентное содержание генов, экспрессия которых подвержена значитальному влиянию при обработке как 1,0 мМ CYL-4077, так и 1,0 мМ любой одной из фракций L,

- 67 033892

M и H (41, 38 и 44% соответственно).

7.8.2.5. Гены, вовлеченные в аутофагию.

Было продемонстрировано, что гидроксипропил-бета-циклодекстрин усиливает аутофагический клиренс агрегатов протеолипидов, которые накапливаются при болезни НПС (Song et al., 2014, J. Biol. Chem. vol. 289(14), p. 10211-10222). Поэтому авторы настоящего изобретения проанализировали влияние обработки 1,0 и 10,0 мМ Kleptose® HPB, CYL-4077 и каждой из фракций H, M и L на экспрессию генов, связанных с аутофагией, в клетках NPC GM18453.

В табл. 25 приведены все гены аутофагии, изменения в экспрессии которых после обработки были статистически значимы (р < 0,05), и продемонстрировано, что концентрации 1,0 мМ оказывают небольшое влияние на гены, связанные с аутофагией.

Таблица 25

Анализ генов аутофагии клеток GM18453 (1,0 мМ)

Kleptose® HPB	CYL-4077	«Н»	«М»	«L»
ID гена	кратность изменения	ID гена	кратность изменения	ID гена	кратность изменения	ID гена	кратность изменения	ID гена	кратность изменения
ATG2B	-0,995	ATG2B	1,1123	-	-	-	-	-	-

В табл. 26 приведены все гены аутофагии, изменения в экспрессии которых после обработки были статистически значимы (р<0,05) при концентрациях 10,0 мМ.

Таблица 26

Анализ генов аутофагии клеток GM18453(10,0 мМ)

Kleptose® НРБ	CYL-4077	«Н»	«М»	«L»
ID гена	кратность изменения	ID гена	кратность изменения	ID гена	кратность изменения	ID гена	кратность изменения	ID гена	кратность изменения
ATG10	1,23	ATG10	1,045	ATG5	з,п	ATG5	4,332	ATG10	2,7
ATG2A	-0,53	ATG12	0,79	ATG2	-2,65	ATG10	2,705
ATG16L 2	0,57	ATG2 А	-0,53	ATG10	-5,4	ATG16	11,294
ATG3	-0,71	ATG2B	1,1023	ATG18	4,5	ATG12	8,34
ATG4A	1,72	ATG3	-0,68	ATG10 1	2	BECN1	2,7
BECN1	0,45	BECN1	0,96	BECN1	7,12	VPS15	3,356
				VPS15	5,63	VPS13 в	9,28
				VPS13 в	-4,793	VPS36	-4,899
				VPS36	-4,112	VPS37 в	-4,897
				VPS37 в	4,42

Результаты обработки с применением 10,0 мМ демонстрируют, что Kleptose®HPB и CYL-4077 оказывают одинаковое влияние на экспрессию генов, вовлеченных в аутофагию, и дополнительно демонстрируют, что это влияние обеспечивается соединениями, имеющими более высокую степень замещения, принимая во внимание, что фракция L оказывает наименьшее влияние на экспрессию генов, вовлеченных в аутофагию, по сравнению с фракцией H и фракцией M.

7.8.3. Обсуждение.

Используя эксперименты по определению профиля экспрессии генов, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что композиция гидроксипропил-бета-циклодекстринов для парентерального введения, Kleptose® HPB, способна восстанавливать уровни экспрессии генов гомеостаза холестерина в клетках, гомозиготных по мутации NPC1, и усиливать экспрессию генов, связанных с аутофагией. Эти результаты согласуются с данными, полученными в результате клинического исследования на людях, демонстрирующими, что интратекальное введение Kleptose® HPB эффективно для стабилизации или замедления прогрессирования симптомов у пациентов с болезнью НПС. Корреляция с клиническими данными демонстрирует, что анализ экспрессии генов может быть использован для измерения эффективности in vitro.

Методом МС с ионизацией электрораспылением продемонстрировано, что Kleptose® HPB представляет собой сложную смесь, содержащую молекулы бета-циклодекстринов, имеющие различную степень гидроксипропилирования, в воспроизводимых пропорциях.

Способ очистки, который авторы настоящего изобретения разработали для удаления технологических и других примесей из Kleptose® HPB, дополнительно обеспечивает удаление соединений бета

- 68 033892 циклодекстрина с низкой степенью замещения, изменяя характеристический спектр композиции. Эксперименты по определению профиля экспрессии генов продемонстрировали, что, несмотря на указанное изменение в характеристическом спектре композиции, значительного изменения способности композиции нормализовать экспрессию генов путей биосинтеза холестерина в клетках, гомозиготных по мутации NPC, не наблюдалось.

Эти данные свидетельствуют о том, что соответствующая фармакологическая активность обеспечивается прежде всего соединениями с большей степенью замещения, чем у тех, которые удаляются во время очистки.

Авторы настоящего изобретения подтвердили этот вывод путем фракционирования сложной смеси с получением объединенных фракций, содержащих соединения бета-циклодекстрина с низкой (L), средней (M) и высокой (H) степенью гидроксипропильного замещения, и оценки воздействия на экспрессию генов в клетках NPC. Результаты показали, что фракция L не оказывает заметного влияния на экспрессию генов путей биосинтеза холестерина или аутофагии, тогда как фракции M и H значительно влияют на экспрессию генов биосинтеза холестерина и аутофагии. Эти эксперименты также продемонстрировали, что фармакологическая активность композиции в целом складывается из активностей, отдельно обеспечиваемых бета-циклодекстриновыми соединениями, имеющими различную степень гидроксипропильного замещения; общая фармакологическая активность зависит от характеристического спектра композиции, то есть от относительных долей в различной степени гидроксипропилированных соединений, содержащихся в композиции.

Хотя фармакологическая активность композиции в целом складывается из активностей, отдельно обеспечиваемых бета-циклодекстриновыми соединениями, имеющими различную степень гидроксипропильного замещения, неожиданно было обнаружено, что соединения с низкой степенью гидроксипропильного замещения, удаляемые способом очистки, разработанным авторами настоящего изобретения, вносят незначительный вклад, если вносят вообще, в специфическую активность смеси, имеющую фармакологическое значение для лечения болезни НПС. Этот обнаруженный факт позволит производить введение более высокоочищенной композиции ГПБЦД с определенным составом, разработанной авторами настоящего изобретения, посредством интратекального или интрацереброваскулярного пути в СМЖ пациентов с болезнью НПС в течение более длительных периодов времени с обеспечением терапевтического эффекта и повышенной безопасности.

7.9. Пример 9. Альтернативная методика препаративного фракционирования.

Как обсуждалось в примере 8, три фракции, имеющие различную среднюю степень замещения, для применения в экспериментах по определению профиля экспрессии генов получали с использованием колонки CD-Screen для хроматографического разделения.

В качестве альтернативы авторы настоящего изобретения также получали фракции Kleptose® HPB (партия Е0245) с использованием колонки с оксидом алюминия, по существу, как описано выше в примере 5.7.2. Образец наносили на колонку с оксидом алюминия и изократически элюировали 100% метанолом. На фиг. 43 показаны хроматограммы различных фракций, снабженные примечаниями, чтобы показать пронумерованные фракции, объединенные для получения фракций A-F и K, и дополнительно снабженные примечаниями, чтобы показать степень замещения хроматографически разделенных соединений гидроксипропил-бета-циклодекстринов.

Экспериментальные параметры были дополнительно оптимизированы для максимально возможного удаления из Kleptose® HPB незамещенного НЦД и ГПБЦД DS1 с наименьшей потерей ГПБЦД DS2 и DS3. Подробные сведения о способах очистки приведены ниже.

Одинаковые параметры для каждого испытанного способа (способы II-XI):

колонка с оксидом алюминия массой 210 г;

скорость потока 30 мл/мин;

100 сек/фракцию;

время задержки 60 с.

Только MeOH в качестве элюента:

Способ II. 21 г Kleptose, 30 фракций, элюент: изократическое элюирование 100% MeOH, выход: 79,4%.

Способ III. 10,5 г Kleptose, 30 фракций, элюент: изократическое элюирование 100% MeOH, выход: 72,3%.

Способ IV. 15 г Kleptose, 30 фракций, элюент: изократическое элюирование 100% MeOH, выход: 77,7%.

MeOH + вода в качестве элюентов.

Способ V. 10,4 г Kleptose, 30 фракций, элюент: изократическое элюирование 100% MeOH (выход: 73,8%) + 30 фракций, изократическое элюирование 100% MeOH (общий выход 60 фракций: 75,9%) + 30 фракций, 3-стадийное изократическое элюирование (90, 80, 70% MeOH, 15 мин каждое) с короткими (100 с) промежуточными градиентными элюированиями между стадиями, общий выход 90 фракций: 83,1%.

- 69 033892

Способ VI. 10,5 г Kleptose, элюент: MeOH+вода, 75 фракций, градиентное элюирование 20 мин 100^80% MeOH, изократическое элюирование 106 мин 80% MeOH, выход: 82,8%.

Способ VII. Такой же, как способ VI, но с 70% MeOH вместо 80%, выход: 91,2%.

Способ VIII. 10,5 г Kleptose, элюент: MeOH+вода, изократическое элюирование 75% MeOH, 30 фракций, выход: 86,4%.

Способ IX. 10,6 г Kleptose, элюент: MeOH+вода, изократическое элюирование 70% MeOH, 30 фракций, выход: 89,2%.

EtOH (чистота 96%) + вода в качестве элюентов.

Способ X. 10,5 г Kleptose, 30 фракций, элюент: изократическое элюирование 100% EtOH (выход: 27,6%) + 30 фракций, изократическое элюирование 70% EtOH, общий выход 60 фракций: 82,1%.

Способ XI. 10,5 г Kleptose, 60 фракций, элюент: изократическое элюирование 80% EtOH, выход: 82,3%.

На фиг. 44 показаны хроматограммы смеси ГПБЦД после использования различных способов очистки. Отношение DS2/DS1 в смеси после очистки обобщено в табл. 27.

Таблица 27

Отношение DS2/DS1

Образец	площадь DS1	площадь DS2	DS2/DS1
Способ II	790,2	10187,9	12,893
Способ III	282,8	7836,0	27,706
Способ IV	607,1	10563,8	17,400
Способ V	537,5	11873,2	22,090
Способ VI	344,7	11678,9	33,885
Способ VII	982,1	14857,8	15,129
Способ VIII	318,9	10708,8	33,577
Способ IX	729,9	13698,6	18,768
Исходный ГПБЦД (для способов II IX)	5013,215	16290,0	3,249
Способ X	1371,7	14023,1	10,223
Способ XI	274,1	9445,5	34,464
Исходный ГПБЦД (для способов X XI)	5161,88	17371,5	3,365

7.10. Пример 10. Клиническое исследование фазы I для БНПС через 18 месяцев.

Был проведен дополнительный анализ по данным клинического исследования фазы I для болезни Ниманна-Пика типа С, включая результаты эффективности через 18 месяцев. Результаты показаны на фиг. 45-50. Как обобщено на фиг. 45, для анализа данных клинического исследования фазы I через 18 месяцев были использованы угловой коэффициент в пересчете на год, изменение относительно исходных значений и анализ данных пациентов, ответивших на лечение. На основании скорости изменений в пересчете на год результаты лечения в течение 18 месяцев показывают, что смесь ГПБЦД представляет собой лекарственное средство, изменяющее течение заболевания (фиг. 46). При применении смеси ГПБЦД у пациентов с БНПС показано достоверное улучшение или стабилизация заболевания относительно исходного уровня (фиг. 47). Лечение с применением смеси ГПБЦД также обусловливает больший процент пациентов, демонстрирующих стабильное заболевание или улучшение течения заболевания (фиг. 48). Влияние лечения на слух наблюдается, в первую очередь, в диапазоне высоких частот и поддается коррекции с помощью слуховых аппаратов (фиг. 49). На фиг. 50 обобщены сделанные на настоящий момент заключения в отношении влияния лечения на слух.

8. Эквиваленты и включение посредством ссылки

Все публикации, патенты, заявки на патенты и другие документы, цитируемые в настоящей заявке, настоящим включены в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте во всех отношениях в той же степени, как если бы для каждой отдельной публикации, патента, заявки на патент или другого документа было бы индивидуально указано, что они включены посредством ссылки для всех целей.

Несмотря на то что были проиллюстрированы и описаны различные конкретные варианты реализации, следует понимать, что могут быть сделаны различные изменения без отступления от сущности и объема настоящего описания.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1.0е5

0.00»

1100 1200

1.0е6

9.0е5

8.0е5

7.0е5

6.0е5

5.0е5

4.0е5

3.0е5

1.1е6

1.2е6

1.3е6

1.4е6

1. Активный фармацевтический ингредиент, содержащий смесь молекул бета-циклодекстринов, замещенных в одном или более гидроксильных положениях гидроксипропильными группами, необязательно содержащую незамещенные молекулы бета-циклодекстрина, где указанная смесь содержит менее 1% незамещенного бета-циклодекстрина (DS-0) и бета

- 70 033892 циклодекстрина, замещенного одной гидроксипропильной группой (DS-1), в совокупности;

по меньшей мере 85% бета-циклодекстрина, замещенного тремя гидроксипропильными группами (DS-3), бета-циклодекстрина, замещенного четырьмя гидроксипропильными группами (DS-4), бетациклодекстрина, замещенного пятью гидроксипропильными группами (DS-5), и бета-циклодекстрина, замещенного шестью гидроксипропильными группами (DS-6), в совокупности;

менее 1% бета-циклодекстрина, замещенного девятью гидроксипропильными группами (DS-9), и бета-циклодекстрина, замещенного десятью гидроксипропильными группами (DS-10), в совокупности, как установлено по высоте пиков на спектре, полученном методом масс-спектрометрии (МС) с ионизацией электрораспылением; и указанная смесь имеет среднее молярное замещение (МЗ) в диапазоне от 0,50 до 0,80.

2.0е5

2 4 6 8 10 12 14 (минуты)

Фиг. 22

Фиг. 23

Фиг. 24

минуты

Фиг. 25

6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5

Минуты

Фиг. 26

Фиг. 27

Фиг. 28

2 4 6 8 10 20 30 40 44

Содержание в зависимости от времени сбора данных (мин)

Фиг. 18

-Roquette Е0223: 0.6% НЦД, 3.7% DS-1, 0.2% других Очищенная: 0.2% НЦД, 2.6% DS-1, 0.1% других

0 2 4 очищен-6 8 10 12 14 16

Фиг. 19

Фиг. 20

Фиг. 21

- 75 033892 —Roquette E0223: 0.6% НЦД, 3.7% DS-1, 0.2% других — Очищенный фильтрат: 0.1% НЦД, 2.1% DS-1, 0.1% других — Очищенный 1-й промывочный раствор: 0.1% НЦД, 2.0% DS-1, 0.1% других

2. Активный фармацевтический ингредиент по п.1, где менее 0,1% смеси бета-циклодекстринов представляет собой DS-0 и DS-1 в совокупности или менее 0,01% смеси бета-циклодекстринов представляет собой DS-0 и DS-1 в совокупности.

3. Активный фармацевтический ингредиент по п.1, где по меньшей мере 87% смеси бетациклодекстринов представляет собой DS-3, DS-4, DS-5 и DS-6 в совокупности или по меньшей мере 90% смеси бета-циклодекстринов представляет собой DS-3, DS-4, DS-5 и DS-6 в совокупности.

4. Активный фармацевтический ингредиент по любому из пп.1-3, где менее 0,1% смеси бетациклодекстринов представляет собой DS-9 и DS-10 в совокупности или менее 0,01% смеси бетациклодекстринов представляет собой DS-9 и DS-10 в совокупности.

5. Активный фармацевтический ингредиент по любому из пп.1-4, где МЗ находится в диапазоне от 0,60 до 0,70 или в диапазоне от 0,64 до 0,68 или МЗ составляет примерно 0,66-0,67.

6. Активный фармацевтический ингредиент по любому из пп.1-5, дополнительно содержащий фармацевтически приемлемый разбавитель.

7. Активный фармацевтический ингредиент по пп.1-6, где указанная композиция содержит не более 5 ЕЭ эндотоксинов на 1 г смеси бета-циклодекстринов или не более 1,5 ЕЭ эндотоксинов на 1 г смеси бета-циклодекстринов.

8. Активный фармацевтический ингредиент по любому из пп.1-7, содержащий не более 0,5% пропиленгликоля или не более 0,01% пропиленгликоля.

9. Активный фармацевтический ингредиент по любому из пп.1-8, содержащий не более 1 ppm пропиленоксида.

10. Активный фармацевтический ингредиент по любому из пп.1-9, где указанный активный фармацевтический ингредиент подходит для интратекального или интрацеребровентрикулярного введения.

11. Активный фармацевтический ингредиент по п.10, где указанный фармацевтически активный ингредиент имеет осмоляльность от примерно 300 до примерно 450 мОсм/кг.

12. Активный фармацевтический ингредиент по п.10 или 11, где указанный активный фармацевтический ингредиент содержит от примерно 10 до примерно 200 мг/мл смеси бета-циклодекстринов.

13. Активный фармацевтический ингредиент по любому из пп.1-12, где указанная смесь содержит менее 3% незамещенного бета-циклодекстрина (DS-0), бетациклодекстрина, замещенного одной гидроксипропильной группой (DS-1), и бета-циклодекстрина, замещенного двумя гидроксипропильными группами (DS-2), в совокупности;

по меньшей мере 65% бета-циклодекстрина, замещенного пятью гидроксипропильными группами (DS-5), бета-циклодекстрина, замещенного шестью гидроксипропильными группами (DS-6), и бетациклодекстрина, замещенного семью гидроксипропильными группами (DS-7), в совокупности;

менее 3% бета-циклодекстрина, замещенного девятью гидроксипропильными группами (DS-9), и бета-циклодекстрина, замещенного десятью гидроксипропильными группами (DS-10), в совокупности, как установлено по высоте пиков на спектре, полученном методом МС с ионизацией электрораспылением.

14. Способ лечения болезни Ниманна-Пика, включающий введение пациенту с болезнью НиманнаПика типа С терапевтически эффективного количества активного фармацевтического ингредиента по любому из пп.1-13.

15. Способ по п.14, где указанное введение представляет собой интратекальное или интрацеребровентрикулярное введение.

16. Способ по п.14 или 15, включающий введение пациенту от примерно 300 до примерно 2000 мг смеси бета-циклодекстринов.

17. Способ по любому из пп.14-16, где указанное введение осуществляют один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в месяц, один раз в два месяца или один раз в три месяца.

18. Способ по любому из пп.14-17, включающий введение пациенту от примерно 900 до примерно 1800 мг смеси бета-циклодекстринов один раз в две недели или примерно 900 мг смеси бетациклодекстринов один раз в две недели.

19. Способ по любому из пп.14-18, включающий введение количества активного фармацевтического ингредиента,

- 71 033892 достаточного для модулирования уровня в спинномозговой жидкости одного или более из: белка тау, амилоидного пептида, легкого белка нейрофиламентов (NFL), глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), стерола, оксистерола, активности хитотриозидазы, кальбиндина, белка лизосомальной мембраны 1 (LAMP-1), ганглиозидов GM2 или GM3, сфингозина и сфингозин-1-фосфата (S1P); или достаточного для модулирования уровня в плазме одного или более из 7-кетохолестерола, 7βгидроксихолестерола, 24S-гидроксихолестерола, 25-гидроксихолестерола, 27-гидроксихолестерола и холестан-3в,5а,6в-триола; или достаточного для модулирования уровня в моче одной или более из 3Р-сульфокси-7в-№ ацетилглюкозаминил-5-холен-24-овой кислоты (SNAG-A5-CA), конъюгированной с глицином 3βсульфокси-7в-№ацетилглюкозаминил-5-холен-24-овой кислоты (SNAG-A5-CG) и конъюгированной с таурином 3в-сульфокси-7в-№ацетилглюкозаминил-5-холен-24-овой кислоты (SNAG-A5-CT); или достаточного для поддержания или снижения значений одного или более используемых для оценки параметров согласно шкале тяжести БНПС, выбранных из ходьбы, мелкой моторики, когнитивной деятельности, речи, глотания, движения глаз, памяти, слуха и судорог.

Клиническая шкапа тяжести БНПС

Определяет сложность клинических проявлений и прогрессирования

Основные параметры (значение каждого параметра менее или равно 5)

Второстепенные параметры/модификаторы (значение каждого параметра менее или равно 2)

Ходьба

Навыки мелкой моторики

Когнитивная деятельГ еластическая катаплексия

Нарколепсия

Поведение

Глотание

Память

Психические расстройства рефлексия

Недержание

Движение (нейросенсорный)

Приступы

Акустические Респираторстволовые — потенциалы нарушения

Yanjanin et al., “Linear Clinical Progression, Independent of Age of Onset, in Niemann-Pick Disease, Type C,” Am. J. Med. Genet. Part В 153B: 132-140 (2010).

Фиг. 1

Оценка БНПС VTS-270 Естественное течение р-значение для различия в угловых коэффициентах Ср. изменение за один год (ст. ошибка) Общая 0.74 (0.67) 2.53 (0.27) 0.02 Общая без учета слуха и АСП -0.02 (0.69) 2.23 (0.28) 0.004 Ходьба 0.001 (0.18) 0.27(0.07) 0.18 Мелкая моторика 0.03(0.10) 0.11 (0.04) 0.34 Когнитивная деятельность -0.04 (0.16) 0.31 (0.06) 0.04 Глотание -0.11 (0.23) 0.20(0.09) 0.22 Речь -0.16 (0.13) 0.09 (0.05) 0.09 Движение глаз 0.22 (0.16) 0.08 (0.06) 0.42 Слух 0.44(0.16) 0.17(0.06) 0.13 Память -0.04 (0.12) 0.18(0.05) 0.10 Приступы н/о н/о н/о

Фиг. 2

Улучшение или более медленное снижение оценка БНПС

Оценка БНПС** □ □ 101%

71%

Предложенная «комбинированная» конечная точка БНПС

Когнитивная Глотание деятельность** И

Ходьба й Мелк. моторика ^и100% И ^113%73%

278%

Память*

122%

Более быстрое снижение

Нормированный угловой коэффициент в исследовании естественного течения

Слух

Движение глаз gg -175% -^159% ° 12 пациентов с ежемесячным введением и 3 пациента с введением один раз в две недели «Анализ включает дозы до 900 мг

Фиг. 3

Фиг. 4

- 72 033892

7/15 со стабильным заболеванием или улучшением течения заболевания > Ж ___ ^LJLJLJLJUU|J|| ¹⁰ I-IND-1 CDA106 CDA111 l-IND-3 CDA102 CDA103 CDA109 CDA101 CDA104 CDA107 CDA112 CDA110 l-IND-2 CDA108 CDA105

0/13 со стабильным заболеванием или улучшением течения заболевания

-10-----------------------------------------------------------------------------------------5

Сравнительное исследование о естественного течения 5

NPC56 NPCD3 NPC18 NPC23 NPC44 NPC52 NPC10 NPC43 NPC07 NPC24 NPC54 NPC05 NPC17

NPC07, NPC18, NPC24, NPC44, NPC56 и CDA105 не принимают миглустат

Фиг. 5

Фиг. 6

Новая «комбинированная» конечная точка БНПС • Комбинированная оценка, включающая • Ходьбу • Мелкую моторику • Когнитивную деятельность • Глотание

Фиг. 7

Фиг. 8

Фиг. 9 —*ELS1 А, напряжение сигнала (L:\HPLC3\HPLC3_2015\HPBCD\HPBCD_0306\2015-03-06\HPBCD_M09_l.D)

- *ELS1 А, напряжение сигнала (Z:\DATA\HPBCD_0507\HPBCD_0507 2015-05-07\HPBCD_M05_l.D)

150- Растворитель: метанол

125-

Фиг. 10

Фиг. 11

Фиг. 12 —*ELS1 А, напряжение сигнала(2:\ОАТА\НРВСО_05О8\2О15-05-О8\НРВСО_МО6_1.О) — 'ELS1 А, напряжение сигнала L:\HPLC3\HPLC3_2015\HPBCD\HPBCD_0422\ 2015-04-22\HPBCD_M05_l.D)

5 10 15 20 25 30 35

Фиг. 13

5 10 20 30 34

Время сбора данных (мин)

Фиг. 14 —*ELS1 А, напряжение сигнала(X:\HPB0508\2015-05-08\HPB_0508Ml_5ULD) — *ELS1 А, напряжение сигнала(X:\HPB0510\2015-05-ll\HPB_BCD_0508M5_50UL.D)

5 10 15 20 25 30

Фиг. 15

123456 789 1011 12 13 1415 16 17 18 1920 21 22 23242526 27

Фиг. 16

ELS1 А, напряжение сигнала(Х:\НРВ0512\2015-05-12\НРВ_ВС0_ O512M11_1OUL_ 2.D)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Фиг. 17

3 1384.8 1325.0

1269.6

1210.5

1442.7

1500.8

1558.4

Числами обозначено наличие гидроксипропильных фрагментов

1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 m/z, Да

1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 m/z, Да

Фиг. 29

Фиг. 30

С

Фиг. 31

Масс-спектр (39.21-50.97 мс)(1.557 мин) - 2OH-Pr-bCD_Trappsol_Single frame_POS_001_condensed[1]. d

1500 6436

1558.6851

1442.6013

1300 1400 1500 1600 1700

Содержание в зависимости от отношения массы к заряду (m/z)

Фиг. 32

в

Фиг. 33

Фиг. 34

Фиг. 35

Фиг. 36 □ 0.1 мМ

Н1.0 мМ ιο,ο мм

Ξ необработанные 5659

И необработанные GM 18453

Фиг. 37

Фиг. 38

-□-A1DOB -Ь- АВАСА1 -X- ABCG1

ABCG2 -О-АСАТ -I- ANKFY1 -ч- АРОА1 +АРОЕС1 -О-CEL

СЕТР + СН25Н -X- DHCR7

Kleptose ®НРВ 1.0 мМ

Batch CYL-4063 1·0 мМ

Важнейшие биологические пути ^Важнейшие биологические пути Сигнальный путь ЕгЬВ Сигнальный путь МАРК Сигнальный путь МАРК Биосинтез стероидов Сигнальный путь GnRH Сигнальный путь GnRH Эстрогеновый сигнальный путь Сигнальный путь ЕгЬВ Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) Метаболические сигнальные пути Биосинтез стероидов Переносчики семейства АВС Передача сигнала в эпителиальных клетках при инфицировании Helicobacter pylori Сигнальный путь PPAR Алкоголизм Сигнальный путь Т-клеточного рецептора Процессинг белков в эндоплазматическом ретикулуме Сигнальный путь В-клеточного рецептора Меланома Инфицирование вирусом простого герпеса

Фиг. 39

-79033892

Фиг. 40

1075 1125 1175 1225 1 275 1 325 1 3751425 1475 1525 1 575 1 625 1 675

Мэсс<пактр{3е.76-49.67 мс)(1.56О MMn)-CYL-4103-LoDS_Single framB_FOS_002_condensed[1].d

Масс-спектр (39.70-49.83 мс)(1.541 мм н} - CYL-4104-Med DS_Sin0e fram0_POS_OO1_condaieed[1 ].d

Macc-ci тешр (40.52-49.83 мс)(1.559 мин)-cyl-41 06-HiDS_Single1rame_POS_001_t»rriensed[1].d

Содержание в зависимости от отношения массы к заряду (ιτύζ)

Фиг. 41

^S пути Передача сигнала в эпителиальных клетках при инфицировании Helicobacter pylon Биосинтез стероидов | Эстрогеновый сигнальный путь Эстрогеновый сигнальный путь Эстрогеновый сигнальный путь | Биосинтез стероидов | Сигнальный путь ЕгЬВ Передача сигнала в эпителиальных клетках при инфицировании Helicobacter.. Передача сигнала в эпителиальных клетках при инфицировании Helicobacter pylori Сигнальный путь МАРК Сигнальный путь ЕгЬВ Сигнальный путь р53 Сигнальный путь GnRH Сигнальный путь GnRH Апоптоз Нарушение регуляции транскрипции при Апоптоз Сигнальный путь GnRH МикроРНК при раке Сигнальный путь МАРК Сигнальный путь МАРК Сигнальный путь NF-kappa В Нарушение регуляции транскрипции при Инфицирование HTLV-1 Сигнальный путь ФНС МикроРНК при раке Зависимость от амфетамина Взаимодействие цитокина с рецептором к цитокину Инфицирование HTLV-1 Зависимость от кокаина

Фиг. 42

Фиг. 43

750

2000

1750

1500

1250

11000

Исходный ГПБЦЦ

500

Метод II Метод III Метод IV _Методу _

Методу!

_ Метод VIL _Метод VIII Метод IX

А в Фиг. 44

смешанными эффектами для повторных измерений коэффициент согласно

Расчетный угловой коэффициент в пересчете на год вычисляют в моменты времени 12 месяцев и 18 месяцев

Фиг. 48

Фиг. 49

Влияние на слух заключение на настоящий момент о На настоящий момент отсутствует влияние качества жизни ° Различная чувствительность о Кратковременный эффект, с частичным или полным восстановлением » Симптомы поддаются коррекции с помощью слуховых аппаратов ° Большинство нуждались в слуховых аппаратах до воздействия ° Все нуждаются в настоящий момент ° Этиология и влияние ° Влияние на слух в области высоких частот является следствием нарушения функции внешних волосковых клеток ° Влияние на слух не коррелирует с дозой VTS-270; представляется возможным усиление влияния на слух, обусловленного заболеванием