CN105395549A - 烟酸的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种烟酸的新用途，研究表明，烟酸治疗显著提高了microRNA-126的表达，且烟酸可以显著改善糖尿病患者的视网膜病变，对于视网膜微血管具有修复作用，在调控microRNA-126表达以及制备用于治疗糖尿病视网膜病变的药物中具有重要应用价值。

Description

烟酸的新用途

技术领域

本发明涉及烟酸的新用途。

背景技术

世界卫生组织2015年糖尿病报告指出，全球有347,000,000的糖尿病患者，18岁以上的成年人中糖尿病的患病率估计为9％。糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)是糖尿病患者最常见的严重并发症，在糖尿病患者中DR的患病率高达51.3％，造成患者视力严重下降甚至失明，是成年人致盲的重要原因。血-视网膜屏障的损伤及其伴随的视网膜血管通透性增加是非增殖期糖尿病视网膜病变的一个主要特征，也是视力丧失的主要原因。作为一种调脂药物，烟酸已用于预防和治疗动脉粥样硬化达数十年之久，烟酸可有效降低总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)同时有升高高密度脂蛋白(HDL)的作用。一些研究证实烟酸具有改善血管内皮功能，降低血管通透性的作用。

microRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。microRNA-126是一种内皮细胞特异性高表达的miRNA,它主要调控的目的基因包括Ang-1、VEGF、VCAM-1。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供烟酸的新用途。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

烟酸具有调控microRNA-126表达的用途。

优选的，上述烟酸的用途，所述烟酸通过上调microRNA-126的表达量，进而增加Ang-1的表达，用于制备增强损伤血管修复的药物。

优选的，上述烟酸的用途，所述烟酸通过上调microRNA-126的表达量，进而抑制VEGF的表达，用于制备减少细胞的增殖以及病理性新生血管、减少BRB破坏的药物。

优选的，上述烟酸的用途，所述烟酸通过上调microRNA-126的表达量，进而抑制VCAM-1的表达，抑制炎症细胞的浸润，用于制备抑制炎症因子及白细胞粘附的药物。

上述烟酸在制备用于治疗糖尿病视网膜病变的药物中的用途。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种烟酸的新用途，研究表明，烟酸治疗显著提高了microRNA-126的表达，且烟酸可以显著改善糖尿病患者的视网膜病变，对于视网膜微血管具有修复作用，在调控microRNA-126表达以及制备用于治疗糖尿病视网膜病变的药物中具有重要应用价值。

所述烟酸新用途的机制主要是microRNA-126在DR中显著下降，而烟酸通过上调microRNA-126的量，从而增加Ang-1的表达，Ang-1有助于损伤血管的修复，主要是在促进血管成熟稳定过程中并不增加病理性血管的生成，同时具有抑制内皮细胞的凋亡，从而有助于降低血管通透性以及稳定血视网膜屏障(BRB)；同时，上调的microRNA-126有主与抑制VEGF的表达，降低细胞凋亡以及减少新生血管的形成，维持BRB的稳定；DR与炎症因子密不可分，有效的抑制炎症因子及白细胞粘附有助于抑制DR的发展，microRNA-126有效抑制粘附分子VCAM-1的表达，减少白细胞粘附，从而降低BRB的破坏，因此烟酸通过调控microRNA-126表达，从而调节各种血管以及炎症因子的表达，修复血管，抑制炎症，维持血视网膜屏障的完整，以致有效治疗糖尿病视网膜病变。

附图说明

图1中A.是本发明实施例中大鼠视网膜HE染色图像；B.是本发明实施例中大鼠视网膜TUNEL染色图像；C.本发明实施例中大鼠EB血管灌注造影视网膜铺片；D.分别是本发明实施例中为大鼠视网膜神经节细胞层细胞计数；本发明实施例中为大鼠视网膜神经节细胞层TUNEL阳性细胞计数；本发明实施例中为大鼠视网膜EB定量检测。

图2中A.是本发明实施例中大鼠视网膜紧密连接蛋白Claudin-5染色图像；B.是本发明实施例中大鼠视网膜紧密连接蛋白Occludin染色图像；C.本发明实施例中大鼠视网膜紧密连接蛋白Claudin-5以及Occludin染色的量化分析；D.是本发明实施例中大鼠视网膜紧密连接蛋白ZO-1的westernblotting以及相对表达量结果。E.是本发明实施例中大鼠视网膜紧密连接蛋白Claudin-5,Occludin和ZO-1的mRNA相对表达量结果。

图3是本发明实施例中大鼠视网膜microRNA-126的mRNA相对表达量结果。

图4中A.是本发明实施例中大鼠视网膜VEGF以及VEGFR的westernblotting结果；B.是本发明实施例中大鼠视网膜的VEGF以及VEGFR的westernblotting相对表达量结果；C.是本发明实施例中大鼠视网膜Ang-1以及Tie-2的westernblotting结果；D.是本发明实施例中大鼠视网膜的Ang-1以及Tie-2的westernblotting相对表达量结果；E.是本发明实施例中大鼠视网膜VEGF,VEGFR以及Tie-2染色图像；F.本发明实施例中大鼠视网膜VEGF,VEGFR以及Tie-2染色的量化分析

图5中A.是本发明实施例中大鼠视网膜紧密连接蛋白VCAM-1的westernblotting以及相对表达量结果；B.是本发明实施例中大鼠视网膜VCAM-1以及CD45染色图像；C.是本发明实施例中大鼠视网膜VCAM-1以及CD45染色的量化分析。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

实施例1

一.DR大鼠动物模型的建立

1.实验动物

2月龄雄性Wistar大鼠90只，体重200-250g。全部大鼠饲养于标准化动物中心无特定病原体动物(SPF)级动物房，实验动物用标准颗粒饲料喂养，自由饮水摄食，室温为18-22℃。

2.糖尿病大鼠模型制作原理

抗肿瘤药物STZ，通过选择性破坏大鼠胰岛β细胞，引起实验性糖尿病。

3.糖尿病模型的制备及建立标准

大鼠禁食12h后，造模前尾静脉取血，测定血糖并称重。一次性快速腹腔注射2％STZ，剂量为60mg/kg，48h后检测FBG以及尿糖，连续3次FBG>16.7mmol/L，尿糖>+++，为造模成功。

4.分组及成模后检测

将90只大鼠随机分为正常对照组(CON)、模型对照组(DR)、烟酸(NA)干预组，每组30只大鼠。采用尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)溶液的方法建立DR模型。DR模型建立后第7天开始，安慰剂组给予蒸馏水灌胃，1次/d；烟酸组以40mg/kg剂量行烟酸溶液灌胃，1次/d。至实验结束。于造模成功后3个月时取材。糖尿病模型制备成功后每月检测血糖1次，并记录体重变化。

二.视网膜切片的HE染色以及免疫组化染色

1.取材

处死大鼠，完整取出大鼠眼球，眼球环形剪开角膜缘，取出晶状体及玻璃体，保留眼杯。

2.石蜡切片制备

(1)10％的甲醛溶液固定眼杯；

(2)组织依次脱水、媒染、浸蜡，最后硬蜡包埋；

(3)将包埋好的蜡块，用石蜡切片机连续切片，厚度为4μm，制成石蜡切片。

3.HE染色

(1)石蜡切片脱蜡至水：顺序依次为，二甲苯浸洗2次共5min，100％、95％、90％、80％、70％乙醇浸洗3min×5，自来水洗涤10min；

(2)苏木精染色5min，自来水洗lmin；

(3)1％盐酸酒精分化30s，自来水洗lmin，PBS返蓝30s，自来水洗lmin；

(4)伊红染色2min；自来水洗3min；

(5)梯度酒精脱水，二甲苯透明；

(6)中性树脂胶封片，光镜下观察并拍照。

4.视网膜免疫组织化学染色检测VEGF、VEGFR、Tie-2、Claudin-5、Occludin、VCAM-1、CD45

(1)石蜡切片二甲苯脱腊，梯度酒精水化，0.01MPBS洗3次，5min/次；

(2)切片浸入0.01M，PH＝6.0柠檬酸盐缓冲液，微波加热直至沸腾后断电，间隔5-10min后，反复以上操作2次，冷却，0.01MPBS洗3次，3min/次；

(3)加入5％BSA封闭液，室温孵育20min，甩掉封闭液，勿洗；

(4)滴加50ul一抗VEGF抗体(1：100稀释)，VEGFR2(1:800稀释)；Tie-2(1:50稀释)；Claudin-5(1:100稀释)；Occludin(1:100稀释)；VCAM-1(1:500稀释)；CD45(1:100稀释).37℃孵育lh，0.01MPBS洗3次，5min/次；

(5)滴加50ul生物素标记的第二抗体山羊抗鼠/山羊抗兔(1：200稀释)，室温下孵育20min，0.01MPBS洗3次，3min/次；

(6)DAB显色：1ml蒸馏水加A、B、C液各一滴，现用现配；

(7)苏木精复染1min，分化液分化，视复染深浅而定，氨水返蓝；

(8)梯度酒精脱水，二甲苯透明；

(9)中性树胶封片，光镜下观察并拍照。

三.伊文思蓝(EB)血管灌注造影视网膜铺片

于给药后第3个月将3个组分别取4只大鼠，进行EB血管灌注造影视网膜铺片。

(1)麻醉：称重后10％水合氯醛以300mg/kg腹腔注射麻醉；

(2)EB注射：29G针头穿刺入尾静脉内注射2％EB100μl，循环2小时；(3)固定：处死大鼠，摘取眼球，置于浓度为4％多聚甲醛溶液中固定3小时；

(4)剥离视网膜：在手术显微镜下用角巩膜剪于眼球角巩膜缘后约0.5mm处剪开，除去角膜、虹膜，娩出晶状体和玻璃体。将视网膜以视盘为中心放射状剪开4刀，置于载玻片上，用显微有齿镊小心将巩膜翻转，完整分离出视网膜，平铺于载玻片上；

(5)封片：滴少许封片剂后以盖玻片封片；

(6)照相：立即置于激光扫描共聚焦荧光显微镜下观察、照相。

四.视网膜伊文思蓝(EB)渗漏量测定

(1)分别取各组4只大鼠乙醚麻醉后，进行视网膜EB渗漏量的检测。EB溶于0.09％生理盐水，浓度为30mg/ml，超声波震荡5min，直径5μm的过滤器过滤，4℃冰箱保存备用。

(2)尾静脉注射45mg/kgEB。

(3)2h后打开心腔，左室灌注(0.05M，PH3.5)的柠檬酸缓冲液(37℃预热)，灌注压力为120mmHg(灌注流量相当于66ml/min)，时间2min。

(4)灌注结束后迅速摘除眼球，仔细分离视网膜组织，称其湿重。

(5)将视网膜与120μl甲酞胺70℃孵育18h，提取液4℃15000rpm高速离心30min，取上清分别测620nm及740nm的吸光度值，求其净吸光度值。

(6)建立EB染料浓度在甲酰胺中的标准曲线。根据EB与净A值的关系，得到实际溶液中EB浓度，用浓度乘以300μl得出视网膜EB渗漏量(ng)。最后用视网膜干重(mg)标化EB渗漏量(ng)，结果表示为ng/mg。

五.视网膜实时荧光定量检测

1.大鼠视网膜的提取

过量麻醉处死大鼠，在手术显微镜下迅速摘取双眼眼球，去除角膜、晶状体、玻璃体，取出双眼视网膜组织，分别置于不同冻存管中，放入液氮灌中保存。实验时随机抽取左眼或右眼视网膜用于RNA提取。

2.Trizol法提取视网膜总RNA

(1)脱臼处死大鼠，摘除眼球，解剖显微镜下取出视网膜组织。

(2)将视网膜组织放入玻璃体匀浆器中置于冰上的碾碎，每100mg组织加入1mlTrizol。室温放置5min，把裂解液转移到无酶的1.5mlEppendorf管中。

(3)加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min。

(4)10000rpm4℃离心15min，样品分为三层：底层为粉红色的有机相，上层为无色水相和一个中间层。

(5)把水相转移到新的Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，室温放置10min。

(6)10000rpm4℃离心10min，离心后在管底出现白色胶状沉淀，移去上清。

(7)加1ml75℅乙醇(用DEPC水配置)洗涤RNA沉淀，7500rpm4℃离心5min，弃去上清。

(8)室温放置空气干燥沉淀，加40ulRNA溶解液，-80℃冰箱保存备用。

3.测定样本总RNA的纯度和浓度

(1)调零：取49ulRNA溶解液加于紫外分光光度计的比色管中，进行调零。

(2)测定样本RNA含量：取1ul样本RNA加入调零比色管中，读取数值。

(3)样本RNA浓度的计算：RNA样本浓度(ug/ml)＝OD260×40ug/ml×50

(4)样本RNA纯度的计算：以OD260/OD280比值检测RNA的纯度，比值在1.8-2.0范围说明纯度较好。

(5)电泳：取样本RNA2ul加于琼脂糖凝胶上样孔内，130v恒压电泳10min。在凝胶成像仪上观察结果，可见三条带即28s、18s、5s，条带清晰表示RNA完整。

4.逆转录合成cDNA

(1)反应体系各成分用量见表3.1。

表3.1逆转录反应体系

(2)反应条件：25℃孵育10min，42℃孵育30min，85℃加热5min失活EasyScriptRT。

(3)反应流程：将各组份按照反应体系所示加入0.2ml微离心管中，放入PCR仪，按反应条件设定程序，开始运行。结束后取出产物进行下一步实验。

5.实时荧光定量PCR

(1)引物设计：根据引物设计的原则，由上海生工设计并合成针对大鼠的β-actin、p21、CDK2及cyclinE的特异性引物(表3.2)。

表3.2β-actin、eNOS、iNOS及Ang-1的特异性引物设计

(2)配制PCR反应体系，反应体系各成分用量见表3.3。

表3.3PCR反应体系

(3)将反应板放入即7700型荧光定量PCR仪中，这种仪器较普通的PCR仪增加了一套复杂而紧密的荧光强度检测系统及数据分析系统，可对PCR反应过程中的每一循环的系统荧光强度进行实时(real-time)检测，通过对荧光强度的分析来达到等量检测的目的。设置好反应板文件和程序，开始运行，扩增反应条件如下(表3.4)：

表3.4荧光定量PCR的反应扩增条件

(4)反应结束后，仪器自动生成CT(thresholdcycles)值及熔解曲线图。CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。CT值与模板的起始拷贝数的对数存在严格的线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。以β-actin为内参。每份模板的每个基因都设置了3个重复孔，独立的实验重复至少3次。全部实验结束，分析并整理数据。

6待测组织中目的基因相对量的测定

按下列公式计算目的基因的相对量：

△CT＝CT目的基因—CT管家基因

△△CT＝△CT实验组—△CT正常对照组

采用2^—△△CT表示实验组目的基因表达量相对于正常对照组表达量的倍数关系。

六.视网膜TUNEL染色

1.取材及冰冻切片制备

(1)造模后第3个月处死大鼠，完整取出大鼠眼球；

(2)立即将大鼠眼球于液氮中冷冻10-15秒，以OCT包埋；

(3)立即将OCT包埋的大鼠眼球冷冻于-80℃超低温冰箱，15分钟后取出。

(4)将冷冻包埋好的组织用冰冻切片机连续切片，厚度为5μm，制成冰冻切片，切片暂时冷冻于-20℃备用。

2.取材及冰冻切片制备

(1)冰冻切片室温复温30分钟；

(2)冰丙酮固定8min，4℃PBS洗3次×5分钟

(3)3％BSA室温封闭30分钟

(4)滴加TUNEL反应混合液室温孵育1h，4℃PBS洗3次×5分钟；

(5)DAPI染核1分钟，4℃PBS洗3次×5分钟。

七.Westernblot检测大鼠视网膜组织VEGF、VEGFR、Ang-1、Tie-2、ZO-1及VCAM-1的表达量

1.大鼠视网膜组织的采集

(1)术前准备1)手术室消毒：紫外线灯照射30min，通风15min；2)手术器械消毒：手术器械高压蒸汽灭菌半小时，放入烘箱风干备用。

(2)取样方法1)麻醉：称重后10％水合氯醛以300mg/kg腹腔注射麻醉2)麻醉后10min，将大鼠侧卧于手术台上，显微镊固定大鼠眼球，剪除眼球周围组织置于生理盐水中冲洗3遍。在显微镜下去除角膜、晶状体和玻璃体，用显微镊分离视网膜组织。组织冷冻于液氮中备用。

2.大鼠视网膜组织总蛋白的提取

(1)取100mg视网膜组织加入1ml预冷的组织细胞裂解液和2μlPMSF，磷酸酶抑制剂，冰上匀浆、超声裂解90sec。

(2)冰上静置裂解30min，静置过程中每5min用移液器吹打10次。

(3)4℃13000rpm离心20min，移取上清分装于干净的EP管，-80℃保存备用。

3.Westernblot

(1)蛋白质样品预处理：样品蛋白与4×SDS加样缓冲液按3：1(v/v)混匀，100℃水浴变性10min，12,000rpm离心5min，去除杂质。

(2)蛋白浓度的测定(考马斯亮蓝法)：

1)制作标准曲线；

2)根据样品数量，按试剂A：B为50：1的比例配制BCA试剂工作液，充分混匀；

3)各孔加入200μlBCA工作液，37℃放置30min；

4)完全溶解的蛋白标准品，取10μl加PBS稀释至100μl，使终浓度为200.5mg/ml；

5)将标准品按0μl，1μl，2μl，4μl，8μl，12μl，16μl，20μl依次加到96孔板的标准品孔中，加PBS补足到20μl；

6)加2μl样品到96孔板的样品孔中，加PBS到20μl；

7)酶标仪测定A562；

8)根据标准曲线计算出蛋白浓度；

(3)SDS-PAGE电泳胶的配制：

1)安装制胶用玻璃板；

2)配10％分离胶，混匀后将胶灌注于两玻璃板间至分离胶液面距离短玻璃板上沿约1.5cm处；3)在分离胶上注入一层双蒸水，室温下放置30min；

4)分离胶与双蒸水间出现一条明显的界限时，倒去双蒸水，用滤纸吸干残留水分；

5)配制浓缩胶，混匀后将胶直接灌注于分离胶上，立即插入干净的梳子，室温下放置30min。

(4)SDS－PAGE电泳：

1)等浓缩胶充分聚合时，将支架和胶放入电泳槽中，再加入电泳缓冲液，拔去梳子；

2)取出蛋白Marker和蛋白样品，向孔内加蛋白Marker3μl和蛋白样品10μl；

3)蛋白样品在浓缩胶上加电压80V，持续约30min，使蛋白样品缓慢通过浓缩胶，再将电压调至120V，持续约60min，至溴酚蓝到达分离胶底部时，停止电泳。

(5)转膜：

1)将凝胶取下并浸泡在转膜缓冲液中，依据预染蛋白Marker的标记保留需要的凝胶部分，切去右上角作标记；

2)裁剪与凝胶相同大小的PVDF膜1张，于无水甲醇中激活15s，双蒸水中处理2min，然后浸于转膜液中平衡5min；Whatman滤纸6张，转膜缓冲液中平衡大于30s；

3)按照电源负极面、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸、电源正极面顺序的安装转膜系统，安装过程中小心赶走滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜之间的气泡；

4)盖上转膜仪，红对红、黑对黑连接电源；

5)冰浴中转膜：电压调至80V，持续60min；

6)关闭转膜仪，取出PVDF膜，减去一角作正反面标记，再用TBS-T漂洗。(6)封闭：将纤维素膜浸泡于5％脱脂奶粉中(5g奶粉+100mlTBS-T)，室温下摇床孵育1h。然后弃去奶粉，TBST冲洗5min×3次。

(7)一抗孵育：VEGF(1:1000稀释),VEGFR(1:1000稀释),Ang-1(1:1000稀释),Tie-2(1:200稀释),ZO-1(1:200稀释)，VCAM-1(1:2000稀释)，小鼠抗β-actin单克隆抗体(1:1000稀释)4℃摇床孵育过夜。TBS-T冲洗5min×3次。

(8)二抗孵育：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1:10000-1:5000稀释)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(1:5000稀释)37℃摇床孵育1h。TBS-T冲洗5min×3次。

(9)显色：1)取ECL发光试剂盒中的A和B溶液等体积混合避光备用；2)在膜的蛋白面滴加ECL混合液；3)应用Bio-Rad公司ChemiDocMP凝胶成像系统显像。

(10)目的条带的定量分析：应用ImageJ分析软件测定每一个目的条带及其对应的内参β-actin的灰度值。按照相对灰度值＝目的条带灰度值/同一样品β-actin的灰度值计算每个样品相应

八.胆固醇、高密度脂蛋白HDL的检测在处理前由大鼠内眦处取血检测胆固醇，高密度脂蛋白HDL的量。

九.统计学方法

采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析。本研究计量指标的数据资料经Kolmogorov-Smirnov检验呈正态分布，以表示，各组间均数的方差齐性检验，蛋白的相对表达量及EB质量分数的总体差异比较均采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

实验结果

1.血清总胆固醇与高密度脂蛋白的检测

为了检测烟酸是否对于调节胆固醇及HDL，在给药三个月时取血检测。检测结果显示糖尿病显著升高了大鼠的胆固醇以及降低了大鼠HDL水平，然而，烟酸干预组显著改善糖尿病引起的改变，结果见下表1。

表1大鼠胆固醇和HDL水平

(“*”)代表p<0.05vs.CON组(“#”)代表p<0.05vs.DR组

注：依据前述分组及成模后检测中“将90只大鼠随机分为正常对照组(CON)、模型对照组(DR)、烟酸(NA)干预组，每组30只大鼠”，各组分别取了10只鼠的血，已经达到统计学要求。

2.视网膜组织病理学检查HE染色结果

光学显微镜检查显示，正常对照组视网膜各层结构清晰、排列整齐、形态正常；模型对照组大鼠视网膜细胞排列紊乱，细胞核肿胀、体积增大，视网膜组织水肿，可见出血；烟酸组视网膜各层组织水肿减轻，细胞排列渐规则，如图1A。烟酸组显著改善了由糖尿病引起的视网膜神经节细胞层细胞数的减少，如图1D。

3.大鼠视网膜TUNEL染色检测结果

TUNEL染色结果显示，DR组大鼠凋亡的视网膜细胞较多，而NA组大鼠凋亡的视网膜细胞较少。TUNEL染色中，凋亡细胞表现为TUNEL反应混合液(红色荧光)及DAPI(蓝色荧光)复染的紫色荧光着色细胞。如图1B。量化数据显示DR组凋亡细胞较CON组明显升高，NA组较DR组显著下降，差异均具有统计学意义(P<0.05)，如图1D。

4.EB血管灌注造影视网膜铺片及定量检测结果

为评价烟酸对视网膜血管通透性及BRB完整性的作用。结果显示：DR组可见EB自视网膜血管向外渗出，而CON及NA的视网膜血管走形正常，未见明显染料自血管渗出，如图1C。

正常对照组EB平均渗漏量为(12.5±0.91591)ng/mg，DR组EB平均渗漏量为(29.71±1.3214)ng/mg，NA组EB平均渗漏量为(18.15±0.45211)ng/mg。DR组EB平均渗漏量较正常对照组明显增高，NA组EB平均渗漏量较DR组减弱，差异均有统计学意义(P<0.05)。如图1D。

5.烟酸显著改善由DR引起的紧密连接蛋白的减少

1)免疫组化染色及量化结果显示紧密连接蛋白Claudin-5和Occludin在DR组显著下降，而NA组较DR组显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。如图2A、2B、2C。

2)Westernblot及其量化结果显示ZO-1在DR组显著下降，而NA组较DR组显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。如图2D。

3)RT-PCR显示Claudin-5,Occludinandzonulaoccludens(ZO-1)在DR组显著下降，而NA组较DR组显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。如图2E。

6.烟酸降低由DR引起的视网膜mircroRNA-126的升高

mircroRNA-126在血管形成中具有重大作用，因此我们检测3组中micro-126表达的变化

RT-PCR显示microRNA-126在DR组显著下降，而NA组较DR组显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，如图3。

7.烟酸升高视网膜组织Ang-1及其受体Tie-2的表达以及抑制VEGF及其受体VEGFR的表达。

1)Westernblotting及量化结果显示VEGFandVEGFR在DR组显著升高，而NA组较DR组显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，如图4A、4B。

2)Ang-1是重要的血管因子，Tie-2是Ang-1的受体，为了检测烟酸修复血管的机制，我们检测了Ang-1以及Tie-2的表达。Westernblotting及量化结果显示Ang-1以及Tie-2在NA组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)，如图4C、4D。

3)同时，免疫组化染色及量化结果显示与Westernblotting结果一致，差异具有统计学意义(P<0.05)，如图4E、4F。

8.烟酸治疗显著抑制DR中白细胞的粘附，从而抑制炎症的发展。

1)VCAM-1为血管粘附因子，介导白细胞的粘附

Westernblotting及量化结果显示VCAM-1在DR组显著升高，而NA组较DR组显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，如图5A。

2)CD45普遍表达于白细胞表面，代表白细胞粘附。免疫组化染色及量化结果显示VCAM-1和CD45在DR组显著升高，而NA组较DR组显著减低，差异具有统计学意义(P<0.05)，如图5B。

3)Westernblot及其量化结果显示ZO-1在DR组显著下降，而NA组较DR组显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，如图5C。

上述参照具体实施方式对该烟酸的新用途进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.烟酸具有调控microRNA-126表达的用途。

2.根据权利要求1所述的烟酸的用途，其特征在于：所述烟酸通过上调microRNA-126的表达量，进而增加Ang-1的表达，用于制备增强损伤血管修复的药物。

3.根据权利要求1所述的烟酸的用途，其特征在于：所述烟酸通过上调microRNA-126的表达量，进而抑制VEGF的表达，用于制备减少细胞的增殖以及病理性新生血管、减少BRB破坏的药物。

4.根据权利要求1所述的烟酸的用途，其特征在于：所述烟酸通过上调microRNA-126的表达量，进而抑制VCAM-1的表达，抑制炎症细胞的浸润，用于制备抑制炎症因子及白细胞粘附的药物。

5.烟酸在制备用于治疗糖尿病视网膜病变的药物中的用途。