ES2955800T3

ES2955800T3 - Procedimiento de fermentación industrial de células microbianas mediante precultivo alimentado por lotes

Info

Publication number: ES2955800T3
Application number: ES20734422T
Authority: ES
Inventors: Tobias Klein; Andreas Daub; Anbarani Aydin Golabgir
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2019-07-05
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2023-12-07
Anticipated expiration: 2040-06-30
Also published as: PL3959326T3; EP3959326B1; WO2021004830A1; EP3959326C0; CN114096677A; US20230212506A1; EP3959326A1; MX2022000253A

Abstract

La invención se refiere a un proceso para cultivar células microbianas que producen un producto de interés que comprende un precultivo discontinuo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de fermentación industrial de células microbianas mediante precultivo alimentado por lotes Campo de la invención

La invención se refiere a un procedimiento para cultivar células de Bacillus que producen una proteína de interés que comprende un precultivo de lote alimentado.

Antecedentes

Los microorganismos se utilizan ampliamente como caballos de batalla industriales para la producción de un producto de interés, especialmente proteínas, y en particular enzimas. La producción biotecnológica del producto de interés se lleva a cabo mediante fermentación y posterior purificación del producto. Los microorganismos, como las especies de Bacillus, son capaces de segregar cantidades significativas de producto en el caldo de fermentación. Esto permite un procedimiento sencillo de purificación del producto en comparación con la producción intracelular y explica el éxito del Bacillus en la aplicación industrial.

WO-A- 2017/097869 divulga un procedimiento para cultivar células de Bacillus, preferentemente de Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis o Bacillus lentus, para producir una proteína y un procedimiento para producir una proteína cultivando células de Bacillus. La proteína producida es una enzima como una amilasa, proteasa, lipasa, mananasa, fitasa y celulasa, preferentemente, amilasa o proteasa.

R. HUBER ET AL: "Equalizing growth in high-throughput small scale cultivations via precultures operated in fedbatch mode", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 103, no. 6, 15 de agosto de 2009, pp. 1095-1102, enseña un procedimiento de cultivo de células microbianas de E. coli y Hansenula polymorpha para la producción de glucosa que comprende la provisión de un precultivo y el cultivo del precultivo en un modo de alimentación por lotes.

JP S61 28381 A divulga un procedimiento para cultivar como células de Streptococcus thermophilus (FERM P-7025) para producir modecosa glubatch en el que se realiza un precultivo en modo alimentado por lotes.

J. OTTEN ET AL: "Accelerated Yoghourt Production by Fed-batch Prefermentation", NETHERLANDS MILK DAIRY JOURNAL, vol. 50, n° 1, 1996, págs. 19-34, enseña un procedimiento para cultivar células de Streptococcus y Lactobacillus delbrueckiil y la producción de yogur que comprende un precultivo y un cultivo en modo de alimentación por lotes seguido de un cultivo por lotes para producir yogur.

Los bioprocedimientos industriales que utilizan microorganismos se realizan normalmente en biorreactores de producción a gran escala con un tamaño de más de 50 m3. Para producir la cantidad necesaria de inóculo para la producción en estos biorreactores de producción a gran escala se utiliza un precultivo que consiste en al menos una etapa de cultivo en fermentadores de semillas más pequeños. Un precultivo que consta de más de un paso de cultivo, es decir, que implica el uso posterior de más de un fermentador de semillas, se denomina con mayor frecuencia tren de semillas. Los fermentadores de semillas suelen funcionar por lotes. El volumen del inóculo para la inoculación del biorreactor principal puede oscilar entre el 0,1 y el 15 % (v/v) del volumen del volumen inicial del biorreactor de producción. Dependiendo de la cantidad de inóculo, la duración de la fermentación principal puede variar. Un mayor volumen de inoculación contiene más biomasa y, por tanto, puede reducir significativamente el tiempo hasta la cosecha del producto deseado. Sin embargo, un volumen de inoculación superior al 15 % (v/v) del volumen inicial del biorreactor de producción no es razonable desde un punto de vista técnico y económico. Por lo tanto, se necesita un nuevo procedimiento para el cultivo de células microbianas, que sea capaz de reducir el tiempo hasta la cosecha del producto de interés sin exceder el volumen de inoculación por encima del 15 % del volumen inicial del biorreactor de producción.

Sumario de la invención

Los inventores encontraron que un precultivo en modo de alimentación por lotes puede utilizarse para aumentar la densidad celular en el fermentador semillero de precultivo, aumentando así la cantidad de biomasa contenida en el inóculo. El inóculo enriquecido con células aquí descrito puede utilizarse para acortar el tiempo hasta la cosecha del fermentador en comparación con un precultivo normal, que se ejecuta en modo por lotes, sin aumentar el volumen de inóculo introducido en el biorreactor de producción.

Por lo tanto, en un primer aspecto la presente invención se refiere a un procedimiento para cultivar células de Bacillus que producen una proteína de interés, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un precultivo de dichas células microbianas;

(b) inocular un biorreactor de producción con el precultivo de la etapa a); y

(c) cultivar las células microbianas en el biorreactor de producción en condiciones propicias para la producción de la proteína de interés,

en el que el precultivo de la etapa a) se realiza en modo de alimentación por lotes, y en el que las células de Bacillus son células de Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis o Bacillus lentus.

En una realización, el volumen del precultivo utilizado para inocular el biorreactor de producción no es superior al 15 % del volumen del medio de fermentación presente en el biorreactor de producción.

En otra realización, el precultivo comprende al menos dos etapas, en las que al menos la última etapa de las dos etapas se realiza en modo de alimentación por lotes.

En otra realización, el cultivo de las células de Bacillus en el biorreactor de producción se realiza en modo por lotes, modo de alimentación por lotes o modo de fermentación continua.

En una realización preferida, la proteína es una enzima.

Preferentemente, la proteína de interés no es una proteína reportera, preferentemente no GFP o YFP

La enzima puede seleccionarse de la lista que consiste en hidrolasas, oxidasas, isomerasas, por ejemplo amilasa, alfa-amilasa, glucoamilasa, pululanasa, proteasa, metaloproteasa, peptidasa, lipasa, cutinasa, acil transferasa, celulasa, endoglucanasa, glucosidasa, celubiohidrolasa, xilanasa, xiloglucantransferasa, xilosidasa, mananasa, fitasa, fosfatasa, xilosa isomerasa, glucosa isomerasa, lactasa, acetolactato decarboxilasa, pectinasa, pectina metilesterasa, poligalacturonidasa, liasa, pectato liasa, arabinasa, arabinofuranosidasa, galactanasa, lacasa, peroxidasa y asparaginasa.

En una realización, las células de Bacillus secretan la proteína de interés en el caldo de fermentación.

En otra realización, el procedimiento de la presente invención comprende además una etapa (d) de recolección del producto cuando la concentración de la proteína de interés es de al menos 10 g de proteína/kg de caldo de fermentación.

En otra realización, la presente invención se dirige a un procedimiento de producción de una proteína de interés que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un precultivo de células de Bacillus, productoras de la proteína de interés;

(b) inocular un biorreactor de producción con el precultivo de la etapa a); y

(c) cultivar las células de Bacillus en el biorreactor de producción en condiciones propicias para la producción de la proteína de interés,

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para aumentar el rendimiento de una proteína de interés, que comprende las etapas de:

(b) inocular un biorreactor de producción con el precultivo de la etapa a); y

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para reducir el tiempo hasta la cosecha en la producción fermentativa de un compuesto de interés, en particular una proteína de interés, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un precultivo de células de Bacillus, que produzca dicho compuesto de interés;

(b) inocular un biorreactor de producción con el precultivo de la etapa a); y

(c) cultivar las células de Bacillus en el biorreactor de producción en condiciones propicias para la producción del compuesto de interés,

Breve descripción de las figuras

La figura 1 ilustra el tiempo relativo hasta la cosecha en un procedimiento de producción que utiliza un precultivo por lotes o alimentado por lotes para la producción de (A) una proteasa y (B) una amilasa. En cada caso, los resultados se normalizaron en función del tiempo transcurrido hasta la cosecha del precultivo en modo por lotes, que se fijó en 100.

La figura 2 ilustra el tiempo relativo hasta la cosecha en un procedimiento de producción que utiliza un precultivo por lotes o alimentado por lotes e inocula el biorreactor de producción con un inóculo que tiene un volumen del 10 % o del 1 % (v/v) del volumen inicial del medio de fermentación presente en el biorreactor de producción. Para cada volumen, los resultados se normalizaron en función del tiempo transcurrido hasta la cosecha del precultivo ejecutado en modo por lotes.

La figura 3 ilustra el tiempo relativo hasta la cosecha en un procedimiento de producción que utiliza un medio químicamente definido o un medio complejo en el fermentador de semillas del precultivo. Los resultados se normalizaron con respecto al tiempo transcurrido hasta la cosecha del cultivo previo realizado con medio químicamente definido.

La figura 4 ilustra el tiempo relativo hasta la cosecha en un procedimiento de producción que utiliza un precultivo por lotes o alimentado por lotes para la producción de una proteasa en Bacillus subtilis.

Definiciones

A menos que se indique lo contrario, los términos y las expresiones utilizados en el presente documento deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por parte de los expertos en la materia.

Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares de "un" y "uno, una" también incluyen los plurales respectivos, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. En el contexto de la presente invención, los términos "alrededor de" y "aproximadamente" denotan un intervalo de precisión que un experto en la materia entenderá que sigue garantizando el efecto técnico de la característica en cuestión. El término indica típicamente una desviación del valor numérico indicado de ±20 %, preferentemente ±15 %, más preferentemente ±10 %, y aún más preferentemente ±5 %.

Debe entenderse que el término "que comprende" no es limitativo. A los efectos de la presente invención, el término "consistente en" se considera una realización preferida del término "que comprende". Si en lo sucesivo se define que un grupo comprende al menos un cierto número de realizaciones, se entenderá que también abarca un grupo que, preferentemente, consiste sólo en estas realizaciones.

Además, los términos "primero", "segundo", "tercero" o "(a)", "(b)", "(c)", "(d)" etc. y similares en la descripción y en las reivindicaciones se utilizan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Debe entenderse que los términos así utilizados son intercambiables en circunstancias apropiadas y que las realizaciones de la invención aquí descritas son capaces de funcionar en otras secuencias que las aquí descritas o ilustradas. En caso de que los términos "primero", "segundo", "tercero" o "(a)", "(b)", "(c)", "(d)", "i", "ii", etc. se refieran a pasos de un procedimiento o uso o ensayo, no existe coherencia temporal o de intervalos de tiempo entre los pasos, es decir, los pasos pueden llevarse a cabo simultáneamente o puede haber intervalos de tiempo de segundos, minutos, horas, días, semanas, meses o incluso años entre dichos pasos, a menos que se indique lo contrario en la solicitud como se establece aquí arriba o abajo.

Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología particular, protocolos, reactivos, etc. descritos aquí, ya que pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento es sólo con el propósito de describir realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la materia.

A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a varias publicaciones.

Un "procedimiento para cultivar células de Bacillus que producen una proteína de interés" o "procedimiento de fermentación" comprende el cultivo de células de Bacillus en un medio de fermentación adecuado y en condiciones adecuadas, como una temperatura y un pH adecuados. "Cultivo de las células" o "crecimiento de las células" no se entiende limitado a una fase de crecimiento exponencial, sino que también puede incluir el estado fisiológico de las células al inicio del crecimiento tras la inoculación y durante una fase estacionaria.

El término "caldo de fermentación" o "caldo de cultivo", tal como se utiliza en el presente documento, describe el medio de fermentación que contiene células de Bacillus, que se cultivan para expresar y, en función de la proteína de interés, secretar la proteína de interés en el medio de fermentación.

El término "medio de fermentación" se refiere a una solución a base de agua que contiene uno o más compuestos químicos que pueden favorecer el crecimiento de las células.

El término "solución de alimentación" se utiliza aquí para una solución que se añade durante el procedimiento de fermentación al medio de fermentación tras la inoculación del medio de fermentación inicial con las células de Bacillus. La solución de alimentación comprende compuestos que favorecen el crecimiento de las células. En una realización, la solución de alimentación tiene la misma composición que el medio de fermentación inicial. En otra realización, la solución de alimentación tiene una composición diferente de la composición del medio de fermentación. En comparación con el medio de fermentación, la solución de alimentación puede estar enriquecida en uno o más compuestos.

El término "precultivo" se refiere a un cultivo líquido en crecimiento activo de la célula de Bacillus que se cultiva en un fermentador de semillas y que se utiliza para inocular el "biorreactor de producción". Por "crecimiento activo" se entiende que el cultivo se encuentra en una fase en la que aumenta el número de células de Bacillus en el cultivo. Así, al principio del precultivo las células pueden estar en una fase de retardo y pasar a una fase de crecimiento exponencial con el tiempo. Las células del precultivo se utilizan en general como material de inoculación para evitar o reducir la fase de latencia en el biorreactor de producción. Así, en el momento de la transferencia de las células de precultivo al biorreactor de producción, o al siguiente fermentador de semillas de un tren de siembra, las células se encuentran preferentemente en fase exponencial o en fase exponencial tardía, en la que las células crecen activamente.

El término "fermentador de semillas" se refiere a un recipiente de cultivo en el que se forma el precultivo fermentando células de Bacillus hasta obtener un número suficientemente elevado de células para la inoculación en el fermentador principal o en el siguiente fermentador de semillas de un tren de siembra. El fermentador de semillas tiene un volumen menor que el biorreactor de producción. En una realización, el volumen del fermentador de semillas está entre el 5 % y el 20 % del volumen del reactor de producción. En una realización, el volumen del fermentador de semillas está entre el 8 % y el 15 % del volumen del reactor de producción. En una realización, el volumen del fermentador de semillas es el 10 % del volumen del reactor de producción.

El término "tren de siembra" se refiere a una serie de fermentadores de siembra de tamaño creciente en los que el precultivo se realiza en una serie de fermentadores en la que el último fermentador del tren de siembra tiene un tamaño suficiente para contener el inóculo necesario para el biorreactor de producción. Por lo tanto, el volumen del último fermentador de semillas del tren de semillas se sitúa entre el 5 % y el 20 % del volumen del reactor de producción. En una realización, el volumen del último fermentador de semillas del tren de semillas está entre el 8 % y el 15 % del volumen del reactor de producción. En una realización, el volumen del último fermentador de semillas del tren de semillas es el 10 % del volumen del reactor de producción. El volumen de los fermentadores de semillas dentro de un tren de semillas puede aumentar de 5 a 20 veces de un fermentador de semillas al siguiente, hasta obtener una cantidad suficiente de células para inocular el biorreactor de producción.

El término "biorreactor de producción" o "biorreactor principal" o "fermentador principal" o "fermentador de producción" es un término conocido en la técnica y se refiere a un recipiente en el que tiene lugar el cultivo de células a gran escala y la producción a gran escala de una proteína de interés. "Producción a gran escala", "Fermentación a gran escala" o también denominada aquí "Fermentación industrialmente relevante" se refiere a un procedimiento de fermentación en el que se añaden más de 200 g de una fuente de carbono (preferentemente, una fuente de carbono químicamente definida) por litro de medio de fermentación inicial al biorreactor de producción durante el cultivo de las células en el biorreactor de producción. Por lo tanto, el cultivo de células en un "biorreactor de producción" o "biorreactor principal" o "fermentador principal" o "fermentador de producción" se refiere a un procedimiento de fermentación en el que se añaden más de 200 g de una fuente de carbono (preferentemente, una fuente de carbono químicamente definida) por litro de medio de fermentación inicial al biorreactor de producción durante el cultivo de las células en el biorreactor de producción. Una vez finalizado el cultivo en el biorreactor de producción, se recoge el caldo de fermentación y se recupera la proteína de interés. El biorreactor puede contener entradas y salidas, por ejemplo para los medios, y diferentes sensores, por ejemplo para medir el pH y la temperatura durante el procedimiento de fermentación. El medio de fermentación en el biorreactor de producción puede ser el mismo o diferente del medio de fermentación utilizado en el fermentador de semillas o en el último fermentador de semillas de un tren de semillas.

El biorreactor de producción puede tener un volumen de al menos 500 L, al menos 1.000 L, al menos 5.000 L, al menos 10.000 L, al menos 20.000 L, al menos 50.000 L, o al menos 100.000 L. Preferentemente, el biorreactor de producción puede tener un volumen de 500-1.000 L, 1.000-5.000 L, a 5.000-10.000 L, 10.000-20.000 L, 20.000-50.000 L, 50.000-100.000 L, o 100.000-150.000 L. El biorreactor de producción puede tener un volumen de 500 L, 1.000 L, 5.000 L, 10.000 L, 20.000 L 50.000L, o 100.000 L.

Si el biorreactor de producción tiene un volumen de 500 L, el volumen del fermentador de semillas puede ser de entre 25 L y 100 L, o de entre 40 L y 75 L o 50 L. Si el biorreactor de producción tiene un volumen de 1.000 L, el volumen del fermentador de semillas puede ser de entre 50 L y 200 L, o de entre 80 L y 150 L o 100 L. Si el biorreactor de producción tiene un volumen de 5.000 L, el volumen del fermentador de semillas puede ser de entre 250 L y 1.000 L, o de entre 400 L y 750 L o 500 L. Si el biorreactor de producción tiene un volumen de 5.000 L, el volumen del fermentador de semillas podrá estar comprendido entre 250 L y 1.000 L, o entre 400 L y 750 L o 500 L. Si el biorreactor de producción tiene un volumen de 10.000 L, el volumen del fermentador de semillas podrá estar comprendido entre 500 L y 2.000 L, o entre 800 L y 1.500 L o 1.000 L. Si el biorreactor de producción tiene un volumen de 20.000 L, el volumen del fermentador de semillas puede estar entre 1.000 y 4.000 L, o entre 1.600 y 3.000 L o 2.000 L. Si el biorreactor de producción tiene un volumen de 50.000 L, el volumen del fermentador de semillas puede estar entre 2.500 y 10.000 L, o entre 4.000 y 7.500 L o 5.000 L. Si el biorreactor de producción tiene un volumen de 10.000 L, el volumen del fermentador de semillas puede estar comprendido entre 5.000 L y 20.000 L, o entre 8.000 y 15.000 L o 10.000 L.

Si el biorreactor de producción tiene un volumen de 1.000 L, el volumen del último fermentador de semillas en el tren de semillas podrá estar comprendido entre 50 L y 200 L, o entre 80 L y 150 L o 100 L. Si el biorreactor de producción tiene un volumen de 5.000 L, el volumen del último fermentador de semillas en el tren de semillas podrá estar comprendido entre 250 L y 1.000 L, o entre 400 L y 750 L o 500 L. Si el biorreactor de producción tiene un volumen de 10.000 L, el volumen del último fermentador de semillas del tren de semillas puede estar comprendido entre 500 L y 2.000 L, o entre 800 L y 1.500 L o 1.000 L. Si el biorreactor de producción tiene un volumen de 20.000 L, el volumen del último fermentador de semillas del tren de semillas puede estar entre 1.000 y 4.000 L, o entre 1.600 L y 3.000 L o 2.000 L. Si el biorreactor de producción tiene un volumen de 50.000 L, el volumen del último fermentador de semillas del tren de semillas puede estar entre 2.500 y 10.000 L, o entre 4.000 y 7.500 L o 5.000 L. Si el biorreactor de producción tiene un volumen de 100.000 L, el volumen del último fermentador de semillas del tren de semillas puede estar comprendido entre 5.000 y 20.000 L, o entre 8.000 y 15.000 L o 10.000 L.

Por "inóculo" se entiende una cantidad de células de Bacillus que se añade desde el fermentador semilla al biorreactor de producción para iniciar el procedimiento de fermentación en el biorreactor de producción. Además, por "inóculo" también se entiende una cantidad de células de Bacillus de un fermentador de semillas que se añade al siguiente fermentador de semillas en un tren de semillas.

El término "modo por lotes" o "fermentación por lotes" se refiere a un modo de cultivo en el que las células se cultivan en el medio de fermentación inicialmente presente sin ningún cambio en la composición del medio o en el volumen del mismo. Así, en el modo por lotes no se añade una cantidad sustancial o significativa de medio de cultivo líquido fresco al cultivo celular y no se retira una cantidad sustancial o significativa de medio de cultivo líquido del cultivo celular durante el cultivo.

El término "modo alimentado por lotes" o "fermentación alimentada por lotes" se refiere a un modo de cultivo en el que las células se cultivan en el medio de fermentación inicialmente presente y se añade una solución de alimentación de forma periódica o continua sin eliminación sustancial o significativa del medio de cultivo líquido durante el cultivo. Los cultivos alimentados por lotes pueden incluir varios regímenes y tiempos de alimentación, por ejemplo, alimentación diaria, alimentación más de una vez al día, o alimentación menos de una vez al día, etc.

El término "modo de fermentación continua" o "fermentación continua" se refiere a un modo de cultivo en el que las células se cultivan en el medio de fermentación inicialmente presente y se alimenta continuamente nuevo medio de fermentación al fermentador y el fermento se retira del fermentador al mismo ritmo, de modo que el volumen en el fermentador es constante.

El término "título de una proteína de interés", tal como se utiliza aquí, se entiende como la cantidad de proteína de interés en g por volumen de caldo de fermentación en litro (g/L).

El término "cosecha" (como en "cosecha de la proteína de interés") se refiere a la separación de la proteína de interés de al menos una parte de la biomasa en el medio de fermentación. La recolección puede realizarse por cualquier procedimiento conocido, como la filtración y la centrifugación. El procedimiento de recolección se ajusta preferentemente a las necesidades y características de la proteína específica de interés.

El término "tiempo hasta la cosecha" o "tiempo para la cosecha", tal como se utiliza aquí, se define como el periodo entre la inoculación del biorreactor de producción y el punto temporal en el que el título de una proteína de interés alcanza una cierta cantidad medida en g de proteína / kg de caldo de fermentación. El tiempo hasta la cosecha puede ser el periodo entre la inoculación del biorreactor de producción y el momento en que el título de una proteína de interés alcanza de 2 a 20 g de proteína / kg de caldo de fermentación. En una realización, el tiempo hasta la cosecha es el periodo entre la inoculación del biorreactor de producción y el punto temporal en el que el título de una proteína de interés alcanza de 5 a 15 g de proteína / kg de caldo de fermentación. En una realización, el tiempo hasta la cosecha puede ser el periodo entre la inoculación del biorreactor de producción y el punto temporal en el que el título de una proteína de interés alcanza de 8 a 12 g de proteína / kg de caldo de fermentación. En una realización, el tiempo hasta la cosecha puede ser el periodo entre la inoculación del biorreactor de producción y el punto temporal en el que el título de una proteína de interés alcanza 10 g de proteína / kg de caldo de fermentación. El tiempo hasta la cosecha puede ser el período entre la inoculación del biorreactor de producción y el momento en que el título de una proteína de interés alcanza al menos 2 g de proteína / kg de caldo de fermentación, al menos 5 g de proteína / kg de caldo de fermentación, al menos 10 g de proteína / kg de caldo de fermentación, al menos 15 g de proteína / kg de caldo de fermentación, o al menos 20 g de proteína / kg de caldo de fermentación, preferentemente al menos 10 g de proteína / kg de caldo de fermentación. En una realización, el tiempo hasta la cosecha es el periodo entre la inoculación del biorreactor de producción y el punto temporal en el que el título de una proteína de interés alcanza de 5 a 15 g de proteína / kg de caldo de fermentación. En una realización, el tiempo hasta la cosecha puede ser el periodo entre la inoculación del biorreactor de producción y el punto temporal en el que el título de una proteína de interés alcanza de 8 a 12 g de proteína / kg de caldo de fermentación. En una realización, el tiempo hasta la cosecha puede ser el periodo entre la inoculación del biorreactor de producción y el punto temporal en el que el título de una proteína de interés alcanza 10 g de proteína / kg de caldo de fermentación. El tiempo hasta la cosecha puede ser el período entre la inoculación del biorreactor de producción y el momento en que el título de una proteína de interés alcanza al menos 2 g de proteína / kg de caldo de fermentación, al menos 5 g de proteína / kg de caldo de fermentación, al menos 10 g de proteína / kg de caldo de fermentación, al menos 15 g de proteína / kg de caldo de fermentación, o al menos 20 g de proteína / kg de caldo de fermentación, preferentemente al menos 10 g de proteína / kg de caldo de fermentación. El tiempo hasta la cosecha puede ser el período entre la inoculación del biorreactor de producción y el momento en que el título de una proteína de interés alcanza 2 g de proteína / kg de caldo de fermentación, 5 g de proteína / kg de caldo de fermentación, 10 g de proteína / kg de caldo de fermentación, 15 g de proteína / kg de caldo de fermentación, o 20 g de proteína / kg de caldo de fermentación, preferentemente 10 g de proteína / kg de caldo de fermentación.

El término polinucleótido "heterólogo" (o exógeno o extraño o recombinante o no nativo) se refiere a un polinucleótido que no es nativo de la célula hospedante, un polinucleótido nativo de la célula hospedante en el que se han realizado modificaciones estructurales, por ejemplo, deleciones, sustituciones y/o inserciones, mediante técnicas de ADN recombinante para alterar el polinucleótido nativo, o un polinucleótido nativo de la célula hospedante cuya expresión está cuantitativamente alterada como resultado de la manipulación de los elementos reguladores del polinucleótido mediante técnicas de ADN recombinante, por ejemplo, un promotor más fuerte, o un polinucleótido nativo de la célula hospedante, pero que no está integrado dentro de su entorno genético natural como resultado de la manipulación genética mediante técnicas de ADN recombinante.

Con respecto a dos o más secuencias de polinucleótidos o a dos o más secuencias de aminoácidos, el término "heterólogo" se utiliza para caracterizar que dichas dos o más secuencias de polinucleótidos o dos o más secuencias de aminoácidos no se aparecen en la naturaleza en la combinación específica entre sí.

A los efectos de la invención, "recombinante" (o transgénico) con respecto a una célula o un organismo significa que la célula o el organismo contiene un polinucleótido heterólogo que ha sido introducido por el ser humano mediante tecnología génica y, con respecto a un polinucleótido, incluye todas aquellas construcciones realizadas por el ser humano mediante tecnología génica/técnicas de ADN recombinante, en las que:

(a) la secuencia del polinucleótido o de una parte del mismo, o bien

(b) una o más secuencias de control genético que están unidas operativamente con el polinucleótido, incluidas, entre otras, un promotor, o bien

no se encuentran en su entorno genético de tipo salvaje o han sido modificadas.

Los términos célula u organismo "nativo" (o de tipo salvaje o endógeno) y polinucleótido o polipéptido "nativo" (o de tipo salvaje o endógeno) se refieren a la célula u organismo tal como se encuentra en la naturaleza y al polinucleótido o polipéptido en cuestión tal como se encuentra en una célula en su forma natural y en su entorno genético, respectivamente (es decir, sin que haya intervención humana).

Descripción detallada

La presente invención puede entenderse más fácilmente remitiéndose a la siguiente descripción detallada de las realizaciones de la invención y los ejemplos incluidos en el presente documento.

La presente invención está dirigida a un procedimiento de fermentación industrialmente relevante para producir una proteína de interés en células de Bacillus. Los inventores descubrieron sorprendentemente que un paso de precultivo ejecutado en modo de alimentación por lotes puede utilizarse para aumentar la densidad celular en el fermentador de semillas, aumentando así la cantidad de biomasa contenida en el inóculo para la inoculación del biorreactor de producción sin aumentar el volumen del inóculo. El inóculo enriquecido puede utilizarse para acortar el tiempo hasta la cosecha de la proteína de interés en comparación con un procedimiento de fermentación en el que el precultivo se ejecuta en modo por lotes.

Por lo tanto, en un primer aspecto la invención se refiere a un procedimiento para cultivar células de Bacillus que producen una proteína de interés, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un precultivo de dichas células de Bacillus;

(b) inocular un biorreactor de producción con el precultivo de la etapa a); y

(a) proporcionar un precultivo de células de Bacillus productoras de dicha proteína de interés;

(b) inocular un biorreactor de producción con el precultivo de la etapa a); y

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para aumentar el rendimiento de un producto de interés, que comprende las etapas de:

(b) inocular un biorreactor de producción con el precultivo de la etapa a); y

Etapa a): el precultivo

La mayor parte de la proteína de interés se produce cultivando las células de Bacillus en el biorreactor de producción. Por lo tanto, el medio de fermentación presente en el biorreactor de producción debe inocularse con un cultivo inicial de estas células de Bacillus, el inóculo.

En general, el inóculo es un cultivo líquido de células de Bacillus, que se prepara en un fermentador de semillas.

En una realización, el precultivo de las células de Bacillus utiliza sólo un fermentador semilla, es decir, sólo una etapa de precultivo.

En otra realización, el precultivo de células de Bacillus utiliza más de una etapa de precultivo llevado a cabo utilizando más de un fermentador semilla. Un precultivo en el que participan más de un fermentador de semillas suele denominarse tren de semillas. Un tren de semillas para un procedimiento de producción a escala industrial puede comprender de uno a cuatro fermentadores de semillas, preferentemente de uno a tres fermentadores de semillas. En una realización, el tren de semillas comprende dos fermentadores de semillas. En otra realización, el precultivo comprende tres fermentadores de semillas. El volumen del medio de fermentación presente en los fermentadores de semillas puede aumentar dentro del tren de semillas. Por ejemplo, el volumen del segundo fermentador de semillas puede ser mayor que el volumen del primer fermentador de semillas. En una realización, el volumen del tercer fermentador de semillas es mayor que el volumen del segundo fermentador de semillas y el volumen del segundo fermentador de semillas es mayor que el volumen del primer fermentador de semillas.

El precultivo de células de Bacillus puede prepararse inoculando células de Bacillus productoras de la proteína de interés a partir de un vial congelado o una reserva de glicerol en un primer fermentador de semillas y las células de Bacillus se cultivan hasta una densidad deseada. Tras el cultivo en el primer fermentador de semillas, las células de Bacillus pueden inocularse directamente en el biorreactor de producción, si no se utiliza un tren de semillas, o en el siguiente de una serie de fermentadores de semillas dentro de un tren de semillas.

En lugar de utilizar un vial que contenga las células de Bacillus que producen la proteína de interés, el precultivo también puede prepararse a partir de células de Bacillus que crecen en una placa de agar.

Los criterios para la transferencia de las células de Bacillus de un fermentador de semillas a otro fermentador de semillas posterior pueden basarse en el tiempo de cultivo (por ejemplo, las células de Bacillus se transfieren después de un tiempo de cultivo de 12 a 40 horas) o en alcanzar un determinado valor en una señal en línea, por ejemplo, la tasa de absorción de oxígeno (OTR) (por ejemplo las células de Bacillus se transfieren a una OTR entre 30-180 mmol/(L*h)), o la tasa de evolución de dióxido de carbono (CER) (por ejemplo, las células de Bacillus se transfieren a una CER entre 40-200 mmol/(L*h)), o el período durante el cual se ha añadido la solución de alimentación (por ejemplo, las células de Bacillus se transfieren después de que se haya añadido la solución de alimentación durante 5-30h). En una realización, las células de Bacillus se transfieren de un fermentador de semillas a otro fermentador de semillas posterior después de cultivar las células de Bacillus durante 16 horas. En una realización, una parte del caldo de fermentación presente en el fermentador de semillas se transfiere a otro fermentador de semillas o al biorreactor de producción. En una realización, el caldo de fermentación completo presente en el fermentador de semillas se transfiere a otro fermentador de semillas o al biorreactor de producción.

El volumen del caldo de fermentación transferido de un fermentador de semillas al siguiente fermentador de semillas de un tren de semillas no es inferior al 0,1 % ni superior al 20 % del volumen inicial del medio de fermentación presente en el siguiente fermentador de semillas del tren de semillas. En una realización, el volumen del caldo de fermentación transferido del primer fermentador de semillas está entre el 0,1 % y el 15 %, preferentemente entre el 1 % y el 15 %, más preferentemente entre el 5 % y el 10 %, más preferentemente entre el 8 % y el 10 % del volumen del medio de fermentación presente en el fermentador de semillas posterior. En una realización, el volumen del caldo de fermentación transferido de un fermentador de semillas al fermentador de semillas siguiente en un tren de semillas es del 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 % o 15 % del volumen del medio de fermentación presente en el fermentador de semillas siguiente. En una realización preferida, el volumen del caldo de fermentación transferido de un fermentador de semillas al siguiente fermentador de semillas en un tren de semillas es del 10 % del volumen del medio de fermentación presente en el fermentador de semillas subsiguiente.

Según la invención, el precultivo se realiza en modo de alimentación por lotes. Si se utiliza un tren de siembra, al menos la última etapa del tren de siembra, es decir, el cultivo en el último fermentador de semillas antes de la inoculación del biorreactor de producción se realiza en modo de alimentación por lotes. El procedimiento de fermentación en uno o varios fermentadores de semillas precedentes puede realizarse en modo por lotes, en modo ed alimentación por lotes o en modo continuo. Preferentemente, el procedimiento de fermentación en uno o más fermentadores de semillas que preceden al último fermentador de semillas se realiza en modo por lotes. También preferentemente, el procedimiento de fermentación en todos los fermentadores de semillas que preceden al último fermentador de semillas se realiza en modo por lotes.

El medio de fermentación y las condiciones de cultivo utilizadas para el precultivo pueden ser adecuados para un crecimiento rápido de las células de Bacillus. Por lo tanto, las células presentes en el precultivo pueden estar inicialmente en fase retardada, empezar a proliferar con el tiempo y, preferentemente, estar en fase exponencial en el momento de la transferencia al siguiente fermentador o al biorreactor de producción, respectivamente.

Etapa b): inoculación del inóculo en el biorreactor de producción

Cuando la cantidad de células de Bacillus en el (último) fermentador de semillas del precultivo alcanza su máximo, el caldo de fermentación presente en este fermentador semilla se transfiere al biorreactor de producción, en el que se produce la proteína de interés y se inocula en el medio de fermentación.

Los criterios para la transferencia de las células de Bacillus del (último) fermentador de semillas al biorreactor de producción pueden basarse en el tiempo de cultivo (p. ej., las células de Bacillus se transfieren después de un tiempo de cultivo de 12h a 40h) o en alcanzar un determinado valor en una señal en línea, p. ej., la tasa de absorción de oxígeno (OTR) (p. ej. las células de Bacillus se transfieren a una OTR entre 30-180 mmol/(L*h)) o la tasa de evolución de dióxido de carbono (CER) (por ejemplo, las células de Bacillus se transfieren a una CER entre 40-200 mmol/(L*h)) o el período durante el cual se ha añadido la solución de alimentación (por ejemplo, las células de Bacillus se transfieren después de que se haya añadido la solución de alimentación durante 5-30h). En una realización, las células de Bacillus se transfieren del (último) fermentador de semillas al biorreactor de producción después de cultivar las células de Bacillus durante 22 horas en el (último) fermentador de semillas. En una realización, una parte del caldo de fermentación presente en el fermentador de semillas se transfiere a otro fermentador de semillas o al biorreactor de producción. En una realización, el caldo de fermentación completo presente en el fermentador de semillas se transfiere a otro fermentador de semillas o al biorreactor de producción.

El volumen del caldo de fermentación transferido del (último) fermentador de semillas al biorreactor de producción no es inferior al 0,1 % ni superior al 20 % del volumen inicial del medio de fermentación presente en el biorreactor de producción. En una realización, el volumen del caldo de fermentación transferido del (último) fermentador de semillas está entre el 0,1 % y el 15 %, preferentemente entre el 1 % y el 15 % o entre el 1 % y el 12 %, más preferentemente entre el 1 % y el 10 % o entre el 5 % y el 10 %, más preferentemente entre el 8 % y el 10 % del volumen del medio de fermentación presente en el biorreactor de producción. En una realización, el volumen del caldo de fermentación transferido desde el (último) fermentador de semillas al biorreactor de producción es del 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 % o 15 % del volumen del medio de fermentación presente en el biorreactor de producción. En una realización, el volumen del caldo de fermentación transferido desde el (último) fermentador de semillas al biorreactor de producción es el 10 % del volumen del medio de fermentación presente en el biorreactor de producción. En una realización, el volumen del caldo de fermentación transferido desde el (último) fermentador de semillas al biorreactor de producción es el 15 % del volumen del medio de fermentación presente en el biorreactor de producción.

Etapa c): cultivo en el biorreactor de producción

Durante el cultivo en el biorreactor de producción se produce la mayor parte de la proteína de interés. Por lo tanto, la cantidad de producto producido en el biorreactor de producción es mayor que la cantidad de producto producido en el precultivo. La cantidad de la proteína de interés producida en el precultivo puede determinarse tomando una muestra del precultivo antes de inocular el biorreactor de producción con las células del precultivo y determinando la cantidad de la proteína de interés en la muestra del precultivo. La cantidad de producto producido en el biorreactor de producción puede determinarse tomando una muestra del biorreactor de producción al final del cultivo y/o antes de cosechar las células y determinando la cantidad de la proteína de interés en la muestra del biorreactor de producción. En una realización, el porcentaje de la cantidad de proteína de interés producida en precultivo con respecto a la cantidad de proteína de interés producida en el biorreactor de producción no más del 10 % o no más del 8 %. En una realización, el porcentaje de la cantidad de proteína de interés producida en precultivo con respecto a la cantidad de proteína de interés producida en el biorreactor de producción no es más del 7 %, no más del 6 % o no más del 5 %.

En el procedimiento de la presente invención se añaden más de 200 g de una fuente de carbono (preferentemente, una fuente de carbono químicamente definida) por litro de medio de fermentación inicial al biorreactor de producción durante el cultivo en el biorreactor de producción. Preferentemente, la cantidad total de una fuente de carbono (preferentemente, una fuente de carbono químicamente definida) añadida al biorreactor de producción durante el cultivo en el biorreactor de producción es superior a 300 g, más preferentemente superior a 400 g por litro de medio de fermentación inicial. Preferentemente, al menos el 50 % de la fuente de carbono (preferentemente, una fuente de carbono químicamente definida) se proporciona en el procedimiento de fermentación en el biorreactor de producción como solución de alimentación, más preferentemente, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o el 100 % de la fuente de carbono (preferentemente, una fuente de carbono químicamente definida) proporcionada en el procedimiento de fermentación se proporciona como solución de alimentación en el procedimiento de fermentación.

En una realización, el cultivo de las células de Bacillus en el biorreactor de producción puede realizarse en modo por lotes, modo de alimentación por lotes o modo de fermentación continua. En una realización preferida, el cultivo de las células de Bacillus en el biorreactor de producción se realiza en modo de fermentación continua o de alimentación por lotes. Lo más preferible es que el cultivo de las células de Bacillus en el biorreactor de producción se realice en modo de alimentación por lotes.

Según la invención, las células de Bacillus inoculadas en el biorreactor de producción se cultivan en condiciones propicias para la producción de la proteína de interés. En una realización, las células de Bacillus inoculadas en el biorreactor de producción se cultivan en condiciones propicias para el crecimiento de las células de Bacillus y la producción de la proteína de interés. Estas condiciones pueden venir determinadas por el medio de fermentación, el pH y/o la temperatura utilizados.

Los procedimientos de fermentación pueden realizarse con cualquier medio adecuado para el crecimiento celular y la producción del producto deseado para la célula particular de Bacillus.

En general, se supone que las células de Bacillus crecen en una serie de fases en la fermentación, comenzando con una fase de latencia en la que las células de Bacillus se adaptan al medio y comienzan a crecer, una fase exponencial en la que las células de Bacillus crecen a una tasa de crecimiento constante proporcionando un aumento exponencial del número de células y de la masa celular, una fase estacionaria, en la que el crecimiento se ha detenido y el número de células permanece constante y, por último, la fase de muerte en la que el número de células disminuye debido a la muerte celular. Preferentemente, se detiene el cultivo y se recolecta la proteína de interés antes de que comience la fase de muerte. También es preferible que el cultivo pase a la fase estacionaria antes de cosechar la proteína de interés.

El medio y las condiciones de cultivo utilizados en el biorreactor de producción pueden ser adecuados para la producción óptima de la proteína de interés por las células de Bacillus. Las condiciones de cultivo permiten así que las células presentes en el fermentador de producción se encuentren en cualquier fase de crecimiento adecuada para la producción del producto.

Medio de fermentación

El medio de fermentación para el fermentador de semillas puede o no ser el mismo medio de fermentación utilizado en el biorreactor de producción. Además, el medio de fermentación de los distintos fermentadores de semillas de un tren de semillas puede ser el mismo o diferente. El medio de fermentación del fermentador de semillas puede ser un medio químicamente definido o un medio complejo. El medio de fermentación del biorreactor de producción puede ser un medio de fermentación químicamente definido o complejo. En el fermentador de semillas que funciona en modo de alimentación por lotes puede utilizarse un medio complejo o un medio químicamente definido. Preferentemente, el medio de fermentación del (último) fermentador de semillas es un medio de fermentación químicamente definido o un medio de fermentación complejo y el medio de fermentación del biorreactor de producción es un medio de fermentación químicamente definido. En una realización, el tren de semillas comprende tres fermentadores de semillas y en el primer fermentador de semillas se utiliza un medio complejo y en el segundo y tercer fermentadores de semillas, así como en el biorreactor de producción, se utiliza un medio químicamente definido. En una realización, el tren de semillas comprende tres fermentadores de semillas y en el primer y tercer fermentador de semillas se utiliza un medio complejo y en el segundo fermentador de semillas, así como en el biorreactor de producción, se utiliza un medio químicamente definido. En una realización, el tren de semillas comprende tres fermentadores de semillas y en el primero, segundo y tercer fermentador de semillas se utiliza un medio complejo y en el biorreactor de producción se utiliza un medio químicamente definido. En una realización, el tren de semillas comprende tres fermentadores de semillas y en el primero, segundo y tercer fermentador de semillas se utiliza un medio químicamente definido y en el biorreactor de producción se utiliza un medio químicamente definido.

Medio de fermentación complejo

El término "medio de fermentación complejo" se refiere a un medio de fermentación que comprende una fuente de nutrientes complejos en una cantidad de 0,5-30 % p/v del medio de fermentación.

El término "fuente de nutrientes compleja" se utiliza aquí para las fuentes de nutrientes que se componen de compuestos químicamente indefinidos, es decir, compuestos que no se conocen por su fórmula química, que comprenden preferentemente compuestos orgánicos indefinidos que contienen nitrógeno y/o carbono. Por el contrario, se entiende por "fuente de nutrientes químicamente definida" (por ejemplo, "fuente de carbono químicamente definida" o "fuente de nitrógeno químicamente definida") las fuentes de nutrientes compuestas por compuestos químicamente definidos. Un "componente químicamente definido" es un componente que se conoce por su fórmula química.

El término "fuente compleja de nitrógeno" se utiliza aquí para una fuente de nutrientes que está compuesta por uno o más compuestos químicamente indefinidos que contienen nitrógeno, es decir, compuestos que contienen nitrógeno que no se conocen por su fórmula química, preferentemente compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, por ejemplo, proteínas y/o aminoácidos de composición desconocida.

El término "fuente de carbono compleja" se utiliza aquí para referirse a una fuente de carbono compuesta por uno o más compuestos que contienen carbono químicamente indefinidos, es decir, compuestos que contienen carbono cuya fórmula química no se conoce, preferentemente compuestos orgánicos que contienen carbono, por ejemplo, carbohidratos de composición desconocida.

Es evidente para el experto que una fuente de nutrientes complejos puede ser una mezcla de diferentes fuentes de nutrientes complejos. Así, una fuente compleja de nitrógeno puede comprender una fuente compleja de carbono y viceversa, y una fuente compleja de nitrógeno puede ser metabolizada por las células de forma que funcione como fuente de carbono y viceversa.

En una realización, la fuente de nutrientes complejos es una fuente de nitrógeno complejo. Las fuentes complejas de nitrógeno incluyen, entre otras, sustancias que contienen proteínas, como un extracto de células microbianas, animales o vegetales, por ejemplo preparados de proteínas vegetales, harina de soja, harina de maíz, harina de guisantes, gluten de maíz, harina de algodón, harina de cacahuete, harina de patata, carne, caseína, gelatinas, suero de leche, harina de pescado, proteína de levadura, extracto de levadura, triptona, peptona, bacto-triptona, bactopeptona, residuos de la transformación de células microbianas, plantas, carne o cuerpos animales, y combinaciones de los mismos. En una realización, la fuente de nitrógeno complejo se selecciona del grupo que consiste en proteína vegetal, preferentemente proteína de patata, proteína de soja, proteína de maíz, proteína de cacahuete, proteína de algodón, y/o proteína de guisante, caseína, triptona, peptona y extracto de levadura y combinaciones de las mismas.

En una realización, el medio de fermentación también comprende componentes de medios definidos. En una realización, el medio de fermentación también comprende una fuente de nitrógeno definida. Ejemplos de fuentes de nitrógeno inorgánico son el amonio, el nitrato y el nitrito, y combinaciones de los mismos. En una realización preferida, el medio de fermentación comprende una fuente de nitrógeno, donde la fuente de nitrógeno es un complejo o una fuente de nitrógeno definida o una combinación de los mismos. En una realización, la fuente de nitrógeno definida se selecciona del grupo que consiste en amoníaco, amonio, sales de amonio, (por ejemplo, cloruro de amonio, nitrato de amonio, fosfato de amonio, sulfato de amonio, acetato de amonio), urea, nitrato, sales de nitrato, nitrito, y aminoácidos, preferentemente, glutamato, y combinaciones de los mismos.

En una realización, la fuente de nutrientes complejos está en una cantidad de 2-15 % v/p del medio de fermentación. En otra realización, la fuente de nutrientes complejos está en una cantidad de 3-10 % v/p del medio de fermentación.

En una realización, el medio de fermentación complejo comprende además una fuente de carbono. La fuente de carbono es preferentemente un complejo o una fuente de carbono definida o una combinación de los mismos. En una realización, la fuente de nutrientes complejos comprende una fuente de hidratos de carbono. Diversos azúcares y sustancias que contienen azúcares son fuentes adecuadas de carbono, y los azúcares pueden estar presentes en diferentes etapas de la polimerización. Las fuentes de carbono complejas preferidas para la presente invención se seleccionan del grupo formado por melaza, licor de maíz, azúcar de caña, dextrina, almidón, hidrolizado de almidón, hidrolizado de celulosa y combinaciones de los mismos. Las fuentes de carbono definidas preferidas se seleccionan del grupo que consiste en hidratos de carbono, ácidos orgánicos y alcoholes, preferentemente, glucosa, fructosa, galactosa, xilosa, arabinosa, sacarosa, maltosa, lactosa, ácido acético, ácido propiónico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido málico, ácido cítrico, ácido fumárico, glicerol, inositol, manitol y sorbitol, y combinaciones de los mismos. Preferentemente, la fuente de carbono definida se proporciona en forma de jarabe, que puede contener hasta un 20 %, preferentemente, hasta un 10 %, más preferentemente hasta un 5 % de impurezas. En una realización, la fuente de carbono es jarabe de remolacha azucarera, jarabe de caña de azúcar, jarabe de maíz, preferentemente, jarabe de maíz de alta fructosa. En otra realización, la fuente de carbono compleja se selecciona del grupo que consiste en melaza, licor de maíz, dextrina y almidón, o combinaciones de los mismos, y en la que la fuente de carbono definida se selecciona del grupo que consiste en glucosa, fructosa, galactosa, xilosa, arabinosa, sacarosa, maltosa, dextrina, lactosa, o combinaciones de los mismos.

En una realización, el medio de fermentación es un medio complejo que comprende fuentes complejas de nitrógeno y carbono. En una realización, el medio de fermentación es un medio complejo que comprende fuentes complejas de nitrógeno y carbono, en el que la fuente compleja de nitrógeno puede hidrolizarse parcialmente como se describe en WO 2004/003216.

En una realización, el medio de fermentación también comprende una fuente de hidrógeno, una fuente de oxígeno, una fuente de azufre, una fuente de fósforo, una fuente de magnesio, una fuente de sodio, una fuente de potasio, una fuente de oligoelementos y una fuente de vitaminas como se describe más adelante.

Medio de fermentación químicamente definido

El término "medio de fermentación químicamente definido" (también denominado en el presente documento "medio químicamente definido", "medio definido" o "medio sintético") se entiende utilizado para medios de fermentación que se componen esencialmente de componentes químicamente definidos en concentraciones conocidas. Un "componente químicamente definido" es un componente que se conoce por su fórmula química. Un medio de fermentación que se compone esencialmente de componentes químicamente definidos incluye un medio que no contiene una fuente de nutrientes complejos, en particular ninguna fuente compleja de carbono y/o nitrógeno, es decir, que no contiene materias primas complejas que tengan una composición químicamente indefinida. Un medio de fermentación compuesto esencialmente de componentes químicamente definidos puede incluir además un medio que comprenda una cantidad esencialmente pequeña de una fuente nutritiva compleja, por ejemplo una fuente compleja de nitrógeno y/o carbono, una cantidad tal como se define más adelante, que normalmente no es suficiente para mantener el crecimiento del microorganismo y/o garantizar la formación de una cantidad suficiente de biomasa.

A este respecto, las materias primas complejas tienen una composición químicamente indefinida debido a que, por ejemplo, estas materias primas contienen muchos compuestos diferentes, entre ellos compuestos heteropoliméricos complejos, y tienen una composición variable debido a la variación estacional y a las diferencias de origen geográfico. Ejemplos típicos de materias primas complejas que funcionan como fuente compleja de carbono y/o nitrógeno en la fermentación son la harina de soja, la harina de semillas de algodón, el licor de remojo de maíz, el extracto de levadura, el hidrolizado de caseína, las melazas y similares. Una cantidad esencialmente pequeña de una fuente compleja de carbono y/o nitrógeno puede estar presente en el medio químicamente definido según la invención, por ejemplo como remanente del inóculo para la fermentación principal. El inóculo para la fermentación principal no se obtiene necesariamente por fermentación en un medio químicamente definido. En la mayoría de los casos, el arrastre desde el inóculo será detectable a través de la presencia de una pequeña cantidad de una fuente compleja de nitrógeno en el medio químicamente definido de la fermentación principal. También pueden introducirse en el medio de fermentación pequeñas cantidades de componentes complejos del medio, como fuentes complejas de carbono y/o nitrógeno, mediante la adición de pequeñas cantidades de estos componentes complejos al medio de fermentación. Puede ser ventajoso utilizar una fuente compleja de carbono y/o nitrógeno en el procedimiento de fermentación del inóculo para la fermentación principal, por ejemplo para acelerar la formación de biomasa, es decir, para aumentar la tasa de crecimiento del microorganismo, y/o para facilitar el control interno del pH. Por la misma razón, puede ser ventajoso añadir una cantidad esencialmente pequeña de una fuente compleja de carbono y/o nitrógeno, por ejemplo extracto de levadura, en la fase inicial de la fermentación principal, especialmente para acelerar la formación de biomasa en la fase inicial del procedimiento de fermentación.

Una cantidad esencialmente pequeña de una fuente nutritiva compleja que puede añadirse al medio de fermentación químicamente definido en el procedimiento de fermentación según la invención se define como una cantidad de como máximo el 10 % de la cantidad total del nutriente respectivo, que se añade en el procedimiento de fermentación. En particular, una cantidad esencialmente pequeña de una fuente compleja de carbono y/o nitrógeno que puede añadirse al medio de fermentación químicamente definido se define como una cantidad de una fuente compleja de carbono que resulte como máximo en el 10 % de la cantidad total de carbono y/o una cantidad de una fuente compleja de nitrógeno que resulte como máximo en el 10 % de la cantidad total de nitrógeno, que se añade en el procedimiento de fermentación, preferentemente, una cantidad de una fuente compleja de carbono que represente como máximo el 5 % de la cantidad total de carbono y/o una cantidad de una fuente compleja de nitrógeno que represente como máximo el 5 % de la cantidad total de nitrógeno, más preferentemente, una cantidad de una fuente compleja de carbono que represente como máximo el 1 % de la cantidad total de carbono y/o una cantidad de una fuente compleja de nitrógeno que represente como máximo el 1 % de la cantidad total de nitrógeno, que se añada en el procedimiento de fermentación. Preferentemente, como máximo el 10 % de la cantidad total de carbono y/o como máximo el 10 % de la cantidad total de nitrógeno, preferentemente una cantidad como máximo del 5 % de la cantidad total de carbono y/o una cantidad como máximo del 5 % de la cantidad total de nitrógeno, más preferentemente una cantidad como máximo del 1 % de la cantidad total de carbono y/o una cantidad como máximo del 1 % de la cantidad total de nitrógeno que se añade en el procedimiento de fermentación se añade por arrastre desde el inóculo. Lo más preferible es que no se añada ninguna fuente compleja de carbono y/o nitrógeno al medio de fermentación durante el procedimiento de fermentación.

El término "fuente de nutrientes químicamente definida" (por ejemplo, "fuente de carbono químicamente definida" o "fuente de nitrógeno químicamente definida") se entiende utilizado para fuentes de nutrientes que están compuestas por compuestos químicamente definidos.

El cultivo de un microorganismo en un medio de fermentación químicamente definido requiere que las células se cultiven en un medio que contenga varias fuentes de nutrientes químicamente definidas seleccionadas del grupo que consiste en una fuente de hidrógeno químicamente definida, una fuente de oxígeno químicamente definida, una fuente de carbono químicamente definida, una fuente de nitrógeno químicamente definida, una fuente de azufre químicamente definida, una fuente de fósforo químicamente definida, una fuente de magnesio químicamente definida, una fuente de sodio químicamente definida, una fuente de potasio químicamente definida, una fuente de oligoelementos químicamente definida y una fuente de vitaminas químicamente definida.

Preferentemente, la fuente de carbono químicamente definida se selecciona del grupo que consiste en carbohidratos, ácidos orgánicos, hidrocarburos, alcoholes y mezclas de los mismos. Los hidratos de carbono preferidos se seleccionan del grupo formado por glucosa, fructosa, galactosa, xilosa, arabinosa, sacarosa, maltosa, maltotriosa, lactosa, dextrina, maltodextrinas, almidón e inulina, y sus mezclas. Los alcoholes preferidos se seleccionan del grupo formado por glicerol, metanol y etanol, inositol, manitol y sorbitol y sus mezclas. Los ácidos orgánicos preferidos se seleccionan del grupo formado por el ácido acético, el ácido propiónico, el ácido láctico, el ácido fórmico, el ácido málico, el ácido cítrico, el ácido fumárico y los ácidos alcanoicos superiores y sus mezclas. Preferentemente, la fuente de carbono químicamente definida comprende glucosa o sacarosa. Más preferentemente, la fuente de carbono químicamente definida comprende glucosa, incluso más preferentemente la cantidad predominante de la fuente de carbono químicamente definida se proporciona como glucosa.

Más preferentemente, la fuente de carbono químicamente definida es la glucosa. Debe entenderse que la fuente de carbono químicamente definida puede proporcionarse en forma de jarabe, preferentemente como jarabe de glucosa. Tal como se entiende en el presente documento, el término "glucosa" incluirá los jarabes de glucosa. Un jarabe de glucosa es una solución azucarada viscosa con una elevada concentración de azúcar. Los azúcares del jarabe de glucosa son principalmente glucosa y, en menor medida, maltosa y maltotriosa en concentraciones variables según el grado de calidad del jarabe. Preferentemente, además de glucosa, maltosa y maltotriosa, el jarabe puede contener hasta un 10 %, preferentemente hasta un 5 %, más preferentemente hasta un 3 % de impurezas. Preferentemente, el jarabe de glucosa es de maíz.

La fuente de nitrógeno químicamente definida se selecciona preferentemente del grupo que consiste en urea, amoníaco, nitrato, sales de nitrato, nitrito, sales de amonio como cloruro de amonio, sulfato de amonio, acetato de amonio, fosfato de amonio y nitrato de amonio, y aminoácidos como glutamato o lisina y combinaciones de los mismos. Más preferentemente, una fuente de nitrógeno químicamente definida se selecciona del grupo que consiste en amoníaco, sulfato de amonio y fosfato de amonio. Más preferentemente, la fuente de nitrógeno químicamente definida es el amoníaco. El uso de amoníaco como fuente de nitrógeno químicamente definida tiene la ventaja de que el amoníaco puede funcionar además como agente controlador del pH.

Se pueden añadir compuestos adicionales en un medio de fermentación complejo y químicamente definido como se describe a continuación.

El oxígeno se proporciona generalmente durante el cultivo de las células mediante la aireación del medio de fermentación por agitación o gaseado. El hidrógeno suele proceder de la presencia de agua en el medio acuoso de fermentación. Sin embargo, el hidrógeno y el oxígeno también están contenidos en la fuente de carbono y/o nitrógeno y pueden proporcionarse de esa manera.

El magnesio puede aportarse al medio de fermentación mediante una o más sales de magnesio, seleccionadas preferentemente del grupo que consiste en cloruro de magnesio, sulfato de magnesio, nitrato de magnesio, fosfato de magnesio y combinaciones de los mismos, o mediante hidróxido de magnesio, o mediante combinaciones de una o más sales de magnesio e hidróxido de magnesio.

El sodio puede añadirse al medio de fermentación mediante una o más sales de sodio, preferentemente seleccionadas del grupo que consiste en cloruro de sodio, nitrato de sodio, sulfato de sodio, fosfato de sodio, hidróxido de sodio y combinaciones de los mismos.

El calcio puede añadirse al medio de fermentación mediante una o más sales de calcio, seleccionadas preferentemente del grupo que consiste en sulfato de calcio, cloruro de calcio, nitrato de calcio, fosfato de calcio, hidróxido de calcio y combinación de los mismos.

El potasio puede añadirse al medio de fermentación en forma químicamente definida por una o más sales de potasio, preferentemente seleccionadas del grupo que consiste en cloruro de potasio, nitrato de potasio, sulfato de potasio, fosfato de potasio, hidróxido de potasio y combinación de los mismos.

El fósforo puede añadirse al medio de fermentación mediante una o más sales que comprenden fósforo, seleccionadas preferentemente del grupo que consiste en fosfato de potasio, fosfato de sodio, fosfato de magnesio, ácido fosfórico y combinaciones de los mismos. Preferentemente, se añade al menos 1 g de fósforo por litro de medio de fermentación inicial.

El azufre puede añadirse al medio de fermentación mediante una o más sales que comprenden azufre, seleccionadas preferentemente del grupo que consiste en sulfato de potasio, sulfato de sodio, sulfato de magnesio, ácido sulfúrico y combinaciones de los mismos.

Preferentemente, el medio de fermentación comprende uno o más seleccionados del grupo que consiste en:

0,1 - 50 g de nitrógeno por litro de medio de fermentación;

1 - 6 g de fósforo por litro de medio de fermentación;

0,15 - 2 g de azufre por litro de medio de fermentación;

0,4 - 8 g de potasio por litro de medio de fermentación;

0,1 - 2 g de sodio por litro de medio de fermentación;

0,01 - 3 g de calcio por litro de medio de fermentación; y

0,1 -10 g de magnesio por litro de medio de fermentación.

Pueden añadirse uno o más iones de oligoelementos al medio de fermentación, preferentemente en cantidades inferiores a 10 mmol/L de medio de fermentación inicial cada uno. Estos iones de oligoelementos se seleccionan del grupo que consiste en hierro, cobre, manganeso, zinc, cobalto, níquel, molibdeno, selenio y boro y combinaciones de los mismos. Preferentemente, los iones de oligoelementos hierro, cobre, manganeso, zinc, cobalto, níquel y molibdeno se añaden al medio de fermentación. Preferentemente, el uno o más iones de oligoelemento se añaden al medio de fermentación en una cantidad seleccionada del grupo que consiste en 50 jm ol a 5 mmol por litro de medio inicial de hierro, 40 jm ol a 4 mmol por litro de medio inicial de cobre, 30 jm ol a 3 mmol por litro de medio inicial de manganeso, 20 |jmol a 2 mmol por litro de medio inicial de zinc, 1 jm o l a 100 jm o l por litro de medio inicial de cobalto, 2 jm ol a 200 jm ol por litro de medio inicial de níquel, y 0,3 jm ol a 30 jm ol por litro de molibdeno medio inicial, y sus combinaciones. Para la adición de cada oligoelemento pueden utilizarse preferentemente una o varias sales de cloruro, fosfato, sulfato, nitrato, citrato y acetato.

Los compuestos que pueden incluirse opcionalmente en el medio de fermentación son agentes quelantes, como ácido cítrico, MGDA, NTAo GLDA, y agentes tamponadores como fosfato mono y dipotásico, carbonato cálcico y similares. Los agentes tamponadores se añaden preferentemente cuando se trata de procedimientos sin control externo del pH. Además, puede dosificarse un agente antiespumante antes y/o durante el procedimiento de fermentación.

Las vitaminas se refieren a un grupo de compuestos orgánicos estructuralmente no relacionados, que son necesarios para el metabolismo normal de las células. Se sabe que la capacidad de las células para sintetizar las vitaminas que necesitan es muy variable. Debe añadirse una vitamina al medio de fermentación de las células de Bacillus que no sean capaces de sintetizar dicha vitamina. Las vitaminas pueden seleccionarse del grupo de la tiamina, riboflavina, piridoxal, ácido nicotínico o nicotinamida, ácido pantoténico, cianocobalamina, ácido fólico, biotina, ácido lipoico, purinas, pirimidinas, inositol, colina y heminas.

Preferentemente, el medio de fermentación también comprende un agente de selección, por ejemplo, un antibiótico, como ampicilina, tetraciclina, kanamicina, higromicina, bleomicina, cloroanfenicol, estreptomicina o fleomicina, al que el marcador seleccionable de las células proporciona resistencia.

La cantidad de compuestos necesarios que se añadirán al medio dependerá principalmente de la cantidad de biomasa que se formará en el procedimiento de fermentación. La cantidad de biomasa formada puede variar ampliamente, normalmente la cantidad de biomasa es de unos 10 a unos 150 gramos de masa celular seca por litro de caldo de fermentación. Normalmente, para la producción de proteínas, las fermentaciones que producen una cantidad de biomasa inferior a unos 10 g de masa celular seca por litro de caldo de fermentación no se consideran industrialmente relevantes.

La cantidad óptima de cada componente de un medio definido, así como qué compuestos son esenciales y cuáles no, dependerá del tipo de célula de Bacillus que se someta a fermentación en un medio, de la cantidad de biomasa y del producto que se vaya a formar. Típicamente, la cantidad de componentes del medio necesarios para el crecimiento de la célula de Bacillus puede determinarse en relación con la cantidad de fuente de carbono utilizada en la fermentación, ya que la cantidad de biomasa formada estará determinada principalmente por la cantidad de fuente de carbono utilizada.

Un medio de alimentación o solución de alimentación utilizado, por ejemplo, cuando el cultivo se ejecuta en modo de alimentación por lotes, puede ser cualquiera de los componentes del medio mencionados anteriormente o una combinación de los mismos. Se entiende aquí que al menos parte de los compuestos que se proporcionan como solución de alimentación ya pueden estar presentes en cierta medida en el medio de fermentación antes de la alimentación de dichos compuestos. En una realización, la solución de alimentación comprende glucosa. En una realización, la solución de alimentación comprende de 40 % a 60 % de glucosa, preferentemente de 42 % a 58 % de glucosa, más preferentemente de 45 % a 55 % de glucosa, aún más preferentemente de 47 % a 52 % de glucosa y más preferentemente 50 % de glucosa. En una realización, puede utilizarse la misma solución de alimentación para el fermentador de semillas que funciona en modo de alimentación por lotes y para el biorreactor de producción. En una realización, la solución de alimentación utilizada para el fermentador de semillas que funciona en modo de alimentación por lotes difiere de la solución de alimentación utilizada en el biorreactor de producción. En una realización, la solución de alimentación utilizada para el fermentador de semillas que funciona en modo de alimentación por lotes y la solución de alimentación utilizada en el biorreactor de producción tienen la misma concentración de glucosa, pero la solución de alimentación utilizada en el biorreactor de producción contiene sales que no están presentes en la solución de alimentación utilizada para el fermentador de semillas que funciona en modo de alimentación por lotes.

Varios perfiles de alimentación son conocidos en el arte. Se puede añadir una solución de alimentación de forma continua o discontinua durante el procedimiento de fermentación. La adición discontinua de una solución de alimentación puede producirse una vez durante el procedimiento de fermentación en forma de bolo único o varias veces con volúmenes diferentes o iguales. La adición continua de una solución de alimentación puede producirse durante el procedimiento de fermentación a la misma velocidad o a velocidades variables (es decir, volumen por tiempo). También pueden aplicarse combinaciones de perfiles de alimentación continuos y discontinuos durante el procedimiento de fermentación. Los componentes del medio de fermentación que se suministran como solución de alimentación pueden añadirse en una solución de alimentación o como diferentes soluciones de alimentación. En caso de que se aplique más de una solución de alimentación, las soluciones de alimentación pueden tener los mismos o diferentes perfiles de alimentación descritos anteriormente.

Preferentemente, antes de la inoculación, el medio de fermentación y las soluciones de alimentación se esterilizan para evitar o reducir el crecimiento de microorganismos durante el procedimiento de fermentación, que son diferentes de las células microbianas inoculadas. La esterilización puede realizarse con procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, la esterilización en autoclave o la filtración estéril. Algunos o todos los componentes del medio pueden esterilizarse por separado de otros componentes del medio para evitar interacciones de los componentes del medio durante el tratamiento de esterilización o para evitar la descomposición de los componentes del medio en condiciones de esterilización.

pH y temperatura de fermentación

El pH, la temperatura, el antiespumante u otras condiciones específicas de fermentación pueden aplicarse según las condiciones estándar conocidas en la técnica. En una realización, las condiciones de fermentación se ajustan para obtener rendimientos máximos de la proteína de interés.

Preferentemente, las células de Bacillus se cultivan a una temperatura de 25°C a 45°C, preferentemente de 27°C a 40°C, más preferentemente de 27°C a 37°C, más preferentemente a una temperatura de 37°C. Además, puede aplicarse un cambio de temperatura, en el que la temperatura de cultivo se reduce, por ejemplo, de 37°C a una temperatura de 33°C, 32°C, 31°C, 30°C, 29°C o 28°C.

Dependiendo de la célula de Bacillus, se ajusta el pH del caldo de fermentación durante el cultivo. Preferentemente, el pH del medio químicamente definido se ajusta antes de la inoculación. Preferentemente, el pH del medio químicamente definido se ajusta antes de la inoculación, pero después de la esterilización. Preferentemente, el pH del medio químicamente definido se ajusta antes de la inoculación a pH 6,6 a 9, preferentemente a pH 6,6 a 8,5, más preferentemente a pH 6,8 a 8,5, más preferentemente a pH 6,8 a pH 8,0. A modo de ejemplo, el pH se ajusta a o por encima de pH 6,8, pH 7,0, pH 7,2, pH 7,4 o pH 7,6. Preferentemente, el pH del caldo de fermentación durante el cultivo de las células de Bacillus se ajusta a pH 6,8 a 9, preferentemente a pH 6,8 a 8,5, más preferentemente a pH 7,0 a 8,5, más preferentemente a pH 7,2 a pH 8,0.

En una realización, la fermentación se lleva a cabo agitando y/o batiendo el medio de fermentación. En una realización específica, la fermentación se lleva a cabo agitando el medio de fermentación con 50 - 2000 rpm, preferentemente con 50 - 1600 rpm, preferentemente con 800 - 1400 rpm, más preferentemente con 50 - 200 rpm.

En una realización, se añade oxígeno al medio de fermentación durante el cultivo, preferentemente mediante agitación y/o agitación como se describe en el presente documento o mediante gaseado, preferentemente con aire u oxígeno de 0-3 bares. En una realización, la fermentación se lleva a cabo bajo saturación con oxígeno.

Las condiciones de cultivo para un tipo celular dado también pueden encontrarse en la literatura científica y/o en la fuente de la célula, como la American Type Culture Collection (ATCC) y el Fungal Genetics Stock Center.

Momento de la cosecha

El tiempo hasta la cosecha es el lapso de tiempo medido desde la inoculación del biorreactor de producción con las células de Bacillus hasta el momento en que la concentración de la proteína de interés ha alcanzado un nivel predeterminado y se cosecha el caldo de fermentación. En una realización, la proteína se cosecha cuando su concentración es de al menos 5 g de proteína/kg de caldo de fermentación, más preferentemente de al menos 7,5 g de proteína/kg de caldo de fermentación, más preferentemente de al menos 10 g de proteína/kg de caldo de fermentación. En una realización preferida, la proteína se cosecha cuando su concentración es de 10 g de proteína/kg de caldo de fermentación.

Por lo tanto, en una realización, la invención se refiere a un procedimiento para cultivar células de Bacillus que producen una proteína de interés, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un precultivo de dichas células de Bacillus;

(b) inocular un biorreactor de producción con el precultivo de la etapa a); y

en el que el precultivo de la etapa (a) se realiza en modo de alimentación por lotes, y

en el que las células de Bacillus son células de Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis o Bacillus lentus y

en el que el procedimiento comprende además una etapa (d) de recolección de la proteína cuando la concentración de la proteína de interés en el caldo de fermentación es de al menos 10 g de proteína/kg de caldo de fermentación.

La concentración de la proteína de interés en el caldo de fermentación puede monitorearse midiendo continuamente la concentración en muestras de la fermentación. Si la proteína de interés es una enzima, pueden realizarse ensayos de actividad enzimática que proporcionen información sobre la concentración de la enzima en la muestra. Por ejemplo, un ensayo de actividad proteasa puede implicar succinil - Ala - Ala - Pro - Phe - p-nitroanilida (Suc-AAPF-pNA, abreviado: AAPF) como sustrato. Un ensayo de actividad amilásica puede emplear como sustrato el etiliden-4-nitrofenil-a-D-maltoheptaósido (EPS). Los kits que contienen sustrato EPS y alfa-glucosidasa están disponibles en Roche Costum Biotech (cat. N° 10880078103) y se describen en Lorentz K. et al. (2000) Clin. Chem. 46-5): 644 - 649.

El tiempo de cosecha depende de la proteína producida por las células de Bacillus y, por lo tanto, puede variar. Sin embargo, cuando se aplica el procedimiento de la invención que comprende una etapa de precultivo realizada en modo alimentado por lotes, el tiempo hasta la cosecha se reduce entre un 5 % y un 30 %, preferentemente entre un 10 y un 30 %, más preferentemente entre un 15 y un 30 % en comparación con un procedimiento en el que la etapa de precultivo se realiza en modo por lotes. En una realización, el tiempo de fermentación en el biorreactor de producción se reduce en al menos un 5 %, preferentemente en al menos un 10 %, más preferentemente en al menos un 15 %, más preferentemente en al menos un 20 %, más preferentemente en al menos un 25 % y más preferentemente en al menos un 30 % en comparación con un procedimiento en el que la etapa de precultivo se realiza en modo por lotes.

Células de Bacillus

La célula de Bacillus es una célula de Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis o Bacillus lentus. Preferentemente, la célula hospedante bacteriana es una célula de Bacillus licheniformis.

En una realización, la célula comprende uno o más constructos genéticos para la expresión génica heteróloga, es decir, está modificada genéticamente para expresar una proteína. Las células de Bacillus modificadas genéticamente para expresar una proteína también se denominan células de Bacillus "recombinantes" o "transgénicas". Expresan una proteína recombinante. La proteína recombinante puede ser la proteína o interés.

Proteínas de interés

La presente invención se refiere a un procedimiento para cultivar células de Bacillus con el fin de producir una proteína de interés.

Proteínas

No hay ninguna limitación sobre el origen de la proteína de interés producida según el procedimiento de la invención. Así, el término proteína de interés incluye no sólo las proteínas naturales o de tipo salvaje, sino también cualquier mutante, variante, fragmento, etc. de la proteína de interés, así como una proteína sintética. Tales proteínas modificadas genéticamente pueden prepararse como es generalmente conocido en la técnica, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio, por PCR (utilizando un fragmento de PCR que contenga la mutación deseada como uno de los cebadores en las reacciones de PCR), o por mutagénesis aleatoria.

La célula Bacillus puede comprender el gen que codifica la proteína de interés (es decir, el gen de interés) endógenamente, es decir, la célula Bacillus no es recombinante, o el gen de interés puede ser heterólogo a la célula Bacillus, es decir, la célula Bacillus es recombinante. Preferentemente, el gen que codifica la proteína de interés es heterólogo de la célula de Bacillus.

El producto deseado puede secretarse en la fracción líquida del caldo de fermentación o puede permanecer dentro de las células de Bacillus. En una realización preferida, el producto de fermentación es secretado por el microorganismo en el caldo de fermentación. La secreción de la proteína de interés en el medio de fermentación permite la separación de la proteína de interés de las células de Bacillus. Para la secreción de una proteína en el medio de fermentación, el constructo de ácido nucleico utilizado para expresar la proteína de interés puede comprender un polinucleótido que codifica un péptido señal que dirige la secreción de la proteína de interés en el medio de fermentación. Varios péptidos señal son conocidos en la técnica. Los péptidos señal preferidos se seleccionan del grupo que consiste en el péptido señal de la proteína AprE de Bacillus sub tilis o el péptido señal de la proteína YvcE de Bacillus subitilis.

En una realización, la proteína de interés es una enzima.

En una realización preferida, la enzima se selecciona del grupo que consiste en hidrolasas, oxidasas, isomerasas, por ej. amilasa, alfa-amilasa, glucoamilasa, pululanasa, proteasa, metaloproteasa, peptidasa, lipasa, cutinasa, acil transferasa, celulasa, endoglucanasa, glucosidasa, celubiohidrolasa, xilanasa, xiloglucantransferasa, xilosidasa, mananasa, fitasa, fosfatasa, xilosa isomerasa, glucosa isomerasa, lactasa, acetolactato decarboxilasa, pectinasa, pectina metilesterasa, poligalacturonidasa, liasa, pectato liasa, arabinasa, arabinofuranosidasa, galactanasa, lacasa, peroxidasa y asparaginasa, preferentemente cuando la enzima es una amilasa o una proteasa.

En una realización particular preferida, se prefieren las siguientes enzimas:

Proteasa

Las enzimas con actividad proteolítica se denominan "proteasas" o "peptidasas". Las proteasas son proteínas activas que ejercen una "actividad proteasa" o "actividad proteolítica".

Las proteasas son miembros de la clase EC 3.4. Las proteasas incluyen aminopeptidasas (EC 3.4.11), dipeptidasas (EC 3.4.13), dipeptidil-peptidasas y tripeptidil-peptidasas (EC 3.4.14), peptidil-dipeptidasas (EC 3.4.15), carboxipeptidasas de tipo serina (EC 3.4.16), metalocarboxipeptidasas (EC 3.4.17), carboxipeptidasas de tipo cisteína (EC 3.4.18), peptidasas omega (CE 3.4.19), endopeptidasas de serina (CE 3.4.21), endopeptidasas de cisteína (CE 3.4.22), endopeptidasas aspárticas (CE 3.4.23), metaloendopeptidasas (CE 3.4.24), endopeptidasas de treonina (CE 3.4.25), endopeptidasas de mecanismo catalítico desconocido (CE 3.4.99).

Las enzimas proteasas disponibles comercialmente incluyen, pero nose limitan a, Lavergy™ Pro (BASF); Alcalase®, Blaze®, Duralase™, Durazym™, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase® and Esperase® (Novozymes A/S), those sold under the tradename Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect® Prime, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, FN₂®, FN3®, FN4®, Excellase®, Eraser®, Ultimase®, Opticlean®, Effectenz®, Preferenz®y Optimase® (Danisco/DuPont), Axapem™ (Gist-Brocases N.V.), Bacillus lentus Alkaline Protease y KAP(Bacillus alkalophilus subtilisin) de Kao.

En una realización, la proteasa puede seleccionarse entre las serina proteasas (EC 3.4.21). Las serina proteasas o serina peptidasas (EC 3.4.21) se caracterizan por tener una serina en el sitio catalíticamente activo, que forma un aducto covalente con el sustrato durante la reacción catalítica. Una proteasa de serina puede seleccionarse del grupo formado por quimotripsina (por ejemplo, CE 3.4.21.1), elastasa (por ejemplo, CE 3.4.21.36, CE 3.4.21.37 o CE 3.4.21.71), granzima (por ejemplo, CE 3.4.21.78 o CE 3.4.21.79), calicreína (por ejemplo, CE 3.4.21.34, CE 3.4.21.35, CE 3.4.21.118 o CE 3.4.21.119), plasmina (por ejemplo, CE 3.4.21.118 o CE 3.4.21.119), EC 3.4.21.34, EC 3.4.21.35, EC 3.4.21.118, o EC 3.4.21.119,) plasmina (por ejemplo, EC 3.4.21.7), tripsina (por ejemplo, EC 3.4.21.4), trombina (por ejemplo, EC 3.4.21.5,) y subtilisina (también conocida como subtilopeptidasa, por ejemplo, EC 3.4.21.62), esta última también denominada en lo sucesivo "subtilisina".

Un subgrupo de serina proteasas tentativamente designado subtilasas ha sido propuesto porSiezen et al. (1991), Protein Eng. 4:719-737 y Siezen et al. (1997), Protein Science 6:501-523. Se definen mediante el análisis homológico de más de 170 secuencias de aminoácidos de serina proteasas anteriormente denominadas subtilisina-like proteases. Anteriormente, una subtilisina se definía a menudo como una proteasa de serina producida por bacterias Grampositivas u hongos, y según Siezen et al. ahora es un subgrupo de las subtilasas. Se ha identificado una gran variedad de subtilasas y se ha determinado la secuencia de aminoácidos de varias de ellas. Para una descripción más detallada de estas subtilasas y de sus secuencias de aminoácidos, véase Siezen et al. (1997), Protein Science 6:501-523.

Las subtilasas pueden dividirse en 6 subdivisiones, es decir, la familia de las subtilisinas, la familia de las termitasas, la familia de las proteinasas K, la familia de las peptidasas lantibióticas, la familia de las kexinas y la familia de las pirolisinas.

Un subgrupo de las subtilasas son las subtilisinas, que son proteasas de serina de la familia S8 según la definición de la base de datos MEROPS (merops.sanger.ac.uk). La familia de las peptidasas S8 contiene la endopeptidasa de serina subtilisina y sus homólogas. En la subfamilia S8A, los residuos del sitio activo se encuentran frecuentemente en los motivos Asp-Thr/Ser-Gly, His-Gly-Thr-His y Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro. La mayoría de los miembros de la familia de peptidasas S8 son activos a pH neutro o ligeramente alcalino. Muchas peptidasas de la familia son termoestables.

Miembros destacados de la familia S8, subfamilia A son:

continuación

Las proteasas del tipo subtilisina (EC 3.4.21.62) y variantes pueden ser proteasas bacterianas. Dicha proteasa bacteriana puede proceder de una bacteria Gram-positiva como Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, o Streptomyces, o de una bacteria Gram-negativa como Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella o Ureaplasma. En "Subtilasas: Subtilisin-like Proteases" de R. Siezen, páginas 75-95 en "Subtilisin enzymes", editado por R. Bott y C. Betzel, Nueva York, 1996.

Al menos una proteasa puede seleccionarse entre las siguientes: subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens BPN' (descrita porVasantha et al. (1984), J. Virol. Volumen 159, p. 811-819yJA Wells et al. (1983) en Nucleic Acids Research, Volumen 11, p. 7911-7925); subtilisina de Bacillus licheniformis (subtilisina Carlsberg; divulgada en EL Smith et al. (1968) en J. Biol Chem, Volumen 243, pp. 2184-2191y Jacobs et al. (1985) en Nucl. Acids Res, Vol 13, p.

8913-8926); subtilisina PB92 (la secuencia original de la proteasa alcalina PB92 se describe en el documento EP 283075 A2); subtilisina 147 y/o 309 (Esperase®, Savinase®, respectivamente) según se describe en WO 89/06279, subtilisina de Bacillus lentus descrita enWO 91/02792, como la de Bacillus lentus DSM 5483 o las variantes de Bacillus lentus DSM 5483 descritas en el documento WO 95/23221, subtilisina de Bacillus alcalophilus (DSM 11233) descrita en DE 10064983, subtilisina de Bacillus gibsonii (DSM 14391) descrita enWO 2003/054184; subtilisina de Bacillus sp. (DSM 14390) divulgada en WO 2003/056017subtilisina de Bacillus s p . (DSM 14392) divulgada en WO 2003/055974; subtilisina de Bacillus gibsonii (DSM 14393) divulgada en WO 2003/054184 subtilisina con SEQ ID NO: 4 como se describe en WO 2005/063974, subtilisina con SEQ ID NO: 4 como se describe en WO 2005/103244, subtilisina con SEQ ID NO: 7 como se describe en WO 2005/103244 y subtilisina con SEQ ID NO: 2 tal como se describe en la solicitud DE 102005028295.4.

Las proteasas también incluyen las variantes descritas en: WO 92/19729, WO 95/23221, WO 96/34946, WO 98/20115, WO 98/20116, WO 99/11768, WO 01/44452, WO 02/088340, WO 03/006602, WO 2004/03186, WO 2004/041979, WO 2007/006305, WO 2011/036263, WO 2011/036264y WO 2011/072099. Ejemplos adecuados comprenden especialmente variantes de proteasa de subtilisina proteasa derivada de SEQ ID NO:22 como se describe en EP 1921 147 con sustituciones de aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones: 3, 4, 9, 15, 24, 27, 33, 36, 57, 68, 76, 77, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 131, 154, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 y 274 que tienen actividad proteolítica. Además, una subtilisina proteasa no está mutada en las posiciones Asp32, His64 y Ser221.

Una enzima similar a la subtilisina puede tener SEQ ID NO:22 como se describe en EP 1921147o puede ser una variante de la misma que es al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % idéntica a SEQ ID NO:22 según se describe en EP 1921 147 y tenga actividad proteolítica. En una realización, una enzima similar a la subtilisina es al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % idéntica a SEQ ID NO:22 como se describe en EP 1 921 147 y se caracteriza por tener el aminoácido ácido glutámico (E), o ácido aspártico (D), o asparagina (N), o glutamina (Q), o alanina (A), o glicina (G), o serina (S) en la posición 101 (según la numeración BPN') y tiene actividad proteolítica. En una realización, una enzima similar a la subtilisina es al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % idéntica a SEQ ID NO:22 como se describe en EP 1921 147 y se caracteriza por tener el aminoácido ácido glutámico (E), o ácido aspártico (D), en la posición 101 (según la numeración BPN') y tiene actividad proteolítica. Tal variante de subtilisina puede comprender una sustitución de aminoácidos en la posición 101, como R101E o R101D, sola o en combinación con una o más sustituciones en las posiciones 3, 4, 9, 15, 24, 27, 33, 36, 57, 68, 76, 77, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 131, 154, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 y/o 274 (según la numeración BPN') y tiene actividad proteolítica. En una realización, dicha proteasa comprende una o más sustituciones adicionales (a) a (h): (a) treonina en la posición 3 (3T), b) isoleucina en la posición 4 (4I), c) alanina, treonina o arginina en la posición 63 (63A, 63T o 63R), d) ácido aspártico o ácido glutámico en la posición 156 (156D o 156E), e) prolina en la posición 194 (194P) (f) metionina en la posición 199 (199M), (g) isoleucina en la posición 205 (205I), (h) ácido aspártico, ácido glutámico o glicina en la posición 217 (217D, 217E o 217G), (i) combinaciones de dos o más aminoácidos según (a) a (h).

Una enzima similar a la subtilisina puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos 80 % idéntica a SEQ ID NO:22 como se describe en EP 1921 147 y estar caracterizada además por comprender la sustitución R101E, y una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S156D, L262E, Q137H, S3T, R45E,D,Q, P55N, T58W,Y,L, Q59D,M,N,T, G61 D,R, S87E, G97S, A98D,E,R, S106A,W, N117E, H120V,D,K,N, S125M, P129D, E136Q, S144W, S161T, S163A,G, Y171 L, A172S, N185Q, V199M, Y209W, M222Q, N238H, V244T, N261T,D y L262N,Q,D (como se describe en el documento WO 2016/096711 y según la numeración BPN'), y tiene actividad proteolítica.

Las proteasas utilizadas en la presente invención tienen actividad proteolítica. Los procedimientos para determinar la actividad proteolítica son bien conocidos en la bibliografía (véase por ejemplo Gupta et al. (2002), Appl. Microbiol., Biotechnol. 60: 381-395). La actividad proteolítica puede determinarse utilizando Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-pnitroanilida (Suc-AAPF-pNA, abreviado AAPF; véase p. ej. DelMar et al. (1979), Analytical Biochem 99, 316-320el pNA se escinde de la molécula de sustrato por escisión proteolítica, dando lugar a la liberación de color amarillo de pNA libre que puede cuantificarse midiendo la OD405.

Amilasa

Alfa-amilasa (E.C. 3.2.1.1) pueden realizar la endohidrólisis de enlaces (1->4)-alfa-D-glucosídicos en polisacáridos que contengan tres o más unidades D-glucosa enlazadas (1->4)-alfa. Las enzimas amilasas actúan sobre el almidón, el glucógeno y los polisacáridos y oligosacáridos relacionados de forma aleatoria; los grupos reductores se liberan en la configuración alfa. Otros ejemplos de enzimas amilasa incluyen: Beta-amilasa (E.C. 3.2.1.2), Glucano 1,4-alfamaltotetrahidrolasa (E.C. 3.2.1.60), Isoamilasa (C.E. 3.2.1.68), Glucano 1,4-alfa-maltohexaosidasa (C.E. 3.2.1.98), y Glucano 1,4-alfa-maltohidrolasa (E.C. 3.2.1.133).

Las enzimas amilasa se han descrito en documentos de patentes que incluyen, pero no se limitan a: WO 2002/068589, WO 2002/068597, WO 2003/083054, WO 2004/091544 y WO 2008/080093.

Una amilasa derivada de Bacillus licheniformis tiene SEQ ID NO:2 como se describe en WO 95/10603. Las variantes adecuadas de esta amilasa son las que son al menos un 90 % idénticas a SEQ ID NO: 2 como se describe en WO 95/10603 y/o comprenden una o más sustituciones en las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201,202, 207, 208, 209, 211,243, 264, 304, 305, 391,408 y 444 y tienen actividad amilolítica. Tales variantes se describen enWO 94/02597, WO 94/018314, WO 97/043424 y SEQ ID NO:4 deWO 99/019467.

Una amilasa derivada de B. stearothermophilus tiene SEQ ID NO:6 como se describe en WO 02/10355. Las variantes adecuadas de esta amilasa son las que son idénticas en al menos un 90 % y tienen actividad amilolítica. Las variantes adecuadas de SEQ ID NO:6 incluyen aquellas que son al menos un 90 % idénticas a SEQ ID NO:6 como se describe enWO 02/10355 y/o comprenden además una deleción en las posiciones 181 y/o 182 y/o una sustitución en la posición 193.

Una amilasa derivada de Bacillus sp.707 tiene SEQ ID NO:6 como se describe en WO 99/19467 o es al menos un 90 % idéntica a la misma y tiene actividad amilolítica.

Una amilasa derivada de Bacillus halmapalus tiene SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:7 como se describe enWO 96/23872también descrita como SP-722, o es al menos un 90 % idéntica a una de las secuencias que tiene actividad amilolítica.

Una amilasa derivada de Bacillus sp. DSM 12649 tiene SEQ ID NO:4 como se describe enWO 00/22103 o es al menos un 90 % idéntica a la misma y tiene actividad amilolítica.

Una amilasa derivada de la cepa TS-23 de Bacillus tiene SEQ ID NO:2 según se divulga en WO 2009/061380 o es al menos un 90 % idéntica a ella y tiene actividad amilolítica.

Una amilasa derivada de Cytophaga sp. tiene SEQ ID NO:1 según se divulga en WO 2013/184577 o es al menos un 90 % idéntica a la misma y tiene actividad amilolítica.

Una amilasa derivada de Bacillus megaterium DSM 90 tiene SEQ ID NO:1 como se describe en WO 2010/104675 o es al menos un 90 % idéntica a ella y tiene actividad amilolítica.

Se conocen amilasas que tienen los aminoácidos 1 a 485 de SEQ ID NO:2 como se describe enWO 00/60060 o amilasas que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 96 % idéntica a los aminoácidos 1 a 485 de SEQ ID NO:2 que tienen actividad amilolítica.

También se conocen amilasas con SEQ ID NO: 12 como se describe en WO 2006/002643 o amilasas que tengan al menos un 80 % de identidad con ellas y tengan actividad amilolítica. Las amilasas adecuadas incluyen las que tienen al menos un 80 % de identidad con respecto a SEQ ID NO:12 y/o comprenden las sustituciones en las posiciones Y295F y M202LITV y tienen actividad amilolítica.

También se conocen amilasas que tienen SEQ ID NO:6 como se describe en WO 2011/098531 o amilasas que tienen al menos un 80 % de identidad con la misma y que tienen actividad amilolítica. Las amilasas adecuadas incluyen las que tienen al menos un 80 % de identidad con respecto a SEQ ID NO:6 y/o que comprenden una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 193 [G,A,S,T o M], 195 [F,W,Y,L,I o V], 197 [F,W,Y,L,I o V], 198 [Q o N], 200 [F,W,Y,L,I o V], 203 [F,W,Y,L,I o V], 206 [F,W,Y,N,L,I,V,H,Q,D o E], 210 [F,W,Y,L,I o V], 212 [F,W,Y,L,I o V], 213 [G,A,S,T o M] y 243 [F,W,Y,L,I o V] y tienen actividad amilolítica.

Se conocen amilasas que tienen SEQ ID NO:1 como se describe en WO 2013/001078 o amilasas que tienen al menos un 85 % de identidad con ella y que tienen actividad amilolítica. Las amilasas adecuadas incluyen aquellas que tienen al menos un 85 % de identidad con respecto a SEQ ID NO:1 y/o que comprenden una alteración en dos o más (varias) posiciones correspondientes a las posiciones G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 y G477 y que tienen actividad amilolítica.

Se conocen amilasas que tienen SEQ ID NO:2 como se describe en WO 2013/001087 o amilasas que tienen al menos un 85 % de identidad con la misma y que tienen actividad amilolítica. Las amilasas adecuadas incluyen aquellas que tienen al menos un 85 % de identidad con respecto a SEQ ID NO:2 y/o que comprenden una deleción de las posiciones 181 182, o 182+183, o 183+184, que tienen actividad amilolítica. Las amilasas adecuadas incluyen las que tienen al menos un 85 % de identidad con respecto a SEQ ID NO:2 y/o que comprenden una deleción de las posiciones 181 182, o 182+183, o 183+184, que comprenden una o dos o más modificaciones en cualquiera de las posiciones correspondientes a W140, W159, W167, Q169, W189, E194, N260, F262, W284, F289, G304, G305, R320, W347, W439, W469, G476 y G477 y tienen actividad amilolítica.

Las amilasas también incluyen a-amilasas híbridas de las amilasas mencionadas anteriormente, como por ejemplo las descritas en WO 2006/066594.

Las enzimas amilasa disponibles comercialmente incluyen: Amplify®, Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™, Stainzyme™, Stainzyme Plus™, Natalase™, Liquozyme X y BAN™ (de Novozymes A/S), y Rapidase™, Purastar™, PoweraseTM, Effectenz™ (M100 de DuPont), Preferenz™ (S1000, S110 y F1000; de DuPont), PrimaGreen™ (ALL; DuPont), Optisize™ (DuPont).

En una realización, la enzima es una amilasa tipo Termamyl. En el presente contexto, el término "enzima similar a Termamyl" pretende indicar una a-amilasa que, a nivel de aminoácidos, tiene una identidad de secuencia de al menos el 60 % con la a-amilasa de B. licheniformis descrita en el documento WO 96/23874. En una realización, la a-amilasa Termamyl-like muestra al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % de identidad con la a-amilasa de B. licheniformis descrita en el documento WO 96/23874.

Otra a-amilasa aquí presente es la Natalasa o una variante de la misma como se describe en WO 95/26397, WO 99/19467 y WO 01/66712.

Lipasa

"Lipasa", "enzima lipolítica", "lípido esterasa", se refieren todas a una enzima de la clase EC 3.1.1 ("éster carboxílico hidrolasa"). Lipasas (C.E. 3.1.1.3, Triacilglicerol lipasa) puede hidrolizar los triglicéridos en mono- y diglicéridos más hidrófilos, ácidos grasos libres y glicerol. Las enzimas lipasas suelen incluir también enzimas activas sobre sustratos distintos de los triglicéridos o que escinden ácidos grasos específicos, como la fosfolipasa A (E.C. 3.1.1.4), Galactolipasa (C.E. 3.1.1.26), cutinasa (EC 3.1.1.74) y enzimas con actividad esterol esterasa (EC 3.1.1.13) y/o actividad cera-éster hidrolasa (EC 3.1.1.50).

Se han descrito muchas enzimas lipasa en la técnica anterior, incluyendo, pero sin limitarse a: WO 00/032758, WO 03/089620, WO 2005/032496, WO 2005/086900, WO 2006/00976, WO 2006/031699, WO 2008/036863, WO 2011/046812 y WO 2014/059360.

Celulasa2

Las "celulasas", "enzimas celulasa" o "enzimas celulolíticas" son enzimas que intervienen en la hidrólisis de la celulosa. Se conocen tres tipos principales de celulasas, a saber, la endo-beta-1,4-glucanasa (endo-1,4-P-D-glucano 4-glucanohidrolasa, E.C. 3.2.1.4; hidroliza los enlaces p-1,4-glucosídicos de la celulosa), la celobiohidrolasa (1,4-P-D-glucano celobiohidrolasa, EC 3.2.1.91) y la beta-glucosidasa (EC 3.2.1.21).

Las enzimas celulasa se han descrito en patentes y solicitudes de patentes publicadas, entre las que se incluyen: WO 97/025417, WO 98/024799, WO 03/068910, WO 2005/003319 y WO 2009/020459.

Entre las enzimas celulasa disponibles comercialmente se incluyen Celluzyme™, Endolase™, Carezyme™, Cellusoft™, Renozyme™, Celluclean™ (from Novozymes A/S), Ecostone™, Biotouch™, Econase™, Ecopulp™ (de AB Enzymes Finland), Clazinase™, y Puradax HA™, Genencor detergente celulasa L, IndiAge™ Neutra (de Genencor International Inc./DuPont), Revitalenz™ (2000 de DuPont), Primafast™ (DuPont) y KAC-500™ (de Kao Corporation).

Las celulasas utilizadas en los procedimientos según la invención tienen "actividad celulolítica" o "actividad celulasa". Los procedimientos BtL y GtL son conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, la actividad celulolítica puede determinarse en virtud del hecho de que la celulasa hidroliza la carboximetilcelulosa a hidratos de carbono reductores, cuya capacidad reductora se determina colorimétricamente mediante la reacción del ferricianuro, según Hoffman, W. S., J. Biol. Chem. 120, 51-1937).

Mananasa:

Las enzimas Mannasa (E.C. 3.2.1.78) hidrolizan los enlaces p-1,4 internos de los polímeros de mañosa. "Mananasa" puede ser una mananasa alcalina de la familia 5 o 26. Se sabe que las enzimas mananasas derivan del tipo salvaje de Bacillus o Humicola, en particular B. agaradhaerens, B. licheniformis, B. halodurans, B. clausii o H. insolens. Las mananasas adecuadas se describen en WO 99/064619.

Las enzimas mananasas comercialmente disponibles incluyen, pero no se limitan a,Mannaway® (Novozymes AIS).

Pectato liasa

Las enzimas Pectato liasa (E.C. 4.2.2.2) catalizan la escisión eliminativa de (1->4)-alfa-D-galacturonano para dar oligosacáridos con grupos 4-deoxi-alfa-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores.

Las enzimas pectato liasas se han descrito en patentes y solicitudes de patentes publicadas que incluyen, pero no se limitan a: WO/ 2004/090099. Se sabe que las pectato liasas derivan de Bacillus, en particular B. licheniformis o B. agaradhaerens, o una variante derivada de cualquiera de ellos, por ejemplo, como se describe en el documento US 6,124,127, WO 99/027083, WO 99/027084, WO 2002/006442, WO 02/092741, WO 03/095638.

Las enzimas pectato liasas comercialmente disponibles incluyen: XpectTM, PectawashTM y PectawayTM (Novozymes A/S); PrimaGreenTM, EcoScour (DuPont).

Nucleasa

La nucleasa (EC 3.1.21.1), también conocida como desoxirribonucleasa I o DNasa, realiza la escisión endonucleolítica de los productos finales 5'-fosfodinucleótido y 5'-fosfoligonucleótido.

Las enzimas nucleasas se han descrito en patentes y solicitudes de patentes publicadas que incluyen, pero no se limitan a: US 3.451.935, GB 1300596, DE 10304331, WO 2015/155350, WO 2015/155351, WO 2015/166075, WO 2015/181287y WO 2015/181286.

Las variantes de enzimas pueden definirse por su identidad de secuencia cuando se comparan con una enzima parental. La identidad de secuencia se suele indicar como " % de identidad de secuencia" o " % de identidad". Para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos, en una primera etapa se genera un alineamiento de secuencias por pares entre esas dos secuencias, en el que las dos secuencias se alinean en toda su longitud (es decir, un alineamiento global por pares). El alineamiento se genera con un programa que utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol., (1979), 48, págs. 443-453), utilizando preferentemente el programa "NEEDLE" (The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS)) con los parámetros por defecto del programa (apertura de brecha = 10,0, extensión de brecha = 0,5 y matriz = EBLOSUM62). El alineamiento preferido para los fines de la presente invención es el alineamiento a partir del cual puede determinarse la mayor identidad de secuencia.

Tras alinear las dos secuencias, en una segunda etapa se determinará un valor de identidad a partir del alineamiento. Por lo tanto, según la presente invención se aplica el siguiente cálculo de porcentaje de identidad:

% de identidad = (residuos idénticos / longitud de la región de alineamiento que muestra la secuencia respectiva de la presente invención en toda su longitud) * 100. Así, la identidad de secuencia en relación con la comparación de dos secuencias de aminoácidos según esta realización se calcula dividiendo el número de residuos idénticos por la longitud de la región de alineamiento que muestra la secuencia respectiva de la presente invención en toda su longitud. Este valor se multiplica por 100 para obtener el " % de identidad".

Para calcular el porcentaje de identidad de dos secuencias de ADN se aplica lo mismo que para el cálculo del porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos con algunas condiciones. En el caso de las secuencias de ADN que codifican una proteína, el alineamiento por pares se realizará en toda la longitud de la región codificante, desde el codón de inicio hasta el codón de terminación, excluyendo los intrones. Para las secuencias de ADN que no codifican proteínas, el alineamiento por pares se realizará en toda la longitud de la secuencia de la presente invención, de modo que la secuencia completa de la presente invención se compara con otra secuencia o con regiones de otra secuencia. Además, el programa de alineamiento preferido que utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol., (1979), 48, págs. 443-453) es "NEEDLE" (The European Molecular Biology Open Software Suite (E^mB^oSS)) con los parámetros por defecto del programa (apertura de brecha = 10,0, extensión de brecha = 0,5 y matriz = EDNA-FULL).

Hormonas

En otra realización, la proteína de interés puede ser una hormona tal como, pero no limitada a, insulina, hormona de crecimiento humano, somatostatina y factor de crecimiento similar a la insulina.

Procesamiento corriente abajo

Una vez realizado el procedimiento de la presente invención, la proteína de interés puede o no purificarse más a partir del caldo de fermentación. Así, en una realización, la presente invención se refiere a un caldo de fermentación que comprende una proteína de interés obtenida por un procedimiento de fermentación según la presente invención.

Una vez cosechado el caldo de fermentación, el producto deseado puede recuperarse y purificarse mediante procedimientos conocidos en la técnica.

La proteína de interés deseada, preferentemente la proteína deseada, puede ser secretada (en la fracción líquida del caldo de fermentación) o puede no ser secretada por las células de Bacillus (y por lo tanto está comprendida en las células del caldo de fermentación). En función de ello, la proteína deseada puede recuperarse de la fracción líquida del caldo de fermentación o de lisados celulares. La recuperación de la proteína deseada puede conseguirse por procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Los procedimientos adecuados para la recuperación de proteínas del caldo de fermentación incluyen, entre otros, la recogida, centrifugación, filtración, extracción y precipitación. Si la proteína de interés precipita o cristaliza en el caldo de fermentación o se une, al menos en parte, a la materia particulada del caldo de fermentación, podrían ser necesarias etapas de tratamiento adicionales para liberar la proteína de interés de la biomasa o para solubilizar los cristales y precipitados de proteína de interés. US 6.316.240 B1 y WO 2008/110498 A1 describen un procedimiento para recuperar una proteína de interés, que precipita y/o cristaliza durante la fermentación, a partir del caldo de fermentación. En caso de que la proteína deseada se encuentre en las células del caldo de fermentación, puede ser necesario liberar la proteína de interés de las células. La liberación de las células puede conseguirse, por ejemplo, pero sin limitarse a ello, mediante lisis celular con técnicas bien conocidas por el experto, por ejemplo, tratamiento con lisozima, tratamiento ultrasónico, prensa francesa o combinaciones de las mismas.

La proteína de interés, preferentemente la proteína de interés, puede purificarse a partir del caldo de fermentación por procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una proteína de interés puede aislarse del caldo de fermentación mediante procedimientos convencionales que incluyen, entre otros, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación. A continuación, el polipéptido aislado puede purificarse aún más mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, entre otros, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrófoba, de cromatoenfoque y de exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo IEF), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio) o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989). A continuación, el polipéptido purificado puede concentrarse mediante procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, entre otros, la ultrafiltración y la evaporación, en conocido, la evaporación de película fina.

La solución proteica purificada puede procesarse posteriormente para formar una "formulación proteica". Por "formulación proteica" se entiende cualquier formulación no compleja que comprenda un pequeño número de ingredientes, en la que los ingredientes sirvan para estabilizar las proteínas comprendidas en la formulación proteica y/o la estabilización de la propia formulación proteica. El término "estabilidad de la proteína" se refiere a la retención de la actividad de la proteína en función del tiempo durante su almacenamiento o funcionamiento. El término "estabilidad de la formulación proteica" se refiere al mantenimiento del aspecto físico de la formulación proteica durante el almacenamiento o el funcionamiento, así como a la evitación de la contaminación microbiana durante el almacenamiento o el funcionamiento.

La formulación proteica puede ser sólida o líquida. Las formulaciones proteicas pueden obtenerse mediante técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, sin limitarse a ello, las formulaciones enzimáticas sólidas pueden obtenerse por extrusión o granulación. Las técnicas adecuadas de extrusión y granulación son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en WO 94/19444 A1 yW O 97/43482 A1. "Líquido" en el contexto de la formulación enzimática está relacionado con el aspecto físico a 20°C y 101,3 kPa. Las formulaciones proteínicas líquidas pueden comprender cantidades de enzima del orden del 0,1 % al 40 % en peso, o del 0,5 % al 30 % en peso, o del 1 % al 25 % en peso, o del 3 % al 10 %, todo ello en relación con el peso total de la formulación enzimática.

La proteína tal como se produce por el procedimiento de la presente invención puede utilizarse en alimentos, por ejemplo la proteína puede ser un aditivo para hornear. La proteína puede utilizarse en piensos, por ejemplo, la proteína es un aditivo para piensos animales. La proteína puede utilizarse en la industria de transformación del almidón, por ejemplo, las amilasas se utilizan en la conversión del almidón en etanol o azúcares (jarabe de maíz de alta fructosa) y otros subproductos como aceite, granos secos de destilería, etc. La proteína puede utilizarse en el procesado de pasta y papel, por ejemplo, la proteína puede utilizarse para mejorar la resistencia del papel. En una realización, la proteína producida por los procedimientos de la presente invención se utiliza en formulaciones de detergentes o formulaciones de limpieza. Por "formulación detergente" o "formulación limpiadora" se entienden las composiciones destinadas a limpiar el material sucio. La limpieza incluye el lavado y la limpieza de superficies duras. El material sucio según la invención incluye textiles y/o superficies duras.

Realizaciones específicas

A continuación se muestra una lista de realizaciones específicas de la invención:

En una realización, la invención se refiere a un procedimiento para cultivar células de Bacillus que producen una proteína de interés, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un precultivo de dichas células de Bacillus ;

(b) inocular un biorreactor de producción con el precultivo de la etapa a); y

(c) cultivar las células de Bacillus en el biorreactor de producción en condiciones propicias para la producción de la proteína de interés,

En una realización, la invención se refiere a un procedimiento para cultivar células de Bacillus que producen una proteína de interés, que comprende llas etapas de:

(a) proporcionar un precultivo de dichas células de Bacillus ;

(b) inocular un biorreactor de producción con el precultivo de la etapa a); y

en el que el precultivo de la etapa (a) se realiza en modo de alimentación por lotes; y en el que se añaden al biorreactor de producción más de 200 g de una fuente de carbono (preferentemente, una fuente de carbono definida químicamente) por litro de medio de fermentación inicial durante el cultivo de las células de Bacillus en el biorreactor de producción, y

en el que las células de Bacillus son células de Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis o Bacillus lentus.

En una realización, la invención se refiere a un procedimiento para cultivar células de Bacillus que producen una enzima, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un precultivo de dichas células de Bacillus ;

(b) inocular un biorreactor de producción con el precultivo de la etapa a); y

(c) cultivar las células de Bacillus en el biorreactor de producción en condiciones propicias para la producción de la enzima,

En una realización, la invención se refiere a un procedimiento para cultivar células de Bacillus que producen una proteasa, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un precultivo de dichas células de Bacillus ;

(b) inocular un biorreactor de producción con el precultivo de la etapa a); y

(c) cultivar las células de Bacillus en el biorreactor de producción en condiciones propicias para la producción de la proteasa,

En una realización, la invención se refiere a un procedimiento para cultivar células de Bacillus que producen una amilasa, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un precultivo de dichas células de Bacillus ;

(b) inocular un biorreactor de producción con el precultivo de la etapa a); y

(c) cultivar las células de Bacillus en el biorreactor de producción en condiciones propicias para la producción de la amilasa,

En una realización, la invención se refiere a un procedimiento para cultivar células de Bacillus licheniformis que producen una proteína de interés, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un precultivo de dichas células de Bacillus licheniformis ;

(b) inocular un biorreactor de producción con el precultivo de la etapa a); y

(c) cultivar las células de Bacillus licheniformis en el biorreactor de producción en condiciones propicias para la producción de la proteína de interés,

en el que el precultivo de la etapa (a) se realiza en modo de alimentación por lotes.

En una realización, la invención se refiere a un procedimiento para cultivar células de Bacillus licheniformis que producen una proteasa, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un precultivo de dichas células de Bacillus licheniformis ;

(b) inocular un biorreactor de producción con el precultivo de la etapa a); y

(c) cultivar las células de Bacillus licheniformis en el biorreactor de producción en condiciones propicias para la producción de la proteasa,

En una realización, la invención se refiere a un procedimiento para cultivar células de Bacillus licheniformis que producen una amilasa, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un precultivo de dichas células de Bacillus licheniformis ;

(b) inocular un biorreactor de producción con el precultivo de la etapa a); y

(c) cultivar las células de Bacillus licheniformis en el biorreactor de producción en condiciones propicias para la producción de la amilasa,

La invención se ilustra además en los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar en modo alguno el alcance de la invención tal como se reivindica. Las numerosas variaciones posibles que son obvias para un experto en la materia también entran dentro del alcance de la invención.

Ejemplos

A menos que se indique lo contrario, los siguientes experimentos se han realizado aplicando equipos, procedimientos, productos químicos y bioquímicos convencionales utilizados en ingeniería genética y en la producción fermentativa de compuestos químicos mediante el cultivo de microorganismos. Véase también Sambrook et al. Molecular Cloning: Manual de laboratorio. A Laboratory Manual" 3ra ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989); y F.M. (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991). Para el primer precultivo descrito en los ejemplos siguientes (Ejemplos 1-3), se utilizaron matraces agitados que contenían un medio complejo descrito en la Tabla 1. Se inocularon matraces agitados a partir de cepas criogénicas de Bacillus licheniformis que contenían un gen que codificaba una proteasa o una amilasa y se cultivaron durante 16 horas a 30 °C a 200 rpm.

Tabla 1:

Antes de la esterilización en autoclave, se ajustó el pH a 7,5 utilizando NaOH.

Para otros precultivos y los cultivos principales en los biorreactores de producción descritos en los ejemplos siguientes, las células de Bacillus licheniformis del primer precultivo se cultivaron en un procedimiento de fermentación utilizando un medio de fermentación químicamente definido que proporcionaba los componentes enumerados en la Tabla 2 y la Tabla 3.

Tabla 2: Macroelementos aportados en el procedimiento de fermentación

Tabla 3: Oligoelementos aportados en el procedimiento de fermentación

La fermentación se inició con un medio que contenía 8 g/l de glucosa. Como solución de alimentación se utilizó una solución que contenía un 50 % de glucosa. El pH se ajustó durante la fermentación utilizando amoniaco.

Ejemplo 1

Se utilizaron células de Bacillus para la producción de una proteasa o una amilasa. El tren de semillas de los respectivos precultivos constaba de tres fermentadores de semillas. El primer precultivo en un matraz agitador se realizó con un medio complejo como el descrito anteriormente. El 2do precultivo en un fermentador de semillas se inoculó con el 10 % de su volumen del primer precultivo y se cultivó en el medio químicamente definido descrito anteriormente. El 2do precultivo se realizó en modo por lotes durante 16 horas o hasta el agotamiento de la glucosa, indicado por un aumento brusco de la señal de oxígeno disuelto y un aumento del pH. El 3er precultivo que contenía el medio químicamente definido descrito anteriormente se inoculó con el 10 % de su volumen del 2do precultivo. El 3er precultivo se realizó en modo de alimentación por lotes utilizando el medio químicamente definido descrito anteriormente y una solución de alimentación que contenía un 50 % de glucosa. La alimentación se inició al agotarse la cantidad inicial de 8 g/l de glucosa, lo que se indicó por un aumento del pH del cultivo en 0,2 unidades de pH. El alimento se añadió durante 22 h.

Como control, se realizó un precultivo utilizando el mismo número de fermentadores de semillas y los mismos medios, en el que el precultivo se ejecutó completamente en modo por lotes utilizando un medio químicamente definido que contenía 20 g/L de glucosa en el 2do y 3er precultivo.

El volumen del inóculo tanto del precultivo de control como del precultivo de lote alimentado transferido al biorreactor de producción fue del 10 % del volumen del medio de fermentación inicialmente presente en el biorreactor de producción, respectivamente. El cultivo de las células microbianas en el biorreactor de producción se realizó en modo de alimentación por lotes utilizando un medio químicamente definido como se ha descrito anteriormente. La alimentación con una solución de alimentación que contenía 50 % de glucosa se inició al agotarse una cantidad inicial de 8 g/l de glucosa indicada por un aumento del pH del cultivo en 0,2 unidades de pH y se añadió hasta que se alcanzó una concentración de producto de 10 g/kg (corresponde a 10 g/litro) de caldo de fermentación.

El tiempo hasta la cosecha fue monitoreado usando ensayos enzimáticos para proteasa y amilasa en muestras continuas. La actividad de la proteasa se determinó utilizando Succinil - Ala - Ala - Pro - Phe - p-Nitroanilida (Suc-AAPF-pNA, abreviado: AAPF) como sustrato. El pNA se escinde de la molécula de sustrato a 30°C, pH 8,6 tampón TRIS. La velocidad de escisión puede determinarse por el aumento del color amarillo del pNA libre en la solución midiendo la OD405, la densidad óptica a 405 nm. La actividad de la alfa-amilasa se determinó mediante un procedimiento que empleaba el sustrato etiliden-4-nitrofenil-a-D-maltoheptaósido (EPS). El D-maltoheptaósido es un oligosacárido bloqueado que puede ser escindido por una endo-amilasa. Tras la escisión, una alfa-glucosidasa libera una molécula de PNP de color amarillo que puede medirse por espectofotometría visible a 405 nm. Los kits que contienen sustrato EPS y alfa-glucosidasa están disponibles en Roche Costum Biotech (cat. No. 10880078t3) y se describen en Lorentz K. et al. (2000), Clin. Chem., 46/5: 644 -649. La pendiente de la curva de absorción dependiente del tiempo es directamente proporcional a la actividad específica (actividad por mg de enzima) de la alfa-amilasa en cuestión en unas condiciones determinadas.

El momento de la cosecha se definió como el momento en que se produjeron 10 g de proteasa o amilasa/ kg de caldo de fermentación. El tiempo transcurrido hasta la cosecha se normalizó con respecto al cultivo de control, es decir, con respecto al tiempo necesario si se utilizara un cultivo previo por lotes antes de la inoculación del biorreactor de producción.

Para la producción de la proteasa, el tiempo hasta la cosecha se redujo en aproximadamente un 30 % cuando el precultivo que precede al biorreactor se ejecutó en modo alimentado por lotes en comparación con el precultivo ejecutado completamente en modo por lotes (ver Figura 1A). Para la producción de la amilasa, el tiempo hasta la cosecha se redujo en torno a un 20 % cuando el precultivo que precedía al biorreactor se ejecutó en modo alimentado por lotes en comparación con el precultivo ejecutado completamente en modo por lotes (véase la Figura 1B).

Ejemplo 2

Se utilizaron células de Bacillus licheniformis para la producción de una proteasa. El tren de siembra se realizó como se describe en el Ejemplo 1 para el precultivo alimentado por lotes y el precultivo por lotes. El volumen del inóculo respectivo procedente del precultivo para el biorreactor de producción era del 10 % del volumen del medio de fermentación inicialmente presente en el biorreactor de producción o del 1 % del volumen del medio de fermentación inicialmente presente en el biorreactor de producción (Figura 2). El cultivo de las células microbianas en el biorreactor de producción se realizó en modo de alimentación por lotes. El tiempo hasta la cosecha se controló utilizando un ensayo enzimático para la proteasa en muestras continuas como se describe en el Ejemplo 1. El momento de la cosecha, y por tanto el final del procedimiento de fermentación, se definió como el momento en que se han producido 10 g de proteasa/ kg de caldo de fermentación. El tiempo hasta la cosecha se normalizó con respecto al cultivo de control, es decir, con respecto al tiempo necesario si se utiliza un cultivo previo por lotes.

La Figura 2 muestra que cuando el volumen del inóculo era del 1 % o del 10 %, el tiempo hasta la cosecha se reducía en aproximadamente un 20 % cuando el precultivo se ejecutaba en modo de lote alimentado.

Ejemplo 3

Se utilizaron células de Bacillus licheniformis para la producción de una proteasa. En este Ejemplo, se probaron diferentes medios en el fermentador final de semillas que precede al biorreactor de producción. Así pues, el medio en el fermentador de semillas final del tren de semillas era un medio complejo o un medio químicamente definido. A continuación, el precultivo se transfirió al biorreactor de producción. El volumen del inóculo era el 10 % del volumen del medio de fermentación inicialmente presente en el biorreactor de producción.

El cultivo de las células microbianas en el biorreactor de producción se llevó a cabo en modo de alimentación por lotes como se describe en los Ejemplos 1 y 2. El tiempo hasta la cosecha se controló mediante un ensayo enzimático para la proteasa en muestras continuas, utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 1. El momento de la cosecha, y por tanto el final del procedimiento de fermentación, se definió como el momento en que se han producido 10 g de producto de interés/kg de caldo de fermentación. El tiempo transcurrido hasta la cosecha se normalizó con respecto al cultivo realizado con medios químicamente definidos.

La Figura 3 muestra que el tiempo hasta la cosecha fue esencialmente el mismo cuando se utilizó un medio químicamente definido o un medio complejo en el pre-cultivo alimentado por lotes.

Ejemplo 4

Se utilizaron células de Bacillus subtilis para la producción de una proteasa. El tren de siembra se realizó como se describe en el Ejemplo 1 para el precultivo alimentado por lotes y el precultivo por lotes. El volumen del inóculo respectivo procedente del precultivo para el biorreactor de producción era el 10 % del volumen del medio de fermentación inicialmente presente en el biorreactor de producción. El cultivo de las células microbianas en el biorreactor de producción se realizó en modo de alimentación por lotes. El tiempo hasta la cosecha se controló utilizando un ensayo enzimático para la proteasa en muestras continuas como se describe en el Ejemplo 1. El momento de la cosecha, y por tanto el final del procedimiento de fermentación, se definió como el momento en que se han producido 10 g de proteasa/ kg de caldo de fermentación. El tiempo hasta la cosecha se normalizó con respecto al cultivo de control, es decir, con respecto al tiempo necesario si se utiliza un cultivo previo por lotes.

El tiempo hasta la cosecha se redujo en aproximadamente un 12 % cuando el precultivo que precede al biorreactor se ejecutó en modo alimentado por lotes en comparación con el precultivo ejecutado completamente en modo por lotes (ver Figura 4).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para cultivar células de Bacillus que producen una proteína de interés, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un precultivo de dichas células de Bacillus;

(b) inocular un biorreactor de producción con el precultivo de la etapa a); y

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el volumen del precultivo utilizado para inocular el biorreactor de producción no es superior al 15 % del volumen del medio de fermentación presente en el biorreactor.

3. El procedimiento de las reivindicaciones 1 y 2, en el que el precultivo comprende al menos dos etapas, todas ellas realizadas en modo de alimentación por lotes.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa c) se realiza en modo por lotes, modo de alimentación por lotes o modo de fermentación continua.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que las células de Bacillus son células de Bacillus licheniformis.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína de interés es una enzima.

7. El procedimiento de fermentación de la reivindicación 6, en el que la enzima se selecciona de la lista que consiste en hidrolasas, oxidasas, isomerasas, amilasa, alfa-amilasa, glucoamilasa, pululanasa, proteasa, metaloproteasa, peptidasa, lipasa, cutinasa, acil transferasa, celulasa, endoglucanasa, glucosidasa, celubiohidrolasa, xilanasa, xiloglucantransferasa, xilosidasa, mananasa, fitasa, fosfatasa, xilosa isomerasa, glucosa isomerasa, lactasa, acetolactato decarboxilasa, pectinasa, pectina metilesterasa, poligalacturonidasa, liasa, pectato liasa, arabinasa, arabinofuranosidasa, galactanasa, lacasa, peroxidasa y asparaginasa.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteína de interés es secretada por las células de Bacillus en el caldo de fermentación.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además una etapa (d) de cosechar la proteína cuando la concentración de la proteína de interés es de al menos 10 g de proteína/kg de caldo de fermentación.

10. Un procedimiento para producir una solución acuosa de polímero que comprende las etapas de

(b) inocular un biorreactor de producción con el precultivo de la etapa a); y

11. Un procedimiento para reducir el tiempo hasta la cosecha en la producción fermentativa de una proteína de interés, que comprende las etapas de:

(b) inocular un biorreactor de producción con el precultivo de la etapa a); y