ES2936808T3 - Tratamiento para la desinfección de semillas - Google Patents

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Amnon Olesinski
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Abstract

La presente invención se refiere al tratamiento de material vegetal, especialmente semillas. El método utiliza presión de vacío para desinfectar semillas de patógenos. La desinfección de semillas es importante ya que las semillas infectadas por patógenos podrían propagarlos y provocar grandes pérdidas de cultivos. El método es aplicable a semillas de especies de cucurbitáceas, específicamente sandía, melón, calabaza, calabaza, pepino y calabazas, pero también a semillas de especies de solanáceas, específicamente tomates, pimientos y berenjenas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Tratamiento para la desinfección de semillas
Sector de la técnica
La invención se refiere al tratamiento de semillas. El método usa presión de vacío para desinfectar semillas de patógenos, tales como hongos, bacterias, virus, viroides, organismos similares a virus, oomicetos, fitoplasmas, protozoos, nematodos y similares. El método es aplicable, por ejemplo, a semillas de especies de cucurbitáceas, específicamente sandía, melón, calabacín, calabaza, pepino y calabazas ornamentales o semillas de especies de solanáceas, específicamente tomates, pimientos y berenjenas.
Estado de la técnica
Los patógenos transmitidos por semillas causan cada año importantes pérdidas económicas. En particular, reducen el rendimiento del cultivo, deterioran su calidad y dificultan el almacenamiento de las hortalizas. Para los cultivadores, por lo tanto, es fundamental recibir semillas exentas de patógenos, ya que es difícil realizar el control durante la temporada de cultivo.
En general, las semillas se someten a varios tratamientos con el fin de matar los patógenos presentes en las semillas de forma que se evita la transmisión de patógenos al cultivo que se cultiva a partir de las semillas y se previene el daño a las propias semillas. Dicho tratamiento también puede aumentar la vida útil de almacenamiento de las semillas. Esto se aplica tanto a las semillas para siembra como a las semillas que, posiblemente después de la germinación, sean aptas para el consumo o el procesamiento industrial. Para semillas destinadas a la reproducción o al consumo o procesamiento industrial después del inicio del proceso de germinación, es lógicamente de vital importancia que se conserve la capacidad de germinación, o la actividad enzimática.
Es necesario que la desinfección de semillas erradique las enfermedades externas e internas transmitidas por las semillas sin afectar de forma negativa a las características de las semillas tales como la viabilidad, germinación y velocidad de brotación, así como el estado final de las plantas. La desinfección de semillas se puede realizar mediante diversas técnicas que van desde las químicas a las físicas.
Los productos químicos tales como el ácido peroxiacético, ácido clorhídrico o hipoclorito de sodio pueden reducir, por ejemplo, el inóculo de Acidovorax citrulli transmitido por semillas, pero en general no logran erradicar la bacteria de las semillas infectadas (Dutta, B, Avci, U, Hahn, M.G. y Walcott R.R. 2012. Phytopathology 102/5461-468). Actualmente se usan otros medios tales como la inmersión en agua caliente o el uso de aire caliente y húmedo, pero no funcionan correctamente en todas las semillas y pueden llevar a algunos defectos en las semillas.
También se conoce una combinación de medios químicos y físicos tal como la infiltración al vacío de productos químicos. El objetivo de dicha técnica es acercar los productos desinfectantes a los patógenos, ya sea todavía fuera de la semilla o directamente dentro de ella. Véase, por ejemplo, el documento WO 94/15448 donde se aplica infiltración al vacío a semillas de palma de aceite (Flood et al Gitaitis, R.D., y Walcott, R.R. 2008. Annu. Rev. Phytopathol., 45:371-397; Nagy et al). Véase también Docea et al, mayo de 1976, Acta Horticulturae, International Symposium Bucharest, 58/1977, donde se desinfectan semillas de tomate de Corynebacterium michiganense por infiltración al vacío con criptonol.
Sin embargo, hay que indicar que en todos estos estudios, las semillas se han infectado artificialmente, lo que es una diferencia esencial con las semillas infectadas de forma natural. De hecho, la infección artificial se hace en semillas maduras y, por lo tanto, normalmente solo contamina superficialmente la semilla. Así pues, el contacto entre la solución química desinfectante y el patógeno situado fuera de la semilla es relativamente fácil de lograr, desinfectando así aparentemente de manera eficiente la semilla inoculada de forma artificial. Sin embargo, la infección de forma natural de Acidovorax citrulli y otros patógenos de este tipo transmitidos por semillas comienza tan pronto como en la etapa de flor, que es la primera etapa del establecimiento de semillas. En esta etapa, la infección llega a partes muy profundas dentro de la semilla que luego no se podrán alcanzar mediante la desinfección húmeda estándar de semillas (Dutta, B, Avci, U, Hahn, M.G. and Walcott R..R.. 2012. Phytopathology 102/5461-468).
Por lo tanto, aunque estas diversas técnicas de desinfección parecen interesantes, es posible que no sean suficientemente eficaces para producir lotes de semillas de calidad comercial, es decir, lotes de semillas donde el patógeno se ha inactivado. Los lotes de semillas podrían seguir infectados en niveles que los hacen invendibles, o sujetos a advertencias y exención de responsabilidad legal. Es posible que deban destruirse, produciendo pérdidas económicas a las empresas de semillas o a los agricultores.
Por lo tanto, sería de interés desarrollar un nuevo procedimiento para desinfectar semillas y obtener lotes de semillas de valor comercial exentas de patógenos infecciosos.
Objeto de la invención
Los fines de la invención se consiguen mediante un método de desinfección de semillas que comprende:
a) poner las semillas y una solución desinfectante en un reactor de vacío; en donde las semillas se sumergen en la solución desinfectada ya sea antes o después de la etapa b),
b) aplicar una presión de vacío;
c) liberar la presión de vacío;
d) repetir las etapas b-c, al menos una vez;
e) separar la fracción de las semillas que se hunde de la fracción que flota; en donde dicha fracción que se hunde contiene semillas desinfectadas, en donde la presión de vacío aplicada en la etapa b está comprendida entre 400 y 985 mbar.
Preferiblemente, las etapas b-c se repiten hasta que no se observa una nueva fracción que se hunde en la etapa c. En una realización, la fracción que se hunde se recoge después de cada ciclo de las etapas b-c.
En otra realización, no se tarda más de 2 horas en llevar a cabo las etapas a-e, preferiblemente no más de 1 hora y más preferiblemente no más de 30 minutos. Según la invención, la presión de vacío aplicada en la etapa b está comprendida entre 400 y 985 mbar, preferiblemente entre 500 y 980 mbar, lo más preferiblemente entre 400-500 y 975-985 mbar. En otra realización, la pluralidad de ciclos de etapas b-c se lleva a cabo aumentando la presión de vacío en cada ciclo, por ejemplo, la presión de vacío se incrementa en 100 mbar después de cada ciclo de etapas bc. Estos parámetros de presión de vacío serán determinados por el experto en la técnica, por ejemplo la presión de vacío máxima para aplicar podría estar en el intervalo de 975 a 985 mbar y las etapas crecientes en las presiones de vacío pueden ser de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300 mbar y cualquier presión de vacío entre medias. Además, las etapas crecientes pueden ser iguales, por ejemplo, la presión de vacío aumenta en 50 mbar después de cada ciclo de etapas b-c, o pueden no ser regulares, por ejemplo, la presión de vacío aumenta en 50 mbar después de un primer ciclo de etapas b-c, en 60 mbar después de una segunda etapa de b-c, en 70 mbar después de una tercera etapa de b-c, etc.
En una realización preferida, las semillas son de especies de cucurbitáceas, más específicamente seleccionadas del grupo que consiste en especies de sandía, melón, calabacín, calabaza, pepino y calabazas ornamentales, o cultivos de solanáceas, más específicamente seleccionadas del grupo que consiste en especies de tomates, pimientos y berenjenas. En otra realización, la solución desinfectante puede ser un agente químico que destruye cualquier patógeno, por ejemplo hongos, bacterias, virus, viroides, organismos similares a virus, oomicetos, fitoplasmas, protozoos y/o nematodos, por ejemplo una solución que contiene dicloroisocianurato de Na, hipoclorito de sodio o hipoclorito de calcio al menos al 0,1 %, 0,2%, 0,3%; 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 1,5%, 2%, 3%, 4% o 5%. La invención puede aplicarse ventajosamente a semillas que son infectadas de forma natural por patógenos. Por "semillas que son infectadas de forma natural por patógenos", se entiende que las semillas son infectadas por los patógenos durante la formación de las semillas en o sobre la planta. Dichos patógenos que infectan las semillas durante su formación se denominan comúnmente patógenos transmitidos por semillas. Ejemplos de patógenos transmitidos por semillas son: (i) Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola y Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli en judría, (ii) Phoma lingam y Xanthomonas campestris pv. campestris en Brassica, (iii) Alternaría dauci, Alternaria radicina, Alternaria radicina y Xanthomonas hortorum pv. carotae en la zanahoria, (iv) Septoria apiicola en el apio, (v) Acidovorax valerianellae en el canónigo, (vi) Acidovorax spp., Acidovorax avenae subsp. citrulli, virus del mosaico de la calabaza, virus del mosaico verde jaspeado del pepino, virus del mosaico moteado del fruto del pepino y virus de cribado del melón en cucurbitáceas, (vii) virus del mosaico de la lechuga en la lechuga, (viii) virus del mosaico transmitido por semillas del guisante, virus del oscurecimiento precoz del guisante y Pseudomonas syringae pv. pisi en el guisante, (ix) Tobamoviruses y Xanthomonas spp. en el pimiento, (x) Clavibacter spp., Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, virus del mosaico del pepino, Tobamoviruses, Pseudomonas spp. y Xanthomonas spp. en el tomate.
La invención también se refiere a un método para producir semillas esencialmente exentas de patógenos, p. ej. exentas de patógenos transmitidos por semillas, que comprende las etapas de:
a. proporcionar semillas;
b. tratar dichas semillas aplicando el método de desinfección de la presente invención; y
c. recuperar dichas semillas tratadas como semillas esencialmente exentas de patógenos viables.
La descripción se refiere además a las semillas obtenidas u obtenibles por el método de producción anterior. La descripción se refiere además a semillas esencialmente exentas de patógenos viables, p. ej. exentas de patógenos transmitidos por semillas, que contienen la solución desinfectante tal como el dicloroisocianurato de Na, hipoclorito de sodio o hipoclorito de calcio. La invención se puede aplicar ventajosamente a semillas seleccionadas del grupo que consiste en especies de cucurbitáceas y solanáceas, más específicamente, especies de sandía, melón, calabacín, calabaza, pepino, calabazas ornamentales, tomates, pimientos y berenjenas.
En otro aspecto, la descripción se refiere a una solución que comprende dicloroisocianurato de Na para usar como agente desinfectante para tratar semillas. En una realización específica, dicha solución se introduce en las semillas por infiltración al vacío. En otro aspecto, la descripción se refiere a una solución que comprende dicloroisocianurato de Na para usar como agente desinfectante para tratar semillas que han sido infectadas externamente. Estas soluciones contienen, por ejemplo, dicloroisocianurato de Na al menos al 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 1,5%, 2%, 3%, 4% o 5%.
En otro aspecto más, la descripción se refiere también a un dispositivo para llevar a cabo el método de desinfección de la invención, que comprende
i. un reactor que incluye una cámara que se puede sellar para aplicar presión de vacío dentro de la cámara, ii. medios para aplicar presión de vacío en la cámara del reactor,
iii. medios para recoger la fracción de semillas que se hunde,
iv. medios para liberar la presión de vacío,
v. medios para separar la solución desinfectante de la fracción de semillas que se hunde recogida y reintroducir la solución desinfectante recogida en la cámara del reactor,
vi. opcionalmente, medios para introducir las semillas en la solución solo después de aplicar la presión de vacío deseada.
Descripción detallada de la invención
Por consiguiente, la presente invención proporciona un método de dos etapas basado en una primera etapa de infiltración al vacío de la solución desinfectante completado además por una etapa de selección de la fracción que se hunde. Más específicamente, la invención se refiere a un método para desinfectar semillas que comprende: a) poner las semillas y una solución desinfectante en un reactor de vacío; en donde las semillas se sumergen en la solución desinfectada ya sea antes o después de la etapa b),
b) aplicar una presión de vacío;
c) liberar la presión de vacío;
d) repetir las etapas b-c, al menos una vez;
e) separar la fracción de las semillas que se hunde de la fracción que flota; en donde dicha fracción que se hunde contiene semillas desinfectadas, en donde la presión de vacío aplicada en la etapa b está comprendida entre 400 y 985 mbar.
Se puede tratar cualquier tipo de semillas según los métodos de la invención. Por ejemplo, las semillas pueden incluir semillas de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas que pueden ser útiles para fines agronómicos, hortícolas u ornamentales. En particular, grupos importantes de plantas que proporcionan semillas que se pueden tratar con los métodos de la invención son las hortalizas, los cereales y los pastos. Los cereales incluyen, pero no se limitan a, trigo, triticale, cebada, centeno, arroz y avena. Los pastos incluyen césped y pastos forrajeros, tales como el pasto bromo, pasto azul, festuca gigante y pasto bermuda. Otros pastos son los pastos tropicales, tales como la caña de azúcar, maíz, mijo y sorgo. Las hortalizas incluyen plantas solanáceas y cucurbitáceas. Las semillas de solanáceas, tales como patatas, tomates, tabaco, berenjena y semillas de pimiento son semillas adecuadas para tratarlas según los métodos de la invención, al igual que las semillas de Brassicaceae, tales como la coliflor, brócoli, col, col rizada y colinabo. Otras semillas adecuadas incluyen las de zanahorias, perejil, remolacha azucarera, algodón, árboles frutales, plantas de bayas y semillas de uva. Además, los métodos de la invención se pueden usar para semillas de especies de árboles, tales como pino, pícea, abeto, álamo temblón y de diversas maderas duras. También se pueden usar semillas de las familias Gramineae, Leguminosae y Malvaceae. En particular, el método se usa para tratar semillas como se indican en el Anexo al capítulo 5, Reglas Internacionales para Ensayos de Semillas, Asociación Internacional de Ensayos de Semillas, Zúrich, Suiza, 1996.
En una realización, la invención se puede aplicar a semillas de cucurbitáceas, más específicamente seleccionadas del grupo de especies de sandía, melón, calabacín, calabaza, pepino y calabazas ornamentales o solanáceas más específicamente seleccionadas del grupo de especies de tomates, pimientos y berenjenas. Preferiblemente, las semillas que se desinfectan de cucurbitáceas o Solanacea contienen una solución desinfectante suficiente para que la semilla quede esencialmente exenta de cualquier patógeno viable, p. ej., patógeno transmitido por semillas, de modo que la semilla pueda cumplir con las normas de cuarentena.
Preferiblemente, los métodos pueden aplicarse a semillas infectadas de forma natural por patógenos, es decir, semillas infectadas por patógenos transmitidos por semillas. En el caso de las semillas de cucurbitáceas seleccionadas más específicamente del grupo de especies de sandía, melón, calabacín, calabaza, pepino y calabazas ornamentales, la infección bacteriana más importante transmitida por semillas es causada por Acidovorax spp. más específicamente Acidovorax citrulli; la infección viral transmitida por semillas más importante es causada por especies del género Tobamovirus, más específicamente el virus del mosaico verde jaspeado del pepino (CGMMV) o el virus del mosaico moteado del fruto del pepino (CFMMV). Para las semillas de solanáceas más específicamente seleccionadas del grupo de especies de tomates, pimientos y berenjenas, la infección bacteriana transmitida por semillas más importante es causada por Clavibacter spp más específicamente C. michiganensis, más específicamente C. michiganensis subsp. michiganensis, Pseudomonas spp, Xanthomonas spp; las infecciones virales transmitidas por semillas más importantes son causadas por TMV, PepMV. Los viroides también podrían causar infecciones.
En algunas realizaciones, el método según la invención permite la producción de un lote de semillas en el que al menos 90, 95, 96, 97, 98, 99 o el 100% de las semillas están desinfectadas. En una realización preferida particular, el método según la invención permite la producción de un lote de semillas en el que el 100% de las semillas están desinfectadas.
En algunas realizaciones, el método según la invención permite la producción de semillas desinfectadas sin afectar a su calidad de germinación. En algunas realizaciones, las semillas desinfectadas obtenidas tienen una tasa de germinación de al menos 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100%. En una realización preferida particular, las semillas desinfectadas obtenidas tienen una tasa de germinación de 100%. En otras palabras, el método según la invención permite la producción de un lote de semillas en el que germinan al menos 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de las semillas desinfectadas. En una realización preferida particular, el método según la invención permite la producción de un lote de semillas en el que germina 100% de las semillas desinfectadas.
La etapa de infiltración al vacío
La etapa de infiltración al vacío del método de la invención tiene como objetivo infiltrar en las semillas un agente desinfectante contenido en la solución desinfectante. Se lleva a cabo aplicando un vacío para extraer el aire de espacios en el tejido de la semilla, poniendo en contacto las semillas (por inmersión) con una solución desinfectante y liberando el vacío. En una primera realización, las semillas para tratar se sumergen en la solución desinfectante antes de aplicar presión de vacío. Sin estar ligados a ninguna teoría, se cree entonces que los espacios libres en la semilla se llenan con la solución desinfectante.
La presión de vacío inicial aplicada a las semillas sumergidas por la solución desinfectante se puede fijar entre 400­ 500 y 975-985 mbar, por ejemplo entre 550 mbar y 700 mbar, o entre 700 y 820 mbar, todavía por ejemplo entre 576 y 667 mbar o entre 740 y 816 mbar. Preferiblemente, la etapa de vacío se lleva a cabo aplicando primero una presión de vacío comprendida entre 400-700 mbar, preferiblemente 400-600 mbar. A continuación, el vacío se libera inmediatamente o después de un periodo comprendido entre 1 segundo y 5 minutos, preferiblemente después de un periodo de vacío menor de 2 minutos, preferiblemente menor de 1 minuto. Estos parámetros de tiempo y presión de vacío serán determinados fácilmente por el experto dependiendo, entre otras cosas, del tipo de semillas y la cantidad de semillas.
Cuando se introducen en la solución desinfectante, preferiblemente una solución acuosa, parte o todas las semillas pueden flotar inicialmente. Sin estar limitados por ninguna teoría, se cree que, en cada etapa del ciclo de vacío/descarga de vacío, la solución es forzada por diferencias de presión dentro de los espacios en los que se ha extraído el aire de los tejidos de las semillas, lo que puede hacer que las semillas se hundan. Puesto que la solución contiene producto(s) desinfectante(s), la penetración de la solución en los espacios de aire de la semilla despejados por el vacío puede mejorar el contacto entre la solución y la superficie de los patógenos y aumenta la eficacia del tratamiento de desinfección. Este ciclo de etapas de vacío/descarga de vacío se repite típicamente al menos una vez, para aumentar la eficacia del método. Preferiblemente, se repite hasta que no se observa una nueva fracción que se hunde después de la liberación de la presión de vacío. Como se usa en el presente documento, una "fracción que se hunde" se refiere a una fracción de semillas que tiene una densidad que es superior al agua o a la solución acuosa.
Cuando se repiten los ciclos de vacío/descarga de vacío, ventajosamente, la presión de vacío aumenta en cada ciclo, por ejemplo, la presión de vacío aumenta en 100 mbar después de cada ciclo de vacío/descarga de vacío. Estos parámetros de presión de vacío serán determinados por el experto en la técnica, por ejemplo la presión de vacío máxima para aplicar podría estar en el intervalo de 975 a 985 mbar y las etapas crecientes en presiones de vacío pueden ser de 10, 20, 30, 40, 50, 60 , 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 mbar y cualquier presión de vacío intermedia. Además, las etapas crecientes pueden ser iguales, por ejemplo, la presión de vacío aumenta en 50 mbar después de cada ciclo de etapas b-c, o pueden no ser regulares, por ejemplo, la presión de vacío aumenta en 50 mbar después de un primer ciclo de etapas b-c, en 60 mbar después de una segunda etapa de b-c, en 70 mbar después de una tercera etapa de b-c, etc.
Las presiones de vacío específicas y el momento de cada etapa de vacío/descarga de vacío se determinan con el fin de obtener dos fracciones de semillas, una fracción que se hunde y una fracción que flota. El experto en la técnica determinará las condiciones específicas para obtener una cantidad suficiente de semillas que se hunden, preferiblemente en un periodo de tiempo mínimo.
Típicamente, se sumergen equivalentes de aproximadamente 1 kg de semillas en 5-10 litros de solución desinfectante, tal como dicloroisocianurato de Na, por ejemplo, dicloroisocianurato al 0,1 %, hipoclorito de sodio al 0,1 % o hipoclorito de calcio al 0,1 %, y primero se aplica una presión de vacío a una presión comprendida entre 400-700 mbar, preferiblemente 400-600 mbar, luego se libera la presión de vacío después de un periodo de menos de 2 minutos, preferiblemente 1 minuto y se aplica nuevamente presión de vacío, preferiblemente a una presión de vacío creciente, por ejemplo hasta que la presión de vacío alcanza el nivel máximo posible en un espacio sellado que contiene la solución acuosa, en concreto, 975-985 mbar.
Como se usa en el presente documento, la expresión "solución desinfectante" significa cualquier solución que comprende un agente desinfectante, por ejemplo, un agente químico, que destruye organismos perjudiciales, es decir, cualquier patógeno. La solución es preferiblemente una solución acuosa. Se puede usar cualquier fungicida y germicida conocido, tales como antibióticos, antibacterianos, antivirales, antifúngicos, antiprotozoarios y antiparasitarios y otros agentes desinfectantes para materia vegetal, preferiblemente semillas, con los métodos de la invención. Los ejemplos de agentes desinfectantes incluyen, sin limitación bromo, cloro, clorito, yodo, peróxido de hidrógeno, permanganato de potasio, ácido clorhídrico, ácido peracético, ácido peroxiacético, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, formaldehído, glutaraldehído, hidróxido de sodio, fenol, peroxomonosulfato, trifosfato de sodio, amonio cuaternario, plata y cobre (iónico o sales), yodo, bromo, triclosán, etc. En una realización preferida, la solución desinfectante contiene un agente desinfectante basado en cloro, tal como dicloroisocianurato de Na, hipoclorito de sodio o hipoclorito de calcio. En una realización preferida, la solución desinfectante contiene dicloroisocianurato de Na como agente desinfectante, que ya se conoce para usar para mantener flores cortadas en jarrones. En otra realización preferida, la solución desinfectante contiene hipoclorito de sodio o hipoclorito de calcio como agente desinfectante. Preferiblemente, la solución desinfectante es una solución acuosa de dicloroisocianurato de Na, hipoclorito de sodio o hipoclorito de calcio al menos al 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 1,5%, 2%, 3%, 4% o 5%. Preferiblemente, la solución desinfectante es una solución acuosa con una concentración de dicloroisocianurato de Na, hipoclorito de sodio o hipoclorito de calcio comprendida entre 0,1% y 2%, preferiblemente entre 0,25% y 2,5%, todavía preferiblemente entre 0,5% y 2%.
Etapa de infiltración al vacío alternativa
En una segunda realización de la etapa de infiltración al vacío del método de la invención, las semillas y la solución desinfectante se ponen en el reactor de vacío pero las semillas no se ponen en contacto con la solución desinfectante antes de aplicar la presión del vacío. Por ejemplo, las semillas se pueden mantener en una cesta encima de la solución desinfectante en la cámara del reactor antes de la aplicación de presión de vacío. Luego se baja la cesta para sumergir las semillas en la solución desinfectante.
El resto del método se lleva a cabo como se describe para la primera realización.
Típicamente, se pueden mantener equivalentes de aproximadamente 1 kg de semillas en una cesta sobre la solución desinfectante, la presión de vacío se aplica a una presión comprendida entre 400-700 mbar, preferiblemente 400-600 mbar, y luego las semillas se sumergen en 5-10 litros de solución desinfectante, tal como dicloroisocianurato de Na, hipoclorito de sodio o hipoclorito de calcio, por ejemplo, dicloroisocianurato de Na al 0,1%, hipoclorito de sodio al 0,1% o hipoclorito de calcio al 0,1%, luego se libera la presión de vacío después de un periodo de menos de 2 minutos, preferiblemente menos de 1 minuto, y se aplica de nuevo presión de vacío, preferiblemente a una presión de vacío creciente.
La etapa de selección
Los autores de la invención tienen el mérito de haberse dado cuenta de que el comportamiento de hundimiento de las semillas tratadas en realidad refleja el grado de penetración de la solución desinfectante en los materiales de las semillas y proporciona medios convenientes para visualizar la eficiencia del procedimiento de desinfección y separar las semillas tratadas de las semillas no tratadas.
Por consiguiente, la segunda etapa de este procedimiento tiene como objetivo separar la fracción de semillas que permanece flotando de la fracción de semillas que se hunde, ya sea descartando una fracción de semillas que permanece flotando después de la etapa de infiltración al vacío y/o recogiendo la fracción que se hunde. De hecho, se supone que las semillas que flotan no han absorbido una cantidad suficiente de la solución desinfectante, por lo tanto todavía presentan riesgos sanitarios de los patógenos que queden. Además, recoger la fracción que se hunde o descartar la fracción que flota sorprendentemente parece que beneficia a la calidad general de germinación del lote de semillas, permitiendo así la producción de un lote de semillas en el que al menos 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de las semillas están desinfectadas, y más preferiblemente permitiendo la producción de un lote de semillas en el que 100% de las semillas están desinfectadas. En algunas realizaciones, la fracción que se hunde contiene al menos 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de semillas desinfectadas, y más preferiblemente 100% de semillas desinfectadas. En algunas realizaciones, las semillas de la fracción que se hunde tienen una tasa de germinación de al menos 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %. En una realización preferida particular, las semillas de la fracción que se hunde tienen una tasa de germinación de 100%.
La fracción que se hunde se puede recoger después de cada ciclo de vacío/descarga de vacío o al final del procedimiento. Para algunas semillas, la fracción que se hunde puede ser la única fracción, es decir, no hay fracción de semillas que flotan.
En la segunda etapa de la presente invención, la separación de la fracción que flota es preferiblemente rápida, Típicamente en unos pocos minutos, por ejemplo entre 1 segundo y 5 minutos, por ejemplo menos de 2 minutos, preferiblemente menos de 1 minuto. Preferiblemente, el método de la presente invención no comprende ninguna etapa de remojo, tales como las etapas de remojo descritas en el documento WO94/15448, especialmente, puede no comprender ninguna etapa de remojo de más de 12 horas.
Ventajosamente, el método completo desde la inmersión de las semillas hasta la recolección de las semillas tarda preferiblemente no más de 2 horas, preferiblemente incluso no más de 1 hora, y más preferiblemente no más de 30 minutos.
Después de la recolección, las semillas se pueden lavar y secar. Las semillas se pueden tratar además con tratamientos alternativos para descontaminación o protección de semillas. Por ejemplo, se pueden aplicar otros tratamientos de semillas convencionales, mediante recubrimiento, peletización o recubrimiento con película, especialmente con el fin de evitar el daño a las semillas o plántulas, incluyendo, sin limitación, tratamientos con fungicidas o insecticidas.
Métodos de producción de semillas esencialmente exentas de patógenos viables
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para producir semillas esencialmente exentas de patógenos viables, p. ej., exentas de patógenos viables transmitidos por semillas, que comprende las etapas de: a) proporcionar semillas;
b) tratar dichas semillas aplicando el método de desinfección de la invención, y
c) recuperar dichas semillas tratadas como semillas esencialmente exentas de patógenos viables.
Como se usa en el presente documento, una semilla “esencialmente exenta de patógenos” o “esencialmente exenta de patógenos viables” es una semilla que, después de la germinación, no desarrollará ninguna enfermedad infecciosa en un ambiente estéril. En una realización, una semilla "esencialmente exenta de patógenos" o "esencialmente exenta de patógenos viables", ambos usados indistintamente, es una semilla que no contiene ninguno de los siguientes elementos infecciosos en forma viable o en forma infectiva: hongos, bacterias, virus, viroides, organismos similares a virus, oomicetos, fitoplasmas, protozoos y/o nematodos. Dicho método típicamente comprende las etapas de (i) proporcionar semillas, (ii) tratar dichas semillas aplicando el método de desinfección como se describe anteriormente y (iii) recuperar dichas semillas tratadas como semillas esencialmente exentas de patógenos. En algunas realizaciones, las semillas producidas por dicho método están "esencialmente exentas de patógenos viables transmitidos por semillas" o "esencialmente exentas de patógenos transmitidos por semillas". Las semillas obtenidas u obtenibles por este método de producción se caracterizan por que (i) están esencialmente exentas de patógenos viables y (ii) contienen la solución desinfectante, tal como dicloroisocianurato de Na, hipoclorito de sodio o hipoclorito de calcio.
Por lo tanto, la invención proporciona semillas esencialmente exentas de patógenos viables y que contienen la solución desinfectante, tal como dicloroisocianurato de Na, hipoclorito de sodio o hipoclorito de calcio. Preferiblemente, dichas semillas se seleccionan del grupo que consiste en especies de cucurbitáceas y solanáceas, más específicamente especies de sandía, melón, calabacín, calabaza, pepino, calabaza ornamental, tomates, pimientos y berenjenas.
La descripción también se refiere al uso de dicloroisocianurato de Na como agente desinfectante para tratar semillas. En una realización, dicho dicloroisocianurato de Na se ha introducido en las semillas por infiltración al vacío, por ejemplo, en una concentración de al menos 0,1%, 0,4%, 0,75%, 1%, 1,5%, 2%, 3%, 4% o 5%.
También es mérito de los autores de la invención haberse dado cuenta de que el dicloroisocianurato de Na, que hasta ahora era conocido para usar para mantener flores cortadas en jarrones, se puede usar para desinfectar semillas. Además, y al contrario que todas las demás soluciones desinfectantes conocidas en la actualidad, el dicloroisocianurato de Na conserva y, en algunos casos, incluso mejora la calidad de germinación de las semillas. Dispositivo para llevar a cabo los métodos de la invención
La descripción también se refiere a dispositivos para llevar a cabo los métodos de la invención.
En una realización, un dispositivo para llevar a cabo el método de desinfección de la invención comprende i. un reactor que comprende una cámara que se puede sellar para aplicar presión de vacío en el interior, ii. medios para recoger la fracción de semillas que se hunde,
iii. medios para aplicar presión de vacío dentro de la cámara del reactor,
iv. medios para liberar la presión,
v. opcionalmente, medios para separar la solución desinfectante de la fracción de semillas que se hunde recogida, y reintroducir la solución desinfectante recogida en la cámara del reactor,
vi. opcionalmente, medios para introducir las semillas en la solución después de haber aplicado la presión de vacío deseada.
La figura 1 ilustra un ejemplo de un reactor según la descripción.
El reactor (1) del dispositivo puede ser cualquier reactor con una cámara para contener las semillas sumergidas en la solución desinfectante (2) y resistente al vacío (también denominada cámara de vacío). Típicamente, puede estar hecha de plexiglás u otro material resistente a la presión de vacío, y preferiblemente transparente para visualizar el comportamiento de las semillas durante el procedimiento (hundimiento o flotación). Por ejemplo, la cámara del reactor puede contener entre 10-50 litros de volumen de solución desinfectante con semillas, en un reactor de plexiglás de 70 litros.
El reactor puede contener una tapa (3), preferiblemente en su parte superior, que se puede abrir para introducir las semillas y/o solución desinfectante y se puede cerrar herméticamente para permitir aplicar presión de vacío dentro de la cámara del reactor.
El dispositivo puede contener además una tubería de vacío (4), por ejemplo conectada a la tapa, en el lado superior del reactor, y una bomba de vacío (5) para aplicar presión de vacío dentro de la cámara del reactor. Ventajosamente, el reactor contiene además un manómetro (7) y/o medios para controlar la presión de vacío dentro de la cámara del reactor y/o medios para liberar el vacío (6). Alternativamente, la fracción que flota se puede recoger de la parte superior de la solución mediante el uso de un colador o rotando la cámara y descartando las semillas que flotan a otro recipiente desde la parte superior del recipiente.
El reactor está preferiblemente elevado, por ejemplo con soportes (11) y comprende una válvula de salida, por ejemplo, en su parte inferior, para extraer la fracción de semillas que se hunde (8) y recogerla en el colector (9), estando colocado el colector por ejemplo debajo de la cámara del reactor. El colector puede incluir un recipiente con paredes perforadas (o semipermeables) de modo que las semillas están contenidas en el recipiente y la solución desinfectante recogida pueda moverse fuera del recipiente. Ventajosamente, el dispositivo incluye además medios (por ejemplo con una tubería y bomba) para extraer la solución desinfectante recogida del colector y reintroducirla en la cámara del reactor (10).
En realizaciones específicas, la tubería de vacío (4) también puede contener una trampa.
Ahora se ilustrarán realizaciones específicas de la invención en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Desinfección de semillas de sandía infectadas de forma natural por la mancha bacteriana del fruto: La mancha bacteriana del fruto (BFB, por sus siglas en inglés Bacterial Fruit Blotch) es una enfermedad causada por la bacteria Acidovorax citrulli que puede ser devastadora para los agricultores, ya que las pérdidas de fruta pueden llegar a más de 90% de un campo de producción. Según Walcott, R. R. 2005. The Plant Health Instructor. DOI: 10.1094/PHI-I-2005-1025-02-http://www.apsnet.org/edcenter/intropp/lessons/prokaryotes/Pages/BacterialBlotch.aspx. La mancha bacteriana del fruto (BFB,) afecta el follaje en todas las etapas de crecimiento y a la fruta de una amplia variedad de hospedantes cucurbitáceos. Síntomas tales como lesiones de manchas acuosas en la parte inferior de los cotiledones se pueden observar inicialmente en plántulas de cucurbitáceas, entre cinco y ocho días después de la siembra. Las lesiones asociadas con la BFB tienen un aspecto grasiento y persisten en condiciones secas, es decir, observables después del mediodía. Las lesiones de manchas acuosas comienzan como puntos discretos pero luego se unen y se extienden a lo largo de las venas de los cotiledones. Con el tiempo se secan para formar lesiones alargadas, de marrón oscuro a rojizo, que se desarrollan sobre y a lo largo de las venas de los cotiledones. Se producen síntomas similares en plántulas de melón y otras cucurbitáceas. En el follaje maduro de la sandía, se desarrollan lesiones distintivas de marrón oscuro a rojizo a lo largo de los nervios de las hojas. La pérdida económica es resultado de la fase de la enfermedad de pudrición de la fruta. De hecho, los síntomas de la BFB en las frutas de sandía aparecen justo antes de la madurez de la cosecha como manchas pequeñas (< 1 milímetro de diámetro), de forma irregular, de color verde oliva en las superficies superiores de la fruta. Estas lesiones, aunque inicialmente pequeñas, pueden extenderse y cubrir toda la superficie superior de la fruta. En las primeras etapas de la infección, estas lesiones son firmes y rara vez penetran en la pulpa de la fruta. Se pueden desarrollar grietas marrones en las lesiones de la corteza. En etapas avanzadas, las frutas colapsan en una pudrición acuosa debido a la invasión por organismos colonizadores secundarios.
El manejo de la infestación de BFB en producción es extremadamente difícil. Preferiblemente, las semillas solo se producen en áreas sin ningún registro de presencia de BPB, con rotaciones de campo. Según Walcott, "ningún tratamiento de semillas físico o químico es 100% efectivo para erradicar A. avenae subsp. Citrulli". Aunque los tratamientos de semillas que incluyen termoterapia, NaOCI, fermentación, HCI y ácido peroxiacético reducen significativamente la transmisión a las plántulas de BFB, pueden afectar negativamente a la fisiología de la semilla. Dos factores que influyen en la eficacia del tratamiento de las semillas son: 1) la incapacidad de los tratamientos de semillas para penetrar la cubierta de la semilla y 2) la ubicación de las bacterias sobre/dentro de la semilla. Debido a que el riesgo de desarrollo de BFB en las cámaras de trasplante es alto para semillas con bajos niveles de infestación, el tratamiento de semillas por sí solo no puede controlar la BFB".
Por lo tanto, hasta ahora, se cree que el manejo químico de la enfermedad y los controles sanitarios de las semillas tienen un efecto limitado: si bien es posible detectar la pérdida de semillas muy infestadas, los lotes con una infestación muy baja son difíciles de identificar.
Generalmente, las empresas de semillas están analizando entre 30.000 y 50.000 semillas por lote de semillas (Gitaitis, R.D., y Walcott, R.R. 2008. Annu. Rev. Phytopathol., 45:371-397) lo que representa una carga pesada tanto en términos de tiempo como de dinero, ya que un lote de semillas se puede aceptar cuando ninguna de las 30.000 o 50.000 semillas ha dado positivo. Incluso con una muestra tan grande, las empresas de semillas y los agricultores todavía se enfrentan a una amenaza, ya que los lotes de semillas pueden estar infectados con un nivel tan bajo que es indetectable en una muestra de 50.000 semillas.
En el presente caso, se obtuvieron 0,2 kg de semillas de sandía de un lote de semillas comerciales, infectadas de forma natural por BFB en el campo de producción. Después de un procedimiento estándar de desinfección con dicloroisocianurato de Na al 1,0 %, seguían infectadas. Las semillas secas con un contenido de humedad estándar de 5,5-7,5% se ponen en un recipiente de vidrio de 10 litros junto con 1,0 litro de solución desinfectante que comprende dicloroisocianurato de Na al 0,2 %. Se aplica un vacío y se aumenta gradualmente hasta aproximadamente 500 mbar y después se libera. Este procedimiento de vacío/descarga de vacío se repite, cada vez con un aumento de la presión de vacío de aproximadamente 100 mbar, hasta la presión de vacío máxima alcanzable de aproximadamente 975-985 mbar. Este procedimiento conduce a la formación de dos fracciones de semillas en el recipiente: una fracción que se hunde y una fracción que flota. La fracción de semillas que flota se recoge y se aplica de nuevo el procedimiento de vacío en esta. Los ciclos de vacío continúan hasta que las semillas que flotan ya no se hunden. Las semillas que flotan entonces se retiran y descartan. Este procedimiento tarda 20-30 minutos.
Las semillas que se hunden luego se lavan con agua corriente durante 10 minutos y se secan. Estas semillas se han desinfectado de la BFB. Además, son fácilmente identificables porque el interior de la semilla todavía contiene restos del producto desinfectante.
Se analizaron 4200 semillas y se encontró que eran negativas para BFB mediante el ensayo de caja de transpiración (sweat box) (véase la referencia más adelante).
Ejemplo 2: Desinfección de semillas de melón infectadas de forma natural por la mancha bacteriana del fruto: Se desinfectaron 49 kilogramos de semillas de melón infectadas de forma natural por BFB, dos veces mediante un protocolo de desinfección estándar (Dicloroisocianurato de Na, concentración al 1% y 2%; duración: 10 min; enjuague 10 min). Después se analizó en la semilla desinfectada la BFB y se encontró que todavía estaba muy infestada. Se pusieron lotes de 4,5 kilogramos de este lote de semillas en un reactor de 70 litros (como se describe en la figura 1) junto con 20 litros de solución desinfectante que contenía dicloroisocianurato de Na al 0,5%.
Se aplica un vacío y se aumenta gradualmente hasta aproximadamente 500 mbar y luego se libera. Este procedimiento de vacío/descarga de vacío se repite, cada vez con un aumento de la presión de vacío de aproximadamente 100 mbar, hasta la presión de vacío máxima alcanzable de aproximadamente 975-985 mbar. Este procedimiento conduce a la formación de dos fracciones de semillas en el recipiente: una fracción que se hunde y una fracción que flota. Los ciclos de vacío continúan hasta que las semillas que flotan ya no se hunden. Luego, las semillas que flotan se retiran y descartan. Este procedimiento tarda 20-30 minutos.
Las semillas hundidas después se lavan con agua corriente durante 10 minutos y se secan. Estos son lotes de semillas de valor comercial que se han desinfectado de la BFB. Además, son fácilmente identificables porque el interior de la semilla todavía contiene restos del producto desinfectante.
De los 49 kg, la parte desinfectada representa 48 kg de semillas. Con el fin de probar el procedimiento de desinfección, se realizó un control sanitario en 40.000 semillas como sigue:
Se analizaron 10.000 semillas por el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de acuerdo con el Sistema Nacional de Sanidad de Semillas del USDA Cb1.2 Seminis Inc. Método PCR-Lavado. El protocolo estándar se puede obtener del Sistema Nacional de Sanidad de Semillas, un programa autorizado por USDA-APHIS y administrado por el Centro de Ciencias de Semillas de la Universidad Estatal de lowa para acreditar a entidades tanto públicas como privadas para realizar ciertas actividades necesarias para respaldar la emisión de certificados fitosanitarios federales para el movimiento internacional de semillas. Véase la página 56 de la edición de mayo de 2014 del "Vegetable Crop Method - Reference Manual B"
Sistema Nacional de Sanidad de Semillas disponible en http://www.seedhealth.org/files/pdf/Vegetable_Crops.pdf Se analizaron 20.000 semillas mediante un ensayo de campo de crecimiento de plántulas de acuerdo con el método de campo de crecimiento de plántulas del Sistema Nacional de Sanidad de Semillas de USDA Cb1.1, que es conocido y puede obtenerse del Sistema Nacional de Sanidad de Semillas.
Se analizaron 10.000 semillas mediante un ensayo de caja de transpiración que es similar al ensayo de campo de crecimiento anterior pero en el que las semillas se siembran en recipientes cerrados en condiciones de cámara de crecimiento óptimas para que se desarrolle la enfermedad. Luego, las plántulas se analizan de manera similar al método de campo de crecimiento.
No se encontró ninguna de las semillas infectada mientras que, por el contrario, la fracción que flota representa aproximadamente 1 kg y es positiva para BFB (ensayo de caja de transpiración en 10.000 semillas).
La germinación se contó a los 4 y 7 días con resultados de 99%/99% para la fracción pesada y 96%/92% para la fracción que flota (Ensayo de germinación según el Anexo del capítulo 5, Reglas Internacionales para Ensayos de Semillas, Asociación Internacional de Ensayos de Semillas, Zúrich, Suiza, 1996).
Ejemplo 3: Desinfección de semillas de pepino infectadas de forma natural por el virus del mosaico verde jaspeado del pepino (CGMMV):
En este caso, las semillas de pepino se han obtenido de un lote de semillas comerciales, infectadas de forma natural por CGMMV en el campo de producción.
Las semillas se desinfectaron por el método estándar y por el método de infiltración al vacío. En este caso, se aplica vacío a una presión máxima de 975-985 mbar desde el principio. Este procedimiento conduce a la formación de dos fracciones de semillas en el recipiente: una fracción que se hunde y una fracción que flota. Los ciclos de vacío continúan hasta que las semillas que flotan ya no se hunden. Después, las semillas que flotan se retiran y descartan. Este procedimiento tarda 15-20 minutos.
En este caso se utilizaron dos productos químicos. Fosfato trisódico al 10% mediante desinfección estándar (A) e infiltración al vacío (B), dicloroisocianurato de Na al 0,4% mediante desinfección estándar (C) e infiltración al vacío (D) Véase la tabla I para ver los resultados del ensayo ELISA de CGMMV y los resultados de germinación.
También se ensayó el efecto de diferentes concentraciones de dicloroisocianurato de Na aplicado por infiltración al vacío en CGMMV y la germinación (tabla II), el tratamiento E es un control sin tratar; el tratamiento F es la infiltración al vacío de dicloroisocianurato de Na al 0,75%; el tratamiento G es la infiltración al vacío de dicloroisocianurato de Na al 1,5% y el tratamiento H es la infiltración al vacío de dicloroisocianurato de Na al 2,0%.
T l I: Inf i n r MMV n liz r l n ELI A
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Tabla II: Infección por CGMMV analizada por el ensayo ELISA
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El CGMMV se analizó mediante ensayo ELISA según el método 7-026 de las normas internacionales para el análisis de semillas, anexo al capítulo 7: Métodos de ensayos de sanidad de semillas; Asociación Internacional de Ensayos de Semillas, Zúrich, Suiza, 2010.
El ensayo de germinación se llevó a cabo según el anexo al capítulo 5, Reglas Internacionales para Ensayos de Semillas, Asociación Internacional de Ensayos de Semillas, Zúrich, Suiza, 1996.
Ejemplo 4: Desinfección de semillas de tomate infectadas de forma natural por el virus del mosaico del tabaco (ToMV):
Las semillas de tomate se han obtenido de un lote de semillas comerciales, infectadas de forma natural por ToMV en el campo de producción. Los lotes de semillas se desinfectaron previamente 3 veces por un método estándar, sin éxito (control).
En este caso se desinfectaron 30 gramos de semillas secas por el método de infiltración al vacío usando 4 litros de Virkon al 2% (peroxomonosulfato de potasio al 50%, ácido sulfámico al 5% y alquilencenosulfonato de sodio al 15%). Virkon es una marca registrada de Antec International Limited, una subsidiaria de DuPont, EE. UU.).
El vacío se aplicó mientras las semillas se encontraban en una cesta perforada encima de la solución desinfectante en una cámara cerrada. Se aplicó una presión de vacío a la presión de vacío máxima alcanzable de aproximadamente 975-985 mbar, seguido de inmersión de las semillas en la solución y liberación del vacío. Los ciclos de vacío/descarga de vacío se repitieron 4 veces y al final todas las semillas se hundieron. Las semillas se recogieron, se enjuagaron durante 5 minutos y se secaron. Resultados: en todos los lotes de semillas de tomate, el nivel de ToMV se redujo a 0% del nivel de control (véase la tabla III). El nivel de germinación aumentó en 2% en un lote de semillas y disminuyó en 5% en el otro lote de semillas.
Tabla III
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El ToMV se ensayó según las reglas de ISHI (Iniciativa Internacional de Sanidad de Semillas, véase el anexo al Capítulo 7: Métodos de ensayos de sanidad de semillas 7-028: “Detection of infectious tobamoviruses on Lycopersicon esculentum (tomato) by the local lesion assay (indexing) on Nicotiana tabacum plants”. pág. 1-10, publicado por la Asociación Internacional de Ensayos de Semillas (ISTA) Zürichstr. 50, CH-8303 Bassersdorf, Suiza.
1 de enero de 2013).
El ensayo de germinación se llevó a cabo según las reglas de AOSA de Ensayo de semillas (Volumen 1 “Principles and Procedures, Tabla 6A. Methods of testing laboratory germination”. pág. 6-55, Solanumn lycopersicum var. lycopersicum (tomate), publicado por la Asociación de analistas oficiales de semillas (AOSA) 1601 52nd Avenue, Suite 1, Moline, IL 61265 EE. UU., 1 de octubre de 2012).
Ejemplo 5: Desinfección estándar con dicloroisocianurato de Na (lavado externo):
Especie: melón o sandía
El procedimiento: se añaden 10 kg de semillas a 45 litros de dicloroisocianurato de Na al 1% o 2%. Las semillas se mezclan en la solución durante 30 minutos y luego se lavan con agua corriente durante 10 minutos y luego se secan hasta el contenido de agua original.
Ejemplo 6: Desinfección de semillas de melón infectadas de forma natural por la mancha bacteriana del fruto mediante presión de vacío reducida:
Semillas de melón infectadas de forma natural por BFB se desinfectaron dos veces mediante el protocolo de desinfección estándar como se describe en el ejemplo 5 y se encontró que todavía estaban infectadas por BFB. Se pusieron tres lotes de 1 kilogramo de este lote de semillas en un recipiente de vidrio de 10 litros junto con 3,0 litros de solución desinfectante que contenía dicloroisocianurato de Na al 1,0%. Se aplicaron treinta ciclos de vacío/descarga de vacío (cada ciclo con una duración de 1 a 1,5 minutos) con tres niveles diferentes: (i) nivel A: vacío total hasta 975-985, (ii) nivel B: nivel medio de 740-816 mbar, y (iii) nivel C: nivel bajo de 576-667 mbar. Después de 40 minutos (es decir, después de lograr los 30 ciclos de vacío/descarga de vacío) se descartaron las fracciones que flotaban y se recogieron las fracciones que se hundían, se lavaron durante 40 minutos y se secaron. Se analizaron cinco mil semillas de cada nivel de tratamiento (A, B, C) y se encontró que eran negativas para BFB por el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) según el método de PCR mejorado Cb1.4 de Monsanto del Sistema Nacional de Sanidad de Semillas del USDA. El protocolo estándar se puede obtener del Sistema Nacional de Sanidad de Semillas, un programa autorizado por USDA-APHIS y administrado por el Centro de Ciencias de Semillas de la Universidad Estatal de Iowa para acreditar a entidades tanto públicas como privadas para realizar ciertas actividades necesarias para respaldar la emisión de certificados fitosanitarios federales para el movimiento internacional de semillas. Véase la página 69 de la edición de mayo de 2014 del Sistema Nacional de Sanidad de Semillas “Vegetable Crop Method - Reference Manual B" disponible en http://www.seedhealth.org/files/pdf/Vegetable_Crops.pdf.
Ejemplo 7: Desinfección de semillas de sandía infectadas de forma natural por el virus del mosaico verde jaspeado del pepino (CGMMV):
Se han obtenido 0,150 kg de semillas de sandía de un lote de semillas comerciales infectadas de forma natural por el virus del mosaico verde jaspeado del pepino (CGMMV) en el campo de producción. Esta muestra se puso en un recipiente de vidrio de 1 litro junto con 0,5 litros de solución desinfectante que comprendía dicloroisocianurato de Na al 0,2%. Se aplicó vacío y se aumentó gradualmente hasta aproximadamente 700 mbar y luego se liberó. Este procedimiento de vacío/descarga de vacío se repite, cada vez con un aumento de la presión de vacío de aproximadamente 50 mbar, hasta la presión de vacío máxima de aproximadamente 985 mbar. Este procedimiento continuó durante 40 minutos hasta que se recogió la fracción que se hunde. El CGMMV se analizó en 2000 semillas y se encontró que era negativo por el ensayo ELISA según el método 7-026 de las Normas internacionales para el ensayo de semillas, anexo al capítulo 7 (Métodos de ensayo de sanidad de semillas; Asociación Internacional de Ensayos de Semillas, Zúrich, Suiza, 2010).
Ejemplo 8: Desinfección de semillas de tomate infectadas de forma natural por CMM (Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis usando tratamiento con Ca(CIO)2:
Las semillas de tomate se han obtenido de lotes de semillas comerciales infectados de forma natural por CMM en el campo de producción. El tratamiento al vacío se hizo por el método de infiltración al vacío (VI) usando 4 litros de hipoclorito de calcio al 1%, como se describe a continuación. El vacío se aplicó mientras las semillas se encontraban en una cesta perforada encima de la solución desinfectante en una cámara cerrada. Se aplicó una presión de vacío a la presión de vacío máxima alcanzable de aproximadamente 975-985 mbar, seguido de inmersión de las semillas en la solución y liberación del vacío. Los ciclos de vacío/descarga de vacío se repitieron 4 veces y al final todas las semillas se hundieron. Las semillas se recogieron, se enjuagaron durante 5 minutos y se secaron. El tratamiento de remojo se hizo en la misma solución durante una hora después del tratamiento VI o sin tratamiento VI.
Los ensayos de germinación se han hecho según la Asociación de Analistas Oficiales de Semillas (AOSA) (http://www.aosaseed.com/).
Los resultados de la infección por Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis se obtuvieron utilizando el "método para la detección de Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis en semillas de tomate" según el Manual de la Federación Internacional de Semillas (ISF) de Métodos de Sanidad de Semillas, que se puede encontrar en el sitio de Internet: http://www.worldseed.org/isf/ishi_vegetable.html.
Todos los resultados se presentan en la Tabla IV a continuación.
Tabla IV
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VI: infiltración al vacío, EN: energía = recuentos de germinación temprana tomados el día 5 después de la siembra en toallas enrolladas), OG: germinación óptima = germinación contada el día 14 después de la siembra en toallas enrolladas, UT: trasplantes utilizables = plantados en bandejas en un invernadero. Recuentos de plántulas consideradas utilizables para un productor comercial, UNIF: Trasplantes uniformes (UNIF) = Plantadas en bandejas en un invernadero. Recuentos de plántulas que se considera que son de tamaño uniforme.
Ejemplo 9: Desinfección de semillas de pepino infectadas de forma natural por el virus del mosaico verde jaspeado del pepino (CGMMV):
En este caso, se trató un lote comercial de semillas de pepino (2 kg) infectado de forma natural por CGMMV. Las semillas infectadas se pusieron en un reactor que contenía 20 litros de dicloroisocianurato de Na al 1,33%. Los ciclos de vacío/descarga de vacío (es decir, infiltración al vacío) se aplicaron gradualmente empezando en 500 mbar y se aumentaron en 50 mbar cada ciclo hasta el máximo de 985 mbar. Después se continuaron lo ciclos de vacío/descarga de vacío a una presión de vacío máxima de 985 mbar para un total de 30 ciclos. Este procedimiento conduce a la formación de dos fracciones de semillas en el recipiente: una fracción que se hunde y una fracción que flota. Ambas fracciones se recogieron por separado. Este procedimiento tarda 45 minutos. El CGMMV se analizó por el ensayo ELISA según el método 7-026 de las Normas internacionales para ensayos de semillas, anexo al capítulo 7: Métodos de ensayos de sanidad de semillas; Asociación Internacional de Ensayos de Semillas, Zúrich, Suiza, 2010 .
El ensayo de germinación se llevó a cabo en placas de Petri (TOP) en una incubadora a 24 °C y se contó la protrusión de raíces a los 4 días después de la siembra (TOP en 4 d).
Los resultados se presentan en la Tabla V a continuación.
Tabla V
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Ejemplo 10: Desinfección de semillas de pepino infectadas de forma natural por el virus del mosaico verde jaspeado del pepino (CGMMV):
Muestras de dos lotes comerciales de semillas de pepino infectadas de forma natural por CGMMV en el campo de producción se trataron por desinfección estándar o mediante métodos de infiltración al vacío. Todos los tratamientos se hicieron en 1500 semillas en 300 ml de solución durante 40 minutos, seguidos de 40 minutos de lavado con agua corriente. Para la desinfección estándar se usó una solución de dicloroisocianurato de Na al 2,5% y para la infiltración al vacío se usó una solución que contenía dicloroisocianurato de Na al 1,5%. Los ciclos de vacío/descarga de vacío se aplicaron gradualmente empezando en 500 mbar y se aumentaron en 100 mbar cada ciclo hasta el máximo de 985 mbar. Después se continuaron los ciclos de vacío/descarga de vacío a una presión de vacío máxima de 985 mbar durante un total de 30 ciclos. Al final del tratamiento, las semillas que flotaban se descartaron y la fracción pesada se recogió, lavó y secó para el análisis.
El CGMMV se analizó por ensayo ELISA según el método 7-026 de las Normas internacionales para ensayos de semillas, anexo al capítulo 7: Métodos de ensayos de sanidad de semillas; Asociación Internacional de Ensayos de Semillas, Zúrich, Suiza, 2010. El ensayo de germinación se llevó a cabo en placas de Petri (TOP) en una incubadora a 24 °C y se contó la protrusión de raíces a los 4 días después de la siembra (TOP en 4 d). Los resultados se presentan en la tabla VI.
Tabla VI
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Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un método para desinfectar semillas, que comprende:
a) poner las semillas y una solución desinfectante en un reactor de vacío (1); en donde las semillas se sumergen en la solución desinfectada ya sea antes o después de la etapa b),
b) aplicar presión de vacío;
c) liberar la presión de vacío;
d) repetir las etapas b-c al menos una vez;
caracterizado por que el método comprende además una etapa de
e) separar la fracción de las semillas que se hunde de la fracción que flota; en donde dicha fracción que se hunde contiene semillas desinfectadas,
y en donde la presión de vacío aplicada en la etapa b está comprendida entre 400 y 985 mbar.
2. El método según la reivindicación 1, en donde dichas semillas están infectadas por patógenos transmitidos por semillas.
3. El método según la reivindicación 1 o 2, en donde la fracción que se hunde se recoge después de cada ciclo de etapas b-c.
4. El método según la reivindicación 1, 2 o 3, en donde en llevar a cabo las etapas a-e no se tarda más de 2 horas, preferiblemente no más de 1 hora y más preferiblemente no más de 30 minutos.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde se lleva a cabo una pluralidad de ciclos de etapas b-c aumentando la presión de vacío en cada ciclo, por ejemplo, la presión de vacío se aumenta en 100 mbar después de cada ciclo de etapas b-c.
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dichas semillas son de
(i) especies de cucurbitáceas, más específicamente seleccionadas del grupo que consiste en especies de sandía, melón, calabacín, calabaza, pepino y calabazas ornamentales, o
(ii) especies de solanáceas, más específicamente seleccionadas del grupo que consiste en especies de tomates, pimientos y berenjenas.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la solución desinfectante es una solución que contiene dicloroisocianurato de Na al menos al 0,1%.
8. Un método para producir semillas esencialmente exentas de patógenos viables, que comprende las etapas de: a) proporcionar semillas;
b) tratar dichas semillas aplicando el método de desinfección de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7; y c) recuperar dichas semillas tratadas como semillas esencialmente exentas de patógenos viables.
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