JPH02150290A - グリチルリチンの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ グリチルリチンは漢方でいう甘草の主成分であり、汁り
は医薬品や甘味料として我が国で広く用いられる。本発
明はクリチルリチンの生産方法に関するものである。

［従来の技術］ 現在、実用的に用いられているグリチルリチンの生産方
法は、栽培したＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ属植物を収穫し
、その根またはストロンからグリチルリチンを抽出する
方法である。この方法は材料の供給や品質の安定性に問
題かある。

方、Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ属植物の細胞の培養の研究
は少数であるが報告されている。それら研究の中で藤田
ら（特開昭５３−９１１８８）は、培地中の植物成長調
節物質の濃度を調節することで、培養細胞から根を分化
形成させ、その組織にグリチルリチンを生産させること
かり能であることを報告している。

また近年、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌が植物
に感染すると、植物の組織をカン様の組織であるクラウ
ンゴールや毛状根に形質転換することが知られている。

なお本明細書において、「廿苧」とは局方に指定された
漢方の生薬を示す。’Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ属植物」
とは甘草の原料として用いられるＧｌｙｃｙｒｒｈｉ−
ｚａ属の植物、例えば、Ｇ、ｕｒａｌｅｎｓｉｓ　Ｆｉ
ｓｈｅｒ、Ｇ。

ｇｌａｂｒａ　Ｌ、、Ｇ４１ａｎｄｕｌｉｆｅｒａ、Ｇ
、１ｎｆｌａｔａ等を示す。「細菌」とは各々の実験に
用いられたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌を示す
。「毛状根」とは、組織が形質転換した結果生じた一種
のガン化した根株の器官で、毛根状で多数の根が分枝し
ながら伸長して増殖している器官を示す。

［発明が解決しようとする問題点］ 野生のものや栽培したＧｌｙｃｙ−ｒｒｈｉｚａ属植物
の根の組織である甘草に含まれる有効成分の含量が一定
しないことは良く知られた事実である。また我が国では
ｔｔ苧の大部分を輸入に頼っている。これらのことは我
が国で広く用いられている甘草を安定して供給する上で
はなはだ都合が悪い。これらのことから植物体から抽出
する方法以外の方法の開発を必要としている。

また、培養した未分化なＧ　Ｉｙｃｙｒｒｈ　ｉ　ｚａ
属植物の細略を用いて有効成分を合成する方法も考えら
れるが、実用的な含量で生産した報告はなく、困難だと
考えられる。

・方、未分化な植物細胞を用いず、培地中の植物成長調
節物質の濃度を調節して、植物の培養細胞から根を分化
させ、その組織から有効成分を得る方法は、根の分化を
注意深くコントロールしなければならず、１業的に利用
するには必ずしも適していない。

［問題を解決するための手段］ 本発明者らは、Ｇ　１ｙｃｙｒｒｈ　ｉ　ｚａ属植物の
組織を、＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ属の細菌を用いて形
質転換し、毛状根を形成させ、その毛状根を培養容器中
で増殖させることによって、特別な組織分化のための制
御を行なうことなく、安定してかつ容易に根を増殖させ
る方法を見いだした。さらにこの根の中には汁苧の有効
成分であるグリチルリチンが著量含まれており、この方
法を用いわばＷ草もしくはその有効成分であるグリチル
リチンを安定して生産することが可能である。

以下具体的にこの発明について説明する。

Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ属植物、例えば、Ｇ、ｕｒａｌ
ｅｎｓｉｓＦｉｓｈｅｒ、Ｇ４１ａｂｒａ　Ｌ、、Ｇ、
ｇｌａｎｄｕｌｉｆｅｒａ、Ｇ、１ｎｆｌａｔａ等の種
子を滅菌し、無菌的に培養し、無菌幼植物を得る。この
幼植物を形質転換させる。形質転換は、例えばエレクト
ロポレーション法、ポリエチレングリコール法、ＤＮＡ
をまぶしたタングステンの微小粒を細胞に撃ち込むマイ
クロプロジェクタイル法、受粉過程の卵細胞に遺伝子を
注入する方法、及び＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌
を感染させて行なう方法等が用いられるが、特に＾ｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌を感染させて行なう方法が
好ましい。即ちこの幼植物の茎の側面ないしは茎の切片
の上端面にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌、例え
ばＡ、ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓまたはＡ、ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓの懸濁液を塗布する。

この状態でも感染は成立するが、培地に比較的低濃度の
クラフオラン（５０〜４００ｍｇ／ｌ）を添加すると細
菌の増殖が抑制されて、植物体と細菌体との共存期間を
長くすることができる。

この状態で２〜４週間すると茎の側面から毛状根が発生
する。この毛状根を切り取り、クラフォラン（１００〜
４ｏｏｍｇ／Ｉ）を含む培地で培養し毛状根の増殖と除
菌を行なう。同様の操作をもう一度おこない除菌を確実
にする。除菌が確認された毛状根は抗生物質を含まない
培地でさらに増殖させる。

増殖した毛状根を乾燥させ、グリチルリチンを抽出し高
速液体クロマトグラフィー（）（ＰＬＣ）を用いて定量
する。

これらの組織を培養する培地としてはＭＳ培地（Ｍｕｒ
ａｓｈｉｇｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ　１９６２）、　Ｎ　＆
Ｎ培地（Ｎｉｔｃｈ　＆Ｎ１ｔｃｈ　１９６７）及びＢ
５培地（Ｇａｍｂｏｒｇｅｔ　ａｌ、１９６８）等が都
合良く利用できる。また細菌の増殖を抑制する抗生物質
としては他に同様の濃度のカーペニシリンおよびクロラ
ムフェニコール等が有効に利用できる。

［作　用］ この発明によって、Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ属植物を形
質転換することによって、毛状根を培養容器内で安定し
て増殖させることが可能となった。

［実施例１］ 北海道大学付属植物園より入手したＧｌｙｅｙｒｒｈｉ
−ｚａ　ｕｒａｌｅｎｓｉｓの種子を中性洗剤で１０分
間洗浄した。この種子を７０％エタノールで１５分滅菌
し、滅菌蒸溜水ですすいだ。そしてさらにこの種子を０
．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む次亜塩素酸ナトリウム溶
液（有効塩素量０．０５％）に浸し、減圧状態で１５分
間おいた。その後滅菌蒸溜水で３回すすいだ。このよう
に滅菌した種子を０．８％の寒天で固化した培地上に播
種し、無菌的に発芽させ、無菌の幼植物を得た。

土壌細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅ
ｎｅｓ　（ＡＴ（：Ｃ１５８３４）をＹＥＢ培地（酵母
抽出物５ｇ、肉汁５ｇ、シヨ糖５ｇ、バタトベブトン５
　ｇ　、　Ｍｇ５ｏ、・７Ｈ２０４９２ｍｇ、ゲルライ
ト　２．５ｇあるいは寒天１．５ｇを培地ｌｌ中に含む
。ｐＨ７，２）中で２５℃で３日間培養した。

この細菌懸濁成約５０μＩを有鉤針の先に付け、上記の
Ｇ、ｕｒａｌｅｎｓｉｓの無菌の幼植物に傷を付けなが
ら塗布し細菌を感染させた。この植物をクラフォラン（
３００＋ｎｇ／ｌ）を含む培地（ショ糖３％を添加した
ＭＳ培地）に感染部分が接しないように置き培養した。

また成育したＧ、ｕｒａｌｅｎｓｉｓの無菌幼植物から
約１ｃｍの長さの茎の切片を切り出しクラフィラン（２
００Ｂ／ｌ）を添加した寒天培地（３％ショ糖を加えた
ＭＳ培地）に突き立てた。その−Ｌ部の切断面に約５０
μｌの細菌の懸濁液を塗布した。

この状態で２週間培養すると毛状根が形成した。さらに
６日間培養し、これら毛状根を切り取り新鮮な培地に移
植した。この培地にはクラフィラン（３００ｍｇ／ｌ）
を添加し除菌を図った。この状態で毛状根は２週間後に
は約５ｃｍにまで成育した。

成育した毛状根をさらにタラフォラン（３００ｍｇ／Ｉ
）を含む培地に移植し成育させた。さらに２週間培養し
クラフォランを含まないＭＳ培地に移し培養した。毛状
根の増殖速度は２週間で約２倍に増えた。

この独立に形成し、成育した４株の毛状根の部を取り出
しグリチルリチンを抽出し、含量を測定した。

グリチルリチンの定量はＨＰＬＣを用いて行なった。カ
ラムは０ＤＳ１２０　Ｔ　（ＴＯＳＯ社製、逆相カラム
、型番）を用いた。展開溶媒としては＋−＋２０（１％
の酢酸を含む）とＣ）＋３ＣＮ　（１％の酢酸を含む）
の混合液を１　ｍｌ／ｍｉｎ、の流速で流した。

ＣＨ３ＣＮの混合比は２０から９０％に６０分間かけて
変化させた。グリチルリチンの検出は波長２５４ｒｖ＋
の紫外線の吸収で行ない、２４．７３分に流出する分画
をグリチルリチンとした。

この方法で定量した結果は表１の如くであった。

表１　毛状根中のグリチルリチンの含量［実施例２］ 上湯薬物研究所より人手したＧ、ｕｒａｌｅｎｓｉｓの
種子を用いて実施例１と同様に無菌的に発芽させ、無菌
の幼植物を得た。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚ
ｏｇｅｎｓｅｓ（＾ＴＣＣ１５８３４）も実施例１と同
様に成育させた。この細菌の懸濁成約５０μｌを有鉤針
の先に付け、上記のＧ、ｕｒａｌｅｎｓｉｓの無菌の幼
植物に傷を付けながら塗布し細菌を感染させた。この植
物をクラフィラン（３００ｍｇ／ｌ）を含む培地（ショ
糖３％を添加したＭＳ培地）に感染部分が接しないよう
に置き培養した。この状態で２週間放置すると毛状根が
形成した。形成した毛状根を切り取り新鮮な培地に移植
した。この培地にはクラフォラン（３００ｍＨ／Ｉ）を
添加し除菌を図った。この状態で毛状根は２週間後には
約５ｃｍにまで成育した。成育した毛状根をさらにタラ
フォラン（３００＋ａｇ／Ｉ）を含む培地に移し完全な
除菌と成育を図った。成育した毛状根を表２に示すよう
な各種の液体培地に移植し６０日間培養し、増殖した毛
状根中のグリチルリチン含量を測定した。

表２　毛状根中のグリチルリチンの含量［実施例３］ 東京大学薬用植物園から入手したＧｌ　ｙｃｙｒｒｈ　
ｉｚａｇｌｏｂｒａの種子を実施例１と同様に滅菌し無
菌植物を得た。この茎に実施例１と同様に調整したＡ、
ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（ＡＴ（：（：　１５８３４）の
懸濁液を塗布し形質転換させた。３週間後に毛状根の形
成がみられた。これらの毛状根をクラフォラン（３００
ｍｇ／ｌ）を含むＮ＆Ｎ培地で除菌しつつ増殖を行なっ
たところ良好な増殖がみられた。

５系統の独立な毛状根が得られ、これら毛状根中には平
均０．３３％のグリチルリチンが含まれていた。

［実施例４］ 実施例１で用いた植物を実施例１と同様に無菌化し無菌
幼植物を得た。

土壌細菌として日本の土壌から単離されたＡ、ｒｈｉｚ
ｏｇｅｎｅｓ　Ｍ旧株及びＡ、ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　
ＭＲ２２株を用い、実施例１と同様に培養した。

これら細菌の懸濁液の各々を、上述の無菌植物の茎の側
面に傷を付けながら塗布した。

これらの感染した植物はクラフィラン（２００ｍｇ／ｌ
）を含むＢ５培地で成育させたところ、３週間後に毛状
根の発生が見られた。これらの毛状根を切り取り、各種
濃度のクラフォランを含むＢ５培地で除菌と毛状根の増
殖を図った。その結果タラフォランの濃度が４００Ｈ／
ｌ以下の場合には細菌の増殖が見られ、５００＋ｎｇ／
ｌの場合には細菌の増殖が見られず、除菌することがで
きた。

これらの細菌を用いた場合には毛状根の増殖は実施例１
に比べると悪く３週間で約２倍となった。各々５系統の
毛状根を得たのでその中のグリチルリチンの含量を測定
した。それら５系統の平均地を表３に示す。

表３　毛状根中のグリチルリチンの含量［発明の効果］ 本発明により、従来屋外で成育した植物体のみから供給
さねていた甘草ないしはその有効成分であるグリチルリ
チンの生産を、屋内の培養容器内で効率良く行なえるよ
うになり、これら漢方生薬の安定的な供給が可能となっ
た。

特許出願人　　三井東圧化学株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、グリチリーザ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ）属植物の
   組織を形質転換させて形成させた根から抽出することを
   特徴とするグリチルリチンの生産方法。 ２、形質転換は植物の組織を細菌に感染させて行なうこ
   とを特徴とする請求項第１項に記載の方法。 ３、細菌が土壌感染性細菌である請求項第２項に記載の
   方法。 ４、土壌感染性細菌がアグロバクター（Ａｇｒｏｂａｃ
   ｔｅｒ）属細菌である請求項第３項に記載の方法。 ５、形成させた根は増殖させたものである請求項第１項
   に記載の方法。 ６、増殖は一旦殺菌剤を含む培地で行なった後殺菌剤を
   含まない培地で行なう請求項第５項の方法。