ES2924896T3

ES2924896T3 - Procedimiento para reciclar artículos de plástico mixto con PET

Info

Publication number: ES2924896T3
Application number: ES15722194T
Authority: ES
Inventors: Emmanuel Maille
Original assignee: Carbios SA
Current assignee: Carbios SA
Priority date: 2014-05-16
Filing date: 2015-05-12
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2035-05-12
Also published as: US20170114205A1; WO2015173265A1; CA2947478C; US10385183B2; EP4056631A1; LT3143075T; PT3143075T; CA2947478A1; EP3143075A1; EP3143075B1; CN106459471A

Abstract

La invención se refiere a un método para reciclar al menos un artículo de plástico PET mixto, comprendiendo el método degradar al menos PET del artículo plástico PET mixto a monómeros y/u oligómeros usando una enzima y recuperar los monómeros y/u oligómeros resultantes. El método de la invención se puede utilizar para despolimerizar, simultánea o secuencialmente, al menos dos polímeros diferentes del artículo de plástico PET mixto, y/o para reciclar al menos dos artículos de plástico PET mixto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para reciclar artículos de plástico mixto con PET

La presente invención se refiere a un procedimiento para reciclar artículos de plástico mixto con PET, tales como plásticos de desecho, que contienen polímeros de poli(tereftalato de etileno) y al menos un componente adicional. Más particularmente, la invención se refiere a un procedimiento biológico para despolimerizar al menos los polímeros de poli(tereftalato de etileno) de esos artículos de plástico mixto con PET y recuperar los monómeros y/u oligómeros resultantes, que pueden reprocesarse adicionalmente para sintetizar nuevos polímeros y fabricar nuevos artículos de plástico.

Contexto de la invención

Los plásticos son materiales económicos y duraderos, que se pueden utilizar para fabricar una variedad de productos que encuentran uso en una amplia gama de aplicaciones, por lo que la producción de plásticos ha aumentado drásti camente en las últimas décadas. Más del 50% de esos plásticos se utilizan para aplicaciones desechables de un solo uso, como envases, películas agrícolas, artículos de consumo desechables o para productos de vida corta que se desechan en el plazo de un año desde su fabricación. Debido a la durabilidad de los polímeros implicados, se acumu lan cantidades sustanciales de plásticos en los vertederos y en hábitats naturales a nivel mundial, lo que genera problemas ambientales cada vez mayores. Incluso los plásticos degradables y biodegradables pueden persistir du rante décadas, dependiendo de factores ambientales locales, como los niveles de exposición a luz ultravioleta, la temperatura, la presencia de microorganismos adecuados, etc.

En los últimos años, el poli(tereftalato de etileno), un poliéster aromático producido a partir de ácido tereftálico y etilenglicol, y más conocido como PET, ha sido ampliamente empleado en la fabricación de diversos productos para el consumo humano, incluyendo la fabricación de envases para alimentos y bebidas, especialmente de refrescos de tamaño adecuado, zumos y agua, bandejas o bolsas con base y la fabricación de fibras utilizadas en tejidos, telas, alfombras o moquetas, etc.

El PET es el plástico más reciclado en circuito cerrado del mundo. En general, los residuos de PET se someten a sucesivos tratamientos que dan lugar al PET reciclado (rPET). Los residuos de PET (principalmente botellas) se reco gen, se clasifican, se prensan en balas, se trituran, se lavan, se trocean en escamas, se funden y se extruyen en forma de gránulos y se ponen a la venta. A continuación, el PET reciclado se puede utilizar para crear tejidos para la industria de la confección o nuevos envases tales como botellas o envases tipo blíster, etc. Ese procedimiento se adapta a una corriente de plástico puro que contiene solo PET. Sin embargo, ese procedimiento no es aplicable en productos plás ticos que contienen un componente adicional diferente al PET.

Existe un procedimiento adicional para el reciclaje de residuos de plástico PET, conocido como "reciclado químico", que permite recuperar los constituyentes del polímero utilizando un catalizador químico. Los monómeros y/u oligómeros resultantes se pueden usar después para volver a fabricar plástico o para fabricar otros productos químicos sinté ticos. Sin embargo, hasta la fecha, ese reciclaje químico solo se ha realizado con polímeros purificados y no es eficaz con artículos de plástico complejos constituidos por una mezcla de polímeros y otros compuestos y aditivos.

Debido a su bajo peso, alta resistencia, baja permeabilidad a los gases y al hecho de que el PET no tiene efectos nocivos para la salud humana, el PET se emplea ampliamente en la fabricación de artículos de plástico mixto, consti tuidos por PET y componente(s) adicional(es), incluyendo sin limitación otros polímeros, partículas metálicas, partícu las o fibras de vidrio, componentes de madera, fibras de carbono, etc.

Por ejemplo, para ciertos envases de bebidas, tales como botellas de cerveza o de agua con gas, el PET se intercala entre una capa de poli(alcohol vinílico) (PVOH) o una capa de poliamida para reducir la permeabilidad al oxígeno del envase. Del mismo modo, algunos envases rígidos para alimentos, como las bandejas para alimentos, contienen una capa de polietileno (PE) como agente de soldadura entre la bandeja y la tapa, ambas constituidas por PET. Algunos envases flexibles para alimentos también contienen una película de poliéster hecha a base de PET estirado, metali zado mediante una película delgada de metal para reducir la permeabilidad y hacerlo reflectante y opaco. También se utilizan mantas aislantes hechas con PET metalizado, por ejemplo, en casos de emergencia para mantener el cuerpo caliente. De una manera diferente, el PET también se funde o se rellena con partículas o fibras de vidrio, para que se vuelva más rígido y duradero y, por lo tanto, se pueda utilizar en otras industrias. De forma similar, recientemente se han desarrollado compuestos de madera y plástico, en los que se funden madera aserrada y PET y se moldean en formas de madera aserrada. Esas formas de madera son más rígidas ya que las fibras de madera actúan como re fuerzo. Esas formas de madera también son más resistentes a la penetración de la humedad y la degradación por hongos debido a que el plástico encapsula y une la madera, por lo que ese nuevo plástico mixto muestra algunas de las mejores propiedades tanto de la madera como del plástico.

Sin embargo, los actuales procedimientos de reciclado mecánico o químico que se han desarrollado no están adapta dos a ese tipo de artículos de plástico complejos que contienen una mezcla de PET y otro(s) constituyente(s), que no pueden separarse fácilmente entre sí antes del reciclado.

Por lo tanto, existe la necesidad de un procedimiento para reciclar artículos de plástico mixto que no requiera una clasificación preliminar ni pretratamientos costosos y que pueda usarse para reciclar el PET contenido en diferentes artículos de plástico mixto.

El documento WO 2014/079844 describe un método para reciclar un producto de plástico mixto que comprende al menos dos polímeros diferentes, comprendiendo el método degradar, simultánea o secuencialmente, los, al menos dos, polímeros diferentes del producto de plástico, hasta monómeros usando una enzima tal como una cutinasa y recuperar los monómeros resultantes.

El documento US 2005/261465 describe un método para aumentar la degradación hidrolítica mediante microorganis mos de polímeros desechables, en particular un copoliéster alifático-aromático, comprendiendo el método poner en contacto al menos una enzima hidrolítica, tal como una lipasa, en una solución acuosa con el copoliéster.

Compendio de la invención

La invención propone un procedimiento biológico para reciclar plásticos mixtos con PET. Más particularmente, la in vención muestra que se pueden usar despolimerasas particulares para despolimerizar eficientemente artículos de plástico mixto con PET para generar monómeros de etilenglicol y/o ácido tereftálico y/u oligómeros y/o derivados de los mismos, incluyendo tereftalato de metil-2-hidroxietilo (MHET) y/o tereftalato de bis(2-hidroxietilo) (BHET) y/o ben zoato de 2-hidroxietilo (HEB) y/o tereftalato de dimetilo (DMT) y/o ácido benzoico (BA). El procedimiento de la inven ción permite recuperar monómeros y/u oligómeros que forman polímeros de un artículo de plástico mixto con PET, y reprocesarlos para sintetizar nuevos polímeros y artículos.

A este respecto, un objeto de la invención es proporcionar un procedimiento para reciclar al menos un artículo de plástico mixto que contiene poli(tereftalato de etileno) (PET) de acuerdo con la reivindicación 1.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método para producir monómeros y/u oligómeros a partir de un artículo de plástico mixto con PET según la reivindicación 15.

En una realización, el procedimiento comprende las siguientes etapas:

- Poner en contacto el(los) artículo(s) de plástico mixto con PET con la despolimerasa en condiciones y durante un tiempo adecuado para que la despolimerasa despolimerice al menos los polímeros de PET del(de los) artículo(s) de plástico mixto con PET;

- recuperar los monómeros y/o los oligómeros resultantes; y opcionalmente

- reprocesar los monómeros y/o los oligómeros recuperados en uno o varios polímeros.

La despolimerasa es cualquier polimerasa que despolimeriza el PET, tal como una cutinasa, una lipasa o una esterasa, preferiblemente una cutinasa. Además, según realizaciones particulares, se pueden usar varias despolimerasas en combinación, juntas o secuencialmente.

En una realización particular, el procedimiento de la invención se implementa poniendo en contacto el(los) artículo(s) de plástico mixto con PET con un microorganismo que expresa y excreta la despolimerasa. De acuerdo con la inven ción, el microorganismo puede ser un microorganismo recombinante que exprese y excrete una despolimerasa re combinante y/o un microorganismo recombinante con un metabolismo modificado que evita el consumo de los monómeros/oligómeros resultantes.

Ventajosamente, el componente adicional que constituye el(los) artículo(s) de plástico mixto con PET se selecciona a partir de polímeros, tales como poliésteres, poliamidas, poliolefinas y polímeros vinílicos, compuestos metálicos, com puestos minerales, fibras, papel, compuestos de vidrio, madera, compuestos de madera tales como lignina, celulosa o hemicelulosa, almidón y derivados de los mismos.

Un objeto adicional de la invención es permitir el reciclado de al menos dos polímeros diferentes del(de los) artículo(s) de plástico mixto con PET, en donde dichos al menos dos polímeros diferentes se degradan, simultánea o secuencialmente.

Otro objeto del procedimiento de la invención es permitir el reciclado de al menos dos artículos de plástico mixto con PET, simultánea o secuencialmente.

Estos y los otros objetos y realizaciones de la invención se harán más evidentes después de la descripción detallada de la invención, incluyendo las realizaciones preferidas de la misma, proporcionadas en términos generales.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de reciclaje completo para reciclar artículos de plástico mixto con PET que contienen polímeros de PET, mediante la despolimerización de al menos los polímeros de PET de dicho(s) artículo(s) de plástico, en donde se genera una mezcla de monómeros y/u oligómeros repolimerizables y que se puede recuperar adicionalmente.

Definiciones

La presente descripción se comprenderá mejor haciendo referencia a las siguientes definiciones.

Dentro del contexto de la invención, la expresión "artículo de plástico mixto con PET' se refiere a cualquier artículo o producto o material (tal como lámina de plástico, tubo, varilla, perfil, forma, bloque macizo, fibra, etc.) que comprende poli(tereftalato de etileno) (PET) y al menos un componente adicional. En el contexto de la invención, el artículo de plástico mixto con PET incluye todo tipo de artículos de plástico compuestos por polímeros de poli(tereftalato de eti leno) y otro u otros componentes dispuestos entre sí de tal manera que no pueden separarse fácilmente. Preferible mente, el artículo de plástico mixto es un producto manufacturado tal como un envase, películas agrícolas, artículos desechables o similares, restos de alfombras, telas, tejidos, etc. Además, los polímeros del artículo de plástico mixto con PET pueden ser polímeros cristalizados y/o semicristalizados o polímeros amorfos o una mezcla de polímeros cristalizados y/o semicristalizados y polímeros amorfos.

Un "polímero" se refiere a un compuesto químico o mezcla de compuestos cuya estructura está constituida por múlti ples unidades repetitivas unidas por enlaces químicos covalentes. Dentro del contexto de la invención, el término polímero incluye polímeros naturales o sintéticos, que constituyen un solo tipo de unidad repetitiva (es decir, homopolímeros) o una mezcla de diferentes unidades repetidas (es decir, copolímeros). Los polímeros sintéticos incluyen polímeros derivados del petróleo, como poliolefinas, poliésteres alifáticos o aromáticos, poliamidas, poliuretanos y poli(cloruro de vinilo). Los polímeros naturales incluyen lignina y polisacáridos, tales como como celulosa, hemicelulosa, almidón y derivados de los mismos.

Según la invención, "oligómeros" se refiere a moléculas que contienen de 2 a aproximadamente 20 unidades monoméricas. Ventajosamente, los oligómeros recuperados con el procedimiento de la invención incluyen tereftalato de metil-2-hidroxietilo (MHET) y/o tereftalato de bis(2-hidroxietilo) (BHET) y/o benzoato de 2-hidroxietilo (HEB) y/o teref talato de dimetilo (D^mT).

"Poli(tereftalato de etileno)" o "polímero de poli(tereftalato de etileno)", también abreviados como PET o PETE, se usan indistintamente y se refieren a una resina polimérica termoplástica de la familia de los poliésteres, producida a partir de monómeros de monoetilenglicol (MEG) y tereftalato de dimetilo (DMT) o ácido tereftálico purificado (PTA). El PET puede existir tanto como polímero amorfo como semicristalino. En el contexto de la invención también se incluyen los homopolímeros y copolímeros de PET. Ejemplos de copolímeros son el tereftalato de polietileno modificado con glicol (PETG), en donde se añade ciclohexano dimetanol a la estructura principal del polímero, en lugar de etilenglicol, o el tereftalato de polietileno modificado con ácido isoftálico, en donde el ácido isoftálico reemplaza parte del enlace de las unidades de tereftalato, o PET bi-orientado axialmente (BOPET) o PET orientado (OPET), etc.

Un "procedimiento para reciclar' o "procedimiento completo de reciclaje" en relación con un artículo de plástico se refiere a un procedimiento mediante el cual al menos un polímero de dicho artículo de plástico se degrada para pro porcionar monómeros y/u oligómeros repolimerizables, que se recuperan ventajosamente para ser reutilizados.

En la presente descripción, un "microorganismo recombinante" se refiere a un microorganismo cuyo genoma ha sido modificado mediante la inserción de al menos una secuencia o una unidad de ácido nucleico, que se corresponde con al menos un gen o parte del mismo, que no es idéntico a la secuencia de ácido nucleico de un gen presente de forma natural en el microorganismo existente. Dicha secuencia o unidad de ácido nucleico ha sido ensamblada y/o insertada en dicho microorganismo o en un ancestro del mismo, utilizando tecnología de ADN recombinante (también denomi nada clonación génica o clonación molecular) que se refiere a técnicas de transferencia de ADN desde un organismo a otro. Un "microorganismo recombinante" incluye además un microorganismo cuyo genoma ha sido modificado me diante la inactivación de al menos una secuencia o unidad de ácido nucleico. Los microorganismos recombinantes pueden generarse mediante una variedad de métodos conocidos por sí mismos en la técnica y posteriormente con servarlos o reproducirlos o expandirlos en cultivo, sin el uso de una tecnología de ADN recombinante adicional. De lo contrario, el microorganismo recombinante puede obtenerse a partir de un banco metagenómico.

Un "mutante" en relación con una enzima se refiere a una enzima en la que al menos un aminoácido es diferente de la enzima de tipo silvestre.

Las expresiones "ácido nucleico", "secuencia nucleica", "polinucleótido", "oligonucleótido"y "secuencia de nucleótidos" se usan indistintamente y se refieren a una secuencia de desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede prepararse primero, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes, enzimáticas y/o químicas, y posteriormente replicarla en una célula hospedadora o en un sistema in vitro. La secuencia de nucleótidos comprende preferentemente un marco de lectura abierto que codifica un (poli)péptido. La secuencia de nucleótidos puede contener secuencias adicionales, tales como un terminador de transcripción, un péptido señal, un intrón, un dominio de unión, etc.

Dentro del contexto de la invención, la expresión "derivado de un microorganismo"en relación con una enzima o un (poli)péptido indica que la enzima o el (poli)péptido se ha aislado a partir de ese microorganismo, o que la enzima o el (poli)péptido comprende la totalidad o una parte biológicamente activa de la secuencia de aminoácidos de una enzima o un (poli)péptido aislado o caracterizado a partir de ese microorganismo.

El término "vector" se refiere a una molécula de ADN o ARN utilizada como vehículo para transferir material genético recombinante a una célula hospedadora. Los principales tipos de vectores son plásmidos, bacteriófagos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales. Los vectores denominados vectores de expresión (estructuras artificiales de expresión) se adaptan específicamente para la expresión de secuencias heterólogas en una célula diana y, en general, tienen una secuencia promotora que dirige la expresión de las secuencias heterólogas. Generalmente, los elementos regu ladores que están presentes en un vector de expresión incluyen un promotor transcripcional, un sitio de unión al ribosoma, un terminador y/o un operador. Preferiblemente, un vector de expresión también contiene un origen de replicación para la replicación autónoma en una célula hospedadora, un marcador seleccionable, un número limitado de sitios para enzimas de restricción útiles y/o potencial para un número de copias elevado. Los vectores de expresión que proporcionan niveles adecuados de expresión de un polipéptido en diferentes hospedadores son bien conocidos en la técnica. Los vectores de expresión bacterianos bien conocidos en la técnica incluyen pET 11 a (Novagen), lamda gt11 (Invitrogen).

Los vectores de expresión se pueden introducir en las células hospedadoras usando técnicas convencionales. Ejem plos de tales técnicas incluyen transformación, transfección, lipotransfección, fusión de protoplastos y electroporación. Ejemplos de técnicas para introducir ácido nucleico en una célula y expresar el ácido nucleico para producir proteínas, se proporcionan en referencias tales como Ausubel, Current Protocols in molecular biology, John Wiley, 1987-1998, y Sambrook, et al., in Molecular cloning, A laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Artículo de plástico mixto

La presente invención describe un método novedoso según la reivindicación 1, para degradar al menos un artículo de plástico mixto con PET para generar monómeros y/u oligómeros que pueden reutilizarse, por ejemplo, para crear polímeros y/o fabricar nuevos artículos.

Los inventores han desarrollado un procedimiento de reciclaje adecuado para degradar artículo(s) de plástico mixto con PET, sin una separación preliminar del PET de los otros componentes. El procedimiento de la invención se puede aplicar ventajosamente a artículos de plástico mixto con PET provenientes directamente de la recogida de desechos plásticos y/o desechos post-industriales. Más particularmente, el procedimiento de la invención puede aplicarse sobre una mezcla de residuos plásticos domésticos, incluyendo botellas de plástico, bolsas de plástico y envases de plástico, plásticos blandos y/o duros, incluso contaminados con residuos de alimentos, tensioactivos, etc. Según la invención, el procedimiento de reciclaje también puede utilizarse para reciclar artículos de plástico que contienen un 100% en peso de PET, incluso si están mezclados con otros artículos de plástico, incluyendo artículos de plástico sin PET.

El contenido en PET en el artículo de plástico mixto con PET puede variar desde el 5% en peso hasta menos del 100% en peso, preferiblemente desde el 10% hasta el 95% en peso. Por ejemplo, en envases flexibles para alimentos tales como bolsas, el contenido en PET es desde el 14% en peso a aproximadamente el 65% en peso, estando asociado el PET con PVC, OPS, LDPE, OPP, OPET, aluminio, p P, etc.

En una primera realización, el contenido en PET representa menos del 50% en peso del peso total del artículo de plástico mixto con PET. Preferentemente, el contenido en PET representa del 5% al 45% en peso, más preferente mente del 10% al 40% en peso, aún más preferentemente del 10% al 35% en peso.

En una segunda realización, el contenido en PET representa más del 50% en peso del peso total del artículo de plástico mixto con PET. Preferentemente, el contenido en PET representa del 55% al 95% en peso, más preferente mente del 65% al 95% en peso, aún más preferentemente del 75% al 95% en peso.

De acuerdo con la invención, el(los) componente(s) adicional(es) del artículo de plástico mixto con PET se selec ciona^) a partir de polímeros, tales como poliolefinas o polímeros vinílicos, compuestos metálicos, compuestos de vidrio, fibras, papel, minerales, madera o compuestos de madera tales como lignina, celulosa o hemicelulosa, y almi dón y derivados de los mismos. Clásicamente, el artículo de plástico mixto con PET puede contener además, además del(los) componente(s) adicional(es), otras sustancias o aditivos, tales como plastificantes, cargas minerales u orgá nicas, captadores de oxígeno, compatibilizadores, adhesivos o tintas.

En una realización particular, los artículos de plástico mixto comprenden, además de PET, al menos una poliolefina y/o al menos un polímero vinílico.

En consecuencia, el artículo de plástico mixto con PET puede contener un poliéster adicional, preferiblemente selec cionado a partir de poli(tereftalato de trimetileno) (PTT), poli(tereftalato de butileno) (PBT), poli(tereftalato de isosorbida de etileno) (PEIT), poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido L-láctico) (PLLA ), poli(ácido D-láctico) (PDLA), poli(ácido D,L-láctico) (PDLLA), estereocomplejo PLA (scPLA), poli(ácido glicólico) (PGA), polihidroxialcanoato (PHA), poli(3-hidroxibutirato) (P(3Hb )/PHB), poli(3-hidroxivalerato) (P(3HV)/PHV), poli(3-hidroxihexanoato) (P(3HHx)), poli(3-hidroxioctanoato) (p (3HO)), poli(3-hidroxidecanoato) (P(3h D)), poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (P(3HB-co-3HV)/pHbV), poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato) (P(3HB-co-3HHx)/(PHBHHx)), poli(3-hidroxibutirato-co-5-hidroxivalerato) (PHB5HV), poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxipropionato) (PHB3HP), polihidroxibutirato-cohidroxioctonoato (PHBO), poli(hidroxibutirato-co-hidroxioctadecanoato) (PHBOd), poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato-co-4-hidroxibutirato) (P(3HB-co-3HV-co-4HB)), poli(succinato de butileno) (PBS), poli(adipato de succinato de butileno) (PBSA), poli(tereftalato de adipato de butileno) (PBAT), poli(furanoato de etileno) (PEF), policaprolactona (PCL), poli(adipato de etileno) (PEA), poli(naftalato de etileno) (PEN), poli(tereftalato de ciclohexilendimetileno) (PCT) y combinaciones/mezclas de esos materiales.

Como alternativa o además, el artículo de plástico mixto con PET puede contener una poliamida (también denominada nailon), preferentemente seleccionada a partir de poliamida-6 o poli(p-caprolactama) o policaproamida (PA6), poliamida-6,6 o poli(hexametilenadipamida) (PA6,6), poli(11-aminoundecanoamida) (PA11), polidodecanolactama (PA12), poli(tetrametilen adipamida) (PA4,6), poli(pentametilen sebacamida) (PA5,10), poli(hexametilen azelaamida) (PA6,9), poli(hexametilen sebacamida) (PA6,10), poli(hexametilen dodecanoamida) (PA6,12), poli(m-xililen adipa mida) (PAMXD6), copolímero de poli(hexametilen adipamida)/poli(hexametilen tereftalamida) (PA66/6T), polihexametilen adipamida /copolímero de polihexametilenisoftalamida (PA66/6I) y combinaciones/mezclas de esos materiales.

En una realización particular, el artículo de plástico mixto con PET contiene del 1% al 45% en peso de poliamida, preferentemente del 2% al 30%, y aún más preferentemente del 2% al 20% en peso de poliamida.

En otra realización particular, el artículo de plástico mixto con PET contiene del 55% al 90% en peso de poliamida, preferentemente del 65% al 90%, y aún más preferentemente del 70% al 90% en peso de poliamida.

Como alternativa o además, el artículo de plástico mixto con PET puede contener además una poliolefina, preferible mente seleccionada a partir del grupo que consiste en polietileno (PE), polipropileno (PP), polimetilpenteno (PMP), polibuteno-1 (PB-1), poliisobutileno (PIB), caucho de etileno propileno (EPR), caucho de monómero de etileno propileno dieno (EPDM), copolímero de olefina cíclica (COC) y combinaciones/mezclas de esos materiales.

En una realización particular, el artículo de plástico mixto con PET contiene del 1% al 45% en peso de poliolefinas, preferentemente del 2% al 40%, y aún más preferentemente del 5% al 35% en peso de poliolefinas.

En otra realización, el artículo de plástico mixto con PET contiene de 55% a 90% en peso de poliolefinas, preferible mente de 60% a 90%, e incluso más preferiblemente de 70% a 90% en peso de poliolefinas.

Alternativamente o además, los artículos de plástico mixto con PET pueden contener además un polímero vinílico producido a base de monómeros vinílicos, pequeñas moléculas que contienen dobles enlaces carbono-carbono, pre feriblemente seleccionados a partir del grupo que consiste en polietileno (PE), polipropileno (PP), poliestireno (PS), poli(cloruro de vinilo) (PVC), poli(cloruro de vinilideno) (PVdC), acetato de etilenvinilo (EVA), alcohol de etilenvinilo (EVOH), poli(alcohol vinílico) (PVOH) y combinaciones/mezclas de esos materiales.

En otra realización particular, el artículo de plástico mixto con PET contiene al menos un polímero adicional seleccio nado a partir del grupo formado por polímero de ortoftalaldehído (OPA), policlorotrifluoroetileno (PCTFE) y caucho.

Preferiblemente, el polímero adicional se selecciona a partir del grupo que consiste en polietileno (PE), polipropileno (PP), poli(cloruro de vinilo) (PVC), alcohol etilenvinílico (EVOH), polímero de ortoftalaldehído (OPA), poliestireno (PS), policlorotrifluoroetileno (PCTFE), caucho y sus derivados.

Alternativamente o además, según la invención, el artículo de plástico mixto con PET puede contener compuestos adicionales seleccionados a partir de compuestos metálicos, compuestos minerales, compuestos de vidrio, fibras na turales o sintéticas, papel, madera, compuestos de madera como lignina, celulosa o hemicelulosa, almidón y/o deriva dos de los mismos.

En una realización particular, el artículo de plástico mixto con PET contiene del 5% al 45% en peso de fibras, prefe rentemente del 10% al 35%, más preferentemente del 25% al 45% en peso de fibras. En otra realización particular, el artículo de plástico mixto con PET contiene del 55% al 95% en peso de fibras, preferentemente del 60% al 90%, más preferentemente del 65% al 90% en peso de fibras. Ventajosamente, las fibras se seleccionan a partir del grupo for mado por fibras de carbono, fibras de lino, fibras de cáñamo, fibras de madera, fibras de papel, fibras de paja, fibras de yute, fibras de algodón, fibras de viscosa, fibras de vidrio, fibras metálicas, fibras de aramida, fibras de boro, fibras cerámicas, fibras de polímero de cristal líquido, fibras de poliéster y mezclas de las mismas, etc. Preferiblemente, el artículo de plástico mixto con PET comprende fibras de algodón y/o fibras de viscosa y/o fibras de nailon. Ejemplos de ese artículo de plástico mixto incluyen tejidos, telas, alfombras y moquetas.

En una realización particular, el artículo de plástico mixto con PET comprende al menos un compuesto metálico. Ventajosamente, los compuestos metálicos se seleccionan a partir de aluminio, tal como hoja de aluminio, óxido de aluminio, titanio, óxido de titanio, níquel o cromo, preferiblemente a partir de aluminio.

Por ejemplo, el artículo de plástico mixto con PET contiene de 1% a 70% en peso de compuestos metálicos, preferi blemente de 2% a 50%, más preferiblemente de 2% a 40% en peso de compuestos metálicos.

En una realización particular, el artículo de plástico mixto comprende al menos un compuesto mineral, preferentemente seleccionado a partir de sílice o dióxido de silicio, vidrio o mica.

En una realización preferida, los compuestos adicionales se seleccionan a partir del grupo que consiste en aluminio, celulosa, almidón o mezclas de los mismos.

El procedimiento de la invención está diseñado para reciclar cualquier artículo de plástico mixto con PET. El artículo de plástico mixto con PET al que se dirige el procedimiento de la invención puede comprender diferentes tipos de materiales de plástico, incluidos materiales de plástico sintético, derivados de productos petroquímicos o materiales de plástico con base biológica (es decir, compuestos en su totalidad o en una parte significativa a partir de productos biológicos).

De acuerdo con la invención, el PET y el(los) componente(s) adicional(es) pueden combinarse de manera diferente en los artículos de plástico mixto con PET. Por ejemplo, pueden mezclarse por completo para formar una misma masa, incluidas las mezclas producidas por extrusión. Alternativamente o además, los artículos de plástico mixto con PET pueden estar constituidos por varias capas y/o partes que contienen diferentes componentes. Alternativamente, el artículo de plástico mixto con PET puede ser un artículo compuesto por PET constituido por fibras naturales o sintéticas impregnadas de resina PET, como el poliéster reforzado con fibra de vidrio utilizado en la industria de la construcción para fachadas, pórticos, jardineras, balaustradas, etc.

Por ejemplo, los artículos de plástico mixto con PET pueden comprender lámina(s) de plástico, tubo(s), varilla(s), perfil(es), forma(s), bloque(es) macizo(s), fibra(s), etc. Las diferentes capas/partes de los artículos de plástico mixto con PET pueden coexistir, ser adyacentes, estar unidas o imbricadas.

En consecuencia, el procedimiento de la invención se puede usar para reciclar uno o varios artículos de plástico mixto con PET que comprenden capas sucesivas de diferentes materiales de plástico. Las capas pueden tener diferentes longitudes, espesores, etc. Las capas pueden superponerse por completo o solo parcialmente. Las capas se pueden unir con un adhesivo específico, durante la fabricación, a través de procedimientos propuestos, etc. En una realización particular, una de las capas forma un adhesivo entre la capa de PET y otra capa del artículo de plástico. Ejemplos de tales artículos de plástico mixto incluyen botellas de plástico, envases de alimentos, blísteres de plástico, cubiertas de plástico, etc. Por ejemplo, el procedimiento de la invención puede implementarse ventajosamente para reciclar botellas de plástico para líquidos gaseosos, en donde los nanocompuestos a base de nailon o la(s) capa(s) de EVOH se intercalan entre dos capas de PET. Del mismo modo, el procedimiento de la invención puede implementarse para reciclar envases de alimentos en forma de bandejas, en donde se utiliza una capa de PE como agente de soldadura entre la bandeja y la tapa, ambas constituidas por PET.

El procedimiento de la invención puede usarse además para reciclar artículos de plástico mixto con PET que com prenden diferentes porciones o partes hechas a base de diferentes materiales de plástico. Las porciones pueden tener dimensiones diferentes o iguales y estar, al menos parcialmente, unidas físicamente entre sí. Por ejemplo, el procedi miento de la invención se puede usar para reciclar restos de alfombras hechos con una mezcla de fibras de PET y PTT o que contienen fibras de PET y PTT imbricadas.

En otra realización, el procedimiento de la invención se puede utilizar para reciclar artículos de plástico mixto con PET, elaborados con materiales de plástico que contienen PET y otro material, tal como material de madera, material me tálico, fibras, etc.

Ese tipo de artículos de plástico mixto con PET se pueden formar con capas o porciones de esos diferentes materiales que están al menos parcialmente unidos entre sí. Las capas o porciones pueden tener diferentes dimensiones y pue den superponerse total o parcialmente. Las capas o porciones se pueden unir con un adhesivo específico, durante la fabricación, a través de procedimientos propuestos, etc. Por ejemplo, el procedimiento de la invención se puede utilizar para reciclar artículos de plástico mixto con PET que comprenden una capa de PET recubierta por un lado con una capa de aluminio. Como ejemplo particular, el procedimiento de la invención se puede utilizar para reciclar bolsas utilizadas para el envasado de alimentos que comprenden PET laminado con una capa o lámina de aluminio. En otra realización, el procedimiento de la invención puede utilizarse para reciclar un envase flexible para alimentos compuesto por una película de PET recubierta con celulosa nanocristalina. El procedimiento de la invención también se puede utilizar para reciclar envases flexibles como el utilizado para envases farmacéuticos que comprenden varios compo nentes, incluidos PET, papel y aluminio.

Alternativamente, ese tipo de artículos de plástico mixto se pueden formar con una mezcla de PET y fibras o PET imbricado con fibras, tales como fibras de algodón, poliamida o viscosa. Ejemplos de tales artículos de plástico incluyen tejidos y telas.

En otra realización, el procedimiento de reciclaje de la invención se aplica a un artículo de plástico mixto con PET fabricado con una composición que contiene una mezcla de PET y al menos otro polímero. En otra realización, los artículos de plástico mixto con PET objeto se fabrican al menos parcialmente con una resina PET en la que se incluyen partículas metálicas y/o partículas cerámicas y/o partículas de vidrio. En otra realización, el procedimiento de reciclaje de la invención se aplica a artículos de plástico que contienen PET mezclado con acetato de celulosa. En otra realiza ción, el procedimiento de reciclaje de la invención se aplica a artículos de plástico que contienen resina PET imbricada con fibras tejidas o no tejidas. La resina también puede contener polímeros adicionales, incluyendo otro poliéster y/o poliamida y/o poliolefina y/o polímero de vinilo.

En una realización particular, los artículos de plástico mixto con PET comprenden dos componentes adicionales. Ven tajosamente, uno de los componentes adicionales es un polímero, preferentemente seleccionado a partir de poliésteres, poliamidas y poliolefinas, y el segundo componente adicional es un compuesto metálico, preferentemente alumi nio. Por ejemplo, el procedimiento de la invención se puede usar para reciclar un artículo de plástico mixto con PET que contiene una mezcla y/o capas sucesivas de PET, polietileno tal como LDPE y aluminio. A modo de otro ejemplo, el procedimiento de la invención se puede usar para reciclar un artículo de plástico mixto con PET que contiene una mezcla y/o capas sucesivas de PET, polipropileno y aluminio.

Despolimerasas

Los inventores han desarrollado un procedimiento de reciclaje que permite degradar el PET contenido en artículos de plástico mixto con PET, para recuperar monómeros y/u oligómeros del mismo.

De acuerdo con la invención, se pueden usar despolimerasas particulares para implementar el procedimiento de reci claje. Más particularmente, se puede utilizar una cutinasa, una lipasa y/o una esterasa. En una realización preferida, la despolimerasa es una cutinasa, preferiblemente seleccionada a partir de Thermobifida cellulosityca, Thermobifida halotolerans, Thermobifida fusca, Thermobifida alba, Bacillus subtilis, Fusarium solani pisi, Humicola insolens y Thielavia terrestris. En otra realización, la cutinasa se selecciona a partir de un banco metagenómico.

Ventajosamente, los artículos de plástico mixto con PET se ponen en contacto con la enzima, que puede ser natural o sintética. Por ejemplo, la enzima se puede producir mediante técnicas recombinantes, o se puede aislar o purificar a partir de fuentes naturales, cuando se produce de forma natural, o se puede producir artificialmente.

La enzima puede estar en forma soluble, o en fase sólida tal como en forma de polvo. En particular, puede unirse a membranas celulares o vesículas lipídicas, o a soportes sintéticos como vidrio, plástico, polímeros, filtros, membranas, por ejemplo, en forma de perlas, columnas, placas y similares.

La enzima está preferentemente en forma aislada o purificada. Preferiblemente, las enzimas de la invención se expre san, obtienen, secretan, aíslan o purifican a partir de microorganismos. Las enzimas pueden purificarse mediante técnicas conocidas por sí mismas en la técnica y se pueden almacenar mediante técnicas convencionales. Las enzi mas pueden modificarse adicionalmente para mejorar, por ejemplo, su estabilidad o actividad.

Por ejemplo, las enzimas se formulan con componentes estabilizantes y/o solubilizantes, como agua, glicerol, sorbitol, dextrina, incluyendo maltodextrina y/o ciclodextrina, almidón, propanodiol, sal, etc.

En otra realización, los artículos de plástico mixto que se van a reciclar se ponen en contacto con un microorganismo que sintetiza y excreta la despolimerasa. En el contexto de la invención la enzima puede ser excretada en el medio de cultivo o hacia la membrana celular del microorganismo, en donde dicha enzima puede estar anclada.

Dicho microorganismo puede sintetizar de forma natural la despolimerasa, o puede ser un microorganismo recombi nante, en el que se ha insertado una secuencia de nucleótidos recombinante que codifica la despolimerasa, utilizando, por ejemplo, un vector.

Por ejemplo, una molécula de nucleótidos que codifica la despolimerasa de interés se inserta en un vector, por ejemplo, plásmido, virus recombinante, fago, episoma, cromosoma artificial y similares.

Ventajosamente, la molécula de nucleótidos está bajo el control de un promotor específico. A continuación, el vector se transfecta en microorganismos hospedadores para formar microorganismos recombinantes. Los hospedadores se cultivan adicionalmente en condiciones de cultivo adecuadas de los hospedadores para obtener así células recombi nantes que contienen la enzima de la presente invención. Las condiciones de cultivo adecuadas para el hospedador son bien conocidas por los expertos en la técnica.

La molécula de nucleótidos de la invención puede estar en forma aislada o purificada y estar preparada, aislada y/o manipulada mediante técnicas conocidas por si mismas en la técnica, por ejemplo, clonación y expresión de bancos de ADNc, amplificación, síntesis enzimática o tecnología recombinante. La molécula de nucleótidos también se puede sintetizar in vitro mediante técnicas de síntesis química bien conocidas. Las moléculas de nucleótidos de esta inven ción pueden comprender secuencias de nucleótidos adicionales, tales como regiones reguladoras, es decir, promoto res, potenciadores, silenciadores, terminadores y similares que pueden usarse para causar o regular la expresión de la enzima en una célula o sistema hospedador seleccionado.

Los microorganismos recombinantes pueden usarse directamente. Alternativamente o además, las enzimas recombi nantes pueden purificarse desde el medio de cultivo. Cualquier medio de separación/purificación comúnmente usado, tal como la eliminación de sales, la filtración en gel, la cromatografía de interacción hidrófoba o la cromatografía de intercambio iónico, puede usarse para este fin.

En realizaciones particulares, pueden usarse microorganismos conocidos por sintetizar y excretar despolimerasas de interés. Por ejemplo, se pueden emplear Asperigillus oryzae, Humicola insolens, Penicillium citrinum, Fusarium so lani y Thermobifida cellulosilytica, que sintetizan y excretan una cutinasa. Del mismo modo, Candida antarctica, Thermomyces lanuginosus, Burkholdería spp y Triticum aestivum sintetizan una lipasa adecuada para despolimerizar el PET.

De acuerdo con la invención, se pueden usar varios microorganismos y/o enzimas purificadas y/o enzimas sintéticas juntas o secuencialmente, para despolimerizar diferentes tipos de polímeros contenidos en un mismo artículo de plás tico mixto con PET o en diferentes artículos de plástico mixto con PET.

Ventajosamente, el microorganismo de la invención presenta un metabolismo modificado para evitar el consumo de los monómeros y/u oligómeros obtenidos a partir de los polímeros degradados. Por ejemplo, el microorganismo es un microorganismo recombinante, en el que las enzimas que degradan dichos monómeros y/u oligómeros se han elimi nado o desactivado. Alternativamente, el procedimiento de la invención puede realizarse en un medio de cultivo que contiene al menos una fuente de carbono utilizable por el microorganismo, de forma que dicho microorganismo con sume preferentemente esa fuente de carbono en lugar de los monómeros y/u oligómeros.

Ventajosamente, los artículos de plástico mixto con PET se ponen en contacto con un medio de cultivo que contiene los microorganismos, glucosa o similares como fuente de carbono, así como una fuente de nitrógeno disponible, in cluida una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo, peptona, extracto de carne, extracto de levadura, licor macerado de maíz) o una fuente de nitrógeno inorgánico (p. ej., sulfato de amonio, cloruro de amonio). Si es necesario, el medio de cultivo puede contener además sales inorgánicas (por ejemplo, iones de sodio, iones de potasio, iones de calcio, iones de magnesio, iones de sulfato, iones de cloro, iones de fosfato). Además, el medio también puede complemen tarse con oligoelementos tales como vitaminas y aminoácidos.

En una realización particular, la despolimerasa se utiliza en condiciones que favorecen su sorción sobre los artículos de plástico mixto con PET, de manera que el PET de los artículos de plástico mixto se despolimeriza más eficiente mente hasta monómeros y/u oligómeros. Más particularmente, la despolimerasa puede ser una enzima mutada que tiene una afinidad mejorada hacia el PET contenido en los artículos de plástico mixto, en comparación con una enzima de tipo silvestre. Alternativamente, la despolimerasa se puede usar con proteínas que se unen al plástico o módulos de unión que mejoran la unión entre la despolimerasa y los artículos de plástico mixto con PET.

En el contexto de la invención, una "proteína que se une a plástico" se refiere a una proteína, sin actividad enzimática, que facilita la adsorción de la despolimerasa sobre un artículo de plástico. Por ejemplo, biotensioactivos como las hidrofobinas, que pueden adsorberse naturalmente a sustancias hidrófobas y a interfaces entre fases hidrófobas (plás tico) e hidrófilas (medio acuoso), o proteínas disruptivas tales como las expansinas y swolleninas que actúan debili tando enlaces tales como los enlaces de hidrógeno entre cadenas poliméricas adyacentes, pueden usarse como pro teína que se une al plástico.

Las swolleninas son proteínas que se han caracterizado por primera vez en el hongo saprofito Trichoderma reesei ("Swollenin, a Trichoderma reesei protein with sequence similarity to the plant expansins, exhibits disruption activity on cellulosic materials". Eur J Biochem 269:4202-4211). La proteína tiene un dominio de la familia 1 del módulo que se une a carbohidratos (CBD) de tipo fúngico N-terminal, con función de unión a celulosa, conectada por una región enlazadora a un dominio similar a una expansina con homología con los alérgenos del polen de gramíneas del grupo 1 (pfam 01357).

Las expansinas están estrechamente relacionadas con proteínas no enzimáticas que se encuentran en las células de varias plantas. Se cree que la expansina promueve la expansión celular y, por lo tanto, el crecimiento celular al permitir el deslizamiento o el movimiento de las cadenas de celulosa, pectina y/o hemicelulosa dentro de las fibras vegetales. Se ha mostrado que las expansinas debilitan los enlaces de hidrógeno entre las fibras de papel reciclado, incluyendo los papeles comerciales, como los papeles estucados de revistas y catálogos, que pueden ser difíciles de reciclar. Las expansinas y las swolleninas actúan debilitando los enlaces, como los enlaces de hidrógeno, entre cadenas poliméri cas adyacentes, lo que facilita la accesibilidad de la despolimerasa hasta el plástico.

La proteína que se une al plástico puede ser producida por el mismo microorganismo que produce la despolimerasa.

Tal y como se usa en este documento, "hidrofobinas" se refiere a pequeñas proteínas fúngicas secretadas que con tienen 8 residuos de cisteína conservados posicionalmente y un parche hidrófobo definido por 4 enlaces disulfuro intramoleculares. Las hidrofobinas se pueden adsorber naturalmente a sustancias hidrófobas y a las interfaces entre una fase hidrófoba (plástica) y una hidrófila (medio acuoso). Más particularmente, las hidrofobinas se ensamblan en estructuras anfifílicas y reducen la energía de la interfaz entre el plástico y la despolimerasa (Takahashi et al., 2005 Mol. Microbiol. 57, 1780-1796; Espino-Rammer et al., 2013 AEM 79, 4230-4238). Preferiblemente, las hidrofobinas son lo suficientemente rígidas para mantener expuesto el parche hidrófobo cuando se fusionan con una proteína (Paananen et al., 2013 Soft Matter 9, 1612-1619).

Preferiblemente, la proteína que se une al plástico es una hidrofobina.

Según la invención, la proteína que se une al plástico no promueve por sí misma la despolimerización, pero es capaz de mejorar la eficacia de la despolimerización facilitando la adsorción de la despolimerasa sobre el artículo de plástico mixto con PET o aumentando su accesibilidad. El uso de una proteína que se une al plástico puede mejorar la despo limerización de un polímero diana en al menos 1,01 veces, por ejemplo, al menos 1,025 veces, al menos 1,05 veces, al menos 1,075 veces, al menos 1,10 veces, al menos 1,25 veces, al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o al menos 20 veces, en comparación con la misma despolimerización sin la proteína que se une al plástico.

Ventajosamente, la proteína que se une al plástico se fusiona con la despolimerasa. Alternativamente, la proteína que se une al plástico puede ser una molécula distinta, simplemente situada junto a la despolimerasa y el artículo de plástico mixto con PET para fijarla a una superficie hidrófoba del artículo de plástico mixto con PET y cooperar con la despolimerasa para promover la degradación del artículo de plástico mixto con PET. La proteína que se une al plástico se puede utilizar simultáneamente con dicha despolimerasa. "Simultáneamente", tal y como se usa en este docu mento, significa administrar al mismo tiempo o sustancialmente al mismo tiempo, es decir, en 30 segundos, un minuto, dos minutos, tres minutos, cuatro minutos o cinco minutos. Alternativamente, la proteína que se une al plástico y la despolimerasa se pueden aplicar secuencialmente. Por ejemplo, la proteína que se une al plástico se puede aplicar primero, seguida de la despolimerasa. En algunas realizaciones, la despolimerasa se administra al menos cinco mi nutos o más después de la administración de la proteína que se une al plástico.

En una realización particular, la despolimerasa comprende un "módulo de unión" que potencia la unión de la despoli merasa al artículo de plástico mixto con PET, en comparación con la despolimerasa sin dicho módulo de unión.

Un "módulo de unión" (BM, por sus siglas en inglés) o "dominio de unión"se refiere a una secuencia de aminoácidos consecutivos de una proteína que mejora la unión de la proteína con un sustrato. En el contexto de la invención, un módulo de unión se refiere más particularmente a un polipéptido que tiene alta afinidad hacia o que se une a un polímero de interés y que se puede conectar con una enzima a través de un enlazador o espaciador flexible. Ventajo samente, el módulo de unión es responsable de la unión a cadenas poliméricas y permite que el sitio activo de la enzima se coordine hacia el artículo de plástico. El módulo de unión también puede alterar parcialmente la estructura del polímero, siendo entonces los enlaces diana más accesibles para el sitio activo de la despolimerasa. Un módulo de unión suele ser capaz de unirse a una variedad de polímeros. El módulo de unión generalmente implica interaccio nes hidrófobas a través de residuos de triptófano o aminoácidos hidrófobos específicos. Según la invención, la despolimerasa puede comprender naturalmente un módulo de unión. Por ejemplo, las (hemi)celulasas y quitinasas de tipo silvestre contienen módulos de unión a carbohidratos, y la poli(ácido hidroxialcanoico) despolimerasa contiene módu los de unión al poliéster. De lo contrario, el módulo de unión puede ser un módulo de unión exógeno fusionado con la despolimerasa de interés para mejorar su sorción y, por lo tanto, la hidrólisis.

En una realización particular, el módulo de unión es un péptido exógeno fusionado con la despolimerasa a través de un enlazador, para promover la sorción de la enzima con el sustrato. La despolimerasa recombinante tiene una activi dad de despolimerización mejorada en comparación con la despolimerasa de tipo silvestre. Por ejemplo, el módulo de unión exógeno mejora la despolimerización de un polímero específico en al menos 1,01 veces, por ejemplo, al menos 1,025 veces, al menos 1,05 veces, al menos 1,075 veces, al menos 1,10 veces, al menos 1,25 veces, al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o al menos 20 veces, en comparación con la misma despolimerización sin módulo de unión. La ingeniería genética para modificar una enzima está documentada y los expertos en la materia pueden implementarla fácilmente.

En una realización particular, la secuencia del módulo de unión puede modificarse adicionalmente para aumentar sus propiedades de unión. Por ejemplo, mutaciones en W68L y W68Y en el módulo de unión de la cutinasa de Thermobifida fusca fusionado con el módulo de unión a carbohidratos de la celulosa CenA de Cellulomonas fimi, mejora 1,5 veces la despolimerización de PET en comparación con el tipo silvestre (Zhang et al., 2013 Carbohydrate Polymers 97, 124-129).

En una realización adicional, el procedimiento implica una despolimerasa recombinante que muestra un sitio activo y/o un sitio de unión mutado. En particular, el sitio activo puede ampliarse en comparación con la enzima de tipo silvestre para potenciar la actividad catalítica de la enzima. Ventajosamente, el sitio activo de la despolimerasa se puede ampliar mediante mutagénesis dirigida al sitio, para adaptarlo mejor a una cadena polimérica más grande. Por ejemplo, una cutinasa de Fusarium sotanípisicon mutaciones en L81A o L189A aumenta 4 y 5 veces respectivamente la despolimerización de PET, en comparación con la enzima de tipo silvestre; y la mutación en L182A permite incre mentar 2 veces la despolimerización de PA6,6 (Araujo et al., 2007 Journal of Biotechnology 128, 849-857).

En caso contrario o además, los aminoácidos situados en la superficie de la despolimerasa y especialmente los cer canos al sitio activo de la enzima también pueden mutarse para mejorar la adsorción de dicha enzima a los artículos de plástico. Tales mutaciones aumentan ventajosamente las interacciones hidrófobas y disminuyen la carga positiva superficial. Un potencial electrostático neutro en la superficie de la región unida al plástico, puede ser favorable para la despolimerización.

En una realización particular, la despolimerasa recombinante puede combinar dos o más mutagénesis dirigidas al sitio. Por ejemplo, el doble mutante Q132A/T101A de la cutinasa Tfu_0883 de Thermobifida fusca con un sitio activo más amplio y mayor hidrofobicidad (Silva et al., 2011 Biotech. J. 6, 1230-1239), puede implementarse ventajosamente en el procedimiento de la invención para la despolimerización de PET.

Parámetros del procedimiento de reciclaje

De acuerdo con la invención, los artículos de plástico mixto con PET pueden reciclarse poniendo en contacto dichos artículos de plástico con una despolimerasa particular y/o con un microorganismo que sintetiza y excreta esa enzima en condiciones que permiten la degradación del PET.

En una realización particular, el artículo de plástico mixto con PET se puede tratar previamente antes de ponerlo en contacto con la despolimerasa para cambiar físicamente su estructura, para aumentar la superficie de contacto entre los polímeros y las enzimas y/o disminuir la carga microbiana proveniente de los desechos. Por ejemplo, el artículo de plástico mixto con PET puede transformarse en una emulsión o en polvo, que se añade a un medio líquido que contiene los microorganismos y/o las enzimas. Alternativamente, el artículo de plástico mixto con PET se puede triturar, granu lar, peletizar, etc., mecánicamente mediante corte, impacto, trituración, molido, fraccionamiento, trituración criogénica o similar, para reducir la forma y el tamaño del material antes de añadirlo al medio líquido que contiene los microorga nismos y/o las enzimas. El pretratamiento mecánico también puede ser someter a ultrasonidos, una centrifugación, un cizallamiento, un colisop, un homogeneizador de alta presión, una maceración o una licuefacción con un tambor rota torio, una prensa de tornillo, una trituradora de pantalla de disco o una prensa de pistón. Alternativa o adicionalmente, se puede aplicar un pretratamiento térmico. Se puede conseguir con microondas. Ese pretratamiento térmico puede proporcionar una desinfección, pasteurización o esterilización. En otra realización, el artículo de plástico mixto con PET se trata previamente de forma química para modificar su estructura y aumentar la superficie de contacto entre los polímeros y las enzimas. Se puede utilizar una base, un ácido, un disolvente o un líquido iónico. También se puede implementar una ozonización. En una realización particular, los artículos de plástico también se pueden clasificar, lavar, desinfectar, esterilizar y/o limpiar biológicamente antes de la degradación. Según la invención, se pueden com binar varios pretratamientos.

El tiempo requerido para la degradación de un artículo de plástico mixto con PET puede variar según el artículo de plástico mixto con PET (es decir, la naturaleza y el origen del artículo de plástico, su composición, forma, etc.), el tipo y la cantidad de microorganismos/enzimas utilizados, así como varios parámetros del procedimiento (es decir, tempe ratura, pH, agentes adicionales, etc.). Un experto en la materia puede adaptar fácilmente los parámetros del procedi miento a los artículos de plástico y/o a las despolimerasas.

Ventajosamente, el procedimiento se implementa a una temperatura comprendida entre 20°C y 80°C, más preferen temente entre 25°C y 60°C. Preferiblemente, la temperatura se mantiene entre 25°C y 50°C al menos durante la etapa de despolimerización. Más generalmente, la temperatura se mantiene por debajo de una temperatura de inactivación, que corresponde a la temperatura a la que se inactiva la enzima y/o a la que el microorganismo ya no sintetiza la enzima degradante. Sorprendentemente, los inventores han descubierto que el procedimiento de la invención puede implementarse a una temperatura por debajo de la Tg (es decir, temperatura de transición vítrea) del PET que es superior a 70°C.

Ventajosamente, según la invención, la cantidad añadida de enzima para la etapa de despolimerización es como máximo el 5% en peso de los artículos de plástico, preferentemente como máximo el 1%, más preferentemente como máximo el 0,1%, y aún más preferentemente como máximo el 0,05%. Ventajosamente, la cantidad añadida de enzima de degradación está en un intervalo de 0,001% a 5% en peso del artículo plástico, preferiblemente en un intervalo de 0,001% a 1%, más preferiblemente en un intervalo de 0,001% a 0,1%, aún más preferiblemente en un intervalo de 0,001% a 0,05%.

El pH del medio puede estar en el intervalo de 4 a 10. Ventajosamente, el pH se ajusta de acuerdo con la pareja de polímero/enzima objetivo y la solubilidad del monómero objetivo para mejorar la eficiencia del procedimiento. Más particularmente, el pH se ajusta para que se mantenga en el pH óptimo de la enzima. De hecho, la despolimerización de los poliésteres y poliamidas produce monómeros y oligómeros ácidos que inducen una disminución del pH. Se puede usar una adición de un álcali diluido para compensar esa acidificación y mantener el pH en el nivel óptimo.

En una realización particular, el procedimiento se realiza bajo agitación violenta, preferentemente comprendida entre 100 rpm y 5000 rpm, para favorecer el contacto entre la despolimerasa y el producto de plástico y de ese modo la adsorción de la enzima sobre el plástico.

En una realización particular, se añade al medio al menos un agente lipófilo y/o hidrófilo para mejorar la etapa de despolimerización. Se puede añadir al medio un inductor tal como oligómeros de poliésteres o derivados de los mismos para mejorar la producción de enzimas. Se puede añadir al medio un tensioactivo como Tween para modificar la energía de la interfaz entre el polímero y la enzima o el microorganismo y mejorar la eficiencia de la degradación. Se podría usar una sustancia orgánica o un líquido iónico para hinchar el polímero y aumentar su accesibilidad al micro organismo o a la enzima.

Ventajosamente, el procedimiento de la invención se realiza sin ningún acelerador de la degradación. En una realiza ción particular, el procedimiento de la invención se realiza en un líquido de degradación que contiene únicamente la despolimerasa y agua. En una realización particular, el procedimiento de la invención se realiza sin disolvente orgá nico.

El tiempo de reacción para la despolimerización de al menos un polímero del artículo de plástico está ventajosamente comprendido entre 5 y 72 horas. Ese tiempo de reacción puede permitir que la despolimerización avance lo suficiente y no será perjudicial económicamente.

Separación, purificación y reutilización de los monómeros y/u oligómeros recuperados

Los monómeros y/o los oligómeros resultantes de la despolimerización pueden recuperarse secuencial o continua mente. Se puede recuperar un solo tipo de monómero y/u oligómero o varios tipos diferentes de monómeros y/u oligómeros, dependiendo de los polímeros y/o los artículos de plástico mixto con PET de partida.

De acuerdo con la invención, los monómeros preferidos se seleccionan a partir de monoetilenglicol y ácido tereftálico, y los oligómeros preferidos se seleccionan a partir de tereftalato de metil-2-hidroxietilo (MHET), tereftalato de bis(2-hidroxietilo) (BHET), benzoato de 2-hidroxietilo (HEB) y tereftalato de dimetilo (DMT).

Los monómeros y/u oligómeros recuperados pueden purificarse adicionalmente, usando todos los métodos de purifi cación adecuados y acondicionados en una forma repolimerizable. Ejemplos de métodos de purificación incluyen pro cedimiento de extracción, separación mediante solución acuosa, condensación selectiva con vapor, filtración y con centración del medio después del bioprocedimiento, separación, destilación, evaporación al vacío, extracción, electrodiálisis, adsorción, intercambio iónico, precipitación, cristalización, concentración y deshidratación con adición de ácido y precipitación por adición, nanofiltración, tratamiento con catalizador ácido, destilación en modo semicontinuo o des tilación en modo continuo, extracción con disolvente, concentración por evaporación, cristalización por evaporación, extracción líquido/líquido, hidrogenación, procedimiento de destilación azeotrópica, adsorción, cromatografía en co lumna, destilación al vacío simple y microfiltración, combinados o no.

Los monómeros y/u oligómeros repolimerizables se pueden volver a utilizar para sintetizar polímeros. Ventajosamente, se repolimerizan polímeros de la misma naturaleza. Sin embargo, es posible mezclar los monómeros y/u oligómeros recuperados con otros monómeros y/u oligómeros, para sintetizar nuevos copolímeros.

En una realización particular, la repolimerización se lleva a cabo usando una hidrolasa en condiciones apropiadas para permitir la reacción de polimerización. Se pueden añadir iniciadores a la solución de monómeros/oligómeros para favorecer la reacción de polimerización. Un experto en la materia puede adaptar fácilmente los parámetros del proce dimiento a los monómeros/oligómeros y a los polímeros que se van a sintetizar.

Otros aspectos y ventajas de la invención se describirán en los siguientes ejemplos, que deben considerarse como ilustrativos y no limitativos del alcance de esta solicitud. Lo que sigue a continuación es una descripción de la presente invención, incluyendo las realizaciones preferidas de la misma, proporcionadas en términos generales. La presente invención se ejemplifica adicionalmente en la descripción proporcionada bajo el título "Ejemplos" más adelante, que proporciona datos experimentales que respaldan la invención y los medios para realizar la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

El presente experimento muestra la recuperación de ácido tereftálico y tereftalato de mono(2-hidroxietilo) mediante el tratamiento de artículos de plástico mixto con PET con la cutinasa Thc_Cut1 de Thermobifida cellulosilytica DSM 44535.

Materiales y métodos

Técnicas generales de ADN recombinante

Thermobifida cellulosilytica DSM44535 se obtuvo del Centro Alemán de Recursos para Material Biológico (DSMZ, Alemania). La cepa se conservó sobre placas de agar LB y se cultivó en matraces de agitación de 500 mL (200 mL de medio LB) a 37°C y 160 rpm durante 24 h. Las células se recogieron por centrifugación a 3200 g y 4°C durante 20 min.

Se usó el vector pET26b(+) (Novagen, Alemania) para la expresión de la cutinasa THC_Cut1 de Thermobifida cellu losilytica en Escherichia coli BL21 -Gold (DE3) (Stratagene, Alemania).

El gen Thc_cut1 que codifica la cutinasa se amplificó a partir del ADN genómico de T. cellulosilytica DSM44535 me diante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional. Basándose en la secuencia conocida de los genes que codifican cutinasas procedentes de T. fusca YX (números de registro de Genbank YP_288944 y YP_288943,33) se diseñaron dos cebadores, 5'-CCCCCGCTCATATGGCCAACCCCTACGAGCG-3' (cebador directo - SEQ ID N°1) y 5'-GTGTTCTAAGCTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGGCCAGGCACTGAGAGTAGT-3' (cebador inverso - SEQ ID N° 2), lo que permitió la amplificación del gen respectivo sin péptido señal y la introducción del marcador 6xHis en el extremo C-terminal de la cutinasa. Los cebadores diseñados incluían sitios de restricción de Ndel y HindlII para clonar el gen en el vector pET26b(F). La PCR se realizó con un volumen de 50 pL con ADN genómico como molde, 0,4 pM de cada cebador, dNTPs 0,2 mM, 5 unidades de ADN polimerasa Phusion (Finnzymes) y tampón de reacción IX proporcionado por el proveedor. La PCR se realizó en un termociclador Gene Amp PCR 2200 (Applied Biosystems, EE.UU.). Se realizaron 35 ciclos, cada ciclo con una exposición secuencial de la mezcla de reacción a 98°C (30 s, desnaturalización), 63°C (30 s, apareamiento) y 72°C (30 s, extensión). Los plásmidos y los fragmentos de ADN se purificaron con kits de purificación de ADN de Qiagen (Qiagen, Alemania). Los productos de la PCR amplificados y purificados así obtenidos se digirieron con las endonucleasas de restricción NdeI y HindIII (New England Biolabs, EE.UU.), se desfosforilaron con fosfatasa alcalina (Roche, Alemania) y se ligaron a pET26b(F) con una ADN-ligasa T4 (Fermentas, Alemania) y se transformaron en E. coli BL21-Gold(DE3) de acuerdo con las instruc ciones del fabricante.

La secuencia del gen se determinó mediante una secuenciación del ADN utilizando los cebadores 5'-GAGCGGA-TAACAATTCCCCTCTAGAA-3' (SEQ ID N°3) y 5'-CAGCTTCCTTTCGGGCTTTGT-3' (SEQ ID N°4). El ADN se secuenció como un servicio personalizado (Agowa, Alemania). El análisis y el manejo de las secuencias de ADN se realizaron con Vector NTi Suite 10 (Invitrogen, EE.UU.). Las secuencias de proteínas se alinearon utilizando el pro grama Clustal W (servidor de nodos Swiss EMBnet). La secuencia de nucleótidos del gen aislado se depositó en la base de datos GenBank con el número de registro HQ147786 (Thc_cut2).

Expresión y purificación de la cutinasa

Las células de E. coli BL21-Gold (DE3) recién transformadas se utilizaron para inocular 20 mL de medio LB comple mentado con 40 pg/mL de kanamicina y se cultivaron durante una noche a 37°C y 160 rpm. El cultivo durante la noche se utilizó para inocular 200 mL de medio LB con 40 pg/mL de kanamicina con una DO600=0,1 y se incubó hasta que se alcanzó una DO600=0,6-0,8. Posteriormente el cultivo se enfrió a 20°C y se indujo con IPTG hasta tener una concentración final de 0,05 mM. La inducción se realizó durante 20 h a 20°C y 160 rpm. Las células se recogieron por centrifugación (20 min, 4°C, 3200 g).

El sedimento celular de 200 mL de cultivo celular se resuspendió en 30 mL de tampón de unión (NaH2PO4*2H2O 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM, pH 7,4). Las células resuspendidas se sometieron a ultrasonidos con tres pulsos de 30 s enfriando con hielo (Vibra Cell, Sonics Materials, Meryin/Satigny, Suiza). Los lisados se centrifugaron (30 min, 4°C, 4000 g) y se filtraron a través de una membrana de 0,2 pm. El lisado celular se purificó usando un sistema de purificación Ákta con columnas HisTrap FF (tampón de elución NaH2PO4*2H2O 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 500 mM, pH 7,4). Para la caracterización de la cutinasa, el tampón de elución con marcador His se intercambió con Tris HCl 100 mM pH 7,0 mediante el uso de columnas de desalinización PD-10 (GE Healthcare).

La concentración de proteínas se determinó mediante el kit de ensayo de proteínas de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories GmbH) y seroalbúmina bovina como proteína patrón. Se realizó una SDS-PAGE correspondiente a Laemmli (Laemmli, U. K. Nature 1970, 227 (5259), 680-685) y las proteínas se tiñeron con azul de Coomassie brillante R-250.

Todos los productos químicos eran de Sigma con grado analítico (Alemania).

Hidrólisis de artículos de plástico mixto con PET

Los artículos de plástico mixto con PET se trataron previamente para aumentar la superficie de contacto entre el PET y la enzima. Se molieron mecánicamente en polvo utilizando un molino de corte SM-2000 (Retsch) durante 5 min. El polvo recogido se tamizó a continuación con un tamiz AS 200 (Retsch) durante 10 min, con una amplitud de 1,5 mm para obtener polvo con un tamaño de partícula ente 500 pm y 250 pm. Se utilizaron pruebas de calorimetría diferencial de barrido (DSC) para determinar la temperatura de transición vítrea (Tg) y la cristalinidad del PET en los artículos de plástico con PET, utilizando un aparato Q100 TA-RCS 90 bajo atmósfera de nitrógeno (50 mL/min) con una tasa de barrido de 10°C/min desde -50°C a 300°C en bandejas de aluminio sobre muestras de aproximadamente 8 mg.

En cada muestra, se incubaron 10 mg de producto de plástico con cutinasa 5 pM en 1 mL de tampón KH2PO4/K2HPO4 100 mM, pH 7,0 durante 24 h a 50°C agitando a 300 rpm. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Los controles se realizaron utilizando 1 mL de tampón sin enzima.

Ensayo de ácido tereftálico (TA) y tereftalato de mono(2-hidroxietilo) (MHET)

Después del tratamiento enzimático, las proteínas precipitaron usando metanol absoluto 1:1 (v/v) (Merck) sobre hielo. Las muestras se centrifugaron (Hettich MIKRO 200 R, Tuttlingen, Alemania) a 16.000 g a 0°C durante 15 min. Se introdujeron 500 pL de material sobrenadante en un vial de HPLC y se acidificó añadiendo 3,5 pL de HCl 6 N. La HPLC utilizada era una bomba DIONEX P-580 (Dionex Cooperation, Sunnyvale, EE.UU.), con un inyector de muestras au tomatizado ASI-100 y un detector de matriz de fotodiodos PDA-100. Para el análisis de TA y MHET se utilizó una columna de fase inversa RP-C18 (Discovery HS-C18, 5 pm, 150 x 4,6 mm con precolumna, Supelco, Bellefonte, EE.UU.). El análisis se realizó con agua al 60%, H2SO40,01 N al 10% y metanol al 30% como eluyente, gradual (15 min) hasta metanol al 50% y ácido al 10%, gradual (hasta 20 min) metanol al 90% y ácido, permaneciendo 2 min y luego gradualmente hasta la posición inicial, 5 min después de la ejecución. El caudal se fijó en 1 mL/min y la columna se mantuvo a una temperatura de 25°C. El volumen de inyección era de 10 pL. La detección de TA y MHET se realizó con un detector de matriz de fotodiodos con una longitud de onda de 241 nm.

Resultados

Ejemplo 1A: Reciclado de un artículo de plástico mixto con PET fabricado con PETy poliolefina

Un envase de jamón fabricado con PET y polietileno PE (Herta "tendre noix"®) se hidrolizó para la recuperación de TA. La proporción de PE se estimó en un 8% (p/p). El PET tenía una Tg de 80°C y era semicristalino con un 10% de cristalinidad.

El polvo de PET-PE fue hidrolizado por la cutinasa Thc_Cut1 y el ácido tereftálico se recuperó en solo 24 h (347 ± 19 pM), mientras que en los controles no se detectó ácido tereftálico. De la misma forma se recuperó MHET: 71 ± 3 pM en 24 h.

Ejemplo de referencia 1B: Reciclado de un artículo de plástico mixto con PET fabricado con PET y poliamida

Una botella de agua con gas fabricada con PET y PA (nailon poli(m-xililen adipamida) denominada MXD6) (Perrier®) se hidrolizó para la recuperación de TA. La proporción de PA se estimó en un 8% (p/p). El PET tenía una Tg de 76°C y era semicristalino con un 23% de cristalinidad.

El polvo de PET-PA fue hidrolizado por la cutinasa Thc_Cut1 y el ácido tereftálico se recuperó en solo 24 h (332 ± 7 pM), mientras que en los controles no se detectó ácido tereftálico. De la misma forma se recuperó MHET: 65 ± 2 pM en 24 h.

Ejemplo 1C: Reciclado de un artículo de plástico mixto con PET fabricado con PET y algodón

Se hidrolizó una porción de una prenda de vestir fabricada con PET y algodón para la recuperación de TA. Las pro porciones especificadas eran 65% (p/p) de algodón y 35% (p/p) de ^pE^t.

La fibra de PET-algodón fue hidrolizada por la cutinasa Thc_Cut1 y se recuperó aproximadamente 4 pM de ácido tereftálico en 24 h, mientras que no se detectó ácido tereftálico en los controles. De la misma manera, se recuperó aproximadamente MHET 2 pM en 24 h.

Ejemplo 1D: Reciclado de un artículo de plástico mixto con PET fabricado con PET y lámina de aluminio

Una bolsa de envasado de alimentos fabricada con PET y lámina de aluminio ("Elle et Vire Creme légere épaisse"®) se hidrolizó para la recuperación de TA. La proporción de aluminio se estimó en un 10% (p/p). El PET era semicristalino.

El polvo de PET-aluminio fue hidrolizado por la cutinasa Thc_Cut1 y se recuperó aproximadamente 88 pM de ácido tereftálico en 24 h, mientras que no se detectó ácido tereftálico en los controles. De la misma forma, se recuperó aproximadamente 51 pM de MHET en 24 h.

Ejemplo 1E: Reciclado de varios artículos de plástico mixto con PET

Una mezcla de artículos de plástico mixto con PET utilizados en el Ejemplo 1A (envase a base de PET y PE), 1B (envase a base de PET y PA), 1C (envase a base de PET y aluminio) y 1D (tejido a base de PET y algodón), se hidrolizaron juntos para la recuperación de TA, mediante la cutinasa Thc_Cut1. Se recuperó aproximadamente 780 pM de ácido tereftálico en 24 h, mientras que no se detectó ácido tereftálico en los controles. De la misma forma, se recuperó aproximadamente 200 pM de MHET en 24 h.

Ejemplo de referencia 2

El presente experimento muestra la recuperación de ácido tereftálico y tereftalato de mono(2-hidroxietilo) mediante el tratamiento de una botella de PET que contiene PET y aditivos, con la cutinasa Thc_Cut1 de Thermobifida cellulosilytica DSM 44535.

Las técnicas generales de ADN recombinante, expresión y purificación de la cutinasa son las mismas que en el Ejem plo 1.

Se trataron botellas de PET, que anteriormente contenían agua mineral de la marca Cristalline®. Las botellas enteras fueron tratadas previamente para aumentar la superficie de contacto entre el PET y la enzima. Se molieron mecánica mente en polvo, utilizando un molino de corte SM-2000 (Retsch) durante 5 min. A continuación, el polvo recogido se tamizó con un tamiz AS 200 (Retsch) durante 10 min con una amplitud de 1,5 mm para obtener polvo con un tamaño de partícula de 250 pm. Se utilizaron pruebas de calorimetría diferencial de barrido (DSC) para determinar la tempe ratura de transición vítrea (Tg) y la cristalinidad del PET en el producto de plástico, utilizando un aparato Q100 TA-RCS 90 bajo atmósfera de nitrógeno (50 mL/min) con una tasa de barrido de 10°C/min desde -50°C a 300°C en bandejas de aluminio sobre muestras de aproximadamente 8 mg. El polvo de la botella de PET tenía una Tg de 77,2°C y era semicristalino con un 30% de cristalinidad.

La hidrólisis se realizó en cada muestra del modo siguiente. Se incubaron 10 mg de producto de plástico con cutinasa 5 pM en 1 mL de tampón KH2PO4/K2HPO4 100 mM, pH 7,0 durante 24 h a 60°C agitando a 300 rpm. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Los controles se realizaron utilizando 1 mL de tampón sin enzima.

Resultados

El ácido tereftálico (TA) y el tereftalato de mono(2-hidroxiet¡lo) (MHET) se sometieron a ensayo como en el Ejemplo 1.

La botella de PET fue hidrolizada por la cutinasa Thc_Cut1 y el ácido tereftálico se recuperó en solo 24 h (252 ± 13 pM), mientras que en los controles no se detectó ácido tereftálico. De la misma forma se recuperó MHET: 35 ± 1 pM en 24 h.

Ejemplo de referencia 3

Los artículos de plástico mixto con PET formulados con aditivos se pueden reciclar gracias al procedimiento de la invención. El presente experimento muestra la recuperación de ácido tereftálico mediante el tratamiento de un producto de plástico mixto con PET constituido por PET semicristalino, con mutantes de la cutinasa Thc_Cut2 procedente de Thermobifida cellulosilytica DSM 44535. Esos mutantes múltiples, el mutante doble (DM) Arg29Asn_Ala30Val y el mutante triple (TM) Arg19Ser_Arg29Asn_Ala30Val, tienen propiedades de superficie que mejoran la adsorción de cutinasa sobre el PET y, por lo tanto, aumentan la eficiencia de la despolimerización.

Técnicas generales de ADN recombinante

Se usó el vector pET26b(+) (Novagen, Alemania) para la expresión de la cutinasa THC_Cut2 procedente de Thermo bifida cellulosilytica en Escherichia coli BL21-Gold (DE3) (Stratagene, Alemania).

El gen Thc_cut2 que codifica la cutinasa se amplificó a partir del ADN genómico de T. cellulosilytica DSM44535 me diante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional. Basándose en la secuencia conocida de los genes que codifican cutinasas procedentes de T. fusca YX (números de registro de Genbank YP_288944 y YP_288943,33) se diseñaron dos cebadores, 5'-CCCCCGCTCATATGGCCAACCCCTACGAGCG-3' (cebador directo - SEQ ID N°1) y 5'-GTGTTCTAAGCTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGGCCAGGCACTGAGAGTAGT-3' (cebador inverso - SEQ ID N° 2), lo que permitió la amplificación del gen respectivo sin péptido señal y la introducción del marcador 6xHis en el extremo C-terminal de la cutinasa. Los cebadores diseñados incluían sitios de restricción de Ndel y HindIII para clonar el gen en el vector pET26b(P). La PCR se realizó en un volumen de 50 pL con ADN genómico como molde, 0,4 pM de cada cebador, dNTPs 0,2 mM, 5 unidades de ADN polimerasa Phusion (Finnzymes) y tampón de reacción IX proporcionado por el proveedor. La PCR se realizó en un termociclador Gene Amp PCR 2200 (Applied Biosystems, EE.UU.). Se realizaron 35 ciclos, cada ciclo con una exposición secuencial de la mezcla de reacción a 98°C (30 s, desnaturalización), 63°C (30 s, apareamiento) y 72°C (30 s, extensión). Los plásmidos y los fragmentos de ADN se purificaron con kits de purificación de ADN de Qiagen (Qiagen, Alemania). Los productos de la PCR am plificados y purificados así obtenidos se digirieron con las endonucleasas de restricción NdeI y HindIII (New England Biolabs, EE.UU.), se desfosforilaron con fosfatasa alcalina (Roche, Alemania) y se ligaron a pET26b(P) con una ADN-ligasa T4 (Fermentas, Alemania) y se transformaron en E. coli BL21-Gold(DE3) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Mutagénesis dirigida al sitio de Thc_Cut2

La mutagénesis dirigida al sitio de Thc_Cut2 se llevó a cabo con el kit de mutagénesis dirigida a múltiples sitios de QuikChange (Stratagene), usando pET26b(+)_Thc_cut2 como molde (Herrero Acero et al., 2011 Macromol 44, 4640) y megacebadores que eran portadores de la mutación apropiada (Thc_Cut2_Asn29_Val30.FW - SEQ ID N°5; Thc_Cut2_Asn29_Val30.Rev- SEQ ID N°6; Thc_Cut2_Asn29_Val30_Ser19.FW- SEQ ID N°7 y Thc_Cut2_Asn29_Val30_Ser19.Rev- SEQ ID N°8). Los productos de la PCR se transfirieron a E. co liBL21-Gold (DE3).

Expresión y purificación

Todos los productos químicos eran de grado analítico de Sigma (Alemania).

Hidrólisis de producto de plástico

Se trataron botellas de PET, que anteriormente contenían agua mineral de la marca Cristalline®. Las botellas enteras fueron tratadas previamente para aumentar la superficie de contacto entre el PET y la enzima. Se molieron mecánica mente en polvo, utilizando un molino de corte SM-2000 (Retsch) durante 5 min. A continuación, el polvo recogido se tamizó con un tamiz AS 200 (Retsch) durante 10 min con una amplitud de 1,5 mm para obtener polvo con un tamaño de partícula de 250 pm. Se utilizaron pruebas de calorimetría diferencial de barrido (DSC) para determinar la tempe ratura de transición vítrea (Tg) y la cristalinidad del PET en el producto de plástico, utilizando un aparato Q100 TA-RCS 90 bajo atmósfera de nitrógeno (50 mL/min) con una tasa de barrido de 10°C/min desde -50°C a 300°C en bandejas de aluminio sobre muestras de aproximadamente 8 mg.

El polvo de la botella de PET tenía una Tg de 77,2°C y era semicristalino con un 30% de cristalinidad.

En cada muestra, se incubaron 10 mg de producto de plástico con cutinasa 5 pM en 1 mL de tampón Tris/HCl 100 mM, pH 7,0 durante 24 h a 50°C agitando a 300 rpm. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Los controles se realizaron utilizando 1 mL de tampón sin enzima.

Ensayo con ácido tereftálico (TA)

Después del tratamiento enzimático, las proteínas precipitaron usando metanol absoluto 1:1 (v/v) (Merck) sobre hielo. Las muestras se centrifugaron (Hettich MIKRO 200 R, Tuttlingen, Alemania) a 16.000 g a 0°C durante 15 min. El material sobrenadante para la medición se introdujo en un vial de HPLC y se acidificó añadiendo 3,5 pL de HCl 6 N. La HPLC utilizada era una bomba DIONEX P-580 (Dionex Cooperation, Sunnyvale, EE.UU.), con un inyector de mues tras automatizado ASI-100 y un detector de matriz de fotodiodos PDA-100. Para el análisis de TA y MHET se utilizó una columna de fase inversa RP-C18 (Discovery HS-C18, 5 pm, 150 x 4,6 mm con precolumna, Supelco, Bellefonte, EE.UU.). El análisis se realizó con agua al 60%, H2SO40,01 N al 10% y metanol al 30% como eluyente, gradual (15 min) hasta metanol al 50% y ácido al 10%, gradual (hasta 20 min) metanol al 90% y ácido, permaneciendo 2 min y luego gradualmente hasta la posición inicial, 5 min después de la ejecución. El caudal se fijó en 1 mL/min y la columna se mantuvo a una temperatura de 25°C. El volumen de inyección era de 10 pL. La detección de TA se realizó con un detector de matriz de fotodiodos con una longitud de onda de 241 nm.

Resultado

El polvo de PET se hidrolizó mediante cutinasas recombinantes Thc_Cut2 y el ácido tereftálico se recuperó en solo 24 h, mientras que no se detectó ácido tereftálico en los controles. Los mutantes permitieron una liberación de TA más importante que la cutinasa de tipo silvestre (13 ± 1 pM). Además, el mutante triple era más eficaz que el mutante doble: se obtuvo TA 30 ± 1 pM con el mutante triple en lugar de 25 ± 1 pM con el mutante doble.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para reciclar al menos un artículo de plástico mixto con PET que contiene una mezcla de poli(tereftalato de etileno) (PET) cristalizado y/o semicristalizado y al menos un componente adicional, comprendiendo el método las etapas de

- exponer el artículo de plástico mixto con PET a una despolimerasa capaz de despolimerizar el PET, y - recuperar los monómeros y/u oligómeros de PET

en donde el componente adicional se selecciona a partir de poliolefinas, polímeros de vinilo, polímero de ortoftalaldehído (OPA), policlorotrifluoroetileno (PCTFE), caucho, compuestos metálicos, compuestos minerales, compuestos de vidrio, fibras naturales o sintéticas, papel, madera, compuestos de madera como lignina, celulosa o hemicelulosa, almidón y sus derivados.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en donde el artículo de plástico mixto con PET es un envase, preferi blemente un envase para alimentos o bebidas.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en donde el artículo de plástico mixto con PET se selecciona a partir de fibras, preferiblemente de moquetas, alfombras, telas y tejidos.

4. El procedimiento según la reivindicación 1 a 3, en donde la despolimerasa se selecciona a partir del grupo que consiste en cutinasas, lipasas y esterasas.

5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la despolimerasa es una cutinasa, preferiblemente seleccionada a partir de un banco metagenómico o a partir de un microorganismo que sintetiza una cutinasa, tal como Thermobifida cellulosityca, Thermobifida halotolerans, Thermobifida fusca, Thermobifida alba, Bacillus subtilis, Fusarium solani pisi, Humicola insolens, Thielavia terrestris.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el artículo de plástico mixto con PET comprende capas de cada componente y/o una mezcla de PET y el componente adicional y/o es un material compuesto de PET.

7. El procedimiento según una cualquiera de la reivindicación 1, en donde el componente adicional son fibras naturales o sintéticas seleccionadas a partir de fibras de poliéster, fibras de nailon, fibras de viscosa y fibras de algodón.

8. El procedimiento según la reivindicación 1, en donde el componente adicional se selecciona a partir del grupo que consiste en polietileno (PE), polipropileno (PP), poli(cloruro de vinilo) (PVC), alcohol etilenvinílico (EVOH), polímero de ortoftalaldehído (OPA), poliestireno (PS), policlorotrifluoroetileno (PCTFE), caucho y sus derivados.

9. El procedimiento según la reivindicación 1, en donde el componente adicional es un compuesto metálico seleccio nado a partir de aluminio, óxido de aluminio, titanio, óxido de titanio, níquel y cromo y/o es un compuesto mineral seleccionado a partir de sílice, dióxido de silicio y mica.

10. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende una etapa de trata miento previo del artículo de plástico mixto con PET, antes de la exposición a la despolimerasa, para modificar mecá nica y/o física y/o química y/o biológicamente el artículo de plástico mixto con PET.

11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el procedimiento comprende - una etapa de recuperación de monoetilenglicol (MEG) y/o ácido tereftálico (PTA) y/o tereftalato de metil-2-hidroxietilo (MHET) y/o tereftalato de bis(2-hidroxietilo) (BHET) y/o benzoato de 2-hidroxietilo (HEB) y/o teref talato de dimetilo (DMT), y

- una etapa de reprocesamiento adicional de los monómeros y/u oligómeros para producir polímeros.

12. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde al menos dos polímeros diferentes del artículo de plástico mixto con PET se degradan, simultánea o secuencialmente, y/o al menos dos artícu los de plástico mixto con PET se reciclan, simultánea o secuencialmente.

13. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el contenido en PET en el artículo de plástico mixto con PET se selecciona desde el 5% en peso a menos del 100% en peso, preferiblemente desde el 10% al 95% en peso.

14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el contenido en PET en el artículo de plástico mixto con PET representa más del 50% en peso del peso total del artículo de plástico mixto con PET.

15. Un método para producir monómeros y/u oligómeros a partir de un artículo de plástico mixto con PET que contiene poli(tereftalato de etileno) (PET) y al menos un componente adicional, que comprende exponer el artículo de plástico mixto con PET a una despolimerasa capaz de despolimerizar el PET, y recuperar los monómeros y/u oligómeros de PET, en donde el componente adicional se selecciona a partir de poliolefinas, polímeros de vinilo, polímero de ortoftalaldehído (OPA), policlorotrifluoroetileno (PCTFE), caucho, compuestos metálicos, compuestos minerales, compues tos de vidrio, fibras naturales o sintéticas, papel, madera, compuestos de madera como lignina, celulosa o hemicelulosa, almidón y derivados de los mismos.