CN111542603B - 新型蛋白酶及其用途 - Google Patents

新型蛋白酶及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN111542603B
CN111542603B CN201880082799.XA CN201880082799A CN111542603B CN 111542603 B CN111542603 B CN 111542603B CN 201880082799 A CN201880082799 A CN 201880082799A CN 111542603 B CN111542603 B CN 111542603B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protease
polyester
seq
amino acid
host cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201880082799.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN111542603A (zh
Inventor
A·马蒂
S·迪奎斯内
M·吉谢尔
M·盖鲁特
I·安德烈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Carbios SA
Original Assignee
Carbios SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carbios SA filed Critical Carbios SA
Publication of CN111542603A publication Critical patent/CN111542603A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111542603B publication Critical patent/CN111542603B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
    • Y02W30/00—Technologies for solid waste management
    • Y02W30/50—Reuse, recycling or recovery technologies
    • Y02W30/62—Plastics recycling; Rubber recycling

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
  • Biological Depolymerization Polymers (AREA)

Abstract

本发明涉及新型蛋白酶，更具体地涉及与SEQ ID No:1的蛋白酶相比具有改进的活性的蛋白酶变体，及其用于降解含聚酯材料，诸如塑料制品的用途。本发明的蛋白酶特别适合于降解聚乳酸和含聚乳酸材料。

Description

新型蛋白酶及其用途
技术领域
本发明涉及新型蛋白酶，更特别地涉及与亲本蛋白酶相比，具有改进的活性的蛋白酶，及其用于降解聚酯或含聚酯材料(诸如塑料制品)的用途。本发明的蛋白酶特别适用于降解乳酸和含聚乳酸材料。
背景技术
蛋白酶能够催化多种聚合物(包括聚酯)的水解反应。在这方面，蛋白酶已在许多工业应用中显示出令人鼓舞的效果，包括作为用于洗碗和洗衣应用的洗涤剂、作为用于加工生物质和食品的降解酶、作为对环境污染物进行解毒的生物催化剂、或用于处理纺织工业中聚酯织物的蛋白酶。同样，蛋白酶作为用于水解乳酸(PLA)的降解酶的用途特别引人关注。实际上，PLA是可用于许多技术领域的生物基聚合物(即衍生自天然和/或可再生资源的聚合物)，诸如柔性和刚性包装、袋、覆盖膜，以及用于制造衣服和地毯。因此，PLA在垃圾填埋场的积累成为日益严重的生态问题。
在蛋白酶中，丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)是裂解蛋白质中肽酰胺键的酶，其中丝氨酸充当酶活性位点的亲核氨基酸。在真核生物和原核生物中均普遍发现丝氨酸蛋白酶。许多细菌丝氨酸蛋白酶最初是在芽孢杆菌中鉴定出的，后来在其他嗜温宿主中鉴定出。但是，已经有越来越多的丝氨酸蛋白酶从嗜热和超嗜热细菌被分离出。
生物降解，更特别是酶降解，被认为是减少塑料废料积累的有意义的解决方案。实际上，酶能够加速含聚酯材料(更特别是塑料制品)的水解，甚至降解到单体水平。此外，可以将水解产物(即单体和低聚物)作为用于合成新聚合物的材料进行再回收。最近，已经开发出整合生物实体的新型塑料材料，该生物实体适于降解该塑料材料中的至少一种聚合物，从而制备出可生物降解塑料制品。例如，已经制备出由PLA制成并包括蛋白酶的塑料制品。该可生物降解的塑料至少可以部分解决塑料在垃圾填埋场和自然栖息地中积累的问题。
对此，已经鉴定了几种蛋白酶为候选降解酶。例如，马杜拉放线菌属(Actinomadura sp.)的蛋白酶(WO 2016/062695)已被描述了其降解聚酯(特别是聚乳酸)的能力。
但是，仍然需要具有改进的活性的蛋白酶，以允许进行更高效的降解工艺，从而使生物可降解塑料制备工艺、生物聚酯降解工艺和/或生物循环工艺的竞争力提高。
发明内容
本发明提供了蛋白酶的新变体，其与亲本或野生型蛋白酶相比，表现出提高的聚酯降解活性。这些蛋白酶在用于降解聚酯和/或含聚酯塑料材料和制品(诸如PLA或含聚乳酸(PLA)塑料材料和制品)的工艺中特别有效。更特别地，本发明提供了马杜拉放线菌属的蛋白酶的变体，该蛋白酶具有如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，其在本文中称为亲本蛋白酶或野生型蛋白酶。有趣的是，野生型蛋白酶和其变体都被认为是枯草杆菌蛋白酶样(subtilisin-like)蛋白酶。本发明进一步提供了使用本发明的变体降解聚酯和/或含聚酯塑料材料和制品(更特别是聚乳酸(PLA)和/或含PLA塑料材料和制品)的方法。
在这方面，本发明的一个目的是提供蛋白酶变体，其(i)与SEQ ID No:1所示的全长氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性，且(ii)具有在选自S101、S103、T106、G131、或G133的位置的至少一种氨基酸取代，其中所述位置通过参考SEQID No:1所示的氨基酸序列来编号，且(iii)与SEQ ID No:1的蛋白酶相比，表现出提高的聚酯降解活性。
在一个具体实施方案中，该蛋白酶包含至少一种选自下组的取代：S101F/L/M/W/Y、S103L、T106I/L、G131I、或G133K，优选地至少一种选自S101F/L/M/W/Y的取代，更优选地至少所述取代S101F。
本发明的另一目的是提供蛋白酶变体，其(i)与SEQ ID No:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；且(ii)具有在选自S101F/L/M/W/Y、S103L、T106I/L、G131I、或G133K的位置的至少一种氨基酸取代，其中所述位置通过参考SEQ ID No:1所示的氨基酸序列来编号，优选至少选自S101F/L/M/W/Y的取代，更优选至少所述取代S101F，且(iii)与SEQ ID No:1蛋白酶相比，表现出提高的聚酯降解活性。
本发明的另一目的是提供蛋白酶，其(i)与SEQ ID No:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，且(ii)至少具有在位置S101和S103的氨基酸取代，其中所述位置通过参考SEQ ID No:1所示的氨基酸序列来编号，且(iii)与SEQ ID No:1蛋白酶相比，表现出提高的聚酯降解活性。在此情况下，取代优选选自S101F/L/M/W/Y和S103L。
更特别地，本发明提供特定蛋白酶，其与SEQ ID No:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，且至少具有选自以下的取代的组合：S101F+S103L、S101F+T106I、T106I+G133K、S101F+S103L+T106I、S101F+S103L+G133K、S101F+T106I+G133K、S101F+S103L+T106L、S101F+S103L+T106I+G133K、S101F+S103L+T106I+G131I，优选S101F+S103L+T106I/L。
本发明的另一目的是提供编码如上定义的蛋白酶的核酸。本发明还涉及包含所述核酸的表达盒或表达载体，并涉及包含所述核酸、表达盒、或载体的宿主细胞。
本发明的另一目的是提供制备如上定义的蛋白酶的方法，其包括：
(a)在适于表达编码所述蛋白酶的核酸的条件下，培养如上定义的宿主细胞；和任选地
(b)从所述细胞培养物中回收所述蛋白酶。
本发明还涉及降解含有至少一种聚酯(优选PLA)的塑料制品的方法，其包括：
(a)使所述塑料制品与如上定义的蛋白酶或宿主细胞接触，从而降解所述塑料制品；和任选地
(b)回收单体和/或低聚物，优选乳酸(LA)的单体和/或低聚物。
本发明还涉及含聚酯材料，其包含根据本发明的蛋白酶或宿主细胞。更优选地，本发明涉及含聚乳酸(PLA)材料，其包含根据本发明的蛋白酶或宿主细胞或组合物。本发明还提供制备该含聚酯材料的方法，其包括将聚酯(优选PLA)与根据本发明的蛋白酶或宿主细胞或组合物混合的步骤，其中所述混合步骤在所述聚酯处于部分或完全熔融状态的温度下，优选在挤出工艺期间进行。
本发明还涉及如上所述的蛋白酶用于降解含聚酯材料，更优选含PLA材料的用途。
附图说明
图1A&1B&1C显示了在45℃孵育5小时后，基于野生型蛋白酶(SEQ ID No:1–图1A)和本发明的蛋白酶(V8-图1B和V19-图1C)的固体形式的乳蛋白降解的比蛋白酶活性。
具体实施方式
定义
参考以下定义，以最佳地理解本公开。
在本文中，术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”、“酶”是指通过肽键连接的氨基酸链，而与形成所述链的氨基酸数目无关。本文中的氨基酸，按照下述命名法，由一个字母或三个字母的代码表示：A：丙氨酸(Ala)；C：半胱氨酸(Cys)；D：天冬氨酸(Asp)；E：谷氨酸(Glu)；F：苯丙氨酸(Phe)；G：甘氨酸(Gly)；H：组氨酸(His)；I：异亮氨酸(Ile)；K：赖氨酸(Lys)；L：亮氨酸(Leu)；M：蛋氨酸(Met)；N：天冬酰胺(Asn)；P：脯氨酸(Pro)；Q：谷氨酰胺(Gln)；R：精氨酸(Arg)；S：丝氨酸(Ser)；T：苏氨酸(Thr)；V：缬氨酸(Val)；W：色氨酸(Trp)；和Y：酪氨酸(Tyr)。
术语“蛋白酶”是指根据酶命名法属于EC 3.4类水解酶的酶，其能够催化肽或蛋白质中肽键的水解。术语“丝氨酸蛋白酶”是指根据酶委员会的命名法分类为EC 3.4.21的蛋白酶。
术语“野生型蛋白”或“亲本蛋白”可互换使用，并且是指自然出现的非突变形式的多肽。亲本蛋白酶的一个示例是具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列的蛋白酶。
术语“突变”和“变体”可互换使用，并且是指衍生自野生型或亲本多肽并在一个或多个位置包含至少一种修饰或改变(即取代、插入和/或缺失)的多肽。可以通过本领域公知的各种技术获得变体。特别地，用于改变编码野生型蛋白的DNA序列的技术的示例包括但不限于：定点诱变、随机诱变和合成寡核苷酸构建。因此，本文所用的相对于具体位置的术语“修饰”和“改变”，是指与野生型蛋白中该具体位置的氨基酸相比，至少该具体位置的氨基酸已被修饰。
“取代”是指氨基酸残基被另一氨基酸残基替代。优选地，术语“取代”是指氨基酸残基被选自天然存在的标准的20种氨基酸残基、罕见天然存在的氨基酸残基(例如羟脯氨酸、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-乙基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、别异亮氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、焦谷氨酰胺、氨基丁酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸)和通常是合成制备的非天然存在的氨基酸残基(例如环己基丙氨酸)的另一个替换。优选地，术语“取代”是指氨基酸残基被选自天然存在的标准的20种氨基酸残基(G、P、A、V、L、I、M、C、F、Y、W、H、K、R、Q、N、E、D、S和T)的另一个替换。符号“+”表示取代的组合。在本文中，使用以下术语指定取代：Y167R表示亲本序列第167位的氨基酸残基酪氨酸(Y)被精氨酸(R)取代。Y167V/I/M表示亲本序列第167位的氨基酸残基酪氨酸(Y)被以下氨基酸之一取代：缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或蛋氨酸(M)。该取代可以是保守或非保守取代。保守取代的示例包括碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺和苏氨酸)、疏水性氨基酸(蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)。
除非另有说明，本申请中公开的位置通过参考SEQ ID No:1所示的氨基酸序列来编号。
在本文中，术语“序列同一性”或“同一性”是指两个多肽序列之间的匹配(相同的氨基酸残基)的数目(或分数，表示为百分比％)。当进行比对以使重叠和同一性最大化而同时使序列缺口最小化时，通过比对序列来确定序列同一性。特别地，可以通过使用多种数学的整体或局部比对算法中的任何一种来确定序列同一性，这取决于这两个序列的长度。优选使用整体比对算法(例如Needleman和Wunsch算法；Needleman和Wunsch，1970)对相似长度的序列进行比对，其在整个长度上最优地比对序列，而优选使用局部比对算法(例如Smith和Waterman算法(Smith和Waterman，1981)或Altschul算法(Altschul等，1997；Altschul等，2005)对实质上不同长度的序列进行比对。为了确定氨基酸序列同一性百分数，可以通过各种本领域技术范围内的方法来实现比对，例如，使用可为公众获得的计算机软件，该软件可从互联网网站(诸如http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)获得。本领域技术人员可以确定适用于测量比对的参数，包括使所比较的序列全长实现最大程度比对所需的任何算法。为了本文的目的，％氨基酸序列同一性值是指使用配对序列比对程序EMBOSS Needle生成的值，该程序使用Needleman-Wunsch算法建立两个序列的最优整体比对，其中所有检索参数均设置为默认值，即得分矩阵＝BLOSUM62，缺口开放＝10，缺口延伸＝0.5，结尾缺口罚分＝错误，结尾缺口开放＝10，结尾缺口延伸＝0.5。
术语“重组”是指通过通过基因工程化制备的核酸构建体、载体、多肽、或细胞。
如本文所用，术语“表达”是指涉及制备多肽的任何步骤，诸如转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、或分泌。
根据本发明，“低聚物”是指含有2-约20个单体的分子。
在本说明书中，“聚酯”涵盖聚乳酸(PLA)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸乙二醇异山梨酯(PEIT)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)、丁二酸丁二醇酯-己二酸丁二醇酯共聚物(PBSA)、己二酸丁二醇酯-对苯二甲酸丁二醇酯共聚物(PBAT)、聚呋喃二羧酸乙二醇酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、或聚(己二酸乙二醇酯)(PEA)，以及这些聚合物的任何共混物/混合物。在具体实施方案中，“聚酯”还涵盖聚乙醇酸(PGA)、或聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，以及这些聚合物的任何共混物/混合物。
在本发明范围内，“含聚酯材料”或“含聚酯制品”是指包含至少一种呈结晶、半结晶或完全无定形形式的制品，诸如塑料制品。在一个具体实施方案中，含聚酯材料是指任何的由至少一种塑料材料制成的物品，诸如塑料的片、管、棒、型材、模型、膜、大块、纤维、纺织品等，其含有至少一种聚酯，和可能的其他物质或添加剂，诸如增塑剂、矿物填料或有机填料。在另一具体实施方案中，含聚酯材料是指包含至少一种聚酯的纺织品、织物或纤维。在另一具体实施方案中，含聚酯材料是指包含至少一种聚酯的塑料废料或纤维废料。在另一具体实施方案中，含聚酯材料是指处于熔融或固态的适于制造塑料制品的塑料混配物或塑料制剂。
在本发明范围内，术语“提高的降解活性”表示与SEQ ID No:1的蛋白酶相比，酶降解聚酯(优选PLA)或包含至少一种聚酯(优选至少PLA)的塑料制品或材料的能力提高。与亲本蛋白酶相比，该提高典型地为约5％、10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％、500％或更高。
蛋白质的活性可以由本领域技术人员根据本领域本身已知的方法来评估。例如，可以通过测量比蛋白酶活性速率、测量pNA(N-琥珀酰基-Ala-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺)的水解、测量特定聚酯的解聚活性速率、测量对分散在琼脂平板中的固态聚酯混配物或蛋白质的降解速率、测量含聚酯乳剂的浊度降低、或测量反应器中特定聚酯的解聚活性速率来评估活性。
在本发明范围内，针对目标聚酯的术语“比降解活性”表示当使含有所述目标聚酯的塑料制品与根据本发明的蛋白酶接触时，在合适的温度、pH和缓冲液条件下，每小时和每毫克酶释放的单体和/或低聚物(以毫克计)的初始速率。例如，PLA的比降解活性相当于每小时和每毫克酶产生的乳酸和乳酸二聚体的毫克数，或相当于每分钟和每毫克酶产生的水解PLA的毫摩尔数，其通过水解曲线的线性部分确定。
新型蛋白酶
通过研究与目前可用的酶相比具有提高的聚酯降解活性的新型蛋白酶，发明人进一步研究了具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的丝氨酸蛋白酶，并且已经能够开发出表现出改进的聚酯降解活性的变体。特别地，发明人已经鉴定该蛋白质内的特定氨基酸残基，其能够与聚酯底物接触并其可以有利地被修饰来促进聚酯底物与所述蛋白质的接触。不受理论的束缚，据信这种修饰提高了蛋白酶在聚酯上的吸附性，从而改进降解活性。因此，本发明人能够开发出衍生自SEQ ID NO:1的新型蛋白酶，其显示出更高的活性，并且特别适合于降解聚酯或含聚酯制品。有趣的是，这些新型蛋白酶具有工业工艺上的优异性能。在可进行可降解塑料制品的工业化生产和/或可获得塑料制品的环境降解的条件下，新开发的蛋白酶表现出改进的活性。
根据一个实施方案，蛋白酶是SEQ ID NO:1的蛋白酶的变体，其与SEQ ID NO:1所示的全长氨基酸序列相比具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，且其具有在选自S101、S103、T106、G131或G133的位置的至少一种取代，其中所述位置通过参考SEQID NO:1所示的氨基酸序列来编号。
只要所得多肽保持蛋白酶活性，目标氨基酸可潜在地被任何氨基酸替代，该氨基酸选自天然存在的氨基酸残基、稀有的天然存在的氨基酸残基和非天然存在的氨基酸残基。优选地，目标氨基酸可以被19种其它氨基酸中的任一种替代。
或者或另外地，本发明的蛋白酶(i)与SEQ ID NO:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，且(ii)具有在选自S101F/L/M/W/Y、S103L、T106I/L、G131I或G133K的位置的至少一种氨基酸取代，其中所述位置通过参考SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列来编号，优选至少选自S101F/L/M/W/Y的取代，更优选至少所述取代S101F，且(iii)与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，表现出提高的聚酯降解活性。以下所有限定均可应用于两个实施方案。
在一个具体实施方案中，与SEQ ID NO:1相比，该蛋白酶变体包含在选自S101、S103、T106、G131、或G133的位置，优选在位置S101或S103的单个取代。优选地，蛋白酶变体包含选自S101F/L/M/W/Y、S103L、T106I/L、G131I或G133K，更优选地选自S101F或S103L的单个取代。
在一个具体实施方案中，该蛋白酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，但取代S101F(V1)、S103L(V2)、T106I(V3)、G131I(V4)、G133K(V5)、S101L(V14)、S101M(V15)、S101W(V16)、S101Y(V17)或T106L(V18)除外。
在另一具体实施方案中，与SEQ ID NO:1相比，该蛋白酶变体包含两种或更多种取代，其中至少一种取代在选自S101、S103、T106、G131或G133的位置。在一个优选实施方案中，该变体包含在位置S101、S103或T106的至少一种取代。在一个具体实施方案中，该蛋白酶变体包含选自S101F/L/M/W/Y、S103L、T106I/L、G131I或G133K的至少一种取代。优选地，该蛋白酶变体至少包含取代S101F、S103L或T106I/L。
在另一具体实施方案中，该蛋白酶变体包含在选自S101、S103、T106、G131或G133的位置的至少两种取代。有利地，该蛋白酶变体包含选自S101F/L/M/W/Y、S103L、T106I/L、G131I或G133K的至少两种取代。
或者或另外地，本发明的蛋白酶(i)与SEQ ID NO:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，且(ii)至少具有在位置S101和S103的氨基酸取代，其中该位置通过参考SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列来编号，且(iii)与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，表现出提高的聚酯降解活性。有利地，该取代选自S101F/L/M/W/Y和S103L，优选由S101F和S103L组成。
在一个具体实施方案中，该蛋白酶具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，但选自S101F/L/M/W/Y+S103L的取代的组合除外。
或者或另外地，本发明的蛋白酶(i)与SEQ ID NO:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，且(ii)至少具有在位置S103和T106的氨基酸取代，其中该位置通过参考SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列来编号，且(iii)与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，表现出提高的聚酯降解活性。有利地，该取代选自S103L和T106I/L。
或者或另外地，本发明的蛋白酶(i)与SEQ ID NO:1所示的全长氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，且(ii)至少具有在位置S101和T106的氨基酸取代，其中该位置通过参考SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列来编号，且(iii)与SEQID NO:1的蛋白酶相比，表现出提高的聚酯降解活性。有利地，该取代选自S101F/L/M/W/Y和T106I/L，优选由S101F和T106I/L组成。
或者或另外地，本发明的蛋白酶(i)与SEQ ID NO:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，且(ii)至少具有在位置T106和G133的氨基酸取代，其中该位置通过参考SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列来编号，且(iii)与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，表现出提高的聚酯降解活性。有利地，该取代选自T106I/L和G133K。
在一个具体实施方案中，该蛋白酶包含选自S101F+S103L、S101F+T106I、T106I+G133K的至少两种取代，优选至少S101F+S103L的组合。
在一个具体实施方案中，该蛋白酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，但选自以下的取代的组合除外：S101F+S103L(V6)、S101F+T106I(V7)、S103L+T106L、和T106I+G133K(V9)，优选S101F+S103L的组合。
在一个具体实施方案中，该蛋白酶包含在选自S101、S103、T106、G131或G133的位置的至少三种取代。有利地，该蛋白酶变体包含选自S101F/L/M/W/Y、S103L、T106I/L、G131I或G133K的至少三种取代。根据一个具体实施方案，该蛋白酶变体包含在位置S101+S103+G133，优选S101F+S103L+G133K的至少三种取代。根据另一具体实施方案，该蛋白酶变体包含在位置S101+T106+G133，优选S101F+T106I+G133K的至少三种取代。在一个具体实施方案中，该蛋白酶变体包含在位置S101+S103+T106，优选S101F+S103L+T106I/L的至少三种取代。
根据一个具体实施方案，该蛋白酶至少包含选自以下的取代的组合：S101F+S103L+G133K、S101F+S103L+T106I、S101F+T106I+G133K、S101F+S103L+T106L，优选S101F+S103L+T106I或S101F+S103L+T106L。
在一个具体实施方案中，该蛋白酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，但以下的取代的组合除外：S101F+S103L+G133K(V10)、S101F+S103L+T106I(V8)、S101F+T106I+G133K(V11)或S101F+S103L+T106L(V19)。
根据一个具体实施方案，该蛋白酶至少包含选自以下的取代的组合：S101F+S103L+T106I+G133K或S101F+S103L+T106I+G131I。
在一个具体实施方案中，该蛋白酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，但取代的组合S101F+S103L+T106I+G133K(V12)或S101F+S103L+T106I+G131I(V13)除外。
在一个具体实施方案中，本发明的蛋白酶变体还包含在选自D12、L21、T175、S194、H197、G212、I217或R247的位置的至少一种氨基酸取代，其中该位置通过参考SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列来编号，优选选自D12C+L21C、T175C+R247C、S194P、H197D、G212N或I217K的至少一种取代。
在一个具体实施方案中，该蛋白酶具有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，和在选自S101、S103、T106、G131或G133的位置的至少一种取代，其中该位置通过参考SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列来编号。优选地，该蛋白酶具有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，和在选自S101F/L/M/W/Y、S103L、T106I/L、G131I或G133K的位置的至少一种氨基酸取代，其中该位置通过参考SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列来编号，更优选至少选自S101F/L/M/W/Y的取代，更优选至少该取代S101F。
前肽
有利地，蛋白酶变体和/或亲本蛋白酶包含位于N末端的充当“前肽”的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)，该前肽至少部分地负责蛋白酶的3D折叠和成熟。
特别地，该蛋白酶变体和/或亲本蛋白酶包含位于N末端的氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
根据一个具体实施方案，该蛋白酶变体和/或亲本蛋白酶包含位于N末端的氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，并且具有在选自M8、D75、A76、I78或D81的位置的至少一种氨基酸取代，其中该位置通过参考SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列来编号。根据本发明，目标氨基酸可被任何氨基酸替代，该氨基酸选自天然存在的氨基酸残基、稀有的天然存在的氨基酸残基和非天然存在的氨基酸残基。优选地，目标氨基酸可以被19种其它氨基酸中的任一种替代。
聚酯降解活性
本发明的目的是提供具有蛋白酶活性的新型酶。
在一个具体实施方案中，本发明的蛋白酶具有聚酯降解活性，优选聚乳酸降解活性。优选地，与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，本发明的蛋白酶表现出提高的聚酯降解活性。
有利地，本发明的蛋白酶变体和/或亲本蛋白酶至少在10℃-90℃，优选20℃-70℃，更优选30℃-60℃的温度范围内，甚至更优选在45℃下表现出聚酯降解活性。在一个具体实施方案中，在40℃-60℃，优选在50℃-60℃的温度仍可测量到聚酯降解活性。在另一个具体实施方案中，对应于自然环境中的平均温度，在10℃-30℃，优选15℃-28℃的温度仍可测量到聚酯降解活性。
在一个具体实施方案中，与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，本发明的蛋白酶变体在给定温度下，更具体地，在20℃-80℃，更优选在30℃-70℃，更优选在40℃-60℃，更优选在45℃的温度下具有提高的聚酯降解活性。在一个具体实施方案中，在45℃下，该蛋白酶变体的聚酯降解活性比SEQ ID NO:1的蛋白酶的聚酯降解活性高至少5％，优选至少10％、20％、50％、100％、200％、300％、500％或更高。
在一个具体实施方案中，与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，本发明的蛋白酶变体在10℃-30℃，更优选在15℃-30℃，甚至更优选在20℃-30℃，甚至更优选在28℃的温度下具有提高的聚酯降解活性。在一个具体实施方案中，在28℃下，该蛋白酶变体的聚酯降解活性比SEQ ID NO:1的蛋白酶的聚酯降解活性高至少5％，优选至少10％、20％、50％、100％、200％、300％、500％或更高。
在一个具体实施方案中，本发明的蛋白酶变体至少在5-11的pH范围内，优选在7-10的pH范围内，更优选在7.5-9的pH范围内，甚至更优选在pH 7.5和9表现出可测量的聚酯降解活性。
热稳定性
有利地，与SEQ ID NO:1的亲本蛋白酶的热稳定性相比，本发明的变体蛋白酶的热稳定性没有受到损害。更有利地，与亲本蛋白酶的热稳定性相比，变体的热稳定性得到改进。在本发明范围内，术语“改进的热稳定性”表示与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，在高温时，更特别地在40℃-90℃的温度，诸如70℃，酶抵抗化学和/或物理结构变化的能力提高。特别地，与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，本发明的蛋白酶在40℃-90℃的温度(诸如70℃)下可具有提高的残存降解活性。特别地，与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，本发明的蛋白酶在40℃-90℃温度(诸如70℃)下，可具有延长的半衰期。特别地，本发明的变体在挤出工艺期间，并且更特别地在介于50℃-250℃之间，优选在130℃-180℃之间的温度下实施的挤出工艺期间，显示出改进的热稳定性。
可以由本领域技术人员根据本领域已知的方法来评估蛋白质的热稳定性。例如，可以通过在不同温度下孵育后测量酶的残存蛋白酶活性和/或残存聚酯解聚活性(即聚酯降解活性)来评估其热稳定性。还可以评估在不同温度下进行多轮聚酯降解试验的能力。快速定性测试可包括通过光晕直径测量，评估不同温度孵育后该酶的降解琼脂平板中分散的固体聚酯混配物的能力。或者或另外地，可进行差示扫描荧光法(DSF)以评估蛋白质/酶的热稳定性。在本发明范围内，圆二色性用于量化蛋白质的热变性温度的变化，从而确定其解链温度(Tm)。在本发明范围内，给定蛋白质的“解链温度(Tm)”对应于一半的所述蛋白质发生变性(未折叠或错误折叠)的温度。可以用实验步骤中展现的圆二色性来测量该Tm。
有利地，与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，本发明的蛋白酶表现出更高或相当的解链温度(Tm)。在一个具体实施方案中，本发明的蛋白酶表现出高于40℃，优选高于45℃，更优选高于50℃的解链温度(Tm)。
核酸、表达盒、载体、宿主细胞
本发明的另一目的是提供编码以上定义的酶的核酸。
如本文所用，术语“核酸””、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核苷酸序列”可互换使用，并且是指脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的序列。该核酸可以是DNA(cDNA或gDNA)、RNA或其混合物。它可以是单链形式或双链形式或其混合物。它可以是重组、人工和/或合成来源的，并且它可以包含修饰的核苷酸，包括例如修饰的键、修饰的嘌呤或嘧啶碱基、或修饰的糖。本发明的核酸可以是分离的或纯化的形式，并且可以通过本领域已知的技术，例如cDNA文库的克隆和表达、扩增、酶促合成或重组技术来制备、分离和/或操作。核酸也可以通过公知的化学合成技术在体外合成，例如在Belousov(1997)Nucleic AcidsRes.25:3440-3444中所述的。
本发明还涵盖在严格条件下，与编码如上定义的蛋白酶的核酸杂交的核酸。优选地，该严格条件包括在2X SSC/0.1％SDS中将杂交过滤器中于约42℃孵育约2.5小时，随后在1 X SSC/0.1％SDS中于65℃下将过滤器洗涤15分钟四次。所使用的操作描述于如Sambrook等人的参考文献(Molecular Cloning:a Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Press,Cold Spring Harbor N.Y.(1988))和Ausubel(Current Protocols inMolecular Biology(1989))中。
本发明还涵盖编码本发明的蛋白酶的核酸，其中已经使用优化的密码子用法将所述核酸的序列或所述序列的至少一部分工程化。
或者，可以从根据本发明的蛋白酶的序列推导根据本发明的核酸，并且可以根据应在其中转录核酸的宿主细胞来调整密码子用法。可以根据本领域技术人员众所周知的方法进行这些步骤，其中部分描述于Sambrook等人的参考手册(Sambrook等，2001)。
本发明的核酸还可以包含其他核苷酸序列，诸如调节区域，即启动子、增强子、沉默子、终止子、信号肽等，该调节区域可以用于引起或调节所选宿主细胞或系统中多肽的表达。或者或另外地，本发明的核酸还可以包含编码融合蛋白的其它核苷酸序列，诸如可以用于促进多肽表达和/或溶解性的麦芽糖结合蛋白(MBP)或谷胱甘肽S转移酶(GST)。
本发明还涉及表达盒，其包含根据本发明的可操作地连接至一个或多个控制序列的核酸，该控制序列指导所述核酸在合适的宿主细胞中的表达。术语“表达盒”表示包含编码区域(即本发明的核酸)，和调节区域(即包含一个或多个控制序列(例如转录启动子和/或转录终止子))的核酸构建体。该控制序列可以包括被用于表达编码本发明蛋白酶的宿主细胞或体外表达系统识别的启动子。该启动子含有介导酶表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变、截短和杂交的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因中获得。该控制序列也可以是被宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子与编码蛋白酶的核酸的3'末端可操作地连接。任何在宿主细胞中有功能的终止子均可用于本发明。典型地，表达盒包含可操作地连接至转录启动子和转录终止子的根据本发明的核酸或由可操作地连接至转录启动子和转录终止子的根据本发明的核酸组成。
本发明还涉及包含如上所定义的核酸或表达盒的载体。
术语“载体”是指作为将重组的遗传物质转移到宿主细胞中的载体的DNA或RNA分子。载体可以是线性或环状的单链或双链的DNA或RNA。载体可以是整合的或染色体外的，或自复制的。优选地，表达载体是线性或环状双链DNA分子。载体的主要类型是质粒、噬菌体、病毒、fosmids、粘粒和人工染色体。载体本身通常是DNA或RNA序列，其由插入物(异源核酸序列，转基因)和充当载体“骨架”的较大序列组成。将遗传信息转移到宿主的载体的目的典型地是在靶细胞中分离、繁殖或表达该插入物。被称为表达载体(表达构建体)的载体特别适合在靶细胞中表达异源序列，并且通常具有驱动编码多肽的异源序列的表达的启动子序列。如本文所用，术语“表达载体”是指包含本发明的表达盒的DNA或RNA分子。通常，表达载体中存在的调节元件包括转录启动子、核糖体结合位点、终止子和任选存在的操纵子。优选地，表达载体还含有用于在宿主细胞中自主复制的复制起点、筛选标记、有限数量的有用的限制酶位点和潜在的高拷贝数。表达载体的示例是克隆载体、修饰的克隆载体、特定设计的质粒和病毒。在不同宿主中提供合适水平的多肽表达的表达载体是本领域众所周知的。载体的选择典型地取决于载体与将载体引入其中的宿主细胞的相容性。优选地，表达载体是线性或环状双链DNA分子。
本发明的另一目的是提供宿主细胞，其包含如上所述的核酸、表达盒或载体。因此，本发明涉及根据本发明的核酸、表达盒或载体在转化、转染或转导宿主细胞中的用途。载体的选择将典型地取决于载体与必须将其引入其中的宿主细胞的相容性。
根据本发明，可以以瞬时或稳定的方式转化、转染或转导宿主细胞。将本发明的表达盒或载体引入宿主细胞，以保持所述表达盒或载体为染色体整合体或自复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”还涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本宿主细胞不同的亲本宿主细胞的任何后代。宿主细胞可以是可用于制备本发明的变体的任何细胞，例如原核生物或真核生物。原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。宿主细胞也可以是真核细胞，诸如酵母、真菌、哺乳动物、昆虫或植物细胞。在一个具体实施方案中，宿主细胞选自下组：大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、木霉、曲霉、酿酒酵母、毕赤酵母、栖热菌、放线菌或耶氏酵母。
可以通过任何本领域技术人员已知的方法将根据本发明的核酸、表达盒或表达载体引入宿主细胞，诸如电穿孔、缀合、转导、感受态细胞转化、原生质体转化、原生质体融合、“基因枪”转化、PEG介导的转化、脂质辅助转化或转染、化学介导的转染、乙酸锂介导的转化、脂质体介导的转化。
任选地，可以将多于一个拷贝的本发明的核酸、盒或载体插入宿主细胞中以提高变体的产生。
在一个具体实施方案中，宿主细胞是重组微生物。本发明实际上允许工程化具有改进的降解含聚酯材料的能力的微生物。例如，本发明的序列可用于补助已知能降解聚酯的真菌或细菌的野生型菌株，以改进和/或提高菌株能力。
制备蛋白酶变体
本发明的另一目的是提供制备本发明的蛋白酶变体的方法，其包括表达编码该蛋白酶的核酸和任选地回收该蛋白酶。
特别地，本发明涉及体外制备本发明的蛋白酶的方法，其包括：(a)使本发明的核酸、表达盒或载体与体外表达系统接触；和(b)回收制备的蛋白酶。体外表达系统是本领域技术人员众所周知的并可商购。
优选地，该制备方法包括：
(a)在适于表达该核酸的条件下，培养包含编码本发明的蛋白酶的核酸的宿主细胞；和任选地
(b)从该细胞培养物中回收所述蛋白酶。
优选地，该宿主细胞是重组芽孢杆菌、重组大肠杆菌、重组曲霉、重组木霉、重组链霉菌、重组酿酒酵母、重组毕赤酵母、重组栖热菌、重组放线菌或重组耶氏酵母。优选地，该宿主细胞是重组芽孢杆菌。
使用本领域已知的方法在适合于制备多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以在合适的培养基中，并在允许酶被表达和/或分离条件下，通过摇瓶培养或在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批、或固态发酵)来培养细胞。培养在合适的营养培养基中进行，该营养培养基获自商业供应商处，或者根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备，或在任何其他适合细胞生长的培养基中进行。
如果蛋白酶分泌到营养培养基中，则可以直接从培养上清液中回收蛋白酶。相反，可以从细胞裂解物中或透化后回收蛋白酶。可以使用本领域已知的任何方法回收蛋白酶。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收蛋白酶，该常规方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。任选地，可以通过多种本领域已知的方法来部分或完全纯化蛋白酶，该方法包括但不限于，热冲击、色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳方法(例如，制备等电聚焦)、溶解度差异(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取，以获得基本上纯的多肽。
该蛋白酶可以以纯化形式单独或与其他酶组合使用，以催化参与降解聚酯和/或回收聚酯和/或含聚酯材料(诸如含聚酯塑料制品)的酶促反应。蛋白酶可以是可溶形式或固相形式。特别地，它可以结合至细胞膜或脂质囊泡，或结合至合成载体，诸如玻璃、塑料、聚合物、过滤器、膜，例如以珠、柱、板等形式。
组合物
本发明的另一目的是提供包含本发明的蛋白酶或宿主细胞或其提取物的组合物。在本发明中，术语“组合物”涵盖任何种类的包含本发明的蛋白酶或宿主细胞的组合物。在一个具体实施方案中，该蛋白酶是分离的或至少部分纯化的形式。
该组合物可以是液态或干燥的，例如以粉末形式。在一些实施方案中，该组合物是冻干物。例如，该组合物可包含蛋白酶和/或编码本发明的蛋白酶的宿主细胞或其包含所述蛋白酶的提取物，以及任选地赋形剂和/或试剂等。合适的赋形剂涵盖生物化学中常用的缓冲剂、用于调节pH的试剂、防腐剂(诸如苯甲酸钠、山梨酸钠或抗坏血酸钠)、防腐剂、保护剂或稳定剂，诸如淀粉、糊精、阿拉伯胶、盐、糖(如山梨糖醇、海藻糖或乳糖)、甘油、聚乙烯乙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、丙二醇、二价离子(诸如钙)、螯合剂(诸如EDTA)、还原剂、氨基酸、载体(诸如溶剂或水溶液)等。本发明的组合物可通过将蛋白酶与一种或几种赋形剂混合而获得。
本发明的组合物可包含0.1重量％-99.9重量％，优选0.1重量％-50重量％，更优选0.1重量％-30重量％，甚至更优选0.1重量％-5重量％的本发明的蛋白酶和0.1重量％-99.9重量％，优选50重量％-99.9重量％，更优选70重量％-99.9重量％，甚至更优选95重量％-99.9重量％的赋形剂。优选的组合物包含0.1-5重量％的本发明的蛋白酶。在另一实施方案中，本发明的组合物可包含0.1重量％-40重量％，更优选1重量％-30重量％，更甚优选5重量％-25重量％的本发明蛋白酶和60重量％-99.9重量％，优选70重量％-99重量％，更优选75重量％-95重量％的赋形剂。
在一个具体实施方案中，该组合物还可包含其它的表现出酶促活性的多肽。本领域技术人员将容易地例如根据待降解的聚酯和/或含聚酯材料的性质和/或组合物中所含的其它酶/多肽的性质，来调整本发明的蛋白酶的量。
在一个具体实施方案中，本发明的蛋白酶与一种或几种赋形剂，尤其是能够稳定或保护多肽不被降解的赋形剂，一起溶解在水性介质中。例如，本发明的蛋白酶可以溶于水，最终与其它组分(诸如甘油、山梨糖醇、糊精、淀粉、二醇(诸如丙二醇)、盐等)一起溶解。然后，所得的混合物可被干燥以得到粉末。干燥此类混合物的方法是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于冻干、冷冻干燥、喷雾干燥、超临界干燥、下排式蒸发、薄层蒸发、离心蒸发、输送机干燥、流化床干燥、转鼓干燥或其任何组合。
在另一具体实施方案中，本发明的组合物包含至少一种表达本发明的蛋白酶的宿主细胞或其提取物。“细胞提取物”表示从细胞(诸如细胞上清液、细胞碎片、细胞壁、DNA提取物、酶或酶制剂、或任何通过化学、物理和/或酶处理的衍生自细胞的制剂)获得的任何成分，其基本上不含活细胞。优选的提取物是酶活性提取物。本发明的组合物可包含一种或几种本发明的宿主细胞或其含有本发明的蛋白酶的提取物，以及任选地一种或几种其他细胞。
在一个具体实施方案中，该组合物包括或包含表达和/或分泌本发明的蛋白酶的重组微生物的冻干培养基。在一个具体实施方案中，该粉末包含本发明的蛋白酶、和稳定/溶解剂量的甘油、山梨糖醇或糊精(诸如麦芽糊精和/或环糊精)、淀粉、阿拉伯树胶，二醇(诸如丙二醇)、和/或盐。
蛋白酶的用途
本发明的另一目的是提供使用本发明的蛋白酶在有氧或无氧条件下降解和/或再回收聚酯和/或含聚酯材料以作为由聚酯制成或含有聚酯的塑料制品和/或制备含聚酯的可生物降解的塑料的方法。本发明的蛋白酶可特别用于制备含PLA的可生物降解的塑料制品和/或用于降解PLA和包含PLA的塑料制品。
因此，本发明的目的是使用本发明的蛋白酶，或含有该蛋白酶的相应宿主细胞或其提取物、或组合物，以用于酶降解聚酯或含聚酯材料，诸如PLA或含PLA材料。
本发明的另一目的是提供用于降解聚酯或含有至少一种聚酯的塑料制品的方法，其中该聚酯或塑料制品与本发明的蛋白酶或宿主细胞或组合物接触。有利地，将聚酯和/或含聚酯材料的聚酯降解成单体和/或低聚物。在该降解方法的实施方案中，将至少一种聚酯降解以产生可再聚合的单体和/或低聚物，其有利地被回收以便被使用。在该降解方法的优选实施方案中，至少PLA被降解以产生可再聚合的乳酸(LA)的单体和/或低聚物，其有利地被回收以便被用于例如制备新的PLA聚合物。
在一个实施方案中，聚酯和/或含聚酯材料的聚酯被完全降解。
在一个具体实施方案中，聚酯选自聚乳酸(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸乙二醇异山梨酯(PEIT)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)、丁二酸丁二醇酯-己二酸丁二醇酯共聚物(PBSA)、丁二酸丁二醇酯-己二酸丁二醇酯共聚物(PBAT)、聚呋喃二羧酸乙二醇酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、聚(己二酸乙二醇酯)(PEA)及其共混物/混合物，优选聚乳酸。
在一个具体实施方案中，该塑料制品包含至少一种选自以下的聚酯：聚乳酸(PLA)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸乙二醇异山梨酯(PEIT)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)、丁二酸丁二醇酯-己二酸丁二醇酯共聚物(PBSA)、丁二酸丁二醇酯-己二酸丁二醇酯共聚物(PBAT)、聚呋喃二羧酸乙二醇酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、聚(己二酸乙二醇酯)(PEA)以及这些材料的共混物/混合物，优选为聚乳酸。
在一个具体实施方案中，PLA或含PLA的塑料制品与本发明的蛋白酶或宿主细胞接触，并且PLA被降解为乳酸的单体和/或低聚物。在一个优选实施方案中，乳酸的单体和/或低聚物被回收用于例如再回收、聚合PLA或甲烷化。
本发明还涉及由聚酯或含聚酯材料制备单体和/或低聚物的方法，包括将聚酯或含聚酯材料暴露于本发明的蛋白酶或其相应的宿主细胞或其提取物或组合物，和任选地回收单体和/或低聚物。本发明的方法可特别用于从含PLA的塑料制品制备单体(诸如乳酸)。
用于降解聚酯或含聚酯材料所需的时间可能会有所不同，这取决于聚酯或含聚酯材料本身(即塑料制品的性质和来源、组分、形状等)、所用蛋白酶的类型和用量、以及各种工艺参数(即温度、pH、其他试剂等)。本领域技术人员可以容易地根据含聚酯材料调试工艺参数。
有利地，该降解工艺在10℃-90℃，优选20℃-70℃，更优选30℃-60℃，甚至更优选45℃下进行。更一般而言，将温度保持在失活温度以下，该失活温度对应于蛋白酶失活和/或重组微生物不再合成蛋白酶的温度。优选地，将温度保持在低于含聚酯材料中的聚酯的玻璃化转变温度(Tg)以下。在此实施方案中，该降解工艺在低于80℃，优选低于70℃，更优选低于60℃，更优选低于50℃，甚至更优选在45℃下进行。更具体地，该工艺在蛋白酶可以被多次使用和/或再回收的温度下以连续方式实施。
有利地，降解工艺在pH 5-11下，优选在pH 7-10下，更优选在pH 7.5-9下，甚至更优选在pH 7.5或pH 9下进行。
在一个具体实施方案中，可以在与蛋白酶接触之前对聚酯或含聚酯材料进行预处理，以物理改变其结构，从而提高聚酯与酶之间的接触表面。
任选地，可以将由解聚得到的单体和/或低聚物顺序地或连续地回收。取决于起始的含聚酯材料，可以回收单一类型的单体和/或低聚物、或几种不同类型的单体和/或低聚物。
回收的单体和/或低聚物可以使用所有合适的纯化方法进一步纯化，并以可再聚合的形式进行处理。纯化方法的示例包括汽提工艺、通过水溶液分离、蒸汽选择性冷凝、生物过程后的介质过滤和浓缩、分离、蒸馏、真空蒸发、提取、电渗析、吸附、离子交换、沉淀、结晶、浓缩以及加酸脱水和沉淀、纳米过滤、酸催化剂处理、半连续模式蒸馏或连续模式蒸馏、溶剂萃取、蒸发浓缩、蒸发结晶、液/液萃取、氢化、共沸蒸馏工艺、吸附、柱色谱法、简单的真空蒸馏和微滤，结合使用或不结合使用。
可再聚合的单体和/或低聚物可再用于例如合成聚酯。优选地，相同性质的聚酯被再聚合。但是，回收的单体和/或低聚物可以与其他单体和/或低聚物混合，以例如合成新的共聚物。或者，回收的单体可以用作化学中间体，以制备新的目标化学混配物。
本发明的另一目的是提供聚酯或含聚酯材料，其中包括本发明的蛋白酶和/或表达和/或分泌所述蛋白酶的重组微生物和/或其含有该蛋白酶的提取物，和/或本发明的组合物。在一个具体实施方案中，该含聚酯材料可以是塑料混配物、母料组合物和/或塑料制品。在本发明范围内，“母料组合物”是指所选成分(例如，活性剂、添加剂等)的浓缩混合物，其可以用于将所述成分引入塑料混配物或制品中以赋予其所需的性能。母料组合物可以是固体或液体。优选地，本发明的母料组合物含有至少10重量％的活性成分，更优选本发明的蛋白酶或组合物。
因此，本发明的另一目的是提供一种塑料混合物，其含有本发明的蛋白酶和/或表达和/或分泌所述蛋白酶的重组微生物或其含有该蛋白酶的提取物、和/或本发明的组合物，以及至少一种聚酯。在一个具体实施方案中，该聚酯是聚乳酸(PLA)，优选聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(D-乳酸)(PDLA)或聚(DL-乳酸)(PDLLA)。在一个具体实施方案中，该塑料混配物可含有其它聚合物，该其它聚合物优选地选自聚酯(诸如PBAT、PCL、PET)、聚烯烃(诸如聚乙烯)、聚丙烯或天然聚合物(诸如淀粉、纤维素或面粉)；及其共混物/混合物。更具体地，该塑料混配物可含有其它的选自PBAT、面粉或淀粉的聚合物。在另一具体实施方案中，该聚酯是聚己内酯(PCL)。
因此，本发明的另一目的是提供含有本发明的蛋白酶和/或表达和/或分泌所述蛋白酶的重组微生物或其含有该蛋白酶的提取物和/或本发明的组合物的母料组合物，以及至少一种聚酯。在一个具体实施方案中，该聚酯是聚乳酸(PLA)、优选聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(D-乳酸)(PDLA)或聚(DL-乳酸)(PDLLA)。在另一具体实施方案中，该聚酯优选是聚己内酯(PCL)。
特别地，本发明涉及用于制备该含聚酯材料(即，塑料混配物、母料组合物或塑料制品)的方法，其包括在聚酯处于部分或完全熔融状态的温度下，将聚酯与能够降解所述聚酯的本发明的蛋白酶和/或重组微生物或其含有该蛋白酶的提取物和/或本发明的组合物混合的步骤，使得蛋白酶/微生物被整合到含聚酯材料的整个结构中。在一个具体实施方案中，该工艺是挤出工艺。
例如，可以在玻璃化转变温度与聚酯的熔点之间的温度下，将本发明的蛋白酶和/或组合物与聚酯混合。或者，可以在对应于所述聚酯的熔点的温度或更高的温度下，将本发明的蛋白酶/组合物与聚酯混合。在一个具体实施方案中，将蛋白酶/组合物与聚酯在40℃-250℃，优选在50℃-180℃的温度下混合。或者，将多肽/组合物与聚酯在高于40℃，优选高于50℃，甚至更优选高于60℃的温度下混合。
在一个优选实施方案中，该聚酯选自聚乳酸(PLA)，并且将蛋白酶/组合物与PLA在60℃-250℃，优选在100℃-200℃，更优选在130℃-180℃，甚至更优选140℃-160℃的温度下混合。或者，将蛋白酶/组合物与PLA在高于80℃，优选高于100℃，甚至更优选高于130℃，且低于180℃的温度下混合。
在另一个优选实施方案中，该聚酯选自聚己内酯(PCL)，并且将蛋白酶/组合物与PCL在40℃-100℃，优选50℃-80℃的温度下混合。或者，将蛋白酶/组合物与PCL在高于40℃，优选高于50℃，甚至更优选高于55℃，且低于80℃的温度下混合。
更优选地，使用挤出、双螺杆挤出、单螺杆挤出、注塑、浇铸、热成型、旋转模塑、压缩、压延、熨烫、涂覆、层化、膨胀、拉挤成型、挤出吹塑、挤出溶胀、压缩造粒、水包油包水型双乳液蒸发、3D打印或任何本领域技术人员已知的技术进行混合步骤。
所得的塑料混配物、母料组合物或塑料制品整合了包被在混配物、母料组合物或塑料制品的质量中的本发明的蛋白酶/微生物或组合物。
有利地，该塑料混配物、母料组合物可用于制备含聚酯材料和/或塑料制品，该含聚酯材料和/或塑料制品因此将包括本发明的多肽。
在一个具体实施方案中，所得的塑料混配物、母料组合物或塑料制品是符合本领域技术人员已知的至少一种相关标准和/或标签中的可生物降解的塑料混配物、母料组合物或塑料制品，诸如标准EN13432、标准ASTM D6400、OK生物降解土壤(Label)、OK生物降解水(Label/>)、OK堆肥(Label/>)、OK家庭堆肥(Label/>)。
有利地，含聚酯材料(即，塑料混配物、母料组合物或塑料制品)的降解工艺在10℃-50℃，优选15℃-40℃，更优选20℃-30℃，更优选28℃，+/-2℃的温度下进行。
或者，含聚酯材料(即，塑料混配物、母料组合物或塑料制品)的降解工艺在50℃-60℃，更优选在55℃，+/-2℃下的温度下进行。
有意义地，包含与SEQ ID No:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的蛋白酶可用于以上引用的应用中。
经典地，本发明的蛋白酶或包含与SEQ ID No:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的蛋白酶，可用于洗涤剂、食品、动物饲料和药物应用中。
更特别地，本发明的蛋白酶或包含与SEQ ID No:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的蛋白酶，可用作洗涤剂组合物的组分。
洗涤剂组合物包括但不限于，手洗或机洗衣物洗涤剂组合物(诸如适合于对染色的织物进行预处理的衣物添加剂组合物和漂洗添加的织物柔软剂组合物)、用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物、用于手洗或机洗洗碗操作的洗涤剂组合物。
在一个具体实施方案中，本发明的蛋白酶或包含与SEQ ID No:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的蛋白酶可以用作洗涤剂添加剂。因此，本发明提供了洗涤剂组合物，其包含本发明的蛋白酶或包含与SEQ ID No:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的蛋白酶。
本发明还涉及在动物饲料中使用本发明的蛋白酶或包含与SEQ ID No:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的蛋白酶的方法，以及包含本发明的蛋白酶或包含与SEQ ID No:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的蛋白酶的饲料组合物和饲料添加剂。术语“饲料”和“饲料组合物”是指适合或旨在被动物摄取的任何混配物、制剂、混合物或组合物。在另一具体实施方案中，本发明的蛋白酶或包含与SEQ ID No:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的蛋白酶被用于水解蛋白质，并制备包含肽的水解产物。该水解产物可以用作饲料组合物或饲料添加剂。
本发明还涉及表面水解或表面官能化含聚酯材料的方法，其包括将含聚酯材料暴露于本发明的蛋白酶或包含与SEQ ID No:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的蛋白酶，或其相应的重组细胞或提取物或组合物。本发明的方法可特别用于提高聚酯材料的亲水性或吸水性。这种提高的亲水性在纺织品制备、电子和生物医学应用中可能特别有意义。
实施例实施例1--蛋白酶的构建、表达和纯化
-1.1构建体
将编码未成熟的亲本蛋白酶(对应于SEQ ID No:2+SEQ ID No:1的SEQ ID No:4)的基因(核酸SEQ ID No:5)克隆到质粒pET26b+(EMD Millipore，Billerica，Massachusetts,USA)，框架为在该基因上游的编码PelB信号肽的序列(SEQ ID No:3MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA)和该基因下游的6x组氨酸标签(SEQ ID No:6LEHHHHHH)。用构建的质粒转化大肠杆菌OneBL21 DE3(Life Technologies，Carlsbad,California,USA)。所获得的菌株表达在蛋白的N端具有PelB前导序列并且在蛋白的C端具有6x组氨酸标签的野生型蛋白酶。根据供应商的建议，使用QuikChange II定点诱变试剂盒构建变体(Santa Clara,California,USA)。表1给出了用于定点诱变的正向和反向引物。
表1.用于定点诱变编码亲本蛋白酶基因以制备本发明的蛋白酶变体的正向和反向引物
/>
下划线为突变密码子
-1.2蛋白酶的表达和纯化
表达野生型蛋白酶的菌株及其变体的重组表达，通过在100mL TB培养基中于37℃下4小时，然后于21℃添加IPTG以终浓度1mM实现(Tartoff K.D.and Hobbs C.A.,1987,Improved Media for Growing Plasmid and Cosmid Clones,Bethesda Res.Lab.Focus,9:12)。通过在Avanti J-26XP离心机(Beckman Coulter,Brea,USA)中离心(8000rpm，在10℃下20分钟)以停止培养。将细胞在-80℃冷冻至少2.5小时，然后悬浮在10mL Tris HCl缓冲液(Tris 0.1M，pH 9)中。根据供应商的建议，使用LysonaseTM生物处理试剂(EMDMillipore)裂解细胞。然后，将细胞悬浮液在11000rpm和10℃下离心30分钟。收集可溶级分，并使用金属亲和力树脂(Clontech,CA,USA)进行钴亲和层析。蛋白已用在20mMTris-HCl中的100mM咪唑，300mM NaCl，pH 8.0洗脱。在针对Tris HCl缓冲液(Tris 0.1M，5mM CaCl2，pH 7.5或pH 9，在45℃下调节)透析步骤后，已从纯化的提取物中去除咪唑。已按照制造商的指导(Lifescience Bio-Rad,France)使用Bio-Rad Bradford蛋白测定法对纯化的蛋白进行了定量，并将其保存在+4℃下。TCA沉淀后，已在SDS-PAGE上评估了纯化的质量，预期的蛋白质大小约为29kDa。
所得蛋白酶(即，SEQ ID No:1的变体)包含SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，但下表2和3中列出的特定取代除外。
实施例2–评估蛋白酶降解活性
在PLA水解期间已确定了野生型蛋白酶及其变体的比降解活性。称取50mg 500μmPLA粉末(PLLA 001-Natureplast)，并将其引入透析管中。除了所列的特定取代之外，变体具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。然后，在关闭透析管之前，将酶样品(1.5mL蛋白酶制剂，其含有为2.5、5、10或15mg/L的酶固定浓度，以便测量准确的比活性)先添加到透析管中，然后将其引入含有25mL pH 9或pH 7.5的0.1M Tris-HCl缓冲液(在45℃下调节)的玻璃瓶中。野生型蛋白酶(SEQ ID No:1)用作对照。
通过在Max Q 4450恒温箱(Thermo Fisher Scientific，Inc.Waltham，MA，USA)中以45℃和170rpm孵育每个样品来开始解聚。
通过在最初的24小时内在不同时间进行采样并通过超高效液相色谱(UHPLC)进行分析来确定解聚反应的初始速率(以生成的克乳酸和/或乳酸二聚物/克酶/小时计)。如果必要，将样品在pH 9或pH 7.5的0.1M Tris-HCl缓冲液(在45℃下调节)中稀释。在0.45μm注射器过滤器上过滤后，将样品上样至UHPLC，以监测乳酸和乳酸二聚体的释放。所使用的色谱系统是Ultimate 3000UHPLC系统(Thermo Fisher Scientific，Inc.Waltham，MA，USA)，其包括泵模块、自动进样器、温度控制在50℃的柱温箱、210nm下的UV检测器。所使用的色谱柱为配备了预柱的Aminex HPX-87H(300mm×7.8mm)(Supelco，Bellefonte，USA)。使用流动相H2SO4 5mM以0.5mL.min-1的流速分离乳酸和乳酸二聚体。进样量为20μL样品。乳酸和乳酸二聚体根据从商业化乳酸(Sigma-Aldrich L1750-10G)制备的标准曲线以及在与样品相同的条件下在室内合成的乳酸二聚体来测量。在水解曲线的线性部分确定PLA水解的比降解活性(克当量乳酸(即，克乳酸和乳酸二聚物/小时/克酶))。下表2和表3中示出了不同实验的结果。
表2：野生型蛋白酶(SEQ ID No:1)及其变体在pH 7.5下(在45℃下调节)的比降解活性。
这些结果证实，与SEQ ID No:1的亲本蛋白酶相比，本发明的蛋白酶在pH 7.5下具有提高的降解活性。由于本发明的蛋白酶在环境条件(中性pH)下显示出极大的降解活性，因此对于制备可降解塑料制品特别有意义，其掺入能够降解所述塑料制品的一种或多种聚酯的蛋白酶。
根据V3、V18、V6、V13、V8或V19的蛋白酶，更特别是根据V8或V19的蛋白酶，对于制备可生物降解的含PLA的塑料制品将特别有意义。在pH 7.5下，对V1、V2、V4、V5、V7、V9、V10、V11、V12、V14、V15、V16和V17进行的类似测试也证实，与SEQ ID No:1的亲本蛋白酶相比，本发明的该蛋白酶在pH 7.5下具有提高的降解活性(数据未显示)。
表3：野生型蛋白酶(SEQ ID No:1)及其变体在pH 9下的比降解活性。
/>
这些结果证实了本发明的蛋白酶可用于各种工业工艺，诸如聚酯降解工艺，其中降解步骤可在pH 9下进行。在pH 9下对V18和V19进行的类似测试还证实，与SEQ ID No:1的亲本蛋白酶相比，本发明的该蛋白酶在pH 9下具有提高的降解活性(数据未显示)。
实施例3——评估本发明蛋白酶的活性
已确定本发明的蛋白酶的比降解活性，并将其与SEQ ID No:1的野生型蛋白酶的比活性进行比较。
使用多种方法来评估比活性：
(1)基于pNA水解的比活性；
(2)基于固体形式的聚酯的降解的比降解活性
(3)基于固体形式的蛋白质的降解的比活性
(4)基于含PLA乳液的浊度降低的比降解活性
(5)在反应器中基于PLA水解的比降解活性
3.1 pNA水解
将在溶液中的20μL蛋白与180μL的5mM N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺(pNA)合并到0.1M pH7.5的Tris HCl缓冲液中。酶促反应已在30℃、搅拌下进行至少15分钟，并通过酶标仪(Versamax，Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)获得了在405nm处的吸光度。在水解曲线的线性部分确定了比活性(以释放的微摩尔对硝基苯胺/分钟/毫克酶表示的初始速度)，并将其用于与具有变体活性的野生型蛋白酶的活性比较。
3.2降解固体形式的聚酯
将20μL酶制剂沉积在含有PLA的琼脂糖平板上的孔中。制备琼脂糖平板是通过将450mg PLA溶解在10mL二氯甲烷(DCM)中并用涡旋均质化来实现的。添加90mL 0.1M pH 7-9的Tris HCl缓冲液，然后进行超声处理(Fisher ScientificTM Model 705 SonicDismembrator，最大功率为30％)后，将DCM在50℃蒸发。过滤所得溶液以去除未溶解的残存物。最后，将12mL的0.5％PLA乳液与3mL的pH为9的1M Tris HCl缓冲液(在45℃下调节)和15mL的2％琼脂糖混合，以制备每个omnitray(在4℃下储存)。
在45℃下4-24小时后，测量并比较了由于聚酯被野生型蛋白酶和变体降解而形成的光晕的直径。
3.3降解固体形式的蛋白质
将20μL酶制剂沉积在含奶的琼脂平板中的孔中。制备琼脂平板是通过制备28g/L的奶粉(RegilaitTM)在水中的溶液来实现的。然后，将15mL的奶与15mL的15g/L琼脂混合，以制备每个omnitray(在4℃下储存)。
在45℃下4-24小时后，测量并比较由于酶促乳蛋白降解而形成的光晕的直径。5小时后的结果显示在图1A、1B和1C中，并证实野生型蛋白酶(图1A)以及蛋白酶变体V8(图1B)和V19(图1C)均表现出蛋白酶活性。
3.4基于含PLA乳液的浊度降低的比活性
降解PLA的活性是基于在45℃下30分钟且pH为9下，在100mM Tris-HCl缓冲液(pH9(在45℃下调节))中的终浓度为0.1％(w/v)的乳化PLA的浊度降低来测定的(使用声波分散器，最大功率为30％)。将PLA降解活性的一个单位定义为在所述测定条件下每分钟光密度降低1个单位。
3.5反应器中的PLA水解
Minibio 500生物反应器(Applikon Biotechnology B.V.，Delft,TheNetherlands)以5g PLA和100mL含有2.5-10mg蛋白酶的pH 7.5(在45℃下调节)的100mMTris-HCl缓冲液开始使用。使用船用叶轮将搅拌设置为250rpm。通过浸入外部水浴中将生物反应器恒温在45℃。通过添加3M KOH，将pH调节为7.5。借助于BioXpert V2.95软件，可以监视不同的参数(pH、温度、搅拌、添加碱)。定期取样500μL反应介质。
如实施例2所述，通过HPLC确定LA和LA的二聚体的量。
比活性对应于降解的比速率，并以每小时和每毫克酶释放的LA和LA的二聚体的总毫克数来计算。
实施例4–评估蛋白酶变体的热稳定性
使用了不同的方法来估算热稳定性：
(1)在给定的温度、时间和缓冲液条件下蛋白质孵育后，残存聚酯的解聚活性；
(2)溶液中蛋白质的圆二色性；
4.1残存聚酯的降解活性
通过测量在热冲击后回收的残存比降解活性(如实施例2中所述的PLA水解)来确定野生型蛋白酶和变体的热稳定性。进行热冲击的方法如下：将在pH 7.5(在45℃下调节)的0.1M Tris-HCl缓冲液中含有固定酶浓度(0.15g/L)的酶样品浸入在给定时间(30或60分钟)内在70℃下调节的水浴中。热冲击后，将样品立即置于冰上。在酶稀释步骤(至多0.05g/L)后，如实施例2中所详述的测量热冲击和未热冲击样品后回收的比降解活性(PLA水解)(缓冲液：Tris-HCl 0.1M pH7.5(在45℃下调节))。残存降解活性的结果表示为未热冲击样品的比活性的百分比。
表4示出了热冲击条件和热冲击后残存的降解活性结果。
表4：热冲击后，野生型蛋白酶和变体V8的残存降解活性。
表4显示，与野生型蛋白酶相比，在70℃下处理30分钟-60分钟后，蛋白酶变体V8保留更大的降解活性。
4.2圆二色性
在J-815CD光谱仪(JASCO)上进行圆二色性(CD)，以确定并比较SEQ ID No:1的蛋白酶和本发明的蛋白酶变体的解链温度(Tm)。Tm对应于50％的蛋白质变性的温度。
在含有pH7.5的100mM Tris-HCl的缓冲液中制备0.2mg/mL的蛋白质样品。实验是在1mm光程石英比色皿(Starna Scientific Ltd,UK)中进行的，且首先测量远紫外(195-260)CD光谱，以确定对应于蛋白质的正确折叠的两个最大CD强度。
通过监测随着温度升高在220nm下CD值的变化，获得蛋白质的热变性曲线。温升速率为1.5℃.min-1。过渡中点的温度Tm通过使用Sigmaplot 11.0版软件在最小二乘分析的基础上通过将所得CD值与温度数据进行曲线拟合来计算。
获得的Tm反映了给定蛋白质的热稳定性。Tm越高，该变体在高温下越稳定。
SEQ ID No:1的野生型蛋白酶的Tm已在49.2+/-0.4℃的温度下评估，其未添加CaCl2。分别在51.3℃+/-0.40℃(+2.10℃)和53.4℃+/-0.30℃(+4.2℃)下评估了蛋白酶变体V8和V19的Tm，其与SEQ ID No:1的酯酶的Tm相比，分别显示出Tm的增益为2.1℃和4.2℃。
SEQ ID No:1的野生型蛋白酶的Tm和蛋白酶变体V8的Tm均已评估为70,4+/-0.2，CaCl2浓度为5mM。
实施例5-含有本发明蛋白酶的可生物降解的聚酯材料
-5.1通过挤出工艺制备塑料混配物
制备包括本发明的蛋白酶变体的塑料混配物制剂，并将其与包括商业化酶的塑料混配物制剂进行比较。两种制剂均列于表5。百分数以重量计，基于制剂的总重量。/>
表5：塑料混配物制剂
制剂B对应于含有本发明的变体V8(S101F+S103L+T106I)的塑料混配物。制剂A对应于含有商业化酶的对照物(购自Novozyme的固体形式的16L，已知其可降解PLA；商业化蛋白酶对聚乳酸的降解；Y.Oda等人。2000)。
为了比较结果，每种酶制剂均包含相同量的纯酶(基于酶制剂的总重量，为2.1重量％)。
使用以下方法制备制剂：
-PLA(聚乳酸聚合物，NatureWorks的PLA 4043D)，粉末形式(<1mm)，由PLA颗粒浸入液氮中并使用Ultra Centrifugal Mill ZM200系统微粉化而成。
-固体形式的16L，其通过在3.5kDa膜上进行超滤，渗滤，添加阿拉伯树胶(购自Nexira)并通过冷冻干燥进行干燥，从市售液体形式获得。
-固体形式的变体V8，其通过发酵工艺，然后在钴柱上纯化，渗滤，添加阿拉伯树胶并通过冷冻干燥进行干燥获得。
基于这些制剂，已经通过挤出工艺制备了可生物降解的基于聚乳酸的塑料组合物。已经使用了混炼机或同向旋转双螺杆挤出机(“Haake MiniLab II ThermoFisher”)。该混炼机依次包括手动进料元件、两个同向旋转螺杆和双螺杆的头部。
在引入混合机之前，通过手动摇动将所有粉末混合在一起。然后，将混合物引入进料区，并在手动压力下将其推入螺杆挤出机。以80RPM的双螺杆转速，使混合物通过同向旋转螺杆。挤出温度固定为165℃。然后，使PLA和蛋白酶的混合物到达螺杆头部，该螺杆头部包括一个直径为0.4mm的孔，在其中推动混合物以形成条形。然后，用切钳将该挤压物切成颗粒形式的塑料组合物，即塑料混配物。
-5.2测试塑料组合物的生物降解性
已经评估了以上获得的塑料混配物的生物降解性。
称重100mg的每种颗粒状样品A和B，并将其引入透析管中。在关闭透析管之前，将3mL pH 8的0.1M Tris-HCl缓冲液添加到透析管中。然后，将透析管引入含有50mL pH 8的0.1M Tris-HCl缓冲液的塑料瓶中。
通过在Infors HT Multitron Pro孵育摇床中于28℃或45℃，150rpm孵育每种样品来开始解聚。定期采样1mL缓冲液的等分试样，在0.22μm注射器过滤器上过滤，并通过带有Aminex HPX-87H柱的高压液相色谱(HPLC)进行分析，以监测乳酸(LA)和乳酸二聚体(DP2)的释放。所使用的色谱系统是Ultimate 3000UHPLC系统(Thermo FisherScientific,Inc.Waltham,MA,USA)，其包括泵模块、自动进样器、在50℃下恒温的柱温箱和在220nm下UV检测器。洗脱液为5mM H2SO4。进样量为20μL样品。乳酸和乳酸二聚体根据从商业化乳酸(Sigma-Aldrich L1750-10G)制备的标准曲线以及在与样品相同的条件下在室内合成的乳酸二聚体来测量。
基于释放的LA和LA的二聚体计算塑料制品的水解。通过在给定时间的LA加上DP2中包含的LA与塑料组合物中最初包含在PLA中的LA的摩尔比来计算降解百分比。表6示出了在28℃下反应10天后或在45℃下反应24小时后的解聚结果。
表6：在28℃下反应10天后或在45℃下反应24小时后，包括16L(A)或变体V8(B)的塑料混配物的解聚
该测试证实了与含有商业化酶的塑料组合物A相比，含有蛋白酶变体V8的塑料组合物B的降解速率更高。10天后，组合物B的降解速率比组合物A的降解速率高10倍。
这些结果有趣地表明，与商业化酶相比，本发明的变体具有更高的PLA降解活性和/或更高的热稳定性。

Claims (14)

1.蛋白酶，其在SEQ ID No:1所示的氨基酸序列的基础上具有选自S101F/L/M/W/Y、S103L、T106I/L、S101F+S103L、S101F+T106I、T106I+G133K、S101F+S103L+T106I、S101F+S103L+G133K、S101F+T106I+G133K、S101F+S103L+T106L、S101F+S103L+T106I+G133K或S101F+S103L+T106I+G131I的氨基酸取代，其中所述位置通过参考SEQ ID No:1所示的氨基酸序列来编号；且与SEQ ID No:1的蛋白酶相比，表现出提高的聚酯降解活性。
2.根据权利要求1所述的蛋白酶，其中与所述SEQ ID No:1的蛋白酶相比，在pH 7-10下，所述蛋白酶表现出提高的聚酯降解活性。
3.核酸，其编码如权利要求1-2中任一项所定义的蛋白酶。
4.表达盒或载体，其包含权利要求3所述的核酸。
5.宿主细胞，其包含权利要求3所述的核酸或权利要求4所述的表达盒或载体。
6.组合物，其包含如权利要求1-2中任一项所定义的蛋白酶，或根据权利要求5所述的宿主细胞，或其包含所述蛋白酶的提取物。
7.制备蛋白酶的方法，其包括：
(a)在适于表达编码所述蛋白酶的核酸的条件下，培养根据权利要求5所述的宿主细胞；和
(b)从所述细胞培养物中回收所述蛋白酶。
8.降解含有至少一种聚酯的塑料制品的方法，其包括：
使所述塑料制品与权利要求1-2中任一项所述的蛋白酶或根据权利要求5所述的宿主细胞或根据权利要求6所述的组合物接触。
9.权利要求8所述的方法，其中所述塑料制品包含至少一种选自以下的聚酯：聚乳酸(PLA)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸乙二醇异山梨酯(PEIT)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)、丁二酸丁二醇酯-己二酸丁二醇酯共聚物(PBSA)、己二酸丁二醇酯-对苯二甲酸丁二醇酯共聚物(PBAT)、聚呋喃二羧酸乙二醇酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、聚(己二酸乙二醇酯)(PEA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，以及这些材料的共混物/混合物。
10.塑料混配物，其含有(i)至少一种聚酯；和(ii)权利要求1-2中任一项所述的蛋白酶或根据权利要求5所述的宿主细胞或其包含所述蛋白酶的提取物或根据权利要求6所述的组合物。
11.权利要求10所述的塑料混配物，其中所述聚酯是聚乳酸。
12.权利要求10所述的塑料混配物，其中所述蛋白酶能够降解所述塑料混配物的至少一种聚酯。
13.制备权利要求10-12中任一项所述的塑料混配物的方法，其中在所述聚酯处于部分或完全熔融状态的温度下，将至少一种聚酯与权利要求1-2中任一项所述的蛋白酶或根据权利要求5所述的宿主细胞或其包含所述蛋白酶的提取物或根据权利要求6所述的组合物混合。
14.根据权利要求1-2中任一项所述的蛋白酶或根据权利要求5所述的宿主细胞或根据权利要求6所述的组合物用于降解含聚酯材料的用途。
CN201880082799.XA 2017-12-21 2018-12-21 新型蛋白酶及其用途 Active CN111542603B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17306878.4 2017-12-21
EP17306878 2017-12-21
PCT/EP2018/086526 WO2019122308A1 (en) 2017-12-21 2018-12-21 Novel proteases and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111542603A CN111542603A (zh) 2020-08-14
CN111542603B true CN111542603B (zh) 2024-04-02

Family

ID=60954837

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880082799.XA Active CN111542603B (zh) 2017-12-21 2018-12-21 新型蛋白酶及其用途

Country Status (10)

Country Link
US (1) US11549105B2 (zh)
EP (1) EP3728571A1 (zh)
JP (2) JP2021508455A (zh)
KR (1) KR20200103757A (zh)
CN (1) CN111542603B (zh)
AU (1) AU2018386552A1 (zh)
BR (1) BR112020012212A2 (zh)
CA (1) CA3084107A1 (zh)
MX (1) MX2020006359A (zh)
WO (1) WO2019122308A1 (zh)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2017016068A (es) 2015-06-12 2018-11-09 Carbios Composicion de mezcla maestra que comprende una elevada concentracion de entidades biologicas.
EP3458508A1 (en) 2016-05-19 2019-03-27 Carbios A process for degrading plastic products
KR102649944B1 (ko) 2016-07-12 2024-03-22 까르비오 신규한 에스테라아제 및 그의 용도
JP7179002B2 (ja) 2016-12-16 2022-11-28 キャルビオス 改良されたプラスチック分解プロテアーゼ
EP3904431A1 (en) 2017-08-31 2021-11-03 Carbios Liquid composition comprising biological entities and uses thereof
JP2021531030A (ja) 2018-07-27 2021-11-18 キャルビオスCarbios 新規なエステラーゼ及びその使用
JP2021531032A (ja) 2018-07-27 2021-11-18 キャルビオスCarbios 新規なエステラーゼ及びその使用
MX2021001045A (es) 2018-07-27 2021-04-12 Carbios Nuevas esterasas y usos de las mismas.
EP4061934A1 (en) 2019-11-18 2022-09-28 Carbios Novel proteases and uses thereof
CA3159993A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 Alain Marty Process for degrading plastic products
EP3838976A1 (en) 2019-12-19 2021-06-23 Carbios Process for degrading plastic products
CN114829470B (zh) 2019-12-19 2024-01-23 卡比奥斯公司 发泡塑料组合物
GB202005073D0 (en) 2020-04-06 2020-05-20 Mellizyme Biotechnology Ltd Enzymatic degradation of plastics
EP4204547A1 (en) 2020-08-28 2023-07-05 Novozymes A/S Protease variants with improved solubility
EP4023752A1 (en) 2020-12-30 2022-07-06 Carbios Novel proteases and uses thereof
CN112903805B (zh) * 2021-01-27 2022-03-01 中国科学院生态环境研究中心 代谢酶诱导微纳塑料颗粒生物降解方法及其产物分析方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010069742A1 (en) * 2008-12-18 2010-06-24 Unilever Nv Laundry detergent composition
WO2014122698A1 (ja) * 2013-02-08 2014-08-14 国立大学法人福島大学 プロテアーゼ、プロテアーゼ含有洗浄剤及びその製造方法
JP2016036327A (ja) * 2014-08-11 2016-03-22 国立大学法人福島大学 プロテアーゼ含有洗浄組成物及びプロテアーゼの安定化方法
CN105452455A (zh) * 2013-07-29 2016-03-30 中央研究院 热稳定角蛋白酶及其用途
WO2016062695A1 (en) * 2014-10-21 2016-04-28 Carbios Polypeptide having a polyester degrading activity and uses thereof

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6449165B2 (ja) 2012-11-20 2019-01-09 キャルビオスＣａｒｂｉｏｓ プラスチック製品をリサイクルする方法
US10385183B2 (en) 2014-05-16 2019-08-20 Carbios Process of recycling mixed PET plastic articles
WO2016097325A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Carbios Plastic compound and preparation process
US10508269B2 (en) 2015-03-13 2019-12-17 Carbios Polypeptide having a polyester degrading activity and uses thereof
MX2017016068A (es) 2015-06-12 2018-11-09 Carbios Composicion de mezcla maestra que comprende una elevada concentracion de entidades biologicas.
RU2758138C2 (ru) 2015-12-21 2021-10-26 Карбио Рекомбинантные клетки дрожжей, продуцирующие полимолочную кислоту, и их использования
EP3458508A1 (en) 2016-05-19 2019-03-27 Carbios A process for degrading plastic products
KR102649944B1 (ko) 2016-07-12 2024-03-22 까르비오 신규한 에스테라아제 및 그의 용도
CN114891768A (zh) 2016-07-12 2022-08-12 卡比奥斯公司 新酯酶及其用途
JP7179002B2 (ja) 2016-12-16 2022-11-28 キャルビオス 改良されたプラスチック分解プロテアーゼ
EP3904431A1 (en) 2017-08-31 2021-11-03 Carbios Liquid composition comprising biological entities and uses thereof
MX2021001045A (es) 2018-07-27 2021-04-12 Carbios Nuevas esterasas y usos de las mismas.
JP2021531030A (ja) 2018-07-27 2021-11-18 キャルビオスCarbios 新規なエステラーゼ及びその使用
JP2021531032A (ja) 2018-07-27 2021-11-18 キャルビオスCarbios 新規なエステラーゼ及びその使用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010069742A1 (en) * 2008-12-18 2010-06-24 Unilever Nv Laundry detergent composition
WO2014122698A1 (ja) * 2013-02-08 2014-08-14 国立大学法人福島大学 プロテアーゼ、プロテアーゼ含有洗浄剤及びその製造方法
CN105452455A (zh) * 2013-07-29 2016-03-30 中央研究院 热稳定角蛋白酶及其用途
JP2016036327A (ja) * 2014-08-11 2016-03-22 国立大学法人福島大学 プロテアーゼ含有洗浄組成物及びプロテアーゼの安定化方法
WO2016062695A1 (en) * 2014-10-21 2016-04-28 Carbios Polypeptide having a polyester degrading activity and uses thereof
CN106852154A (zh) * 2014-10-21 2017-06-13 卡比欧斯公司 具有聚酯降解活性的多肽及其用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Enhanced accumulation and changed monomer composition in polyhydroxyalkanoate (PHA) copolyester by in vitro evolution of Aeromonas caviae PHA synthase;Kichise, T等;《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》;第68卷(第5期);第2411-2419页 *
改性聚乳酸共聚物的酶降解研究;高慧娟;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊） 工程科技I辑》;B014-98 *
生物催化在高分子合成中的应用;李祖义等;《有机化学》(第09期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200103757A (ko) 2020-09-02
JP2021508455A (ja) 2021-03-11
EP3728571A1 (en) 2020-10-28
CN111542603A (zh) 2020-08-14
BR112020012212A2 (pt) 2020-11-24
WO2019122308A1 (en) 2019-06-27
US20200385698A1 (en) 2020-12-10
CA3084107A1 (en) 2019-06-27
MX2020006359A (es) 2020-08-17
AU2018386552A1 (en) 2020-07-16
JP7465391B2 (ja) 2024-04-10
JP2023103426A (ja) 2023-07-26
US11549105B2 (en) 2023-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111542603B (zh) 新型蛋白酶及其用途
US11345906B2 (en) Plastic degrading proteases
JP7392029B2 (ja) 新規エステラーゼ及びその使用
JP6804440B2 (ja) ポリエステル分解活性を有するポリペプチド及びその使用
CN112639101A (zh) 新酯酶及其用途
CN112673104A (zh) 新酯酶及其用途
CN112654701A (zh) 新酯酶及其用途
US20220282235A1 (en) Novel proteases and uses thereof
JP2023546501A (ja) 新規エステラーゼ及びその使用
CN116829710A (zh) 新型蛋白酶及其用途
JP2023546500A (ja) 新規エステラーゼ及びその使用
JP2023546505A (ja) 新規エステラーゼ及びその使用
JP2023546506A (ja) 新規エステラーゼ及びその使用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant