KR20200103757A

KR20200103757A - 신규한 프로테아제 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20200103757A
Application number: KR1020207021217A
Authority: KR
Inventors: 알랭 마르띠; 소피 뒤께스느; 마리 귀셰르; 마끄 게훌; 이자벨 앙드레
Original assignee: 까르비오
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2020-09-02
Also published as: JP2021508455A; EP3728571A1; CN111542603A; BR112020012212A2; CN111542603B; WO2019122308A1; US20200385698A1; CA3084107A1; MX2020006359A; AU2018386552A1; JP7465391B2; JP2023103426A; US11549105B2

Abstract

본 발명은 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여 증진된 활성을 갖는 신규한 프로테아제, 보다 특히 프로테아제 변이체 및 폴리에스테르 함유 물질, 예를 들면, 플라스틱 생성물을 분해하기 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 프로테아제는 폴리락트산, 및 폴리락트산을 함유하는 물질을 분해하는데 특히 적합하다.

Description

신규한 프로테아제 및 이의 용도

본 발명은 프로테아제, 보다 특히 모 프로테아제와 비교하여 증진된 활성을 갖는 프로테아제 및 폴리에스테르 또는 폴리에스테르 함유 물질, 예를 들면, 플라스틱 생성물을 분해하기 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 프로테아제는 폴리락트산, 및 폴리락트산 함유 물질을 분해하는데 특히 적합하다.

배경

프로테아제는 다양한 중합체, 예를 들면, 폴리에스테르의 가수분해를 촉매할 수 있다. 이러한 맥락에서, 프로테아제는 다수의 산업적 적용, 예를 들면, 식기세척 및 세탁 적용을 위한 세제로서, 바이오매스(biomass) 및 식품 가공용 분해 효소로서, 환경 오염물질의 해독작용시 생물촉매로서 또는 섬유 산업에서 폴리에스테르 직물의 처리를 위해 촉망되는 효과를 나타내었다. 유사하게, 폴리락트산(PLA)을 가수분해하기 위한 분해 효소로서 프로테아제의 용도가 특히 관심이 집중되고 있다. 실제로, PLA는 다수의 기술 분야, 예를 들면, 유연하고 단단한 포장(packing), 가방, 멀칭 필름(mulching film)에서 뿐만 아니라, 의복 및 카페트의 제조시 사용되는 생물-기반 중합체(즉, 천연 및/또는 재생원으로부터 유래된 중합체)이다. 따라서, 쓰레기매립지에서의 PLA 축적은 증가하는 생태학적 문제가 되고 있다.

프로테아제들 중에서, 세린 프로테아제(EC 3.4.21)는 단백질내 펩타이드 아미드 결합을 절단하는 효소이며, 여기서 세린은 효소 활성 부위에서 친핵성 아미노산으로서 작용한다. 세린 프로테아제는 진핵세포 및 원핵세포 둘 모두에서 편재적으로 발견된다. 다수의 세균 세린 프로테아제가 바실러스 및 보다 최근에는 다른 중온성 숙주에서 초기에 확인되었다. 그러나, 증가하는 수의 세린 프로테아제는 호열성 및 초호열성 세균으로부터 단리되었다.

생물학적 분해, 및 보다 특히 효소 분해는 플라스틱 폐기물 축적을 감소시키는 관심있는 해결책으로 고려되고 있다. 실제로, 효소는 폴리에스테르 함유 물질, 및 보다 특히 플라스틱의 가수분해를 심지어 단량체 수준으로 가속화시킬 수 있다. 또한, 가수분해물(즉, 단량체 및 올리고머)는 신규 중합체의 합성을 위한 물질로 재생될 수 있다. 최근에, 플라스틱 물질의 적어도 하나의 중합체를 분해시키는데 적합한 생물학적 실체를 통합하여 생분해가능한 플라스틱 생성물을 생성하도록 하는 신규한 플라스틱 물질이 개발되었다. 예로서, PLA로 제조되고 프로테아제를 함유하는 플라스틱 생성물이 생산되었다. 이러한 생분해성 플라스틱은 적어도 부분적으로 쓰레기매립지 부지 및 천연 서식지에서 플라스틱 증가(plastic build-up)의 문제를 적어도 부분적으로 해결할 수 있다.

이와 관련하여, 수개의 프로테아제가 후보물 분해 효소로서 확인되었다. 예를 들면, 악티노마두라 종(Actinomadura sp.)(WO 2016/062695)의 프로테아제가 폴리에스테르, 및 보다 특히 폴리락트산를 분해하는 이의 능력에 대해 기술되었다.

그러나, 보다 높은 효율을 지닌 분해 공정을 허용함으로써 생분해가능한 플라스틱 생산 공정, 생물학적 폴리에스테르 분해 공정 및/또는 생물학적 재활용 공정의 경쟁력을 향상시키는 증진된 활성을 지닌 프로테아제가 여전히 요구되고 있다.

발명의 요약

본 발명은 모, 또는 야생형 프로테아제와 비교하여 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타내는 프로테아제의 신규 변이체를 제공한다. 이러한 프로테아제는 폴리에스테르(들) 및/또는 플라스틱 물질 및 폴리에스테르(들)을 함유하는 생성물, 예를 들면, PLA 또는 플라스틱 물질 및 폴리락트산(PLA)을 함유하는 생성물을 분해하는 공정에서 특히 유용하다. 보다 특히, 본 발명은 모 프로테아제 또는 야생형 프로테아제로서 본원에 지칭된 서열 번호 1에 설정된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 악티노마두라 종(Actinomadura sp.)의 프로테아제 프로테아제의 변이체를 제공한다. 흥미롭게도, 야생형 프로테아제 및 변이체 둘 다는 서브틸리신-유사 프로테아제로서 고려된다. 본 발명은 또한 본 발명의 변이체를 사용하여 폴리에스테르(들) 및/또는 플라스틱 물질 및 폴리에스테르(들)을 함유하는 생성물, 및 보다 특히 폴리락트산(PLA) 및/또는 플라스틱 물질 및 PLA를 함유하는 생성물을 분해하기 위한 공정을 제공한다.

이와 관련하여, 본 발명의 목적은 (i) 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성(identity)을 갖고, (ii) S101, S103, T106, G131, 또는 G133로부터 선택된 위치(여기서 이러한 위치는 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 참고로 번호매김된다)에서의 적어도 하나의 아미노산 치환을 가지며, (iii) 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타내는 프로테아제 변이체를 제공하는 것이다.

특수한 구현예에서, 프로테아제는 S101F/L/M/W/Y, S103L, T106I/L, G131I, 또는 G133K로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 치환, 바람직하게는 S101F/L/M/W/Y로부터 선택된 적어도 하나의 치환, 보다 바람직하게는 적어도 치환 S101F을 포함한다.

본 발명의 추가의 목적은 (i) 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖고, (ii) S101F/L/M/W/Y, S103L, T106I/L, G131I, 또는 G133K로부터 선택된 위치(여기서 이러한 위치는 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 참고로 번호매김된다)에서의 적어도 하나의 아미노산 치환, 바람직하게는 S101F/L/M/W/Y로부터 선택된 적어도 하나의 치환, 보다 바람직하게는 적어도 치환 S101F을 갖고, (iii) 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타내는 는 프로테아제 변이체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖고, (ii) 위치 S101 및 S103(여기서 이러한 위치는 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 참고로 번호매김된다) 둘 모두에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖고, (iii) 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타내는 프로테아제 변이체를 제공하는 것이다. 이러한 경우에, 치환은 바람직하게는 S101F/L/M/W/Y 및 S103L로부터 선택된다.

본 발명은 보다 특히 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성, 및 S101F + S103L, S101F + T106I, T106I + G133K, S101F + S103L + T106I, S101F + S103L + G133K, S101F + T106I + G133K, S101F + S103L + T106L, S101F + S103L + T106I + G133K, S101F + S103L + T106I + G131I, 바람직하게는 S101F + S103L + T106I/L로부터 선택된 치환의 적어도 하나의 조합을 갖는 구체적인 프로테아제를 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 정의된 바와 같은 프로테아제를 암호화하는 핵산을 제공하는 것이다. 본 발명은 또한 상기 핵산을 포함하는 발현 카세트 또는 발혁 벡터, 및 상기 핵산, 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 목적은:

(a) 상기 정의된 바와 같은 숙주 세포를 프로테아제를 암호화하는 핵산을 발현시키기에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 임의로

(b) 상기 프로테아제를 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 프로테아제를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한 적어도 하나의 폴리에스테르, 바람직하게는 PLA를 함유하는 플라스틱 생성물을 분해하는 방법에 관한 것이다.

(a) 플라스틱 생성물을 상기 정의된 바와 같은 프로테아제 또는 숙주 세포와 접촉시켜 플라스틱 생성물을 분해하는 단계; 및 임의로

(b) 단량체 및/또는 올리고머, 바람직하게는 락트산(LA)의 단량체 및/또는 올리고머를 회수하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 폴리에스테르, 바람직하게는 PLA를 함유하는 플라스틱 생성물을 분해하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 프로테아제 또는 숙주 세포를 포함하는 물질을 함유하는 폴리에스테르에 관한 것이다. 본 발명은 보다 바람직하게는 본 발명에 따른 프로테아제 또는 숙주 세포를 포함하는 물질 또는 조성물을 함유하는 폴리락트산(PLA)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리에스테르, 바람직하게는 PLA, 및 프로테아제 또는 숙주 세포 또는 조성물을 혼합하는 단계를 포함하는, 이러한 폴리에스테르 함유 물질을 생산하는 공정을 제공하며, 여기서 혼합 단계는 폴리에스테르가 바람직하게는 압출 공정 동안에 부분적으로 또는 전체적으로 용융 상태로 있는 온도에서 수행된다.

본 발명은 또한 폴리에스테르 함유 물질, 보다 바람직하게는 PLA 함유 물질을 분해하기 위한 상술한 바와 같은 프로테아제의 용도에 관한 것이다.

도면에 대한 범례
도 1a 및 1b 및 1c는 45℃에서 5시간 항온처리(incubation) 후 야생형 프로테아제(서열 번호 1 - 도 1a) 및 본 발명의 프로테아제(V8 - 도 1b 및 V19 - 도 1c)둘 모두에 대해 고체 형태의 유단백질의 분해를 기반으로 한 특이적인 프로테아제 활성을 나타낸다.

발명의 상세한 설명

정의

본 개시내용은 다음의 정의를 참고로 가장 잘 이해될 것이다.

본원에서, 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", "단백질", "효소"는 상기 쇄를 형성하는 아미노산의 수와 상관없이, 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산의 쇄를 지칭한다. 아미노산은 본원에서 다음의 명명법에 따라 이들의 1-문자 또는 3-문자 코드로 나타낸다: A: 알라닌(Ala); C: 시스테인(Cys); D: 아스파르트산(Asp); E: 글루탐산(Glu); F: 페닐알라닌(Phe); G: 글리신(Gly); H: 히스티딘(His); I: 이소루이신(Ile); K: 라이신(Lys); L: 루이신(Leu); M: 메티오닌(Met); N: 아르파라긴(Asn); P: 프롤린(Pro); Q: 글루타민(Gln); R: 아르기닌(Arg); S: 세린(Ser); T: 트레오닌(Thr); V: 발린(Val); W: 트립토판(Trp ) 및 Y: 타이로신(Tyr).

용어 "프로테아제"는 펩타이드 또는 단백질 내 펩타이드 결합의 가수분해를 촉매할 수 있는 효소 명명법에 따라 EC 3.4로 분류된 하이드롤라제 부류에 속하는 효소를 지칭한다. 용어 "세린 프로테아제"는 효소 위원회(Enzyme Commission)의 명명법에 따라 EC 3.4.21로 분류된 프로테아제를 지칭한다.

용어 "야생형 단백질" 또는 "모 단백질"은 상호교환적으로 사용되며 이는 천연적으로 존재하므로 폴리펩타이드의 돌연변이되지 않은 버젼을 지칭한다. 모 프로테아제의 예는 서열 번호 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 프로테아제이다.

용어 "돌연변이체" 및 "변이체"는 야생형 또는 모 폴리펩타이드로부터 유래되고 적어도 하나의 변형 또는 변경, 즉 적어도 하나 이상의 위치에서 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다. 변이체는 당해 분야에 잘 공지된 다양한 기술에 의해 수득될 수 있다. 특히, 야생형 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 변경시키는 기술의 예는 부위-지시된 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발 및 합성 올리고뉴클레오타이드 작제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "변형" 및 "변경"은 적어도 이러한 특수한 위치에서의 아미노산이 야생형 단백질 내 이러한 특수한 위치에서의 아미노산과 비교하여 변형되었음을 의미한다.

"치환"은 다른 아미노산 잔기에 의해 대체됨을 의미한다. 바람직하게는, 용어 "치환"은 아미노산의 천연적으로 존재하는 표준의 20개 아미노산 잔기, 드물게 천연적으로 존재하는 아미노산 잔기(예컨대, 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 알로하이드록시라이신, 6-N-메틸라이신, N-에틸글리신, N-메틸글리신, N-에틸아스파라긴, 알로-이소루이신, N-메틸이소루이신, N-메틸발린, 피로글루타민, 아미노부티르산, 오르니틴, 노르루이신, 노르발린), 및 흔히 합성적으로 제조된 비-천연적으로 존재하는 아미노산 잔기(예컨대, 사이클로헥실-알라닌)로부터 선택된 다른 것에 의한 교체를 지칭한다. 바람직하게는, 용어 "치환"은 아미노산 잔기의 천연적으로 존재하는 표준의 20 아미노산 잔기(G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S 및 T)에 의한 교체를 지칭한다. 신호 "+"는 치환의 조합을 나타낸다. 본 서류에서, 다음의 전문용어가 치환을 저정하기 위해 사용된다: Y167R은 모 서열의 167번 위치에서 아미노산 잔기 타이로신(Y)이 아르기닌(R)으로 치환되어 있음을 나타낸다. Y167V/I/M은 모 서열의 167번 위치에서 아미노산 잔기 타이로신(Y)이 다음의 아미노산 중 하나에 의해 치환되어 있음을 나타낸다: 발린(V), 이소루이신(I), 또는 메티오닌(M). 치환은 보존적 또는 비-보존적 치환일 수 있다. 보존적 치환의 예는 염기성 아미노산(아르기닌, 라이신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민, 아스파라긴 및 트레오닌), 소수성 아미노산(메티오닌, 루이신, 이소루이신, 시스테인 및 발린), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신), 및 소 아미노산(글리신, 알라닌 및 세린)의 그룹 내에 있다.

달리 명시하지 않는 한, 본원에 개시된 위치는 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열에 대한 참고로 번호매김된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 2개의 폴리펩타이드 서열 사이의 매치(동일한 아미노산 잔기)의 수(또는 퍼센트 %로 나타낸 부분)를 지칭한다. 서열 동일성은 정렬시켜 서열 갭(sequence gap)을 최소화하면서 오버랩 및 동일성을 최대화시키는 경우 서열을 비교하여 측정한다. 특히, 서열 동일성은 2개의 서열의 길이에 따라 다수의 수학적인 전체 또는 국소 정렬 알고리즘 중 어느 것을 사용하여 측정할 수 있다. 유사한 길이의 서열은 바람직하게는 전체 길이에 걸쳐 최적으로 서열을 정렬하는 전체 정렬 알고리즘(예컨대, Needleman and Wunsch 알고리즘; Needleman and Wunsch, 1970)을 사용하여 정렬되는 반면, 실질적으로 상이한 길이의 서열은 바람직하게는 국소 정렬 알고리즘(예컨대, Smith and Waterman 알고리즘(Smith and Waterman, 1981) 또는 Altschul 알고리즘(Altschul et al., 1997; Altschul et al., 2005))을 사용하여 정렬된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 측정하기 위한 목적의 정렬은 당해 분야의 기술내에 있는 다양한 방법, 예를 들면, 인터넷 웹 사이트, 예를 들면 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 또는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)에서 이용가능한 공공 이용의 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당해 분야의 기술자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 요구되는 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 측정할 수 있다. 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성 값 %는 Needleman-Wunsch 알고리즘을 사용하여 2개의 서열의 최적의 전체 정렬을 생성하는 쌍식 서열 정렬 프로그램 EMBOSS Needle을 사용하여 생성시킨 값을 지칭하며, 여기서 모든 조사 매개변수는 디폴트 값(default value)에 대해 설정된다, 즉, 점수매김 매트릭스 = BLOSUM62, 갭 오픈(Gap open) = 10, 갭 연장(Gap extend) = 0.5, 말단 갭 페널티(End gap penalty) = 거짓(false), 말단 갭 오픈(End gap open) = 10 및 말단 갭 연장(and End gap extend) = 0.5.

용어 "재조합체"는 유전 공학에 의해 생산된 핵산 작제물, 벡터, 폴리펩타이드 또는 세포를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "발현"은 전사, 전사 후 변형, 해독, 해독 후 변형, 또는 분비와 같이 폴리펩타이드의 생산에 포함된 임의의 단계를 지칭한다.

본 발명에 따라서, "올리고머"는 2 내지 약 20개의 단량체를 함유하는 분자를 지칭한다.

본 설명에서, "폴리에스테르"는 폴리락트산(PLA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트(PTT), 폴리부틸렌 테레프탈레이트(PBT), 폴리에틸렌 이소소르바이드 테레프탈레이트(PEIT), 폴리하이드록시알카노에이트(PHA), 폴리부틸렌 석시네이트(PBS), 폴리부틸렌 석시네이트 아디페이트(PBSA), 폴리부틸렌 아디페이트 테레프탈레이트(PBAT), 폴리에틸렌 푸라노에이트(PEF), 폴리카프로락톤(PCL), 또는 폴리(에틸렌 아디페이트)(PEA) 뿐만 아니라, 이러한 중합체의 임의의 배합물/혼합물을 포함한다. 특수한 구현예에서, "폴리에스테르"는 또한 폴리(글리콜산)(PGA) 또는 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 뿐만 아니라 이러한 중합체의 임의의 배합물/혼합물을 포함한다.

본 발명의 맥락에서, "폴리에스테르 함유 물질" 또는 "폴리에스테르 함유 생성물"은 결정성, 반-결정성 또는 전체적으로 무정형 형태의 적어도 하나의 폴리에스테르를 포함하는 생성물, 예를 들면, 플라스틱 생성물을 지칭한다. 특수한 구현예에서, 폴리에스테르 함유 물질은 적어도 하나의 플라스틱 물질, 예를 들면, 플라스틱 시이트(pastic sheet), 튜브, 막대, 프로파일(profile), 형태(shape), 필름, 거대 블록, 섬유, 직물 등으로부터 제조된 임의의 항목을 지칭하며, 이는 적어도 하나의 폴리에스테르, 및 가능하게는 다른 물질 또는 첨가제, 예를 들면, 가소제, 광물 또는 유기 충전제를 함유한다. 다른 특수한 구현예에서, 폴리에스테르 함유 물질은 적어도 하나의 폴리에스테르를 포함하는 직물(textile), 패브릭(fabric) 또는 섬유(fiber)를 지칭한다. 다른 특수한 구현예에서, 폴리에스테르 함유 물질은 적어도 하나의 폴리에스테르를 포함하는 플라스틱 페기물 또는 섬유 폐기물을 지칭한다. 다른 특수한 구현예에서, 폴리에스테르 함유 물질은 플라스틱 생성물을 제조하는데 적합한 용융되거나 고체 상태인 플라스틱 화합물, 또는 플라스틱 제형을 지칭한다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "증가된 분해 활성"은 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여, 폴리에스테르, 바람직하게는 PLA 또는 적어도 하나의 폴리에스테르, 바람직하게는 적어도 PLA를 포함하는 플라스틱 생성물 또는 물질를 분해하는 효소의 증가된 능력을 나타낸다. 이러한 증가는 모 프로테아제와 비교하여 전형적으로 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상이다.

단백질의 활성은 당해 분야에 공지된 방법에 따라, 당해 분야의 기술자에 의해 평가될 수 있다. 예를 들면, 활성은 특이적인 프로테아제 활성율의 측정, pNA (N-석시닐-Ala-Ala-Ala-p-니트로아닐리드)의 가수분해의 측정, 특이적인 폴리에스테르 해중합(depolymeraization) 활성 속도의 측정, 아가 플레이트(agar plate) 속에 분산된 고체 폴리에스테르 화합물 또는 단백질을 분해하는 속도의 측정, 폴리에스테르를 함유하는 유액의 혼탁도의 감소의 측정, 또는 반응기 속에서 특이적인 폴리에스테르 해중합 활성의 측정에 의해 평가될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 표적화된 폴리에스테르에 대한 용어 "특이적인 분해 활성"은 상기 표적화된 폴리에스테르를 함유하는 플라스틱 생성물을 본 발명에 따른 프로테아제와 접촉시키는 경우, 온도, pH 및 완충액의 적합한 조건 하의 시간당 및 효소 mg당 방출된 단량체 및/또는 올리고머의 초기 비율을 나타낸다. 예로서, PLA에 대한 특이적인 분해 활성은 시간 당 및 효소 mg당 생산된 락트산 및 락트산의 이량체의 mg, 또는 가수분해 곡선의 선형 부분에서 측정된, 분당 및 효소 mg 당 가수분해된 PLA의 μmol에 상응한다.

신규한 프로테아제

현재 이용가능한 효소와 비교하여 증진된 폴리에스테르-분해 활성을 갖는 신규 프로테아제의 개발에 대해 연구함으로써, 본 발명자는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 세린 프로테아제에서 추가로 연구하고 증진된 폴리에스테르-분해 활성을 나타내는 이의 변이체를 개발할 수 있었다. 특히, 본 발명자는 단백질 내에서 특이적인 아미노산 잔기를 확인하였으며, 이는 폴리에스테르 기질과 접촉되어야 하는 것으로 의도되며 유리하게 변형되어 폴리에스테르 기질과 단백질의 접촉을 촉진할 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 이러한 변형은 폴리에스테르 상의 프로테아제의 흡수를 증가시켜 증진된 분해 활성을 생성하는 것으로 간주된다. 따라서, 본 발명자는 특히 높은 활성을 나타내고 폴리에스테르 또는 폴리에스테르-함유 생성물을 분해하는데 특히 적합한 서열 번호 1로부터 유래된 신규한 프로테아제를 개발할 수 있었다. 흥미롭게도, 이러한 신규 프로테아제는 산업 공정에서 사용하기 위한 우수한 특성을 갖는다. 새로이 개발된 프로테아제는 분해가능한 플라스틱 생성물의 산업적 생산이 수행될 수 있고/있거나 플라스틱 생성물의 환경적 분해가 수득될 수 있는 조건에서 증진된 활성을 나타낸다.

구현예에 따라서, 프로테아제는 서열 번호 1의 프로테아제의 변이체이며, 이는 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지고, 이는 S101, S103, T106, G131 또는 G133로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 치환을 가지며, 여기서 위치는 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열에 대해 참고로 번호매김된다.

표적화된 아미노산(들)은, 수득되는 폴리펩타이드가 프로테아제 활성을 보유하는 한, 천연적으로 존재하는 아미노산 잔기, 드믄 천연적으로 존재하는 아미노산 잔기 및 비-천연적으로 존재하는 아미노산 잔기로부터 선택된 임의의 아미노산에 의해 잠재적으로 대체될 수 있다. 바람직하게는, 표적화된 아미노산(들)은 19개의 다른 아미노산 중 임의의 하나로 대체될 수 있다.

대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 프로테아제는 (i) 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖고, (ii) S101F/L/M/W/Y, S103L, T106I/L, G131I, 또는 G133K로부터 선택된 위치(여기서 이러한 위치는 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열에 대해 참고로 번호매김된다)에서 적어도 하나의 아미노산 치환, 바람직하게는 S101F/L/M/W/Y로부터 선택된 적어도 하나의 치환, 보다 바람직하게는 적어도 치환 S101F를 갖고 (iii) 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타낸다. 모든 다음의 제한은 구현예 둘 다에 대해 적용될 수 있다.

특수한 구현예에서, 프로테아제 변이체는 S101, S103, T106, G131 또는 G133으로부터 선택된 위치, 바람직하게는 위치 S101 또는 S103에서, 서열 번호 1과 비교하여 단일의 치환을 포함한다. 바람직하게는, 프로테아제 변이체는 S101F/L/M/W/Y, S103L, T106I/L, G131I 또는 G133K로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 S101F 또는 S103L로부터 선택된 단일의 치환을 포함한다.

특수한 구현예에서, 프로테아제는 치환 S101F (V1), S103L (V2), T106I (V3), G131I (V4), G133K (V5), S101L (V14), S101M (V15), S101W (V16), S101Y (V17) 또는 T106L (V18)을 제외하고는, 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다.

다른 특수한 구현예에서, 프로테아제 변이체는 서열 번호 1과 비교하여 2개 이상의 치환을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 치환은 S101, S103, T106, G131 또는 G133로부터 선택된 위치에 있다. 바람직한 구현예에서, 변이체는 위치 S101, S103 또는 T106에서 적어도 하나의 치환을 포함한다. 특수한 구현예에서, 프로테아제 변이체는 S101F/L/M/W/Y, S103L, T106I/L, G131I 또는 G133K로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함한다. 바람직하게는, 프로테아제 변이체는 적어도 치환 S101F, S103L 또는 T106I/L을 포함한다.

다른 특수한 구현예에서, 프로테아제 변이체는 S101, S103, T106, G131 또는 G133으로부터 선택된 위치에서 적어도 2개의 치환을 포함한다. 유리하게는, 프로테아제 변이체는 S101F/L/M/W/Y, S103L, T106I/L, G131I 또는 G133K로부터 선택된 적어도 2개의 치환을 포함한다.

대안적으로, 또는 추가로, 본 발명의 프로테아제는 (i) 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖고, (ii) 위치 S101 및 S103 둘 모두에서 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서 위치는 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열에 대해 참고로 번호매김된다)을 가지며, (iii) 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타낸다. 유리하게는 치환은 S101F/L/M/W/Y 및 S103L로부터 선택되며, 바람직하게는 S101F 및 S103L로 이루어진다.

특수한 구현예에서, 프로테아제는 S101F/L/M/W/Y + S103L로부터 선택된 치환의 조합을 제외하고는, 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다.

대안적으로, 또는 추가로, 본 발명의 프로테아제는 (i) 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지고, (ii) 위치 S103 및 T106 둘 모두에서 적어도 아미노산 치환(여기서 위치는 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열에 대한 참고로 번호매김된다)을 가지고, (iii) 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타낸다. 유리하게는, 치환은 S103L 및 T106I/L로부터 선택된다.

유리하게는, 또는 추가로, 본 발명의 프로테아제는 (i) 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖고, (ii) 위치 S101 및 T106 둘 모두에서 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서 위치는 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열에 대한 참고로 번호매김된다)을 가지며, (iii) 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타낸다. 유리하게는, 치환은 S101F/L/M/W/Y 및 T106I/L로부터 선택되고, 바람직하게는 S101F 및 T106I/L로 이루어진다.

유리하게는, 또는 추가로, 본 발명의 프로테아제는 (i) 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖고, (ii) 위치 T106 및 G133 둘 모두에서 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서 위치는 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열에 대한 참고로 번호매김된다)을 가지며, (iii) 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타낸다. 유리하게는, 치환은 T106I/L 및 G133K로부터 선택된다.

특수한 구현예에서, 프로테아제는 S101F + S103L, S101F + T106I, T106I + G133K로부터 선택된 적어도 2개의 치환, 바람직하게는 적어도 S101F + S103L의 조합을 포함한다.

특수한 구현예에서, 프로테아제는 S101F + S103L (V6), S101F + T106I (V7), S103L+T106L, 및 T106I + G133K (V9)로부터 선택된 치환의 조합, 바람직하게는 조합 S101F + S103L을 제외하고는, 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다.

특수한 구현예에서, 프로테아제는 S101, S103, T106, G131 또는 G133으로부터 선택된 위치에서 적어도 3개의 치환을 포함한다. 유리하게는, 프로테아제 변이체는 S101F/L/M/W/Y, S103L, T106I/L, G131I 또는 G133K로부터 선택된 적어도 3개의 치환을 포함한다. 특수한 구현예에 따라서, 프로테아제 변이체는 위치 S101 + S103 + G133, 바람직하게는 S101F + S103L + G133K에서 적어도 3개의 치환을 포함한다. 다른 특수한 구현예에 따라서, 프로테아제 변이체는 위치 S101 + T106 + G133, 바람직하게는 S101F + T106I + G133K에서 적어도 3개의 치환을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 프로테아제 변이체는 위치 S101 + S103 + T106, 바람직하게는 S101F + S103L + T106I/L에서 적어도 3개의 치환을 포함한다.

특수한 구현예에 따라서, 프로테아제는 적어도 S101F + S103L + G133K, S101F + S103L + T106I, S101F + T106I+ G133K, S101F + S103L + T106L, 바람직하게는 S101F + S103L + T106I 또는 S101F + S103L + T106L로부터 선택된 치환의 조합을 포함한다.

특수한 구현예에서, 프로테아제는 치환 S101F + S103L + G133K (V10), S101F + S103L + T106I (V8), S101F + T106I+ G133K (V11) 또는 S101F + S103L + T106L (V19)의 조합을 제외하고는, 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다.

특수한 구현예에 따라서, 프로테아제는 적어도 S101F + S103L + T106I + G133K 또는 S101F + S103L + T106I + G131I로부터 선택된 치환의 조합을 포함한다.

특수한 구현예에서, 프로테아제는 치환 S101F + S103L + T106I+ G133K (V12) 또는 S101F + S103L + T106I+ G131I (V13)의 조합을 제외하고는, 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다.

특수한 구현예에서, 본 발명의 프로테아제 변이체는 D12, L21, T175, S194, H197, G212, I217 또는 R247로부터 선택된 위치(여기서 위치는 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열에 대해 참고로 번호매김된다)로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환, 바람직하게는 D12C + L21C, T175C + R247C, S194P, H197D, G212N, 또는 I217K로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 추가로 포함한다.

특수한 구현예에서, 프로테아제는 서열 번호 28에 나타낸 아미노산 서열 및 S101, S103, T106, G131 또는 G133으로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 치환을 가지며 여기서 위치는 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 참고로 번호매김된다. 바람직하게는, 프로테아제는 서열 번호 28에 나타낸 아미노산 서열 및 S101F/L/M/W/Y, S103L, T106I/L, G131I, 또는 G133K로부터 선택된 위치(여기서 위치는 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열에 대한 참고로 번호매김된다)에서 적어도 하나의 아미노산 치환, 보다 바람직하게는 S101F/L/M/W/Y, 보다 바람직하게는 적어도 치환 S101F로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 갖는다.

프로펩타이드

유리하게는, 프로테아제 변이체 및/또는 모 프로테아제는 N-말단 끝에 3D 폴딩 및 프로테아제의 성숙에 적어도 부분적으로 관여하는 "프로펩타이드"로서 작용하는 아미노산 서열(서열 번호 2)을 포함한다.

특히, 프로테아제 변이체 및/또는 모 프로테아제는 N-말단 끝에서 서열 번호 2에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

특수한 구현예에 따라서, 프로테아제 변이체 및/또는 모 프로테아제는 N-말단 끝에서 서열 번호 2에 나타낸 전체 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, M8, D75, A76, I78 또는 D81로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 가지며 여기서 위치는 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 대한 참고로 번호매김된다. 본 발명에 따라서, 표적화된 아미노산(들)은 표준의 천연적으로 존재하는 아미노산 잔기, 드믄 천연적으로 존재하는 아미노산 잔기 및 비-천연적으로 존재하는 아미노산 잔기로부터 선택된 다른 아미노산 중 임의의 하나로 대체될 수 있다. 바람직하게는, 표적화된 아미노산(들)은 19개의 다른 아미노산 중 임의의 하나로 대체될 수 있다.

폴리에스테르 분해 활성

본 발명의 목적은 프로테아제 활성을 갖는 신규한 효소를 제공하는 것이다.

특수한 구현예에서, 본 발명의 프로테아제는 폴리에스테르 분해 활성, 바람직하게는 폴리락트산 분해 활성을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 프로테아제는 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타낸다.

유리하게는, 본 발명의 프로테아제 변이체 및/또는 모 프로테아제는 10 내지 90℃, 바람직하게는 20℃ 내지 70℃, 보다 바람직하게는 30℃ 내지 60℃의 온도 범위, 심지어 보다 바람직하게는 45℃에서 폴리에스테르 분해 활성을 나타낸다. 특수한 구현예에서, 폴리에스테르 분해 활성은 여전히 40℃ 내지 60℃, 바람직하게는 50℃ 내지 60℃의 온도에서 측정가능하다. 다른 특수한 구현예에서, 폴리에스테르 분해 활성은 천연 환경에서 평균 온도에 상응하는 10℃ 내지 30℃, 바람직하게는 15℃ 내지 28℃에서 여전히 측정가능하다.

특수한 구현예에서, 본 발명의 프로테아제 변이체는 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여, 주어진 온도에서, 및 보다 바람직하게는 20℃ 내지 80℃, 보다 바람직하게는 30℃ 내지 70℃, 심지어 보다 바람직하게는 40℃ 내지 60℃, 심지어 보다 바람직하게는 45℃의 온도에서 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 갖는다. 특수한 구현예에서, 프로테아제 변이체는 45℃에서 서열 번호 1의 프로테아제의 폴리에스테르 분해 활성보다 5% 더 높은, 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 50%, 100%, 200%, 300%, 500% 이상의 폴리에스테르 분해 활성을 갖는다.

특수한 구현예에서, 본 발명의 프로테아제 변이체는 10℃ 내지 30℃, 보다 바람직하게는 15℃ 내지 30℃, 심지어 보다 바람직하게는 20℃ 내지 30℃, 심지어 보다 바람직하게는 28℃의 온도에서 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여, 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 갖는다. 특수한 구현예에서, 프로테아제 변이체는 28℃에서 서열 번호 1의 프로테아제의 폴리에스테르 분해 활성보다 적어도 5% 더 높은, 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 50%, 100%, 200%, 300%, 500% 이상의 폴리에스테르 분해 활성을 갖는다.

특수한 구현예에서, 본 발명의 프로테아제 변이체는 5 내지 11의 pH의 범위, 바람직하게는 7 내지 10의 pH의 범위, 보다 바람직하게는 7.5 내지 9의 pH 범위, 심지어 보다 바람직하게는 pH 7.5 및 9 둘 모두에서 측정가능한 폴리에스테르 분해 활성을 나타낸다.

열안전성

유리하게는, 본 발명의 변이체 프로테아제의 열안전성은 서열 번호 1의 모 프로테아제의 열안전성과 비교하여 손상되지 않는다. 보다 유리하게는, 변이체의 열안전성은 모 프로테아제의 열안전성과 비교하여 증진되어 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "증진된 열안전성"은 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여, 고온, 및 보다 특히 40℃ 내지 90℃, 예를 들면, 70℃의 온도에서 이의 화학적 및/또는 물리적 구조의 변화에 견디는 효소의 증가된 능력을 나타낸다. 특히, 본 발명의 프로테아제는 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여, 40℃ 내지 90℃, 예를 들면, 70℃의 온도에서 증가된 잔류 분해 활성을 가질 수 있다. 특히, 본 발명의 프로테아제는 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여, 40℃ 내지 90℃, 예를 들면, 70℃의 온도에서 증가된 반감기를 가질 수 있다. 특히, 본 발명의 변이체는 압출 공정 동안, 및 보다 특히 50℃ 내지 250℃, 바람직하게는 130℃ 내지 180℃를 포함한 온도에서 수행된 압출 공정 동안에 증진된 열안전성을 나타낸다.

단백질의 열안전성은 당해 분야에 공지된 방법에 따라, 당해 분야의 기술자에 의해 평가될 수 있다. 예를 들면, 열안전성은 상이한 온도에서 항온처리 후 잔류 프로테아제 활성 및/또는 효소의 잔류 폴리에스테르 해중합 활성(즉, 폴리에스테르 분해 활성)을 측정함으로써 평가할 수 있다. 상이한 온도에서 폴리에스테르의 해중합 검정의 수회 라운드를 수행하기 위한 능력을 또한 평가할 수 있다. 신속하고 정성적인 시험은 상이한 온도에서 항온처리 후 아가 플레이트 속에 분산된 고체 폴리에스테르 화합물을 분해하는 효소 능력의 할로 직경 측정(halo diameter measurement)에 의한 평가로 이루어질 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 차등 주사 형광측정법(DSF)을 수행하여 단백질/효소의 열안전성을 평가할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 원편광 이색성을 사용하여 단백질의 열 변성 온도의 변화를 정량화함으로써 이의 융점(Tm)을 측정한다. 본 발명의 맥락에서, 주어진 단백질의 "용융 온도(Tm)"는 상기 단백질의 1/2이 변성되는(폴딩되지 않거나 잘못폴딩된) 온도에 상응한다. Tm은 실험 부분에 노출된 바와 같은 원편광 이색성을 사용하여 측정할 수 있다.

유리하게는, 본 발명의 프로테아제는 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여 보다 높거나 동등한 용융 온도(Tm)를 나타낸다. 특수한 구현예에서, 본 발명의 프로테아제는 40℃ 초과, 바람직하게는 45℃ 초과, 보다 바람직하게는 50℃ 초과의 용융 온도를 나타낸다.

핵산, 발현 카세트, 벡터, 숙주 세포

본 발명의 추가의 목적은 상기 정의한 바와 같은 프로테아제를 암호화하는 핵산을 제공하는 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산", "핵산 서열", "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드" 및 "뉴클레오타이드 서열"은 상호교환적으로 사용되며 데옥시리보뉴클레오타이드 및/또는 리보뉴클레오타이드의 서열을 지칭한다. 핵산은 DNA(cDNA 또는 gDNA), RNA, 또는 이의 혼합물로 존재할 수 있다. 이는 단일 가닥 형태 또는 듀플렉스 형태(duplex form) 또는 이의 혼합물일 수 있다. 이는 재조합, 인공 및/또는 합성 기원일 수 있으며 이는 예를 들면, 변형된 결합, 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기, 또는 변형된 당을 포함하는 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은 단리되거나 정제된 형태로 존재할 수 있으며, 당해 분야에 rm 자체로 공지된 기술, 예컨대, cDNA 라이브러리의 클로닝 및 발현, 증폭, 효소적 합성 또는 재조합 기술에 의해 제조되고/되거나, 단리되고/되거나 조작될 수 있다. 핵산은 또한 예컨대, Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444에 기술된 바와 같이, 잘-공지된 촤학적 합성 기술에 의해 시험관내에서 합성될 수 있다.

본 발명은 또한 엄격한 조건(stringent condition) 하에, 상기 정의된 바와 같은 프로테아제를 암호화하는 핵산에 하이브리드화하는 핵산을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 엄격한 조건은 약 42℃에서 약 2.5 시간 동안 2 X SSC/0.1% SDS 속에서 하이브리드화 여과기의 항온처리에 이어, 여과기를 65℃에서 1 X SSC/0.1% SDS 속에서 15분으로 4회 세척함을 포함한다. 사용된 프로토콜은 Sambrook et al. (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1988)) 및 Ausubel (Current Protocols in Molecular Biology (1989))와 같은 참고문헌에 기술되어 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 프로테아제를 암호화하는 핵산을 포함하며, 여기서 상기 핵산의 서열, 또는 상기 서열의 일부는 적어도 최적화된 코돈 사용을 이용하여 가공되었다.

대안적으로, 본 발명에 따른 핵산은 본 발명에 따른 프로테아제의 서열로부터 유추될 수 있으며 코돈 사용은 핵산이 전사될 숙주 세포에 따라 채택될 수 있다. 이러한 단계는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지된 방법에 따라 수행할 수 있으며, 이중 일부는 참고문헌 매뉴얼 Sambrook et al. (Sambrook et al., 2001)에 기술되어 있다.

본 발명의 핵산은 또한 선택된 숙주 세포 또는 시스템 내에서 폴리펩타이드의 발현을 유발하거나 조절할 수 있는 추가의 뉴클레오타이드 서열, 예를 들면, 조절 영역, 즉, 프로모터, 인핸서(enhancer), 사일런서(silencer), 터미네이터, 신호 펩타이드 등을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 본 발명의 핵산은 융합 단백질, 예를 들면, 폴리펩타이드 발현 및/또는 용해도를 선호하는데 사용될 수 있는 말토즈 결합 단백질(MBP) 또는 글루타티온 S 트랜스퍼라제(GST)를 암호화하는 추가의 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 적합한 숙주 세포 내에서 상기 핵산을 발현을 지시하는 하나 이상의 제어 서열(control sequence)에 작동적으로 연결된 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다. 용어 "발현 카세트"는 암호화 영역, 즉, 본 발명의 핵산 및 조절 영역(regulatory region)을 포함하는, 즉, 하나 이상의 제어 서열(예컨대, 전사 프로모터 및/또는 전사 터미네이터)를 포함하는 핵산 작제물을 나타낸다. 제어 서열은 숙주 세포에 의해 인식된 프로모터 또는 본 발명의 프로테아제를 암호화하는 핵산의 발현을 위한 시험관내 발현 시스템을 포함할 수 있다. 프로모터는 효소의 발현을 매개하는 전사 제어 서열을 함유한다. 프로모터는 돌연변이체, 트렁케이트된(truncated) 및 하이브리드 프로모터를 포함하는, 숙주 세포 내에서 전사 활성을 나타내는 임의의 폴리뉴클레오타이드일 수 있으며, 숙주 세포에 대해 동종성 또는 이종성인 세포외 또는 세포내 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자로부터 수득될 수 있다. 제어 서열은 또한 전사 터미네이터일 수 있으며, 이는 숙주 세포에 의해 인식되어 전사를 종결시킨다. 터미네이터는 프로테아제를 암호화하는 핵산의 3'-말단에 작동적으로 연결된다. 숙주 세포 내에서 기능성인 임의의 터미네이터가 본 발명에서 사용될 수 있다. 전형적으로, 발현 카세트는 전사 프로모터 및 전사 터미네이터에 작동적으로 연결된 본 발명에 따른 핵산을 포함하거나, 이로 이루어진다.

본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 핵산 또는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

용어 "벡터"는 숙주 세포내로 재조합 유전 물질을 전달하는 비히클로서 사용된 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 벡터는 선형 또는 환형의 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA일 수 있다. 벡터는 통합성 또는 염색체외, 또는 자가복제성일 수 있다. 바람직하게는, 발현 벡터는 선형 또는 환형의 이중 가닥 DNA 분자이다. 벡터의 대부분의 형태는 플라스미드, 박테리오파아지, 바이러스, 포스미드(fosmid), 코스미드(cosmid), 및 인공 염색체이다. 벡터 자체는 일반적으로 삽입체(이종 핵산 서열, 전이유전자) 및 벡터의 "골격"으로서 제공되는 보다 큰 서열로 이루어진 DNA 또는 RNA 서열이다. 유전 정보를 숙주로 전달하는 벡터의 목적은 전형적으로 표적 세포 내에서 삽입체를 단리하거나, 증식시키거나 발현시키는 것이다. 발현 벡터(발현 작제물)로 불리는 벡터는 구체적으로 표적 세포 내에서 이종 서열의 발현을 위해 구체적으로 채택되며, 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 서열의 발현을 구동하는 프로모터 서열을 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현 벡터"는 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 일반적으로, 발현 벡터 속에 존재하는 조절 성분은 전사 프로모터, 리보소옴 결합 부위, 터미네이터, 및 임의로 존재하는 오퍼레이터를 포함한다. 바람직하게는, 발현 벡터는 또한 숙주 세포 내에서 자가 복제하기 위한 복제 오리진(origin of replication), 선택가능한 마커, 제한된 수의 유용한 제한 효소 부위, 및 고 카피 수(copy number)의 잠재능을 함유한다. 발현 벡터의 예는 클로닝 벡터, 변형된 클로닝 벡터, 구체적으로 설계된 플라스미드 및 바이러스이다. 상이한 숙주 내에서 적합한 수준의 폴리펩타이드를 제공하는 발현 벡터는 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터가 도입될 숙주 세포와 벡터의 혼용성에 의존할 것이다. 바람직하게는, 발현 벡터는 선형 또는 원형 이중 가닥 DNA 분자이다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 바와 같은 핵산, 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 숙주 세포를 형질전환시키거나, 형질감염시키거나 형질도입하기 위한 본 발명에 따른 핵산, 발현 카세트 또는 벡터의 용도에 관한 것이다. 벡터의 선택은 이것이 도입되어야만 하는 숙주 세포와 벡터의 혼용성에 전형적으로 의존할 것이다.

본 발명에 따라서, 숙주 세포는 일시적이거나 안정한 방식으로 형질전환되거나, 형질감염되거나 형질도입될 수 있다. 본 발명의 발현 카세트 또는 벡터는 숙주 세포내로 도입됨으로써 카세트 또는 벡터는 염색체 통합체로서 또는 자가-복제하는 염색체외 벡터로서 유지된다. 용어 "숙주 세포"는 또한 복제 동안 발생하는 돌연변이로 인하여 모 숙주 세포와 동일하지 않은 모 숙주 세포의 임의의 후대세포를 포함한다. 숙주 세포는 본 발명의 변이체의 생산에 유용한 임의의 세포, 예컨대, 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 원핵 숙주 세포는 그람-양성 또는 그람-음성 세균일 수 있다. 숙주 세포는 또한 진핵 세포, 예를 들면, 효모, 진균, 포유동물, 곤충 또는 식물세포일 수 있다. 특수한 구현예에서, 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 트리코데르마(Trichoderma),아스퍼길러스(Aspergillus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia), 써무스(Thermus), 악티노마두라(Actinomadura) 또는 야로위아(Yarrowia)의 그룹으로부터 선택된다.

본 발명에 따른 핵산, 발현 카세트 또는 발현 벡터는 기술자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 전기천공(electroporation), 접합, 형질도입, 적격성 세포(competent cell) 형질전환, 원형질체 형질전환, 원형질체 융합, 바이오리스틱(biolistic) "유전자 총(gene gun)" 형질전환, PEG-매개된 형질전환, 지질-보조된 형질전환 또는 형질감염, 화학적으로 매개된 형질감염, 아세트산리튬-매개된 형질전환, 리포좀-매개된 형질전환에 의해 숙주 세포내로 도입될 수 있다.

임의로, 본 발명의 핵산, 카세트 또는 벡터의 하나 이상의 카피는 숙주 세포 내로 삽입되어 변이체의 생산을 증가시킬 수 있다.

특수한 구현예에서, 숙주 세포는 재조합 미생물이다. 본 발명은 실제로 폴리에스테르 함유 물질을 분해하는 증진된 능력을 지닌 미생물의 가공을 허용한다. 예를 들면, 본 발명의 서열을 사용하여 폴리에스테르를 분해할 수 있는 것으로 이미 공지된 진균 또는 세균의 야생형 균주를 보완하는데 사용함으로써 균주 능력을 증진시키고/시키거나 증가시킬 수 있다.

프로테아제 변이체의 생산

본 발명의 다른 목적은 프로테아제를 암호화하는 핵산을 발현시키는 단계 및 임의로 프로테아제를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 프로테아제 변이체를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

특히, 본 발명은 (a) 본 발명의 핵산, 카세트 또는 벡터를 시험관내 발현 시스템과 접촉시키는 단계; 및 (b) 생산된 프로테아제를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 프로테아제를 생산하는 시험관내(in vitro) 방법에 관한 것이다. 시험관내 발현 시스템은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있으며 상업적으로 이용가능하다.

바람직하게는, 생산 방법은

(a) 본 발명의 프로테아제를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 핵산을 발현하는데 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 임의로

(b) 숙주 배양물로부터 상기 프로테아제를 회수하는 단계를 포함한다.

유리하게는, 숙주 세포는 재조합 바실러스, 재조합 이. 콜라이(E. coli), 재조합 아스퍼길러스(Aspergillus), 재조합 트리코데르마(Trichoderma), 재조합 스트렙토마이세스(Streptomyces), 재조합 사카로마이세스(Saccharomyces), 재조합 피키아(Pichia), 재조합 써무스(Thermus), 재조합 악티노마두라(Actinomadura) 또는 재조합 야로위아(Yarrowia)이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 재조합 바실러스(Bacillus)이다.

숙주 세포는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여, 폴리펩타이드의 생산에 적합한 영양 배지 속에서 배양된다. 예를 들면, 세포는 진탕 플라스크 배양, 또는 소-규모 또는 대-규모 발효(연속식, 배치식, 공급물-배치식, 또는 고체 상 발효)에 의해 적합한 배지 속에서 및 효소가 발현되고/되거나 단리되도록 하는 조건 하에서 수행된 실험실 또는 공업용 발효기 속에서 배양될 수 있다. 배양은 상업적 공급업자로부터의 적합한 영양 배지 속에서 일어나거나 발표된 조성물(예컨대, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)의 카탈로그) 또는 세포 성장에 적합한 임의의 다른 배양 배지에 따라 제조하였다.

프로테아제가 영양 배지로부터 분비되는 경우, 프로테아제는 배양 상층액으로부터 직접 회수될 수 있다. 역으로, 프로테아제는 세포 분해물로부터 또는 투과 후 회수될 수 있다. 프로테아제는 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 회수할 수 있다. 예를 들면, 프로테아제는 수집, 원심분리, 여과, 추출, 분무-건조, 증발, 또는 침전을 포함하나, 이에 한정되지 않는 통상의 과정에 의해 영양 배지로부터 회수할 수 있다. 임의로, 프로테아제는 열 쇼크, 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱(chromatofocusing), 및 크기 배제), 전기천공 과정(예컨대, 제조 등전 포커싱(preparative isoelectric focusing)), 차등적인 용해도(예컨대, 황상암모늄 침전), SDS-PAGE, 또는 추출을 포함하나, 이에 한정되지 않는 당해 분야에 공지된 다양한 과정에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 정제함으로써 실질적으로 순수한 폴리펩타이드를 수득할 수 있다.

프로테아제는 자체적으로, 정제된 형태로서, 단독 또는 추가의 효소와 함께 사용되어, 폴리에스테르(들) 및/또는 폴리에스테르 함유 물질, 예를 들면, 폴리에스테르를 함유하는 플라스틱 생성물의 분해 및/또는 재활용에 포함된 효소 반응을 촉매작용시킬 수 있다. 프로테아제는 가용성 형태, 또는 고체 상으로 존재할 수 있다. 특히, 이는 예컨대, 비드(bead), 컬럼, 플레이트 등의 형태의, 세포 막 또는 지질 소낭, 또는 합성 지지체, 예를 들면, 유리, 플라스틱, 중합체, 여과제, 막에 결합될 수 있다.

조성물

본 발명의 추가의 목적은 본 발명의 프로테아제 또는 숙주 세포 또는 이의 추출물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 내용에서, 용어 "조성물"은 본 발명의 프로테아제 또는 숙주 세포를 포함하는 임의의 종류의 조성물을 포함한다. 특수한 구현예에서, 프로테아제는 단리되거나 적어도 부분적으로 정제된 형태이다.

조성물은 액체 또는 무수, 예를 들면, 분말의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물을 동결건조물이다. 예를 들면, 조성물을 프로테아제 및/또는 본 발명의 프로테아제 또는 상기 프로테아제를 함유하는 이의 추출물을 암호화하는 숙주 세포, 및 임의로 부형제 및/또는 시약 등을 포함할 수 있다. 적절한 부형제는 생화학에 일반적으로 사용된 완충제, pH 조절제, 방부제, 예를 들면, 벤조산나트륨, 소르브산나트륨 또는 아스코르브산나트륨, 보존제, 보호제, 안정화제, 예를 들면, 전분, 덱스트린, 아라빅 검, 염, 당, 예컨대, 소르비톨, 트레할로즈 또는 락토즈, 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에텐 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 2가 이온, 예를 들면, 칼슘, 금속이온봉쇄제(sequestering agent), 예를 들면, EDTA, 환원제, 아미노산, 담체, 예를 들면, 용매 또는 수용액 등을 포함한다. 본 발명의 조성물은 프로테아제를 하나 또는 수개의 부형제와 혼합함으로써 수득될 수 있다.

본 발명의 조성물은 0.1 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 중량% 내지 30 중량%, 심지어 보다 바람직하게는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 본 발명의 프로테아제 및 0.1 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 50 중량% 내지 99.9 중량%, 보다 바람직하게는 70 중량% 내지 99.9 중량%, 심지어 보다 바람직하게는 95 중량% 내지 99.9 중량%의 부형제(들)을 포함할 수 있다. 바람직한 조성물은 0.1 내지 5 중량%의 본 발명의 프로테아제를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 0.1 중량% 내지 40 중량%, 보다 바람직하게는 1 중량% 내지 30 중량%, 심지어 보다 바람직하게는 5 중량% 내지 25 중량%의 본 발명의 프로테아제 및 60 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 70 중량% 내지 99 중량%, 보다 바람직하게는 75 중량% 내지 95 중량%의 부형제(들)을 포함할 수 있다.

특수한 구현예에서, 조성물은 효소 활성을 나타내는 추가의 폴리펩타이드(들)를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 프로테아제의 양은 예컨대, 조성물 속에 함유된 추가의 효소/폴리펩타이드를 분해하는 폴리에스테르 및/또는 폴리에스테르 함유 물질의 특성에 따라 당해 분야의 기술자에 의해 용이하게 채택될 것이다.

특수한 구현예에서, 본 발명의 프로테아제는 하나 또는 수개의 부형제, 특히 분해로부터 폴리펩타이드를 안정화시키거나 보호할 수 있는 부형제와 함께 수성 배지 속에 용해시킨다. 예를 들면, 본 발명의 프로테아제는 궁극적으로 추가의 구성성분, 예를 들면, 글리세롤, 소르비톨, 덱스트린, 전분, 글리콜, 예를 들면, 프로판디올, 염 등과 함께, 물 속에서 용해시킬 수 있다. 수득되는 혼합물은 이후에 건조시켜 분말을 수득할 수 있다. 이러한 혼합물을 건조시키는 방법은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있으며 제한없이, 동결건조, 냉동-건조, 분무-건조, 초임계 건조, 하향 증발(down-draught evaporation), 박층 증발, 원심분리 증발, 컨베이어 건조(conveyer drying), 유동층 건조, 드럼 건조 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.

추가의 특수한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 프로테아제, 또는 이의 추출물을 발현하는 적어도 하나의 숙주 세포를 포함한다. "세포의 추출물"은 세포로부터 수득된 임의의 분획, 예를 들면, 세포 상층액, 세포 부스러기, 세포벽, DNA 추출물, 효소 또는 효소 제제 또는 화학적, 물리적 및/또는 효소적 처리에 의해 세포로부터 유래된 임의의 제제를 규정하며, 이는 필수적으로 살아있는 세포를 포함하지 않는다. 바람직한 추출물은 효소적으로 활성인 추출물이다. 본 발명의 조성물을 본 발명의 프로테아제 및 임의로 하나 또는 수개의 추가의 세포를를 함유하는 본 발명의 하나 또는 수개의 숙주 세포 또는 이의 추출물을 포함할 수 있다.

특수한 구현예에서, 조성물은 본 발명의 프로테아제를 발현하고/하거나 분비하는 재조합 미생물의 동결건조된 배양 배지로 이루어지거나 이를 포함한다. 특수한 구현예에서, 분말은 본 발명의 프로테아제 및 안정화/가용화 양의 글리세롤, 소르비톨 또는 덱스트린, 예를 들면, 말토덱스트린 및/또는 사이클로덱스트린, 전분, 아라빅 검, 글리콜, 예를 들면, 프로판디올, 및/또는 염을 포함한다.

프로테아제의 용도

본 발명의 추가의 목적은 호기성 또는 혐기성 조건 하에서 폴리에스테르로 제조되거나 이를 함유하는 플라스틱 생성물로서, 폴리에스테르 및/또는 폴리에스테르 함유 물질을 분해하고/하거나 재순환시키고/시키거나 폴리에스테르를 함유하는 생분해성 플라스틱 생성물을 생산하기 위해 본 발명의 프로테아제를 사용하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 프로테아제는 PLA를 함유하는 생분해성 플라스틱 생성물을 생산하고/하거나 PLA 및 PLA를 함유하는 플라스틱 생성물을 분해하는데 특히 유용하다.

따라서, 본 발명의 목적은 폴리에스테르 또는 폴리에스테르 함유 물질, 예를 들면, PLA 또는 PLA 함유 물질의 효소적 분해를 위한, 본 발명의 프로테아제, 또는 이러한 프로테아제를 함유하는 상응하는 숙주 세포 또는 이의 추출물, 또는 조성물을 사용하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 폴리에스테르 또는 적어도 하나의 폴리에스테르를 함유하는 플라스틱 생성물을 분해하는 방법을 제공하기 위한 것이며, 여기서 폴리에스테르 또는 플라스틱 생성물은 본 발명의 프로테아제 또는 숙주 세포 또는 조성물과 접촉된다. 유리하게는, 폴리에스테르(들) 및/또는 폴리에스테르 함유 물질의 폴리에스테르(들)은 단량체 및/또는 올리고머로 해중합된다. 분해 방법의 구현예에서, 적어도 하나의 폴리에스테르는 분해되어 재중합가능한 단량체 및/또는 올리고머를 생성하며, 이는 유리하게는 회수되어 사용된다. 분해 방법의 바람직한 구현예에서, 적어도 PLA는 분해되어 락트산(LA)의 재중합가능한 단량체 및/또는 올리고머를 생성하며, 이는 유리하게는 회수됨으로써 예를 들면, PLA의 신규한 중합체를 생산하는데 사용된다.

구현예에서, 폴리에스테르(들) 및/또는 폴리에스테르 함유 물질의 폴리에스테르(들)은 완전히 분해된다.

특수한 구현예에서, 폴리에스테르는 폴리락트산(PLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트(PTT), 폴리부틸렌 테레프탈레이트(PBT), 폴리에틸렌 이소소르바이드 테레프탈레이트(PEIT), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리하이드록시알카노에이트(PHA), 폴리부틸렌 석시네이트(PBS), 폴리부틸렌 석시네이트 아디페이트(PBSA), 폴리부틸렌 아디페이트 테레프탈레이트(PBAT), 폴리에틸렌 푸라노에이트(PEF), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(에틸렌 아디페이트)(PEA) 및 이의 배합물/혼합물로부터 선택되며, 바람직하게는 폴리락트산이다.

특수한 구현예에서, 플라스틱 생성물은 폴리락트산(PLA), 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트(PTT), 폴리부틸렌 테레프탈레이트(PBT), 폴리에틸렌 이소소르바이드 테레프탈레이트(PEIT), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리하이드록시알카노에이트(PHA), 폴리부틸렌 석시네이트(PBS), 폴리부틸렌 석시네이트 아디페이트(PBSA), 폴리부틸렌 아디페이트 테레프탈레이트(PBAT), 폴리에틸렌 푸라노에이트(PEF), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(에틸렌 아디페이트)(PEA) 및 이들 물질의 배합물/혼합물로부터 선택된 적어도 하나의 폴리에스테르, 바람직하게는 폴리락트산을 포함한다.

특수한 구현예에서, PLA 또는 PLA를 함유하는 플라스틱 생성물은 본 발명의 프로테아제 또는 숙주 세포와 접촉되고 PLA는 락트산의 단량체 및/또는 올리고머로 분해된다. 바람직한 구현예에서, 락트산의 단량체 및/또는 올리고머는 예를 들면, PLA의 재순환, 중합 또는 메탄화를 위해 회수된다.

본 발명은 또한 폴리에스테르 또는 폴리에스테르 함유 물질을 본 발명의 프로테아제 또는 상응하는 숙주 세포 또는 이의 추출물, 또는 조성물에 노출시키는 단계, 및 임의로 단량체 및/또는 올리고머를 회수하는 단계를 포함하는, 폴리에스테르 또는 폴리에스테르 함유 물질로부터 단량체 및/또는 올리고머를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 PLA를 함유하는 플라스틱 생성물로부터 락트산과 같은 단량체를 생산하는데 특히 유용하다.

폴리에스테르 또는 폴리에스테르 함유 물질을 분해하는데 필요한 시간은 폴리에스테르 또는 폴리에스테르 함유 물질 자체(즉, 플라스틱 생성물의 특성 및 기원, 이의 조성, 형상 등), 사용된 프로테아제의 유형 및 양 뿐만 아니라, 다양한 공정 매개변수(즉, 온도, pH, 추가의 제제 등)에 따라 변할 수 있다. 당해 분야의 기술자는 폴리에스테르 함유 물질 대헤 공정 매개변수를 용이하게 조정할 수 있다.

유리하게는, 분해 공정은 10℃ 내지 90℃, 바람직하게는 20℃ 내지 70℃, 보다 바람직하게는 30℃ 내지 60℃, 심지어 보다 바람직하게는 45℃를 포함하는 온도에서 수행된다. 보다 일반적으로, 온도는 온도는 불활성화 온도 이하에서 유지되며, 이는 프로테아제가 불활성화되고/되거나 재조합 미생물이 프로테아제를 더 이상 합성하지 않는 온도에 상응한다. 바람직하게는, 온도는 폴리에스테르 함유 물질 속의 폴리에스테르의 유리 전이 온도(Tg) 이하에서 유지된다. 이러한 구현에에서, 분해 공정은 80℃ 이하, 바람직하게는 70℃ 이하, 보다 바람직하게는 60℃ 이하, 보다 바람직하게는 50℃ 이하, 심지어 보다 바람직하게는 45℃ 이하를 포함하는 온도에서 수행된다. 보다 특히, 공정은 연속적인 방식으로, 프로테아제가 수회 사용될 수 있고/있거나 재순환될 수 있는 온도에서 수행된다.

유리하게는, 분해 공정은 5 내지 11의 pH, 바람직하게는 7 내지 10의 pH, 보다 바람직하게는 7.5 내지 9의 pH, 심지어 보다 바람직하게는 pH 7.5 또는 pH 9를 포함하는 pH에서 수행된다.

특수한 구현예에서,폴리에스테르 또는 폴리에스테르 함유 물질은 프로테아제와 접촉되기 전에 예비처리됨으로써, 이의 구조를 물리적으로 변화시킴으로써 폴리에스테르와 효소 사이의 접촉 표면을 증가시킬 수 있다.

임의로, 해중합으로부터 생성되는 단량체 및/또는 올리고머는 순차적으로 또는 연속적으로 회수될 수 있다. 단일 유형의 단량체 및/또는 올리고머 또는 수개의 상이한 유형의 단량체 및/또는 올리고머는 출발 폴리에스테르 함유 물질에 따라 회수될 수 있다.

회수된 단량체 및/또는 올리고머는 모든 적합한 정제 방법을 사용하여 추가로 정제할 수 있고 재중합가능한 형태로 조건화시킬 수 있다. 정제 방법의 예는 스트라이핑 공정, 수용액에 의한 분리, 스팀 선택적 응축, 생물공정 후 매질의 여과 및 농축, 분리, 증발, 진공 증발, 추출, 전기투석, 흡수, 이온 교환, 침전, 결정화, 농축 및 산 첨가 탈수 및 침전, 나노여과, 산 촉매 처리, 반 연속 방식 증류 또는 연속 방식 증류, 용매 추출, 증발 농축, 증발 결정화, 액체/액체 추출, 수소화, 공비 증류 공정, 흡수, 컬럼 크로마토그래피, 단순 진공 증류 및 미세여과를 조합하여 또는 조합되지 않고 포함한다.

이후에, 재중합가능한 단량체 및/또는 올리고머를 사용하여 예를 들면, 폴리에스테르를 합성할 수 있다. 유리하게는, 동일한 특성의 폴리에스테르가 재중합된다. 그러나, 회수된 단량체 및/또는 올리고머와 다른 단량체 및/또는 올리고머를 혼합하여, 예를 들면, 새로운 공중합체를 합성하는 것이 가능하다. 대안적으로, 회수된 단량체는 화학적 중간체로서 사용되어 목적한 신규한 화학적 화합물을 생산할 수 있다.

본 발명의 추가의 목적은 폴리에스테르 또는 폴리에스테르 함유 물질을 제공하는 것이며 여기서 본 발명의 프로테아제 및/또는 상기 프로테아제 및/또는 상기 프로테아제를 함유하는 이의 추출물, 및/또는 본 발명의 조성물을 발현하고/하거나 분비하는 재조합 미생물이 포함된다. 특수한 구현예에서, 이러한 폴리에스테르 함유 물질은 플라스틱 화합물, 마스터배치 조성물(masterbatch composition) 및/또는 플라스틱 생성물일 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "마스터배치 조성물"은 상기 성분을 플라스틱 화합물 또는 생성물로 도입하여 이에 대해 목적한 특성을 부여할 수 있는 선택된 성분(예컨대, 활성제, 첨가제 등)의 농축된 혼합물을 지칭한다. 마스터배치 조성물은 고체 또는 액체일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 마스터배치 조성물은 적어도 10 중량%의 활성 성분, 보다 바람직하게는 본 발명의 프로테아제 또는 조성물을 함유한다.

따라서, 본 발명의 추가의 목적은 본 발명의 프로테아제를 함유하는 플라스틱 화합물 및/또는 상기 프로테아제 또는 이러한 프로테아제를 함유하는 이의 추출물을 발현하고/하거나 분비하는 재조합 미생물 및/또는 본 발명의 조성물 및 적어도 하나의 폴리에스테르를 제공하는 것이다. 특수한 구현예에서, 폴리에스테르는 폴리락트산(PLA), 바람직하게는 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(D-락트산)(PDLA) 또는 폴리(DL-락트산)(PDLLA)를 제공하기 위한 것이다. 특수한 구현예에서, 플라스틱 화합물은 바람직하게는 폴리에스테르, 예를 들면, PBAT, PCL, PET; 폴리올레핀, 예를 들면, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 또는 천연 중합체, 예를 들면, 전분, 셀룰로즈 또는 밀가루; 및 이의 배합물/혼합물로부터 선택된 추가의 중합체를 함유할 수 있다. 보다 특히, 플라스틱 화합물은 PBAT, 밀가루 또는 전분으로부터 선택된 추가의 중합체를 함유할 수 있다. 다른 특수한 구현예에서, 폴리에스테르는 폴리카프로락톤(PCL)이다.

따라서, 본 발명의 추가의 목적은 본 발명의 프로테아제를 함유하는 마스터배치 조성물 및/또는 이러한 프로테아제를 함유하는 상기 프로테아제 또는 이의 추출물을 발현하고/하거나 분비하는 재조합 미생물 및/또는 본 발명의 조성물, 및 적어도 하나의 폴리에스테르를 제공하기 위한 것이다. 특수한 구현예에서, 폴리에스테르는 폴리락트산(PLA), 바람직하게는 폴리(L-락트산) (PLLA), 폴리(D-락트산) (PDLA) 또는 폴리(DL-락트산)(PDLLA)이다. 다른 특수한 구현예에서, 폴리에스테르는 바람직하게는 폴리카프로락톤(PCL)이다.

특히, 본 발명의 폴리에스테르 및 프로테아제 및/또는 재조합 미생물 또는 이러한 프로테아제를 함유하는 이의 추출물 및/또는 상기 폴리에스테르를 분해할 수 있는 본 발명의 조성물을 폴리에스테르가 부분적으로 또는 전체적으로 용융된 상태에 있는 온도에서 혼합시킴으로써 프로테아제/미생물이 폴리에스테르 함유 물질의 구조 내로 통합시키는 단계를 포함하는, 상기 폴리에스테르 함유 물질(즉, 플라스틱 화합물, 마스터배치 조성물 또는 플라스틱 생성물)을 함유하는 상기 폴리에스테르를 생산하는 공정에 관한 것이다. 특수한 구현예에서, 공정은 압출 공정이다.

예를 들면, 본 발명의 프로테아제 및/또는 조성물 및 폴리에스테르는 폴리에스테르의 유리 전이 온도와 용융 온도 사이에서 혼합될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 프로테아제/조성물 및 폴리에스테르는 상기 폴리에스테르의 융접 이상에 상응하는 온도에서 혼합될 수 있다. 특수한 구현예에서, 프로테아제/조성물 및 폴리에스테르는 40℃ 내지 250℃, 바람직하게는 50℃ 내지 180℃의 온도에서 혼합된다. 대안적으로, 폴리펩타이드/조성물 및 폴리에스테르는 40℃ 이상, 바람직하게는 50℃ 이상, 심지어 보다 바람직하게는 60℃ 이사의 온도에서 혼합된다.

바람직한 구현예에서, 폴리에스테르는 폴리락트산(PLA), 및 프로테아제/조성물로부터 선택되고 PLA는 60℃ 내지 250℃, 바람직하게는 100℃ 내지 200℃, 보다 바람직하게는 130℃ 내지 180℃, 심지어 보다 바람직하게는 140℃ 내지 160℃의 온도에서 혼합된다. 대안적으로, 프로테아제/조성물 및 PLA는 80℃ 이상, 바람직하게는, 100℃ 이상, 심지어 보다 바람직하게는 130℃ 이상, 및 180℃ 이하의 온도에서 혼합된다.

다른 바람직한 구현예에서, 폴리에스테르는 폴리카프로락톤(PCL)으로부터 선택되고, 프로테아제/조성물 및 PCL은 40℃ 내지 100℃, 바람직하게는 50℃ 내지 80℃의 온도에서 혼합된다. 대안적으로, 프로테아제/조성물 및 PCL은 40℃ 이상, 바람직하게는, 50℃ 이상, 심지어 보다 바람직하게는 55℃ 이상, 및 80℃ 이하의 온도에서 혼합된다.

보다 바람직하게는, 혼합 단계는 압출, 트윈 스크류 압출(twin screw extrusion), 단일 스크류 압출, 사출-성형(injection-molding), 캐스팅(casting), 열성형, 회전 성형(rotary molding), 압출, 칼렌더링(calendering), 아이러닝(ironing), 코팅, 계층화, 확장, 인발성형(pultrusion), 압출 취입 성형(extrusion blow-molding), 압출-팽윤(extrusion-swelling), 압축-과립화(compression-granulation), 수중 오일중 수 이중 에멀젼 증발(water-in-oil-in-water double emulsion evaporation), 3D 프린팅 또는 당해 분야의 기술자에게 공지된 임의의 기술을 사용하여 수행된다.

수득되는 플라스틱 화합물, 마스터배치 조성물 또는 플라스틱 생성물은 화합물, 마스터배치 조성물 또는 플라스틱 생성물의 덩어리 속에 포매된(embedded) 본 발명의 프로테아제/미생물 또는 조성물을 통합한다.

유리하게는, 이러한 플라스틱 화합물, 마스터배치 조성물은 본 발명의 폴리펩타이드를 포함할 폴리에스테르 함유 물질 및/또는 플라스틱 물품을 함유하는 폴리에스테르 생산을 위해 사용될 수 있다.

특수한 구현예에서, 수득되는 플라스틱 화합물, 마스터배치 조성물 또는 플라스틱 물품은 적어도 하나의 관련 표준에 부합하는 생분해가능한 플라스틱 화합물, 마스터배치 조성물 또는 플라스틱 물품 및/또는 당해 분야의 기술자에게 공지된 표지, 예를 들면, 표준 EN 13432, 표준 ASTM D6400, OK 생분해 소일(Biodegradation Soil)(Label Vincotte), OK 생분해 워터(Biodegradation Water)(Label Vincotte), OK 컴포스트(Compost)(Label Vincotte), OK 홈 컴포스트(Home Compost)(Label Vincotte)이다.

유리하게는, 폴리에스테르 함유 물질(즉, 플라스틱 화합물, 마스터배치 조성물 또는 플라스틱 생성물)의 분해 공정은 10℃ 내지 50℃, 바람직하게는 15℃ 내지 40℃, 보다 바람직하게는 20℃ 내지 30℃, 보다 바람직하게는 28℃, +/- 2℃에서 수행된다.

대안적으로, 폴리에스테르 함유 물질(즉, 플라스틱 화합물, 마스터배치 조성물 또는 플라스틱 생성물)의 분해 공정은 50℃ 내지 60℃, 보다 바람직하게는 55℃, +/- 2℃를 포함하는 온도에서 수행된다.

흥미롭게도, 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제가 상기 인용된 출원에서 사용될 수 있다.

전통적으로, 본 발명의 프로테아제 또는 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산을 포함하는 프로테아제는 세제, 식품, 동물 사료 및 약제학적 적용에 사용될 수 있다.

보다 특히, 본 발명의 프로테아제 또는 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제는 세제 조성물의 구성성분으로서 사용될 수 있다.

세제 조성물은 제한없이, 손 또는 기계 세탁 세제 조성물, 예를 들면, 염색된 패브릭의 전-처리에 적합한 세탁 첨가 조성물 및 일반적으로 가정 경질 표면 세정 작동시 사용하기 위한 세제 조성물, 손 또는 기계 식기세척 작동을 위한 세제 조성물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

특수한 구현예에서, 본 발명의 프로테아제 또는 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제는 세제 첨가제로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 프로테아제 또는 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제를 포함하는 세제 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 프로테아제 또는 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제를 동물 사료 속에서 뿐만 아니라 본 발명의 프로테아제 또는 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제를 포함하는 사료 조성물 및 사료 첨가제를 사용하는 방법에 관한 것이다. 용어 "사료" 및 "사료 조성물"은 동물에 의한 섭취용으로 적합하거나 의도된 임의의 화합물, 제조, 혼합물, 또는 조성물을 지칭한다. 다른 특수한 구현예에서, 본 발명의 프로테아제 또는 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산을 포함하는 프로테아제를 사용하여 단백질을 가수분해하고, 펩타이드를 포함하는 가수분해물을 생산한다. 이러한 가수분해물은 사료 조성물 또는 사료 첨가제로서 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 폴리에스테르 함유 물질을 본 발명의 프로테아제, 또는 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제, 또는 상응하는 재조합 세포 또는 이의 추출물에 노출시키는 단계를 포함하는, 폴리에스테르 함유 물질의 표면 가수분해 또는 표면 기능화 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 폴리에스테르 물질의 친수성, 또는 물 흡수성을 증가시키는데 특히 유용하다. 이러한 증가된 친수성은 직물 생산, 전자공학 및 생물의학 적용시 특별한 관심을 가질 수 있다.

실시예

실시예 1 - 프로테아제의 작제, 발현 및 정제

- 1.1 작제

성숙되지 않은 모 프로테아제(서열 번호 2 + 서열 번호 1에 상응하는 서열 번호 4)를 암호화하는 유전자(핵산 서열 번호 5)를 플라스미드 pET26b+ (EMD Millipore, 미국 매사츄세츠주 빌레리카(Billerica) 소재) 내로 유전자 상부의 PelB 신호 펩타이드(서열 번호 3 MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA)를 암호화하는 서열 및 유전자 하부의 6x 히스티딘 태그(서열 번호 6 LEHHHHHH)를 사용하여 프레임 내로 클로닝하였다. 이. 콜라이(E. coli)의 하나의 Shot^® BL21 DE3(Life technologies, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 작제된 플라스미드로 형질전환시켰다. 수득된 균주는 단백질의 N-말단에 PelB 리더 서열 및 단백질의 C 말단에 6X 히스티딘 Tag를 사용하여 야생형 프로테아제를 발현시킨다. QuikChange II 부위-지시된 돌연변이유발 키트를 공급업자의 추천에 따라 사용하여 변이체(미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)를 작제하였다. 표 1은 부위-지시된 돌연변이유발에 사용된 전방(forward) 및 역방(reverse) 프라이머를 제공한다.

- 1.2 프로테아제의 발현 및 정제

야생형 프로테아제 및 이의 변이체를 발현하는 균주의 재조합 발현을 1mM의 최종 농도에서 IPTG를 첨가한 후 100mL의 TB 배지 속에서 4시간 동안에 37℃에서 이어서 21℃에서 실현하였다(Tartoff K. D. and Hobbs C. A., 1987, Improved Media for Growing Plasmid and Cosmid Clones, Bethesda Res. Lab. Focus, 9:12.). 배양을 Avanti J-26 XP 원심분리기(Beckman Coulter, 미국 브레아 소재) 속에서 원심분리(8000 rpm, 10℃에서 20분)하여 정지시켰다. 세포를 -80℃에서 적어도 2.5 시간 동안 동결시킨 다음 10 mL의 트리스 HCl 완충액(트리스 0.1M, pH 9) 속에 현탁시켰다. Lysonase™ 바이오프로세싱 시약(Bioprocessing Reagent)(EMD Millipore)을 사용하여 공급업자의 추천에 따라 세포를 용해시켰다. 이후에, 세포 현탁액을 11000 rpm 및 10℃에서 30분 동안 원심분리시켰다. 가용성 분획을 수집하고 코발트 친화성 크로마토그래피에 Talon^® 금속 친화성 수지(미국 캘리포니아주 클론테크)를 사용하여 넣었다. 단백질을 20mM 트리스-HCl, 300mM NaCl, pH 8.0 중 100mM 이미다졸로 용출시켰다. 이미다졸을 트리스 HCl 완충액(트리스 0.1 M, 5 mM CaCl₂, 45℃에서 조절된 pH 7.5 또는 pH 9)에 대해 투석 단계 후 정제된 추출물로부터 제거하였다. 정제된 단백질을 제조업자의 설명서(Lifescience Bio-Rad, 프랑스 소재)에 따라 Bio-Rad 브래드포드 단백질 검정(Branford protein assay)을 사용하여 정량화하고 +4℃에서 저장하였다. 정제의 품질을 TCA 침전 후 SDS-PAGE 상에서 평가하였으며, 예측된 단백질 크기는 대략 29kDa이었다.

수득되는 프로테아제(즉, 서열 번호 1의 변이체)는 하기 표 2 및 3에 나타낸 특이적인 치환을 제외하고는, 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 2 - 프로테아제의 분해 활성의 평가

야생형 프로테아제 및 이의 변이체의 특이적인 분해 활성을 PLA 가수분해 동안 측정하였다. 50 mg의 500μm PLA 분말(PLLA 001 - Natureplast)을 칭량하고 투석 튜빙(tubing) 속에 도입하였다. 변이체는 나타낸 바와 같은, 특이적인 치환을 제외하고는, 서열 번호 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 이후에, 효소 샘플(정밀한 비활성(specific activity)을 측정하기 위한 2.5, 5, 10 또는 15 mg/L의 고정된 농도의 효소를 함유하는 1.5 mL의 프로테아제 제제)을 투석 튜빙에 가한 후 이를 밀봉시키고, 후자를 25 mL의 0.1 M 트리스-HCl 완충액 pH 9 또는 pH 7.5(45℃에서 조절됨)을 함유하는 유리 병내로 도입하였다. 야생형 프로테아제(서열 번호 1)는 대조군으로서 사용하였다.

해중합은 각각의 샘플을 45℃ 및 170 rpm에서 Max Q 4450 항온처리기(Thermo Fisher Scientific, Inc. 미국 매사츄세츠주 왈탐 소재) 속에서 항온처리함으로써 출발하였다.

생성된 락트산 및/또는 락트산의 이량체의 g/효소의 g/시간으로 해중합 반응의 초기 속도를 처음 24시간 동안 상이한 시간에서 수행된 샘플처리로 측정하고 초 고 성능 액체 크로마토그래피(Ultra High Performance Liquid Chromatography: UHPLC)로 분석하였다. 필요할 경우, 샘플을 0.1M 트리스-HCl 완충제 pH9 또는 pH 7.5(45℃에서 조절됨) 속에서 희석시켰다. 0.45 μm 주사기 여과기 속에서 여과한 후, 샘플을 UHPLC 상에서 로딩(loading)하여 락트산 및 락트산의 이량체의 유리(liberation)를 모니터링하였다. 사용된 크로마토그피 시스템은 펌프 모듈, 자동샘플러, 50℃에서 열 고정된 컬럼 오븐, 및 210 nm에서의 UV 검출기를 포함하는 Ultimate 3000 UHPLC 시스템(Thermo Fisher Scientific, Inc. 미국 매사츄세츠 왈탐 소재)이었다. 사용된 컬럼은 예비컬럼(Supelco, 미국 벨레폰트 소재)이 장착된, Aminex HPX-87H (300 mm × 7.8 mm)이었다. 락트산 및 락트산의 이량체를 이동 상 H₂SO₄ 5 mM를 사용하여, 0.5 mL.min^-1의 유동 속도에서 분리하였다. 20 μL의 샘플을 주입하였다. 락트산 및 락트산의 이량체를 시판되는 락트산(Sigma-Aldrich L1750-10G) 및 샘플보다 동일한 조건에서 자체로(in house) 합성된 락트산의 이량체로부터 제조된 표준 곡선에 따라 측정하였다. PLA 가수분해물의 비 분해 활성(등가의 락트산의 g(즉, 락트산 및 락트산의 이량체의 g/시간/효소의 g)을 가수분해 곡선의 선형 부분에서 측정하였다. 상이한 실험의 결과는 하기 표 2 및 표 3에 나타낸다.

이러한 결과는 본 발명의 프로테아제가 서열 번호 1의 모 프로테아제와 비교하여 pH 7.5에서 증가된 분해 활성을 가짐을 입증한다. 이는 생분해성 플라스틱 물품을 생산하는데 특히 흥미로우며, 이는 본 발명의 프로테아제가 환경 조건(중성 pH) 하에서 큰 분해 활성을 나타내므로, 상기 플라스틱 물품의 하나 이상의 폴리에스테르를 분해할 수 있는 프로테아제를 혼입한다.

V3, V18, V6, V13, V8 또는 V19에 따른, 및 보다 특히 V8 또는 V19에 따른 프로테아제는 생분해가능한 PLA-함유 플라스틱 물품을 생산하는데 특히 흥미로울 수 있다. pH 7.5에서 V1, V2, V4, V5, V7, V9, V10, V11, V12, V14, V15, V16 및 V17 상에서 수행된 유사한 시험은 또한 본 발명의 이러한 프로테아제가 서열 번호 1의 모 프로테아제와 비교하여 pH 7.5에서 증가된 분해 활성을 가짐을 입증한다(데이타를 나타내지 않음).

이러한 결과는 본 발명의 프로테아제가 다양한 산업적 공정, 예를 들면, 폴리에스테르 분해 공정에 사용될 수 있음을 입증하며, 여기서 분해 단계는 pH 9에서 수행할 수 있다. pH 9에서 V18 및 V19에서 수행된 유사한 시험은 본 발명의 이러한 프로테아제가 서열 번호 1의 모 프로테아제와 비교하여 pH 9에서 증가된 분해 활성을 가짐을 입증한다(데이타는 나타내지 않음).

실시예 3 - 본 발명의 프로테아제 활성의 평가

본 발명의 프로테아제의 비 분해 활성을 측정하고 서열 번호 1의 야생형 프로테아제의 비 활성(specific activity)과 비교하였다.

비 활성을 평가하기 위한 다수의 방법론을 사용하였다:

(1) pNA 가수분해를 기반으로 한 비 활성;

(2) 고체 형태 하에서 폴리에스테르의 분해를 기반으로 한 비 분해 활성

(3) 고체 형태 하에서 단백질의 분해를 기반으로 한 비 활성

(4) PLA를 함유하는 에멀젼의 혼탁도의 감소를 기반으로 하는 비 분해 활성

(5) 반응기 속의 PLA 가수분해를 기반으로 한 비 분해 활성

3.1 pNA 가수분해

용액 속의 20μL의 단백질을 180μL의 5mM N-석시닐-Ala-Ala-Ala-p-니트로아닐리드(pNA)에 대해 트리스 HCl 완충액, 0.1M pH 7.5 내로 합하였다. 효소 반응을 30℃에서 교반 하에, 적어도 15분 동안 수행하고, 405nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 분광광도계(Versamax, Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)로 획득하였다. 비 활성(μmol의 방출된 p 니트로아닐리드/분/mg의 효소로 나타낸 초기 속도)을 가수분해 곡선의 선형 부분으로 측정하고 이를 사용하여 변이체의 활성을 지닌 야생형 프로테아제의 활성을 비교하였다.

3.2 고체 형태 하에서 폴리에스테르의 분해

20 μL의 효소 제제를 PLA를 함유하는 아가로즈 플레이트 속에서 생성된 웰 속에 침착시켰다. 아가로즈 플레이트의 제조는 450 mg의 PLA를 10 mL의 디클로로메탄(DCM) 속에 가용화시키고 와동시켜 균질화함으로써 실현하였다. 90 mL의 트리스 HCl 완충액 0.1 M pH 7 내지 9를 첨가하고 이어서 초음파 단계(Fisher Scientific™ Model 705 Sonic Dismembrator, 최대 파워의 30%) 후, DCM을 50℃에서 증발시켰다. 수득되는 용액을 여과하여 용해되지 않은 잔사를 제거하였다. 최종적으로, 12 mL의 0.5% PLA 유액을 3 mL의 1 M 트리스 HCl 완충액 pH 9(45℃에서 조절됨) 및 15mL의 아가로즈 2%와 혼합하여, 각각의 옴니트레이(omnitray)(4℃에서 저장함)를 제조하였다.

야생형 프로테아제 및 변이체에 의한 폴리에스테르 분해로 인하여 형성된 궤도(halo)의 직경을 측정하고 45℃에서 4 내지 24시간 후 비교하였다.

3.3 고체 형태 하에서 단백질의 분해

20 μL의 효소 제제를 밀크(milk)를 함유하는 아가 플레이트 속에서 생성된 웰 속에 침착시켰다. 아가 플레이트의 제제는 수중 28g/L의 밀크 분말(Regilait^TM)의 용액을 제조함으로써 실현하였다. 이후에, 15 mL의 밀크를 15mL의 15g/L 아가와 혼합하여 각각의 옴니트레이(omnitray)를 제조하였다(4℃에서 저장함).

효소적 밀크-단백질 분해로 인해 형성된 헤일로(halo)의 직경을 측정하고 45℃에서 4 내지 24시간 후 비교하였다. 5시간 후 결과는 도 1a, 1b 및 1c에 나타내고 야생형 프로테아제(도 1a) 및 프로테아제 변이체 V8(도 1b) 및 V19(도 1c)이 프로테아제 활성을 나타냄을 입증한다.

3.4 PLA를 함유하는 유액의 혼탁도의 감소를 기반으로 하는 비 활성

PLA-분해 활성을 45℃에서 30분 동안, 및 pH 9에서 100 mM 트리스-HCl 완충액(pH 9(45℃에서 조절됨)) 중 0.1% (w/v)의 최종 농도의 유화된 PLA를 사용하여 630 nm의 파장에서 혼탁도의 감소를 기반으로 분석하였다(최대 파워의 30%에서 Sonic Dismembrator 사용). 하나의 유닛(unit)의 PLA-분해 활성을 기술된 검정 조건 하에서 분당 광학 밀도의 1 유닛 감소로서 정의하였다.

3.5 반응기 속의 PLA 가수분해

Minibio 500 생물반응기(Applikon Biotechnology B.V., 네덜란트 델프트 소재)를 5 g의 PLA 및 100 mL의 2.5 내지 10 mg 프로테아제를 함유하는 100 mM 트리스-HCl 완충액 pH 7.5(45℃로 조절됨)로 출발하였다. 교반을 해상 임펠러(marine impeller)를 사용하여 250 rpm에서 설정하였다. 생물반응기를 외부 수욕 속에 침지함으로써 45℃에서 열고정시켰다. pH는 KOH를 3 M에서 첨가하여 7.5로 조절하였다. 상이한 매개변수(pH, 온도, 교반, 염기의 첨가)를 BioXpert 소프트웨어 V2.95의 도움으로 모니터링하였다. 500 μL의 반응 매질을 정규적으로 샘플처리하였다.

LA 및 LA의 이량체의 양을 실시예 2에 기술된 바와 같이, HPLC로 측정하였다.

비 활성은 분해의 비 속도(specific rate)에 상응한다. 시간당 및 효소 mg당 유리된 총 LA 및 LA의 이량체의 mg으로 계산하였다.

실시예 4 - 프로테아제 변이체의 열안전성의 평가

상이한 방법론을 사용하여 열안전성을 평가하였다:

(1) 온도, 시간 및 완충액의 주어진 조건 하에서 단백질 항온처리 후 잔류 폴리에스테르의 해중합 활성:

(2) 용액 속의 단백질의 원편광 이색성;

4.1 잔류 폴리에스테르의 분해 활성

야생형 프로테아제 및 변이체의 열 안전성을 열 쇼크 후 회복된 잔류 비 분해 활성(실시예 2에 기술된 바와 같은 PLA 가수분해)의 측정으로 측정하였다. 열 쇼크를 다음과 같이 수행하였다: 0.1 M 트리스-HCl 완충액 pH 7.5(45℃에서 조절됨), 20 mM의 CaCl₂ 중 고정된 효소 농도(0.15 g/L)를 함유하는 효소 샘플을 70℃에서 조절된 수욕 속에 주어진 시간(30 또는 60분) 동안 침지시켰다. 샘플을 열 쇼크 직후에 빙상에 두었다. 효소의 희석(0.05 g/L 까지) 단계 후, 열 쇼크시킨 및 비-열 쇼크시킨 샘플 후에 회수된 비 분해 활성(PLA 가수분해)을 실시예 2에 상세히 설명된 바와 같이 측정하였다(완충액: 트리스-HCl 0.1 M pH 7.5(45℃에서 조절됨)). 잔류 분해 활성의 결과를 비-열 쇼크된 샘플의 비 활성의 퍼센트로 나타낸다.

열 쇼크 조건 및 열 쇼크 후 잔류 분해 활성 결과를 표 4에 나타낸다.

표 4는 프로테아제 변이체 V8이 야생형 프로테아제보다, 30 내지 60분 동안 70℃에서 처리 후 더 큰 분해 활성을 보유함을 나타낸다.

4.2 원편광 이색성

원편광 이색성(CD)을 J-815 CD 분광광도계(JASCO)에서 수행하여 서열 번호 1의 프로테아제 및 본 발명의 프로테아제 변이체의 용융 온도(T _m )를 비교하였다. T_m은 단백질의 50%가 변성되는 온도에 상응한다.

단백질 샘플을 100 mM 트리스-HCl pH 7.5를 함유하는 완충액속에서 0.2 mg/mL에서 제조하였다. 실험을 1 mm의 광학 경로 수정 큐베트(optical path quartz cuvette)(Starna Scientific Ltd, 영국 소재) 속에서 수행하고 원-UV(195-260) CD 스펙트럼을 우선 측정하여 단백질의 정확한 폴딩에 상응하는 CD의 2개의 최대 강도를 측정하였다.

단백질의 열 변형 곡선을 온도가 증가함에 따라 220 nm에서 CD 값의 변화를 모니터링함으로써 수득하였다. 온도 상승의 속도는 1.5 ℃.분-1이었다. 전이의 중간점의 온도, T_m을 Sigmaplot 버젼 11.0 소프트웨어를 사용하여 최소 제곱법 분석(least-squares analysis)을 기반으로 수득되는 CD 값 대 온도 데이타의 곡선 맞춤으로 계산하였다.

수득된 T_m은 주어진 단백질의 열안전성을 반영한다. T_m이 높을 수록, 변이체는 고온에서 더 안정해진다.

서열 번호 1의 야생형 프로테아제의 T_m을 49.2 +/- 0.4℃에서 CaCl₂의 첨가없이 평가하였다. 프로테아제 변이체 V8 및 V19의 T_m을 각각 51.3℃ +/- 0.40℃(+2.10℃) 및 53.4℃ +/- 0.30℃(+4.2℃)에서 평가하였으며, 이는 각각 서열 번호 1의 에스테라제의 T_m과 비교하여 2.1℃ 및 4.2℃의 T_m의 획득을 나타낸다.

서열 번호 1의 야생형 프로테아제 및 프로테아제 변이체 V8 둘 다의 T_m을 70,4 +/- 0,2에서 5mM의 CaCl₂ 농도로 평가하였다.

실시예 5 - 본 발명의 프로테아제를 함유하는 생분해가능한 폴리에스테르 물질.

- 5.1 압출 공정을 통한 플라스틱 화합물 제조

본 발명의 프로테아제 변이체를 포함하는 플라스틱 화합물 제형을 제조하고 시판되는 효소(Savinase^®)를 포함하는 플라스틱 화합물 제형과 비교하였다. 제형 둘 다는 표 5에 나타낸다. 퍼센트는 제형의 총 중량을 기반으로 하여, 중량으로 제공된다.

제형 B는 본 발명의 변이체 V8(S101F + S103L + T106I)을 함유하는 플라스틱 화합물에 상응한다. 제형 A는 시판되는 효소(Savinase® 16L, Novozyme으로부터 고체형으로 시판됨, PLA를 분해하는 것으로 알려짐; 시판되는 프로테아제에 의한 폴리락타이드의 분해; Y.Oda et al. 2000)를 포함하는 대조군에 상응한다.

결과를 비교하기 위하여, 각각의 효소 제형은 동일한 양의 순수한 효소를 함유한다(효소 제형의 총 중량을 기반으로 한 2.1 중량%).

제형은 다음을 사용하여 제조하였다:

- PLA 펠렛(pellet)으로부터 수득한 분말 형태의, PLA(폴리락트산 중합체, NatureWorks로부터 PLA 4043D)(<1mm)를 액체 질소 속에 침지시키고 Ultra Centrifugal Mill ZM 200 시스템을 사용하여 미분하였다.

- Savinase® 16L의 고체 형을 시판되는 액체 형으로부터 3.5 kDa 막 상에서의 한외여과, 정용여과(diafiltration), 검 아라빅(Nexira로부터)의 첨가 및 동결-건조에 의한 건조로부터 수득하였다.

- 변이체 V8의 고체 형을 발효 공정, 코발트-컬럼 상에서 정제, 정용여과(diafiltration), 검 아라빅의 첨가 및 동결-건조에 의한 건조로부터 수득하였다.

이러한 제형을 기반으로 하여, 생분해가능한 폴리락트산-기반 플라스틱 조성물을 압출 공정을 통해 제조하였다. 화합기(compounding machine), 또는 공-회전 트윈-스크류 압출기("Haake MiniLab II ThermoFisher")를 사용하였다. 이러한 화합기는 수동 공급 요소, 2개의 공-회전 스크류 및 트윈 스크류의 헤드를 연속적으로 함유하였다.

모든 분말을 화합기 속에 도입하기 전에 수동 진탕으로 함께 혼합하였다. 이후에, 혼합물을 공급 구역에서 도입하고 수동 압력을 적용하는 스크류 압추기내로 넣었다. 혼합은 80 RPM의 트윈-스크류의 회전 속도를 사용하여 공-회전 스크류를 통과시켰다. 압출 온도를 165℃로 고정시켰다. 이후에 PLA 및 프로테아제의 혼합물은 직경이 0.4 mm인 하나의 홀을 포함하는 스크류 헤드 속에 도달하며, 여기서, 혼합물을 밀어넣어 스트라이프 형태를 형성하였다. 다음에 이러한 압출물을 절단 플라이어(cutting plier)로 절단하여 과립형 하의 플라스틱 조성물, 즉, 플라스틱 화합물을 수득하였다.

- 5.2 플라스틱 조성물의 생분해능의 시험

상기 수득된 플라스틱 화합물의 생분해능을 평가하였다.

100 mg의 각각의 과립화된 샘플 A 및 B를 칭량하고 투석 튜빙내에 도입하였다. 3 mL의 0.1 M 트리스-HCl 완충액 pH 8를 투석 튜빙 내에 가한 후 이를 밀봉하였다. 이후에 투석 튜빙을 50 mL의 0.1 M 트리스-HCl 완충제 pH 8을 함유하는 플라스틱 병에 도입하였다.

해중합은 각각의 샘플을 28℃ 또는 45℃에서, 150 rpm으로 Infors HT Multitron Pro 항온처리 진탕기 속에서 항온처리함으로써 출발하였다. 1 mL의 완충액의 분취량을 정규적으로 샘플처리하고, 0.22 μm 주사기 여과기에서 여과하고 Aminex HPX-87H 컬럼을 지닌 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석하여 락트산(LA) 및 락트산 이량체(DP2)의 유리를 모니터링하였다. 사용된 크로마토그래피 시스템은 펌프 모듈, 자동샘플러, 50℃에서 온도조절된 컬럼 오븐, 및 220 nm에서의 UV 검출기를 포함하는 Ultimate 3000 UHPLC 시스템(Thermo Fisher Scientific, Inc. 미국 매사츄세츠주 왈탐 소재)이었다. 용출은 5 mM H₂SO₄이었다. 주입은 20 μL의 샘플이었다. 락트산 및 락트산이 이량체를 시판되는 락트산(Sigma-Aldrich L1750-10G) 및 샘플보다 동일한 조건에서 자체로 합성된 락트산의 이량체로부터 제조한 표준 곡선에 따라 측정하였다.

플라스틱 물품의 가수분해물을 방출된 LA 및 LA의 이량체를 기반으로 계산하였다. 분해 퍼센트는 주어진 시간에서의 LA 및 DP2 내에 함유된 LA 대 플라스틱 조성물 속의 PLA내 초기에 함유된 LA의 몰 비로 계산하였다. 28℃에서 10일 반응 후 또는 45℃에서 24시간 반응 후, 해중합 결과를 표 6에 나타낸다.

본 시험은 시판되는 효소를 함유하는 플라스틱 조성물 A와 비교하여, 프로테아제 변이체 V8을 함유하는 플라스틱 조성물 B의 보다 높은 분해율을 입증한다. 10일 후에, 조성물 B의 분해율은 조성물 A의 분해율보다 10배 더 높다.

이러한 결과는 흥미롭게도, 본 발명의 변이체가 시판되는 효소와 비교하여 더 높은 PLA-분해 활성 및/또는 더 높은 열안전성을 가짐을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> CARBIOS <120> NOVEL PROTEASES AND USES THEREOF <130> IP20203840FR <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 276 <212> PRT <213> Actinomadura sp <400> 1 Ala Thr Gln Asn Asn Pro Pro Ser Trp Gly Leu Asp Arg Ile Asp Gln 1 5 10 15 Thr Asn Leu Pro Leu Ser Arg Ser Tyr Thr Tyr Asn Ser Thr Gly Ala 20 25 30 Gly Val Asn Ala Tyr Ile Ile Asp Thr Gly Ile Tyr Thr Ala His Ser 35 40 45 Asp Phe Gly Gly Arg Ala Thr Asn Val Tyr Asp Ala Leu Gly Gly Asn 50 55 60 Gly Gln Asp Cys Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Gly 65 70 75 80 Gly Ala Ala Tyr Gly Val Ala Lys Ala Val Asn Leu Arg Gly Val Arg 85 90 95 Val Leu Asn Cys Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Val Ile Ala Gly 100 105 110 Met Asn Trp Val Ala Ser Asn His Val Lys Pro Ala Val Ala Asn Met 115 120 125 Ser Leu Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Leu Asn Thr Ala Ala Asn Asn 130 135 140 Leu Ala Ser Ser Gly Val Phe Leu Ala Val Ala Ala Gly Asn Glu Thr 145 150 155 160 Thr Asn Ala Cys Asn Arg Ser Pro Ala Ser Ala Ala Asn Ala Thr Thr 165 170 175 Val Ala Ala Ser Thr Ser Thr Asp Ala Arg Ala Ser Tyr Ser Asn Tyr 180 185 190 Gly Ser Cys Val His Leu Tyr Ala Pro Gly Ser Ser Ile Thr Ser Ala 195 200 205 Trp Leu Asn Gly Gly Thr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Thr Ala Ala Leu Tyr Lys Ala Thr Tyr Gly Asp 225 230 235 240 Ala Ser Phe Ser Thr Ile Arg Ser Trp Leu Val Ser Asn Ala Thr Ser 245 250 255 Gly Val Ile Thr Gly Asn Val Ser Gly Thr Pro Asn Leu Leu Leu Asn 260 265 270 Lys Arg Ser Leu 275 <210> 2 <211> 81 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> propeptide <400> 2 Ala Pro Ala Val Pro Val Ala Met Ala Ala Ala Gly Gln Gly Val Ala 1 5 10 15 Gly Gln Tyr Ile Val Thr Leu Lys Lys Gly Val Ser Val Asp Ser Thr 20 25 30 Val Ala Lys Arg Gly Ile Arg Thr Gln His Arg Phe Gly Lys Val Leu 35 40 45 Asn Gly Phe Ser Ala Lys Leu Thr Asp Asp Gln Leu Ser Lys Leu Arg 50 55 60 Thr Thr Pro Gly Val Ala Ser Ile Glu Gln Asp Ala Val Ile Thr Val 65 70 75 80 Asp <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> PelB signal peptide <400> 3 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala 20 <210> 4 <211> 357 <212> PRT <213> Actinomadura sp. <400> 4 Ala Pro Ala Val Pro Val Ala Met Ala Ala Ala Gly Gln Gly Val Ala 1 5 10 15 Gly Gln Tyr Ile Val Thr Leu Lys Lys Gly Val Ser Val Asp Ser Thr 20 25 30 Val Ala Lys Arg Gly Ile Arg Thr Gln His Arg Phe Gly Lys Val Leu 35 40 45 Asn Gly Phe Ser Ala Lys Leu Thr Asp Asp Gln Leu Ser Lys Leu Arg 50 55 60 Thr Thr Pro Gly Val Ala Ser Ile Glu Gln Asp Ala Val Ile Thr Val 65 70 75 80 Asp Ala Thr Gln Asn Asn Pro Pro Ser Trp Gly Leu Asp Arg Ile Asp 85 90 95 Gln Thr Asn Leu Pro Leu Ser Arg Ser Tyr Thr Tyr Asn Ser Thr Gly 100 105 110 Ala Gly Val Asn Ala Tyr Ile Ile Asp Thr Gly Ile Tyr Thr Ala His 115 120 125 Ser Asp Phe Gly Gly Arg Ala Thr Asn Val Tyr Asp Ala Leu Gly Gly 130 135 140 Asn Gly Gln Asp Cys Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val 145 150 155 160 Gly Gly Ala Ala Tyr Gly Val Ala Lys Ala Val Asn Leu Arg Gly Val 165 170 175 Arg Val Leu Asn Cys Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Val Ile Ala 180 185 190 Gly Met Asn Trp Val Ala Ser Asn His Val Lys Pro Ala Val Ala Asn 195 200 205 Met Ser Leu Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Leu Asn Thr Ala Ala Asn 210 215 220 Asn Leu Ala Ser Ser Gly Val Phe Leu Ala Val Ala Ala Gly Asn Glu 225 230 235 240 Thr Thr Asn Ala Cys Asn Arg Ser Pro Ala Ser Ala Ala Asn Ala Thr 245 250 255 Thr Val Ala Ala Ser Thr Ser Thr Asp Ala Arg Ala Ser Tyr Ser Asn 260 265 270 Tyr Gly Ser Cys Val His Leu Tyr Ala Pro Gly Ser Ser Ile Thr Ser 275 280 285 Ala Trp Leu Asn Gly Gly Thr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala 290 295 300 Thr Pro His Val Ala Gly Thr Ala Ala Leu Tyr Lys Ala Thr Tyr Gly 305 310 315 320 Asp Ala Ser Phe Ser Thr Ile Arg Ser Trp Leu Val Ser Asn Ala Thr 325 330 335 Ser Gly Val Ile Thr Gly Asn Val Ser Gly Thr Pro Asn Leu Leu Leu 340 345 350 Asn Lys Arg Ser Leu 355 <210> 5 <211> 1071 <212> DNA <213> artificial sequnce <220> <223> gene encoding non-matured protease <400> 5 gcccccgctg tccccgtcgc catggccgct gccggccagg gtgtcgccgg ccagtacatc 60 gttactctga agaagggcgt gtctgttgac tctaccgttg ctaagcgagg catccgaacc 120 cagcaccgat tcggaaaggt cctgaacgga ttttccgcca agctcaccga cgatcagctg 180 tctaagctcc gaaccactcc cggcgtcgcc tctatcgagc aggacgctgt tattaccgtc 240 gatgccactc agaacaaccc tccctcctgg ggtctcgacc gaatcgacca gaccaacctg 300 cctctctctc gatcgtacac ctacaactct actggagccg gcgtcaacgc ttacatcatt 360 gacaccggaa tttacactgc ccactccgat ttcggcggtc gagctaccaa cgtgtacgac 420 gccctgggag gcaacggtca ggattgcaac ggtcacggaa cccatgtggc cggcactgtt 480 ggtggagccg cttacggtgt cgccaaggct gtgaacctgc gaggtgtccg agtgctcaac 540 tgttccggct ctggtaccac ttccggagtc atcgctggca tgaactgggt ggcctctaac 600 catgttaagc ccgccgtcgc taacatgtcc ctgggcggtg gatactcctc ttcgctgaac 660 accgccgcta acaacctcgc ttcctctgga gtgttcctgg ccgttgccgc tggcaacgag 720 accactaacg cctgcaaccg atcgcctgct tccgccgcta acgctaccac tgtggccgct 780 tcgacctcta ctgacgcccg agcttcttac tcgaactacg gttcttgtgt tcacctctac 840 gctcccggat cgtccatcac ctctgcctgg ctgaacggcg gtaccaacac tatttctggc 900 acctcgatgg ccactcctca tgttgctggt accgccgctc tctacaaggc cacttacgga 960 gacgcttcct tttctaccat tcgatcctgg ctggtgtcta acgccacctc gggtgtcatc 1020 actggtaacg tctctggaac tcccaacctg ctcctgaaca agcgaagcct g 1071 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 6xhistidine tag <400> 6 Leu Glu His His His His His His 1 5 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM S101F forward <400> 7 gtccgagtgc tcaactgttt cggctctggt accact 36 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM S101L forward <400> 8 gtccgagtgc tcaactgtct gggctctggt accact 36 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM S101M forward <400> 9 gtccgagtgc tcaactgtat gggctctggt accact 36 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM S101W forward <400> 10 gtccgagtgc tcaactgttg gggctctggt accact 36 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM S101Y forward <400> 11 gtccgagtgc tcaactgtta cggctctggt accact 36 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM S101 reverse <400> 12 acagttgagc actcggacac ctcgcaggtt cacagc 36 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM S103L forward <400> 13 tgctcaactg ttccggcctg ggtaccactt ccgga 35 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM S103 reverse <400> 14 gccggaacag ttgagcactc ggacacctcg cag 33 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM T106I forward <400> 15 gttccggctc tggtaccatc tccggagtca tcgct 35 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM T106L forward <400> 16 gttccggctc tggtaccctg tccggagtca tcgct 35 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM T106 reverse <400> 17 ggtaccagag ccggaacagt tgagcactcg gacacc 36 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM G131I forward <400> 18 cgctaacatg tccctgatcg gtggatactc ctct 34 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM G131 reverse <400> 19 cagggacatg ttagcgacgg cgggcttaac atg 33 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM G133K forward <400> 20 ctaacatgtc cctgggcggt aagtactcct cttcgc 36 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM G133 reverse <400> 21 gcccagggac atgttagcga cggcgggctt aac 33 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM_S101F_S103L <400> 22 gagtgctcaa ctgtttcggc ctgggta 27 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM_S101F_S103L reverse <400> 23 tcggaagtgg tacccaggcc gaaacag 27 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM_S101F_S103L_T106I forward <400> 24 actgtttcgg cctgggtacc atctccggag 30 <210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM_S101F_S103L_T106I reverse <400> 25 ggagatggta cccaggccga aacagttgag c 31 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM_T106L bis forward <400> 26 ggtaccctgt ccggagtcat cg 22 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAM_S103L_T106L reverse <400> 27 tccggacagg gtacccaggc 20 <210> 28 <211> 386 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> protease <400> 28 Met Arg Arg Arg Thr Leu Pro Ile Ala Val Leu Ala Ala Val Pro Leu 1 5 10 15 Ala Met Ala Gly Ala Leu Pro Ala Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala 20 25 30 Val Pro Val Ala Met Ala Ala Ala Gly Gln Gly Val Thr Gly Gln Tyr 35 40 45 Ile Val Thr Leu Lys Lys Gly Val Ser Val Asp Ser Thr Val Ser Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Arg Thr Gln Tyr Arg Phe Gly Lys Val Leu Asn Gly Phe 65 70 75 80 Ser Ala Lys Leu Thr Asp Ala Gln Leu Ala Lys Leu Arg Thr Thr Pro 85 90 95 Gly Val Ala Ser Ile Glu Gln Asp Ala Val Ile Lys Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Gln Thr Asn Pro Pro Ser Trp Gly Ile Asp Arg Ile Asp Gln Thr Asn 115 120 125 Leu Pro Leu Ser Asn Ser Tyr Thr Tyr Asn Ser Thr Gly Ala Gly Val 130 135 140 Asn Ala Tyr Ile Ile Asp Thr Gly Ile Tyr Thr Ala His Pro Asn Phe 145 150 155 160 Gly Gly Arg Ala Thr Asn Val Tyr Asp Ala Leu Gly Gly Asn Gly Gln 165 170 175 Asp Cys Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Gly Ser Thr 180 185 190 Ser Tyr Gly Val Ala Lys Ser Val Asn Leu Arg Gly Val Arg Val Leu 195 200 205 Asn Cys Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Val Ile Ala Gly Met Asn 210 215 220 Trp Val Ala Gly Asn His Val Lys Pro Ala Val Ala Asn Met Ser Leu 225 230 235 240 Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Ile Asn Thr Ala Ala Asn Asn Leu Ala 245 250 255 Asn Ala Gly Val Phe Leu Ala Ala Ala Ala Gly Asn Glu Asn Thr Asn 260 265 270 Ala Cys Asn Arg Ser Pro Ala Ser Ala Ala Asn Ala Thr Thr Val Ala 275 280 285 Ala Ser Thr Ser Thr Asp Ala Arg Ala Ser Tyr Ser Asn Tyr Gly Ser 290 295 300 Cys Val His Leu Tyr Ala Pro Gly Ser Ser Ile Thr Ser Thr Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Gly Thr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His 325 330 335 Val Ala Gly Val Ala Ala Leu Tyr Lys Ala Thr Tyr Gly Asp Ala Ser 340 345 350 Phe Ser Thr Ile Arg Ser Trp Leu Thr Ser Asn Ala Thr Ser Gly Val 355 360 365 Ile Thr Gly Asn Pro Ser Gly Thr Pro Asn Arg Leu Leu Asn Lys Arg 370 375 380 Ser Leu 385

Claims

(i) 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖고, (ii) S101F/L/M/W/Y, S103L, T106I/L, G131I, 또는 G133K로부터 선택된 위치에서의 적어도 하나의 아미노산 치환, 바람직하게는 S101F/L/M/W/Y로부터 선택된 적어도 하나의 치환, 보다 바람직하게는 적어도 치환 S101F을 갖고, 여기서 상기 위치는 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 참고로 번호매김되며, (iii) 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타내는, 프로테아제.
(i) 서열 번호 1에 나타낸 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖고, (ii) S101, S103, T106, G131, 또는 G133으로부터 선택된 위치에서의 적어도 하나의 치환, 바람직하게는 S101F/L/M/W/Y로부터 선택된 적어도 하나의 치환, 보다 바람직하게는 적어도 치환 S101F로부터 선택된 치환을 갖고, 여기서 상기 위치는 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 참고로 번호매김되며, (iii) 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타내는 프로테아제.
제2항에 있어서, 상기 프로테아제가 S101, S103, T106, G131, 또는 G133으로부터 선택된 위치에서의 적어도 2개의 치환, 바람직하게는 적어도 3개의 치환을 포함하는 프로테아제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제가 S101F/L/M/W/Y + S103L + T106I/L로부터 선택된 적어도 하나의 치환의 조합을 포함하는 프로테아제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제가 S101F + S103L, S101F + T106I, T106I + G133K, S101F + S103L + T106I, S101F + S103L + G133K, S101F + T106I + G133K, S101F + S103L + T106L, S101F + S103L + T106I + G133K, S101F + S103L + T106I + G131I, 바람직하게는 S101F + S103L + T106I/L로부터 선택된 적어도 하나의 치환의 조합을 갖는 프로테아제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, pH 7 내지 10, 바람직하게는 pH 7.5 및/또는 pH 9에서 서열 번호 1의 프로테아제와 비교하여 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타내는, 프로테아제.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 프로테아제를 암호화하는 핵산.
제7항의 핵산을 포함하는 발현 카세트 또는 벡터.
제7항의 핵산 또는 제8항의 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 프로테아제, 또는 제9항에 따른 숙주 세포, 또는 상기 프로테아제를 포함하는 이의 추출물을 포함하는 조성물.
프로테아제를 생산하는 방법으로,
(a) 제9항에 따르는 숙주 세포를 상기 프로테아제를 암호화하는 핵산을 발현시키기에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 임의로
(b) 상기 프로테아제를 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는, 프로테아제를 생산하는 방법.
적어도 하나의 폴리에스테르를 함유하는 플라스틱 생성물의 분해 방법으로,
(a) 상기 플라스틱 생성물을 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제 또는 제9항에 따른 숙주 세포 또는 제10항에 따른 조성물과 접촉시키는 단계; 및 임의로
(b) 단량체 및/또는 올리고머를 회수하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 폴리에스테르를 함유하는 플라스틱 생성물의 분해 방법.
제12항에 있어서, 플라스틱 생성물이 폴리락트산(PLA), 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트(PTT), 폴리부틸렌 테레프탈레이트(PBT), 폴리에틸렌 이소소르바이드 테레프탈레이트(PEIT), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리하이드록시알카노에이트(PHA), 폴리부틸렌 석시네이트(PBS), 폴리부틸렌 석시네이트 아디페이트(PBSA), 폴리부틸렌 아디페이트 테레프탈레이트(PBAT), 폴리에틸렌 푸라노에이트(PEF), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(에틸렌 아디페이트)(PEA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 및 이러한 물질의 배합물/혼합물로부터 선택된 적어도 하나의 폴리에스테르, 바람직하게는 폴리락트산을 포함하는 방법.
(i) 적어도 하나의 폴리에스테르, 바람직하게는 적어도 폴리락트산 및 (ii) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 프로테아제 또는 제9항에 따른 숙주 세포 또는 상기 프로테아제를 포함하는 이의 추출물 또는 제10항에 따른 조성물을 함유하는 플라스틱 화합물.
제14항에 있어서, 프로테아제가 플라스틱 화합물의 적어도 하나의 폴리에스테르를 분해할 수 있는 플라스틱 화합물.
적어도 하나의 폴리에스테르 및 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 프로테아제 또는 제9항에 따른 숙주 세포 또는 상기 프로테아제를 포함하는 이의 추출물 또는 제10항에 따른 조성물을, 폴리에스테르가 부분적으로 또는 전체적으로 융융된 상태로 있는 온도에서, 바람직하게는 압출에 의해 혼합시킴을 포함하는, 제14항 또는 제15항의 플라스틱 화합물의 생산 방법.
폴리에스테르 함유 물질을 분해하기 위한, 바람직하게는 폴리락트산 함유 물질을 분해하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제 또는 제9항에 따르는 숙주 세포 또는 제10항에 따른 조성물의 용도.