JP7465391B2 - 新規プロテアーゼ及びその使用 - Google Patents
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Description
プロテアーゼは、ポリエステルを含む様々なポリマーの加水分解を触媒することができる。この文脈では、プロテアーゼは、食器洗浄及び洗濯用途のための洗剤として、バイオマス及び食品を処理するための分解酵素として、環境汚染物質の無毒化における生物触媒として、又は繊維工業におけるポリエステル布地の処理のためのものを含む多くの工業用途において有望な効果を示している。同様に、ポリ乳酸(PLA)を加水分解するための分解酵素としてのプロテアーゼの使用は特に興味深い。実際、PLAは、多数の技術分野、例えば可撓性及び剛性の包装、バッグ、マルチフィルムに、並びに衣類及びカーペットの製造に使用されるバイオ系ポリマー(すなわち、天然及び/又は再生可能資源由来のポリマー)である。したがって、埋立地におけるPLAの蓄積は、深刻化する生態系問題になる。
本発明は、親又は野生型プロテアーゼと比較して増加したポリエステル分解活性を示すプロテアーゼの新たな変異体を提供する。これらのプロテアーゼは、ポリエステル(単数若しくは複数)並びに/又はポリエステル(単数若しくは複数)を含有するプラスチック材料及び製品、例えばPLA又はポリ乳酸(PLA)を含有するプラスチック材料及び製品を分解するためのプロセスにおいて特に有用である。より具体的には、本発明は、本明細書中で親プロテアーゼ又は野生型プロテアーゼとして参照される配列番号1に記載されているアミノ酸配列を有するActinomadura種のプロテアーゼの変異体を提供する。興味深いことに、野生型プロテアーゼ及び変異体は両方とも、サブチリシン様プロテアーゼと考えられる。本発明は更に、本発明の変異体を使用して、ポリエステル(単数若しくは複数)並びに/又はポリエステル(単数若しくは複数)を含有するプラスチック材料及び製品、より具体的にはポリ乳酸(PLA)及び/又はPLAを含有するプラスチック材料及び製品を分解するためのプロセスを提供する。
(a)プロテアーゼをコードする核酸を発現させるために適切な条件下で、上記で定義される宿主細胞を培養すること;及び、場合により、
(b)細胞培養物から上記プロテアーゼを回収すること
を含む、方法を提供することである。
(a)プラスチック製品を、上記で定義されるプロテアーゼ又は宿主細胞と接触させ、それにより、プラスチック製品を分解すること;並びに、場合により、
(b)モノマー及び/又はオリゴマー、好ましくは乳酸(LA)のモノマー及び/又はオリゴマーを回収すること
を含む、方法に関する。
定義
本開示は、以下の定義を参照することにより最も良く理解される。
現在利用可能な酵素と比較して改善されたポリエステル分解活性を有する新規プロテアーゼの開発に取り組むことにより、本発明者らは更に、配列番号1のアミノ酸配列を有するセリンプロテアーゼを検討し、改善されたポリエステル分解活性を示すその変異体を開発することができた。特に、本発明者らは、タンパク質内の特定のアミノ酸残基であって、ポリエステル基質との接触を意図しており、ポリエステル基質とタンパク質との接触を促進するように有利に改変され得る、特定のアミノ酸残基を同定した。理論に縛られるものではないが、このような改変は、改善された分解活性をもたらすポリエステルへのプロテアーゼの吸着を増加させると考えられる。したがって、本発明者らは、配列番号1由来の新規プロテアーゼであって、より高い活性を示し、ポリエステル又はポリエステル含有製品を分解するために特に適した、新規プロテアーゼを開発することができた。興味深いことに、これらの新たなプロテアーゼは、工業プロセスにおける使用のための優れた特性を有する。新たに開発されたプロテアーゼは、分解性プラスチック製品の工業生産が実施され得る条件、及び/又はプラスチック製品の環境分解を得られ得る条件で、改善された活性を示す。
有利には、プロテアーゼ変異体及び/又は親プロテアーゼは、N末端において、プロテアーゼの3Dフォールディング及び成熟に少なくとも部分的に関与する「プロペプチド」(配列番号2)として作用するアミノ酸配列を含む。
本発明の目的は、プロテアーゼ活性を有する新たな酵素を提供することである。
有利には、本発明の変異体プロテアーゼの熱安定性は、配列番号1の親プロテアーゼの熱安定性と比較して損なわれない。より有利には、変異体の熱安定性は、親プロテアーゼの熱安定性と比較して改善される。本発明の文脈内では、「改善された熱安定性」という用語は、高温で、より具体的には40℃~90℃、例えば70℃の温度で、配列番号1のプロテアーゼと比較して、その化学的及び/又は物理的構造の変化に抵抗する酵素の増加した能力を示す。特に、本発明のプロテアーゼは、40℃~90℃、例えば70℃の温度で、配列番号1のプロテアーゼと比較して増加した残存分解活性を有し得る。特に、本発明のプロテアーゼは、40℃~90℃、例えば70℃の温度で、配列番号1のプロテアーゼと比較して増加した半減期を有し得る。特に、本発明の変異体は、押出プロセス中に、より具体的には、50℃~250℃、好ましくは130℃~180℃に含まれる温度で実行される押出プロセス中に、改善された熱安定性を示す。
本発明の更なる目的は、上記で定義されるプロテアーゼをコードする核酸を提供することである。
本発明の別の目的は、本発明のプロテアーゼ変異体を生産する方法であって、当該プロテアーゼをコードする核酸を発現させること、及び場合により当該プロテアーゼを回収することを含む、方法を提供することである。
(a)核酸を発現させるために適切な条件下で、本発明のプロテアーゼをコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること;及び、場合により、
(b)細胞培養物から上記プロテアーゼを回収すること
を含む。
本発明の更なる目的は、本発明のプロテアーゼ又は宿主細胞若しくはその抽出物を含む組成物を提供することである。本発明の文脈では、「組成物」という用語は、本発明のプロテアーゼ又は宿主細胞を含む任意の種類の組成物を包含する。特定の実施態様では、プロテアーゼは、単離された又は少なくとも部分的に精製された形態である。
本発明の更なる目的は、好気性又は嫌気性条件で、ポリエステルから作製された若しくはそれを含有するプラスチック製品のようなポリエステル及び/若しくはポリエステル含有材料を分解及び/若しくはリサイクルし、並びに/又はポリエステルを含有する生分解性プラスチック製品を生産するために、本発明のプロテアーゼを使用する方法を提供することである。本発明のプロテアーゼは、PLAを含有する生分解性プラスチック製品を生産するために、並びに/又はPLA及びPLAを含むプラスチック製品を分解するために特に有用である。
- 1.1 構築
非成熟親プロテアーゼ(配列番号2+配列番号1に対応する配列番号4)をコードする遺伝子(核配列番号5)を、当該遺伝子の上流のPelBシグナルペプチド(配列番号3 MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA)及び当該遺伝子の下流の6×ヒスチジンタグ(配列番号6 LEHHHHHH)をコードする配列とインフレームで、プラスミドpET26b+(EMD Millipore, Billerica, Massachusetts, USA)中にクローニングした。E. coli One Shot(登録商標)BL21 DE3 (Life technologies, Carlsbad, California, USA)を、構築したプラスミドでトランスフォーメーションした。得られた株は、タンパク質のN末端にPelBリーダー配列及びC末端に6×ヒスチジンタグを有する野生型プロテアーゼを発現する。QuikChange II部位特異的突然変異誘発キットを供給業者の推奨にしたがって使用して、変異体を構築した(Santa Clara, California, USA)。表1は、部位特異的突然変異誘発に使用したフォワード及びリバースプライマーを示す。
野生型プロテアーゼとその変異体を発現する株のリコンビナント発現を、TB培地 100mL中、37℃で4時間行い、次いで、最終濃度1mMのIPTG添加後に21℃で行った(Tartoff K. D. and Hobbs C. A., 1987, Improved Media for Growing Plasmid and Cosmid Clones, Bethesda Res. Lab. Focus, 9:12.)。Avanti J-26 XP遠心分離機(Beckman Coulter, Brea, USA)で遠心分離(8000rpm、10℃で20分)により、培養を停止させた。細胞を-80℃で少なくとも2.5時間凍結させ、次いで、トリスHClバッファー(トリス0.1M、pH9)10mLに懸濁した。Lysonase(商標)Bioprocessing Reagent (EMD Millipore)を使用して、供給業者の推奨にしたがって、細胞を溶解した。次いで、細胞懸濁液を11000rpm及び10℃で30分間遠心分離した。可溶性画分を回収し、Talon(登録商標)Metal親和性樹脂(Clontech, CA, USA)を使用して、コバルトアフィニティークロマトグラフィーに供した。タンパク質を、20mM トリス-HCl、300mM NaCl、pH8.0中100mM イミダゾールで溶出した。トリスHClバッファー(トリス0.1M、5mM CaCl2、45℃でレギュレーションしたpH7.5又はpH9)に対する透析工程後に、精製抽出物からイミダゾールを除去した。製造業者の説明書(Lifescience Bio-Rad, France)にしたがってBio-Rad Bradfordタンパク質アッセイを使用して、精製タンパク質を定量し、+4℃で保存した。TCA沈殿後のSDS-PAGE上で精製の質を評価し、予想されるタンパク質サイズは約29kDaであった。
野生型プロテアーゼ及びその変異体の比分解活性をPLA加水分解中に決定した。500μm PLA粉末(PLLA 001 - Natureplast) 50mgを計量し、透析チューブに導入した。掲載されているように、変異体は、特定の置換を除いて、配列番号1に記載されているアミノ酸配列を有する。次いで、酵素サンプル(正確な比活性を測定するために、一定濃度2.5、5、10又は15mg/Lの酵素を含有するプロテアーゼ調製物1.5mL)を透析チューブに添加してからそれを閉じ、この後者を、0.1M トリス-HClバッファーpH9又はpH7.5(45℃でレギュレーション)25mLを含有するガラスボトルに導入した。野生型プロテアーゼ(配列番号1)をコントロールとして使用した。
本発明のプロテアーゼの比分解活性を決定し、配列番号1の野生型プロテアーゼの比活性と比較した。
(1)pNA加水分解に基づく比活性
(2)固体形態のポリエステルの分解に基づく比分解活性
(3)固体形態のタンパク質の分解に基づく比活性
(4)PLA含有エマルジョンの濁度の減少に基づく比分解活性
(5)反応容器中のPLA加水分解に基づく比分解活性
溶液中タンパク質 20μLを、トリスHClバッファー、0.1M pH7.5中5mM N-スクシニル-Ala-Ala-Ala-p-ニトロアニリド(pNA) 180μLに合わせた。酵素反応を、撹拌下、30℃で少なくとも15分間実施し、マイクロプレート分光光度計(Versamax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)により、405nmの吸光度を取得した。加水分解曲線の直線部分で、比活性(酵素1mg当たり1分当たりに放出されたpニトロアニリドのμmolで表される初速度)を決定し、これを使用して、野生型プロテアーゼの活性を変異体の活性と比較した。
酵素調製物20μLを、PLA含有アガロースプレートに作ったウェルに堆積させた。ジクロロメタン(DCM)10mL中PLA450mgを可溶化し、ボルテックスでホモジナイズすることにより、アガロースプレートの調製を達成した。0.1M トリスHClバッファー(pH7~9)90mLを添加し、続いて、超音波処理工程(Fisher Scientific(商標)Model 705 Sonic Dismembrator、最大出力の30%)を行った後、DCMを50℃で蒸発させた。得られた溶液を濾過して、未溶解残留物を除去した。最後に、0.5%PLAエマルジョン12mLを1MトリスHClバッファー(pH9)(45℃でレギュレーション)3mL及び2%アガロース15mLと混合して、各omnitrayを調製した(4℃で保存)。
酵素調製物20μLを、牛乳を含有する寒天プレートに作ったウェルに堆積させた。粉乳の28g/L(Regilait(商標))水溶液を調製することにより、寒天プレートの調製を行った。次いで、牛乳15mLを15g/L寒天15mLと混合して、各omnitrayを調製した(4℃で保存)。
(最大出力の30%でSonic Dismembratorを使用して)100mM トリス-HClバッファー(pH9(45℃でレギュレーション))中最終濃度0.1%(w/v)の乳化PLAを用いて、波長630nmでの濁度の減少に基づいて、PLA分解活性を45℃で30分間pH9で、アッセイした。1単位のPLA分解活性を、記載されているアッセイ条件下における1分当たりの光学密度の1単位の減少として定義した。
PLA5gと、プロテアーゼ2.5~10mgを含有する100mM トリス-HClバッファーpH7.5(45℃でレギュレーション)100mLとを用いて、Minibio 500バイオリアクター(Applikon Biotechnology B.V., Delft, The Netherlands)を開始させた。マリンインペラーを使用して、撹拌を250rpmに設定した。外部水浴への浸漬により、バイオリアクターを45℃で温度調節した。3M KOHの添加により、pHを7.5にレギュレーションした。BioXpertソフトウェアV2.95により、異なるパラメータ(pH、温度、撹拌、塩基の添加)をモニタリングした。反応媒体500μLを定期的にサンプリングした。
異なる方法論を使用して、熱安定性を推定した。
(1)温度、時間及びバッファーの所定の条件下におけるタンパク質のインキュベーション後の残存ポリエステルの脱重合活性
(2)溶液中のタンパク質の円二色性
熱ショック後に回収された残存比分解活性(実施例2に記載されているPLA加水分解)の測定により、野生型プロテアーゼ及び変異体の熱安定性を決定した。熱ショックを以下のように実施した:0.1Mトリス-HClバッファーpH7.5(45℃でレギュレーション)、20mM CaCl2中に一定の酵素濃度(0.15g/L)を含有する酵素サンプルを、70℃に調整された水浴に所定の時間(30又は60分間)浸漬した。熱ショック後、サンプルを氷上に直ぐに置いた。酵素の希釈工程(0.05g/Lまで)後、実施例2に詳述されているように(バッファー:トリス-HCl 0.1M pH7.5(45℃でレギュレーション))、熱ショック後及び非熱ショックのサンプルから回収された比分解活性(PLA加水分解)を測定した。残存分解活性の結果は、非熱ショックサンプルの比活性のパーセンテージとして表されている。
J-815 CD分光計(JASCO)で円二色性(CD)を実施して、配列番号1のプロテアーゼ及び本発明のプロテアーゼ変異体の融解温度(Tm)を決定及び比較した。Tmは、タンパク質の50%が変性する温度に相当する。
- 5.1 押出プロセスによるプラスチック化合物の調製
本発明のプロテアーゼ変異体を含むプラスチック化合物処方を調製し、市販の酵素(Savinase(登録商標))を含むプラスチック化合物処方と比較した。両処方を表5に掲載する。パーセンテージは、処方の総重量に基づいて重量比で示されている。
-液体窒素に浸漬し、Ultra Centrifugal Mill ZM 200システムを使用して微粉化したPLAペレットから得られた粉末形態(<1mm)のPLA(ポリ乳酸ポリマー、NatureWorks製のPLA 4043D)、
-3.5kDa膜の限外濾過、透析濾過、アラビアゴム(Nexira製)の添加及び凍結乾燥による乾燥により、商業的液体形態から得られた固体形態のSavinase(登録商標)16L、
-発酵プロセス、続いて、コバルトカラムでの精製、透析濾過、アラビアゴムの添加及び凍結乾燥による乾燥から得られた固体形態の変異体V8
上記で得られたプラスチック化合物の生分解性を評価した。
Claims (18)
- (i)配列番号1に記載されている全長アミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有し、(ii)S101、S103、T106、G131又はG133から選択される位置において少なくとも1つのアミノ酸置換を有し、該位置は、配列番号1に記載されているアミノ酸配列を参照してナンバリングされている、(iii)配列番号1のプロテアーゼと比較して増加したポリエステル分解活性を示す、プロテアーゼ。
- S101F/L/M/W/Y、S103L、T106I/L、G131I又はG133Kから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換、好ましくはS101F/L/M/W/Yから選択される少なくとも1つの置換、より好ましくは少なくとも置換S101Fを有し、該位置は、配列番号1に記載されているアミノ酸配列を参照してナンバリングされている、請求項1に記載のプロテアーゼ。
- S101、S103、T106、G131又はG133から選択される位置において少なくとも2つの置換、好ましくは少なくとも3つの置換を含む、請求項1に記載のプロテアーゼ。
- S101F/L/M/W/Y+S103L+T106I/Lから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載のプロテアーゼ。
- S101F+S103L、S101F+T106I、T106I+G133K、S101F+S103L+T106I、S101F+S103L+G133K、S101F+T106I+G133K、S101F+S103L+T106L、S101F+S103L+T106I+G133K、S101F+S103L+T106I+G131Iから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせ、好ましくはS101F+S103L+T106I/Lを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載のプロテアーゼ。
- D12、L21、T175、S194、H197、G212、I217又はR247から選択される位置において少なくとも1つのアミノ酸置換(ここで、当該位置は、配列番号1に記載されているアミノ酸配列を参照してナンバリングされている);好ましくはD12C+L21C、T175C+R247C、S194P、H197D、G212N又はI217Kから選択される少なくとも1つの置換
を更に含む、請求項1~5のいずれか一項に記載のプロテアーゼ。 - pH7~10、好ましくはpH7.5及び/又はpH9で、配列番号1のプロテアーゼと比較して増加したポリエステル分解活性を示す、請求項1~6のいずれか一項に記載のプロテアーゼ。
- 請求項1~7のいずれか一項で定義されるプロテアーゼをコードする、核酸。
- 請求項8に記載の核酸を含む、発現カセット又はベクター。
- 請求項8に記載の核酸又は請求項9に記載の発現カセット若しくはベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項1~7のいずれかで定義されるプロテアーゼ又は請求項10に記載の宿主細胞若しくは該プロテアーゼを含むその抽出物を含む、組成物。
- プロテアーゼを生産する方法であって、
(a)該プロテアーゼをコードする核酸を発現させるために適切な条件下で、請求項10に記載の宿主細胞を培養すること;及び、場合により
(b)細胞培養物から該プロテアーゼを回収すること
を含む、方法。 - 少なくとも1つのポリエステルを含有するプラスチック製品を分解する方法であって、
(a)該プラスチック製品を、請求項1~7のいずれか一項に記載のプロテアーゼ又は請求項10に記載の宿主細胞又は請求項11に記載の組成物と接触させること;及び、場合により
(b)モノマー及び/又はオリゴマーを回収すること
を含む、方法。 - 前記プラスチック製品が、ポリ乳酸(PLA)、ポリトリメチレンテレフタラート(PTT)、ポリブチレンテレフタラート(PBT)、ポリエチレンイソソルビドテレフタラート(PEIT)、ポリエチレンテレフタラート(PET) ポリヒドロキシアルカノアート(PHA)、ポリブチレンサクシナート(PBS)、ポリブチレンサクシナートアジパート(PBSA)、ポリブチレンアジパートテレフタラート(PBAT)、ポリエチレンフラノアート(PEF)、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリ(エチレンアジパート)(PEA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)(PLGA)及びこれらの材料のブレンド/混合物から選択される少なくとも1つのポリエステル、好ましくはポリ乳酸を含む、請求項13に記載の方法。
- (i)少なくとも1つのポリエステル、好ましくは少なくともポリ乳酸と、(ii)請求項1~7のいずれか一項に記載のプロテアーゼ又は請求項10に記載の宿主細胞若しくは該プロテアーゼを含むその抽出物又は請求項11に記載の組成物とを含有する、ポリエステル含有材料。
- 前記プロテアーゼが、前記ポリエステル含有材料の少なくとも1つのポリエステルを分解可能である、請求項15に記載のポリエステル含有材料。
- 請求項15又は16に記載のポリエステル含有材料を生産するためのプロセスであって、少なくとも1つのポリエステルと、請求項1~7のいずれか一項に記載のプロテアーゼ又は請求項10に記載の宿主細胞若しくは該プロテアーゼを含むその抽出物又は請求項11に記載の組成物とを、該ポリエステルが部分的又は完全に融解状態である温度で、好ましくは押出により、混合する、プロセス。
- ポリエステル含有材料を分解するための、好ましくはポリ乳酸含有材料を分解するための、請求項1~7のいずれか一項に記載のプロテアーゼ又は請求項10に記載の宿主細胞又は請求項11に記載の組成物の使用。
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014122698A1 (ja) | 2013-02-08 | 2014-08-14 | 国立大学法人福島大学 | プロテアーゼ、プロテアーゼ含有洗浄剤及びその製造方法 |
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Family Cites Families (16)
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BRPI0922586A2 (pt) * | 2008-12-18 | 2016-07-26 | Unilever Nv | composição detergente para lavagem de tecidos, processo para a lavagem de tecidos, e, processo para a fabricação da referida composição |
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