CN106852154A - 具有聚酯降解活性的多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含与如SEQ ID N°1所示的全长氨基酸序列具有至少94％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列并且具有聚酯降解活性的新的分离的多肽及其用途。

Description

具有聚酯降解活性的多肽及其用途
发明领域
本发明涉及一种具有酶活性的新型多肽及其用途。本发明也涉及产生所述多肽的方法、编码核酸分子、重组细胞的方法和使用所述多肽降解含聚酯材料的方法。本发明的多肽特别适合于降解聚乳酸和如同塑性材料的含有聚乳酸的材料。
发明背景
聚酯特别是以塑性材料形式用于从食品包装至医学领域、服装、汽车工业等的大量技术领域中。作为一实例，某些聚酯(例如聚对苯二甲酸乙二酯–PET、聚乳酸–PLA等)用于制造衣服和包装，而且也以热固性树脂形式用于制造汽车或其它零件。
因此，历经过去数十年，含聚酯塑料的产量已显著增加。这些塑料中超过50％用于单次使用抛弃式应用，诸如包装、农用薄膜、抛弃式消费品或用于在制造后1年内被丢弃的短期产品。遗憾的是，视局部环境因素如紫外光暴露水平、温度、适合微生物的存在等而定，塑料可存留数十年。因此，在世界范围内，大量塑料堆积在填埋场所中和天然栖息地中，从而产生递增的环境问题。
用以降低与塑料的积累相关的环境和经济影响的一种解决方案是再循环，其中以机械方式再加工塑性材料以制造新产品。然而，实际再循环方法使用大量电力，特别是在挤出步骤期间，并且所用设备也是昂贵的，从而导致相较于原始塑料可为不具竞争性的高昂价格。
用于再循环塑料的另一潜在方法由允许回收聚合物的化学组分的化学再循环组成。所得单体可接着用于再制造塑料或制备其它合成化学品。然而，迄今为止，所述再循环方法仅已对纯化聚合物执行，并且对由结晶和非晶聚合物和添加剂的混合物构成的原有塑料制品并不高效。此外，所述再循环方法是昂贵的，从而导致单体相较于原始单体不具竞争性。
在另一方面，酶促降解被视为一种理想废物处理方法，因为酶可加速塑料的水解，并且可被并入有机材料的自然循环中。此外，水解物(即单体和寡聚物)可作为聚合物的材料再循环。因此，通过酶来使塑料制品中含有的聚合物解聚作为现有以及不令人满意的方法的替代方案而受到极大关注。
然而，这个途径迄今为止未导致降解含聚酯材料的有效以及工业酶促方法的落实。
实际上，已知许多细菌能够降解聚酯。举例来说，关于聚乳酸，有对源于放线菌(Actinomycetes)诸如拟无枝菌酸菌属种(Amycolatopsis sp.)(菌株K104-1)以及源于溶淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)(菌株TB-13)的降解酶的报道。然而，迄今为止，所鉴定的多肽具有不良降解能力，并且仅允许降解呈乳液形式的聚合物。存在有限数目的关于能够降解呈薄膜或丸粒形式的含聚酯材料的微生物的报道，并且此外，它们的酶是不充分了解的。
鉴于先前所述，对在降解聚酯方面，并且更特别是在降解塑料制品中含有的聚酯方面具有活性的新型酶存在需要。
发明概述
由申请人进行的研究已导致鉴定出一种源于马杜拉放线菌属种(Actinomadurasp.)，并且具有聚酯降解活性的新型多肽。这个多肽在本领域中从未被报道或分离，并且给开发降解含聚酯材料的工业方法带来实质性改进。
本发明尤其基于对具有降解聚酯的卓越性质的这个新型多肽的鉴定。本发明涉及一种用以在工业规模上获得对塑料制品中含有的聚酯的降解的解决方案，所述塑料制品的降解产物(单体和寡聚物)可被再次用于经济地以及可靠地产生新聚酯。
因此，本发明涉及具有酶活性的新型多肽、它们的制造和用途。本发明也涉及编码这些多肽的核酸、载体、表达这些多肽的重组细胞和它们的用途。本发明进一步涉及包含至少一种本发明的多肽的组合物和用于从含聚酯材料诸如由聚酯制得的塑料制品产生目标寡聚物和/或单体的方法。本发明也涉及含有这些多肽和/或表达这些多肽的重组细胞中的至少一种的可生物降解的塑料化合物或塑料物品。
因此，本发明的一目标涉及一种分离的多肽，其包含与如SEQ ID N°1所示的全长氨基酸序列具有至少94％、95％、99％或100％，优选至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有聚酯降解活性。
在一特定实施方式中，多肽的氨基酸残基序列由于在一个或多个位置处的氨基酸残基的氨基酸残基取代而不同于SEQ ID N°1。在一优选实施方式中，氨基酸残基取代在氨基酸残基序列中引入半胱氨酸或额外盐桥，并且由此相较于天然多肽(即具有如SEQ ID N°1所示的氨基酸残基序列的多肽)的热稳定性，使多肽的热稳定性增加。
本发明的另一目标在于提供一种包含如SEQ ID N°1或SEQ ID N°5所示的氨基酸序列的多肽。
在一特定实施方式中，多肽包含一个或若干个糖基化氨基酸残基。
本发明的另一目标是一种编码如上定义的多肽的核酸。本发明也涉及一种包含如上定义的核酸的表达盒和一种包含如上定义的核酸或表达盒的载体。
本发明也涉及一种含有至少一个如上定义的核酸或表达盒或载体的重组细胞或宿主细胞，优选是重组微生物，并且涉及其优选展现酶活性的提取物。
本发明的另一目标在于提供一种产生本发明的多肽的方法，其包括(i)培养如上定义的重组细胞，(ii)回收培养上清液，以及任选地(iii)分离或纯化多肽。
本发明也公开一种包含如上定义的多肽或表达所述多肽的重组细胞或其提取物的组合物。
本发明进一步涉及如上定义的多肽、相应核酸、表达盒、载体、重组细胞、重组细胞提取物或组合物用于酶促降解含聚酯材料，优选是含PLA材料，甚至更优选是含PLLA材料的用途。
本发明的另一目标在于提供一种用于降解含聚酯材料的方法，其中使含聚酯材料与如上定义的多肽、相应核酸、表达盒、载体、重组细胞或重组细胞提取物或组合物接触。方法有利地进一步包括收集所得单体和/或寡聚物的步骤。
本发明也涉及一种用于从含聚酯材料产生单体和/或寡聚物的方法，其包括使含聚酯材料暴露于如上定义的多肽、相应核酸、表达盒、载体、重组细胞或重组细胞提取物或组合物，以及任选地回收单体和/或寡聚物。
本发明的另一目标在于提供一种包含如上定义的多肽和/或表达所述多肽的重组细胞的含聚酯材料。
本发明也提供一种用于产生所述含聚酯材料的方法，其包括混合聚酯和如上定义的多肽和/或表达所述多肽的重组细胞的步骤，其中所述混合步骤在所述聚酯处于部分或完全熔融状态所处的温度下，优选在挤出过程期间进行。
本发明进一步涉及包含与如SEQ ID N°1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、92％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有用于降解含聚酯材料的聚酯降解活性的多肽的用途。
附图说明
图1.由阴离子型纯化获得的pH 10流穿物的SDS-Page凝胶的照片，其显示本发明的多肽的分子量是27kDa；
图2.本发明的多肽的氨基酸序列(SEQ ID N°1)，其中突出显示最重要的残基；
图3：显示聚酯酶催化NaturePlast PLLA粉末(33g/L)水解和乳酸产生随PLLA粒度而变化的图；
图4：显示聚酯酶催化7001D PLA粉末(33g/L)水解和乳酸产生随PLA粒度而变化的图；
图5：显示聚酯酶催化PLA薄膜(17g/L)水解和乳酸产生的图；
图6：显示聚酯酶催化PLA商业物件(PLA杯子、盘子、薄膜和餐具)(33g/L)水解和乳酸产生的图。
图7：显示PLA在包含CaCO3和Ca(OH)2的培养基中水解的图。
图8：显示在28℃、37℃和45℃下在pH 9,5的Tris缓冲液中，含有96％PLA和4％的本发明的多肽的含PLA材料的水解以及含有100％PLA的对照水解的图。
发明详述
本发明大体上涉及一种包含如SEQ ID N°1所示的氨基酸序列的至少生物活性部分的分离的多肽，其能够使聚酯，更优选是聚乳酸解聚。优选在20℃至90℃，以及至少20℃至60℃的温度范围内具有活性的这个多肽可用于降解聚酯塑性材料。这个多肽或它的编码核酸序列也可用于产生可用于导致含聚酯材料降解的重组微生物。所述重组微生物可进一步展现天然或重组聚合物合成活性，以致所述微生物能够再次使用由聚酯降解产生的单体和/或寡聚物。
以下是对本发明的描述，包括其以一般性方式给出的优选实施方式。本发明以在下文标题“实施例”下给出的公开内容进一步例示，所述公开内容提供支持本发明的实验数据和执行本发明的手段。
定义
本公开将通过参照以下定义而得以最充分了解。
术语“分离的”或“分离”意指物质被从它的原始环境(例如天然环境)移除。举例来说，分离的多肽通常缺少细胞的它通常与其相伴或它通常与其一起掺混或溶解的至少一些多肽或其它组分。分离的多肽包括呈纯化或部分纯化形式的所述天然产生的多肽、重组多肽、由宿主细胞表达或分泌的多肽、以及宿主细胞或其培养物或提取物中的多肽。在一优选方面，多肽是至少10％纯的，优选至少50％纯的，更优选至少60％、70％、80％、90％纯的，如通过SDS-PAGE所测定。纯度小于100％在本文中表示多肽制剂含有它天然地或重组地与其相伴的其它多肽物质。关于核酸，术语分离的或纯化的指示例如所述核酸不处于它的天然基因组情形下(例如在载体、表达盒中，连接于启动子，或人工引入异源性宿主细胞中)。
术语“修饰”在本文中意指对由SEQ ID N°1或其同源性序列组成的多肽的任何化学修饰以及对编码这种多肽的DNA的遗传操作。修饰可为一个或若干个氨基酸的取代、缺失和/或插入。因此，术语“突变体”和“变体”可互换用于指代由SEQ ID N°1组成的在确定残基处具有鉴定的氨基酸取代、缺失和/或插入的多肽。
术语“糖基化”意指物质包含一个或若干个连接于多肽的氨基酸残基的聚糖。在本发明的情形下，糖基化涵盖连接于天冬酰胺残基的酰胺氮的N连接的聚糖、连接于丝氨酸或酪氨酸残基的羟基氧的O连接的聚糖、连接于色氨酸残基的碳的C连接的聚糖。
术语“重组体”是指通过遗传工程改造产生的核酸构建体、载体、多肽或细胞。
如本文所用，术语“序列同一性”或“同一性”是指由比对两个多肽序列获得的在各位置中的匹配物(同一氨基酸残基)的数目(％)。序列同一性通过在对准以便使重叠和同一性最大，同时使序列空位数最少时比较序列来确定。特定来说，视两个序列的长度而定，序列同一性可使用许多数学整体或局部比对算法中的任一种来确定。长度类似的序列优选使用历经整个长度来将序列最优比对的整体比对算法(例如Needleman和Wunsch算法；Needleman和Wunsch,1970)来比对，而长度实质上不同的序列优选使用局部比对算法(例如Smith和Waterman算法(Smith和Waterman,1981)或Altschul算法(Altschul等,1997；Altschul等,2005))来比对。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以属于本领域中的技能的各种方式实现，例如使用可在因特网网站诸如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)上获得的可公开获得的计算机软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括为历经所比较序列的全长实现最大对准所需的任何算法。出于本文目的，氨基酸序列同一性％数值是指使用成对序列比对程序EMBOSS Needle产生的数值，所述程序使用Needleman-Wunsch算法产生两个序列的最优整体比对，其中所有搜索参数都设为缺省值，即评分矩阵＝BLOSUM62，空位开放＝10，空位延伸＝0.5，末端空位罚分＝false，末端空位开放＝10，并且末端空位延伸＝0.5。
如本文所用的术语“表达”是指多肽的产生中涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
在本文中，术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”和“酶”可互换采用，并且是指由肽键连接的氨基酸的链，而与形成所述链的氨基酸的数目无关。氨基酸在本文中由它们的根据以下命名法的单字母或三字母代码表示：A：丙氨酸(Ala)；C：半胱氨酸(Cys)；D：天冬氨酸(Asp)；E：谷氨酸(Glu)；F：苯丙氨酸(Phe)；G：甘氨酸(Gly)；H：组氨酸(His)；I：异亮氨酸(Ile)；K：赖氨酸(Lys)；L：亮氨酸(Leu)；M：甲硫氨酸(Met)；N：天冬酰胺(Asn)；P：脯氨酸(Pro)；Q：谷氨酰胺(Gln)；R：精氨酸(Arg)；S：丝氨酸(Ser)；T：苏氨酸(Thr)；V：缬氨酸(Val)；W：色氨酸(Trp)和Y：酪氨酸(Tyr)。
在本发明的情形下，“含聚酯材料”是指包含至少一种呈结晶、半结晶或完全非晶形式的聚酯的制品，诸如塑料制品。在一特定实施方式中，含聚酯材料是指由至少一种塑性材料制得的任何物品，诸如塑料薄片、管子、棒条、型材、模型、薄膜、大块等，所述物品含有至少一种聚酯以及可能其它物质或添加剂诸如塑化剂、无机或有机填料。在一特定实施方式中，含聚酯材料含有聚酯和至少一种附加的聚合物诸如聚烯烃，其相对于彼此以它们不能被易于分开的方式安置。优选地，含聚酯材料由结晶和非晶聚酯、和/或半结晶聚酯以及添加剂的混合物构成。更优选地，含聚酯材料是制造的塑料制品，如包装、农用薄膜、抛弃式物品等。在另一特定实施方式中，含聚酯材料是指处于熔融或固体状态，适于制备塑料制品的塑料化合物或塑料制剂。在本发明的情形下，塑料化合物涵盖至少一种聚酯和至少一种本发明的多肽和/或表达所述多肽的重组细胞的均质掺合物，其中所述多肽和/或重组细胞能够降解所述聚酯。优选地，塑料化合物由半结晶和/或非晶聚合物、或半结晶聚合物以及添加剂的混合物构成。
在本描述中，“聚酯”涵盖聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)、聚对苯二甲酸乙二酯共对苯二甲酸异山梨醇酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(D-乳酸)(PDLA)、聚(D,L-乳酸)(PDLLA)、PLA立体复合物(scPLA)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚(3-羟基丁酸酯)(P(3HB)/PHB)、聚(3-羟基戊酸酯)(P(3HV)/PHV)、聚(3-羟基己酸酯)(P(3HHx))、聚(3-羟基辛酸酯)(P(3HO))、聚(3-羟基癸酸酯)(P(3HD))、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)(P(3HB-共-3HV)/PHBV)、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)(P(3HB-共-3HHx)/(PHBHHx))、聚(3-羟基丁酸酯-共-5-羟基戊酸酯)(PHB5HV)、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基丙酸酯)(PHB3HP)、聚羟基丁酸酯-共-羟基辛酸酯(PHBO)、聚羟基丁酸酯-共-羟基十八酸酯(PHBOd)、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯-共-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-共-3HV-共-4HB))、聚丁二酸丁二酯(PBS)、聚丁二酸丁二酯共己二酸丁二酯(PBSA)、聚己二酸丁二酯共对苯二甲酸丁二酯(PBAT)、聚呋喃酸乙二酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、聚(己二酸乙二酯)(PEA)以及这些聚合物的掺合物/混合物。
“聚合物”是指结构由多个由共价化学键连接的重复单元构成的化合物或化合物的混合物。在本发明的情形下，术语聚合物包括由单一类型的重复单元构成的天然或合成聚合物(即均聚物)或由不同重复单元的混合物构成的天然或合成聚合物(即共聚物)。
根据本发明，“寡聚物”是指含有2至约20个单体单元的分子。
新的分离的多肽
本发明涉及一种能够降解在它们的分子结构中具有酯键的塑料的新型多肽。更特定来说，本发明公开一种新近鉴定和分离的展现聚酯酶活性的多肽。所述多肽最初从角蛋白降解马杜拉放线菌(Actinomadura keratinilytica)T16-1或DSMZ 45195的天然细菌菌株分离。引起关注的是，本发明的多肽能够水解天然和人造聚酯中的酯键。
在第一方面，本发明涉及一种包含与以下提供的如SEQ ID N°1所示的全长氨基酸序列具有至少94％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有聚酯降解活性的分离的多肽。
有利的是，多肽包含与如SEQ ID N°1所示的全长氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
SEQ ID N°1：
ATQNNPPSWGLDRIDQTNLPLSRSYTYNSTGAGVNAYIIDTGIYTAHSDFGGRATNVYDALGGNGQDCNGHGTHVAGTVGGAAYGVAKAVNLRGVRVLNCSGSGTTSGVIAGMNWVASNHVKPAVANMSLGGGYSSSLNTAANNLASSGVFLAVAAGNETTNACNRSPASAANATTVAASTSTDARASYSNYGSCVHLYAPGSSITSAWLNGGTNTISGTSMATPHVAGTAALYKATYGDASFSTIRSWLVSNATSGVITGNVSGTPNLLLNKRSL
如本文所用，本发明的多肽也可被称为具有聚酯酶活性的多肽，或可互换地被称为聚酯酶。
本发明的一特定目标在于提供一种分离的多肽，其包含与如SEQ ID N°1所示的全长氨基酸序列具有至少94％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有聚乳酸降解活性，并且更优选是聚-(L-乳酸)降解活性。在一特定实施方式中，多肽包含与如SEQ IDN°1所示的全长氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一特定实施方式中，分离的多肽包含如SEQ ID N°1所示的氨基酸序列的所有或生物活性部分。更具体来说，多肽的“生物活性部分”指定那个多肽的赋予或展现整个多肽的聚酯酶活性的部分。活性部分可例如赋予底物特异性或亲和力，它可含有催化位点。多肽的活性部分也指定多肽的成熟形式(即其在多肽的N末端不含有信号肽)。在一实施方式中，生物活性部分包括如SEQ ID N°1所示的氨基酸序列的至少一部分，所述至少一部分包括形成多肽的催化位点的氨基酸His 71、Asp 40和Ser 221。或者，或此外，活性部分有利地包含氨基酸Ala 172、Ala 174和His 197和/或形成钙结合位点的氨基酸Asp 12、Asp 15和Gln16和/或形成二硫键的氨基酸Cys 68-Cys 100和Cys 164–Cys 195和/或形成聚酯结合位点的氨基酸。在一特定实施方式中，生物活性部分包含SEQ ID N°1的氨基酸12至221或由所述氨基酸构成。在另一实施方式中，生物活性部分包含SEQ ID N°1的氨基酸40至221或由所述氨基酸构成。
本发明的另一目标在于提供一种包含如SEQ ID N°1或SEQ ID N°5所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的多肽。本发明的另一目标在于提供一种包含SEQ ID N°5的对应于多肽的肽信号的氨基酸1至29或由所述氨基酸构成的肽。
SEQ ID N°5：
MRRRTLPIAVLAAVPLAVAGALPAGAAPAAPAVPVAMAAAGQGVAGQYIVTLKKGVSVDSTVAKRGIRTQHRFGKVLNGFSAKLTDDQLSKLRTTPGVASIEQDAVITVDATQNNPPSWGLDRIDQTNLPLSRSYTYNSTGAGVNAYIIDTGIYTAHSDFGGRATNVYDALGGNGQDCNGHGTHVAGTVGGAAYGVAKAVNLRGVRVLNCSGSGTTSGVIAGMNWVASNHVKPAVANMSLGGGYSSSLNTAANNLASSGVFLAVAAGNETTNACNRSPASAANATTVAASTSTDARASYSNYGSCVHLYAPGSSITSAWLNGGTNTISGTSMATPHVAGTAALYKATYGDASFSTIRSWLVSNATSGVITGNVSGTPNLLLNKRSL
本发明的另一目标在于提供如SEQ ID N°1所示的多肽的变体，其包含SEQ ID N°1的多肽的一个或若干个氨基酸残基的取代、缺失和/或插入，具有聚酯降解活性。
在一特定实施方式中，相较于天然多肽，变体展现更大热稳定性。举例来说，通过氨基酸残基的取代和/或插入，从而相较于天然氨基酸序列在氨基酸序列中产生附加的半胱氨酸残基来引入二硫键。或者或此外，可在多肽的氨基酸序列中引入额外盐桥。
在一特定实施方式中，相对于SEQ ID N°1，变体包含一个或若干个选自T175C、R247C、N139D、S170R、N143R、N173E、S194P、H197D、L210P、G212N、I217K、R166K、T160A、L138A或其组合的取代，并且具有聚酯降解活性，优选是PLA降解活性。
在一特定实施方式中，变体包含具有取代T175C和R247C的氨基酸序列SEQ ID N°1或由所述氨基酸序列组成，并且具有聚酯降解活性，优选是PLA降解活性。
在另一特定实施方式中，变体包含具有取代N139D和S170R的氨基酸序列SEQ IDN°1或由所述氨基酸序列组成，并且具有聚酯降解活性，优选是PLA降解活性。
在另一特定实施方式中，变体包含具有取代N143R和N173E的氨基酸序列SEQ IDN°1或由所述氨基酸序列组成，并且具有聚酯降解活性，优选是PLA降解活性。
在一特定实施方式中，变体包含具有取代T175C、R247C、N139D、S170R、N143R、N173E、S194P、H197D、L210P、G212N、I217K、R166K、T160A和L138A的氨基酸序列SEQ ID N°1或由所述氨基酸序列组成，并且具有聚酯降解活性，优选是PLA降解活性。
在一特定实施方式中，相较于如SEQ ID N°1所示的氨基酸序列，变体包含至多14个氨基酸残基取代，并且具有聚酯降解活性，优选是PLA降解活性。在另一实施方式中，相较于如SEQ ID N°1所示的氨基酸序列，变体包含至多17个氨基酸残基取代。
有利的是，变体比SEQ ID N°1的天然多肽具有更好聚酯降解活性。更优选地，变异多肽比SEQ ID N°1的天然多肽在高温下具有更大稳定性。
在另一实施方式中，多肽包含一个或若干个糖基化。举例来说，多肽包含如SEQ IDN°1所示的氨基酸序列，其中至少一个氨基酸残基被糖基化。有利的是，所述糖基化多肽相较于天然多肽(SEQ ID N°1的未糖基化多肽)显示更大稳定性，具体来说更大热稳定性。举例来说，氨基酸序列SEQ ID N°1的至少一个天冬酰胺残基被糖基化，并且寡糖连接在所述天冬酰胺残基的酰胺氮处。更特定来说，SEQ ID N°1包含一种选自以下的氨基酸残基的至少一个糖基化：N28、N99、N127、N158、N165、N173、N253、N262或其组合。在一优选实施方式中，SEQ ID N°1包含一种选自以下的氨基酸残基的至少一个糖基化：N28、N158、N165。
本发明的多肽在20℃至90℃，优选20℃至60℃，更优选30℃至55℃，甚至更优选40℃至50℃的温度范围内，甚至更优选在45℃下特别具有活性。在一特定实施方式中，多肽在60℃与90℃之间的温度下，优选在80℃下仍然具有活性。
类似地，本发明的多肽在5至11的pH范围内，优选在7至10的pH范围内，更优选在8.5至9.5的pH范围内，甚至更优选在8至9的pH范围内特别具有活性。
本发明的分离的多肽有利地具有至少0.02g.mg-1.h-1、0.05g.mg-1.h-1、0.1g.mg- 1.h-1、0.15g.mg-1.h-1、0.2g.mg-1.h-1、0.5g.mg-1.h-1、1g.mg-1.h-1、1.5g.mg-1.h-1或2g.mg-1.h-1的生产力。就“生产力”来说，其意指在包括在8与9之间的pH下以及在45℃+/-5℃的温度下，每单位多肽以及每单位时间形成的降解产物(即单体)的量。
本发明的多肽特别适用于降解聚乳酸(PLA)，并且更特别是聚(L-乳酸)(PLLA)。
在一特定实施方式中，本发明的多肽具有对映特异性。这意指多肽能够作用于聚酯中的L-对映异构体，而对D-对映异构体无效，或相反。
本发明的多肽可通过重组技术来产生，或它可从天然来源(即微生物并且更特别是细菌、酵母或真菌)分离或纯化，或它可人工产生。在本发明的情形下，与多肽相关的术语“源于微生物”指示多肽已从这种微生物分离，或多肽包含从这种微生物分离或表征的多肽的氨基酸序列的所有或生物活性部分。更特定来说，本发明的多肽可由重组芽孢杆菌(Bacillus)、重组大肠杆菌(E.Coli)或重组解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)产生。
本发明的多肽可通过本领域中本身已知的技术诸如色谱法(例如离子交换、亲和、尺寸排阻、反相等)和沉淀(例如盐析、等电点、有机溶剂、非离子型亲水性聚合物等)来纯化，并且借助常规技术储存。多肽可进一步被修饰以改进例如它的稳定性或活性。它可按原样，以纯化形式，单独或与附加的酶组合用于催化含聚酯材料的降解和/或再循环中涉及的酶促反应。多肽可呈溶解形式，或处于固相上。特定来说，它可结合于细胞膜或脂质囊泡，或结合于例如呈珠粒、管柱、板等形式的合成载体诸如玻璃、塑料、聚合物、过滤器、膜。
本发明的另一目标在于提供一种包含本发明的分离的多肽和/或相应核酸、表达盒、载体、重组细胞或重组细胞提取物，以及任选地，添加剂、赋形剂等的组合物。在本发明的情形下，术语“组合物”涵盖所有种类的包含呈分离或至少部分纯化形式的本发明的多肽的组合物。组合物可为液体或干燥的，例如呈粉末形式。在一些实施方式中，组合物是冻干物。举例来说，组合物可包含本发明的多肽和/或编码多肽的重组细胞或其提取物，以及任选地，赋形剂和/或试剂等。适当赋形剂涵盖通常用于生物化学中的缓冲剂；用于调整pH的试剂；防腐剂(preservative)诸如苯甲酸钠、山梨酸钠或抗坏血酸钠；保存剂(conservative)；保护剂或稳定剂诸如淀粉、糊精、阿拉伯树胶、盐、糖例如山梨糖醇、海藻糖或乳糖、甘油、聚乙二醇、聚乙烯二醇、聚丙二醇、丙二醇；螯合剂诸如EDTA；氨基酸；载体诸如溶剂或水溶液；等。本发明的组合物可通过混合多肽与一种或若干种赋形剂来获得。
本发明的组合物可包含以重量计，0.1％至90％，优选0.1％至50％，更优选0.1％至30％，甚至更优选0.1％至5％的本发明的多肽，以及以重量计，10％至99.9％，优选50％至99.9％，更优选30％至99.9％，甚至更优选95％至99.9％的赋形剂。一优选组合物包含以重量计，0.1与5％之间的本发明的多肽。
在一特定实施方式中，组合物可进一步包含展现酶活性的附加的多肽。本发明的多肽的量将易于由本领域技术人员视例如待降解的含聚酯材料的性质和/或组合物中含有的附加的酶/多肽而改适。
在一特定实施方式中，将本发明的分离的多肽连同一种或若干种赋形剂，尤其是能够稳定或保护多肽免遭降解的赋形剂一起溶解于水性介质中。举例来说，可将本发明的多肽溶解于水中，最终与附加的组分诸如甘油、山梨糖醇、糊精、淀粉、二醇诸如丙二醇、盐等在一起。可接着干燥所得混合物以便获得粉末。用于干燥所述混合物的方法为本领域技术人员所熟知，并且包括不限于冻干、冷冻干燥、喷雾干燥、超临界干燥、下向通风蒸发、薄层蒸发、离心蒸发、传送带干燥、流化床干燥、转鼓干燥或其任何组合。
在另一特定实施方式中，本发明的组合物包含至少一种表达本发明的多肽的重组细胞或其提取物。“细胞的提取物”指定从细胞获得的基本上不含活细胞的任何部分，诸如细胞上清液、细胞碎片、细胞壁、DNA提取物、酶或酶制剂或通过化学、物理和/或酶促处理来由细胞获得的任何制剂。优选提取物是酶活性提取物。本发明的组合物可包含一种或若干种本发明的重组细胞或其提取物，以及任选地，一种或若干种附加的细胞。
在一特定实施方式中，组合物由表达和分泌本发明的多肽的重组微生物的冻干培养基组成或包含所述冻干培养基。在一特定实施方式中，粉末包含本发明的多肽和稳定量/增溶量的甘油、山梨糖醇或糊精诸如麦芽糖糊精和/或环糊精、淀粉、二醇诸如丙二醇、和/或盐。
在另一实施方式中，将本发明的多肽固定在固体载体上。多肽可通过在现有技术下描述的任何适当方法来固定，例如共价结合、吸附、包埋或膜限制。广泛多种载体可用于固定本发明的多肽。待选择的载体取决于它所致力的用途。适宜载体涵盖而不限于塑料、金属、无机载体，诸如玻璃、二氧化硅、氧化铝、膨润土、羟磷灰石、镍/氧化镍、钛、氧化锆、聚合载体等。载体可呈表面、粉末、微米或纳米珠粒、凝胶、溶剂溶胀或水溶胀凝胶或基质、网状基质或凝胶、膜、纤维载体、多孔载体等的形式。用于固定多肽的方法为熟练技术人员所熟知(参见例如Tischer和Wedekind,Topics in Current Chemistry,1999,200,95-126以及Alloue等,Biotechnol Agron Soc Environ 2008,12,57-68；其公开内容以引用的方式并入本文)。
一旦制备，本发明的载体即可直接用于反应介质中。换句话说，本发明的载体可仅添加在反应介质中。当载体具有溶剂溶胀性时，可选择反应的溶剂以便提供适当载体溶胀来致使可到达所固定多肽，而不损害多肽的催化活性。作为一种替代方案，载体可用于制备反应器，其可为例如酶反应器、膜反应器、连续流反应器诸如搅拌槽反应器、连续操作的填充床反应器、或连续操作的流化床反应器、或填充床反应器。在一些实施方式中，本发明的载体是可再循环的，并且可连续使用数次。
核酸
本发明的另一目标是一种编码如上定义的多肽的核酸。
如本文所用，术语“核酸”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核苷酸序列”可互换使用，并且是指脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的序列。核酸可为DNA(cDNA或gDNA)、RNA、或两者的混合物。它可呈单链形式或呈双链体形式，或是两者的混合物。它可具有重组、人工和/或合成来源，并且它可包含修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸包含例如修饰的键、修饰的嘌呤或嘧啶碱基、或修饰的糖。
本发明的核酸可呈分离或纯化形式，并且通过本领域中本身已知的技术来制备、分离和/或操作，例如克隆和表达cDNA文库、扩增、酶促合成或重组技术。核酸也可通过如例如Belousov(1997)Nucleic Acids Res.25:3440-3444中所述的熟知化学合成技术来在体外合成。
本发明也涵盖在严格条件下杂交于编码如上定义的多肽的核酸的核酸。优选地，所述严格条件包括在2X SSC/0.1％SDS中在约42℃下孵育杂交滤膜约2.5小时，随后在1XSSC/0.1％SDS中在65℃下洗涤滤膜4次，每次15分钟。所用方案描述于诸如Sambrook等(Molecular Cloning:a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor N.Y.(1988))和Ausubel(Current Protocols in Molecular Biology(1989))的参考书目中。
本发明也涵盖编码本发明的多肽的核酸，其中所述核酸的序列或所述序列的至少一部分已使用优化密码子用法进行工程改造。
本发明的一特定实施方式在于一种编码如上定义的多肽的分离的核酸，其包含如下公开的如SEQ ID N°2所示的序列。
SEQ ID N°2：
5’gccacgcagaacaacccgccgtcgtggggcctggaccgcatcgaccagacgaacctgccgctgtcgcgcagctacacctacaattccaccggcgcgggcgtgaacgcctacatcatcgacaccggcatctacaccgcgcactccgacttcggcggccgcgccaccaacgtctacgacgccctcggcggcaacggccaggactgcaacggccacggcacccacgtcgcgggcaccgtcggcggcgccgcctacggcgtggccaaggcggtcaacctgcgcggcgtgcgcgtgctcaactgcagcggcagcggcaccacctccggtgtcatcgccggcatgaactgggtggccagcaaccacgtcaagcccgccgtggcgaacatgtcgctgggcggcggctactcctcctccctgaacacggccgccaacaacctggccagctccggcgtgttcctggccgtcgccgcgggcaacgagaccaccaacgcctgcaaccgctcgccggccagcgccgccaacgccaccacggtcgccgcgagcaccagcaccgacgcccgggcctcctacagcaactacggctcgtgcgtccacctgtacgcgcccggctcgtccatcacctccgcctggctgaacggcggcaccaacaccatcagcggcacgtcgatggccacgccgcacgtggccgggaccgccgccctctacaaggcgacctacggcgacgcctcgttcagcaccatccgcagctggctggtcagcaacgccacctccggcgtcatcaccggcaacgtgtcgggcaccccgaacctgctgctgaacaagcgctccctg 3’
或者，本发明的核酸可由本发明的多肽的序列推导，并且可根据核酸将在其中转录的宿主细胞改适密码子用法。这些步骤可根据为本领域技术人员所熟知的方法进行，并且所述方法中的一些描述于参考手册Sambrook等(Sambrook等,2001)中。
本发明的核酸可进一步包含可用于导致或调控多肽在所选宿主细胞或系统中表达的附加的核苷酸序列，诸如调控区，即启动子、增强子、沉默子、终止子、信号肽等。
本发明进一步涉及一种表达盒，其包含本发明的核酸可操作地连接于一种或多种指导所述核酸在适合宿主细胞中表达的控制序列。通常，表达盒包含本发明的核酸可操作地连接于转录启动子和转录终止子，或由本发明的核酸可操作地连接于转录启动子和转录终止子组成。
本发明也涉及一种包含如上定义的核酸或表达盒的载体。
术语“载体”是指用作将重组遗传物质转移至宿主细胞中的运载体的DNA分子。主要类型的载体是质粒、噬菌体、病毒、粘粒和人工染色体。载体自身通常是由插入物(异源性核酸序列、转基因)和充当载体的“骨架”的较大序列组成的DNA序列。将遗传信息转移至宿主中的载体的目的通常在于在靶标细胞中分离、繁殖或表达插入物。称为表达载体(表达构建体)的载体具体来说适合于在靶标细胞中表达异源性序列，并且通常具有驱动编码多肽的异源性序列的表达的启动子序列。通常，存在于表达载体中的调控元件包括转录启动子、核糖体结合位点、终止子以及任选存在的操纵子。优选地，表达载体也含有用于在宿主细胞中自主复制的复制起点、可选择标记、有限数目的适用限制性酶切位点以及高拷贝数潜力。表达载体的实例是克隆载体、修饰的克隆载体、特异性设计的质粒和病毒。在不同宿主中提供适合多肽表达水平的表达载体在本领域中是熟知的。本领域中熟知的细菌表达载体包括pET11a(Novagen)、λgt11(Invitrogen)。
本发明进一步涉及本发明的核酸、表达盒或载体用于转化、转染或转导宿主细胞的用途。对载体的选择将通常取决于载体与将向其中引入载体的宿主细胞的相容性。
本发明也涉及一种包含本发明的核酸、盒或载体的宿主细胞或重组细胞。宿主细胞可以以短暂或稳定方式加以转化、转染或转导。将本发明的表达盒或载体引入宿主细胞中以使盒或载体作为染色体组成部分或作为自我复制性染色体外载体加以维持。可使用标准技术将表达盒或载体引入宿主细胞中。所述技术的实例包括转化、转染、脂质体转染、原生质体融合和电穿孔。
宿主细胞可为可被遗传修饰，并且优选被培养的任何细胞。细胞可为真核的或原核的，诸如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、微生物诸如酵母、真菌或细菌细胞等。在一特定实施方式中，宿主细胞选自大肠杆菌(Escherischia Coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、乳酸菌(Lactic acid bacteria)、链霉菌(Streptomyces)、木霉(Trichoderma)、曲霉(Aspergillus)、毕赤酵母(Pichia)或耶罗威亚酵母(Yarrowia)。应了解本发明关于任何特定细胞类型不受限制，并且可遵循公知常识应用于所有种类的细胞。术语“宿主细胞”也涵盖亲本宿主细胞的由于在复制期间发生的突变而不与所述亲本宿主细胞相同的任何子代。
在一特定实施方式中，宿主细胞是酵母，优选是耶罗威亚酵母，并且产生的多肽是显示较大热稳定性的糖基化多肽。在一优选实施方式中，多肽由包含一种选自N28、N158或N165的氨基酸残基的至少一个糖基化的SEQ ID N°1组成。
在一特定实施方式中，本发明提供一种被工程改造以表达如SEQ ID N°2所示的核酸或其表达盒的宿主细胞。
在一特定实施方式中，本发明提供一种被工程改造以表达如SEQ ID N°2所示的核酸或其表达盒的重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
在另一特定实施方式中，本发明提供一种被工程改造以表达如SEQ ID N°2所示的核酸或其表达盒的重组大肠杆菌。
在另一特定实施方式中，本发明提供一种被工程改造以表达如SEQ ID N°2所示的核酸或其表达盒的重组解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)。
在另一实施方式中，本发明提供一种包含和表达编码多肽的核苷酸序列的宿主细胞，所述多肽包含与如SEQ ID N°1所示的全长氨基酸序列具有至少94％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有聚酯降解活性。
在另一实施方式中，本发明提供一种包含和表达编码多肽的核苷酸序列的宿主细胞，所述多肽包含与如SEQ ID N°1所示的全长氨基酸序列具有至少94％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有PLA降解活性，更优选是PLLA降解活性。
在一特定实施方式中，宿主细胞是重组微生物。本发明实际上允许对具有改进的用以降解含聚酯材料的能力的微生物的工程改造。举例来说，本发明的序列可用于对真菌或细菌的已称为能够降解聚酯的野生型菌株进行补充，以改进和/或增加菌株能力。
在一特定实施方式中，本发明提供一种包含和表达编码多肽的核苷酸序列的重组枯草芽孢杆菌，所述多肽包含与如SEQ ID N°1所示的全长氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有聚酯降解活性，优选是PLA降解活性，更优选是PLLA降解活性。
在另一特定实施方式中，本发明提供一种包含和表达编码多肽的核苷酸序列的重组大肠杆菌，所述多肽包含与如SEQ ID N°1所示的全长氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有聚酯降解活性，优选是PLA降解活性，更优选是PLLA降解活性。
在另一特定实施方式中，本发明提供一种包含和表达编码多肽的核苷酸序列的重组解脂耶罗威亚酵母，所述多肽包含与如SEQ ID N°1所示的全长氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有聚酯降解活性，优选是PLA降解活性，更优选是PLLA降解活性。有利的是，多肽的一个或若干个氨基酸残基被糖基化。更优选地，多肽由包含一种选自N28、N158或N165，优选至少N158的氨基酸残基的至少一个糖基化的SEQ ID N°1组成。
本发明的另一目标在于提供一种产生本发明的多肽的方法，其包括(i)培养如上定义的重组细胞，(ii)回收培养上清液，以及任选地(iii)分离或纯化所述多肽。本发明进一步涉及通过这个产生方法获得的所述多肽。
或者，本发明的多肽可通过无细胞方法产生(Kim等JBiosci.Bioeng.July 2009；Spirin等(2007)Front Matter in Cell-Free Protein Synthesis:Methods andProtocols)，或可被化学合成。
降解含聚酯材料
本发明提供使用本发明的多肽来在好氧或厌氧条件下降解和/或再循环含聚酯材料的方法，所述含聚酯材料如同由聚酯制得或含有聚酯的塑料制品。实际上，由于本发明的多肽的高聚酯解聚效率，所以它相较于其它已知化学或微生物聚酯降解手段更加有利。本发明的多肽具有增加的解聚速率，特别是对于PLA解聚来说。
因此，本发明的一目标在于使用本发明的多肽或相应重组细胞或其提取物或组合物来酶促降解含聚酯材料。在一优选实施方式中，多肽或相应重组细胞、其提取物或组合物用于酶促降解含PLA材料，并且更优选用于酶促降解含PLLA材料。
本发明的另一目标在于使用包含与如SEQ ID N°1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有聚酯降解活性的多肽来降解含聚酯材料。
本发明的另一目标在于提供一种用于降解含聚酯材料的方法，其中使含聚酯材料与本发明的多肽或相应重组细胞或其提取物或组合物接触。有利的是，含聚酯材料的聚酯被解聚直至成为单体和/或寡聚物。在一特定实施方式中，所有目标聚酯都被解聚直至成为形成材料的原始聚酯的单体。
在降解方法的一实施方式中，至少一种聚酯被降解以产生可再聚合单体和/或寡聚物，其有利地被回收以再次使用。
在另一实施方式中，含聚酯材料的聚酯被完全降解。
在一优选实施方式中，含聚酯材料包含PLA，更优选是PLLA，并且至少乳酸单体和/或寡聚物被回收以例如进行再循环或甲烷化(methanisation)。
在另一实施方式中，含聚酯材料包含PLA和至少一种优选选自以下的附加的聚酯：聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚己二酸丁二酯共对苯二甲酸丁二酯(PBAT)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚丁二酸丁二酯(PBS)、聚己内酯(PCL)、聚(己二酸乙二酯)(PEA)以及这些聚酯的掺合物/混合物。
或者或此外，含聚酯材料可进一步含有至少一种聚酰胺(也称为尼龙)和/或至少一种优选选自聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)以及这些聚合物的掺合物/混合物的聚烯烃、和/或至少一种由乙烯基单体即含有碳-碳双键的小分子制得的乙烯基聚合物。
或者或此外，含聚酯材料可进一步含有至少一种优选选自淀粉、面粉、纤维素及其掺合物/混合物的天然聚合物(即非石化衍生)。
在一特定实施方式中，含聚酯材料包含聚羟基链烷酸酯(PHA)和/或聚对苯二甲酸乙二酯(PET)和/或聚己二酸丁二酯共对苯二甲酸丁二酯(PBAT)或这些聚酯的掺合物/混合物。
根据本发明，含聚酯材料也可含有金属化合物、无机化合物、玻璃化合物、天然或合成纤维、纸、木材、木材化合物如同木质素、纤维素或半纤维素、淀粉及其衍生物。
本发明也涉及一种从含聚酯材料产生单体和/或寡聚物的方法，其包括使含聚酯材料暴露于本发明的多肽或相应重组细胞或其提取物或组合物，以及任选地回收单体和/或寡聚物。本发明方法特别适用于产生乳酸单体。
当使用重组微生物时，所述微生物有利地展现修饰的代谢以防止从降解的聚酯获得的单体和/或寡聚物被消耗。举例来说，微生物中降解所述单体和/或寡聚物的酶已被缺失或剔除。或者，可在含有至少一种可由重组微生物使用的碳源的培养基中执行本发明方法以使所述微生物优先消耗这个碳源而非单体和/或寡聚物。有利的是，使含聚酯材料与含有重组微生物、作为碳源的葡萄糖等、以及可用氮源的培养基接触，所述氮源包括有机氮源(例如蛋白胨、肉类提取物、酵母提取物、玉米浆)或无机氮源(例如硫酸铵、氯化铵)。必要时，培养基可进一步含有无机盐(例如钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、硫酸根离子、氯离子、磷酸根离子)。此外，培养基也可补充以痕量组分，诸如维生素、少量元素和氨基酸。
在一特定实施方式中，含聚酯材料可在与本发明的聚酯酶接触之前预处理，以物理改变它的结构，以便增加聚酯与聚酯酶之间的接触面。举例来说，可使含聚酯材料转变成乳液或粉末，其被添加至含有本发明的多肽和/或重组微生物或其提取物的液体介质中。或者，可在添加至含有重组微生物、其提取物和/或多肽的液体介质中之前通过切割、冲击、压碎、研磨、分段、低温研磨等来将含聚酯材料机械研磨、粒化、丸粒化等，以减小材料的形状和尺寸。机械预处理也可为声波处理、离心、剪切、碰撞、采用高压均质器、用转鼓进行浸渍或液化、采用螺旋压机、圆盘筛粉碎机或活塞压机。或者或另外，可应用热预处理。这可用微波实现。所述热预处理可提供消毒、巴斯德灭菌(pasteurization)或灭菌。在另一实施方式中，含聚酯材料被化学预处理以改进它的结构，并且增加聚酯与本发明的多肽之间的接触面。可使用碱、酸、溶剂或离子液体。也可执行臭氧化。在一特定实施方式中，也可在降解之前分选、洗涤、消毒、灭菌和/或生物清洁含聚酯材料。根据本发明，可组合若干预处理。
为降解含聚酯材料所需的时间可视含聚酯材料自身(即塑料制品的性质和来源、它的组成、形状等)、所用多肽的类型和数量、以及各种工艺参数(即温度、pH、附加的试剂等)而变化。本领域技术人员可易于使工艺参数适于含聚酯材料。
有利的是，在包括在20℃与90℃之间，优选在20℃与60℃之间，更优选在30℃与55℃之间，更优选是40℃至50℃，甚至更优选在45℃的温度下执行方法。更通常地，使温度维持在失活温度以下，所述失活温度对应于多肽被失活和/或重组微生物不再合成多肽所处的温度。
介质的pH可在5-11的pH范围内，优选在7-10的pH范围内，更优选在8.5-9.5的pH范围内，甚至更优选在8-9的pH范围内。有利的是，根据目标聚酯以及目标单体/寡聚物的溶解性调整pH以改进工艺效率。优选地，调整pH以维持在多肽的最优pH下。实际上，聚酯的解聚产生诱导pH降低的酸性单体和寡聚物。添加稀释碱或饱和碱诸如氢氧化钙可用于抵消这个酸化，并且将pH维持成最优pH。
有利的是，多肽的添加量以重量计在含聚酯材料的0.001％至5％的范围内，优选在0.001％至1％的范围内，更优选在0.001％至0.1％的范围内，甚至更优选在0.001％至0.05％的范围内。
在一特定实施方式中，在优选包括在30rpm与2000rpm之间的搅拌下执行方法，以有利于多肽与含聚酯材料之间的接触。
在一特定实施方式中，添加至少亲脂性试剂和/或亲水性试剂至介质中以改进解聚步骤。可添加诱导剂诸如聚酯或其衍生物的寡聚物至包含重组微生物的培养基中以改进多肽产生。可添加表面活性剂诸如吐温(Tween)或小蛋白质如疏水蛋白(hydrophobin)至介质中以改进聚酯与多肽或重组微生物之间的界面能，并且改进降解效率。有机物质或离子液体可用于溶胀聚酯，并且增加微生物或多肽对它的可到达性。
用于解聚塑性材料的至少一种聚酯直至成为单体/寡聚物的反应时间有利地包括在5小时或更少与110小时之间，更优选在24小时与72小时之间。所述反应时间可允许解聚充分进展，并且将不是在经济上不利的。对于在甲烷化场所中的厌氧生物降解，或对于在天然环境中的好氧生物降解，反应时间可较长久。
任选地，可依序或连续回收由解聚产生的单体和/或寡聚物。视起始含聚酯材料而定，可回收单一类型的单体和/或寡聚物或若干不同类型的单体和/或寡聚物。
可使用所有适合纯化方法进一步纯化回收的单体和/或寡聚物，并且调节成可再聚合形式。纯化方法的实例包括汽提方法、通过水溶液来分离、蒸汽选择性冷凝、在生物过程之后过滤和浓缩介质、分离、蒸馏、真空蒸发、提取、电渗析、吸附、离子交换、沉淀、结晶、浓缩以及酸添加脱水和沉淀、纳滤、酸催化剂处理、半连续方式蒸馏或连续方式蒸馏、溶剂提取、蒸发浓缩、蒸发结晶、液体/液体萃取、氢化、共沸蒸馏方法、吸附、柱色谱法、简单真空蒸馏和微滤，所述纯化方法可以组合或不组合。
可再聚合单体和/或寡聚物可接着再次用于例如合成聚酯。有利的是，再聚合具有相同性质的聚酯。然而，有可能混合回收的单体和/或寡聚物与其它单体和/或寡聚物，以例如合成新的共聚物。或者，回收的单体可作为化学中间体用于产生新的目标化合物。
在一特定实施方式中，在适于允许进行聚合反应的条件下，使用水解酶进行再聚合。可添加引发剂至单体/寡聚物溶液中以有利于聚合反应。本领域技术人员可易于使工艺参数适于单体/寡聚物以及待合成的聚合物。
在一特定实施方式中，在反应器中执行本发明方法。“反应器”指定适于维持和转化塑料物品的任何装置或装备或设施。反应器可包括进口和出口装置以供给/收集介质、营养物、气体等。反应器可为闭合的或开放的，诸如槽罐。
塑料化合物和物品
本发明的另一目标在于提供一种含聚酯材料，其中包括本发明的多肽和/或表达和分泌所述多肽的重组微生物。在一特定实施方式中，所述含聚酯材料可为塑料化合物。
因此，本发明的一目标在于提供一种塑料化合物，其含有本发明的多肽和/或重组细胞和/或其组合物或提取物；以及至少一种聚酯。在一优选实施方式中，聚酯选自聚乳酸，优选选自PLLA。特定来说，塑料化合物可含有优选选自以下的附加的聚合物：聚酯，诸如PDLA、PBAT、PHA、PCL、PET；聚烯烃，诸如聚乙烯、聚丙烯；或天然聚合物，诸如淀粉、纤维素或面粉；及其掺合物/混合物。更特定来说，塑料化合物可含有选自PBAT和面粉或淀粉的附加的聚合物。
在一特定实施方式中，用于制备塑料化合物的多肽包含与如SEQ ID N°1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、92％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
特定来说，本发明涉及一种包括以下步骤的方法：在聚酯处于部分或完全熔融状态所处的温度下混合所述聚酯和本发明的降解所述聚酯的多肽和/或重组细胞以使所述多肽和/或所述重组细胞整合至含聚酯材料的恰好结构中。在一特定实施方式中，将重组微生物的孢子包括至含聚酯材料中。
举例来说，可在聚酯的玻璃转变温度与熔点之间的温度下混合本发明的多肽和/或重组微生物和聚酯。或者，可在对应于所述聚酯的熔点或以上的温度下混合生物实体和聚烯烃。在一特定实施方式中，在80℃与250℃之间，优选100℃与200℃之间的温度下混合多肽/微生物和聚酯。或者，在高于80℃，优选高于100℃，甚至更优选高于130℃的温度下混合多肽/微生物和聚酯。更通常地，多肽和/或重组微生物有利地至少抵抗聚酯的挤出温度。
更优选地，使用挤出、双螺杆挤出、单螺杆挤出、注射模制、铸造、热成形、旋转模制、压制、压延、压平、涂布、层化、扩展、拉挤成型、挤出吹扫-模制、挤出-膨胀、压制-粒化、水包油包水双重乳液蒸发或由本领域技术人员所知的任何技术进行混合步骤。
所得塑料化合物整合包埋在化合物的主体中的本发明的多肽/微生物。
有利的是，所述塑料化合物可用于制造其中也包括本发明的多肽/微生物的塑料物品。
在一特定实施方式中，所得塑料化合物或塑料物品是符合至少一种由本领域技术人员所知的相关标准和/或标签的可生物降解的塑料化合物或塑料物品，所述相关标准和/或标签诸如标准EN 13432、标准ASTM D6400、良好生物降解土壤(OK BiodegradationSoil，标签)、良好生物降解水(OK Biodegradation Water，标签)、良好堆肥(OK Compost，标签)、良好家庭堆肥(OK Compost Home，标签)。
可生物降解的塑料化合物或塑料物品是指在环境条件下至少部分地转化成水、二氧化碳或甲烷和生物质的塑料化合物或塑料物品。如实施例中所说明，本发明的优选塑料化合物或塑料物品可在水中生物降解。优选地，以重量计，约90％的塑料化合物或塑料物品在小于90天内，更优选在小于60天内，甚至更优选在小于30天内，在水中被生物降解。或者或此外，塑料化合物或塑料物品可在暴露于存在于地貌中的湿润和温度条件时被生物降解。优选地，以重量计，约90％的塑料化合物或塑料物品在环境中在小于3年的情况下，更优选在小于2年内，甚至更优选在小于1年内被生物降解。或者，塑料化合物或塑料物品可在工业堆肥条件下被生物降解，其中将温度维持在50℃以上。
本发明的其它方面和优势将在以下实施例中公开，所述实施例应被视为具有说明性而不限制本申请的范围。
实施例
实施例1：纯化和鉴定来自角蛋白降解马杜拉放线菌T16-1的聚酯酶
从泰国森林土壤分离的角蛋白降解马杜拉放线菌NBRC 104111菌株T16-1(Sukkum等 2009)由于它的上清液具有高PLA降解活性而被选择。
在发酵罐中产生酶
在10L发酵罐( Biostat Cplus)中进行批式实验。500mL酵母麦芽培养液(YM，Sigma-Aldrich)预培养物用于接种4.5L基础培养基(2.4g/L明胶；4g/L(NH4)2SO4；0.2g/L MgSO4.7H2O；0.5g/L酵母提取物；4g/L K2HPO4；2g/L KH2PO4，用NaOH调整在pH 6.8下)。将温度调控在46℃下，并且以添加10％(v/v)H3PO4溶液来将pH维持在6.8下。使搅拌速率固定在70rpm下以使得能够温和混合，并且调控通气率(0.6至1.6vvm)以提供反应器高于20％的空气饱和度的溶氧水平，以避免培养中存在任何氧限制。使发酵罐连接于计算机，并且MFCS/DA软件对受控参数(pH、温度、溶氧分压和H3PO4添加)进行线上采集并允许线上监测和调控这些参数。
培养持续时间是50小时。通过离心(13000g–10分钟)来回收含有细胞外酶的上清液，并且保存在4℃下。
聚酯酶纯化
使用500mL Amicon槽室(Merck Millipore)和具有10KDa的孔尺寸的纤维素再生膜(GE Healthcare Life Science)将培养物的上清液浓缩40倍。相对于50mM甘氨酸-NaOHpH 10缓冲液来透析所得溶液。
AKTA纯化器装置(GE Healthcare Life Science)用于使用阴离子交换纯化HiTrap Q FF 1mL管柱(GE Healthcare Life Science)进行多肽纯化，以50mM甘氨酸-NaOH(pH 10)作为上样缓冲液。用含0至1M梯度NaCl的50mM甘氨酸-NaOH pH 10缓冲液进行洗脱。
在TCA沉淀(v/v)之后，通过无染色剂SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad)以及通过在含有琼脂糖(1％)和PLLA乳液(0.5％，NaturePlast)的混合物的板中测试酶产生晕圈的能力来阐明本发明的聚酯酶在包括流穿级分的不同级分中的存在性。
测定多肽N末端序列
在从凝胶被动提取之后，通过Edman微量测序技术，使用494微量测序仪装置(Perkin Elmer Applied Biosystems)在Rouen的Pissaro平台(France)中对所需条带中含有的多肽进行N末端测序。
分子生物学技术
除非另外规定，否则用于DNA操作的一般性程序如先前所描述(Sambrook J,Russell DW.2001.Molecular cloning:a laboratory manual,第3版Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。限制酶和T4DNA连接酶从New EnglandBiolabs获得，并且根据制造商说明书加以使用。使用CloneAmp HiFi PCR预混合物(Takara-Clontech)进行PCR。合成寡核苷酸由Eurogentec合成。使用GenElute PCR提纯试剂盒(Sigma-Aldrich)纯化PCR产物。使用热激方法将质粒DNA引入大肠杆菌DH5α菌株(Invitrogen)中。使用QIAprep旋转质粒小型制备试剂盒(Qiagen)从大肠杆菌获得质粒DNA。使用加强型小型试剂盒(Qiagen)获得总RNA样品，并且随后，使用Ribo-ZeroTM rRNA移除试剂盒(Epicentre)消减核糖体RNA。
RNA测序
使用Illumina TruSeq链式mRNA试剂盒和超高通量测序系统Ilumina HiSeq 2500构建对应于角蛋白降解马杜拉放线菌T16-1在存在/不存在PLLA(NaturePlast，500μm)下的表达谱的两个RNA文库。使用TruSeq SBS试剂盒(Ilumina)的化学v3获得双端读段(2x100ob)。
生物信息学
利用TBLASTN、BLASTX和BLASTP(Altschul SF等 1997.Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of polypeptide database search programs.Nucleic AcidsRes.25:3389–3402)，使用可在国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)访问的非冗余序列数据库进行数据库搜索。使用Vector NTI软件(Life Technologies)进行序列分析，并且用ClustalW软件(Thompson JD,Higgins DG,Gibson TJ.1994.CLUSTAL W:improving thesensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequenceweighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice.NucleicAcids.Res.22:4673–4680)进行多重局部比对。
结果
多肽纯化
使用阴离子交换柱，在pH 10下实现多肽纯化。在含有PLA的琼脂糖板上测试不同级分的活性。指示PLA水解的晕圈形成仅在流穿级分的情况下获得。在β-巯基乙醇的情况下进行的SDS-PAGE显示流穿级分含有独特条带(图1)。这个纯化方法使得能够获得呈现待获得的PLA水解活性的纯多肽。将多肽的分子量评估为27kDa。
对条带中含有的成熟蛋白质的N末端测序显示独特的含28个氨基酸的序列：
ATQNNPPSWGLDRIDQTNLPLSRSYTYN(SEQ ID N°3)
在流穿物中纯化的多肽显示对PLA粉末的解聚活性。多肽的比活性是每mg酶以及每小时产生4.8g乳酸(根据下述方案)。
RNA测序结果允许鉴定编码其序列显示与先前通过N末端测序鉴定的28个氨基酸的100％同一性的多肽的DNA序列。
以下再现所确定的DNA序列(SEQ ID N°4)，其中加下划线序列对应于假设肽信号和前肽：
5’atgagacgacgtaccctgcccatcgccgtcctcgccgccgttcccctggccgtggcgggcgccctgc ccgccggagccgcccccgccgcccccgccgtcccggtcgccatggcggccgccggacagggcgtcgccggacagtac atcgtgacgctgaagaagggcgtctcggtcgactcgaccgtcgccaagcgcggaatccgcacccagcaccgtttcgg caaggtgctgaacggcttctccgccaagctcaccgatgaccaactgtccaagctgcgcaccacgcccggtgtcgcgt ccatcgagcaggacgccgtcatcacggtggacgccacgcagaacaacccgccgtcgtggggcctggaccgcatcgaccagacgaacctgccgctgtcgcgcagctacacctacaattccaccggcgcgggcgtgaacgcctacatcatcgacaccggcatctacaccgcgcactccgacttcggcggccgcgccaccaacgtctacgacgccctcggcggcaacggccaggactgcaacggccacggcacccacgtcgcgggcaccgtcggcggcgccgcctacggcgtggccaaggcggtcaacctgcgcggcgtgcgcgtgctcaactgcagcggcagcggcaccacctccggtgtcatcgccggcatgaactgggtggccagcaaccacgtcaagcccgccgtggcgaacatgtcgctgggcggcggctactcctcctccctgaacacggccgccaacaacctggccagctccggcgtgttcctggccgtcgccgcgggcaacgagaccaccaacgcctgcaaccgctcgccggccagcgccgccaacgccaccacggtcgccgcgagcaccagcaccgacgcccgggcctcctacagcaactacggctcgtgcgtccacctgtacgcgcccggctcgtccatcacctccgcctggctgaacggcggcaccaacaccatcagcggcacgtcgatggccacgccgcacgtggccgggaccgccgccctctacaaggcgacctacggcgacgcctcgttcagcaccatccgcagctggctggtcagcaacgccacctccggcgtcatcaccggcaacgtgtcgggcaccccgaacctgctgctgaacaagcgctccctgtaa 3’(SEQ ID N°4)
编码的多肽呈现具有386个氨基酸的序列(以下SEQ ID N°5)，其中
-残基1至29对应于肽信号，
-残基30至110对应于假设前肽，并且
-残基111至386对应于成熟多肽。
SEQ ID N°5(加下划线前肽序列；加双下划线肽信号)：
APAVPVAMAAAGQGVAGQYIVTLKKG VSVDSTVAKRGIRTQHRFGKVLNGFSAKLTDDQLSKLRTTPGVASIEQDAVITVDATQNNPPSWGLDRIDQTNLPLSRSYTYNSTGAGVNAYIIDTGIYTAHSDFGGRATNVYDALGGNGQDCNGHGTHVAGTVGGAAYGVAKAVNLRGVRVLNCSGSGTTSGVIAGMNWVASNHVKPAVANMSLGGGYSSSLNTAANNLASSGVFLAVAAGNETTNACNRSPASAANATTVAASTSTDARASYSNYGSCVHLYAPGSSITSAWLNGGTNTISGTSMATPHVAGTAALYKATYGDASFSTIRSWLVSNATSGVITGNVSGTPNLLLNKRSL
成熟多肽序列(SEQ ID N°1)：
ATQNNPPSWGLDRIDQTNLPLSRSYTYNSTGAGVNAYIIDTGIYTAHSDFGGRATNVYDALGGNGQDCNGHGTHVAGTVGGAAYGVAKAVNLRGVRVLNCSGSGTTSGVIAGMNWVASNHVKPAVANMSLGGGYSSSLNTAANNLASSGVFLAVAAGNETTNACNRSPASAANATTVAASTSTDARASYSNYGSCVHLYAPGSSITSAWLNGGTNTISGTSMATPHVAGTAALYKATYGDASFSTIRSWLVSNATSGVITGNVSGTPNLLLNKRSL
对这个含276个氨基酸的成熟多肽计算的理论分子量是27.7kDa，此对应于在从角蛋白降解马杜拉放线菌T16-1的上清液纯化聚酯酶之后观察到的分子量。
根据与已知多肽的同源性，具有聚酯酶活性的多肽揭示存在两个推定钙结合位点，其中第一位点具有残基Ala 172、Ala 174和His 197，并且第二位点具有残基Asp 12、Asp 15和Gln 16。多肽的催化位点由氨基酸His 71、Asp 40和Ser 221组成。此外，也已在多肽序列中鉴定两个在残基Cys 68-Cys 100和Cys 164–Cys 195之间的推定二硫键(图2)。
实施例2：表征来自角蛋白降解马杜拉放线菌T16-1的聚酯酶。
确定酶的最优pH和温度，并且研究酶的热稳定性。
多肽的最优pH和温度
酶的最优pH是8.5。在50℃下，在7与9之间的pH范围内，用含600μg酶的2mL缓冲液以及20mg Goodfellow PLA薄膜在磁力搅拌的管中进行解聚测试。在pH 7下，酶显示少许活性。
在37℃、45℃和50℃下，在pH 8.5下，用含600μg酶的2mL pH 8,5Tris-HCl缓冲液以及20mg Goodfellow PLA薄膜进行解聚测试。酶的最优温度是50℃。
聚酯酶热稳定性
在4℃至60℃的温度范围内实现聚酯酶稳定性测定。在4℃下，聚酯酶持续数月保持稳定。酶的稳定性与活性之间的折中对应于45℃的温度。在45℃下，酶半衰期是2.5周。此外，在冻干程序之后不存在聚酯降解活性损失。
实施例3：开发PLA降解方法。
鉴于乳酸是潜在抑制剂并且在反应期间剧烈降低pH，这些实验的目的在于解决产生乳酸的问题。将酶和PLA引入并限制在10kDa的透析管中。这个管对乳酸可渗透，并且被放置在一定体积的缓冲液中，从而允许在恒定pH下操作，并且稀释乳酸，由此限制它的潜在抑制作用。
酶促PLA降解
在PLA的水解动力学分析期间研究目标多肽(SEQ ID N°1)的降解能力。通过HPLC分析来追踪PLA向乳酸的转化。
在10kDa透析管(纤维素膜，宽度25mm，Sigma-Aldrich D9777-100FT)中进行PLA降解测定。将含90μg酶的3mL 100mM Tris HCl pH 8,5缓冲液、PLLA粉末(Natureplast 500μm)、PLA薄膜(Goodfellow，50μm厚度)或PLA物件引入并限制在透析管中。将管放置在50mL(除非另外规定)100mM Tris-HCl缓冲液中以控制pH至8.5。将缓冲液补充以卡那霉素(40μg/mL)以避免任何污染。在45℃下在搅拌(150rpm)下孵育反应。这个程序的目标在于控制反应的pH，并且避免由乳酸达成的潜在酶抑制。
通过对管外部的缓冲液进行HPLC分析(管柱：Aminex HPX-87H(300mm×7.8mm)，流动相：5mM H2SO4，温度：50℃，流速：0.5mL.min-1，注射体积：20μL)来定量降解产物(乳酸和可溶性寡聚物)。乳酸(Sigma-Aldrich L1750-10G)、二聚体和三聚体(自制)的标准物用于外部校正。
为定量这个方法的好处，用以下透析系统实现PLA水解：在45℃下磁力搅拌的管中，所述管含有引入管中的50mg PLA薄膜(Goodfellow，50μm厚度，2％D-乳酸)、含90μg酶的3mL 100mM Tris-HCl pH 8.5缓冲液。在反应24小时之后，在提出的反应器中获得55％转化率。
实施例4：评估对具有不同粒度测定值的PLA/PLLA的聚酯酶活性。
在水解PLA粉末(PLLA NaturePlast，含有4％D-乳酸的PLA Ingeo 7001D)期间评估酶活性。通过将商业丸粒微粉化和研磨来获得不同粒度(100-250μm、250-500μm、500μm-1mm和1-2mm)(表1)。
表1：PLA(Ingeo 7001D)和PLLA(Natureplast)粉末的特征：粒度和结晶度。
粒度 Tg(℃) 结晶度(％)
PLA Ingeo 7001D 100-250μm 62 3
250-500μm 60 7
500μm-1mm 63 41
1mm-2mm 62 42
PLLA Natureplast 100-250μm 58 23
250-500μm 57 24
500μm-1mm 59 34
1mm-2mm 64 43
差示扫描量热法(DSC)测试用于使用Q100TA-RCS 90仪器，在铝盘中，在氮气氛围(50mL/min)下，在10℃/min的扫描速率下从-50℃至300℃对约8mg样品测定PLA的玻璃温度(Tg)和结晶度。
在实施例3中所述的反应器方法中，用100mg PLA粉末、含60μg酶的2mL 100mMTris-HCl pH 8.5缓冲液测定具有不同粒度的两种不同PLA粉末的水解性能。具有相同尺寸的PLA和PLLA粉末的水解是相同的，从而指示存在4％D-乳酸并不对水解性能有害。在范围5至24％内的PLA结晶度对水解性能具有较低影响。相反地，粒度对PLA和PLLA粉末的水解速率存在强烈影响：粉末越细小，水解速率越高效。这可通过固相与液相之间的交换面的增加来解释。(图3和4)。
在100-250μm的范围内的粒度使得能够在24小时内获得68％的转化率。
如果在反应器中添加10mM CaCl2，那么在反应80小时之后获得500μm PLLA粉末NaturePlast的95％的转化率。
实施例5：PLA浓度对酶活性的影响
用与实施例3中所述相同的方案，含90μg酶的3mL 100mM Tris-HCl pH 8.5缓冲液，在水解PLLA粉末期间，在不同浓度(33至300g/L)下评估酶活性。结果呈现于表2中。
PLLA浓度越高，形成乳酸的生产力越高，在300g/L浓度的PLLA的情况下，倾向于达成0.2g乳酸/mg酶/h。
表2：在聚酯酶催化不同浓度PLLA水解期间在反应10小时获得的生产力。
生产力10h PLLA 33g/L PLLA 100g/L PLLA 200g/L PLLA 300g/L
0.07 0.15 0.17 0.19
改进因子 1 x2.1 x2.3 x2.6
实施例6：聚酯酶催化PLA薄膜水解成乳酸。
在水解PLA薄膜(Goodfellow，50μm厚度，2％D-乳酸)期间使用实施例3中呈现的相同实验方案。在45℃、pH 8.5下，用含90μg聚酯酶的3mL 100mM Tris-HCl pH 8.5缓冲液和50mg薄膜(17g/L)进行动力学分析。
聚酯酶能够将薄膜水解成乳酸。在48小时内获得76％的转化率，在72小时内获得82％的转化率(图5)。
实施例7：聚酯酶催化PLA商业物件水解成乳酸。
在聚酯酶催化水解商业物件(PLA杯子、盘子、薄膜和餐具)期间使用实施例3中呈现的相同实验方案。对这些物件的粉末(250-500μm)进行水解测试。使用100mg商业物件粉末，含90μg酶的3mL 100mM Tris-HCl pH 8.5缓冲液。
无论是什么PLA物件，水解的初始速率都是相对类似的(在10小时，从对于薄膜的27％至对于杯子的44％)。相比于用PLLANaturePlast粉末获得的结果(37％)，这在相同范围内。然而，值得注意的是PLA杯子比PLLA粉末更易于转化成乳酸。在48小时之后获得PLA杯子的98％的转化率。在72小时内，对于薄膜和盘子，分别获得向乳酸的93％和84％的转化率。餐具是最难以降解的物件，其中最多60％的物件转化成乳酸。它含有约1％的TiO2，并且显示TiO2的存在不导致这个现象。
聚酯酶能够将所有商业物件都水解成乳酸(图6)。
实施例8：使用SEQ ID N°1的酶的再循环方法
这些实验的目的在于验证本发明的PLA降解解决方案的工业实用性，其中将SEQID N°1的酶和PLA引入不具有任何透析系统的反应器中。
直接用通过如实施例1中所述的发酵获得的酶产生培养基进行PLA降解测定。通过离心(13000g–10分钟)来回收含有细胞外酶的上清液，并且保存在4℃下。
直接添加400mg PLA Natureplast粉末(粒度<500μm)至25ml上清液中。添加300mg碳酸钙和100mg氢氧化钙以中和在水解期间释放的乳酸，并且维持溶液的pH超过7。在反应开始时，pH在9.0与9.8之间。在45℃下，在搅拌(300rpm)下孵育反应混合物140小时。
在反应期间，收集若干混合物样品(1ml)，并且于0.22μm过滤器上过滤。如实施例2中所述通过HPLC来分析20μl滤液以定量乳酸和可溶性寡聚物(DP2)。在反应144小时之后，获得17.5g/l乳酸和0.52g/l DP2寡聚物。PLA向乳酸的转化产率大于77％(图7)。
实施例9：通过本发明的不同特定多肽来比较PLA降解
已修饰氨基酸序列SEQ ID N°1以改进它的热稳定性。
第一策略在于通过在SEQ ID N°1的残基位置175和247处引入两个半胱氨酸残基(T175C和R247C)来在氨基酸残基序列SEQ ID N°1中进行两个氨基酸残基取代以将附加的二硫键引入在多肽的结构中。
第二策略在于在SEQ ID N°1的氨基酸残基139与170之间或在氨基酸残基143与173之间引入额外盐桥。因此，第一所得变体含有氨基酸残基取代N139D和S170R，并且第二所得变体含有氨基酸残基取代N143R和N173E。
第三策略在于对如SEQ ID N°2所示的核酸序列进行定点诱变以产生5个变体，各自含有一个选自S194P、H197D、L210P、G212N和I217K的氨基酸残基取代。
已测试SEQ ID N°1的各自含有选自R166K、T160A和L138A的氨基酸残基取代的其它变体，并且已测量到活性与SEQ ID N°1的天然多肽相当。
实施例10：重组表达和纯化SEQ ID N°1的聚酯酶。
在以下三种不同宿主中表达SEQ ID N°1的聚酯酶：解脂耶罗威亚酵母、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。
10A-在解脂耶罗威亚酵母中重组表达聚酯酶
在酵母解脂耶罗威亚酵母中，更确切来说在菌株JMY1212中，在组成型启动子TEF控制下表达SEQ ID N°1的聚酯酶，如先前由Bordes等,2007(F.Bordes,F.Fudalej,V.Dossat,J.M.Nicaud,et A.Marty(2007)A new recombinant protein expressionsystem for high-throughput screening in the yeast Yarrowia lipolytica.J.ofMibrob.Meth.,70,3,493-502)所述。对应于继之以表达成熟聚酯酶的基因的序列的前肽的序列针对解脂耶罗威亚酵母的密码子用法加以优化。将这个序列整合在编码来自解脂耶罗威亚酵母的脂肪酶lip2的基因的分泌信号序列的下游。
接着在含有培养基Y1T2O3(总计50mL)的锥形烧瓶(Erlenmeyer flask)(500mL)中成功表达聚酯酶，所述培养基由酵母提取物(10g/L)、细菌用胰蛋白胨(20g/L)和葡萄糖(30g/L)构成，用磷酸盐缓冲液(100mM，pH 6.8)缓冲。在28℃下孵育细胞24小时直至葡萄糖完全消耗。在10,000rpm下离心细胞10分钟，并且将上清液直接用于反应中。
表达水平类似于在角蛋白降解马杜拉放线菌T16-1的情况下获得的表达水平，但它的热稳定性较高。尽管在角蛋白降解马杜拉放线菌T16-1中产生的酶在60℃下5小时之后损失78％的活性，但在解脂耶罗威亚酵母中表达的酶在相同处理之后具有完全活性。
10B-在枯草芽孢杆菌中重组表达SEQ ID N°1的聚酯酶
克隆并在枯草芽孢杆菌中表达SEQ ID N°1的聚酯酶，如商业Takara试剂盒中所述。对应于继之以表达成熟聚酯酶的基因的序列的前肽的序列针对枯草芽孢杆菌的密码子用法加以优化。将这个序列整合在枯草芽孢杆菌的分泌信号序列的下游。
表达水平类似于在角蛋白降解马杜拉放线菌T16-1的情况下获得的表达水平。
10C-在大肠杆菌中重组表达SEQ ID N°1的聚酯酶
克隆并在大肠杆菌中，并且更确切来说在BL21、Origami和Rosetta菌株中表达SEQID N°1的聚酯酶。对应于继之以表达成熟聚酯酶的基因的序列的前肽的序列针对大肠杆菌的密码子用法加以优化。将这个序列在有或无组氨酸标签的情况下整合在用于达成周质表达的PelB信号序列或编码麦芽糖结合蛋白的基因的下游。
表达水平比在角蛋白降解马杜拉放线菌T16-1的情况下获得的表达水平高2至3倍。
使用组氨酸标签，将蛋白质纯化并在使用PLA(Ingeo 7001D)的250-500μm粉末下测试PLA解聚。相比于在角蛋白降解马杜拉放线菌T16-1中表达的酶，在大肠杆菌中产生的酶呈现相同比活性。
实施例11：产生含有SEQ ID N°1的多肽的可生物降解的塑料化合物
11A-塑料化合物产生方法
制备塑料化合物，其包含先前在65℃下干燥4小时的呈粒化形式的PLA聚合物(来自Natureplast的聚乳酸PLE 003)和SEQ ID N°1的多肽的固体制剂。
先前根据以下步骤制备多肽固体制剂：培养产生所述多肽的微生物，过滤所述培养物，随后利用3kD膜进行超滤和透滤，添加10g.l麦芽糖糊精，并且使混合物雾化以获得处于干燥粉末形式下的多肽。
使用混配机或共旋转双螺杆挤出机(“Coperion ZSK 18 megalab”)。这个混配机依次包括第一进料元件、两个混合元件以及第二进料元件。混配机包括9个连续加热区Z1至Z9，其中可独立地控制和调控温度。另一区域Z10存在于区域Z9之后，对应于双螺杆的头部。
根据这个实验，使96重量％的PLA与4重量％的SEQ ID N°1的PLA解聚酶的液体制剂混合，并且挤出，其中温度概况描述于下表3中。
表3：混配机的温度概况
区域 Z1 Z2 Z3 Z4 Z5 Z6 Z7 Z8 Z9 Z10(头部)
T℃ 135℃ 150℃ 170℃ 180℃ 140℃ 140℃ 140℃ 140℃ 140℃ 140℃
将PLA以9,6kg/h的流量引入主进料斗(在Z1区域之前)中。PLA穿过区域Z1至Z5，其中温度被增加直至180℃(Z4)，从而产生熔融PLA。接着通过副进料器N°2将酶以0,4kg/h的流量引入Z6中，其中温度被降低至140℃。
接着通过双螺杆在200Rpm下的旋转来将酶和PLA从区域Z7至区域Z9混合在一起。从Z1至Z9的滞留时间是约1分30秒。PLA和生物实体的混合物接着到达包括两个直径是2.5mm的孔的螺杆头部(Z10)，其中混合物被推动以形成丸粒，其接着在水中冷却并干燥，随后进行调节。
获得处于粒化形式下的塑料化合物，其含有96重量％的PLA以及4重量％的SEQ IDN°1的PLA解聚酶的制剂。所述塑料化合物可用于通过本领域中本身熟知的任何技术来产生塑料物品。
11B-包含PLA和SEQ ID N°1的多肽的塑料化合物的降解测试。
已使用以下各物进行不同可生物降解性比较测试：
-根据实施例11A产生的塑料化合物，其含有96重量％的PLA以及4重量％的本发明的PLA解聚酶的制剂
-如实施例11A中所述产生的PLA化合物，其含有100重量％的PLA(即剥夺PLA解聚酶)，称为对照
在以下不同温度下进行所述测试：28℃、37℃或45℃。
将约1克PLA放置在100mL Tris缓冲液(pH＝9,5)中。准确测量PLA的量以评估产生的乳酸的理论量。
通过测量PLA的转化率，更具体来说PLA向乳酸或乳酸的二聚体的解聚来评估化合物的可生物降解性。通过HPLC分析来追踪这个转化率。
结果(图8)显示相比于对照PLA化合物，整合PLA解聚酶的PLA化合物显示更大解聚速率(即可生物降解性)。相比于在28℃下，PLA化合物在37℃或45℃下的解聚甚至更好。
序列表
<110> 卡比欧斯公司
<120> 具有聚酯降解活性的多肽及其用途
<130> B1898PC00
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 276
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> PAM Polypeptide
<400> 1
Ala Thr Gln Asn Asn Pro Pro Ser Trp Gly Leu Asp Arg Ile Asp Gln
1 5 10 15
Thr Asn Leu Pro Leu Ser Arg Ser Tyr Thr Tyr Asn Ser Thr Gly Ala
20 25 30
Gly Val Asn Ala Tyr Ile Ile Asp Thr Gly Ile Tyr Thr Ala His Ser
35 40 45
Asp Phe Gly Gly Arg Ala Thr Asn Val Tyr Asp Ala Leu Gly Gly Asn
50 55 60
Gly Gln Asp Cys Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Gly
65 70 75 80
Gly Ala Ala Tyr Gly Val Ala Lys Ala Val Asn Leu Arg Gly Val Arg
85 90 95
Val Leu Asn Cys Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Val Ile Ala Gly
100 105 110
Met Asn Trp Val Ala Ser Asn His Val Lys Pro Ala Val Ala Asn Met
115 120 125
Ser Leu Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Leu Asn Thr Ala Ala Asn Asn
130 135 140
Leu Ala Ser Ser Gly Val Phe Leu Ala Val Ala Ala Gly Asn Glu Thr
145 150 155 160
Thr Asn Ala Cys Asn Arg Ser Pro Ala Ser Ala Ala Asn Ala Thr Thr
165 170 175
Val Ala Ala Ser Thr Ser Thr Asp Ala Arg Ala Ser Tyr Ser Asn Tyr
180 185 190
Gly Ser Cys Val His Leu Tyr Ala Pro Gly Ser Ser Ile Thr Ser Ala
195 200 205
Trp Leu Asn Gly Gly Thr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr
210 215 220
Pro His Val Ala Gly Thr Ala Ala Leu Tyr Lys Ala Thr Tyr Gly Asp
225 230 235 240
Ala Ser Phe Ser Thr Ile Arg Ser Trp Leu Val Ser Asn Ala Thr Ser
245 250 255
Gly Val Ile Thr Gly Asn Val Ser Gly Thr Pro Asn Leu Leu Leu Asn
260 265 270
Lys Arg Ser Leu
275
<210> 2
<211> 828
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> PAM nucleic acid sequence
<400> 2
gccacgcaga acaacccgcc gtcgtggggc ctggaccgca tcgaccagac gaacctgccg 60
ctgtcgcgca gctacaccta caattccacc ggcgcgggcg tgaacgccta catcatcgac 120
accggcatct acaccgcgca ctccgacttc ggcggccgcg ccaccaacgt ctacgacgcc 180
ctcggcggca acggccagga ctgcaacggc cacggcaccc acgtcgcggg caccgtcggc 240
ggcgccgcct acggcgtggc caaggcggtc aacctgcgcg gcgtgcgcgt gctcaactgc 300
agcggcagcg gcaccacctc cggtgtcatc gccggcatga actgggtggc cagcaaccac 360
gtcaagcccg ccgtggcgaa catgtcgctg ggcggcggct actcctcctc cctgaacacg 420
gccgccaaca acctggccag ctccggcgtg ttcctggccg tcgccgcggg caacgagacc 480
accaacgcct gcaaccgctc gccggccagc gccgccaacg ccaccacggt cgccgcgagc 540
accagcaccg acgcccgggc ctcctacagc aactacggct cgtgcgtcca cctgtacgcg 600
cccggctcgt ccatcacctc cgcctggctg aacggcggca ccaacaccat cagcggcacg 660
tcgatggcca cgccgcacgt ggccgggacc gccgccctct acaaggcgac ctacggcgac 720
gcctcgttca gcaccatccg cagctggctg gtcagcaacg ccacctccgg cgtcatcacc 780
ggcaacgtgt cgggcacccc gaacctgctg ctgaacaagc gctccctg 828
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> N-terminal polypeptide sequence
<400> 3
Ala Thr Gln Asn Asn Pro Pro Ser Trp Gly Leu Asp Arg Ile Asp Gln
1 5 10 15
Thr Asn Leu Pro Leu Ser Arg Ser Tyr Thr Tyr Asn
20 25
<210> 4
<211> 1161
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> DNA sequence
<400> 4
atgagacgac gtaccctgcc catcgccgtc ctcgccgccg ttcccctggc cgtggcgggc 60
gccctgcccg ccggagccgc ccccgccgcc cccgccgtcc cggtcgccat ggcggccgcc 120
ggacagggcg tcgccggaca gtacatcgtg acgctgaaga agggcgtctc ggtcgactcg 180
accgtcgcca agcgcggaat ccgcacccag caccgtttcg gcaaggtgct gaacggcttc 240
tccgccaagc tcaccgatga ccaactgtcc aagctgcgca ccacgcccgg tgtcgcgtcc 300
atcgagcagg acgccgtcat cacggtggac gccacgcaga acaacccgcc gtcgtggggc 360
ctggaccgca tcgaccagac gaacctgccg ctgtcgcgca gctacaccta caattccacc 420
ggcgcgggcg tgaacgccta catcatcgac accggcatct acaccgcgca ctccgacttc 480
ggcggccgcg ccaccaacgt ctacgacgcc ctcggcggca acggccagga ctgcaacggc 540
cacggcaccc acgtcgcggg caccgtcggc ggcgccgcct acggcgtggc caaggcggtc 600
aacctgcgcg gcgtgcgcgt gctcaactgc agcggcagcg gcaccacctc cggtgtcatc 660
gccggcatga actgggtggc cagcaaccac gtcaagcccg ccgtggcgaa catgtcgctg 720
ggcggcggct actcctcctc cctgaacacg gccgccaaca acctggccag ctccggcgtg 780
ttcctggccg tcgccgcggg caacgagacc accaacgcct gcaaccgctc gccggccagc 840
gccgccaacg ccaccacggt cgccgcgagc accagcaccg acgcccgggc ctcctacagc 900
aactacggct cgtgcgtcca cctgtacgcg cccggctcgt ccatcacctc cgcctggctg 960
aacggcggca ccaacaccat cagcggcacg tcgatggcca cgccgcacgt ggccgggacc 1020
gccgccctct acaaggcgac ctacggcgac gcctcgttca gcaccatccg cagctggctg 1080
gtcagcaacg ccacctccgg cgtcatcacc ggcaacgtgt cgggcacccc gaacctgctg 1140
ctgaacaagc gctccctgta a 1161
<210> 5
<211> 386
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Polypeptide sequence
<400> 5
Met Arg Arg Arg Thr Leu Pro Ile Ala Val Leu Ala Ala Val Pro Leu
1 5 10 15
Ala Val Ala Gly Ala Leu Pro Ala Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Val Pro Val Ala Met Ala Ala Ala Gly Gln Gly Val Ala Gly Gln Tyr
35 40 45
Ile Val Thr Leu Lys Lys Gly Val Ser Val Asp Ser Thr Val Ala Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Arg Thr Gln His Arg Phe Gly Lys Val Leu Asn Gly Phe
65 70 75 80
Ser Ala Lys Leu Thr Asp Asp Gln Leu Ser Lys Leu Arg Thr Thr Pro
85 90 95
Gly Val Ala Ser Ile Glu Gln Asp Ala Val Ile Thr Val Asp Ala Thr
100 105 110
Gln Asn Asn Pro Pro Ser Trp Gly Leu Asp Arg Ile Asp Gln Thr Asn
115 120 125
Leu Pro Leu Ser Arg Ser Tyr Thr Tyr Asn Ser Thr Gly Ala Gly Val
130 135 140
Asn Ala Tyr Ile Ile Asp Thr Gly Ile Tyr Thr Ala His Ser Asp Phe
145 150 155 160
Gly Gly Arg Ala Thr Asn Val Tyr Asp Ala Leu Gly Gly Asn Gly Gln
165 170 175
Asp Cys Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Gly Gly Ala
180 185 190
Ala Tyr Gly Val Ala Lys Ala Val Asn Leu Arg Gly Val Arg Val Leu
195 200 205
Asn Cys Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Val Ile Ala Gly Met Asn
210 215 220
Trp Val Ala Ser Asn His Val Lys Pro Ala Val Ala Asn Met Ser Leu
225 230 235 240
Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Leu Asn Thr Ala Ala Asn Asn Leu Ala
245 250 255
Ser Ser Gly Val Phe Leu Ala Val Ala Ala Gly Asn Glu Thr Thr Asn
260 265 270
Ala Cys Asn Arg Ser Pro Ala Ser Ala Ala Asn Ala Thr Thr Val Ala
275 280 285
Ala Ser Thr Ser Thr Asp Ala Arg Ala Ser Tyr Ser Asn Tyr Gly Ser
290 295 300
Cys Val His Leu Tyr Ala Pro Gly Ser Ser Ile Thr Ser Ala Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Gly Thr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His
325 330 335
Val Ala Gly Thr Ala Ala Leu Tyr Lys Ala Thr Tyr Gly Asp Ala Ser
340 345 350
Phe Ser Thr Ile Arg Ser Trp Leu Val Ser Asn Ala Thr Ser Gly Val
355 360 365
Ile Thr Gly Asn Val Ser Gly Thr Pro Asn Leu Leu Leu Asn Lys Arg
370 375 380
Ser Leu
385

Claims (21)

1.一种分离的多肽，其包含与如SEQ ID N°1所示的全长氨基酸序列具有至少94％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有聚酯降解活性。
2.权利要求1的分离的多肽，其包含至少一个在对应于SEQ ID N°1的残基的残基处的选自以下的氨基酸取代：T175C、R247C、N139D、S170R、N143R、N173E、S194P、H197D、L210P、G212N、I217K、R166K、T160A、L138A或其组合。
3.权利要求1或2的分离的多肽，其在20℃至60℃，优选30℃至55℃，更优选40℃至50℃的温度范围内，甚至更优选在45℃下，和/或在5-11的pH范围内，优选在7-10的pH范围内，更优选在8.5-9.5的pH范围内具有活性。
4.权利要求1-3任一项的分离的多肽，其能够降解聚乳酸(PLA)，优选是聚(L-乳酸)(PLLA)。
5.一种分离的多肽，其包含如SEQ ID N°1或SEQ ID N°5所示的氨基酸序列。
6.一种核酸，其编码权利要求1-5任一项的多肽。
7.一种表达盒，其包含权利要求6的核酸。
8.一种载体，其包含权利要求6的核酸或权利要求7的表达盒。
9.一种重组细胞，其含有权利要求6的核苷酸、权利要求7的表达盒、或权利要求8的载体。
10.一种产生权利要求1-5任一项的多肽的方法，其包括(i)培养权利要求9的重组细胞，(ii)回收培养上清液，以及任选地(iii)分离或纯化所述多肽。
11.一种组合物，其包含权利要求1-5任一项的多肽、或权利要求9的重组细胞或其提取物，所述组合物任选地进一步包含至少一种附加的酶和/或微生物或其提取物和/或添加剂。
12.权利要求11的组合物，其选自液体溶液、固体或冻干组合物，优选是冻干粉末。
13.权利要求1-5任一项的多肽、权利要求9的重组细胞或其提取物、或权利要求11或12的组合物的用途，其用于酶促降解含聚酯材料，优选是含PLA材料，甚至更优选是含PLLA材料。
14.一种用于降解含聚酯材料的方法，其中使含聚酯材料与权利要求1-5任一项的多肽、权利要求9的重组细胞或其提取物、或权利要求11或12的组合物接触。
15.权利要求14的方法，其中所述含聚酯材料的至少一种聚酯被解聚成单体和/或寡聚物，并且所述方法任选地包括回收由所述解聚产生的单体和/或寡聚物的附加步骤。
16.权利要求14或15的方法，其包括所述含聚酯材料的预处理步骤以机械和/或物理改性所述含聚酯材料和/或化学和/或生物改性所述含聚酯材料。
17.权利要求14-16任一项的方法，其中所述含聚酯材料包含PLA，更优选是PLLA，并且其中至少乳酸单体和/或寡聚物被回收。
18.一种从含聚酯材料产生单体和/或寡聚物的方法，其包括使含聚酯材料暴露于权利要求1-5任一项的多肽、权利要求9的重组细胞或其提取物、或权利要求11或12的组合物，以及任选地回收单体和/或寡聚物。
19.一种含聚酯材料，其包含至少一种聚酯和权利要求1-5任一项的多肽和/或权利要求9的重组细胞。
20.一种用于制备权利要求19的含聚酯材料的方法，其包括将聚酯与权利要求1-5任一项的多肽和/或权利要求9的重组微生物混合的步骤，其中所述混合步骤在所述聚酯处于部分或完全熔融状态所处的温度下，优选在挤出过程期间进行。
21.一种多肽用于降解含聚酯材料的用途，其中所述多肽包含与如SEQ ID N°1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、92％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有聚酯降解活性。
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