ES2910993T3 - Producción de ARN mediante unas levaduras con partículas pseudovirales recombinantes - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de producción recombinante de ARN mensajero (ARNm) o de ARN largo no-codificante (ARNlnc), que comprende: - el hecho de cultivar unas células de levadura, que han sido modificadas genéticamente para producir unas partículas pseudovirales recombinantes que comprenden dicho ARNm o ARNlnc, y - el hecho de recoger el ARNm o ARNlnc que está contenido en las partículas pseudovirales así formadas, en el que las células de levadura son unas células de una levadura que está naturalmente desprovista de retrotransposón Ty, o que ha sido modificada genéticamente para no producir ningún retrosoma T, en el que las modificaciones genéticas aportadas a estas células de levadura para que produzcan dichas partículas pseudovirales comprenden la transfección de estas células de levadura mediante i. un ácido nucleico que comprende una primera secuencia nucleotídica, y ii. un ácido nucleico que comprende una segunda secuencia nucleotídica, en el que: - el ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. son una sola y misma molécula, o bien dos moléculas distintas o separadas, - la primera secuencia nucleotídica comprende una secuencia de ADN que codifica la expresión de la proteína Gag de un retrotransposón Ty de levadura, - la segunda secuencia nucleotídica comprende una secuencia de ADN cuyo transcrito ARN es: a. la secuencia de dicho ARNm o ARNlnc, enlazada a b. una secuencia de direccionamiento que comprende un fragmento de la secuencia de ARN cuya traducción en aminoácidos es la secuencia de dicha proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura, siendo este fragmento de por lo menos 150 nucleótidos y no comprende el codón de inicio de traducción de esta secuencia de ARN, y no presentando la secuencia de ADN de esta segunda secuencia nucleotídica ningún marco de lectura cuyo primer codón sería el codón ATG, - el ácido nucleico de ii. no comprende ninguna secuencia de ADN cuyo transcrito ARN sería la secuencia de ARN completa de dicha proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura, - la proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura es una proteína Gag de retrotransposón Ty1, Ty2 o Ty3 de levadura, y la secuencia de esta proteína Gag es la secuencia de SEC ID nº: 3 o una secuencia que es idéntica en por lo menos un 90% a la secuencia de SEC ID nº: 3, y - el ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. no comprenden ninguna secuencia que codifica la transcriptasa inversa de un retrotransposón Ty1 de levadura, codificando así el ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. la formación, en dichas células de levadura, de partículas pseudovirales que están formadas por la proteína Gag traducida a partir de la primera secuencia nucleotídica, y que encapsulan dicho ARNm o ARNlnc transcrito a partir de la segunda secuencia nucleotídica.
Description
DESCRIPCIÓN
Producción de ARN mediante unas levaduras con partículas pseudovirales recombinantes
Campo técnico
La solicitud se refiere a la producción de ARN de interés, más particularmente de ARN mensajero (ARNm) de interés, o de ARN largo no codificante (ARNlnc) de interés, mediante unas levaduras recombinantes, más particularmente mediante unas levaduras con partículas pseudovirales recombinantes.
La solicitud se refiere a estas levaduras, así como a las partículas pseudovirales que producen. La solicitud se refiere asimismo a unos medios para su producción, en particular a unos vectores de ácidos nucleicos, y a unos kits, así como a unas aplicaciones médicas, más particularmente vacunales, antitumorales, antiinfecciosas y proregenerativas.
Antecedentes tecnológicos
En la técnica se conocen diferentes métodos de producción de ARN. Estos métodos comprenden, en particular, unos métodos de síntesis in vitro que utilizan, en particular, unas polimerasas de ARN.
La producción de ARN, en particular de ARNm, que son competentes para la traducción en proteínas en unas células de mamífero, plantea el problema particular de modificaciones postranscripcionales tales como la presencia de una cola poliA en el extremo 3', una caperuza 7-metilguanosina (m7G) en el extremo 5', incluso ciertas metilaciones de adeninas y de citosinas.
Los métodos de síntesis in vitro de la técnica anterior proponen, por ejemplo, colocar unos análogos de caperuza en la mezcla transcripcional, tales como m7G5'ppp5'G. Con el fin de estimular la incorporación del dinucleótido al comienzo de la cadena, los métodos de síntesis in vitro de la técnica anterior proponen además reducir la concentración de la guanosina trifosfato (GTP) en la mezcla transcripcional con respecto a los otros nucleósidos trifosfato (NTP), lo cual disminuye la eficacia de la transcripción. Además, el análogo de caperuza se puede incorporar entonces en las dos orientaciones, lo cual da lugar a un 50% de ARN mal encaperuzado. Por lo tanto, estos métodos de síntesis in vitro de ARN son poco eficaces.
Otros métodos de síntesis in vitro proponen utilizar una enzima quimérica que comprende los dominios catalíticos de una ARN trifosfatasa, de una guanililtransferasa, de una N7-guanina metiltransferasa, y de una polimerasa de ARN dependiente de ADN (véase, por ejemplo, el documento WO 2011/128444 a nombre de e UkARYS). Sin embargo, estos métodos de síntesis de ARN in vitro siguen siendo costosos.
Por otro lado, se han desarrollado unos métodos de producción recombinante de ARN. Por ejemplo, un método propone utilizar la maquinaria de la mitocondria, para hacer de ella una unidad de producción y de almacenamiento de ARN (véase, por ejemplo, el documento WO 2010/084372 a nombre de MITOPROD). Sin embargo, los ARN así producidos no presentan ninguna caperuza en el extremo 5', lo cual limita aún más sus aplicaciones médicas. La solicitud propone unos medios de producción de ARN que no adolezcan de todos los inconvenientes de la técnica anterior.
Resumen
La solicitud se refiere a la producción de ARN, más particularmente de ARN mensajero (ARNm) o de ARN largo no codificante (ARNlnc), mediante unas levaduras recombinantes, más particularmente mediante unas levaduras con partículas pseudovirales recombinantes. Las levaduras se han modificado genéticamente para producir unas partículas pseudovirales recombinantes que contienen este ARN, y no retrotranscriben este ARN ni lo retrointegran en su genoma.
El ARN así producido puede presentar, ventajosamente, una cola poliA en el extremo 3', y una caperuza 7-metilguanosina en el extremo 5'. Por lo tanto, pueden ser competentes para una eventual traducción en unas células de mamífero. Además, el ARN se puede producir en cantidades relativamente elevadas.
La solicitud se refiere a estas levaduras, así como a las partículas pseudovirales que producen. La solicitud se refiere asimismo a unos medios para su producción, en particular a unos vectores de ácidos nucleicos y a unos kits, así como a unas aplicaciones médicas, más particularmente vacunales, antitumorales y proregenerativas. Las partículas pseudovirales recombinantes se producen a partir de ciertos elementos de retrotransposón Ty de levadura, pero no retrotranscriben el ARN que contienen. Los elementos de retrotransposón Ty de levadura utilizados comprenden, en particular:
- la proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura, así como
- un fragmento del ARN que corresponde a esta proteína, en este caso un fragmento de este ARN que no comprende el codón de inicio de la traducción [start] de esta secuencia de ARN.
Este fragmento de ARN no está destinado a traducirse en proteína en la levadura: sirve como secuencia de direccionamiento, que guía el ARN (de interés) hacia la proteína Gag, formando así un complejo entre este ARN y la proteína Gag. Este complejo adopta la forma de una partícula, en este caso de una partícula pseudoviral recombinante, que se forma por la polimerización de la proteína Gag, y en la que se encuentra encapsulado el ARN.
Los elementos de retrotransposón Ty de levadura utilizados no comprenden los medios de transcripción inversa de Ty. Más particularmente, no comprenden los medios de integrasa de Ty, o más generalmente los medios de proteína precursora Pol de Ty.
Breve descripción de las figuras
Algunas de las figuras de la solicitud están en color. La solicitud tal como se presentó contiene la versión en color de estas figuras, que puede ser consultada, por lo tanto, mediante inspección del expediente de la solicitud tal como se presentó.
Figura 1A: La figura 1A ilustra la expresión de la proteína Gag (Tyl) en las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces paradoxus. El análisis de la expresión de la proteína Gag se realizó por transferencia de Western anti-Gag (49 kDa) en unas muestras de lisado celular. A diferencia de S. cerevisiae, S. paradoxus está desprovista de retrotransposón Tyl.
Figura 1B: La figura 1B ilustra la medición por citometría de flujo de la expresión de eGFP en la levadura S. paradoxus salvaje (WT), y los mutantes transcripcionales ASpt2l y ASrb2. Después de la transformación de las levaduras con un plásmido que codifica para la eGFP bajo el control de un promotor inducible por galactosa, los mutantes transcripcionales permiten un aumento significativo del número de células eGFP positivas, así como de la intensidad de la fluorescencia (cantidad por célula, de T-bodies (cuerpos T) (partículas pseudovirales) cuya proteína Gag está marcada por eGFP).
WT = S. paradoxus salvaje; ASpt21 = S. paradoxus que ha sufrido una deleción para el gen Spt21; ASrb2 = S. paradoxus que ha sufrido una deleción para el gen Srb2.
Figura 2A: La figura 2A ilustra los análisis por microscopía confocal de fluorescencia de la expresión de eGFP y de la proteína de fusión Gag-eGFP en la levadura S. paradoxus. eGFP = proteína verde fluorescente mejorada; bright field (campo claro) = exposición a la luz transmitida; Ej. 488nm = exposición a una longitud de onda de 488 nm.
Figura 2B: La figura 2B ilustra los análisis por microscopía confocal de fluorescencia de la expresión de la proteína de fusión Gag-eGFP en la levadura S. paradoxus salvaje (WT), y los mutantes transcripcionales ASpt21 y ASrb2.
WT = S. paradoxus salvaje; ASpt21 = S. paradoxus que ha sufrido una deleción para el gen Spt21; ASrb2 = S. paradoxus que ha sufrido una deleción para el gen Srb2.
Figura 2C: La figura 2C ilustra el análisis por citometría de flujo de la expresión de T-bodies (cuerpos T) eGFP (proteína de fusión Gag-eGFP) en el mutante transcripcional de la levadura S. paradoxus ASrb2 después de un tratamiento de 8 horas con tunicamicina (TUNI9. La expresión de los T-bodies está bajo el control de un promotor inducible por galactosa. CTRL = control; -TUNI = sin tunicamicina; TUNI = con tunicamicina.
Figura 3A: La figura 3A ilustra los experimentos de FISH (fluorescence in situ hybridization) para localizar los ARNm modelo que codifican la proteína eGFP, mediante la utilización de cebadores que tienen como diana el ARNm eGFP marcado con fluoróforo Cy5 sobre la levadura S. paradoxus ASrb2 transformada con un plásmido de fusión Gag-eGFP. Bright field= exposición a la luz transmitida; Merge (fusión)= combinación de las imágenes.
Figura 3B: La figura 3B ilustra unos experimentos de FISH (fluorescence in situ hybridization) para localizar los ARNm que codifican la proteína eGFP (ARNm modelos), mediante la utilización de cebadores que tienen como diana el ARNm eGFP marcado con el fluoróforo Cy5 sobre la levadura S. paradoxus ASrb2 transformada con un plásmido de fusión MiniGag-eGFP. Bright field = exposición a la luz transmitida; Merge = combinación de las imágenes.
Figura 4: La figura 4 ilustra la imagen de microscopia electrónica de transmisión de T-bodies tras la extracción
proteica mediante dos técnicas diferentes (a la izquierda: el residuo obtenido mediante el método de lisis con perlas; a la derecha, el residuo obtenido mediante el método de sonicación). Las muestras han sufrido un marcado con acetato de uranilo al 2%.
Figura 5A: La figura 5A ilustra la observación por microscopía confocal de fluorescencia de T-bodies por inmunofluorescencia (anticuerpos antiTyl/GAG) en la levadura S. paradoxus ASrb2 que expresa la proteína Gag, la proteína de fusión 6His-Gag, Gag-6His, 6His-Gag-6His. Bright field = exposición a la luz transmitida; A488nm = exposición a una longitud de onda de 488 nm.
Figura 5B: La figura 5B ilustra la detección de la expresión de la proteína Gag por transferencia de western (anticuerpos antiTyl/Gag) en la levadura S. paradoxus ASrb2 que expresa la proteína Gag, la proteína de fusión 6His-Gag, Gag-6His, 6His-Gag-6His. YAM13Asrb2 = cepa de levadura S. paradoxus YAM13 que ha sufrido una deleción para el gen Srb2.
Figura 5C: La figura 5C ilustra el análisis por transferencia de western (anticuerpos antiTyl/GAG) de las fracciones eluidas por tampones de concentración creciente de imidazol (100 mM, 200 mM, 400 mM, 800 mM). Estas fracciones corresponden a los T-bodies extraídos de cepas de levadura que expresan Gag, 6His-Gag y Gag-6His y después purificados sobre una columna cargada con níquel.
Figura 6A: La figura 6A es una representación esquemática de las construcciones transformadas en la levadura S. paradoxus ASrb2. La primera construcción es responsable de la formación de los T-bodies (i), la segunda es un plásmido que permite la transcripción de un ARN eGFP que dispone de una secuencia «EndGAG» en el extremo 3' que permite el reconocimiento del ARN dentro de los T-bodies (ii).
GAL = promotor galactosa; EndGAG = mini-GAG (= secuencia de direccionamiento hacia el retrosoma).
Figura 6B: La figura 6B ilustra el análisis por citometría de flujo de células dendríticas de ratones (línea DC2.4) que expresan eGFP después de 24 horas de transfección con la ayuda de un ARN eGFP o bien producido por transcripción in vitro (figura de la izquierda), o bien producido a partir de los T-bodies y vectorizado con liposomas catiónicos (Lip100).
SSC-H = altura de difracción de la luz; FL1-H = intensidad medida en verde.
Figuras 7A, 7B y 7C: Las figuras son una representación esquemática de los plásmidos necesarios para la formación de T-bodies cargados con ARN(m) de interés utilizados para modificar la cepa de levadura Tynegativa (S. paradoxus, por ejemplo). El plásmido GAG (figura 7A) y el plásmido ARN (figura 7B) se utilizan juntos para transformar la cepa de levadura Ty-negativa. La secuencia que codifica la proteína Gag (figura 7A) puede estar unida opcionalmente a una secuencia que codifica una etiqueta de purificación (etiqueta de polihistidina o tag 6His), o un marcador de detección (por ejemplo, la proteína fluorescente eGFP). MS2 = secuencia del bacteriófago MS2 (etiqueta de purificación).
La expresión de los dos plásmidos permite la síntesis de la proteína Gag y del ARN(m) de interés. La secuencia de señal SC sobre el plásmido de ARN es una secuencia de direccionamiento retrosomal que permite la formación del complejo ARNm/proteína Gag, que se denomina retrosoma T (o T-body). Esta secuencia de direccionamiento retrosomal puede ser, por ejemplo, una secuencia GAG modificada para no codificar ya la proteína Gag, en particular por deleción del codón de inicio de la transcripción [start] al comienzo de la secuencia (secuencia «miniGag» o «End Gag»).
El plásmido GAG+ARN (figura 7C) permite al mismo tiempo la síntesis de la proteína Gag y del ARNm de interés.
Figura 8: La figura 8 ilustra el estudio de espectrometría de masas de las modificaciones químicas presentes a nivel del ARN mensajero bioproducido. Esta técnica se basa en un análisis por espectrometría de masas (LC-MS) de los fragmentos obtenidos después de la hidrólisis completa por RNasa T1 del ARN estudiado. Las barras de histogramas negras (ARN antes de «pull out» (extracción)) corresponden a la media de 2 muestras de ARN extraídas de T-bodies procedentes de una lisis mecánica. Las barras de histogramas blancas (ARN después de «pull out») corresponden a la media de 2 muestras de ARN extraídas de T-bodies procedentes de una lisis mecánica seguida de un protocolo «pull out» que permite la purificación exclusiva del ARN de interés.
Abreviaturas:
D = dihidrouridina; Psi = pseudouridina; m5U = 5-metiluridina; m5C = 5-metilcitidina; m2G = N2-metilguanosina; m1A = 1-metiladenosina; m1G = 1-metilguanosina; Gm = 2'-O-metilguanosina; m22G = N2,N2-dimetilguanosina; m7G = 7-metilguanosina; Am = 2'-O-metiladenosina; Cm = 2'-O-metilcitidina; mcm5s2U = 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina; m3C = 3-metilcitidina, y m6A = N6-metiladenosina.
Figura 9: La figura 9 ilustra la medición de la actividad de luciferasa (RLU/mg proteínas) sobre células DC2.4 después de 20h de transfección con 50 ng de ARN Luciferasa producido in vitro (barras negras) y bioproducido (RNA TB, barra gris) vectorizado con Lipofectamine Messenger Max (LFM). Los ARN sintetizados in vitro: - no han sufrido modificaciones: U = uridina; NoCAP = ausencia de caperuza y A64 = ninguna reacción de poliadenilación adicional; o
- han sufrido modificaciones: ARCA = adición de una caperuza ARCA; ^ = incorporación del 50 al 100% de restos de pseudouridina, y A64+ = reacción de poliadenilación adicional.
Descripción detallada
La solicitud describe los objetos definidos en las reivindicaciones tales como se presentaron, los objetos descritos a continuación y los objetos ilustrados en la parte de “ejemplos”.
La solicitud se refiere en particular a un procedimiento de producción (recombinante) de ARN, a un procedimiento de producción de una composición farmacéutica, y a unos productos susceptibles de ser utilizados o producidos en estos procedimientos, en particular unos ácidos nucleicos (más particularmente, unos vectores de ácidos nucleicos, tales como unos plásmidos), a unos kits, a unas células recombinantes de bacterias, a unas células recombinantes de levadura, así como a unos complejos, gránulos o partículas pseudovirales recombinantes. La solicitud utiliza algunos elementos de retrotransposón Ty de levadura (pero no todos los elementos de este retrotransposón). En particular, utiliza unos medios de modificaciones genéticas de levadura, que se derivan de la proteína Gag del retrotransposón Ty de levadura y del ARN de esta proteína. La solicitud no utiliza, sin embargo, los medios de transcripción inversa del retrotransposón Ty de levadura.
La solicitud permite en particular producir ARN, en particular ARN mensajeros (ARNm) o ARN largos no codificantes (ARNlnc) que tienen una cola poliA en el extremo 3' y/o una caperuza 7-metilguanosina (m7G) en el extremo 5', incluso una metilación de resto(s) de adenina y/o de citosina y/o de pseudouridina. Los medios de la solicitud permiten además producir estos ARN en cantidad relativamente elevada, y a coste reducido. Por lo tanto, los medios de la solicitud permiten acceder clínicamente a las aplicaciones médicas de los ARN (tales como ARNm y ARNlnc), en particular en el campo de la inmunoterapia y de la terapia génica.
La solicitud se refiere así a un procedimiento de producción (recombinante) de ARN, comprendiendo dicho procedimiento:
- el hecho de cultivar unas células de levadura, que se han modificado genéticamente para producir este ARN, y
- el hecho de recoger este ARN.
Este ARN comprende ventajosamente una secuencia de direccionamiento, a saber una secuencia que le permite dirigirse a una proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura.
Además de la secuencia de direccionamiento, el ARN puede comprender además por lo menos un ARN de interés, tal como por lo menos un ARN de procariota (en particular de bacteria), de virus (en particular de Zika o Influenza), o de eucariota, en particular de eucariota diferente de la levadura (por ejemplo, de humano), y/o por lo menos un ARN artificial o no natural (por ejemplo, un ARN cuya traducción es una secuencia que comprende diferentes epítopos de virus y/o bacterias).
Este ARN puede ser ventajosamente un ARNm o un ARNlnc, más particularmente un ARNm.
Este ARN puede ser un ARN heterólogo a la levadura que lo produce, o incluso heterólogo a las levaduras en general.
Las modificaciones genéticas que se han aportado a las células de levadura para producir este ARN comprenden en particular la transferencia a estas células de levadura (en particular por transfección o transformación) de una construcción de ácido nucleico que codifica la proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura.
Alternativa o complementariamente, más en particular complementariamente, las modificaciones genéticas que se han aportado a las células de levadura para producir este ARN comprenden en particular la transferencia a estas células de levadura (en particular por transfección o transformación) de una construcción de ácido nucleico, cuyo transcrito ARN comprende:
- dicha secuencia de direccionamiento, y/o
- la secuencia de ARN de interés,
más particularmente, cuyo transcrito ARN comprende por lo menos dicha secuencia de direccionamiento, más particularmente, cuyo transcrito ARN comprende la secuencia de un ARN de interés unida a la secuencia de direccionamiento que dirige (o guía) este ARN hacia la proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura.
El ARN (más particularmente el ARNm o el ARNlnc) es producido por las células de levadura con la proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura, en forma de una estructura que se puede calificar de complejo, de gránulo o de partícula pseudoviral.
Se pueden producir así uno o varios ARN diferentes.
La o las, o por lo menos una, de las construcciones de ácido nucleico transferidas pueden estar integradas en el genoma, o bien no estar integradas en el genoma pero estar presentes en el núcleo o el citoplasma, por ejemplo en forma de episoma.
Por ejemplo, una construcción de ácido nucleico que codifica la proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura puede estar integrada en el genoma de la levadura, mientras que la construcción de ácido nucleico, cuyo transcrito ARN comprende dicha secuencia de direccionamiento y/o la secuencia de ARN de interés, puede no estar integrada en el cromosoma (pero estar presente en el núcleo y/o el citoplasma, en particular en forma de episoma). Alternativamente, puede haber sólo una construcción que contenga los dos ácidos nucleicos (ácido nucleico que codifica Gag, y ácido nucleico cuyo transcrito ARN comprende dicha secuencia de direccionamiento y/o la secuencia de ARN de interés), y esta construcción puede estar integrada en el genoma de la levadura, o estar presente en el núcleo o el citoplasma (por ejemplo, en forma de episoma).
La solicitud se refiere así a un procedimiento de producción de ARN (más particularmente de ARNm o de ARNlnc) de interés, comprendiendo dicho procedimiento:
- el hecho de cultivar unas células de levadura, que se han modificado genéticamente para producir unas partículas pseudovirales (recombinantes) que comprenden un ARN cuya secuencia comprende dicha secuencia de direccionamiento y/o el ARN de interés, más particularmente que comprende dicha secuencia de direccionamiento unida a dicho ARN de interés, y
- el hecho de recoger el ARN que está contenido en las partículas pseudovirales (recombinantes) así formadas.
El término procariota se entiende según su significado habitual en el sector. Se refiere en la presente memoria más particularmente a una bacteria, en particular a una bacteria con potencial infeccioso y/o patógeno para la especie humana.
El término virus se entiende según su significado habitual en el sector. Se refiere en la presente memoria más particularmente a un virus, en particular a un virus con potencial infeccioso y/o patógeno para la especie humana, en particular Zika o Influenza.
El término eucariota se entiende según su significado habitual en el sector. Cuando se refiere al ARN, el ARNm, o el ARNlnc de la solicitud, se refiere más particularmente en la presente memoria a un eucariota diferente de la levadura, más particularmente a un eucariota pluricelular, tal como un mamífero (más particularmente un humano o un mamífero no humano), más particularmente un humano.
El término Ty se entiende según su significado habitual en el sector. Se refiere en la presente memoria más particularmente a un retrotransposón Ty1, Ty2, Ty3, Ty4 o Ty5, más particularmente a un retrotransposón Ty1, Ty2 o Ty3, más particularmente a un retrotransposón Ty1.
El término levadura se entiende según su significado habitual en el sector.
Se refiere en la presente memoria más particularmente a una levadura del género Saccharomyces o del género Pichia, más particularmente del género Saccharomyces.
Entre las levaduras del género Saccharomyces, tiene por objetivo más particularmente las especies paradoxus y cerevisiae, en particular la especie paradoxus
Entre las levaduras del género Pichia, tiene por objetivo más particularmente la especie P. pastoris.
Un ejemplo de cepa de S. paradoxus es la cepa que está disponible en la ETCC con el número 76528™. La ATCC®
es la American Type Culture Collection (10801 University Blvd.; Manassas, Virginia 20110-2209; U.S.A.).
Un ejemplo de cepa de S. cerevisiae es la cepa YAM510, que no contiene ningún retrotransposón Ty1 funcional, y que se ha descrito en Rothstein et al. 1983 y Thomas et al. 1989.
Además de haber sido modificadas genéticamente para producir unas partículas pseudovirales (recombinantes), las células de levadura de la solicitud son unas células de una levadura que:
- está naturalmente desprovista de retrotransposón Ty1, o bien que
- está naturalmente provista de retrotransposón Ty1, pero cuya secuencia de retrotransposón Ty1 se ha modificado para no producir o ser deficiente en retrosoma T.
Alternativa o complementariamente, la levadura puede estar desprovista de retrotransposón Ty2 y Ty3, o bien está naturalmente provista de ellos pero se ha modificado genéticamente para no producir ningún retrosoma T, que estaría codificado por un retrotransposón Ty2 o Ty3.
Alternativa o complementariamente, la levadura puede estar desprovista de retrotransposón Ty2, Ty3, Ty4 y Ty5, o bien está naturalmente provista de ellos pero se ha modificado genéticamente para no producir ningún retrosoma T, que estaría codificado por un retrotransposón Ty2, Ty3, Ty4 o Ty5.
Ventajosamente, la levadura es una levadura que está (naturalmente) desprovista de retrotransposón Ty, o bien es una levadura que está naturalmente provista de uno o varios retrotransposones Ty, pero cuya secuencia de este o de estos retrotransposones Ty se ha modificado genéticamente para no producir ningún retrosoma T Ventajosamente, la levadura está desprovista de retrotransposón Ty, o se ha modificado genéticamente para no producir ningún retrosoma T
El hecho de utilizar una levadura que está desprovista de este o estos retrotransposones Ty, o que no produce este o estos retrosomas Ty, permite en particular limitar o evitar que el ARN (ARNm o ARNlnc) producido no sea retrotranspuesto (en ADNc) (y, por lo tanto, limitar o evitar la “pérdida” de ARNm o ARNlnc por una retrotranscripción ADNc no deseada). La levadura Saccharomyces paradoxus es un ejemplo de levadura que está naturalmente desprovista de retrotransposón Ty, en particular de retrotransposón Ty1. S. paradoxus puede, por lo tanto, ser utilizada directamente para transferir ácidos nucleicos de i. y/o ii.
La levadura Pichia pastoris es una levadura que está naturalmente desprovista de retrotransposón Ty, y puede, por lo tanto, ser utilizada directamente para transferir ácidos nucleicos de i. y/o ii.
La levadura Saccharomyces cerevisiae es un ejemplo de levadura que está naturalmente provista de retrotransposones Ty, en particular de un retrotransposón Ty1. Por lo tanto, se debe modificar genéticamente para no producir ningún retrosoma Ty, en particular ningún retrosoma Ty1.
Una modificación genética que permita no producir retrosoma(s) Ty puede comprender, por ejemplo, la deleción (en el cromosoma de la levadura) del promotor de expresión del o de los retrotransposones Ty, y/o una mutación de este cromosoma (por deleción y/o sustitución y/o inserción de uno o varios nucleótidos) que interrumpen por lo menos uno de los marcos de lectura abiertos del o de los retrotransposones Ty.
De acuerdo con la solicitud, las modificaciones genéticas aportadas a las células de levadura para que produzcan dichas partículas pseudovirales (recombinantes) comprenden la transfección o transformación de estas células de levadura por:
i. un ácido nucleico que comprende una primera secuencia nucleotídica, y/o, preferentemente y, ii. un ácido nucleico que comprende una segunda secuencia nucleotídica,
en el que:
- la primera secuencia nucleotídica comprende, o es, una secuencia de ADN que codifica la expresión de la proteína Gag de un retrotransposón Ty de levadura,
- la segunda secuencia nucleotídica comprende, o es, una secuencia de ADN cuyo transcrito ARN comprende:
a. la secuencia de dicho ARN (ARNm o ARNlnc) de interés, y/o
b. dicha secuencia de direccionamiento,
más particularmente cuyo transcrito ARN comprende por lo menos dicha secuencia de direccionamiento,
más particularmente cuyo transcrito ARN comprende:
a. la secuencia de dicho ARN (ARNm o ARNInc) de interés, unida a
b. dicha secuencia de direccionamiento.
El ácido nucleico de i. puede, por ejemplo, estar en forma de episomas que se replican de manera autónoma, o estar integrado en los cromosomas de la levadura.
El ácido nucleico de ii. puede, por ejemplo, estar en forma de episomas que se replican de manera autónoma, o estar integrado en los cromosomas de la levadura.
El ácido nucleico de i. codifica la expresión de la proteína Gag que formará la partícula pseudoviral, o estar comprendido en el polímero proteico que forma esta partícula (véanse las figuras 7A, 7B y 7C).
El ácido nucleico de ii. “codifica” la transcripción del ARN que contiene el ARN de interés a producir, unido a una secuencia ARN de direccionamiento que guía este ARN de interés hacia la proteína Gag de la partícula pseudoviral en formación (véanse las figuras 7A, 7B y 7C).
La combinación de los ácidos nucleicos de i. y ii. produce así una partícula pseudoviral que contiene el ARN de interés (por ejemplo un ARNm o un ARNlnc) (véanse las figuras 7A, 7B y 7C).
El ácido nucleico de ii. (o cada una de las secuencias que contiene) está destinado, por lo tanto, a transcribirse en el ARN en la levadura, pero no está destinado particularmente a traducirse en proteína. El ácido nucleico de ii. (o cada una de las secuencias que contiene) puede, por lo tanto, ser una secuencia que, en una levadura, no puede traducirse en proteína (o polipéptido).
Por el contrario, el ARN así transcrito y producido en la célula de levadura puede ser un ARN que codifica la expresión de una proteína (o de un polipéptido) en una célula de mamífero (por ejemplo un ARN que codifica la expresión de uno o varios antígenos en una célula de mamífero).
La proteína Gag puede ser, en particular:
- la del retrotransposón Ty1 de S. cerevisiae, es decir la proteína de secuencia SEC ID n°: 3, o
- una secuencia que es idéntica en por lo menos el 90% a la secuencia de SEC ID n°: 3 [calculándose el porcentaje de identidad sobre la más larga de las dos secuencias].
Por ejemplo, la proteína Gag puede ser, en particular, una proteína Gag de otro retrotransposón de levadura distinto del retrotransposón Ty1 de S. cerevisiae (retrotransposón de S. cerevisiae distinto de Ty1, y/o retrotransposón de levadura distinto de S. cerevisiae, por ejemplo retrotransposón Ty1 de levadura diferente de S. cerevisiae), cuya secuencia es idéntica en por lo menos el 90% a la secuencia de SEC ID n°: 3.
La proteína Gag del retrotransposón Ty de levadura puede así ser, en particular, una proteína cuya secuencia es la secuencia de SEC ID n°: 3, o una secuencia idéntica en por lo menos el 90% (más particularmente en por lo menos el 95%) a la secuencia de SEC ID n°: 3, y que es una proteína Gag de retrotransposón Ty1, Ty2 o Ty3 de levadura.
En la segunda secuencia nucleotídica, la “secuencia b.” tiene en particular la función de dirigir la “secuencia a.” (en este caso, el ARN de interés) hacia la proteína Gag del retrotransposón Ty, que se produce por la primera secuencia nucleotídica, más particularmente dirigirla hacia un polímero proteico que contiene esta proteína Gag que se sintetiza en la célula de levadura genéticamente modificada.
La segunda secuencia nucleotídica está destinada a transcribirse en ARN, pero no está destinada particularmente a traducirse en proteína en la levadura. En efecto, es en forma de ARN en la que ejerce su función de direccionamiento o de guía. Por lo tanto, la segunda secuencia nucleotídica puede estar desprovista de marco de lectura, cuyo primer codón sería el codón de inicio de la traducción [sfarf] (a Tg ).
Ventajosamente, la secuencia de direccionamiento o “secuencia b.” comprende un fragmento de la secuencia ARN cuya traducción en aminoácidos es la secuencia de dicha proteína Gag del retrotransposón Ty de levadura. Este fragmento puede comprender un fragmento de por lo menos 150 nucleótidos, más particularmente de por lo menos 200 nucleótidos, más particularmente de por lo menos 250 nucleótidos, más particularmente de por lo menos 300 nucleótidos, más particularmente de por lo menos 350 nucleótidos, más particularmente de por lo menos 398 nucleótidos, más particularmente de por lo menos 500 nucleótidos, más particularmente de por lo menos 1000 nucleótidos, más particularmente de por lo menos 1078 nucleótidos. En lo sucesivo, la expresión “por
lo menos 150 nucleótidos” incluye explícitamente cada uno de los umbrales superiores que se han indicado anteriormente (por lo menos 200 nucleótidos, etc.).
Este fragmento puede ser, en particular, el fragmento de una secuencia ARN cuya traducción en aminoácidos sería:
- la secuencia de la proteína Gag de retrotransposón Ty1 de S. cerevisiae, a saber la proteína de SEC ID n°:
3, o
- la secuencia de la proteína Gag de otro retrotransposón de levadura (retrotransposón distinto de Ty1, por ejemplo Ty2 o Ty3, y/o levadura distinta de S. cerevisiae) que es idéntico en por lo menos el 90% a la secuencia de SEC iD n°: 3 (calculándose el porcentaje de identidad sobre la longitud de la más larga de las dos secuencias). Este fragmento de por lo menos 150 nucleótidos puede comprender, en particular, o ser:
- la secuencia de SEC ID n°: 16 (398 nucleótidos), o
- un (sub)-fragmento de por lo menos 150 nucleótidos de la secuencia de SEC ID n°: 16.
Por ejemplo, el fragmento puede comprender:
- la secuencia de SEC ID n°: 18 (1078 nucleótidos), o
- una secuencia que es idéntica en por lo menos el 90% a la secuencia de SEC ID n°: 18 (y que comprende un fragmento de por lo menos 150 nucleótidos de la secuencia ARN cuya traducción en aminoácidos es la secuencia de dicha proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura, más particularmente que comprende la secuencia de SEC ID n°: 16, o un (sub)-fragmento de por lo menos 150 nucleótidos de la secuencia de SEC ID n°: 16) [calculándose el porcentaje de identidad sobre la longitud de la más larga de las dos secuencias].
Ventajosamente, la “secuencia b.” no comprende el codón de inicio de la traducción [start] (AUG) de la secuencia ARN de dicha proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura. En la secuencia ARN cuya traducción sería la secuencia de SEC ID n°: 3 (proteína Gag de Ty1 de S. cerevisiae), este codón de inicio es el codón AUG que es el transcrito del codón ATG en las posiciones 1-3 de la secuencia de SEC ID n°: 2. Este codón de inicio de la traducción puede ser delecionado, o mutado en un codón distinto de “start", por ejemplo en un codón stop (codón de terminación) (UAA, UAG o AGA).
Más generalmente, el fragmento ARN que está comprendido en dicha secuencia b. de direccionamiento, y que es un fragmento de la secuencia ARN cuya traducción en aminoácidos sería la secuencia de dicha proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura, no comprende ventajosamente ningún marco de lectura cuyo primer codón sería un codón de inicio de la traducción (AUG). Más generalmente, este fragmento ARN no comprende ningún marco de lectura que, en una levadura, sería un marco de lectura abierto (esta secuencia está destinada a transcribirse en ARN en la levadura, pero no está desinada particularmente a traducirse en proteína).
Más generalmente, la secuencia de direccionamiento b. no comprende ventajosamente ningún marco de lectura cuyo primer codón sería el codón de inicio de la traducción (AUG). Más generalmente, no comprende ningún marco de lectura que, en una levadura, sería un marco de lectura abierto (esta secuencia está destinada a transcribirse en ARN en la levadura, pero no está destinada particularmente a traducirse en proteína).
Por ejemplo, la “secuencia b.” puede ser o comprender:
- la secuencia de SEC ID n°: 14 o
- una secuencia que es idéntica en por lo menos el 90% a la secuencia de SEC ID n°: 14 (y que comprende un fragmento de por lo menos 150 nucleótidos de la secuencia ARN cuya traducción en aminoácidos sería la secuencia de dicha proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura, más particularmente que comprende la secuencia de SEC ID n°: 16 o un (sub)fragmento de por lo menos 150 nucleótidos de la secuencia de SEC ID n°: 16) [calculándose el porcentaje de identidad sobre la longitud de la más larga de las dos secuencias],
sin comprender por ello el codón de inicio (AUG) de la secuencia ARN de dicha proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura, más generalmente sin comprender ningún marco de lectura cuyo primer codón sería un codón de inicio de la traducción AUG, más generalmente sin comprender ningún marco de lectura abierto.
Complementariamente a la ausencia de este codón de inicio de la traducción, la “secuencia b.” puede comprender uno o varios codones stop (UAA, UAG, o AGA) en por lo menos uno, incluso en cada uno de los tres, marcos de lectura.
Más generalmente, la segunda secuencia nucleotídica no comprende ventajosamente ningún marco de lectura cuyo primer codón sería el codón de inicio de la traducción [ATG], más generalmente no comprende ningún marco de lectura que, en una levadura, sería un marco de lectura abierto (esta secuencia está destinada a transcribirse en ARN en la levadura, pero no está destinada particularmente a traducirse en proteína).
Ventajosamente, el ácido nucleico de ii. no comprende ninguna secuencia de ADN que codifique la secuencia ARN completa de dicha proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura.
El ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. codifican la formación, en (el citoplasma de dichas) dichas células de levadura, de complejos que comprenden:
- (un polímero proteico que comprende) la proteína Gag traducida a partir de la primera secuencia nucleotídica, y
- el ARN (ARNm o ARNlnc) transcrito a partir de la segunda secuencia nucleotídica.
Más particularmente, el ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. codifican la formación, en (el citoplasma de dichas) dichas células de levadura, de gránulos (recombinantes) o de partículas pseudovirales (Virus-Like Particles o VLP) (recombinantes) que:
- están formadas por (un polímero proteico que comprende) la proteína Gag traducida a partir de la primera secuencia nucleotídica, y que
- encapsulan el ARN (ARNm o ARNlnc), transcrito a partir de la segunda secuencia nucleotídica.
El término “código” (y sus equivalentes gramaticales) se entiende en su significado habitual en el sector. Este término se aplica tanto a la expresión de una secuencia de ADN en proteína, es decir, a su transcripción y a su traducción (codones ADN transcritos en codones ARN, y después traducidos en aminoácidos de acuerdo con el código genético universal, y teniendo debidamente en cuenta la degeneración de este código).
Por simplificación, este término se puede aplicar también en este caso a la (simple) transcripción de una secuencia de ADN en secuencia de ARN (por ejemplo, nucleótidos A, T, G y C transcritos en los nucleótidos A, U, G y C, respectivamente), o a la (simple) traducción de una secuencia de ARN en aminoácidos (de acuerdo con el código genético universal, y teniendo debidamente en cuenta la degeneración de este código).
El experto en la materia puede entender que la expresión “codifica la expresión” o “codifica la transcripción” implica la presencia en la secuencia de ADN de secuencia o secuencias que permiten inducir, en particular iniciar, la transcripción, por ejemplo, la presencia de la secuencia de (por lo menos) un promotor.
La primera secuencia nucleotídica comprende, por lo tanto, ventajosamente una secuencia de ADN (o ADNc, o ADNg) que es la secuencia codificante [CDS] del marco de lectura abierto de la proteína Gag de un retrotransposón Ty de levadura, bajo el control de un promotor para la expresión de este marco abierto.
La secuencia de ADN de la segunda secuencia nucleotídica comprende ventajosamente una secuencia de ADN que es el retrotranscrito de una secuencia de ARN que comprende el ARN (ARNm o ARNlnc) de interés, bajo el control de un promotor para la transcripción de este ADN (pero preferentemente sin comprender ningún marco de lectura, que, en una levadura, sería un marco de lectura abierto).
Ventajosamente, el ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. son unos vectores de ácido nucleico, más particularmente unos vectores de ácido nucleico adecuados para la transferencia de ácidos nucleicos a células de levadura, por ejemplo adecuados para la transfección o la transformación de estas células de levadura. El ácido nucleico i. y el ácido nucleico de ii. pueden (cada uno independientemente del otro) ser o no integrativos (es decir, estar o no destinados a integrarse con el cromosoma de la célula que los recibe en transferencia).
La expresión “vector de ácido nucleico” se entiende según su significado habitual en el sector. Está más particularmente dirigida a un plásmido, más particularmente a un plásmido replicativo o un plásmido episómico. Así, el ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. pueden ser, cada uno independientemente del otro, plásmidos, en particular plásmidos episómicos o plásmidos replicativos.
El ácido nucleico de i. puede, por ejemplo, ser un vector de ácido nucleico, en particular un plásmido (episómico o no integrativo), que comprende la primera secuencia nucleotídica como inserto para su transcripción y su traducción en una célula de levadura.
El ácido nucleico de ii. puede, por ejemplo, ser un vector de ácido nucleico, en particular un plásmido (episómico o no integrativo), que comprende la segunda secuencia nucleotídica como inserto para su transcripción en una célula de levadura.
Por ejemplo, el ácido nucleico de i. es un plásmido episómico, mientras que el ácido nucleico de ii. es un plásmido no integrativo, más particularmente un vector replicativo.
El ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. pueden ser una sola y misma molécula, o bien pueden ser dos moléculas distintas o separadas. Por ejemplo, el ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. pueden ser un solo y mismo vector de ácido nucleico, en particular un solo y mismo plásmido, o pueden ser dos vectores de ácido nucleico separados o distintos, en particular dos plásmidos separados o distintos.
Ventajosamente, el ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. están, cada uno (independientemente uno del otro) presentes en varias copias. Ventajosamente, el número de copias del ácido nucleico de ii. es superior (por ejemplo 2, 3, 4, 5 o 6 veces superior) al número de copias del ácido nucleico de i.
La primera secuencia nucleotídica se puede integrar en el genoma de la levadura que ha recibido el ácido nucleico de i. en transferencia, o no integrarse en él.
La segunda secuencia nucleotídica se puede integraren el genoma de la levadura que ha recibido el ácido nucleico de ii. en transferencia, o no integrarse en él.
Por ejemplo, la primera secuencia nucleotídica está integrada en el genoma de la levadura, y la segunda secuencia nucleotídica no está integrada (pero está presente en el núcleo y/o el citoplasma, por ejemplo, al estar comprendida en el ácido nucleico de ii.).
Así, de acuerdo con la solicitud, las modificaciones genéticas aportadas a las células de levadura para que produzcan dichas partículas pseudovirales (recombinantes) comprenden la inserción en estas células de levadura (por ejemplo, por transfección o transformación) de:
i. un ácido nucleico que comprende una primera secuencia nucleotídica, y/o, preferentemente, ii. un ácido nucleico que comprende una segunda secuencia nucleotídica,
en el que:
- el ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. son una sola y misma molécula, o bien dos moléculas distintas o separadas,
- la primera secuencia nucleotídica comprende, o es, una secuencia de ADN que codifica la expresión de la proteína Gag de un retrotransposón Ty de levadura,
- la segunda secuencia nucleotídica comprende, o es, una secuencia de ADN que codifica la transcripción de un ARN cuya secuencia comprende (es decir, una secuencia de ADN cuyo transcrito ARN comprende) una secuencia (de direccionamiento) que comprende un fragmento de por lo menos 150 nucleótidos de la secuencia de ARN de dicha proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura, pero que no comprende el codón de inicio de la traducción (start) AUG de la secuencia de ARN de esta proteína (más generalmente, que no comprende ningún marco de lectura cuyo primer codón sería el codón de inicio de la traducción AUG, más generalmente que no comprende ningún marco de lectura que, en la levadura, sería un marco de lectura abierto),
- el ácido nucleico de ii. no comprende ninguna secuencia de ADN que codifica la secuencia de ARN completa de dicha proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura,
- el ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. no comprenden ninguna secuencia que codifica la transcriptasa inversa de un retrotransposón Ty de levadura.
El ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. codifican así la formación, en (el citoplasma de dichas) dichas células de levadura, de una partícula pseudoviral que está formada por un polímero proteico que comprende la proteína Gag traducida a partir de la primera secuencia nucleotídica, y que encapsula dicho ARN (ARNm o ARNlnc) de interés transcrito a partir de la segunda secuencia nucleotídica.
Además de la secuencia de ADN que codifica la expresión de la proteína Gag de un retrotransposón Ty de levadura, la primera secuencia nucleotídica, el ácido nucleico de i., puede comprender una secuencia de ADN que codifica la expresión de un marcador para la detección de la proteína Gag (por ejemplo, una secuencia de ADN que codifica un marcador fluorescente, por ejemplo un marcador fluorescente unido o fusionado a una proteína fluorescente verde (GFP), en particular una eGFP) y/o la expresión de una etiqueta para la purificación de la proteína Gag (por ejemplo, una secuencia de ADN que codifica una etiqueta de polihistidina y/o la secuencia del bacteriófago MS2, fusionada con la proteína Gag) (véanse las figuras 7A, 7B y 7C).
Además de la secuencia de direccionamiento, la segunda secuencia nucleotídica comprende ventajosamente un ARN (ARNm o ARNlnc) de interés unido a esta secuencia de direccionamiento. La segunda secuencia nucleotídica puede comprender además una secuencia de ADN etiqueta de purificación, tal como una o varias (por ejemplo, tres) copias de la secuencia del bacteriófago MS2 (véanse las figuras 7A, 7B y 7C).
El ácido nucleico de i. puede estar integrado en el genoma de la levadura, o bien no estar integrado en el genoma pero estar presente en el núcleo y/o el citoplasma de la levadura, por ejemplo en forma de episoma.
El ácido nucleico de ii. puede estar integrado en el genoma de la levadura, o bien no estar integrado en el genoma pero estar presente en el núcleo y/o el citoplasma de la levadura. Por ejemplo, el ácido nucleico de i. puede estar integrado en el genoma de la levadura, y el ácido nucleico de ii. puede no estar integrado en el genoma pero estar presente en el núcleo y/o el citoplasma de la levadura, por ejemplo en forma de episoma.
Por ejemplo, el ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. pueden estar ambos integrados en el genoma de la levadura (pueden ser entonces una sola y misma molécula de ácido nucleico).
Más particularmente, la segunda secuencia nucleotídica comprende o es una secuencia de ADN que codifica la transcripción de un ARN cuya secuencia comprende (es decir, una secuencia de ADN cuyo transcrito ARN comprende):
a. la secuencia de dicho ARN (ARNm o ARNlnc) de interés, unida a
b. una secuencia (de direccionamiento) que comprende un fragmento de por lo menos 150 nucleótidos de la secuencia de ARN de dicha proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura, pero que no comprende el codón de inicio (start) AUG de la secuencia de ARN de esta proteína (más generalmente, que no comprende ningún marco de lectura cuyo primer codón sería el codón de inicio de la traducción AUG, más generalmente que no comprende ningún marco de lectura que, en la levadura, sería un marco de lectura abierto).
Más generalmente, el ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. son cada uno ADN. Más generalmente, la primera secuencia nucleotídica y la segunda secuencia nucleotídica son cada una, una secuencia de ADN, más particularmente ADNc. La primera secuencia nucleotídica es (o comprende) una secuencia de ADN que codifica la expresión de la proteína Gag de un retrotransposón Ty de levadura. Comprende, por lo tanto, o es, un marco de lectura abierto que codifica la secuencia de esta proteína.
Más generalmente, en la segunda secuencia nucleotídica, el enlace entre la secuencia a. de dicho ARN (ARNm o ARNlnc) de interés, y la secuencia de direccionamiento b., es un enlace covalente, o un enlace directo, o un enlace covalente y directo. Este enlace puede estar en particular en el extremo 5' o 3' de la secuencia del ARN de interés.
Por ejemplo, la secuencia de direccionamiento b. está enlazada por covalencia al extremo 5' de la secuencia del ARN de interés.
Por ejemplo, la secuencia de direccionamiento b. está enlazada directamente y por covalencia al extremo 3' de la secuencia del ARN de interés.
La primera secuencia nucleotídica contiene ventajosamente (por lo menos) un promotor para su expresión, o para la transcripción y la traducción del marco de lectura abierto que contiene. La primera secuencia nucleotídica puede comprender, por lo tanto, un marco de lectura abierto que codifica la secuencia de la proteína Gag de un retrotransposón Ty de levadura, bajo el control de un promotor para la transcripción y traducción de este marco de lectura abierto en una célula de levadura.
La segunda secuencia nucleotídica contiene ventajosamente (por lo menos) un promotor para su transcripción, en particular para su transcripción en una célula de levadura.
El promotor de la primera secuencia nucleotídica puede ser el mismo que el de la segunda secuencia nucleotídica, o bien puede tratarse de promotores diferentes.
Estos promotores pueden ser, cada uno independientemente del otro, un promotor constitutivo o un promotor inducible (por ejemplo, un promotor inducible por la galactosa).
Estos promotores pueden ser, cada uno independientemente uno del otro, un promotor fuerte, es decir, un promotor al que el complejo de transcripción (y en particular la ARN polimerasa) puede enlazarse para iniciar la transcripción, sin que haya necesariamente intervención de factores adicionales (tales como el factor sigma). Por ejemplo, el promotor de la segunda secuencia nucleotídica puede ser un promotor fuerte. Ventajosamente, el promotor de la primera secuencia nucleotídica es un promotor para la expresión de esta primera secuencia nucleotídica en una célula eucariota, más particularmente una célula de levadura (más particularmente, para la transcripción y la traducción, en una célula eucariota, en particular en una célula de levadura, del marco de lectura abierto que está
contenido en esta primera secuencia nucleotídica). Ventajosamente, el promotor de la segunda secuencia nucleotídica es un promotor para la transcripción de la segunda secuencia nucleotídica en una célula eucariota, más particularmente una célula de levadura.
Se puede utilizar cualquier promotor inducible o constitutivo que el experto en la materia considere adecuado. Unos ejemplos de promotores inducibles comprenden en particular los promotores Gall, GallO, Tet07, Met. Unos ejemplos de promotores constitutivos comprenden en particular los promotores ADH, CYC, PGK1, GPD. Ventajosamente, la primera secuencia nucleotídica contiene (por lo menos) un origen para su replicación, o para la replicación del marco de lectura abierto que contiene.
Asimismo, la segunda secuencia nucleotídica contiene ventajosamente (por lo menos) un origen para su replicación.
El origen de replicación contenido en la primera secuencia nucleotídica es ventajosamente un origen de replicación en procariota y eucariota, más particularmente un origen de replicación en bacterias y levaduras.
Asimismo, el origen de replicación contenido en la segunda secuencia nucleotídica es ventajosamente un origen de replicación en procariota y eucariota, más particularmente un origen de replicación en bacterias y levaduras. De manera ventajosa, las células de levadura son unas células de levadura que no comprenden ninguna secuencia nucleotídica que permitiría la retrotransposición del ARN (ARNm o ARNlc) de interés. Un objetivo en la presente memoria es limitar o evitar la pérdida de los ARN (ARNm o ARNlnc) producidos por su retrotranscripción en ADNc. Así, de manera ventajosa, el ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. no comprenden ninguna secuencia que codifique la transcriptasa inversa de un retrotransposón Ty de levadura, más generalmente cualquier secuencia que codifique la expresión de una transcriptasa inversa.
En otras palabras, la secuencia del ácido nucleico de i. y la secuencia del ácido nucleico de ii. están ventajosamente:
- desprovistas de marco de lectura abierto, que codificaría la transcriptasa inversa de un retrotransposón Ty de levadura, o más generalmente una transcriptasa inversa, y/o
- están desprovistas de promotor de expresión de dicha transcriptasa.
Alternativa o complementariamente, el ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. pueden estar desprovistos de secuencia que codifique la expresión de una integrasa de retrotransposón Ty de levadura, más generalmente de cualquier secuencia que codifique la expresión de una integrasa. En otras palabras, la secuencia del ácido nucleico de i. y la secuencia del ácido nucleico de ii. pueden estar desprovistas de marco de lectura abierto, que codifica la integrasa de un retrotransposón Ty de levadura, o más generalmente una integrasa, y/o pueden estar desprovistas de promotor de expresión de dicha integrasa.
El ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. pueden además estar desprovistos de secuencia que codifique la expresión de una proteasa de retrotransposón Ty de levadura, más generalmente de cualquier secuencia que codifique la expresión de una proteasa. En otras palabras, la secuencia del ácido nucleico de i. y la secuencia del ácido nucleico de ii. pueden estar desprovistas de marco de lectura abierto, que codifica la proteasa de un retrotransposón Ty de levadura, o más generalmente una proteasa, y/o pueden estar desprovistas de promotor de expresión de dicha proteasa.
El ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. pueden estar, por lo tanto, desprovistos de secuencia que codifique la expresión de la proteína Pol de retrotransposón Ty de levadura, más generalmente de cualquier secuencia que codifica la expresión de una proteína Pol.
En otras palabras, la secuencia del ácido nucleico de i. y la secuencia del ácido nucleico de ii. pueden estar desprovistas de marco de lectura abierto, que codifica la proteína Pol de un retrotransposón Ty de levadura, o más generalmente una proteína Pol, y/o pueden estar desprovistas de promotor de expresión de dicha proteína Pol. Dicho ARN (ARNm o ARNlnc) de interés puede estar, en particular, en la cepa de levadura utilizada, incluso en el conjunto de las levaduras.
Dicho ARN (ARNm o ARNlnc) de interés puede ser, en particular:
- un ARN (ARNm o ARNlnc) de procariota, en particular de bacteria,
- un ARN (ARNm o ARNInc) de virus, en particular de Zika o Influenza, o
- un ARN (ARNm o ARNInc) de eucariota diferente de la levadura, en particular de humano, o
- un ARN artificial o no natural, tal como, por ejemplo, un ARN cuya traducción es un polipéptido o proteína que comprende unos epítopos de proteínas de diferentes microorganismos (por ejemplo, unos epítopos de diferentes bacterias y/o virus), en particular unos epítopos de antígenos (en particular unos epítopos de proteínas de diferentes microorganismos, que son antigénicos en humanos),
- un ARN artificial o no natural, tal como, por ejemplo, un ARN cuya traducción es un polipéptido o proteína que comprende diferentes epítopos de por lo menos una proteína de un mismo microorganismo (por ejemplo, unos epítopos de bacterias y/o virus), en particular unos epítopos de antígenos (en particular, unos epítopos de proteínas de un microorganismo, que son antigénicos en humanos,
más particularmente
- un ARN (ARNm o ARNlnc) de virus, en particular de Zika o Influenza, o
- un ARN (ARNm o ARNlnc) de eucariota diferente de la levadura, en particular de humano,
- un ARN artificial o no natural, tal como, por ejemplo, un ARN cuya traducción es un polipéptido o proteína que comprende unos epítopos de proteínas de diferentes microorganismos (por ejemplo, unos epítopos de diferentes bacterias y/o virus), en particular unos epítopos de antígenos (en particular unos epítopos de proteínas de diferentes microorganismos, que son antigénicos en humanos),
más particularmente un ARN (ARNm o ARNlnc) de eucariota diferente de la levadura, en particular de humanos. Dicho ARN (ARNm o ARNlnc) de interés puede comprender por lo menos 120 nucleótidos, en particular por lo menos 150 nucleótidos, en particular por lo menos 180 nucleótidos, en particular por lo menos 210 nucleótidos, en particular por lo menos 240 nucleótidos, en particular por lo menos 270 nucleótidos, en particular por lo menos 2300 nucleótidos.
Alternativa o complementariamente, dicho ARN (ARNm o ARNlnc) a producir puede comprender menos de 6000 nucleótidos, menos de 5800 nucleótidos, en particular menos de 5000 nucleótidos, en particular menos de 4000 nucleótidos, en particular menos de 3000 nucleótidos, en particular menos de 2000 nucleótidos, en particular menos de 1800 nucleótidos.
Se consideran explícitamente en la presente memoria todas las combinaciones de número mínimo y número máximo de nucleótidos. Dicho ARN (ARNm o ARNlnc) de interés puede comprender, por ejemplo, por lo menos 150 nucleótidos, y menos de 2000 nucleótidos.
Dicho ARN (ARNm o ARNlnc) de interés puede codificar en particular (es decir, la traducción proteica de su secuencia puede ser la de):
- una proteína o un polipéptido de bacteria,
- una enzima de edición genómica (tal como Cas9, transposasa),
- una proteína o un polipéptido de virus,
- un factor de transcripción (de eucariota diferente de levadura, en particular humano),
- un factor de crecimiento (de eucariota diferente de levadura, en particular humano),
- una proteína CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) (humana),
- un anticuerpo (policlonal o monoclonal), o fragmento de anticuerpo (en particular Fv, Fab o F(ab')2)), en particular un intra-anticuerpo [intrabody] o un anticuerpo humanizado, o
- un polipéptido que comprende por lo menos un epítopo (bacteriano o viral), en particular varios epítopos (bacterianos y/o virales) separados eventualmente por secuencias espaciadoras,
más particularmente
- una proteína o un polipéptido de virus,
- un factor de transcripción (de eucariota diferente de levadura, en particular humano),
- un factor de crecimiento (de eucariota diferente de levadura, en particular humano),
- una proteína CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) (humana),
- un anticuerpo (policlonal o monoclonal), o fragmento de anticuerpo (en particular Fv, Fab o F(ab')2)), en particular un intra-anticuerpo [intrabody] o un anticuerpo humanizado,
más particularmente
- un factor de transcripción (de eucariota diferente de levadura, en particular humano),
- un factor de crecimiento (de eucariota diferente de levadura, en particular humano),
- una proteína CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) (humana),
- un anticuerpo (policlonal o monoclonal), o fragmento de anticuerpo (en particular Fv, Fab o F(ab')2)), en particular un intra-anticuerpo [intrabody] o un anticuerpo humanizado, más particularmente un factor de transcripción (de eucariota diferente de levadura, en particular humano) o un factor de crecimiento (de eucariota diferente de levadura, en particular humano).
Se pueden producir varios ARN (ARNm o ARNlnc) diferentes en la misma célula recombinante de levadura. Cada uno de estos diferentes ARN tiene una segunda secuencia nucleotídica que le es propia (secuencia de ADN cuyo transcrito ARN comprende la secuencia ARN de interés unida a una secuencia de direccionamiento). Cada una de estas segundas secuencias nucleotídicas puede estar comprendida o ser llevada sobre la misma molécula de ácido nucleico de ii., o sobre moléculas distintas de ácido nucleico de ii.
La levadura que se ha modificado genéticamente para producir los complejos, gránulos o partículas pseudovirales (recombinantes) de la solicitud puede presentar ventajosamente unas mutaciones genéticas, en particular cromosómicas, que están destinadas a estimular o incrementar la producción de estas partículas pseudovirales. Puede tratarse, por ejemplo, de una o varias mutaciones de genes de levadura, que comprenden una o varias mutaciones seleccionadas de entre:
- la sustitución de uno o varios codones cada uno por otro codón o por otro triplete de nucleótidos, y - la deleción de uno o varios nucleótidos.
Los genes de levadura pueden ser, por ejemplo, uno o varios genes de entre los genes Rpbl, Spt21, Srb2 y Srb5. Por ejemplo, el gen Rpbl puede comprender una sustitución de codones que confiere la mutación de aminoácido C67Y, C70Y o H80Y. Por ejemplo, el gen Rpbl de la cepa puede ser sustituido por el gen Rpbl de otra cepa de levadura, en particular de otra cepa de levadura que pertenezca al mismo género de levadura, y que porte por lo menos una de estas sustituciones de codones. Por ejemplo, el gen Rpbl de S. paradoxus se puede reemplazar por el gen Rpbl de S. cerevisiae, en el que se ha introducido una o varias de las mutaciones de codones que confieren las mutaciones de aminoácidos C67y , C70Y y H80Y.
Por ejemplo, uno o varios de los genes Spt21, Srb2 y Srb5 pueden ser (por lo menos parcialmente) delecionados [ASpt21, ASrb2 y ASrb5\.
Por ejemplo, la levadura puede ser una levadura de la cual:
- el gen Rpbl comprende el reemplazo de codón o codones por un codón o codones que confieren una (o varias) de las mutaciones de aminoácidos C67Y, C70Y y H80Y (o se ha reemplazado por el gen Rpbl de otra cepa de levadura, en la que se ha realizado por lo menos uno de estos reemplazos), y de la cual - uno o varios de los genes Spt21, Srb2 y Srb5 son delecionados (por lo menos parcialmente delecionados, por lo menos suficientemente delecionados para no producir más ninguna proteína).
Por ejemplo, la levadura puede ser una cepa de S. paradoxus (que está naturalmente desprovista de Ty, en particular de Ty1 (cepa Ty0)), que es:
- Rpbl C67Y,
- Rpbl C70Y,
- Rpbl H80Y,
- ASrb2,
- ASpt21,
- ASrb2 y ASpt21,
- Rpbl C67Y ASrb2,
- Rpbl C70Y ASrb2,
- Rpbl H80Y ASrb2,
- Rpbl C67Y ASpt21,
- Rpbl C70Y ASpt21,
- Rpbl H80Y ASpt21,
- Rpbl C67Y ASrb2 ASpt21,
- Rpbl C70Y ASrb2 ASpt21, o
- Rpbl H80Y ASrb2 ASpt21.
Puede tratarse, por ejemplo, de una cepa de S. cerevisiae (que se ha modificado genéticamente para no producir ningún retrosoma T (cepa Ty0), y) que es (además) modificada genéticamente para ser:
- Rpbl C67Y,
- Rpbl C70Y,
- Rpbl H80Y,
- ASrb2,
- ASpt21,
- ASrb2 ASpt21,
- C67Y ASrb2,
- C70Y ASrb2,
- Rpbl H80Y ASrb2,
- Rpbl C67Y ASpt21,
- Rpbl C70Y ASpt21,
- Rpbl H80Y ASpt21,
- Rpbl C67Y ASrb2 ASpt21,
- Rpbl C70Y ASrb2 ASpt21, o
- Rpbl H80Y ASrb2 ASpt21.
Alternativamente o además de las mutaciones genéticas, en particular cromosómicas, que están destinadas a estimular o incrementar la producción de estas partículas pseudovirales, se pueden utilizar uno o más productos para estimular o incrementar esta producción. Este o estos productos pueden estar presentes en particular en el medio de transfección o de cultivo en el que se coloca la levadura.
Las células (recombinantes) de levadura que han sido modificadas genéticamente para, en particular, comprender los ácidos nucleicos de i. y de ii. se pueden colocar en condiciones que permitan que el ácido nucleico de i. (en la primera secuencia nucleotídica) exprese la proteína Gag que codifica, y que el ácido nucleico de ii. (en la segunda secuencia nucleotídica) transcriba el ARN que codifica.
En particular, se pueden colocar sobre o en un medio de cultivo adecuado para el crecimiento o multiplicación de levaduras (véase más adelante). Si la primera secuencia nucleotídica y/o la segunda secuencia nucleotídica llevan unos promotores inducibles, este medio puede comprender, en particular, cualquier compuesto o producto que fuera necesario para la inducción del o de estos promotores.
Los complejos, gránulos, o partículas pseudovirales producidos por las células (recombinantes) de levadura se recogen, por ejemplo mediante lisis de las células, en particular mediante lisis química o mecánica (con perlas, en lugar de por sonicación), y los ARN contenidos en estos complejos, gránulos o partículas pseudovirales, y en particular los ARNm o ARNlnc así contenidos, se purifican.
Alternativamente, los ARN contenidos en estos complejos, gránulos o partículas pseudovirales (recombinantes), y en particular los ARNm o ARNlnc contenidos en ellos, se extraen o purifican directamente de las células de levadura, sin extracción o recogida previa de los complejos, gránulos o partículas pseudovirales que los contienen.
Se pueden producir así grandes cantidades de ARN (ARNm o ARNlnc), por ejemplo por lo menos 0,9 gramos de A r N (ARNm o ARNlnc) por litro de cultivo de levadura.
Ventajosamente, el ARN, que está presente o producido en el complejo, gránulo, partícula pseudoviral de la solicitud, comprende unas modificaciones postranscripcionales que lo hacen competente para una traducción en células de mamífero. Ventajosamente, el ARN del complejo, gránulo, partícula pseudoviral de la solicitud puede estar provisto de una cola poliA en el extremo 3'.
Ventajosamente, el ARN del complejo, gránulo, partícula pseudoviral de la solicitud puede estar provisto de una caperuza en el extremo 5', más particularmente de una caperuza tal como la conoce el experto en la materia, más
particularmente de una caperuza que comprende una 7-metilguanosina (unida al ARNm por tres fosfatos en configuración 5'-5'). Esta caperuza puede bloquear la acción de las exonucleasas y puede ser necesaria para estimular la (futura) traducción del ARN de interés (ARNm o ARNlnc) en las células de mamíferos.
Ventajosamente, el ARN del complejo, gránulo, partícula pseudoviral de la solicitud puede estar metilado, en particular a nivel de uno o varios de sus restos de adenina y/o citosina y/o pseudouridina, en particular a nivel de uno o varios de sus restos de adenina y/o citosina.
Ventajosamente, el ARN, que está presente o producido en el complejo, gránulo, partícula pseudoviral de la solicitud, comprende unas modificaciones postranscripcionales de tipo metilación de resto(s) de citosina y/o adenina y/o pseudouridina, más particularmente de resto(s) de citosina y/o adenina que aumentan su eficacia de traducción en células de mamífero.
Por lo tanto, los medios de la solicitud son particularmente adecuados para la producción de ARN (ARNm o ARNlnc) que está destinado a una administración en una eucariota, en particular una eucariota pluricelular, en particular un mamífero, en particular un humano.
Se han depositado varios ejemplos de cepas de levadura de acuerdo con la solicitud en la CNCM (véase más adelante).
La solicitud se refiere también a cada uno de los medios utilizados o producidos por el método de producción de ARN descrito en este documento, así como a su utilización en la producción de ARNm o ARNlnc que presentan una cola poliA en el extremo 3' y/o una caperuza 7-metilguanosina en el extremo 5' (incluso una metilación de resto(s) de adenina y/o citosina y/o pseudouridina, en particular de resto(s) de adenina y/o citosina).
La solicitud se refiere así al ácido nucleico de i. tal como se describe en este documento.
La solicitud se refiere asimismo al ácido nucleico de ii. tal como se describe en este documento.
La solicitud se refiere así a la asociación del ácido nucleico de i. y del ácido nucleico de ii. tal como se describe en este documento, y a su asociación para una utilización simultánea, separada o diferida en el tiempo, más particularmente para su utilización simultánea, separada o diferida en el tiempo en la transfección o transformación de células de levaduras, más particularmente de células de levadura como se describen en este documento. Más particularmente, la solicitud se refiere a un kit que comprende un ácido nucleico i. y/o, preferentemente, un ácido nucleico ii. tal como se describe en este documento. Este kit está adaptado especialmente a la producción recombinante de ARN, en particular de ARNm o de ARNlnc, como se describen en este documento.
Ventajosamente, el kit no comprende ninguna proteína o ácido nucleico que permita la retrotransposición del ARNm o ARNlnc a producir, más particularmente su retrotransposición en una célula de levadura.
Ventajosamente, el kit no comprende ninguna transcriptasa inversa de retrotransposón Ty de levadura, ni ácido nucleico que codifique dicha transcriptasa inversa.
Alternativa o complementariamente, el kit no comprende ninguna integrasa de retrotransposón Ty de levadura, ni ácido nucleico que codifique dicha integrasa. Ventajosamente, el kit no comprende ninguna proteasa de retrotransposón Ty de levadura, ni ácido nucleico que codifique dicha proteasa.
Más generalmente, el kit puede no comprender ninguna transcriptasa inversa, ni ácido nucleico que codifique una transcriptasa inversa.
Más generalmente, el kit puede no comprender ninguna integrasa, ni ácido nucleico que codifique una integrasa. Más generalmente, el kit puede no comprender ninguna proteasa, ni ácido nucleico que codifique una proteasa. La solicitud se refiere así a un kit (que está adaptado especialmente a la realización del procedimiento de producción recombinante de ARN de la solicitud), que comprende:
i. por lo menos un ácido nucleico que comprende una primera secuencia nucleotídica y/o, preferentemente y, ii. por lo menos un ácido nucleico que comprende una segunda secuencia nucleotídica,
tales como se describen en este documento, más particularmente para una utilización simultánea, separada o diferida en el tiempo.
Más particularmente, el ácido nucleico de i. y/o (preferentemente y) el ácido nucleico de ii. del kit se pueden definir de la siguiente manera:
- la primera secuencia nucleotídica comprende una secuencia de ADN que codifica la expresión de la proteína Gag de un retrotransposón Ty de levadura,
- la proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura es una proteína Gag de retrotransposón Ty1, Ty2 o Ty3 de levadura (Ty de levadura, en particular Ty1, Ty2 o Ty3 de levadura, en particular Ty1, Ty2, Ty3, Ty4 o Ty5 de levadura), y la secuencia de esta proteína Gag es la secuencia de SEC ID n°: 3 o una secuencia que es idéntica en por lo menos un 90% a la secuencia de SEC ID n°: 3,
- la segunda secuencia nucleotídica comprende una secuencia de ADN que comprende la secuencia de SEC ID n°: 16 o un fragmento de por lo menos 150 nucleótidos de la secuencia de SEC ID n°: 16, y ventajosamente no comprende ningún marco de lectura cuyo primer codón sería el codón de inicio de la traducción (ATG) (o más generalmente, no comprende ningún marco de lectura que, en la levadura, sería un marco de lectura abierto)
- el ácido nucleico que comprende la segunda secuencia nucleotídica no comprende ninguna secuencia de ADN cuyo transcrito ARN sería la secuencia de ARN completa de dicha proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura, y
- el ácido nucleico que comprende la primera secuencia nucleotídica y el ácido nucleico que comprende la segunda secuencia nucleotídica son una sola y misma molécula, o bien dos moléculas distintas o separadas.
El kit puede no comprender ninguna transcriptasa inversa de retrotransposón Ty de levadura, ni ácido nucleico que codifique dicha transcriptasa inversa, ni ácido nucleico que comprenda una secuencia que codifique dicha transcriptasa inversa.
Un kit de la solicitud puede comprender además una o más células de una levadura tal como se describe en este documento, más particularmente una o más células de una levadura:
- que está desprovista de retrotransposón Ty1 o que está naturalmente provista de una secuencia de retrotransposón Ty1 pero cuya secuencia de retrotransposón Ty1 se ha modificado genéticamente para no producir ningún retrosoma T, o más generalmente de una levadura
- que está desprovista de retrotransposón Ty o que se ha modificado genéticamente para no producir ningún retrosoma T.
La o las células de levadura del kit pueden ventajosamente no comprender ninguna proteína que permita la retrotransposición del ARN (ARNm o ARNlnc) a producir (transcriptasa inversa, en particular), o ácido nucleico que codifique dicha proteína. Ventajosamente, la o las células de levadura del kit no comprenden ninguna transcriptasa inversa de retrotransposón Ty de levadura, ni ácido nucleico que codifique dicha transcriptasa inversa.
Alternativa o complementariamente, la o las células de levadura del kit no comprenden ninguna integrasa de retrotransposón Ty de levadura, ni ácido nucleico que codifique dicha integrasa.
Ventajosamente, la o las células de levadura del kit no comprenden ninguna proteasa de retrotransposón Ty de levadura, ni ácido nucleico que codifique dicha proteasa.
Más generalmente, la o las células de levadura del kit pueden no comprender ninguna transcriptasa inversa, ni ácido nucleico que codifique una transcriptasa inversa.
Más generalmente, la o las células de levadura del kit pueden no comprender ninguna integrasa, ni ácido nucleico que codifique una integrasa.
Más generalmente, la o las células de levadura del kit pueden no comprender ninguna proteasa, ni ácido nucleico que codifique una proteasa.
Por supuesto, la levadura del kit puede comprender una o varias copias de por lo menos uno de entre el ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii.
Un kit de la solicitud puede comprender, por ejemplo:
- una o más células de una levadura tal como se describe en este documento, comprendiendo esta o estas células la primera secuencia nucleotídica (integrada) en sus cromosomas; y
en forma distinta o separada,
- el ácido nucleico de ii. (o la segunda secuencia nucleotídica), por ejemplo en forma de un vector no integrativo, más particularmente de un vector replicativo.
El kit puede comprender además un prospecto que contenga unas instrucciones para su utilización en la transfección o transformación de células de levaduras, y/o para su utilización en la producción (recombinante) de ARN, más particularmente de ARNm o ARNlnc, tal como se describe en este documento, en particular para esta producción en células de levadura.
El kit puede comprender, en particular, un prospecto que contenga unas instrucciones para modificar genéticamente células de una levadura, en particular de una levadura tal como se describe en este documento (o, llegado el caso, tal como la contenida en el kit), comprendiendo estas modificaciones genéticas la transfección o transformación de estas células de levadura por los ácidos nucleicos i. y ii. del kit.
El kit se puede utilizar ventajosamente para la producción de ARNm o ARNlnc que presenta una cola poliA en el extremo 3' y/o una caperuza 7-metilguanosina en el extremo 5' (incluso una metilación de resto(s) de adenina y/o citosina y/o pseudouridina, en particular de resto(s) de adenina y/o citosina).
La solicitud se refiere asimismo a una célula de bacteria que se ha modificado genéticamente para comprender el ácido nucleico de i. y/o, preferentemente y, el ácido nucleico de ii., tales como se describen en este documento, en particular para comprenderlos en su citoplasma. La solicitud se refiere asimismo a una pluralidad de dichas células de bacterias, y en particular a una cepa de bacteria cuyas células comprenden, o son, dichas células. La bacteria puede ser, por ejemplo, Escherichia, en particular E. coli, por ejemplo la bacteria E. coli DH5a, que está disponible en el ATCC bajo el numero 67877™.
La o las células de bacteria se pueden utilizar ventajosamente para amplificar los ácidos nucleicos de i. y/o de ii., por ejemplo antes de transferirlas a una célula de levadura.
La solicitud se refiere asimismo a un medio de cultivo de microorganismos, en particular a un medio artificial de cultivo de bacterias, que comprende por lo menos una célula de bacteria de la solicitud o por lo menos una cepa de bacteria de la solicitud.
Este medio puede estar, por ejemplo, en forma líquida o sólida.
La composición de este medio de cultivo puede ser la de un medio de cultivo adecuado para el crecimiento o multiplicación bacteriana. Comprende, en particular, uno o varios elementos de entre la triptona, el extracto de levadura y NaCl, más particularmente por lo menos el extracto de levadura, más particularmente por lo menos el extracto de levadura y la triptona. Por ejemplo, la composición de este medio de cultivo puede ser en particular, o comprender, la de un medio SOB (Super Optimal Broth), de un medio SOC (Super Optimal broth with Catabolite repression), o de un medio LB (Lysogeny Broth). Este tipo de composición de medio de cultivo es bien conocido por el experto en la materia.
Un medio SOB puede comprender, por ejemplo, triptona y extracto de levadura, por ejemplo: un 2% w/v triptona, un 0.5% w/v de extracto de levadura, 8,56 de 10 mM de NaCl, 2.5 mM de KCl, 10 mM de MgCh, 10 mM de MgSO4 , H2 O csp 1000 ml.
Un medio SOC puede diferir de un medio SOB solo por la adición de un azúcar, por ejemplo glucosa, por ejemplo 20 mM de glucosa.
Un medio LB puede comprender, por ejemplo, triptona, extracto de levadura y NaCl.
El medio de cultivo se puede utilizar ventajosamente para la producción de ARNm o ARNlnc que presenta una cola poliA en el extremo 3' y/o una caperuza 7-metilguanosina en el extremo 5' (incluso una metilación de adenina y/o citosina y/o pseudouridina, en particular de resto(s) de adenina y/o citosina).
La solicitud se refiere asimismo a una célula de levadura que se ha modificado genéticamente para comprender el ácido nucleico de i. y/o, preferentemente y, el ácido nucleico de ii. tales como se describen en este documento, en particular para comprender estos ácidos nucleicos en su núcleo (incluidos sus cromosomas) y/o su citoplasma.
La solicitud se refiere así a una célula de levadura (recombinante) (que está adaptada especialmente para la realización del procedimiento de producción recombinante de ARN de la solicitud), y que está caracterizada por que:
- la célula de levadura está desprovista de retrotransposón Ty1, Ty2 y Ty3 (Tyl, más particularmente Ty1, Ty2 y Ty3, más particularmente de retrotransposones Ty1, Ty2, Ty3, Ty4 y Ty5 de levadura, más particularmente de cualquier retrotransposón de levadura), y
- la célula de levadura no comprende ninguna transcriptasa inversa de retrotransposón Ty de levadura, ni ácido nucleico que codifique dicha transcriptasa inversa, ni ácido nucleico que comprenda una secuencia que codifique dicha transcriptasa inversa, ni ácido nucleico que comprenda una secuencia que codifique dicha transcriptasa inversa,
- la célula de levadura se ha modificado genéticamente para comprender:
i. por lo menos un ácido nucleico que comprende una primera secuencia nucleotídica y/o, preferentemente y,
ii. por lo menos un ácido nucleico que comprende una segunda secuencia nucleotídica, como se describen en este documento.
Más particularmente, en la célula de levadura, el ácido nucleico de i. y/o el ácido nucleico de ii. se pueden definir de la siguiente manera:
- la primera secuencia nucleotídica comprende una secuencia de ADN que codifica la expresión de la proteína Gag de un retrotransposón Ty de levadura,
- la proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura es una proteína Gag de retrotransposón Ty1, Ty2 o Ty3 de levadura (Ty de levadura, en particular Ty1, Ty2 o Ty3 de levadura, en particular Ty1, Ty2, Ty3, Ty4 o Ty5 de levadura), y la secuencia de esta proteína Gag es la secuencia de SEC ID n°: 3 o una secuencia que es idéntica en por lo menos un 90% a la secuencia de SEC ID n°: 3,
- la segunda secuencia nucleotídica comprende una secuencia de ADN cuyo transcrito ARN comprende la secuencia de SEC ID n°: 16 o un fragmento de por lo menos 150 nucleótidos de la secuencia de SEC ID n°: 16, y ventajosamente no comprende ningún marco de lectura cuyo primer codón sería el codón de inicio de la traducción (ATG) (o más generalmente, no comprende ningún marco de lectura que, en la levadura, sería un marco de lectura abierto),
- el ácido nucleico que comprende la segunda secuencia nucleotídica no comprende ninguna secuencia de ADN cuyo transcrito ARN sería la secuencia de ARN completa de dicha proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura, y
- el ácido nucleico que comprende la primera secuencia nucleotídica y el ácido nucleico que comprende la segunda secuencia nucleotídica son una sola y misma molécula, o bien dos moléculas distintas o separadas.
Por ejemplo, la célula de levadura puede comprender la primera secuencia nucleotídica, más particularmente la primera secuencia nucleotídica integrada en sus cromosomas. Esta célula de levadura puede comprender además el ácido nucleico de i. en su núcleo y/o citoplasma, en forma no integrada en sus cromosomas, por ejemplo en forma de un plásmido replicativo.
Ventajosamente, esta célula de levadura es una célula de una levadura:
- que está (naturalmente) desprovista de retrotransposón Ty1, o que está naturalmente provista de una secuencia de retrotransposón Ty1 pero cuya secuencia de retrotransposón Ty1 se ha modificado genéticamente para no producir ningún retrosoma T, o más generalmente
- que está (naturalmente) desprovista de retrotransposón Ty o que se ha modificado genéticamente para no producir ningún retrosoma T.
La célula de levadura puede, ventajosamente, no comprender ninguna proteína que permita la retrotransposición del ARNm o ARNlnc a producir (transcriptasa inversa, en particular), o ácido nucleico que codifique dicha proteína. Ventajosamente, la célula de levadura no comprende ninguna transcriptasa inversa de retrotransposón Ty de levadura, ni ácido nucleico que codifique dicha transcriptasa inversa. Alternativa o complementariamente, la célula de levadura no comprende ninguna integrasa de retrotransposón Ty de levadura, ni ácido nucleico que codifique dicha integrasa. Ventajosamente, la célula de levadura no comprende ninguna proteasa de retrotransposón Ty de levadura, ni ácido nucleico que codifique dicha proteasa.
Más generalmente, la célula de levadura puede no comprender ninguna transcriptasa inversa, ni ácido nucleico que codifique una transcriptasa inversa.
Más generalmente, la célula de levadura puede no comprender ninguna integrasa, ni ácido nucleico que codifique
una integrasa.
Más generalmente, la célula de levadura puede no comprender ninguna proteasa, ni ácido nucleico que codifique una proteasa.
La o las células de levadura se pueden utilizar ventajosamente para la producción de ARNm o ARNlnc que presentan una cola poliA en el extremo 3' y/o una caperuza 7-metilguanosina en el extremo 5' (incluso una metilación de resto(s) de citosina y/o adenina y/o pseudouridina, más particularmente de resto(s) de citosina y/o adenina).
La solicitud se refiere asimismo a una pluralidad de dichas células de levadura, y en particular a una cepa de levadura cuyas células comprenden o son dichas células. La célula o cepa de levadura de la solicitud está adaptada especialmente a la producción (recombinante) de ARN, en particular de ARN heterólogo a esta levadura, más particularmente de ARNm o ARNlnc heterólogo a esta levadura.
Una cepa de levadura de la solicitud puede ser, en particular, la cepa I-5171 que se presentó en la CNCM en virtud del Tratado de Budapest el 24 de febrero de 2017 (cepa «TB16»).
Esta levadura es una cepa de S. paradoxus, cuyo gen Rpbl se ha reemplazado por una versión mutada del gen Rpbl de S. cerevisiae (a saber una versión C67Y del gen Rpbl de S. cerevisiae), y en la que se ha transferido un ácido nucleico de i. Este ácido nucleico de i. está integrado en el genoma de la levadura, y comprende una secuencia que codifica para la proteína de fusión Gag-eGFP (Gag de Ty1, en este caso Gag de s Ec ID n°: 3; eGFP de s Ec ID n°: 27) bajo la influencia de un promotor galactosa (Gal) [medio selectivo URA].
Una cepa de levadura de la solicitud puede ser, en particular, la cepa I-5172 que se presentó en la CNCM en virtud del Tratado de Budapest el 24 de febrero de 2017 (cepa «TB17»).
Esta levadura es una cepa de S. paradoxus, cuyo gen Rpbl se ha reemplazado por una versión mutada del gen Rpbl de S. cerevisiae (a saber una versión C70Y del gen Rpbl de S. cerevisiae), y en la que se ha transferido un ácido nucleico de i. Este ácido nucleico de i. está integrado en el genoma de la levadura, y comprende una secuencia que codifica la proteína de fusión Gag-eGFP (Gag de Ty1, en este caso Gag de SEC ID n°: 3; eGFP de SEC ID n°: 27) bajo la influencia de un promotor galactosa (Gal) [medio selectivo URA].
Una cepa de levadura de la solicitud puede ser en particular la cepa I-5173 que se presentó en la CNCM en virtud del T ratado de Budapest el 24 de febrero de 2017 (cepa «TB18»).
Esta levadura es una cepa de S. paradoxus, cuyo gen Rpbl se ha reemplazado por una versión mutada del gen Rpbl de S. cerevisiae (a saber, una versión H80Y del gen Rpbl de S. cerevisiae), y en la que se ha transferido un ácido nucleico de i. Este ácido nucleico de i. está integrado en el genoma de la levadura, y comprende una secuencia que codifica para la proteína de fusión Gag-eGFP (Gag de Ty1, en este caso Gag de s Ec ID n°: 3; eGFP de s Ec ID n°: 27) bajo la influencia de un promotor galactosa (Gal) [medio selectivo URA].
Una cepa de levadura de la solicitud puede ser, en particular, la cepa I-5174 que se presentó en la CNCM en virtud del T ratado de Budapest el 24 de febrero de 2017 (cepa «TB21»).
Esta levadura es una cepa de S. paradoxus, cuyo gen Srb2 se ha delecionado, cuyo gen Rpbl se ha reemplazado por una versión mutada del gen Rpbl de S. cerevisiae (a saber una versión H80Y del gen Rpbl de S. cerevisiae), y en la que se ha transferido un ácido nucleico de i. Este ácido nucleico de i. está integrado en el genoma de la levadura, y comprende una secuencia que codifica para la proteína de fusión Gag-eGFP (Gag de Ty1, en este caso Gag de s Ec ID n°: 3; eGFP de SEC ID n°: 27) bajo la influencia de un promotor galactosa (Gal) [medio selectivo URA].
Una cepa de levadura de la solicitud puede ser, en particular, la cepa I-5175 que se presentó en la CNCM en virtud del Tratado de Budapest el 24 de febrero de 2017 (cepa «TB32»).
Esta levadura es una cepa de S. paradoxus, cuyo gen Srb2 se ha delecionado, y en la que se ha transferido un ácido nucleico de i. Este ácido nucleico de i. está integrado en el genoma de la levadura, y comprende una secuencia que codifica para la proteína de fusión Gag-eGFP-6His-3MS2 (Gag de Ty1, en este caso Gag de SEC ID n°: 3; eGFP de SEC ID n°: 27; 6His de SEC ID n°: 6; 3MS2 = 3 copias de la secuencia del bacteriófago MS2, como etiqueta de purificación) bajo la influencia de un promotor galactosa (Gal) [medio selectivo URA].
Una cepa de levadura de la solicitud puede ser en particular la cepa I-5176 que se presentó en la CNCM en virtud del Tratado de Budapest el 24 de febrero de 2017 (cepa «TBSc1»).
Esta levadura es una cepa de S. cerevisiae, que es virgen de elementos Ty (Ty0), y que se ha transformado por un plásmido episómico que contiene un ácido nucleico de i., en este caso un ácido nucleico que permite la
expresión de una proteína de fusión Gag-eGFP (Gag de SEC ID n°: 3; eGFP de SEC ID n°: 27) bajo la influencia de un promotor galactosa (Gal) [medio selectivo URA].
La CNCM es la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (Institut Pasteur; 28, rue du Dr Roux; 75724 Paris Cedex 15; Francia).
Una cepa de levadura de la solicitud puede ser asimismo una de las cepas I-5171 a I-5176, en la que se ha transferido un ácido nucleico de ii., por ejemplo en forma de un plásmido, en particular de un plásmido no integrativo, más particularmente de un plásmido replicativo.
Una cepa de levadura de la solicitud puede ser, en particular, la cepa I-5293 que se presentó en la CNCM en virtud del Tratado de Budapest el 15 de marzo de 2018 (cepa «TB53»).
Esta levadura es una cepa S. paradoxus cuyo gen Srb2 se ha delecionado, y en la que se han transferido un ácido nucleico de i. y ii. El ácido nucleico de i. está integrado en el genoma de la levadura, y comprende una secuencia que codifica para la proteína de fusión Gag-eGFP (Gag de Ty1, en este caso Gag de SEC ID n°: 3; eGFP de SEC ID n°: 27) bajo la influencia de un promotor galactosa (Gal) [medio selectivo URA]. El ácido nucleico ii., por su parte, corresponde a un plásmido no integrativo que permite la expresión de un ARN modelo Luciferasa (SEC ID n°: 29) que dispone en el extremo 3' de una secuencia de reconocimiento completa mutada (GAGm = SEC ID n°: 14) del ARN en los T-bodies bajo la influencia de un promotor galactosa (GAL) [medio selectivo LEU].
Una cepa de levadura de la solicitud puede ser, en particular, la cepa I-5294 que se presentó en la CNCM en virtud del Tratado de Budapest el 15 de marzo de 2018 (cepa «TB54»).
Esta levadura es una cepa S. paradoxus cuyo gen Srb2 se ha delecionado, y en la que se han transferido un ácido nucleico de i. y ii. El ácido nucleico de i. está integrado en el genoma de la levadura, y comprende una secuencia que codifica para la proteína de fusión Gag-eGFP (Gag de Ty1, en este caso Gag de SEC ID n°: 3; eGFP de SEC ID n°: 27) bajo la influencia de un promotor galactosa (Gal) [medio selectivo URA]. El ácido nucleico ii., por su parte, corresponde a un plásmido no integrativo que permite la expresión de un ARN modelo Luciferasa (SEC ID n°: 29) que dispone de una secuencia de reconocimiento parcial (o mínima) (SEC ID n°: 18) del ARN en los T-bodies bajo la influencia de un promotor galactosa (GAL) [medio selectivo LEU].
La CNCM es la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (Institut Pasteur; 28, rue du Dr Roux; 75724 Paris Cedex 15; Francia).
Una célula de la solicitud puede ser, en particular, una célula de una de estas cepas.
La o las células de levadura se pueden utilizar ventajosamente para la producción de ARNm o ARNlnc que presenta una cola poliA en el extremo 3' y/o una caperuza 7-metilguanosina en el extremo 5' (incluso una metilación de resto(s) de adenina y/o citosina y/o pseudouridina, en particular de resto(s) de adenina y/o citosina).
La solicitud se refiere asimismo a un medio de cultivo de microorganismos, en particular a un medio artificial de cultivo de microorganismos, que comprende por lo menos una célula de levadura de la solicitud o por lo menos una cepa de levadura de la solicitud. Este medio puede estar, por ejemplo, en forma líquida.
La composición de este medio de cultivo puede ser la de un medio adecuado para el crecimiento o multiplicación de células de levadura. Puede comprender, en particular, uno o varios elementos de entre el extracto de levadura, la glucosa, la peptona, y el NaCl, más particularmente por lo menos el extracto de levadura y/o la glucosa, más particularmente por lo menos el extracto de levadura.
Este medio puede comprender en particular, además, un compuesto o producto que sería necesario para la inducción de promotor o promotores.
El medio de cultivo se puede utilizar ventajosamente para la producción de ARNm o ARNlnc que presentan una cola poliA en el extremo 3' y/o una caperuza 7-metilguanosina en el extremo 5' (incluso una metilación de resto(s) de adenina y/o citosina y/o pseudouridina, en particular de resto(s) de adenina y/o citosina).
La solicitud se refiere asimismo a un medio de transfección o de transformación de microorganismos, en particular de levadura, más particularmente a un medio artificial de transfección o de transformación de microorganismos, en particular de levadura. El medio de transfección o de transformación de la solicitud comprende por lo menos una célula de levadura de la solicitud o por lo menos una cepa de levadura de la solicitud. Este medio puede estar en forma líquida, en particular en forma de suspensión.
La composición de este medio de transfección o transformación puede comprender en particular polietilenglicol (PEG), en particular PEG 50, y puede comprender además, opcionalmente, ADN de salmón desnaturalizado y/o acetato de litio. El medio de transfección o de transformación se puede utilizar ventajosamente para la producción
de ARNm o ARNInc que presentan una cola poliA en el extremo 3' y/o una caperuza 7-metilguanosina en el extremo 5' (incluso una metilación de resto(s) de adenina y/o citosina y/o pseudouridina, en particular de resto(s) de adenina y/o citosina).
La solicitud se refiere asimismo a un complejo, un gránulo, una partícula o una partícula pseudoviral (virus-like particle o VLP) (recombinantes). Este complejo, gránulo, partícula pseudoviral (recombinante) es susceptible de producirse cuando tiene lugar la realización del método de producción (recombinante) de ARN de la solicitud (y mediante recogida del complejo, gránulo, partícula pseudoviral así producido).
Este complejo, gránulo, partícula pseudoviral comprende un ARN complejado con, o encapsulado por, un polímero proteico, en el que el polímero proteico comprende la proteína Gag de un retrotransposón Ty de levadura.
La secuencia nucleotídica del ARN comprende dicha secuencia de direccionamiento («secuencia b.») y/o la secuencia de una molécula de un ARN (en particular de un ARNm o ARNlnc) de interés («secuencia a.»), más particularmente dicha secuencia de direccionamiento unida a la secuencia de una molécula de un ARN (en particular de un ARNm o ARNlnc) de interés.
La solicitud se refiere así a una partícula pseudoviral (recombinante) (que es susceptible de obtenerse por recogida de una partícula pseudoviral producida cuando tiene lugar la realización del procedimiento de producción recombinante de ARN de la solicitud), y que está caracterizada por que la partícula pseudoviral comprende un ARN encapsulado por un polímero proteico, en la que:
- el polímero proteico comprende la proteína Gag de un retrotransposón Ty de levadura,
- la proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura es una proteína Gag de retrotransposón Ty1, Ty2 o Ty3 de levadura, y la secuencia de esta proteína Gag es la secuencia de SEC ID n°: 3 o una secuencia que es idéntica en por lo menos un 90% a la secuencia de SEC ID n°: 3,
- la secuencia nucleotídica del ARN encapsulado comprende la secuencia de SEC ID n°: 16 o un fragmento de por lo menos 150 nucleótidos de la secuencia de SEC ID n°: 16 (pero preferentemente no comprende ningún marco de lectura cuyo primer codón sería el codón de inicio de la traducción [start] (AUG)), y no comprende la secuencia de ARN que es el transcrito ARN de la SEC ID n°: 2, y
- la partícula pseudoviral no comprende ni transcriptasa inversa, ni ácido nucleico que codifique una transcriptasa inversa, ni ácido nucleico que comprenda una secuencia que codifique dicha transcriptasa inversa.
Ventajosamente, el ARN del complejo, gránulo, partícula pseudoviral de la solicitud, más particularmente el ARN de interés, en particular el ARNm o ARNlnc de interés, («secuencia a.»), puede estar provisto de una cola poliA en la posición 3' (véanse las figuras 7A, 7B y 7C).
Ventajosamente, el ARN del complejo, gránulo, partícula pseudoviral de la solicitud, más particularmente el ARN, en particular el ARNm o ARNlnc, («secuencia a.»), puede estar provisto de una caperuza en la posición 5', más particularmente en su extremo 5' (véanse las figuras 7A, 7B y 7C), en particular de una caperuza que comprende una 7-metilguanosina (única al ARNm por tres fosfatos). Esta caperuza puede bloquear la acción de las exonucleasas, y puede ser necesaria para estimular la (futura) traducción de dicho ARN en las células de mamíferos.
Ventajosamente, el ARN del complejo, gránulo, partícula pseudoviral de la solicitud, más particularmente el ARN de interés, en particular el ARNm o ARNlnc, («secuencia a.»), puede metilarse, en particular a nivel de uno o varios de sus restos de adenina y/o citosina y/o pseudouridina, en particular resto(s) de adenina y/o citosina.
Este complejo, gránulo, partícula pseudoviral (y en particular el polímero proteico de este complejo, gránulo, partícula pseudoviral) puede no comprender una proteína que permita la retrotransposición del A r N (ARNm o ARNlnc) de interés (transcriptasa inversa, en particular), o ácido nucleico que codifique dicha proteína.
Este complejo, gránulo, partícula pseudoviral (y en particular el polímero proteico de este complejo, gránulo, partícula pseudoviral) puede no comprender ninguna transcriptasa inversa de retrotransposón Ty de levadura, ni ácido nucleico que codifique dicha transcriptasa inversa.
Este complejo, gránulo, partícula pseudoviral (y en particular el polímero proteico de este complejo, gránulo, partícula pseudoviral) puede no comprender ninguna integrasa de retrotransposón Ty de levadura, ni ácido nucleico que codifique dicha integrasa.
Este complejo, gránulo, partícula pseudoviral (y en particular el polímero proteico de este complejo, gránulo, partícula pseudoviral) puede no comprender ninguna proteasa de retrotransposón Ty de levadura, ni ácido nucleico
que codifique dicha proteasa.
Más generalmente, este complejo, gránulo, partícula pseudoviral (y en particular el polímero proteico de este complejo, gránulo, partícula pseudoviral) puede no comprender ninguna transcriptasa inversa, ni ácido nucleico que codifique una transcriptasa inversa. Más generalmente, este complejo, gránulo, partícula pseudoviral (y en particular el polímero proteico de este complejo, gránulo, partícula pseudoviral) puede no comprender ninguna integrasa, ni ácido nucleico que codifique una integrasa.
Más generalmente, este complejo, gránulo, partícula pseudoviral (y en particular el polímero proteico de este complejo, gránulo, partícula pseudoviral) puede no comprender ninguna proteasa, ni ácido nucleico que codifique una proteasa.
La solicitud se refiere asimismo al ARN aislado de este complejo, gránulo, partícula pseudoviral.
El complejo, gránulo o partícula pseudoviral se puede utilizar, ventajosamente, para la producción de ARNm o ARNlnc que presenta una cola poliA en el extremo 3' y/o una caperuza 7-metilguanosina en el extremo 5' (incluso una metilación de uno o varios resto(s) de adenina y/o citosina y/o pseudouridina, en particular resto(s) de adenina y/o citosina).
La solicitud se refiere asimismo a un procedimiento de producción (in vitro) de ADN (en particular de ADNc), que comprende el hecho de producir un ARN (en particular un ARNm o ARNlnc) según el procedimiento de producción de ARN de la solicitud, y de retrotranscribir este ARN en ADN (en particular en ADNc), y recoger este ADN (o ADNc).
La solicitud se refiere asimismo a un procedimiento de producción (in vitro) de proteína, que comprende el hecho de producir un ARNm según el procedimiento de producción de ARN de la solicitud, y de traducir este ARNm en proteína in vitro (por ejemplo in vitro en células, en particular en células de mamífero, en particular en células humanas), y de recoger esta proteína.
La solicitud se refiere asimismo a un procedimiento para la producción de una composición farmacéutica que comprende por lo menos un ARN de interés, en particular por lo menos un ARNm o ARNlnc de interés.
El procedimiento comprende el hecho de producir por lo menos un ARN mediante el procedimiento de producción de ARN de la solicitud, y el hecho de colocar este ARN en contacto con (en mezcla con, en suspensión en) o en un vehículo farmacéuticamente aceptable para producir una composición farmacéutica.
La expresión «composición farmacéutica» se entiende según su significado habitual en el sector. Incluye el significado de medicamento, en particular de vacuna o composición inmunogénica.
La expresión «vehículo farmacéuticamente aceptable» se entiende según su significado habitual en el sector. Incluye el significado de «vehículo fisiológicamente aceptable», en particular fisiológicamente aceptable para una administración a humanos.
Un vehículo farmacéuticamente (o fisiológicamente) aceptable puede tener, por ejemplo, una o varias de las siguientes funciones: funciones de diluyente, excipiente, aditivo, emulsionante, agente dispersante, agente para el ajuste del pH, conservante, surfactante, agente gelificante, agente tampón, agente estabilizante, un agente estabilizador de ARN (en particular un agente que protege el ARN de la degradación enzimática), un agente solubilizante.
El experto en la materia conoce ejemplos de vehículos farmacéuticamente (o fisiológicamente) aceptables, y se describen, por ejemplo, en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20a edición, Mack Publishing Co. y en "Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", Ansel, Popovich y Allen Jr., Lippincott Williams y Wilkins (novena edición).
Unos ejemplos de vehículos farmacéuticamente (o fisiológicamente) aceptables pueden comprender, por ejemplo, unos fluidos inyectables, tales como el agua, el suero fisiológico, los tampones, las emulsiones.
La composición farmacéutica (o medicamento) puede estar destinada, en particular, a:
- la prevención o al tratamiento de una infección microbiológica, en particular bacteriana y/o viral y/o parasitaria (enfermedades infecciosas o bio-defensa),
- la prevención o al tratamiento de una proliferación tumoral,
- a la prevención o al tratamiento de una enfermedad crónica (mucoviscidosis, por ejemplo),
- la terapia por regeneración tisular o celular (enfermedades cardiovasculares, enfermedades raras), o a - la terapia génica (en particular mediante corrección de un gen o de una deficiencia genética, en particular mediante la reexpresión de una proteína que resulta ser no funcional o no expresada).
Por ejemplo, un ARN producido de acuerdo con la solicitud se puede formular en forma de:
- una vacuna a ARN o una composición inmunogénica de ARN (estando el ARN administrado destinado a ser traducido en las células, en particular dendríticas, del sujeto, en particular del sujeto humano, al cual se administra);
- un medicamento antitumoral;
- un medicamento para el tratamiento o la paliación de la mucoviscidosis (por ejemplo, mediante el aporte de ARN que codifica la CFTR); o
- un medicamento o producto de regeneración tisular o celular.
El hecho que el ARN producido de acuerdo con la solicitud pueda presentar una cola poliA en el extremo 3' y/o una caperuza m7G en el extremo 5', incluso una metilación de resto(s) de adenina y/o citosina y/o pseudouridina, en particular adenina y/o citosina, lo hace directamente competente para una traducción en células de mamífero, en particular en células humanas.
En la solicitud, salvo que se especifique de otra manera, o que el contexto lo dicte de otra manera, todos los términos tienen sus sentidos habituales en el o los sectores en cuestión.
La expresión "que comprende", de la que es sinónimo "que incluye" o "que contiene", es una expresión abierta, y no excluye la presencia de uno o varios elementos, ingredientes, o etapas de método adicionales que no estuvieran indicados explícitamente, mientras que el término "que consiste en" o "constituido" es una expresión cerrada, que excluye la presencia de cualquier otro elemento adicional, etapa, o ingrediente que no se estuviera expuesto explícitamente.
La expresión "que consiste esencialmente" o "esencialmente constituido" es una expresión parcialmente abierta, que no excluye la presencia de uno o varios elementos, ingredientes, o etapas adicionales, en la medida en la que este o estos elementos, ingredientes o etapas adicionales no afectan materialmente a las propiedades de base de la invención.
Por consiguiente, la expresión "que comprende" (o "comprende(comprenden)") incluye los términos "que consiste", "constituido", así como las expresiones "que consiste esencialmente" y " constituido esencialmente".
Con el objetivo de facilitar la lectura de la solicitud, la descripción se ha separado en diversos párrafos y secciones. No se debe considerar que estas separaciones desconectan la sustancia de un párrafo o sección de la de otro párrafo o sección. Por el contrario, la descripción abarca todas las combinaciones posibles de los diferentes párrafos, secciones y frases que contiene.
Los ejemplos siguientes se dan a título puramente ilustrativo. No son de ninguna manera limitativos.
Ejemplos
Ejemplo 1
Se produjeron:
- unas construcciones plasmídicas que codifican la proteína Gag (bajo el control de un promotor inducible), eventualmente en fusión con una etiqueta de purificación (tag 6His) o con un marcador de detección (eGFP) [véase la figura 6A construcción i.; véase la figura 7A], así como
- unas construcciones plasmídicas que codifican un ARN heterólogo de interés enlazado a una secuencia de direccionamiento retrosomal (bajo el control de un promotor inducible), por ejemplo unas construcciones plasmídicas que contienen (en inserto) un ADN que codifica un ARNm de eGFP (como ARN heterólogo) enlazado (en el extremo 3') a una secuencia de ADN GAG desprovista del promotor de expresión de la proteína Gag (a título de secuencia de direccionamiento retrosomal) [véase la figura 6A construcción ii.; véase la figura 7B],
se produjeron y se utilizaron para la transformación de una cepa de levadura desprovista de retrotransposón Ty endógeno (Saccharomyces paradoxus).
Las células de levadura así transformadas producen unos retrosomas T (T-bodies o partículas pseudovirales) que contienen el ARN heterólogo, sin retrotranscribir este ARN heterólogo ni retrointegrarlo en el genoma.
Los ARN heterólogos así producidos se purificaron.
Material y Métodos
1. Cepas y plásmidos utilizados
Cepas:
Una cepa de bacteria Escherichia coli DH5a está disponible en el ATCC® bajo el numero 67877™.
Una cepa de levadura Saccharomyces paradoxus salvaje está disponible en el ATCC® bajo el numero 76528™. La cepa de levadura YAM13 es una cepa de S. paradoxus MATalpha Ty0leu2 lys2 ura3.
La cepa de levadura YAM13 ASrb2 es una cepa S. paradoxus YAM13, cuyo gen Srb2 se ha delecionado.
La cepa de levadura YAM13 ASpt21 es una cepa S. paradoxus YAM13, cuyo gen Spt21 se ha delecionado. Una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae salvaje está disponible en el ATCC® bajo el numero 52530™. La ATCC® es la American Type Culture Collection (10801 University Blvd.; Manassas, Virginia 20110-2209; U.S.A.).
S. paradoxus está naturalmente desprovista de retrotransposón, en particular de retrotransposón Ty1, a diferencia de S. cerevisiae, que está naturalmente provista de retrotransposón Ty1.
Construcción que codifica la proteína Gag (véase la figura 7A):
Para la construcción que codifica la proteína Gag, se utilizaron dos plásmidos, uno para amplificar la secuencia GAG (SEC ID n°: 1) y el otro para expresar la proteína Gag con y sin etiqueta poli-histidina (tag 6-His).
Las secuencias ADN, ARN y proteica de tag 6-His son las secuencias de SEC ID n°: 4, 5 y 6, respectivamente. El primer plásmido (pBDG1130Apol) contiene la secuencia GAG y sirvió de matriz para la amplificación y la adición de tag 6-His aguas arriba y/o aguas abajo (SEC ID n°: 7, SEC ID n°: 9 y SEC iD n°: 11) de esta secuencia por PCR.
El segundo plásmido pAG425GAL-ccdB se utilizó para expresar las proteínas Gag con o sin tag 6-His en la posición N-terminal y/o C-terminal en la levadura (S. paradoxus YAM13 ASrb2).
Las proteínas se expresaron de manera inducible por la presencia del promotor en la galactosa GAL1. Este plásmido está constituido por un origen de replicación bacteriana y eucariota (2|j-20-50 copias por célula) que permite la amplificación del plásmido en la bacteria E. coli DH5a y una expresión de las proteínas en la levadura. Con el fin de seleccionar específicamente las células transfectadas por el plásmido, se utilizaron diferentes marcadores de selección. Para la bacteria E. coli, el gen de resistencia a la ampicilina permitió la selección de las bacterias transfectadas, y el gen ccdB permitió inducir la muerte de las bacterias transfectadas al no haber recombinación entre la secuencia de interés y el plásmido. Para la cepa de levadura, el gen de síntesis de la leucina (LEU2) permitió la selección de las levaduras transformadas por el plásmido. La levadura YAM13 ASrb2 es auxótrofa para este aminoácido, y la transformación por parte del plásmido permite el crecimiento de las levaduras en un medio desprovisto de leucina (-LEU).
El medio de expresión de las proteínas de interés por parte de las levaduras se realizó, por lo tanto, sobre un medio - LEU y que contenía un 2% de galactosa.
Se produjo una construcción plasmídica similar para expresar la proteína Gag (SEC ID n°: 3 en fusión con la proteína eGFP dentro del plásmido pAG426-ccdB-eGFP (véase la figura 7A). El plásmido pAG426-ccdB-eGFP dispone del gen de síntesis del uracilo (URA3) que permite la selección de las levaduras transformadas por el plásmido. La levadura YAM13 ASrb2 es auxótrofa para este aminoácido, y la transformación por el plásmido permite el crecimiento de las levaduras sobre un medio desprovisto de uracilo (-URA).
Las secuencias ADN, ARN y proteica de eGFP son las secuencias de SEC ID n°: 25, 26 y 27, respectivamente.
Construcción que codifica el ARN heterólogo que presenta la secuencia de direccionamiento Gag (véase la figura 7B: véase construcción ii) de la figura 6A):
Un ARNm que codifica eGFP se utilizó (enhanced Green Fluorescent Protein) a título de ARN heterólogo.
Un ARNm que codifica la luciferasa se utilizó a título de ARN heterólogo, y las secuencias ADN, ARN y proteica de la luciferasa son las secuencias de SEC ID n°: 28, 29 y 30, respectivamente.
La secuencia de direccionamiento Gag es una secuencia de ARN de direccionamiento retrosomal (secuencia de ARN que dirige el ARN heterólogo al cual está enlazada, hacia los retrosomas que están formados, por otro lado, por la proteína Gag).
La secuencia de direccionamiento retrosomal es una secuencia Gag no codificante (secuencia que codifica Gag que se ha modificado por deleción del promotor de expresión de Gag: secuencia Gag no codificante que se puede designar también «mini-GAG» o «MiniGag» o «End GAG»).
Las secuencias ADN y ARN de la secuencia de direccionamiento Gag son las secuencias de SEC ID n°: 13 y 14, respectivamente.
El ADN que codifica el ARNm heterólogo y el ADN que codifica la secuencia de direccionamiento Gag se insertaron en un plásmido (plásmido pAG425-GAL-ccdB).
2. Clonación del plásmido episómico que codifica la proteína GAG
2.1. Secuencia GAG con y sin Tag 6-His
2.1.1. Amplificación de la secuencia de GAG para la adición de Tag 6-His por PCR
La estrategia adoptada para la clonación es una estrategia que se basa en la ligación entre dos secuencias nucleotídicas que presentan unos extremos cohesivos obtenidos por digestiones enzimáticas.
La expresión de la proteína Gag con tag 6-His facilita la purificación sobre columna de níquel. La secuencia GAG codificante (SEC ID n°: 1) se amplificó para obtener, aguas arriba y/o aguas abajo, una secuencia que permitiera la expresión de tag 6-His (SEC ID n°: 7, SEC ID n°: 9 y SEC ID n°: 1l). Se añadieron a ambos lados unos sitios de restricciones para SpeI y HindIII, y las secuencias se clonaron en el plásmido pAG425GAL-ccdB. Se utilizó la PCR (Polimerase Chain Reaction o reacción en cadena de polimerasa) para amplificar la secuencia GAG y permitir la adición de los sitios de restricciones y de la secuencia que codifica la tag 6-His. La PCR se realizó con la ayuda del kit KAPA HIFI HOTSTART READYMIX PCR™ (KAPABIOSYSTEMS) según las recomendaciones del proveedor, utilizando diferentes pares de cebadores:
- amplificación de la secuencia codificante GAG con tag 6-His aguas arriba de la SEC ID n°: 7 (denominada 6His-GAG): cebador sentido FQ3 de la SEC ID n°: 19 y cebador antisentido RQ3 de la SEC iD n°: 20;
- amplificación de la secuencia codificante GAG con tag 6-His aguas abajo de la SEC ID n°: 9 (denominada GAG-6His): cebador sentido FQ4 de la SEC ID n°: 21 y cebador antisentido RQ4 de la SEC iD n°: 22;
- amplificación de la secuencia codificante GAG con tag 6-His aguas arriba y aguas abajo de la SEC ID n°:
11 (denominada 6His-GAG-6His): cebador sentido FQ3 de la SEC ID n°: 19 y cebador antisentido RQ4 de la SEC ID n°: 22.
Los cebadores RQ3 y FQ4 se utilizaron para amplificar GAG y añadir los sitios de restricciones en los extremos. La reacción PCR se realizó con unas concentraciones finales de cebadores de 0,3 pM, 1X de KAPA HIFI HOTSTART READYMIX PCR™ y 200 ng/pl de ADN. Se añadió dimetilsulfóxido (DMSO), a una concentración final del 5%, para las reacciones de amplificación con los pares de cebadores FQ4/RQ4 y FQ3/RQ4 con el fin de evitar las estructuras secundarias que pudieran ser tomadas por los cebadores. El ADN matriz utilizado es el plásmido pBDG1130 que contiene la secuencia GAG a amplificar.
La desnaturalización se realizó a 95°C durante 30 min, y seguida de 30 ciclos de 20 s a 98°C y después 15 s a 65°C (par de cebadores FQ3/RQ3) o a 60°C (pares de cebadores FQ4/RQ4, FQ3/RQ4 y FQ4/RQ3), y 1 min a 72°C. La elongación terminal se realizó a 72°C durante 3 min. Al final de la reacción de amplificación, se añadieron 8 pl de producto PCR de 2 pl de tampón de carga 5X. La mezcla obtenida se depositó sobre gel de agarosa 0,6% 5% de bromuro de etidio (BET), y después se realizó la migración durante 1 h a 80 V. El marcador de tamaño utilizado es el 1 KB DNA LADDER ™ (n Ew ENGLAND BIOLABS). Después de la migración, una revelación bajo UV permitió verificar que hubo una amplificación específica.
Los productos PCR específicos se extrajeron con el kit PCR CLEAN-UP, GEL EXTRACTION™ (MACHEREYNAGEL) según las recomendaciones del proveedor. Los fragmentos extraídos se cuantifican con NANODROP y después se digieren con HindIII y SpeI para ser ligados con el plásmido de expresión pAG425GAL-ccdB.
2.1.2. Ligación
La digestión enzimática por HindIII y SpeI del plásmido de expresión episómico pAG425GAL-ccdB y de los insertos (GAG con tag 6-His C-terminal (s Ec ID n°: 7), GAG con tag 6-His N-terminal (SEC ID n°: 9), GAG con tag 6-His C-terminal y N-terminal (SEC ID n°: 11) permitió linealizar el plásmido y formar unos extremos sobresalientes cohesivos entre el plásmido y los diferentes insertos. La digestión por las dos enzimas de restricciones se realizó en una reacción en las siguientes condiciones: 1 |jg de ADN (inserto o plásmido), 5 U/ml de cada una de las dos enzimas HindIII y SpeI, 1X de tampón CUTSMARt ™ 10X para un volumen de reacción de 40 jl. La digestión se realizó durante 1h30 a 37°C. Después de la digestión, la mezcla de reacción se depositó sobre gel de agarosa al 0,6% con el fin de verificar que hubo digestión, y se realizó una extracción sobre gel del fragmento de interés con el kit PCR CLEAN-UP GEL EXTRACTION™ (MACHEREY-NAGEL) según las recomendaciones del proveedor.
Después de la cuantificación de los extractos, la ligación se realizó en función de una relación molar ADNp/inserto de 1:3. La reacción se realizó a 25°C durante 5 min (Quick ligation kit NEB). Después de la obtención de los diferentes plásmidos recombinantes, se realizó una amplificación por E. coli DH5a de los plásmidos construidos pAG425GAL-GAG, pAG425GAL-6His-GAG. pAG425GAL-GAG-6His, pAG425GAL-6His-GAG-6His.
2.2 Secuencia de fusión GAG-eGFP
2.2.1. Amplificación de la secuencia de GAG para la fusión con eGFP
La secuencia GAG codificante (SEC ID n°: 1) se amplificó por PCR sin el codón stop (TGA) para permitir la fusión con eGFP. Los cebadores de amplificación permiten obtener aguas arriba y aguas abajo de la secuencia amplificada los sitios de restricciones SpeI y EcoRI. La PCR se realizó con la ayuda del kit KApA HIF1HOTSTART READYMIX PCR™ (KAPABIOSYSTEMS) según las recomendaciones del proveedor, utilizando el par de cebador:
- amplificación de la secuencia codificante GAG sin codón stop (TGA): cebador sentido FQ5 de la SEC ID n°: 31 y cebador antisentido RQ5 de la SEC ID n°: 32;
La reacción PCR se realizó con unas concentraciones finales de cebadores de 0,3 jM , 1X de KAPA HIFI HOTSTART READYMIX PCR™ y 200 ng/jl de ADN. Se añadió dimetilsulfóxido (DMSO), a una concentración final del 5%, para las reacciones de amplificación con los pares de cebadores FQ5/RQ5. El ADN matriz utilizado es el plásmido pBDG1 130 que contiene la secuencia GAG a amplificar.
Al final de la reacción de amplificación, se añadieron 8 j l de producto PCR de 2 j l de tampón de carga 5X. La mezcla obtenida se depositó sobre un gel de agarosa al 0,6% un 5% de bromuro de etidio (BET), y después se realizó la migración durante 1 h a 80 V. El marcador de tamaño utilizado es el 1 KB DNA LADDER ™ (NEW ENGLAND BIOLABS). Después de la migración, una revelación bajo UV permitió verificar que hubo una amplificación específica.
Los productos PCR específicos se extrajeron con el kit PCR CLEAN-UP, GEL EXTRACTION™ (MACHEREY-NAGEL) según las recomendaciones del proveedor. Los fragmentos extraídos se cuantifican con NANODROP y después se digirieron con SpeI y EcoRI para ser ligados con el plásmido de expresión pAG426GAL-ccdB-eGFP.
2.2.2. Digestión y ligación
La digestión enzimática por SpeI y EcoRI del plásmido de expresión pAG426GAL-ccdB-eGFP y del inserto (GAG sin codón stop (SEC ID n°: 37) permitió linealizar el plásmido y formar unos extremos sobresalientes cohesivos entre el plásmido y el inserto. La digestión por las dos enzimas de restricciones se realizó en una reacción en las siguientes condiciones: 1 jg de ADN (inserto o plásmido), 5 U/ml de cada una de las dos enzimas HindIII y SpeI, 1X de tampón NEB 2.1 1X para un volumen de reacción de 40 jl. La digestión se realizó durante 1h30 a 37°C. Después de la digestión, la mezcla de reacción se depositó sobre gel de agarosa al 0,6% con el fin de verificar que hubo digestión, y se realizó una extracción sobre gel del fragmento de interés con el kit PCR CLEAN-UP GEL EXTRACTION™ (MACHEREY-NAGEL) según las recomendaciones del proveedor. Después de la cuantificación de los extractos, la ligación se realizó en función de una relación molar ADNp/inserto de 1:3. La reacción se realizó a 25°C durante 5 min (Quick ligation kit NEB). Después de la obtención de los diferentes plásmidos recombinantes, se realizó una amplificación por E. coli DH5a del plásmido construido pAG426GAL-GAGeGFP.
2.3 Secuencia GAG-eGFP-6-His con y sin 3MS2
2.3.1. Síntesis y digestión de la secuencia de GAG- eGFP-6-His-3MS2
El casete «GAG-eGFP-6HIS-3MS2» se ordena (SEC ID n°: 38) y sintetiza por GenScript, y se inserta en el plásmido
pUC57 (pUC57-GeGHM). Esta secuencia codifica para la proteína de fusión Gag-eGFP con una tag histidina en C-terminal con, en el extremo 3' de esta secuencia, tres repeticiones MS2 (SEC ID n°: 35).
El plásmido pUC57-GAG-eGFP-6HIS (pUC57-GeGH) se clona retirando la secuencia 3MS2 (SEC ID n°: 35) por digestión NotI, seguida de una ligación a 25°C durante 5 min (Quick ligation kit NEB).
Los plásmidos pUC57-GeGHM y pUC57-GeGH son digeridos por las enzimas de restricción SpeI y KpnI. El fragmento correspondiente a la secuencia GAG-eGFP-6HIS-3MS2 (SEC ID n°: 38) (2369 pb) y GAG-eGFp-6HIS (SEC ID n°: 39) (2101 pb) se purifican después del depósito sobre gel de agarosa al 0,6% con el fin de verificar que hubo digestión, y se realiza una extracción sobre gel del fragmento de interés con el kit PCR CLEAN-UP GEL Ex TRACTION™ (MACHEREY-NAGEL) según las recomendaciones del proveedor.
2.3.2. Ligación
La digestión enzimática por SpeI y KpnI del plásmido de expresión pAG426GAL-ccdB-eGFP y de los insertos GAG sin codón stop (SEC ID n°: 37) permitió linealizar el plásmido y formar unos extremos sobresalientes cohesivos entre el plásmido y los insertos GAG-eGFP-6HIS-3MS2 (SEC ID n°: 38) y GAG-eGFP-6HIS (SEC ID n°: 39). Después de la digestión, la mezcla de reacción se deposita sobre gel de agarosa al 0,6% con el fin de verificar que hubo digestión, y se realiza una extracción sobre gel del fragmento de interés con el kit PCR CLEAN-UP GEL EXTRACTION™ (MACHEREY-NAGEL) según las recomendaciones del proveedor. Después de la cuantificación de los extractos, la ligación se realizó en función de una relación molar ADNp/inserto de 1:3. La reacción se realizó a 25°C durante 5 min (Quick ligation kit NEB). Después de la obtención de los diferentes plásmidos recombinantes, se realizó una amplificación por E. coli DH5a.
Después de la cuantificación de los extractos, la ligación se realizó en función de una relación molar ADNp/inserto de 1:3. La reacción se realizó a 25°C durante 5 min (Quick ligation kit NEB). Después de la obtención de los diferentes plásmidos recombinantes, se realizó una amplificación por E. coli DH5a de los plásmidos construidos pAG426GAL-GeGHM y pAG426GAL-GeGH.
3. Clonación del plásmido integrativo que codifica la proteína GAG
3.1. Amplificación de la secuencia de GAL-GAG-eGFP por PCR
La secuencia GAL-GAG-eGFP que codifica para el promotor galactosa la proteína de fusión Gag-eGFP (SEC ID n°: 42) se amplificó por PCR. Los cebadores de amplificación permiten obtener, aguas arriba y aguas abajo de la secuencia amplificada, los sitios de restricciones SacI y KpnI. La PCR se realizó con la ayuda del kit KAPa HIFI HOTSTART READYMIX PCR™ (KAPABIOSYSTEMS) según las recomendaciones del proveedor, utilizando el par de cebador:
- amplificación de la secuencia codificante GAG-eGFP: cebador sentido FQ5 de la SEC ID n°: 31 y cebador antisentido RQ5 de la SEC ID n°: 32;
Al final de la reacción de amplificación, se añadieron 8 pl de producto PCR de 2 pl de tampón de carga 5X. La mezcla obtenida se depositó sobre gel de agarosa al 0,6% un 5% de bromuro de etidio (BET), y después se realizó la migración durante 1 h a 80 V. El marcador de tamaño utilizado es el 1 KB DNA LADDER™ (NEW ENGLAND BIOLABS). Después de la migración, una revelación bajo UV permitió verificar que hubo una amplificación específica.
3.2. Ligación
El plásmido de levadura integrativo pRS306 posee un marcador URA3 y un gen de resistencia a la Ampicilina AmpR.
El plásmido de expresión pRS306 sufre una digestión enzimática por SacI y KpnI.
La digestión por las dos enzimas de restricciones se realizó en una reacción en las siguientes condiciones: 1 pg de ADN (inserto o plásmido), 5 U/ml de cada una de las dos enzimas SacI y KpnI, 1X de tampón NEB 1.1 1X para un volumen de reacción de 40 pl. La digestión se realizó durante 1h30 a 37°C. Después de la digestión, la mezcla de reacción se deposita sobre gel de agarosa al 0,6% con el fin de verificar que hubo digestión, y se realizó una extracción sobre gel del fragmento de interés con el kit PCR CLEAN-UP g El EXTRACTIONTM (MACHEREY-NAGEL) según las recomendaciones del proveedor. La ligación se realizó con la ayuda del kit Gibson Assembly en las siguientes condiciones: 5 pl Gibson Master Mix 50 ng de vector pRS306 digerido SacI/KpnI (4271pb) 0,5 pM, o 926 ng de PCR GAL-GAG-EGFP Csp H2O 10 pl. La reacción se incuba durante 1h a 50°C. Después de la obtención de los diferentes plásmidos recombinantes, se realizó una amplificación por E. coli DH5a.
4. Clonación del plásmido que codifica el ARN heterólogo
Se utilizó un ARNm que codifica la eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) a título de ARN heterólogo. Las secuencias ADN, ARN y proteica de la eGFP son las secuencias de SEC ID n°: 25, 26 y 27, respectivamente.
Se utilizó un ARNm que codifica la luciferasa a título de ARN heterólogo. Las secuencias ADN, ARN y proteica de la luciferasa son las secuencias de SEC ID n°: 28, 29 y 30, respectivamente
4.1 Secuencia Luciferasa como ARN heterólogo
4.1.1. Secuencia EndGAG como secuencia de reconocimiento
El casete «Luc-EndGAG-3MS2» se ordena (SEC ID n°: 43) y se sintetiza por GenScript, y se inserta en el plásmido pUC57 (pUC57-LEGM). Esta secuencia codifica para la proteína luciferasa en el extremo 3' de esta secuencia la secuencia de reconocimiento en los T-bodies EndGAG seguida de tres repeticiones MS2 (SEC ID n°: 35).
El plásmido pUC57-Luc-EndGAG (pUC57-LEG) se clona retirando la secuencia 3MS2 (SEC ID n°: 35) por digestión NotI, seguida de una ligación a 25°C durante 5 min (Quick ligation kit NEB).
Los plásmidos pUC57-LEGM y pUC57-LEG son digeridos por las enzimas de restricción SpeI y HindIII. El fragmento correspondiente a la secuencia Luc-EndGAG-3MS2 (SEC ID n°: 43) (3425 pb) y Luc-EndGAG (SEC ID n°: 44) (3039 pb) se purifica después del depósito sobre gel de agarosa al 0,6% con el fin de verificar que hubo digestión, y se realiza una extracción sobre gel del fragmento de interés con el kit PCR CLEAN-UP GEL EXTRACTION™ (MACHEREY-NAGEL) según las recomendaciones del proveedor. La digestión enzimática por SpeI y KpnI del plásmido de expresión pAG425GAL-ccdB y de los insertos Luc-EndGAG-3MS2 (SEC ID n°: 43) y Luc-EndGAG (SEC ID n°: 44) permitió linealizar el plásmido y formar unos extremos sobresalientes cohesivos entre el plásmido y los insertos. Después de la digestión, la mezcla de reacción se deposita sobre gel de agarosa al 0,6% con el fin de verificar que hubo digestión, y se realiza una extracción sobre gel del fragmento de interés con el kit PCR CLEAN-UP GEL EXTRACTION™ (MACHEREY-NAGEL) según las recomendaciones del proveedor.
Después de la cuantificación de los extractos, la ligación se realizó en función de una relación molar ADNp/inserto de 1:3. La reacción se realizó a 25°C durante 5 min (Quick ligation kit NEB). Después de la obtención de los diferentes plásmidos recombinantes, se realizó una amplificación por E. coli DH5a de los plásmidos construidos pAG425GAL-LEGM y pAG425GAL-LEG.
4.1.2 Secuencia GAGm como secuencia de reconocimiento
La secuencia «GAGm» se ordena (SEC ID n°: 13) y se sintetiza por GenScript, y se inserta en el plásmido pUC57 (pUC57-Gm). Esta secuencia es la secuencia de reconocimiento en los T-bodies completa y mutada (SEC ID n°: 14).
El plásmido pAG425GAL-LEGM es digerido por la enzima de restricción NdeI y después parcialmente por la enzima de restricción NotI. Los fragmentos correspondientes al plásmido liberado de la secuencia EndGAG (9850 pb) y al plásmido liberado de la secuencia EndGAG y 3MS2 (9464 pb) se purifican después del depósito sobre gel de agarosa al 0,6% con el fin de verificar que hubo digestión, y se realizó una extracción sobre gel del fragmento de interés con el kit PCR CLEAN-UP GEL EXTRACTION™ (MACHEREY-NAGEL) según las recomendaciones del proveedor.
El plásmido pUC57-GAGm es digerido por las enzimas de restricción NdeI y NotI, el fragmento correspondiente a GAGm (1336 pb) se purifica después del depósito sobre gel de agarosa al 0,6% y se realiza una extracción sobre gel del fragmento de interés con el kit PCR CLEAN-UP GEL EXTRACTION™ (MACHEREY-NAGEL) según las recomendaciones del proveedor.
Después de la cuantificación de los extractos, la ligación se realizó en función de una relación molar ADNp/inserto de 1:3. La reacción se realizó a 25°C durante 5 min (Quick ligation kit NEB). Después de la obtención de los diferentes plásmidos recombinantes, se realizó una amplificación por E. coli DH5a de los plásmidos construidos pAG425GAL-LGmM y pAG425GAL-LGm.
4.2 Secuencia eGFP como ARN heterólogo
La secuencia eGFP se amplifica por PCR a partir del plásmido pCMV-eGFP. Los cebadores de amplificación permiten obtener, aguas arriba y aguas abajo de la secuencia amplificada, los sitios de restricciones SpeI y AleI. La PCR se realizó con la ayuda del kit KAPA HIFI HOTSTART READYMIX PCR™ (KAPABIOSYSTEMS) según las recomendaciones del proveedor, utilizando el par de cebador. Al final de la reacción de amplificación, se añadieron 8 |jl de producto PCR de 2 j l de tampón de carga 5X. La mezcla obtenida se depositó sobre un gel de agarosa al 0,6% un 5% de bromuro de etidio (BET), y después se realizó la migración durante 1 h a 80 V. El marcador de
tamaño utilizado es el 1 KB DNA LADDER™ (NEW ENGLAND BIOLABS). Después de la migración, una revelación bajo UV permitió verificar que hubo una amplificación específica.
Los plásmidos pAG425GAL-LGmM, pAG425GAL-LGm, pAG425GAL-LEGM y pAG425GAL-LEG son digeridos por las enzimas de restricción SpeI y AleI. Los fragmentos correspondientes a los plásmidos liberados de la luciferasa se purifican después del depósito sobre gel de agarosa al 0,6%, y se realiza una extracción sobre gel del fragmento de interés con el kit PCR CLEAN-UP GEL EXTRACTION™ (MACHEREY-NAGEL) según las recomendaciones del proveedor.
Después de la cuantificación de los extractos, la ligación se realizó en función de una relación molar ADNp/inserto de 1:3. La reacción se realizó a 25°C durante 5 min (Quick ligation kit NEB). Después de la obtención de los diferentes plásmidos recombinantes, se realizó una amplificación por E. coli DH5a de los plásmidos construidos pAG425GAL-eGFPGmM, pAG425GAL-eGFPGm, pAG425GAL-eGFPEGM y pAG425GAL-eGFPEG
5. Amplificación de los plásmidos recombinantes por E. coli DH5a
La transformación de las bacterias E. coli DH5a se realizó por adición de 5 pl del producto de ligación por 50 pl de bacterias E. coli DH5a competentes. Se realizó una incubación de 30 min en hielo antes de inducir un choque térmico a 42°C durante 30 s. Después, las muestras se incubaron en hielo durante 5 min antes de ponerlas a 37°C durante 50 min en 300 pl de medio SOC. Las bacterias transformantes se esparcieron en cajas con medio LB 100 pg/ml de ampicilina.
Después del cultivo de los transformantes, se trasplantaron varios clones y se recogieron en medio líquido con el fin de extraer los plásmidos recombinantes. La extracción se realizó con la ayuda del kit PLASMID DNA PURIFICACIÓN™ (MACHEREY-NAGEL) según las recomendaciones del proveedor. Después de la purificación, se realizó una digestión enzimática por HpaI (NEW ENGLAND BIOLABS). Esta digestión se efectúo en las mismas condiciones que las de HindIII/SpeI (NEW ENGLAND BIOLABS). Para los plásmidos recombinantes, se observaron dos sitios de restricciones, mientras que para los plásmidos no recombinantes, se observó un solo sitio de restricción. Se pudieron encontrar tres perfiles: plásmido linealizado no digerido por HindIII/SpeI (9249 pb), plásmido linealizado digerido por HindIII/SpeI (7495 pb), y plásmido linealizado recombinante (6752 pb 2036 pb). Se realizó una secuenciación para los plásmidos recombinantes.
6. Transformación de las levaduras
6.1. Transformación con plásmido episómico
Los diferentes plásmidos recombinantes episómicos obtenidos se utilizaron para transformar las levaduras S. paradoxus y S. cerevisiae (véanse las figuras 7A y 7B).
Las levaduras se lavan con agua y después con acetato de litio 0,1 M (LiOAc). El residuo se resuspendió en 240 pl de PEG al 50%, 36 pl de LiOAc 1 M 8 pl de ADN plasmídico 5 pL de ADN de salmón desnaturalizado. La mezcla obtenida se agitó durante 1 min y después se incubó por lo menos 30 min a 25°C. Se indujo un choque térmico a 42°C o 37°C durante 20 min. Las células se lavan y después se resuspenden en agua destilada estéril. Las levaduras transformadas se esparcieron sobre la caja selectiva desprovista de Leucina (en el caso de la transformación de un plásmido que posee el gen Leu2 cuyo backbone (esqueleto) se denomina pAG425), de Uracilo (en el caso de la transformación de un plásmido que posee el gen URA3 cuyo backbone se denomina pAG426), de Leucina y Uracilo (en el caso de la transformación de dos plásmidos, uno que posee el gen URA3 cuyo backbone se denomina pAG426, y el otro que posee el gen Leu2 cuyo backbone se denomina pAG425).
Los ejemplos de cepas de S. paradoxus que ilustran esta transformación con un plásmido episómico se depositaron en la CNCM en virtud del Tratado de Budapest, véase a continuación la tabla 1.
6.2. Transformación con plásmido integrativo
El plásmido pRS306-GAL-GAG-EGFP se linealiza por digestión con AatII FastDigest (ThermoScientifique) en las siguientes condiciones: 2 pl de enzima AatII 2 pg de ADNpl pRS306-GAL-GAG-EGFP 5pl de tampón Green FastDigest Csp 50 pl de H2O. La reacción se incuba 25 min a 37°C. Después de la digestión, la mezcla de reacción se deposita sobre gel de agarosa al 0,6% con el fin de verificar que hubo digestión, y se realiza una extracción sobre gel del fragmento de interés con el kit PCR CLEAN-UP GEL EXTRACTION™ (MACHEREY-NAGEL) según las recomendaciones del proveedor.
Las levaduras se lavan con agua y después con acetato de litio 0,1 M (LiOAc). El residuo se resuspendió en 240 pl de PEG al 50%, 36 pl de LiOAc 1 M 8 pl de ADN plasmídico 5 pl de ADN de salmón desnaturalizado. La mezcla obtenida se agitó durante 1 min y después se incubó por lo menos 30 min a 25°C. Se indujo un choque térmico a 42°C o 37°C durante 20 min. Las células se lavan y después se resuspenden en agua destilada estéril. Las levaduras transformadas se esparcieron sobre la caja selectiva desprovista de Leucina y de Uracilo (en el caso de
la transformación de un plásmido que posee el gen URA3 cuyo backbone se denomina pRS306), de Leucina y Uracilo (en el caso de la transformación de dos plásmidos, uno que posee el gen URA3 cuyo backbone se denomina pRS306, y el otro que posee el gen Leu2 cuyo backbone se denomina pAG425).
Los ejemplos de cepas de S. paradoxus que ilustran esta transformación con plásmido integrativo se depositaron en la CNCm en virtud del Tratado de Budapest, véase a continuación la tabla 1.
Tabla 1:
7. Inducción de la expresión y extracción de los T-bodies
7.1. Inducción de galactosa
Con el objetivo de producir T-bodies y expresar la proteína Gag (SEC ID n°: 3) con o sin tag 6-His (SEC ID n°: 8, SEC ID n°: 10 y SEC ID n°: 12), se realiza una inducción de galactosa. Las células se centrifugan 10 min a 3000 rpm, y después se aclaran 2 veces con agua estéril. Las células se vuelven a sembrar después en el medio selectivo apropiado para los plásmidos episómicos y/o integrativos transformados desprovisto de glucosa y suplementado con un 2% de galactosa. La inducción se desarrolla durante una noche a 25°C. Se probaron diferentes técnicas de extracción mecánica para optimizar las condiciones de obtención de los retrosomas T (T-bodies o partículas pseudovirales).
7.2. Lisis mecánica con perlas
Las levaduras se centrifugaron 3 min a 3000 rpm, y después se lavaron en tampón de lisis frío (50 mM Tris pH 7,6; 50 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0,1% NPA; 1 mM p-mercaptoetanol; 1X PROTEASE INHIBITOR COMPLETE MINI EDTA FREE™; 0,4 U/pl RNASE INHIBITOR™). Las células se centrifugan, el residuo se recoge en tampón de lisis
frío adicionado con perlas. La mezcla obtenida se mezcló por vórtice sobre hielo durante 1 min. Se realiza una centrifugación de 2 min a 2000 g, y se recoge el sobrenadante, y después se centrifuga 10 min a 10000 g. El residuo se recogió en tampón de lisis frío y se incubó 30 min a temperatura ambiente. Se realizó una centrifugación de 10 min a 10000 g, y después se recogió el residuo en tampón de lisis frío.
7.3. Lisis mecánica por sonicación
Las levaduras se centrifugaron 10 min a 10000 g, y después se resuspendieron en BINDING BUFFER™ 1X que contenía 80 U/ml de liticasa con el fin de obtener unos esferoplastos. La suspensión se incubó 10 min a 25°C. Después de esta incubación, las levaduras se lisaron por sonicación sobre hielo a razón de 10 x 15 s al 70% con 15 s de enfriamiento entre cada sonicación. Se realizó una centrifugación de 15 min a 5000 g con el fin de recoger los cuerpos de inclusión y los desechos celulares.
7.4. Lisis química en hidróxido de sodio
Las levaduras se centrifugaron y se resuspendieron en una mezcla volumen a volumen de H2 O y NaOH 0,2M. La mezcla obtenida se incubó a temperatura ambiente durante 5 min y después se centrifugó 2 min a 14000 rpm. El residuo obtenido se recogió en LAEMMLI™ 2X para ser desnaturalizado durante 15 min a 95°C. Después de la desnaturalización, se realizó una centrifugación de 2 min a 8000 rpm, y el sobrenadante se recuperó en un nuevo tubo para conservarse a 4°C.
7.5. Lisis química Y-PERTM
El kit Y-PERTM YEAST PROTEIN EXTRACTION REAGENT™ (THERMOSCIENTIFIC) se utilizó según las recomendaciones del proveedor.
7.6. Lisis mecánica por homogeneización a alta presión
Las levaduras se lisan por homogeneización a alta presión, 3 pasadas a 2000 bar en el tampón de lisis (50 mM Tris pH 7,6, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,1% NP-40, 1 mM p-mercaptoetanol, 1 * inhibidor de proteasa completo mini sin EDTA, 0.4 U/pl RNase inhibitor) (V/V).
8. Dosificación proteica
La dosificación de los extractos proteicos se realizó mediante el método BCA (INTERCHIM).
9. Transferencia de Western SDS-PAGE
Las proteínas extraídas se separaron sobre gel SDS-PAGE en un tampón de migración 1 X. El gel de separación utilizado contenía un 12% de acrilamida. La migración se realizó durante 1h a 180V. El marcador de tamaño, el PRECISION PLUS PROTEIN™ KALEIDOSCOPE™ (BIO-RAD), se depositó a razón de 10 pl/pocillo. Después de la migración, las proteínas se transfirieron sobre una membrana de polifluoruro de vinilideno (PVDF) mediante una transferencia semiseca. La membrana de PVDF se activó previamente en metanol antes de realizar el montaje de la transferencia. El montaje se realizó de la siguiente manera, 5 papeles WHATMANN humidificados en tampón de transferencia 1X, la membrana de PVDF, el gel de separación de acrilamida al 12% y 5 papeles WHATMANN humidificados en tampón de transferencia 1X. La transferencia se realizó a 2,5 A; 25 V durante 7 min. La membrana se recuperó y después se lavó dos veces durante 10 min mediante TBS 0,1% TWEEN (TBST). Se realizó una saturación durante 1 h en TBST 0,1% 3-5% de leche. Después de la saturación, se realizaron tres lavados de 15 min en TBST al 0,1% y después se añadieron los anticuerpos primarios para incubación durante una noche a 4°C. Se diluyeron al 1/2000 en TBST al 0,1% un 3% de leche unos anticuerpos primarios de ratones anti-Ty1 y unos anticuerpos de conejos anti-6-His. Después de la incubación con los anticuerpos primarios, la membrana se lavó tres veces durante 15 min en TBST al 0,1%, y los anticuerpos secundarios se añadieron para incubación durante 1 h a temperatura ambiente bajo agitación. Los anticuerpos secundarios anti-IgG de ratones (HRP) y el anticuerpo anti-IgG de conejo (HRP) se diluyeron al 1/20000 en TBST al 0,1% un 3% de leche. Después de la incubación con los anticuerpos secundarios, las membranas se lavaron 3 veces 15 min en TBST al 0,1%. Las membranas se revelan después por CLARITY WESTERN ECL BLOTTING SUBSTRATE™ (BIO-RAD). Se preparó una mezcla volumen a volumen (1:1) de CLARITY WESTERN PEROXIDE REAGENT™ y CLARITY WESTERN LUMINOL/ENHANCER™ y se depositó sobre las membranas. La lectura se realizó con PIXI™ o por película fotográfica.
10. Análisis de la inmunofluorescencia con microscopio confocal
Con el fin de verificar que la presencia de la tag 6-His (SEC ID n°: 5) no interfiere en la formación de los retrosomas T (T-bodies), se realizó un marcado de estos T-bodies con la ayuda del par de anticuerpo anti-Tyl/FITC.
Antes del marcado, la inducción de la expresión de las diferentes proteínas se realizó durante una noche a 25°C
en -LEU un 2% de galactosa. Las levaduras se fijaron después con un 4% de formaldehído durante 1 h a 25°C. Las células se recuperaron después de la centrifugación de 3 min a 2000 rpm y se lavaron tres veces en una solución de 0,1M KHPO4 ; pH 6,5 y una vez en una disolución de 1,2M de sorbitol; 0,1M KHPO4 ; pH 6,5. El residuo se puso en suspensión en una solución de 1,2M de sorbitol; 0,1M KHPO4 ; pH 6,5, y después se añadió el residuo volumen a volumen en una solución compuesta por 1,2M de sorbitol; 0,1 M KHPO4 ; pH 6,5 adicionada con 1/100 de p-mercaptoetanol. La mezcla obtenida se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. La liticasa se añadió a una razón final de 50 U/ml antes de la incubación a 25°C durante 30 min. Los esferoplastos obtenidos se recuperaron por centrifugación de 2 min a 2000 rpm. Se realizó un lavado con una solución de 1,2M de sorbitol; 0,1M KHPO4 ; pH 6,5. Se añadió metanol frío a un volumen equivalente durante 6 min y después acetona fría durante 30 s. Se realizó un lavado con PBS suplementado con un 1% de BSA antes de saturar las levaduras durante 5-10 min en esta misma solución. La solución de saturación se eliminó, y el anticuerpo primario de ratones anti-Ty1 diluido al 1/1000 en PBS se puso en contacto con las levaduras durante una noche a 4°C. Al día siguiente, las levaduras se lavaron 5 veces en PBS 1% BSA. El anticuerpo secundario anti-IgG de ratones acoplado con fluoresceína (FITC) diluido al 1/2000 en PBS+BSA 1% se incubó durante 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, se efectuaron 5 lavados en PBS BSA al 1% y un lavado con una solución de 1,2M de sorbitol; 0,1 M KHPO4 ; pH 6,5. Las levaduras se resuspendieron en esta última solución antes de ser depositadas entre láminas y portaobjetos.
11. Análisis de la fluorescencia por citometría de flujo
Para determinar qué técnica de extracción permite recuperar la mayor cantidad de células positivas para Gag (SEC ID n°: 3), se utilizó un par de anticuerpos acoplado a fluorescencia, y después se analizó la fluorescencia por citometría de flujo.
Para 100 pl de extractos proteicos, se añadieron 400 pl de PBS suplementados con un 10% de suero fetal de ternera (SVF) y un 0,1% de RNAsin® (PROMEGA). El conjunto se incubó a 4°C durante 30 min. El anticuerpo primario de ratones anti-Ty1 diluido al 1/100, se incubó durante 1h a 4°C. El anticuerpo secundario anti-IgG de ratones Cy5 diluido al 1/200 se añadió y después se incubó durante 30 min a 4°C. Las muestras se analizaron por citometría de flujo.
12. Purificación por cromatografía de afinidad al níquel
La purificación se realizó con la ayuda del kit HIS BIND™ RESIN CHROMATOGRAPHY (NOVAGEN). La purificación se basó en la inmovilización de iones bivalentes de níquel (Ni2+) sobre una matriz de ácido nitrilotriacético (NTA). La tag 6-His (SEC ID n°: 6) añadida en fusión de la proteína Gag (SEC ID n°: 3) está constituida por varios núcleos de imidazoles que son donadores de electrones que permiten interactuar en gran medida con los iones Ni2+ inmovilizados sobre la matriz. La proteína Gag en fusión con una tag 6-His en Nter y/o Cter (SEC ID n°: 8, SEC ID n°: 10 y SEC ID n°: 12) se retiene sobre la columna de níquel. Después de la retención de la proteína sobre la columna, se añadió una alta concentración de imidazol para que desempeñara el papel de competidor en la interacción con Ni2+. Esta competición indujo una elución de la proteína Gag en fusión con una tag 6-His en Nter y/o Cter. La purificación se realizó mediante el kit HIS BIND™ RESIN CHROMATOGRAPHY (NOVAGEN), según las recomendaciones del proveedor, mediante dos métodos distintos:
- un método por lotes (método en batch) para bajas concentraciones de proteínas, con el objetivo de poner a punto la condición de elución óptima: este método consiste en realizar la purificación en un microtubo que contiene la matriz;
- un método en columna, con una mayor concentración de proteínas: la columna se conecta a una bomba peristáltica y a un espectrofotómetro UVICORDSII™ (AMERSHAM) que permite obtener una señal cuando se detecta una proteína.
13. Extracción de los ARN
Después de la purificación de las proteínas, se realizó una extracción de los ARN para cuantificar la proporción de ARN específica de Gag. Para un volumen mínimo de 200 pl de T-bodies purificados, se añadió un volumen de fenol ácido/cloroformo. La mezcla obtenida se mezcló en vórtice durante 1 min y después se centrifugó durante 5 min a 14000 rpm. Se recuperó el sobrenadante y se añadió un volumen de cloroformo. La mezcla obtenida se mezcló en vórtice durante 1 min y después se centrifugó durante 5 min a 14000 rpm. Se recuperó el sobrenadante y 1/10 volumen acetato de sodio 3 M, pH 5,2 así como 2,5 volúmenes (sobrenadante acetato de sodio) de etanol al 100%. La mezcla obtenida se incubó a -20°C durante la noche. Al día siguiente, la mezcla obtenida se centrifugó durante 15 min a 14000 rpm a 4°C. El residuo se secó y se resuspendió en 20 pl de agua sin nucleasas (Nuclease Free Water). Los ARN extraídos se cuantificaron con NANODROP™.
14. qRT-PCR
Los ARN extraídos se sometieron a transcripción inversa (reverse transcripción; RT) para la producción de ADN
complementario (ADNc) mediante el kit REVERTAID RT REVERSE TRANSCRIPCIÓN™ (THERMOFISHER SCIENTIFIC), según las recomendaciones del proveedor, utilizando 500 ng de ARN por reacción con los cebadores hexámeros aleatorios (random hexamerprimer) del kit. Los ADNc obtenidos se cuantifican con NANODROP™. La qPCR se realiza con la ayuda del kit QUANTIFFAST SYBR GREEN PCR™ (QUIAGEN), según las recomendaciones del proveedor. El intervalo patrón se realizó utilizando el plásmido pBDG1130 de 1 pg/pl a 0,1 pg/pl. Los cebadores utilizados: qGAGF (s Ec ID n°: 23) y qGAGR (SEC ID n°: 24) permitieron la amplificación de 277 pb de GAG. El programa utilizado para la amplificación fue el siguiente: en primer lugar, una pre-incubación a 50°C durante 2 min, y después una desnaturalización a 95°C durante 10 min, seguida de 40 ciclos a 95°C durante 15 s, 60°C durante 30 s, 72°C durante 30 s. Se produjo una curva de fusión al final del experimento para verificar la ausencia de contaminantes: 95°C durante 15 s, y después 50°C durante 1 min, y 95°C con adquisiciones cada 5°C.
Resultados
Selección y modificaciones de cepas de levadura (para una producción firme de ARNm en los retrosomas T (T-bodies))
El análisis de la expresión de la proteína Gag (49kDa; SEC ID n°: 3) sobre unas muestras de lisado celular de levaduras S. cerevisiae y S. paradoxus confirma que la cepa S. paradoxus está desprovista del elemento de retrotransposición Ty1 (véase la figura 1A).
La transformación de la levadura S. paradoxus con un plásmido que codifica para la eGFP bajo el control de un promotor inducible por galactosa muestra que las mutaciones transcripcionales ASpt21y/o ASrb2 permiten un aumento significativo del número de células eGFP positivas, así como de la intensidad de la fluorescencia. Los resultados se ilustran en la figura 1B.
Construcción de vectores de expresión que permite la formación de T-bodies y el reconocimiento de los ARNm EGFP en los T-bodies
Se realizaron los análisis por microscopia confocal de fluorescencia de la expresión de eGFP y de la proteína de fusión Gag-eGFP en la levadura S. paradoxus y los mutantes transcripcionales ASpt21 y ASrb2. Los resultados se ilustran mediante las figuras 2A y 2b . Se observa un aumento del número de células positivas en los T-bodies (figura 2A) así como un aumento del número de T-bodies por células en los mutantes transcripcionales ASpt21 y ASrb2 (figura 2B).
Se realizó el análisis por citometría de flujo de la expresión de T-bodies eGFP (proteína de fusión Gag-eGFP) en el mutante de transcripción de la levadura S. paradoxus ASrb2 después de un tratamiento de 8 horas con tunicamicina (TUNI) (la tunicamicina es un antibiótico producido por las bacterias del género Streptomyces que tiene una acción sobre la N-glicosilación y sobre el ciclo celular). Los resultados se ilustran en la figura 2C. Un tratamiento de 8 horas con tunicamicina provoca un aumento del número de T-bodies (un 11% frente a un 48%).
Se realizaron unos experimentos de hibridación in situ en fluorescencia (fluorescence in situ hybridization; FISH) para localizar los ARNm modelo que codifican la proteína eGFP, mediante la utilización de cebadores dirigidos al ARNm eGFP marcado Cy5 sobre la levadura S. paradoxus ASrb2 transformada con un plásmido de fusión GageGFP o con un plásmido de fusión MiniGag-eGFP. Los resultados se ilustran en las figuras 3A y 3B.
Se observa una perfecta colocalización entre la proteína Gag y el ARNm correspondiente (figura 3A). Se realizó un estudio para buscar la secuencia nucleotídica Gag delecionada que permite un reconocimiento de los ARNm en los T-bodies. Esta secuencia se denomina MiniGag en la figura 3B.
Purificación de los T-bodies
El protocolo de extracción de los T-bodies en la levadura S. paradoxus que expresa la proteína de fusión GageGFP después de la inducción con galactosa se basa en una lisis mecánica de las levaduras seguida por unas centrifugaciones diferenciales.
Se probaron dos técnicas diferentes de extracción mecánica (método de lisis con perlas y por sonicación). Los resultados se ilustran en las figuras 4A (perlas de vidrio) y 4B (sonicación). Después de la extracción con la ayuda de perlas de vidrio (figura 4A), los T-bodies aparecen como partículas de aspecto esférico y un diámetro de 200 nm. Por el contrario, el método de lisis por sonicación induce una destrucción de los T-bodies con desechos observables en microscopía electrónica (figura 4B). El método de lisis con perlas parece ser, por lo tanto, el más adecuado para obtener más T-bodies íntegros.
La purificación de los T-bodies se efectuó sobre columna de níquel gracias a la presencia de la unidad 6 histidinas (tag 6His). Se realizaron tres construcciones, en las que la proteína Gag dispone de una tag 6His: - en N-terminal (6His-GAG), - en C-terminal (GAG-6His), - en N y C-terminal (6His-GAG-6His). Estas construcciones se
transformaron en el mutante ASrb2 de la levadura S. paradoxus. La formación de los T-bodies se observó por inmunofluorescencia (figura 5A). La expresión de la proteína Gag se verificó por transferencia Western (figura 5B). La purificación se realizó sobre columna de níquel por competición con imidazol. Los resultados se ilustran en la figura 5C (elución de los T-bodies a 800 mM de imidazol para la construcción GAG-6His).
Ejemplo 2
Se transformaron unas levaduras Saccharomyces de especies distintas a paradoxus (en este caso, levaduras S. cerevisiae), y unas levaduras de géneros distintos a Saccharomyces (en este caso, levaduras de género Pichia) mediante las construcciones plasmídicas descritas en el ejemplo 1 anterior, a saber mediante:
- una construcción plasmídica que codifica la proteína Gag (bajo el control de un promotor inducible), eventualmente en fusión con una etiqueta de purificación (tag 6His) o con un marcador de detección (eGFP) [véase la figura 6A construcción i.; véase la figura 7A], y mediante
- una construcción plasmídica que codifica un ARN heterólogo de interés enlazado a una secuencia de direccionamiento retrosomal (bajo el control de un promotor inducible), por ejemplo una construcción plasmídica que contiene (en inserto) un ADN que codifica un ARNm de eGFP (a título de ARN heterólogo) enlazado (en el extremo 3') a una secuencia de ADN GAG desprovista del promotor de expresión de la proteína Gag (a título de secuencia de direccionamiento retrosomal) [véase la figura 6A construcción ii.; véase la figura 7B].
Las levaduras así transformadas producen unos retrosomas que contienen el ARN heterólogo, sin retrotranscribir este ARN ni retrointegrarlo.
Se depositaron unas muestras de algunas de estas levaduras en la CNCN en virtud del Tratado de Budapest.
Tabla 2:
Ejemplo 3: Transfección (y expresión) de ARN extraídos de los T-bodies (partículas pseudovirales) en unas células dendríticas de mamífero
Se produjeron unos ARN tal como se describen en el ejemplo 1 y se transfectaron (por vía liposómica) en unas células de mamífero, en este caso unas células dendríticas. Los experimentos de transfección de ARN se realizaron en unas células dendríticas de ratones (línea DC2.4, disponible en THERMOFISHER SCIENTIFIC).
Se transfectaron los ARNm eGFP que se produjeron en la levadura S. paradoxus ASrb2 (véase el ejemplo 1 anterior) transformada por:
una construcción responsable de la formación de la estructura de los T-bodies (plásmido que codifica la proteína Gag de SEC ID n°: 3; figura 6A (i)), y
una construcción que permite la transcripción de un ARN eGFP que dispone, en el extremo 3', de una secuencia miniGAG (“EndGAG”; SEC ID n°: 14) que dirige este ARN eGFp dentro de los T-bodies (figura 6A (ii)).
Los ARNm eGFP producidos en los T-bodies de esta levadura se extrajeron y se purificaron como se describe en el ejemplo 1 anterior (extracción de los T-bodies por vía mecánica -perlas-, y después purificación de los ARNm eGFP contenidos en estos T-bodies), y después se vectorizaron en unos liposomas catiónicos (liposomas 100 o Lip100). Los liposomas 100 están compuestos a partes iguales por un lípido catiónico (lípido 1), y por un colípido neutro sensible al pH (lípido 2). El lípido 1 es un lípido catiónico de carga permanente portada por un grupo N-metilimidazolio, para la complejación de los ácidos nucleicos. El lípido 2 es protonable a pH ácido, lo cual favorece el escape endosomal después de la desestabilización de la membrana en medio ácido. En estos lípidos no es un amonio cuaternario, sino un átomo de fósforo el que hace de enlace entre las cadenas carbonadas y el núcleo de imidazol. Estos lípidos son unos lipofosforamidatos cuya estructura está inspirada en la de los lípidos de las membranas que son menos tóxicas tanto in vitro como in vivo. Los liposomas 100 se describen, en particular, en Perche et al. 2010, Perche et al. 2011, Mével et al. 2008a, y Mével et al. 2008b.
Las células dendríticas de ratones se incubaron durante 20 horas con estos liposomas, o bien con ARN sintéticamente producido in vitro a título de control.
Los resultados se ilustran en la figura 6B. El ARNm producido sintéticamente in vitro a título de control da sólo un porcentaje muy bajo de transfección, del 0 al 1,5%, con una dosis de 100 ng de ARNm eGFP in vitro (figura 6B; citograma de la izquierda). Por el contrario, después de la transfección con la ayuda de los liposomas que contienen el ARN de los T-bodies, el 32.77% de las células expresan la proteína fluorescente (figura 6B; citograma de la derecha).
Estos resultados ilustran el hecho de que los ARNm producidos por los T-bodies de levadura de la solicitud se pueden transfectar en una célula de mamífero, más particularmente en una célula dendrítica, y que la proteína que estos ARNm codifican puede traducirse correctamente en esta célula hospedante. Estos resultados respaldan las aplicaciones médicas, y en particular vacunales, de los ARN producidos por estos T-bodies (vacunación con ARN).
Ejemplo 4: Estudio por espectrometría de masas de las modificaciones postranscripcionales presentes en unos ARN extraídos de los T-bodies (partículas pseudovirales)
Se realizó un estudio por espectrometría de masas de las modificaciones químicas presentes a nivel del ARN mensajero modelo luciferasa bioproducido como se describe en el ejemplo 1 después de "pulí out" el ARNm luciferasa de la siguiente manera.
Se realiza una primera etapa de hibridación entre 10 pg de ARN extraído de los complejos, gránulos, partículas pseudovirales y 1 pM de oligonucleótido de ADN monocatenario biotinilado en el extremo 3', complementario de la secuencia del ARN luciferasa bioproducido (5'-TCCATCTTCCAGCGGATAGAATGGCGCCGGGCCTTTCTTTATGTTTTTGGCGTC TTCCATAAA 3') en tampón SSC 5X (cloruro de sodio 750 mM y citrato trisódico 75 mM (ajustado a pH 7,0 con HCl) en un volumen final de 100 pl. El volumen de reacción se incuba durante 3 min a 90°C, y después 10 min a 65°C. La reacción de hibridación se conserva después a temperatura ambiente. Paralelamente, se lavan unas perlas magnéticas MyOneT1 Dynabeads injertadas con estreptavidina. Se extraen 100 pl de perlas mediante pipeteo y se mezclan en un vórtice a la mitad de la velocidad. Para separar las perlas del sobrenadante, las perlas se centrifugan brevemente, y después se colocan sobre un soporte magnético durante 2 min, y se retira el sobrenadante delicadamente (el tubo está todavía sobre el soporte magnético). Las perlas se resuspenden en un volumen igual de tampón B&W 1X (5 mM Tris-HCl (pH 7,5) 0,5 mM EDTA 1 M NaCl). Esta etapa se repite 3 veces. Se realiza un último lavado en tampón SSC 5X. La reacción de hibridación se pone en presencia de las perlas mezcladas en un vórtice a la mitad de la velocidad y se agitan (600 rpm) durante 30 min a 25°C. Las perlas se lavan una vez en 50 pl de tampón SSC 1X y 3 veces en 25 pl de SSC 0,1X. El sobrenadante se retira y las perlas se resuspenden en 25 pl de agua MilliQ. Las perlas se calientan a 75°C durante 3 min Las perlas se centrifugan brevemente, y después se colocan sobre un soporte magnético durante 2 min., se recoge el sobrenadante (tubo todavía sobre el soporte magnético) y se transfiere a un nuevo tubo. En la etapa de elución, una parte del oligonucleótido inmovilizado se escinde de las perlas, se puede eliminar por digestión con ADNasa1 (RNase-free, 3,5 U/pl final) durante 2 horas a 37°C. La muestra se puede conservar a -20°C. El volumen de la muestra se lleva a 180 pl gracias al agua MilliQ, se añaden 18 pl de solución de acetato de sodio 3 M y 2 pl de glicógeno (10 mg/m), y se mezcla en un vórtice. Se añaden 600 pl de etanol al 100%. La reacción se mezcla en un vórtice y después se incuba a -20°C por lo menos durante 1 hora. La reacción se centrifuga después a 10000 g durante 30 min a 4°C. El residuo se aclara 2 veces con 200 pl de etanol al 70% y después se seca a temperatura ambiente durante 5 min. El residuo se recoge después en agua MilliQ.
Sobre esta muestra se realizó un estudio en espectrometría de masas de las modificaciones químicas presentes a nivel del ARN mensajero bioproducido. Esta técnica se basa en un análisis por espectrometría de masas (LC-MS) de los fragmentos obtenidos después de la hidrólisis completa por ARNasa T1 del ARN estudiado. Se digiere 1 pg de ARN en nucleósidos, y se añade el patrón interno (SlLlS).
El cromatograma resultante que muestra las modificaciones comunes del ARN eucariota corresponde a la figura 8. Gracias a esta técnica, se selecciona una veintena de modificaciones de ribonucleósidos características de los eucariotas (véase la figura 8A). Numerosas modificaciones ya no son detectables entre el ARN antes y después del "pulí out" en el ARN purificado (véase la figura 8). Algunas modificaciones son detectables después de la purificación "pulí out
- m5U, 5-metiluridina;
- m5C, 5-metilcitidina;
- m1A, 1-metiladenosina;
- Gm, 2'-O-metilguanosina;
- M7G, 7-metilguanosina;
- Am, 2'-O-metiladenosina;
- Cm, 2'-O-metilcitidina; y
- m3C, 3-metilcitidina.
Ejemplo 5: Estabilidad de la expresión de ARN extraídos de los T-bodies (partículas pseudovirales) en unas células dendríticas de mamífero
Se transfectaron unos ARN luciferasa producidos y modificados in vitro (caperuza ARCA, cola PoliA64+ o pseudouridina) en unas células dendríticas murinas (DC2.4) en paralelo con un ARN luciferasa bioproducido en levadura (véase la figura 9):
■ Los ARN encaperuzados se producen mediante transcripción in vitro por la polimerasa T7 a partir de matrices de ADN linealizadas. Se utilizó el kit de transcripción Ambion mMessage mMachine™ ULTRA según el protocolo del proveedor. La mezcla de transcripción contiene un análogo de la caperuza m7G(5')ppp(5')G de los ARNm (anti-reverse cap analog (ARCA)) que es incorporado por la T7 polimerasa en el extremo 5' de los transcritos.
■ La cola PoliA64+ se añade in vitro con la ayuda del reactivo E-PAP para una poliadenilación suplementaria.
■ La pseudouridina (N1-Metilpseudouridina-5'-Trifosfato - 100 mM - Trilink) se incorpora a la mezcla de reacción (1,5 pl de pseudouridina por 20 pl de volumen de reacción) con el fin de incorporar in vitro el 50% de pseudouridina en la composición del ARN sintetizado.
■ Los ARN bioproducidos se produjeron como se describe en el ejemplo 1.
Se vectorizaron 50 ng de cada uno de los ARN utilizando la Lipofectamina Messenger Max, y se midió in vitro la actividad luciferasa en las células transfectadas. Se observa que el ARN luciferasa bioproducido en los T-bodies (TB) de levaduras es más eficaz (3 logs de diferencia) que el más eficaz de los ARN sintetizados in vitro (véase la figura 9).
Ejemplo 6: Producción preindustrial de ARN extraídos de los t-bodies
Se obtuvieron unos ARN bioproducidos en levadura en la fase preindustrial a través de la realización del protocolo siguiente:
1/ se realizan 3 precultivos (PC) en medio YNB (6,7g/l) CSM -URA-LEU (0,79 g/l) Glucosa (20 g/l) esterilizado en autoclave a 25°C bajo agitación (230 rpm) de la siguiente manera:
a. PC1: 5 ml a 25°C durante 24 h a partir de un clon aislado;
b. PC2: 100 ml (3,5 ml PC1 96,5 ml de medio) a 25°C durante 24 h; y después
c. PC3: 400 ml (inoculación a DO6 0 0nm 0,1 a partir de la PC2) a 25°C durante 24h.
2/ Se inocula un fermentador (capacidad de 5 l) a DO 0,2 (a partir de la PC3) en medio YNB (6,7 g/l) CSM -URA-LEU (0,79 g/l) Glucosa (20 g/l). Se añade un antiespumante de tipo EX-CELL® Antifoam: pulso 0,5% (v/v) al final del día. La agitación del fermentador se fija a 1000 rpm en “local” y después se pasa a “remoto” cuando el valor de la pO2 está un 10% por debajo del valor de referencia. El pH se mantiene a 5,4 y se ajusta a partir de soluciones de ácido fosfórico (1,2 M) y de amoniaco al 20% estériles.
3/ En paralelo, se realiza un feeding galactosa. El desencadenamiento de esta feeding galactosa se programa sobre el pico pO2 con, como consigna pO2 : 40%. Siendo el aumento de pO2 dependiente del consumo total de glucosa. Esta feeding de galactosa se realiza a partir de una solución al 20% de galactosa estéril para una concentración final del 2%. La duración de la inducción se fija en 24h.
4/ Pasadas estas 24 h, el volumen de cultivo se recoge y se centrifuga a 4000 rpm durante 15 min.
5/ Los T-bodies se extraen como se describe en el ejemplo 1.
6/ Los ARN bioproducidos en levadura se extraen de los T-bodies como se describe en el ejemplo 1.
Referencias bibliográficas
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Mével et al. 2008b Novel neutral imidazole-lipophosphoramides for transfection assays. Chem Commun. 3124 316.
Perche et al. 2010 Selective gene delivery in dendritic cells with mannosylated and histidylated lipopoliplexes.
Claims (10)
1. Procedimiento de producción recombinante de ARN mensajero (ARNm) o de ARN largo no-codificante (ARNInc), que comprende:
- el hecho de cultivar unas células de levadura, que han sido modificadas genéticamente para producir unas partículas pseudovirales recombinantes que comprenden dicho ARNm o ARNlnc, y
- el hecho de recoger el ARNm o ARNlnc que está contenido en las partículas pseudovirales así formadas, en el que las células de levadura son unas células de una levadura que está naturalmente desprovista de retrotransposón Ty, o que ha sido modificada genéticamente para no producir ningún retrosoma T,
en el que las modificaciones genéticas aportadas a estas células de levadura para que produzcan dichas partículas pseudovirales comprenden la transfección de estas células de levadura mediante
i. un ácido nucleico que comprende una primera secuencia nucleotídica, y
ii. un ácido nucleico que comprende una segunda secuencia nucleotídica,
en el que:
- el ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. son una sola y misma molécula, o bien dos moléculas distintas o separadas,
- la primera secuencia nucleotídica comprende una secuencia de ADN que codifica la expresión de la proteína Gag de un retrotransposón Ty de levadura,
- la segunda secuencia nucleotídica comprende una secuencia de ADN cuyo transcrito ARN es:
a. la secuencia de dicho ARNm o ARNlnc, enlazada a
b. una secuencia de direccionamiento que comprende un fragmento de la secuencia de ARN cuya traducción en aminoácidos es la secuencia de dicha proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura, siendo este fragmento de por lo menos 150 nucleótidos y no comprende el codón de inicio de traducción de esta secuencia de ARN, y
no presentando la secuencia de ADN de esta segunda secuencia nucleotídica ningún marco de lectura cuyo primer codón sería el codón ATG,
- el ácido nucleico de ii. no comprende ninguna secuencia de ADN cuyo transcrito ARN sería la secuencia de ARN completa de dicha proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura,
- la proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura es una proteína Gag de retrotransposón Ty1, Ty2 o Ty3 de levadura, y la secuencia de esta proteína Gag es la secuencia de SEC ID n°: 3 o una secuencia que es idéntica en por lo menos un 90% a la secuencia de SEC ID n°: 3, y
- el ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. no comprenden ninguna secuencia que codifica la transcriptasa inversa de un retrotransposón Ty1 de levadura,
codificando así el ácido nucleico de i. y el ácido nucleico de ii. la formación, en dichas células de levadura, de partículas pseudovirales que están formadas por la proteína Gag traducida a partir de la primera secuencia nucleotídica, y que encapsulan dicho ARNm o ARNlnc transcrito a partir de la segunda secuencia nucleotídica.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho fragmento de secuencia de ARN, que está comprendido en dicha secuencia de direccionamiento b., es la secuencia de SEC ID n°: 16, o un fragmento de por lo menos 150 nucleótidos de la secuencia de SEC ID n°: 16.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que la levadura es una levadura del género Saccharomyces o Pichia, más particularmente una levadura de la especie Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces cerevisiae, o Pichia pastoris.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la levadura es una levadura de la cual uno o varios de los genes rpbl, spt21, srb2 y srb5 han sido mutados por una o varias mutaciones que comprenden una o varias mutaciones seleccionadas de entre:
- el reemplazo de uno o varios codones, cada uno por otro codón o por otro triplete de nucleótidos, y
- la deleción de uno o varios nucleótidos,
y que estimulan o aumentan la producción de partículas pseudovirales.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el ARNm o ARNlnc comprende por lo menos 120 nucleótidos y es heterólogo a dicha levadura, y en el que el ARNm o ARNlnc codifica opcionalmente:
- una proteína o un polipéptido de bacteria,
- una enzima de edición genómica,
- una proteína o un polipéptido de virus,
- un factor de transcripción humano,
- un factor de crecimiento humano,
- una proteína CFTR humana,
- un anticuerpo o fragmento de anticuerpo,
- un polipéptido que comprende por lo menos un epítopo de antígenos.
6. Kit que está adaptado especialmente para la realización del procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que el kit comprende por lo menos un ácido nucleico que comprende una primera secuencia nucleotídica y por lo menos un ácido nucleico que comprende una segunda secuencia nucleotídica, en la que:
- la primera secuencia nucleotídica comprende una secuencia de ADN que codifica la expresión de la proteína Gag de un retrotransposón Ty de levadura,
- la proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura es una proteína Gag de retrotransposón Ty1, Ty2 o Ty3 de levadura, y la secuencia de esta proteína Gag es la secuencia de SEC ID n°: 3 o una secuencia que es idéntica en por lo menos un 90% a la secuencia de SEC ID n°: 3, y
- la segunda secuencia nucleotídica comprende una secuencia de ADN que comprende la secuencia de SEC ID n°: 16 o un fragmento de por lo menos 150 nucleótidos de la secuencia de SEC ID n°: 16, no comprendiendo la secuencia de ADN de esta segunda secuencia nucleotídica ningún marco de lectura cuyo primer codón sería el codón ATG,
- el ácido nucleico que comprende la segunda secuencia nucleotídica no comprende ninguna secuencia de ADN cuyo transcrito ARN sería la secuencia de ARN completa de dicha proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura, y
- el ácido nucleico que comprende la primera secuencia nucleotídica y el ácido nucleico que comprende la segunda secuencia nucleotídica son una sola y misma molécula, o bien dos moléculas distintas o separadas,
no comprendiendo dicho kit ninguna transcriptasa inversa de retrotransposón Ty de levadura, ni ácido nucleico que codifique dicha transcriptasa inversa, ni ácido nucleico que comprenda una secuencia que codifica dicha transcriptasa inversa, y
pudiendo dicho kit comprender además, opcionalmente, unas células de una levadura que está naturalmente desprovista de retrotransposón Ty, o que ha sido modificada genéticamente para no producir ningún retrosoma T.
7. Cepa recombinante de levadura que está adaptada especialmente para la realización del procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que:
- la cepa de levadura está desprovista de retrotransposón Ty1, Ty2 y Ty3, y
- la cepa de levadura no comprende ninguna transcriptasa inversa de retrotransposón Ty de levadura, ni ácido nucleico que codifique dicha transcriptasa inversa, ni ácido nucleico que comprenda una secuencia que codifica dicha transcriptasa inversa,
- la cepa de levadura ha sido modificada genéticamente para comprender por lo menos un ácido nucleico que comprende una primera secuencia nucleotídica y por lo menos un ácido nucleico que comprende una segunda secuencia nucleotídica, en la que:
- la primera secuencia nucleotídica comprende una secuencia de ADN que codifica la expresión de la proteína Gag de un retrotransposón Ty de levadura,
- la proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura es una proteína Gag de retrotransposón Ty1, Ty2 o Ty3 de levadura, y la secuencia de esta proteína Gag es la secuencia de SEC ID n°: 3 o una secuencia que es
idéntica en por lo menos un 90% a la secuencia de SEC ID n°: 3,
- la segunda secuencia nucleotídica comprende una secuencia de ADN cuyo transcrito ARN comprende la secuencia de SEC ID n°: 16 o un fragmento de por lo menos 150 nucleótidos de la secuencia de SEC ID n°: 16, y la secuencia de ADN de esta segunda secuencia nucleotídica no comprende ningún marco de lectura cuyo primer codón sería el codón ATG,
- el ácido nucleico que comprende la segunda secuencia nucleotídica no comprende ninguna secuencia de ADN cuyo transcrito ARN sería la secuencia de ARN completa de dicha proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura, y
- el ácido nucleico que comprende la primera secuencia nucleotídica y el ácido nucleico que comprende la segunda secuencia nucleotídica son una sola y misma molécula, o bien dos moléculas distintas o separadas.
8. Partícula pseudoviral recombinante, que es susceptible de ser obtenida mediante la recogida de una partícula pseudoviral producida cuando tiene lugar la realización del procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que la partícula pseudoviral recombinante comprende un ARN encapsulado por un polímero proteico, en la que:
- el polímero proteico comprende la proteína Gag de un retrotransposón Ty de levadura,
- la proteína Gag de retrotransposón Ty de levadura es una proteína Gag de retrotransposón Ty1, Ty2 o Ty3 de levadura, y la secuencia de esta proteína Gag es la secuencia de SEC ID n°: 3 o una secuencia que es idéntica en por lo menos un 90% a la secuencia de SEC ID n°: 3,
- la secuencia nucleotídica del ARN encapsulado comprende la secuencia de SEC ID n°: 16 o un fragmento de por lo menos 150 nucleótidos de la secuencia de SEC ID n°: 16, pero no comprende ningún marco de lectura cuyo primer codón sería el codón ATG, y no comprende la secuencia de ARN que es el transcrito ARN de la SEC ID n°: 2, y
- la partícula pseudoviral VLP no comprende ni transcriptasa inversa, ni ácido nucleico que codifique una transcriptasa inversa, ni ácido nucleico que comprenda una secuencia que codifica dicha transcriptasa inversa.
9. Utilización in vitro del kit según la reivindicación 6, o de la cepa recombinante de levadura según la reivindicación 7, o de la partícula pseudoviral recombinante según la reivindicación 8, para la producción de ARNm o ARNlnc que presenta una cola poliA en el extremo 3' y/o una caperuza 7-metilguanosina en el extremo 5'.
10. Procedimiento para la producción de una composición farmacéutica que comprende por lo menos un ARNm o ARNlnc, comprendiendo dicho procedimiento el hecho de producir un ARNm o ARNlnc mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y el hecho de colocar este ARNm o ARNlnc en un vehículo farmacéuticamente aceptable para producir una composición farmacéutica, estando esta composición farmacéutica destinada opcionalmente a:
- la prevención o al tratamiento de una infección microbiológica,
- la prevención o al tratamiento de una proliferación tumoral,
- la prevención o al tratamiento de una enfermedad crónica,
- una terapia por regeneración tisular o celular, o
- una terapia génica.
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