ES2903164T3 - Diaminas primarias vecinas asociadas a motivos quelantes de metales y/o de radicales libres, activas contra al estrés carbonílico y oxidativo y su uso - Google Patents

Diaminas primarias vecinas asociadas a motivos quelantes de metales y/o de radicales libres, activas contra al estrés carbonílico y oxidativo y su uso Download PDF

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Nobumichi André Sasaki
Pascal Sonnet
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Abstract

Compuesto de fórmula I: **(Ver fórmula)** y sus sales, en la que n es un número entero de 1 a 6; X es CO o CH2; Y es NR1R2 o R2 o **(Ver fórmula)** R1 es H o alquilo o alquil-arilo; R2 es Z-L-R3; Z es inexistente, CO o CH2; L es inexistente, CH=CH o (CH2)m; m es un número entero de 1 a 6; R3 es fenilo, sustituido con al menos un grupo OH y uno o más sustituyentes seleccionados entre OH, alcoxi C1 a C4 y alquilo C1 a C4, o R3 es N-piridinonilo, sustituido con al menos un grupo OH y opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados entre OH, alcoxi C1 a C4 y alquilo C1 a C4.

Description

DESCRIPCIÓN
Diaminas primarias vecinas asociadas a motivos quelantes de metales y/o de radicales libres, activas contra al estrés carbonílico y oxidativo y su uso
Sector de la técnica
La presente invención se refiere a nuevos derivados de diamina captadores de alfa-oxoaldehídos (a-oxoaldehídos) y aldehidos alfa, beta-insaturados (aldehidos a,p-insaturados) y quelantes de metales, así como sus usos, concretamente en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o afecciones asociadas con la acumulación de AGE (inglés: Advanced Glycation Endproducts) y/o ALE (inglés: Advanced Lipid Peroxidation Endproducts).
Estado de la técnica
Durante la glucólisis y la peroxidación lipídica, compuestos de carbonilo se forman y reaccionan con los grupos nucleófilos de las proteínas (lisina, arginina, cisterna...) para dar los AGE ("Advanced Glycation Endproducts" en Inglés) (Pathologie, Biologie, 2006, 54, 405-419) y los ALE ("Advanced Lipid Peroxidation Endproducts") (Br. J. Pharm., 2008, 153, 6-20). Por lo tanto, los AGE aparecen como modificaciones perjudiciales de las proteínas después de la formación de una base de Schiff, seguida por un reordenamiento de Amadori, de sus grupos amino libres con diversos derivados de a-oxoaldehído tales como, por ejemplo, glioxal (GO), metilglioxal (MGO) y desoxiglucosona (3-DG), resultantes del metabolismo oxidativo de los glúcidos (Diabetes Res. Clin. Pract. 2013, 99, 261-271). De la misma forma, los ALE se forman después de la adición 1,2 o 1,4 de Michael de estos grupos amino de las proteínas en aldehídos a,p-insaturados tales como malondialdehído (MDA), acroleína, 4-hidroxinonenal (4-HNE) o 4-hidroxi-2-hexanal (4-HHe ), resultantes de la degradación de ácidos grasos poliinsaturados bajo el efecto del estrés oxidativo inducido concretamente por los metales de transición (Cu2+, Fe3+) (Prog. Lipid Res., 2003, 42, 318-343). Además, estos derivados de carbonilo tóxicos también pueden reaccionar según un proceso no enzimático con las bases del ADN para dar AGE/ALE ramificados o no. Existen mecanismos de detoxificación enzimática como el sistema glioxalasa dependiente de glutatión (GSH) (glioxalasas I y II) que transforma los compuestos carbonílicos reactivos en D-lactato, glicolato o acetol, pero su disfunción podrá conducir a una acumulación de AGE.
La acumulación de AGE tiene dos consecuencias biológicas principales. En primer lugar, pueden estar en el origen de una reticulación proteica observada sobre todo en proteínas de larga vida útil tales como, por ejemplo, colágeno, proteínas del cristalino, fibronectina, albúmina y hemoglobina. De este modo, este fenómeno desempeña un papel preponderante en la aparición de diversas disfunciones (pérdida de elasticidad del tejido cutáneo o del endotelio vascular, pigmentación de la piel...) y patologías relacionadas con la edad (cataratas, reumatismo...). A continuación, el estrés oxidativo promovería la aparición de reacciones inflamatorias y trombogénicas, pero también la apoptosis a través de una interacción entre los AGE y sus receptores específicos (RAGE). De este modo, estos mecanismos estarían implicados concretamente en la aparición de aterosclerosis y diversas complicaciones, concretamente complicaciones microangiopáticas relacionadas con la diabetes, tales como trastornos cardiovasculares, nefropatías, retinopatías, neuropatías, etc. (Biofactors 2012, 38, 266-274; Int. J. Mol, Med., 2010, 26, 813-818; Mol. Metabolism, 2014, 3, 94-108). Ahora bien, la acumulación de AGE asociada con el desequilibrio oxidativo inducido por la sobreproducción de especies reactivas de oxígeno (ERO) y el estancamiento de los sistemas de defensa celular antioxidantes que se encuentra en los diabéticos, también estará en el origen de la exacerbación de la peroxidación lipídica (Chem. Biol. Interact., 2008, 171, 251-271). Esta cascada oxidativa generará por lo tanto en paralelo la formación de ALE tales como el complejo entre la apolipoproteína B de LDL (Low Density Lipoproteins) nativos y la MDA implicado en la génesis de LDL oxidados. Estos últimos serán absorbidos después por macrófagos que, una vez cargados con gotitas lipídicas, se transformarán en células espumosas, constitutivas de la placa de ateroma (Int. J. Mol, Med., 2010, 26, 813-818).
De la misma forma, tras la exacerbación del estrés oxidativo y de la peroxidación lipídica, niveles significativos de ALE asociados con proteínas neuronales se encuentran en pacientes que padecen enfermedades neurodegenerativas tales como, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. De este modo, en el caso de la enfermedad de Alzheimer, el modelo fisiopatológico de la cascada p-amiloide tendería a probar que la acumulación de placas p-amiloides, que constituyen uno de los marcadores predominantes de la enfermedad, estaría en el origen de una cascada oxidativa perjudicial (Trends Mol. Med. 2001, 7, 548-554; Free Radic. Biol. Med., 2002, 32, 1050-1060). En efecto, bajo la influencia de diversos factores genéticos y ambientales, la escisión por la p-secretasa del péptido precursor amiloide (APP) se vuelve preferencial en detrimento de la vía de degradación que implica a la a-secretasa. Después se forman monómeros Ap no tóxicos que, después de la agregación inducida por iones metálicos, se transforman en oligómeros tóxicos, constitutivos de las placas pamiloides en el origen de una exacerbación del estrés oxidativo (Chem. Eur. J., 2012, 18, 15910-15920; Neurochem. Int., 2013, 62, 367-378). Finalmente, la neurotoxicidad de los aldehídos a,p-insaturados que resultan de la peroxidación lipídica, estará implicada en gran medida en la aparición de la demencia (Curr. Alzheimer Res., 2011, 8, 452-469). Entre estos últimos, cabe mencionar la acroleína, que aparece como compuesto más reactivo con respecto a residuos de cisteína, histidina y lisina de proteínas o 4-HNE. La acroleína conducirá así a la formación de ALE, en el origen de una alteración del citoesqueleto y de la aparición de degeneración neurofibrilar, otro marcador importante de la enfermedad de Alzheimer. A continuación, el 4-HNE inducirá una desestabilización a nivel de la membrana neuronal, concretamente después de la formación de ALE en los canales iónicos y finalmente un desequilibrio cálcico en el origen de la apoptosis. Además, los ALE resultantes de la condensación de MDA en residuos de lisina de las proteínas podrían ser identificados en forma de derivados de dihidropiridina y participarían en la reducción de la resistencia de la piel a los rayos UV que contribuiría a envejecimiento cutáneo y, opcionalmente, al desarrollo de cánceres de piel (Mech. Ageing Dev., 2001, 122, 735-755). Finalmente, el MDA también puede comportarse como mutágeno después de la reacción sobre las funciones amina de las bases del ADN y concretamente la desoxiguanosina y promover de este modo el desarrollo de ciertos cánceres (Toxicology, 2002, 181-182, 219-222). Ahora bien, cabe señalar que este tipo de modificación del ADN también se ha descrito en la bibliografía en forma de aductos con MGO (Chem. Res. Toxicol., 2005, 18, 1586-1592).
Se han descrito anteriormente en la bibliografía varios agentes anti-AGE/ALE. De este modo, la aminoguanidina (Pimagedine®) ha demostrado ser un excelente captador de MGO in vitro e in vivo en modelos animales de diabetes (Arch. Biochem. Biophys., 2003, 419, 31-40; Diabetes, 2012, 61, 549-559). No obstante, estudios clínicos de fase III en seres humanos no han proporcionado resultados concluyentes que muestren propiedades débiles antioxidantes vasoprotectoras y efectos secundarios hepáticos y gastrointestinales (Am. J. Nephrol., 2004, 4, 32-40). De este modo, se abandonaron las pruebas con esta molécula.
Sin embargo, varios otros compuestos han demostrado in vitro e in vivo su eficacia para ralentizar la formación de AGE y ALE. Nagai et al. (Bioorg. Med. Chem. 2009, 17, 2310-2320) informan, por ejemplo, de las propiedades anti­ AGE de piridoxamina (Pyridorin®), de 2,3-diaminofenazina, de tiamina, de benfotiamina, de TM-2002, de tenilsetam y de LR-9, 20, 59, 74 y 90 así como el hecho de que PTB ("Phenacyl Thiazolium Bromide") y ALT-711 ha demostrado ser capaces de destruir AGE y ALE. También se han descrito efectos antiAGE para carnosina (Neurosci. Lett., 1997, 238, 135-13) y OPB-9195 (J. Am. Soc. Nephrol., 2000, 11, 1719-1725). Cabe señalar que los primeros ensayos clínicos sobre OPB-9195 no arrojaron resultados concluyentes y tuvieron que suspenderse debido a la aparición de efectos secundarios significativos (Pathologie, Biologie, 2006, 54, 405-419). La mayoría de los estudios sobre las otras moléculas aún se encuentran en fase experimental, a excepción de ALT-711, para el cual también se han suspendido los ensayos clínicos.
Las solicitudes de patente WO 2006/103274 A1 y WO 2013/050721 A1 describen derivados del ácido 2,3-diaminopropiónico sintetizados previamente por Sasaki et al. así como sus propiedades anti-AGE/ALE.
Es importante señalar que estos diferentes trabajos se han centrado esencialmente en la elaboración de agentes anti-AGE. En efecto, hasta ahora se han realizado pocos estudios sobre el desarrollo de posibles agentes anti-ALE. Aún no se ha descrito el diseño de compuestos multipotentes a la vez anti-AGE/ALE y quelantes de metales.
De este modo, sigue existiendo una necesidad de nuevos compuestos que presenten propiedades anti-AGE/ALE y que sean preferentemente también quelantes de metales.
Objeto de la invención
Los inventores han logrado ahora desarrollar nuevos derivados de diamina captadores de alfa-oxoaldehídos (aoxoaldehídos) y aldehídos alfa, beta-insaturados (aldehídos a,p-insaturados) y quelantes de metales. Estos compuestos multipotentes presentan la ventaja de asociar a las propiedades captadoras de los compuestos carbonílicos, propiedades quelantes de metales y propiedades antirradicalarias.
Por lo tanto, la invención se refiere a compuestos de fórmula I, sus sales farmacéuticamente aceptables así como al uso de estos compuestos o sus sales farmacéuticamente aceptables en composiciones farmacéuticas, agroalimentarias o cosméticas.
En un primer aspecto, la invención se refiere a compuestos de fórmula I:
Figure imgf000003_0001
I
y sus sales, concretamente farmacéuticamente aceptables,
en la que
n es un número entero de 1 a 6;
X es CO o CH2;
Y es NR1R2 o R2 o
Figure imgf000004_0001
R1 es H o alquilo o alquil-arilo;
R2 es Z-L-R3;
Z es inexistente, CO o CH2;
L es inexistente, CH=CH o (CH2)m;
m es un número entero de 1 a 6;
R3 es fenilo, sustituido con al menos un grupo OH y uno o más sustituyentes seleccionados entre OH, alcoxi C1 a C4 y alquilo C1 a C4, o R3 es N-piridinonilo, sustituido con al menos un grupo OH y opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados entre OH, alcoxi C1 a C4 y alquilo C1 a C4.
Los compuestos de fórmula I que constan de un átomo de carbono asimétrico, existen en forma de dos enantiómeros. Estos enantiómeros así como sus mezclas, incluyendo las mezclas racémicas, forman parte de la invención.
En otro aspecto, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas, cosméticas o agroalimentarias que comprenden al menos un compuesto según la invención o una de sus sales, concretamente farmacéuticamente aceptables, y al menos un excipiente aceptable a nivel farmacéutico, cosmético y/o agroalimentario.
Como se ha indicado anteriormente, los compuestos de la invención, así como sus sales farmacéuticamente aceptables encuentran una aplicación particular en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o afecciones asociadas con una acumulación de AGE (Inglés: Advanced Glycation Endproducts) y/o de ALE (inglés: Advanced Lipid Peroxidation Endproducts).
Descripción detallada de la invención
Como se ha detallado anteriormente, la invención se refiere a compuestos de fórmula I así como a sus sales, concretamente aceptables a nivel farmacéutico, cosmético y/o agroalimentario.
Los compuestos de fórmula I y sus sales preferidas son aquellos en los que uno, varios o cada uno de n, Y, R1, R2, Z, L, m y R3 se definen de la siguiente manera:
n es un número entero de 1 a 4; preferentemente n es 1, 2 o 3; aún más preferentemente n es 2 o 3;
Y es NR1R2 o R2 o
Figure imgf000004_0002
R1 es H, metilo o bencilo; preferentemente R1 es H o metilo, aún más preferentemente R1 es H;
R2 es Z-L-R3;
Z es CO o CH2;
L está ausente, CH=CH o (CH2K preferentemente L está ausente, frans-CH=CH o (CH2)m; m es un número entero de 1 a 6; preferentemente de 1 a 4, aún más preferentemente m es 1, 2 o 3;
R3 es fenilo, sustituido con al menos un grupo OH y uno o más sustituyentes seleccionados entre OH, alcoxi C1 a C4 y alquilo C1 a C4, o R3 es N-piridinonilo, sustituido con al menos un grupo OH y opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados entre OH, alcoxi C1 a C2 y alquilo C1 a C2, preferentemente seleccionado entre OH, metoxi y metilo, aún más preferentemente entre OH y metoxi u OH y metilo u OH, aún más preferentemente R3 se selecciona entre:
Figure imgf000005_0001
En una realización particular, los compuestos de fórmula I y sus sales son aquellos en los que R2 se selecciona entre:
Figure imgf000006_0001
Z siendo CO o CH2.
De hecho, y sin desear quedar ligado a teoría alguna, los inventores piensan que la capacidad de formar aductos con MGO y MDA y el poder quelante del cobre de los compuestos según la invención se obtienen a nivel del grupo diamina. En paralelo, el poder quelante del hierro y las propiedades antirradicalarias de los compuestos según la invención se obtienen gracias a los grupos derivados del ácido ferúlico (4-hidroxi-3-metoxifenil), del ácido gálico (3,4,5-trihidroxibenzoil) e hidroxipiridinonas.
En una primera realización, los compuestos de la invención son los de fórmula II:
Figure imgf000006_0002
y sus sales, concretamente farmacéuticamente aceptables,
en la que n e Y son tal como se definieron anteriormente con respecto a la fórmula I.
En una segunda realización, los compuestos de la invención son los de fórmula III
Figure imgf000006_0003
y sus sales, concretamente farmacéuticamente aceptables,
en la que n e Y son tal como se definieron anteriormente con respecto a la fórmula I.
En una tercera realización, los compuestos de la invención son los de fórmula IV
Figure imgf000007_0001
y sus sales, concretamente farmacéuticamente aceptables,
en la que n, X, R1, Z, L y R3 son tal como se definen con respecto a la fórmula I.
Los compuestos preferidos de fórmula IV son aquellos en los que Z-L-R3 se selecciona entre:
Figure imgf000007_0002
en los que R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20 y R21 se seleccionan, independientemente entre sí, entre H, OH, alcoxi C1 a C4 y alquilo C1 a C4, preferentemente entre H, OH, alcoxi C1 a C2 y alquilo C1 a C2, preferentemente entre H, OH, metoxi y metilo, aún más preferentemente entre H, OH y metoxi; H u OH y H, metilo u OH; con la condición de que al menos uno de R4, R5, R6, R7 y R8, de R9, R10, R11, R12 y R13, de R14, R15, R16 y R17, de R18, R19, R20 y R21 sea OH.
Los compuestos particularmente preferidos de fórmula IV son aquellos en los que Z-L-R3 se selecciona entre:
Figure imgf000008_0001
en los que R5, R6, R9, R10, R11, R16, R17 y R21 se seleccionan, independientemente entre sí, entre OH, alcoxi C1 a C4 y alquilo C1 a C4, preferentemente entre OH, alcoxi C1 a C2 y alquilo C1 a C2, preferentemente entre OH, metoxi y metilo, aún más preferentemente entre OH y metoxi u OH y metilo u OH; con la condición de que al menos uno de R5 y R6, de R9, R10 y R11, de R16 y R17 y de R21 sea OH. Los compuestos particularmente ventajosos de fórmula IV son aquellos en los que
- R5 y R6 se seleccionan, independientemente entre sí, entre OH y alcoxi C1 a C4, preferentemente entre OH y alcoxi C1 a C2, aún más preferentemente entre OH y metoxi; ventajosamente, R5 es alcoxi C1 a C4, preferentemente alcoxi C1 a C2, aún más preferentemente metoxi y R6 es OH;
- R9, R10 y R11 son OH;
- R16 y R17 se seleccionan, independientemente entre sí, entre OH y alquilo C1 a C4, preferentemente entre OH y alquilo C1 a C2, aún más preferentemente entre OH y metilo; ventajosamente, R16 es OH y R17 es alquilo C1 a C4, preferentemente alquilo C1 a C2, aún más preferentemente metilo;
- R21 es OH.
En una realización, los compuestos de fórmula IV son aquellos en los que Z-L-R3 se selecciona entre:
Figure imgf000008_0002
en los que R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20 y R21 se seleccionan, independientemente entre sí, entre H, OH y alquilo C1 a C4, preferentemente entre H, OH y alquilo C1 a C2, preferentemente entre H, OH y metilo; con la condición de que al menos uno de R14, R15, R16 y R17 y de R18, R19, R20 y R21 sea OH. Ventajosamente Z-L-R3 se selecciona entre:
Figure imgf000008_0003
en los que R16, R17 y R21 se seleccionan, independientemente entre sí, entre OH y alquilo C1 a C4, preferentemente entre OH y alquilo C1 a C2, aún más preferentemente entre OH y metilo; con la condición de que al menos uno de R16 y R17 y de R21 sea OH. Los compuestos particularmente ventajosos son aquellos en los que
- R16 y R17 se seleccionan, independientemente entre sí, entre OH y alquilo C1 a C4, preferentemente entre OH y alquilo C1 a C2, aún más preferentemente entre OH y metilo; ventajosamente, R16 es OH y R17 es alquilo C1 a C4, preferentemente alquilo C1 a C2, aún más preferentemente metilo;
- R21 es OH.
En una cuarta realización, los compuestos de la invención son los de fórmula V
Figure imgf000009_0001
y sus sales, concretamente farmacéuticamente aceptables,
en la que n, X, Z, L y R3 son tal como se definen con respecto a la fórmula I.
Los compuestos preferidos de fórmula V son aquellos en los que Z-L-R3 se selecciona entre:
Figure imgf000009_0002
en los que R4, R5, R6, R7 R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20 y R21 se seleccionan, independientemente entre sí, entre H, OH, alcoxi C1 a C4 y alquilo C1 a C4, preferentemente entre H, OH, alcoxi C1 a C2 y alquilo C1 a C2, preferentemente entre H, OH, metoxi y metilo, aún más preferentemente entre H, OH y metoxi; H u OH y H, metilo u OH; con la condición de que al menos uno de R4, R5, R6, R7 y R8, al menos uno de R9, R10, R11, R12 y R13, al menos uno de R14, R15, R16 y R17, y al menos uno de R18, R19, R20 y R21 sea OH.
Los compuestos particularmente preferidos de fórmula V son aquellos en los que Z-L-R3 se selecciona entre:
Figure imgf000010_0001
en los que R5, R6, R9, R10, R11, R16, R17 y R21 se seleccionan, independientemente entre sí, entre OH, alcoxi C1 a C4 y alquilo C1 a C4, preferentemente entre OH, alcoxi C1 a C2 y alquilo C1 a C2, preferentemente entre OH, metoxi y metilo, aún más preferentemente entre OH y metoxi u OH y metilo u OH; con la condición de que al menos uno de R5 y R6, al menos uno de R9, R10 y R11, al menos uno de R16 y R17 sea OH y R21 sea OH. Los compuestos particularmente ventajosos de fórmula IV son aquellos en los que
- R5 y R6 se seleccionan, independientemente entre sí, entre OH y alcoxi C1 a C4, preferentemente entre OH y alcoxi C1 a C2, aún más preferentemente entre OH y metoxi; ventajosamente, R5 es alcoxi C1 a C4, preferentemente alcoxi C1 a C2, aún más preferentemente metoxi y R6 es OH;
- R9, R10 y R11 son OH;
- R16 y R17 se seleccionan, independientemente entre sí, entre OH y alquilo C1 a C4, preferentemente entre OH y alquilo C1 a C2, aún más preferentemente entre OH y metilo; ventajosamente, R16 es OH y R17 es alquilo C1 a C4, preferentemente alquilo C1 a C2, aún más preferentemente metilo;
- R21 es OH.
En una realización, los compuestos de fórmula V son aquellos en los que Z-L-R3 se selecciona entre:
Figure imgf000010_0002
en los que R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20 y R21 se seleccionan, independientemente entre sí, entre H, OH y alquilo C1 a C4, preferentemente entre H, OH y alquilo C1 a C2, preferentemente entre H, OH y metilo; con la condición de que al menos uno de R14, R15, R16 y R17 y al menos uno de R18, R19, R20 y R21 sea OH. Ventajosamente Z-L-R3 se selecciona entre:
Figure imgf000010_0003
en los que R16, R17 y R21 se seleccionan, independientemente entre sí, entre OH y alquilo C1 a C4, preferentemente entre OH y alquilo C1 a C2, aún más preferentemente entre OH y metilo; con la condición de que al menos uno de R16 y R17 sea Oh y R21 sea OH. Los compuestos particularmente ventajosos son aquellos en los que
- R16 y R17 se seleccionan, independientemente entre sí, entre OH y alquilo C1 a C4, preferentemente entre OH y alquilo C1 a C2, aún más preferentemente entre OH y metilo; ventajosamente, R16 es OH y R17 es alquilo C1 a C4, preferentemente alquilo C1 a C2, aún más preferentemente metilo;
- R21 es OH.
En una quinta realización, los compuestos de la invención son los de fórmula VI
Figure imgf000011_0001
VI
y sus sales, concretamente farmacéuticamente aceptables,
en la que n, X, L y R3 son tal como se definen con respecto a la fórmula I.
Los compuestos preferidos de fórmula VI son aquellos en los que n es 1 o 2, X es CH2 y/o L-R3 es
Figure imgf000011_0002
en el que R14, R15, R16 y R17 se seleccionan, independientemente entre sí, entre H, OH y alquilo C1 a C4, preferentemente entre H, OH y alquilo C1 a C2, preferentemente entre H, OH y metilo; con la condición de que al menos uno de R14, R15, R16 y R17 sea OH. Ventajosamente L-R3 se selecciona entre:
Figure imgf000011_0003
en los que R16 y R17 se seleccionan, independientemente entre sí, entre OH y alquilo C1 a C4, preferentemente entre OH y alquilo C1 a C2, aún más preferentemente entre OH y metilo; con la condición de que al menos uno de R16 y R17 sea OH. Los compuestos particularmente ventajosos son aquellos en los que R16 es OH y R17 es alquilo C1 a C4, preferentemente alquilo C1 a C2, aún más preferentemente metilo.
Los compuestos particularmente preferidos de la invención son los enumerados en la tabla 1 a continuación: Tabla 1
Figure imgf000012_0001
continuación
Figure imgf000013_0001
Los compuestos de fórmula I se pueden preparar según reacciones conocidas por el experto en la materia. Los esquemas de reacción descritos en la parte de "Ejemplos" ilustran posibles enfoques de síntesis.
Debido a su capacidad de captar a-oxoaldehídos y/o aldehidos a,p-insaturados, su capacidad para quelar metales y sus propiedades antioxidantes, los compuestos de la invención y sus sales, concretamente aceptables a nivel farmacéutico y/o cosmético, encuentran una aplicación en el campo farmacéutico y/o cosmético.
En un segundo aspecto, la invención se refiere, por lo tanto, a los compuestos de la invención para uso como medicamento.
Más particularmente, los compuestos de la invención son, de este modo, útiles en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o afecciones asociadas con una acumulación de productos de glicación avanzada (AGE, en Inglés: Advanced Glycation Endproducts) y/o de productos de peroxidación de lípidos (ALE, en Inglés: Advanced Lipid Peroxidation Endproducts).
Estas enfermedades o afecciones comprenden enfermedades neurodegenerativas, micro y macroangiopatías relacionadas con el estrés oxidativo y carbonílico, afecciones relacionadas con la diabetes y patologías relacionadas con la edad.
En una realización particular, las enfermedades o afecciones se seleccionan entre enfermedades neurodegenerativas, concretamente entre la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.
En otra realización particular, las enfermedades o afecciones se seleccionan entre micro y macroangiopatías relacionadas con el estrés oxidativo y carbonílico de tipo aterosclerosis.
En otra realización particular, las enfermedades o afecciones se seleccionan entre enfermedades relacionadas con la diabetes, concretamente entre aterosclerosis, retinopatía, nefropatía, neuropatía, micro y macroangiopatías, cataratas, amiloidosis, trastornos reumáticos y úlceras varicosas y arteriales.
En otra realización particular, las enfermedades o afecciones se seleccionan entre patologías relacionadas con la edad tales como, por ejemplo, cataratas y reumatismo.
La presente invención, según otro de sus aspectos, se refiere también a un método de tratamiento de las enfermedades y afecciones indicadas anteriormente, que comprende la administración, a un paciente, de una dosis eficaz de un compuesto según la invención, o de uno de sus solvatos farmacéuticamente aceptables. Preferentemente, el paciente es un animal de sangre caliente, más preferentemente un ser humano.
La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de la invención o al menos una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos excipientes se seleccionan, según la forma farmacéutica y el modo de administración deseado, entre los excipientes habituales y conocidos por el experto en la materia.
La composición farmacéutica de la presente invención se puede seleccionar entre composiciones farmacéuticas para administración oral, sublingual, subcutánea, intramuscular, intravenosa, tópica, local, intratraqueal, intranasal, transdérmica o rectal. En estas composiciones, el principio activo de fórmula I anterior, o su solvato farmacéuticamente aceptable, se puede administrar en forma unitaria de administración, en mezcla con excipientes farmacéuticos convencionales, a los animales y a los seres humanos para el tratamiento y/o la prevención de las enfermedades o afecciones indicadas anteriormente. Las formas unitarias de administración adecuadas comprenden formas por vía oral tales como comprimidos, cápsulas blandas o duras, polvos, gránulos y soluciones o suspensiones orales, formas de administración sublingual, bucal, intratraqueal, intraocular, intranasal, por inhalación, formas de administración tópica, transdérmica, subcutánea, intramuscular o intravenosa, formas de administración rectal e implantes. Para la aplicación tópica, se pueden utilizar los compuestos según la invención en cremas, geles, pomadas o lociones. En una realización preferida, se trata de una composición farmacéutica para administración oral. Dichas formas de administración apropiadas que pueden presentarse en forma sólida, semisólida o líquida, en función del modo de administración, son generalmente conocidos por el experto en la materia, haciendo referencia a la última edición de la obra "Remington's Pharmaceutical Sciences".
Al estar la acumulación de los AGE también relacionada con disfunciones que tienen un impacto cosmético, tales como la pérdida de elasticidad del tejido cutáneo o del endotelio vascular y la pigmentación de la piel (Dermatoendocrinol. 2012, 4, 259-270), los compuestos de la invención son útiles como principio activo en composiciones cosméticas.
[Definiciones]
Las definiciones y explicaciones siguientes se refieren a los términos y expresiones que se utilizan en la presente solicitud, que comprende la descripción así como las reivindicaciones.
Para la descripción de los compuestos de la invención, los términos y expresiones utilizados deben, salvo que se indique otra cosa, interpretarse según las definiciones siguientes.
El término "alquil(o)", solo o como parte de otro grupo, designa un radical hidrocarburo de fórmula CnH2n+i en el que n es un número entero superior o igual a 1.
El término "sal" designa las sales de adición de ácido de compuestos de fórmula I. Abarca las sales con ácidos inorgánicos y orgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido acético, ácido succínico, ácido tartárico, ácido metanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido oxálico y similares.
Todas las referencias a compuestos de Fórmula I también designan las sales de los mismos.
El término "paciente" designa un animal de sangre caliente, preferentemente un ser humano, que espera o recibe un tratamiento médico.
El término "ser humano" se refiere a sujetos de ambos sexos y en cualquier fase de desarrollo (es decir, neonatal, infantil, juvenil, adolescente y adulto). En una realización, se trata de un adolescente o un adulto, preferentemente un adulto.
Los términos "tratar'' y "tratamiento" deben entenderse en su significado general y, de este modo, comprenden la mejora y la abrogación de un estado patológico.
Los términos "prevenir" y "prevención" designan el hecho de evitar o de retrasar la aparición de una enfermedad o afección y los síntomas relacionados, excluyendo así a un paciente de desarrollar una enfermedad o afección o reduciendo el riesgo de un paciente de desarrollar una enfermedad o afección.
El término "dosis terapéuticamente eficaz" o "dosis eficaz" designa la dosis de principio activo (compuesto de fórmula I) que es suficiente para alcanzar el resultado terapéutico o profiláctico deseado en el paciente al que se le administra.
El término "farmacéuticamente aceptable" o "aceptable a nivel farmacéutico" designa que un compuesto o componente no es nocivo para el paciente y que, en el contexto de una composición farmacéutica, es compatible con los otros componentes.
El término "aceptable a nivel cosmético" designa que un compuesto o un componente no es nocivo para el usuario, concretamente un ser humano, y que, en el contexto de una composición cosmética, es compatible con los otros componentes.
El término "aceptable a nivel agroalimentario" designa que un compuesto o componente no es nocivo para un animal de sangre caliente, concretamente para un ser humano cuando se ingiere y que, en el contexto de una composición agroalimentaria, es compatible con los otros componentes.
Descripción de las figuras
La presente invención se entenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son representativos de ciertas realizaciones de la invención y de ninguna manera limitan el alcance de la invención. Las figuras sirven para ilustrar los resultados experimentales.
FIGURAS (los compuestos 37d, 37f, 37i y 37j son compuestos de referencia y no forman parte de la invención) Figura 1: Estructura de los diferentes compuestos estudiados
Figura 2: Estudio cinético de la formación de aductos entre MGO y los compuestos según la invención Figura 3: Espectro de masas que atestigua la formación de al menos tres tipos de aductos entre MGO y el compuesto 37a después de 15 min de incubación a 37 °C
Figura 4: Estudio cinético de la formación de aductos entre MDA y los compuestos según la invención Figura 5: Espectro de masas que atestigua la formación de al menos un aducto entre MDA y el compuesto 37a después de 5 h de incubación a 37 °C
Figura 6: Curva de calibración realizada en tampón hexamina 0,01 M / KCl 0,01 M (pH = 5)
Figura 7: Curva de calibración realizada en una mezcla de tampón de hexamina 0,01 M / KCl 0,01 M (pH = 5) y MeOH 75/25
Figura 8: Comparación de los % de complejación de Cu2+ de diferentes compuestos según la invención en función de su concentración
Figura 9: Dos compuestos relacionados con el compuesto 37b puestos a prueba para sus propiedades quelantes de Cu2+
Figura 10: Comparación de los % de complejación de Cu2+ del compuesto 37b y dos compuestos relacionados que presentan un solo extremo quelante de Cu2+ libre en función de su concentración
Figura 11: Curva de calibración de trolox (AUC neta vs concentración). Los valores representados se expresan mediante la media ± SEM de triplicados que constituyen un experimento representativo entre los tres experimentos independientes realizados.
Figura 12: Curva de disminución de la fluorescencia de fluoresceína inducida por AAPH. Los valores representados se refieren a los resultados obtenidos en ausencia (control) o en presencia de trolox a diferentes concentraciones y se expresan mediante la media ± SEM de triplicados que constituyen un experimento representativo entre los tres experimentos independientes realizados.
Figura 13: Curva de disminución de la fluorescencia de fluoresceína inducida por AAPH. Los valores representados se refieren a los resultados obtenidos en ausencia (control) o en presencia de carnosina a diferentes concentraciones y se expresan mediante la media ± SEM de triplicados que constituyen un experimento representativo entre los tres experimentos independientes realizados.
Figura 14: Curva de disminución de la fluorescencia de fluoresceína inducida por AAPH. Los valores representados se refieren a los resultados obtenidos en ausencia (control) o en presencia de Dap-Pip a diferentes concentraciones y se expresan mediante la media ± SEM de triplicados que constituyen un experimento representativo entre los tres experimentos independientes realizados.
Figura 15: Curva de disminución de la fluorescencia de fluoresceína inducida por AAPH. Los valores representados se refieren a los resultados obtenidos en ausencia (control) o en presencia del compuesto 29a a diferentes concentraciones y se expresan mediante la media ± SEM de triplicados que constituyen un experimento representativo entre los tres experimentos independientes realizados.
Figura 16: Curva de disminución de la fluorescencia de fluoresceína inducida por AAPH. Los valores representados se refieren a los resultados obtenidos en ausencia (control) o en presencia del compuesto 29b a diferentes concentraciones y se expresan mediante la media ± SEM de triplicados que constituyen un experimento representativo entre los tres experimentos independientes realizados.
Figura 17: Curva de disminución de la fluorescencia de fluoresceína inducida por AAPH. Los valores representados se refieren a los resultados obtenidos en ausencia (control) o en presencia del compuesto 30a a diferentes concentraciones y se expresan mediante la media ± SEM de triplicados que constituyen un experimento representativo entre los tres experimentos independientes realizados.
Figura 18: Curva de disminución de la fluorescencia de fluoresceína inducida por AAPH. Los valores representados se refieren a los resultados obtenidos en ausencia (control) o en presencia del compuesto 30b a diferentes concentraciones y se expresan mediante la media ± SEM de triplicados que constituyen un experimento representativo entre los tres experimentos independientes realizados.
Figura 19: Curva de disminución de la fluorescencia de fluoresceína inducida por AAPH. Los valores representados se refieren a los resultados obtenidos en ausencia (control) o en presencia del compuesto 37a a diferentes concentraciones y se expresan mediante la media ± SEM de triplicados que constituyen un experimento representativo entre los tres experimentos independientes realizados.
Figura 20: Curva de disminución de la fluorescencia de fluoresceína inducida por AAPH. Los valores representados se refieren a los resultados obtenidos en ausencia (control) o en presencia del compuesto 37b a diferentes concentraciones y se expresan mediante la media ± SEM de triplicados que constituyen un experimento representativo entre los tres experimentos independientes realizados.
Figura 21: Curva de disminución de la fluorescencia de fluoresceína inducida por AAPH. Los valores representados se refieren a los resultados obtenidos en ausencia (control) o en presencia del compuesto 37c a diferentes concentraciones y se expresan mediante la media ± SEM de triplicados que constituyen un experimento representativo entre los tres experimentos independientes realizados.
Figura 22: Curva de disminución de la fluorescencia de fluoresceína inducida por AAPH. Los valores representados se refieren a los resultados obtenidos en ausencia (control) o en presencia del compuesto 37d a diferentes concentraciones y se expresan mediante la media ± SEM de triplicados que constituyen un experimento representativo entre los tres experimentos independientes realizados.
Figura 23: Curva de disminución de la fluorescencia de fluoresceína inducida por AAPH. Los valores representados se refieren a los resultados obtenidos en ausencia (control) o en presencia del compuesto 37f a diferentes concentraciones y se expresan mediante la media ± SEM de triplicados que constituyen un experimento representativo entre los tres experimentos independientes realizados.
Figura 24: Curva de disminución de la fluorescencia de fluoresceína inducida por AAPH. Los valores representados se refieren a los resultados obtenidos en ausencia (control) o en presencia del compuesto 37i a diferentes concentraciones y se expresan mediante la media ± SEM de triplicados que constituyen un experimento representativo entre los tres experimentos independientes realizados.
Figura 25: Curva de disminución de la fluorescencia de fluoresceína inducida por AAPH. Los valores representados se refieren a los resultados obtenidos en ausencia (control) o en presencia del compuesto 37j a diferentes concentraciones y se expresan mediante la media ± SEM de triplicados que constituyen un experimento representativo entre los tres experimentos independientes realizados.
Figura 26: Capacidad antioxidante (ORACf l ) de los compuestos según la invención a 10 pM. Los resultados representados corresponden a la media ± SEM de tres experimentos independientes realizados por triplicado. * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 vs Trolox (prueba de la t de Student: si p < 0,05, la diferencia se considera significativa).
Figura 27: Evaluación de las propiedades antirradicalarias de Dap-Pip, un compuesto de 2a generación
Figura 28: Evaluación de las propiedades antirradicalarias del compuesto 29a según la invención
Figura 29: Evaluación de las propiedades antirradicalarias del compuesto 29b según la invención
Figura 30: Evaluación de las propiedades antirradicalarias del compuesto 30b según la invención
Figura 31: Evaluación de las propiedades antirradicalarias del compuesto 37a según la invención
Figura 32: Evaluación de las propiedades antirradicalarias del compuesto 37c según la invención
Figura 33: Comparación de las propiedades antirradicalarias de la vitamina E, Dap-Pip de 2a generación y los diferentes compuestos según la invención a una concentración de 10 pM
Figura 34: Comparación de las propiedades antirradicalarias de la vitamina E, Dap-Pip de 2a generación y los diferentes compuestos según la invención a una concentración de 1 pM
Figura 35: Estudio de la citotoxicidad de los compuestos según la invención en células endoteliales cerebrales murinas (bEnd.3) después de 24 h de tratamiento. La viabilidad de las células se expresa mediante la media ± desviación estándar de los triplicados. (a) compuestos 29a, 29b, 30b, 37a y 37c; (b) compuestos 30a y 37b.
Figura 36: Estudio de la citotoxicidad de los compuestos según la invención en células de feocromocitoma de rata, equiparadas a células neuronales (PC12) después de 24 h de tratamiento. La viabilidad de las células se expresa mediante la media ± desviación estándar de los triplicados. (a) compuestos 29a, 29b, 30b, 37a y 37c; (b) compuestos 30a y 37b.
Figura 37: Estudio de la citotoxicidad de los compuestos según la invención en fibroblastos humanos (MRC-5) después de 24 h de tratamiento. La viabilidad de las células se expresa mediante la media ± desviación estándar de los triplicados. (a) compuestos 29a, 29b, 30b, 37a y 37c; (b) compuestos 30a y 37b.
Figura 38: Estudio de la citotoxicidad de los compuestos según la invención en células endoteliales cerebrales murinas (bEnd.3) después de 48 h de tratamiento. La viabilidad de las células se expresa mediante la media ± desviación estándar de los triplicados. (a) compuestos 29a, 29b, 30b, 37a y 37c; (b) compuestos 30a y 37b.
Figura 39: Estudio de la citotoxicidad de los compuestos según la invención en células de feocromocitoma de rata, equiparadas a células neuronales (PC12) después de 48 h de tratamiento. La viabilidad de las células se expresa mediante la media ± desviación estándar de los triplicados. (a) compuestos 29a, 29b, 30b, 37a y 37c; (b) compuestos 30a y 37b.
Figura 40: Estudio de la citotoxicidad de los compuestos según la invención en fibroblastos humanos (MRC-5) después de 48 h de tratamiento. La viabilidad de las células se expresa mediante la media ± desviación estándar de los triplicados. (a) compuestos 29a, 29b, 30b, 37a y 37c; (b) compuestos 30a y 37b.
Figura 41: Estudio de la citotoxicidad de los compuestos según la invención (29a, 29b, 30a, 30b, 37a, 37b, 37c, 37d, 37f, 37i y 37j) en células de feocromocitoma de rata, equiparadas a células neuronales (PC12) después de 24 h de tratamiento. La viabilidad de las células se expresa mediante la media ± SEM de tres experimentos independientes realizados por triplicado.
Figura 42: Evaluación de las propiedades antiapoptóticas del compuesto 30b en células endoteliales cerebrales murinas (bEnd.3). Las células bEnd.3 se pretrataron durante 30 min con 10 pM o 100 pM de 30b antes de la adición de 2 mM de MGO, y a continuación se incubaron durante 24 h. La apoptosis de las células se expresa mediante la media ± desviación estándar de los triplicados.
Figura 43: Evaluación de las propiedades antiapoptóticas del compuesto 37c en células endoteliales cerebrales murinas (bEnd.3). Las células bEnd.3 se pretrataron durante 30 min con 10 pM o 100 pM de 37c antes de la adición de 2 mM de MGO, y a continuación se incubaron durante 24 h. La apoptosis de las células se expresa mediante la media ± desviación estándar de los triplicados.
Figura 44: Evaluación de las propiedades antiapoptóticas del compuesto 30b en células de feocromocitoma de rata, equiparadas a células neuronales (PC12). Las células PC12 se pretrataron durante 30 min con 10 pM o 100 pM de 30b antes de la adición de 1 mM de MGO, y a continuación se incubaron durante 24 h. La apoptosis de las células se expresa mediante la media ± desviación estándar de los triplicados.
Figura 45: Evaluación de las propiedades antiapoptóticas del compuesto 37c en células de feocromocitoma de rata, equiparadas a células neuronales (PC12). Las células PC12 se pretrataron durante 30 min con 10 pM o 100 pM de 37c antes de la adición de 1 mM de MGO, y a continuación se incubaron durante 24 h. La apoptosis de las células se expresa mediante la media ± desviación estándar de los triplicados.
Figura 46: Evaluación de las propiedades antiapoptóticas del compuesto 37b en fibroblastos humanos (MRC-5).
Las células MRC5 se pretrataron durante 1 h con 10 pM o 100 pM de 37b antes de la adición de 2 mM de MGO, y a continuación se incubaron durante 24 h. La apoptosis de las células se expresa mediante la media ± desviación estándar de los triplicados.
Figura 47: Evaluación de las propiedades antiapoptóticas del compuesto 37c en fibroblastos humanos (MRC-5). Las células MRC5 se pretrataron durante 1 h con 1o pM o 100 pM de 37c antes de la adición de 2 mM de MGO, y a continuación se incubaron durante 24 h. La apoptosis de las células se expresa mediante la media ± desviación estándar de los triplicados.
Figura 48: Evaluación de las propiedades antiapoptóticas del compuesto 37c en células de feocromocitoma de rata, equiparadas a células neuronales (PC12). Las células PC12 se pretrataron durante 1 h con 10 pM o 100 pM de 37c antes de la adición de 1 mM de MGO, y a continuación se incubaron durante 24 h. La apoptosis de las células se expresa mediante la media ± SEM de tres experimentos independientes realizados por triplicado. * p < 0.05; ** p < 0.01 vs control (células no tratadas con MGO) (prueba de la t de Student: si p < 0,05, la diferencia se considera significativa).
Ejemplos
A. SÍNTESIS
I) Material y métodos
Los diferentes productos de reacción se adquirieron de Sigma-Aldrich (Lyon, Francia) y se utilizan sin purificaciones adicionales. Las TLC se realizaron en placas de sílice Merck 60F254, se observaron en el ultravioleta (A = 254 nm) antes de ser reveladas con ácido fosfomolíbdico en etanol al 95 % seguido de calentamiento hasta coloración máxima. Las cromatografías preparativas en columna se realizaron mediante la técnica cromatográfica en gel de sílice Kielselgel 60 (40-63 pm) (Merck) o con ayuda de un sistema de cromatografía ultrarrápida Reveleris® (Grace) en fase normal.
Los análisis de RMN se realizaron en un aparato Bruker AC300, 400 o 600. Los desplazamientos químicos se expresan en partes por millón (ppm) con respecto al disolvente deuterado utilizado como referencia interna. Las constantes de acoplamiento (J) se expresan en Hercios (Hz) y la multiplicidad de las señales se simboliza de la siguiente manera: s (singlete), d (doblete), t (triplete), c (cuadruplete) y m (multiplete). Los espectros de masas se obtuvieron en un aparato Shimadzu LCMS-2020 para MS y un aparato Micromass Q-TOF Ultima para HRMS, en modo de ionización por electropulverización positiva (ESI ).
II) Síntesis de los compuestos según la invención
1- Síntesis de los sintones de diamina iniciales
a) Derivados del ácido aspártico y del ácido glutámico (Esquema 1)
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000019_0007
1) CICOOEt / TEA
THF / -15 C, y después TA / 30 mm
bajo Ar TFAA / TEA
2) NH3 acuoso 25%
Figure imgf000019_0002
Boc ' N
Figure imgf000019_0003
-15°C, y después TA/ 18h THF -10 C / 2 a 4h OMi.-
Rdt = 68 a 77%
Figure imgf000019_0005
Rdt - 60 a 74%
Figure imgf000019_0004
1 NaBH. / NiCI,,6H20
Buü'O
MeOH / 0 C, y después
2) LÍOH 4N
THF.'H201:1 / TA / 1 a 1
Rdt = 50 a 67%
Figure imgf000019_0006
Esquema 1: Elaboración de los sintones derivados de los ácidos aspartico y glutamico
* Compuestos 1 (Bioconjug. Chem., 2007, 18, 1625-1636) y 2 (J. Med. Chem., 200952, 4650-4656):
La primera etapa de síntesis (
Esquema 1) que permite obtener un éster metílico a partir del ácido aspártico fue desarrollado anteriormente por Wojciechowski et al. (Bioconjugate Chem., 2007, 18, 1625-1636) y en el presente caso se transpuso a ácido glutámico.
* Compuestos 3 (WO 2013/030193 A1) y 4 (J. Med. Chem., 200952, 4650-4656):
Ollivier et al (Tetrahedron Lett., 2010, 51, 4147-4149) y More et al. (J. Med. Chem., 2009, 52, 4650-4656) describieron, respectivamente, las condiciones de protección utilizadas del grupo amino de los ésteres metílicos 1 y 2 con un grupo t-butiloxicarbonilo.
* Compuestos 5 y 6 (J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1999, 2057-2060):
A una solución del compuesto 3 o 4 (38,3-40,4 mmol) en THF anhidro (150 ml), agitada a -15 °C y bajo Ar, se añaden sucesivamente trietilamina (1,1 eq) y cloroformiato de etilo (1,4 eq) disuelto en anhidro THF (50 ml)) gota a gota. Después de agitación durante 30 min a -15 °C, una solución de amoniaco al 25 % (2,5-2,7 eq en un volumen final de 16 ml) se introduce en el medio de reacción que después se agita de nuevo a -15 °C, y después a temperatura ambiente durante 18 h. A continuación, el THF se evapora a presión reducida y el producto deseado se extrae con ayuda de acetato de etilo. La fase orgánica se lava con una solución de KHSO4 1 N, y después de NaHCO3 al 10 % y una solución saturada de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y finalmente se evapora a presión reducida para dar, respectivamente, el derivado 5 o 6 en forma de un polvo blanco (68 o 77 %).
Compuesto 5: 1H RMN (CDCla, 300 MHz): 5 (ppm) 6,59 (s, 1H); 6,20 (s, 1H); 5,79-5,76 (s, 1H); 4,50-4,49 (m, 1H); 3,65 (s, 3H); 2,91 (dd, J = 16,9 Hz y J' = 4,8 Hz, 1H); 2,66 (dd, J = 18,7 Hz y J' = 5,7 Hz, 1H); 1,40 (s, 9H).
13C RMN (CDCla, 75 MHz): 5 (ppm) 173,2; 171,9; 155,1; 80,1; 51,7; 49,9; 35,6; 27,9 (3C).
MS (ESI ): m/z = [M H] 247,1; [M Na] 269,1; [M MeCN Na] 310,1.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C10H1aN2O5Na [M Na] = 269,1113; encontrado = 269,1103. *
* Compuestos 7 y 8:
A una solución del compuesto 5 o 6 (26,4-28,8 mmol) en THF (100 ml), agitada a -10 °C, se añaden anhídrido trifluoroacético (1,5 eq) y trietilamina (3 eq) (Synth. Commun., 2009, 39, 395-406). Después, el medio de reacción se agita a esta misma temperatura durante de 2 a 4 h. A continuación, el THF se evapora a presión reducida y el producto deseado se extrae con ayuda de acetato de etilo. La fase orgánica se lava con una solución de KHSO41 N, y después de NaHCO3 al 10 % y una solución saturada de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y finalmente se evapora a presión reducida para dar, respectivamente, el derivado 7 u 8 en forma de un sólido amarillo (60 o 74 %) después de la purificación en columna de sílice con ayuda de una mezcla de CH2Ch/MeOH 98:2 o mediante cromatografía ultrarrápida en fase normal con ayuda de un gradiente de CH2Cb/MeOH de 100:0 a 90:10.
Compuesto 7: 1H RMN (CDCb, 300 MHz) 5 (ppm): 5,61 (s, 1H); 4,90 (m, 1H); 3,75 (s, 3H); 2,86-2,82 (m, 2H); 1,39 (s, 9H).
13C RMN (CDCb, 75 MHz) 5 (ppm): 159,0; 117,9; 80,3; 52,6; 37,4; 28,4 (3C).
MS (ESI ): m/z = [M H] 229,2; [M MeCN Na] 292,1; [2M Na H] 480,2. HRMS (ESI ): m/z calc. para C10H16N2O4Na [M Na] = 251,1008; encontrado = 251,1000.
Compuesto 8: 1H RMN (CDCla, 600 MHz): 5 (ppm) 5,41 (s, 1H); 4,62 (m, 1H); 3,67 (s, 3H); 2,53-2,46 (m, 2H); 2,13-2,10 (m, 2H); 1,41 (s, 9H).
13C RMN (CDCls, 150 MHz): 5 (ppm) 172,6; 154,5; 118,8; 81,2; 52,0; 41,6; 29,6; 28,2 (3C); 28,2.
MS (ESI ): m/z = [M H] 243,1; [M Na] 265,1; [M K] 281,0; [M MeCN Na] 306,1.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para CnH18N2O4Na [M Na] = 265,1164; encontrado = 265,1159.
* Compuestos 9 y 10:
A una solución del compuesto 7 u 8 (15,3-19,8 mmol) en metanol (150 ml), agitada a 0 °C, se añaden dicarbonato de di-t-butilo (2 eq) y N O 2.6 H2O (0,1 eq). A continuación se introduce borohidruro de sodio (8 eq) en pequeñas porciones durante un período de 1 h y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 3 h (Tetrahedron, 2003, 59, 5417-5423). Después de la adición de dietilentriamina (2 eq) y agitación de nuevo durante de 30 min a 1 h, el metanol se evapora a presión reducida y el producto deseado se extrae con ayuda de acetato de etilo. La fase orgánica se lava con una solución saturada de NaHCO3, y después de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y finalmente se evapora a presión reducida. El compuesto intermedio obtenido se disuelve después en una mezcla de THF/H20 1:1 (40 ml) y a continuación se introduce una solución acuosa de LiOH 4 N (4 eq) en el medio que se mantiene en agitación durante de 1 h a 1 h 30. El THF se evapora a presión reducida, y después la mezcla se recoge en éter dietílico o acetato de etilo y se alcaliniza con una solución de Na2CO3 al 10 % con el fin de eliminar el éster de metilo y el dicarbonato de di-f-butilo restante en la fase orgánica. A continuación, la fase acuosa se acidifica con ayuda de una solución de HCl 6 N y después se extrae el producto deseado con ayuda de éter dietílico o acetato de etilo. Después del lavado con una solución saturada de NaCl, la fase orgánica se seca finalmente sobre Na2SO4 y se evapora a presión reducida para dar, respectivamente, el derivado 9 o 10 en forma de un polvo blanco (50 o 67 %).
Compuesto 9: 1H RMN (CDCb, 300 MHz): 5 (ppm) 8,70-8,61 (s, 1H); 5,54-5,41 (s, 1H); 5,15 (s, 1H); 4,00-3,98 (m, 1H); 3,37-3,25 (m, 2H); 2,65-2,59 (m, 2H); 1,43 (s, 18H). 13C RMN (CDCb, 75 MHz): 5 (ppm) 174,7; 174,6; 146,2 (2C); 79,9; 79,8; 48,0; 43,4; 36,4; 28,1 (6C).
MS (ESI ): m/z = [M H] 319,2; [M Na] 341,2; [M MeCN Na] 382,2.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C14H26N2O6Na [M Na] = 341,1689; encontrado = 341,1676.
Compuesto 10: 1H RMN (CDCb, 300 MHz): 5 (ppm) 8,35-8,28 (s, 1H); 5,06 (s, 1H); 4,99-4,96 (s, 1H); 3,72-3,66 (m, 1H); 3,18-3,16 (m, 2H); 2,43-2,37 (m, 2H); 1,87-1,76 (m, 2H); 1,43 (s, 18H).
13C RMN (CDCb, 75 MHz): 5 (ppm) 177,4; 156,8; 156,5; 79,6 (2C); 51,0; 44,6; 30,5; 28,3 (6C), 27,7.
MS (ESI ): m/z = [M Na] 355,9; [M MeCN Na] 396,2.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C15H2sN2O6Na [M Na] = 355,1845; encontrado = 355,1855.
b) Derivados de ornitina y lisina (Esquema 2)
Figure imgf000021_0001
Esquema 2: Elaboración de los sintones derivados de ornitina y lisina
* Compuesto 11 y 12 (comerciales)
* Compuestos 13 (WO 07/011623 A1) y 14 (WO 00/64865 A1):
A una solución del compuesto 11 o 12 (1 eq) (13,7-24,5 mmol) en THF (50-150 ml), agitada a -10 °C, se añaden sucesivamente W-metilmorfolina (1,1 eq) y cloroformiato de etilo (1,1 eq). Después de agitación durante 20 min a -10 °C, una solución de amoniaco al 25 % (2,5 eq en un volumen final de 16 ml) se introduce en el medio de reacción que después se agita durante 4 h. A continuación, el THF se evapora a presión reducida y el producto deseado se extrae con ayuda de acetato de etilo. La fase orgánica se lava con una solución de KHSO4 1 N, y después de NaHCO3 al 10 % y una solución saturada de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y finalmente se evapora a presión reducida para dar, respectivamente, el derivado 13 o 14 en forma de un polvo blanco (91 u 80 %) después de recristalización con ayuda de una mezcla de AcOEt/ciclohexano 20:80.
* Compuestos 15 y 16 (WO 2000/64865 A1):
A una solución del compuesto 13 o 14 (8,1-10 mmol) en THF (60-70 ml), agitada a -10 °C, se añaden anhídrido trifluoroacético (1,5 eq) y piridina (3 eq). Después, el medio de reacción se agita a esta misma temperatura durante 2 h. A continuación, el THF se evapora a presión reducida y el producto deseado se extrae con ayuda de acetato de etilo. La fase orgánica se lava con una solución de KHSO4 1 N, y después de NaHCO3 al 10 % y una solución saturada de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y finalmente se evapora a presión reducida para dar, respectivamente, el derivado 15 o 16 en forma de un polvo blanco (99 u 95 %) después de recristalización con ayuda de una mezcla de AcOEt/ciclohexano 20:80.
Compuesto 15: 1H RMN (CDCls, 600 MHz): 5 (ppm) 7,36-7,29 (m, 5H); 5,11 (s, 1H); 5,08 (s, 2H); 4,96 (s, 1H); 4,55 (m, 1H); 3,24-3,23 (m, 2H); 1,81-1,79 (m, 2H); 1,68-1,65 (m, 2H); 1,44 (s, 9H).
13C RMN (CDCla, 150 MHz): 5 (ppm) 156,6 (2C); 136,4; 128,5 (2C); 128,2; 128,1 (2C); 118,7; 79,1; 66,8; 42,0; 40,0; 29,6; 28,2 (3C); 26,1.
MS (ESI ): m/z = [M Na] 370,2; [2M Na] 717,3.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C1sH25N3O4Na [M Na] = 370,1743; encontrado = 370,1749.
* Compuestos 17 y 18:
A una solución del compuesto 15 o 16 (8-10 mmol) en metanol (60-80 ml), agitada a 0 °C, se añaden dicarbonato de di-f-butilo (2 eq) y N O 2.6 H2O (0,1 eq). A continuación se introduce borohidruro de sodio (7 eq) en pequeñas porciones durante un período de 30 min a 1 h y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 1 h. Después de la adición de dietilentriamina (1 eq) y agitación de nuevo durante de 30 min a 1 h, el metanol se evapora a presión reducida y el producto deseado se extrae con ayuda de acetato de etilo. La fase orgánica se lava con una solución saturada de NaHCO3, y después de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y finalmente se evapora a presión reducida para dar, respectivamente, el derivado 17 o 18 en forma de un polvo blanco (92 u 89 %).
Compuesto 17: 1H RMN (CDCb, 300 MHz): 5 (ppm) 7,34-7,31 (m, 5H); 5,06 (s, 2H); 5,06 (s, 1H); 4,94 (s, 1H); 4,80-4,77 (s, 1H); 3,58 (m, 1H); 3,21-3,12 (m, 4H); 1,56-1,52 (m, 2H); 1,45-1,44 (m, 2H); 1,43 (s, 18H).
13C RMN (CDCb, 75 MHz): 5 (ppm) 172,0; 156,9 (2C); 136,9; 128,8 (2C); 127,4 (3C); 79,7 (2C); 67,0; 51,5; 44,8; 41,1; 30,4; 28,7 (6C); 26,5.
MS (ESI ): m/z = [M H] 452,1; [M Na] 474,0.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C23H37NaO6Na [M Na] = 474,2580; encontrado = 474,2560.
Compuesto 18: 1H RMN (CDCb, 300 MHz): 5 (ppm) 7,34-7,29 (m, 5H); 5,07 (s, 2H); 4,98-4,91 (s, 2H); 4,72 (s, 1H); 3,56 (m, 1H); 3,17-3,13 (m, 4H); 1,46-1,41 (m, 6H); 1,41 (m, 18H).
13C RMN (CDCla, 75 MHz): 5 (ppm) 176,3; 155,8 (2C); 136,0; 127,8 (2C); 127,4 (3C); 78,7 (2C); 65,9; 50,5; 43,9; 39,8; 31,6; 29,1; 27,7 (6C); 22,1.
MS (ESI ): m/z = [M H] 466,3; [M Na] 488,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C24H39N3O6Na [M Na] = 488,2737; encontrado = 488,2730.
* Compuestos 19 y 20:
A una solución del compuesto 17 o 18 (1,1-5,7 mmol) en metanol (10-40 ml), se añade Pd/C (10 % m/m). El medio de reacción se coloca al vacío y se agita a temperatura ambiente durante 30 min, y después se mantiene bajo un flujo de H2 durante 6 h. A continuación se filtra a través de papel y el metanol se evapora a presión reducida para dar, respectivamente, el derivado 19 o 20 en forma de un polvo blanco (92 o 100 %).
Compuesto 19: 1H RMN (CDCb, 600 MHz): 5 (ppm) 4,98 (s, 1H); 4,96 (s, 1H); 3,56 (m, 1H); 3,18-3,12 (m, 2H); 2,74 (s, 2H); 2,74 (m, 2H); 1,48-1,43 (m, 4H); 1,41 (s, 18H).
13C RMN (CDCb, 150 MHz): 5 (ppm) 156,7; 156,3; 79,3 (2C); 51,2; 44,7; 41,6; 30,1; 29,3; 28,4 (6C).
MS (ESI ): m/z = [M H] 318,2; [M Na] 340,2.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C15H31N3O4 [M H] = 318,2393; encontrado = 318,2379.
Compuesto 20: 1H RMN (CDCb, 300 MHz): 5 (ppm) 4,99 (s, 2H); 4,76-4,73 (s, 2H); 3,55 (m, 1H); 3,10 (m, 2H); 2,61-2,59 (m, 2H); 1,57 (m, 2H); 1,37 (m, 22H).
13C RMN (CDCb, 75 MHz): 5 (ppm) 170,8; 167,9; 78,9 (2C); 51,0; 44,4; 41,5; 33,1; 32,4; 28,0 (6C); 22,7.
MS (ESI ): m/z = [M H] 332,2; [M Na] 354,2.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C16H33N3O4 [M H] = 332,2549; encontrado = 332,2564.
2- Acoplamiento del grupo Ra o NR'aRb
a) Acoplamiento pseudopeptídico
a- Método A (Esquema 3)
1) NHS / DCC
Figure imgf000023_0001
Rk=
Figure imgf000023_0002
Figure imgf000023_0003
Esquema 3: Acoplamiento pseudopeptidico del grupo R a o INR aRb (Método A)
* 1a etapa: A una solución del derivado 10, 33a-b, 41a-b, portador de la función ácido (0,4-3,0 mmol) en diclorometano o 1,4-dioxano (10-25 ml), se añaden sucesivamente N-hidroxisuccinimida (1,1 a 1,5 eq) y DCC (1 a 1,2 eq). El medio de reacción se mantiene en agitación a temperatura ambiente durante 24 h, y después se filtra al vacío. A continuación, el filtrado se evapora a presión reducida para dar el intermedio activado del ácido.
* 2a etapa: El derivado de amina 20, 26, 27, 35 o 42 (1 a 1,7 eq) se disuelve en diclorometano (8-30 ml) y se hace reaccionar con trietilamina (0 a 4 eq) a temperatura ambiente durante 30 min. A continuación, el intermedio activado del ácido (1 eq) se introduce en el medio de reacción, que después se agita a temperatura ambiente durante 18 h. La fase orgánica se lava a continuación con una solución de HCl 1 N, y después de NaHCO3 y saturada de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y finalmente se evapora a presión reducida para dar el compuesto 21a-b, 22a-b, 23c-f o 23j (25 a 82 %) después de purificación en columna de sílice (CH2Ch/MeOH 98:2 a 95:5) (tabla 2).
j3- Método B (Esquema 4)
Figure imgf000024_0001
Esquema 4: Acoplamiento pseudopeptidico del grupo R a o (Método B)
A una solución del derivado portador de la función ácido 33b, 41a-b (1-6,5 mmol) en diclorometano, DMF o THF (25­ 100 ml), agitada a 0 °C, se añaden sucesivamente clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (1,2 eq), 1-hidroxibenzotriazol monohidrato (1,1-1,2 eq). Después de 30 min de agitación a 0 °C, el derivado de amina 19, 20 o 27 (1 eq) se introduce con trietilamina (1,2 eq) en el medio de reacción que después se mantiene en agitación a temperatura ambiente durante de 4 a 18 h. Después de la evaporación del DMF o del THF y la recuperación del residuo en diclorometano, la fase orgánica se lava con una solución saturada de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y finalmente se evapora a presión reducida para dar, después de purificación en columna de sílice (AcOEt/ciclohexano 60:40 o AcOEt/MeOH 80:20) los compuestos 23a-b, 23g-i o 23k (51 a 86 %) (tabla 2).
Tabla 2: Com uestos 21-23
Figure imgf000024_0002
continuación
Figure imgf000025_0001
Compuesto 21a: 1H RMN (CDCI3, 300 MHz): 5 (ppm) 7,63 (d, J = 15,0 Hz, 1H); 7,09 (dd, Ji = 8,4 Hz, J 2 = 1,8 Hz, 1H); 6,99 (d, J = 1,8 Hz, 1H); 6,91 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 6,67 (d, J = 15,3 Hz, 1H); 6,08 (s, 1H); 4,93 (s, 2H); 3,92 (s, 3H); 3,73-3,50 (m, 9H); 3,20 (t, J = 5,4 Hz, 2H); 2,45-2,39 (m, 2H); 1,86-1,80 (m, 2H); 1,42 (s, 18H). 13C RMN (CDCla, 75 MHz): 5 (ppm) 170,8; 170,5; 165,5 (2C); 147,2; 146,4; 143,4; 127,1; 121,7; 114,4; 113,3; 109,5; 77,5 (2C); 55,6; 51,0; 44,8; 44,2 (2C); 41,3 (2C); 29,1; 27,9 (6C); 27,5.
MS (ESI ): m/z = [M H] 577,3; [M Na] 599,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C29H44N4O8 [M Na] = 599,3057; encontrado = 599,3043.
Compuesto 21b: 1H RMN (CDCla, 300 MHz): 5 (ppm) 7,52 (d, J = 15,6 Hz, 1H); 7,02 (dd, Ji = 8,1 Hz, J2 = 1,8 Hz, 1H); 6,96 (d, J = 1,8 Hz, 1H); 6,87 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 6,31 (d, J = 15,6 Hz, 1H); 6,28 (s, 1H); 5,01-4,99 (s, 1H); 4,84-4,82 (s, 1H); 3,86 (s, 3H); 3,59-3,58 (m, 1H); 3,34-3,33 (m, 2H); 3,16 (m, 2H); 1,57-1,55 (m, 2H); 1,42 (m, 22H). 13C RMN (CDCb, 75 MHz): 5 (ppm) 167,4 (2C); 157,3; 148,3; 147,8; 141,6; 128,4; 122,9; 119,5; 115,8; 110,8; 80,4 (2C); 56,8; 52,2; 45,3; 39,9; 33,1; 30,6; 29,3 (6C); 23,7.
MS (ESI ): m/z = [M H] 508,2; [M Na] 530,2.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C26H41N3O7Na [M Na] = 530,2842; encontrado = 530,2856.
Compuesto 22a: 1H RMN (CDCb, 300 MHz): 5 (ppm) 7,40-7,33 (m, 12H); 7,28-7,26 (m, 3H); 6,65 (s, 2H); 5,12 (s, 4H); 5,10 (s, 2H); 3,65-3,19 (m, 11H); 2,42-2,39 (m, 2H); 1,90-1,84 (m, 2H); 1,70-1,64 (m, 2H); 1,43 (s, 18H).
13C RMN (CDCb, 75 MHz): 5 (ppm) 171,0; 169,9; 156,5; 156,2; 152,5 (2C); 139,7; 137,3; 136,5 (2C); 129,9; 128,4 (6C); 128,0; 127,8 (2C); 127,1 (6C); 107,1 (2C); 79,2 (2C); 75,0; 71,0 (2C); 51,2; 45,0 (2C); 44,4; 41,5 (2C); 33,7; 29,3; 28,2 (6C).
MS (ESI ): m/z = [M H] 823,3; [M Na] 845,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C47H58N4OgNa [M Na] = 845,4101; encontrado = 845,4138.
Compuesto 22b: 1H RMN (CDCb, 300 MHz): 5 (ppm) 7,38-7,28 (m, 12H); 7,28-7,26 (m, 3H); 7,17 (s, 2H); 6,62 (s, 1H); 5,13 (s, 4H); 5,09 (s, 2H); 4,97 (s, 1H); 4,78-4,75 (s, 1H); 3,63-3,62 (m, 1H); 3,40 (m, 2H); 3,20-3,18 (m, 2H); 1,62 (m, 2H); 1,46-1,44 (m, 22H). 13C RMN (CDCb, 75 MHz): 5 (ppm) 167,2; 156,2 (2C); 152,8 (2C); 141,1; 137,6; 136,9 (2C); 130,3; 128,6 (6C); 128,3; 128,1 (2C); 127,7 (6C); 107,0 (2C); 79,6 (2C); 75,3 (2C); 71,5; 51,4; 44,2; 39,5; 32,1; 29,2; 28,5 (6C); 22,8.
MS (ESI ): m/z = [M - 3Bn 3H Na] 506,3; [M H Na] 777,2.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C44H55N3OsNa [M Na] = 776,3887; encontrado = 776,3905.
Compuesto 23a: 1H RMN (CDCb, 300 MHz): 5 (ppm) 7,38-7,28 (m, 5H); 7,22-7,19 (s, 1H); 7,08 (dd, Ji = 6,9 Hz, J 2 = 1,5 Hz, 1H); 6,70 (dd, Ji = 7,5 Hz, J2 = 1,2 Hz, 1H); 6,04 (t, J = 7,2 Hz, 1H); 5,07-5,01 (s, 2H); 4,93-4,90 (s, 1H); 4,28-4,18 (m, 2H); 3,51-3,47 (m, 1H); 3,05-3,03 (m, 4H); 2,63 (t, J = 6,0 Hz, 2H); 2,27-1,40 (s, 9H); 1,38 (s, 9H); 1,32-1,17 (m, 4H).
13C RMN (CDCb, 75 MHz): 5 (ppm) 169,7 (2C); 157,7; 156,1; 148,1; 135,4; 130,0; 128,1 (2C); 127,7; 127,2 (2C); 115,1; 104,4; 78,7 (2C); 70,3; 50,5; 46,5; 44,6; 38,6; 34,5; 29,4; 27,9 (6C); 25,0.
MS (ESI ): m/z = [M H] 573,2; [M Na] 595,1.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C30H44N4O7Na [M Na] = 595,3108; encontrado = 595,3098.
Compuesto 23b: 1H RMN (CDCb, 300 MHz): 5 (ppm) 7,36-7,25 (m, 5H); 7,06 (dd, Ji = 6,9 Hz, J2 = 1,5 Hz, 1H); 6,99 (s, 1H); 6,66 (dd, Ji = 7,5 Hz, J2 = 1,5 Hz, 1H); 6,00 (t, J = 7,2 Hz, 1H); 5,00 (s, 1H); 5,00 (s, 2H); 4,83-4,80 (s, 1H); 4,21 (t, J = 6,3 Hz, 2H); 3,50-3,48 (m, 1H); 3,07-3,00 (m, 4H); 2,65 (t, J = 6,0 Hz, 2H); 1,38 (s, 18H); 1,33­ 1,23 (m, 6H).
13C RMN (CDCb, 75 MHz): 5 (ppm) 170,1 (2C); 158,1 (2C); 148,5; 135,9; 130,3; 128,5 (2C); 128,1; 127,4 (2C); 115,6; 104,7; 79,2 (2C); 70,6; 51,1; 47,0; 44,6; 38,8; 35,0; 32,0; 28,9; 28,3 (6C); 22,7.
MS (ESI ): m/z = [M H] 587,5; [M Na] 609,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C31H46N4O7Na [M Na] = 609,3264; encontrado = 609,3254.
Compuesto 23c: 1H RMN (CDCb, 300 MHz): 5 (ppm) 7,40 (s, 1H); 7,38-7,25 (m, 5H); 6,95 (d, J = 6,0 Hz, 1H); 6,67 (d, J = 6,8 Hz, 1H); 6,10 (t, J = 7,2 Hz, 1H); 5,40-5,23 (s, 2H); 5,03 (s, 2H); 4,00 (t, J = 5,1 Hz, 2H); 3,61-3,59 (m, 1H); 3,11 (m, 4H); 2,33-2,26 (m, 2H); 1,87-1,61 (m, 4H); 1,35 (s, 18H).
13C RMN (CDCb, 75 MHz): 5 (ppm) 172,3 (2C); 156,4; 156,2; 148,2; 135.6; 128,5; 128,2 (2C); 128,0; 127,8 (2C); 115,5; 105,8; 79,0 (2C); 70,4; 50,9; 46,8; 44,2; 35,7; 32,6; 30,3; 28,8; 28,0 (6C).
MS (ESI ): m/z = [M H] 573,5; [M Na] 595,4.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C30H44N4O7Na [M Na] = 595,3108; encontrado = 595,3078.
Compuesto 23d: 1H RMN (CDCb, 300 MHz): 5 (ppm) 7,32-7,18 (m, 5H); 7,01 (d, J = 6,1 Hz, 1H); 6,56 (d, J = 5,4 Hz, 1H); 5,92 (t, J = 6,9 Hz, 1H); 5,62-5,60 (s, 1H); 5,03-4,97 (s, 1H); 4,97 (s, 2H); 4,14 (t, J = 6,3 Hz, 2H); 3,81­ 3,79 (m, 1H); 3,54-3,32 (m, 8H); 3,23-3,13 (m, 2H); 2,79 (t, J = 6,0 Hz, 2H); 2,57-2,38 (m, 2H); 1,30 (s, 18H). 13C RMN (CDCb, 75 MHz): 5 (ppm) 168,7; 168,6; 157,8; 156,2; 155,2; 142,0; 135,6; 129,8; 128,1 (2C); 127,5; 126,8 (2C); 115,1; 104,1, 79,1 (2C); 70,2; 48,6; 46,7; 44,8 (2C); 43,1; 41,0 (2C); 34,7; 31,2; 27,9 (6C). MS (ESI ): m/z = [M H] 642,3; [M Na] 664,3.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C33H47N5O8Na [M Na] = 664,3322; encontrado = 664,3322.
Compuesto 23e: 1H RMN (CDCb, 400 MHz): 5 (ppm) 7,38 (d, J = 7,1 Hz, 2H); 7,32 (t, J = 7,5 Hz, 2H); 7,26 (t, J = 7,8 Hz, 1H); 7,27 (m, 1H); 6,65 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 6,05 (t, J = 7,0 Hz, 1H); 5,06 (s, 2H); 5,04-5,02 (s, 2H); 4,76­ 4,69 (m, 2H); 3,75-3,41 (m, 9H); 3,17-3,14 (m, 2H); 2,40-2,34 (m, 2H); 1,85-1,63 (m, 2H); 1,39 (s, 18H).
13C RMN (CDCb, 100 MHz): 5 (ppm) 171,3; 165,6 (2C); 158,0; 156,1; 148,3; 135,9; 129,6; 128,5 (2C); 127,9; 127,2 (2C); 115,9; 104,8; 79,3 (2C); 70,7; 51,4; 49,2; 45,2; 44,8; 44,4; 42,0; 41,4; 29,7; 28,3 (6C); 27,8.
MS (ESI ): m/z = [M - Boc 2H] 542,3; [M H] 642,3; [M Na] 664,3.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C33H47N5O8Na [M Na] = 664,3322; encontrado = 664,3324.
Compuesto 23f: 1H RMN (CDCb, 300 MHz): 5 (ppm) 7,42 (d, J = 6,6 Hz, 2H); 7,37-7,28 (m, 3H); 7,11 (d, J = 5,9 Hz, 1H); 6,65 (d, J = 6,2 Hz, 1H); 6,02 (t, J = 7,2 Hz, 1H); 5,08 (s, 2H); 4,94-4,93 (s, 2H); 4,24 (t, J = 6,3 Hz, 2H); 3,54-3,32 (m, 9H); 3,17 (t, J = 5,4 Hz, 2H); 2,89 (t, J = 6,3 Hz, 2H); 2,41-2,34 (m, 2H); 1,94-1,82 (m, 2H); 1,40 (s, 18H). 13C RMN (CDCb, 75 MHz): 5 (ppm) 171,4 (2C); 158,6; 156,7; 149,1; 140,1; 138,2; 130,7; 128,9 (2C); 128,4; 127,7 (2C); 115,9; 104,9; 87,1; 87,0; 71,1; 51,8; 47,6; 45,9 (2C); 45,0; 41,9 (2C); 32,0; 30,1; 28,7 (6C); 28,3.
MS (ESI ): m/z = [M H] 656,3; [M Na] 678,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C34H49N5OsNa [M Na] = 678,3479; encontrado = 678,3474.
Compuesto 23g: 1H RMN (CD3OD, 300 MHz): 5 (ppm) 7,61 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 7,41-7,31 (m, 5H); 6,46 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 5,05 (s, 2H); 4,68 (s, 2H); 3,58-3,54 (m, 1H); 3,23-3,18 (m, 2H); 3,12-2,97 (m, 2H); 2,07 (s, 3H); 1,58-1,30 (m, 22H).
13C RMN (CD3OD, 75 MHz): 5 (ppm) 175,6; 168,5; 163,7; 158,7; 147,3; 145,9; 143,0; 138,8; 130,4 (2C); 129,8 (2C); 129,6; 117,4; 80,4; 80,3; 75,0; 57,2; 52,2; 45,8; 40,9; 31,2; 29,1 (6C); 27,2; 13,3.
MS (ESI ): m/z = [M Na] 595,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C3oH44N4O7Na [M Na] = 595,3108; encontrado = 595,3121.
Compuesto 23h: 1H RMN (CD3OD, 300 MHz): 5 (ppm) 7,62 (d, J = 7,2 Hz, 1H); 7,42-7,32 (m, 5H); 6,47 (d, J = 7,2 Hz, 1H); 5,06 (s, 2H); 4,68 (s, 2H); 3,56-3,54 (m, 1H); 3,23-3,18 (m, 2H); 3,14-2,98 (m, 2H); 2,08 (s, 3H); 1,49-1,35 (m, 24H).
13C RMN (CD3OD, 75 MHz): 5 (ppm) 175,3; 168,2; 161,1; 158,7; 147,0; 145,6; 142,7; 138,5; 130,2 (2C); 129,5 (2C); 129,3; 117,1; 80,1; 80,0; 74,7; 56,9; 52,1; 45,5; 40,6; 33,1; 30,1; 28,9 (6C); 24,4; 13,0.
MS (ESI ): m/z = [M Na] 609,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C31H46N4O7Na [M Na] = 609,3264; encontrado = 609,3271.
Compuesto 23i: 1H RMN (CDCb, 400 MHz): 5 (ppm) 7,70 (s, 1H); 7,37-7,30 (m, 6H); 6,28 (d, J = 5,6 Hz, 1H); 5,40 (s, 1H); 5,18 (s, 1H); 5,06 (s, 2H); 4,10-4,06 (m, 2H); 3,51-3,49 (m, 1H); 3,24-3,04 (m, 4H); 2,65-2,50 (m, 4H); 2,12 (s, 3H); 1,44-1,37 (m, 4H); 1,37 (s, 18H).
13C RMN (CDCl3, 75 MHz): 5 (ppm) 173,6; 169,1; 157,0; 156,4; 145,8; 141,6; 139,2; 137,2; 128,9; 128,4 (2C); 128.3 (2C); 116,9; 79,2 (2C); 72,9; 52,3; 50,1; 44,4; 39,1; 36,2; 35,0; 31,9; 28,4 (6C); 22,7; 12,4.
MS (ESI ): m/z = [M H] 601,3; [M Na] 623,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C32H49N4O7 [M H] = 601,3601; encontrado = 601,3621.
Compuesto 23j: 1H RMN (CDCb, 300 MHz): 5 (ppm) 7,58-7,55 (s, 1H); 7,37-7,24 (m, 6H); 6,32 (d, J = 5,6 Hz, 1H); 5,47-5,45 (s, 2H); 5,08 (s, 2H); 3,80-3,77 (m, 2H); 3,54-3,53 (m, 1H); 3,24-3,10 (m, 4H); 2,22 (t, J = 4,9 Hz, 2H); 2,03 (s, 3H); 1,93-1,70 (m, 4H); 1,36 (s, 18H).
13C RMN (CDCb, 75 MHz): 5 (ppm) 173,8; 173,3; 156,9 (2C); 146,3; 141,4; 139,0; 137,4; 129,0 (2C); 128,4 (2C); 128,2; 117,1; 79,6 (2C); 73,1; 51,9; 51,3; 44,4; 36,2; 32,9; 30,7; 29,2; 28,4 (6C), 12,4.
MS (ESI ): m/z = [M H] 587,3; [M Na] 609,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C31H46N4OzNa [M Na] = 609,3264; encontrado = 609,3265.
Compuesto 23k: 1H RMN (CDCb, 400 MHz): 5 (ppm) 7,35-7,28 (m, 6H); 6,42 (d, J = 7,2 Hz, 1H); 5,17 (s, 2H); 5.03 (s, 2H); 4,83 (m, 2H); 3,60-3,42 (m, 9H); 3,19 (m, 2H); 2,43-2,37 (m, 2H); 2,04 (s, 3H); 1,88-1,67 (m, 2H); 1,43 (s, 18H). 13C RMN (CDCb, 100 MHz): 5 (ppm) 173,1; 171,4; 164,5; 157,0; 156,3; 145,6; 144,1; 140,8; 137,6; 129,0 (2C); 128,7 (2C); 128,4; 116,3; 79,6 (2C); 73,8; 55,3; 51,6; 45,1; 44,7; 42,5; 41,7; 41,4; 29,7; 28,6 (6C); 28,0; 13,0.
MS (ESI ): m/z = [M H] 656,4; [M Na] 678,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C34H49N5OsNa [M Na] = 678,3479; encontrado = 678,3464.
Y- Acoplamiento de los sintones resultantes de ácidos aspártico y glutámico con piperazina (Esquema 5)
Figure imgf000027_0001
Rdt = 96 a 100%
26 (n, = 1) o 27 (n, =2)
Esquema 5: Acoplamiento de los derivados de los ácidos aspártico y glutámico con piperazina
Se sintetizó piperazina-1-carboxilato de bencilo adaptando un método desarrollado por Dener et al (WO 1998/04537 A1) pasando por 4-benciloxicarbonilpiperazina-1-carboxilato de t-butilo. De este modo, se obtiene piperazina-1-carboxilato de f-butilo según un procedimiento descrito por Moussa et al. (J. Med. Chem., 2010, 53, 6228-6239). A continuación, se hace reaccionar (18,8 mmol) con trietilamina (1,2 eq) en diclorometano (50 ml) a 0 °C durante 10 min. A continuación, se introduce una solución de cloroformiato de bencilo (1,2 eq) en diclorometano (30 ml) en el medio que se agita a temperatura ambiente durante 18 h. Después, se evapora el diclorometano a presión reducida y se recupera el residuo en acetato de etilo. La fase orgánica se lava finalmente con una solución de KHSO41 M y de NaHCO3 al 5 %, y después una solución saturada de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y finalmente se evapora a presión reducida para dar 4-benciloxicarbonilpiperazina-1-carboxilato de t-butilo en forma de un polvo blanco (87 %) después de purificación en columna de sílice (CH2Ch/MeOH 99:1). Este intermedio (10,9 mmol) se disuelve finalmente en 1,4-dioxano (15 ml) en presencia de una solución comercial de HC1 4 N en 1,4-dioxano (20 eq).
Después, el medio de reacción se agita a temperatura ambiente durante 45 min. El 1,4-dioxano se evapora a presión reducida y el residuo se tritura en éter para dar piperazina-1-carboxilato de bencilo en forma de un polvo blanco (92 %), después de filtración al vacío.
* Compuestos 24 y 25:
1a etapa: A una solución del compuesto 9 o 10 (3,1-4,5 mmol) en diclorometano (25-30 ml), se añaden sucesivamente W-hidroxisuccinimida (1,2-1,5 eq) y DCC (1,1-1,2 eq). El medio de reacción se mantiene en agitación a temperatura ambiente durante de 1 h 30 a 24 h, y después se filtra al vacío. A continuación, el filtrado se evapora a presión reducida para dar el intermedio activado del ácido.
2a etapa: El piperazina-1-carboxilato de bencilo (1,2 eq) se disuelve en diclorometano (40 ml) y se hace reaccionar con trietilamina (3 eq) a temperatura ambiente durante 30 min. A continuación, el intermedio activado del ácido (1 eq) se introduce en el medio de reacción, que después se agita a temperatura ambiente durante de 15 a 24 h. La fase orgánica se lava a continuación con una solución de HCl 1 N, y después una solución saturada de NaHCO3 y de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y finalmente se evapora a presión reducida para dar el compuesto 24 o 25 en forma de un polvo blanco (77 o 97 %) después de purificación en columna de sílice (CH2Ch/MeOH 98:2).
Compuesto 24: 1H RMN (CDCb, 300 MHz): 5 (ppm) 7,33 (m, 5H); 5,69 (s, 1H); 5,12 (s, 2H); 5,03 (s, 1H); 3,89 (m, 1H); 3,62-3,45 (m, 10H); 2,65-2,41 (m, 2H); 1,40 (s, 18H).
13C RMN (CDCb, 75 MHz): 5 (ppm) 173,0; 163,7; 161,1; 147,7; 132,4; 128,9 (2C); 128,5; 128,3 (2C); 81,2 (2C); 67,8; 49,7; 45,9; 44,1 (2C); 41,8 (2C); 35,3; 28,7 (6C).
MS (ESI ): m/z = [M H] 521,3; [M Na] 543,2.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C26H40N4OzNa [M Na] = 543,2795; encontrado = 543,2794.
Compuesto 25: 1H RMN (CDCla, 300 MHz): 5 (ppm) 7,36-7,32 (m, 5H); 5,13 (s, 2H); 4,92 (s, 2H); 3,60-3,44 (m, 9H); 3,20-3,16 (m, 2H); 2,41-2,38 (m, 2H); 1.83-1,81 (m, 2H); 1,40 (s, 18H).
13C RMN (CDCls, 75 MHz): 5 (ppm) 170,8; 164,1; 163,8; 154,7; 136,0; 128,2 (2C); 127,8; 127,6 (2C); 79,0 (2C); 67,1; 51,1; 44,8; 44,3; 43,4; 41,1 (2C); 29,2; 28,0 (6C); 27,5. MS (ESI ): m/z = [M H] 535,3; [M Na] 557,3. HRMS (ESI ): m/z calc. para C27H42N4OyNa [M Na] = 557,2951; encontrado = 557,2945.
* Compuestos 26 y 27:
A una solución del compuesto 24 o 25 (0,7-2,7 mmol) en metanol (8-30 ml), se añade Pd/C (10 % m/m). El medio de reacción se coloca al vacío y se agita a temperatura ambiente durante 30 min, y después se mantiene bajo un flujo de H2 durante 6 h. A continuación se filtra a través de papel y el metanol se evapora a presión reducida para dar, respectivamente, el derivado 26 o 27 en forma de un polvo blanco (100 o 96 %).
Compuesto 26: 1H RMN (CDCls, 300 MHz): 5 (ppm) 7,33 (s, 1H); 5,69-5,66 (s, 1H); 5,12 (s, 1H); 3,89-3,88 (m, 1H); 3,66-3,23 (m, 8H); 2,93-2,83 (m, 2H); 2,67-2,43 (m, 2H); 1,41 (s, 18H).
13C RMN (CDCl3, 75 MHz): 5 (ppm) 167,1; 157,5; 155,4; 79,1 (2C); 48,6; 45,0; 44,6; 43,1; 40,9; 34,8; 27,9 (6C). MS (ESI ): m/z = [M H] 387,3; [M Na] 409,3.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C1sH34N4O5Na [M Na] = 409,2427; encontrado = 409,2418.
Compuesto 27: 1H RMN (CDCb, 300 MHz): 5 (ppm) 5,13-5,09 (s, 2H); 3,56-3,52 (m, 3H); 3,39-3,36 (m, 2H); 3,15-3,12 (m, 2H); 2,80-2,76 (m, 4H); 2,37-2,31 (m, 2H); 1,81-1,63 (m, 2H); 1,37 (s, 18H).
13C RMN (CDCb, 75 MHz): 5 (ppm) 170,8; 156,5; 156,2; 80,3; 79,1; 51,3; 46,0; 45,3; 44,5; 42,6; 41,5; 29,4; 28,2 (6C); 27,7.
MS (ESI ): m/z = [M H] 401,4; [M Na] 423,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C1gH36N4O5Na [M Na] = 423,2583; encontrado = 423,2573.
b) Compuestos portadores de un grupo derivado del ácido ferúlico o del ácido gálico
a- Preparación del sintón R ’a-OH resultante del ácido gálico
La triple O-bencilación de los grupos fenólicos del ácido gálico está descrita en la bibliografía (Carbohydr. Res., 2007, 342, 1510-1513).
fi- Desbencilación del grupo R ’a resultante del ácido gálico (Esquema 6)
Figure imgf000029_0001
Esquema 6 : Desbencilacion del grupo R a resultante del acido gálico
A una suspensión del compuesto 22a o 22b (0,5 mmol) en metanol (20 ml), se añade Pd/C (10 % m/m). El medio de reacción se coloca al vacío y se agita a temperatura ambiente durante 30 min, y después se mantiene bajo un flujo de H2 durante 6 h. A continuación se filtra a través de papel y el metanol se evapora a presión reducida para dar, respectivamente, el derivado 28a o 28b (soluble en metanol, a diferencia del producto de partida) en forma de un polvo blanco o de un aceite naranja (99 o 100 %).
Compuesto 28a: 1H RMN (CD3OD, 400 MHz): 5 (ppm) 6,45 (s, 2H); 3,59-3,43 (m, 8H); 3,32-3,31 (m, 1H); 3,06­ 3,01 (m, 2H); 2,47-2,45 (m, 2H); 2,01-1,70 (m, 2H); 1,43 (s, 18H).
13C RMN (CD3OD, 100 MHz): 5 (ppm) 172,4; 171,9; 157,3; 157,0; 145,8 (2C); 135,3; 125,0; 106,3 (2C); 78,7 (2C); 50,5; 45,1 (2C); 43,8; 42,3 (2C); 33,5; 29,1; 27,4 (6C).
MS (ESI ): m/z = [M H] 553,1; [M Na] 575,1.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C26H40N4OgNa [M Na] = 575,2693; encontrado = 575,2719.
Compuesto 28b: 1H RMN (CDCla, 300 MHz): 5 (ppm) 7,25 (s, 3H); 6,84 (s, 2H); 5,43 (s, 1H); 5,24-5,21 (s, 2H); 3,15-3,04 (m, 5H); 1,41-1,35 (m, 22H); 1,20-1,16 (m, 2H).
13C RMN (CDCla, 75 MHz): 5 (ppm) 168,4; 156,7; 156,4; 144,3 (2C); 135,7; 124,6; 106,9 (2C); 79,1 (2C); 50,7; 44,2; 39,5; 31,9; 29,2; 27,9 (6C); 22,6.
MS (ESI ): m/z = [M H] 484,2; [M Na] 506,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C23H37N3OsNa [M Na] = 506,2478; encontrado = 506,2501.
Y- Desprotección final del grupo diamina (Esquema 7)
Figure imgf000029_0002
R
Figure imgf000029_0003
Esquema 7: Desproteccion final del grupo diamina
El compuesto 21a, 21b, 28a o 28b (0,3-0,4 mmol) se disuelve en 1,4-dioxano (7-12 ml) en presencia de una solución comercial de HCl 4 N en 1,4-dioxano (20 eq). Después, el medio de reacción se agita a temperatura ambiente durante de 45 min a 6 h. El 1,4-dioxano se evapora a presión reducida y el residuo se tritura en éter. Después de evaporación al vacío (productos muy higroscópicos), el precipitado obtenido se liofiliza para dar, respectivamente, el derivado 29a, 29b, 30a o 30b en forma de un polvo amarillo o beige (75, 66, 100 o 57 %).
Compuesto 29a: 1H RMN (d6-DMSO, 300 MHz): 5 (ppm) 9,52 (s, 1H); 8,57 (s, 2H); 8,46 (s, 2H); 7,44 (d, J = 15,0 Hz, 1H); 7,33 (s, 1H); 7,10 (m, 2H); 6,79 (d, J = 8,4 Hz, 1H); 3,83 (s, 3H); 3,71-3,45 (m, 9H); 3,12 (m, 2H); 2,60-2,58 (m, 2H); 1,89 (m, 2H).
13C RMN (d6-DMSO, 75 MHz): 5 (ppm) 169,7; 165,0; 162,9; 148,5; 142,4; 126,4; 122,5; 115,3; 114,2; 111,2; 55,7; 48,7; 39,7 (5C); 28,1; 25,3.
MS (ESI ): m/z = [M H] 377,2.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C19H29N4O4 [M H] = 377,2189; encontrado = 377,2198.
Compuesto 29b: 1H RMN (d6-DMSO, 300 MHz): 5 (ppm) 8,49 (s, 4H); 8,11-8,09 (s, 1H); 7,30 (d, J = 15,9 Hz, 1H); 7,11 (d, J = 1.8 Hz, 1H); 6,97 (dd, Ji = 8,4 Hz y J 2 = 1,8 Hz, 1H); 6,79 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 6,49 (d, J = 15,9 Hz, 1H); 3,78 (s, 3H); 3,42-3,39 (m, 1H); 3,17 - 3,05 (m, 4H); 1,64-1,62 (m, 2H); 1,46-1,40 (m, 4H).
13C RMN (d6-DMSO, 75 MHz): 5 (ppm) 165,3; 148,2; 147,7; 138,7; 126,3; 121,4; 119,0; 115,6; 110,7; 55,4; 48,9; 38,1 (2C); 29,5; 28,6; 21,7.
MS (ESI ): m/z = [M H] 308,1.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C16H26N3O3 [M H] = 308,1974; encontrado = 308,1986.
Compuesto 30a: 1H RMN (d6-DMSO, 300 MHz): 5 (ppm) 8,65 (s, 2H); 8,55 (s, 2H); 6,37 (s, 2H); 3,49-3,48 (m, 9H); 3,13 (m, 2H); 2,59 (t, J = 4,8 Hz, 2H); 1,90-1,88 (m, 2H). 13C RMN (d6-DMSO, 75 MHz): 5 (ppm) 169,5; 169,3; 145,3 (2C); 134,5; 124,9; 106,3 (2C); 48,5; 40,0 (2C); 39,7; 38,3; 27,8; 25,0.
MS (ESI ): m/z = [M H] 352,9.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C16H25N4O5 [M H] = 353,1825; encontrado = 353,1813.
Compuesto 30b: 1H RMN (d6-DMSO, 300 MHz): 5 (ppm) 8,47 (s, 4H); 8,11 (s, 1H); 6,82 (s, 2H); 3,24-3,07 (m, 5H); 1,65-1,35 (m, 6H).
13C RMN (d6-DMSO, 75 MHz): 5 (ppm) 166,5; 145,4; 136,1; 125,0; 106,8 (2C); 49,0; 40,4 (2C); 29,6; 28,8; 21,8. MS (ESI ): m/z = [M H] 284,2.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C13H22N3O4 [M H] = 284,1610; encontrado = 284,1612.
c) Compuestos portadores de un grupo hidroxipiridinona
a- Preparación de los sintones R ’a-OH y R ’a-NHRb
* Preparación de los sintones R'a-OH y R'a-NHRb de tipo 3-bencilox¡p¡r¡din-2-ona (Esquema 7):
Figure imgf000030_0001
Esquema 7: Preparación de los sintones R a-OH y R a-NHRb de tipo
3-bencioxipindin-2-ona *
* Compuesto 31 (Synthesis, 2011, 57-64):
A una solución de 2,3-dihidroxipiridina (135 mmol) en acetonitrilo (120 ml), se añaden fluoruro de cesio (0,1 eq) y acrilonitrilo (3 eq) (Tetrahedron Lett., 2002, 43, 7379-7383; Synthesis, 2011, 57-64). El medio de reacción se calienta a reflujo durante 16 h. Después, el acetonitrilo se evapora a presión reducida y el producto deseado se extrae con ayuda de acetato de etilo. La fase orgánica se lava con una solución de Na2CO3 al 10 %, y después una solución saturada de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y finalmente se evapora a presión reducida para dar el derivado 31 en forma de un polvo blanco (93 %) después de recristalización en una mezcla de AcOEt/ciclohexano 50:50.
* Compuesto 32 (Synthesis, 2011, 57-64):
El derivado 32 se preparó según la síntesis descrita por Arumugam et al. (Synthesis, 2011, 57-64) en 2011.
* Compuesto 33a (J. Med. Chem., 1990, 33, 1749-1755, Molecules, 2015, 20, 19393-19405):
1a etapa: Se añade 2,3-dihidroxipiridina (50 mmol) a bromoacetato de etilo (5 eq). Después, el medio de reacción se calienta a reflujo durante 48 h bajo Ar y el producto deseado se obtiene finalmente después de precipitación en acetato de etilo y filtración al vacío.
2a etapa: A una solución de este intermedio (18 mmol) en una mezcla de MeOH/H2O 9:1 (150 ml), se añade una solución de NaOH 10,5 N (2 eq). Después, el medio de reacción se calienta a reflujo durante 30 min. A continuación, se introduce cloruro de bencilo (2 eq.) gota a gota durante un período de 30 min a temperatura ambiente y la mezcla se calienta de nuevo a reflujo durante 18 h. Después de la filtración al vacío y la evaporación del metanol a presión reducida, la fase acuosa se extrae con ayuda de diclorometano, y después se acidifica con ayuda de HCl 6 N. El producto deseado se extrae finalmente con ayuda de diclorometano. La fase orgánica se lava con una solución saturada de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y se evapora a presión reducida para dar el derivado 33a en forma de un polvo blanco (36 %).
° Compuesto 33b:
A una solución del compuesto 32 (1 eq) en agua (20 ml/mmol), se añade hidróxido de sodio (12,5 eq). Después, el medio de reacción se calienta a reflujo durante 1 h, y después se extrae con ayuda de acetato de etilo con el fin de eliminar la materia prima restante. A continuación, la fase acuosa se acidifica con ayuda de una solución de HCl 6 N y el compuesto deseado se extrae con ayuda de acetato de etilo. La fase orgánica se lava con ayuda de una solución saturada de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y finalmente se evapora a presión reducida para dar el derivado 33 en forma de un polvo amarillento (65 %).
Compuesto 33b: 1H RMN (CDCb, 300 MHz): 5 (ppm) 7,43-7,32 (m, 5H); 7,25 (dd, Ji = 6,9 Hz y J 2 = 1,5 Hz, 1H); 6,87 (dd, Ji = 7,3 Hz y J 2 = 1,8 Hz, 1H); 6,09 (t, J = 7,2 Hz, 1H); 4,99 (s, 2H); 4,07 (t, J = 6,9 Hz, 2H); 2,65 (t, J = 6,9 Hz, 2H).
13C RMN (CDCla, 75 MHz): 5 (ppm) 171,9; 156,5; 147,5; 136,2; 130,1; 128,0 (2C); 127,5; 127,4 (2C); 115,1; 103,4; 69,4; 45,0; 32,5.
MS (ESI ): m/z = [M H] 273,8.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C15H15NO4Na [M Na] = 296,0899; encontrado = 296,0893.
* Compuesto 34:
A una solución del compuesto 32 (7,9 mmol) en metanol (80 ml), agitada a 0 °C, se añaden dicarbonato de di-t-butilo (2 eq) y N O 2.6 H2O (0,1 eq). A continuación se introduce borohidruro de sodio (7 eq) en pequeñas porciones durante un período de 30 min y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 1 h. Después de la adición de dietilentriamina (1 eq) y agitación de nuevo durante 1 h, el metanol se evapora a presión reducida y el producto deseado se extrae con ayuda de acetato de etilo. La fase orgánica se lava con una solución saturada de NaHCO3, y después de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y finalmente se evapora a presión reducida para dar el derivado 34 en forma de un polvo blanquecino (84 %).
Compuesto 34: 1H RMN (CDCb, 400 MHz): 5 (ppm) 7,33 (d, J = 7,6 Hz, 2H); 7,25 (t, J = 6,8 Hz, 2H); 7,19 (t, J = 6,8 Hz, 1H); 6,80 (d, J = 6,3 Hz, 1H); 6,55 (d, J = 7,4 Hz, 1H); 5,96 (t, J = 7,3 Hz, 1H); 5,49 (s, 1H); 5,01 (s, 2H); 3,95 (t, J = 6,3 Hz, 2H); 3,01-2,96 (m, 2H); 1,81-1,75 (m, 2H); 1,33 (s, 9H).
13C RMN (CDCls, 100 MHz): 5 (ppm) 158,3; 155,9; 148,5; 135,8; 128,4; 128,3 (2C); 127,8; 127,1 (2C); 115,1; 105,2; 78,6; 70,5; 46,0; 36,3; 29,7; 28,3 (3C).
MS (ESI ): m/z = [M H] 358,9; [M Na] 380,9.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C20H26N2O4Na [M Na] = 381,1790; encontrado = 381,1782.
* Compuesto 35:
El compuesto 34 (2,4 mmol) se disuelve en 1,4-dioxano (10 ml) en presencia de una solución comercial de HCl 4 N en 1,4-dioxano (20 eq). Después, el medio de reacción se agita a temperatura ambiente durante 18 h. El 1,4-dioxano se evapora a presión reducida y el residuo se tritura en éter para dar el derivado 35 en forma de un polvo beige (100 %), después de filtración al vacío.
Compuesto 35: 1H RMN (da-DMSO, 300 MHz): 5 (ppm) 8,06-8,05 (s, 2H); 7,45-7,33 (m, 6H); 6,93 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 6,18 (t, J = 7,2 Hz, 1H); 5,01 (s, 2H); 4,00 (t, J = 6,9 Hz, 2H); 2,75 (t, J = 7,2 Hz, 2H); 1,98-1,93 (m, 2H). 13C RMN (d6-DMSO, 75 MHz): 5 (ppm) 175,1; 147,6; 136,1; 129,5; 128,0 (2C); 127,5 (3C); 115,3; 104,1; 69,4; 45,4; 35,9; 26,5.
MS (ESI ): m/z = [M H] 259,1; [M H MeCN] 300,2.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C15H19N2O2 [M H] = 259,1436; encontrado = 259,1447.
° Compuesto 39:
A una solución del compuesto 34 (1,5 mmol) en DMF (3 ml), se añade hidruro de sodio (1,4 eq). Después de 10 min de agitación a temperatura ambiente, se introduce yoduro de metilo (1,2, eq) y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 18 h (Org. Lett., 2014, 16, 3196-3199). Después de la evaporación del DMF a presión reducida, el residuo se recupera en acetato de etilo. La fase orgánica se lava con una solución saturada de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y finalmente se evapora a presión reducida para dar el derivado 39 en forma de un aceite amarillo (91 %) después de purificación en columna de sílice (AcOEt/MeOH 50:50).
Compuesto 39: 1H RMN (CDCb, 400 MHz): 5 (ppm) 7,40 (d, J = 8,0 Hz, 2H); 7,31 (t, J = 8,5 Hz, 2H); 7,26 (t, J = 7,2 Hz, 1H); 6,93-6,86 (m, 1H); 6,61 (d, Ji = 7,4 Hz y J 2 = 1,6 Hz, 1H); 5,99 (t, J = 7,1 Hz, 1H); 5,07 (s, 2H); 3,92 (t, J = 7,2 Hz, 2H); 3,27 (m, 2H); 2,82 (s, 3H); 1,96 (t, J = 7,2 Hz, 2H); 1,41 (s, 9H).
13C RMN (CDCla, 100 MHz): 5 (ppm) 158,2; 149,0; 136,4; 128,6 (2C); 128,0; 127,4 (2C); 115,5; 104,8; 79,6; 70,8; 47,8; 45,8; 34,1; 28,5 (3C); 27,1.
MS (ESI ): m/z = [M H] 373,2; [M Na] 395,2.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C21H29N2O4 [M H] = 373,2127; encontrado = 373,2137.
* Preparación de los sintones R'a-OH y R'a-NHRb de tipo 3-bencilox¡-2-met¡lp¡r¡d¡n-4-ona (Esquema 8):
Figure imgf000032_0001
2) HCI 4N en 1,4-dioxano
HCI
1,4-dioxano / TA / 3h
Rdt - 48%
Esquema 8: Preparación de los sintones R a-OH y R 'a-NHRb de tipo
3-bencioxi-2-metilpiridin-4-ona
Compuesto 40 (J. Med. Chem., 1998, 41, 3347-3359, J. Inorg. Biochem., 2000, 78, 303-311):
A una solución de maltol (79,3 mmol) en metanol (80 ml), se añade una solución de NaOH 10,5 N (1,1 eq). Después, el medio de reacción se calienta a reflujo durante 30 min. A continuación, se introduce cloruro de bencilo (1,2 eq.) gota a gota durante un período de 30 min a temperatura ambiente y la mezcla se calienta de nuevo a reflujo durante 18 h. Después de filtración al vacío, el metanol se evapora a presión reducida, a continuación, el residuo se recupera en agua y el producto deseado se extrae con ayuda de diclorometano. La fase orgánica se lava con una solución de NaOH al 5 %, y después una solución saturada de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y finalmente se evapora a presión reducida para dar el derivado 40 en forma de un aceite amarillo (88 %).
° Compuestos 41a (J. Heterocyclic Chem., 1994, 31, 947-56) y 41b (J. Inorg. Biochem., 2000, 78, 303-311):
A una solución de NaOH (3 eq) en una mezcla de EtOH/H2O 1:1 (100 ml), se añaden el compuesto 40 (18,5 mmol) y glicinato de sodio o S-alanina (2 eq) (Bioconjugate Chem. 2005, 16, 1597-1609). Después, el medio de reacción se calienta a reflujo durante 18 h. Después de la evaporación al vacío del etanol, el residuo se recupera en agua y se extrae con ayuda de acetato de etilo con el fin de eliminar la materia prima restante. La fase acuosa se concentra a continuación a presión reducida y se acidifica usando una solución de HCl 6 N y el derivado 41a o 41b se obtiene finalmente después de precipitación, filtración al vacío y lavado con agua, en forma de un polvo blanquecino (48 o 45 %).
° Compuesto 42 (Dalton Trans., 2004, 3772-3781):
A una solución de NaOH (0,5 eq) en una mezcla de EtOH/H2O 1:1 (20 ml), se añaden el compuesto 40 (18,5 mmol) y 1,3-diaminopropano (1,1 eq). Después, el medio de reacción se calienta a reflujo durante 18 h. Después de la evaporación al vacío del etanol, la fase acuosa y se acidifica con ayuda de HCl 6 N y se extrae con ayuda de acetato de etilo con el fin de eliminar la materia prima restante. A continuación, la fase acuosa se neutraliza con ayuda de una solución de NaOH 6 N y el producto deseado se extrae con ayuda de acetato de etilo. La fase orgánica se lava con una solución saturada de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y finalmente se evapora a presión reducida. Después de la agitación del compuesto intermedio a temperatura ambiente durante 2 h en 1,4-dioxano (20 ml) en presencia de una solución comercial de HCl 4 N en 1,4-dioxano (5 eq) y la evaporación bajo presión reducida del 1,4-dioxano, el residuo obtenido se tritura en éter para dar el derivado 42 en forma de un polvo blanco (48 %).
S - Diferentes farmacomodulaciones realizadas a nivel del "linker"
* Reducción de los grupos carbonilo del compuesto 23f (Esquema 9):
Figure imgf000033_0001
Esquema 9: Reducción de los grupos carbonilo del compuesto 23f
A una solución del compuesto 23f (1 mmol) en THF (100 ml), se añade gota a gota una solución de complejo borano/sulfuro de dimetilo 2 M en THF (5 eq) (J. Med. Chem., 2005, 48, 3891-3902). Después, el medio de reacción se calienta a reflujo durante 2 h. Después del enfriamiento, el borano se capta con ayuda de MeOH y la mezcla se calienta nuevamente a reflujo durante 18 h. Después de la evaporación al vacío del MeOH, el residuo se recupera en una mezcla de EtOH/NaOH 1 N 5:1 que se lleva a reflujo durante 2 h. La fase acuosa se extrae finalmente con ayuda de acetato de etilo después de la evaporación del etanol. La fase orgánica se lava con una solución saturada de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y se evapora a presión reducida para dar el derivado 43 en forma de un aceite incoloro (44 %) después de purificación en columna de sílice (AcOEt/MeOH 50:50).
Compuesto 43: 1H RMN (CDCb, 400 MHz): 5 (ppm) 7,40 (d, J = 7,3 Hz, 2H); 7,32 (t, J = 7,2 Hz, 2H); 7,26 (t, J = 7,8 Hz, 1H); 6,93 (d, J = 6,8 Hz, 1H); 6,61 (d, J = 7,4 Hz, 1H); 5,96 (t, J = 7,1 Hz, 1H); 5,27 (s, 3H); 5,08 (m, 2H); 4,98 (s, 1H); 3,99 (t, J = 6,8 Hz, 2H); 3,57 (m, 1H); 3,14 (m, 2H); 2,43-2,31 (m, 10H); 1,92 (t, J = 6,8 Hz, 2H); 1,54-1,52 (m, 2H); 1,40 (m, 20H).
13C RMN (CDCla, 100 MHz): 5 (ppm) 158,5 (2C); 149,0; 136,8; 129,8; 128,7 (2C); 128,1; 127,5 (2C); 115,7; 104,5; 79,4 (2C); 70,9; 58,2; 54,8 (2C); 53,4; 53,0; 51,2; 48,2; 45,1; 30,7; 29,9; 28,6 (6C); 26,0; 23,2.
MS (ESI ): m/z = [M H] 628,3; [M Na] 650,3.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C34H54N5O6 [M H] = 628,4074; encontrado = 628,4080.
* Preparación de un análogo N-metilado y descarbonilado del compuesto 23c (Esquema 10):
Figure imgf000034_0001
1a etapa: El compuesto 39 (0,7 mmol) se disuelve en 1,4-dioxano (2 ml) en presencia de una solución comercial de HCl 4 N en 1,4-dioxano (20 eq). Después, el medio de reacción se agita a temperatura ambiente durante 6 h. El dioxano se evapora a presión reducida y el residuo se tritura en éter para dar el clorhidrato de amonio correspondiente en forma de un precipitado.
2a etapa: A una solución del compuesto 10 (0,8 mmol) en DMF (20 ml), agitada a 0 °C, se añaden sucesivamente clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (1,2 eq), 1-hidroxibenzotriazol monohidrato (1,1 eq). Después de 30 min de agitación a 0 °C, el derivado de amina intermedio (1 eq) se introduce con trietilamina (1,2 eq) en el medio de reacción que después se mantiene en agitación a temperatura ambiente durante 18 h. Después de la evaporación del DMF y la recuperación del residuo en acetato de etilo, la fase orgánica se lava con una solución de HCl 1 N, de NaHCO3, y después saturada de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y finalmente se evapora a presión reducida para dar, después de purificación en columna de sílice (AcOEt/MeOH 50:50) el compuesto 45 (89 %).
Compuesto 44: 1H RMN (CDCla, 400 MHz): 5 (ppm) 7,39 (d, J = 7,1 Hz, 2H); 7,31 (t, J = 7,6 Hz, 2H); 7,27-7,25 (m, 1H); 7,01 (d, J = 6,5 Hz, 1H); 6,61 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 5,99 (t, J = 7,1 Hz, 1H); 5,06 (s, 2H); 5,02 (m, 2H); 3,95-3,88 (m, 2H); 3,60-3,59 (m, 1H); 3,46-3,29 (m, 2H); 3,17-3,15 (m, 2H); 2,95 (s, 3H); 2,43-2,29 (m, 2H); 2,02­ 1,92 (m, 2H); 1,85-1,77 (m, 2H); 1,39 (s, 18H).
13C RMN (CDCla, 100 MHz): 5 (ppm) 173,0; 158,4 (2C); 149,2; 136,6; 129,7; 128,8 (2C); 128,3; 127,6 (2C); 115,9; 104,9; 79,5; 79,4; 71,0; 51,7; 48,1; 45,3; 45,1; 35,4; 30,1; 28,6 (6C); 27,9; 27,0.
MS (ESI ): m/z = [M Na] 609,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C31H46N4O7Na [M Na] = 609,3264; encontrado = 609,3268.
° Compuesto 45
A una solución del compuesto 44 (0,5 mmol) en THF (30 ml), se añade gota a gota una solución de complejo borano/sulfuro de dimetilo 2 M en THF (2,5 eq). Después, el medio de reacción se calienta a reflujo durante 2 h. Después del enfriamiento, el borano se capta con ayuda de MeOH y la mezcla se calienta nuevamente a reflujo durante 18 h. Después de la evaporación al vacío del MeOH, el residuo se recupera en una mezcla de EtOH/NaOH 1 N 5:1 que se lleva a reflujo durante 2 h. La fase acuosa se extrae finalmente con ayuda de acetato de etilo después de la evaporación del etanol. La fase orgánica se lava con una solución saturada de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y se evapora a presión reducida para dar el derivado 45 en forma de un polvo marrón (82 %) después de purificación en columna de sílice (AcOEt/MeOH 70:30).
Compuesto 45: 1H RMN (CDCb, 400 MHz): 5 (ppm) 7,41 (d, J = 7,3 Hz, 2H); 7,33 (t, J = 6,7 Hz, 2H); 7,26 (t, J = 6,8 Hz, 1H); 6,94 (d, J = 6,9 Hz, 1H); 6,63 (d, J = 7,4 Hz, 1H); 6,00 (t, J = 7,2 Hz, 1H); 5,08 (s, 2H); 5,08 (s, 2H); 5,06-5,01 (m, 2H); 3,99 (t, J = 6,7 Hz, 2H); 3,58 (m, 1H); 3,16-3,15 (m, 2H); 2,37-2,30 (m, 4H); 2,17 (s, 3H); 1,92 (t, J = 7,1 Hz, 2H); 1,51-1,50 (m, 2H); 1,40 (m, 20H).
13C RMN (CDCb, 100 MHz): 5 (ppm) 158,2 (2C); 149,0; 136,5; 129,6; 128,6 (2C); 128,0; 127,4 (2C); 115,7; 104,6; 79,3 (2C); 70,8; 57,2; 54,4; 51,3; 48,1; 45,0; 41,6; 30,7; 28,5 (6C); 23,4; 21,1.
MS (ESI ): m/z = [M H] 573,4; [M Na] 595,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C31H49N4O6 [M H] = 573,3652; encontrado = 573,3664.
* Preparación de un derivado portador de un "linker" alifático desprovisto de función amida (Esquema 11):
Figure imgf000035_0001
A una solución de NaOH (0,5 eq) en una mezcla de EtOH/H2O 1:1 (120 ml), se añaden el compuesto 40 (5,1 mmol) y el compuesto 20 (0,7 eq). Después, el medio de reacción se calienta a reflujo durante 24 h (Dalton Trans., 2004, 3772-3781). Después de la evaporación al vacío del etanol, la fase acuosa y se neutraliza con ayuda de HCl 6 N y se extrae con ayuda de acetato de etilo. La fase orgánica se lava con una solución saturada de NaCl, se seca sobre Na2SO4 y finalmente se evapora a presión reducida para dar el derivado 46 en forma de un polvo amarillo (61 %) después de purificación en columna de sílice (AcOEt/MeOH 90:10).
Compuesto 46: 1H RMN (CDCb, 400 MHz): 5 (ppm) 7,38 (d, J = 6,7 Hz, 2H); 7,32-7,26 (m, 3H); 7,16 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 6,39 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 5,03 (s, 2H); 4,95-4,93 (s, 2H); 3,71-3,76 (m, 2H); 3,59 (m, 1H); 3,14 (m, 2H); 2,06 (s, 3H); 1,66-1,55 (m, 2H); 1,40-1,35 (m, 22H).
13C RMN (CDCb, 100 MHz): 5 (ppm) 173,5; 156,6 (2C); 146,4; 141,0; 138,3; 137,9; 129,3 (2C); 128,4 (2C); 128,1; 117,5; 79,7 (2C); 73,1; 53,9; 51,2; 44,7; 32,6; 30,9; 28,5 (6C); 23,0; 12,5.
MS (ESI ): m/z = [M H] 530,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C29H44N3O6 [M H] = 530,3230; encontrado = 530,3245.
Y- Desbencilación del grupo R ’a (Esquema 12)
Figure imgf000035_0002
Esquema 12: Desbencilación del grupo R
A una solución del compuesto 23a-k, 43, 45 o 46 (0,2-1,6 mmol) en metanol (5-40 ml), se añade Pd/C (10 % m/m).
El medio de reacción se coloca al vacío y se agita a temperatura ambiente durante 30 min, y después se mantiene bajo un flujo de H2 durante 6 h. A continuación se filtra a través de papel y el metanol se evapora a presión reducida para dar el derivado 36a-n (60 a 100 %) (tabla 3).
Tabla 3: Com uestos 36
Figure imgf000036_0001
continuación
Figure imgf000037_0001
Compuesto 36a: 1H RMN (CDCb, 600 MHz): 5 (ppm) 6,95 (d, J = 6,7 Hz, 1H); 6,92 (s, 1H); 6,82 (d, J = 7,2 Hz, 1H); 6,14 (t, J = 7,1 Hz, 1H); 5,18 (s, 1H); 5,04-5,03 (s, 1H); 4,25 (m, 2H); 3,56-3,54 (m, 1H); 3,17-3,16 (m, 2H); 3,09 (m, 2H); 2,68 (t, J = 6,4 Hz, 2H); 1,50-1,40 (m, 22H).
13C RMN (CDCb, 150 MHz): 5 (ppm) 170,3; 158,7; 157,0; 156,7; 146,7; 128,6; 115,2; 107,2; 79,7 (2C); 50,8; 47,3; 44,8; 39,5; 35,5; 29,9; 28,6 (6C); 25,7.
MS (ESI ): m/z = [M H] 483,3; [M Na] 505,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C23H3sN4O7Na [M Na] = 505,2638; encontrado = 505,2644.
Compuesto 36b: 1H RMN (CDCb, 300 MHz): 5 (ppm) 6,96 (dd, Ji = 6,9 Hz y J 2 = 1.5 Hz, 1H); 6,80 (dd, Ji = 7,4 Hz y J 2 = 1.5 Hz, 1H); 6,52-6,51 (s, 1H); 6,12 (t, J = 7,2 Hz, 1H); 5,04 (s, 1H); 4,88-4,86 (s, 1H); 4,26 (t, J = 6,3 Hz, 2H); 3,55-3,53 (m, 1H); 3,13-3,08 (m, 4H); 2,68 (t, J = 6,3 Hz, 2H); 1,79-1,50 (m, 2H); 1,40 (s, 18H); 1,35-1,23 (m, 4H).
13C RMN (CDCb, 75 MHz): 5 (ppm) 169,7; 158,3 (2C); 146,2; 128,2; 114,6; 106,7; 79,5 (2C); 51,1; 46,9; 44,3; 38,8; 35,1; 31,9; 28,8; 28,2 (6C); 22,6.
MS (ESI ): m/z = [M - 2Boc 3H] 296,9; [M - Boc 2H] 397,0; [M H] 497,1; [M Na] 519,1.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C24H40N4O7Na [M Na] = 519,2795; encontrado = 519,2801.
Compuesto 36c: 1H RMN (CDCb, 300 MHz): 5 (ppm) 7,34 (s, 1H); 6,89 (dd, Ji = 6,9 Hz y J 2 = 1,2 Hz, 1H); 6,83 (d, J = 7,2 Hz, 1H); 6,19 (t, J = 6,9 Hz, 1H); 5,33-5,23 (s, 2H); 4,06 (t, J = 5,2 Hz, 2H); 3,67-3,64 (m, 1H); 3,28­ 3,17 (m, 4H); 2,30 (t, J = 7,2 Hz, 2H); 1,93 (t, J = 6,3 Hz, 2H); 1,95-1,60 (m, 2H); 1,40 (s, 18H).
13C RMN (CDCb, 75 MHz): 5 (ppm) 173,3; 172,4; 158,6; 156,8; 146,5; 127,0; 114,6; 107,6; 79,4 (2C); 51,2; 47,1; 44,5; 35,9; 33,0; 29,3; 28,2 (6C); 25,4.
MS (ESI ): m/z = [M H] 483,4; [M Na] 505,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C23H3sN4O7Na [M Na] = 505,2638; encontrado = 505,2652.
Compuesto 36d: 1H RMN (CDCb, 600 MHz): 5 (ppm) 7,03-7,01 (m, 1H); 6,80 (d, J = 7,3 Hz, 1H); 6,10 (t, J = 7,1 Hz, 1H); 5,66 (s, 1H); 4,98 (s, 1H); 4,27 (t, J = 7,1 Hz, 2H); 3,89 (m, 1H); 3,66-3,31 (m, 8H); 3,23-3,21 (m, 2H); 2,87-2,85 (m, 2H); 2,67-2,46 (m, 2H); 1,39 (s, 18H).
13C RMN (CDCb, 150 MHz): 5 (ppm) 169,5; 169,0; 158,6; 157,0; 156,1; 146,5; 128,9; 115,1; 107,0; 79,8; 79,7; 49,5; 47,3; 45,8 (2C); 43,9; 41,8 (2C); 35,4; 32,1; 28,6 (6C).
MS (ESI ): m/z = [M - 2Boc 3H] 352,1; [M - Boc 2H] 452,2; [M H] 552,2; [M Na] 574,2.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C26H41N5OsNa [M Na] = 574,2853; encontrado = 574,2849.
Compuesto 36e: 1H RMN (CDCb, 400 MHz): 5 (ppm) 6,80 (d, J = 6,4 Hz, 2H); 6,18 (t, J = 7,1 Hz, 1H); 5,06-4,99 (s, 2H); 4,85-4,71 (m, 2H); 3,86-3,38 (m, 9H); 3,21-3,15 (m, 2H); 2,46-2,32 (m, 2H); 1,92-1,64 (m, 2H); 1,40 (s, 18H). 13C RMN (CDCb, 100 MHz): 5 (ppm) 171,6; 165,4; 158,9; 157,2; 156,6; 146,7; 128,1; 114,9; 107,2; 79,8 (2C); 51,6; 49,9; 45,2; 44,8; 42,5; 41,8; 41,5; 30,0; 28,6 (6C); 28,2. MS (ESI ): m/z = [M H] 552,3; [M Na] 574.3.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C26H41N5OsNa [M Na] = 574,2853; encontrado = 574,2832.
Compuesto 36f: 1H RMN (CDCb, 400 MHz): 5 (ppm) 7,01-7,00 (m, 1H); 7,76 (d, J = 7,1 Hz, 1H); 6,09 (t, J = 6,9 Hz, 1H); 5,04 (s, 2H); 4,23 (t, J = 5,9 Hz, 2H); 3,67-3,36 (m, 9H); 3,12 (m, 2H); 2,83 (m, 2H); 2,36-2,30 (m, 2H); 1,80-1,62 (m, 2H); 1,35 (s, 18H).
13C RMN (CDCb, 100 MHz): 5 (ppm) 171,3; 169,0; 158,6; 156,7; 156,4; 146,5; 128,6; 114,8; 106,7; 79,3 (2C); 51,4 ; 47 ,1 ; 45 ,2 ; 44,4 (2C); 41,6 (2C); 31,7; 29,4; 28,4 (6C); 27,7. MS (ESI ): m/z = [M H] 566,3; [M Na] 588.3. HRMS (ESI ): m/z calc. para C27H43N5OsNa [M Na] = 588,3009; encontrado = 588,2980.
Compuesto 36g: 1H RMN (CDCb, 400 MHz): 5 (ppm) 7,49 (d, J = 4,8 Hz, 1H); 6,33 (d, J = 4,8 Hz, 1H); 4,70 (s, 2H); 3,53-3,51 (m, 1H); 3,19 - 3,17 (m, 2H); 3,07-2,91 (m, 2H); 2,26 (s, 3H); 1,56-1,44 (m, 4H); 1,42 (s, 18H). 13C RMN (CDCb, 100 MHz): 5 (ppm) 169,9; 167,1; 157,3; 157,0; 145,5; 139,0; 131,9; 111,1; 78,6 (2C); 55,5; 50,5; 44,1; 39,2; 29,6; 27,4 (6C); 25,4; 10.7.
MS (ESI ): m/z = [M H] 483,2.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C23H3sN4O7Na [M Na] = 505,2638; encontrado = 505,2636.
Compuesto 36h: 1H RMN (CDCb, 400 MHz): 5 (ppm) 7,57 (d, J = 4,8 Hz, 1H); 6,41 (d, J = 4,8 Hz, 1H); 4,77 (s, 2H); 3,57 (m, 1H); 3,14-3,11 (m, 2H); 3,02-2,98 (m, 2H); 2,34 (s, 3H); 1,58-1,49 (m, 2H); 1,40 (s, 20H); 1,39-1,35 (m, 2H). 13C RMN (CDCla, 100 MHz): 5 (ppm) 169,9; 167,1; 157,3; 157,0; 145,5; 139,0; 131,9; 111,1; 78,6 (2C); 55,5; 50,7; 44,0; 39,1; 31,6; 28,7; 27,4 (6C); 22,9; 10.7.
MS (ESI ): m/z = [M H] 497,3; [M Na] 519,2.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C24H40N4O7Na [M Na] = 519,2795; encontrado = 519,2789.
Compuesto 36i: 1H RMN (CDCla, 400 MHz): 5 (ppm) 7,56 (d, J = 7,2 Hz, 1H); 6,37 (d, J = 7,2 Hz, 1H); 4,37-4,33 (m, 2H); 3,53 (m, 1H); 3,13-3,07 (m, 2H); 3,00-2,95 (m, 2H); 2,64 (t, J = 6,5 Hz, 2H); 2,46 (s, 3H); 1,44 (s, 18H); 1,44-1,40 (m, 4H); 1,40-1,23 (m, 2H).
13C RMN (CDCI3, 100 MHz): 5 (ppm) 171,5; 170,8; 158,5; 158,2; 147,1; 139,0; 132,5; 112,5; 80,0 (2C); 51,4; 50,3; 45,4; 40,2; 37,6; 32,9; 30,0; 28,8 (6C); 24,3; 11,8.
MS (ESI ): m/z = [M H] 511,3; [M Na] 533,2.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C25H42N4O7Na [M Na] = 533.2951; encontrado = 533.2935.
Compuesto 36j: 1H RMN (CDCI3, 400 MHz): 5 (ppm) 7,39 (m, 2H); 6,31 (m, 1H); 5,40-5,33 (s, 2H); 3,95 (m, 2H); 3,55 (m, 1H); 3,40-3,13 (m, 4H); 2,35 (s, 3H); 2,24 (m, 2H); 1,96-1,60 (m, 4H), 1,40 (s, 18H).
13C RMN (CDCI3, 100 MHz): 5 (ppm) 174,2; 169,8; 157,7 (2C); 146,8; 137,5; 129,3; 111,6; 80,2 (2C); 52,2; 51,6; 44,9; 36,8; 33,5; 31,4; 30,2; 28,7 (6C); 12.1.
MS (ESI ): m/z = [M H] 497,2; [M Na] 519,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C24H40N4O7Na [M Na] = 519,2795; encontrado = 519,2795.
Compuesto 36k: 1H RMN (CDCb, 400 MHz): 5 (ppm) 7,26 (m, 1H); 6,35 (m, 1H); 5,98 (s, 2H); 5,13 (m, 2H); 4,88 (m, 1H); 3,67-3,66 (m, 8H); 3,14 (m, 2H); 2,35 (m, 2H); 2,17 (s, 3H); 1,80-1,63 (m, 2H), 1,40 (s, 18H).
13C RMN (CDCls, 100 MHz): 5 (ppm) 171,6; 168,9; 164,5; 156,9 (2C); 142,8; 138,6; 128,5; 111,5; 79,6 (2C); 55,0; 50,7; 45,2; 44,9; 44,6; 42,1; 41,5; 29,9; 28,4 (6C); 28,1; 12,2.
MS (ESI ): m/z = [M H] 566,3; [M Na] 588,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C27H43N5OsNa [M Na] = 588,3009; encontrado = 588,3002.
Compuesto 36l: 1H RMN (CDCls, 400 MHz): 5 (ppm) 6,83 (d, J = 6,8 Hz, 1H); 6,76 (d, J = 7,3 Hz, 1H); 6,11 (t, J = 7,1 Hz, 1H); 5,17-5,08 (s, 2H); 4,02 (t, J = 6,9 Hz, 2H); 3,56 (m, 1H); 3,15-3,12 (m, 4H); 2,91-2,83 (m, 6H); 2,57­ 2,56 (m, 2H); 2,12 (m, 2H); 1,80-1,78 (m, 2H); 1,37 (m, 22H).
13C RMN (CDCl3, 100 MHz): 5 (ppm) 159,0; 157,2; 156,3; 147,0; 127,4; 114,3; 107,1; 79,7 (2C); 56,9; 54,4; 51,1; 50,2 (2C); 48,4; 44,7 (2C); 30,1; 28,6 (6C); 27,3; 25,5; 21,2. MS (ESI ): m/z = [M H] 538,3.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C27H48N5O6 [M H] = 538,3605; encontrado = 538,3611.
Compuesto 36m: 1H RMN (CDCb, 400 MHz): 5 (ppm) 6,85 (d, J = 6,6 Hz, 1H); 6,77 (dd, Ji = 7,3 Hz y J 2 = 1,5 Hz, 1H); 6,12 (t, J = 7,1 Hz, 1H); 5,07 (s, 2H); 4,02-3,88 (m, 2H); 3,59 (m, 1H); 3,16 (m, 2H); 2,34-2,32 (m, 4H); 2,16 (s, 3H); 1,90 (t, J = 6,6 Hz, 2H); 1,51 (m, 4H); 1,41 (s, 18H).
13C RMN (CDCb, 100 MHz): 5 (ppm) 159,3; 156,9 (2C); 147,1; 127,6; 113,7; 106,8; 79,5 (2C); 57,5; 54,5; 51,4; 48,3; 45,1; 42,0; 31,4; 28,6 (6C); 26,8; 24,4.
MS (ESI ): m/z = [M H] 483,4; [M Na] 505,3.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C24H43N4O6 [M ] = 483,3183; encontrado = 483,3172. Compuesto 36n: 1H RMN (CDCb, 400 MHz): 5 (ppm) 7,86 (m, 1H); 7,03-7,02 (m, 2H); 5,19-5,10 (m, 2H); 4,19 (m, 2H); 3,59 (m, 1H); 3,13 (m, 2H); 2,51 (s, 3H); 1,84-1,78 (m, 2H); 1,39-1,38 (m, 22H).
13C RMN (CDCb, 100 MHz): 5 (ppm) 161,5; 157,1; 156,6; 144,5; 138,4; 137,5; 112,3; 79,6 (2C); 56,3; 51,2; 44,6; 32,3; 30,3; 28,6 (6C); 22,8; 12,8.
MS (ESI ): m/z = [M H] 440,3.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C22H38N3O6 [M H] = 440,2761; encontrado = 440,2749.
- Desprotección final del grupo diamina (Esquema 13)
Figure imgf000039_0001
El compuesto 36a-n o 23b (0,2-1,7 mmol) se disuelve en 1,4-dioxano (4-10 ml) en presencia de una solución comercial de HCl 4 N en 1,4-dioxano (20 eq). Después, el medio de reacción se agita a temperatura ambiente durante de 45 min a 16 h. El dioxano se evapora a presión reducida y el residuo se tritura en éter. Después de evaporación al vacío (productos muy higroscópicos), el precipitado obtenido se liofiliza para dar el derivado 37a-n o 38 (78 a 100 %) (tabla 4).
Los compuestos 37d, 37f, 37i, 37j y 38 son compuestos de referencia y no forman parte de la invención.
T l 4: m 7
Figure imgf000039_0002
continuación
Figure imgf000040_0001
Compuesto 37a: 1H RMN (D2O, 400 MHz): 5 (ppm) 7,16 (dd, Ji = 6,8 Hz y J 2 = 1,4 Hz, 1H); 7,05 (dd, Ji = 7,5 Hz y J 2 = 1,4 Hz, 1H); 6,41 (t, J = 7,1 Hz, 1H); 4,30 (t, J = 6,4 Hz, 2H); 3,67-3,64 (m, 1H); 3,35-3,34 (m, 2H); 3,18 (t, J = 6,7 Hz, 2H); 2,72 (t, J = 6,4 Hz, 2H); 1,76-1,57 (m, 4H).
13C RMN (D2O, 100 MHz): 5 (ppm) 173,3; 158,5; 145,5; 129,4; 118,8; 108,5; 49,0; 47,4; 40,9; 38,7; 35,3; 27,5; 24,1. MS (ESI ): m/z = [M H] 283,1.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C13H23N4O3 [M H] = 283,1770; encontrado = 283.1765.
Compuesto 37b: 1H RMN (d6-DMSO, 300 MHz): 5 (ppm) 8,59 (s, 4H); 8,10-8,07 (s, 1H); 7,08 (dd, Ji = 6,9 Hz y 2 = 1,5 Hz, 1H); 6,70 (dd, Ji = 7,2 Hz y J 2 = 1,5 Hz, 1H); 6,07 (t, J = 7,2 Hz, 1H); 4,10 (t, J = 6,9 Hz, 2H); 3,40­ 3,38 (m, 1H); 3,09-3,00 (m, 4H); 2,53-2,49 (m, 2H); 1,63-1,58 (m, 2H); 1,19 (m, 4H).
13C RMN (d6-DMSO, 75 MHz): 5 (ppm) 169,6; 157,8; 146,8; 128,6; 115,0; 105,4; 49,1; 45,9; 40,6; 38,2; 34,8; 29,7; 28,6; 21,9.
MS (ESI ): m/z = [M H] 296,9.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C14H25N4O3 [M H] = 297,1927; encontrado = 297.1914.
Compuesto 37c: 1H RMN (d6-DMSO, 300 MHz): 5 (ppm) 8,63 (s, 2H); 8,54 (s, 2H); 8,30 (s, 1H); 7,20 (dd, Ji = 6,8 Hz y J 2 = 1,5 Hz, 1H); 6,72 (dd, Ji = 7,2 Hz y J 2 = 1,8 Hz, 1H); 6,11 (t, J = 6,9 Hz, 1H); 3,96-3,87 (m, 2H); 3,49-3,46 (m, 1H); 3,11 - 3,04 (m, 4H); 2,32-2,31 (m, 2H); 1,90-1,75 (m, 4H).
13C RMN (d6-DMSO, 75 MHz): 5 (ppm) 171,2; 157,6; 146,6; 128,2; 114,8; 105,5; 48,7; 46,6; 40,3; 35,8; 30,8; 28,7; 26,1.
MS (ESI ): m/z = [M H] 283,0.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C13H23N4O3 [M H] = 283,1810; encontrado = 283,1800. Compuesto 37d: 1H RMN (D2O, 400 MHz): 5 (ppm) 7,20 (d, J = 6,4 Hz, 1H); 7,03 (d, J = 6,6 Hz, 1H); 6,39 (t, J = 6,9 Hz, 1H); 4,32­ 4,28 (m, 1H); 4,06-4,02 (m, 2H); 3,69-3,45 (m, 8H); 3,17-3,10 (m, 2H); 3,04-3,01 (m, 2H); 2,99-2,95 (m, 2H). 13C RMN (D2O, 100 MHz): 5 (ppm) 172,8; 171,5; 168,8; 158,5; 129,5; 118,9; 108,3; 47,1; 45,5; 45,3; 44,7; 44,3; 41,5; 40,7; 33,2; 31,5.
MS (ESI ): m/z = [M H] 352,2.
Hr Ms (e S i ): m/z calc. para C16H26N5O4 [M H] = 352,1985; encontrado = 352,1977. Compuesto 37e: 1H RMN (D2O, 400 MHz): 5 (ppm) 7,14-7,08 (m, 2H); 6,44 (m, 1H); 5,01 (s, 2H); 3,94-3,85 (m, 1H); 3,66 (m, 8H); 3,17 (m, 2H); 2,78-2,76 (m, 2H); 2,13-2,08 (m, 2H).
13C RMN (D2O, 100 MHz): 5 (ppm) 172,5; 167,2; 158,7; 145,4; 130,1; 119,2; 108,3; 51,2; 49,2; 44,6; 44,1; 42,9; 41,7; 41,3; 28,5; 25,3.
MS (ESI ): m/z = [M H] 352,2.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C16H26N5O4 [M H] = 352,1985; encontrado = 352,1981. Compuesto 37f: 1H RMN (D2O, 400 MHz): 5 (ppm) 7,20 (d, J = 6,3 Hz, 1H); 7,03 (d, J = 6,4 Hz, 1H); 6,39 (t, J = 6,8 Hz, 1H); 4,30 (t, J = 6,3 Hz, 2H); 3,75-3,60 (m, 4H); 3,55-3,52 (m, 5H); 3,37-3,35 (m, 2H); 2,98-2,95 (m, 2H); 2,74-2,68 (m, 2H); 2,11-2,03 (m, 2H).
13C RMN (D2O, 100 MHz): 5 (ppm) 172,7; 161,7; 158,8; 145,3; 129,5; 118,6; 108,3; 49,0; 47,0; 45,1; 44,4; 41,5; 41,2; 40,6; 31,4; 28,3; 25,2.
MS (ESI ): m/z = [M H] 366,2.
Hr Ms (ESi ): m/z calc. para C17H28N5O4 [M H] = 366,2146; encontrado = 366,2134. Compuesto 37g: 1H RMN (CD3OD, 400 MHz): 5 (ppm) 8,22 (d, J = 5,8 Hz, 1H); 7,16 (d, J = 5,8 Hz, 1H); 5,29 (s, 2H); 3,66-3,61 (m, 1H); 3,35-3,31 (m, 4H); 2,53 (s, 3H); 1,90-1,73 (m, 4H).
13C RMN (CD3OD, 100 MHz): 5 (ppm) 167,1; 160,7; 145,0; 144,3; 141,2; 111,5; 59,4; 51,0; 42,4; 40,1; 29,1; 26,2; 13.3.
MS (ESI ): m/z = [M H] 283,2.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C13H23N4O3 [M H] = 283,1770; encontrado = 283,1772. Compuesto 37h: 1H RMN (CD3OD, 400 MHz): 5 (ppm) 8,15 (d, J = 6,8 Hz, 1H); 7,12 (d, J = 6,6 Hz, 1H); 5,22 (s, 2H); 3,58-3,56 (m, 1H); 3,29-3,25 (m, 4H); 2,48 (s, 3H); 1,81-1,73 (m, 2H); 1,62-1,49 (m, 4H).
13C RMN (CD3OD, 100 MHz): 5 (ppm) 166,8; 160,4; 144,8; 143,9; 140,8; 111,4; 59,1; 50,9; 42,9; 40,3; 31,0; 29,7; 23,2; 12.9.
MS (ESI ): m/z = [M H] 297,2; [M Na] 319,2.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C14H25N4O3 [M H] = 297,1927; encontrado = 297,1913.
Compuesto 37i: 1H RMN (D2O, 400 MHz): 5 (ppm) 7,97 (d, J = 6,6 Hz, 1H); 7,18 (d, J = 7,0 Hz, 1H); 4,68 (t, J = 6,4 Hz, 2H); 3,71-3,65 (m, 1H); 3,38-3,37 (m, 2H); 3,16 (t, J = 6,7 Hz, 2H); 3,08-3,04 (s, 1H); 2,88 (t, J = 6,5 Hz, 2H); 2,56 (s, 3H); 1,85-1,74 (m, 2H); 1,52-1,38 (m, 4H).
13C RMN (D2O, 100 MHz): 5 (ppm) 171,3 (2C); 158,2; 142,4; 138,7; 110,9; 52,7; 49,2; 40,8; 38,9; 35,8; 29,6; 27,9; 21,6; 12,3.
MS (ESI ): m/z = [M H] 311,2.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C15H27N4O3 [M H] = 311.2083; encontrado = 311.2075. Compuesto 37j: 1H RMN (D2O, 400 MHz): 5 (ppm) 8,28 (d, J = 6,5 Hz, 1H); 7,13 (d, J = 6,5 Hz, 1H); 4,44 (m, 2H); 3,33-3,29 (m, 5H); 2,64 (s, 3H); 2,57 (m, 2H); 2,08-2,07 (m, 4H).
13C RMN (D2O, 100 MHz): 5 (ppm) 174,9; 159,8; 145,2; 143,4; 139,4; 111,7; 55,7; 50,6; 41,9; 37,3; 32,2; 31,0; 27,1; 12,8.
MS (ESI ): m/z = [M H] 297,2.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C14H25N4O3 [M H] = 297,1927; encontrado = 297,1931. Compuesto 37k: 1H RMN (D2O, 400 MHz): 5 (ppm) 8,01 (d, J = 6,8 Hz, 1H); 7,19 (d, J = 6,9 Hz, 1H); 5,53 (s, 2H); 3,72-3,55 (m, 9H); 3,41-3,39 (m, 2H); 2,81-2.75 (m, 2H); 2,47 (s, 3H); 2,16-2,08 (m, 2H).
13C RMN (D2O, 100 MHz): 5 (ppm) 172,4; 165,2; 159,4; 143,4; 142,5; 139,9; 111,1; 57,2; 49,1; 44,5; 44,1; 42,2; 41,4; 40,7; 28,5; 25,3; 12,5.
MS (ESI ): m/z = [M H] 366,2.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C17H28N5O4 [M H] = 366,2141; encontrado = 366,2133.
Compuesto 37l: 1H RMN (d6-DMSO, 400 MHz): 5 (ppm) 6,83 (d, J = 6,8 Hz, 1H); 6,76 (d, J = 7,3 Hz, 1H); 6,11 (t, J = 7,1 Hz, 1H); 5,17-5,08 (s, 2H); 4,02 (t, J = 6,9 Hz, 2H); 3,56 (m, 1H); 3,15-3,12 (m, 4H); 2,91-2,83 (m, 6H); 2,57-2,56 (m, 2H); 2,12 (m, 2H); 1,80-1,78 (m, 2H); 1,37 (m, 22H).
13C RMN (d6-DMSO, 100 MHz): 5 (ppm) 159,0; 157,2; 156,3; 147,0; 127,4; 114,3; 107,1; 79,7 (2C); 56,9; 54,4; 51,1; 50,2 (2C); 48,4; 44,7 (2C); 30,1; 28,6 (6C); 27,3; 25,5; 21,2. MS (ESI ): m/z = [M H] 338,3.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C17H32N5O2 [M H] = 338,2556; encontrado = 338,2552. Compuesto 37m: 1H RMN (CD3OD, 400 MHz): 5 (ppm) 7,49 (m, 1H); 7,14 (m, 1H); 6,60-6,59 (m, 1H); 4,34-4,30 (m, 2H); 3,82-3,78 (m, 1H); 3,40-3,34 (m, 4H); 3,31-3,26 (m, 2H); 2,95 (s, 3H); 2,35-2,31 (m, 2H); 2,03-1,91 (m, 4H).
13C RMN (CD3OD, 100 MHz): 5 (ppm) 158,8; 147,8; 130,1; 121,2; 112,2; 56,8; 54,6; 50,3; 49,8; 42,1; 40,9; 28,5; 25,4; 21,2.
MS (ESI ): m/z = [M H] 283,2.
Hr Ms (ESI ): m/z calc. para C14H27N4O2 [M ] = 283,2134; encontrado = 283,2133. Compuesto 37n: 1H RMN (CD3OD, 400 MHz): 5 (ppm) 8,25 (d, J = 7,0 Hz, 1H); 7,13 (d, J = 6,9 Hz, 1H); 4,42 (t, J = 7,6 Hz, 2H); 3,64-3,61 (m, 1H); 3,31-3,27 (m, 2H); 2,64 (s, 3H); 1,93-1,82 (m, 4H); 1,57-1,56 (m, 2H).
13C RMN (CD3OD, 100 MHz): 5 (ppm) 159,5; 145,0; 143,1; 139,6; 111,8; 57,4; 50,6; 42,0; 31,0; 30,7; 22,7; 12,7. MS (ESI ): m/z = [M H] 240,2.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C12H22N3O2 [M H] = 240,1712; encontrado = 240,1713. Compuesto 38: 1H RMN (CD3OD, 400 MHz): 5 (ppm) 7,46 (s, 2H); 7,37-7,27 (m, 3H); 6,58 (m, 1H); 5,21 (m, 2H); 4,40 (m, 2H); 3,62 (m, 1H); 3,32-3,31 (m, 2H); 3,19 (m, 2H); 2,77 (m, 2H); 1,80 (m, 2H); 1,53 (m, 4H).
13C RMN (CD3OD, 100 MHz): 5 (ppm) 171,4;157,1; 147,2; 135,7; 130,3; 128,6 (2C); 128,2; 127,8 (2C); 119,3; 109,5; 71,0; 49,6; 40,8; 38,5; 34,7; 32,4; 29,7; 28,3; 21,8.
MS (ESI ): m/z = [M H] 387,2.
HRMS (ESI ): m/z calc. para C21H31N4O3 [M H] = 387,2396; encontrado = 387,2382.
B. ESTUDIOS FISICOQUÍMICOS
I) Evaluación de la formación de aductos entre los compuestos según la invención (29a, 29b, 30a, 30b; 37a, 37b, 37c, 37d, 37f, 37i, 37j) y a-oxoaldehídos o aldehidos a,p-insaturados mediante análisis por HPLC
1- Principio
Los compuestos a probar se incuban a 37 °C en presencia de MGO o de MDA. A continuación, se realiza un estudio cinético con el objetivo de dar cuenta de la formación de aductos con MGO o MDA mediante análisis por HPLC.
2- Método
a) Preparación de las soluciones
Los compuestos a probar (30 jm ol) se disuelven en PBS (1,5 ml). Una solución acuosa (csp 1,25 ml) de MGO al 40 % en agua (250 jm ol) se prepara a continuación, y en paralelo, se hace reaccionar MDA bis-(diOEt)-acetal (250 |jmol) con una solución de HCl 1 N (2 eq) en agua (csp 1,25 ml) durante 1 h a temperatura ambiente. También es necesaria una solución acuosa de NaOH 0,05 N para neutralizar el medio de reacción (5 ml).
b) Incubación de las mezclas a 37 °C
La solución de compuesto a probar (625 j l - concentración final en el medio = 10 mM) se hace reaccionar a continuación con la solución de MGO o MDA preparada extemporáneamente (125 j l - concentración final en el medio = 20 mM) en presencia de NaOH 0,05 N (0,5 ml).
A continuación, las diferentes mezclas se incuban en un horno a 37 °C durante 24 h.
c) Análisis por HPLC
Se realiza la toma una muestra de cada mezcla (100 j l) a intervalos de tiempo regulares (0,25; 0,5; 1; 5 y 24 h) y se almacena a -20 °C para detener la reacción. Después de la dilución en una mezcla de MeCN/H2O 98:2 a temperatura ambiente, el análisis por HPLC se realiza en un dispositivo Shimadzu LCMS-2020 (cromatograma UV a 190 nm y espectro de masas en modo de ionización por electropulverización positiva (ESI )) después de separación en una columna Waters Acquity con ayuda de un gradiente de disolventes H2O HCOOH al 0,1 % / MeCN HCOOH al 0,1 % (98/2 durante 2 min, y después 55/45 durante 2 min y 45/55 durante 3 min) con un caudal de 0,3 ml/min a 40 °C y un volumen de inyección de 1 j l ( "detection mode: scan, interface voltage: tuning file, DL voltage: 100 V, Q-array DC: 40 V, Q-array RF: 40 V"). En primer lugar, se produce un blanco con ayuda de una solución que contiene el medio de reacción sin captador. A continuación, se usa una solución de captador libre 10 mM como control negativo y carnosina como referencia en la bibliografía. La proporción de aductos formados con MGO o MDA (generalmente, tR = 4,1 a 6,8 min) se mide a continuación con respecto a la cantidad de captador libre restante (generalmente, tR = 0,8 a 4,6 min) después de la medición del área bajo la curva de los picos correspondientes en el espectro UV (mediciones realizadas para una muestra representativa).
3- Resultados y discusión
a) Evaluación de la formación de aductos con MGO (figura 2)
En primer lugar, se observa una desaparición del captador libre a favor de los diferentes aductos con MGO mucho más rápido con los nuevos compuestos según la invención que con los derivados de 2a generación (Dap-Pip y Dap-(nBu)Pip) o carnosina (figura 2). La mayor eficacia de esta nueva serie de derivados de diamina como captadores de MGO, ligada al alejamiento del grupo carbonilo con respecto a la función diamina, se ha podido demostrar por lo tanto. Los compuestos 37a, 37b, 37c, 37f, 37i y 37j portadores de un grupo hidroxipiridinona aparecen además como los más reactivos con una actividad comparable a la de la hidralazina y una desaparición casi total del captador a partir de 15 min de incubación. También se pudieron identificar tres tipos de aductos posibles con MGO (aducto A (AdA) de tipo 1:1, es decir, una molécula de captador para dos moléculas de MGO; Aducto B (AdB) de tipo 1:2; Aducto C (AdC) de tipo 2:1) con una evolución frecuente hacia la observación de un aducto mayoritario de tipo 1:2, portador de un ciclo de pirazina (AdB) (figura 3). Finalmente, cabe señalar que los resultados obtenidos con el compuesto 29a no pudieron ser representados gráficamente (ND = no determinado), ya que no fue posible obtener separación entre el captador libre y los aductos con MGO. En este caso durante el análisis por HPLC. Sin embargo, parece surgir una tendencia hacia una presencia mayoritaria de AdB con respecto al captador libre después de 5 h de reacción.
b) Evaluación de la formación de aductos con MDA (figura 4)
Se observa, concretamente, la formación de un aducto portador de un ciclo de 2,3-dihidro-1H-1,4-diazepina (Aducto D (AdD)) con el conjunto de los compuestos según la invención (figura 4 y figura 5). Los derivados 30b, 37c, 37d, 37f, 37i y 37j resultaron ser los más reactivos con la consecuente desaparición del captador probado a favor de los aductos con MDA al cabo de 1 h (> 81 % de aductos). Cabe señalar que los resultados obtenidos con el compuesto 29a no pudieron una vez más ser representados gráficamente (ND = no determinado) porque, como con m Go , no se pudo encontrar ninguna separación entre el captador de y los aductos con MDA durante el análisis por HPLC. En este caso, parece surgir una tendencia hacia una presencia mayoritaria de TDA con respecto al captador libre solamente después de 24 h de reacción.
II) Evaluación de las propiedades quelantes de Cu2+ de los compuestos según la invención ((29a, 29b, 30a, 30b; 37a, 37b, 37c, 37d, 37f, 37i, 37j) por espectrofotometría UV/visible
1- Principio:
Los compuestos a probar se incuban a TA en presencia de Cu2+ durante 10 min. La cantidad de Cu2+ libre restante se determina después de la complejación con murexida (Int. J. Mol. Sci., 2009, 10, 5485-5497; Molecules, 2012, 17, 13457-13472). Una medición de la absorbancia a 485 nm (A485) del complejo Cu2+/murexida (naranja) y de la absorbancia a 520 nm (A520) de la murexida libre (rosa) se realiza, en efecto, mediante espectrofotometría UV/visible. La cantidad de Cu2+ libre restante se evalúa después con ayuda de la ecuación de la recta de calibración que da la relación A485/A520 en función de la concentración de Cu2+ obtenida previamente. Al final, se deduce de ello el porcentaje de complejación de Cu2+ por los compuestos probados.
2- Método:
a) Preparación de las soluciones
En primer lugar, se prepara un tampón hexamina 0,01 M/KCl 0,01 M (csp 200 ml) cuyo pH se ajusta a 5 con ayuda de una solución de HCl 1 N. A continuación, se producen soluciones de CuSO4.5H2O 0,5 mM (20 ml) y 0,25 mM (100 ml) en este tampón, utilizándose la primera para la obtención de la curva de calibración. Una solución acuosa de murexida a 1 mM también debe prepararse extemporáneamente (10 ml), así como una solución madre de los compuestos a probar a 4,2 mM en tampón hexamina 0,01 M/ KCl 0,01 M o en una mezcla de tampón y de MeOH 75/25 (6,2 ml).
b) Incubación de las mezclas a TA
Diferentes concentraciones de los compuestos a probar se distribuyen en tampón hexamina 0,01 M/KCl 0,01 M (pH = 5) (tabla 5) o en una mezcla de tampón y MeOH 75/25 en tubos de hemólisis (tabla 6). A continuación, se añade la solución de CuSO4.5H2O 0,25 mM (1 ml) y la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 10 min. Finalmente, se introduce la solución acuosa de murexida a 1 mM (0,1 ml) y se incuba nuevamente a TA durante 1 min. A continuación, se miden las absorbancias a 485 nm (A485) y 520 nm (A520) mediante espectrofotometría UV/visible (espectrómetro V-650 JASCO) (mediciones realizadas por triplicado). Se utiliza un blanco que contiene tampón hexamina 0,01 M/KCl 0,01 M (pH = 5) (2 ml) y agua (0,1 ml), y etilendiamina (EDA) como referencia de la bibliografía como quelante de Cu2+.
Tabla 5: Preparación de las diferentes concentraciones de compuesto a probar en tampón hexamina 0,01 M / KCl 001 M H = 5
Figure imgf000043_0001
continuación
Figure imgf000044_0002
Tabla 6: Preparación de las diferentes concentraciones de compuesto a probar en una mezcla de tampón hexamina 001 M / KCl 001 M H = 5 de MeOH 75/25
Figure imgf000044_0003
Se realizaron previamente curvas de calibración después de la distribución de diferentes concentraciones de CUSO4.5 H2O en tampón hexamina 0,01 M/ KCl 0,01 M (pH = 5) (tabla 7) o en una mezcla de tampón y MeOH 75/25 (tabla 8) en tubos de hemólisis (mediciones realizadas por triplicado). Después de la introducción de la solución acuosa de murexida a 1 mM (0,1 ml), se incuba a TA durante 1 min y se miden finalmente las absorbancias a 485 nm (A485) y 520 nm (A520) mediante espectrofotometría UV/visible.
Tabla 7: Preparación de las diferentes concentraciones de CuSO4.5H2 en tampón hexamina 0,01 M/ KCl 0,01
M H = 5 ara la realización de las curvas de calibración
Figure imgf000044_0001
Tabla 8: Preparación de las diferentes concentraciones de CuSO4.5H2O en una mezcla de tampón hexamina 1 M K l 1 M H = M H 7 2 r l r liz i n l rv li r i n
Figure imgf000044_0004
3- Resultados y discusión:
a) Curvas de calibración
Se obtienen rectas (figura 6, figura 7), cuyas ecuaciones permitirán determinar la cantidad de Cu2+ libre restante, después de la complejación por los compuestos a probar y finalmente evaluar su poder de complejación del Cu2+.
b) Comparación de las propiedades quelantes del Cu2+ de los compuestos probados
En primer lugar, los nuevos compuestos según la invención aparecen como mejores quelantes de Cu2+ que los derivados de 2a generación (Dap-Pip y Dap-(nBu) Pip) (figura 8). Los compuestos 30b, 37b, 37i y 37j han demostrado, de este modo, ser los más activos con un poder complejante cercano, sobre todo para el compuesto 30b, al del EDA utilizado como referencia de la bibliografía. Dentro de una misma serie, la comparación de las propiedades quelantes de Cu2+ de los compuestos 37a y 37b (compuesto 37b mejor complejante que el compuesto 37a) muestra que el alargamiento de la cadena de carbono portadora del grupo diamina terminal parece, como se esperaba, mejorar la actividad. Por tanto, el alejamiento de la función carbonilo permite, por lo tanto, potenciar bien la capacidad quelante del grupo diamina. Sin embargo, el mal resultado obtenido con el compuesto 29b en comparación con los obtenidos con los compuestos 30b y 37b, cuya cadena de carbono también se deriva de la lisina, sugiere una intervención asociada en la complejación del Cu2+ del grupo derivado de ácido ferúlico, ácido gálico o hidroxipiridinona introducido en el extremo opuesto de la molécula. Para validar esta hipótesis, se compararon, por lo tanto, las propiedades quelantes de Cu2+ del compuesto 37b y de dos compuestos relacionados que presentan solamente un extremo quelante del Cu2+ libre (compuestos 36b y 38) (figura 9 y figura 10). De este modo, la pérdida del grupo diamina (compuesto 36b) resulta casi sin consecuencias, a diferencia de la del grupo hidroxipiridinona (compuesto 38) que, por tanto, parece esencial para la actividad quelante de Cu2+ de los nuevos compuestos según la invención. Además, la comparación de los resultados obtenidos con los compuestos 37c y 37j muestra un mayor poder complejante de Cu2+ del motivo 3-hidroxi-2-metilpiridin-4-ona con respecto al motivo 3-hidroxipiridin-2-ona. Por último, teniendo en cuenta los malos resultados obtenidos con los compuestos 29a y 29b, el grupo derivado de ácido ferúlico parece presentar el poder complejante de Cu2+ menos interesante.
III) Evaluación de las propiedades antioxidantes de los compuestos según la invención (29a, 29b, 30a, 30b; 37a, 37b, 37c, 37d, 37f, 37i, 37j) mediante una prueba ORAC ("Oxygen radical absorbance capacity")
1- Principio:
Las propiedades antioxidantes de los compuestos según la invención se evaluaron gracias a una prueba ORACfl utilizando fluoresceína (J. Agric. Food Chem.,2004 52, 48-54; J. Agric. Food Chem., 2005, 53, 4290-4302). De este modo, los radicales peróxido, generados en presencia de AAPH (2,2'-azobis(2-metilpropionamidina)diclorhidrato) a 37 °C, reaccionan con esta sonda fluorescente para dar un producto no fluorescente. El efecto protector de los compuestos probados se puede determinar después siguiendo la curva de disminución de la fluorescencia de la fluoresceína con el tiempo y midiendo el área bajo la curva (AUC = "Area under the curve") de la muestra con respecto a la de un control correspondiente a la ausencia de antioxidante.
El trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico), un análogo hidrosoluble de la vitamina E, se utiliza como estándar para el cálculo de la capacidad antioxidante (ORACfl) de los compuestos probados a 10 pM, expresada en pmol de equivalente de Trolox (TE = "Trolox equivalent")/pmol de compuesto probado. Este valor se obtiene, de este modo, con ayuda de la ecuación de la recta de calibración que da el área bajo la curva en función de diferentes concentraciones de trolox (Bioorg. Med. Chem., 2015, 23, 1135-1148) (figura 11).
2- Método:
Una solución de fluoresceína (FL) (12 nM; 150 pl) se introduce en una placa negra de 96 pocillos (Dutscher, Brumath, Francia). Los compuestos a probar (1-20 pM; 25 pl) o el trolox (1-50 pM; 25 pl) disuelto en D-PBS se añaden a cada pocillo. Después del equilibrado de la placa durante una incubación a 37 °C durante un mínimo de 30 min, se inician las reacciones radicalarias con ayuda de una solución de AAPH preparada extemporáneamente (30 mM; 25 pl). La fluorescencia (Aex: 485 nm; ÁEm: 520 nm) se mide cada 90 segundos durante 60 ciclos gracias a un lector de microplacas termostático Tecan Infinite® 200 PRO (mediciones realizadas por triplicado durante tres experimentos independientes).
3- Resultados y discusión:
Los compuestos según la invención han mostrado una capacidad antioxidante significativa (tabla 9: ORACfl s 1 pmol TE/pmol), comparada en concreto con la muy baja actividad encontrada para la carnosina. Además, la introducción del grupo resultante del ácido ferúlico, del ácido gálico o del motivo hidroxipiridinona parece indispensable para la adquisición de estas propiedades antioxidantes teniendo en cuenta la ausencia de actividad encontrada para el derivado Dap-Pip de 2a generación. De este modo, los compuestos 30b y 37c han demostrado ser los más activos y, debido a esto, serán retenidos como líderes de sus respectivas familias. Cabe señalar que la comparación de los resultados obtenidos con los compuestos 37c y 37j fue en este caso a favor de una mejor capacidad antioxidante del motivo 3-hidroxipiridin-2-ona.
Tabla 9: Capacidad antioxidante (ORACfl) de los compuestos según la invención a 10 pM (los valores se expresan mediante la media ± SEM ("Standard error of the mean") de tres experimentos independientes realizados por tri licado .
Figure imgf000045_0001
continuación
Figure imgf000046_0001
C. EVALUACION BIOLOGICA IN VITRO
I) Evaluación in vitro de las propiedades antirradicalarias de los compuestos según la invención (29a, 29b, 30a, 30b; 37a, 37b, 37c)
1- Principio:
Las propiedades antirradicalarias de los diferentes compuestos se determinan mediante la inhibición de la peroxidación lipídica en el modelo in vitro de oxidación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) (Free Radic. Biol. Med., 1992, 13, 341-390). La peroxidación lipídica se inicia por el ataque de los radicales libres de un doble enlace de un ácido graso poliinsaturado presente en las LDL. Esto da como resultado la eliminación de un átomo de hidrógeno de un grupo CH2. Este radical inestable se reordena para dar como resultado, después, una configuración más estable, a saber, un dieno conjugado. Una vez iniciada, la oxidación de LDL es una reacción en cadena de peroxidación lipídica generada por los radicales libres. La oxidación in vitro de LDL se induce a continuación a 37 °C mediante la adición del compuesto hidrosoluble 2,2'-azobis(2-metilpropionamidina)diclorhidrato (AAPH), que genera radicales libres durante su descomposición térmica espontánea.
2- Método:
Brevemente, la oxidación, realizada en una placa de 96 pocillos, se induce a 37 °C añadiendo 20 pl de una solución de AAPH a 2 mM en D-PBS a 160 pl de LDL (100 pg/ml) en presencia o ausencia de 20 pl de las diferentes soluciones de los compuestos a probar disueltos en D-PBS (0,1 a 100 pM en concentraciones finales). Las LDL solas sin adición de AAPH se utilizan como control negativo. Cada oxidación se realiza por duplicado. Durante la oxidación, la formación de los dienos conjugados se supervisa mediante medición de la densidad óptica a 234 nm cada 10 minutos durante 8 h a 37 °C con ayuda de un espectrofotómetro termostatizado TECAN. La vitamina E (atocoferol), que es un poderoso antioxidante reconocido en este modelo in vitro se utiliza como molécula de referencia (J. Nutr. Biochem., 2012, 23, 845-51).
3- Resultados y discusión:
El derivado Dap-Pip de 2a generación no muestra ningún efecto antirradicalario incluso a alta concentración (100 pM) (figura 27).
Los compuestos 29a y 29b, derivados del ácido ferúlico se comportan de forma similar (figura 28 y figura 29). En efecto, los resultados muestran que estos productos son antioxidantes para concentraciones que oscilan entre 25 y 100 pM, pero se convierten en prooxidantes a concentraciones más bajas (de 0,1 a 10 pM).
El compuesto 30b, derivado del ácido gálico, es muy prooxidante para concentraciones que oscilan entre 50 y 100 pM, pero se vuelve fuertemente antioxidante a las concentraciones más bajas (0,1 a 10 pM) (figura 30).
Los compuestos 37a y 37c, portadores de un grupo hidroxipiridinona, se comportan de forma similar. Tienen un efecto antioxidante creciente para concentraciones que oscilan entre 1 y 100 pM (figura 31 y figura 32).
A bajas concentraciones de 1 a 10 pM, los compuestos 30b, 37a y 37c según la invención presentan propiedades antirradicalarias superiores a las del derivado Dap-Pip de 2a generación, e incluso a las de la vitamina E (figura 33 y la figura 34). La eficacia de esta 3a generación de compuestos antioxidantes a la vez frente a derivados relacionados anteriores, pero también a un producto de referencia, se ha podido demostrar por lo tanto.
Queda aún por estudiar el comportamiento bastante atípico del compuesto 30b (antioxidante a bajas concentraciones y prooxidante a altas concentraciones). Por el contrario, el perfil de los compuestos 29a y 29b (prooxidantes a bajas concentraciones y antioxidantes a altas concentraciones) puede encontrar eco en ciertos trabajos recientes descritos en la bibliografía (J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 3597-3604; J. Agric. Food Chem., 2010, 58, 9273-9280).
Finalmente, los compuestos 37a y 37c, portadores de un grupo hidroxipiridinona, parecen tener las mejores propiedades antioxidantes a bajas concentraciones del orden de 1 pM.
II) Estudio de la citotoxicidad de los compuestos según la invención
Las líneas celulares utilizadas tanto para el estudio de la citotoxicidad de los compuestos según la invención como para la evaluación de sus propiedades antiapoptóticas fueron seleccionados teniendo en cuenta las reivindicaciones expuestas anteriormente, con vistas a una utilización en cosmética o en el tratamiento y/o la prevención en concreto de la aterosclerosis y las enfermedades neurodegenerativas de los compuestos según la invención. De este modo, estos diferentes estudios pudieron realizarse en fibroblastos humanos (MRC-5), células endoteliales cerebrales murinas (bEnd.3) y células de feocromocitoma de rata, equiparadas a células neuronales (PC12) (Eur. J. Med. Chem., 2014, 83, 355-365; Chem. Biol. Interact., 2014, 224, 108-116; Neurochem. Int., 2013, 62, 620-625).
1- Principio:
La viabilidad celular se evalúa mediante un método colorimétrico basado en la detección de la conversión de una sal de tetrazolio (WST-8) por las células metabólicamente activas (kit CCK-8, Sigma, Lyon, Francia) (Molecules, 2014, 19(8), 12048-12064; J. Pharmacol. Toxicol. Methods., 2007, 56(1), 58-62). Las células vivas poseen deshidrogenasas mitocondriales que reducen el WST-8 (2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio), sal monosódica) a formazán de color naranja, que se disuelve directamente en el medio de cultivo en presencia de 1-metoxi PMS (metilsulfato de 1-metoxi-5-metilfenazinio). Después de una incubación de 1 h a 37 °C, se mide la absorbancia del formazán a 450 nm. La absorbancia es directamente proporcional al número de células vivas.
2- Método:
Brevemente, las células se siembran en placas de 96 pocillos a razón de 5.103 células por pocillo en 100 pl del medio apropiado hasta subconfluencia. A continuación, las células se lavan con D-PBS, y después se tratan con diferentes concentraciones (10 pM, 100 pM) de los productos a probar por triplicado durante 24 y 48 h. Se realiza un control positivo con un 10 % de DMSO. A continuación, se añade la solución CCK-8 (10 pl) a cada pocillo para una incubación de 1 h a 37 °C. La medición de la absorbancia se efectúa a 450 nm con ayuda de un lector de microplacas Perkin Elmer 2103 Envision®.
La viabilidad de las células se expresa en % del control (células no tratadas) mediante la media ± desviación estándar de los triplicados que forman un experimento representativo o de tres experimentos independientes realizados por triplicado.
3- Resultados y discusión:
Tabla 10: Estudio de la citotoxicidad de los compuestos según la invención en tres líneas celulares (células endoteliales cerebrales murinas (bEnd.3), células de feocromocitoma de rata, equiparadas a células neuronales (PC12) y fibroblastos humanos (MRC-5)) después de 24 h de tratamiento. La viabilidad de las l l x r m r n l l l n r 1 ^ n i i n n r l .
Figure imgf000047_0001
Tabla 11: Estudio de la citotoxicidad de los compuestos según la invención en tres líneas celulares (células endoteliales cerebrales murinas (bEnd.3), células de feocromocitoma de rata, equiparadas a células neuronales (PC12) y fibroblastos humanos (MRC-5)) después de 48 h de tratamiento. La viabilidad de las l l x r m r n l l l n r 1 ^ n i i n n r l .
Figure imgf000047_0002
continuación
Figure imgf000048_0001
La tendencia general que se desprende de estos primeros resultados (mediciones realizadas por triplicado que forman un experimento representativo) revela a priori una baja citotoxicidad, incluso una ausencia de citotoxicidad de los compuestos según la invención en las tres líneas celulares probadas a 10 y 100 pM después de 24 h (tabla 10, figura 35, figura 36, figura 37) o 48 h de tratamiento (tabla 11, figura 38, figura 39, figura 40). Sin embargo, aparecen algunos datos menos satisfactorios, sobre todo para una alta concentración de 100 pM para, concretamente, los compuestos 29a, 30b y 37c. El compuesto 30b está, de este modo, en el origen de una disminución no despreciable de la viabilidad celular a 100 pM y después de 48 h de tratamiento en células PC12 (67 % de control). Sin embargo, esta citotoxicidad podría explicarse por su carácter prooxidante ya observado a alta concentración durante la evaluación in vitro de sus propiedades antirradicalarias (figura 30). Finalmente, habiéndose encontrado una actividad antirradicalaria superior a la de la vitamina E para los derivados más interesantes para concentraciones inferiores o iguales a 10 pM (figura 33, figura 34), estos primeros resultados sobre la citotoxicidad de los compuestos según la invención parecerán muy alentadores.
Por último, la ausencia de citotoxicidad de los compuestos según la invención pudo confirmarse después de 24 h de tratamiento en las células PC12 durante tres experimentos independientes llevados a cabo por triplicado (figura 41).
III) Evaluación de las propiedades antiapoptóticas de los compuestos según la invención en diferentes líneas celulares (29a, 29b, 30a, 30b; 37a, 37b, 37c)
1- Principio:
La apoptosis es un mecanismo intrínsecamente programado de muerte celular, altamente regulado, que constituye una respuesta del organismo a estímulos fisiológicos o patológicos que provocan un desequilibrio entre la producción y la eliminación de células. Este mecanismo de muerte programada permite mantener la homeostasis de los tejidos. Morfológicamente, la apoptosis corresponde a una retracción progresiva de la célula, con condensación de la cromatina y del citoplasma, seguida de una fragmentación característica regular del ADN que conduce a la formación de fragmentos celulares (fragmentación internucleosómica) o cuerpos apoptóticos. Una regulación inadecuada de la apoptosis juega un papel importante en muchas afecciones patológicas como cáncer, autoinmunidad, enfermedad de Alzheimer... (The Lancet, 1993, 381, 1251-1254; Toxicol Pathol., 2007, 35(4), 495­ 516).
Diversos estudios han demostrado que el metiglioxal (MGO) induce la apoptosis en numerosos tipos celulares (Int. J. Mol, Med., 2010, 26, 813-818).
La apoptosis de las células se evalúa mediante un método ELISA utilizando dos anticuerpos monoclonales murinos dirigidos uno contra el ADN y el otro contra las histonas (kit Cell Death Detection ELISAPLUS, Roche, Meylan, Francia). Esta técnica permite medir específicamente los mono y oligonucleosomas en la fracción citoplásmica de los lisados celulares.
2- Método:
Brevemente, las células se siembran en placas de 96 o 24 pocillos a razón de 5.103 células/pocillo para Bend.3 y PC12 y 75.103 células/pocillo para MRC5 en el medio adecuado hasta subconfluencia. A continuación, las células se lavan con PBS, y después se tratan con diferentes concentraciones (10 pM, 100 pM) de los productos a probar, por triplicado durante de 30 min a 1 h (células PC12 y Bend.3) o 1 h (células MRC5) a 37 °C. La solución de MGO (1 mM para las células PC12, 2 mM para las células Bend.3 y MRC5) se añade a continuación para una incubación de 24 h. Las concentraciones de MGO para cada tipo celular se seleccionaron según la bibliografía y una prueba de citotoxicidad (CCK8) que se realizó. A continuación, se añade la solución de lisis a cada pocillo durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, los lisados celulares se centrifugan a 200 g durante 10 min. Después, se utilizan veinte microlitros de este lisado celular para el ELISA según el procedimiento descrito por el proveedor. De este modo, los lisados celulares se aplican a una placa recubierta de anticuerpos anti-Histonas que permite visualizar la fragmentación del ADN. Una peroxidasa asociada a anticuerpos anti-ADN reacciona, a continuación, en presencia de su sustrato, ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato de diamonio) y H2O2 para dar un derivado verde cuya densidad óptica refleja el nivel de apoptosis. La medición de la absorbancia se efectúa a 405 nm con ayuda de un lector de microplacas Perkin Elmer 2103 Envision®. Se realiza un control positivo en presencia de MGO solo.
La apoptosis de las células se expresa mediante la media ± desviación estándar de triplicados que forman un experimento representativo o de tres experimentos independientes realizados por triplicado.
3- Resultados y discusión:
Los compuestos 30b y 37c han mostrado propiedades antiapoptóticas muy interesantes a partir de 10 pM después de la inducción de apoptosis por MGO en células endoteliales cerebrales murinas (bEnd.3) (figura 42, figura 43). Por lo tanto, parecen capaces de ralentizar la cascada celular dañina ligada al estrés oxidativo y carbonílico con vistas al uso de los compuestos según la invención en el tratamiento y/o la prevención de la aterosclerosis.
El compuesto 37c ha revelado propiedades antiapoptóticas muy interesantes a partir de 10 pM después de la inducción de apoptosis por MGO en células de feocromocitoma de rata, equiparadas a células neuronales (PC12) (figura 44, figura 45). Por lo tanto, parece capaz de ralentizar la cascada celular dañina ligada al estrés oxidativo y carbonílico con vistas al uso de los compuestos según la invención en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades neurodegenerativas. Para el compuesto 30b, esta tendencia se confirma a 100 pM.
Los compuestos 37b y 37c presentan propiedades antiapoptóticas prometedoras a 100 pM después de la inducción de apoptosis por MGO en fibroblastos humanos (MRC-5) (figura 46, figura 47). Por lo tanto, parecen capaces de ralentizar la cascada celular dañina ligada al estrés oxidativo y carbonílico con vistas a una aplicación de los compuestos según la invención en el campo cosmético para la prevención del envejecimiento prematuro de la piel.
Por último, las propiedades antiapoptóticas del compuesto 37c a 100 pM después de la inducción de apoptosis por MGO en células de feocromocitoma de rata, equiparadas a células neuronales (PC12) pudieron confirmarse durante tres experimentos independientes realizados por triplicado (figura 48).

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Compuesto de fórmula I:
Figure imgf000050_0001
y sus sales,
en la que
n es un número entero de 1 a 6;
X es CO o CH2;
Y es NR1R2 o R2 o
Figure imgf000050_0002
R1 es H o alquilo o alquil-arilo;
R2 es Z-L-R3;
Z es inexistente, CO o CH2;
L es inexistente, CH=CH o (CH2K
m es un número entero de 1 a 6;
R3 es fenilo, sustituido con al menos un grupo OH y uno o más sustituyentes seleccionados entre OH, alcoxi C1 a C4 y alquilo C1 a C4, o R3 es N-piridinonilo, sustituido con al menos un grupo OH y opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados entre OH, alcoxi C1 a C4 y alquilo C1 a C4.
2. Compuesto o sal según la reivindicación 1, que tiene la fórmula II
Figure imgf000050_0003
3. Compuesto o sal según la reivindicación 1, que tiene la fórmula III
Figure imgf000050_0004
III.
4. Compuesto o sal según la reivindicación 1, que tiene la fórmula IV
Figure imgf000051_0001
5. Compuesto o sal según la reivindicación 1, que tiene la fórmula V
Figure imgf000051_0002
6. Compuesto o sal según la reivindicación 4 o 5, en el que Z-L-R3 se selecciona entre:
Figure imgf000051_0003
en los que R5, R6, R9, R10, R11, R16, R17 y R21 se seleccionan, independientemente entre sí, entre OH, alcoxi C1 a C4 y alquilo C1 a C4
7. Compuesto o sal según la reivindicación 1, que tiene la fórmula VI
Figure imgf000052_0001
VI.
8. Compuesto o sal según la reivindicación 1, seleccionado entre:
(E)-4,5-diamino-1-(4-(3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acriloil)piperazin-1-il)pentan-1-ona,
(E)-W-(5,6-diaminohexil)-3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acrilamida,
4.5- diamino-1-(4-(3,4,5-trihidroxibenzoil)piperazin-1-il)pentan-1-ona,
W-(5,6-diaminohexil)-3,4,5-trihidroxibenzamida,
W-(4,5-diaminopentil)-3-(3-hidroxi-2-oxopiridin-1(2H)-il)propanamida,
W-(5,6-diaminohexil)-3-(3-hidroxi-2-oxopiridin-1(2H)-il)propanamida,
4.5- diamino-W-(3-(3-hidroxi-2-oxopiridin-1(2H)-il)propil)pentanamida.
1-(2-(4-(4,5-diaminopentanoil)piperazin-1-il)-2-oxoetil)-3-hidroxipiridin-2(1H)-ona
W-(4,5-diaminopentil)-2-(3-hidroxi-2-metil-4-oxopiridin-1(4H)-il)acetamida
W-(5,6-diaminohexil)-2-(3-hidroxi-2-metil-4-oxopiridin-1(4H)-il)acetamida
1-(2-(4-(4,5-diaminopentanoil)piperazin-1-il)-2-oxoetil)-3-hidroxi-2-metilpiridin-4(1H)-ona
1-(3-(4-(4,5-diaminopentil)piperazin-1-il)propil)-3-hidroxipiridin-2(1H)-ona
1-(3-((4,5-diaminopentil)(metil)amino)propil)-3-hidroxipiridin-2(1H)-ona
1-(5,6-diaminohexil)-3-hidroxi-2-metilpiridin-4(1H)-ona
9. Composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto o una de sus sales farmacéuticamente aceptables según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
10. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una de sus sales farmacéuticamente aceptables para uso como medicamento.
11. Compuesto o sal farmacéuticamente aceptable para uso según la reivindicación 10 en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o afecciones asociadas con una acumulación de productos de glicación avanzada y/o productos de peroxidación de lípidos seleccionados entre enfermedades neurodegenerativas, patologías relacionadas con la edad, afecciones relacionadas con la diabetes y cáncer.
12. Compuesto o sal farmacéuticamente aceptable para uso según la reivindicación 11 en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades neurodegenerativas, concretamente entre la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.
13. Compuesto o sal farmacéuticamente aceptable para uso según la reivindicación 12 en el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad de Alzheimer o de la enfermedad de Parkinson.
14. Compuesto o sal farmacéuticamente aceptable para uso según la reivindicación 11 en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades, patologías relacionadas con la edad seleccionadas entre cataratas y reumatismo.
15. Compuesto o sal farmacéuticamente aceptable para uso según la reivindicación 11 en el tratamiento y/o la prevención de afecciones relacionadas con la diabetes.
16. Compuesto o sal farmacéuticamente aceptable para uso según la reivindicación 15 en el tratamiento y/o la prevención de aterosclerosis, retinopatía, nefropatía, neuropatía, micro y macroangiopatías, cataratas, amiloidosis, trastornos reumáticos y úlceras varicosas y arteriales.1789
17. Uso de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 como principio activo cosmético o ingrediente agroalimentario.
18. Composición cosmética que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
19. Composición agroalimentaria que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
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