CN113620831B - 抑制淀粉样β蛋白聚集的小分子化合物和制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抑制淀粉样β蛋白聚集的小分子化合物和制备方法及其应用。利用3,4,5‑三羟基苯甲酸表面羧基偶联谷氨酰胺，获得4‑氨基甲酰基‑2‑[(3,4,5‑三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物。该小分子化合物在5‑25μM的浓度范围内能够有效抑制淀粉样β蛋白的聚集，降低β折叠结构的含量，清除阿尔兹海默症模型秀丽隐杆线虫CL2006体内的淀粉样斑块，并CL2006的寿命延长了三分之一。与同类的小分子类和异类的多肽或蛋白类阿尔兹海默症抑制剂相比具有显著的淀粉样蛋白抑制效果和良好的血脑屏障穿透性；能够改变Aβ42的聚集形态，抑制淀粉样蛋白纤维的生成。作为制备治疗阿尔茨海默氏症的药物应用具有广阔前景。

Description

抑制淀粉样β蛋白聚集的小分子化合物和制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及抑制淀粉样β蛋白聚集的小分子化合物和制备方法及其应用。
背景技术
阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种神经退行性疾病。近年来，AD已成为全球性的健康问题，随着世界人口老龄化的加剧，AD的发病率升高，全球约有5000万人患病，预计到2050年将增加至现有患病人数的三倍(Lancet,2021,397:1577-1590)。AD的临床表现为记忆和认知功能的丧失，主要病理特征为胞外的老年斑沉积和胞内的神经纤维缠结(Nature,2014,515:274-278)。其中，老年斑是由淀粉样β蛋白(Amyloid-βprotein，Aβ)在脑组织中聚集形成的。Aβ由淀粉样前体蛋白(amyloid-βprecursor protein，APP)经β-和γ-分泌酶水解产生，在体内主要存在Aβ40和Aβ42两种形式，其中Aβ40在脑脊液中含量较多，约占90％，而Aβ42更容易聚集且毒性更大(Journal of biological chemistry,2012,287:5650-5660)。淀粉样级联假说认为，Aβ单体由无规则卷曲结构不断折叠成有序的β-sheet结构，随后聚集形成寡聚体、原纤维和成熟纤维，导致淀粉样沉积和神经毒性的产生(Science,2002,297:353-356)。目前开发的AD治疗药物在临床试验阶段大多出现了不良反应，如具有肝毒性或导致皮肤癌，且部分药物只能延缓AD患者的病症，不能预防和完全治愈AD(ACS chemical neuroscience,2018,9:198-210)。因此，开发一种生物相容性好，且能够有效抑制Aβ聚集的抑制剂是至关重要的。
现有的抑制剂可分为四大类，包括多肽抑制剂、蛋白抑制剂、纳米抑制剂和小分子抑制剂。多肽抑制剂特异性高，易于修饰，但多肽易发生自聚集，有效作用浓度偏高(ACSchemical neuroscience,2019,10:1390-1401)。蛋白抑制剂生物相容性好，便于化学改性，但分子量大，血脑屏障穿透性差(Journal of inorganic biochemistry,2017,171:67-75)。纳米抑制剂比表面积大，易于表面修饰，但生物相容性差，特异性不高(ACS appliedmaterials&interfaces,2015,7:5650-5662)。相比之下，小分子抑制剂结构简单，抗氧化能力强，有效作用浓度低，具有较好的血脑屏障穿透性，受到研究者的广泛关注(Science ofthe total environment,2020,725:138313)。
多酚在食物中广泛存在，已有多项研究表明，天然多酚能够抑制淀粉样纤维的形成，表现出良好的抗淀粉样变性(Molecular nutrition&food research,2015,59:8-20)。表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是绿茶的主要成分，能够显著抑制Aβ聚集体的形成。EGCG能够直接与Aβ结合，干扰Aβ聚集过程中有序的β-sheet结构的生成，形成无毒的球形聚集体(Nature structural&molecular biology,2008,15:558-566)。3,4,5-三羟基苯甲酸(Gallic acid，GA)作为EGCG的关键组成部分，同样能够抑制AD转基因小鼠大脑中Aβ的聚集沉积及其诱导产生的神经毒性(Molecular nutrition&food research,2011,55:1798-1808)。此外，GA还具有抗氧化、抗炎、抗病毒和抗癌活性(Biological&pharmaceutical bulletin,2007,30:1052-1055；Environmentaltoxicology,2013,28:579-587；Toxicology and applied pharmacology,2013,266:76-85)。利用动力学实验进行比较可知，在等质量浓度下，GA的抑制效果高于EGCG。因此，推测GA特有的羧基对具有高度结构依赖性的多酚是至关重要的。
本发明基于GA进行设计，将GA的羧基与谷氨酰胺的主链氨基结合，得到4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物(4-carbamoyl-2-[(3,4,5-trihydroxyphenyl)formamido]butanoic acid,CTFBA)，CTFBA与Aβ之间具有较高的亲和力，能够在低浓度下有效地抑制Aβ的聚集。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，合成一种具有抑制淀粉样β蛋白聚集功能的小分子化合物，并提供该小分子化合物的制备方法及其在抑制β-淀粉样蛋白聚集中的应用。
所述的4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物不仅对Aβ聚集具有显著的抑制效果，抑制淀粉样β蛋白聚集的效果一般要好于同类的小分子。4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物还能够清除AD模型秀丽隐杆线虫CL2006体内的淀粉样斑块并延长线虫寿命，同时，4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物具有穿透血脑屏障的能力，效果优于多肽类和蛋白类抑制剂。
本发明是通过以下技术手段实现的：
一种抑制淀粉样β蛋白聚集的小分子化合物，使3,4,5-三羟基苯甲酸的羧基与谷氨酰胺的主链氨基反应，获得4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物(4-carbamoyl-2-[(3,4,5-trihydroxyphenyl)formamido]butanoic acid,CTFBA)。反应式如下：
本发明提供的一种小分子化合物，具有抑制淀粉样β蛋白聚集功能的小分子化合物和制备方法及其在抑制淀粉样β蛋白聚集中的应用，具有如下的优势：
第一，小分子化合物4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物在5-25μM的浓度范围内能够有效抑制Aβ42的聚集，显著减少Aβ42聚集过程中β-sheet结构的生成。
第二，小分子化合物4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物能够改变Aβ42的聚集形态，抑制淀粉样蛋白纤维的生成。
第三，小分子化合物4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物能够抑制AD模型秀丽隐杆线虫CL2006体内淀粉样斑块的形成，清除CL2006的运动障碍。
第四，小分子化合物4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物能够抑制CL2006体内表达的Aβ42聚集诱导产生的毒性，并将CL2006的寿命延长了三分之一，是Aβ42聚集的理想抑制剂。
第五，小分子化合物4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物能够使Aβ42寡聚体抗体A11和Aβ42纤维抗体OC的免疫反应活性迅速降低，能够显著抑制Aβ42聚集过程中寡聚体和纤维的生成。
第六，小分子化合物4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物对Aβ42聚集的抑制效果既强于同类的小分子类抑制剂EGCG，又优于异类的多肽类抑制剂LK7和蛋白类抑制剂BSA-B。
第七，小分子化合物4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物既强于不具有血脑屏障穿透能力的多肽类抑制剂LK7和蛋白类抑制剂BSA-B，又优于同样具有血脑屏障穿透能力的小分子类抑制剂EGCG，由此表明CTFBA具有良好的血脑屏障渗透性。
附图说明
图1：实施例1中不同浓度CTFBA与Aβ42共培养48h后培养物的ThT荧光图。
图2：实施例2中等摩尔浓度比的CTFBA与Aβ42共培养48h后培养物的形貌图。
图3：实施例3中CTFBA清除秀丽隐杆线虫CL2006体内淀粉样斑块的荧光显微镜图。
图4：实施例4中CTFBA与秀丽隐杆线虫CL2006共培养后CL2006的存活率。
图5：实施例5中CTFBA对Aβ42寡聚体抗体A11和纤维抗体OC的免疫活性的抑制。
图6：CTFBA与同类和异类Aβ聚集抑制剂ThT荧光强度的比较图。
图7：CTFBA与同类和异类Aβ聚集抑制剂对血脑屏障的渗透性的比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
本发明在3,4,5-三羟基苯甲酸的羧基上偶联谷氨酰胺，制备得到4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物(CTFBA)。多种实验手段证明，4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物可以高于5μM的浓度下显著抑制Aβ42的聚集，清除AD模型秀丽隐杆线虫CL2006体内的淀粉样沉积，且能够延长CL2006的存活期。此外，4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物具有良好的血脑屏障渗透性。4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物抑制Aβ42聚集的能力是通过ThT荧光和原子力显微镜等方法测定的，其清除CL2006体内的淀粉样沉积和延长CL2006存活期的能力是通过荧光显微镜实验和生存周期实验测定的，4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物的血脑屏障渗透性是通过平行人工膜渗透法测定的。
实施例1：不同浓度CTFBA与Aβ42共培养48h后培养物的ThT荧光强度。
将纯度为95％的Aβ42以1.0mg/mL的浓度溶于六氟异丙醇(hexafiuro-2-isopropanol，HFIP)中，冰浴超声30min破坏已形成的聚集体，于4℃条件下静置2h使其充分溶解，然后在4℃、16000g转速下离心20min，取75％上清液置于-70℃冰箱中过夜冻实。最后放入到冷冻干燥机中，将Aβ42冻干成棉絮状后置于-20℃冰箱保存。
将已冻干的Aβ42溶于20mM的NaOH溶液中，冰浴超声10min使之充分溶解，得到浓度为275μM的Aβ42母液。用含27.5μM ThT的HEPES缓冲液(20mM,，pH 7.4，含100mM NaCl)稀释，得到终浓度为25μM的Aβ42溶液，作为对照实验。
称取CTFBA分别溶于20mM地HEPES缓冲液(pH 7.4，含100mM NaCl)中，获得浓度为2.75,2.75,5.5,13.75和27.5μM的抑制剂溶液。取浓度为275μM的Aβ42母液，分别用不同浓度的抑制剂溶液稀释，获得终浓度分别为1.25,2.5,5,12.5和25μM的抑制剂和25μM的Aβ42溶液。将这些不同浓度的溶液连同对照溶液在37℃，150rpm条件下进行培养48h。
称取0.80mg的ThT溶于100mL的HEPES缓冲液(20mM,，pH 7.4，含100mM NaCl)中，配制终浓度为25μM的ThT溶液。取200μL培养时间48h的样品与2mL 25μM的ThT溶液混合，在440nm激发波长和480nm发射波长下检测荧光强度，每组做三次平行，激发和发射缝宽均为5nm，扫描速度为100nm/min。将不同浓度抑制剂在480nm处的荧光强度作图，如图1所示。
从图1可以看出，CTFBA能够有效抑制Aβ42的聚集，且呈浓度依赖性，最佳浓度范围为5-25μM。
实施例2：CTFBA对Aβ42聚集形态的影响。
按实施例1方法配置Aβ42母液，用HEPES缓冲液(20mM,，pH 7.4，含100mM NaCl)稀释，得到终浓度为25μM的Aβ42溶液。再配制含有25μM CTFBA的Aβ42溶液，溶液中Aβ42的终浓度为25μM。将上述溶液于37℃，150rpm条件下进行培养。培养48h后，取20μL滴在云母片上，静置10min，使样品与云母表面充分结合。随后用去离子水缓慢洗涤7次，去除缓冲液中的盐离子，静置晾干。用原子力显微镜(CSPM5500，本原)的轻敲模式进行观测。如图2示。
从图2A可以看出，Aβ42单独培养48h后形成密集的纤维状聚集体，图2B中CTFBA与Aβ42共同培养后，纤维几乎完全消失，形成少量不定形的聚集体，表明CTFBA能够显著减少Aβ42纤维的生成量，并改变Aβ42的聚集形态。
实施例3：CTFBA对秀丽隐杆线虫CL2006体内淀粉样斑块的清除作用。
首先配制NMG培养基，称取17g琼脂粉、2.5g蛋白胨和3g氯化钠加入锥形瓶，加入去离子水至1L，在120℃条件下高温灭菌20分钟，待冷却至70℃，向锥形瓶中依次加入25mL的1M的磷酸二氢钾、1mL的1M的硫酸镁、1mL的5mg/mL的胆固醇和1mL的1M的氯化钙，摇匀后导入平板中，晾干后备用。
配制LB液体培养基，称取2g蛋白胨、1g酵母粉和2g氯化钠加入锥形瓶，加入去离子水至200mL，挑取大肠杆菌OP50至LB液体培养基中，在37℃和220rpm的条件下放于摇床中培养12h。将培养好的OP50菌液涂至NGM培养基中，每个平板滴入200μL，待菌液晾干后倒置放入4℃冰箱中备用。
将200μL的25μM的CTFBA加入带有OP50的NGM培养基中，待液体干燥后，挑取10条L4阶段的AD模型秀丽隐杆线虫突变型CL2006于培养皿中，并设置相应的无CTFBA的空白对照组。培养3天后，利用4％组织细胞固定液将培养皿中的线虫冲洗下来，在4℃条件下固定24h，再利用10μM的ThT溶液染色4h。将染色后的线虫置于载玻片上，利用倒置荧光显微镜(TE2000-U,Nikon,Japan)进行观察。如图3所示。
从图3A可以看出，突变型CL2006中出现明显的荧光斑点，表明大量淀粉样斑块的生成。图3B中加入25μM的CTFBA时，CL2006中的大量淀粉样斑块消失，表明CTFBA能够抑制CL2006体内淀粉样斑块的形成。
实施例4：CTFBA对秀丽隐杆线虫CL2006存活率的影响。
按照实施例3的方法准备带有OP50的NGM培养基，向培养基中接入200μL的25μM的CTFBA，并设置相应的无CTFBA的空白对照组。向培养基中分别加入300μL的150μM的5-氟-2′-脱氧尿苷抑制线虫产卵。待液体干燥后，分别挑取60条L4阶段的CL2006线虫至培养皿中，每天记录培养皿中存活的线虫数量，直至所有线虫死亡。为保证充足的食物供给，每3天进行一次转板。如图4所示。
从图4可以看出，突变型CL2006单独培养的生存周期约为12天，加入25μM CTFBA时，从培养初始阶段起，CL2006的死亡率即出现明显的降低，直至第16天线虫才全部死亡，表明CTFBA能够降低CL2006的瘫痪率，清除CL2006的运动障碍，抑制CL2006体内表达的Aβ42聚集诱导的细胞毒性，从而将CL2006的寿命延长了三分之一。
实施例5：CTFBA对Aβ42寡聚体抗体A11和纤维抗体OC的免疫活性的抑制
按实施例1方法配置Aβ42溶液，将Aβ42(25μM)单独培养或与不同浓度的CTFBA(1.25μM、5μM、25μM)共同培养0h和48h，分别取10μL滴在硝酸纤维素膜(0.2μm)上，放置室温下干燥。用10％的脱脂奶粉震荡1h，用于封闭硝酸纤维素膜上的非特异性蛋白结合。随后用TBST缓冲液(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,0.05％Tween 20,pH＝7.4)对膜进行清洗(5min×3)，分别加入一抗6E10(针对所有种类的Aβ,1:5000)、A11(针对Aβ寡聚体,1:2000)和OC(针对Aβ纤维,1:3000)室温震荡1h，用TBST对膜进行清洗(5min×3)。其中，由于商品化的一抗A11敏感度较低，因此加大硝酸纤维膜上的样品量，取100μL样品，分10次滴于膜上，每次滴10μL。随后用辣根过氧化物酶标记的二抗羊抗兔IgG(1:5000)和羊抗鼠IgG(1:1000)室温震荡1h，用TBST对膜进行清洗(5min×3)以去除未结合的二抗。最后用ECL化学发光试剂盒进行显色。
从图5A可以看出，在0h时，Aβ42寡聚体抗体A11的免疫反应活性呈现轻微阳性，培养48h后，单独Aβ42的免疫反应活性迅速增强，表明Aβ42聚集过程中产生了较多的寡聚体。当加入不同浓度的CTFBA共同培养时，CTFBA可使A11的免疫反应活性迅速降低，表明CTFBA能够显著抑制Aβ42聚集过程中寡聚体的生成。从图5B可以看出，CTFBA能够使Aβ42纤维抗体OC的免疫反应活性迅速减弱，随着CTFBA浓度的升高，斑点印记逐渐变浅至几近消失，表明CTFBA能够显著抑制Aβ42纤维的生成。
实施例6：CTFBA与同类和异类Aβ聚集抑制剂ThT荧光强度的比较
按实施例1方法配置Aβ42母液，用HEPES缓冲液(20mM,，pH 7.4，含100mM NaCl)稀释，得到终浓度为25μM的Aβ42溶液。称取小分子CTFBA、同类的小分子抑制剂EGCG、多肽类抑制剂LVFFARK(LK7)和蛋白类抑制剂碱化的牛血清白蛋白(BSA-B)分别溶于20mM地HEPES缓冲液(pH 7.4，含100mM NaCl)中，获得浓度为27.5μM的抑制剂溶液。取浓度为275μM的Aβ42母液，用27.5μM的抑制剂溶液稀释，获得终浓度为25μM的抑制剂和25μM的Aβ42溶液。将这些不同浓度的溶液连同对照溶液在37℃，150rpm条件下进行培养48h。
称取0.80mg的ThT溶于100mL的HEPES缓冲液(20mM,，pH 7.4，含100mM NaCl)中，配制终浓度为25μM的ThT溶液。取200μL培养时间48h的样品与2mL 25μM的ThT溶液混合，在440nm激发波长和480nm发射波长下检测荧光强度，每组做三次平行，激发和发射缝宽均为5nm，扫描速度为100nm/min。将不同浓度抑制剂在480nm处的荧光强度作图，如图6所示。
从图6可以看出，25μM的CTFBA能够有效抑制Aβ42的聚集，CTFBA的抑制效果既强于同类的小分子类抑制剂EGCG，又优于异类的多肽类抑制剂LK7和蛋白类抑制剂BSA-B，由此可见CTFBA是一种非常有潜力的小分子AD药物。
实施例7：CTFBA与同类和异类Aβ聚集抑制剂对血脑屏障的渗透性的比较。
通过平行人工膜渗透法(PAMPA-BBB)测定抑制剂CTFBA与同类和异类Aβ聚集抑制剂的血脑屏障渗透性。将小分子CTFBA、同类的小分子抑制剂EGCG、多肽类抑制剂LVFFARK(LK7)和蛋白类抑制剂碱化的牛血清白蛋白(BSA-B)分别溶解于PBS/EtOH(v/v,7/3)缓冲液中，终浓度为25μM。向下层96孔接收板中加入300μL PBS/EtOH缓冲液，中间滤膜中加入4μL猪脑脂质，其中，猪脑脂质以20mg/mL溶于十二烷中，上层96孔供体板中加入200μL样品。将供体96孔板置于受体96孔板上，形成“三明治”结构，于25℃静置10h。利用酶标仪(InfiniteM200 Pro,TECAN,Salzburg,Austria)测定样品在受体板中的吸光度。利用以下公式计算CTFBA、EGCG、LK7和BSA-B的渗透率：
为了验证检测结果，引入了12种已知血脑屏障渗透性的商品化药物进行线性相关分析，得到能够穿透血脑屏障的标准渗透率极限。实验测量值与文献中的理论值进行对比，通过线性拟合得到方程：P(exp)＝1.04P(lit)-0.03,(R2＝0.96)。根据文献中给出的血脑屏障渗透极限(P(lit)＝4.0×10-6cm/s)，通过计算得到在本实验条件下，若渗透率高于4.1×10-6cm/s的化合物能够透过血脑屏障，渗透率低于2.1×10-6cm/s的化合物不能透过血脑屏障。
如图7所示，CTFBA的P值为11.96×10-6cm/s，既强于不具有血脑屏障穿透能力的多肽类抑制剂LK7和蛋白类抑制剂BSA-B，又优于同样具有血脑屏障穿透能力的小分子类抑制剂EGCG，由此表明CTFBA具有良好的血脑屏障渗透性，在AD治疗中具有广阔的应用前景。
本发明提出了在3,4,5-三羟基苯甲酸表面偶联谷氨酰胺得到小分子抑制剂，提出了4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物在制备抑制淀粉样β蛋白聚集的药物等方面的用途，并将其应用于Aβ42的聚集、清除、毒性抑制和血脑屏障穿透实验。通过现场较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替代和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims (7)

1.一种抑制淀粉样β蛋白聚集的小分子化合物，其特征在于，将3,4,5-三羟基苯甲酸的羧基与谷氨酰胺的主链氨基反应，获得4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸，其结构式如下：
2.权利要求1的抑制淀粉样β蛋白聚集的小分子化合物的制备方法，其特征在于：在3,4,5-三羟基苯甲酸的羧基上修饰谷氨酰胺，3,4,5-三羟基苯甲酸的羧基与谷氨酰胺主链的氨基连接，谷氨酰胺主链的羧基保持游离状态，得到结构稳定的小分子化合物4-氨基甲酰基-2-[(3,4,5-三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物。
3.权利要求1的抑制淀粉样β蛋白聚集的小分子化合物在制备具有抑制淀粉样β蛋白聚集的药物中的用途。
4.权利要求1的抑制淀粉样β蛋白聚集的小分子化合物在制备清除阿尔兹海默症模型秀丽隐杆线虫CL2006体内淀粉样β蛋白聚集的药物中的用途，且能够将CL2006的寿命延长三分之一的能力。
5.权利要求1的抑制淀粉样β蛋白聚集的小分子化合物在制备穿透血脑屏障的药物中的用途。
6.权利要求1的抑制淀粉样β蛋白聚集的小分子化合物在制备多肽或蛋白类药物的用途。
7.权利要求1的抑制淀粉样β蛋白聚集的小分子化合物在制备治疗阿尔茨海默氏症的药物中用途。
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