ES2903097T3 - Formulación farmacéutica que comprende un derivado de fosforamidato de 5-fluoro-2'-desoxiuridina para su uso en el tratamiento del cáncer - Google Patents
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Abstract
Una formulación farmacéutica adecuada para administración intravenosa, comprendiendo dicha formulación un compuesto de fórmula (I), o una sal, hidrato o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, y un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable: **(Ver fórmula)** en donde Ar es una porción de arilo bicíclico condensado o una porción de arilo monocíclico, cualquiera de las porciones de arilo es carbocíclico o heterocíclico y está opcionalmente sustituido; R3 es alquilo, que está opcionalmente sustituido; R4 es H o alcoilo; R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y alquilo, o R1 y R2 juntos forman una cadena de alquileno para proporcionar, junto con el átomo de C al que están unidos, un sistema cíclico, o uno de R1 y R2 comprende una cadena de alquileno unida a N, el átomo de H unido a N está ausente y uno de R1 y R2 comprende H o alquilo, cualquiera de cuyas dichas porciones de alquilo o cadenas de alquileno pueden estar sustituidas; en donde el compuesto no es un compuesto que tiene, en combinación, Ar como fenilo no sustituido, R3 como CH3, R4 como H, uno de R1 y R2 como H y uno de R1 y R2 como CH3.
Description
DESCRIPCIÓN
Formulación farmacéutica que comprende un derivado de fosforamidato de 5-fluoro-2'-desoxiuridina para su uso en el tratamiento del cáncer
La presente invención se relaciona con formulaciones farmacéuticas que comprenden compuestos químicos útiles en el tratamiento del cáncer.
En 1957, se descubrió la actividad antitumoral de 5-Fluorouracilo (5FU). Más de cincuenta años desde que se sintetizó por primera vez, el 5FU permanece ampliamente usado en el tratamiento de tumores sólidos que incluyen de mamas, del sistema gastrointestinal, de cabeza, de cuello y ovarios y particularmente de cáncer colorrectal, ya que se aprobó por la FDA en 1962. El fluoropirimidina 5-fluorouracilo (5FU) y 5-fluoro-2'-desoxiuridina (5-FdUrd) se usan en combinación con ácido fólico como tratamiento estándar para una variedad de carcinomas, como de estómago, de colon y mamas. Además, una combinación de 5FU con leucovorin (LV) se considera como quimioterapia estándar para cáncer de colon. El fármaco 5FU se administra usualmente mediante bolo intravenoso o mediante infusión continua.
La actividad antitumoral de 5FU es comparable con la de su análogo 5-FdUrd, que actúa parcialmente como profármaco de 5FU. 5-FdUrd se aprobó por la FDA en 1970, y se ha usado extensivamente para el tratamiento clínico de carcinoma de ovarios, de mamas y del tracto gastrointestinal. Además, debido a la extracción hepática extensiva, 5-FdUrd es un fármaco útil para quimioterapia arterial hepática de metástasis del hígado, por consiguiente, se metaboliza más eficientemente por el hígado que 5FU.
Sin embargo, existe un problema en que la actividad tanto del agente 5FU como 5-FdUrd puede deteriorarse por el desarrollo de resistencia en células tumorales. El tratamiento del cáncer con 5FU se ha encontrado además que causa efectos secundarios neurotóxicos y cardiotóxicos. La toxicidad además se deriva de la falta de selectividad de 5FU hacia los tumores.
El documento WO 99/37753 A1 divulga métodos y ejemplos de moléculas para matar selectivamente una célula patológica poniendo en contacto la célula con un profármaco que es un sustrato selectivo para una enzima intracelular endógena. Posteriormente, el profármaco se convierte en una toxina celular.
El documento WO 2005/012327 A2 divulga derivados de fosforamidato de nucleótidos y su uso en el tratamiento del cáncer.
Es un objeto de la presente invención proporcionar formulaciones farmacéuticas que comprenden compuestos derivados de 5-fluoro-2'-desoxiuridina que muestren una mejor actividad y/o reducida toxicidad en su tratamiento del cáncer, en comparación con las que se muestran por 5-fluoracil o 5-fluoro-2'-desoxiuridina per se.
Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar formulaciones farmacéuticas que comprenden compuestos derivados de 5-fluoro-2'-desoxiuridina que muestren un bajo nivel de resistencia en células tumorales, particularmente una resistencia en células tumorales que sea menor que la que se muestra por 5FU o por 5-FdUrd.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona una formulación farmacéutica adecuada para administración intravenosa, comprendiendo dicha formulación un compuesto de fórmula (I), o una sal, hidrato o solvato
en donde
Ar es una porción de arilo bicíclico condensado o una porción de arilo monocíclico, cualquiera de las porciones arilo es carbocíclica o heterocíclica y está opcionalmente sustituida;
R3 es alquilo, que está opcionalmente sustituido;
R4 es H o alcoilo; y
R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y alquilo o R1 y R2 juntos forman una cadena de alquileno para proporcionar, junto con el átomo de C al que están unidos, un sistema cíclico, o uno de R1 y R2 comprende una cadena de alquileno unida a N, el átomo de H unido a N está ausente y uno de R1 y R2 comprende H o alquilo, cualquiera de cuyas porciones alquilo o cadenas de alquileno pueden estar sustituidas;
en donde el compuesto no es un compuesto que tiene, en combinación, Ar como fenilo no sustituido, R3 como CH3, R4 como H y uno de R1 y R2 como H y uno de R1 y R2 como CH3.
Se ha encontrado que los compuestos en las formulaciones de la presente invención muestran actividad que los hace útiles en la profilaxis o tratamiento del cáncer en homo sapiens. Particularmente, los compuestos exhiben propiedades beneficiosas que indican su capacidad para tratar el cáncer en pacientes, en tanto muestran resistencia reducida en células tumorales. Notablemente, dichos compuestos pueden mostrar una citoactividad comparable con o mejor que la de 5-fluoracil, pero con una resistencia que es comparable con o menor que la de 5-fluoracil y la de 5-fluoro-2'-desoxiuridina.
Por "resistencia" en la presente solicitud se entiende una respuesta baja o disminuida a la terapia. La resistencia puede ser innata o adquirida. Una resistencia innata es un grado de reacción reducido en relación con otros especímenes o pacientes. Una resistencia adquirida es una efectividad reducida con el transcurso del tiempo en un paciente dado, sea o no adquirida en relación con la terapia que comprende la administración al paciente de un régimen terapéutico para tratar el cáncer, por ejemplo, un régimen terapéutico que comprende 5FU y/o 5-FdUrd. Cada resistencia innata y resistencia adquirida pueden corresponder a la regulación por disminución o baja actividad de proteínas transportadoras, que incluyen proteínas transportadoras de nucleósidos, o enzimas anabólicas necesarias o la regulación por aumento de enzimas catabólicas.
Aunque el solicitante no desea estar ligado a teoría alguna, se postula, como se discutirá adicionalmente más abajo, que las causas de resistencia en células tumorales a la actividad de 5FU y/o de 5-FdUrd podrían ser: a) deleción de quinasa activante como timidina quinasa (TK), una enzima clave requerida para la etapa inicial de fosforilación de 5-FdUrd a 5-FdUMP; b) superproducción de timidilato sintasa (TS); y/o c) transporte deficiente dentro de las células objetivo.
Sorprendentemente ahora se ha encontrado que los compuestos en las formulaciones de la presente invención pueden mostrar actividad citostática significativa en células con nivel reducido de proteínas transportadoras de nucleósidos y/o en células deficientes de quinasas de nucleósidos y/o en células infectadas con micoplasmas.
La propiedad beneficiosa de los compuestos en formulaciones de la presente invención para retener marcada actividad citostática en células deficientes de quinasas de nucleósidos puede conferir in vivo una ventaja clínica en entornos celulares carentes de quinasas de nucleósidos o que tienen niveles disminuidos de quinasas y así incapaces de activar eficientemente el 5-FdUrd.
Las células infectadas con micoplasmas reducen en gran medida la actividad de nucleósidos tal como el 5-FdUrd debido, se presume, a la superproducción de timidilato sintasa (TS). El uso propuesto actualmente de los compuestos en células infectadas con micoplasmas por tanto, se postula, se deriva de la propiedad beneficiosa de los compuestos para actuar adicionalmente como inhibidores de TS y así permitir que los compuestos retengan su actividad citostática en células infectadas con micoplasmas. Los compuestos en las formulaciones de la presente invención, debido a su naturaleza lipofílica pueden captarse por las células objetivo en al menos una vía parcialmente independiente del portador transportador de nucleósidos, y así, pueden evadir mecanismos de resistencia potenciales debido a niveles reducidos de portadores transportadores de nucleósidos o nucleobases en la membrana de células objetivo.
Adicionalmente, los compuestos en las formulaciones de la presente invención son sorprendentemente insensibles a la acción de la enzima catabólica Timidina Fosforilasa (TP) que frecuentemente se regula por disminución en tumores, y así, los compuestos serían más independientes de la presencia de esta enzima catabólica que 5-FdUrd.
Se ha observado que la infección por micoplasmas de las células puede reducir en gran medida la actividad de nucleósidos, que incluyen el 5-FdUrd. La administración de un inhibidor de TP restaura la actividad citostática de 5-FdUrd en cultivos de células infectadas con micoplasmas, lo que proporciona evidencia de la función deteriorante de TP en la actividad citostática final de 5-FdUrd. Esto puede ser una limitación en pacientes que están infectados con micoplasmas. A diferencia de 5-FdUrd, los compuestos en las formulaciones de la presente invención pueden retener alta actividad en estas células infectadas con micoplasmas.
Los compuestos tienen así el potencial para superar muchas de las limitaciones de 5FU y 5-FdUrd.
5-Fluorouracil (5FU) es uno de los primeros ejemplos de un fármaco anticancerígeno. El diseño de 5FU se basó en la información bioquímica disponible: un átomo de flúor y un átomo de hidrógeno tienen un tamaño similar, sin embargo, un enlace carbono-flúor es mucho más fuerte que un enlace carbono-hidrógeno. La timidilato sintasa actúa mediante sustitución del hidrógeno 5 de desoxiuridina monofosfato con un grupo metilo obtenido a partir de metilen tetrahidrofolato para hacer timidilato. 5FU ejerce su efecto citotóxico a través de tres rutas diferentes. La nucleobase de 5FU y el
desoxirribonucleósido de 5-FdUrd entran a las células a través de sistemas de transporte facilitado de nucleósidos. Uno de los mecanismos de acción de estos agentes es la inhibición de la enzima timidilato sintasa (TS). La nucleobase de 5FU se convierte en el desoxinucleósido de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (5-FdUrd) mediante la timidina fosforilasa. La fosforilación subsecuente del desoxinucleósido de 5-FdURd mediante timidina quinasa resulta en la formación del nucleótido citotóxico 5-fluoro-2'-desoxiuridina-5'-monofosfato (5-FdUMP). En presencia del folato reducido, 5,10-metilentetrahidrofolato (mTHF), el nucleótido (5-FdUMP) inhibe la timidilato sintasa (TS) debido a la incapacidad de la enzima para eliminar el átomo de flúor-5. Así, el primer y más importante mecanismo de acción de 5FU y FDUR es la inhibición de la enzima timidilato sintasa (TS). La timidilato sintasa (TS) tiene dos sustratos (dUMP y mTHF), los cuales se unen en el sitio catalítico para permitir la síntesis de dTMP. 5-FdUMP forma un complejo ternario covalente con la timidilato sintasa (TS), lo que inhibe la actividad de esta enzima y conduce al agotamiento de desoxitimidina trifosfato, necesario para la síntesis de ADN. Alternativamente, (5-FdUMP) se sintetiza después de la conversión de 5FU en 5-FUMP porOPRT, en fluorouridina difosfato (FUDP), fluorodesoxiuridina difosfato (5-FdUDP) por la ribonucleótido reductasa (RR) y finalmente en 5'-FdUMP. Se ha observado que después de la exposición terapéutica a 5FU o 5-FdUrd, las células desarrollan resistencia a estos agentes quimioterapéuticos. La superexpresión de la timidilato sintasa (TS) reduce el efecto terapéutico del fármaco inhibitorio TS lo que conduce a resistencia. Se observó que algunos individuos son más resistentes a la terapia dirigida con TS que otros. En segundo lugar, el desoxinucleósido 5-fluoro-2'-desoxiuridina (5-FdUrd) puede convertirse en su forma trifosfato 5-FdUTP la cual a su vez puede incorporarse en el ADN lo que causa daño celular. En tercer lugar, 5FU puede inhibir además la síntesis de ARN mediante su conversión en FUMP por OPRT y posteriormente, en dos etapas, en fluorouridina trifosfato (FUTP) que se incorpora en el ARN. Esto se presume sea otra acción potencial de 5FU.
Así la molécula 5FU no resulta en un fármaco inhibitorio óptimo de TS porque se convierte de manera ineficiente en 5-FdUMP, debido a varias etapas metabólicas requeridas para la activación metabólica de 5FU. Puede ocurrir resistencia adicional si la célula produce cantidades en exceso de dUMP que compita con el fármaco por el sitio activo.
5-FdUrd es un sustrato relativamente bueno para la timidina quinasa, que lo convierte directamente en 5-FdUMP. Los estudios in vitro, en varias líneas celulares de cáncer han demostrado que 5-FdURd es aproximadamente 5000 veces más potente como inhibidor del crecimiento celular que 5FU. Además, el profármaco 5-FdURd no muestra significativa conversión en metabolitos de ribonucleótidos en concentraciones citotóxicas. Los estudios in vivo mostraron que una cantidad significativa de 5-FdUrd se degrada en sus 5FU de bases relativas por la timidina fosforilasa, enzima para la cual 5-FdUrd muestra una buena afinidad. Esta escisión fosforolítica rápida de 5-FdUrd en 5FU in vitro e in vivo representa un obstáculo trascendental en el suministro del 5-FdUrd intacto a las células para mejor acción citotóxica. Adicionalmente, la degradación de 5-FdUrd en homogenados de intestinos de ratas y en humanos, después de la administración oral, sugiere que 5-FdUrd podría absorberse escasamente como 5-FdUrd intacto.
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, la formulación de la presente invención se proporciona para usar en un método de profilaxis o tratamiento de cáncer en homo sapiens. De manera adecuada, el cáncer se selecciona del grupo que comprende leucemia, cáncer pancreático, de próstata, pulmón, mama y de cuello uterino.
Particularmente, la formuñación de la presente invención es para usar en un método de profilaxis o tratamiento de cáncer en un paciente que ha desarrollado o tiene el potencial para desarrollar resistencia en células tumorales con respecto a la actividad de 5-fluoracilo o 5-fluoro-2'-desoxiuridina en la profilaxis o tratamiento de cáncer.
Por ejemplo, la formuñación de la presente invención puede usarse en un método de profilaxis o tratamiento de cáncer en un paciente con células con un reducido nivel de proteínas transportadoras de nucleósidos y/o con células deficientes de la nucleósido quinasa de y/o con células infectadas con micoplasmas, particularmente donde el cáncer es leucemia. La formulación de la presente invención puede ser más bien o lo mismo para usar en un método de profilaxis o tratamiento de cáncer en un paciente que tiene células con nivel elevado de timidilato sintasa (TS).
"Tumor" o "célula tumoral" como se usa en la presente solicitud, a menos que se indique de otra manera, se refiere tanto a tumores sólidos como cánceres tal como leucemia.
Las formulaciones de la presente invención pueden usarse para tratar a un paciente con cáncer lo mismo de novo o junto con otra terapia contra el cáncer. Por ejemplo, las formulaciones de la presente invención pueden usarse en un régimen de tratamiento contra el cáncer junto con otros fármacos anticancerígenos, tal como 5FU y/o 5-FdUrd lo mismo, con o sin leucovorin (LV), y/u otros fármacos anticancerígenos. Alternativamente, las formulaciones de la presente invención pueden usarse cuando un paciente ha fallado en responder a otros fármacos anticancerígenos, tal como por ejemplo 5FU y/o 5-FdUrd ya sea con o sin leucovorin (LV), o cuando el paciente ha mostrado resistencia a otros fármacos anticancerígenos, tal como por ejemplo 5FU y/o 5-FdUrd ya sea con o sin leucovorin (LV).
Los compuestos en las formulaciones de la presente invención cuando Ar es 1-naftilo, sea sustituido o no sustituido, son particularmente adecuados para usaren los usos anteriores de la presente invención, particularmente en un paciente que ha desarrollado, o que tiene el potencial para desarrollar, resistencia en células tumorales, tal como, por ejemplo, un paciente con células con un reducido nivel de células transportadoras de nucleósidos y/o con células deficientes de quinasas y/o con células infectadas con micoplasmas y/o un paciente que tiene células con elevado nivel de timidilato sintasa (TS).
El grupo Ar comprende un grupo arilo sustituido o no sustituido, en el que el término "grupo arilo" y la posible sustitución de dicho grupo es como se define en el presente documento. De forma adecuada, Ar es una porción de anillo aromático de 5 a 14 miembros. Preferiblemente, Ar es carbocíclico. Alternativamente, el uno o dos anillos pueden incluir 1, 2, 3 o 4 heteroátomos, preferiblemente 1, seleccionado, independientemente, de O, S y N. Preferiblemente, Ar es una porción de arilo carbobicíclico condensado. Más preferiblemente, Ar es naftilo, incluso más preferiblemente 1-naftilo, es decir, naftilo unido a P mediante O unido en la posición 1-naftilo. De forma adecuada, Ar puede ser alternativamente fenilo.
Uno, dos, tres o cuatro sustituyentes, que pueden ser iguales o diferentes, pueden estar presentes en Ar y se seleccionan del grupo que comprende halógeno, que puede -F, -Cl, -Br o -I; -NO2; -NH2; -alquilo C1-3 opcionalmente sustituido; -alcoxi C1-3 opcionalmente sustituido, preferiblemente metoxi (-OCH3); -S alquilo C1-3 opcionalmente sustituido; -CN; -COalquilo C1-3 opcionalmente sustituido; y -CO2alquilo C1-3 opcionalmente sustituido; donde dichos grupos opcionalmente sustituidos pueden estar sustituidos con uno o más hasta seis, preferiblemente tres, miembros seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, que puede ser F, Cl, Br e I, y NO2. Sustituyentes particularmente preferidos en Ar son grupos extractores de electrones tales como grupos halógeno (preferiblemente cloro o flúor), trihalometilo (preferiblemente trifluorometilo), ciano y nitro.
Los sustituyentes pueden estar en cualquier posición de la porción Ar arilo. Cuando Ar es 1-naftilo, se prefiere un solo sustituyente en cualquiera de las posiciones 2, 3, 4, 5, 6 , 7 u 8.
Cuando Ar es fenilo, se prefiere un solo sustituyente en la posición 2 (orto) o 4 (para), más preferido en la posición 4. Por ejemplo, cuando Ar es un fenilo sustituido, Ar puede ser 3,5-diclorofenilo, p-trifluorometil-fenilo, p-ciano-fenilo o pnitrofenilo.
De forma adecuada, R3 es un grupo alquilo primario, secundario o terciario C1-16 y puede incluir porciones carbocíclicas; un grupo alquilo cíclico C5-7; o un grupo alquilo C1-6 arilo C5-11. De manera más adecuada, R3 es un grupo alquilo C1-10 o un grupo alquilo C1-3 arilo C5-7 tal como bencilo (-CH2-C6H5). Un grupo alquilo cíclico puede ser carbocíclico o puede contener, en total, uno, dos o tres heteroátomos de anillo seleccionados independientemente de O, N y S. Preferiblemente, R3 no está sustituido. Cuando están sustituidos, los sustituyentes se indican a continuación.
De manera adecuada, R4 es H o alcoilo, es decir, alquil-C (= O) -, donde alquilo es C1 a C10.
Cuando R1 y/o R2 es alquilo, cada uno de ellos se selecciona de forma adecuada independientemente de C1 a C16, de manera más adecuada de C1 a C6. Cuando R1 y R2 juntos comprenden una cadena de alquileno, la cadena es de manera adecuada C1 a C6 y puede contener insaturación y, en total, uno, dos o tres heteroátomos en la cadena seleccionados independientemente de O, N y S. Cuando uno de R1 y R2 está unido a N, el tamaño total del anillo que incluye N y el átomo de C al que están unidos R1 y R2 comprende de manera adecuada de 4 a 7 miembros, más de manera adecuada 5 miembros. Cualquier cadena de alquilo o alquileno que comprenda R1 y/o R2 puede estar sustituida con uno o más sustituyentes indicados en este documento.
Cuando R1 y R2 son diferentes, el átomo de C al que están unidos es quiral. Preferiblemente, la estereoquímica en un centro asimétrico -CR1R2 corresponde a un L-aminoácido. Sin embargo, la estereoquímica en un centro asimétrico -CR1R2 puede corresponder a un D-aminoácido. Alternativamente, se pueden emplear mezclas de compuestos que tengan centros asimétricos correspondientes a los aminoácidos L y D.
De forma adecuada, R1 y R2 pueden corresponder a las porciones unidas al átomo de alfa C en un alfa aminoácido de origen natural. Por "alfa aminoácido de origen natural" se entiende alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, cistina, glicina, ácido glutámico, glutamina, histidina, hidroxilisina, hidroxiprolina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, Treonina, Triptófano, Tirosina y Valina. Por tanto, uno de R1 y R2 puede ser H y uno de R1 y R2 puede ser H o alquilo seleccionado de las siguientes porciones o R1 y R2juntos pueden formar una cadena de alquileno seleccionada de las siguientes porciones:
CH3- presente en Alanina
H2NC(=NH)NH[CH2]3- presente en Argenina
NH2C(O)CH2- presente en Aspargina
HO2CH2- presente en Ácido aspártico
HSCH2- presente en Cisteína
HO2CH(NH2)CH2SSCH2- presente en Cistina
H- presente en Glicina
HO2CH2CH2- presente en Ácido glutamico
H2N(O)CCH2CH2- presente en Glutamina
C3N2HCH2- presente en Histidina
H2NCH2CH(OH)CH2CH2- presente en Hidroxilisina
-CH2CH(OH)CH2- presente en Hidroxiprolina
CH3CH2CH(CH3)- presente en Isoleucina
(CH3)2CHCH2- presente en Leucina
H2NCH2(CH2)3- presente en Lisina
CH3SCH2CH2- presente en Metionina
PhCH2- presente en Fenilalanina
-CH2CH2CH2- presente en Prolina
OHCH2- presente en Serina
CH3CH(OH)- presente en Treonina
C8NH6CH2- presente en Triptófano
HOC6H4CH2- presente en Tirosina
(CH3)2CH- presente en Valina.
Por "un derivado farmacéuticamente aceptable" se entiende cualquier sal, éster, sal de dicho éster, hidrato, solvato o forma cristalina o metabolito o cualquier otro compuesto farmacéuticamente aceptable que, tras la administración a un receptor, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto de fórmula (I).
La referencia en la presente memoria descriptiva a un grupo alquilo significa un radical hidrocarbilo ramificado o no ramificado, cíclico o acíclico, saturado o insaturado (por ejemplo, alquenilo o alquinilo). Cuando es cíclico, el grupo alquileno es preferiblemente C3 a C12, más preferiblemente C5 a C10, más preferiblemente C5 a C7. Cuando es acíclico, el grupo alquilo es preferiblemente C1 a C16, más preferiblemente C1 a C6.
La referencia en la presente memoria descriptiva a un grupo arilo significa un grupo aromático que contiene, de manera adecuada, de 5 a 14 átomos en el anillo. Por ejemplo, Ar es fenilo o naftilo. El grupo aromático puede ser un grupo heteroaromático que contiene uno, dos, tres o cuatro, preferiblemente uno, heteroátomos seleccionados, independientemente, del grupo que consiste en O, N y S. Ejemplos de tales grupos heteroaromáticos incluyen piridilo, pirrolilo, furanilo y tiofenilo.
Los grupos alquilo y arilo pueden estar sustituidos o no sustituidos. Cuando está sustituido, generalmente habrá de uno a tres sustituyentes presentes, preferiblemente un sustituyente. Los sustituyentes pueden incluir átomos de halógeno, lo que significa átomos de F, Cl, Br e I, y grupos halometilo tales como CF3 y CCh; grupos que contienen oxígeno tales como oxo, hidroxi, carboxi, carboxialquilo C1-16, alcoxi, alcoilo, alcoiloxi, ariloxi, ariloilo y ariloiloxi; grupos que contienen nitrógeno tales como amino, alquilamino C1-6, dialquilamino C1-6, ciano, azida y nitro; grupos que contienen azufre tales como tiol, alquiltiol C1-6, sulfonilo y sulfóxido; grupos heterocíclicos que pueden estar ellos mismos sustituidos; grupos alquilo como se definieron anteriormente, que pueden estar ellos mismos sustituidos; y grupos arilo como se definieron anteriormente, que pueden estar ellos mismos sustituidos, tales como fenilo y fenilo sustituido. Los sustituyentes de dichos grupos heterocíclicos, alquilo y arilo son como se definieron inmediatamente antes. Los sustituyentes en R1 y/o R2 incluyen porciones para proporcionar compuestos en los que R1 y R2 corresponden a porciones unidas al átomo de alfa C en un alfa aminoácido de origen natural.
La referencia en la presente memoria descriptiva a grupos alcoxi y ariloxi significa, respectivamente, alquil-O-(por ejemplo, donde alquilo es C1 a C16, preferiblemente C1 a C6) y aril-O-(por ejemplo, donde arilo es una porción de anillo aromático mono o bifusionado de 5 a 14 miembros, que contiene opcionalmente 1, 2, 3 o 4 heteroátomos seleccionados, independientemente, de O, S y N, preferiblemente arilo es fenilo).
La referencia en la presente memoria descriptiva a grupos alcoilo y ariloilo significa, respectivamente, alquil-CO- (por ejemplo, donde alquilo es C1 a C16, preferiblemente C1 a C6) y aril-0O-(por ejemplo, donde arilo es una porción de anillo aromático mono o bifusionado de 5 a 14 miembros, que contiene opcionalmente 1, 2, 3 o 4 heteroátomos seleccionados, independientemente, de O, S y N, preferiblemente arilo es fenilo).
La referencia en la presente memoria descriptiva a alcoiloxi y ariloiloxi significa, respectivamente, alquil-CO-O (por ejemplo, donde alquilo es C1 a C16, preferiblemente C1 a C6) y aril-CO-O (por ejemplo, donde arilo es un sistema de anillo aromático mono o bifusionado de 5 a 14 miembros, que contiene opcionalmente 1,2, 3 o 4 heteroátomos seleccionados, independientemente, de O, S y N, preferiblemente arilo es fenilo).
La referencia en la presente memoria descriptiva a grupos heterocíclicos significa grupos que contienen uno o más, pirrolilo, imidazolilo, piraziolilo, tiazolilo, isotiazolilo, oxazolilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, tetrahydrofuranilo, piranilo, pironly, piridilo, pirazinilo, piridazinilo, piperidilo, piperazinilo, morpholinilo,
tionaftilo, benzofuranilo, isobenzofurilo, indolilo, oxiindolilo, isoindolilo, indazolilo, indolinilo, 7-azaindolilo, isoindazolilo, benzopiranilo, coumarinilo, isocoumarinilo, quinolilo, isoquinolilo, naphthridinilo, cinnolinilo, quinazolinilo, piridopiridilo, benzoxazinilo, quinoxadinilo, cromenilo, cromanilo, isocromanilo y carbolinilo.
En una realización de la presente invención, Ar es de manera adecuada naftilo, especialmente 1 -naftilo, es decir, naftilo enlazado a P mediante O unido en la posición 1-naftilo.
En otra realización de la presente invención, Ar es de manera adecuada fenilo.
En una realización de la presente invención, Ar está sustituido. Los sustituyentes adecuados se establecen en este documento.
En una realización de la presente invención, Ar es 1-naftilo no sustituido.
En una realización de la presente invención, Ar es fenilo no sustituido.
En una realización de la presente invención, R4 se selecciona del grupo que consiste en H y acetilo (CH3C(=O)-), especialmente R4 es H.
En una realización de la presente invención, R3 se selecciona del grupo que consiste en bencilo y miembros del grupo que comprende alquilos C1 a C10, especialmente R3 se selecciona entre n-propilo, n-butilo, n-pentilo y n-hexilo, más especialmente R3 es n-pentilo.
En una realización de la presente invención, R1 y R2 corresponden a las porciones unidas al átomo de alfa C en un alfa aminoácido de origen natural, como se establece en el presente documento. Un alfa-aminoácido de origen natural particularmente adecuado es la L-alanina, de manera que, de tal manera que de manera adecuada, uno de R1 y R2 es H, uno de R1 y R2 es CH3 y el átomo de C al que están unidos tiene quiralidad L. En otras realizaciones, R1 y R2 corresponden a las porciones unidas al átomo de alfa C en un alfa aminoácido de origen no natural, por ejemplo, R1 y R2 son ambos de manera adecuada CH3.
Las características específicas mencionadas en las realizaciones anteriores se describen específicamente para combinarse en todas y cada una de las combinaciones en los compuestos de las formulaciones de la presente invención.
Los compuestos particularmente adecuados para las formulaciones de la presente invención son compuestos en los que Ar es 1-naftilo, R3 es bencilo, uno de R1 y R2 es H, uno de R1 y R2 es metilo y el átomo de C al que R1 y R2 están unidos tiene L-quiralidad y compuestos donde Ar es 1-naftilo, R3 es n-pentilo, uno de R1 y R2 es H, uno de R1 y R2 es metilo y el átomo de C al que están unidos R1 y R2 tiene L- quiralidad. Para cada compuesto, R4 es de manera más adecuada H.
El tratamiento convencional del cáncer mediante el uso de compuestos quimioterapéuticos se basa mayormente en el uso de análogos de nucleósidos. Estas moléculas se diseñan para imitar los nucleósidos naturales de pirimidina y purina. Después de la captación por la célula, se fosforilan mediante enzimas celulares tales como (desoxi)citidina quinasa (dCK), timidina quinasa (TK) y/o nucleósidos/nucleótidos quinasas. Estos antimetabolitos pueden interferir posteriormente con la síntesis de novo de precursores de ADN/ARN para finalmente inhibir la síntesis de ADN/ARN lo que resulta en la actividad citotóxica/citostática (Hatse y otros, 1999; Galmarini y otros, 2002).
Los antimetabolitos basados en fluoropirimidina tales como fluorouracilo (5FU), capecitabina y 5-fluoro-2'-desoxiuridina (5-FdUrd) se usan principalmente en el tratamiento del carcinoma de colon, mama y ovario (de Bruin y otros, 2006; Ishikawa y otros, 1998; Walko y otros, 2005). Intracelularmente, estos fármacos se metabolizan en 5-FdUMP, el cual forma un complejo inhibidor estable con timidilato sintasa (TS) y el cosustrato 5,10-metilentetrahidofolato reducido, lo que bloquea de ese modo la unión del sustrato normal dUMP a la enzima (Beck y otros, 1994; Tanaka y otros, 2000; Longley y otros, 2003). TS es la enzima responsable de la conversión de dUMP en TMP y, por lo tanto, es indispensable para la proliferación celular, que la hace un objetivo interesante para el diseño de fármacos. Entre las fluoropirimidinas mencionadas anteriormente, 5-FdUrd requiere solo una conversión metabólica, una fosforilación catalizada por TK para generar 5-FdUMP (Longley y otros,2003). Esta fosforilación obligatoria frecuentemente es la etapa limitante de la velocidad en el metabolismo de muchos fármacos anticancerígenos (que incluyen 5-FdUrd), y por lo tanto es aún uno de los factores limitantes para el uso terapéutico de los análogos de nucleósidos. Por lo tanto, se han investigado diferentes estrategias para mejorar la eficacia antitumoral de los análogos de nucleósidos (Galmarini y otros, 2002).
La naturaleza cargada de los monofosfatos de nucleósidos en condiciones fisiológicas resulta en una penetración pobre, si la hay, a través de la membrana celular (Mehellou y otros, 2009). Por lo tanto, la administración directa de moléculas fosforiladas para eludir la primera etapa de fosforilación tiene poca ventaja terapéutica. Por tanto, se han explorado diferentes estrategias para eludir la fosforilación limitante de la velocidad mediante el uso de varios tipos de profármacos de nucleósido 5'-monofosfato para una administración de fármacos más eficiente (Hecker & Erion, 2008). La administración de profármacos de nucleótido fosforamidatos lipofílicos (ProTides) ha demostrado ser exitosa para varias moléculas con actividad antiviral/cancerígena (Harris y otros, 2001; Congiatu y otros, 2006; McGuigan y otros, 2010). Mediante enmascaramiento de las cargas del motivo de fosfato, puede lograrse una buena difusión pasiva de la membrana
de los profármacos después de lo cual el profármaco se convierte rápidamente intracelularmente en el nucleósido monofosfato por escisión enzimática (Mehellou y otros, 2009).
Los micoplasmas son los organismos autorreplicantes más pequeños en la tierra y se caracterizan por la falta de una pared celular y un genoma fuertemente reducido (600-1,200 kb). Muchas de estas bacterias tienen un estilo de vida parasitario y residen en el cuerpo humano lo que causa infecciones asintomáticas (Razin y otros, 1998). Se demostró que estos procariotas tienden a colonizar preferentemente el tejido tumoral: Zhang y otros. (2001) informaron que 39.7-56 % de los cánceres humanos, el gástrico, de colon, esofágico, pulmonar y de mamas están infectados con micoplasmas en comparación con 20.9-30 % en el tejido no tumorigénico. Pehlivan y otros. (2005) encontraron >80 % de las muestras de tejido renal de pacientes con carcinoma de células renales estaban infectadas con micoplasmas en comparación con 14 % en muestras de control de tejido. Chan y otros (1996) informaron una tasa de infección de 59 % en tejidos de cáncer de ovario y otros estudios informan además una alta tasa de infección por micoplasma en tejidos gástricos (Sasaki y otros, 1995, Yang y otros, 2010) y de condiloma de cuello uterino (Kidder y otros, 1998). Debido a su conjunto reducido de genes, los micoplasmas carecen de la ruta para la síntesis de novo de pirimidina y purina y, por lo tanto, expresan una amplia serie de enzimas que metabolizan nucleósidos/nucleótidos, tales como timidina fosforilasa (TP), desoxicitidina desaminasa, etc. (Razin, 1978; Charron & Langelier, 1981; Neale y otros, 1983; Tham y otros, 1993). Ya en 1985 se observó que las enzimas codificadas por micoplasmas (por ejemplo, TP), presentes en cultivos de células contaminadas, conducen a una reducida incorporación de dTTP en los linfocitos (Sinigaglia & Talmadge, 1985). Recientemente, se ha demostrado que estas enzimas, particularmente la timidina fosforilasa codificada por micoplasma, además interfieren con la actividad citostática de varios agentes quimioterapéuticos, lo que incluye la 5-trifluorotimidina, in vitro (Bronckaers y otros, 2008; Jetté y otros, 2008; Liekens y otros, 2009). Por lo tanto, se ha formulado la hipótesis de que la eliminación de micoplasmas por antibióticos o la supresión de enzimas codificadas por micoplasmas en tejido tumoral humano puede optimizar el tratamiento de pacientes con cáncer que usan antimetabolitos de purina y pirimidina (Liekens y otros, 2009).
La presente invención se deriva del desarrollo y evaluación de derivados de fosforamidato independiente de TK de 5-FdUrd y proporciona compuestos que pueden además ser insensibles a la inactivación dependiente de TP de su análogo de nucleósido libre. Los compuestos en las formulaciones de la presente invención pueden proporcionar así derivados análogos de nucleósidos insensibles a micoplasmas que pueden optimizar el tratamiento de pacientes con cáncer con el uso de un antimetabolito de pirimidina. De entre los derivados de fosforamidato sintetizados actualmente de 5-FdUrd, se eligió CPF-373 (identificado más abajo y mencionado anteriormente como un compuesto particularmente adecuado para las formulaciones de la presente invención con R4 como H) para promover estudios en profundidad. Esta molécula contiene un grupo naftilo y bencilalaninilo para enmascarar el 5'-fosfato cargado en 5-FdUMP.
Se han descrito varios mecanismos de resistencia de las células tumorales hacia las fluoropirimidinas como 5FU, 5-FdUrd y trifluorotimidina (TFT), que incluyen una actividad disminuida de las enzimas activadoras de fármacos cruciales (por ejemplo, TK y orotato fosforibosiltransferas), una actividad incrementada de enzimas inactivadoras de fármacos (es decir, la timidina fosforilasa) y/o una regulación por aumento de las enzimas objetivo (por ejemplo, TS) (Agarwal y otros, 1999; Murakami y otros, 2000; Kosaka y otros, 2004). Además, se informó que los altos niveles de TP encontrados en varios tipos de tejido canceroso son predictivos de un pronóstico menos favorable después del tratamiento con fluoropirimidinas (Kamoshida y otros, 2005; Ciaparrone y otros, 2006; Koopman y otros, 2009), aunque otros estudios no han confirmado estos hallazgos (Ciccolini y otros,2004; Koopman y otros, 2009). La presente invención se deriva del desarrollo de un derivado de 5-FdUrd, para eludir posibles mecanismos de resistencia y susceptibilidad a la degradación por enzimas catabólicas, presentes en el microambiente tumoral.
Los compuestos que incorporan los compuestos de las formulaciones de la presente invención, por ejemplo, CPF-373, son derivados de fosforamidato de 5-FdUrd y se describen en la presente descripción y pueden cumplir estos objetivos. Después de la captación en las células tumorales, CPF-373, por ejemplo, genera 5-FdUMP intracelularmente después de la escisión enzimática. Los estudios de estabilidad y los estudios enzimáticos/séricos mediante tecnología de 31P RMN revelaron que el compuesto CPF-373, por ejemplo, es completamente estable en condiciones ácidas y alcalinas, pero sujeto a hidrólisis en presencia de suero o carboxipeptidasa Y, lo que resulta en la formación de derivado de nucleósido 5'-fosforamidato. Mientras que TK es una enzima clave en la activación de 5-FdUrd, se encontró que CPF-373, por ejemplo, fue mucho menos dependiente de TK para ejercer su acción citostática tanto en cultivos de células de murino (L1210) como de humano (c Em ). Debido a la naturaleza lipofílica de ProTides, estas moléculas pueden suministrar nucleósido-monofosfatos directamente en la célula tumoral intacta después de la conversión en su derivado de nucleósido fosforamidato por enzimas tales como carboxiesterasas o carboxipeptidasas (es decir, carboxipeptidasa Y), lo que elimina la necesidad de una fosforilación inicial por nucleósido quinasas específicas tal como TK. Con respecto a esto, CPF-373, por ejemplo, puede ser una herramienta adecuada para el tratamiento de células tumorales con una actividad de TK modificada (ya sea adquirida o inherente). Además, dado que la expresión de TK depende de la fase S, se espera que CPF-373, por ejemplo, pueda además suministrar eficientemente 5-FdUMP en células tumorales que no estén en la fase S de su ciclo de replicación. Los estudios de actividad de TS revelaron que CPF-373, por ejemplo, fue capaz de inhibir a TS en líneas celulares tumorales tanto de tipo silvestre como deficientes de TK, lo que señaló nuevamente hacia un suministro intracelular eficiente del 5'-monofosfato de 5-FdUrd, y su independencia implícita de la TK celular para la activación metabólica.
Es poco probable que los compuestos en las formuaciones de la presente invención, tales como CPF-373, se inactiven por enzimas catabólicas implicadas en el metabolismo de los nucleósidos. De hecho, mientras que 5-FdUrd es altamente
susceptible a la hidrólisis enzimática porTP lo que resulta en la formación de 5FU y 2-desoxirribosa-1-fosfato, su derivado, por ejemplo CPF-373, no es un sustrato para TP procariótica (es decir, de E. coli) o de mamíferos (es decir, de eritrocitos humanos). Además, la uridina fosforilasa no reconoce, por ejemplo, a CPF-373 como sustrato, mientras que 5-FdUrd se hidroliza (pobremente, pero de forma medible) por esta enzima. Varios estudios revelaron que muchas células tumorales tienen niveles elevados de TP, que además actúa como un factor angiogénico (Koopman y otros, 2009; Bronckaers y otros, 2009). Además, hay varios informes sobre la colonización preferencial de tejido tumoral por micoplasmas (Sasaki y otros, 1995; Chan y otros, 1996; Huang y otros, 2001; Pehlivan y otros, 2005) que interfieren con la actividad citostática de varios agentes quimioterapéuticos convencionales in vitro a través de su TP codificada (Bronckaers y otros,2008; Jetté y otros, 2008; Liekens y otros, 2009). Las presentes observaciones de que 5-FdUrd, pero no, por ejemplo, CPF-373, pierde notablemente la actividad citostática cuando las células tumorales (que expresan TP) están infectadas por micoplasmas, están totalmente en concordancia con estas observaciones. Por lo tanto, la administración de un derivado anticancerígeno insensible a TP tal como CPF-373, probado como químicamente estable en condiciones de pH extremas, puede mejorar aún más la quimioterapia contra el cáncer. En conclusión, ProTides, como CPF-373, proporciona un nuevo enfoque interesante para el desarrollo de fármacos anticancerígenos más resilientes. Por ejemplo, CPF-373 puede tener al menos varias ventajas sobre su fármaco original 5-FdUrd: ejerce su actividad citostática independiente de las TKy es resistente a la degradación metabólica por TP, una enzima que frecuentemente se regula por aumento en tumores o puede expresarse externamente por infección por micoplasmas del tejido tumoral.
Las formulaciones de la invención serán generalmente soluciones o suspensiones acuosas estériles, tamponadas a un pH e isotonicidad apropiados. Los vehículos acuosos adecuados incluyen solución de Ringer y cloruro de sodio isotónico. Las suspensiones acuosas de acuerdo con la invención pueden incluir agentes de suspensión tales como derivados de celulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona y goma tragacanto, y un agente humectante tal como lecitina. Los conservantes adecuados para suspensiones acuosas incluyen p-hidroxibenzoato de etilo y de n-propilo.
Las formulaciones de la invención pueden presentarse además como formulaciones liposómicas.
En general, una dosis adecuada estará en el intervalo de 0.1 a 300 mg por kilogramo de peso corporal del receptor por día. Una dosis más baja preferida es 0.5 mg por kilogramo de peso corporal del receptor por día, una dosis más baja más preferida es 6 mg por kilogramo de peso corporal del receptor por día, una dosis más baja aún más preferida es 10 mg por kilogramo de peso corporal del receptor por día. Una dosis adecuada está preferentemente en el intervalo de 6 a 150 mg por kilogramo de peso corporal por día, y con la máxima preferencia en el en el intervalo de 15 a 100 mg por kilogramo de peso corporal por día. La dosis deseada se presenta preferentemente como dos, tres, cuatro, cinco o seis o más subdosis administradas en intervalos apropiados durante todo el día. Estas subdosis pueden administrarse en formas de dosificación unitaria, por ejemplo, que contiene de 10 a 1500 mg, preferentemente de 20 a 1000 mg, y con la máxima preferencia de 50 a 700 mg de ingrediente activo por forma de dosificación unitaria.
Ejemplos de los compuestos de las formulaciones de la presente invención se describirán ahora, a modo de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos acompañantes, que comprenden las Figuras 1 a 11, en donde:
La Figura 1 muestra la fórmula estructural de 5-FdUrd y su CPF-373 de fosforamidato;
La Figura 2 muestra el efecto de la timidina fosforilasa y la uridina fosforilasa sobre dThd, Urd, 5-FdUrd y CPF-373, donde los datos son la media de al menos 2 experimentos independientes (± S.D.);
La Figura 3 muestra la inhibición de TS por 5-FdUrd y CPF-373 medida por liberación de tritio a partir de [5-3H]dUrd (paneles A y B) y de [5-3H]dCyd (paneles C y D) en cultivos de células L1210/0 y por liberación de tritio a partir de [5-3H]dCyd (paneles E y F) en cultivos de células L1210/TK-, donde los datos son la media de 2 experimentos independientes (± S.E.M.);
La Figura 4 muestra un supuesto mecanismo propuesto de activación de 5-FdUrd ProTides;
La Figura 5 muestra la escisión mediada por carboxipeptidasa de CPF-373 monitoreado mediante 31P RMN;
La Figura 6 muestra el espectro de 31P RMN del compuesto CPF-373 en suero;
La Figura 7 muestra el espectro de 31P RMN del compuesto CPF-373 en tampón pH = 1;
La Figura 8 muestra el espectro de 31P RMN del compuesto CPF-373 en tampón pH = 8;
La Figura 9 muestra los espectros de nucleósido y base relativa por 19F RMN: a) 5-FdUrd sometido al ensayo de fosforilasa (A); b) 5-FdUrd y la base 5FU en condiciones del ensayo en ausencia de la enzima (TP) (B);
La Figura 10 muestra los espectros de nucleósido y la base en tampón de fosfato de potasio (205 nM) por 19F RMN: a) 5-FdUrd sometido al ensayo de fosforilasa en ausencia de la enzima (A); b) Resultado después de la adición de la enzima (TP) (B); y
La Figura 11 muestra los espectros del compuesto CPF-373 en el ensayo de fosforilasa: a) CPF-373 en condiciones del ensayo en ausencia de la enzima (TP) (A); b) CPF-373 sometido a la acción de la timidina fosforilasa (TP) (B).
Síntesis de compuestos
Con referencia a la Figura 1 y Esquemas 1 a 3 más abajo, los compuestos para las formulaciones de la presente invención - como se ejemplifica por el compuesto CPF-373 (1), se han sintetizado mediante el uso de la química de fosforocloridato, cuya química de fosforocloridato ha sido previamente informada por McGuigan y otros (1993, 1996, 1997). Por ejemplo, el arilfosforodiclorofosfato (2) se preparó mediante acoplamiento de 1-naftol (3) con oxicloruro de fósforo (4) en presencia de Et3N (Esquema 1) y se dejó reaccionar con el tosilato de éster bencílico de L-alanina (5) en presencia de Et3N para generar el derivado de fosforocloridato (6) (Esquema 2). El nucleósido 5-FdUrd (7) se convirtió en 5' ProTide por acoplamiento con el derivado de fosforocloridato (6) en THF, en presencia de W-metil imidazol (NMI) para dar el compuesto objetivo CPF-373 (1) (Esquema 3). La muestra se obtuvo como una mezcla de dos diastereoisómeros confirmada por la presencia de dos picos en la 31P RMN.
Esquema 1: Reactivos y Condiciones: (i) 1-naftol (3), oxicloruro de fósforo (4), Et2O, Et3N seco, -78oC, 30 min, después t.a., 3 h.
Esquema 2: Reactivos y Condiciones: (i) Et3N seco, CH2Ch, -78oC, 1 h después t.a., 3h.
Esquema 3: Reactivos y Condiciones: (i) NMI, THF seco, 10 min, después fosfocloridato (6), t.a. toda la noche
Los disolventes anhidros se obtuvieron de Aldrich y se usaron sin purificación adicional. Todas las reacciones se llevaron a cabo bajo una atmósfera de argón. Las reacciones se monitorearon con TLC analítica en placas de aluminio recubiertas previamente con gel de sílice 60-F254 y se visualizaron con espectros bajo luz UV (254 nm) y/o con 31P RMN. La cromatografía en columna se realizó en gel de sílice (35-70 pM). Los espectros de RMN con protón (1H), carbono (13C), fósforo (31P) y flúor (19F) se registraron en un espectrómetro Bruker Avance 500 a 25 °C. Los espectros se autocalibraron con el pico de disolvente deuterado y todos los espectros de 13C RMN y 31P RMN se desacoplaron de protones. La HPLC analítica se realizó mediante Varian Prostar (LC Workstation-Varian prostar 335 LC detector) mediante el uso de Varian Polaris C18-A (10 pM) como columna analítica.
Los espectros de masas de baja y alta resolución se realizaron como un servicio por la Universidad de Birmingham, mediante el uso de electrospray (ES). El microanálisis de CHN se realizó como un servicio por MEDAC Ltd., Surrey.
Procedimiento estándar A: Síntesis de Diclorofosfato (2).
Se añadió oxicloruro de fósforo (1.0 equiv) a una solución de 1-naftol (1.0 equiv) en éter dietílico en atmósfera de argón, después se añadió trietilamina anhidra (1.0 equiv) gota a gota a -78 °C y se agitó la mezcla de reacción resultante durante 1 h. Posteriormente, la mezcla de reacción se dejó calentar lentamente hasta la temperatura ambiente durante 3 h. La formación del compuesto deseado se monitoreó mediante 31P RMN. La mezcla resultante se filtró y después se evaporó al vacío bajo nitrógeno para proporcionar el aceite incoloro en bruto como producto, que se usó sin purificación adicional en la siguiente etapa.
Síntesis de 1-Naftil Diclorofosfato (2): Se preparó de acuerdo con el Procedimiento estándar A, a partir de 1-naftol (3.00 g, 20.81 mmol), oxicloruro de fósforo (1.94 mL, 20.81 mmol), trietilamina (2.9 mL, 20.81 mmol) y éter dietílico anhidro (70 mL). Después de 1 h a -78 °C la reacción se dejó subir a temperatura ambiente y se agitó durante 3 h. El producto en bruto se obtuvo como un aceite. La mezcla resultante se filtró y luego se evaporó al vacío, después de la purificación por cromatografía en columna mediante elución con hexano-EtOAc, (1:1) para proporcionar un aceite incoloro (4.59 g, 84 %) [Rf = 0.93 (hexano-EtOAc, 1:1)], 31P RMN (202 MHz, CDClg): Sp 5.07; 1H RMN (500 MHz, CDClg): Sh 7.52-7.71 (m, 4H, ArH), 7.86-7.89 (m, 1H, ArH), 7.95-7.98 (m, 1H, ArH), 8.16-8.19 (m, 1H, ArH).
Procedimiento estándar B: Síntesis de Fosforocloridato (6 ).
Se añadió gota a gota una solución de fosforodicloridato de arilo (1.0 equiv) y sal de éster de aminoácido apropiada (1.0 equiv.) en diclorometano en atmósfera de argón, a trietilamina anhidra (2.0 equiv.) a -78 °C. Después de 1 h, la mezcla de reacción se dejó poner tibio lentamente a temperatura ambiente durante 3 horas y la formación del compuesto deseado se monitoreó mediante 31P RMN. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida, el residuo se redisolvió en éter dietílico, se filtró y se evaporó al vacío bajo nitrógeno para proporcionar un aceite incoloro en bruto, que en algunos casos se usó sin purificación adicional en la siguiente etapa. El fosforocloridato de arilo sintetizado se purificó por cromatografía en columna mediante elución con hexano-EtOAc, (7:3) para proporcionar el compuesto del título como un aceite incoloro.
Síntesis de fosforocloridato de 1-naftil(bencil-L-alaninilo) (6 ): El fosforocloridato se preparó mediante el uso de diclorofosfato de 1-naftilo (2.50 g, 9.57 mmol), sal de tosilato de L-alanina bencil éster (3.36 g, 9.57 mmol), trietilamina seca (2.66 mL, 19.14 mmol) y diclorometano seco (35.7 mL) de acuerdo con el procedimiento general B. Purificación por cromatografía en columna mediante elución con hexano-EtOAc, (7:3) proporcionó el compuesto del título en forma de un aceite incoloro (1.82 g, 47 %) [Rf = 0.90 (hexano-EtOAc, 7:3)], 31P r MN (202 MHz, CDCh, mezcla de diastereoisómeros): Sp 7.92, 8.14 (Int.: 1.00:1.00); 1H RMN (500 MHz, CDCh, mezcla de diastereoisómeros con una relación de 1:1): Sh1.42-1.45 (m, 3H, CHCH3), 4.20-4.23 (m, 1H, CHCH3), 4.78-4.81 (m, 1H, NH), 5.09 (s, 2H, OCH2Ph), 7.09-7.73 (m, 11H, ArH), 7.97-8.12 (m, 1H, ArH).
Procedimiento estándar C: Síntesis del Nucleósido Fosforamidato (1).
Se añadió una solución del nucleósido apropiado (1.0 equiv.) en THF seco (10 mL) a NMI (5.0 equiv.) a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón. Después de 10 minutos, la mezcla de reacción se añadió gota a gota a una solución de fosforocloridato (3.0 equiv) en THF anhidro. La reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche y se evaporó al vacío. El aceite obtenido se disolvió en CH2Ch, se lavó dos veces con H2O, después con 0.5 M de HCl o como alternativa, el producto en bruto se lavó con éter dietílico. Después el producto en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre sílice, mediante elución con CH2Ch-MeOH como un gradiente para proporcionar el fosforamidato.
Síntesis de 5-Fluoro-2'desoxiuridina-5'-0-[a-naftil (bencil-L-alaninil)]fosfato (1): El fosforamidato se preparó mediante el uso de 5-Fluoro-2'desoxiuridina (0.25 g, 1.01 mmol), NMI (0.40 mL, 5.07 mmol) y naftil(bencil-L-alaninil)fosforocloridato (0.82 g, 3.04 mmol) de acuerdo con el procedimiento general C. Purificación por cromatografía en columna de gradiente mediante elución con CH2Ch until C^Ch-M eOH (95:5) proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro (47.0 mg, 8%) [Rf = 0.19 (CH2Ch-MeOH, 95:5)], (Encontrado: MNa+, 636.1520. C2gH2gN3OgFNaP requiere [MNa+], 636.1523); 31P RMN (202 MHz, MeOD, mezcla de diastereoisómeros): Sp 4.24, 4.59; 19F RMN (470 MHz, MeOD): Sf-167.36, -167.18; 1H RMN (500 MHz, MeOD): Sh 1.34-1.38 (m, 3H, CHCH3), 1.67-1.79 (m, 1H, H-2'), 2.08-2.17 (m, 1H, H-2'), 4.03-4.15 (m, 2H, CHCH3, H-4'), 4.24-4.36 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 5.08 (d, 1H, J =12.0 Hz, OCHHPh), 5.13 (d, 1H, J =12.0 Hz, OCHHPh), 6.09-6.16 (m, 1H, H-1'), 7.27-7.45 (m, 6H, ArH), 7.47-7.55 (m, 3H, ArH), 7.67-7.72 (m, 2H, ArH, H-6), 7.86-7.90 (m, 1H, ArH), 8.12-8.18 (m, 1H, ArH); 13C RMN (125 MHz, MeOD): Sc 20.3 (d, 3Jc-p = 7.6 Hz, CH3), 20.5 (d, 3Jc-p = 6.5 Hz, CH3), 40.8 (CH2), 40.9 (CH2), 51.8 (CH), 51.9 (CH), 67.6 (d, 2Jc-p =5.3 Hz, CH2), 67.8 (d, 2Jc-p = 5.2 Hz, CH2), 68.0 (CH2), 68.1 (CH2), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.7 (d, 3Jc-p =8.1 Hz, CH), 86.8 (d, 3Jc-p =8.1 Hz, CH), 86.9 (CH), 87.0 (CH), 116.2 (d, 3Jcp = 3.3 Hz, CH), 116.5 (d, 3Jc-p= 3.5 Hz, CH), 122.6 (CH), 125.3 (CH), 125.4 (CH), 125.6 (CH), 125.7 (CH), 126.2 (CH), 126.5 (CH), 126.6 (CH), 127.6 (CH), 127.7 (CH), 127.8 (C), 127.9 (C), 128.0 (CH), 128.1 (CH), 128.9 (CH), 129.0 (CH), 129.4 (CH), 129.5 (CH), 129.6 (CH), 129.7 (CH), 136.2 (C), 137.1 (C), 137.2 (C), 141.6 (d, 1Jc-f = 233.8 Hz, C), 141.7 (d, 1Jc-f = 233.9 Hz, C), 147.8 (d, 2Jc-p = 7.7 Hz, C), 147.9 (d, 2Jc-p = 7.4 Hz, C), 150.5 (d, 4Jc-f= 4.0 Hz, C), 159.3 (d, 2Jc-f = 26.1 Hz, C), 174.6 (d, 3Jc-p =5.0 Hz, C), 174.9 (d, 3Jc-p = 4.3 Hz, C), m/z (ES) 636 (MH+, 100 %), HPLC inversa mediante
elución con (H2O/MeOH de 100/0 a 0/100) en 45 min., mostró dos picos de los diasteroisómeros con ír 34.23 min. and ír 34.59 min. Anal. Calculado para C29H29FN3O9P: C, 56.77; H, 4.76; N, 6.85. Encontrado: C, 56.57; H, 5.06; N, 6.72.
Desoxinucleósidos pirimidínicos radiactivos
[5-3H]dCyd (radiospecificidad: 22 Ci/mmol) y [5-3H]dUrd (radiospecificidad: 15.9 Ci/mmol) se obtuvieron de Moravek Biochemicals Inc. (Brea, CA).
Procedimiento estándar D: síntesis de fosforamidatos (método NMI)
A una solución en agitación de 5F-dUrd (1.0 eq.) en THF anhidro, se añadió gota a gota un fosforocloridato apropiado (3.0 eq) disuelto en THF anhidro bajo una atmósfera de Ar. A esa mezcla de reacción a -78°C se añadió gota a gota NMI (5.0 eq.) durante 5 minutos. Después de 15 minutos, la mezcla de reacción se llevó a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo se volvió a disolver en DCM y se lavó tres veces con 0.5 M de HCl. La capa orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró, se redujo a sequedad y se purificó por cromatografía en columna con gradiente de eluyente (DCM/MeOH 99:1 a 97:3 a 95:5).
Procedimiento estándar E: síntesis de fosforamidatos (método fBuMgCl)
A una solución en agitación de 5-FdUrd (1.0 eq.) disuelta en THF anhidro, se añadió fBuMgCl (1.1 mol eq. solución 1M en THF) gota a gota en una atmósfera de Ar, seguido de la adición (después de 30 min.) del fosforocloridato apropiado (2.0 mol eq.) disuelto en THF anhidro. La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. El solvente se eliminó a presión reducida, y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna mediante el uso de gradiente de eluyente (DCM/MeOH 99:1 a 97:3 a 95:5)
5-fluoro-2-desoxiuridina-5-0-[fenil(benzoxi-L-alamniil)]fosfato (CPF381)
El fosforamidato se preparó mediante el uso de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (0.40 g, 1.62 mmol), cloruro de ferc-butilmagnesio en tetrahidrofurano (‘BuMgCl) (1.0 M, 2.43 mL, 2.43 mmol) y fenil(benzoxi-L-alaninilo)fosforocloridato (1.08 g, 3.20 mmol) de acuerdo con el procedimiento general E. Purificación por cromatografía en columna de gradiente sobre sílice, mediante elución con CH2Ch hasta CH2Ch-MeOH (95:5) proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro (71.0 mg, 8 %) [Rf = 0.35 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)], (Encontrado: MNa+, 586.1360. C25H2yNaO9NaPF requiere [MNa+], 586.1367); 31P RMN (202 MHz, MeOD): ™ p 3.74, 4.14; 19F RMN (470 MHz, MeOD): ™ f-167.57,-167.46; 1H RMN (500 MHz, MeOD): ™ h 1.35 (d, 3H, J = 7.4 Hz, CHCH3, un diast.), 1.37 (d, 3H, J = 6.9 Hz, CHCH3, un diast.), 1.96-2.32 (m, 2H, H-2'), 3.95-4.08 (m, 2H, CHCH3, H-4'), 4.23-4.34 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 5.13 (brd, 1H, J =12.3 Hz, OCHHPh), 5.16 (br d, 1H, J =12.3 Hz, OCHHPh, un diast.), 5.17 (br d, 1H, J = 12.2 Hz, OCHHPh, un diast.), 6.16-6.22 (m, 1H, H-1'), 7.17-7.25 (m, 3H, ArH), 7.26-7.40 (m, 7H, ArH), 7.81-7.85 (m, 1H, H-6 ); 13C RMN (125 MHz, MeOD): ™ c20.2 (d, 3Jc-p =7.5 Hz, CH3), 20.4 (d, 3Jcp = 6.2 Hz, CH3), 40.6 (CH2), 40.9 (CH2), 51.6 (CH), 51.8 (CH), 67.5 (d, 2Jc-p = 5.3 Hz, CH2), 67.6 (d, 2Jc-p = 5.5 Hz, CH2), 68.0 (CH2), 71.8 (CH), 71.9 (CH), 86.6 (d, 3Jc-p = 8.0 Hz, CH), 86.8 (d, 3Jc-p =8.3 Hz, CH), 86.9 (CH), 87.0 (CH), 121.4 (d, 3Jc-p = 5.1 Hz, CH), 121.5 (d, 3Jc-p =5.6 Hz, CH), 125.5 (d, 5Jc-p = 3.2 Hz, CH), 125.8 (d, 5Jc-p =3.2 Hz, CH), 126.3 (CH), 129.0 (CHx2), 129.3 (CHx2), 129.6(CHx2), 130.8(CHx2), 140.9(C), 141.6 (d, 1Jc-f = 233.6 Hz, C), 141.7 (d, J c-f = 233.6 Hz, C), 150.7 (d, 4Jc-f =5.7 Hz, C), 152.1 (d, 2Jc-f = 6.5 Hz, C), 159.2 (d, 2Jc-f = 26.3 Hz, C), 174.6 (d, 3Jc-p = 4.9 Hz, C), 174.7 (d, 3Jc-p =4.9 Hz, C), m/z (ES) 586 (MNa+, 100 %); La HPLC de fase inversa eluyendo con H2O/MeOH de 100/0 a 0/100 en 45 minutos, 1 mL/min, L = 275 nm, mostró un pico de la mezcla de diastereoisómeros confR 25.08 min. (97 %).
5-fluoro-2'-desoxiuridina-5'-0-[fenil(metoxi-L-alaninil)]fosfato (CPF382) (ejemplo de referencia)
El fosforamidato se preparó mediante el uso de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (0.25 g, 1.01 mmol), W-metilimidazol (NMI) (0.40 mL, 5.07 mmol) y fenil(metoxi-L-alaninil)fosforocloridato (0.84 g, 3.04 mmol) de acuerdo con el procedimiento general D. Purificación por cromatografía en columna de gradiente mediante elución con CH2Ch hasta CH2Ch-MeOH (95:5) proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro (16.0 mg, 4 %) [Rf = 0.30 (CH2Ch-MeOH, 95:5)], (Encontrado: MNa+, 510.1045. C-ig^gNgOgNaPF requiere [MNa+], 510.1054); 31P RMN(202 MHz, MeOD): ™ p 3.79, 4.09; 19F RMN (470 MHz, MeOD): ™ f -167.78, -167.72; 1H RMN (500 MHz, MeOD): ™ h 1.34 (d, 3H, J = 7.1 Hz, CHCH3, un diast.), 1.36 (d, 3H, J = 7.1 Hz, CHCH3, un diast.), 2.02-2.16 (m, 1H, H-2'), 2.25-2.34 (m, 1H, H-2'), 3.69 (s, 3H, OCH3, un diast.), 3.70 (s, 3H, OCH3, un diast.), 3.93-4.02 (m, 1H, CHCH3), 4.08-4.13 (m, 1H, H-4'), 4.27-4.45 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 6.20-6.29 (m, 1H, H-1'), 7.18-7.28 (m, 3H, ArH), 7.35-7.40 (m, 2H, ArH), 7.85 (d, 1H, 3Jh-f = 6.4 Hz, H-6); 13C RMN (125 MHz, MeOD): ™ c 20.2 (d, 3Jc-p = 7.5 Hz, CH3), 20.5 (d, 3Jc-p = 6.7 Hz, CH3), 40.8 (CH2), 40.9 (CH2), 51.5 (CH3), 51.6 (CH3), 52.7 (CH), 52.8 (CH), 67.5 (d, 2Jc-p = 5.5 Hz, CH2), 67.6 (d, 2Jc-p = 5.1 Hz, CH2), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.7 (d, 3Jc-p = 8.2 Hz, CH), 86.8 (d, 3Jc-p =8.2 Hz, CH), 86.9 (CH), 87.0 (CH), 121.2 (d, 3Jc-p = 4.5 Hz, CH), 121.4 (d, 3Jc-p = 4.7 Hz, CH), 125.6 (d, 5Jc-p = 2.9 Hz, CH), 125.9 (d, 5Jc-p = 2.9 Hz, CH), 126.2 (CH), 130.8 (CH), 130.9 (CH), 141.6 (d, J c-f = 233.8 Hz, C), 141.7 (d, 1Jc-f = 233.9 Hz, C), 150.6 (d, 4Jc-f =3.6 Hz, C), 152.1 (d, 2Jc-p = 6.8 Hz, C), 152.2 (d, 2Jc-p = 6.8 Hz, C), 159.4 (d, 2Jcf = 26.0 Hz, C), 175.2 (d, 3Jc-p = 4.8 Hz, C), 175.5 (d, 3Jc-p = 3.7 Hz, C), m/z (ES) 510 (MNa+, 100 %); HPLC de fase inversa eluyendo con H2O/MeOH de 100/0 a 0/100 en 45 minutos, 1 mL/min, L = 275 nm, mostró dos picos de los diastereoisómeros con ír 23.11 min. y tR 24.11 min. (74 % : 24 %).
5-fluoro-2'-desoxiuridina-5'-0-[fenil(etoxi-L-alaninil)]fosfato (CPF383)
El fosforamidato se preparó mediante el uso de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (0.10 g, 0.40 mmol), W-metilimidazol (NMI) (0.16 mL, 2.03 mmol) y (etoxi-L-alaninil)fosforocloridato (0.35 g, 1.21 mmol) de acuerdo con el procedimiento general D. Purificación por cromatografía en columna de gradiente mediante elución con CH2Ch hasta CH2Ch-MeOH (95:5) proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro (10.0 mg, 5 %) [Rf = 0.11 (CH2Ch-MeOH, 95:5)], (Encontrado: MNa+, 524.1202. C20H25N3O9NaPF require [MNa+], 524.1210); 31P RMN (202 MHz, MeOD): ™ p 3.83, 4.11; 19F RMN (470 MHz, MeOD): ™ f -167.67, -167.61; 1H RMN (500 MHz, MeOD): ™ h 1.25 (t, 3H, J = 7.1 Hz, CH2CH3, un diast.), 1.26 (t, 3H, J = 7.1 Hz, CH2CH3, un diast.), 1.34 (d, 3H, J = 7.2 Hz, CHCH3, un diast.), 1.36 (d, 3H, J =7.2 Hz, CHCH3, un diast.), 2.02-2.15 (m, 1H, H-2'), 2.24-2.34 (m, 1H, H-2'), 3.90-4.00 (m, 1H, CHCH3,), 4.08-4.19 (m, 3H, CH2CH3, H-4'), 4.27-4.45 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 6.20-6.28 (m, 1H, H-1'), 7.18-7.28 (m, 3H, ArH), 7.34-7.39 (m, 2H, ArH), 7.85 (d, 1H, 3Jh-f = 6.4 Hz, H-6); 13C RMN (125 MHz, MeOD): ™ c 14.4 (CH3), 15.4 (CH3), 20.3 (d, 3Jc-p =7.6 Hz, CH3), 20.5 (d, 3Jc-p =6.5 Hz, CH3), 40.8 (CH2), 40.9 (CH2), 51.6 (CH), 51.7 (CH), 62.4 (CH2), 62.5 (CH2), 67.5 (d, 2Jc-p = 5.4 Hz, CH2), 67.6 (d, 2Jc-p = 5.4 Hz, CH2), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.7 (d, 3Jc-p =8.1 Hz, CH), 86.8 (d, 3Jc-p = 8.3 Hz, CH), 86.9 (CH), 87.0 (CH), 121.3 (d, 3Jcp = 4.8 Hz, CH), 121.4 (d, 3Jc-p = 4.6 Hz, CH), 125.6 (d, 5Jc-p = 4.6 Hz, CH), 125.8 (d, 5Jc-p = 4.8 Hz, CH), 126.3 (CH), 130.8 (CH), 130.9 (CH), 141.6 (d, 1Jc-f = 233.7 Hz, C), 141.8 (d, J c-f = 233.8 Hz, C), 150.8 (br C), 152.0 (d, 2Jc-p = 7.1 Hz, C), 152.1 (d, 2Jc-p =7.1 Hz, C), 159.6 (d, 2Jc-f = 26.0 Hz, C), 174.8 (d, 3Jc-p = 5.4 Hz, C), 175.1 (d, 3Jc-p =4.4 Hz, C), m/z (ES) 524 (MNa+, 100 %); HPLC de fase inversa eluyendo con H2O/MeOH de 100/0 a 0/100 en 45 minutos, 1 mL/min, L = 275 nm, mostró dos picos de los diastereoisómeros con ír 25.63 min. y ír26.40 min. (71 %: 27 %).
5-fluoro-2'-desoxiuridina-5'-0-[fenil(isopropoxi-L-alaninil)]fosfato (CPF384)
El fosforamidato se preparó mediante el uso de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (0.25 g, 1.01 mmol), N-metilimidazol (NMI) (0.40 mL, 5.07 mmol) y fenil(isopropoxi-L-alaninil)fosforocloridato (0.93 g, 3.04 mmol) de acuerdo con el procedimiento general D. Purificación por cromatografía en columna de gradiente mediante elución con CH2Ch hasta CH2Ch-MeOH (95:5) proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro (31.0 mg, 6 %) [Rf = 0.21 (CH2Ch-MeOH, 95:5)], (Encontrado: MNa+, 538.1370. C ^ y ^ O g N a P F requiere [MNa+], 538.1367); 31P RMN(202 MHz, MeOD): ™ p 3.87, 4.13; 19F RMN (470 MHz, MeOD): ™ f -167.64, -167.56; 1H RMN (500 MHz, MeOD): ™ h 1.22-1.26 (m, 6H, CH(C«b)2), 1.33 (d, 3H, J =7.1 Hz, CHCH3, un diast.), 1.35 (d, 3H, J = 7.1 Hz, CHCH3, un diast.), 2.00-2.15 (m, 1H, H-2'), 2.23-2.34 (m, 1H, H-2'), 3.88-3.96 (m, 1H, CHCH3), 4.08-4.14 (m, 1H, H-4'), 4.27-4.45 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 4.98 (hept, 1H, J = 6.1 Hz, CH(CHa)2), 6.20 6.29 (m, 1H, H-1'), 7.17-7.29 (m, 3H, Ar-H), 7.34-7.40 (m, 2H, Ar-H), 7.84 (d, 1H, 3Jh-f = 6.4 Hz, H-6); 13C RMN (125 MHz, MeOD): ™ c 20.3 (d, 3Jc-p = 7.6 Hz, CH3), 20.5 (d, 3Jc-p = 6.4 Hz, CH3), 21.9 (CHax2), 22.0 (CHax2), 40.8 (CH2), 40.9 (CH2), 51.7 (CH), 51.8 (CH), 67.5 (d, 2Jc-p = 5.4 Hz, CH2), 67.6 (d, 2Jc-p = 5.2 Hz, CH2), 70.2 (CH), 70.3 (CH), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.6 (d, 3Jc-p = 8.2 Hz, CH), 86.8 (d, 3Jc-p = 8.2 Hz, CH), 86.9 (CH), 87.0 (CH), 121.2 (d, 3Jc-p = 4.7 Hz, CH), 121.4 (d, 3Jc-p = 4.9 Hz, CH), 125.6 (d, 5Jc-p = 7.1 Hz, CH), 125.9 (d, 5Jc-p = 7.1 Hz, CH), 126.3 (CH), 130.8 (CH), 130.9 (CH), 141.8 (d, 1Jc-f = 234.5 Hz, C), 141.9 (d, J c-f = 234.4 Hz, C), 150.7 (d, 4Jc-f = 3.7 Hz, C), 152.0 (d, 3Jc-p =6.2 Hz, C), 152.1 (d, 3Jc-p = 6.2 Hz, C), 159.3 (d, 2Jc-f = 26.3 Hz, C), 159.4 (d, 2Jc-f = 26.0 Hz, C), 174.3 (d, 3Jc-p = 5.6 Hz, C), 174.6 (d, 3Jcp = 4.6 Hz, C), m/z (ES) 538 (MNa+, 100 %); HPLC de fase inversa eluyendo con H2O/MeOH de 100/0 a 0/100 en 45 minutos, 1 mL/min, L = 275 nm, mostró dos picos de los diastereoisómeros con ír28.93 min. y ír 29.45 min. (44 % : 52 %).
5-fluoro-2'-desoxiuridina-5'-0-[fenil(ciclohexoxi-L-alaninil)]fosfato (CPF508)
El fosforamidato se preparó mediante el uso de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (0.30 g, 1.21 mmol), N-metilimidazol (NMI) (0.48 mL, 6.09 mmol) y fenil(ciclohexoxi-L-alaninil)fosforocloridato (1.026 g, 3.65 mmol) de acuerdo con el procedimiento general D. Purificación por cromatografía en columna de gradiente mediante elución con CH2Ch hasta CH2Ch-MeOH (95:5) proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro (6.7 mg, 3 %) [Rf = 0.45 (CH2Ch-MeOH, 95:5)], (Encontrado: MNa+, 565.48. C24H31N3OgNaPF requiere [MNa+], 565.49); 31P RMN (202 MHz, MeOD): ™ p 3.86, 4.15; 19F RMN (470 MHz, MeOD): ™ f -167.68, -167.62; 1H RMN (500 MHz, MeOD): ™ h 1.26-1.40 (m, 3H, C H C ^), 1.41-1.50 (m, 4H, CH(CH2)5), 1.52-1.61 (m, 1H, CH(CH2)a), 1.70-1.88 (m, 5H, CH(CH2)a), 2.00-2.14 (m, 1H, H-2'), 2.23-2.34 (m, 1H, H-2'), 3.90-3.98 (m, 1H, C H C ^), 4.07-4.14 (m, 1H, H-4'), 4.29-4.39 (m, 2H, CH2OP), 4.40-4.45 (m, 1H, H-3'), 4.72-4.78 (m, 1H, CH(CH2)5), 6.20-6.28 (m, 1H, H-1'), 7.18-7.29 (m, 3H, ArH), 7.34-7.39 (m, 2H, ArH), 7.85 (d, 1H, 3Jh-f = 6.6 Hz, H-6); 13C RMN (125 MHz, MeOD): ™ c 20.3 (d, J c-p = 7.3 Hz, C ^ ), 20.6 (d, 3Jc-p = 6.5 Hz, CH3), 24.6 (CH2), 26.4 (CH2), 32.3 (CH2), 32.4 (CH2), 40.9 (CH2), 51.7 (CH), 51.9 (CH), 67.5 (d, 2Jc-p = 5.3 Hz, CH2), 67.7 (d, 2Jc-p = 5.3 Hz, CH2), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 74.9 (CH), 86.6 (d, 3Jc-p =8.5 Hz, CH), 86.8 (d, 3Jc-p = 8.5 Hz, CH), 86.9 (CH), 87.0 (CH), 121.3 (CH), 121.4 (CH), 121.5 (CH), 121.6 (CH), 125.6 (CH), 125.7 (CH), 125.8 (CH), 125.9 (CH), 126.3 (CH), 130.1 (CH), 141.5 (d, 1Jc-f = 234.0 Hz, C), 150.7 (d, 4Jc-p = 4.0 Hz, C), 152.0 (d, 2Jc-p =7.2 Hz, C), 152.1 (d, 2Jc-p =7.2 Hz, C), 159.4 (d, 2Jc-f= 26.3 Hz, C), 174.3 (d, 3Jc-p =4.6 Hz, C), 174.5 (d, 3Jc-p =4.3 Hz, C); m/z (ES) 565(MNa+, 100%); HPLC de fase inversa eluyendo con H2O/MeOH de 100/0 a 0/100 en 45 minutos, 1 mL/min, L = 275 nm, mostró dos picos de los diastereoisómeros con ír 30.00 min. y ír30.45 min. (33 % : 65 %).
5-fluoro-2'desoxiuridina-5'-0-[p-nitro-fenil(etoxi-L-alaninil)]fosfato (CPF430)
El fosforamidato se preparó mediante el uso de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (0.25 g, 1.01 mmol), W-metilimidazol (NMI) (0.40 mL, 5.07 mmol) y p-nitro-fenil(etoxi-L-alaninil)fosforocloridato (1.02 g, 3.04 mmol) de acuerdo con el procedimiento general D.Purificación por cromatografía en columna de gradiente mediante elución con CH2Ch hasta CH2Ch-MeOH (95:5) proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro (77.0 mg, 14 %) [Rf = 0.24 (CH2Ch-MeOH, 95:5)], (Encontrado: MNa+, 569.1066. C20H24N4OnNaPF requiere [MNa+], 569.1061); 31P RMN (202 MHz, MeOD): ™ p 3.63, 3.67; 19F RMN (470 MHz, MeOD): ™ f -167.89, -167.82; 1H RMN (500 MHz, MeOD): ™ h 1.24 (t, 3H, J = 7.0 Hz, CH2CH3), 1.25 (t, 3H, J = 7.0 Hz, CH2CH3), 1.36-1.40 (m, 3H, CHCH3), 2.16-2.25 (m, 1H, H-2'), 2.30-2.38 (m, 1H, H-2'), 3.95-4.00 (m, 1H, CHCH3), 4.09-4.19 (m, 3H, CH2CH3, H-4'), 4.32-4.48 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 6.21-6.29 (m, 1H, H-1'), 7.46 (d, 1H, J = 8.7 Hz, ArH), 7.49 (d, 1H, J= 8.7 Hz, ArH), 7.85 (d, 1H, 3Jh-f = 6.6 Hz, H-6), 7.87 (d, 1H, 3Jh-f = 6.6 Hz, H-6), 8.29 (d, 2H, J = 8.7 Hz, ArH); 13C RMN (125 MHz, MeOD): ™ c14.5 (CH3), 14.6 (CH3), 20.3 (d, 3Jc-p = 7.5 Hz, CH3), 20.4 (d, 3Jc-p = 6.4 Hz, CH3), 40.8 (CH2), 51.6 (CH), 51.7 (CH), 62.5 (CH2), 67.8 (d, 2Jc-p =5.5 Hz, CH2), 68.0 (d, 2Jc-p =5.2 Hz, CH2), 71.8 (CHx2), 86.4 (CH), 86.5 (CH), 87.0 (d, 3Jc-p =7.5 Hz, CH), 122.1 (d, 3Jc-p = 5.2 Hz, CH), 122.5 (d, 3Jc-p =5.0 Hz, CH), 125.7 (CH), 126.0 (CH), 126.6 (CH), 141.3 (d, 1Jc-f = 233.6 Hz, C), 141.5 (d, J c-f = 233.7 Hz, C), 146.2 (C), 150.6 (d, 4Jc-p = 4.6 Hz, C), 156.9 (d, 2Jc-p = 2.6 Hz, C), 157.0 (d, 2Jc-p= 2.6 Hz, C), 159.3 (d, 2Jc-f = 26.3 Hz, C), 174.6 (d, 3Jc-p = 4.6 Hz, C), 174.9 (d, 3Jc-p = 3.7 Hz, C), m/z (ES) 569 (MNa+, 100%); HPLC de fase inversa eluyendo con H2O/MeOH de 100/0 a 0/100 en 45 min., 1 mL/min, L = 275 nm, mostró dos picos de los diastereoisómeros contR31.63 min. and ír 31.89 min. (11 %: 85 %).
5-Fluoro-2'desoxiuridina-5'-0-[1-naftil(benzoxi-L-alaninil)]fosfato (CPF373)
El fosforamidato se preparó mediante el uso de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (0.25 g, 1.01 mmol), N-metilimidazol (NMI) (0.40 mL, 5.07 mmol) y 1-naftil(benzoxi-L-alaninil)fosforocloridato (0.82 g, 3.04 mmol) de acuerdo con el procedimiento general D. Purificación por cromatografía en columna de gradiente mediante elución con CH2Ch hasta CH2Ch-MeOH (95:5) proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro (47.0 mg, 8 %) [Rf = 0.19 (CH2Ch-MeOH, 95:5)], (Encontrado: MNa+, 636.1520. C29H29N3OgNaPF requiere [MNa+], 636.1523); 31P RMN (202 MHz, MeOD): ™ p 4.24, 4.59; 19F RMN (470 MHz, MeOD): ™ f -167.36, -167.18; 1H RMN (500 MHz, MeOD): ™ h 1.34-1.38 (m, 3H, CHCH3), 1.67-1.79 (m, 1H, H-2'), 2.08-2.17 (m, 1H, H-2'), 4.03-4.15 (m, 2H, CHCH3, H-4'), 4.24-4.36 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 5.08 (d, 1H, J = 12.0 Hz, OCHHPh), 5.13 (d, 1H, J = 12.0 Hz, OCHHPh), 6.09-6.16 (m, 1H, H-1'), 7.27-7.45 (m, 6H, ArH), 7.47-7.55 (m, 3H, ArH), 7.67-7.72 (m, 2H, ArH, H-6), 7.86-7.90 (m, 1H, ArH), 8.12-8.18 (m, 1H, ArH); 13C RMN (125 MHz, MeOD): ™ c20.3(d , 3Jcp = 7.6 Hz, CH3), 20.5 (d, 3Jc-p = 6.5 Hz, CH3), 40.8 (CH2), 40.9 (CH2), 51.8 (CH), 51.9 (CH), 67.6 (d, 2Jc-p =5.3 Hz, CH2), 67.8 (d, 2Jc-p =5.2 Hz, CH2), 68.0 (CH2), 68.1 (CH2), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.7 (d, 3Jc-p =8.1 Hz, CH), 86.8 (d, 3Jc-p =8.1 Hz, CH), 86.9 (CH), 87.0 (CH), 116.2 (d, 3Jc-p = 3.3 Hz, CH), 116.5 (d, 3Jc-p= 3.5 Hz, CH), 122.6 (CH), 125.3 (CH), 125.4 (CH), 125.6 (CH), 125.7 (CH), 126.2 (CH), 126.5 (CH), 126.6 (CH), 127.6 (CH), 127.7 (CH), 127.8 (C), 127.9 (C), 128.0 (CH), 128.1 (CH), 128.9 (CH), 129.0 (CH), 129.4 (CH), 129.5 (CH), 129.6 (CH), 129.7 (CH), 136.2 (C), 137.1 (C), 137.2 (C), 141.6 (d, 1Jc-f = 233.8 Hz, C), 141.7 (d, J c-f = 233.9 Hz, C), 147.8 (d, 2Jc-p =7.7 Hz, C), 147.9 (d, 2Jc-p =7.4 Hz, C), 150.5 (d, 4Jc-f= 4.0 Hz, C), 159.3 (d, 2Jc-f = 26.1 Hz, C), 174.6 (d, 3Jc-p =5.0 Hz, C), 174.9 (d, 3Jc-p = 4.3 Hz, C), m/z (ES)
636 (MNa+, 100%); HPLC de fase inversa eluyendo con H2O/MeOH de 100/0 a 0/100 en 45 minutos, 1 mL/min, L = 275 nm, mostró dos picos de los diastereoisómeros con ír34.23 min. y ír 34.59 min. (23 % : 76 %).
El fosforamidato se preparó mediante el uso de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (0.25 g, 1.01 mmol), N-metilimidazol (NMI) (0.40 mL, 5.07 mmol) y 1-naftil(metoxi-L-alaninil)fosforocloridato (0.99 g, 3.04 mmol) de acuerdo con el procedimiento general D. Purificación por cromatografía en columna de gradiente mediante elución con CH2Ch hasta CH2Ch-MeOH (95:5) proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro (7.0 mg, 1 %) [Rf = 0.23 (CH2Ch-MeOH, 95:5)], (Encontrado: MNa+, 560.1198. C2aH25N3O9NaPF requiere [MNa+], 560.1210); 31P RMN(202 MHz, MeOD): ™ p 4.31,4.56; 19F RMN (470 MHz, MeOD): ™ f -167.51, -167.37; 1H RMN (500 MHz, MeOD): ™ h 1.34 (d, 3H, J = 6.7 Hz, CHCH3, un diast.), 1.36 (d, 3H, J = 6.7 Hz, CHCH3, un diast.), 1.76-1.87 (m, 1H, H-2'), 2.12-2.22 (m, 1H, H-2'), 3.64 (s, 3H, OCH3, un diast.), 3.65 (s, 3H, OCH3, un diast.), 4.03-4.13 (m, 2H, CHCH3, H-4'), 4.30-4.38 (m, 2H, CH2OP), 4.41 (dd, 1H, J = 2.5 Hz, J = 5.8 Hz, H-3'), 6.12-6.19 (m, 1H, H-1'), 7.41-7.46 (m, 1H, ArH), 7.50-7.58 (m, 3H, ArH), 7.70-7.76 (m, 2H, H-6, ArH), 7.87-7.91 (m, 1H, ArH), 8.15-8.20 (m, 1H, ArH); 13C RMN (125 MHz, MeOD): ™ c 20.3 (d, 3Jc-p = 7.1 Hz, CH3), 20.4 (d, 3Jc-p =6.5 Hz, CH3), 40.7 (CH2), 40.8 (CH2), 51.6 (CH3), 51.7 (CH3), 52.7 (CH), 52.8 (CH), 67.8 (d, 2Jc-p = 5.7 Hz, CH2), 67.5 (d, 2Jc-p = 5.7 Hz, CH2), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.7 (d, 3Jc-p = 7.9 Hz, CH), 86.9 (d, 3Jc-p = 8.5 Hz, CH), 86.9 (CH), 87.0 (CH), 116.2 (d, 3Jc-p = 3.1 Hz, CH), 116.5 (d, 3Jc-p = 3.5 Hz, CH), 122.5 (CH), 122.6 (CH), 125.4 (CH), 125.5 (CH), 125.6 (CH), 125.7 (CH), 126.1 (CH), 126.2 (CH), 126.5 (CH), 126.6 (CH), 127.6 (CH), 127.7 (Cx2), 127.8 (CH), 127.9 (CH), 128.9 (CH), 129.0 (CH), 136.3 (C), 141.6 (d, 1Jc-f = 233.4 Hz, C), 141.7 (d, J c-f = 234.1 Hz, C), 147.8 (d, 2Jc-p =7.9 Hz, C), 148.0 (d, 2Jc-p = 7.2 Hz, C), 150.6 (C), 159.4 (d, 2Jc-f = 27.0 Hz, C), 175.2 (d, 3Jc-p =3.9 Hz, C), 175.5 (d, 3Jc-p =3.9 Hz, C), m/z (ES) 560 (MNa+, 100 %); HpLC de fase inversa eluyendo con H2O/MeOH de 100/0 a 0/100 en 45 minutos, 1 mL/min, L = 275 nm, mostró dos picos de los diastereoisómeros con ír 28.45 min. y ír 28.85 min. (73% : 25%).
5-Fluoro-2'desoxiuridina-5'-0-[1-naftil(etoxi-L-alaninil)]fosfato (CPF386)
El fosforamidato se preparó mediante el uso de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (0.25 g, 1.01 mmol), N-metilimidazol (NMI) (0.40 mL, 5.07 mmol) y 1-naftil(etoxi-L-alaninil) fosforocloridato (1.04 g, 3.04 mmol) de acuerdo con el procedimiento general D. Purificación por cromatografía en columna de gradiente mediante elución con CH2Ch hasta CH2Ch-MeOH (95:5) proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro (47.0 mg, 4 %) [Rf = 0.25 (CH2Ch-MeOH, 95:5)], (Encontrado: MNa+, 574.1360. C24H27NaO9NaPF requiere [MNa+], 574.1367); 31P RMN (202 MHz, MeOD): ™ p 4.34, 4.55; 19F RMN (470 MHz, MeOD): ™ f -167.31, -167.16; 1H RMN (500 MHz, MeOD): ™ h 1.20 (t, 3H, J = 7.0 Hz, CH2CH3, un diast.), 1.21 (t, 3H, J = 7.0 Hz, CH2CH3, un diast.), 1.33-1.37 (m, 3H, CHCH3), 1.73-1.86 (m, 1H, H-2'), 2.12-2.21 (m, 1H, H-2'), 4.01-4.07 (m, 1H, CHCH3), 4.08-4.13 (m, 3H, CH2CH3, H-4'), 4.31-4.43 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 6.11-6.19 (m, 1H, H-1'), 7.39-7.46 (m, 1H, ArH), 7.50-7.57 (m, 3H, ArH), 7.68-7.75 (m, 2H, ArH, H-6), 7.86-7.91 (m, 1H, ArH), 8.15-8.20 (m, 1H, ArH); 13C RMN (125 MHz, MeOD): ™ c 14.4 (CH3), 20.3 (d, 3Jc-p = 7.4 Hz, CH3), 20.5 (d, 3Jc-p =6.2 Hz, CH3), 40.8 (CH2), 40.9 (CH2), 51.8 (CH), 51.9 (CH), 62.4 (CH2), 62.5 (CH2), 67.8 (d, 2Jc-p = 4.6 Hz, CH2), 67.9 (d, 2Jc-p = 4.6 Hz, CH2), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.7 (d, 3Jc-p =8.4 Hz, CH), 86.8 (d, 3Jc-p = 8.4 Hz, CH), 86.9 (CH), 87.0 (CH), 116.1 (d, 3Jc-p =3.5 Hz, CH), 116.5 (d, 3Jcp = 3.5 Hz, CH), 122.6 (CH), 125.4 (CH), 125.5 (CH), 125.7 (CH), 125.8 (CH), 126.1 (CH), 126.2 (CH), 126.5 (CH), 126.6 (CH), 127.5 (CH), 127.6 (C), 127.7 (C), 127.8 (CH), 127.9 (CH), 128.9 (CH), 129.0 (CH), 136.3 (C), 141.6 (d, 1Jc-f = 233.3 Hz, C), 141.7 (d, 1Jc-f = 233.4 Hz, C), 147.8 (d, 2Jc-p= 6.9 Hz, C), 148.0 (d, 2Jc-p = 6.9 Hz, C), 150.6 (C), 159.3 (d, 2Jc-f =
26.3 Hz, C), 174.8 (d, 3Jc-p = 4.8 Hz, C), 175.1 (d, 3Jc-p = 4.0 Hz, C); m/z (ES) 574 (MNa+, 100 %); HPLC de fase inversa eluyendo con H2O/MeOH de 100/0 a 0/100 en 45 minutos, 1 mL/min, L = 275 nm, mostró dos picos de los diastereoisómeros con ír 30.77 min. y ír31.20 min. (51 %: 48 %).
El fosforamidato se preparó mediante el uso de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (0.10 g, 0.40 mmol), cloruro deterc-butilmagnesio en tetrahidrofurano (‘BuMgCl) (1.0 M, 0.61 mL, 0.61 mmol) y 1-naftil(isopropoxi-L-alaninil) fosforocloridato (0.31 g, 0.89 mmol) de acuerdo con el procedimiento general E. Purificación por cromatografía en columna de gradiente mediante elución con CH2Ch hasta C^Ch-M eOH (95:5) proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro (71.0 mg, 17 %) [Rf = 0.21 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)], (Encontrado: MNa+, 588.1521. C25H29N3O9NaPF requiere [MNa+], 588.1523); 31P RMN (202 MHz, MeOD): ™ p 4.38, 4.58; 19F RMN (470 MHz, MeOD): ™ f -167.43, -167.26; 1H RMN (500 MHz, MeOD): ™ h 1.19-1.23 (m, 6H, CH(CH9)2), 1.34-1.38 (m, 3H, CHCH3), 1.68-1.84 (m, 1H, H-2'), 2.09-2.20 (m, 1H, H-2'), 3.96-4.05 (m, 1H, CHCH3), 4.07-4.12 (m, 1H, H-4'), 4.29-4.38 (m, 2H, CH2OP), 4.39-4.42 (m, 1H, H-3'), 4.93-5.01 (m, 1H, CH(CH3)2), 5.10-6.18 (m, 1H, H-1'), 7.40-7.46 (m, 1H, ArH), 7.50-7.57 (m, 3H, ArH), 7.70-7.75 (m, 2H, H-6, ArH), 7.87-7.92 (m, 1H, ArH), 8.16-8.20 (m, 1H, ArH); 13C RMN (125 MHz, MeOD): ™ c 20.3 (d, 3Jc-p =7.1 Hz, CH3), 20.5 (d, 3Jc-p = 6.6 Hz, CH3), 21.8 (CH3), 21.9 (CH3), 22.0 (CH3), 22.1 (CH3), 40.8 (CH2), 40.9 (CH2), 51.9 (CH), 52.0 (CH), 67.8 (d, 2Jc-p =4.5 Hz, CH2), 67.9 (d, 2Jc-p = 4.8 Hz, CH2), 70.2 (CH), 70.3 (CH), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.6 (CH), 86.7 (CH), 86.9 (d, 3Jc-p = 8.6 Hz, CH), 87.0 (d, 3Jc-p = 8.6 Hz, CH), 116.2 (d, 3Jc-p = 2.5 Hz, CH), 116.5 (d, 3Jc-p = 2.7 Hz, CH), 122.6 (CH), 125.5 (CH), 125.7 (CH), 126.1 (CH), 126.2 (CH), 126.5 (CH), 127.5 (CH), 127.6 (C), 127.7 (C), 127.8 (CH), 127.9 (CH), 128.9 (CH), 129.0 (CH), 136.3 (C), 141.6 (d, 1Jc-f = 233.2 Hz, C), 141.7 (d, 1Jc-f = 233.4 Hz, C), 147.7 (d, 2Jc-p =7.6 Hz, C), 147.9 (d, 2Jc-p = 7.7 Hz, C), 150.5 (C), 159.4 (d, 2Jcf = 26.2 Hz, C), 174.4 (d, 3Jc-p = 5.0 Hz, C), 174.7 (d, 3Jc-p = 5.1 Hz, C); m/z (ES) 588 (MNa+, 100 %); HpLC de fase inversa eluyendo con H2o/MeOH de 100/0 a 0/100 en 45 minutos, 1 mL/min, L = 275 nm, mostró dos picos de los diastereoisómeros con ír 32.20 min. y ír 32.80 min. (27 % : 69 %).
El fosforamidato se preparó mediante el uso de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (0.30 g, 1.21 mmol), W-metilimidazol (NMI) (0.48 mL, 6.09 mmol) y fenil(ciclohexoxi-L-alaninil)fosforocloridato (1.45 g, 3.65 mmol) de acuerdo con el procedimiento general D. Purificación por cromatografía en columna de gradiente mediante elución con CH2Ch hasta CH2Ch-MeOH (95:5) proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro (6.7 mg, 3 %) [Rf = 0.47 (CH2Ch-MeOH, 95:5)]; (Found: MNH4+, 623.2261. C2sH37N4O9NaPF requiere [MNH4+], 623.2282); 31P RMN (202 MHz, MeOD): ™ p 4.35, 4.52; 19F RMN (470 MHz, MeOD): ™ f -167.31, -167.17; 1H RMN (500 MHz, MeOD): ™ h 1.30-1.43 (m, 3H, CHCH3), 1.44-1.56 (m, 4H, CH(CH2)5), 1.57-1.66 (m, 1H, CH(CH2)g), 1.67-1.83 (m, 5H, CH(CH2)g), 1.84-1.93 (m, 1H, H-2'), 2.09-2.20 (m, 1H, H-2'), 3.98-4.06 (m, 1H, CHCH3), 4.07-4.15 (m, 1H, H-4'), 4.29-4.38 (m, 2H, CH2OP), 4.39-4.44 (m, 1H, H-3'), 4.67-4.76 (m, 1H, CH(CH2)5), 6.09-6.19 (m, 1H, H-1'), 7.38-7.57 (m, 5H, ArH), 7.68-7.75 (m, 1H, ArH), 7.79-7.92 (m, 1H, ArH), 8.17 (d, 1H, 3Jh-f = 6.6 Hz, H-6); 13C RMN (125 MHz, MeOD): ™ c 20.4 (d, 3Jc-p = 8.0 Hz, CH3), 20.6 (d, 3Jc-p = 6.5 Hz, CH3), 24.5 (CH2), 26.3 (CH2), 32.3 (CH2), 40.8 (CH2), 51.8 (CH), 51.9 (CH), 67.8 (CH2), 72.0 (CH), 72.2 (CH), 75.0 (CH), 86.7 (d, 3Jcp = 8.2 Hz, CH), 87.0 (CH), 116.1 (d, 3Jc-p = 2.5 Hz, CH), 116.4 (d, 3Jc-p = 3.0 Hz, CH), 122.6 (CH), 124.8 (CH), 125.9 (CH), 126.1 (CH), 126.2 (CH), 126.4 (CH), 126.5 (CH), 126.6 (CH), 127.6 (CH), 127.7 (Cx2), 127.8 (CH), 127.9 (CH),
128.9 (CH), 129.0 (CH), 136.3 (C), 141.6 (C), 148.0 (d, 2Jc-p =7.2 Hz, C), 150.6 (C), 159.4 (d, 2Jc-f = 27.0 Hz, C), 175.2 (d, 3Jc-p = 3.9 Hz, C), 175.5 (d, 3Jc-p = 3.9 Hz, C); m/z (ES) 623 (MNH4+, 100 %); HPLC de fase inversa eluyendo con H2O/MeOH de 100/0 a 0/100 en 45 minutos, 1 mL/min, L = 275 nm, mostró dos picos de los diastereoisómeros con ír 30.50 min. y ír 31.48 min. (27 % : 69 %).
El fosforamidato se preparó mediante el uso de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (0.40 g, 1.62 mmol), cloruro de terc-butilmagnesio en tetrahidrofurano (‘BuMgCl) (1.0 M, 2.43 mL, 2.43 mmol) y fenil(benzoxi-a,a-dimetilglicina) fosforocloridato (1.17 g, 3.20 mmol) de acuerdo con el procedimiento general E. Purificación por cromatografía en columna de gradiente mediante elución con CH2Ch hasta C^Ch-M eOH (95:5) proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro (69.0 mg, 7 %) [Rf = 0.27 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)], (Encontrado: MNa+, 600.1527. C26H29NaO9NaPF requiere [MNa+], 600.1523); 31P RMN (202 MHz, MeOD): ™ p 2.42, 2.47; 19F RMN (470 MHz, MeOD): ™ f -167.80, -167.62; 1H RMN (500 MHz, MeOD): ™ h 1.51-1.60 (m, 6H, C(CHa)2), 1.89-1.97 (m, 1H, H-2', un diast.), 2.07-2.15 (m, 1H, H-2', un diast.), 2.21 (ddd, 1H, J =3.4 Hz, 5.9 Hz, 13.5 Hz, H-2', un diast.), 2.29 (ddd, 1H, J = 3.2 Hz, 6.1 Hz, 13.5 Hz, H-2', un diast.), 4.00-4.07 (m, 1H, H-4'), 4.22-4.31 (m, 2H, CH2OP), 4.32-4.36 (m, 1H, H-3', un diast.), 4.37-4.41 (m, 1H, H-3', un diast.), 5.08-5.18 (m, 2H, OCH2Ph), 6.19-6.25 (m, 1H, H-1'), 7.20-7.26 (m, 3H, ArH), 7.27-7.39 (m, 7H, ArH), 7.74 (d, 3Jh-f =6.4 Hz, H-6, un diast.), 7.80 (d, 3Jh-f = 6.4 Hz, H-6, un diast.); 13C RMN (125 MHz, MeOD): ™ c 27.5 (CH3), 27.7 (d, 3Jc-p = 7.1 Hz, CH3), 27.8 (d, 3Jc-p = 7.1 Hz, CH3), 40.8 (CH2), 40.9 (CH2), 58.2 (C), 58.3 (C), 67.6 (d, 2Jc-p =5.5 Hz, CH2), 67.7 (d, 2Jc-p =5.5 Hz, CH2), 68.3 (CH2), 71.9 (CH), 72.0 (CH), 86.6 (d, 3Jc-p = 8.1 Hz, CH), 86.8 (d, 3Jc-p =7.3 Hz, CH), 86.9 (CH), 121.4 (d, 3Jc-p = 4.8 Hz, CH), 121.6 (d, 3Jc-p =4.5 Hz, CH), 125.6 (CH), 125.8 (CH), 125.9 (CH), 126.1 (CH), 126.2 (CH), 129.3 (CH), 129.4 (CH), 129.6 (CH), 130.7 (CH), 130.8 (CH), 137.2 (C), 137.3 (C), 141.8 (d, 1Jc-f = 233.7 Hz, C), 150.6 (C), 152.1 (d, 4Jc-f = 7.0 Hz, C), 152.1 (d, 4Jc-f = 7.6 Hz, C), 159.3 (d, 2Jc-f = 26.1 Hz, C), 159.4 (d, 2Jc-f = 26.1 Hz, C), 176.5 (d, 3Jc-p =4.0 Hz, C), 176.6 (d, 3Jc-p = 3.8 Hz, C), m/z (ES) 600.1 (MNa+, 100 %); HPLC de fase inversa eluyendo con H2O/MeOH de 100/0 a 0/100 en 35 minutos, 1 mL/min, L = 275 nm, mostró un pico de la mezcla de diastereoisómeros con ír 17.71 (96 %).
El fosforamidato se preparó mediante el uso de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (0.20 g, 0.80 mmol), W-metilimidazol (NMI) (0.31 mL, 4.0 mmol) fenil(etoxi-a,a-dimetilglicina) fosforocloridato (0.73 g, 2.40 mmol) de acuerdo con el procedimiento general D. Purificación por cromatografía en columna de gradiente mediante elución con CH2Ch hasta CH2Ch-MeOH (95:5) proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro (25.0 mg, 6 %) [Rf = 0.24 (CH2Ch-MeOH, 95:5)], (Encontrado: MNa+, 538.1367. C^yNaO gNaPF requiere [MNa+], 538.1367); 31P RMN (202 MHz, MeOD): ™ p 2.49, 2.52; 19F RMN (470 MHz, MeOD): ™ f -167.62, -167.58; 1H RMN (500 MHz, MeOD): ™ h 1.24 (t, 3H, J = 7.1 Hz, CH2CH3, un diast.), 1.26 (t, 3H, J = 7.1 Hz, CH2CH3, un diast.), 1.44-1.54 (m, 6H, C(CHah), 1.95-2.04 (m, 1H, H-2', un diast.), 2.13-2.21 (m, 1H, H-2', un diast.), 2.24 (ddd, 1H, J = 3.1 Hz, J = 6.3 Hz, J =13.5 Hz, H-2', un diast.), 2.31 (ddd, 1H, J = 3.2 Hz, J = 6.1 Hz, J = 13.7 Hz, H-2', un diast.), 4.08-4.19 (m, 3H, CH2CH3, H-4'), 4.33-4.49 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 6.20-6.30 (m, 1H, H-1'), 7.237.28 (m, 3H, ArH), 7.33-7.40 (m, 2H, ArH), 7.80 (d, 3Jhf = 6.4 Hz, H-6, un diast.), 7.88 (d, 3Jhf = 6.4 Hz, H-6, un diast.); 13C RMN (125 MHz, MeOD): ™ c 14.4 (CH3), 14.5 (CH3), 27.5 (d, 3Jc-p = 7.3 Hz, CH3), 27.7 (d, 3Jc-p = 7.6 Hz, CH3), 27.8 (d, 3Jc-p = 7.6 Hz, CH3), 40.8 (CH2), 40.9 (CH2), 58.1 (C), 62.6 (CH2), 62.7 (CH2), 67.6 (d, 2Jc-p = 6.7 Hz, CH2), 67.7 (d, 2Jc-p = 5.8 Hz, CH2), 71.9 (CH), 72.0 (CH), 86.6 (d, 3Jc-p =8.1 Hz, CH), 86.8 (d, 3Jc-p =7.6 Hz, CH), 86.9 (CH), 121.4 (d, 3Jc-p = 4.4 Hz, CH), 121.6 (d, 3Jc-p = 4.4 Hz, CH), 125.6 (CH), 125.8 (CH), 125.9 (CH), 126.1 (CH), 126.2 (CH), 130.7 (CH), 130.8 (CH), 130.9 (CH), 141.8 (d, 1Jc-f = 233.5 Hz, C), 150.6 (C), 150.7 (C), 152.2 (d, 4Jc-f = 7.3 Hz, C), 152.3 (d, 4Jc-f = 6.9 Hz, C), 159.2 (d, 2Jc-f = 20.3 Hz, C), 159.4 (d, 2Jc-f = 20.4 Hz, C), 176.6 (d, 3Jc-p = 4.2 Hz, C), 176.8 (d, 3Jc-p = 4.6 Hz, C), m/z (ES) 538.1 (MNa+, 100 %); HPLC de fase inversa eluyendo con H2O/MeOH de 100/0 a 0/100 en 45 minutos, 1 mL/min, L = 275 nm, mostró dos picos de los diastereoisómeros con ír 18.76 min. y tR 20.44 min. (68 % : 30 %).
El fosforamidato se preparó mediante el uso de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (0.40 g, 1.62 mmol), N-metilimidazol (NMI) (0.64 mL, 8.0 mmol) 1-naftil(benzoxi-a,a-dimetilglicina) fosforocloridato (2.00 g, 4.80 mmol) de acuerdo con el procedimiento general D. Purificación por cromatografía en columna de gradiente mediante elución con CH2Ch hasta CH2Ch-MeOH (95:5) proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro (16.4 mg, 6 %) [Rf = 0.15 (CH2Ch-MeOH, 95:5)], (Encontrado: MNa+, 650.1678. C30H31N3OgNaPF requiere [MNa+], 650.1680); 31P RMN (202 MHz, MeOD): ™ p 2.87, 3.03; 19F RMN (470 MHz, MeOD): ™ f -167.95, -167.13; 1H RMN (500 MHz, MeOD): ™ h 1.37-1.42 (m, 6H, C(CH3)2), 1.61-1.69 (m, 1H, H-2', un diast.), 1.79-1.87 (m, 1H, H-2', un diast.), 2.06 (ddd, 1H, J = 3.0 Hz, J = 6.1 Hz, J = 13.6 Hz, H-2', un diast.), 2.15 (ddd, 1H, J = 3.2 Hz, J = 5.9 Hz, J = 13.7 Hz, H-2', un diast.), 3.98-4.04 (m, 1H, H-4'), 4.19-4.35 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 5.09-5.13 (m, 1H, OCHHPh), 5.18-5.19 (m, 1H, OCHHPh), 6.05-6.15 (m, 1H, H-1'), 7.28-7.40 (m, 7H, ArH), 7.48-7.55 (m, 3H, ArH), 7.62 (d, 3Jh-f = 6.4 Hz, H-6, un diast.), 7.70 (d, 3Jh-f = 6.4 Hz, H-6, un diast.), 7.86-7.90 (m, 1H, ArH), 8.17-8.22 (m, 1H, ArH); 13C RMN (125 MHz, MeOD): ™ c 27.5 (d, 3Jc-p = 4.4 Hz, CH3), 27.9 (d, 3Jc-p =7.3 Hz, CH3), 28.0 (d, 3Jc-p = 7.3 Hz, CH3), 40.7 (CH2), 40.8 (CH2), 65.2 (C), 67.8 (d, 2Jc-p = 6.5 Hz, CH2), 68.3 (CH2), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.6 (d, 3Jc-p = 8.2 Hz, CH), 86.8 (d, 3Jc-p = 7.8 Hz, CH), 86.9 (CH), 116.3 (d, 3Jc-p = 3.2 Hz, CH), 116.7 (d, 3Jc-p = 2.9 Hz, CH), 122.8 (CH), 122.9 (CH), 125.4 (CH), 125.5 (CH), 125.6 (CH), 126.0 (CH), 126.1 (CH), 126.4 (CH), 126.5 (CH), 127.4 (CH), 127.5 (CH), 127.7 (CH), 127.8 (CH), 127.9 (C), 128.0 (CH), 128.9 (CH), 129.3 (CH), 129.4 (CH), 129.6 (CH), 136.2 (C), 137.3 (C), 141.8 (d, 1Jc-f = 234.4 Hz, C), 147.9 (d, 3Jc-p =7.7 Hz, C), 148.0 (d, 3Jc-p =8.2 Hz, C), 150.7 (d, 4Jc-f = 3.7 Hz, C), 159.5 (d, 2Jc-f = 25.8 Hz, C), 159.6 (d, 2Jc-f = 25.8 Hz, C), 176.5 (C), 176.6 (C), m/z (ES) 650.0 (MNa+, 100 %); HPLC de fase inversa eluyendo con H2O/MeOH de 100/0 a 0/100 en 45 minutos, 1 mL/min, L = 275 nm, mostró dos picos de los diastereoisómeros conÍR 20.80 min. y ír 21.00 min. (72 % : 24 %).
El fosforamidato se preparó mediante el uso de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (0.40 g, 1.62 mmol), cloruro de terc-butilmagnesio en tetrahidrofurano (‘BuMgCl) (1.0 M, 2.43 mL, 2.43 mmol) y 1-naftil(etoxi-a,a-dimetilglicina) fosforocloridato (1.14 g, 3.20 mmol) de acuerdo con el procedimiento general E. Purificación por cromatografía en columna de gradiente mediante elución con CH2Ch hasta CH2Ch-MeOH (95:5) proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro (54.0 mg, 2 %) [Rf = 0.10 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)], (Encontrado: MNa+, 588.1528. C25H2gN3OgNaPF requiere [MNa+], 588.1523); 31P
RMN (202 MHz, MeOD): ™ p 2.91, 3.03; 19F RMN (470 MHz, MeOD): ™ f -167.38, -167.21; 1H RMN (500 MHz, MeOD): ™ h 1.24 (t, 3H, J =7.1 Hz, CH2CH3, un diast.), 1.25 (t, 3H, J = 7.1 Hz, CH2CH3, un diast.), 1.50-1.55 (m, 6H, C(CHa)2), 1.68-1.76 (m, 1H, H-2', un diast.), 1.87-1.94 (m, 1H, H-2', un diast.), 2.09 (ddd, 1H, J= 2.9 Hz, J = 6.3 Hz, J =13.4 Hz, H-2', un diast.), 2.19 (ddd, 1H, J = 3.0 Hz, J = 6.3 Hz, J = 13.8 Hz, H-2', un diast.), 4.07-4.10 (m, 1H, H-4'), 4.16 (q, 2H, J = 7.1 Hz, CH2CH3), 4.36-4.41 (m, 3H, CH2OP, H-3'), 6.10-6.18 (m, 1H, H-1'), 7.40-7.46 (m, 1H, ArH), 7.50-7.59 (m, 3H, ArH), 7.66-7.72 (m, 2H, ArH, H-6), 7.85-7.91 (m, 1H, ArH), 8.18-8.24 (m, 1H, ArH); 13C RMN (125 MHz, MeOD): ™ c 14.4 (CH3), 27.5 (brs, CH3), 27.9 (d, 3Jc-p = 6.1 Hz, CH3), 28.0 (d, 3Jc-p = 6.1 Hz, CH3), 40.7 (CH2), 40.8 (CH2), 58.2 (C), 58.3 (C), 62.6 (CH2), 67.8 (d, 2Jc-p = 4.9 Hz, CH2), 67.9 (d, 2Jc-p =4.5 Hz, CH2), 72.0 (CH), 72.1 (CH), 86.7 (d, 3Jc-p =7.7 Hz, CH), 86.9 (d, 3Jc-p = 7.3 Hz, CH), 87.0 (CH), 116.3 (d, 3Jc-p = 3.2 Hz, CH), 116.6 (d, 3Jc-p = 2.9 Hz, CH), 122.8 (CH), 122.9 (CH), 125.4 (CH), 125.6 (CH), 125.7 (CH), 126.0 (CH), 126.1 (CH), 126.5 (CH), 127.4 (CH), 127.5 (CH), 127.7 (CH), 127.8 (CH), 127.9 (C), 128.0 (C), 128.9 (CH), 136.2 (C), 141.8 (d, 1Jc-f = 233.5 Hz, C), 148.0 (d, 2Jc-p =7.3 Hz, C), 148.1 (d, 2Jc-p = 7.6 Hz, C), 150.5 (C), 150.6 (C), 159.3 (d, 2Jc-f = 26.2 Hz, C), 159.4 (d, 2Jc-f = 26.6 Hz, C), 176.8 (C), 176.9 (C); m/z (ES) 588.1 (MNa+, 100 %); HPLC de fase inversa eluyendo con H2O/MeOH de 100/0 a 0/100 en 45 minutos, 1 mL/min, L = 275 nm, mostró un pico de la mezcla de diastereoisómeros conÍR 16.05 min. (96 %).
Se preparó de acuerdo con el procedimiento estándar D a partir de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (0.25 g, 1.01 mmol), NMI (0.41 g, 5.07 mmol, 0.40 mL) y fenil(benzoxi-L-prolinil)-fosfocloridato (0.77 g, 2.03 mmol) en THF (10 mL). La purificación en columna seguida de dos purificaciones porTLC preparativas dio el producto como un sólido blanco (0.010 g, 2 %). 31P-RMN (MeOD, 202 MHz) 81.82
19F-RMN (MeOD, 470 MHz) 8 - 167.91
1H-RMN (MeOD, 500 MHz) 87.84 (d, J = 7.18 Hz, 1H, H-base), 7.39-7.33 (m, 7H, H-Ar), 7.22-7.19 (m, 3H, H-Ar), 6.26 -6.23 (m, 1H, H-1'), 5.22-5.13 (m, CH2Ph éster), 4.40-4.35 (m, 3H, NCH, 2 x H-5'), 4.33-4.28 (m, 1H, H-3'), 4.06-4.04 (m, 1H, H-4'), 3.36-3.32 (m, 2H, NCH2), 2.26-2.19 (m, 1H, H-2'), 2.18-2.13 (m, 1H, CH2-L-Pro), 2.00-1.81 (m, 4H, 3 x H, CH2-L-Pro, 1 x H, H-2')
13C-RMN (MeOD, 125 MHz) 8174.81 (C=O, éster), 159.40 (C=O, base), 152.0 (d, 2Jc-p = 6.32 Hz, OC-Ar), 150.71 (C=O, base), 141.88 (1 Jc-f = 232 Hz, CF, base), 137.23 (CAr), 131.33, 129.70, 129.48, 129.45, 129.30, 126.45 (CH-Ar), 125.80, 125.53 (2 x d, 2Jc-f = 29.0 Hz, CH-base), 121.00, 120.96 (CH-Ar), 87.80 (C-1'), 86.80 (C-4'), 72.02 (C-3'), 68.16 (CH2Ph), 67.64 (d, 2Jc-p = 4.65 Hz, C-5'), 62.40 (d, 2Jc-p = 5.60 Hz, NCH), 48.03 (d, 2Jc-p = 4.80 Hz, NCH2), 41.07 (C-2'), 32.18, 32.11 (CH2-L-Pro), 26.29, 26.21 (CH2-L-Pro).
MS (ES+) m/e: 612 (MNa+, 100%), 590 (MH+, 1 %) Masa exacta: C27H29FN3O9P requirió 589.51
Se preparó de acuerdo con el procedimiento estándar D a partir de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (0.25 g, 1.01 mmol), NMI (0.41 g, 5.07 mmol, 0.40 mL)y 1-naftil(benzoxi-L-prolinil)-fosfocloridato (0.84 g, 2.03 mmol) en THF (10 mL). La purificación en columna seguida de dos purificaciones porTLC preparativas dio el producto como un sólido blanco (0.006 g, 1 %). 31P-RMN (MeOD, 202 MHz) 82.27
19F-RMN (MeOD, 121 MHz) 8 - 167.46
1H-RMN (MeOD, 500 MHz) 8 8.14 - 8.12 (m, 1H, H-Ar), 7.90 - 7.89 (m, 1H, H-Ar), 7.74 - 7.71 (m, 2H, 1 x H-Ar, 1 x H-base), 7.56 - 7.42 (m, 4H, H-Ar), 7.36 - 7.33 (m, 5H, H-Ar), 6.13 (t, J = 6.38 Hz, H-1'), 5.22 - 5.13 (m, 2H, CH2Ph), 4.49 -4.46 (m, 1H, NCH), 4.42 - 4.33 (m, 2H, H-5'), 4.25 - 4.23 (m, 1H, H-3'), 4.06 - 4.04 (m, 1H, H-4'), 3.36 - 3.34 (m, 2H, NCH2),
2.23-2.15 (m, 1H, CH2-L-Pro), 2.10-2.02 (m, 2H, 1 x H, CH2-L-Pro, 1 x H, H-2'), 1.97 - 1.77 (m, 2H, CH2-L-Pro), 1.63 1.57 (m, 1H, H-2')
13C-RMN (MeOD, 125 MHz) 8 174.82 (C=O, éster), 159.52 (C=O, base), 150.54 (C=O, base), 147.84, 147.78 (d, 2Jc-p = 6.03 Hz, OC-Ar), 141.75, 139.97 (2xd , 1Jc-f = 232 Hz, CF, base), 137.20, 136.34 (C-Ar), 129.76, 129.65, 129.44, 129.36, 129.27, 129.06, 128.95, 128.04, 128.75, 126.56 (CH-Ar), 125.41 (d, 2Jc-f = 30.0 Hz, CH-base), 122.13 (CH-Ar), 115.76 (d, 3Jc-p = 3.3 Hz, CH-Ar), 87.06 (C-1'), 86.79 (C-4'), 72.23 (C-3'), 68.15 (d, 2Jc-p = 5.46 Hz, C-5'), 68.08 (CH2Ph), 62.53 (d, 2Jc-p = 5.60 Hz, NCH), 48.26 (d, 2Jc-p = 5.34 Hz, NCH2), 40.97 (C-2'), 32.16, 32.09 (CH2-L-Pro), 26.22, 26.15 (CH2-L-Pro).
5-Fluoro-2'd
Se preparó de acuerdo con el procedimiento estándar D a partir de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (0.25 g, 1.01 mmol), NMI (0.41 g, 5.07 mmol, 0.40 mL) y 1-naftil-(3,3-dimetil-1-butoxi-L-alaninil)-fosfocloridato (1.21 g, 3.04 mmol) en THF (10 mL). La purificación en columna seguida de dos purificaciones por TLC preparativas dio el producto como un sólido blanco (0.010 g, 2 %).
31P-RMN (MeOD, 202 MHz) 84.48, 4.33
19F-RMN (MeOD, 470 MHz) 8 - 167.30, - 167.47
1H-RMN (MeOD, 500 MHz) 88.20 - 8.17 (m, 1H, H-Ar), 7.91 - 7.89 (m, 1H, H-Ar), 7.77 - 7.72 (m, 2H, H-Ar), 7.58 - 7.51 (m, 3H, H-base, 2 x H-Ar), 7.46-7.41 (2 x t, 1H, J = 7.8 Hz, H-Ar), 6.19 - 6.13 (m, 1H, H-1'), 4.42 - 4.40 (m, 1H, 1 x H-5'), 4.38-4.32 (m, 2H, H-3', 1 x H-5'), 4.14-4.00 (m, 4H, H-4', CHCH3, OCH2CH2(CH3)3), 2.21 -2.13(m , 1H, 1 x H-2'), 1.91 -1.76 (m, 1H, 1 x H-2'), 1.52 - 1.48 (m, 2H, OC^CH^CHab), 1.37 - 1.35 (m, 3H, CHCH3), 0.92, 0.91 (2 x s, 9H, OCH2CH2(CH3)3) 13C-RMN (MeOD, 125 MHz) 8175.16, 174.84 (2 x d, 3Jc-p = 4.75 Hz, C=O, éster), 159.56, 159.35 (C=O, éster), 150.61 (C=O, éster), 148.00, 147.86 (2 x d, 2Jc-p = 6.25 Hz, OC-Ar), 141.78, 141.73 (2 x d, 1Jc-f = 232 Hz, CF, base), 136.28 (C-Ar), 128.98, 128.95, 127.92, 127.90, 127.58, 126.57, 126.20, 126.14 (CH-Ar), 125.63, 125.55 (2xd , 2Jcf = 34 Hz, CH, base), 122.65, 122.63 (CH-Ar), 116.48, 116.15 (2 x d, 3Jc-p = 3.0 Hz, CH-Ar), 87.01, 86.94 (C-1'), 86.73, 86.68 (d, 3Jc-p = 7.75 Hz, C-4'), 72.18, 72.07 (C-3'), 67.87, 67.85 (2 x d, 2Jc-p = 5.0 Hz, C-5'), 64.08, 64.05 (OCH2CH2(CH3)3), 51.86 (d, 3Jc-p = 5.5 Hz, CHCH3), 42.74 (OCH2CH2(CH3)3), 40.91, 40.83 (C-2'), 29.96 (OCH2CH2(CH3)3), 20.50, 20.34 (2 x d, 3Jc-p = 6.5 Hz, CHCH3).
MS (ES+) m/e: 630 (MNa+, 100 %), 608 (MH+, 10 %) Masa exacta: C28H35FN3O9P requirió 607.56
Se preparó de acuerdo con el procedimiento estándar D a partir de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (0.23 g, 0.93 mmol), NMI (0.38 g, 4.67 mmol, 0.37 mL) y 1-naftil-(ciclobutoxi-L-alaninil)-fosfocloridato (0.85 g, 2.33 mmol) en THF (10 mL). La purificación en columna seguida de purificación por TLC preparativa dio el producto como un sólido blanco (0.010 g, 2 %).
31P-RMN (MeOD, 202 MHz) 84.54, 4.36
19F-RMN (MeOD, 470 MHz) 8 - 167.12, - 167.29
1H-RMN (MeOD, 500 MHz) 8 8.18 - 8.17 (m, 1H, H-Ar), 7.81 - 7.87 (m, 1H, H-Ar), 7.74 - 7.71 (m, 2H, 1 x H-Ar, 1 x H-base), 7.60 - 7.53 (m, 3H, H-Ar), 7.46 - 7.43 (2 x t, J = 8.0 Hz, 1H, H-Ar), 6.18 - 6.12 (m, 1H, H-1'), 5.00 - 4.95 (m, 1H, OCH éster), 4.41 -4.36 (m, 3H, 2 x H-5', H-3'), 4.11 -4.00 (m, 2H, H-4', CHCH3), 2.36-2.27 (m, 2H, CH2), 2.18-1.98 (m, 3H, CH2 éster, 1 x H-2'), 1.82 - 1.56 (m, 3H, CH2 éster, 1 x H-2'), 1.36 - 1.34 (m, 3H, CHCH3)
13C-RMN (MeOD, 125 MHz) 8 175.97, 173.34 (C=O, éster), 159.88 (C=O, base), 151.64 (C=O, base), 146.58 (OC-Ar), 141.15 (d, 1Jc-f = 220 Hz, CF, base), 136.28 (CAr), 128.93, 127.89, 127.54, 126.52, 126.18, 126.14 (CH-Ar), 125.53,
125.44 (2 x d, 2Jc-f = 32.5 Hz, CH-base), 122.63 (CH-Ar), 116.46, 116.44 (2 x d, 3Jc-p = 2.5 Hz, CH-Ar), 86.98 (d, 3Jc-p = 6.25 Hz, C-4'), 86.71 (C-1'), 72.14, 72.04 (C-3'), 71.07 (OCH éster), 67.83 (d, 2Jc-p = 7.38 Hz, C-5'), 51.66 (d, 2Jc-p = 8.75 Hz, CHCH3), 40.89, 40.83 (C-2'), 31.03 (OCHCH2), 20.43 (CHCH3), 14.23 (CH2 éster).
MS (ES+) m/e: 600 (MNa+, 100 %), 578 (MH+, 10 %) Masa exacta: C26H29FN3O9P requirió 577.50
5-Fluoro-2'-desox¡ur¡dina-5'-0-[1-naft¡l-(c¡cloprop¡lmetanox¡-L-alan¡n¡l)] fosfato (CPF579)
Se preparó de acuerdo con el procedimiento estándar D a partir de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (0.25 g, 1.01 mmol), NMI (0.41 g, 5.07 mmol, 0.40 mL) y 1-naftil-(ciclopropilmetanoxi-L-alaninil)-fosfodoridato (0.93 g, 2.54 mmol) en THF (10 mL). La purificación en columna dio el producto como un sólido blanco (0.056 g, 10 %).
31P-RMN (MeOD, 202 MHz) 64.58, 4.30
19F-RMN (MeOD, 470 MHz) 6 - 167.18, - 167.22
1H-RMN (MeOD, 500 MHz) 68.18 (d, J = 7.0 Hz, 1H, H-Ar), 7.89 - 7.87 (m, 1H, H-Ar), 7.73 - 7.70 (m, 2H, H-Ar), 7.58 -7.53 (m, 3H, H-Ar), 7.45-7.40 (2 x t, J = 8.0 Hz, 1H, H-Ar), 6.17-6.11 (m, 1H, H-1'), 4.43-4.41 (m, 1H, H-5'), 4.38-4.32 (m, 2H, H-5', H-3'), 4.11 - 4.04 (m, 2H, H-4', CHCH3), 3.95 - 3.85 (m, 2H, OCH2 éster), 2.19 - 2.11 (m, 1H, H-2'), 1.84 -1.72 (m, 1H, H-2'), 1.38, 1.36 (2 x d, J = 5.0 Hz, 3H, CHCH3), 1.15 -1.07 (m, 1H, OCH2CH éster), 0.59 - 0.50 (m, 2H, CH2 éster), 0.30 - 0.24 (m, 2H, CH2 éster)
13C-RMN (MeOD, 125 MHz) 6 175.25, 174.94 (2 x d, 3Jc-p = 4.75 Hz, C=O, éster), 159.54, 159.35 (C=O, base), 150.60, 150.56 (C=O, base), 148.05, 147.86 (2 xd, 2Jc-p = 7.5 Hz, OC-Ar), 141.79, 141.73 (2xd , 1Jc-f = 232 Hz, CF, base), 136.29 (C-Ar), 128.94 (d, 3Jc-p = 4.4 Hz, CH-Ar), 127.89 (d, 4Jc-p = 3.7 Hz, CH-Ar), 127.56, 126.55, 126.52, 126.19, 126.16 (CH-Ar), 125.64, 125.53 (2Jc-f = 34 Hz, CH-base), 122.65 (CH-Ar), 116.54, 116.24 (2 x d, 4Jc-p = 2.6 Hz, CH-Ar), 87.04, 86.99 (C-1'), 86.90, 86.73 (2 x d, 3Jc-p = 7.1 Hz, C-4'), 72.18, 72.07 (C-3'), 71.21, 71.18 (OCH2, éster), 67.87, 67.84 (t aparente, 2Jc-p = 5.0 Hz, C-5'), 51.88 (d, 2Jc-p = 10.0 Hz, CHCH3), 40.91, 40.83 (C-2'), 20.60, 20.46 (2 x d, 3Jc-p = 6.5 Hz, CHCH3), 10.69 (OCH2CH éster), 3.70, 3.65 (2 x CH2, éster).
MS (ES+) m/e: 600 (MNa+, 100 %), 578 (MH+, 15 %) Masa exacta: C26H29FN3O9P requirió 577.50.
HPLCb (H2O/Acetonitrilo de 100/0 a 0/100 en 35 min) TA 12.91 min.
5-Fluoro-2'desoxiuridina-5'-0-[1-naftil(tetrahidropiroxi-L-alaninil)]fosfato (CPF580)
Se preparó de acuerdo con el procedimiento estándar E a partir de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (0.25 g, 1.01 mmol), fBuMgCl (1.1 mL, 1.1 mmol) y 1-naftil-(tetrahidropiroxi-L-alaninil)-fosfocloridato (0.80 g, 2.03 mmol) en THF (10 mL). La purificación en columna seguida de dos purificaciones por TLC preparativas dio el producto como un sólido blanco (0.010 g, 1.6 %).
31P-RMN (MeOD, 202 MHz) 63.77, 3.22
19F-RMN (MeOD, 470 MHz) 6 - 168.27, - 168.35
1H-RMN (MeOD, 500 MHz) 68.60 (d, J = 7.0 Hz, 2H, H-Ar), 8.22-8.19 (m, 1H, H-Ar), 7.92-7.91 (d, J =5.50 Hz, 1H, H-Ar), 7.60- 7.45 (m, 4H, H-Ar, H-base), 6.29 - 6.25 (m, 1H, H-1'), 5.25-5.17 (m, 1H, H-3'), 4.96-4.87 (m, 1H, CH-éster), 4.28 - 4.26 (m, 1H, H-4'), 4.11 - 4.03 (m, 1H, CHCH3), 3.88 - 3.66 (m, 4H, 2 x OCH2a' éster, 2 x H-5'), 3.55 - 3.50 (m, 2H, 2 x OCH2a" éster), 2.63 - 2.30 (m, 2H, H-2'), 1.91 - 1.85 (m, 2H, 2 x CH2b' éster), 1.65 - 1.54 (m, 2H, CH2b" éster), 1.39 -1.35 (m, 3H, CHCH3).
13C-RMN (MeOD, 125 MHz) 6174.34 (C=O, éster), 159.24 (C=O, base), 150.76 (C=O, base), 148.03 (OC-Ar), 141.97 (d, 1Jc-f = 238 Hz, CF, base), 136.37 (C-Ar), 128.97, 128.56, 127.61, 127.57, 126.58, 126.23, 126.16, 126.12, 125.84 (CHAr), 122.70 (d, 2Jc-f = 24.0 Hz, CH-base), 116.62, 116.37 (CH-Ar), 87.54 (d, 3Jc-p = 5.40 Hz, C-4'), 86.60, 86.57 (C-1'), 79.82, 79.47 (C-3'), 71.45 (CH-éster), 66.12, 66.08 (2 x OCH2a éster), 66.02 (C-5'), 51.83 (CHCH3), 39.97, 39.94 (C-2'), 32.65, 32.57 (2 x CH2b éster), 20.45, 20.30 (CHCH3).
MS (ES+) m/e: 630 (MNa+, 100 %), 608 (MH+, 10 %) Masa exacta: C27H31FN3O10P requirió 607.52.
Se preparó de acuerdo con el procedimiento estándar E a partir de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (0.25 g, 1.01 mmol), fBuMgCl (1.1 mL, 1.1 mmol) y 1-naftil-(pentoxi-L-alaninil)-fosfocloridato (0.78 g, 2.03 mmol) en THF (10 mL). La purificación en columna dio el producto como un sólido blanco (0.047 g, 8 %).
31P-RMN (MeOD, 202 MHz) 84.48, 4.32
19F-RMN (MeOD, 470 MHz) 8 - 167.18, - 167.29
1H-RMN (MeOD, 500 MHz) 88.25- 8.17 (m, 1H, H-Ar), 8.05-7.95 (m, 2H, H-Ar), 7.85-7.60 (m, 2H, H-Ar, H-base), 7.65 - 7.48 (m, 3H, H-Ar), 6.30 - 6.18 (m, 1H, H-1'), 4.60 - 4.37 (m, 3H, 2 x H-5', H-3'), 4.28 - 4.00 (m, 4H, H-4', CHCH3, OCH2CH2CH2CH2CH3), 2.32 - 2.12 (m, 1H, H-2'), 1.95 - 1.75 (m, 1H, H-2'), 1.70 - 1.55 (m, 2H, OCH2CH2CH2CH2CH3), 1.50 - 1.28 (m, 7H, 4 x H OCH2CH2CH2CH2CH3, CHCH3), 0.83, 0.82 (2 x d, J = 7.9 Hz, 3H, OCH2CH2CH2CH2CH3) 13C-RMN (MeOD, 125 MHz) 8175.22, 174.91 (C=O, éster), 159.5 (C=O, base), 150.54 (C=O, base), 147.90, 147.88 (OC Ar), 141.75 (d, 1Jc-f = 225 Hz, CF, base), 136.37 (CAr), 128.95, 127.90, 127.56, 126.55, 126.19 (CH-Ar), 125.64, 125.53 (2 x d, 2Jc-f = 34.0 Hz, CH-base), 122.65 (CH-Ar), 116.51, 116.21 (CH-Ar), 87.03, 86.96 (C-1'), 86.85, 86.74 (C-4'), 72.16, 72.05 (C-3'), 67.87 (d, 2Jc-p = 5.0 Hz, C-5'), 66.54 (OCH2), 51.87, 51.81 (d, 2Jc-p = 7.5 Hz, CHCH3), 40.87, 40.80 (C-2'), 29.35, 29.10 (CH2 éster), 23.33 (CH2 éster), 20.60, 20.43 (2 x d, 3Jc-p = 6.5 Hz, CHCH3), 14.28 (CH3, éster).
MS (ES+) m/e: 616 (MNa+, 100 %), 594 (MH+, 10 %) Masa exacta: C27H33FN3O9P requirió 593.54.
HPLCb (H2O/Acetonitrilo de 100/0 a 0/100 en 35 min) TA 15.56 min.
5-Fluoro-2'-desoxiuridina-5'-0-[1-naftil-(ciclopentoxi-L-alaninil)] fosfato (CPF582)
Se preparó de acuerdo con el procedimiento estándar E a partir de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (0.25 g, 1.01 mmol), fBuMgCl (1.1 mL, 1.1 mmol) y 1-naftil-(ciclopentoxi-L-alaninil)-fosfocloridato (0.77 g, 2.03 mmol) en THF (10 mL). La purificación en columna dio el producto como un sólido blanco (0.030 g, 5 %).
31P-RMN (MeOD, 202 MHz) 84.53, 4.37
19F-RMN (MeOD, 470 MHz) 8 - 167.07, - 167.19
1H-RMN (MeOD, 500 MHz) 88.18 - 8.16 (m, 1H, H-Ar), 7.89-7.85 (m, 1H, H-Ar), 7.70 (t aparente, J = 6.50 Hz, 2H, H-Ar), 7.57 - 7.50 (m, 3H, 2 x H-Ar, H-base), 7.45-7.40 (m, 1H, H-Ar), 6.16-6.11 (m, 1H, H-1'), 5.15-5.09 (m, 1H, OCH éster), 4.41 - 4.30 (m, 3H, 2 x H-5', H-3'), 4.11 - 4.08 (m, 1H, H-4'), 4.04-3. 98 (m, 1H, CHCH3), 2.19-2.10(m , 1H, H-2'), 1.86 1.73 (m, 3H, OCHCH2 éster), 1.73 - 1.56 (m, 6H, H-2', CH2 éster), 1.35, 1.34 (2 x d, J = 6.57 Hz, CHCH3)
13C-RMN (MeOD, 125 MHz) 8 174.68, 174.64 (C=O, éster), 159.27 (C=O, base), 150.51 (C=O, base), 147.86 (d, 2Jc-p = 7.5 Hz, OC-Ar), 141.78, 141.72 (2 x d, 1Jc-f = 232 Hz, CF-base), 136.30 (C-Ar), 128.95, 128.54, 127.94, 127.80, 127.60, 127.56, 127.17, 126.80, 126.54, 126.19, 126.16 (CH-Ar), 125.66, 125.53 (2 x d, 2Jc-f = 34 Hz, CH-base), 122.65, 122.61 (CH-Ar), 116.53, 116.22 (2 x d, 4Jc-p = 3.75 Hz, CH-Ar), 86.99, 86.96 (C-1'), 86.70 (d, 3Jc-p = 7.50 Hz, C-4'), 79.64, 79.61 (OCH éster), 72.21, 72.07 (C-3'), 67.89, 67.85 (2 x d, 2Jc-p = 5.0 Hz, C-5'), 51.92 (d, 2Jc-p = 5.0 Hz, CHCH3), 40.92, 40.86 (C-2'), 33.65, 33.61, 33.52, 33.47 (2 x CH2 éster), 24.68, 24.66 (CH2 éster), 20.45, 20.30 (2 x d, 3Jc-p = 6.25 Hz, CHCH3).
MS (ES+) m/e: 614 (MNa+, 100 %), 592 (MH+, 30 %) Masa exacta: C27H31FN3O9P requirió 591.52
HPLCb (H2O/Acetonitrilo de 100/0 a 0/100 en 35 min) TA 14.03 min.
5-Fluoro-2'desox¡ur¡dina-5'-0-[1-naft¡l(2-¡ndanox¡-L-alan¡n¡l)]fosfato (CPF597)
Se preparó de acuerdo con el procedimiento estándar E a partir de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (0.30 g, 1.22 mmol), fBuMgCl (1.34 mL, 1.34 mmol) y 1-naftil-(2-indanoxi-L-alaninil)-fosfocloridato (1.06 g, 2.43 mmol) en THF (20 mL). La purificación en columna dio el producto como un sólido blanco (0.045 g, 6 %).
31P-RMN (MeOD, 202 MHz) 64.62, 4.30
19F-RMN (MeOD, 470 MHz) 6 - 167.14, - 167.34
1H-RMN (MeOD, 500 MHz) 68.15 - 8.12 (m, 1H, H-Ar, Naph), 7.89 - 7.87 (m, 1H, H-Ar, Naph), 7.72- 7.67 (m, 2H, H-Ar, Naph), 7.56-7.46 (m, 3H, 2 x H-Ar, H-base), 7.40 - 7.37 (m, 1H, H-Ar), 7.20-7.12 (m, 4H, H-Ar, Ph), 6.14-6.08 (m, 1H, H-1'), 5.49-5.46 (m, 1H, OCH éster), 4.32-4.26 (m, 3H, 2 x H-5', H-3'), 4.04-3.98 (m, 1H, H-4', CHCH3), 3.30-3.24 (m, 2H, 2 x CH éster), 2.99-2.91 (m, 2H, 2 x CH éster), 2.14-2.07 (m, 1H, H-2'), 1.75 - 1.64 (m, 1H, H-2'), 1.33 - 1.29 (m, 3H, CHCH3)
13C-RMN (MeOD, 125 MHz) 6 175.02, 174.66 (2 x d, 3Jc-p = 3.75 Hz, C=O, éster), 159.48 (2Jc-f = 25.0 Hz, C=O, base), 150.57 (C=O, base), 147.97, 147.80 (2 x d, 2Jc-p = 7.5 Hz, OC-Ar), 141.73, 141.68 (2 x d, 1Jc-f = 232.5 Hz, CF-base), 141.54 , 141.49, 141.48, 139.10, 136.27, 136.26 (C-Ar), 129.01, 128.94, 128.91, 127.91, 127.87, 128.85, 127.80, 127.77, 127.60, 127.57, 127.50, 126.20, 126.18, 125.69 (CH-Ar), 125.50, 125.43 (2 xd , 2Jc-f = 25 Hz, CH-base), 122.64, 122.60, 121.85 (CH-Ar), 116.57, 116.26 (2 x d, 4Jc-p = 2.5 Hz, CH-Ar), 86.96 (C-1'), 86.87, 86.66 (2 x d, 3Jc-p = 7.50 Hz, C-4'), 77.85, 79. (OCH éster), 72.21, 72.07 (C-3'), 67.77, 67.75 (2 x d, 2Jc-p = 6.25 Hz, C-5'), 51.97, 51.82 (CHCH3), 40.91, 40.86 (C-2'), 40.44, 40.43, 40.38, 40.34 (2 x CH2 éster), 20.30, 20.16 (2 x d, 3Jc-p = 6.25 Hz, CHCH3)
5-Fluoro-2'-desoxiuridina-5'-0-[fenil(benzoxi-L-metioninil)]fosfato (CPF586)
Se preparó de acuerdo con el procedimiento estándar D a partir de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (0.25 g, 1.01 mmol), NMI (0.41 g, 5.07 mmol, 0.40 mL) y fenil(benzoxi-L-metioninil)-fosfocloridato (0.7 g, mmol) en THF (10 mL). La purificación en columna dio el producto como un sólido amarillento (0.014 g, 2 %).
31P-RMN (MeOD, 202 MHz) 64.34, 3.94
19F-RMN (MeOD, 470 MHz) 6 - 167.40, - 167.69
1H-RMN (MeOD, 500 MHz) 67.83 - 7.80 (m, 1H, H-Ar), 7.74 - 7.72 (m, 1H, H-Ar), 7.64 - 7.62 (m, 1H, H-Ar), 7.37 - 7.32 (m, 6H, H-Ar, H-base), 7.26 - 7.17 (m, 2H, H-Ar), 6.25 - 6.17 (m, 1H, H-1'), 5.18, 5.13 (sistema AB, Jab = 12.0 Hz, 2H, CH2Ph), 4.40 - 4.35 (m, 1H, H-3'), 4.32 - 4.22 (m, 2H, H-5'), 4.16 - 4.03 (m, 2H, NHCH, H-4'), 2.44, 2.36 (2 x t, J = 7.50 Hz, CH2S), 2.16-2.08 (m, 1H, 1 x H-2'), 1.98- 1.82 (m, 6H, 1 x H-2', NHCHCH2CH2SCH3),
MS (ES+) m/e: 646 (MNa+, 100 %), 624 (MH+, 10 %) Masa exacta: C27H31FN3O9P requirió 623.56
5-Fluoro-2'desoxiuridina-5'-0-[1-naftil(benzoxi-L-fenilalaninil)]fosfato (CPF587)
Se preparó de acuerdo con el procedimiento estándar D a partir de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (0.25 g, 1.01 mmol), NMI (0.41 g, 5.07 mmol, 0.40 mL) y 1-naftil(benzoxi-L-fenilalaninil)-fosfodoridato (1.45 g, mmol) en THF (10 mL). La purificación en columna dio el producto como un sólido blanco (0.007 g, 1 %).
31P-RMN (MeOD, 202 MHz) 84.27, 4.14
19F-RMN (MeOD, 470 MHz) 8 - 166.99, - 167.18
1H-RMN (MeOD, 500MHz)88.11 -8.00(m , 1H, H-Ar, Ar), 7.89-7.85(m , 1H, H-Ar), 7.69-7.67 (m, 1H, H-Ar), 7.60-7.49 (m, 3H, 2 x H-Ar, H-base), 7.37- 7.33 (m, 2H, H-Ar), 7.25-7.12 (m, 10H, H-Ar), 6.09-6.04 (m, 1H, H-1'), 5.11 - 5.01 (m, 2H, CH2Ph), 4.29 - 4.18 (m, 1H, CHCH3), 4.15 - 4.08 (m, 1H, H-3'), 4.02 - 3.95 (m, 2H, H-5'), 3.86 - 3.67 (m, 1H, H-4'), 3.14 - 3.10 (m, 1H, 1 x NHCHCH2Ph), 2.91 -2.82(m , 1H, 1 xNHCHCH2Ph), 2.12-2.06, 2.00- 1.95 (2 x m, 1H, H-2'), 1.68 - 1.62, 1.42- 1.36 (2 x m, 1H, H-2')
5-Fluoro-2'desox¡ur¡d¡na-5'-0-[1-naft¡l(2,2-dimet¡lpropox¡-L-alan¡n¡l)]fosfato (CPF588)
Se preparó de acuerdo con el procedimiento estándar D a partir de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (0.25 g, 1.01 mmol), NMI (0.41 g, 5.07 mmol, 0.40 mL) y 1-naftil-(2,2-dimetilpropoxi-L-alaninil)-fosfocloridato (0.77, mmol) en THF (10 mL). La purificación en columna dio el producto como un sólido blanco (0.006 g, 1 %).
31P-RMN (MeOD, 202 MHz) 84.56, 4.33
19F-RMN (MeOD, 470 MHz) 8 - 167.32, - 167.43
1H-RMN (MeOD, 500 MHz) 88.19 - 8.16 (m, 1H, H-Ar, Ar), 7.91 -7.89(m , 1H, H-Ar), 7.74-7.71 (m, 2H, H-Ar), 7.57-7.51 (m, 3H, 2 x H-Ar, H-base), 7.46-7.41 (m, 1H, H-Ar), 6.17-6.10 (m, 1H, H-1'), 4.42-4.30 (m, 3H, H-3', 2 x H-5'), 4.13 4.07 (m, 2H, H-4', CHCH3), 3.86, 3.75 (sistema AB, Jab = 10.50 Hz, 2H, CH2C(CH3)3), 2.18-2.10 (m, 1H, H-2'), 1.81 -1.70 (m, 1H, H-2'), 1.41 -1.38 (m, 3H, CHCH3), 0.95, 0.94 (2 x s, 9H, CH2C(CH3)3)
Se preparó de acuerdo con el procedimiento estándar D a partir de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (0.25 g, 1.01 mmol), NMI (0.41 g, 5.07 mmol, 0.40 mL) y 1-naftil-(butoxi-L-alaninil)-fosfocloridato (0.75 g, mmol) en THF (10 mL). La purificación en columna dio el producto como un sólido blanco (0.006 g, 1%).
31P-RMN (MeOD, 202 MHz) 84.52, 4.35
19F-RMN (MeOD, 470 MHz) 8 - 167.36, - 167.49
1H-RMN (MeOD, 500 MHz) 88.19 - 8.16 (m, 1H, H-Ar, Naph), 7.1 - 7.89 (m, 1H, H-Ar, Naph), 7.75 - 7.72 (m, 2H, H-Ar, Naph), 7.58-7.51 (m, 3H, 2 x H-Ar, H-base), 7.46-7.41 (m, 1H, H-Ar), 6.18-6.11 (m, 1H, H-1'), 4.42-4.40 (m, 1H, 1 x H-5'), 4.37 - 4.32 (m, 2H, 1 x H-5', H-3'), 4.12 - 4.01 (m, 4H, H-4', CHCH3, OCH2 CH2CH2CH3), 2.20 - 2.12 (m, 1H, H-2'), 1.85 - 1.73 (m, 1H, H-2'), 1.61 - 1.54 (m, 2H, OCH2CH2CH2CH3), 1.39 - 1.31 (m, 5H, OCH2CH2CH2CH3, CHCH3), 0.93 -0.89 (m, 3H, OCH2CH2CH2CH3)
Ensayos biológicos
Los datos experimentales que tienen que ver con los compuestos adecuados para las formulaciones de la presente invención se describen más abajo.
Cultivo de células
Las células L1210/0 de leucemia de murino y CEM/0 de linfocitos T humanos se obtuvieron de la Colección Americana de Tipos de Cultivos (ATCC) (Rockville, MD). Las células humanas de glioblastoma U87 fueron amablemente proporcionadas por el Dr. E. Menue (Institut Pasteur, París, Francia). Las células deficientes en timidina quinasa CEM/TK-fueron un amable obsequio del Prof. S. Eriksson (actualmente en la Universidad de Uppsala, Uppsala, Suecia) y del Prof. A. Karlsson (Instituto Karolinska, Estocolmo, Suecia). Las L1210/TK- deficientes en timidina quinasa se derivaron a partir de células L1210/0 después de la selección para la resistencia contra 5-bromo-2'-dUrd (Balzarini y otros, 1982). La infección de líneas celulares relevantes con Mycoplasma hyorhinis (ATCC) resultó en líneas celulares infectadas crónicamente más conocidas como L1210.Hyor y U87.Hyor. Todas las células se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, c A) con suero bovino fetal al 10 % (FBS) (Biochrom AG, Berlín, Alemania), Hepes 10 mM y 1 mM de piruvato de sodio (Invitrogen). Las células se cultivaron a 37 °C en una incubadora humidificada con una fase gaseosa de 5 % de CO2.
Ensayos citostáticos
Ensayos citostáticos Las células monocapas (U87 y U87.Hyor) se sembraron en placas de microvaloración de 48 pocillos (Nunc™, Roskilde, Dinamarca) a 10,000 células/pocillo. Después de 24 horas, se añadió un volumen igual de medio nuevo que contenía los compuestos de ensayo. El día 5, las células se digirieron con tripsina y se contaron en un contador Coulter (Analis, Suarlée, Bélgica). Las células en suspensión (L1210/0, L1210/TK-, L1210.Hyor, CEM/0, CEM/TK’) se sembraron en placas de microvaloración de 96 pocillos (Nunc™) a 60,000 células/pocillo en presencia de una cantidad dada de los compuestos de prueba. Las células se dejaron proliferar durante 48 h (L1210) o 72 horas (CEM) y después se contaron en un contador Coulter. La concentración inhibitoria de 50 % (IC50) se definió como la concentración de compuesto requerida para reducir el número de células viables en un 50 %.
Ensayo 1. Las muestras se ensayaron para determinar la actividad biológica frente a una gama de líneas celulares tumorales con los datos registrados en la Tabla 1 más abajo. Los datos se expresan como CC50 en pM, es decir, concentración citostática requerida para inhibir la proliferación celular en un 50 %. Las líneas celulares empleadas fueron L1210/0 (una línea celular de leucemia), FM3A/0 (una línea celular de cáncer de mama), Cem/0 (una línea celular de leucemia linfoblástica aguda) y HeLa (una línea celular de cuello uterino).
La Tabla 1 contiene además datos comparativos para 5FU, 5-FdUrd y los compuestos de referencia CPF 382, CPF 437 y CPF 438. La estructura de CPF 382 se proporciona más arriba. La estructura de cada uno de CPF 437 y CPF 438 es la siguiente:
Como puede verse a partir de los datos en la Tabla 1, los compuestos en las formulaciones de la presente invención pueden exhibir una actividad citostática que es comparable con o mejor que la del 5FU, mientras que exhiben una actividad
citostática marcada en células deficientes en nucleósido quinasas. Dicha actividad citostática en células deficientes en nucleótidos quinasas está en contraste directo con la de 5-FdUrd.
Como puede verse además a partir de la Tabla 1, la actividad en células TK- de los compuestos en las formulaciones de la presente invención puede ser marcadamente mayor que la de los compuestos de referencia CPF 382, CPF 437 y CPF 438.
Tabla 1
Ensayo 2. Las muestras se ensayaron además para determinar su % de retención de actividad en células infectadas con micoplasmas. Los resultados se exponen en la Tabla 2 más abajo. Los resultados muestran que los compuestos en las formulaciones de la presente invención pueden retener una alta actividad en células infectadas con micoplasmas, en contraste con la actividad mostrada por 5-FdURD. La administración de un inhibidor de timidina fosforilasa (TP) restaura la actividad citostática de 5-FdUrd en cultivos de células infectadas con micoplasmas, lo que proporciona evidencia de la función deteriorante de TP en la actividad citostática final de 5-FdUrd. Como se sabe que la infección de las células por micoplasmas reduce en gran medida la actividad de los nucleósidos, que incluye 5-FdUrd, la actividad de algunos nucleósidos en las células infectadas por micoplasmas proporciona un beneficio potencial en pacientes que se infectan por micoplasmas.
Tabla 2.
Se llevaron a cabo otros experimentos (Ensayos 3 a 8 más abajo) con respecto al compuesto CPF 373.
Ensayo 3. Actividad citostática de 5-FdUrd y su derivado CPF-373 contra las líneas celulares tumorales competentes para TK y deficientes en TK
La actividad citostática de 5-FdUrd y CPF-373 se determinó en diferentes líneas celulares tumorales que expresan TK y deficientes en TK. Como se muestra en la Tabla 3, 5-FdUrd depende fuertemente de la expresión de t K para su actividad citostática. Su IC50 aumentó en 4,000 veces para células L1210/TK-(IC50: 3.1 j M) versus células de tipo silvestre L1210/0 (IC50: 0.0008 j M) y en 50 veces para células CEM/TK- (IC50: 1.5 j M) versus células CEM/0 (IC50: 0.028 j M). Por el contrario, la actividad citostática del derivado CPF-373 de 5-FdUrd permaneció prácticamente sin cambios en las células deficientes en TK en comparación con las células de tipo silvestre (IC50: 0.027 y 0.011 j M para células L1210/TK y L1210/0, y 0.32 y 0.089 j M para CEM/TK y CEM/0, respectivamente). Aunque la actividad citostática de CPF-373 fue de 3 a 10 veces inferior a la de 5-FdUrd contra las células de tipo silvestre L1210/0 y CEM/0, resultó 5 a 100 veces superior a la de 5-FdUrd en líneas celulares tumorales deficientes en TK (ver Tabla 3).
Tabla 3. Actividad citostática de 5-FdUrd CPF-373 re resentada or el valor IC50 en diferentes líneas celulares
Ensayo 4. Efecto de la infección por micoplasmas de cultivos de células tumorales sobre la actividad citostática de 5-FdUrd y su derivado CPF-373
Los cultivos de células L1210/0 se infectaron con la especie de micoplasma M. hyorhinis (células designadas: L1210.Hyor). 5-FdUrd perdió notablemente su actividad citostática contra las células L1210.Hyor infectadas con micoplasma en 300 veces (IC50: 0.24 |jM). Además, 5-FdUrd perdió su actividad citostática en 400 veces en cultivos de células U87.Hyoren comparación con células U87 no infectadas (ver Tabla 3). En marcado contraste, el derivado CPF-373 de 5-FdUrd mantuvo un potencial citostático similar tanto en cultivos de células L1210/0 como L1210.Hyor (IC50: 0.011 y 0.025 j M, respectivamente). Se realizó una observación similar para este compuesto cuando se evaluó su actividad citostática en cultivos de células U87 y U87.Hyor (IC50: 0.035 y 0.039 j M, respectivamente). Así, mientras que el nucleósido libre 5-FdUrd perdió notablemente su potencial citostático contra líneas celulares tumorales infectadas con Mycoplasma hyorhinis, el potencial antiproliferativo de su derivado CPF-373 fue independiente de la infección por micoplasma.
Ensayo 5. Los experimentos se llevaron a cabo para evaluar la estabilidad de CPF 373 en presencia de Timidina Fosforilasa (TP). Los experimentos se ilustran con referencia a las Figuras 9 a 11, cada una de las cuales comprende espectros de RMN, como se describe más abajo. El presente ensayo muestra que la insensibilidad de los compuestos en las formulaciones de la presente invención a la acción de la enzima catabólica TP, que frecuentemente se regula por aumento en tumores, hace que los compuestos sean más independientes de la enzima catabólica TP que 5-FdUrd.
Ensayo de fosforilasa en 5-FdUrd y su compuesto ProTide CPF 373 por timidina fosforilasa (TP) purificada de Escherichia Coli.
El nucleósido 5-FdUrd puede degradarse a su base relativa 5FU mediante una reacción fosforolítica, mediante el uso de timidina fosforilasa purificada de Escherichia coli así como también uridina fosforilasa purificada a partir de tumor de ascitis de Ehrlich. Se ha sugerido que esta degradación es una de las razones de la efectividad terapéutica limitada de 5-FdUrd de acuerdo con el siguiente esquema:
El ensayo de la fosforilasa se llevó a cabo hacia la fosforólisis mediante Timidina Fosforilasa purificada de Escherichia coli mediante el uso de 19F RMN in situ. La aplicación al compuesto ProTide CPF 373 fue un intento de evitar la escisión de la estructura y así eludir la acción de la enzima.
Se usaron dos tampones de fosfato de potasio a pH = 7.4, solución 200 nM y solución 300 nM respectivamente, como donador de fosfato. Las unidades de enzima se definieron como la cantidad de enzima requerida para hidrolizar aproximadamente 0.25 mg de inosina por minuto usada como estándar. Los ensayos se llevaron a cabo durante 30 minutos.
Ensayo de fosforilasa en 5-FdUrd
Inicialmente, se registraron los espectros de 19F RMN (470 MHz) de 5-FdUrd y 5FU previamente disueltos en metanol deuterado. 5-FdUrd mostró un singulete a ~ 8-167.21 ppm y 5FU a ~ 8-169.30 ppm. Así, el ensayo de fosforilasa se llevó a cabo mediante disolución de 5-FdUrd en metanol deuterado, en presencia de tampón de fosfato de potasio (solución 200 nM, pH = 7.4), lo que registró el blanco antes de la adición de la enzima timidina fosforilasa (TP) (20.7 UNI).Losespectros de19F RMN, registrados a 25 °C, mostraron el singulete de 5-FdUrd a ~ 8-165.17 ppm y un nuevo pico a ~ 8-169.50ppm, atribuido a 5FU, como se muestra en la Figura 9 en el espectro A.
Después, para probar la escisión del nucleósido en la base relativa, se realizó un nuevo experimento mediante disolución de iguales moles del análogo de nucleósido 5-FdUrd y la base relativa 5FU, en la misma condición descrita anteriormente sin la enzima TS, como se muestra en la Figura 9 en el espectro B. Este espectro mostró dos singuletes con los mismos desplazamientos químicos previamente observados en el espectro A en la Figura 9. Estos datos confirmaron que 5FU
tiene un desplazamiento químico a ~ 8-169.50 ppm y así, la acción fosforolítica de la enzima (TP). La conversión del nucleósido 5-FdURd en la base libre 5FU fue de 66 %.
Cuando la concentración inicial de tampón de fosfato de potasio se incrementó desde 200 nM hasta 205 nM, el sustrato 5-FdUrd se convirtió completamente en la base 5FU como se muestra en la Figura 10.
Ensayo de fosforilasa en el compuesto ProTide CPF 373
El ensayo de fosforilasa se aplicó al derivado de fenil benzil L-alanina CPF 373 para investigar la estabilidad, con el procedimiento y las condiciones descritas anteriormente. El compuesto ProTide CPF 373 demostró ser completamente estable como se muestra al comparar los desplazamientos químicos de la muestra analizada sin la enzima TP, como se muestra en el espectro A de la Figura 11, y en presencia de TP, como se muestra en el espectro B de la Figura 11. Se repitió la 19F RMN después de 4 días y se demostró una vez más que el compuesto ProTide CPF 373 era estable.
Estos experimentos confirmaron que el nucleósido 5-FdUrd se degrada rápidamente en su base relativa 5FU por una reacción fosforolítica, en presencia de timidina fosforilasa, con una vida media de menos de 30 minutos, mientras que el compuesto profármaco CPF 373 mostró una estabilidad evidente contra la actividad enzimática de TP, a mayor tiempo de exposición hasta 3 días. Este importante resultado mostró que los derivados de ProTides 5-FdUrd podrían favorecer el efecto terapéutico de 5-FdUrd.
Ensayo 6. Exposición de 5-FdUrd y CPF-373 a TP codificada de E. coliy TP codificada de humano y a UP
La especificidad del sustrato de timidina fosforilasa hacia timidina natural (dThd), uridina (Urd), 5-FdUrd y CPF-373 se investigó mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Se incubaron a temperatura ambiente mezclas de reacción que contienen 100 M de compuesto de prueba y TP o UP recombinante (TP humana: 8.6 ng/pL; E. coli TP: 3.0 ng/pL; UP humana: 4 ng/mL) en volumen total de 500 pL de tampón de reacción (10 mM TrisHCl; 300 pM NaCl; 1 mM EDTA; 2 mM KH2PO4/K2HPO4). En diferentes puntos de tiempo (es decir, 0, 20, 40 min), se retiraron alícuotas de 100 pL de las mezclas de reacción y se calentaron a 95 °C durante 3 min para inactivar la enzima. Los productos de reacción resultantes se separaron en una columna RP-8 de fase inversa (Merck, Darmstadt, Alemania) y se cuantificaron por análisis de HPLC (Alliance 2690, Waters, Milford, MA). La separación de dThd de la timina se realizó mediante un gradiente lineal de 98 % de tampón de separación (50 mM NaH2PO4 y 5 mM de ácido heptano sulfónico, pH 3.2) y 2 % acetonitrilo, hasta 20 % de tampón de separación 80 % de acetonitrilo (8 min 98 % de tampón de separación 2 % de acetonitrilo; 5 min gradiente lineal de 98 % tampón de separación 2 % acetonitrilo hasta 20 % de tampón de separación 80 % de acetonitrilo; 10 min 20 % de tampón de separación 80 % de acetonitrilo, seguido de equilibrio en 98% de tampón de separación 2 % de acetonitrilo). La detección basada en radiación UV se realizó a 267 nm. La separación de Urd del uracilo se realizó mediante un gradiente lineal desde 100 % de tampón de separación (ver más arriba) hasta 60 % de tampón de separación 40 % de acetonitrilo (3 min 100 % de tampón de separación; 6 min de gradiente lineal de 100 % de tampón de separación hasta 60 % de tampón de separación 40% de acetonitrilo; 6 min 60 % de tampón de separación 40% de acetonitrilo, seguido de equilibrio en 100 % de tampón de separación). La detección basada en radiación UV se realizó a 258 nm.
Fosforolisis de 5-FdUrd y CPF-373 mediante timidina y uridina fosforilasas
5-FdUrd y CPF-373 se expusieron a timidina fosforilasa purificada derivada de E.coli o de eritrocitos humanos, y a uridina fosforilasa purificada derivada de tumores humanos. Mientras que TP de E.coli y humana convirtieron rápidamente dThd y 5-FdUrd en sus bases libres, CPF-373 se mantuvo completamente estable en presencia de estas enzimas (Figura 2). En condiciones experimentales similares, uridina se convirtió en uracilo mediante UP humana, pero no por TP de E.coli TP, o TP humana. Cuando ambos compuestos se expusieron a UP, dThd y CPF-373 no se afectaron por la enzima, mientras que 5-FdUrd se hidrolizó ligeramente (Figura 2, panel C).
Ensayo 7. Mediciones de la actividad de la timidilato sintasa (TS)
La actividad de TS en células intactas L1210/0 y L1210/TK- se midió mediante la evaluación de la liberación de tritio a partir de [5-3H]dUMP (formado en las células a partir de [5-3H]dUrd o [5-3H]dCyd) en la reacción catalizada por TS. Este método ha sido descrito en detalle por Balzarini & De Clercq (1984). Brevemente, se prepararon cultivos celulares (500 pL de medio de cultivo DMEM) que contenían ~ 3 x 106 células L1210 y cantidades apropiadas de los compuestos de prueba (5-FdUrd y CPF-373). Después de 30 min, 2 h y 4 h de preincubación de las células con los compuestos a 37 °C, se añadió 1 pCi de [5-3H]dUrd o [5-3H]dCyd a los cultivos celulares. Después de 30 minutos de incubación, se extrajeron 100 pL de las suspensiones celulares y se añadieron a una suspensión fría de 500 pL de carbón activado (VWR, Haasrode, Bélgica) (100 mg/mL en 5% de TCA). Después de 10 minutos, la suspensión se centrifugó a 13,000 rpm durante 10 minutos, después de lo cual se contó la radiactividad en 400 pL del sobrenadante en un sinctillador líquido mediante el uso de OptiPhase HiSafe (Perkin Elmer, Waldham, MA).
Inhibición de timidilato sintasa (TS) por 5-FdUrd y CPF-373
El objetivo principal para la actividad citostática de 5-FdUrd es la timidilato sintasa (TS). La actividad de TS en células tumorales intactas puede monitorearse directamente mediante medición de la liberación de tritio en cultivos de células L1210/0 intactas que se expusieron a [5-3H]desoxiuridina ([5-3H]dUrd) o [5-3H]desoxicitidina ([5-3H]dCyd). De hecho, después de la conversión intracelular de [5-3H]dUrd o [5-3H]dCyd en [5-3H]dUMP, el átomo de tritio C-5 en la base de pirimidina se libera durante la metilación reductora catalizada por TS. La capacidad de 5-FdUrd y su derivado CPF-373 para inhibir la liberación de tritio a partir de [5-3H]dUrd y [5-3H]dCyd se evaluó por lo tanto en cultivos de células L1210/0 en una variedad de concentraciones de compuestos. 5-FdUrd resultó ser un potente inhibidor de TS in situ. Su IC50 para la liberación de tritio a partir de [5-3H]dCyd y [5-3H]dUrd fue alrededor de 0.0007 - 0.0009 pM (ver Tabla 4).
Tabla 4. Valores de IC50 values de 5-FdUrd y CPF-373 contra TS en células tumorales intactas L1210/0 (según se determina por la liberación de tritio a partir de [5-3H]dUrd y [5-3H]dCyd después de 30 minutos de exposición a los fármacos).
La actividad inhibidora de CPF-373 en la liberación de tritio fue mucho menos pronunciada (~ 200 veces) que la de 5-FdUrd, especialmente después de solo 30 min de preincubación de las células con los fármacos (IC50: 0.16-0.19 pM). Sin embargo, los tiempos de preincubación más largos de las células (hasta 4 horas) con 5-FdUrd y CPF-373 antes de medir la actividad de TS en las células tumorales intactas revelaron una actividad inhibidora mucho más pronunciada del profármaco contra TS in situ (Figura 3). De hecho, mientras que la inhibición de la liberación de 3H aumentó solamente 2 veces después de tiempos de preincubación más largos de 5-FdUrd, el potencial inhibidor de CPF-373 aumentó 10 veces (Figura 3, paneles A y B, y C y D).
La preincubación de las células tumorales con 5-FdUrd y CPF-373 durante al menos 4 horas resulta en la inhibición de TS en las células tumorales intactas a concentraciones del fármaco que son muy comparables con las concentraciones de actividad citostática del 50 % de estos fármacos.
Las presentes observaciones indican así que el derivado de 5-FdUrd necesita varias etapas de conversión metabólica antes de alcanzar a TS como la enzima objetivo para la inhibición, y respaldan la opinión de que CPF-373 actúa como un derivado eficiente de 5-FdUrd para ejercer su actividad citostática final.
La actividad de TS en presencia de 5-FdUrd y CPF-373 se midió además en células L1210/TK- intactas mediante el uso de [5-3H]dCyd como un sustrato suministrado externamente (debido a la deficiencia de TK, [5-3H]dUrd no puede usarse). Como se demuestra en la Tabla 5 y la Figura 3 (paneles E y F), la concentración de 5-FdUrd requerida para provocar una inhibición de 50 % de TS disminuyó en un factor de 5,700 en células deficientes en TK L1210/TK- (IC50: 1.4 pM) en comparación con células de tipo silvestre L1210/0 (IC50: 0.0003 pM). Por el contrario, la actividad inhibidora de CPF-373 frente a TS permaneció prácticamente inalterada en células L1210/TK-(IC50: 0.053 pM en células L1210/TK- versus0.013 pM en células L1210/0).
Tabla 5. Valores de IC50 de 5-FdUrd y CPF-373 contra TS en células intactas L1210/0 y L1210/TK-(según se determina or la liberación de tritio a artir de [5-3H]dC d des ués de 4 horas de reincubación con los roductos
Ensayo 8. Ensayos de estabilidad
Ensayo de carboxipeptidasa Y (EC 3.4.16.1)
La estabilidad enzimática de CPF-373 hacia la carboxipeptidasa Y se estudió mediante el uso de 31P RMN in situ (202 MHz). El experimento se llevó a cabo mediante disolución de CPF-373 (3.0 mg) en d6-acetona (150 j L) y adición de tampón TRlZMA pH 7.6 (300 j L). La solución resultante se colocó en un tubo de RMN y se registró un experimento de 31P-RMN a 25 °C como experimento en blanco. La enzima Carboxipeptidasa Y (0.2 mg) se solubilizó en TRIZMA (150 j L) y se añadió a la solución del derivado de fosforamidato en el tubo de RMN. A continuación, el tubo se colocó en la máquina de RMN, que se configuró para realizar un experimento de 31P-RMN experiment (64 exploraciones) cada 4 minutos durante 14 horas a 25 °C. Los datos se procesaron y se analizaron con el programa Bruker Topspin 2.1. La carboxipeptidasa Y y el tampón TRIZMA se adquirieron de Sigma-Aldrich.
Suero humano
La estabilidad de CPF-373 en presencia de suero humano se estudió mediante el uso de 31P NMR in situ (202 MHz). El ProTide CPF-373 (1) (5.0 mg) se disolvió en DMSO (0.05 mL) y D2O (0.15 mL). Después la muestra se transfirió a un tubo de RMN, que se insertó en la cámara de RMN a 37 °C (con suficiente disolvente para obtener una lectura de RMN de control del blanco). Después se añadió rápidamente 0.3 mL de suero humano a la muestra en el tubo de RMN. Los experimentos de RMN se programaron para registrar datos cada 15 minutos durante 12 horas y 30 minutos. Debido al exceso de ruido y los pobres perfiles radiantes (muy probablemente debido a los medios biológicos y la concentración), los espectros individuales se procesaron adicionalmente. Después del procesamiento de la transformada de Fourier normal, cada espectro se desconvolucionó (desconvolución de Lorentz-Gauss) para revelar únicamente la frecuencia y el área de los picos espectrales sin la línea base. Los datos registrados se procesaron y analizaron con el programa Bruker Topspin 2.1.
Tampón a pH 1
La estabilidad de CPF-373 en relación a la hidrólisis a pH = 1 se estudió mediante el uso de 31P RMN in situ (202 MHz). El ProTide CPF-373 (1) (2.6 mg) se disolvió en MeOD (0.1 mL) después de lo cual se añadió 0.5 mL de tampón (pH = 1) (preparado a partir de partes iguales de 0.2 M de HCl y 0.2 M de KCl). Después la muestra se transfirió a un tubo de RMN, y se realizó un experimento de31P RMN a 37 °C cuyos datos se registraron cada 12 minutos durante 14 horas. Los datos se procesaron y analizaron con el programa Bruker Topspin 2.1.
Tampón a pH 8
La estabilidad de CPF-373 en relación a la hidrólisis a pH = 8 se estudió mediante el uso de 31P RMN in situ (202 MHz). El ProTide CPF-373 (1) (4.9 mg) se disolvió en MeOD (0.1 mL) después de lo cual se añadió 0.5 mL de tampón (pH = 8) (preparado a partir de una solución de 0.1 M de Na2HPO4, que se ajustó con0.1 M de HCl). Después la muestra se transfirió a un tubo de RMN, y se realizó un experimento de31P RMN a 37 °C cuyos datos se registraron cada 12 minutos durante 14 horas. Los datos se procesaron y analizaron con el programa Bruker Topspin 2.1.
Estudios de estabilidad
Se han realizado estudios de estabilidad química en CPF-373 (1) mediante exposición del compuesto a suero humano y a tampones acuosos (pH 1.0 y 8.0) mediante el uso de 31P RMN in situ. Cada experimento se ha llevado a cabo mediante disolución de ProTide en el disolvente deuterado adecuado y análisis de las muestras a 37 °C durante aproximadamente 14 horas, mientras se adquieren escaneos en intervalos de tiempo regulares. Para una mejor resolución, se informan los espectros originales (gráficos inferiores) y desconvolucionados (gráficos superiores). El ensayo de estabilidad del fosforamidato de CPF-373 (1), después de la incubación en suero humano, mostró 73 % del compuesto sin cambios después de 12 horas y 30 minutos como se muestra en la Figura 6.
Los espectros mostraron un pico singulete inherente al suero humano a ~ 82.00 y el doble pico del elemento parental a ~ 84.50 que después de 4 horas y 15 minutos se hidrolizó al intermediario aminoacil fosforamidato que se muestra como un pico singlete a 87.20.
Cuando se evaluó la hidrólisis química en condiciones experimentales extremas, es decir, a pH 1.0 y pH 8.0 a 37 °C, se observó una estabilidad completa de CPF-373 (1) en condiciones de tampón tanto ácido como básico. Los espectros se registraron durante 14 horas al adquirir exploraciones cada 12 minutos a intervalos regulares como se muestra en las Figuras 7 y 8. El ProTide (1) examinado a pH 1.0 mostró picos de doblete constantes de diastereoisómeros a 84.35; 4.50 a lo largo del tiempo del ensayo (Figura 7).
Además, a pH 8.0 los espectros mostraron un pico persistente de (1) a 84.48 y un pico singulete a 82.55 correspondiente a un pico del tampón (Figura 8).
Metabolismo de Fosforamidatos de 5-FdUrd
Como se muestra en la Figura 4, el mecanismo supuesto de activación de los ProTides dentro de la célula, después de la captación, implica una primera etapa de activación enzimática mediada por una enzima de tipo carboxipeptidasa que hidroliza el éster de la porción de aminoacilo (etapa a) seguido de ciclación espontánea y posterior desplazamiento espontáneo del grupo arilo (etapa b) y apertura del anillo inestable mediado por agua (etapa c). La última etapa implica
una hidrólisis del enlace P-N mediado por una enzima de tipo fosforamidasa (etapa d) con liberación del nucleósido monofosfato en la célula intacta (Figura 4) (McGuigan y otros, 2009; Mehellou y otros, 2010).
Para demostrar el esquema metabólico propuesto para CPF-373 (1) y si el motivo éster del derivado de fosforamidato de 5-FdUrd se fragmenta o no, se llevó a cabo un experimento de incubación enzimática diseñado para imitar las primeras etapas de la supuesta activación en las células tumorales intactas. El compuesto (1) se incubó con carboxipeptidasa Y (conocida además como catepsina A) en tampón TRIZMA y la conversión de (1) se monitoreó mediante 31P RMN. Los espectros se registraron durante 14 h con la adquisición de exploraciones a intervalos periódicos cada 4 minutos como se muestra en la Figura 5. Para una mejor resolución, se muestran los espectros originales (gráficos inferiores) y desconvolucionados (gráficos superiores).
En la 31P RMN, CPF-373 (1) apareció como dos picos 84.07; 4.23 correspondiente con los dos diastereoisómeros señalados como originales con la duplicación característica del centro de fosfato quiral del fosforamidato. Después de la adición de catepsina A, el compuesto se hidrolizó rápidamente después de 4 minutos en los intermediarios 84.95; 5.16 que carecen del motivo éster y este intermediario no persistió ya que a su vez se metabolizó rápidamente en el intermediario de aminoacil fosforamidato, producto final en este ensayo, a través de la pérdida del grupo arilo (etapas a a c en la Figura 4). El intermediario apareció como un pico singulete a 86.85 debido al centro de fosfato aquiral. Así, los espectros de ensayo enzimático mostraron un metabolismo rápido del original- 84.00 con la conversión completa en el supuesto intermediario en 26 minutos, que además se mantuvo constantemente presente a lo largo de las 14 h del ensayo. La escisión del enlace P-N que libera el nucleósido monofosfato no se detectó en el experimento de la enzima, como se esperaba. Este experimento indica que la primera etapa de activación de ProTide CPF-373 (1) puede ser suficientemente eficiente y, por lo tanto, puede permitir el suministro final del metabolito de nucleósido monofosfato en las células tumorales intactas.
Conclusión
En conclusión, la presente invención proporciona formulaciones de novedosos derivados de nucleótido fosforamidato del análogo de nucleósido anticancerígeno 5-fluoro-2'-desoxiuridina (5-FdUrd), que se sintetizaron y evaluaron para determinar su actividad citostática. Mientras que 5-FdUrd perdió sustancialmente su potencial citostático en cultivos de células L1210 de leucemia de murino deficiente en timidina quinasa (TK) y de células CEM de linfocitos humanos, los compuestos en las formulaciones de la presente invención, por ejemplo CPF-373, mantuvieron marcadamente su actividad antiproliferativa tanto en células tumorales de tipo silvestre como las deficientes en TK y, así, son en gran parte independientes de la actividad de TK intracelular para ejercer su acción citostática. Se encontró que CPF-373, por ejemplo, inhibe la timidilato sintasa (TS) en las líneas celulares deficientes en TK y de tipo silvestre a concentraciones de fármaco que se correlacionan bien con su actividad citostática en estas células. El CPF-373 no parece ser susceptible a la inactivación por enzimas catabólicas como la timidina fosforilasa (TP) y la uridina fosforilasa (UP). Estos hallazgos están en línea con las observaciones de que 5-FdUrd, pero no CPF-373, pierde sustancialmente su potencial citostático en presencia de micoplasmas que expresan TP en los cultivos de células tumorales. Por lo tanto, los compuestos en las formulaciones de la presente invención son novedosos derivados de fosforamidato de 5-FdUrd que (i) pueden eludir los mecanismos de resistencia potenciales de las células tumorales (por ejemplo, disminución de la actividad de TK) y (ii) no se degradan por enzimas catabólicas tal como TP cuya actividad frecuentemente se regula por aumento en células tumorales o se expresa en tejido tumoral infectado con micoplasmas.
Las realizaciones de la presente invención, como se establece a continuación, se divulgan en, McGuigan, C. y otros J. Med. Chem. 2011, 547247-7258 (publicado el 5 de septiembre de 2011).
La Tabla 6 más abajo registra la actividad citostática de 5FU, 5-FdUrd, ejemplo de referencia CPF382 y compuestos en las formulaciones de la presente invención contra líneas celulares tumorales en términos de IC50 o la concentración del compuesto requerida para inhibir la proliferación de células tumorales en 50 %. Los datos son la media (±SD) de al menos dos a cuatro experimentos independientes. La Tabla 6 identifica el motivo fosforamidato del ejemplo de referencia CPF382 y de los compuestos en las formulaciones de la presente invención con respecto a: "arilo", que corresponde a Ar de fórmula I y es lo mismo fenilo (Ph) o 1-naftilo (Nap); "éster", que corresponde a R3 de Fórmula I; y "AA", que establece el aminoácido cuyo átomo de C alfa y sustituyentes en el átomo de C alfa corresponden a CR1R2 de Fórmula I. La Tabla 6 describe compuestos en las formulaciones de la presente invención no mencionados previamente en la Tabla 1, así como también datos adicionales para algunos de los compuestos mencionados en la Tabla 1.
La Tabla 7 mas abajo registra la actividad citostatica de 5-FdUrd, ejemplo de referencia CPF382 y compuestos en las formulaciones de la presente invención en cultivos de células L1210 de leucemia de murino (L1210/0) y cultivos de células L1210, infectados con Mycoplasma hyorhinis (L1210.Hyor) en términos de IC50 o la concentración del compuesto para inhibir la proliferación celular en 50 %. Los datos son la media (±SD) de al menos dos a cuatro experimentos independientes. La Tabla 7 identifica el motivo fosforamidato del ejemplo de referencia CPF382 y de los compuestos que encarnan los compuestos de la presente invención, como se discutió anteriormente con respecto a la Tabla 6 , pero con "Naph" que representa 1-naftilo. La Tabla 7 describe compuestos que encarnan los compuestos en las formulaciones de la presente invención no mencionados previamente en la Tabla 2, así como también datos adicionales para algunos de los compuestos mencionados en la Tabla 2.
Tabla 7.
La Tabla 8 más abajo registra la actividad citostática de 5-FdUrd y compuestos en las formulaciones de la presente invención en cultivos de células CEM que contienen (Cem/hEnt-1) o que carecen (Cem/hEnt-0) el transportador hEnt1 en términos de IC50 o concentración de compuesto requerida para inhibir la proliferación de células tumorales en 50 %. Los datos son la media (±SD) de al menos dos a cuatro experimentos independientes. La Tabla 8 identifica el motivo fosforamidato de dichos compuestos, como se discutió anteriormente con respecto a la Tabla 6, pero con "Naph" que representa 1-naftilo. Los datos de la Tabla 8 muestran que dichos compuestos son menos dependientes de la presencia del transportador hENT1, que 5-FdUrd, ya que pierden solamente actividad antiproliferativa de 7 a 15 veces contra las células CEM deficientes en hENT1. Estas observaciones concuerdan con una actividad citostática solo disminuida de 2 a 7 veces de dichos compuestos en presencia de inhibidores de transporte (es decir, dipiridamol y NBMPR), en comparación con una pérdida de actividad antiproliferativa de 20 a 60 veces de 5-FdUrd y FdUMP en condiciones experimentales similares.
Tabla 8.
Los estudios se realizaron en el compuesto CPF 381 de la siguiente manera:
Se llevó a cabo un ensayo de fosforilasa enzimática mediante el uso de timidina fosforilasa (TP, purificada de Escherichia coli) en presencia de tampón de fosfato de potasio (solución 300 nM, pH 7.4). El espectro de 19F RMN después de 5 min, 14 h y 72 h no mostró evidencia alguna de fosforolisis. Por el contrario de 5-FdUrd, CPF 381 es, en el mejor de los casos, un sustrato muy pobre, si existe, para la timidina fosforilasa.
Se evaluó una hidrólisis química en condiciones experimentales a pH 1 y pH 8 y se monitoreó mediante 31P RMN. Durante el ensayo (14 h) en condiciones ácidas (pH 1), solo se registraron dos picos que representaban los dos diastereoisómeros. La falta de formación de nuevas señales en el espectro 31P RMN indica que el compuesto CPF 381 es altamente estable en medio ácido. Se observó el mismo resultado cuando el compuesto CPF 381 se sometió al ensayo en condiciones básicas suaves (pH 8).
Los estudios se realizaron en el compuesto CPF 581 de la siguiente manera:
Se realizó un estudio enzimático mediante el uso de un ensayo de carboxipeptidasa Y en el que se disolvieron el compuesto CPF 581, carboxipeptidasa Y y tampón Trizma (pH 7.6) en acetona-cfe y se registraron los espectros de 31P RMN (202 MHz) a intervalos regulares (cada 7 min) más de 14 h. El compuesto CPF 581 se hidrolizó rápidamente en un primer metabolito carente de la porción éster (R3), ambos diastereoisómeros se procesaron a una velocidad aproximadamente similar. El procesamiento adicional del primer metabolito condujo a la formación de un segundo metabolito aniónico, carente de Ar, en aproximadamente 45 min con una vida media estimada de menos de 5 min. La velocidad de la etapa de activación inicial podría así considerarse en general como uno de los requisitos para una buena actividad biológica de los fosforamidatos. La hidrólisis química del compuesto CPF 373 en presencia de trietilamina y agua produjo la sal diamónica del segundo metabolito aniónico, que se añadió a la muestra de ensayo final derivada del compuesto CPF 373, es decir, que contenía solo el segundo metabolito enzimático derivado del compuesto CPF 581 en Trizma. La muestra tenía un espectro de 31P RMN que mostraba solo un único pico a Sp 6.85 ppm, lo que sustenta fuertemente esta parte de la ruta metabólica y la activación de los compuestos de fosforamidato en las formulaciones de de la presente invención.
Los estudios se realizaron en el compuesto CPF 386 de la siguiente manera:
La estabilidad del compuesto CPF 386 en presencia de suero humano se investigó mediante el uso de 31P RMN in situ. Se registraron datos de 31P RMN de control del compuesto CPF 386 en DMSO y D2O. La muestra de RMN se trató después con suero humano y se sometió inmediatamente a experimentos adicionales de 31P RMN a 37°C. Los datos de 31P RMN se registraron cada 15 minutos durante 14 h. Los espectros mostraron un único pico inherente al suero humano a ~5p 2.00 ppm y dos picos correspondientes al compuesto CPF 386 a ~5p 4.59 y 4.84 ppm. Después de aproximadamente 6 h y 45 min, el compuesto se hidrolizó parcialmente en un intermediario, carente de R3 (Et), como un único pico a Sp 5.79 ppm. Después de 11 h y 30 min, se observó la formación del segundo metabolito, carente de Ar (1-naftilo), que se muestra como pico único a Sp 7.09 ppm. Después de 13 hy 30 minutos, la mezcla de reacción contenía 96 % del compuesto original CPF 386 junto con el primer metabolito propuesto (3 %) y el segundo metabolito (1 %).
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Claims (15)
1. Una formulación farmacéutica adecuada para administración intravenosa, comprendiendo dicha formulación un compuesto de fórmula (I), o una sal, hidrato o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, y un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable:
en donde
Ar es una porción de arilo bicíclico condensado o una porción de arilo monocíclico, cualquiera de las porciones de arilo es carbocíclico o heterocíclico y está opcionalmente sustituido;
R3 es alquilo, que está opcionalmente sustituido;
R4 es H o alcoilo;
R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y alquilo, o R1 y R2 juntos forman una cadena de alquileno para proporcionar, junto con el átomo de C al que están unidos, un sistema cíclico, o uno de R1 y R2 comprende una cadena de alquileno unida a N, el átomo de H unido a N está ausente y uno de R1 y R2 comprende H o alquilo, cualquiera de cuyas dichas porciones de alquilo o cadenas de alquileno pueden estar sustituidas;
en donde el compuesto no es un compuesto que tiene, en combinación, Ar como fenilo no sustituido, R3 como CH3, R4 como H, uno de R1 y R2 como H y uno de R1 y R2 como CH3.
2. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1, en la que Ar es 1-naftilo.
3. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que R4 es H.
4. La formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que R3 se selecciona del grupo que consiste en bencilo y miembros del grupo que comprende alquilos C1 a C10.
5. La formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que R1 y R2 corresponden a las porciones unidas al átomo de alfa C en L-alanina.
6. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo dicha formulación un compuesto seleccionado del grupo que comprende:
5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-O-[fenil(benzoxi-L-alaninil)]fosfato (CPF 381) 5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-O-[fenil(etoxi-L-alaninil)] fosfato (CPF383) 5-fluoro-2'desoxiuridin-5'-O-[fenil(isopropoxi-L-alaninil)] fosfato (CPF384) 5-fluoro-2'desoxiuridin-5'-O-[fenil(ciclohexoxi-L-alaninil)] fosfato (CPF508)
5-Fluoro-2'desoxiuridin-5'-0-[p-nitro-fenil(etoxi-L-alaninil)] fosfato (CPF430)
5-Fluoro-2'desoxiuridin-5'-0-[1-naftil (benzoxi-L-alaninil)] fosfato (CPF373)
5-Fluoro-2'desoxiuridin-5'-0-[1-naftil (metoxi-L-alaninil)] fosfato (CPF385)
5-Fluoro-2'desoxiuridin-5'-0-[1-naftil (etoxi-L-alaninil)] fosfato (CPF386)
5-Fluoro-2'desoxiuridin-5'-0-[1-naftil (isopropoxi-L-alaninil)] fosfato (CPF387)
5-Fluoro-2'desoxiuridin-5'-0-[1-naftil (ciclohexoxi-L-alaninil)] fosfato (CPF509)
5-Fluoro-2'desoxiuridin-5'-0-[fenil (benzoxi-a,a-dimetilglicina)] fosfato (CPF393)
5-Fluoro-2'desoxiuridin-5'-0-[fenil (etoxi-a,a-dimetilglicina)] fosfato (CPF394)
5-Fluoro-2'desoxiuridin-5'-0-[1-naftil (benzoxi-a,a-dimetilglicina)] fosfato (CPF395)
5-Fluoro-2'desoxiuridin-5'-0-[1-naftil (etoxi-a,a-dimetilglicina)] fosfato (CPF396)
5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-0-[fenil(benzoxi-L-prolinil)] fosfato (CPF583) 5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-0-[1-naftil(benzoxi-L-prolinil)] fosfato (CPF577)
5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-0-[1-naftil(3,3-dimetil-1-butoxi-L-alaninil)] fosfato (CPF585)
5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-0-[1-naftil-(ciclobutoxi-L-alaninil)] fosfato (CPF578)
5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-0-[1-naftil-(ciclopropilmetanoxi-L-alaninil) fosfato (CPF579)
5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-0-[1-naftil-(tetrahidropiroxi-L-alaninil)] fosfato (CPF580)
5-Fluoro-2-desoxiuridin-5-0-[1-naftil-(pentoxi-L-alaninil)] fosfato (CPF581)
5-Fluoro-2-desoxiuridin-5-0-[1-naftil-(ciclopentoxi-L-alaninil)] fosfato (CPF582)
5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-0-[l-naftil-(2-indanoxi-L-alaninil)] fosfato (CPF597)
5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-0-[fenil-(benzoxi-L-metioninil)] fosfato (CPF586)
5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-0-[l-naftil-(benzoxi-L-fenilalaninil)] fosfato (CPF587)
5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-0-[l-naftil-(2,2-dimetilpropoxi-L-alaninil)] fosfato (CPF588)
5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-0-[l-naftil-(butoxi-L-alaninil)] fosfato (CpF589)
5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-0-[fenil(benzoxi-L-leucinil)] fosfato 5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-0-[fenil(benzoxi-L-isoleucinil)] fosfato 5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-0-[fenil(benzoxi-L-fenilalaninil)] fosfato 5-Fluoro-2-desoxiuridin-5-0-[fenil(pentoxi-L-metioninil)] fosfato 5-Fluoro-2-desoxiuridin-5-0-[1-naftil(hexoxi-L-alaninil)] fosfato 5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-0-[1-naftil(pentoxi-L-leucinil)] fosfato 5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-0 -[1-naftil(benzoxi-L-leucinil)] fosfato 5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-0-[l-naftil(pentoxi-L-isoleucinil)] fosfato 5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-0-[1-naftil(pentoxi-L-fenilalaninil)] fosfato 5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5'-0-[1-naftil(benzoxi-L-metioninil)] fosfato 5-Fluoro-2'-desoxiuridin-5-0-[1-naftil(pentoxi-a,adimetilglicina)] fosfato, y sal, hidrato y solvato de los mismos.
7. Una formulación de la reivindicación 6 , en la que la formulación comprende 5-fluoro-2'desoxiuridin-5'-O-[l-naftil (benzoxi-L-alaninil)] fosfato (CPF373) o una sal, hidrato y solvato del mismo.
8. Una formulación de la reivindicación 7, en la que la formulación comprende 5-fluoro-2'desoxiuridin-5'-O-[I-naftil (benzoxi-L-alaninil)] fosfato (CPF373).
9. Una formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , en la que la formulación es una solución o suspensión acuosa.
10. Una formulación de la reivindicación 9, en la que la solución o suspensión acuosa comprende un vehículo acuoso seleccionado de solución de Ringer y cloruro de sodio isotónico.
11. Una formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la formulación es para uso en el tratamiento del cáncer.
12. Una formulación para uso de la reivindicación 11, en la que dicho cáncer se selecciona de cáncer gastrointestinal, leucemia, linfoma, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de ovario.
13. Una formulación para uso de la reivindicación 12, en la que dicho cáncer es cáncer gastrointestinal.
14. Una formulación para uso de la reivindicación 13, en la que dicho cáncer gastrointestinal se selecciona de cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago y cáncer de colon y recto.
15. Una formulación para uso de la reivindicación 14, en la que dicho cáncer gastrointestinal es cáncer de colon y recto.
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