CN103403013B - 用于治疗癌症的5-氟-2’-脱氧尿苷的氨基磷酸酯衍生物 - Google Patents

用于治疗癌症的5-氟-2’-脱氧尿苷的氨基磷酸酯衍生物 Download PDF

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Abstract

公开了5-氟-2’-脱氧尿苷的氨基磷酸酯衍生物，其用于治疗癌症，尤其是用于治疗其中患者显示抗性的癌症，例如，在具有核苷转运蛋白水平降低的细胞和/或具有核苷激酶缺乏的细胞和/或具有支原体感染的细胞和/或具有胸苷酸合成酶水平升高的细胞的患者中。

Description

用于治疗癌症的5-氟-2’-脱氧尿苷的氨基磷酸酯衍生物
本发明涉及可用于治疗癌症的化学化合物。
在1957年，发现了5-氟尿嘧啶(5FU)的抗肿瘤活性。自它被首次合成以来超过五十年，5FU仍然被广泛地用于治疗实体瘤，包括乳腺癌，胃肠系统癌，头部癌症，颈部癌症和卵巢癌，并且尤其是结直肠癌，如由FDA在1962年所批准的。氟嘧啶5-氟尿嘧啶(5FU)和5-氟-2’-脱氧尿苷(5-FdUrd)结合叶酸被用作用于各种各样的癌症如胃癌、结肠癌和乳腺癌的标准治疗。此外，5FU与甲酰四氢叶酸(LV)的结合被认为是用于结肠癌的标准化学疗法。药物5FU通常通过静脉内推注或连续输注施用。
5FU的抗肿瘤活性与其类似物5-FdUrd的抗肿瘤活性相当，5-FdUrd部分地充当5FU的前药。5-FdUrd被FDA在1970年批准，并且已经被广泛地用于卵巢癌、乳腺癌和胃肠道癌症的临床治疗。此外，由于广泛的肝提取，所以5-FdUrd是用于肝转移的肝动脉化疗的有用药物，由此与5FU相比，它通过肝更有效地代谢。
然而存在的问题在于，药剂5FU和5-FdUrd两者的活性可受到肿瘤细胞中抗性的形成损害。还发现利用5FU的癌症治疗引起神经中毒和心脏中毒的副作用。毒性也来源于5FU对肿瘤缺少选择性。
本发明的一个目的是提供衍生自5-氟-2’-脱氧尿苷的化合物，与5-氟尿嘧啶或5-氟-2’-脱氧尿苷本身相比，所述化合物在其对癌症的治疗中显示增强的活性和／或降低的毒性。
本发明的另一个目的是提供衍生自5-氟-2’-脱氧尿苷的化合物，所述化合物在肿瘤细胞中显示低水平的抗性，尤其是比5FU或5-FdUrd所显示的更低的肿瘤细胞中的抗性。
根据本发明，提供式(I)的化合物：
其中
Ar是稠合二环芳基部分或单环芳基部分，其芳基部分中的任一个是碳环的或杂环的并且任选被取代；
R3是烷基，其任选被取代；
R4是H或烷酰基(alkoyl)；并且
R1和R2独立地选自由H和烷基组成的组，或R1和R2一起形成亚烷基链从而与它们连接的C原子一起提供环系统，或R1和R2中的一个包含连接到N的亚烷基链，不存在与N连接的H原子，并且R1和R2中的一个包含H或烷基，所述烷基部分或亚烷基链中的任一个可以被取代；
或式I的药用衍生物或代谢物，
其中所述化合物不是具有以下组合的化合物：Ar为未取代的苯基，R3为CH3，R4为H，R1和R2中的一个为H并且R1和R2中的一个为CH3。
已经发现，本发明的化合物显示这样的活性，所述活性使得它们可以用于预防或治疗人类的癌症。尤其是，本发明的化合物表现出有益性质，所述性质指示它们治疗患者的癌症的能力，同时显示在肿瘤细胞中降低的抗性。特别地，本发明的化合物可以显示与5-氟尿嘧啶相当或更好的细胞活性，但具有与5-氟尿嘧啶和5-氟-2’-脱氧尿苷中的任一个相当或更低的抗性。
在本申请中“抗性”是指对治疗的低或减少的反应。抗性可以是先天的或获得的。先天抗性是相对于其他样本或患者下降的反应性。获得的抗性是在给定患者中随着时间过程下降的有效性，无论是否是联合包含向患者施用药物方案以治疗癌症，例如包含5FU和／或5-FdUrd的药物方案的疗法获得的。先天抗性和获得抗性各自可以对应于转运蛋白，包括核苷转运蛋白，或必要合成代谢酶的减量调节或低活性，或分解代谢酶的增量调节。
尽管申请人不希望受限于任何理论，但如以下进一步讨论的，假定肿瘤细胞中对5FU和／或5-FdUrd的活性的抗性的原因可以是：a)活化激酶如胸苷激酶(TK)(从5-FdUrd到5-FdUMP的初始磷酸化步骤所需的关键酶)的缺失；b)胸苷酸合成酶(TS)的超量产生；和／或c)到目标细胞中的转运不足。
现已令人惊奇地发现本发明的化合物可以在核苷转运蛋白水平降低的细胞和／或核苷激酶缺乏的细胞和／或支原体感染的细胞中显示显著的抑制细胞活性。
本发明的化合物在核苷激酶缺乏的细胞中保持显著抑制细胞活性的有益性质可以在缺少核苷激酶或具有减少的核苷激酶水平并且因此不能有效激活5-FdUrd的细胞环境中提供体内临床优势。
支原体感染的细胞极大地降低核苷如5-FdUrd的活性，据信是由于胸苷酸合成酶(TS)的超量产生。因此假定，当前提出的本发明化合物在支原体感染的细胞中的用途源自本发明化合物额外地充当TS抑制剂并由此允许本发明化合物在支原体感染的细胞中保持其抑制细胞活性的有益性质。包含本发明化合物的前药，由于其亲脂(lipophylic)性质而可以以至少部分地不依赖于核苷转运载体的方式被目标细胞摄取，并且因此，可以避免由于目标细胞膜中降低的核苷或核碱基转运载体水平所致的潜在抗性机制。
此外，包含本发明化合物的前药令人惊奇地对通常在肿瘤中被增量调节的分解代谢酶胸苷磷酸化酶(TP)的作用不敏感，并且因此，与5-FdUrd相比，该前药将更不依赖此分解代谢酶的存在。
已经观察到细胞的支原体感染可以极大地减少核苷(包括5-FdUrd)的活性。施用TP抑制剂恢复5-FdUrd在支原体感染的细胞培养物中的抑制细胞活性，提供了TP在5-FdUrd的最终抑制细胞活性中的劣化作用的证据。这在作为支原体感染的患者中可能是一个限制。与5-FdUrd不同，本发明的5-FdUrd前药在这些支原体感染的细胞中可以保持高活性。
本发明的化合物因此具有克服5-FU和5-FdUrd的许多限制的潜力。
5-氟尿嘧啶(5FU)是抗癌药物的最初实例中的一个。5-FU的设计是基于可获得的生物化学信息：氟原子和氢原子具有相似的大小，然而碳-氟键比碳-氢碱强得多。胸苷酸合成酶通过用获自亚甲基四氢叶酸的甲基取代脱氧尿苷单磷酸酯的5-氢以生成胸苷酸而起作用。5FU通过三种不同路径发挥其细胞毒性作用。核碱基5FU和脱氧核糖核苷5-FdUrd通过被促进的核苷转运系统进入细胞。这些试剂的作用机制之一是抑制酶胸苷酸合成酶(TS)。核碱基5FU通过胸苷磷酸化酶转化为脱氧核苷5-氟-2’-脱氧尿苷(5-FdUrd)。随后该脱氧核苷5-FdURd通过胸苷激酶的磷酸化导致有细胞毒性的核苷酸5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-单磷酸酯(5-FdUMP)的形成。在被还原的叶酸5，10-亚甲基-四氢叶酸(mTHF)存在下，核苷酸(5-FdUMP)抑制胸苷酸合成酶(TS)，因为该酶不能去除5-氟原子。因此，5FU和FDUR的首先和最重要作用机制是抑制酶胸苷酸合成酶(TS)。胸苷酸合成酶(TS)具有两个底物(dUMP和mTHF)，这两者结合在催化位点而使dTMP的合成成为可能。5-FdUMP与胸苷酸合成酶(TS)形成共价三元复合物，抑制此酶活性并且导致DNA合成所必需的三磷酸脱氧胸苷的耗尽。备选地，(5-FdUMP)在5FU通过OPRT转化为5-FUMP，转化为二磷酸氟尿苷(FUDP)，通过核糖核苷酸还原酶(RR)转化为二磷酸氟脱氧尿苷(5-FdUDP)并且最终转化为5’-FdUMP后合成。已经观察到，在对5FU或5-FdUrd的药物暴露之后，细胞对这些化疗剂形成抗性。胸苷酸合成酶(TS)的过表达降低TS抑制药物的疗效，导致产生抗性。观察到，一些个体对以TS为靶标的疗法比其他抗性更大。其次，脱氧核苷5-氟-2’-脱氧尿苷(5-FdUrd)可以被转化为其三磷酸酯5-FdUTP形式，其又可以被结合到DNA中，导致细胞损伤。第三，5FU还可以通过以下方式抑制RNA合成：其通过OPRT转化为FUMP并且随后，在两个步骤中，转化为氟尿苷三磷酸酯(FUTP)，其被结合到RNA中。据信这是5FU的另一种可能的作用。
因此分子5FU不产生最佳的TS抑制药物，因为由于5FU的代谢活化需要若干代谢步骤导致它不能被有效地转化为5-FdUMP。而且如果细胞产生过量的dUMP与药物竞争活性位点，则可能出现抗性。
5-FdUrd是胸苷激酶的相对好的底物，胸苷激酶将5-FdUrd直接转化为5-FdUMP。若干癌症细胞系中的体外研究证明，作为细胞生长的抑制剂，5-FdURd比5FU更有效约5000倍。此外，在细胞毒性浓度，前药5-FdURd不显示明显的向核糖核苷酸代谢物的转化。体内研究显示显著量的5-FdUrd通过胸苷磷酸化酶(5-FdUrd对其显示良好亲和力的酶)降解为其相关碱基5FU。在体外和体内5-FdUrd到5FU的这种快速磷酸化裂解代表了在将完整5-FdUrd递送到细胞用于增强的细胞毒性作用中的主要障碍。此外，在经口施用后，在大鼠肠匀浆以及在人中5-FdUrd的降解，表明5-FdUrd几乎不作为完整5-FdUrd被吸收。
根据本发明的另一方面，本发明的化合物提供用于预防或治疗人类的癌症的方法。合适地，该癌症选自包含以下各项的组：白血病、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌和宫颈癌。
尤其，本发明的化合物用于预防或治疗患者的癌症的方法，所述患者在肿瘤细胞中对于5-氟尿嘧啶或5-氟-2’-脱氧尿苷在预防或治疗癌症中的活性已经形成或潜在形成抗性。例如，本发明的化合物可以用于预防或治疗患者的癌症的方法，所述患者具有核苷转运蛋白水平降低的细胞和／或核苷激酶缺乏的细胞和／或支原体感染的细胞，尤其是其中癌症是白血病。本发明的化合物可以代替地或也用于预防或治疗患者的癌症的方法，所述患者具有胸苷酸合成酶(TS)水平升高的细胞。
根据本发明的另一方面，提供一种预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向需要这样的治疗的人类患者施用有效剂量的本发明化合物。合适地，癌症选自包含以下各项的组：白血病、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌和宫颈癌。
尤其，本发明包括用于治疗患者的方法，所述患者在肿瘤细胞中对于5-氟尿嘧啶或5-氟-2’-脱氧尿苷在预防或治疗癌症的方法中的活性已经形成或潜在形成抗性。例如，本发明的方法可以包括治疗具有核苷转运蛋白水平降低的细胞和/或核苷激酶缺乏的细胞和/或支原体感染的细胞的患者，尤其是其中癌症是白血病。本发明的用于治疗患者的方法可以代替地或也用于治疗具有胸苷酸合成酶(TS)水平升高的细胞的患者。
除非另外说明，如本申请中使用的，“肿瘤”或“肿瘤细胞”是指实体肿瘤和癌症如白血病两者。
本发明的化合物可以用于从头单独地或联合其他癌症疗法一起治疗患有癌症的患者。例如，本发明的化合物可以联合其他抗癌药物，如5-FU和/或5-FdUrd，在有或没有甲酰四氢叶酸(LV)下，和/或其他抗癌药物，用于癌症治疗方案。备选地，可以在患者不对其他抗癌药物，如例如5FU和/或5-FdUrd，在有或没有甲酰四氢叶酸(LV)下反应的情况下，或者在患者对其他抗癌药物，如例如5-FU和/或5-FdUrd，在有或没有甲酰四氢叶酸(LV)下已经显示抗性的情况下使用本发明的化合物。
其中Ar是1-萘基(取代或未取代)的本发明化合物特别适用于本发明的以上用途和方法，尤其在在肿瘤细胞中已经形成或潜在形成抗性的患者中，如例如，具有核苷转运蛋白水平降低的细胞和/或激酶缺乏的细胞和/或支原体感染的细胞的患者和/或具有胸苷酸合成酶(TS)水平升高的细胞的患者。
根据本发明的另一方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含与药用载体、稀释剂或赋形剂结合的本发明的化合物。
根据本发明的另一方面，提供一种制备药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：将本发明的化合物与药用赋形剂、载体或稀释剂结合。
根据本发明的另一方面，提供一种用于制备本发明的化合物的方法，所述方法包括使式(II)的化合物
与式(III)的化合物反应，
III
其中Ar，R3，R4，R1和R2具有以上和在权利要求1中所述的含义。
基团Ar包括取代或未取代的芳基，其中术语“芳基”和所述基团的可能取代如本文中所限定。合适地，Ar是5至14元芳香族环部分。优选地，Ar是碳环的。备选地，一个或两个环可以包括1、2、3或4个独立地选自O、S和N中的杂原子，优选1个。优选地，Ar是稠合碳二环芳基部分。更优选地，Ar是萘基，甚至更优选是1-萘基，即经由在1-萘基位置处键接的O与P连接的萘基。合适地，Ar备选地可以是苯基。
可以相同或不同的一个、两个、三个或四个取代基可以存在于Ar上并且选自包含以下各项的组：卤素，其可以是-F，-Cl，-Br或-I；-NO2；-NH2；任选取代的-C1-3烷基；任选取代的-C1-3烷氧基，优选甲氧基(-OCH3)；任选取代的-SC1-3烷基；-CN；任选取代的-COC1-3烷基；和任选取代的-CO2C1-3烷基；其中所述任选取代的基团可以被一个或多个，多至六个，优选三个独立地选自包含以下各项的组中的成员取代：卤素，其可以是F，Cl，Br和I，和NO2。特别优选的Ar上的取代基是吸电子基团如卤素(优选氯或氟)，三卤代甲基(优选三氟甲基)，氰基和硝基。
取代基可以在Ar芳基部分上的任何位置。当Ar是1-萘基时，在2、3、4、5、6、7或8位中的任一处的单个取代基是优选的。当Ar是苯基时，在2(邻)或4(对)位处的单个取代基是优选的，更优选的是在4位。例如，在Ar是取代的苯基的情况下，Ar可以是3，5-二氯-苯基，对三氟甲基-苯基，对氰基-苯基，或对硝基-苯基。
合适地，R3是C1-16伯烷基、仲烷基或叔烷基并且可以包括碳环部分；C5-7环烷基；或C1-6烷基C5-11芳基。更合适地，R3是C1-10烷基或C1-3烷基C5-7芳基如苄基(-CH2-C6H5)。环烷基可以是碳环的或可以含有总计一个、两个或三个独立地选自O、N和S中的环杂原子。优选R3是未取代的。在被取代的情况下，取代基如以下所述。
合适地，R4是H或烷酰基，即烷基-C(＝O)-，其中烷基是C1至C10。
当R1和/或R2是烷基时，它们各自合适地独立选自C1至C16，更合适地选自C1至C6。当R1和R2一起包含亚烷基链时，该链合适地是C1至C6并且可以含有不饱和度，以及在该链中的总共一个、两个或三个独立地选自O、N和S中的杂原子。当R1和R2中的一个连接到N时，包括R1和R2连接的N和C原子在内的总的环大小合适地包含4至7个成员，更合适地5个成员。包含R1和/或R2的任何烷基或亚烷基链可以被一个或多个本文所述的取代基取代。
当R1和R2不相同时，它们连接的C原子是手性的。优选地，在该不对称中心-CR1R2处的立体化学对应于L-氨基酸。然而，在不对称中心-CR1R2处的立体化学可以对应于D-氨基酸。备选地，可以采用具有对应于L和D氨基酸的不对称中心的化合物的混合物。
合适地，R1和R2可以对应于连接到天然存在的α氨基酸中的αC原子的部分。“天然存在的α氨基酸”是指丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、羟赖氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。R1和R2中的一个因此可以是H，并且R1和R2中的一个因此可以是H或选自以下部分的烷基，或R1和R2一起可以形成选自以下部分的亚烷基链：
CH3-如存在于丙氨酸
H2NC(＝NH)NH[CH2]3-如存在于精氨酸
NH2C(O)CH2-如存在于天冬酰胺
HO2CH2-如存在于天冬氨酸
HSCH2-如存在于半胱氨酸
HO2CH(NH2)CH2SSCH2-如存在于胱氨酸
H-如存在于甘氨酸
HO2CH2CH2-如存在于谷氨酸
H2N(O)CCH2CH2-如存在于谷氨酰胺
C3N2HCH2-如存在于组氨酸
H2NCH2CH(OH)CH2CH2-如存在于羟赖氨酸
-CH2CH(OH)CH2-如存在于羟脯氨酸
CH3CH2CH(CH3)-如存在于异亮氨酸
(CH3)2CHCH2-如存在于亮氨酸
H2NCH2(CH2)3-如存在于赖氨酸
CH3SCH2CH2-如存在于甲硫氨酸
PhCH2-如存在于苯丙氨酸
-CH2CH2CH2-如存在于脯氨酸
OHCH2-如存在于丝氨酸
CH3CH(OH)-如存在于苏氨酸
C8NH6CH2-如存在于色氨酸
HOC6H4CH2-如存在于酪氨酸
(CH3)2CH-如存在于缬氨酸。
“药用衍生物”是指在施用至受体后能够提供(直接或间接地)式(I)化合物的任何药用盐，酯，这样的酯的盐，水合物，溶剂化物，或晶体形式或代谢物或任何其他化合物。
本说明书中提及的烷基是指支化或未支化的，环状或无环的，饱和或不饱和(例如烯基或炔基)的烃基。在环状的情况下，亚烷基优选是C3至C12，更优选是C5至C10，更优选是C5至C7。在无环的情况下，烷基优选是C1至C16，更优选是C1至C6。
本说明书中提及的芳基是指合适地含有5至14环原子的芳族基团。例如Ar是苯基或萘基。芳族基团可以是含有一个、两个、三个或四个(优选一个)独立地选自由O、N和S组成的组中的杂原子的杂芳族基团。这样的杂芳族基团的实例包括吡啶基、吡咯基、呋喃基和噻吩基。
烷基和芳基可以是取代的或未取代的。在被取代的情况下，通常将存在一至三个取代基，优选一个取代基。取代基可以包括卤素原子，其是指F，Cl，Br和I原子，和卤代甲基如CF3和CCl3；含氧基团如氧代、羟基、羧基、羧基C1-16烷基、烷氧基、烷酰基、烷酰基氧基、芳氧基、芳酰基和芳酰基氧基；含氮基团如氨基、C1-6烷基氨基、二C1-6烷基氨基、氰基、叠氮化物和硝基；含硫基团如硫羟(thiol)、C1-6烷基硫羟、磺酰基和亚砜；自身可以被取代的杂环基团；自身可以被取代的如上所定义的烷基；和自身可以被取代的如上所定义的芳基，如苯基和取代苯基。所述杂环基、烷基和芳基上的取代基如以上刚刚定义的。R1和/或R2中的取代基包括这样的部分，其提供其中R1和R2对应于连接到天然存在的α氨基酸中的αC原子的部分的化合物。
本说明书中提及的烷氧基和芳氧基分别是指烷基-O-(例如其中烷基是C1至C16，优选C1至C6)和芳基-O-(例如其中芳基是5至14元芳族单或二稠合环部分，任选含有1、2、3或4个独立地选自O、S和N中的杂原子，优选地芳基是苯基)。
本说明书中提及的烷酰基和芳酰基分别是指烷基-CO-(例如其中烷基是C1至C16，优选C1至C6)和芳基-CO-(例如其中芳基是5至14元芳族单或二稠合环部分，任选含有1、2、3或4个独立地选自O、S和N中的杂原子，优选地芳基是苯基)。
本说明书中提及的烷酰基氧基和芳酰基氧基分别是指烷基-CO-O(例如其中烷基是C1至C16，优选C1至C6)和芳基-CO-O(例如其中芳基是5至14元单或二稠合芳环系统，任选含有1、2、3或4个独立地选自O、S和N中的杂原子，优选地芳基是苯基)。
本说明书中提及的杂环基团是指含有一个或多个以下各项的基团：吡咯基、咪唑基、吡唑基(pyraziolyl)、噻唑基、异噻唑基、唑基、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、四氢呋喃基、吡喃基、吡喃酮基(pyronly)、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、萘硫基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、吲哚基、羟吲哚基、异吲哚基、吲唑基、二氢吲哚基、7-氮杂吲哚基、异吲唑基、苯并吡喃基、香豆素基(coumarinyl)、异香豆素基、喹啉基、异喹啉基、萘啶基、噌啉基、喹唑啉基、吡啶并吡啶基、苯并嗪基、喹喔啉基(quinoxadinyl)、色烯基、苯并二氢吡喃基、异苯并二氢吡喃基和咔啉基。
在本发明的一个实施方案中，Ar合适地是萘基，尤其是1-萘基，即经由键接在1-萘基位置处的O与P连接的萘基。
在本发明的另一个实施方案中，Ar合适地是苯基。
在本发明的一个实施方案中，Ar是被取代的。合适的取代基在本文中提出。
在本发明的一个实施方案中，Ar是未取代的1-萘基。
在本发明的一个实施方案中，Ar是未取代的苯基。
在本发明的一个实施方案中，R4选自由H和乙酰基(CH3C(=O)-)组成的组，尤其R4是H。
在本发明的一个实施方案中，R3选自由苄基和包含C1至C10烷基的组的成员组成的组，尤其R3选自正丙基、正丁基、正戊基和正己基，更尤其是正戊基。
在本发明的一个实施方案中，R1和R2对应于连接到天然存在的α氨基酸中的αC原子的部分，如本文所述。特别合适的天然存在的α氨基酸是L-丙氨酸以致R1和R2中的一个合适地是H，R1和R2中的一个是CH3，并且它们连接的C原子具有L手性。在其他实施方案中，R1和R2对应于与非天然存在的α氨基酸中的αC原子连接的部分，例如R1和R2合适地都是CH3。
以上实施方案中提及的具体特征被具体公开，已在本发明的化合物中的任何和所有组合中被结合在一起。
特别合适的本发明的化合物是这样的化合物，其中Ar是1-萘基，R3是苄基，R1和R2中的一个是H，R1和R2中的一个是甲基，并且R1和R2连接的C原子具有L-手性；以及这样的化合物，其中Ar是1-萘基，R3是正戊基，R1和R2中的一个是H，R1和R2中的一个是甲基，并且R1和R2连接的C原子具有L-手性。对于每个化合物，R4最合适地是H。
使用化疗剂的常规癌症治疗大部分基于使用核苷类似物。这些分子被设计成模拟天然嘧啶和嘌呤核苷。在被细胞摄取后，它们通过细胞的酶如(脱氧)胞苷激酶(dCK)、胸苷激酶(TK)和／或核苷(酸)激酶磷酸化。这些抗代谢物随后可以干扰DNA／RNA前体的从头合成而最终抑制DNA／RNA合成，导致细胞毒性／抑制活性(Hatse等，1999；Galmarini等，2002)。
氟嘧啶系抗代谢物如氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨(capecitabine)和5-氟-2’-脱氧尿苷(5-FdUrd)主要用于治疗结肠癌、乳腺癌和卵巢癌(deBruin等，2006；Ishikawa等，1998；Walko等，2005)。细胞内地，这些药物被代谢为5-FdUMP，其与胸苷酸合成酶(TS)和被还原的共底物5，10-亚甲基四氢叶酸形成稳定的抑制复合物，由此阻断正常底物dUMP结合至该酶(Beck等，1994；Tanaka等，2000；Longley等，2003)。TS是负责将dUMP转化为TMP的酶，并且因此是细胞增殖所不可缺少的，使得它成为药物设计的关注靶标。在以上提及的氟嘧啶中，5-FdUrd仅需要一次代谢转化，通过TK催化的生成5-FdUMP的磷酸化(Longley等，2003)。此强制性磷酸化通常是许多抗癌药物(包括5-FdUrd)的代谢中的限速步骤，并且因此仍然是核苷类似物的治疗用途的限制因子之一。因此，已经研究了用于提高核苷类似物的抗肿瘤效力的不同策略(Galmarini等，2002)。
核苷一磷酸在生理条件下的带电性质导致差的(如果有的话)对细胞膜的穿透(Mehellou等，2009)。因此，直接施用磷酸化的分子以避免最初的磷酸化步骤几乎不具有治疗优势。因此，已经研究了不同策略，这些策略使用多种核苷5’-单磷酸酯前药绕过限速的磷酸化以获得更有效的药物递送(Hecker和Erion，2008)。对于具有抗病毒／癌症活性的若干分子，施用亲脂的氨基磷酸酯核苷酸前药(ProTide)已被证明是成功的(Harris等，2001；Congiatu等，2006；McGuigan等，2010)。通过掩蔽磷酸基序的电荷，可以实现前药的良好的被动膜扩散，在此之后通过酶分解前药在细胞内被快速地转化为核苷一磷酸(Mehellou等，2009)。
支原体是地球上最小的自我复制的生物体并且表征为缺少细胞壁和极其简化的基因组(600-1,200kb)。很多这些细菌具有寄生的生活方式并且寄居在人体中导致无症状感染(Razin等，1998)。据显示，这些原核生物倾向于优先定殖肿瘤组织：Huang等(2001)报道了，与在非肿瘤组织中的20.9-30％相比，39.7-56％的人胃癌、结肠癌、食管癌、肺癌和乳腺癌被支原体感染。Pehlivan等(2005)发现患有肾细胞癌的患者的>80％的肾组织样品被支原体感染，与之相比在对照组织样品中是14％。Chan等(1996)报道了在卵巢癌组织中59％的感染率，而其他研究也报道了在胃湿疣组织(Sasaki等，1995，Yang等，2010)和子宫颈湿疣组织(Kidder等，1998)中的高的支原体感染率。由于其简化的基因组，支原体缺少用于从头合成嘧啶和嘌呤的通路，并且因此表达多种补救核苷／核苷酸代谢酶，如胸苷磷酸化酶(TP)，脱氧胞苷脱氨酶等(Razin，1978；Charron和Langelier，1981；Neale等，1983；Tham等，1993)。在1985年已经观察到，存在于被感染的细胞培养物中的支原体编码的酶(例如TP)，导致淋巴细胞中的dTTP渗入减少(Sinigaglia&Talmadge，1985)。目前，已经证明，在体外，这些酶，特别是支原体编码的胸苷磷酸化酶，同样干扰包括5-三氟胸苷在内的若干化疗剂的抑制细胞活性(Bronckaers等，2008；Jetté等，2008；Liekens等，2009)。因此，猜测通过抗生素消灭支原体或抑制在人肿瘤组织中的支原体编码的酶可以优化对使用嘌呤和嘧啶抗代谢物的癌症患者的治疗(Liekens等，2009)。
本发明来源于对5-FdUrd的不依赖TK的氨基磷酸酯前药的开发和评估，并且提供这样的化合物，所述化合物也可以对其游离核苷类似物的TP依赖性失活不敏感。本发明的化合物因此可以提供对支原体不敏感的核苷类似物前药，这可以优化使用嘧啶抗代谢物的癌症患者的治疗。在目前合成的5-FdUrd的氨基磷酸酯前药中，选择CPF-373(以下鉴定并且以上提及作为尤其合适的本发明的化合物，其中R4是H)用于进一步的深入研究。这个分子含有萘基和苄基丙氨酰基团而掩蔽在5-FdUMP上的带电荷的5’-磷酸。
已经描述了对氟嘧啶如5FU、5-FdUrd和三氟胸苷(TFT)的肿瘤细胞抗性的各种机制，包括关键性活化药物的酶(例如TK和乳清酸磷酸核糖转移酶)的活性降低，使药物失活的酶(即胸苷磷酸化酶)的活性增加，和／或目标酶(例如TS)的增量调节(Agarwal等，1999；Murakami等，2000；Kosaka等，2004)。同样，据报道，在多种癌症组织中发现的高TP水平预示在用氟嘧啶治疗后较差的预后(Kamoshida等，2005；Ciaparrone等，2006；Koopman等，2009)，虽然其他研究还未确认这些发现(Ciccolini等，2004；Koopman等，2009)。本发明来源于开发可以避免可能的抗性机制和对存在于肿瘤微环境中的分解代谢酶的降解的易感性的5-FdUrd的前药。
使本发明具体化的化合物，例如CPF-373，是5-FdUrd的氨基磷酸酯前药，并且描述于本文中，并且可以实现这些目标。在被摄取到肿瘤细胞中后，在细胞内酶裂解后，例如，CPF-373产生5-FdUMP。通过31PNMR技术的稳定性研究和酶／血清研究揭示例如，前药CPF-373在酸性和碱性条件中是完全稳定的，但是在存在血清或羧肽酶Y下发生水解，导致形成核苷5’-氨基磷酸酯衍生物。尽管TK是5-FdUrd活化中的关键酶，但是发现，在鼠(L1210)和人(CEM)细胞培养物中，例如，CPF-373显著较不依赖TK来发挥其抑制细胞作用。由于ProTide的亲脂性质，所以在通过酶如羧酯酶或羧肽酶(即羧肽酶Y)转化为其核苷氨基磷酸酯衍生物后，这些分子可以将核苷-一磷酸酯直接递送到完整的肿瘤细胞中，消除了对于通过特定的核苷激酶如TK的初始磷酸化的需要。在这点上，对于具有改变的TK活性(不论它是获得性的还是先天性的)的肿瘤细胞的治疗来说，例如，CPF-373可以是合适的工具。同样，因为TK表达是S一期依赖的，所以预期CPF-373，例如，也可以有效地在不处于其复制周期的S一期中的肿瘤细胞中递送5-FdUMP。TS活性研究揭示，CPF-373，例如，能够在野生型和TK缺陷型肿瘤细胞系中抑制TS，再次指向5-FdUrd的5’一单磷酸酯的有效胞内递送，并且其对于代谢活化实际上不依赖于细胞TK。
本发明的化合物，如CPF-373，不可能被参与核苷代谢的分解代谢酶失活。实际上，尽管5-FdUrd对导致形成5-FU和2一脱氧核糖一1一磷酸的通过TP的酶水解高度易感，但是其前药，例如CPF-373，不是用于原核(即大肠杆菌)或哺乳动物(即人红血球)TP的底物。而且，尿苷磷酸化酶不识别例如CPF-373作为底物，而5-FdUrd被该酶水解(较差，但是可测)。若干研究揭示许多肿瘤细胞具有升高的TP水平，其也充当血管生成因子(Koopman等，2009；Bronckaers等，2009)。此外，关于通过支原体对肿瘤组织的优先建群有若干报道(Sasaki等，1995；Chan等，1996；Huang等，2001；Pehlivan等，2005)，支原体通过其编码的TP在体外干扰若干常规化疗剂的抑制细胞活性(Bronckaers等，2008；Jetté等，2008；Liekens等，2009)。目前的观察结果，即当肿瘤细胞被(表达TP的)支原体感染时5-FdUrd而不是例如CPF-373显著丧失抑制细胞活性，与这些观察完全相符。因此，施用被证明在极端pH条件下是化学稳定的TP不敏感型抗癌前药如CPF-373，可以进一步提高癌症化疗。总之，ProTide，如CPF-373，对于开发更反弹的抗癌药物提供令人感兴趣的新方法。例如，CPF-373相对于其母体药物5-FdUrd可以具有至少若干优势：其不依赖于TK地发挥其抑制细胞活性，并且它对通过TP的代谢分解是抗性的，TP是肿瘤中通常被增量调节的酶或者可以被肿瘤组织的支原体感染外部表达的酶。
根据本发明的式I的化合物或药物组合物可以通过任何合适的方式施用到人类患者。
用于本发明的药物可以通过经口或肠胃外途径施用，包括静脉内施用，肌肉内施用，腹膜内施用，皮下施用，经皮施用，气道(气溶胶)施用，直肠施用，阴道施用和局部施用(包括含服和舌下施用)。
对于经口施用，本发明的化合物将通常以片剂或胶囊的形式提供，作为粉剂或粒剂，或作为水溶液或混悬剂。
口服用片剂可以包含与药用赋形剂如惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、增甜剂、调味剂、着色剂和防腐剂混合的活性成分。合适的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙，磷酸钠和磷酸钙，和乳糖，同时玉米淀粉和海藻酸是合适的崩解剂。粘合剂可以包括淀粉和明胶，而润滑剂(如果存在)通常是硬脂酸镁，硬脂酸或滑石。如果需要，可以用材料如一硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯对片剂进行包衣，以延迟在胃肠道中的吸收。
口服用胶囊包括其中活性成分与固体稀释剂混合的硬明胶胶囊，和其中活性成分与水或油如花生油、液体石蜡或橄榄油混合的软明胶胶囊。
利用合适的基质，包括例如可可脂或水杨酸酯(盐)，用于直肠施用的制剂可以呈现为栓剂。
适于阴道施用的制剂可以呈现为阴道栓、棉球、霜剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂，这些制剂除了活性成分以外还含有如本领域中已知是适合的这样的载体。
对于肌肉内、腹膜内、皮下和静脉内使用，本发明的化合物通常提供在被缓冲至合适pH和等张性的无菌水溶液或混悬剂中。合适的水性载体包括林格溶液(Ringer’ssolution)和等张氯化钠。根据本发明的含水混悬剂可以包括悬浮剂如纤维素衍生物，藻酸钠，聚乙烯吡咯烷酮和黄菁树胶，和湿润剂如卵磷脂。适用于含水混悬剂的防腐剂包括对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙酯。
本发明的化合物也可以呈现为脂质体制剂。
通常，合适的剂量为0.1至300mg／kg受体体重／天。优选的较低剂量是0.5mg／kg受体体重／天，更优选的较低剂量是6mg／kg受体体重／天，甚至更优选的较低剂量是10mg／kg体重／受体／天。合适的剂量优选在6至150mg／kg体重／天的范围内，并且最优选在15至100mg／kg体重／天的范围内。期望剂量优选呈现为在整个一天中以合适的间隔施用的两个、三个、四个、五个或六个或更多个的子剂量。这些子剂量可以以单位剂型施用，例如，每单位剂型含有10至1500mg，优选20至1000mg，并且最优选50至700mg的活性成分。
现在将参考包括图1至11在内的附图，通过仅是举例的方式，描述本发明的实施例，其中：
图1显示5-FdUrd及其氨基磷酸酯前药CPF-373的结构式；
图2显示胸苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶对dThd，Urd，5-FdUrd和CPF-373的作用，其中数据是至少2次独立实验的平均值(±S.D.)；
图3显示通过5-FdUrd和CPF-373对TS的抑制，如通过在L1210／0细胞培养物中从[5-3H]dUrd(图A和B)和[5-3H]dCyd(图C和D)的氚释放和在L1210／TK￣细胞培养物中从[5-3H]dCyd(图E和F)的氚释放测量的，其中数据是2次独立实验的平均值(±S.EM.)；
图4显示提出的活化5-FdUrdProTide的假定机制；
图5显示通过31PNMR监测的前药CPF-373的羧肽酶介导的分解；
图6显示在血清中化合物CPF-373的31PNMR谱；
图7显示在pH=1的缓冲液中化合物CPF-373的31PNMR谱；
图8显示在pH=8的缓冲液中化合物CPF-373的31PNMR谱；
图9显示通过19FNMR的核苷和相关碱基的谱图：a)经过磷酸化酶测定的5-FdUrd(A)；b)在不存在酶(TP)的测定条件下的5-FdUrd和碱基5FU(B)；
图10显示通过19FNMR的在磷酸钾缓冲液(205nM)中的核苷和碱基的谱图：a)在不存在酶的情况下经过磷酸化酶测定的5-FdUrd(A)；b)添加酶(TP)后的结果(B)；以及
图11显示在磷酸化酶测定中前药化合物CPF373的谱图：a)在不存在酶(TP)的测定条件下的前药CPF373(A)；b)经过胸苷磷酸化酶(TP)的作用的前药CPF373(B)。
化合物合成
参考图1和以下方案1至3，如通过化合物CPF-373(1)示例的，本发明的化合物已经使用氯磷酸酯化学合成，所述氯磷酸酯化学之前已被McGuigan等(1993，1996，1997）报道。例如，已经通过在Et3N存在下将1-萘酚(3)与磷酰氯(4)偶联，制备了芳基磷酰二氯磷酸酯(2)(方案1)，并且这被允许与L-丙氨酸苄基酯甲苯磺酸盐(5)在Et3N存在下反应以生成氯磷酸酯衍生物(6)(方案2)。通过在THF中，在N-甲基咪唑(NMI)存在下与氯磷酸酯衍生物(6)偶联，核苷5-FdUrd(7)被转化为5’ProTide，从而产生目标化合物CPF-373(1)(方案3)。获得的样品为两种非对映异构体的混合物，如通过在31PNMR中存在的两个峰确认的。
方案1.试剂和条件：(i)1-萘酚(3)，磷酰氯(4)，无水Et20，无水Et3N，-78℃.，30分钟，然后室温3小时
方案2.试剂和条件：(i)无水Et3N，CH2Cl2，-78℃，1小时，然后室温3小时
方案3.试剂和条件：(i)NMI，无水THF，10分钟，然后磷酰氯(6)，室温过夜
无水溶剂获自Aldrich并且在不经进一步纯化的情况下使用。所有反应在氩气氛下进行。利用在硅胶(SilicaGel)60-F254预涂铝板上的分析型TLC监测反应，并且在UV(254nm)下和／或利用31PNMR谱来使其可视化。在硅胶(35-70μM)上进行柱色谱。质子(1H)、碳(13C)、磷(31P)和氟(19F)NMR谱于25℃在BrukerAvance500光谱仪上记录。谱图自动校准至氘化溶剂峰，并且所有的13CNMR和31PNMR都被质子去偶。通过VarianProstar(LCWorkstation-Varianprostar335LC检测器)，使用VarianPolarisC18-A(10μM)作为分析柱来进行分析型HPLC。
低和高分辨率质谱使用电喷(ES)作为由Birmingham大学的服务进行。CHN微量分析作为通过MEDACLtd.，Surrey的服务进行。
标准程序A：二氯磷酸酯(2)的合成。
在氩气氛下，将磷酰氯(1.0当量)添加到1-萘酚(1.0当量)在二乙醚中的溶液，然后在-78℃逐滴加入无水三乙胺(1.0当量)并且将所得的反应混合物搅拌1小时。随后允许反应混合物缓慢温热至室温达3小时。通过31PNMR监测所需化合物的形成。将所得的混合物过滤然后在氮气下在真空中蒸发而获得作为产物的粗制无色油状物，其未经进一步纯化而用于下一步骤。
1-萘基二氯磷酸酯(2)的合成：根据标准程序A，由1-萘酚(3.00g，20.81mmol)，磷酰氯(1.94mL，20.81mmol)，三乙胺(2.9mL，20.81mmol)和无水二乙醚(70mL)制备。在-78℃1小时后，使反应升至室温并且搅拌3小时。获得作为油状物的粗产物。将所得的混合物过滤然后在真空中蒸发，在通过利用己烷-EtOAc(1：1)洗脱的柱色谱纯化后，得到无色油状物(4.59g，84)[Rf=0.93(己烷-EtOAc，1：1)]，31PNMR(202MHz，CDCl3)：δP5.07；1HNMR(500MHz，CDCl3)：δH7.52-7.71(m，4H，ArH)，7.86-7.89(m，1H，ArH)，7.95-7.98(m，1H，ArH)，8.16-8.19(m，1H，ArH)。
标准程序B：氯磷酸酯(6)的合成.
在氩气氛下，在-78℃，将二氯磷酸芳基酯(1.0当量)和适当的氨基酸酯盐(1.0当量)在二氯甲烷中的溶液逐滴加入无水三乙胺(2.0当量)。在1小时后，使反应混合物缓慢温热至室温达3小时，并且通过31PNMR监测所需化合物的形成。在氮气下将反应混合物在减压下浓缩，将残余物重新溶解在二乙醚中，过滤并在真空中蒸发而得到粗制无色油状物，其在一些情况中未经进一步纯化而用于下一步骤。通过利用己烷-EtOAc(7：3)洗脱的柱色谱纯化合成的氯磷酸芳基酯，得到作为无色油状物的标题化合物。
1-萘基(苄基-L-丙氨酰)氯磷酸酯(6)的合成：使用1-萘基二氯磷酸酯(2.50g，9.57mmol)，L-丙氨酸苄基酯甲苯磺酸盐(3.36g，9.57mmol)，无水三乙胺(2.66mL，19.14mmol)和无水二氯甲烷(35.7mL)，根据通用程序B制备所述氯磷酸酯。通过利用己烷-EtOAc(7：3)洗脱的柱色谱纯化，得到作为无色油状物的标题化合物(1.82g，47％)[Rf=0.90(己烷-EtOAc，7：3)]，31PNMR(202MHz，CDCl3，非对映异构体的混合物)：δP7.92，8.14(Int.：1.00：1.00)；1HNMR(500MHz，CDCl3，比率为1：1的非对映异构体的混合物)：δH1.42-1.45(m，3H，CHCH3)，4.20-4.23(m，1H，CHCH3)，4.78-4.81(m，1H，NH)，5.09(s，2H，OCH2Ph)，7.09-7.73(m，11H，ArH)，7.97-8.12(m，1H，ArH)。
标准程序C：核苷氨基磷酸酯(1)的合成.
在室温，在氩气氛下，将适当的核苷(1.0当量)在无水THF(10mL)中的溶液添加到NMI(5.0当量)中。10min后，将反应混合物逐滴加入到氯磷酸酯(3.0当量)在无水THF中的溶液。将反应在室温搅拌过夜并在真空中蒸发。将获得的油状物溶解在CH2Cl2中，用H2O洗涤两次，然后用HC10.5M洗涤，或者备选地将粗产物用二乙醚洗涤。然后粗产物通过在二氧化硅上，利用CH2Cl2-MeOH为梯度来洗脱的柱色谱进行纯化，得到所述氨基磷酸酯。
5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[α-萘基(苄基-L-丙氨酰)]磷酸酯(1)的合成：使用5-氟-2’脱氧尿苷(0.25g，1.01mmol)，NMI(0.40mL，5.07mmol)和萘基(苄基-L-丙氨酰)氯磷酸酯(0.82g，3.04mmol)，根据通用程序C制备所述氨基磷酸酯。通过利用CH2Cl2至CH2Cl2-MeOH(95：5)进行洗脱的梯度柱色谱纯化，得到作为无色固体的标题化合物(47.0mg，8％)[Rf＝0.19(CH2Cl2-MeOH，95：5)]，(实验值：MNa+，636.1520.C29H29N3O9FNaP需要[MNa+]，636.1523)；31PNMR(202MHz，MeOD，非对映异构体的混合物)：δP4.24，4.59；19FNMR(470MHz，MeOD)：δF-167.36，-167.18；1HNMR(500MHz，MeOD)：δH1.34-1.38(m，3H，CHCH3)，1.67-1.79(m，1H，H-2’)，2.08-2.17(m，1H，H-2’)，4.03-4.15(m，2H，CHCH3，H-4’)，4.24-4.36(m，3H，CH2OP，H-3’)，5.08(d，1H，J＝12.0Hz，OCHHPh)，5.13(d，1H，J＝12.0Hz，OCHHPh)，6.09-6.16(m，1H，H-1’)，7.27-7.45(m，6H，ArH)，7.47-7.55(m，3H，ArH)，7.67-7.72(m，2H，ArH，H-6)，7.86-7.90(m，1H，ArH)，8.12-8.18(m，1H，ArH)；13CNMR(125MHz，MeOD)：δC20.3(d，3JC-P＝7.6Hz，CH3)，20.5(d，3JC-P＝6.5Hz，CH3)，40.8(CH2)，40.9(CH2)，51.8(CH)，51.9(CH)，67.6(d，2JC-P＝5.3Hz，CH2)，67.8(d，2JC-P＝5.2Hz，CH2)，68.0(CH2)，68.1(CH2)，72.0(CH)，72.1(CH)，86.7(d，3JC-P＝8.1Hz，CH)，86.8(d，3JC-P＝8.1Hz，CH)，86.9(CH)，87.0(CH)，116.2(d，3JC-P＝3.3Hz，CH)，116.5(d，3JC-P＝3.5Hz，CH)，122.6(CH)，125.3(CH)，125.4(CH)，125.6(CH)，125.7(CH)，126.2(CH)，126.5(CH)，126.6(CH)，127.6(CH)，127.7(CH)，127.8(C)，127.9(C)，128.0(CH)，128.1(CH)，128.9(CH)，129.0(CH)，129.4(CH)，129.5(CH)，129.6(CH)，129.7(CH)，136.2(C)，137.1(C)，137.2(C)，141.6(d，1JC-F＝233.8Hz，C)，141.7(d，1JC-F＝233.9Hz，C)，147.8(d，2JC-P＝7.7Hz，C)，147.9(d，2JC-P＝7.4Hz，C)，150.5(d，4JC-F＝4.0Hz，C)，159.3(d，2JC-F＝26.1Hz，C)，174.6(d，3JC-P＝5.0Hz，C)，174.9(d，3JC-P＝4.3Hz，C)，m／z(ES)636(MH+，100％)，反相HPLC(在45分钟内用(H2O／MeOH从100／0到0／100)进行洗脱)显示非对映异构体的两个峰，tR34.23min和tR34.59min。C29H29FN3O9P的计算值：C，56.77；H，4.76；N，6.85。实验值：C，56.57；H，5.06；N，6.72。
放射性嘧啶脱氧核苷
[5-3H]dCyd(放射特异性：22Ci／mmol)和[5-3H]dUrd(放射特异性：15.9Ci／mmol)获自MoravekBiochemicalsInc.(Brea，CA)。
标准程序D：氨基磷酸酯的合成(NMI法)
在Ar气氛下，向5-F-dUrd(1.0eq.)在无水THF中的搅拌溶液中逐滴加入溶解在无水THF中的适当氯磷酸酯(3.0当量)。在-78℃，在5分钟时间内，向该反应混合物逐滴加入NMI(5.0当量)。在15分钟后，使反应混合物升至室温并搅拌过夜。在真空下除去溶剂，并且将残余物重新溶解在DCM中，并用0.5MHCl洗涤三次。用MgSO4干燥有机层，过滤，减少至干，并且通过利用洗脱剂的梯度(DCM／MeOH99：1至97：3至95：5)的柱色谱进行纯化。
标准程序E：氨基磷酸酯的合成(tBuMgCl法)
在Ar气氛下，向溶解在无水THF中的5-FdUrd(1.0当量)的搅拌溶液中逐滴加入tBuMgCl(1.1mol当量在THF中的1M溶液)，之后(在30分钟后)加入溶解在无水THF中的适当氯磷酸酯(2.0mol当量)。将所得的反应混合物在室温搅拌过夜。在减压下除去溶剂，并且通过使用洗脱剂的梯度(DCM／MeOH99：1至97：3至95：5)的柱色谱对残余物进行纯化。
5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-O-[苯基(苄氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF381)
使用5-氟-2’-脱氧尿苷(0.40g，1.62mmol)，在四氢呋喃中的叔丁基氯化镁(tBuMgCl)(1.0M，2.43mL，2.43mmol)和苯基(苄氧基-L-丙氨酰)氯磷酸酯(1.08g，3.20mmol)，根据通用程序E制备所述氨基磷酸酯。通过在二氧化硅上、使用CH2Cl2至CH2Cl2-MeOH(95：5)进行洗脱的梯度柱色谱纯化，得到作为无色固体的标题化合物(71.0mg，8％)[Rf＝0.35(CH2Cl2-MeOH，95：5)]，(实验值：MNa+，586.1360.C25H27N3O9NaPF需要[MNa+]，586.1367)；31PNMR(202MHz，MeOD)：TM P3.74，4.14；19FNMR(470MHz，MeOD)：TM F-167.57，-167.46；1HNMR(500MHz，MeOD)：TM H1.35(d，3H，J＝7.4Hz，CHCH3，一种非对映异构体)，1.37(d，3H，J＝6.9Hz，CHCH3，一种非对映异构体)，1.96-2.32(m，2H，H-2’)，3.95-4.08(m，2H，CHCH3，H-4’)，4.23-4.34(m，3H，CH2OP，H-3’)，5.13(brd，1H，J＝12.3Hz，OCHHPh)，5.16(brd，1H，J＝12.3Hz，OCHHPh，一种非对映异构体)，5.17(brd，1H，J＝12.2Hz，OCHHPh，一种非对映异构体)，6.16-6.22(m，1H，H-1’)，7.17-7.25(m，3H，ArH)，7.26-7.40(m，7H，ArH)，7.81-7.85(m，1H，H-6)；13CNMR(125MHz，MeOD)：TM C20.2(d，3JC-P＝7.5Hz，CH3)，20.4(d，3JC-P＝6.2Hz，CH3)，40.6(CH2)，40.9(CH2)，51.6(CH)，51.8(CH)，67.5(d，2JC-P＝5.3Hz，CH2)，67.6(d，2JC-P＝5.5Hz，CH2)，68.0(CH2)，71.8(CH)，71.9(CH)，86.6(d，3JC-P＝8.0Hz，CH)，86.8(d，3JC-P＝8.3Hz，CH)，86.9(CH)，87.0(CH)，121.4(d，3JC-P＝5.1Hz，CH)，121.5(d，3JC-P＝5.6Hz，CH)，125.5(d，5JC-P＝3.2Hz，CH)，125.8(d，5JC-P＝3.2Hz，CH)，126.3(CH)，129.0(CHx2)，129.3(CHx2)，129.6(CHx2)，130.8(CHx2)，140.9(C)，141.6(d，1JC-F＝233.6Hz，C)，141.7(d，1JC-F＝233.6Hz，C)，150.7(d，4JC-F＝5.7Hz，C)，152.1(d，2JC-F＝6.5Hz，C)，159.2(d，2JC-F＝26.3Hz，C)，174.6(d，3JC-P＝4.9Hz，C)，174.7(d，3JC-P＝4.9Hz，C)，m／z(ES)586(MNa+，100％)；反相HPLC(在45分钟内用H2O／MeOH从100／0到0／100进行洗脱，1ml／min，)显示非对映异构体的混合物的一个峰，tR25.08min(97％)。
5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-O-[苯基(甲氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF382)(参考例)
使用5-氟-2’-脱氧尿苷(0.25g，1.01mmol)，N-甲基咪唑(NMI)(0.40mL，5.07mmol)和苯基(甲氧基-L-丙氨酰)氯磷酸酯(0.84g，3.04mmol)，根据通用程序D制备所述氨基磷酸酯。通过利用CH2Cl2至CH2Cl2-MeOH(95：5)进行洗脱的梯度柱色谱纯化，得到作为无色固体的标题化合物(16.0mg，4％)[Rf＝0.30(CH2Cl2-MeOH，95：5)]，(实验值：MNa+，510.1045.C19H23N3O9NaPF需要[MNa+]，510.1054)；31PNMR(202MHz，MeOD)：TM P3.79，4.09；19FNMR(470MHz，MeOD)：TM F-167.78，-167.72；1HNMR(500MHz，MeOD)：TM H1.34(d，3H，J＝7.1Hz，CHCH3，一种非对映异构体)，1.36(d，3H，J＝7.1Hz，CHCH3，一种非对映异构体)，2.02-2.16(m，1H，H-2’)，2.25-2.34(m，1H，H-2’)，3.69(s，3H，OCH3，一种非对映异构体)，3.70(s，3H，OCH3，一种非对映异构体)，3.93-4.02(m，1H，CHCH3)，4.08-4.13(m，1H，H-4’)，4.27-4.45(m，3H，CH2OP，H-3’)，6.20-6.29(m，1H，H-1’)，7.18-7.28(m，3H，ArH)，7.35-7.40(m，2H，ArH)，7.85(d，1H，3JH-F＝6.4Hz，H-6)；13CNMR(125MHz，MeOD)：TM C20.2(d，3JC-P＝7.5Hz，CH3)，20.5(d，3JC-P＝6.7Hz，CH3)，40.8(CH2)，40.9(CH2)，51.5(CH3)，51.6(CH3)，52.7(CH)，52.8(CH)，67.5(d，2JC-P＝5.5Hz，CH2)，67.6(d，2JC-P＝5.1Hz，CH2)，72.0(CH)，72.1(CH)，86.7(d，3JC-P＝8.2Hz，CH)，86.8(d，3JC-P=8.2Hz，CH)，86.9(CH)，87.0(CH)，121.2(d，3JC-P＝4.5Hz，CH)，121.4(d，3JC-P=4.7Hz，CH)，125.6(d，5JC-P=2.9Hz，CH)，125.9(d，5JC-P=2.9Hz，CH)，126.2(CH)，130.8(CH)，130.9(CH)，141.6(d，1JC-F=233.8Hz，C)，141.7(d，1JC-F=233.9Hz，C)，150.6(d，4JC-F=3.6Hz，C)，152.1(d，2JC-P=6.8Hz，C)，152.2(d，2JC-P=6.8Hz，C)，159.4(d，2JC-F＝26.0Hz，C)，175.2(d，3JC-P=4.8Hz，C)，175.5(d，3JC-P=3.7Hz，C)，m／z(ES)510(MNa+，100％)；反相HPLC(在45分钟内利用H2O／MeOH从100／0到0／100进行洗脱，1ml／min，)显示非对映异构体的两个峰，tR23.11min和tR24.11min(74％：24％)。
5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-O-[苯基(乙氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF383)
使用5-氟-2’脱氧尿苷(0.10g，0.40mmol)，N-甲基咪唑(NMI)(0.16mL，2.03mmol)和苯基(乙氧基-L-丙氨酰)氯磷酸酯(0.35g，1.21mmo1)，根据通用程序D制备所述氨基磷酸酯。通过利用CH2C12至CH2C12-MeOH(95：5)进行洗脱的梯度柱色谱纯化，得到作为无色固体的标题化合物(10.0mg，5％)[Rf=0.11(CH2C12-MeOH，95：5)]，(实验值：MNa+，524.1202.C20H25N309NaPF需要[MNa+]，524.1210)；31PNMR(202MHz，MeOD)：TM P3.83，4.11；19FNMR(470MHz，MeOD)：TM F-167.67，-167.61；1HNMR(500MHz，MeOD)：TM H1.25(t，3H，J=7.1Hz，CH2CH3，一种非对映异构体)，1.26(t，3H，J=7.1Hz，CH2CH3，一种非对映异构体)，1.34(d，3H，J=7.2Hz，CHCH3，一种非对映异构体)，1.36(d，3H，J=7.2Hz，CHCH3，一种非对映异构体)，2.02-2.15(m，1H，H-2’)，2.24-2.34(m，1H，H-2’)，3.90-4.00(m，1H，CHCH3，)，4.08-4.19(m，3H，CH2CH3，H-4’)，4.27-4.45(m，3H，CH2OP，H-3’)，6.20-6.28(m，1H，H-1’)，7.18-7.28(m，3H，ArH)，7.34-7.39(m，2H，ArH)，7.85(d，1H，3JH-F=6.4Hz，H-6)；13CNMR(125MHz，MeOD)：TM C14.4(CH3)，15.4(CH3)，20.3(d，3JC-P=7.6Hz，CH3)，20.5(d，3JC-P=6.5Hz，CH3)，40.8(CH2)，40.9(CH2)，51.6(CH)，51.7(CH)，62.4(CH2)，62.5(CH2)，67.5(d，2JC-P=5.4Hz，CH2)，67.6(d，2JC-P=5.4Hz，CH2)，72.0(CH)，72.1(CH)，86.7(d，3JC-P=8.1Hz，CH)，86.8(d，3JC-P=8.3Hz，CH)，86.9(CH)，87.0(CH)，121.3(d，3JC-P=4.8Hz，CH)，121.4(d，3JC-P=4.6Hz，CH)，125.6(d，5JC-P=4.6Hz，CH)，125.8(d，5JC-P=4.8Hz，CH)，126.3(CH)，130.8(CH)，130.9(CH)，141.6(d，1JC-F=233.7Hz，C)，141.8(d，1JC-F=233.8Hz，C)，150.8(brC)，152.0(d，2JC-P=7.1Hz，C)，152.1(d，2JC-P=7.1Hz，C)，159.6(d，2JC-F=26.0Hz，C)，174.8(d，3JC-P=5.4Hz，C)，175.1(d，3JC-P=4.4Hz，C)，m／z(ES)524(MNa+，100％)；反相HPLC(在45分钟内利用H2O／MeOH从100／0到0／100进行洗脱，1ml／min，显示非对映异构体的两个峰，tR25.63min和tR26.40min(71％：27％)。
5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[苯基(异丙氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF384)
使用5-氟-2’-脱氧尿苷(0.25g，1.01mmol)，N-甲基咪唑(NMI)(0.40mL，5.07mmol)和苯基(异丙氧基-L-丙氨酰)氯磷酸酯(0.93g，3.04mmol)，根据通用程序D制备所述氨基磷酸酯。通过利用CH2Cl2至CH2Cl2-MeOH(95：5)进行洗脱的梯度柱色谱纯化，得到作为无色固体的标题化合物(31.0mg，6％)[Rf=0.21(CH2Cl2-MeOH，95：5)]，(实验值：MNa+，538.1370.C21H27N3O9NaPF需要[MNa+]，538.1367)；31PNMR(202MHz，MeOD)：TM P3.87，4.13；19FNMR(470MHz，MeOD)：TM F-167.64，-167.56；1HNMR(500MHz，MeOD)：TM H1.22-1.26(m，6H，CH(CH3)2)，1.33(d，3H，J=7.1Hz，CHCH3，一种非对映异构体)，1.35(d，3H，J=7.1Hz，CHCH3，一种非对映异构体)，2.00-2.15(m，1H，H-2’)，2.23-2.34(m，1H，H-2’)，3.88-3.96(m，1H，CHCH3)，4.08-4.14(m，1H，H-4’)，4.27-4.45(m，3H，CH2OP，H-3’)，4.98(hept，1H，J=6.1Hz，CH(CH3)2)，6.20-6.29(m，1H，H-1’)，7.17-7.29(m，3H，Ar-H)，7.34-7.40(m，2H，Ar-H)，7.84(d，1H，3JH-F=6.4Hz，H-6)；13CNMR(125MHz，MeOD)：TM C20.3(d，3JC-P=7.6Hz，CH3)，20.5(d，3JC-P=6.4Hz，CH3)，21.9(CH3x2)，22.0(CH3x2)，40.8(CH2)，40.9(CH2)，51.7(CH)，51.8(CH)，67.5(d，2JC-P=5.4Hz，CH2)，67.6(d，2JC-P＝5.2Hz，CH2)，70.2(CH)，70.3(CH)，72.0(CH)，72.1(CH)，86.6(d，3JC-P=8.2Hz，CH)，86.8(d，3JC-P=8.2Hz，CH)，86.9(CH)，87.0(CH)，121.2(d，3JC-P=4.7Hz，CH)，121.4(d，3JC-P=4.9Hz，CH)，125.6(d，5JC-P=7.1Hz，CH)，125.9(d，5JC-P=7.1Hz，CH)，126.3(CH)，130.8(CH)，130.9(CH)，141.8(d，1JC-F=234.5Hz，C)，141.9(d，1JC-F=234.4Hz，C)，150.7(d，4JC-F=3.7Hz，C)，152.0(d，3JC-P=6.2Hz，C)，152.1(d，3JC-P=6.2Hz，C)，159.3(d，2JC-F＝26.3Hz，C)，159.4(d，2JC-F=26.0Hz，C)，174.3(d，3JC-P=5.6Hz，C)，174.6(d，3JC-P=4.6Hz，C)，m／z(ES)538(MNa+，100％)；反相HPLC(在45分钟内利用H2O／MeOH从100／0到0／100进行洗脱，1ml／min，显示非对映异构体的两个峰，tR28.93min和tR29.45min(44％：52％)。
5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[苯基(环己氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF508
使用5-氟-2’-脱氧尿苷(0.30g，1.21mmol)，N-甲基咪唑(NMI)(0.48mL，6.09mmol)和苯基(环己氧基-L-丙氨酰)氯磷酸酯(1.026g，3.65mmol)，根据通用程序D制备所述氨基磷酸酯。通过利用CH2Cl2至CH2Cl2-MeOH(95：5)进行洗脱的梯度柱色谱纯化，得到作为无色固体的标题化合物(6.7mg，3％)[Rf=0.45(CH2Cl2-MeOH，95：5)]；(实验值：MNa+，565.48.C24H31N3O9NaPF需要[MNa+]，565.49)；31PNMR(202MHz，MeOD)：TM P3.86，4.15；19FNMR(470MHz，MeOD)：TM F-167.68，-167.62；1HNMR(500MHz，MeOD)：TM H1.26-1.40(m，3H，CHCH3)，1.41-1.50(m，4H，CH(CH2)5)，1.52-1.61(m，1H，CH(CH2)5)，1.70-1.88(m，5H，CH(CH2)5)，2.00-2.14(m，1H，H-2’)，2.23-2.34(m，1H，H-2’)，3.90-3.98(m，1H，CHCH3)，4.07-4.14(m，1H，H-4’)，4.29-4.39(m，2H，CH2OP)，4.40-4.45(m，1H，H-3’)，4.72-4.78(m，1H，CH(CH2)5)，6.20-6.28(m，1H，H-1’)，7.18-7.29(m，3H，ArH)，7.34-7.39(m，2H，ArH)，7.85(d，1H，3JH-F=6.6Hz，H-6)；13CNMR(125MHz，MeOD)：TM C20.3(d，3JC-P=7.3Hz，CH3)，20.6(d，3JC-P=6.5Hz，CH3)，24.6(CH2)，26.4(CH2)，32.3(CH2)，32.4(CH2)，40.9(CH2)，51.7(CH)，51.9(CH)，67.5(d，2JC-P=5.3Hz，CH2)，67.7(d，2JC-P=5.3Hz，CH2)，72.0(CH)，72.1(CH)，74.9(CH)，86.6(d，3JC-P=8.5Hz，CH)，86.8(d，3JC-P=8.5Hz，CH)，86.9(CH)，87.0(CH)，121.3(CH)，121.4(CH)，121.5(CH)，121.6(CH)，125.6(CH)，125.7(CH)，125.8(CH)，125.9(CH)，126.3(CH)，130.1(CH)，141.5(d，1JC-F=234.0Hz，C)，150.7(d，4JC-P=4.0Hz，C)，152.0(d，2JC-P＝7.2Hz，C)，152.1(d，2JC-P=7.2Hz，C)，159.4(d，2JC-F=26.3Hz，C)，174.3(d，3JC-P=4.6Hz，C)，174.5(d，3JC-P=4.3Hz，C)；m／z(ES)565(MNa+，100％)；反相HPLC(在45分钟内利用H2O／MeOH从100／0到0／100进行洗脱，1ml／min， 显示非对映异构体的两个峰，tR30.00min和tR30.45min(33％：65％)。
5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[对硝基-苯基(乙氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF430)
使用5-氟-2’-脱氧尿苷(0.25g，1.01mmol)，N-甲基咪唑(NMI)(0.40mL，5.07mmol)和对硝基-苯基(乙氧基-L-丙氨酰)氯磷酸酯(1.02g，3.04mmol)，根据通用程序D制备所述氨基磷酸酯。通过利用CH2Cl2至CH2Cl2-MeOH(95：5)进行洗脱的梯度柱色谱纯化，得到作为无色固体的标题化合物(77.0mg，14％)[Rf=0.24(CH2Cl2-MeOH，95：5)]，(实验值：MNa+，569.1066.C20H24N4O11NaPF需要[MNa+]，569.1061)；31PNMR(202MHz，MeOD)：TM P3.63，3.67；19FNMR(470MHz，MeOD)：TM F-167.89，-167.82；1HNMR(500MHz，MeOD)：TM H1.24(t，3H，J=7.0Hz，CH2CH3)，1.25(t，3H，J=7.0Hz，CH2CH3)，1.36-1.40(m，3H，CHCH3)，2.16-2.25(m，1H，H-2’)，2.30-2.38(m，1H，H-2’)，3.95-4.00(m，1H，CHCH3)，4.09-4.19(m，3H，CH2CH3，H-4’)，4.32-4.48(m，3H，CH2OP，H-3’)，6.21-6.29(m，1H，H-1’)，7.46(d，1H，J=8.7Hz，ArH)，7.49(d，1H，J=8.7Hz，ArH)，7.85(d，1H，3JH-F=6.6Hz，H-6)，7.87(d，1H，3JH-F=6.6Hz，H-6)，8.29(d，2H，J=8.7Hz，ArH)；13CNMR(125MHz，MeOD)：TM C14.5(CH3)，14.6(CH3)，20.3(d，3JC-P=7.5Hz，CH3)，20.4(d，3JC-P=6.4Hz，CH3)，40.8(CH2)，51.6(CH)，51.7(CH)，62.5(CH2)，67.8(d，2JC-P=5.5Hz，CH2)，68.0(d，2JC-P=5.2Hz，CH2)，71.8(CHx2)，86.4(CH)，86.5(CH)，87.0(d，3JC-P=7.5Hz，CH)，122.1(d，3JC-P=5.2Hz，CH)，122.5(d，3JC-P=5.0Hz，CH)，125.7(CH)，126.0(CH)，126.6(CH)，141.3(d，1JC-F=233.6Hz，C)，141.5(d，1JC-F=233.7Hz，C)，146.2(C)，150.6(d，4JC-P=4.6Hz，C)，156.9(d，2JC-P=2.6Hz，C)，157.0(d，2JC-P=2.6Hz，C)，159.3(d，2JC-F=26.3Hz，C)，174.6(d，3JC-P=4.6Hz，C)，174.9(d，3JC-P=3.7Hz，C)，m／z(ES)569(MNa+，100％)；反相HPLC(在45分钟内利用H2O／MeOH从100／0到0／100进行洗脱，1ml／min，显示非对映异构体的两个峰，tR31.63min和tR31.89min(11％：85％)。
5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基(苄氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF373)
使用5-氟-2’-脱氧尿苷(0.25g，1.01mmol)，N-甲基咪唑(NMI)(0.40mL，5.07mmol)和1-萘基(苄氧基-L-丙氨酰)氯磷酸酯(0.82g，3.04mmol)，根据通用程序D制备所述氨基磷酸酯。通过利用CH2Cl2至CH2Cl2-MeOH(95：5)进行洗脱的梯度柱色谱纯化，得到作为无色固体的标题化合物(47.0mg，8％)[Rf=0.19(CH2Cl2-MeOH，95：5)]，(实验值：MNa+，636.1520.C29H29N3O9NaPF需要[MNa+]，636.1523)；31PNMR(202MHz，MeOD)：TM P4.24，4.59；19FNMR(470MHz，MeOD)：TM F-167.36，-167.18；1HNMR(500MHz，MeOD)：TM H1.34-1.38(m，3H，CHCH3)，1.67-1.79(m，1H，H-2’)，2.08-2.17(m，1H，H-2’)，4.03-4.15(m，2H，CHCH3，H-4’)，4.24-4.36(m，3H，CH2OP，H-3’)，5.08(d，1H，J=12.0Hz，OCHHPh)，5.13(d，1H，J=12.0Hz，OCHHPh)，6.09-6.16(m，1H，H-1’)，7.27-7.45(m，6H，ArH)，7.47-7.55(m，3H，ArH)，7.67-7.72(m，2H，ArH，H-6)，7.86-7.90(m，1H，ArH)，8.12-8.18(m，1H，ArH)；13CNMR(125MHz，MeOD)：TM C20.3(d，3JC-P=7.6Hz，CH3)，20.5(d，3JC-P=6.5Hz，CH3)，40.8(CH2)，40.9(CH2)，51.8(CH)，51.9(CH)，67.6(d，2JC-P=5.3Hz，CH2)，67.8(d，2JC-P=5.2Hz，CH2)，68.0(CH2)，68.1(CH2)，72.0(CH)，72.1(CH)，86.7(d，3JC-P=8.1Hz，CH)，86.8(d，3JC-P=8.1Hz，CH)，86.9(CH)，87.0(CH)，116.2(d，3JC-P=3.3Hz，CH)，116.5(d，3JC-P=3.5Hz，CH)，122.6(CH)，125.3(CH)，125.4(CH)，125.6(CH)，125.7(CH)，126.2(CH)，126.5(CH)，126.6(CH)，127.6(CH)，127.7(CH)，127.8(C)，127.9(C)，128.0(CH)，128.1(CH)，128.9(CH)，129.0(CH)，129.4(CH)，129.5(CH)，129.6(CH)，129.7(CH)，136.2(C)，137.1(C)，137.2(C)，141.6(d，1JC-F＝233.8Hz，C)，141.7(d，1JC-F＝233.9Hz，C)，147.8(d，2JC-P＝7.7Hz，C)，147.9(d，2JC-P＝7.4Hz，C)，150.5(d，4JC-F＝4.0Hz，C)，159.3(d，2JC-F＝26.1Hz，C)，174.6(d，3JC-P＝5.0Hz，C)，174.9(d，3JC-P＝4.3Hz，C)，m/z(ES)636(MNa+，100％)；反相HPLC(在45分钟内利用H2O/MeOH从100/0到0/100进行洗脱，1ml/min，显示非对映异构体的两个峰，tR34.23min和tR34.59min(23％：76％)。
5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基(甲氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF385)
使用5-氟-2’-脱氧尿苷(0.25g，1.01mmol)，N-甲基咪唑(NMI)(0.40mL，5.07mmol)和1-萘基(甲氧基-L-丙氨酰)氯磷酸酯(0.99g，3.04mmol)，根据通用程序D制备所述氨基磷酸酯。通过利用CH2Cl2至CH2Cl2-MeOH(95：5)进行洗脱的梯度柱色谱纯化，得到作为无色固体的标题化合物(7.0mg，1％)[Rf＝0.23(CH2Cl2-MeOH，95：5)]，(实验值：MNa+，560.1198.C23H25N3O9NaPF需要[MNa+]，560.1210)；31PNMR(202MHz，MeOD)：TM P4.31，4.56；19FNMR(470MHz，MeOD)：TM F-167.51，-167.37；1HNMR(500MHz，MeOD)：TM H1.34(d，3H，J＝6.7Hz，CHCH3，一种非对映异构体)，1.36(d，3H，J＝6.7Hz，CHCH3，一种非对映异构体)，1.76-1.87(m，1H，H-2’)，2.12-2.22(m，1H，H-2’)，3.64(s，3H，OCH3，一种非对映异构体)，3.65(s，3H，OCH3，一种非对映异构体)，4.03-4.13(m，2H，CHCH3，H-4’)，4.30-4.38(m，2H，CH2OP)，4.41(dd，1H，J＝2.5Hz，J＝5.8Hz，H-3’)，6.12-6.19(m，1H，H-1’)，7.41-7.46(m，1H，ArH)，7.50-7.58(m，3H，ArH)，7.70-7.76(m，2H，H-6，ArH)，7.87-7.91(m，1H，ArH)，8.15-8.20(m，1H，ArH)；13CNMR(125MHz，MeOD)：TM C20.3(d，3JC-P＝7.1Hz，CH3)，20.4(d，3JC-P＝6.5Hz，CH3)，40.7(CH2)，40.8(CH2)，51.6(CH3)，51.7(CH3)，52.7(CH)，52.8(CH)，67.8(d，2JC-P＝5.7Hz，CH2)，67.5(d，2JC-P＝5.7Hz，CH2)，72.0(CH)，72.1(CH)，86.7(d，3JC-P＝7.9Hz，CH)，86.9(d，3JC-P＝8.5Hz，CH)，86.9(CH)，87.0(CH)，116.2(d，3JC-P＝3.1Hz，CH)，116.5(d，3JC-P＝3.5Hz，CH)，122.5(CH)，122.6(CH)，125.4(CH)，125.5(CH)，125.6(CH)，125.7(CH)，126.1(CH)，126.2(CH)，126.5(CH)，126.6(CH)，127.6(CH)，127.7(Cx2)，127.8(CH)，127.9(CH)，128.9(CH)，129.0(CH)，136.3(C)，141.6(d，1JC-F＝233.4Hz，C)，141.7(d，1JC-F＝234.1Hz，C)，147.8(d，2JC-P＝7.9Hz，C)，148.0(d，2JC-P＝7.2Hz，C)，150.6(C)，159.4(d，2JC-F＝27.0Hz，C)，175.2(d，3JC-P＝3.9Hz，C)，175.5(d，3JC-P＝3.9Hz，C)，m/z(ES)560(MNa+，100％)；反相HPLC(在45分钟内利用H2O/MeOH从100/0到0/100进行洗脱，1ml/min，显示非对映异构体的两个峰，tR28.45min和tR28.85min(73％：25％)。
5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基(乙氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF386)
使用5-氟-2’-脱氧尿苷(0.25g，1.01mmol)，N-甲基咪唑(NMI)(0.40mL，5.07mmol)和1-萘基(乙氧基-L-丙氨酰)氯磷酸酯(1.04g，3.04mmol)，根据通用程序D制备所述氨基磷酸酯。通过利用CH2Cl2至CH2Cl2-MeOH(95：5)进行洗脱的梯度柱色谱纯化，得到作为无色固体的标题化合物(47.0mg，4％)[Rf＝0.25(CH2Cl2-MeOH，95：5)]，(实验值：MNa+，574.1360.C24H27N3O9NaPF需要[MNa+]，574.1367)；31PNMR(202MHz，MeOD)：TM P4.34，4.55；19FNMR(470MHz，MeOD)：TM F-167.31，-167.16；1HNMR(500MHz，MeOD)：TM H1.20(t，3H，J＝7.0Hz，CH2CH3，一种非对映异构体)，1.21(t，3H，J＝7.0Hz，CH2CH3，一种非对映异构体)，1.33-1.37(m，3H，CHCH3)，1.73-1.86(m，1H，H-2’)，2.12-2.21(m，1H，H-2’)，4.01-4.07(m，1H，CHCH3)，4.08-4.13(m，3H，CH2CH3，H-4’)，4.31-4.43(m，3H，CH2OP，H-3’)，6.11-6.19(m，1H，H-1’)，7.39-7.46(m，1H，ArH)，7.50-7.57(m，3H，ArH)，7.68-7.75(m，2H，ArH，H-6)，7.86-7.91(m，1H，ArH)，8.15-8.20(m，1H，ArH)；13CNMR(125MHz，MeOD)：TM C14.4(CH3)，20.3(d，3JC-p＝7.4Hz，CH3)，20.5(d，3JC-P＝6.2Hz，CH3)，40.8(CH2)，40.9(CH2)，51.8(CH)，51.9(CH)，62.4(CH2)，62.5(CH2)，67.8(d，2JC-P＝4.6Hz，CH2)，67.9(d，2JC-P＝4.6Hz，CH2)，72.0(CH)，72.1(CH)，86.7(d，3JC-P＝8.4Hz，CH)，86.8(d，3JC-P＝8.4Hz，CH)，86.9(CH)，87.0(CH)，116.1(d，3JC-P＝3.5Hz，CH)，116.5(d，3JC-P＝3.5Hz，CH)，122.6(CH)，125.4(CH)，125.5(CH)，125.7(CH)，125.8(CH)，126.1(CH)，126.2(CH)，126.5(CH)，126.6(CH)，127.5(CH)，127.6(C)，127.7(C)，127.8(CH)，127.9(CH)，128.9(CH)，129.0(CH)，136.3(C)，141.6(d，1JC-F＝233.3Hz，C)，141.7(d，1JC-F＝233.4Hz，C)，147.8(d，2JC-P＝6.9Hz，C)，148.0(d，2JC-P＝6.9Hz，C)，150.6(C)，159.3(d，2JC-F＝26.3Hz，C)，174.8(d，3JC-P＝4.8Hz，C)，175.1(d，3JC-P＝4.0Hz，C)；m/z(ES)574(MNa+，100％)；反相HPLC(在45分钟内利用H2O/MeOH从100/0到0/100进行洗脱，1ml/min，显示非对映异构体的两个峰，tR30.77min和tR31.20min(51％：48％)。
5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基(异丙氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF387)
使用5-氟-2’-脱氧尿苷(0.10g，0.40mmol)，在四氢呋喃中的叔丁基氯化镁(tBuMgCl)(1.0M，0.61mL，0.61mmol)和1-萘基(异丙氧基-L-丙氨酰)氯磷酸酯(0.31g，0.89mmol)，根据通用程序E制备所述氨基磷酸酯。通过利用CH2Cl2至CH2Cl2-MeOH(95：5)进行洗脱的梯度柱色谱纯化，得到作为无色固体的标题化合物(71.0mg，17％)[Rf＝0.21(CH2Cl2-MeOH，95：5)]，(实验值：MNa+，588.1521.C25H29N3O9NaPF需要[MNa+]，588.1523)；31PNMR(202MHz，MeOD)：TM P4.38，4.58；19FNMR(470MHz，MeOD)：TM F-167.43，-167.26；1HNMR(500MHz，MeOD)：TM H1.19-1.23(m，6H，CH(CH3)2)，1.34-1.38(m，3H，CHCH3)，1.68-1.84(m，1H，H-2’)，2.09-2.20(m，1H，H-2’)，3.96-4.05(m，1H，CHCH3)，4.07-4.12(m，1H，H-4’)，4.29-4.38(m，2H，CH2OP)，4.39-4.42(m，1H，H-3’)，4.93-5.01(m，1H，CH(CH3)2)，5.10-6.18(m，1H，H-1’)，7.40-7.46(m，1H，ArH)，7.50-7.57(m，3H，ArH)，7.70-7.75(m，2H，H-6，ArH)，7.87-7.92(m，1H，ArH)，8.16-8.20(m，1H，ArH)；13CNMR(125MHz，MeOD)：TM C20.3(d，3JC-P＝7.1Hz，CH3)，20.5(d，3JC-P＝6.6Hz，CH3)，21.8(CH3)，21.9(CH3)，22.0(CH3)，22.1(CH3)，40.8(CH2)，40.9(CH2)，51.9(CH)，52.0(CH)，67.8(d，2JC-P＝4.5Hz，CH2)，67.9(d，2JC-P＝4.8Hz，CH2)，70.2(CH)，70.3(CH)，72.0(CH)，72.1(CH)，86.6(CH)，86.7(CH)，86.9(d，3JC-P＝8.6Hz，CH)，87.0(d，3JC-P＝8.6Hz，CH)，116.2(d，3JC-P＝2.5Hz，CH)，116.5(d，3JC-P＝2.7Hz，CH)，122.6(CH)，125.5(CH)，125.7(CH)，126.1(CH)，126.2(CH)，126.5(CH)，127.5(CH)，127.6(C)，127.7(C)，127.8(CH)，127.9(CH)，128.9(CH)，129.0(CH)，136.3(C)，141.6(d，1JC-F＝233.2Hz，C)，141.7(d，1JC-F＝233.4Hz，C)，147.7(d，2JC-P＝7.6Hz，C)，147.9(d，2JC-P＝7.7Hz，C)，150.5(C)，159.4(d，2JC-F＝26.2Hz，C)，174.4(d，3JC-P＝5.0Hz，C)，174.7(d，3JC-P＝5.1Hz，C)；m/z(ES)588(MNa+，100％)；反相HPLC(在45分钟内利用H2O/MeOH从100/0到0/100进行洗脱，1ml/min， 显示非对映异构体的两个峰，tR32.20min和tR32.80min(27％：69％)。
5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基(环己氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF509)
使用5-氟-2’-脱氧尿苷(0.30g，1.21mmol)，N-甲基咪唑(NMI)(0.48mL，6.09mmol)和苯基(环己氧基-L-丙氨酰)氯磷酸酯(1.45g，3.65mmol)，根据通用程序D制备所述氨基磷酸酯。通过利用CH2Cl2至CH2Cl2-MeOH(95：5)进行洗脱的梯度柱色谱纯化，得到作为无色固体的标题化合物(6.7mg，3％)[Rf＝0.47(CH2Cl2-MeOH，95：5)]；(实验值：MNH4 +，623.2261.C28H37N4O9NaPF需要[MNH4 +]，623.2282)；31PNMR(202MHz，MeOD)：TM P4.35，4.52；19FNMR(470MHz，MeOD)：TM F-167.31，-167.17；1HNMR(500MHz，MeOD)：TM H1.30-1.43(m，3H，CHCH3)，1.44-1.56(m，4H，CH(CH2)5)，1.57-1.66(m，1H，CH(CH2)5)，1.67-1.83(m，5H，CH(CH2)5)，1.84-1.93(m，1H，H-2’)，2.09-2.20(m，1H，H-2’)，3.98-4.06(m，1H，CHCH3)，4.07-4.15(m，1H，H-4’)，4.29-4.38(m，2H，CH2OP)，4.39-4.44(m，1H，H-3’)，4.67-4.76(m，1H，CH(CH2)5)，6.09-6.19(m，1H，H-1’)，7.38-7.57(m，5H，ArH)，7.68-7.75(m，1H，ArH)，7.79-7.92(m，1H，ArH)，8.17(d，1H，3JH-F＝6.6Hz，H-6)；13CNMR(125MHz，MeOD)：TM C20.4(d，3JC-P＝8.0Hz，CH3)，20.6(d，3JC-P＝6.5Hz，CH3)，24.5(CH2)，26.3(CH2)，32.3(CH2)，40.8(CH2)，51.8(CH)，51.9(CH)，67.8(CH2)，72.0(CH)，72.2(CH)，75.0(CH)，86.7(d，3JC-P＝8.2Hz，CH)，87.0(CH)，116.1(d，3JC-P＝2.5Hz，CH)，116.4(d，3JC-P＝3.0Hz，CH)，122.6(CH)，124.8(CH)，125.9(CH)，126.1(CH)，126.2(CH)，126.4(CH)，126.5(CH)，126.6(CH)，127.6(CH)，127.7(Cx2)，127.8(CH)，127.9(CH)，128.9(CH)，129.0(CH)，136.3(C)，141.6(C)，148.0(d，2JC-P＝7.2Hz，C)，150.6(C)，159.4(d，2JC-F＝27.0Hz，C)，175.2(d，3JC-P＝3.9Hz，C)，175.5(d，3JC-P＝3.9Hz，C)；m/z(ES)623(MNH4 +，100％)；反相HPLC(在45分钟内利用H2O/MeOH从100/0到0/100进行洗脱，1ml/min，显示非对映异构体的两个峰，tR30.50min和tR31.48min(27％：69％)。
5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[苯基(苄氧基-α，α-二甲基甘氨酸)]磷酸酯(CPF393)
使用5-氟-2’-脱氧尿苷(0.40g，1.62mmol)，在四氢呋喃中的叔丁基氯化镁(tBuMgCl)(1.0M，2.43mL，2.43mmol)和苯基(苄氧基-α，α-二甲基甘氨酸)氯磷酸酯(1.17g，3.20mmol)，根据通用程序E制备所述氨基磷酸酯。通过利用CH2Cl2至CH2Cl2-MeOH(95：5)进行洗脱的梯度柱色谱纯化，得到作为无色固体的标题化合物(69.0mg，7％)[Rf＝0.27(CH2Cl2-MeOH，95：5)]，(实验值：MNa+，600.1527.C26H29N3O9NaPF需要[MNa+]，600.1523)；31PNMR(202MHz，MeOD)：TM P2.42，2.47；19FNMR(470MHz，MeOD)：TM F-167.80，-167.62；1HNMR(500MHz，MeOD)：TM H1.51-1.60(m，6H，C(CH3)2)，1.89-1.97(m，1H，H-2’，一种非对映异构体)，2.07-2.15(m，1H，H-2’，一种非对映异构体)，2.21(ddd，1H，J＝3.4Hz，5.9Hz，13.5Hz，H-2’，一种非对映异构体)，2.29(ddd，1H，J＝3.2Hz，6.1Hz，13.5Hz，H-2’，一种非对映异构体)，4.00-4.07(m，1H，H-4’)，4.22-4.31(m，2H，CH2OP)，4.32-4.36(m，1H，H-3’，一种非对映异构体)，4.37-4.41(m，1H，H-3’，一种非对映异构体)，5.08-5.18(m，2H，OCH2Ph)，6.19-6.25(m，1H，H-1’)，7.20-7.26(m，3H，ArH)，7.27-7.39(m，7H，ArH)，7.74(d，3JH-F＝6.4Hz，H-6，一种非对映异构体)，7.80(d，3JH-F＝6.4Hz，H-6，一种非对映异构体)；13CNMR(125MHz，MeOD)：TM C27.5(CH3)，27.7(d，3JC-P＝7.1Hz，CH3)，27.8(d，3JC-P＝7.1Hz，CH3)，40.8(CH2)，40.9(CH2)，58.2(C)，58.3(C)，67.6(d，2JC-P＝5.5Hz，CH2)，67.7(d，2JC-P＝5.5Hz，CH2)，68.3(CH2)，71.9(CH)，72.0(CH)，86.6(d，3JC-P＝8.1Hz，CH)，86.8(d，3JC-P＝7.3Hz，CH)，86.9(CH)，121.4(d，3JC-P＝4.8Hz，CH)，121.6(d，3JC-P＝4.5Hz，CH)，125.6(CH)，125.8(CH)，125.9(CH)，126.1(CH)，126.2(CH)，129.3(CH)，129.4(CH)，129.6(CH)，130.7(CH)，130.8(CH)，137.2(C)，137.3(C)，141.8(d，1JC-F＝233.7Hz，C)，150.6(C)，152.1(d，4JC-F＝7.0Hz，C)，152.1(d，4JC-F＝7.6Hz，C)，159.3(d，2JC-F＝26.1Hz，C)，159.4(d，2JC-F＝26.1Hz，C)，176.5(d，3JC-P＝4.0Hz，C)，176.6(d，3JC-P＝3.8Hz，C)，m/z(ES)600.1(MNa+，100％)；反相HPLC(在35分钟内利用H2O/MeOH从100/0到0/100进行洗脱，1ml/min，显示非对映异构体的混合物的一个峰，tR17.71(96％)。
5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[苯基(乙氧基-α，α-二甲基甘氨酸)]磷酸酯(CPF394)
使用5-氟-2’-脱氧尿苷(0.20g，0.80mmol)，N-甲基咪唑(NMI)(0.31mL，4.0mmol)和苯基(乙氧基-α，α-二甲基甘氨酸)氯磷酸酯(0.73g，2.40mmol)，根据通用程序D制备所述氨基磷酸酯。通过利用CH2Cl2至CH2Cl2-MeOH(95：5)进行洗脱的梯度柱色谱纯化，得到作为无色固体的标题化合物(25.0mg，6％)[Rf＝0.24(CH2Cl2-MeOH，95：5)]，(实验值：MNa+，538.1367.C21H27N3O9NaPF需要[MNa+]，538.1367)；31PNMR(202MHz，MeOD)：TM P2.49，2.52；19FNMR(470MHz，MeOD)：TM F-167.62，-167.58；1HNMR(500MHz，MeOD)：TM H1.24(t，3H，J＝7.1Hz，CH2CH3，一种非对映异构体)，1.26(t，3H，J＝7.1Hz，CH2CH3，一种非对映异构体)，1.44-1.54(m，6H，C(CH3)2)，1.95-2.04(m，1H，H-2’，一种非对映异构体)，2.13-2.21(m，1H，H-2’，一种非对映异构体)，2.24(ddd，1H，J＝3.1Hz，J＝6.3Hz，J＝13.5Hz，H-2’，一种非对映异构体)，2.31(ddd，1H，J＝3.2Hz，J＝6.1Hz，J＝13.7Hz，H-2’，一种非对映异构体)，4.08-4.19(m，3H，CH2CH3，H-4’)，4.33-4.49(m，3H，CH2OP，H-3’)，6.20-6.30(m，1H，H-1’)，7.23-7.28(m，3H，ArH)，7.33-7.40(m，2H，ArH)，7.80(d，3JH-F＝6.4Hz，H-6，一种非对映异构体)，7.88(d，3JH-F＝6.4Hz，H-6，一种非对映异构体)；13CNMR(125MHz，MeOD)：TM C14.4(CH3)，14.5(CH3)，27.5(d，3JC-P＝7.3Hz，CH3)，27.7(d，3JC-P＝7.6Hz，CH3)，27.8(d，3JC-P＝7.6Hz，CH3)，40.8(CH2)，40.9(CH2)，58.1(C)，62.6(CH2)，62.7(CH2)，67.6(d，2JC-P＝6.7Hz，CH2)，67.7(d，2JC-P＝5.8Hz，CH2)，71.9(CH)，72.0(CH)，86.6(d，3JC-P＝8.1Hz，CH)，86.8(d，3JC-P＝7.6Hz，CH)，86.9(CH)，121.4(d，3JC-P＝4.4Hz，CH)，121.6(d，3JC-P＝4.4Hz，CH)，125.6(CH)，125.8(CH)，125.9(CH)，126.1(CH)，126.2(CH)，130.7(CH)，130.8(CH)，130.9(CH)，141.8(d，1JC-F＝233.5Hz，C)，150.6(C)，150.7(C)，152.2(d，4JC-F＝7.3Hz，C)，152.3(d，4JC-F＝6.9Hz，C)，159.2(d，2JC-F＝20.3Hz，C)，159.4(d，2JC-F＝20.4Hz，C)，176.6(d，3JC-P＝4.2Hz，C)，176.8(d，3JC-P＝4.6Hz，C)，m/z(ES)538.1(MNa+，100％)；反相HPLC(在45分钟内利用H2O/MeOH从100/0到0/100进行洗脱，1ml/min，显示非对映异构体的两个峰，tR18.76min和tR20.44min(68％：30％)。
5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基(苄氧基-α，α-二甲基甘氨酸)]磷酸酯(CPF395)
使用5-氟-2’-脱氧尿苷(0.40g，1.62mmol)，N-甲基咪唑(NMI)(0.64mL，8.0mmol)和1-萘基(苄氧基-α，α-二甲基甘氨酸)氯磷酸酯(2.00g，4.80mmol)，根据通用程序D制备所述氨基磷酸酯。通过利用CH2Cl2至CH2Cl2-MeOH(95：5)进行洗脱的梯度柱色谱纯化，得到作为无色固体的标题化合物(16.4mg，6％)[Rf＝0.15(CH2Cl2-MeOH，95：5)]，(实验值：MNa+，650.1678.C30H31N3O9NaPF需要[MNa+]，650.1680)；31PNMR(202MHz，MeOD)：TM P2.87，3.03；19FNMR(470MHz，MeOD)：TM F-167.95，-167.13；1HNMR(500MHz，MeOD)：TM H1.37-1.42(m，6H，C(CH3)2)，1.61-1.69(m，1H，H-2’，一种非对映异构体)，1.79-1.87(m，1H，H-2’，一种非对映异构体)，2.06(ddd，1H，J＝3.0Hz，J＝6.1Hz，J＝13.6Hz，H-2’，一种非对映异构体)，2.15(ddd，1H，J＝3.2Hz，J＝5.9Hz，J＝13.7Hz，H-2’，一种非对映异构体)，3.98-4.04(m，1H，H-4’)，4.19-4.35(m，3H，CH2OP，H-3’)，5.09-5.13(m，1H，OCHHPh)，5.18-5.19(m，1H，OCHHPh)，6.05-6.15(m，1H，H-1’)，7.28-7.40(m，7H，ArH)，7.48-7.55(m，3H，ArH)，7.62(d，3JH-F＝6.4Hz，H-6，一种非对映异构体)，7.70(d，3JH-F＝6.4Hz，H-6，一种非对映异构体)，7.86-7.90(m，1H，ArH)，8.17-8.22(m，1H，ArH)；13CNMR(125MHz，MeOD)：TM C27.5(d，3JC-P＝4.4Hz，CH3)，27.9(d，3JC-P＝7.3Hz，CH3)，28.0(d，3JC-P＝7.3Hz，CH3)，40.7(CH2)，40.8(CH2)，65.2(C)，67.8(d，2JC-P＝6.5Hz，CH2)，68.3(CH2)，72.0(CH)，72.1(CH)，86.6(d，3JC-P＝8.2Hz，CH)，86.8(d，3JC-P＝7.8Hz，CH)，86.9(CH)，116.3(d，3JC-P＝3.2Hz，CH)，116.7(d，3JC-P＝2.9Hz，CH)，122.8(CH)，122.9(CH)，125.4(CH)，125.5(CH)，125.6(CH)，126.0(CH)，126.1(CH)，126.4(CH)，126.5(CH)，127.4(CH)，127.5(CH)，127.7(CH)，127.8(CH)，127.9(C)，128.0(CH)，128.9(CH)，129.3(CH)，129.4(CH)，129.6(CH)，136.2(C)，137.3(C)，141.8(d，1JC-F＝234.4Hz，C)，147.9(d，3JC-P＝7.7Hz，C)，148.0(d，3JC-P＝8.2Hz，C)，150.7(d，4JC-F＝3.7Hz，C)，159.5(d，2JC-F＝25.8Hz，C)，159.6(d，2JC-F＝25.8Hz，C)，176.5(C)，176.6(C)，m/z(ES)650.0(MNa+，100％)；反相HPLC(在45分钟内利用H2O/MeOH从100/0到0/100进行洗脱，1ml/min，显示非对映异构体的两个峰，tR20.80min和tR21.00min(72％：24％)。
5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基(乙氧基-α，α-二甲基甘氨酸)]磷酸酯(CPF396)
使用5-氟-2’-脱氧尿苷(0.40g，1.62mmol)，在四氢呋喃中的叔丁基氯化镁(tBuMgCl)(1.0M，2.43mL，2.43mmol)和1-萘基(乙氧基-α，α-二甲基甘氨酸)氯磷酸酯(1.14g，3.20mmol)，根据通用程序E制备所述氨基磷酸酯。通过利用CH2Cl2至CH2Cl2-MeOH(95：5)进行洗脱的梯度柱色谱纯化，得到作为无色固体的标题化合物(54.0mg，2％)[Rf＝0.10(CH2Cl2-MeOH，95：5)]，(实验值：MNa+，588.1528.C25H29N3O9NaPF需要[MNa+]，588.1523)；31PNMR(202MHz，MeOD)：TM P2.91，3.03；19FNMR(470MHz，MeOD)：TM F-167.38，-167.21；1HNMR(500MHz，MeOD)：TM H1.24(t，3H，J＝7.1Hz，CH2CH3，一种非对映异构体)，1.25(t，3H，J＝7.1Hz，CH2CH3，一种非对映异构体)，1.50-1.55(m，6H，C(CH3)2)，1.68-1.76(m，1H，H-2’，一种非对映异构体)，1.87-1.94(m，1H，H-2’，一种非对映异构体)，2.09(ddd，1H，J＝2.9Hz，J＝6.3Hz，J＝13.4Hz，H-2’，一种非对映异构体)，2.19(ddd，1H，J＝3.0Hz，J＝6.3Hz，J＝13.8Hz，H-2’，一种非对映异构体)，4.07-4.10(m，1H，H-4’)，4.16(q，2H，J＝7.1Hz，CH2CH3)，4.36-4.41(m，3H，CH2OP，H-3’)，6.10-6.18(m，1H，H-1’)，7.40-7.46(m，1H，ArH)，7.50-7.59(m，3H，ArH)，7.66-7.72(m，2H，ArH，H-6)，7.85-7.91(m，1H，ArH)，8.18-8.24(m，1H，ArH)；13CNMR(125MHz，MeOD)：TM C14.4(CH3)，27.5(brs，CH3)，27.9(d，3JC-P＝6.1Hz，CH3)，28.0(d，3JC-P＝6.1Hz，CH3)，40.7(CH2)，40.8(CH2)，58.2(C)，58.3(C)，62.6(CH2)，67.8(d，2JC-P＝4.9Hz，CH2)，67.9(d，2JC-P＝4.5Hz，CH2)，72.0(CH)，72.1(CH)，86.7(d，3JC-P＝7.7Hz，CH)，86.9(d，3JC-P＝7.3Hz，CH)，87.0(CH)，116.3(d，3JC-P＝3.2Hz，CH)，116.6(d，3JC-P＝2.9Hz，CH)，122.8(CH)，122.9(CH)，125.4(CH)，125.6(CH)，125.7(CH)，126.0(CH)，126.1(CH)，126.5(CH)，127.4(CH)，127.5(CH)，127.7(CH)，127.8(CH)，127.9(C)，128.0(C)，128.9(CH)，136.2(C)，141.8(d，1JC-F＝233.5Hz，C)，148.0(d，2JC-P=7.3Hz，C)，148.1(d，2JC-P=7.6Hz，C)，150.5(C)，150.6(C)，159.3(d，2JC-F=26.2Hz，C)，159.4(d，2JC-F=26.6Hz，C)，176.8(C)，176.9(C)；m／z(ES)588.1(MNa+，100％)；反相HPLC(在45分钟内利用H2O／MeOH从100／0到0／100进行洗脱，1ml／min，)显示非对映异构体的混合物的一个峰，tR16.05min(96％)。
5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-O-[苯基(苄氧基-L-脯氨酰)]磷酸酯(CPF583)
根据标准程序D，由5-氟-2’-脱氧尿苷(0.25g，1.01mmol)，NMI(0.41g，5.07mmol，0.40mL)和苯基(苄氧基-L-脯氨酰)-氯磷酸酯(0.77g，2.03mmol)在THF(10mL)中制备。柱纯化，之后是两次制备型TLC纯化，得到作为白色固体的产物(0.010g，2％)。
31P—NMR(MeOD，202MHz)δ1.82
19F—NMR(MeOD，470MHz)δ—167.91
1H—NMR(MeOD，500MHz)δ7.84(d，J=7.18Hz，1H，H-碱基)，7.39—7.33(m，7H，H-Ar)，7.22—7.19(m，3H，H-Ar)，6.26—6.23(m，1H，H-1’)，5.22—5.13(m，CH2Ph酯)，4.40—4.35(m，3H，NCH，2xH-5’)，4.33—4.28(m，1H，H-3’)，4.06—4.04(m，1H，H-4’)，3.36—3.32(m，2H，NCH2)，2.26—2.19(m，1H，H-2’)，2.18—2.13(m，1H，CH2-L—Pro)，2.00—1.81(m，4H，3xH，CH2-L-Pro，1xH，H-2’)
13C—NMR(MeOD，125MHz)δ174.81(C=O，酯)，159.40(C=O，碱基)，152.0(d，2JC-P=6.32Hz，OC—Ar)，150.71(C=O，碱基)，141.88(1JC-F=232Hz，CF，碱基)，137.23(C-Ar)，131.33，129.70，129.48，129.45，129.30，126.45(CH-Ar)，125.80，125.53(2xd，2JC-F=29.0Hz，CH-碱基)，121.00，120.96(CH-Ar)，87.80(C-1’)，86.80(C-4’)，72.02(C-3’)，68.16(CH2Ph)，67.64(d，2JC-P=4.65Hz，C-5’)，62.40(d，2JC-P=5.60Hz，NCH)，48.03(d，2JC-P=4.80Hz，NCH2)，41.07(C-2’)，32.18，32.11(CH2-L—Pro)，26.29，26.21(CH2-L—Pro)。
MS(ES+)m／e：612(MNa+，100％)，590(MH+，1％)精确质量：C27H29FN3O9P所需的589.51
5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基(苄氧基-L-脯氨酰)]磷酸酯(CPF577)
根据标准程序D，由5-氟-2’-脱氧尿苷(0.25g，1.01mmol)，NMI(0.41g，5.07mmol，0.40mL)和1-萘基(苄氧基-L-脯氨酰)-氯磷酸酯(0.84g，2.03mmol)在THF(10mL)中制备。柱纯化，之后是两次制备型TLC纯化，得到作为白色固体的产物(0.006g，1％)。
31P—NMR(MeOD，202MHz)δ2.27
19F—NMR(MeOD，121MHz)δ—167.46
1H—NMR(MeOD，500MHz)δ8.14—8.12(m，1H，H-Ar)，7.90—7.89(m，1H，H-Ar)，7.74—7.71(m，2H，1xH-Ar，1xH-基)，7.56—7.42(m，4H，H-Ar)，7.36—7.33(m，5H，H-Ar)，6.13(t，J=6.38Hz，H-1’)，5.22—5.13(m，2H，CH2Ph)，4.49—4.46(m，1H，NCH)，4.42—4.33(m，2H，H-5’)，4.25—4.23(m，1H，H-3’)，4.06—4.04(m，1H，H-4’)，3.36—3.34(m，2H，NCH2)，2.23—2.15(m，1H，CH2-L—Pro)，2.10—2.02(m，2H，1xH，CH2-L—Pro，1xH，H-2’)，1.97—1.77(m，2H，CH2-L—Pro)，1.63—1.57(m，1H，H-2’)
13C—NMR(MeOD，125MHz)δ174.82(C=O，酯)，159.52(C=O，碱基)，150.54(C=O，碱基)，147.84，147.78(d，2JC-P=6.03Hz，OC—Ar)，141.75，139.97(2xd，1JC-F=232Hz，CF，碱基)，137.20，136.34(C—Ar)，129.76，129.65，129.44，129.36，129.27，129.06，128.95，128.04，128.75，126.56(CH-Ar)，125.41(d，2JC-F=30.0Hz，CH-碱基)，122.13(CH-Ar)，115.76(d，3JC-P=3.3Hz，CH-Ar)，87.06(C-1’)，86.79(C-4’)，72.23(C-3’)，68.15(d，2JC-P=5.46Hz，C-5’)，68.08(CH2Ph)，62.53(d，2JC-P=5.60Hz，NCH)，48.26(d，2JC-P=5.34Hz，NCH2)，40.97(C-2’)，32.16，32.09(CH2-L—Pro)，26.22，26.15(CH2-L—Pro)。
5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基(3，3-二甲基-1-丁氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF585)
根据标准程序D，由5-氟-2’-脱氧尿苷(0.25g，1.01mmol)，NMI(0.41g，5.07mmol，0.40mL)和1-萘基-(3，3-二甲基-1-丁氧基-L-丙氨酰)-氯磷酸酯(1.21g，3.04mmol)在THF(10mL)中制备。柱纯化，之后是两次制备型TLC纯化，得到作为白色固体的产物(0.010g，2％)。
31P—NMR(MeOD，202MHz)δ4.48，4.33
19F—NMR(MeOD，470MHz)δ—167.30，-167.47
1H—NMR(MeOD，500MHz)δ8.20—8.17(m，1H，H-Ar)，7.91—7.89(m，1H，H-Ar)，7.77—7.72(m，2H，H-Ar)，7.58—7.51(m，3H，H-碱基，2xH-Ar)，7.46—7.41(2xt，1H，J=7.8Hz，H-Ar)，6.19—6.13(m，1H，H-1’)，4.42—4.40(m，1H，1xH-5’)，4.38—4.32(m，2H，H-3’，1xH-5’)，4.14—4.00(m，4H，H-4’，CHCH3，OCH2CH2(CH3)3)，2.21—2.13(m，1H，1xH-2’)，1.91—1.76(m，1H，1xH-2’)，1.52—1.48(m，2H，OCH2CH2(CH3)3)，1.37—1.35(m，3H，CHCH3)，0.92，0.91(2xs，9H，OCH2CH2(CH3)3)13C—NMR(MeOD，125MHz)δ175.16，174.84(2xd，3JC-P=4.75Hz，C=O，酯)，159.56，159.35(C=O，酯)，150.61(C=O，酯)，148.00，147.86(2xd，2JC-P=6.25Hz，OC—Ar)，141.78，141.73(2xd，1JC-F=232Hz，CF，碱基)，136.28(C-Ar)，128.98，128.95，127.92，127.90，127.58，126.57，126.20，126.14(CH-Ar)，125.63，125.55(2xd，2JC-F=34Hz，CH，碱基)，122.65，122.63(CH-Ar)，116.48，116.15(2xd，3JC-P=3.0Hz，CH-Ar)，87.01，86.94(C-1’)，86.73，86.68(d，3JC-P=7.75Hz，C-4’)，72.18，72.07(C-3’)，67.87，67.85(2xd，2JC-P=5.0Hz，C-5’)，64.08，64.05(OCH2CH2(CH3)3)，51.86(d，3JC-P=5.5Hz，CHCH3)，42.74(OCH2CH2(CH3)3)，40.91，40.83(C-2’)，29.96(OCH2CH2(CH3)3)，20.50，20.34(2xd，3JC-P=6.5Hz，CHCH3).
MS(ES+)m／e：630(MNa+，100％)，608(MH+，10％)精确质量：C28H35FN3O9P所需的607.56
5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基-(环丁氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF578)
根据标准程序D，由5-氟-2’-脱氧尿苷(0.23g，0.93mmol)，NMI(0.38g，4.67mmol，0.37mL)和1-萘基-(环丁氧基-L-丙氨酰)-氯磷酸酯(0.85g，2.33mmol)在THF(10mL)中制备。柱纯化，之后是制备型TLC纯化，得到作为白色固体的产物(0.010g，2％)。
31P—NMR(MeOD，202MHz)δ4.54，4.36
19F—NMR(MeOD，470MHz)δ—167.12，-167.29
1H—NMR(MeOD，500MHz)δ8.18—8.17(m，1H，H-Ar)，7.81—7.87(m，1H，H-Ar)，
7.74—7.71(m，2H，1xH-Ar，1xH-碱基)，7.60—7.53(m，3H，H-Ar)，7.46—7.43(2xt，J=8.0Hz，1H，H-Ar)，6.18—6.12(m，1H，H-1’)，5.00—4.95(m，1H，OCH酯)，4.41—4.36(m，3H，2xH-5’，H-3’)，4.11—4.00(m，2H，H-4’，CHCH3)，2.36—2.27(m，2H，CH2)，2.18—1.98(m，3H，CH2酯，1xH-2’)，1.82—1.56(m，3H，CH2酯，1xH-2’)，1.36—1.34(m，3H，CHCH3)
13C—NMR(MeOD，125MHz)δ175.97，173.34(C=O，酯)，159.88(C=O，碱基)，151.64(C=O，碱基)，146.58(OC—Ar)，141.15(d，1JC-F=220Hz，CF，碱基)，136.28(C-Ar)，128.93，127.89，127.54，126.52，126.18，126.14(CH-Ar)，125.53，125.44(2xd，2JC-F=32.5Hz，CH-碱基)，122.63(CH-Ar)，116.46，116.44(2xd，3JC-P=2.5Hz，CH-Ar)，86.98(d，3JC-P=6.25Hz，C-4’)，86.71(C-1’)，72.14，72.04(C-3’)，71.07(OCH酯)，67.83(d，2JC-P=7.38Hz，C-5’)，51.66(d，2JC-P=8.75Hz，CHCH3)，40.89，40.83(C-2’)，31.03(OCHCH2)，20.43(CHCH3)，14.23(CH2酯).
MS(ES+)m／e：600(MNa+，100％)，578(MH+，10％)精确质量：C26H29FN3O9P所需的577.50
5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基-(环丙基甲氧基(methanoxy)-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF579)
根据标准程序D，由5-氟-2’-脱氧尿苷(0.25g，1.01mmol)，NMI(0.41g，5.07mmol，0.40mL)和1-萘基-(环丙基甲氧基-L-丙氨酰)-氯磷酸酯(0.93g，2.54mmol)在THF(10mL)中制备。柱纯化得到作为白色固体的产物(0.056g，10％)。
31P—NMR(MeOD，202MHz)δ4.58，4.30
19F—NMR(MeOD，470MHz)δ—167.18，-167.22
1H—NMR(MeOD，500MHz)δ8.18(d，J=7.0Hz，1H，H-Ar)，7.89-7.87(m，1H，H-Ar)，7.73-7.70(m，2H，H-Ar)，7.58-7.53(m，3H，H-Ar)，7.45-7.40(2xt，J＝8.0Hz，1H，H-Ar)，6.17-6.11(m，1H，H-1’)，4.43-4.41(m，1H，H-5’)，4.38-4.32(m，2H，H-5’，H-3’)，4.11-4.04(m，2H，H-4’，CHCH3)，3.95-3.85(m，2H，OCH2酯)，2.19-2.11(m，1H，H-2’)，1.84-1.72(m，1H，H-2’)，1.38，1.36(2xd，J＝5.0Hz，3H，CHCH3)，1.15-1.07(m，1H，OCH2CH酯)，0.59-0.50(m，2H，CH2酯)，0.30-0.24(m，2H，CH2酯)
13C-NMR(MeOD，125MHz)δ175.25，174.94(2xd，3JC-P＝4.75Hz，C＝O，酯)，159.54，159.35(C＝O，碱基)，150.60，150.56(C＝O，碱基)，148.05，147.86(2xd，2JC-P＝7.5Hz，OC-Ar)，141.79，141.73(2xd，1JC-F＝232Hz，CF，碱基)，136.29(C-Ar)，128.94(d，3JC-P＝4.4Hz，CH-Ar)，127.89(d，4JC-P＝3.7Hz，CH-Ar)，127.56，126.55，126.52，126.19，126.16(CH-Ar)，125.64，125.53(2JC-F＝34Hz，CH-碱基)，122.65(CH-Ar)，116.54，116.24(2xd，4JC-P＝2.6Hz，CH-Ar)，87.04，86.99(C-1’)，86.90，86.73(2xd，3JC-P＝7.1Hz，C-4’)，72.18，72.07(C-3’)，71.21，71.18(OCH2，酯)，67.87，67.84(表观t，2JC-P＝5.0Hz，C-5’)，51.88(d，2JC-P＝10.0Hz，CHCH3)，40.91，40.83(C-2’)，20.60，20.46(2xd，3JC-P＝6.5Hz，CHCH3)，10.69(OCH2CH酯)，3.70，3.65(2xCH2，酯).
MS(ES+)m／e：600(MNa+，100％)，578(MH+，15％)精确质量：C26H29FN309P所需的577.50.
HPLCb(H2O／乙腈从100／0至0／100，在35分钟内)Rt12.91分钟。
5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基-(四氢吡喃氧基(tetrahydropyroxy)-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF580)
根据标准程序E由5-氟-2’-脱氧尿苷(0.25g，1.01mmol)，tBuMgCl(1.1mL，1.1mmol)和1-萘基-(四氢吡喃氧基-L-丙氨酰)-氯磷酸酯(0.80g，2.03mmol)在THF(10mL)中制备。柱纯化，之后是两次制备型TLC纯化，得到作为白色固体的产物(0.010g，1.6％)。
31P-NMR(MeOD，202MHz)δ3.77，3.22
19F-NMR(MeOD，470MHz)δ-168.27，-168.35
1H-NMR(MeOD，500MHz)δ8.60(d，J＝7.0Hz，2H，H-Ar)，8.22-8.19(m，1H，H-Ar)，7.92-7.91(d，J＝5.50Hz，1H，H-Ar)，7.60-7.45(m，4H，H-Ar，H-碱基)，6.29-6.25(m，1H，H-1’)，5.25-5.17(m，1H，H-3’)，4.96-4.87(m，1H，CH-酯)，4.28-4.26(m，1H，H-4’)，4.11-4.03(m，1H，CHCH3)，3.88-3.66(m，4H，2xOCH2a’酯，2xH-5’)，3.55-3.50(m，2H，2xOCH2a”酯)，2.63-2.30(m，2H，H-2’)，1.91-1.85(m，2H，2xCH2b’酯)，1.65-1.54(m，2H，CH2b”酯)，1.39-1.35(m，3H，CHCH3).
13C-NMR(MeOD，125MHz)δ174.34(C＝O，酯)，159.24(C＝O，碱基)，150.76(C＝O，碱基)，148.03(OC-Ar)，141.97(d，1JC-F＝238Hz，CF，碱基)，136.37(C-Ar)，
128.97，128.56，127.61，127.57，126.58，126.23，126.16，126.12，125.84(CH-Ar)，122.70(d，2JC-F＝24.0Hz，CH-碱基)，116.62，116.37(CH-Ar)，87.54(d，3JC-P＝5.40Hz，C-4’)，86.60，86.57(C-1’)，79.82，79.47(C-3’)，71.45(CH-酯)，66.12，66.08(2xOCH2a酯)，66.02(C-5’)，51.83(CHCH3)，39.97，39.94(C-2’)，32.65，32.57(2xCH2b酯)，20.45，20.30(CHCH3).
MS(ES+)m／e：630(MNa+，100％)，608(MH+，10％)精确质量：C27H31FN3O10P所需的607.52。
5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基-(戊氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF581)
根据标准程序E，由5-氟-2’-脱氧尿苷(0.25g，1.01mmol)，tBuMgCl(1.1mL，1.1mmol)和1-萘基-(戊氧基-L-丙氨酰)-氯磷酸酯(0.78g，2.03mmol)在THF(10mL)中制备。柱纯化得到作为白色固体的产物(0.047g，8％)。
31P-NMR(MeOD，202MHz)δ4.48，4.32
19F-NMR(MeOD，470MHz)δ-167.18，-167.29
1H-NMR(MeOD，500MHz)δ8.25-8.17(m，1H，H-Ar)，8.05-7.95(m，2H，H-Ar)，7.85-7.60(m，2H，H-Ar，H-碱基)，7.65-7.48(m，3H，H-Ar)，6.30-6.18(m，1H，H-1’)，4.60-4.37(m，3H，2xH-5’，H-3’)，4.28-4.00(m，4H，H-4’，CHCH3，OCH2CH2CH2CH2CH3)，2.32-2.2(m，1H，H-2’)，1.95-1.75(m，1H，H-2’)，1.70-1.55(m，2H，OCH2CH2CH2CH2CH3)，1.50-1.28(m，7H，4xHOCH2CH2CH2CH2CH3，CHCH3)，0.83，0.82(2xd，J＝7.9Hz，3H，OCH2CH2CH2CH2CH3)
13C-NMR(MeOD，125MHz)δ175.22，174.91(C＝O，酯)，159.5(C＝O，碱基)，150.54(C＝O，碱基)，147.90，147.88(OC-Ar)，141.75(d，1JC-F＝225Hz，CF，碱基)，136.37(C-Ar)，128.95，127.90，127.56，126.55，126.19(CH-Ar)，125.64，125.53(2xd，2JC-F＝34.0Hz，CH-碱基)，122.65(CH-Ar)，116.51，116.21(CH-Ar)，87.03，86.96(C-1’)，86.85，86.74(C-4’)，72.16，72.05(C-3’)，67.87(d，2JC-P＝5.0Hz，C-5’)，66.54(OCH2)，51.87，51.81(d，2JC-P＝7.5Hz，CHCH3)，40.87，40.80(C-2’)，29.35，29.10(CH2酯)，23.33(CH2酯)，20.60，20.43(2xd，3JC-P＝6.5Hz，CHCH3)，14.28(CH3，酯).
MS(ES+)m／e：616(MNa+，100％)，594(MH+，10％)精确质量：C27H33FN3O9P所需的593.54。
HPLCb(H2O／乙腈从100／0至0／100，在35分钟内)室温15.56分钟。
5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基-(环戊氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF582)
根据标准程序E，由5-氟-2’-脱氧尿苷(0.25g，1.01mmol)，tBuMgCl(1.1mL，1.1mmol)和1-萘基-(环戊氧基-L-丙氨酰)-氯磷酸酯(0.77g，2.03mmol)在THF(10mL)中制备。柱纯化得到作为白色固体的产物(0.030g，5％)。
31P-NMR(MeOD，202MHz)δ4.53，4.37
19F-NMR(MeOD，470MHz)δ-167.07，-167.19
1H-NMR(MeOD，500MHz)δ8.18-8.16(m，1H，H-Ar)，7.89-7.85(m，1H，H-Ar)，7.70(表观t，J＝6.50Hz，2H，H-Ar)，7.57-7.50(m，3H，2xH-Ar，H-碱基)，7.45-7.40(m，1H，H-Ar)，6.16-6.11(m，1H，H-1’)，5.15-5.09(m，1H，OCH酯)，4.41-4.30(m，3H，2xH-5’，H-3’)，4.11-4.08(m，1H，H-4’)，4.04-3。98(m，1H，CHCH3)，2.19-2.10(m，1H，H-2’)，1.86-1.73(m，3H，OCHCH2酯)，1.73-1.56(m，6H，H-2’，CH2酯)，1.35，1.34(2xd，J＝6.57Hz，CHCH3)
13C-NMR(MeOD，125MHz)δ174.68，174.64(C＝O，酯)，159.27(C＝O，碱基)，150.51(C＝O，碱基)，147.86(d，2JC-P＝7.5Hz，OC-Ar)，141.78，141.72(2xd，1JC-F＝232Hz，CF-碱基)，136.30(C-Ar)，128.95，128.54，127.94，127.80，127.60，127.56，127.17，126.80，126.54，126.19，126.16(CH-Ar)，125.66，125.53(2xd，2JC-F＝34Hz，CH-碱基)，122.65，122.61(CH-Ar)，116.53，116.22(2xd，4JC-P＝3.75Hz，CH-Ar)，86.99，86.96(C-1’)，86.70(d，3JC-P＝7.50Hz，C-4’)，79.64，79.61(OCH酯)，72.21，72.07(C-3’)，67.89，67.85(2xd，2JC-P＝5.0Hz，C-5’)，51.92(d，2JC-P＝5.0Hz，CHCH3)，40.92，40.86(C-2’)，33.65，33.61，33.52，33.47(2xCH2酯)，24.68，24.66(CH2酯)，20.45，20.30(2xd，3JC-P＝6.25Hz，CHCH3).
MS(ES+)m／e：614(MNa+，100％)，592(MH+，30％)精确质量：C27H31FN3O9P所需的591.52
HPLCb(H2O／乙腈从100／0至0／100，在35分钟内)室温14.03分钟。
5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基-(2-茚满氧基(indanoxy)-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF597)
根据标准程序E，由5-氟-2’-脱氧尿苷(0.30g，1.22mmol)，tBuMgCl(1.34mL，1.34mmol)和1-萘基-(2-茚满氧基-L-丙氨酰)-氯磷酸酯(1.06g，2.43mmol)在THF(20mL)中制备。柱纯化得到作为白色固体的产物(0.045g，6％)。
31P-NMR(MeOD，202MHz)δ4.62，4.30
19F-NMR(MeOD，470MHz)δ-167.14，-167.34
1H-NMR(MeOD，500MHz)δ8.15-8.12(m，1H，H-Ar，Naph)，7.89-7.87(m，1H，H-Ar，Naph)，7.72-7.67(m，2H，H-Ar，Naph)，7.56-7.46(m，3H，2xH-Ar，H-碱基)，7.40-7.37(m，1H，H-Ar)，7.20-7.12(m，4H，H-Ar，Ph)，6.14-6.08(m，1H，H-1’)，5.49-5.46(m，1H，OCH酯)，4.32-4.26(m，3H，2xH-5’，H-3’)，4.04-3.98(m，1H，H-4’，CHCH3)，3.30-3.24(m，2H，2xCH酯)，2.99-2.91(m，2H，2xCH酯)，2.14-2.07(m，1H，H-2’)，1.75-1.64(m，1H，H-2’)，1.33-1.29(m，3H，CHCH3)
13C-NMR(MeOD，125MHz)δ175.02，174.66(2xd，3JC-P=3.75Hz，C=O，酯)，159.48(2JC-F=25.0Hz，C=O，碱基)，150.57(C=O，碱基)，147.97，147.80(2xd，2JC-P=7.5Hz，OC-Ar)，141.73，141.68(2xd，1JC-F=232.5Hz，CF-碱基)，141.54，141.49，141.48，139.10，136.27，136.26(C-Ar)，129.01，128.94，128.91，127.91，127.87，128.85，127.80，127.77，127.60，127.57，127.50，126.20，126.18，125.69(CH-Ar)，125.50，125.43(2xd，2JC-F=25Hz，CH-碱基)，122.64，122.60，121.85(CH-Ar)，116.57，116.26(2xd，4JC-P=2.5Hz，CH-Ar)，86.96(C-1’)，86.87，86.66(2xd，3JC-P=7.50Hz，C-4’)，77.85，79。(OCH酯)，72.21，72.07(C-3’)，67.77，67.75(2xd，2JC-P=6.25Hz，C-5’)，51.97，51.82(CHCH3)，40.91，40.86(C-2’)，40.44，40.43，40.38，40.34(2xCH2酯)，20.30，20.16(2xd，3JC-P=6.25Hz，CHCH3)
5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-O-[苯基-(苄氧基-L-甲硫氨酰)]磷酸酯(CPF586)
根据标准程序D，由5-氟-2’-脱氧尿苷(0.25g，1.01mmol)，NMI(0.41g，5.07mmol，0.40mL)和苯基-(苄氧基-L-甲硫氨酰)-氯磷酸酯(0.7g，mmol)在THF(10mL)中制备。柱纯化得到作为淡黄色固体的产物(0.014g，2％)。
31P-NMR(MeOD，202MHz)δ4.34，3.94
19F-NMR(MeOD，470MHz)δ-167.40，-167.69
1H-NMR(MeOD，500MHz)δ7.83-7.80(m，1H，H-Ar)，7.74-7.72(m，1H，H-Ar)，
7.64-7.62(m，1H，H-Ar)，7.37-7.32(m，6H，H-Ar，H-碱基)，7.26-7.17(m，2H，H-Ar)，6.25-6.17(m，1H，H-1’)，5.18，5.13(AB体系，JAB=12.0Hz，2H，CH2Ph)，4.40-4.35(m，1H，H-3’)，4.32-4.22(m，2H，H-5’)，4.16-4.03(m，2H，NHCH，H-4’)，2.44，2.36(2xt，J=7.50Hz，CH2S)，2.16-2.08(m，1H，1xH-2’)，1.98-1.82(m，6H，1xH-2’，NHCHCH2CH2SCH3)，
MS(ES+)m/e：646(MNa+，100％)，624(MH+，10％)精确质量：C27H31FN309PS所需的623.56
5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基-(苄氧基-L-苯丙氨酰)]磷酸酯(CPF587)
根据标准程序D，由5-氟-2’-脱氧尿苷(0.25g，1.01mm01)，NMI(0.41g，5.07mmol，0.40mL)和1-萘基-(苄氧基-L-苯丙氨酰)-氯磷酸酯(1.45g，mm01)在THF(10mL)中制备。柱纯化得到作为白色固体的产物(0.007g，1％)。
31P-NMR(MeOD，202MHz)δ4.27，4.14
19F-NMR(MeOD，470MHz)δ-166.99，-167.18
1H-NMR(MeOD，500MHz)δ8.11-8.00(m，1H，H-Ar，Ar)，7.89-7.85(m，1H，H-Ar)，7.69-7.67(m，1H，H-Ar)，7.60-7.49(m，3H，2xH-Ar，H-碱基)，7.37-7.33(m，2H，H-Ar)，7.25-7.12(m，10H，H-Ar)，6.09-6.04(m，1H，H-1’)，5.11-5.01(m，2H，CH2Ph)，4.29-4.18(m，1H，CHCH3)，4.15-4.08(m，1H，H-3’)，4.02-3.95(m，2H，H-5’)，3.86-3.67(m，1H，H-4’)，3.14-3.10(m，1H，1xNHCHCH2Ph)，2.91-2.82(m，1H，1xNHCHCH2Ph)，2.12-2.06，2.00-1.95(2xm，1H，H-2’)，1.68-1.62，1.42-1.36(2xm，1H，H-2’)
5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基-(2,2-二甲基丙氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF588)
根据标准程序D，由5-氟-2’-脱氧尿苷(0.25g，1.01mm01)，NMI(0.41g，5.07mmol，0.40mL)和1-萘基-(2,2-二甲基丙氧基-L-丙氨酰)-氯磷酸酯(0.77g，mm01)在THF(10mL)中制备。柱纯化得到作为白色固体的产物(0.006g，1％)。
31P-NMR(MeOD，202MHz)δ4.56，4.33
19F-NMR(MeOD，470MHz)δ-167.32，-167.43
1H-NMR(MeOD，500MHz)δ8.19-8.16(m，1H，H-Ar，Ar)，7.91-7.89(m，1H，H-Ar)，7.74-7.71(m，2H，H-Ar)，7.57-7.51(m，3H，2xH-Ar，H-碱基)，7.46-7.41(m，1H，H-Ar)，6.17-6.10(m，1H，H-1’)，4.42-4.30(m，3H，H-3’，2xH-5’)，4.13-4.07(m，2H，H-4’，CHCH3)，3.86，3.75(AB体系，JAB=10.50Hz，2H，C42C(CH3)3)，2.18-2.10(m，1H，H-2’)，1.81-1.70(m，1H，H-2’)，1.41-1.38(m，3H，CHCH3)，0.95，0.94(2xs，9H，CH2C(CH3)3)
5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基-(丁氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯(CPF589)
根据标准程序D，由5-氟-2’-脱氧尿苷(0.25g，1.01mm01)，NMI(0.41g，5.07mmol，0.40mL)和1-萘基-(丁氧基-L-丙氨酰)-氯磷酸酯(0.75g，mm01)在THF(10mL)中制备。柱纯化得到作为白色固体的产物(0.006g，1％)。
31P-NMR(MeOD，202MHz)δ4.52，4.35
19F-NMR(MeOD，470MHz)δ-167.36，-167.49
1H-NMR(MeOD，500MHz)δ8.19-8.16(m，1H，H-Ar，Naph)，7.1-7.89(m，1H，H-Ar，Naph)，7.75-7.72(m，2H，H-Ar，Naph)，7.58-7.51(m，3H，2xH-Ar，H-碱基)，7.46-7.41(m，1H，H-Ar)，6.18-6.11(m，1H，H-1’)，4.42-4.40(m，1H，1xH-5’)，4.37-4.32(m，2H，1xH-5’，H-3’)，4.12-4.01(m，4H，H-4’，CHCH3，OCH2CH2CH2CH3)，2.20-2.12(m，1H，H-2’)，1.85-1.73(m，1H，H-2’)，1.61-1.54(m，2H，OCH2CH2CH2CH3)，1.39-1.31(m，5H，OCH2CH2CH2CH3，CHCH3)，0.93-0.89(m，3H，OCH2CH2CH2CH3)
生物学测定
以下描述关于使本发明具体化的化合物的实验数据。
细胞培养物
鼠类白血病L1210/0和人T-淋巴细胞CEM/0细胞获白美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD)。人成胶质细胞瘤U87细胞由Dr.E.Menue(InstitutPasteur，Paris，France)友好地提供。胸苷激酶缺乏的CEM/TK-细胞友好获赠白S.Eriksson教授(目前在Uppsala大学，Uppsala，Sweden)和AKarlsson教授(KarolinskaInstitute，Stockholm，Sweden)。胸苷激酶缺乏的L1210/TK-来源于在对针对5-溴-2’-dUrd的抗性进行选择后的L1210/0细胞(Balzarini等，1982)。用猪鼻支原体(mycoplasmahyorhinis)(ATCC)感染相关的细胞系产生慢性感染的细胞系，其被进一步称为L1210.Hyor和U87.Hyor。将所有细胞保持在具有10％胎牛血清(FBS)(BiochromAG，Berlin，Germany)，10mMHepes和1mM丙酮酸钠(Invitrogen)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。在37℃在加湿的具有5％CO2的气相的培养箱中生长细胞。
抑制细胞测定
以10,000细胞/孔将单层细胞(U87和U87.Hyor)接种在48-孔微量滴定板(NuncTM，Roskilde，Denmark)中。24小时后，加入等体积的含有试验化合物的新鲜培养基。在第5天，用胰蛋白酶处理细胞并且在Coulter计数器(Analis，Suarlée，Belgium)中计数。在给定量的试验化合物存在下，以60,000细胞/孔将悬浮细胞(Ll210/0，L1210/TK-，L1210.Hyor，CEM/0，CEM/TK-)接种在96-孔微量滴定板(NuncTM)中。使细胞增殖48小时(L1210)或72小时(CEM)然后在Coulter计数器中计数。50％抑制浓度(IC50)定义为使存活细胞的数目减少50％所需的化合物浓度。
测定1：对多种肿瘤细胞系测定样品的生物学活性，数据记录在以下表1中。数据表示为以μM计的CC50，即抑制细胞增殖达50％所需的抑制细胞浓度。所用的细胞系是L1210/0(一种白血病细胞系)，FM3A/0(一种乳腺癌细胞系)，Cem/0(一种急性淋巴细胞性白血病细胞系)和HeLa(一种宫颈癌细胞系)。
表1还包含5FU、5-FdUrd和参考化合物CPF382、CPF437和CPF438的比较数据。以上给出了CPF382的结构。CPF437和CPF438中每个的结构如下：
如从表1中的数据可看到的，本发明的化合物可以表现出与5-FU的抑制细胞活性相当或更好的抑制细胞活性，同时表现出在核苷激酶缺乏的细胞中的显著抑制细胞活性。这样的在核苷酸激酶缺乏的细胞中的抑制细胞活性与5-FdUrd的抑制细胞活性形成直接对比。
如从表1中可看到的，具体体现本发明的化合物在TK-细胞中的活性明显大于参考化合物CPF382，CPF437和CPF438的活性。
测定2:还测定样品在支原体感染的细胞中的活性的%保持率。结果显示在以下表2中。所述结果显示本发明的化合物可以在支原体感染的细胞中保持高活性，这与由5-FdURD所示的活性相反。施用胸苷磷酸化酶(TP)抑制剂恢复5-FdUrd在支原体感染的细胞培养物中的抑制细胞活性，这提供了TP在5-FdUrd的最终抑制细胞活性方面的劣化作用的证据。因为已知细胞的支原体感染极大地减弱核苷(包括5-FdUrd)的活性，所以一些核苷在支原体感染的细胞中的活性在支原体感染的患者中提供潜在的益处。
表2.
5-FdUrd和具体体现本发明的化合物在支原体阴性和阳性细胞中的以μM计的CC50值，以及对支原体感染的活性的%保持率。“％保持率”是对于L1210测量的CC50值相对于对于L1210/Hyor测量的CC50值的比率的量度，并且被计算为:CC5OL1210x100÷CC50L1210/Hyor。
对具体体现本发明的化合物CPF373进行进一步的实验(以下的测定3至8)。
测定3:5-FdUrd及其前药CPF-373对TK活性(TK-competent)和TK缺乏的肿瘤细胞系的抑制细胞活性
在不同TK表达和TK缺乏的肿瘤细胞系中测定5-FdUrd和CPF-373的抑制细胞活性。如表3中所示，对于其抑制细胞活性，5-FdUrd强烈依赖于TK的表达。相对于野生型L1210/0细胞(IC50:0.0008μM)，其对L1210/TK-细胞的IC50提高了4,000倍(IC50:3.1μM)，而相对于CEM/0细胞(IC50:0.028μM)，其对CEM/TK-细胞的IC50提高了50倍(IC50：1.5μM)。相反，当与野生型细胞相比时，5-FdUrd前药CPF-373在TK缺乏的细胞中的抑制细胞活性实际上保持不变(对于L1210/TK-和L1210/0，IC50分别为0.027和0.011，而对于CEM/TK-和CEM/0细胞，IC50分别为0.32和0.089μM)。虽然CPF-373对野生型L1210/0和CEM/0细胞的抑制细胞活性比5-FdUrd低3至10倍，但是它证明在TK缺乏的肿瘤细胞系中比5-FdUrd高5至100倍(见表3)。
表3.在不同细胞系中由IC50值表示的5-FdUrd和CPF-373的抑制细胞活性
a抑制50％的肿瘤细胞增殖所需的50％抑制浓度或化合物浓度
测定4：肿瘤细胞培养物的支原体感染对5-FdUrd及其前药CPF-373的抑制细胞活性的影响
用支原体物种猪鼻支原体(M.hyorhinis)感染L1210/0细胞培养物(细胞指定为：L1210.Hyor)。5-FdUrd显著丧失其针对支原体感染的L1210.Hyor细胞的抑制细胞活性达300倍(IC50：0.24μM)。而且，当与未被感染的U87细胞相比时，在U87.Hyor细胞培养物中，5-FdUrd丧失其抑制细胞活性达400倍(见表3)。形成明显对比的是，在L1210/0和L1210.Hyor两种细胞培养物中，5-FdUrd前药CPF-373保持相似的抑制细胞潜力(IC50分别为：0.011和0.025μM)。对于该前药，当在U87和U87.Hyor细胞培养物中评估其抑制细胞活性时，作出类似的观察(IC50分别为：0.035和0.039μM)。因此，尽管游离核苷5-FdUrd针对猪鼻支原体感染的肿瘤细胞系显著丧失其抑制细胞潜力，但是其前药CPF-373的抗增殖潜力不依赖于支原体感染。
测定5.进行实验以评估CPF373在胸苷磷酸化酶(TP)存在下的稳定性。参考图9至11对实验进行举例说明，每个图都包含NMR谱，如以下所讨论的。本测定显示具体体现本发明的化合物对在肿瘤中通常被增量调节的分解代谢酶TP的作用的不敏感性，使得本发明的化合物比5-FdUrd更独立于分解代谢酶TP。
通过纯化自大肠杆菌(EscherichiaColi)的胸苷磷酸化酶(TP)对5-FdUrd及其ProTide化合物CPF373进行磷酸化酶测定.
通过磷酸解反应，使用纯化自大肠杆菌的胸苷磷酸化酶以及纯化自艾氏腹水瘤(Ehrlichascitestumor)的尿苷磷酸化酶，可以将核苷5-FdUrd分解为其相关碱基5FU。根据以下方案，该分解被提出作为5-FdUrd有限疗效的原因之一：
使用原位19FNMR，通过纯化自大肠杆菌的胸苷磷酸化酶，磷酸化酶测定朝着磷酸解进行。向ProTide化合物CPF373施用是试图防止结构的裂解并且因此避免酶的作用。
分别将两种pH＝7.4的磷酸钾缓冲液(200nM溶液和300nM溶液)用作磷酸供体。酶的单位被定义为每分钟水解约0.25mg的肌苷所需的酶的量，其被用作标准。测定进行30分钟。
对5-FdUrd的磷酸化酶测定
开始，记录之前溶解在氘化甲醇中的5-FdUrd和5FU的19FNMR(470MHz)谱图。5-FdUrd在～δ-167.21ppm显示单峰而5FU在～δ-169.30ppm显示。因此，通过在磷酸钾缓冲液(200nM溶液；pH＝7.4)存在下将5-FdUrd溶解在氘化甲醇中来进行磷酸化酶测定，在添加酶胸苷磷酸化酶(TP)(20.7UNI)前记录空白(blank)。在25℃记录的19FNMR谱图显示5-FdUrd在～δ-165.17ppm的单峰以及归属于5FU的在～δ-169.50ppm的新的峰，如在图9在谱图A中所示。
然后，为了证明核苷被分解为相关碱基，通过在与以上所述相同的条件(没有TS酶)溶解等摩尔的核苷类似物5-FdUrd和相对的碱基5FU进行新的实验，如在图9中谱图B所示。该谱图显示之前在图9谱图A中观察到的具有相同化学位移的两个单峰。这些数据确认5FU在～δ-169.50ppm具有化学位移，并且因此确认酶(TP)的磷酸化作用。核苷5-FdURd到游离碱基5FU的转化率为66％。
当磷酸钾缓冲液的初始浓度从200nM增加直至205nM时，底物5-FdUrd完全转化为碱基5-FU，如在图10中所示。
对ProTide化合物CPF373的磷酸化酶测定
遵照以上所述的程序和条件，对苄基L-丙氨酸苯基衍生物CPF373施加磷酸化酶测定以考察稳定性。如通过比较如在图11谱图A中所示的在不存在TP酶的情况下分析的样品的化学位移和如在图11谱图B中所示的在TP存在下分析的样品的化学位移所示的，ProTide化合物CPF373被证明是完全稳定的。4天后重复19FNMR，ProTide化合物CPF373再次显示是稳定的。
这些实验确认：在胸苷磷酸化酶存在下，通过磷酸解反应，核苷5-FdUrd被快速分解为其相关碱基5FU，其中半衰期小于30分钟，而前药化合物CPF373在多达3天的更长时间的暴露下显示明显的针对TP酶活性的稳定性。此重要结果显示具体体现本发明的5-FdUrdProTide衍生物可以有利于5-FdUrd的疗效。
测定6：5-FdUrd和CPF-373暴露于大肠杆菌编码的TP和人编码的TP和UP
通过高压液相色谱(HPLC)研究胸苷磷酸化酶对天然胸苷(dThd)，尿苷(Urd)，5-FdUrd和CPF-373的底物特异性。将在总体积500μL的反应缓冲液(10mMTrisHCl；300μMNaCl；1mMEDTA；2mMKH2PO4/K2HPO4)中的含有100μM待测化合物和重组TP或UP(人TP：8.6ng/μL；大肠杆菌TP：3.0ng/μL；人UP：4ng/mL)的反应混合物在室温温育。在不同时间点(即0、20、40分钟)，取出100μL等分试样的反应混合物，并在95℃加热3分钟以使酶失活。将所得的反应产物在反相RP-8柱(Merck，Darmstadt，Germany)上分离，并且通过HPLC分析(Alliance2690，Waters，Milford，MA)纯化。通过从98％分离缓冲液(50mMNaH2PO4和5mM庚烷磺酸，pH3.2)和2％乙腈，到20％分离缓冲液+80％乙腈的线性梯度(8分钟98％分离缓冲液+2％乙腈；5分钟98％分离缓冲液+2％乙腈至20％分离缓冲液+80％乙腈的线性梯度；10分钟20％分离缓冲液+80％乙腈，之后以98％分离缓冲液+2％乙腈平衡)进行dThd与胸苷的分离。在267nm进行基于UV的检测。通过从100％分离缓冲液(参见以上)至60％分离缓冲液+40％乙腈的线性梯度(3分钟100％分离缓冲液；100％分离缓冲液至60％分离缓冲液+40％乙腈的6分钟线性梯度；6分钟60％分离缓冲液+40％乙腈，之后以100％分离缓冲液平衡)进行Urd与尿嘧啶的分离。在258nm进行基于UV的检测。
胸苷和尿苷磷酸化酶对5-FdUrd和CPF-373的磷酸解作用
将5-FdUrd及其前药CPF-373暴露于纯化的来自大肠杆菌或人红血球的胸苷磷酸化酶，并且暴露于纯化的来源于人肿瘤的尿苷磷酸化酶。尽管大肠杆菌和人TP快速地将dThd和5-FdUrd转化为其游离碱基，但是在这些酶存在下，CPF-373保持完全稳定(图2)。在相似的实验条件下，尿苷被通过UP而不是通过大肠杆菌TP，或人TP转化为尿嘧啶。当两种化合物暴露于UP时，dThd和CPF-373不受酶的影响，而5-FdUrd被轻微水解(图2，图C)。
测定7：胸苷酸合成酶(TS)活性测量
通过评估在由TS催化的反应中从[5-3H]dUMP(在细胞中由[5-3H]dUrd或[5-3H]dCyd形成)的氚释放，测量TS在完整L1210/0以及L1210/TK-细胞中的活性。该方法已经由Balzarini和DeClercq(1984)详细描述。简言之，制备细胞培养物(500μLDMEM培养基)，其含有～3x106个L1210细胞和适当量的试验化合物(5-FdUrd和CPF-373)。在将细胞与化合物在37℃预温育30分钟、2小时和4小时后，将1μCi的[5-3H]dUrd或[5-3H]dCyd添加到细胞培养物中。在温育30分钟后，取出100μL的细胞悬浮液并将其加入到500μL活性炭的冷悬浮液(VWR，Haasrode，Belgium)(100mg／ml，在TCA5％中)中。10分钟后，将悬浮液以13,000rpm离心10分钟，之后在液体闪烁计中使用OptiPhaseHiSafe(PerkinElmer，Waldham，MA)对400μL上清中的放射性进行计数。
由5-FdUrd和CPF-373对胸苷酸合成酶(TS)的抑制
5-FdUrd的抑制细胞活性的主要目标是胸苷酸合成酶(TS)。通过测量在暴露于[5-3H]脱氧尿苷([5-3H]dUrd)或[5-3H]脱氧胞苷([5-3H]dCyd)的完整L1210／0细胞培养物中的氚释放，可以直接监测TS在完整肿瘤细胞中的活性。实际上，在[5-3H]dUrd或[5-3H]dCyd在细胞内转化为[5-3H]dUMP后，在TS催化的还原甲基化期间，嘧啶碱基上的C-5氚原子被释放。因此，在L1210／0细胞培养物中，在各种各样的化合物浓度下，评估5-FdUrd及其前药CPF-373抑制从[5-3H]dUrd和[5-3H]dCyd的氚释放的能力。5-FdUrd被证明是有效的TS原位抑制剂。其对从[5-3H]dCyd和[5-3H]dUrd的氚释放的IC50约为0.0007-0.0009μM(见表4)。
表4.5-FdUrd和CPF-373针对完整L1210／0肿瘤细胞中的TS的IC50值(如通过在暴露于药物30分钟后从[5-3H]dUrd和[5-3H]dCyd的氚释放确定的)。
a在暴露于药物的L1210／0细胞培养物中抑制50％的从[5-3H]dUrd或[5-3H]dCyd的氚释放所需的50％抑制浓度或化合物浓度。
CPF-373对氚释放的抑制活性明显显著小于(～200倍)5-FdUrd对氚释放的抑制活性，特别是在仅将细胞用药物预温育30分钟后(IC50：0.16-0.19μM)。然而，在完整肿瘤细胞中测量TS活性前，将细胞用5-FdUrd和CPF-373预温育更长时间(多至4小时)揭示该前药对TS的显著得多的原位抑制活性(图3)。实际上，尽管在5-FdUrd的更长预温育时间后，3H释放的抑制仅提高2倍，但是CPF-373的抑制潜力提高10倍(图3，图A和B，以及C和D)。
将肿瘤细胞用5-FdUrd和CPF-373预温育至少4小时，导致在完整肿瘤细胞中在与这些药物的50％抑制细胞活性浓度非常相当的药物浓度下的TS抑制。
因此当前的观察指示，在到达作为用于抑制的靶标酶的TS前，5-FdUrd前药需要若干代谢转化步骤，并且支持以下观点：CPF-373充当5-FdUrd的有效前药以发挥其最终的抑制细胞活性。
还在完整L1210／TK-细胞中使用[5-3H]dCyd作为外部供应的底物(由于TK缺乏，不能使用[5-3H]dUrd)测量在5-FdUrd和CPF-373存在下的TS的活性。如在表5和图3(图E和F)中所示，当与野生型L1210／0细胞(IC50：0.0003μM)相比时，在TK缺乏的L1210／TK-细胞中导致TS的50％抑制所需的5-FdUrd浓度减小了5,700倍(IC50：1.4μM)。相反，在L1210／TK-细胞中，CPF-373对TS的抑制活性实际上保持不变(在L1210／TK-细胞中IC50为0.053μM，而在L1210／0细胞中IC50为0.013μM)。
表5.在完整L1210／0和L1210／TK-细胞中，5-FdUrd和CPF-373对TS的IC50值(如在用产品预温育4小时后通过从[5-3H]dCyd的氚释放所测量的)
a在暴露于药物的L1210细胞中，在将肿瘤细胞预暴露于药物达4小时后，抑制50％的从[5-3H]dCyd的氚释放所需的50％抑制浓度或化合物浓度。
测定8：稳定性测定
羧肽酶Y(EC3.4.16.1)测定
使用原位31PNMR(202MHz)研究前药CPF-373对羧肽酶Y的酶促稳定性。通过将CPF-373(3.0mg)溶解在d6-丙酮(150μL)中并添加TRIZMA缓冲液pH7.6(300μL)来进行实验。将所得的溶液置于NMR管中，并且记录在25℃的31P-NMR实验作为空白实验。将酶羧肽酶Y(0.2mg)溶解在TRIZMA(150μL)中并将其添加到在NMR管中的氨基磷酸酯衍生物的溶液中。接下来，将该管置于NMR机器中，该NMR机器被设定为在25℃每4分钟运行一次31P-NMR实验(64次扫描)持续14小时。利用BrukerTopspin2.1程序处理和分析数据。羧肽酶Y和TRIZMA缓冲液购自Sigma-Aldrich。
人血清
使用原位31PNMR(202MHz)研究在人血清存在下前药CPF-373的稳定性。将ProTideCPF-373(1)(5.0mg)溶解在DMSO(0.05mL)和D2O(0.15mL)中。然后将样品转移到NMR管中，该NMR管被插入到在37℃的NMR室(具有足够的溶剂以获得空白的对照NMR读数)中。然后将0.3ml人血清快速加入到在NMR管中的样品中。将NMR实验程序化为每15分钟记录一次数据，持续12小时30分钟。由于过度的噪音和不良的匀场分布(很可能是由生物介质和浓度所致)，所以对单个谱图进行进一步处理。在标准傅里叶变换处理后，对各个谱图进行去卷积(Lorentz-Gauss去卷积)以在没有基线的情况下单独显示谱峰的频率和面积。使用BrukerTopspin2.1程序对记录的数据进行分析和处理。
pH1的缓冲液
使用原位31PNMR(202MHz)研究前药CPF-373对在pH=1的水解的稳定性。将ProTideCPF-373(1)(2.6mg)溶解在MeOD(0.1mL)中，之后加入0.5mL缓冲液(pH=1)(由等份的0.2MHCl和0.2MKCl制备)。然后将样品转移到NMR管中，并且在37℃进行31PNMR实验，每12分钟记录一次数据，持续14小时。使用BrukerTopspin2.1程序对数据进行处理和分析。
pH8的缓冲液
使用原位31PNMR(202MHz)研究前药CPF-373对在pH=8的水解的稳定性。将ProTideCPF-373(1)(4.9mg)溶解在MeOD(0.1mL)中，之后加入0.5mL缓冲液(pH=8)(由用0.1MHCl调节的0.1MNa2HPO4的溶液制备)。然后将样品转移到NMR管中，并且在37℃进行31PNMR实验，每12分钟记录一次数据，持续14小时。使用BrukerTopspin2.1程序对数据进行处理和分析。
稳定性研究
已经通过将化合物暴露于人血清和含水缓冲液(pH1.0和8.0)，使用原位31PNMR，进行了对前药CPF-373(1)的化学稳定性研究。如下地进行每个实验：将ProTide溶解在合适的氘化溶剂中并且在37℃分析样品持续约14小时，以规则的时间间隔获取扫描。为了更好的分辨率，报告了原始的谱图(下图)和去卷积的谱图(上图)。氨基磷酸酯CPF-373(1)在人血清中温育后的稳定性测定，显示在12小时30分钟后73％的未改变化合物，如在图6中所示。
该谱图显示在～δ2.00的人血清固有的单峰并且在～δ4.50的母体的双峰，其在4小时15分钟后被水解为氨基磷酸氨基芳基酯中间体，如在δ7.20的单峰所示。
当在极端实验条件(即在pH1.0和pH8.0、在37℃)评价化学水解时，观察到前药CPF-373(1)在酸性和碱性缓冲液条件中的完全稳定性。记录谱图持续14小时，以规则的时间间隔每12分钟获取扫描，如在图7和8中所示。在pH1.0考察的ProTide(1)在整个测定时间内显示在δ4.35；4.50的非对映异构体的恒定双峰(图7)。
而且，在pH8.0，所述谱图在δ4.48显示前药(1)的持久峰和对应于缓冲液峰的在δ2.55的单峰(图8)。
5-FdUrd氨基磷酸酯的代谢
如在图4中所示，在摄取后，ProTide在细胞内的活化的假定机制包括首先由水解氨基酰基部分的酯的羧肽酶型酶介导的酶活化步骤(步骤a)，之后是自发的环化和随后的芳基的自发移位(步骤b)以及由水介导的不稳定的环的打开(步骤c)。最后一步涉及由磷酰胺酶型的酶介导的P-N键的水解(步骤d)，伴随在完整细胞中释放一磷酸核苷(图4)(McGuigan等，2009；Mehellou等，2010)。
为了证明提出的用于CPF-373(1)的代谢方案以及5-FdUrd氨基磷酸酯衍生物的酯基序是否被裂解掉，进行酶温育实验，该酶温育实验被设计成模拟在完整肿瘤细胞中的推定活化的第一阶段。将化合物(1)用羧肽酶Y(也称为组织蛋白酶A)在TRIZMA缓冲液中温育，并且通过31PNMR监测(1)的转化。记录谱图持续14小时，以定期间隔每4分钟获取扫描，如在图5中所示。为了更好的分辨率，显示原始谱图(下图)和去卷积后的谱图(上图)。
在31PNMR，前药CPF-373(1)表现为两个峰δ4.07；4.23，其对应解释为母体的两种非对映异构体，具有氨基磷酸酯的手性磷酸酯中心的特征性加倍。在加入组织蛋白酶A后，化合物在4分钟后快速水解为缺少酯基序的中间体δ4.95；5.16，并且该中间体不持久，因为经由失去芳基它又被快速代谢为氨基酰基氨基磷酸酯中间体，即此测定中的终产物(图4中的步骤a至c)。由于手性磷酸酯中心，该中间体表现为在δ6.85的单峰。因此，酶测定谱图显示母体～δ4.00的快速代谢，在26分钟内完全转化为假定的中间体，该中间体进一步在整个14小时的测定中保持一贯地存在。如预期的，在酶实验中未检测到释放一磷酸核苷的P-N键的裂解。此实验表明，ProTideCPF-373(1)的第一活化步骤可以足够有效，并且因此，可以允许一磷酸核苷代谢物在完整肿瘤细胞中的最终递送。
结论
总之，本发明提供抗癌核苷类似物5-氟-2’-脱氧尿苷(5-FdUrd)的新型氨基磷酸酯核苷酸前药，其被合成并且评价它们的抑制细胞活性。尽管5-FdUrd在胸苷激酶(TK)缺乏的鼠自血病L1210和人淋巴细胞CEM细胞培养物中基本上丧失其抑制细胞潜力，但是本发明的化合物，例如CPF-373，在野生型和TK缺乏的肿瘤细胞中都显著地保持了其抗增殖活性，并且因此在很大程度上独立于细胞内TK活性而发挥其抑制细胞作用。发现例如CPF-373在TK缺乏的和野生型细胞系中，在与其在这些细胞中的抑制细胞活性良好相关的药物浓度下，抑制胸苷酸合成酶(TS)。CPF-373看起来不对通过分解代谢酶如胸苷磷酸化酶(TP)和尿苷磷酸化酶(UP)的失活敏感。这些发现与以下观察一致：5-FdUrd，而不是CPF-373，在肿瘤细胞培养物中、在表达TP的支原体存在下，基本上丧失其抑制细胞潜力。因此，本发明的化合物如CPF-373是新的5-FdUrd氨基磷酸酯前药，其(i)可以避免肿瘤细胞的潜在抗性机制(例如降低的TK活性)并且(ii)不被分解代谢酶如TP分解，其活性在肿瘤细胞中通常被增量调节或在支原体感染的肿瘤组织中被表达。通过引用以其整体结合的是VandeVoorde，J等BiochemicalPharmacology82(2011)441-452。
本发明的实施方案，如以下所述，被公开在McGuigan，C等J.Med.Chem.2011，547247-7258(2011年9月5日公开)中，将其内容通过引用以其整体结合于此。
以下表6记录了以IC50或抑制50％的肿瘤细胞增殖所需的化合物浓度表示的5-FU、5-FdUrd、参考例CPF382和具体体现本发明的化合物对于肿瘤细胞系的抑制细胞活性。数据是至少二至四次独立实验的平均值(+SD)。表6鉴别了参考例CPF382和具体体现本发明的化合物的氨基磷酸酯基序，关于：“芳基”，其对应于式I的Ar并且是苯基(Ph)或1-萘基(Nap)；“酯”，其对应于式I的R3；和“AA”，其表示αC原子和αC原子上的取代基对应于式I的CR1R2的氨基酸。表6公开了之前在以上表1中未提及的具体体现本发明的化合物，以及对于一些在表1中提及的化合物的额外数据。
以下表7记录了以IC50或抑制50％的细胞增殖所需的化合物浓度表示的5-FdUrd、参考例CPF382和具体体现本发明的化合物在野生型鼠白血病L1210细胞培养物(L1210／0)和感染有猪鼻支原体的L1210细胞培养物(L1210.Hyor)中的抑制细胞活性。数据是至少二至四次独立实验的平均值(±SD)。表7鉴别了参考例CPF382和具体体现本发明的化合物的氨基磷酸酯基序，如以上关于表6所讨论的，只是其中“Naph”代表1-萘基。表7公开了之前在以上表2中未提及的具体体现本发明的化合物，以及对于一些在表2中提及的化合物的额外数据。
以下表8记录了以IC50或抑制50％的肿瘤细胞增殖所需的化合物浓度表示的5-FdUrd和具体体现本发明的化合物在含有(Cem／hEnt-1)或缺少(Cem／hEnt-0)hEnt1转运蛋白的CEM细胞培养物中的抑制细胞活性。数据是至少二至四次独立实验的平均值(±SD)。表8鉴别了具体体现本发明的化合物的氨基磷酸酯基序，如以上关于表6所讨论的，只是其中“Naph”代表1-萘基。表8的数据显示：与5-FdUrd相比，具体体现本发明的化合物较不依赖于hENT1转运蛋白的存在，因为它们针对hENT1缺乏的CEM细胞仅失去7至15倍的抗增殖活性。这些观察与以下相符：在相似的实验条件下与5-FuDrd和FdUMP的抗增殖活性的20至60倍损失相比，在转运抑制剂(即双嘧达莫(dipyridamole)和NBMPR)存在下，具体体现本发明的化合物的抑制细胞活性仅下降2-至7倍。
对化合物CPF381进行如下研究：
使用胸苷磷酸化酶(TP，纯化自大肠杆菌)，在磷酸钾缓冲液(300nM溶液，pH7.4)存在下，进行酶促磷酸化酶测定。在5分钟、14小时和72小时后的19FNMR谱图未显示任何磷酸解的证据。与5-FdUrd不同，CPF381即使是充其量也是胸苷磷酸化酶的非常差的底物。
化学水解在pH1和pH8的实验条件下评估，并且通过31PNMR监测。在酸性条件(pH1)下进行测定(14h)期间，仅记录到代表两种非对映异构体的两个峰。在31PNMR谱图中没有新的信号形成表明，化合物CPF381在酸性介质中是高度稳定的。当在温和碱性条件(pH8)下对化合物CPF381进行测定时，观察到相同的结果。
对化合物CPF581进行如下研究：
使用羧肽酶Y测定进行酶研究，其中化合物CPF581、羧肽酶Y和Trizma缓冲液(pH7.6)被溶解在丙酮-d6中，并且在14小时内以规则的间隔(每7min)记录31PNMR谱(202MHz)谱图。化合物CPF581被快速水解为缺少酯(R3)部分的第一代谢物，两种非对映异构体被以大致相似的速率处理。对第一代谢物的进一步处理导致在约45分钟内形成阴离子型第二代谢物(缺少Ar)，具有小于5分钟的估算半衰期。因此初始活化步骤的速率可能通常被认为是对氨基磷酸酯的良好生物学活性的要求之一。化合物CPF373在三乙胺和水存在下的化学水解产生阴离子型第二代谢物的二铵盐，其被添加到来源于化合物CPF373的最终测定样品，即仅含有在Trizma中的来源于化合物CPF581的酶促第二代谢物。该样品具有这样的31PNMR谱图，其仅显示在δP6.85ppm的单个峰，强有力地支持这部分的本发明的氨基磷酸酯化合物的代谢途径和活化。
对化合物CPF386进行如下研究：
使用原位31PNMR来考察化合物CPF386在人血清存在下的稳定性。记录化合物CPF386在DMSO和D2O中的对照31PNMR数据。然后用人血清处理NMR样品，并且立即在37℃对其进行进一步的31PNMR实验。在14小时内每15分钟记录一次31PNMR数据。谱图显示人血清固有的在～δP2.00ppm的单个峰以及对应于化合物CPF386的在～δP4.59和4.84ppm的两个峰。在约6小时45分钟后，化合物被部分水解为缺少R3(Et)的中间体，如在δP5.79ppm的单个峰。在11小时30分钟后，观察到形成缺少Ar(1-萘基)的第二代谢物，如在δP7.09ppm的单个峰所示。在13小时30分钟后，反应混合物含有96％的母体化合物CPF386连同所提出的第一代谢物(3％)和第二代谢物(1％)。
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Claims (23)

1.一种化合物，所述化合物是5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基(苄氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯。
2.根据权利要求1所述的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗人类患者的癌症。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述癌症选自包含以下各项的组：白血病、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌和宫颈癌。
4.根据权利要求2所述的用途，所述用途在这样的患者中，所述患者在肿瘤细胞中对于5-氟尿嘧啶或5-氟-2’-脱氧尿苷在预防或治疗癌症的方法中的活性已经形成或潜在形成抗性。
5.根据权利要求2所述的用途，其中所述患者具有核苷转运蛋白水平降低的细胞。
6.根据权利要求2所述的用途，其中所述患者具有核苷激酶缺乏的细胞。
7.根据权利要求2所述的用途，其中所述患者具有支原体感染的细胞。
8.根据权利要求2所述的用途，其中所述患者具有胸苷酸合成酶水平升高的细胞。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的用途，所述方法与其他癌症疗法联合。
10.一种药物组合物，所述药物组合物包含与药用载体、稀释剂或赋形剂结合的5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基(苄氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯。
11.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：将5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基(苄氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯与药用赋形剂，载体或稀释剂结合。
12.一种化合物，所述化合物是5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基(苄氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯或其药用盐。
13.根据权利要求12所述的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗人类患者的癌症。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述癌症选自包含以下各项的组：白血病、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌和宫颈癌。
15.根据权利要求13所述的用途，所述用途在这样的患者中，所述患者在肿瘤细胞中对于5-氟尿嘧啶或5-氟-2’-脱氧尿苷在预防或治疗癌症的方法中的活性已经形成或潜在形成抗性。
16.根据权利要求13所述的用途，其中所述患者具有核苷转运蛋白水平降低的细胞。
17.根据权利要求13所述的用途，其中所述患者具有核苷激酶缺乏的细胞。
18.根据权利要求13所述的用途，其中所述患者具有支原体感染的细胞。
19.根据权利要求13所述的用途，其中所述患者具有胸苷酸合成酶水平升高的细胞。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的用途，所述方法与其他癌症疗法联合。
21.一种药物组合物，所述药物组合物包含与药用载体、稀释剂或赋形剂结合的5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基(苄氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯或其药用盐。
22.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：将5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基(苄氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯或其药用盐与药用赋形剂，载体或稀释剂结合。
23.一种用于制备5-氟-2’脱氧尿苷-5’-O-[1-萘基(苄氧基-L-丙氨酰)]磷酸酯的方法，所述方法包括使5-氟-2’-脱氧尿苷与1-萘基(苄氧基-L-丙氨酰)氯磷酸酯反应。
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