ES2901349T3

ES2901349T3 - Derivado de pirazol pirimidina y usos del mismo

Info

Publication number: ES2901349T3
Application number: ES16753709T
Authority: ES
Inventors: Neriah Yinon Ben; Guy Brachya; Ido Burstain; Waleed Minzel; Irit Snir-Alkalay; Joseph VACCA; Dansu Li
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 2015-08-04
Filing date: 2016-08-04
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2036-08-04
Also published as: JP2018525441A; HRP20211949T1; RU2018107668A3; NZ739511A; US20190365759A1; US10376511B2; US11925641B2; PT3331877T; LT3331877T; AU2016304464A1; US20180214447A1; US20210251992A1; PL3331877T3; CN108137562A; DK3331877T3; EP3331877A1; EP3331877B1; ZA201800671B; WO2017021969A1; IL257282B

Abstract

Un compuesto que tiene la fórmula (I), o un estereoisómero o sal del mismo: **(Ver fórmula)** en que: R1 y R2 son cada uno independientemente H; o alquilo C1 - C8 lineal o ramificado, alcoxi C1 - C5 lineal o ramificado, acilo C1 - C5 lineal o ramificado o heteroarilo C3 - C7, cada uno opcionalmente sustituido por al menos uno de haluro, hidroxilo, un éster, un éter, arilo C1 - C15, heteroarilo C3 - C7 y una amida; o R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno están conectados para formar un anillo saturado, insaturado o aromático de 4 - 7 miembros que opcionalmente incluye al menos uno de N, O, NH, C = N, C = O y SO2, y es opcionalmente sustituido por al menos uno de alquilo C1 - C5 lineal o ramificado, arilo C3 - C15, heteroarilo C3 - C7, hidroxilo, haluro y ciano; R3 y R4 son cada uno independientemente H, o alquilo C1 - C8 lineal o ramificado opcionalmente sustituido por al menos uno de haluro, hidroxilo, alcoxi, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7, un éster y una amida; o R1 o R2 junto con R3 y el átomo de carbono y nitrógeno, cada uno de ellos está conectado para formar un anillo saturado, insaturado o aromático de 4 - 7 miembros que opcionalmente incluye al menos uno de N, NH, O, C = N, C = O, y SO2, y es opcionalmente sustituido por al menos uno de alquilo C1 - C5 lineal o ramificado, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7, hidroxilo, carbonilo y haluro; R5 y R8 son cada uno independientemente H o haluro; o alquilo C1 - C8 lineal o ramificado, alquenilo C2 - C8 lineal o ramificado, o alquinilo C2 - C8 lineal o ramificado, cada uno opcionalmente sustituido por al menos un haluro; R6 es alquilo C1 - C8 lineal o ramificado, alquenilo C2 - C8 lineal o ramificado, alquinilo C2 - C8 lineal o ramificado, cicloalquilo C5 - C10 o heterociclilo saturado o insaturado de 4 - 6 miembros, cada uno opcionalmente sustituido por al menos uno de alquilo C1 - C8 lineal o ramificado, cicloalquilo C3 - C7, heterociclilo de 4 - 6 miembros, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7, haluro, hidroxilo y haloalquilo C1 - C5; y R7 es alquilo C1 - C8 lineal o ramificado, alquenilo C2 - C8 lineal o ramificado, o alquinilo C2 - C8 lineal o ramificado, cada uno sustituido por al menos uno de cicloalquilo C3 - C7, heterociclilo de 4 - 6 miembros, arilo C5 - C15, Heteroarilo C3 - C7, haluro, hidroxilo y haloalquilo C1 - C5; en que "éster" representa -C (= O) OR10 o -OC (= O) R10 en que R10 es un alquilo C1 - C8 lineal o ramificado; "éter" representa -R13OR14' o -OR15' en que R13 se selecciona de un alquileno C1 - C8 lineal o ramificado y R14' y R15' se seleccionan cada uno independientemente de un alquilo C1 - C8 lineal o ramificado; y "amida" representa -C (= O) NR11R12' o -NR11C (= O) R12' donde R11 y R12' son cada uno independientemente H o un alquilo C1 - C8 lineal o ramificado.

Description

DESCRIPCIÓN

Derivado de pirazol pirimidina y usos del mismo

CAMPO TECNOLOGICO

La presente invención proporciona derivados de pirazol pirimidina y usos de los mismos en métodos para tratar enfermedades y trastornos malignos, así como métodos para tratar enfermedades y trastornos inflamatorios.

ANTECEDENTES

La familia de la caseína quinasa 1 (CK1 o CKI) son las serina / treonina quinasas con seis miembros (isoformas) en humanos: a, ^y1, ^y2, ^y3, 6 y £. Se diferencian en la longitud y la secuencia del dominio no catalítico N-terminal (9-76 aminoácidos) y especialmente del C-terminal (24-200 aminoácidos) (Schittek y Sinnberg, Molecular Cancer (Cáncer Molecular) 2014, 13: 231).

CK16 y CK1e son 98% idénticas en su dominio quinasa y 53% idénticas en su dominio regulador C-terminal (Fish KJ y col. J Biol Chem 1995, 270: 14875-14883). Si bien existe cierta redundancia con respecto a la fosforilación del sustrato de CK1, la mayoría de las isoformas de CK1 tienen funciones biológicas distintas. La amplia gama de sustratos de CK1 muestra que los miembros de la familia CK1 están involucrados en múltiples procesos celulares, incluida la regulación del tráfico de membranas, citocinesis, transporte vesicular, biogénesis de ribosomas, reparación del ADN, vías de transducción de señales y apoptosis y en el ritmo circadiano (Knippschild U et al. Cell Signal (Señal Celular) 2005, 17: 675-689; Cheong ^jK y Virshup DM. Int J Biochem Cell Biol 2011, 43: 465-469; Zemp I, et al. J Cell Sci 2014, 127: 1242-1253).

CK1a juega un papel en la formación del huso mitótico durante la división celular y en los mecanismos de reparación del ADN y participa en el metabolismo del ARN (Knippschild U et al. Cell Signal (Señal Celular) 2005, 17: 675-689). Contribuye a la activación de mTOR mediante la degradación sostenida del inhibidor endógeno de mTOR DEPTOR (Duan S et al. Mol Cell 2011,44: 317-324).

CK1a tiene un papel importante en la regulación de la vía de señalización de Wnt / p-catenina. Los inventores de esta solicitud han demostrado que CK1a es un componente clave del complejo de destrucción de p-catenina. Cuando los receptores Wnt no están acoplados, CK1a fosforila la p-catenina en el residuo de serina S45, que es necesaria para la fosforilación de cebado de otra quinasa, GSK3 (Amit et al. Genes Dev. 200216: 1066-1076). La fosforilación de p-catenina por GSK3 en los residuos T41, S37 y S33 genera un degrón de ubiquitinación, que recluta el E3 SCF-p-TrCP, lo que lleva a la ubiquitinación y degradación de p-catenina (Clevers H y Nusse R Cell 2012, 149: 1192 -1205). Los inventores han demostrado además que la ablación inducible de CK1a en el epitelio intestinal de ratón desencadena una respuesta Wnt epitelial masiva, que sorprendentemente no alteró la homeostasis intestinal, con solo una pequeña proliferación mejorada y sin tumorigénesis (Elyada et al. Nature 2011, 470: 409- 413). Esto es diferente a las consecuencias de la ablación aguda de otros componentes del complejo de destrucción de p-catenina, como por ejemplo APC, que da como resultado la pérdida de homeostasis y tumorigénesis (O.J. Sansom, O.J. et al. Genes Dev. 2004, 18:1385-1390).

Los inventores de la presente solicitud han descubierto que la razón del mantenimiento de la homeostasis después de la ablación de cK la es que, paralelamente a la activación de Wnt, la ablación de CK1a induce varias vías supresoras de tumores, entre las que se encuentran la respuesta al daño del ADN (DDR), la senescencia celular y la activación de la vía p53 (Elyada E et al. Nature 2011, 470: 409-413, Pribluda A et al. Cancer Cell (Célula Cancerosa) 2013, 24: 1-5).

Si bien los mecanismos moleculares que subyacen a la activación de estas vías antineoplásicas aún son difíciles de alcanzar, los inventores han descubierto que la ablación de CK1a induce un daño desproporcionadamente menor en el ADN, sin signos de activación de ATM, lo que indica que la activación de DDR y p53 inducida por CK1a probablemente implica mecanismos moleculares poco comunes. (Burstain I et al, no publicado). Además, los inventores han descubierto que la ablación de CK1a da como resultado la inducción de un nuevo tipo de respuesta inflamatoria, denominada parainflamación, que se limita al epitelio, sin signos comunes de respuesta inflamatoria (infiltración de células inflamatorias, calor, rubor, tumor y dolor) (Pribluda A et al. Cancer Cell (Célula Cancerosa) 2013, 24: 1-5, Lasry A y Ben-Neriah Y 2015, Trends in Immunology, vol. 36: 217-228). La parainflamación coopera con la activación de WT p53 en la supresión de la tumorigénesis, pero cambia a un mecanismo promotor de tumores en ausencia de p53 funcional (Pribluda A et al. Cancer Cell (Célula Cancerosa) 2013, 24: 1-5, Aran y col., Genome Biol. 20168 de julio; 17 (1): 145).

Si bien ya se ha establecido que CK1a es un regulador principal de p53, los inventores también han descubierto que la ablación combinada de CK16 y CK1^een el epitelio intestinal también da como resultado la activación de p53, que puede sinergizar con la activación de p53 inducida por CK1a.

IRAK1 se identificó como un objetivo terapéutico para MDS y ciertos subconjuntos de AML y cáncer de mama triple negativo (Garrett W.Rhyasen et al, 2013, Cancer Cell (Célula Cancerosa) 24, 90-104, Rhyasen GW, Bolanos L, Starczynowski DT, 2013, Exp. Hematol. 41:1005-7, Zhen Ning Wee et al, 2015, NATURE COMMUNICATIONS, 6: 8746). El ARNm de IRAK1 está sobreexpresado en -20-30% de los pacientes con MDS y la proteína IRAK1 está drásticamente sobreexpresada y está hiperactivada en la mayoría de las muestras de médula MDS examinadas. IRAK1 es una serina / treonina quinasa que media las señales provocadas por el receptor tipo Toll (TLR) y el receptor de interleucina-1 (IL1R). Después de la activación del receptor, IRAK1 se fosforila, lo que a continuación conduce al reclutamiento de TRAF6, lo que resulta en la activación de TRAF6 de las vías NF-^kB y JNK. La fuente molecular de sobreexpresión y / o hiperactivación de IRAK1 en MDS (o AML) no es concluyente. Se cree que la sobreexpresión de TLR o cofactores necesarios en clones de MDS puede resultar en la activación crónica de IRAK1 incluso en ausencia de infección. Los inhibidores de moléculas pequeñas que están dirigidas a IRAK1 (IRAK1 / 4 Inhibitor, Amgen Inc.) se han desarrollado originalmente para enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Dado que IRAK1 está hiperactivada (es decir, fosforilada) en los MDS pero no en las células de la médula normal, Starczynowski y sus colegas demostraron que el tratamiento con inhibidores de IRAK (IRAK1 / 4, Amgen) y la eliminación de IRAK1 dieron como resultado un deterioro drástico de la proliferación celular de MDS, la función progenitora y viabilidad in vitro e in vivo. Yu y sus colegas demostraron que la sobreexpresión de IRAK1 confiere una ventaja de crecimiento de las células de cáncer de mama triple negativo (TNBC) a través de la secreción de citocinas relacionadas con NF-^kB y las células de TNBC metastásicas exhiben un aumento de la dependencia de IRAK1, lo que da como resultado una alta susceptibilidad a la inhibición genética y farmacológica de IRAK1. El tratamiento con paclitaxel de células TNBC induce una fuerte fosforilación de IRAK1, un aumento en la expresión de citocinas inflamatorias,un enriquecimiento de células madre cancerosas y una resistencia adquirida al tratamiento con paclitaxel. La inhibición farmacológica de IRAK1 pudo revertir la resistencia al paclitaxel al desencadenar una apoptosis masiva. También se descubrió que IRAK1 es un objetivo transcripcional de DEK y es esencial para la supervivencia de las células cancerosas de cabeza y cuello (Adams AK et al. Oncotarget. 2015, 22; 6 (41): 43395 -43407) y también como objetivo potencial en el tratamiento de Trastornos inflamatorios e inmunológicos (Bahia MS et al. Cell Signal. 2015 Junio; 27 (6): 1039-55). Los inhibidores de quinasas que incluyen IRAK1 se describen en el documento WO 2015/058140.

Por lo tanto, los inventores han descubierto que los compuestos de la invención son capaces de inhibir IRAK1, un importante regulador aguas arriba de la ruta NF-kB que juega un papel importante en las neoplasias hematológicas.

DESCRIPCIÓN GENERAL

La presente invención proporciona un compuesto que tiene la fórmula general (I), incluyendo cualquier estereoisómero o sal del mismo:

donde

R1 y R2 se seleccionan cada uno independientemente de H, alquilo C1 - Cs lineal o ramificado, alcoxi C1 - C5 lineal o ramificado, acilo C1 - C5 lineal o ramificado y heteroarilo C3 - C7, cada uno opcionalmente sustituido por al menos uno de haluro, hidroxilo, éster, éter, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7 y amida; o Ri y R2 junto con el átomo de nitrógeno están conectados para formar un anillo aromático, insaturado o saturado de 4 a 7 miembros que puede incluir opcionalmente al menos uno de N, O, NH, C = N, C = O y SO2 y puede opcionalmente estar sustituido por al menos uno de alquilo C1 - C5 lineal o ramificado, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7, hidroxilo, haluro y ciano;

R3 y R4 se seleccionan cada uno independientemente de H, alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado opcionalmente sustituido por al menos uno de haluro, hidroxilo, alcoxi, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7, éster y amida; o

R1 o R2 junto con R3 y el átomo de carbono y nitrógeno, cada uno de ellos está conectado para formar un anillo saturado, insaturado o aromático de 4 - 7 miembros que puede incluir opcionalmente al menos uno de N, NH, O, C = N, C = O y SO2, y puede ser opcionalmente sustituido por al menos uno de alquilo C1 - C5 lineal o ramificado, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7, hidroxilo, carbonilo y haluro;

R5 y R⁸se seleccionan cada uno independientemente de H, haluro, alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado, alquenilo C2 - C⁸lineal o ramificado y alquinilo C2 - C⁸lineal o ramificado; opcionalmente sustituido por al menos un haluro;

R6 se selecciona de alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado, alquenilo C2 - C⁸lineal o ramificado, alquinilo C2 -C⁸lineal o ramificado, cicloalquilo C5 - C10 y heterociclilo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros; opcionalmente sustituido por al menos uno de alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado, cicloalquilo C3 - C7, heterociclilo de 4 - 6 miembros, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7, haluro, hidroxilo y haloalquilo C1 - C5; R7 se selecciona de alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado, alquenilo C2 - C⁸lineal o ramificado y alquinilo C2 - C⁸lineal o ramificado; sustituido por al menos uno de cicloalquilo C3 - C7, heterociclilo de 4 a 6 miembros, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7, haluro, hidroxilo y haloalquilo C1 - C5.

La presente invención proporciona un compuesto que tiene la fórmula general (I), que incluye cualquier estereoisómero o sal del mismo en que:

R1 y R2 se seleccionan cada uno independientemente de H, alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado, alquenilo C2 - C⁸lineal o ramificado, alquinilo C2 - C⁸lineal o ramificado, alcoxi C1 - C5 lineal o ramificado, acilo C1 - C5 lineal o ramificado, y heteroarilo C3 - C7, cada uno opcionalmente sustituido por al menos uno de haluro, hidroxilo, éster, éter, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7 y amida; o

R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno están conectados para formar un anillo aromático, insaturado o saturado de 4 a 7 miembros que puede incluir opcionalmente al menos uno de N, O, NH, C = N, C = O y SO2 y puede opcionalmente ser sustituido por al menos uno de alquilo C1 - C5 lineal o ramificado, alquenilo C2 - C5 lineal o ramificado, alquinilo C2 - C5 lineal o ramificado, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 -C7, hidroxilo, haluro y ciano;

R3 y R4 se seleccionan cada uno independientemente de H, alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado, alquenilo C2 - C⁸lineal o ramificado y alquinilo C2 - C⁸lineal o ramificado, opcionalmente sustituido por al menos uno de haluro, hidroxilo, alcoxi, éster, Arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7 y amida; o

R1 o R2 junto con R3 y el átomo de carbono y nitrógeno están conectados para formar un anillo saturado, insaturado o aromático de 4 - 7 miembros que puede incluir opcionalmente al menos uno de N, NH, O, C = N, C = O, y SO2, y puede ser opcionalmente sustituido por al menos uno de alquilo C1 - C5 lineal o ramificado, alquenilo C2 - C5 lineal o ramificado, alquinilo C2 - C5 lineal o ramificado, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7, hidroxilo, carbonilo y haluro;

R5 y R⁸se seleccionan cada uno independientemente de H, haluro, alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado, alquenilo C2 - C⁸lineal o ramificado y alquinilo C2 - C⁸lineal o ramificado, opcionalmente sustituido por al menos un haluro (en algunas formas de realización CF3);

R⁶se selecciona de alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado, alquenilo C2 - C⁸lineal o ramificado, alquinilo C2 -C⁸lineal o ramificado, cicloalquilo C5 - C10 y heterociclilo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros; opcionalmente sustituido por al menos uno de alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado, cicloalquilo C3 - C7, heterociclilo de 4 - 6 miembros, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7, haluro, hidroxilo y haloalquilo C1 - C5; R7 se selecciona de alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado, alquenilo C2 - C⁸lineal o ramificado y alquinilo C2 - C⁸lineal o ramificado; sustituido por al menos uno de cicloalquilo C3 - C7, heterociclilo de 4 a 6 miembros, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7, haluro, hidroxilo y haloalquilo C1 - C5.

En algunas formas de realización, cada uno de R1 y R2 se selecciona independientemente entre H y alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado opcionalmente sustituido por al menos uno de haluro, hidroxilo, éster y amida.

En algunas formas de realización, cada uno de R1 y R2 se selecciona independientemente de H, y alcoxi C1 - C5 lineal o ramificado opcionalmente sustituido por al menos uno de haluro, hidroxilo, éster y amida.

En algunas formas de realización, cada uno de R1 y R2 se selecciona independientemente entre H y acilo C1 - C5, opcionalmente sustituido por al menos uno de haluro, hidroxilo, éster, éter y amida.

En algunas formas de realización, al menos uno de R1 y R2 es H.

En algunas formas de realización, R4 es H. En algunas formas de realización, R3 y R4 son H.

En algunas formas de realización, R5 se selecciona de H, Cl y alquilo Ci - C4 lineal o ramificado. En algunas formas de realización, R5 es H. En algunas formas de realización, R⁸se selecciona entre H, Cl y alquilo C1 - C4 lineal o ramificado. En algunas formas de realización, R⁸es H. En alguna forma de realización adicional, uno de R5 o R⁸es H (es decir, solo uno de R5 o R⁸es H, en otras palabras, uno de R5 o R⁸es diferente de H).

En algunas formas de realización, R⁶se selecciona de alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado, cicloalquilo C5 - C10 y heterociclilo saturado o insaturado de 4 - 6 miembros; y R7 se selecciona de alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado, sustituido por al menos un cicloalquilo C3 - C7, heterociclilo de 4 - 6 miembros, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7, haluro, hidroxilo y haloalquilo C1 - C5.

En algunas formas de realización, R⁶se selecciona de un alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado, cicloalquilo C5 - C10 y heterociclilo saturado de 4 - 6 miembros.

En algunas formas de realización, R7 es un alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado sustituido por al menos uno de cicloalquilo C3 - C7 e hidroxilo.

En algunas formas de realización, R⁶se selecciona de alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado y heterociclilo saturado o insaturado de 4 - 6 miembros, cada uno opcionalmente sustituido por al menos uno de alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado, cicloalquilo C3 - C7, haluro, hidroxilo, CF3.

En algunas formas de realización, R7 es un alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado sustituido por al menos un cicloalquilo C3 - C7.

En algunas formas de realización, R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno están conectados para formar un anillo saturado de 4 - 7 miembros que incluye opcionalmente al menos uno de N u O, NH, C = N, C = O o SO2 (es decir, además del átomo de N R1 y R2 están conectados a) y son opcionalmente sustituidos por al menos uno de alquilo C1 - C5 lineal o ramificado, hidroxilo, haluro y ciano.

En algunas formas de realización, R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno están conectados para formar un anillo saturado de 4 a 7 miembros.

En algunas formas de realización, R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno están conectados para formar un anillo saturado de 4 - 7 miembros que incluye al menos uno de N u O (además del átomo de N al que están conectados R1 y R2).

En formas de realización adicionales, R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno están conectados para formar un anillo aromático de 4 - 7 miembros que incluye opcionalmente al menos uno de N u O (además del átomo de N al que están conectados R1 y R2).

En algunas formas de realización, R1 o R2 junto con R3 y el átomo de carbono y nitrógeno están conectados para formar un anillo saturado de 4 - 7 miembros que opcionalmente incluye al menos uno de N, NH, O, C = O y SO2, y puede opcionalmente ser sustituido por al menos uno de alquilo C1 - C5, hidroxilo, carbonilo y haluro lineales o ramificados.

En algunas formas de realización, R1 o R2 junto con R3 y el átomo de carbono y nitrógeno están conectados para formar un anillo saturado de 4 - 7 miembros que incluye al menos uno de NH, O y C = O.

En algunas formas de realización, el compuesto de la invención se selecciona de los siguientes (el compuesto A68 de la invención no entra dentro del alcance de la fórmula (I)):

En algunas formas de realización, el compuesto de la invención es:

En algunas otras formas de realización, el compuesto de la invención es:

En otras formas de realización, el compuesto de la invención es:

El término "Ci - Os alquilo lineal o ramificado" debe entenderse que abarca una cadena saturada de hidrocarburo, que puede ser lineal o ramificada, que comprende 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 átomos de carbono.

El término "C2 - C⁸alquenilo lineal o ramificado" o "C2 - C⁸alquenilo lineal o ramificado" debe entenderse que abarca una cadena de hidrocarburo que tiene al menos un doble enlace entre dos átomos de carbono cualesquiera en la cadena, que puede ser lineal o ramificada, que comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 átomos de carbono o 2, 3, 4, 5 átomos de carbono, respectivamente.

El término "C2 - C⁸alquinilo lineal o ramificado" debe entenderse que abarca una cadena de hidrocarburo que tiene al menos un triple enlace entre dos átomos de carbono cualesquiera en la cadena, que puede ser lineal o ramificada, que comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 átomos de carbono.

El término "C1 - C⁸alcoxi lineal o ramificado" debe entenderse que abarca una fracción de -OR9 en que R9 es un alquilo C1 - C5 lineal o ramificado.

Debe entenderse que el término "haluro" abarca cualquier radical halógeno seleccionado entre -F, -Br, -Cl, -I.

El término "C1 - C⁸haloalquilo" debe entenderse que abarca cualquier cadena de alquilo lineal o ramificada que tenga entre 1 y 5 átomos de carbono y que son sustituidos por al menos un radical halógeno seleccionado entre -F, -Br, -Cl y -I, en cualquier punto de la cadena lineal o de la cadena ramificada. En algunas formas de realización, el haluro de alquilo incluye un halógeno; en otras formas de realización, el haluro de alquilo incluye dos átomos de halógeno (iguales o diferentes); en otras formas de realización, el haluro de alquilo incluye tres átomos de halógeno (iguales o diferentes) y así sucesivamente.

Debe entenderse que el término "hidroxilo" abarca -OH.

Debe entenderse que el término "éster" abarca cualquiera de -C (= O) OR10 o -OC (= O) R10 en que R10 es un alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado.

Debe entenderse que el término "amida" abarca cualquiera de -C (= O) NR11R12' y -NR11C (= O) R12' en que R11 y R12 'son cada uno independientemente H o un alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado.

El término "éter" debe entenderse que abarca cualquiera de -R13OR14' o -OR15' en que R13 se selecciona de un alquileno C1 - C⁸lineal o ramificado y R14' y R15' se seleccionan cada uno independientemente de un alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado.

El término "acilo C1 - C5 lineal o ramificado” debe entenderse que abarca cualquier -C (= O) R16 en el que R16 es alquilo C1 - C5 lineal o ramificado.

El término "arilo C5 - C15" debe entenderse que abarca cualquier sistema de anillo aromático único o fusionado que comprende de 5 a 7 átomos de carbono. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, fenilo, pentalenilo, nafatalenilo, antracenilo y cualquier combinación de los mismos.

El término "heteroarilo C3 - C7" debe entenderse que abarca cualquier sistema de anillo aromático único o fusionado que comprende de 5 a 7 átomos de carbono y al menos un heteroátomo seleccionado de N, O y S. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, furanilo, benzofuranilo, isobenzofuranilo, pirrolinilo, indolinilo , isoindolinilo, tiofenilo, banzotiofenilo, banzo [c] tiofenilo, imidazolilo, bencimidazolilo, purinilo, pirazolilo, indazolilo, oxazolilo, benzoxazolilo, isoxazolilo, benzoisoxazolilo, tiasolilo, benzotiazolilo, piridinilo, auolininilo, isoquinolinilo, piromodinilo, quinzolinilo, piridazinilo, cinnolinilo y cualquier combinación de los mismos.

Cuando se hace referencia a la forma de realización en la que R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno están conectados para formar un anillo saturado, insaturado o aromático de 4 - 7 miembros, debe entenderse que se refiere a cualquier anillo que pueda formarse con 4, 5, 6 o 7 miembros que incluyen dicho átomo de nitrógeno. Dicho anillo puede estar saturado, es decir, tener todos los enlaces sigma, insaturado, es decir, tener al menos un doble o al menos un triple enlace o cualquier combinación de los mismos o aromático, es decir, un sistema de anillo que posea carácter aromático, un sistema de anillo molecular cíclicamente conjugado con una estabilidad (debido a la deslocalización) significativamente mayor que el de una estructura localizada hipotética (por ejemplo, Estructura Kekulé).

Por ejemplo, dicho anillo se puede seleccionar entre piperidinilo, pirrolidinilo, azetidinilo, etc.

En algunas formas de realización, dicho anillo puede incluir opcionalmente (dentro de los miembros del anillo) al menos uno de N, O, NH, C = N, C = O y SO2. En algunas formas de realización adicionales, dicho anillo puede ser opcionalmente sustituido (en el sistema de anillo por sustitución de un átomo de -H en dicho anillo) con al menos uno de alquilo C1 - C5 lineal o ramificado, hidroxilo, haluro y ciano (-CN).

Cuando se hace referencia a las formas de realización en las que R1 o R2 junto con R3 y el átomo de carbono y nitrógeno están conectados para formar un anillo saturado, insaturado o aromático de 4 - 7 miembros, debe entenderse que se refiere a cualquier anillo que pueda formarse con 4, 5, 6 o 7 miembros que incluyen dicho átomo de nitrógeno. Este anillo forma un sistema de dos anillos espiro con el anillo ciclohexilo en el esqueleto del compuesto de fórmula I. Dicho anillo puede estar saturado, es decir, tener todos los enlaces sigma, o insaturado, es decir, tener al menos un doble o al menos un triple enlace o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el anillo es un anillo aromático.

En algunas formas de realización, dicho anillo incluye opcionalmente al menos uno de N, NH, O, C = N, C = O y SO2 dentro de la formación del anillo. En algunas formas de realización adicionales, dicho anillo es opcionalmente sustituido (en el sistema de anillos por sustitución de un átomo -H en dicho anillo) con al menos uno de alquilo C1 -C5, hidroxilo, carbonilo (-C (= O) R) lineales o ramificados en que R es H o alquilo C1 - C5 lineal o ramificado) y haluro.

El término "cicloalquilo C5 - C10" o el término "cicloalquilo C3 - C7" debe entenderse que abarca un anillo de hidrocarburo saturado (es decir, el anillo que contiene solo enlaces sigma entre sus miembros) que comprende 5, 6, 7, 8, 9 o 10 átomos de carbono o 3, 4, 5, 6 o 7 átomos de carbono respectivamente.

El término "heterociclilo saturado, insaturado o aromático de 4 - 6 miembros" debe entenderse que abarca un anillo saturado (es decir, el anillo que contiene solo enlaces sigma entre sus miembros), insaturado o aromático (es decir, el anillo que contiene al menos un doble enlace o al menos un triple enlace o cualquiera de sus combinaciones) que contiene 4, 5 o 6 miembros, al menos uno de los cuales es un heteroátomo seleccionado entre N, O, S y P.

El término "opcionalmente sustituido", tal como se utiliza en el presente documento, significa que los grupos en cuestión no son sustituidos, o que son sustituidos por uno o más de los sustituyentes especificados. Cuando los grupos en cuestión están sustituidos por más de un sustituyente, los sustituyentes pueden ser iguales o diferentes. Algunos de los compuestos descritos en el presente documento pueden contener uno o más centros quirales, o pueden ser capaces de existir de otro modo como dos enantiómeros o varios diastereómeros. Por consiguiente, los compuestos de esta invención también incluyen mezclas de enantiómeros así como enantiómeros purificados o mezclas enriquecidas enantioméricamente. Los compuestos de esta invención incluyen también mezclas de diastereómeros, así como diastereómeros purificados o mezclas enriquecidas en diastereómeros.

La invención también incluye cualquier sal de un compuesto de fórmula (I), incluida cualquier sal farmacéuticamente aceptable, en la que un compuesto de la invención tiene una carga neta (positiva o negativa) y al menos un contraión (que tiene una carga negativa o una carga positiva) a la misma para formar dicha sal. La frase "sal (es) farmacéuticamente aceptable (s)", tal como se utiliza en este documento, significa aquellas sales de compuestos de la invención que son seguras y efectivas para uso farmacéutico en mamíferos y que poseen la actividad biológica deseada. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de grupos ácidos o básicos presentes en los compuestos de la invención. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales de hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, nitrato, sulfato, bisulfato, fosfato, fosfato de ácido, isonicotinato, acetato, lactato, salicilato, citrato, tartrato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucaronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencensulfonato, p-toluensulfonato y pamoato (es decir, 1,1'-metilen-bis- (2-hidroxi-3-naftoato)). Ciertos compuestos de la invención pueden formar sales farmacéuticamente aceptables con varios aminoácidos. Las sales básicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio, zinc y dietanolamina. Para una revisión de las sales farmacéuticamente aceptables, véase BERGE ET AL., 66 J. PHARM. SCI. 1 - 19 (1977).

La invención proporciona además una composición que comprende al menos un compuesto tal como se define en el presente documento anteriormente y a continuación (de acuerdo con la fórmula general I).

La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la presente invención mezclado con auxiliares farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, otros agentes terapéuticos. Los auxiliares deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la composición y no perjudiciales para los receptores de los mismos.

Las composiciones farmacéuticas incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo transdérmica, bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica) o administración a través de un implante. Las composiciones se pueden preparar mediante cualquier método bien conocido en la técnica de farmacia.

Dichos métodos incluyen la etapa de asociar compuestos de la invención o combinaciones de los mismos con cualquier agente auxiliar. El (los) agente (s) auxiliar (es), también denominado (s) ingrediente (s) accesorio (s), incluyen los convencionales en la técnica, como por ejemplo vehículos, cargas 02429524 \ 45-01, agentes aglutinantes, diluyentes, desintegrantes, lubricantes, colorantes, agentes aromatizantes, antioxidantes y humectantes.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración oral pueden presentarse como unidades de dosificación discretas como por ejemplo píldoras, tabletas, grageas o cápsulas, o como polvo o gránulos, o como una solución o suspensión. El ingrediente activo también se puede presentar en forma de bolo o pasta. Las composiciones se pueden procesar adicionalmente en un supositorio o enema para administración por vía rectal. La invención incluye además una composición farmacéutica, tal como se describe en el presente documento anteriormente, en combinación con material de envasado, incluyendo instrucciones para el uso de la composición para un uso tal como se describe en el presente documento anteriormente.

Para la administración parenteral, las composiciones adecuadas incluyen inyecciones estériles acuosas y no acuosas. Las composiciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo viales y ampollas sellados, y pueden almacenarse en un estado congelado en seco (liofilizado) que requiere solo la adición de un vehículo líquido estéril, por ejemplo agua, antes de utilizar. Para administración transdérmica, por ejemplo, se pueden contemplar geles, parches o aerosoles. Las composiciones o formulaciones adecuadas para administración pulmonar, por ejemplo por inhalación nasal, incluyen polvos finos o nieblas que pueden generarse por medio de aerosoles, nebulizadores o insufladores presurizados de dosis medida.

La dosis exacta y el régimen de administración de la composición dependerán necesariamente del efecto terapéutico o nutricional que se desea alcanzar y pueden variar con la fórmula particular, la vía de administración y la edad y condición del sujeto individual al que se le aplica la composición para ser administrada.

La invención proporciona además un compuesto tal como se describe en el presente documento anteriormente y a continuación (de acuerdo con la fórmula general I), para su utilización en terapia.

El término "tratamiento" o "terapia" tal como se utiliza en este documento significa la gestión y el cuidado de un paciente con el propósito de combatir una enfermedad, trastorno o afección. El término pretende incluir el retraso de la progresión de la enfermedad, trastorno o afección, el alivio o alivio de síntomas y complicaciones y / o la cura o eliminación de la enfermedad, trastorno o afección. El paciente a tratar es preferiblemente un mamífero, en particular un ser humano.

Debe entenderse que los intervalos de dosificación establecidos anteriormente son únicamente a modo de ejemplo y no pretenden limitar el alcance de esta invención. La cantidad terapéuticamente eficaz para cada compuesto activo puede variar con factores que incluyen, pero no se limitan a, la actividad del compuesto utilizado, la estabilidad del compuesto activo en el cuerpo del paciente, la gravedad de las afecciones a aliviar, el peso total del paciente tratado, la vía de administración, la facilidad de absorción, distribución y excreción del compuesto activo por parte del cuerpo, la edad y la sensibilidad del paciente a tratar, y similares, tal como resultará evidente para un experto en la materia. La cantidad de administración se puede ajustar a medida que los diversos factores cambian con el tiempo.

Para la administración oral, los compuestos activos se pueden incorporar en una formulación que incluye vehículos farmacéuticamente aceptables como por ejemplo aglutinantes (por ejemplo, gelatina, celulosa y goma de tragacanto), excipientes (por ejemplo, Almidón, lactosa), lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio y dióxido de silicio), agentes desintegrantes (por ejemplo, alginato, primogel y almidón de maíz) y agentes edulcorantes o aromatizantes (por ejemplo, glucosa, sacarosa, sacarina, salicilato de metilo y menta piperita). La formulación se puede administrar por vía oral en forma de cápsulas o comprimidos de gelatina. Las cápsulas y comprimidos se pueden preparar mediante cualquier técnica convencional. Las cápsulas y comprimidos también se pueden revestir con varios revestimientos conocidos en la técnica para modificar los sabores, colores y formas de las cápsulas y comprimidos. Además, también se pueden incluir en cápsulas vehículos líquidos como por ejemplo aceite graso. Las formulaciones orales adecuadas también pueden estar en forma de suspensión, jarabe, goma de mascar, oblea, elixir y similares. Si se desea, también se pueden incluir agentes convencionales para modificar sabores, colores y formas de las formas especiales. Además, para una administración conveniente mediante sonda de alimentación enteral en pacientes que no pueden tragar, los compuestos activos se pueden disolver en un vehículo de aceite vegetal lipófilo aceptable, como por ejemplo aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de cártamo.

Los compuestos activos también se pueden administrar por vía parenteral en forma de solución o suspensión, o en forma liofilizada capaz de convertirse en una forma de solución o suspensión antes de su uso. En dichas formulaciones, se pueden usar diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables como por ejemplo agua estéril y tampón salino fisiológico. Pueden incluirse otros disolventes, tampones de pH, estabilizadores, agentes antibacterianos, tensioactivos y antioxidantes convencionales. Por ejemplo, los componentes útiles incluyen cloruro de sodio, acetatos, tampones citratos o fosfatos, glicerina, dextrosa, aceites fijados, metil parabenos, polietilenglicol, propilenglicol, bisulfato de sodio, alcohol bencílico, ácido ascórbico y similares. Las formulaciones parenterales se pueden almacenar en cualquier recipiente convencional, como por ejemplo viales y ampollas.

Las vías de administración tópica incluyen aplicaciones nasales, bucales, mucosas, rectales o vaginales. Para la administración tópica, los compuestos activos se pueden formular en lociones, cremas, ungüentos, geles, polvos, pastas, aerosoles, suspensiones, gotas y aerosoles. Por tanto, se pueden incluir en las formulaciones uno o más agentes espesantes, humectantes y agentes estabilizantes. Los ejemplos de dichos agentes incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol, sorbitol, goma de xantano, vaselina, cera de abejas o aceite mineral, lanolina, escualeno y similares. Una forma especial de administración tópica es la administración mediante un parche transdérmico. Se describen métodos para preparar parches transdérmicos, por ejemplo, en Brown, et al. (1988) Ann. Rev. Med.

39:221-229.

La implantación subcutánea para la liberación sostenida de los compuestos activos también puede ser una vía de administración adecuada. Esto implica procedimientos quirúrgicos para implantar un compuesto activo en cualquier formulación adecuada en un espacio subcutáneo, por ejemplo, debajo de la pared abdominal anterior. Véase, por ejemplo, Wilson et al. (1984) J. Clin. Psych. 45:242-247. Los hidrogeles pueden utilizarse como vehículo para la liberación sostenida de los compuestos activos. Los hidrogeles son generalmente conocidos en la técnica. Por lo general, se fabrican reticulando polímeros biocompatibles de alto peso molecular en una red, que se hincha en agua para formar un material similar a un gel. En algunos casos, los hidrogeles son biodegradables o biosorbibles. Para los propósitos de esta invención, pueden ser útiles los hidrogeles hechos de polietilenglicoles, colágeno o poli (ácido glicólico-co-L-láctico). Véase, por ejemplo, Phillips et al. (1984) J. Pharmaceut. Sci., 73: 1718-1720.

La invención proporciona además un compuesto tal como se define en el presente documento anteriormente y a continuación (de acuerdo con la fórmula general I) para su uso en la inhibición de al menos una de caseína quinasa I (CKI) y quinasa 1 asociada al receptor de interleucina-1 (IRAK1). En algunas formas de realización, un compuesto tal como se define en el presente documento anteriormente y a continuación (de acuerdo con la fórmula general I) se utiliza en la inhibición de CKI e IRAK1. En las formas de realización anteriores, el uso de un compuesto de la invención tal como se define en el presente documento anteriormente y a continuación (de acuerdo con la fórmula I) permite el tratamiento de enfermedades, trastornos, síntomas y afecciones asociadas con al menos uno de CKI e IRAK1 (o en algunas formas de realización, tanto CKI como IRAK1). Bajo tales aspectos, la invención proporciona el tratamiento de enfermedades, trastornos, síntomas y afecciones asociadas con la inhibición de al menos uno de CKI e IRAK1 (o en algunas formas de realización, tanto CKI como IRAK1).

En otro de sus aspectos, la invención proporciona un compuesto tal como se define en el presente documento anteriormente y a continuación (de acuerdo con la fórmula general I) para su uso en la inhibición de la quinasa 1 asociada al receptor de interleucina-1 (IRAK1).

La invención proporciona además un compuesto tal como se define en el presente documento anteriormente y a continuación (de acuerdo con la fórmula general I) para su uso en la inhibición de la caseína quinasa I (CKI).

Debe entenderse que el término "caseína quinasa I" engloba una familia de proteína quinasas que son enzimas selectivas de serina / treonina que funcionan como reguladores de las rutas de transducción de señales en la mayoría de los tipos de células eucariotas. Las isoformas de CK1 están implicadas en la señalización de Wnt, los ritmos circadianos, el transporte nucleocitoplasmático de factores de transcripción, la reparación del ADN, la activación de p53 y la transcripción del ADN.

El término "quinasa 1 asociada al receptor de interleucina-1" debe entenderse que abarca una enzima codificada por el gen IRAK1 que se encontró que es un importante regulador aguas arriba de la vía NF-kB implicada en vías de enfermedad de neoplasias hematológicas, como por ejemplos múltiples mielomas, MDS, leucemia y linfomas, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, trastornos inflamatorios e inmunitarios y otros.

Cuando se hace referencia a la "inhibición" de dicha enzima, debe entenderse que abarca cualquier disminución cualitativa o cuantitativa de la actividad de dicha enzima debido a la unión directa o indirecta de al menos un compuesto de la invención a dicha enzima.

La invención proporciona además un compuesto tal como se define en el presente documento anteriormente y a continuación (de acuerdo con la fórmula general I) para su uso en el tratamiento de una afección, síntoma o enfermedad asociada con una afección maligna.

En algunas formas de realización, dicha afección maligna es cáncer. En otras formas de realización, dicho cáncer tiene WT o p53 mutante (mutaciones que desactivan la p53 típica de las afecciones cancerosas). En formas de realización adicionales, dicho cáncer se selecciona de leucemia, melanoma maligno, cáncer de mama, cáncer de próstata y cáncer colorrectal. En algunas formas de realización, dicho cáncer tiene WT p53.

La invención proporciona además un compuesto tal como se define en el presente documento anteriormente y a continuación para su uso en el tratamiento del cáncer que tiene WT p53, en que dicho WT p53 es un biomarcador de la eficacia de dicho compuesto. Por tanto, en este aspecto, WT p53 sirve como un indicador medible de la eficacia del tratamiento del cáncer del compuesto o composición que comprende un compuesto de la invención. La invención proporciona además un método para tratar el cáncer que tiene WT p53 en un sujeto que lo necesita, en el que dicho WT p53 es un biomarcador de la eficacia de dicho compuesto.

En algunas formas de realización, dicho uso comprende además una inducción de la respuesta de inmunoterapia del cáncer. Por tanto, en algunas formas de realización de la invención, un compuesto o una composición que comprende un compuesto de la invención proporciona tanto el tratamiento del cáncer (actividad antitumoral, antineoplásica) como la respuesta de inmunoterapia del cáncer.

En algunas formas de realización, dicha afección maligna se selecciona entre neoplasias hematológicas malignas (mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia mieloide aguda (AML), melanoma y cáncer de mama ER negativo, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), leucemia mielógena crónica ( CML), leucemia linfocítica crónica (CLL), cáncer de cabeza y cuello y cualquier combinación de los mismos.

En otro de sus aspectos, la invención proporciona un compuesto tal como se define en el presente documento anteriormente y a continuación para su uso en la inducción de una respuesta antitumoral. En algunas formas de realización, dicha respuesta antitumoral comprende una respuesta de inmunoterapia contra el cáncer.

Debe entenderse que el término "respuesta antitumoral inducida" abarca cualquier quimioterapia cualitativa o cuantitativa de tumores cancerosos.

El término "respuesta de inmunoterapia del cáncer" debe entenderse que abarca cualquier inducción de inmunoterapia del cáncer cualitativa o cuantitativa del propio sistema inmunológico del sujeto para combatir las células cancerosas. Por lo general, las inmunoterapias se pueden clasificar como activas, pasivas o híbridas (activas y pasivas), y están diseñadas para aprovechar el hecho de que las células cancerosas a menudo tienen moléculas en su superficie que pueden ser detectadas por el sistema inmunológico de un sujeto, conocido como antígenos asociados a un tumor (TAA); a menudo son proteínas u otras macromoléculas (por ejemplo, carbohidratos). La inmunoterapia activa indica al sistema inmunológico que ataque las células tumorales dirigiéndose a los TAA. Las inmunoterapias pasivas mejoran las respuestas antitumorales existentes.

En algunas formas de realización, dicha respuesta de inmunoterapia del cáncer se refiere al cambio en la expresión de moléculas de un punto de control inmunológico en una célula tumoral, en una célula que presenta antígenos, en una célula T o en una célula Natural Killer (NK).

En algunas formas de realización, dicha respuesta de inmunoterapia del cáncer se refiere a la reducción en la expresión de una molécula de punto de control inmune en la célula tumoral que induce la supresión de la actividad antitumoral de una célula T.

En algunas formas de realización, dicha respuesta de inmunoterapia contra el cáncer se refiere a la reducción en la expresión de la proteína de punto de control PD-L1. En algunas otras formas de realización, dicha respuesta de inmunoterapia se relaciona con la inhibición de PD-L1. En algunos aspectos adicionales, se usa un compuesto de la invención en un método para inhibir PD-L1.

La invención proporciona además un compuesto tal como se define en el presente documento anteriormente y a continuación (de acuerdo con la fórmula general I) para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio y relacionado con el sistema inmunológico que incluye una afección, síntoma o enfermedad asociada con el mismo. Cuando se hace referencia a "trastornos inflamatorios y relacionados con el sistema inmunológico", debe entenderse que se refiere a cualquier tipo de trastorno (incluyendo afecciones, síntomas y enfermedades asociadas con ellos) que sean tratables con inhibidores de quinasa asociados al receptor de interleucina-1. Se ha demostrado, por ejemplo, que IRAK1 es un elemento indispensable de las vías de IL-R y TLR que puede regular los niveles anormales de citocinas y, por lo tanto, puede emplearse para controlar trastornos inmunitarios y relacionados con la inflamación como, por ejemplo, artritis reumatoide, trastorno inflamatorio intestinal, psoriasis, gota, asma y cáncer (Bahia MS et al. Cell Signal. 2015 Junio; 27 (6): 1039-55).

La invención proporciona además un método para tratar una afección, síntoma o enfermedad asociada con una afección maligna en un sujeto que lo necesita, en que dicho método comprende la etapa de administrar a dicho sujeto al menos un compuesto tal como se define en el presente documento anteriormente y a continuación (de acuerdo con la fórmula general I).

La invención proporciona además un método para inhibir al menos una de la quinasa I de caseína I (CKI) y la quinasa 1 asociada al receptor de interleucina-1 (IRAKI) en un sujeto que lo necesita, que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto al menos un compuesto tal como se define en el presente documento anteriormente y a continuación (de acuerdo con la fórmula general I).

En otro de sus aspectos, la invención proporciona un método para inhibir la quinasa 1 asociada al receptor de interleucina-1 (IRAK1) en un sujeto que lo necesita, que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto al menos un compuesto tal como se define en el presente documento anteriormente y a continuación (de acuerdo con la fórmula general I).

En algunas formas de realización, un método de la invención comprende además inducir la respuesta de inmunoterapia del cáncer en dicho sujeto.

En otro de sus aspectos, la invención proporciona un método para inducir una respuesta de inmunoterapia contra el cáncer en un sujeto que lo necesite, en que dicho método comprende la etapa de administrar a dicho sujeto al menos un compuesto tal como se describe en el presente documento anteriormente y a continuación.

La invención proporciona además un método para tratar un trastorno inflamatorio y relacionado con el sistema inmunológico que incluye una afección, síntoma o enfermedad asociada con el mismo; dicho método comprende administrar a un sujeto que lo necesite un compuesto tal como se define en el presente documento anteriormente y a continuación (de acuerdo con la fórmula general I).

La invención también proporciona un método para inhibir la caseína quinasa I en un sujeto que lo necesita, que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto al menos un compuesto tal como se define en el presente documento anteriormente y a continuación (de acuerdo con la fórmula general I).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Con el fin de comprender mejor el tema que se describe en este documento y para ejemplificar cómo se puede llevar a cabo en la práctica, a continuación se describirán formas de realización, solo a modo de ejemplo no limitativo, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

Las Figuras 1A y 1B muestran una respuesta a la dosis de los compuestos indicados de la invención (la Fig. 1A los compuestos A36, A39, A6, A14, A35, A51, A29, A19-4, A41, A28, A42, A43, A46; La Fig. 1B los compuestos A30-1, A30-2, A51, A60, A64, A65) - cribado en la línea celular colorrectal RKO. Las células RKO se incubaron durante 16 horas a 37 °C con las concentraciones indicadas de los compuestos y se analizaron mediante Western Blot. Se muestran la estabilización y fosforilación de pcatenina y p53 de H2AX (yH2AX), un marcador de daños en el ADN, indicativo de inhibición de la cinasa CKIa. Debe tenerse en cuenta que mientras que la estabilización de la p-catenina y p53, y la fosforilación de H2AX es un efecto común de la mayoría de los compuestos, algunos compuestos no estabilizan la p-catenina, mientras que los análogos cercanos (por ejemplo, A19-4) solo estabilizan la pcatenina. Los niveles de proteína CKIa sirven como control de carga.

Las Figuras 2A-2D muestran que el A14 inhibidor de CKIa induce la apoptosis de células de médula ósea aisladas de ratones con crisis blástica de CML de una manera dependiente de la dosis (ex vivo). La Fig. 2A es una representación esquemática del procedimiento experimental; Incubación con A14 o DMSO durante 8 horas. La Fig. 2B muestra una reducción drástica del número de células leucémicas después del tratamiento con A14, una curva de respuesta a la dosis. La Fig. 2C muestra el porcentaje aumentado de células apoptóticas (Annexin5 / 7AAD-) de una manera dependiente de la dosis. La Fig. 2D muestra el porcentaje aumentado de células de muerte total (7AAD ) de una manera dependiente de la dosis.

Las Figuras 3A-3C demuestran que A14 reduce significativamente la carga de células leucémicas en la sangre periférica y la médula ósea in vivo en ratones con crisis blástica de CML. La Fig. 3A es una representación esquemática del procedimiento experimental, inoculación de células BM de un ratón con crisis blástica de CML (células GFP ) a ratones C57B1 / 6 normales y tratamiento diario (administración oral) con A14 o vehículo solo. La Fig. 3B muestra el porcentaje de células leucémicas GFP en sangre periférica el día 9 después del tratamiento; A14 (N = 6) en comparación con los ratones tratados con vehículo (N = 6). La Fig. 3C muestra el porcentaje de células leucémicas GFP en la médula ósea el día 9 después del tratamiento: A14 (N = 6) en comparación con los ratones tratados con vehículo (N = 6).

Las Figuras 4A-4F muestran el recuento sanguíneo completo en el día 9 después del tratamiento con A14 de ratones con crisis blástica de CML: la Fig. 4A muestra el número absoluto de glóbulos blancos (WBC) en sangre periférica (109 / L) (N = 5). La Fig. 4B muestra el número absoluto de linfocitos (linfa) en sangre periférica (109 / L) (N = 5). La Fig. 4C muestra el número absoluto de monocitos (Mono) en sangre periférica (109 / L) (N = 5). La Fig. 4D muestra el número absoluto de granulocitos (Gran) en sangre periférica (109 / L). La Fig. 4E muestra el recuento de glóbulos rojos (RBC, 1012 / L). La Fig. 4F muestra el nivel de hemoglobina (HGB, g / L).

La Figura 5 muestra fotografías representativas de frotis de sangre de un ratón tratado con A14 en comparación con un ratón con crisis blástica de CML tratado con vehículo el día 9 después del trasplante de BM.

La Figura 6 muestra una representación esquemática de la preparación del modelo de ratón AML.

Las Figuras 7A-7D muestran el efecto inhibidor de A14 sobre la progresión de AML. La Fig. 7A es una representación esquemática de los procedimientos experimentales. La Fig. 7B demuestra el porcentaje de leucocitos GFP en sangre periférica (PB) de los ratones tratados con A14 en comparación con los ratones tratados con vehículo. Las Fig. 7C y 7D muestran gráficos de análisis de citometría de flujo representativos de los leucocitos GFP en PB un día antes (Fig. 7C) y tres días (Fig. 7D) después del tratamiento con A14.

Las Figuras 8A-8G muestran el recuento sanguíneo completo el día 9 después del tratamiento de ratones AML con A14 de la invención. La Fig. 8A muestra el número absoluto de glóbulos blancos (WBC) en sangre periférica (109 / L). La Fig. 8B muestra el número absoluto de linfocitos (Linfa) en sangre periférica (109 / L). La Fig. 8C muestra el número absoluto de monocitos (Mono) en sangre periférica (109 / L). La Fig. 8D muestra el número absoluto de granulocitos (Gran) en sangre periférica (109 / L). La Fig. 8E muestra el recuento de glóbulos rojos (RBC, 1012 / L). La Fig. 8F muestra la hemoglobina (g / L). La Fig. 8G muestra plaquetas (PLT) en sangre periférica (109 / L).

La Figura 9 muestra fotografías representativas de frotis de sangre de A14 en comparación con ratones AML tratados con vehículo el día 9 después del primer tratamiento con A14.

La Figura 10 muestra la inhibición de IRAK1 por los compuestos inhibidores de la invención, A51 y A14. Las células se recolectaron y analizaron mediante transferencia Western. Las transferencias se incubaron con los siguientes anticuerpos: Phospho-IRAKl (Thr209), (A1074, AssayBiothechnology; 1 / 1,000), Phospho-IKKa / p (Ser176 / 180) (16A6, Cell Signaling (Señalización celular); 1 / 1,000), IKKa (2682, señalización celular; 1 / 1,1000), iKk p (2370, señalización celular; 1 / 1,1000), Phospho-c-Jun (Ser 63) (9261, señalización celular; 1 / 1,1000), p53 (DO -1 & 1801 mezcla de hibridomas; dilución 1:20 de sobrenadantes de cada uno), CKIa (C-19; 1 / 1.000; Santa Cruz Biotechnology) y fosfohistonaH2AX (S139; 1 / 1.000; Millipore). Los anticuerpos secundarios fueron anticuerpos anti-ratón de cabra ligados a HRP, anti-conejo de cabra y anti-cabra de conejo (todos 1 / 10.000; Jackson). La inhibición de Phospho-IRAK1, Phospho-IKKa / p y Phospho-c-Jun indican inhibición de IRAK1. Estabilización de p53 y fosforilación de H2AX (yH2AX), un marcador de daño en el ADN, indicativo de inhibición de la cinasa CKIa. Los niveles de proteína CKIa sirven como control de carga.

Las Figuras 11A-11E se refieren a los resultados experimentales conseguidos con un tratamiento de dosis única del inhibidor A51 de CKI en ratones AML. La Fig. 11A muestra esquemáticamente la preparación de ratones AML y su tratamiento con A51 (20 mg / kg) el día 30 desde la inducción de la enfermedad (inoculación de leucemia). Las Figuras 11B - 11E muestran el efecto de A51 después de 16 horas de tratamiento (en comparación con el tratamiento con vehículo solo) en la reducción de las células leucémicas totales en la sangre. La Fig. 11B muestra la reducción de leucocitos en sangre periférica (PB), la Fig. 11C muestra la contracción del bazo leucémico y las Fig. 11D y 11E muestran la reducción de la proporción de blastos leucémicos (células GFP ) en la sangre periférica (PB) y la médula ósea (BM), respectivamente.

Las Figuras 12A y 12B muestran imágenes de bazo y hueso de ratones con AML tratados. La reducción real del tamaño del bazo (esplenomegalia) después del tratamiento con A51, tal como se ha descrito anteriormente (Fig. 12A) y los huesos opacos volvieron a su color normal después de un tratamiento de dosis única (Fig. 12B).

Las Figuras 13A-13E muestran los resultados de los efectos del tratamiento in vitro de los inhibidores de CKI sobre células de AML aisladas de la médula ósea de ratones leucémicos. Se muestran el porcentaje de células muertas (7AAD ) y los efectos de los inhibidores sobre la expresión de la principal proteína del punto de control inmunológico PD-L1 en las células leucémicas; El tratamiento con inhibidores fue de 10 o 100 nM durante varios puntos de tiempo (5 horas, - Fig. 13A, 6 horas, - Fig. 13B y 13C, y 9 horas Fig. 13D y 13E).

Paso 1: Se añadieron clorhidrato de N, O-dimetilhidroxilamina (25,14 g, 257,69 mmol, 1,72 eq), HATU (56,97 g, 149.82 mmol, 1,00 eq) y TEA (45,48 g, 449,46 mmol, 3,00 eq) a una solución de ácido 2 - ciclopropilacético (15,00 g, 149.82 mmol, 1,00 eq) en DCM (500 mL) a 0 °C, y a continuación la mezcla se agitó a 30 °C durante 3 h. La mezcla resultante se vertió en agua (500 mL). La fase de lavado acuosa se extrajo con DCM (3 x 250 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na²SO⁴anhidro, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (SiO2, éter de petróleo (PE): acetato de etilo (EA) = 50: 1 a 10: 1) para dar el compuesto deseado 2 (13,20 g, 82,97 mmol, 55,4% de rendimiento) como un líquido incoloro.

¹H RMN (CDCl³, 400 MHz) 63,65 (s, 3H), 3,17 (s, 3H), 2,33 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 1,09-1,06 (m, 1H), 0,54-0,50 (m, 2H), 0,16-0,14 (m, 2H).

Paso 2: A una solución de 4-metil-2-metilsulfanilpirimidina (9,00 g, 64,19 mmol, 1,00 eq) en THF (500 mL) se le añadió LDA (2 M, 48,46 mL, 1,51 eq) a -78 °C. Después de agitar durante 1 h, se añadió gota a gota una solución del compuesto 2 (13,79 g, 96,29 mmol, 1,50 eq) en THF (500 mL) a -78 °C y a continuación la mezcla de reacción se agitó a -78 °C durante 4 h. Neutralizado con NH⁴Cl (100 mL) en solución acuosa saturada, la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 50 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na²SO⁴anhidro, se filtraron y se concentraron. El residuo se cristalizó a partir de éter de petróleo / acetato de etilo para producir el compuesto 4 deseado (13,60 g, 55,06 mmol, 85,8% de rendimiento) en forma de un sólido amarillo.

LCMS: TR = 0,629 min, m / z 223,0 [M H] .

Paso 3: Se agitó una solución del compuesto 4 (13,60 g, 61,18 mmol, 1,00 eq) en DMF-DMA (51,42 g, 2,45 mol, 40 eq) a 90 °C durante 2 h. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice para dar el núcleo A (10,60 g, 36,30 mmol, 59,3% de rendimiento) en forma de un sólido amarillo.

LCMS: TR = 0,634 min, m / z 278,2 [M H]

¹H RMN (CDCl³, 400 MHz) 68,38 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 7,62 (s, 1H), 6,96 (s, 1H), 2,96-2,87 (m, 6H), 2,56 (s, 3H) , 2,38 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 1,04-1,02 (m, 1H), 0,52-0,46 (m, 2H), 0,09-0,04 (m, 2H).

Paso 4 : Se agitó una solución de Núcleo A (10,60 g, 38,21 mmol, 1,00 eq) e hidrato de hidrazina (6,75 g, 114,63 mmol, 3,00 eq) en etanol (200 ml) a 90 °C durante 3 h. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice para producir el Núcleo B (9,00 g, 35,81 mmol, rendimiento del 93,7%) en forma de un sólido de color amarillo claro.

LCMS: TR = 2,018 min, m / z 247,1 [M H]

¹H RMN (CDCl³, 400 MHz) 68,43 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 8,04 (s, 1H), 7,10 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 3,12 (d, J = 7,2 Hz, 2H ), 2,60 (s, 3H), 1,19-1,14 (m, 1H), 0,66 (q, J = 5,2 Hz, 2H), 0,32 (q, J = 5,2 Hz, 2H).

Preparación de 4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) -2- (metilsulfonil) pirimidina (Núcleo C)

Paso 1: Se agitó una solución de Núcleo A (6,20 g, 22,35 mmol, 1,00 eq) y metilhidrazina (8,00 g, 69,46 mmol, 3,11 eq) en etanol (100 ml) a 90 °C durante 16 h. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condición básica) para producir el compuesto 5 (1,80 g, 6,84 mmol, rendimiento del 30,6%) como un sólido amarillo y el isómero 5A (2,00 g, 7,30 mmol, rendimiento del 32,6%) como un aceite amarillo.

Compuesto 5:

LCMS: TR = 2,551 min, m / z 261,1 [M H]

¹H RMN (CDCl³, 400 MHz) ó 8,38 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,11 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 3,93 (s, 3H), 3,24 (d , J = 6.4 Hz, 2H), 2,62 (s, 3H), 1,12 - 1,09 (m, 1H), 0,54 - 0,49 (m, 2H), 0,32-0,28 (m, 2H).

Regioisómero 5A:

LCMS: TR = 2,486 min, m / z 261,1 [M H]

¹H RMN (CDCla, 400 MHz) ó 8,41 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,04 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 3,92 (s, 3H), 2,96 (d , J = 6.4 Hz, 2H), 2,61 (s, 3H), 1,20 - 1,17 (m, 1H), 0,50 - 0,45 (m, 2H), 0,26 - 0,22 (m, 2H).

Paso 2: A una solución del compuesto 1 (1,50 g, 5,76 mmol, 1,00 eq) en DCM (20 mL) se le añadió m-CPBA (2,98 g, 17,28 mmol, 3,00 eq) a 0 °C y se agitó a 30 ° C durante 2 horas. La mezcla resultante se lavó con NaHSO3 (2 x 100 ml), solución acuosa saturada de NaHCO³(100 mL) y salmuera, se secaron sobre Na²SO⁴anhidro, se filtró y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (éter de petróleo: acetato de etilo = 10: 1 a 1: 1) para dar el compuesto del Núcleo C (1,50 g, 5,08 mmol, 88,2% de rendimiento) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 1,891 min, m / z 293,0 [M H]

1H RMN (CDCla, 400 MHz) ó 8,74 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 7,97 (s, 1H), 7,58 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,37 (s 3H), 3,25 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 1,14 - 1,11 (m, 1H), 0,52 - 0,49 (m, 2H), 0,37 - 0,35 (m, 2H).

Procedimientos generales para la preparación de A-n:

Método A: preparación de compuesto n_6

Se enfrió una solución de Núcleo B (25 mmol, 1,00 eq ) en DMF (50 ml) a 0 °C y se añadió NaH (1,50 eq ). Después de agitar a 0 °C durante 1 hora, se añadió RBr (1,60 eq ) y la mezcla de reacción se agitó a 20 °C durante 15 horas. Se añadió agua (10,00 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 10 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (10 ml) y salmuera (10 ml), se secaron sobre Na²SO⁴, se filtraron y se concentraron para dar el producto bruto, que se purificó para dar el compuesto n_6.

Método B: preparación del compuesto n_7

A una solución del compuesto n_6 (10 mmol, 1,00 eq ) en diclorometano (30 ml) se le añadió m-CPBA (3,00 eq ) a 0 °C y la mezcla de reacción se agitó a 20-30 °C durante 5 h. La mezcla resultante se lavó con NaHSO³(2 x 50,00 ml), solución acuosa saturada. NaHCO³(50 ml) y salmuera (10 ml), se secó sobre Na²SO⁴anhidro, se filtró y se concentró para dar el compuesto n_7.

Método C: preparación del compuesto A-n

Se calentó una mezcla de compuesto n_7 (10 mmol, 1,0 eq), DIEA (10,00 eq ) y trans-4-aminociclohexanol (1,0-3,0 eq ) en DMSO (80 ml) a 160 °C durante 3 horas. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se vertió en agua (100 ml) y a continuación se extrajo con diclorometano (3 x 50 ml). Las capas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na²SO⁴anhidro, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condición básica) para producir el compuesto A-n.

Método D: preparación del compuesto A-n

La solución del compuesto n_7 (10 mmol, 1,00 eq ) y trans-ciclohexano-1,4-diamina (2,0-4,0 eq ) en dioxano (40 ml) se agitó a 130 °C durante 2 h con microondas. La mezcla se filtró y el filtrado se purificó mediante HPLC preparativa (condición básica) para dar A-n.

Preparación de (1r, 4r) -N1- (4- (5- (ciclopropilmetil) -1-isopropil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1,4-diamina (A-35)

Paso 1: El compuesto 35_6 se sintetizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método A y se obtuvo como un sólido amarillo después de la purificación por HPLC (condición TFA). Rendimiento: 17,1%;

LCMS: TR = 1,959 min, m / z 289,1 [M H]

¹H RMN (CDCl³, 400 MHz) ó 8,49-8,47 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 8,06 (s, 1H), 7,21-7,20 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,63-4,60 (t, J = 6,6 Hz, 1H), 3,26-3,24 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 2,65 (s, 3H), 1,56 (s, 3H), 1,55 (s, 3H), 1,07-1,04 (m, 1H), 0,54-0,51 (m, 2H), 0,30-0,28 (m, 2H).

Paso 2: El compuesto 35_7 se sintetizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método B y se obtuvo como un sólido amarillo después de la purificación mediante TLC. Rendimiento: 57,8%;

LCMS: TR = 0,711 min, m / z 321,1 [M H]

Paso 3: El compuesto A-35 se sintetizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método D con transciclohexano-1,4-diamina (4,0 eq) y se obtuvo como un sólido blanco. Rendimiento: 19,7%

LCMS: TR = 1,223 min, m / z 355,3 [M H]

¹H RMN (CDCla, 400 MHz) ó 8,17-8,16 (d, J = 5,2 Hz, 1 H), 7,89 (s, 1 H), 6,72-6,71 (d, J = 5,2 Hz, 1 H), 4,85-4,83 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.60-4.53 (m, 1H), 3.23-3.22 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 2.20-2.18 (d, J = 10 Hz, 2H), 2.02-1.99 (m , 2 H), 1.54 (s, 3H), 1.52 (s, 3H), 1.40-1.27 (m, 4H), 1.08-1.06 (m, 1H), 0.52-0.48 (m, 2H), 0.28-0.26 (m, 2 H).

Preparación de (1R, 4R) -N 1- (4- (1-ciclopentil-5- (ciclopropilmetil) -1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1,4-diamina (A-36)

Paso 1: El compuesto 36_6 se sintetizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método A y se obtuvo como un aceite amarillo después de la purificación mediante HPLC preparativa (condición TFA). Rendimiento: 14,7%

LCMS: TR = 2,228 min, m / z 315,2 [M H]

¹H RMN (CDCl³, 400 MHz) ó 8,31-8,30 (d, J = 5,6 Hz, 1 H), 7,84 (s, 1 H), 7,03-7,01 (d, J = 5,2 Hz, 1 H), 4,67-4,63 (m, 1H), 3.20-3.18 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 2.52 (s, 3H), 2.05-2.02 (m, 7H), 1.65-1.62 (m, 2H), 0.98 (m, 1H), 0.43 -0,39 (m, 2 H), 0,23-0,20 (m, 2 H).

Paso 2: El compuesto 36_7 se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método B y se obtuvo como un sólido amarillo después de la purificación mediante cromatografía en columna. Rendimiento: 66,6%

LCMS: TR = 0,707 min, m / z 347,2 [M H]

Paso 3: El compuesto A-36 se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método D con transciclohexano-1,4-diamina (2,0 eq) y se obtuvo como un sólido blanco después de purificación mediante HPLC preparativa (condición TFA). Rendimiento: 41,35%

LCMS: TR = 0,591 min, m / z 381,4 [M H]

¹H RMN (CD3OD, 400 MHz) ó 8,26 (s, 1H), 8,08-8,06 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 7,27-7,25 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 4,15 (s, 1H) , 3,33 (s, 3H), 3,20 (s, 1H), 2,25-1,99 (m, 11H), 1,75 (m, 2H), 1,64-1,58 (m, 4H), 1,16 (m, 1H), 0,57-0,55 (m, 2H), 0,36 0,35 (m, 1 H).

Preparación de (1R, 4R) -N1 - (4- (5- (ciclopropilmetil) -1- (tetrahidro-2H-piran-4-H) -1H-pirazol-4-i¡) pirimidin-2-il) ciclohexano-1,4-diamina (A-39)

Paso 1: A una solución de Núcleo B (700,00 mg, 2,84 mmol, 1,00 eq) en MeCN (14 ml) se añadió CS2CO3 (1,85 g, 5,68 mmol, 2,00 eq) a 0 °C. Después de 30 min, se añadió 4-bromotetrahidropirano (703,03 mg, 4,26 mmol, 1,50 eq). La mezcla se agitó a 100 °C durante 16 h en un tubo sellado. La mezcla de reacción se filtró y el filtrado se concentró. El producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa (TFA) para dar el compuesto 39_6 (45,0 mg, 136,18 pmol, rendimiento del 4,8%) en forma de un sólido amarillo.

LCMS: TR = 0,702 min, m / z 331,1 [M H]

1H RMN (CDCls, 400 MHz) ó 8,42-8,40 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,11-7,10 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,37-4,33 (m, 1H), 4.19-4.15 (m, 1H), 3.59-3.54 (m, 2H), 3.28-3.26 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 2.6 (s, 3H), 2.44-2.40 (m, 2H) , 1,87-1,84 (m, 2 H), 1,05-1,02 (m, 1 H), 0,55-0,50 (m, 2 H), 0,33-0,30 (m, 2H).

Paso 2: El compuesto 39_7 se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método B y se obtuvo como un sólido amarillo después de la purificación por TLC preparativa. Rendimiento: 72,6%

LCMS: TR = 0,607 min, m / z 363,1 [M H]

Paso 3 : Se elaboró el compuesto A-39 de acuerdo con el procedimiento descrito en el método C con transciclohexano-1,4-diamina (3,0 eq) sin DIEA y se obtuvo como un sólido amarillo tras purificación mediante HPLC preparativa (condición básica). Rendimiento: 40,2%

LCMS: TR = 1,104 min, m / z 397,4 [M H]

¹H RMN (CDCI3, 400 MHz) 58,17-8,16 (d, J = 4,4 Hz, 1 H), 7,89 (s, 1 H), 6,72-6,70 (d, J = 5,2 Hz, 1 H), 5,12-5,07 (m, 1H), 4.37-4.34 (m, 1H), 4.18-4.15 (m, 2H), 3.84 (s, 1H), 3.59-3.53 (m, 2H), 3.26-3.25 (d, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.77 (s, 1H), 2.44-2.40 (m, 2H), 2.16 (s, 2H), 1.93 (s, 2H), 1.87-1.83 (m, 2H), 1.32-1.27 (m, 4H), 1.05 (s, 1H), 0,54-0,49 (m, 2 H), 0,29-0,27 (m, 2 H).

Preparación de (1R, 4R) -N 1 - (4- (5 -(ciclopropilmetil) -1- (oxetan-3-il) -1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1,4-diamina (A-43)

A-43

Paso 1: El compuesto 43_6 se sintetizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método A y se obtuvo como un sólido amarillo después de la purificación mediante HPLC preparativa (condición TFA). Rendimiento: 17,9% LCMS: TR = 0,664 min, m / z 303,1 [M H]

1H RMN (CDCla, 400 MHz) 58,44-8,42 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 8,04 (s, 1H), 7,13-7,12 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 5,89-5,34 (m, 1H), 5.28-5.25 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 5.03-5.00 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.21-3.20 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 2.6 (s, 3H), 0,97-0,94 (m, 1H), 0,51-0,46 (m, 2H), 0,25-0,22 (m, 2H).

Paso 2: El compuesto 43_7 se sintetizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método B y se obtuvo como un sólido amarillo después de la purificación mediante TLC preparativa. Rendimiento: 79,6%

LCMS: TR = 0,566 min, m / z 335,1 [M H]

Paso 3: El compuesto A-43 se sintetizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método D con transciclohexano-1,4-diamina (3,0 eq) y se obtuvo como una goma blanca después de purificación mediante HPLC preparativa (condición TFA). Rendimiento: 24,7%;

LCMS: TR = 0,987 min, m / z 369,3 [M H]

1H RMN (CD3OD, 400 MHz) 58,40 (s, 1 H), 8,13-8,11 (d, J = 6,8 Hz, 1 H), 7,31-7,29 (d, J = 7,2 Hz, 1 H), 5,83-5,80 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 5.15-5.12 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 5.06-5.03 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 4.12 (s, 1H), 3.28-3.26 (d, J = 6,4 Hz, 2 H), 3,19 (s, 1 H), 2,23-2,17 (m, 4 H), 1,62-1,60 (m, 4 H), 1,06 (s, 1 H), 0,53-0,52 (m, 2 H), 0,28- 0,27 (m, 2 H).

Preparación de de (R) -tetrahidrofuran-3-il metanosulfonato (41 4)

A una solución de (R) -tetrahidrofuran-3-ol (500,00 mg, 5,68 mmol, 1,00 eq) en DCM (5 ml) se le añadió TEA (1,15 g, 11,36 mmol, 2,00 eq) y cloruro de metanosulfonilo (650,11 mg, 5,68 mmol, 1,00 eq) a 0 °C. La mezcla se agitó a 20 °C durante 1 hora. La mezcla se diluyó con agua (20 ml) y se extrajo con DCM (10 ml x 2). Las capas orgánicas combinadas se concentraron para proporcionar 41_4 (900,00 mg, 5,42 mmol, rendimiento del 95,3%) como un líquido incoloro.

¹H RMN (CDCI3, 400 MHz) 55,33-5,30 (m, 1H), 4,06-3,90 (m, 4H), 3,05 (s, 3H), 2,28-2,23 (m, 2H). Preparación de (1R, 4S) -N 1- (4- (5- (ciclopropilmetil) -1 - ((S) -tetrahidrofuran-3-il) -1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1.4-diamina (A-41)

A-41

Paso 1: El compuesto 41_6 se sintetizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método A y se obtuvo como un sólido amarillo después de la purificación mediante HPLC preparativa (condición TFA). Rendimiento: 13,1% 1H RMN (CDCla, 400 MHz) 58,42-8,40 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,11-7,10 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 5,04-5,00 (m, 1H), 4.27-4.03 (m, 4H), 3.29-3.27 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 2.6 (s, 3H), 2.48-2.42 (m, 2H), 1.07-1.02 (m, 1H) , 0,53-0,49 (m, 1H), 0,30-0,28 (m, 2H).

Paso 2: El compuesto 41_7 se sintetizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método B y se obtuvo como un sólido amarillo después de la purificación por TLC preparativa. Rendimiento: 57,5%

LCMS: TR = 0,585 min, m / z 349,2 [M H]

Paso 3: El compuesto A-41 se sintetizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método D con transciclohexano-1,4-diamina (4,0 eq) y se obtuvo como un sólido gomoso blanco después de purificación mediante HPLC preparativa (condición TFA). Rendimiento: 17,2%

LCMS: TR = 0,969 min, m / z 383,3 [M H]

1H RMN (CDaOD, 400 MHz) 58,26 (s, 1 H), 8,10-8,09 (d, J = 6,8 Hz, 1 H), 7,25-7,23 (d, J = 6,8 Hz, 1 H), 5,28-5,23 (m , 1H), 4.22-4.12 (m, 3H), 3.99-3.95 (m, 2H), 3.35-3.33 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 3.19 (s, 1H), 2.47-2.44 (m, 2H), 2,35 2,17 (m, 4H), 1,62-1,57 (m, 4H), 1,14 (s, 1H), 0,58-0,56 (m, 2H), 0,36 (m, 2H).

Preparación de (S) -tetrahidrofuran-3-il metanosulfonato (42 4)

El compuesto 42_4 se preparó de la misma manera que 41_4 a partir de (S) -tetrahidrofuran-3-ol y era un líquido incoloro. Rendimiento: 90,0%

1H RMN (CDCla, 400 MHz) 55,33-5,30 (m, 1H), 4,04-3,86 (m, 4H), 3,05 (s, 3H), 2,27-2,22 (m, 2H).

Preparación de (1R, 4R) -N1- (4- (5- (ciclopropilmetil) -1 - ((R) -tetrahidrofurano-3-il) -1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1,4-diamina (A-42)

Paso 1: El compuesto 42_6 se sintetizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método A y se obtuvo como un sólido amarillo después de la purificación mediante HPLC preparativa (condición de TFA). Rendimiento: 21,4% LCMS: TR = 0,692 min, m / z 317,1 [M H]

1H RMN (CDCla, 400 MHz) ó 8,42-8,40 (d, J = 4,4 Hz, 1 H), 7,95 (s, 1 H), 7,12-7,10 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 5,04-5,00 (m, 1H), 4.27-4.03 (m, 4H), 3.29-3.27 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 2.6 (s, 3H), 2.47-2.42 (m, 2H), 1.06-1.03 (m, 1H) , 0,55-0,50 (m, 1H), 0,31-0,29 (m, 2H).

Paso 2: El compuesto 42_7 se sintetizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método B y se obtuvo como un sólido amarillo después de la purificación por TLC preparativa. Rendimiento: 83,2%

LCMS: TR = 0,587 min, m / z 349,1 [M H]

Paso 3: El compuesto A-42 se sintetizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método D y se obtuvo como un sólido gomoso blanco después de purificación mediante HPLC preparativa (condición TFA). Rendimiento: 51,5% LCMS: TR = 1,078 min, m / z 383,3 [M H]

1H RMN (CDaOD, 400 MHz) ó 8,26 (s, 1 H), 8,10-8,08 (d, J = 6,8 Hz, 1 H), 7,28-7,26 (d, J = 6,8 Hz, 1 H), 5,27-5,24 (m, 1H), 4.22-4.13 (m, 3H), 3.99-3.96 (m, 2H), 3.35-3.31 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.19 (s, 1H), 2.46-2.44 (m, 2H), 2,36 2,17 (m, 4H), 1,63-1,58 (m, 4H), 1,15 (s, 1H), 0,58-0,56 (m, 2H), 0,36 (m, 2H).

Preparación de (1R, 4R) -N1- (4- (5- (ciclopropilmetil) -1- (tetrahidro-2H-piran-3-il) -1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1,4-diamina (A-38)

Paso 1: La mezcla de 38_1 (1,20 g, 11,99 mmol, 1,40 eq) y N-aminocarbamato de bencilo (1,42 g, 8,56 mmol, 1,00 eq) en MeOH (15 ml) se agitó a 30 °C durante 2 h. Se añadió NaBH3CN (2,69 g, 42,82 mmol, 5,00 eq). La mezcla resultante se agitó a 30 °C durante 16 h. La mezcla se concentró y se diluyó con agua (50 ml) y EA (50 ml). La capa orgánica se concentró y se purificó mediante cromatografía en columna (PE: EA = 10: 1-2: 1) para proporcionar 38_2 (1,50 g, 5,99 mmol, rendimiento del 70%) como un aceite incoloro.

LCMS: TR = 0,568 min, m / z 273,2 [M H]

1H RMN (CDCla, 400 MHz) 67,40-7,35 (m, 5H), 6,25 (s, 1H), 5,26-5,14 (m, 2H), 3,86-3,73 (m, 3H), 3,48-3,30 (m, 2H), 1,91-1,85 (m, 2H), 1,59-1,46 (m, 2H).

Paso 2: A una solución de 38_2 (1,60 g, 6,39 mmol, 1,00 eq) en MeOH (15 ml) se le añadió Pd (OH) 2 (179,54 mg, 1,28 mmol, 0,20 eq). La mezcla se agitó a 20 °C bajo H2 (15 psi) durante 16 h. La mezcla se filtró y el filtrado se concentró para dar 38_3 (450 mg, bruto) como un aceite incoloro, que se utilizó en la siguiente etapa directamente sin purificación.

Paso 3: El compuesto 38_6 se preparó a partir del Núcleo A y el compuesto 38_4 de acuerdo con el mismo procedimiento descrito para la síntesis del Núcleo B y se obtuvo como un aceite amarillo después de la purificación mediante HPLC preparativa (condición TFA). Rendimiento: 40,3%

LCMS: TR = 0,851 min, m / z 331,1 [M H]

1H RMN (CDCla, 400 MHz) 68,41-8,40 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 7,92 (s, 1H), 7,10-7,09 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,34-4,33 (m, 1H), 4.03-4.00 (m, 2H), 3.87-3.81 (t, J = 10.8 Hz, 1H), 3.51-3.50 (m, 1H), 3.29-3.19 (m, 2H), 2.60 (s, 3H), 2,35 (m, 1H), 2,13 (m, 1H), 1,89-1,85 (m, 2H), 1,06-1,03 (m, 1H), 0,53-0,51 (m, 2H), 0,31 (m, 2H).

Paso 4: El compuesto 38_7 se sintetizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método B y se obtuvo como un sólido amarillo después de la purificación por TLC preparativa. Rendimiento: 56,1%

LCMS: TR = 0,739 min, m / z 363,1 [M H]

Paso 5: El compuesto A-38 se sintetizó según el procedimiento descrito en el método D con trans-ciclohexano-1,4-diamina (4,0 eq) y se obtuvo como un sólido amarillo después de purificación mediante HPLC preparativa (condición básica). Rendimiento: 40%

LCMS: TR = 1,154 min, m / z 397,3 [M H]

1H RMN (CDCb, 400 MHz) 68,18-8,17 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 7,86 (s, 1H), 6,70-6,69 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,88-4,86 (m, 1H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.02-4.00 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.86-3.81 (m, 2H), 3.51-3.49 (t, J = 3.00 Hz, 1H), 3.27 -3,19 (m, 2H), 2,81 (s, 1H), 2,34-2,31 (m, 1H), 2,19-2,16 (m, 3H), 2,00-1,97 (m, 4H), 1,38-1,27 (m, 4H) , 1.06 (s, 1H), 0.52-0.50 (m, 2H), 0.28 (m, 2H)

Procedimiento general para la síntesis de A-n

Método E

La mezcla de reacción de Núcleo C (1,00 eq ) y amina n (4,00 eq ) en DMSO (8 ml) se agitó a 160 °C durante 3 h. La mezcla de reacción se enfrió a t. a. y se vertió sobre hielo- H2O (20 ml). La capa acuosa se extrajo con EA (50 ml *3). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (50 ml *3), se secaron sobre Na²SO⁴, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna para proporcionar A-n.

Método F

La mezcla de reacción de Núcleo C (1,00 eq), TBAF (2,00 eq), K2CO3 (4,00 eq) y amina n (4,00 eq) en DMSO (10 ml) se agitó a 160 °C durante 3 h. La mezcla de reacción se enfrió a 15 °C y se vertió en H2O (20 ml). La capa acuosa se extrajo con EA (20 ml *3). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (20 ml *3), se secaron sobre Na²SO⁴, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó por mediante HPLC preparativa (condición de HCl) para proporcionar A-n.

Método G

La mezcla de reacción de amina n (1,20 eq ) y Núcleo C (1,00 eq) en dioxano (3 ml) se agitó a 130 °C en microondas durante 1,5 h. La mezcla de reacción se vertió en H2O (20 ml). La capa acuosa se extrajo con EA (20 ml *3). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (20 ml *3), se secaron sobre Na²SO⁴, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condición básica) para dar A-n.

Preparación de (1R, 4R) -N 1 - (4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1,4-diamina (A-14) y (1r, 4r) -N1 - (4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) -N4, N4-dimetilciclohexano-1,4-diamina (A-28)

Paso 1: El compuesto A-14 se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método G y se obtuvo como un sólido amarillo. Rendimiento: 38,4%

LCMS: TR = 2,043 min, m / z 327,2 [M H]

¹H RMN (CDCl³, 400 MHz) ó 8,17 (d, J = 5,3 Hz, 1 H), 7,83 (s, 1 H), 6,70 (d, J = 5,3 Hz, 1 H), 4,91 (s, 1 H), 3,93 -3,85 (m, 4 H), 3,21 (d, J = 6,3 Hz, 2 H), 2,74 (s, 1 H), 2,16 (d, J = 4,0 Hz, 2 H), 1,94 (d, J = 6,7 Hz, 2 H), 1,30 - 1,25 (m, 4H), 1,11 - 1,10 (m, 1H), 0,50 - 0,46 (m, 1H), 0,27 - 0,24 (m, 1H)

Paso 2: A una mezcla de A-14 (18,52 mg, 122,53 pmol, 1,00 eq) en EtOH (500 pL) se le añadió 2,3-dihidrobenzotriazol-1-ilmetanol (18,52 mg, 122,53 pmol, 1,00 eq) en una porción a 0 °C. La mezcla se agit ó a 15 °C durante 1 hora y se añadió NaBH4 (9,27 mg, 245,06 pmol, 2,00 eq). La mezcla resultante se agitó a 15°C durante 1 hora y se vertió en H2O (10 ml). La capa acuosa se extrajo con DCM (20 ml *3). La capa orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre NaSO4 y se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condición básica) para dar A-28 (5,00 mg, 14,10 pmol, 11,5% de rendimiento, 100% de pureza) como un sólido blanco.

LCMS: TR = 2,535 min, m / z 355,2 [M H]

¹H RMN (CDCI3, 400 MHz) 58,10 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 6,63 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,78 (d, J = 3,6 Hz, 1H) ), 3,81 (s, 3H), 3,77 - 3,71 (m, 1H), 3,13 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 2,27 (s, 6H), 2,17 (d, J = 12,4 Hz, 2H), 1,93 (d, J = 11,6 Hz, 2H), 1,36-1,31 (m, 2H), 1,23 - 1,17 (m, 2H), 1,04-1,02 (m, 1H), 0,44 - 0,39 (m, 2 H), 0,20-0,18 (m, 2 H).

Preparación de clorhidrato de 8-amino-1.3-diazaespiro Í4.51 decano-2.4-diona (amina-19)

Paso 1: Se añadió una solución de NaCN (2,75 g, 56,02 mmol, 2,39 eq) en H2O (10 ml) a la mezcla del compuesto 19_1 (5,00 g, 23,44 mmol, 1,00 eq) y (NH4) 2CO3 (4,96 g, 51,57 mmol, 2,20 eq) en EtOH (25 ml) y H2O (25 ml). La mezcla de reacción se agitó a 10 °C durante 16 horas y a continuación a 70 °C durante otras 24 horas. La TLC (PE: EA = 3: 1) mostró que se consumió el reactante (Rf = 0,55) y se formó una mancha principal (Rf = 0,25). Se dejó enfriar la mezcla de reacción y se filtró. La torta del filtro se lavó con H2O (100 ml) y se secó. Se obtuvo el compuesto 19_2 (4,00 g, 14,12 mmol, rendimiento del 60,2%) como un sólido blanco.

¹H RMN (DMSO-d6, 400 MHz) 510,51 (s, 1H), 8,48 (s, 1H), 6,70-6,72 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 3,16 (s, 1H), 1,79-1,76 (m, 2H), 1,65-1,64 (d, J = 4,0 Hz, 2H), 1,62-1,52 (m, 2H), 1,60-1,59 (m, 1H), 1,37 (s, 11H).

Paso 2: A la mezcla del compuesto 19_2 (1,00 g, 3,53 mmol, 1,00 eq) en MeOH (10 mL) se le añadió HCl / dioxano (4 M, 10 mL, 11,33 eq) a 0 °C y la mezcla de reacción se agitó a 10 °C durante 16 horas. LCMS mostró el consumo de reactivo. La mezcla de reacción se concentró para dar Amina-19 (700,00 mg, 3,19 mmol, 90,3% de rendimiento, HCl) como un sólido blanco.

¹H RMN (DMSO-d6, 400 MHz) 58,52 (s, 1H), 8,21 (s, 3H), 3,06 (s, 1H), 1,96-1,89 (m, 1H), 1,76-1,59 (m, 6H).

Preparación de 8 - ((4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) amino) -1.3-diazaespiro Í4.51 decano-2, 4-diona (A194) y (1-amino-4 - ((4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) amino) ciclohexil) metanol (A-19)

Paso 1: El compuesto A19_4 se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método E con amina-19 (4 eq) y DIEA (4 eq) y estaba como un sólido blanco después de la purificación mediante HPLC preparativa (condición básica). Rendimiento: 72,2%

LCMS: TR = 0,573 min, m / z 397,2 [M H]

¹H RMN (CD3OD, 400 MHz) ó 8,22 (s, 1H), 8,14-8,09 (m, 1H), 7,24 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 5,19 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 4,21 (s, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,30 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 2,20 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 2,09-2,05 (t, 2H), 1,86 (d, J = 14,8 Hz, 2H), 1,69-1,65 (m, 2H), 1,25-1,21 (m, 1H), 0,60 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 0,39-0,35 (m, 2H),

Paso 2: Se añadió el compuesto A19_4 (95,00 mg, 240,23 pmol, 1,00 eq) a NaOH / H2O (3 M, 640,60 pl, 8,00 eq) y la mezcla de reacción se agitó a 120 °C durante 16 h. La mezcla de reacción se enfrió a 15 °C y se vertió en H2O (20 ml). La capa acuosa se ajustó a pH = 7 con una solución 2N de HCl. La mezcla se concentró. El producto bruto se trituró con MeOH (50 ml *3). El filtrado se concentró para dar 19_5 (300,00 mg, bruto) como un sólido blanco.

LCMS: TR = 1,148 min, m / z 371,2 [M H]

¹H RMN (CD3OD, 400 MHz) ó 8,15 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 7,95-7,93 (m, 1H), 6,89-6,85 (m, 1H), 4,03 (s, 1H), 3,91 (s, 3H), 3,28 (s, 2H), 2,32-2,25 (m, 2H), 2,16-2,13 (d, J = 9,6 Hz, 2H), 1,99-1,95 (d, J = 9,6 Hz, 2H), 1,57-1,54 (d, J = 14 Hz, 2H), 1,37 (s, 1H), 0,51-0,48 (m, 2H), 0,31-0,27 (m, 2H),

Paso 3: A la mezcla de 19_5 (330,00 mg, 890,81 pmol, 1,00 eq) en THF (500 pL) se le añadió BH3 (1 M, 7,13 ml, 8,00 eq) y la mezcla de reacción se agitó a 100°C durante 16 h. La mezcla de reacción se enfrió a 15°C y se vertió en MeOH (20 ml). La mezcla se concentró. El producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa (condición básica) para dar A-19 (23,00 mg, 64,52 pmol, 7,2% de rendimiento, 100% de pureza) como un sólido blanco.

LCMS: TR = 1,060 min, m / z 357,2 [M H]

¹H RMN (CD3OD, 400 MHz) ó 8,12 (d, J = 5,6 Hz, 1 H), 7,93 (s, 1 H), 6,85-6,82 (m, 1 H), 3,88-3,80 (m, 4 H), 3,28 (s, 2H), 3,39 (s, 2H), 3,27 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 2,03-1,94 (m, 3H), 1,68-1,58 (m, 6H), 1,13 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 0,50-0,47 (m, 2H), 0,30-0,28 (m, 2H).

Preparación de 8 - ((4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) amino) -3-oxa-1-azaespiro

eq) y la mezcla de reacción se agitó a 25°C durante 16 h. La mezcla de reacción se concentró. El producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa (condición básica) para dar A-26 (4,00 mg, 10,46 pmol, 18,6% de rendimiento, 100% de pureza) como un sólido blanco.

LCMS: TR = 2,210 min, m / z 383,2 [M H]

1H RMN (CDCl3, 400 MHz) ó 8,19 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 6,74 (s, 1H), 5,97 (s, 1H), 5,02 (s, 1H), 4,15 (s , 1H), 3,89 (s, 4H), 3,17 (s, 2H), 2,16-2,13 (d, J = 12,4 Hz, 2H), 1,98-1,95 (d, J = 13,2 Hz, 2H), 1,72-1,68 (d, J = 12,8 Hz, 2H), 1,48 1,45 (d, J = 10,08 Hz, 2H), 1,10 (s, 1H), 0,49 (s, 2H), 0,24 (s, 2H).

Preparación de (1R, 4R) -N1- (4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) -N4-metilciclohexano-1,4-diamina (A-27)

Paso 1: El compuesto 27_2 se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método E con amina-27 (1.0 eq) y DIEA (10 eq) a 160 °C durante 6 h y se obtuvo como un sólido amarillo después de purificación mediante HPLC preparativa (TFA). Rendimiento: 41,1%

¹H RMN (CDCl³, 400 MHz) ó 8,18 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 7,83 (s, 1H), 6,71 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,41 (s , 1H), 3,89 - 3,82 (m, 4H), 3,49 (s, 1 H), 3,19 (d, J = 6,3 Hz, 2H), 2,19 - 2,05 (m, 4H), 1,46 (s, 9H), 1,35 - 1,29 (m, 7H), 1,26 (m, 2H), 1,23 (m, 2H), 0,50 - 0,46 (m, 2H), 0,26 - 0,24 (m, 2H)

Paso 2: A una solución de 27_2 (100,00 mg, 234,44 pmol, 1,00 eq) en THF (4,00 ml) se le añadió LiAlH4 (26,69 mg, 703,32 pmol, 3,00 eq) a 0 °C. La mezcla se agitó a 70 °C durante 3 h. La mezcla se enfrió a 0 °C y a continuación se inactivó con una solución acuosa. NH⁴Cl (3 gotas). La solución resultante se secó sobre Na²SÜ⁴y a continuación se concentró. No se pudo purificar el residuo mediante HPLC preparativa. Por lo tanto, A-27 (70 mg, bruto) se purificará después de protegerse con el grupo Boc. A la solución de A-27 (en bruto) en THF (1 ml) se le añadió (Boc2) 2 (200 mg, 2 eq). Después de agitar durante 1 hora a 20 °C, la mezcla de reacción se purificó mediante TLC preparativa (EA) para obtener 27_Boc (30 mg, 29,13% de rendimiento total), que se utilizó directamente para el siguiente paso.

Paso 3: A una solución de 27_Boc (30,00 mg, 68,09 pmol, 1,00 eq) en DCM (100 pL) se le añadió HCl / dioxano (4 M, 85 pL, 5,00 eq) en una porción a 0 °C y la mezcla se agitó a 15 °C durante 5 h. La mezcla de reacción se concentró para dar A-27 (12,00 mg, 30,88 pmol, 45,35% de rendimiento, 97% de pureza, HCl) en forma de un sólido de color amarillo claro. Rendimiento: 45,4%

LCMS: TR = 2,558 min, m / z 341,2 [M H]

¹H RMN (CD3OD, 400 MHz) ó 8,26 (s, 1H), 8,14 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 7,31 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 4,19 - 4,12 (m, 1H), 3,95 (s, 3H), 3,71 (s, 2H), 3,17 (s, 1H), 2,76 (s, 3H), 2,31-2,20 (m, 4H), 1,65 (m, 4H), 1,21 (s, 1H), 0,51 (s, 2H), 0,37 (d, J = 3,2 Hz, 2H).

Preparación de clorhidrato de N - ((1R, 4R) -4-aminociclohexil) -2-metoxiacetamida (amina-29)

Paso 1: A una mezcla de 29_1 (658,25 mg, 3,07 mmol, 1,0 eq) y cloruro de 2-metoxiacetilo (500 mg, 4,61 mmol, 1,5 eq) en DCM (5 ml) se añadió DIEA (310,82 mg, 3,07 mmol, 1,00 eq) a 0 °C. A continuación, la mezcla de reacción se agitó a 15 °C durante 2 horas. La mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna para dar 29_2 (490,00 mg, 1,71 mmol, 55,7% de rendimiento) como un sólido blanco.

¹H RMN (CDCl³, 400 MHz) ó 3,80 (s, 1H), 3,74-3,67 (m, 1H), 3,40 (s, 1H), 3,33 (s, 3H), 1,97-1,87 (m, 4H), 1,37 (s, 9H), 1,22-1,12 (m, 3H)

Paso 2: Se desprotegió el compuesto 29-2 de una manera similar a la mostrada en la etapa 3 de la síntesis de A27 y se obtuvo la amina-29 como un sólido blanco. Rendimiento: 91,9%

1H RMN (CDaOD, 400 MHz) 4,05 (s, 1H), 374 (s, 2H), 3,70 - 3,69 (m, 1H), 3,36 (s, 3H), 3,28-3,27 (m, 1H), 3,09-3,07 (m, 1H), 2,07 - 2,04 (m, 2H), 1,94 - 1,92 (m, 2H), 1,56 - 1,40 (m, 4H)

Preparación de N - ((1R, 4R) -4 - ((4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) amino) ciclohexil) -2-metoxiacetamida (A29 1)

El compuesto A29_1 se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método E con amina-29 (1,0 eq) y DIEA (4 eq) y se obtuvo como un sólido amarillo claro después de purificación mediante HPLC preparativa (condición básica). Rendimiento: 27,4%

LCMS: TR = 2,535 min, m / z 355,2 [M H]

1H RMN (CDCla, 400 MHz) ó 8,20 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 7,85 (s, 1H), 6,73 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 6,40 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,92 (s, 1H), 3,91 (m, 7H), 3,45 (m, 3H), 3,27-3,20 (m, 2H), 2,21 (s, 2H), 2,10 (s, 2H), 1,45 - 1,36 (m, 4H), 1,13-1,12 (m, 1H), 0,53 - 0,48 (m, 2H), 0,28-0,26 (q, J = 4,9 Hz, 2H)

Preparación de (1R, 4R) -N1- (4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) -N4- (2-metoxietil) ciclohexano-1.4-diamina (A-29)

A una mezcla de LAH (40,00 mg, 1,05 mmol, 10,50 eq) en THF (4 ml) se añadió una solución de A29_1 (40,00 mg, 100,38 pmol, 1,00 eq) en THF (1 ml) a 15°C. La mezcla se agitó a 70°C durante 36 h. La mezcla de reacción se enfrió y se vertió en H2O (0,1 ml). Se añadió 1 N NaOH (0,1 ml) y se filtró. El filtrado se concentró. El producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa (condición básica) para dar A-29 (4,00 mg, 9,88 pmol, rendimiento del 9,8%, pureza del 95,0%) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 2,535 min, m / z 355,2 [M H]

1H RMN (CDCla, 300 MHz) ó 8,17 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 7,82 (s, 1H), 6,76 - 6,69 (m, 1H), 4,88 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 3,89 (s, 4H), 3,54-3,50 (m, 2H), 3,38 (s, 3H), 3,22 (d, J = 8,40 Hz, 2 H) 2,84-2,81 (m, 2H), 2,49 (s, 1H) 2,19 (s, 2H), 2,01 (s, 1H) 1,38 (s, 4H), 1,07 (s, 1H) 0,49-0,43 (m, 2H), 0,25 - 0,20 (m, 2H)

Preparación de clorhidrato de (1R, 4R) -4- (piperidin-1-il) ciclohexanamina (amina-47)

-

Paso 1: Una mezcla de 47_1 (200,00 mg, 933,27 pmol, 1,00 eq), 1, 5-diyodopentano (302,32 mg, 933,27 pmol, 1,00 eq) y K2CO3 (515,95 mg, 3,73 mmol, 4,00 eq) en MeCN (10 mL) se agitó a 90 °C durante 16 horas. La mezcla se filtró y el filtrado se concentró para dar 47_2 (300 mg, bruto) como un sólido blanco y se utilizó directamente en el siguiente paso.

Paso 2: Se desprotegió 47_2 bruto de una manera similar a la mostrada en el paso 3 de la síntesis de A27 y se obtuvo la amina-47 como un sólido blanco.

¹H RMN (D2O, 400 MHz) 53,55-3,10 (m, 6H), 2,16-2,08 (m, 4H), 1,59-1,41 (m, 10H).

Preparación de 4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) -N - ((1R, 4R) -4- (piperidin-1-il) ciclohexil) pirimidin-2-amina (A-47)

El compuesto A-47 se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método F con amina-47 y se obtuvo como un sólido blanco después de purificación mediante HPLC preparativa (condición de HCl). Rendimiento: 49,3% LCMS: TR = 1,530 min, m / z 395,2 [M H]

¹H RMN (CD3OD, 400 MHz) 58,21 (s, 1H), 8,06 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 7,24 - 7,21 (m, 1H), 4,10 (s, 1H), 3,88 (s, 3H), 3,49 (d, J = 11,2 Hz, 2H), 3,23 (s, 2H), 3,06-3,00 (m, 4H), 2,26 (d, J = 10 Hz, 4H), 1,96-1,57 (m, 10H), 1,15 (s, 1H), 0,50 (s, 2H), 0,31-0,30 (m, 2H)

Preparación de clorhidrato de (1R, 4R) -4-morfolinociclohexanamina (amina-48)

La amina 48 bruta se sintetizó de una manera similar a la descrita para la síntesis de la amina 47 y se obtuvo como un sólido amarillo.1

¹H RMN (D2O, 400 MHz) 53,87 (s, 4H), 3,24-3,11 (m, 6H), 2,20-2,12 (m, 4H), 1,59-1,39 (m, 5H).

Preparación de 4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) -N - ((1r, 4r) -4-morfolinociclohexil) pirimidin-2-amina (A-48)

El compuesto A-48 se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método F con amina-48 con TBAF (1,0 eq) y se obtuvo como un sólido blanco después de purificación mediante HPLC preparativa (condición de HCl). Rendimiento: 51,2%

LCMS: TR = 2,095 min, m / z 397,3 [M H]

¹H RMN (CD3OD, 400 MHz) ó 8,16 (s, 1H), 8,01 (s, 1H), 7,19 (s, 1H), 4,06-3,97 (m, 3H), 3,83-3,78 (m, 5H), 3,51 3,42 (m, 2H), 3,24 (s, 1H), 3,14-3,12 (m, 1H), 2,29-2,19 (m, 4H), 1,69-1,63 (m, 2H), 1,54-1,48 (m, 2H), 1,02 (s, 1H), 0,45 (s, 2H), 0,25 (s, 2H).

Preparación de clorhidrato de (1R, 4R) -4- (pirrolidin-1-il) ciclohexanamina (amina-49)

49 2

La amina 49 bruta se sintetizó de manera similar a la descrita para la síntesis de la amina 47 y se obtuvo como un sólido blanco.

¹H RMN (D2O, 400 MHz) ó 3,55-3,53 (m, 3H), 3,13-2,99 (m, 4H), 2,21-2,09 (m, 2H), 2,06-1,99 (m, 7H), 1,49-1,40 (m, 4H).

Preparación de 4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) -N - ((1R, 4R) -4- (pirrolidin-1-il) ciclohexil) pirimidin-2-amina (A-49)

El compuesto A-49 se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método F con amina-49 y se obtuvo como un sólido blanco después de purificación mediante HPLC preparativa (condición de HCl). Rendimiento: 89,3%. LCMS: TR = 2,607 min, m / z 381,3 [M H]

¹H RMN (CDCl³, 400 MHz) ó 8,16 (s, 1H), 8,01 (s, 1H), 7,19 (s, 1H), 4,06 (s, 1H), 3,83 (s, 3H), 3,08 (s, 2H) , 2,26 1,48 (m, 13H), 1,09 (s, 1H), 0,45 (s, 2H), 0,25 (s, 2H).

Preparación de clorhidrato de (1R, 4R) -4- (azetidin-1-il) ciclohexanamina (amina-50)

50 1 50 2 amina -50

La amina 50 bruta se sintetizó de manera similar a la descrita para la síntesis de la amina 47 y se obtuvo como un sólido blanco.

1H RMN (CDCls, 400 MHz) ó 4.15-4.08 (m, 2H), 3.65-3.12 (m, 1H), 2.28-2.03 (m, 6H), 1.50-1.42 (m, 4H), 1.26-1.20 (m, 1H).

Preparación de N - ((1R, 4R) -4- (azetidin-1-il) ciclohexil) -4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-amina (A-50)

El compuesto A-50 se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método F con amina-50 y se obtuvo como un sólido blanco después de purificación mediante HPLC preparativa (condición básica). Rendimiento: 16% LCMS: TR = 2,494 min, m / z 367,3 [M H]

1H RMN (CDCls, 400 MHz) ó 8,17 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 7,88 (s, 1H), 6,70 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 4,86 (d, J = 11,6 Hz, 1H) ), 3.91 (m, 4H), 3.25-3.20 (m, 5H), 2.31-2.07 (m, 6H), 2.05-2.02 (m, 2H), 1.24-1.10 (m, 5H), 0.47-0.43 (m, 2H), 0,25 0,22 (s, 2H).

Preparación de (1R, 4R) -N1- (4- (5- (ciclobutilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1,4-diamina (A-45)

Paso 1: Se agitó una solución de 2-ciclobutilacetonitrilo (1,00 g, 10,51 mmol, 1,00 eq) en HCl (6 M, 10,00 ml, 5,71 eq) a 120 °C durante 16 h. La mezcla se diluyó con agua (50 ml) y se extrajo con EA (20 ml x 2). La capa orgánica combinada se lavó con agua (40 ml), se secó y se concentró para dar 45_1 (750 mg, 6,57 mmol, rendimiento del 62,5%) como un líquido incoloro.

1H RMN (CDCI3, 400 MHz) 52,72-2,68 (m, 1H), 2,47-2,45 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 2,17-2,15 (m, 2H), 1,90-1,88 (m, 2H), 1,75-1,70 (m, 2 H).

Pasos 2-4: El compuesto 45_5 se sintetizó de una manera similar a la descrita para la síntesis del núcleo A en el esquema 1.1.

El compuesto 45_2 se obtuvo como un líquido incoloro.

1H RMN (CDCl3, 400 MHz) 53,68 (s, 3H), 3,16 (s, 3H), 3,75-3,71 (m, 1H), 2,55-2,53 (m, 2H), 2,16-2,13 (m, 3H), 1,89-1,87 (m, 2H), 1,73-1,68 (m, 2H).

El compuesto 45_4 se obtuvo como un aceite amarillo.

LCMS: TR = 0,795 min, m / z 237,1 [M H]

El compuesto 45_5 se obtuvo como un sólido marrón oscuro:

1H RMN (CDCla, 400 MHz) 58,39-8,38 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,59 (s, 1H), 6,96-6,92 (m, 1H), 2,96 (s, 3H), 2,89 (m, 5H), 2,72-2,68 (m, 1H), 2,57 (s, 3H), 2,10-2,05 (m, 2H), 1,87-1,82 (m , 4H).

Pasos 5-6: El compuesto 45_7 se sintetizó de una manera similar a la descrita para la síntesis de Núcleo C en el esquema 1.2.

El compuesto 45_6 se obtuvo como un aceite amarillo después de la purificación mediante HPLC preparativa (condición TFA). Rendimiento: 21,2%;

1H RMN (CDCla, 400 MHz) 58,41-8,39 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,88 (s, 1H), 7,09-7,07 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 3,89 (s, 3H), 3.35-3.33 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 2.72-2.67 (m, 1H), 2.6 (s, 3H), 2.02-1.98 (m, 2H), 1.84-1.76 (m, 4H).

El compuesto 45_7 se obtuvo como un aceite amarillo después de la purificación mediante TLC preparativa. Rendimiento: 86,6%;

LCMS: TR = 0,706 min, m / z 307,2 [M H]

Paso 7: El compuesto A-45 se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el método D con transciclohexano-1,4-diamina (4,0 eq) y se obtuvo como un sólido amarillo después de purificación mediante HPLC preparativa (condición básica). Rendimiento: 21,9%;

LCMS: RT = 0,539 min, m / z 341,3 [M H] ;

1H RMN (CDCls, 400 MHz) 58,18-8,17 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 7,82 (s, 1H), 6.69-6.68 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 4.85-4.83 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.91-3.84 (m, 4H), 3.33-3.31 (d, J = 7.6 Hz , 2H), 2,75-2,68 (m, 2H), 2,18-2,17 (m, 2H), 2,00-1,93 (m, 4H), 1,80-1,77 (m, 4H), 1,31-1,26 (m, 4H).

Preparación de (1R, 4R) -N1- (4- (5- (ciclopentilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1.4-diamina (A-46)

El compuesto A-46 se sintetizó de una manera similar a la descrita para la síntesis del compuesto A-45.

El compuesto 46_2 se obtuvo como un aceite incoloro.

¹H RMN (CDCl³, 400 MHz) 63,64 (s, 3H), 3,14 (s, 3H), 2,41-2,40 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,26-2,25 (m, 1H), 1,82-1,80 (m, 2H), 1,59-1,51 (m, 4H), 1,15 - 1,13 (m, 2H).

El compuesto 46_5 se obtuvo como un aceite amarillo.

LCMS: TR = 1,294 min, m / z 306,2 [M H]

El compuesto 46_6 se obtuvo como un aceite amarillo después de la purificación mediante TLC preparativa. Rendimiento: 26,5%

LCMS: TR = 0,866 min, m / z 289,1 [M H]

¹H RMN (CDCl³, 400 MHz) 68,42-8,41 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,10-7,09 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 3,90 (s, 3H) , 3.26-3.24 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 2.61 - 2.60 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.21 (m, 1H), 1.72 - 1.67 (m, 4H), 1.27 - 1.26 (m, 2H), 1,25 (m, 3H).

El compuesto 46_7 se obtuvo como un sólido blanco después de la purificación mediante TLC preparativa. Rendimiento: 44,0%

LCMS: TR = 1,219 min, m / z 321,2 [M H]

El compuesto A-46 se obtuvo como un sólido amarillo después de la purificación mediante HPLC preparativa (condición básica). Rendimiento: 52,7%

LCMS: TR = 2,381 min, m / z 355,2 [M H]

¹H RMN (CD3OD, 400 MHz) 68,16 (s, 1H), 8,07-8,03 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 7,20-7,18 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 4,06-4,02 (m, 1H), 3,88 (s, 3H), 3,31-3,30 (m, 2H), 3,16 (s, 1H), 2,17-2,15 (m, 5H), 1,67 (m, 4H), 1,56 (m, 6H), 1,30 -1,25 (m, 2H) Preparación de (1R, 4R) -N1- (5-cloro-4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1,4-diamina (A-51)

Paso 1: A una solución de compuesto N-metilpirazol (51_1,8,00 g, 97,44 mmol, 1,00 eq ) en THF (160 ml) se añadió gota a gota n-BuLi (2,5 M, 46,77 ml, 1,20 eq ) a -78 °C. Después de agitar la mezcla resultante durante 1 ha esa temperatura, se añadió gota a gota la solución de ciclopropanocarbaldehído (8,20 g, 116,93 mmol, 1,20 eq) en THF (80 ml). Y a continuación la mezcla de reacción se agitó a 20 °C durante 16 h. La TLC (PE: EA = 2: 1) mostró que se consumió el reactante 1 (Rf = 0,3) y se formó el producto (Rf = 0,05). La mezcla se vertió en NH⁴Cl acuoso (300 ml) y se agitó durante 10 min. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (100 ml x 2). La fase orgánica combinada se lavó con salmuera (100 ml), se secó sobre Na²SO⁴anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (SiO2, PE: EA = 8: 1-0: 1) para producir el compuesto 51_3 (12,00 g, 78,85 mmol, 80,9% de rendimiento, 100% de pureza) como un aceite incoloro.

LCMS: TR = 0,118 min, m / z 153,1 [M H]

Paso 2 : La mezcla de reacción del compuesto 51_3 (9,00 g, 59,14 mmol, 1,00 eq), TFA (40,46 g, 354,84 mmol, 26,27 mL, 6,00 eq ) y Et³SiH (41,26 g, 354,84 mmol, 56,52 mL, 6,00 eq) en DCM (900 ml) se agitó a 40 °C durante 36 h. La mezcla se ajustó a pH = 8 con NaHCO³acuoso y se separó. La capa orgánica se concentró y se purificó mediante HPLC preparativa (condición básica) para dar el compuesto 51_5 (2,10 g, 15,42 mmol, rendimiento del 26,1 %) como un aceite marrón oscuro.

LCMS: TR = 0,565 min, m / z 137,1 [M H]

Paso 3: A una solución del compuesto 51_5 (2,10 g, 15,42 mmol, 1,00 eq) en DCM (21 ml) se le añadió NBS (3,02 g, 16,96 mmol, 1,10 eq) a 0 °C. La mezcla se agitó a 20 °C durante 2 h. La mezcla se concentró y se purificó mediante cromatografía en columna (SiO2, PE: EA = 20: 1) para dar el compuesto 51_6 (3,00 g, 13,95 mmol, rendimiento del 90,5%) en forma de un aceite amarillo.

LCMS: TR = 0,784 min, m / z 217,1 [M H]

¹H RMN (CDCl³, 400 MHz) 67,39 (s, 1 H), 3,87 (s, 3 H), 2,65-2,63 (d, J = 8,8 Hz, 2 H), 0,98-0,94 (m, 1H), 0,55 -0,51 (m, 2H), 0,29-0,25 (m, 2H).

Paso 4 : A una solución del compuesto 51_6 (3,00 g, 13,95 mmol, 1,00 eq) en THF (60 ml) se le añadió gota a gota n-BuLi (2 M, 10,46 ml, 1,50 eq) a -78 °C. Después de agitar durante 0,5 h a dicha temperatura, se añadió una solución de 2-isopropoxi-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (5,19 g, 27,90 mmol, 2,00 eq) en THF (6 ml). La mezcla resultante se calentó a 20 °C y se agitó durante 0,5 h. La TLC (PE: EA = 5: 1) mostró que se consumió el reactivo (Rf = 0,6) y se formó el producto (Rf = 0,5). La mezcla se inactivó con NH⁴Cl saturado (50 ml) y se extrajo con EA (100 ml). La capa orgánica se concentró y se purificó mediante cromatografía en columna (SiO2, PE: EA = 20: 1-10: 1) para dar el compuesto 51_7 (3,30 g, 11,40 mmol, rendimiento del 81,7%, pureza del 90,5%) como un aceite incoloro.

LCMS: TR = 0,801 min, m / z 263,2 [M H]

¹H RMN (CDCl³, 400 MHz) 67,67 (s, 1 H), 3,85 (s, 3 H), 2,82-2,81 (d, J = 6,8 Hz, 2 H), 1,30 (s, 12H), 0,92-0,90 (m, 1H), 0,45-0,42 (m, 2H), 0,29-0,27 (m, 2H).

Paso 5: A una solución del compuesto 51_7 (500,00 mg, 1,91 mmol, 1,00 eq) en DME (10 mL) se le añadieron 2, 4, 5-tricloropirimidina (51_8, 420,40 mg, 2,29 mmol, 1,20 eq), Na2CO3 (2 M, 2,10 ml, 2,20 eq) y catalizador PdCl2 (Amphos) 2 (67,62 mg, 95,50 pmol, 0,05 eq) bajo nitrógeno. La mezcla resultante se agitó a 85 °C durante 2 h bajo nitrógeno. La TLC (PE: EA = 5: 1) mostró que se consumió el reactivo (Rf = 0,4) y se formó el producto (Rf = 0,5). La mezcla se diluyó con agua (50 ml) y se extrajo con EA (50 ml). La capa orgánica se concentró y se purificó mediante una columna de gel de sílice (PE: EA = 5: 1) para producir el compuesto 51_9 (350,0 mg, 1,05 mmol, 55% de rendimiento, 85% de pureza) como un aceite amarillo.

LCMS: TR = 0,819 min, m / z 283,1 [M H]

Paso 6: La mezcla de reacción del compuesto 51_9 (300,00 mg, 1,06 mmol, 1,00 eq) y trans-ciclohexano-1,4-diamina (484,17 mg, 4,24 mmol, 4,00 eq) en dioxano (4,5 mL) se agitó a 130 °C durante 2h en microondas. La mezcla se filtró y se concentró. El bruto se purificó mediante HPLC preparativa (condición de HCl) para proporcionar A-51 (80,00 mg, 200,04 pmol, 18,9% de rendimiento, 99,3% de pureza, HCl) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 2,817 min, m / z 361,1 [M H]

¹H RMN (DMSO-d6, 400 MHz) 68,37 (s, 1 H), 8,29 (s, 3 H), 8,08 (s, 1 H), 3,86 (s, 3 H), 3,70-3,68 (m, 2 H), 3.06-3.05 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 2.96 (s, 1H), 2.03-1.95 (m, 4H), 1.49-1.32 (m, 4H), 0.98 (s, 1H), 0.42 -0,40 (m, 2H), 0,16 (m, 2H).

Preparación de (1R, 4R) -N1- (4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) -5-meti¡pirimidin-2-i¡) ciclohexano-1,4-diamina (A-52)

Paso 1: A una solución del compuesto 51_7 (500,00 mg, 1,91 mmol, 1,00 eq) en DME (10 mL) se le añadió el compuesto 52_8 (373,60 mg, 2,29 mmol, 1,20 eq), Na2CO3 (ac) (2 M, 2,1 mL), 2,20 eq) y catalizador PdCl2 (Amphos) 2 (67,62 mg, 95,50 pmol, 0,05 eq) bajo nitrógeno. La mezcla resultante se agitó a 85 °C durante 2 h bajo nitrógeno. La TLC (PE: EA = 5: 1) mostró que se consumió el reactivo (Rf = 0,4) y se formó el producto (Rf = 0,25). La mezcla se diluyó con agua (50 ml) y se extrajo con EA (50 ml). La capa orgánica se concentró y se purificó mediante cromatografía en columna (SiO2, PE: EA = 20: 1-5: 1) para dar el compuesto 52_9 (350,00 mg, 1,15 mmol, 60,3% de rendimiento, 86,5% de pureza) como un aceite amarillo.

LCMS: TR = 0,761 min, m / z 263,2 [M H]

Paso 2: La mezcla de reacción del compuesto 52_9 (350,00 mg, 1,33 mmol, 1,00 eq) y trans-ciclohexano-1,4-diamina (607,49 mg, 5,32 mmol, 4,00 eq) en dioxano (5 ml) se agitó a 130 °C durante 2 h en microondas. La TLC (PE: EA = 1: 1) mostró que se consumió el reactivo (Rf = 0,6) y se formó el producto (Rf = 0,05). La mezcla se filtró y se concentró. El bruto se purificó mediante HPLC preparativa (condición de HCl) y a continuación mediante HPLC preparativa (condición básica) para dar A-52 (30,0 mg, 88,00 |jmol, 6,6% de rendimiento, 99,8% de pureza) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 2,429 min, m / z 341,2 [M H]

1H RMN (CDCla, 400 MHz) 8,09 (s, 1H), 7,67 (s, 1H), 4,72-4,70 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 3,91 (s, 3H), 3,82-3,80 (m, 1H), 3,02-3,00 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 2,79-2,76 (m, 1H), 2,22 (s, 3H), 2,14-1,93 (m, 4H), 1,32-1,23 (m, 4H), 0,97 (m, 1H), 0,45-0,42 (m, 2H), 0,12-0,10 (m, 2H).

Preparación de (1R, 4R) -N1- (5-cloro-4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) -4-metilciclohexano-1,4-diamina (A-30 1) y (1S, 4S) -N1- (5-cloro-4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) -4-metilciclohexano-1,4-diamina (A-302)

Paso 1: A una mezcla de compuesto 30_1 (900,00 mg, 3,96 mmol, 1,00 eq) y BnNH2 (424,26 mg, 3,96 mmol, 432,92 jL, 1,00 eq) en DCM (18,00 ml) se le añadió AcOH (237,77 mg, 3,96 mmol, 226,45 jL, 1,00 eq) y NaBH (OAc) 3 (1,68 g, 7,92 mmol, 2,00 eq). La mezcla resultante se agitó a 20 °C durante 2 horas. La mezcla se inactivó con H2O (50 ml) y se separó. La capa orgánica se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre Al2O3 (DCM: MeOH = 20: 1) para dar el compuesto 30_2 (650,00 mg, 2,03 mmol, 51,3% de rendimiento, 99,6% de pureza) como un aceite rojo.

LCMS: TR = 1,520 min, m / z 319,2 [M H]

1H RMN (CDCla, 400 MHz) 67,33-7,31 (m, 5 H), 4,43-4,35 (m, 1 H), 3,81 (d, J = 10,8 Hz, 2 H), 2,62-2,50 (m, 1H), 2,12-2,09 (m, 1H), 1,82-1,79 (m, 4H), 1,43 (s, 9H), 1,38-1,27 (m, 7H).

Paso 2: A una solución del compuesto 30_2 (350,00 mg, 1,10 mmol, 1,00 eq) en MeOH (3,5 ml) se le añadió Pd (OH) 2 (35,00 mg). La mezcla se agitó a 20 °C durante 16 horas bajo H2 (16 psi). La T^lC (DCM: MeOH = 10: 1) mostró el reactante (Rf = 0,6) consumido y el producto (Rf = 0,3) formado. La mezcla se filtró y las aguas madres se concentraron para dar amina-30 (220,00 mg, 963,5 umol, 87,6% de rendimiento) como un aceite rojo.

MS: m / z 229,2 [M H]+

¹H RMN (CDCls, 400 MHz) 64,43-4,33 (m, 1 H), 3,82-2,66 (m, 1 H), 2,08 (s, 1H), 1,79-1,66 (m, 4H), 1,43 (s, 9H)), 1,33-1,27 (m, 7H).

Paso 3: A una solución de Amina-30 (300,00 mg, 917,99 jmol, 1,00 eq) y Core D (230,57 mg, 1,01 mmol, 1,10 eq) en DMSO (4 ml) se le añadió DIEA (480,97 jL, 2,75 mmol, 3,00 eq) y T^bAF (48,00 mg, 2,75 mmol, 0,20 eq). La mezcla se agitó a 160 °C durante 3 horas. La mezcla se separó entre EA (50 ml) y H2O (50 ml). La capa orgánica se concentró para proporcionar 30_3 (400,00 mg, en bruto) como un aceite rojo.

LCMS: TR = 1,081 min, m / z 475,2 [M H]

Paso 4: A una solución de 30_3 (400,00 mg, 842,05 jmol, 1,00 eq) en DCM (4 ml) se le añadió TFA (800 jL ) a 0 °C. La mezcla resultante se agitó a 20 °C durante 1 hora. La TLC (PE: EA = 2: 1) mostró el reactante (Rf = 0,6) consumido y el producto (Rf = 0,05) formado. La mezcla se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condición de HCl) para dar A-30_1 (55,00 mg, 127,60 pmol, 15,1% de rendimiento, 95,4% de pureza, Hcl) y A-30_2 (40,00 mg, 95,31 pmol, 11,3% de rendimiento, 98,0 % de pureza, HCl) como un sólido amarillo. LCMS (A-30_1): TR = 2,495 min, m / z 375,2 [M H]

1H RMN_Pico-1 (MeOD, 400 MHz) ó 8,49 (s, 1 H), 8,45 (s, 1 H), 4,10 (s, 1 H), 3,96 (s, 3H), 3,23 (d, J = 6,4 Hz , 2H), 2.11-2.10 (m, 2H), 2.07-1.94 (m, 2H), 1.84-1.74 (m, 4H), 1.47 (s, 3H), 1.09-1.08 (m, 1H), 0.55-0.51 (m, 2H), 0,28-0,27 (m, 2 H).

LCMS (A-30_2): TR = 2,527 min, m / z 375,2 [M H]

1H RMN_Pico-2 (MeOD, 400 MHz) ó 8,47 (s, 2H), 4,19 (s, 1 H), 3,96 (s, 3H), 3,19 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 2,05-2,1. 99 (m, 2H), 1,87-1,78 (m, 2H), 1,42 (s, H), 1,08-1,07 (m, 1H), 0,54-0,52 (m, 2H), 0,30-0,28 (m, 2H).

Preparación de (1R, 4R) -N1- (4- (5- (ciclobutilmetil) -1-isopropil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1,4-

Paso 1: A una mezcla de NaCN (13,81 g, 281,82 mmol, 1,40 eq) en DMSO (240 ml) se le añadió gota a gota 53_1 (30,00 g, 201,30 mmol, 22,56 ml, 1,00 eq) a 60°C. La mezcla se mantuvo a 75 °C durante 16 h. La mezcla se enfrió y se diluyó con agua (500 mL). La solución se extrajo con EtOAc (200 ml *3). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (100 ml *3) y se secaron. La capa orgánica se concentró para dar 53_2 (15,00 g, 157,66 mmol, 78,3% de rendimiento) como un líquido amarillo claro.

1H RMN (CDCla, 400 MHz) ó 2,64-2,63 (m, 1 H), 2,42-2,41 (d, J = 6,4 Hz, 2 H), 2,20-2,17 (m, 2 H), 1,90-1,83 (m, 4H).

Paso 2: Se agitó una solución de 53_2 (15,00 g, 157,66 mmol, 1,00 eq) en HCl (6 M, 150 ml, 5,71 eq) a 120 °C durante 16 horas. La mezcla se diluyó con agua (500 ml) y se extrajo con EtOAc (200 ml x 2). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (400 ml). La capa orgánica se secó y se concentró para dar 53_3 (16,00 g, 140,18 mmol, 88,9% de rendimiento) como un líquido incoloro.

1H RMN (CDCla, 400 MHz) ó 2,69-2,68 (m, 1 H), 2,47-2,45 (m, 2 H), 2,17-2,15 (m, 2H), 1,89-1,87 (m, 2H), 1,75-1,70 (m, 2H).

Paso 3: A una solución de 53_3 (16,00 g, 140,18 mmol, 1,00 eq) y N-metoximetanamina (20,51 g, 210,27 mmol, 1,50 eq, HCl) en DCM (160 ml) se añadió CDI (45,46 g, 280,36 mmol, 2,00 eq) a 0 °C en porciones. La mezcla se agitó a 20 °C durante 16 horas. La mezcla se diluyó con agua (50 ml) y se extrajo con DCM (30 ml *3). La capa orgánica combinada se secó y se concentró para dar un producto bruto. El producto bruto se purificó mediante columna de gel de sílice (PE: Ea = 50: 1 ~ 10: 1) para dar 53_4 (12,00 g, 76,33 mmol, 54,4% de rendimiento) como un líquido incoloro.

¹H RMN (CDCI3, 400 MHz) 53,68-3,67 (d, J = 2,4 Hz, 3 H), 3,16 (s, 3 H), 2,77-2,73 (m, 1H), 2,54-2,53 (m, 2H), 2,16 2,13 (m, 2H), 1,88-1,86 (m, 2H), 1,73-1,72 (m, 2H), 1,70-1,68 (m, 2H).

Paso 4: A una solución de 53_4 (4,50 g, 32,09 mmol, 1,00 eq) en THF (225 ml) se añadió LDA (2 M, 24,07 ml, 1,50 eq) a -78 °C. Después de agitar durante 1 hora, se le añadió una solución de 2-ciclobutil-N-metoxi-N-metil-acetamida (6,05 g, 38,51 mmol, 1,20 eq) en THF (120 ml) a -78 °C. La mezcla resultante se agitó a -78 °C durante 4 h, se inactivó con NH⁴Cl saturado (200 ml) y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (200 ml *3). Las capas combinadas se lavaron con salmuera (200 ml), se secaron sobre Na²SÜ⁴anhidro, se filtraron y se concentraron para dar 53_5 (10,00 g, bruto) como un aceite amarillo.

LCMS: TR = 0,788 min, m / z 237,1 [M H]

Paso 5: La solución de 53_5 (10,00 g, 42,31 mmol, 1,00 eq) en DMF-DMA (201,68 g, 1,69 mol, 224,09 mL, 40,00 eq) se agitó a 90°C durante 2 h. La mezcla se concentró para dar un producto bruto. El producto bruto se purificó mediante columna de gel de sílice (DCM: MeOH = 1: 0 ~ 10: 1) para proporcionar 53_6 (8,80 g, bruto) como un sólido marrón negro.

Paso 6: A una solución de 53_6 (800,00 mg, 2,75 mmol, 1,00 eq) en EtOH (12 mL) se le añadió isopropilhidrazina (364,95 mg, 3,30 mmol, 1,20 eq, Hc I) y TEA (333,93 mg, 3,30 mmol, 457,43 ul , 1,20 eq). La mezcla se agitó a 90 °C durante 1 hora. La mezcla se concentró. El bruto se purificó mediante HPLC preparativa (TFA) para dar 53_7 (600,00 mg, 1,88 mmol, 68,5% de rendimiento, 95% de pureza) como un aceite amarillo.

LCMS: TR = 0,901 min, m / z 303,2 [M H]

Paso 7: A una solución de 53_7 (600,00 mg, 1,98 mmol, 1,00 eq) en DCM (9 ml) se añadió m-CPBA (1,01 g, 4,96 mmol, 85% de pureza, 2,50 eq) a 0 °C. La mezcla se agitó a 20 °C durante 3 h. La reacción se inactivó con NaS2O3 acuoso saturado (50 ml) y se extrajo con DCM (20 ml x 2). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con NaHCO³acuoso (40 ml). La capa orgánica se secó y se concentró. El bruto se purificó mediante TLC preparativa (DCM: MeOH = 10: 1) (Rf = 0,6) para proporcionar 53_8 (500,00 mg, 1,50 mmol, 75,5% de rendimiento) como un aceite amarillo.

LCMS: TR = 0,803 min, m / z 335,1 [M H]

Paso 8: A una solución de 53_8 (500,00 mg, 1,50 mmol, 1,00 eq) en dioxano (7,5 ml) se le añadió transciclohexano-1,4-diamina (685,14 mg, 6,00 mmol, 4,00 eq). La mezcla se agitó a 130 °C durante 2 h en el microondas. La mezcla se filtró y se concentró. El bruto se purificó mediante HPLC preparativa (base) y HPLC preparativa (HCl) para dar A-53 (250,00 mg, 615,9 pmol, 41% de rendimiento, 99,8% de pureza, HCl) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 2,57 min, m / z 369,2 [M H]

¹H RMN (DMSO, 400 MHz) 58,88-8,87 (m, 1 H), 8,38-8,25 (m, 5 H), 7,30-7,28 (m, 1H), 4,78-4,76 (m, 1H), 3,36-3,34 (m, 2H), 3,05 (s, 1H), 2,61 (s, 1H), 2,05 (m, 4H), 1,92-1,91 (m, 2H), 1,78 (m, 4H), 1,47-1,39 (m, 10H).

Preparación de (1R, 4R) -N1 - (4- (1-metil-5 - ((1-metilciclopropil) metil) -1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1,4-diamina (A56)

Paso 1: A una solución de ácido 1-metilciclopropano-1-carboxílico (4,00 g, 39,95 mmol, 1,00 eq) y CDI (7,13 g, 43,95 mmol, 1,10 eq) en DCM (40 mL) se le añadió N-metoximetanamina (4,68 g, 47,94 mmol, 1,20 eq, HCl) a 0°C en porciones. La mezcla se agitó a 20 °C durante 16 h. La mezcla se diluyó con agua (50 ml) y se extrajo con DCM (20 ml *3). Las capas orgánicas combinadas se secaron y concentraron para dar un producto bruto. El producto bruto se purificó mediante una columna de gel de sílice (PE: EA = 30: 1 ~ 10: 1) para dar 56_1 (3,30 g, 23,05 mmol, rendimiento del 57,7%) como un líquido incoloro.

¹H RMN (CDCla, 400 MHz) ó 3,73 (s, 3 H), 3,23 (s, 3 H), 1,37 (s, 3H), 1,05-1,03 (m, 2H), 0,58-0,55 (m, 2H).

Paso 2: A una solución de 1-metilpirazol (1,70 g, 20,71 mmol, 1,72 ml, 1,00 eq) en THF (35,00 ml) se le añadió n-BuLi (2,5 M, 9,94 ml, 1,20 eq) a -78 °C. Agitado durante 1 hora. Se le añadió el compuesto 56_1 (3,26 g, 22,78 mmol, 1,10 eq) en THF (35 ml) a -78 °C. La mezcla resultante se agitó a 20°C durante 1 hora. La mezcla se inactivó con NH⁴Cl saturado (20 ml) y se extrajo con EtOAc (20 ml x 2). La capa orgánica se concentró y se purificó mediante una columna de gel de sílice (PE: eA = 1: 0 ~ 20: 1) para dar 56_2 (2,50 g, 13,41 mmol, rendimiento del 64,8%, pureza del 88,1%) como un aceite amarillo.

LCMS: TR = 0,609 min, m / z 165,1 [M H]

Paso 3: La mezcla de reacción de 56_2 (2,00 g, 12,18 mmol, 1,00 eq) y KOH (2,73 g, 48,72 mmol, 4,00 eq) en NH2NH2. Se calentó H2O (2,57 g, 48,72 mmol, 2,49 ml, 95% de pureza, 4,00 eq) y diglicol (40 ml) a 110 °C durante 1,5 h, a continuación a 200 °C durante 1 hora más con Dean-Stark. La mezcla se diluyó con agua (50 ml) y se extrajo con MTBE (50 ml x 2). Las capas orgánicas combinadas se concentraron para dar 56_3 (1,10 g, bruto) como un aceite incoloro.

LCMS: TR = 0,639 min, m / z 151,1 [M H]

Paso 4: A una solución de 56_3 (1,10 g, 7,32 mmol, 1,00 eq) en DCM (11 ml) se le añadió NBS (1,30 g, 7,32 mmol, 1,00 eq) a 0 °C. La mezcla se agitó a 20 °C durante 1 hora. La mezcla se concentró. El bruto se purificó mediante columna de gel de sílice (PE: EA = 1: 0 ~ 50: 1) para proporcionar 56_4 (1,45 g, 5,65 mmol, 77,1% de rendimiento, 89,2% de pureza) como un aceite incoloro.

LCMS: TR = 0,835 min, m / z 229,0 [M H]

¹H RMN (CDCla, 400 MHz) ó 7,39 (s, 1 H), 3,85 (s, 3 H), 2,73 (s, 2H), 1,05 (s, 3H), 0,44-0,31 (m, 4H).

Paso 5: A una solución de 56_4 (1,45 g, 6,33 mmol, 1,00 eq) en THF (29 ml) se le añadió n-BuLi (2 M, 4,75 ml, 1,50 eq) a -78 °C. Después de 30 min, se le añadió 2-isopropoxi-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (2,36 g, 12,66 mmol, 2,59 ml, 2,00 eq) en THF (2,5 ml). La mezcla resultante se calentó a 20 °C y se agitó durante 0,5 h. La mezcla se inactivó con NH4CI saturado (50 ml) y se extrajo con EtOAc (100 ml). La capa orgánica se concentró y se purificó mediante una columna de gel de sílice (PE: EA = 20: 1 ~ 10: 1) para dar 56_5 (1,25 g, 4,11 mmol, rendimiento del 64,9%, pureza del 90,7%) como un aceite incoloro.

LCMS: TR = 0,928 min, m / z 277,1 [M H]

Paso 6: A una solución de 56_5 (500,00 mg, 1,81 mmol, 1,00 eq) en DME (10 ml) se añadió 4-cloro-2-metilsulfanilpirimidina (290,79 mg, 1,81 mmol, 210,72 pL, 1,00 eq), NA2CO3 (2 M, 1,99 ml, 2,20 eq) y 4-ditertbutilfosfanil-N, N-dimetil-anilina; dicloropaladio (64,09 mg, 90,50 pmol, 64,09 pL, 0,05 eq) bajo nitrógeno. La mezcla resultante se agitó a 85 °C durante 2 h bajo nitrógeno. La mezcla se diluyó con agua (50 ml) y se extrajo con EtOAc (50 ml). La capa orgánica se concentró y se purificó mediante una columna de gel de sílice (PE: EA = 5: 1) para dar 56_6 (350,00 mg, 1,14 mmol, 63% de rendimiento, 89% de pureza) como un aceite amarillo.

LCMS: TR = 0,829 min, m / z 275,1 [M H]

Paso 7: A una solución de 56_6 (350,00 mg, 1,28 mmol, 1,00 eq) en DCM (5,5 ml) se le añadió MCPBA (690,28 mg, 3,20 mmol, 80% de pureza, 2,50 eq) a 0 °C. La mezcla se agitó a 20 °C durante 2 h. La mezcla se inactivó con Na²S²O³acuoso (100 ml) y se extrajo con DCM (50 ml x 2). Las capas orgánicas combinadas se concentraron y purificaron mediante columna de gel de sílice (PE: EA = 1: 1) para dar 56_7 (200,00 mg, 617,72 pmol, 48,6% de rendimiento, 94,6% de pureza) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 0,653 min, m / z 307,1 [M H]

Paso 8: La mezcla de 56_7 (200,00 mg, 652,78 pmol, 1,00 eq) y trans-ciclohexano-1,4-diamina (298,17 mg, 2,61 mmol, 4,00 eq) en dioxano (3 ml) se agitó a 130 ° C durante 2 horas en el microondas. La mezcla se filtró y se concentró. El bruto se purificó mediante HPLC preparativa (base) para dar A-56 (50,00 mg, 144,85 pmol, 22,2% de rendimiento, 98,6% de pureza) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 1,999 min, m / z 341,2 [M H]

¹H RMN (CDCla, 400 MHz) ó 8,18-8,17 (d, J = 5,2 Hz, 1 H), 7,82 (s, 1 H), 6,69-6,67 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,87-4,85 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 3,88 (s, 3H), 3,84 (s, 1H), 3,38 (s, 2H), 2,75-2,73 (m, 1H), 2,17-2,16 (m, 2H), 1,94 -1,92 (m, 2H), 1,31-1,27 (m, 4H), 1,08 (s, 3 H), 0,31-0,25 (m, 4H).

Preparación de [1R, 4R) -N1- [4- (1-metil-5-neopentil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1,4-diamina (A57)

El compuesto A-57 se sintetizó de una manera similar a la descrita para la síntesis del compuesto A-56.

LCMS: TR = 1,558 min, m / z 343,2 [M H]

1H RMN (MeOD, 400 MHz) 58,20-8,13 (m, 2 H), 7,29-7,27 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,12-4,09 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 3,34 (s, 1H), 3,21 (s, 1H), 2,20 (m, 4H), 1,63 (m, 4H), 0,98 (s, 9 H).

Preparación de (4- (2 - (((1R, 4R) -4-aminociclohexil) amino) pirimidin-4-il) -1-metil-1H-pirazol-5-il) (ciclopropil)

Paso 1 al Paso 6 : El intermedio 58_6 se sintetizó a partir del compuesto 51_3 de una manera similar a la descrita para la síntesis de A-56.

LCMS: TR = 0,676 min, m / z 457,4 [M H]

Paso 7: A una solución de 58_6 (300,00 mg, 656,89 pmol, 1,00 eq ) en THF (300 pL) se añadió TBAF.3 H2O (414,51 mg, 1,31 mmol, 2,00 eq ) a 20 °C. La mezcla se agitó durante 30 min. La mezcla se filtró y se concentró.

El producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa (base) para proporcionar A-58 (27,00 mg, 76,89 pmol, 11,7% de rendimiento, 97,5% de pureza) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 2,29 min, m / z 343,2 [M H]

¹H RMN (CDCla, 400 MHz) 58,23-8,22 (d, J = 5,2 Hz, 1 H), 7,86 (s, 1 H), 6,81-6,80 (d, J = 5,2 Hz, 1 H), 5,09 (s, 1H), 4.32-4.30 (m, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.81-3.79 (m, 1H), 2.93-2.88 (m, 1H), 2.20-2.06 (m, 4H), 1.52-1.31 (m, 5H), 0,59-0,28 (m, 4H).

Preparación de (1R, 4R) -N1- (5-cloro-4- (5- (ciclopropilmetil) -1-isopropil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1,4-diamina (A59)

El compuesto A-59 se sintetizó de una manera similar a la descrita para la síntesis del compuesto A-51.

LCMS: TR = 2,478 min, m / z 389,2 [M H]

1H RMN (MeOD, 400 MHz) ó 8,42-8,36 (m, 2 H), 4,82-4,75 (m, 1H), 4,00 (s, 1H), 3,21-3,20 (s, 3H), 2,20-2,15 (m, 4H), 1,60-1,56 (m, 4H), 1,51 (s, 6H), 1,05 (s, 1H), 0,55-0,53 (m, 2H), 0,28 (m, 2H).

Preparación de (1R, 4R) -N1- (4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) -5- (trifluorometil) pirimidin-2-il) ciclohexano-1,4-diamina (A60)

Paso 1: A una solución de 60_1 (2,00 g, 9,22 mmol, 1,00 eq) en THF (40 mL) se le añadió ZnCl2-Et2O (1 M, 11,06 mL, 1,20 eq) a 0 °C bajo protección de nitrógeno. La mezcla se agitó durante 2 horas a 0 °C. Se añadió metilsulfanilsodio (646,23 mg, 9,22 mmol, 587,48 pl, 1,00 eq). La mezcla resultante se agitó a 20 °C durante 16 horas. La TLC (PE puro) mostró el reactante 1 (Rf = 0,5) consumido y el producto (Rf = 0,3) formado. La mezcla se inactivó con HCl 1 M (20 ml) y se concentró. La capa acuosa se extrajo con DCM (20 ml *3). La capa orgánica combinada se concentró y se purificó mediante una columna de gel de sílice (PE: EA = 1: 0 ~ 50: 1) para dar 60_2 (1,00 g, 1,97 mmol, 21,4% de rendimiento, 45,1% de pureza) como un aceite incoloro.

LCMS: TR = 0,794 min, m / z 228,9 [M H]

1H RMN (CDCla, 400 MHz) ó 8,67 (s, 1H), 2,62 (s, 3H).

Paso 2: A una solución de 51_7 (574.11 mg, 2.19 mmol, 1.00 eq) en THF (10 mL) se agregaron 60_2 (500.00 mg, 2.19 mmol, 1.00 eq), K3PO4 (1 M, 4.38 mL, 2.00 eq) y Ad2nBuP.Bifenilo (50,00 mg) bajo nitrógeno. La mezcla resultante se agitó a 85 °C durante 2 horas bajo nitrógeno. La TLC (PE: EA = 1: 1) mostró el reactante (Rf = 0,6) consumido y el producto (R = 0,5) formado. La mezcla se concentró y se diluyó con H2O (50 ml). La capa acuosa se extrajo con EA (20 ml x 2). La capa orgánica se concentró. El residuo se purificó mediante columna de gel de sílice (PE: EA = 20: 1 ~ 5: 1) para dar 60_3 (300,00 mg, 611,96 umol, 27,9% de rendimiento, 66,9% de pureza) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 0,927 min, m / z 329,0 [M H]

¹H RMN (CDCl³, 400 MHz) ó 8,75 (s, 1H), 7,75 (s, 1H), 3,94 (s, 3H), 2,95 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 2,57 (s, 3H), 0,98 -0,94 (m, 1H), 0,48-0,44 (m, 2H), 0,17-0,13 (m, 2H).

Paso 3: A una solución de 60_3 (400,00 mg, 1,22 mmol, 1,00 eq) en DCM (7 ml) se añadió m-CPBA (657,92 mg, 3,05 mmol, 80% de pureza, 2,50 eq) a 0 °C. La mezcla se agitó a 20 °C durante 1 hora. La TLC (DCM: MeOH = 20: 1) mostró el reactante (Rf = 0,6) consumido y el producto (Rf = 0,5) formado. La mezcla se inactivó con Na²S²O³acuoso (100 ml) y se extrajo con DCM (50 ml x 2). La capa orgánica se concentró y se purificó mediante una columna de gel de sílice (p E: EA = 1: 1) para dar 60_4 (300,00 mg, 738,23 umol, 60,5% de rendimiento, 88,7% de pureza) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 0,72 min, m / z 361,0 [M H]

Paso 4: La mezcla de 60_4 (200,00 mg, 555,02 pmol, 1,00 eq) y trans-ciclohexano-1, 4-diamina (253,51 mg, 2,22 mmol, 4,00 eq) en dioxano (3 ml) se agitó a 130 °C durante 2 horas en microondas. La mezcla se filtró y el filtrado se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condición de HCl) para dar A-60 (80,00 mg, 185,66 pmol, rendimiento del 33,5%, pureza del 100%, HCl) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 2,417 min, m / z 395,2 [M H]

¹H RMN (MeOH, 400 MHz) ó 8,66 (s, 1H), 7,90 (s, 1H), 4,15 (s, 1H), 3,97 (s, 3H), 3,20 (s, 1H), 3,10 (s, 2H), 2,18 (s, 4H), 1,62 (s, 4H), 1,05 (s, 1H), 0,53 (s, 2H), 0,25 (s, 2H).

^{64_1 64_2 64_3} amina - 64 ^A-64

Paso 1: A una solución de 64_1 (2,00 g, 9,29 mmol, 1,00 eq) en DCM (20 mL) se le añadió TEA (1,88 g, 18,58 mmol, 2,58 mL, 2,00 eq) y cloruro de metanosulfonilo (1,06 g, 9,29 mmol, 719,03 pL, 1,00 eq) a 0 °C. La mezcla se agitó a 20 °C durante 2 horas. La mezcla se diluyó con H2O (30 ml) y se extrajo con DCM (20 ml x 2). Las capas orgánicas combinadas se secaron y se concentraron para dar 64_2 (2,50 g, 8,52 mmol, rendimiento del 91,7%) en forma de un sólido blanco.

¹H RMN (CDCla, 400 MHz) ó 4,88 (s, 1 H), 4,48 (s, 1 H), 3,52 (s, 1 H), 3,01 (s, 3H), 2,07-2,03 (m, 2H), 1,83 -1,82 (m, 2H), 1,73-1,70 (m, 2H), 1,61-1,55 (m, 7H), 1,448 (s, 9H).

Paso 2: A una solución de 1H-pirazol (195,25 mg, 2,87 mmol, 1,20 eq) en MeCN (7,00 mL) se le añadió Cs2CO3 (1,56 g, 4,78 mmol, 2,00 eq) y 64_2 (700,00 mg, 2,39 mmol, 1,00 eq.). La mezcla se agitó a 100 °C durante 2 horas. La mezcla se diluyó con H2O (20 ml) y se extrajo con EtOAc (10 ml *3). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (20 ml) y se concentraron. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condición básica) para dar 64_3 (200,00 mg, 732,25 pmol, 30,6% de rendimiento, 97,1% de pureza) como un sólido amarillo.

EM: m / z RT = 0,888 min, 266,0 [M H]

Paso 3: A una solución de 64_3 (180,00 mg, 678,35 pmol, 1,00 eq) en DCM (2 ml) se le añadió TFA (400,00 pL) a 0 °C. La mezcla se agitó a 20 °C durante 1 hora. La mezcla se diluyó con H2O (30 ml) y se extrajo con DCM (10 ml x 2). La capa acuosa se liofilizó para dar amina-64 (180,00 mg, 633,91 pmol, 93,5% de rendimiento, 98,3% de pureza, TFA) como un aceite incoloro.

LCMS: TR = 0,272 min, m / z 166,2 [M H]

Paso 4 : A una solución de 51_9 (100,00 mg, 353,16 pmol, 1,00 eq) en DMSO (1,5 mL) se le añadió amina-64 (95,48 mg, 529,74 pmol, 1,50 eq) y DIEA (182,57 mg, 1,41 mmol, 246,71 pL, 4,00 eq). La mezcla resultante se agitó a 160°C durante 3 horas, se filtró y el líquido madre se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condición básica) y a continuación mediante HPLC preparativa (condición de HCl) para dar A-64 (10,00 mg, 23,42 pmol, 6,6% de rendimiento, 100% de pureza) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 1,981 m / z 412,2 [M H]

1H RMN (MeOD, 400 MHz) ó 8,41-8,37 (m, 2 H), 7,83 (s, 1 H), 7,67 (s, 1 H), 6,39 (s, 1H), 4,36 (s, 1H), 4,12 -4,08 (m, 1H), 3,95 (s, 3H), 3,25-3,23 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 2,26-2,23 (m, 4H), 2,05-2,02 (m, 2H), 1,99-1,96 (m, 2H), 1,73-1,67 (m, 2H), 1,09 (s, 1H), 0,55-0,50 (m, 2H), 0,27-0,26 (m, 2H).

Preparación de N ((1R.4R) -4- (1H-imidazol-1-il) ciclohexil) -5-cloro-4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-amina (A-65)

El compuesto A-65 se sintetizó de una manera similar a la descrita para la síntesis del compuesto A-64 como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 1,461 min, m / z 412,2 [M H]

1H RMN (MeOD, 400 MHz) ó 9,10 (s, 1 H), 8,42 (s, 1 H), 7,81 (s, 1 H), 7,62 (s, 1 H), 4,55-4,49 (m, 1H), 4.13 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.25-3.24 (d, J = 6.4Hz, 2H), 2.36-2.28 (m, 4H), 2.08-1.98 (m, 2H), 1.80-1.74 (m, 2H), 1,09 (s, 1H), 0,53 0,51 (m, 2H), 0,27-0,26 (m, 2H).

Preparación de (1R, 4R) - N 1- (5-cloro-4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) -N4 -fenilciclohexano-1.4-diamina (A-68)

Paso 1: A una solución de ((1R, 4R) -4-aminociclohexil) carbamato de terc-butilo (500,00 mg, 2,33 mmol, 1,00 eq) y yodobenceno (713,01 mg, 3,49 mmol, 389,63 uL, 1,50 eq) en THF (15 ml) se añadieron t-BuOK (784,35 mg, 6,99 mmol, 3,00 eq) y RuPhos Indoline (100,00 mg). La mezcla resultante se agitó a 80 °C durante 12 horas bajo nitrógeno. La mezcla se filtró y el líquido madre se concentró. El residuo se purificó mediante columna de gel de sílice (PE: EA = 10: 1 ~ 4: 1) para dar 68_1 (300,00 mg, 869,39 pmol, 37,3% de rendimiento, 84,1% de pureza) como un sólido blanco.

LCMS: TR = 1,024 min, m / z 291,0 [M H]

Paso 2 y Paso 3: El compuesto A-68 se sintetizó de una manera similar a la descrita para la síntesis del compuesto A-64 como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 1,194 min, m / z 437,2 [M H]

1H RMN (MeOD, 400 MHz) 58,29 (s, 1 H), 8,03 (s, 1 H), 7,75-7,34 (m, 5 H), 3,86 (s, 3H), 3,05 (d, J = 6,4 Hz , 2H), 2,00-1,97 (m, 4H), 1,55 (s, 2H), 1,37-1,29 (m, 2H), 0,97 (s, 1H), 0,39 (s, 2H), 0,14 (s, 2H).

Preparación de (5R, 8R) -8 - ((5-cloro-4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-vy) amino) -1-azaespiro Í4.51 decan-2-ona (A-71)

A una solución de amina-71 (180,00 mg, 879,34 jmol, 1,00 eq, HCl) y 51_9 (248,99 mg, 879,34 jmol, 1,00 eq) en DMSO (2,7 mL) se le añadió DIEA (614,30 ^|jL, 3,52 mmol, 4,00 eq) y TBAF (1 M, 175,87 jl, 0,20 eq). La mezcla se agitó a 160 °C durante 3 horas. La mezcla se enfrió y se filtró. El sólido se lavó con MeOH (10 ml) a temperatura ambiente y a continuación con EtOAc (3 ml) a 50 °C para dar A-71 (40,00 mg, 90,39 jmol, 11,4% de rendimiento, 93,7% de pureza) como un sólido blanco.

LCMS: TR = 2,836 min, m / z 415,2 [M H]

1H RMN (DMSO, 400 MHz) 58,26 (s, 1 H), 8,00 (s, 1 H), 7,72 (s, 1 H), 7,20 (s, 1 H), 3,85 (s, 3H), 3,70- 3,68 (m, 1H), 3,06 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 2,19-2,15 (m, 2H), 1,86-1,80 (m, 5H), 1,64-1,60 (m, 3H), 1,49-1,41 (m, 5H), 0,97 (s, 1H), 0,40 (s, 2H), 0,13 (s, 2H).

Preparación de (1R, 4R) -N 1-bencil-N4 - (5-cloro-4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1,4-diamina (A-74)

A una solución de A-51 (200,00 mg, 554,20 jmol, 1,00 eq) y benzaldehído (58,81 mg, 554,20 umol, 56,01 ^jL, 1,00 eq) se le añadió AcOH (33,28 mg, 554,20 jmol, 31,70 jL, 1,00 eq) y NaBH3CN (69,65 mg, 1,11 mmol, 2,00 eq). La mezcla se agitó a 15 °C durante 16 horas. La mezcla se inactivó con NaHCO3 acuoso (1 ml) y se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (columna: Phenomenex Gemini 150 * 25 mm * 10 um; fase móvil:

[agua (hidróxido de amoniaco al 0,05% v / v) -A^cN]; B%: 55% -85%, 12 min) para dar A-74 (100,00 mg, 217,80 jmol, 39,3% de rendimiento, 98,2% de pureza) como un sólido rosa.

LCMS: TR = 2,74 min, m / z 451,2 [M H]

1H RMN (CDCla, 400 MHz) 58,20-8,13 (m, 2 H), 7,34 - 7,33 (m, 5 H), 4,87 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 3,91 (s, 3H), 3,84 (s, 3H), 3.07-3.06 (m, 2H), 2.58-2.52 (m, 1H), 2.16-2.02 (m, 4H), 1.32-1.22 (m, 4H), 1.01-0.99 (m, 1H), 0,49-0,45 (m, 2H), 0,18-0,16 (m, 2H).

Preparación de (1R, 4R) -N1- ((1H-pirazol-4-il ) metil) -N 4 - (5-cloro-4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1,4-diamina (A-75)

A una solución de A-51 (200,00 mg, 554,20 pmol, 1,00 eq) y 1 H-pirazol-4-carbaldehído (53,25 mg, 554,20 pmol, 1,00 eq) se le añadió AcOH (34,86 pL, 609,62 umol, 1,10 eq) y NaBH3CN (69,65 mg, 1,11 mmol, 2,00 eq). La mezcla se agitó a 15 °C durante 16 horas. La mezcla se inactivó con NaHCO³acuoso (1 ml) y se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (columna: Phenomenex Gemini 150 * 25 mm * 10 um; fase móvil: [agua (hidróxido de amoniaco al 0,05% v / v) -ACN]; B%: 39% -39%, 12 min) para dar A-75 (4,00 mg, 9,04 pmol, rendimiento del 1,6%, pureza del 99,7%) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 2,95 min, m / z 441,2 [M H]

¹H RMN (CDCl³, 400 MHz) ó 8,21-8,12 (m, 2 H), 7,61 (s, 2 H), 4,90 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 3,91 (s, 3H), 3,85-3,80 (m, 3H), 3.06-3.05 (m, 2H), 2.70 (m, 1H), 2.19-2.07 (m, 4H), 1.42-1.23 (m, 4H), 1.09 (m, 1H), 0.50-0.45 (m, 2H), 0,18 0,14 (m, 2H).

Preparación de (1R, 4R) -N 1- (5-cloro-4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) -N4 -(piridin-3-ilmetil) ciclohexano-1,4-diamina (A-76)

A una solución de A-51 (200,00 mg, 554,20 pmol, 1,00 eq) y piridina-3-carbaldehído (59,36 mg, 554,20 pmol, 52,07 uL, 1,00 eq) se le añadió AcOH (33,28 mg, 554,20 pmol, 31,70 pL, 1,00 eq) y NaBH3CN (69,65 mg, 1,11 mmol, 2,00 eq). La mezcla se agitó a 15 °C durante 16 horas. La mezcla se inactivó con NaHCO³acuoso (1 ml) y se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (columna: Phenomenex Gemini 150 * 25 mm * 10 um; fase móvil:

[agua (hidróxido de amoniaco al 0,05% v / v) -^aCⁿ]; B%: 40% -58%, 12 min) para dar A-76 (100,00 mg, 219,09 pmol, 39,5% de rendimiento, 98,8% de pureza) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 2,381 min, m / z 452,2 [M H]

¹H RMN (CDCls, 400 MHz) 68,58-8,51 (m, 2 H), 7,69 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,27 (s, 1 H), 4,87 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.85-3.81 (m, 3H), 3.07-3.06 (m, 2H), 2.56-2.51 (m, 1H), 2.16-2.01 (m, 4H), 1.30-1.22 (m , 4H), 1,09 (m, 1H), 0,50-0,46 (m, 2H), 0,19-0,16 (m, 2H).

Preparación de (1R, 4R) -N1 - ((1H-pirazol-4-il) metil) -N 4 - (4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1,4-diamina (A80)

A una solución de A-14 (200,00 mg, 612,67 pmol, 1,00 eq) y 1H-pirazol-4-carbaldehído (58,87 mg, 612,67 pmol, 1,00 eq) se le añadió AcOH (36,79 mg, 612,67 pmol, 35,04 uL, 1,00 eq. ) y NaBH3CN (77,00 mg, 1,23 mmol, 2,00 eq). La mezcla se agitó a 15 °C durante 16 horas. La mezcla se inactivó con NaHCO3 acuoso (1 ml) y se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condición básica) para dar A-80 (20,00 mg, 48,90 pmol, 8% de rendimiento, 99,4% de pureza) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 2,418 min, m / z 407,2 [M H]

1H RMN (CDCla, 400 MHz) ó 8,17 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 7,83 (s, 1H), 7,58 (s, 1H), 6,71 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 4,88 (d , J = 7,6 Hz, 1H), 3,89 (s, 4H), 3,81 (s, 2H), 3,21 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 2,61 (s, 1H), 2,21-2,03 (m, 4H), 1,36-1,25 (m, 4H), 1,09 (s, 1H), 0,48-0,46 (m, 2H), 0,25-0,24 (m, 2H).

Preparación de (1R, 4R) -N1 - (4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) -N 4 - ((1-metil-1H-pirazol-4-il) metil) ciclohexano-1.4-diamina (A81)

A una solución de A-14 (200,00 mg, 612,67 pmol, 1,00 eq) y el compuesto 81_1 (67,46 mg, 612,67 pmol, 1,00 eq) se le añadió AcOH (36,79 mg, 612,67 pmol, 35,04 pL, 1,00 eq) y NaBH3CN (77,00 mg, 1,23 mmol, 2,00 eq). La mezcla se agitó a 15 °C durante 16 horas. La mezcla se inactivó con NaHCO3 acuoso (1 ml) y se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condición básica) para dar A-81 (40,00 mg, 87,81 pmol, rendimiento del 14,3%, pureza del 92%) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 2,469 min, m / z 421,2 [M H]

1H RMN (CDCla, 400 MHz) ó 8,17 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 7,82 (s, 1 H), 7,57 (s, 1 H), 7,51 (s, 1 H), 6,7 (d, J = 6.2Hz, 1H), 4.84 (d, J = 7.6Hz, 1H), 3.89-3.85 (m, 8H), 3.19 (d, J = 6.0Hz, 2H), 2.73 (s, 1H), 2.25-2.12 (m, 4 H), 1,54 (m, 1 H), 1,29-1,23 (m, 2H), 1,07 (s, 1H), 0,50-0,46 (m, 2H), 0,26-0,24 (m, 2H).

Preparación de (1R. 4R) -N1 - ((1H-pirazol-3-il) metil) -N 4 - (5-cloro-4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1.4-diamina (A-82)

A una solución de A-51 (200,00 mg, 554,20 pmol, 1,00 eq) y 1 H-pirazol-3-carbaldehído (53,25 mg, 554,20 pmol, 1,00 eq) se añadieron AcOH (31,7 pL, 554,20 pmol, 1,00 eq) y NaBH3CN (69,65 mg, 1,11 mmol, 2,00 eq). La mezcla se agitó a 15 °C durante 16 horas. La mezcla se inactivó con NaHCO³acuoso (1 ml) y se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condición básica) para dar A-82 (35,00 mg, 79,28 pmol, rendimiento del 14,3%, pureza del 99,9%) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 2,867 min, m / z 441,2 [M H]

¹H RMN (CDCla, 400 MHz) ó 8,20 (s, 1H), 8,13 (s, 1H), 7,53 (s, 1H), 6,22 (s, 1H), 4,91 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 3,93 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.81 (s, 1H), 3.49 (s, 1H), 3.07 (d, J = 5.6Hz, 2H), 2.56-2.53 (m, 1H), 2.16- 2,02 (m, 4H), 1,33-1,32 (m, 4H), 1,05 (s, 1H), 0,48-0,45 (m, 2H), 0,18-0,16 (m, 2H).

Preparación de (1R, 4R) -N1 - (1- (1H-pirazol-4-il) etil) -N 4 - (5-cloro-4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1.4-diamina (A83)

A una solución de A-51 (100,00 mg, 251,67 pmol, 1,00 eq, HCl), se añadió el compuesto 83_1 (27,71 mg, 251,67 pmol, 1,00 eq) TEA (503,34 pmol, 69,77 uL, 2,00 eq) y Ti (i- PrO) 4 (149 pL, 503,34 pmol, 2,00 eq). La mezcla se agitó a 80 °C durante 12 horas. A continuación se añadió NaBH3CN (39,54 mg, 629,18 pmol, 2,50 eq). La mezcla resultante se agitó a 15 °C durante 4 horas. La mezcla se inactivó con NaHCO³acuoso (50 ml) y se extrajo con DCM (50 ml x 2). La capa orgánica se concentró y se purificó mediante HPLC preparativa (condición básica) para dar A-83 (20,00 mg, 43,96 pmol, 17,5% de rendimiento) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 1,897 m / z 455,2 [M H]

¹H RMN (CDCla, 400 MHz) ó 8,19 (s, 1H), 8,12 (s, 1H), 7,52 (s, 2H), 4,90 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,05-4,00 (m, 1H) , 3.91 (s, 3H), 3.78-3.76 (m, 1H), 3.06 (d, J = 5.6Hz, 2H), 2.49-2.46 (m, 1H), 2.11-2.08 (m, 4H), 1.40-1.38 (m, 3H), 1,25 1,19 (m, 4H), 1,05 (s, 1H), 0,47-0,44 (m, 2H), 0,16-0,15 (m, 2H).

Preparación de N - ((1R, 4R) -4 - ((5-cloro-4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) amino) ciclohexil) -1H-pirazol-4-carboxamida (A87)

A una solución del compuesto 87_1 (46,59 mg, 415,65 pmol, 1,00 eq) en DCM (4 ml) se le añadió DIEA (181,5 pL, 1,04 mmol, 2,50 eq), EDCI (95,62 mg, 498,78 pmol, 1,20 eq) y HOBt (11,23 mg, 83,13 pmol, 0,20 eq) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 0,5 horas. Se añadió la solución de A-51 (150,00 mg, 415,65 pmol, 1,00 eq) en DCM (4,5 ml). La mezcla resultante se agitó a 20 °C durante 16 horas. La mezcla se diluyó con H2O (50 ml) y se extrajo con DCM (40 ml *3). La capa orgánica se concentró y se purificó mediante HPLC preparativa (condición de HCl) para dar A-87 (80,00 mg, 160,61 pmol, 38,6% de rendimiento, 98,6% de pureza, HCl) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 2,391 m / z 455,2 [M H]

1H RMN (MeOD, 400 MHz) ó 8,48 (s, 1H), 8,39 (s, 1H), 8,16 (s, 2H), 4,04 (s, 1H), 3,96 (s, 3H), 3,93-3,90 (m, 1H), 3.24 (d, J = 6.4Hz, 2H), 2.18-2.04 (m, 4H), 1.67-1.53 (m, 4H), 1.18 (s, 1H), 0.57-0.55 (m, 2H), 0.30 -0,29 (m, 2H).

Preparación de (1R, 4R) -N1 - (5-cloro-4- (5- (ciclopropilmetU) -1-metil-1H-pirazol-4-H) pirimidin-2-H) -N4- ((5-metil-1H-pirazol-4-il) metil) ciclohexano-1.4-diamina (A-91)

A una solución de A-51 (150,00 mg, 415,65 jmol, 1,00 eq ) y 5-metil-1H-pirazol-4-carbaldehído (54,92 mg, 498,78 |jmol, 1,20 eq ) en MeOH (1,5 ml) se le añadió AcOH (23,77 jL, 415,65 jmol, 1,00 eq) y NaBH3CN (78,36 mg, 1,25 mmol, 3,00 eq). La mezcla se agitó a 15 °C durante 16 horas. La mezcla se inactivó con NaHCO³acuoso (10 ml) y se extrajo con EA (20 ml x 2). Las capas orgánicas combinadas se concentraron y purificaron mediante HPLC preparativa (condición de HCl) para dar A-91 (20,00 mg, 36,22 jmol, rendimiento del 8,7%, pureza del 89%, HCl) como un sólido blanco.

LCMS: TR = 2,425 m / z 455,2 [M H]

¹H RMN (MeOD, 400 MHz) ó 8.44-8.41 (m, 2H), 8.23 (s, 1H), 4.26 (s, 2H), 4.13-4.06 (m, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.24 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 2,51 (s, 3H), 2,40-2,24 (m, 4H), 1,76-1,61 (m, 4H), 1,09 (s, 1H), 0,54-0,53 (m, 2H), 0,28-0,27 (m, 2H).

Preparación de (1R, 4R) -N1 - (5-cloro-4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) -N 4 - (2,2,2-trifluoroetil) ciclohexano-1,4-diamina (A94)

A una solución de A-51 (150,00 mg, 415,65 jmol, 1,00 eq) en THF (4,5 ml) se le añadió TEA (144,04 jL, 1,04 mmol, 2,50 eq) y trifluorometanosulfonato de 2,2,2-trifluoroetilo (115,77 mg, 498,78 jmol, 1,20 eq). La mezcla se agitó a 50 °C durante 16 horas. La mezcla se concentró y se purificó mediante HPLC preparativa (condición de HCl) para dar A-94 (80,00 mg, 163,38 jmol, 39,3% de rendimiento, 97,9% de pureza, HCl) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 2,137 min, m / z 443,2 [M H]

1H RMN (MeOD, 400 MHz) ó 8.45 (m, 2H), 4.15-4.09 (m, 2H), 4.09 (s, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.39-3.36 (m, 1H), 3.22 3,21 (m, 2H), 2,33-2,25 (m, 4H), 1,71-1,56 (m, 4H), 1,09 (s, 1H), 0,54-0,52 (m, 2H), 0,28-0,27 (m, 2H).

Preparación de la preparación de (1R, 4R) -N1 - ((1H-pirazol-4-il) metil) -N4- (5-cloro-4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4 -il) pirimidin-2-il) -N1- (2,2.2-trifluoroetil) ciclohexano-1,4-diamina (A-95)

A una solución de A-75 (150,00 mg, 340,16 pmol, 1,00 eq) en MeCN (4,5 ml) se le añadió Cs2CO3 (221,66 mg, 680,32 pmol, 2,00 eq) y trifluorometanosulfonato de 2,2,2-trifluoroetilo (118,43 mg, 510,24 pmol, 1,50 eq). La mezcla se agitó a 70 °C durante 16 horas. La mezcla se filtró; el filtrado se concentró y se purificó mediante HPLC preparativa (condición de HCl) para dar A-95 (20,00 mg, 35,7 pmol, 10,5% de rendimiento, 100% de pureza, HCl) como un sólido blanco.

LCMS: TR = 2,285 m / z 523,2 [M H]

1H RMN (MeOD, 400 MHz) ó 8,41-8,39 (m, 2H), 8,02 (s, 1H), 7,76 (s, 1H), 5,03-4,97 (m, 2H), 4,23 (s, 2H), 4,12- 4.04 (m, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.21 (d, J = 6.4Hz, 3H), 2.34-2.23 (m, 4H), 1.65-1.53 (m, 4H), 1.09 (s, 1H) , 0,54-0,52 (m, 2H), 0,27-0,26 (m, 2H).

Preparación de (1R, 4R) -N1, N1 -bis ((1H-pirazol-4-il) metil) -N4 - (5-cloro-4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) pirimidin-2-il) ciclohexano-1,4-diamina (A-96)

A una solución de A-75 (50,00 mg, 113,4 pmol, 1,00 eq) y compuesto 1H-pirazol-4-carbaldehído (32,69 mg, 340,17 pmol, 3,00 eq) se le añadió TEA (31,44 pL, 226,78 pmol, 2,00 eq) y Ti (Oi-Pr) 4 (67,1 pl, 226,78 pmol, 2,00 eq). La mezcla se agitó a 80 °C durante 12 horas. Se añadió NaBH3CN (21,38 mg, 340,17 pmol, 3,00 eq) y la mezcla resultante se agitó a 15°C durante 4 horas. La reacción se inactivó con NaHCO³acuoso (1 ml) y se filtró. El filtrado se purificó mediante HPLC preparativa (TFA y luego condición básica) para dar A-96 (7,00 mg, 13,10 umol, 11,6% de rendimiento, 97,5% de pureza) como un sólido blanco.

LCMS: TR = 2,382 m / z 521,3 [M H]

¹H RMN (MeOD, 400 MHz) ó 8,23 (m, 2H), 8,03 (s, 1H), 7,78 (s, 4H), 4,47-4,29 (m, 4H), 3,91-3,87 (m, 4H), 3,12 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 2,27-2,22 (m, 4H), 1,94-1,85 (m, 2H), 1,46-1,36 (m, 2H), 1,01-1,00 (m, 1H), 0,45-0,44 (m, 2H), 0,14 0,13 (m, 2H).

Preparación de (1R, 4R) -N1- (4- (5- (ciclopropilmetil) -1-metil-1H-pirazol-4-il) -5-fluoropirimidin-2-il) ciclohexano-1,4-diamina (A-86)

Paso 1: A una solución del compuesto 51_7 (800 mg, 3,05 mmol, 1,00 eq) en DME (16 mL) se le añadió el compuesto 2 (509,54 mg, 3,05 mmol, 1,00 eq), Na2CO3 (2 M, 4,6 mL, 3,00 eq.) y 4-ditert-butilfosfanil-N, N-dimetilanilina; dicloropaladio (108,04 mg, 152,50 pmol, 108 uL, 0,05 eq) bajo nitrógeno. La mezcla resultante se agitó a 85 °C durante 2 horas bajo nitrógeno. La mezcla se diluyó con H2O (50 ml) y se extrajo con EA (50 ml). La capa orgánica se concentró para dar el compuesto 86_1 (1,20 g, bruto) como un aceite amarillo.

LCMS: TR = 1,819 min, m / z 267,1 [M H]

Paso 2: La mezcla del compuesto 86_1 (1,10 g, 4,12 mmol, 1,00 eq) y el compuesto 4 (1,88 g, 16,48 mmol, 4,00 eq) en dioxano (16 ml) se agitó a 130 °C durante 8 horas en microondas. La mezcla se filtró y se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condición de HCl) para dar A-86 (1,30 g, bruto) como un sólido amarillo. A-86 (300 mg) se purificó de nuevo mediante HPLC preparativa (condición de HCl) para dar A-86 (20,00 mg, 52,51 pmol, 12,1% de rendimiento, 100% de pureza, HCl) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 2,321 min, m / z 345,2 [M H]

1H RMN (MeOD, 400 MHz) ó 8,37-8,36 (m, 1H), 8,23-8,22 (m, 1H), 4,07-4,03 (m, 1H), 3,96 (s, 3H), 3,21 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 2,24-2,18 (m, 4H), 1,68-1,57 (m, 2H), 1,19 (s, 1H), 0,57-0,55 (m, 2H), 0,38-0,34 (m, 2H).

Preparación de (1R, 4R) -N1 - ((1H-pirazo¡-4-i¡) meti¡) -N4 - (4- (5- (cic¡opropi¡meti¡) -1-meti¡-1H-pirazo¡-4-i¡) -5-f¡uoropirimidin-2-i¡) cic¡ohexano-1,4-diamina (A-85)

A una solución de A-86 (300,00 mg, 783,90 pmol, 1,00 eq) y 1 H-pirazol-4-carbaldehído (82,86 mg, 862,29 pmol, 1,10 eq) en MeOH (3 ml) se le añadió AcOH (49,31 pL, 862,29 pmol) , 1,10 eq) y NaBH3CN (98,52 mg, 1,57 mmol, 2,00 eq). La mezcla se agitó a 15 °C durante 16 horas. La mezcla se inactivó con NaHCO³acuoso (1 ml) y se concentró. El producto de residuo se purificó mediante HPLC preparativa (Condición básica) para dar A-85 (50,00 mg, 111,53 pmol, 14,2% de rendimiento, 94,7% de pureza) como un sólido amarillo.

LCMS: TR = 2,472 min, m / z 425,3 [M H]

1H RMN (CDCls, 400 MHz) ó 8,10-8,09 (m, 1 H), 8,02-8,01 (m, 1 H), 7,60 (s, 1H), 4,80 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 3,91 (s, 3H), 3,84 (m, 3H), 3,22-3,21 (m, 2H), 2,68 (s, 1H), 2,21-2,06 (m, 4H), 1,41-1,35 (m, 2H), 1,30-1,24 (m, 3H), 1,10-1,09 (m, 1H), 0,49-0,45 (m, 2H), 0,24-0,22 (m, 2H).

Procedimientos experimenta¡es bio¡ógicos

Cribado primario en células RKO para compuestos que tienen una actividad inhibidora típica de CKIa (estabilización de p-catenina y p53 y fosforilación de histona H2AX; ver Elyada et al, Nature 2011 17 de febrero; 470 (7334): 409-13; Pribluda et al, Cancer Cell 2013 12 de agosto; 24 (2): 242-56). Se incubaron células colorrectales RKO con 10 pM de cada uno de los compuestos durante 16 horas a 37°C. Las células se lavaron con PBS y los sedimentos celulares se incubaron con tampón de lisis de proteínas helado que contenía un cóctel inhibidor de proteasa (1/200; Calbiochem) e inhibidores de fosfatasa (20 mM de p-nitrofenilfosfato (PNPP), 20 mM de pglicerofosfato y 300 nM de ácido okadaico). El análisis de inmunotransferencia se realizó mediante técnicas estándar. Las transferencias se incubaron con anticuerpos que detectan p-catenina (1/2500; transducción BD), p53 (mezcla de hibridomas DO-1 y 1801; dilución de 1:20 de sobrenadantes de cada uno), CKIa (C-19; 1/1000; Santa Cruz Biotechnology) y fosfohistona H2AX (S139; 1 / 1.000; Millipore). Los anticuerpos secundarios fueron anticuerpos anti-ratón de cabra ligados a HRP, anti-conejo de cabra y anti-cabra de conejo (todos 1 / 10.000; Jackson). Las transferencias se desarrollaron utilizando ECL (GE Healthcare).

Ensayo de respuesta a la dosis de los compuestos más activos. Los compuestos activos se analizaron adicionalmente en un experimento de respuesta a la dosis (Figuras 1A y 1B). De manera similar al cribado primario, las células RKO se incubaron con concentraciones descendentes de cada uno de los compuestos activos durante 16 horas a 37 °C. El aislamiento del extracto celular y el análisis de Western Blot fueron similares al cribado primario.

Generación de un modelo de ratón de la crisis blástica de CML y estudios de inhibidores en este modelo.

Para generar el modelo de leucemia mieloide crónica (CML) inducible por BCR-ABL, se extrajeron células de médula ósea (BM) de ratones de 10 semanas de tipo salvaje y se enriquecieron para células que expresan cKit (EasySep # 18757) y se incubaron durante la noche a 37 °C en medio de crecimiento RPMI suplementado con FCS al 15%, L-Glutamina, Pen / Strep (Biological Industries, Israel) y factor de células madre (SCF), IL-3, IL-6 y TPO (Peprotech). A continuación, el cultivo se infectó con la construcción de retrovirus p210BCR-ABL-IRES-GFP que contenía medio sobrenadante durante 4 horas, luego se añadió medio de crecimiento y las células infectadas se incubaron a 37 °C durante 24 h más. A continuación, se inyectó el cultivo I.V. en ratones irradiados subletalmente (500 rad). Al observar un aumento rápido y constante de células que expresan GFP en la sangre periférica de ratones inoculados (por FACS) y un número creciente de leucocitos y células inmaduras (detectadas por frotis de sangre teñidos con Wright-Giemsa), los ratones se sacrificaron y sus células de médula ósea se transfirieron a nuevos huéspedes WT irradiados subletalmente; cada una de estas transferencias se denominó generación de enfermedad. En la cuarta transferencia, los huéspedes ya no fueron irradiados de forma subletal antes de la transferencia de la enfermedad. El desarrollo de una crisis blástica fue fácilmente detectable por un número muy anormal de células blásticas, más del 30% de glóbulos blancos (WBC) en la sangre periférica (PB) y breves intervalos de tiempo entre transferencias. Se realizaron estudios de inhibidores de CKI en enfermedades de última generación, en las que los blastos de PB eran fácilmente detectables, sin irradiación del huésped y con un tiempo de generación corto (hasta 12 días). Los ratones se controlaron diariamente para detectar caquexia, pérdida de peso, letargo y pelajes, y los ratones moribundos se sacrificaron a medida que entraron en estado moribundo.

Para evaluar el efecto de inhibición de CKIa en CML, se administró un inhibidor selectivo de CKIa (A14) por sonda oral una vez al día a una dosis de 10 mg / kg, comenzando 24 h después del trasplante de MO (BMT) (Figura 3A). El inhibidor se disolvió en metilcelulosa al 1% con Tween 80 al 0,1% y polietilenglicol al 0,2% (vehículo). Los ratones de control se trataron solo con el vehículo.

Efectos inhibidores ex vivo (Figuras 2A y 13A-E). Se cultivaron BM recién aisladas de ratones portadores de AML (13A-E) o crisis blástica de CML (2A) en R^pMI suplementado con FCS al 15%, L-glutamina, Pen / Strep, Hepes, piruvato de sodio y aminoácidos no esenciales (Biological Industries, Israel). Los inhibidores de CKI (A14, A51, A75 o A86) se disolvieron en DMSO y se añadieron al medio de cultivo de tejidos a las concentraciones indicadas; los cultivos de control se trataron solo con DMSO. Varias horas después del tratamiento (tal como se indica en cada experimento), las células se recolectaron y se contaron manualmente usando una cámara y un microscopio de luz invertida estándar. Las células muertas se excluyeron usando Trypan Blue (Sigma). La tinción con AnnexinV-PE (MBL), 7AAD (Tonbo) y PD-L1 (BioLegend) se evaluó mediante FACS de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Generación de un modelo de ratón de leucemia mieloide aguda (AML) (Figura 6) y tratamiento con el inhibidor A14 de CKIa (Figuras 7, 8 y 9) o A51 (Figuras 11 y 12). Para generar el modelo de leucemia mieloide aguda (AML) MLL-AF9, se extrajeron células de médula ósea (BM) de ratones de tipo salvaje de 10 semanas de edad y se enriquecieron para células que expresan cKit (EasySep # 18757) y se incubaron durante la noche en RPMI suplementado con L-Glutamina al 15% de FCS, Pen / Strep (Biological Industries, Israel) y factor de células madre (SCF), IL-3, IL-6 y TPO (Peprotech). El cultivo se infectó con la construcción de retrovirus MSCV-MLL-AF9-IRES-GFP que contenía medio sobrenadante durante 4 horas, a continuación se añadió medio de crecimiento y las células infectadas se incubaron a 37 °C durante 24 h adicionales. A continuación, se inyectó el cultivo I.V. en ratones irradiados subletalmente (500 rad). Tras un aumento constante detectable de células que expresan GFP en la sangre periférica de los ratones (comprobado mediante análisis FACS) y un aumento en el número de leucocitos y células inmaduras (detectado por frotis de sangre teñidos con Wright-Giemsa), los ratones se sacrificaron y se transfirió su BM (primer BMT) a huéspedes WT irradiados subletalmente. Tras la aparición de la enfermedad de AML, se sacrificaron los ratones y se trasplantaron 50.000 células BM (segundo BMT) en ratones hospedadores WT. Las células que expresan GFP se controlaron en la sangre periférica y tras detectar> 10% de GFP en PB (día 11 después de BMT), los ratones se trataron con inhibidor de A14 (Figura 7A). A14 se administró por sonda oral una vez al día a una dosis de 20 mg / kg durante 3 días seguido de 10 mg / kg / día durante 6 días más. El inhibidor se disolvió en metilcelulosa al 1% con Tween 80 al 0,1% y polietilenglicol al 0,2% (vehículo). Los ratones de control se trataron solo con el vehículo. Los ratones se controlaron diariamente para detectar caquexia, letargo y pelajes, y se sacrificaron los ratones moribundos. Para un experimento de dosis única (Figura 11A) se administró A51 por sonda oral a una dosis única de 20 mg / kg y los ratones se sacrificaron 16 horas después del tratamiento.

Análisis FACS. Todos los ensayos se realizaron en equipos de BD: calibre FACS, clasificador FACS ARIA o máquinas LSR II. Para la inmunotinción, las células se suspendieron en un tampón BSA / PBS al 1% con 5 pM de EDTA. A continuación, las células se analizaron usando el kit de detección de apootosis de PE de anexina V (eBioscience), 7-AAD (TONBO Biosciences) y anticuerpo de PE anti-CD274 de ratón (B7-H1, PD-L1) (clon 10F.9G2, BioLegend); Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron anticuerpos monoclonales específicos para CD16 y CD32 (Miltenyi Biotec) para el bloqueo de los receptores Fc antes de la tinción.

Recuento sanguíneo completo. La sangre venosa periférica se obtuvo de la vena facial del ratón usando técnicas estándar y se analizó usando el analizador de hematología automática BC-2800 (Mindray) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La Tabla 1 proporciona información cuantificada para los compuestos de la invención en la activación de p53 y la respuesta al daño del ADN (DDR) y la estabilización de la p-catenina como indicador de la activación de la vía Wnt. La activación de p53 se determinó de acuerdo con el grado de estabilización de la proteína en varios ensayos de transferencia Western (los ejemplos de transferencia Western se muestran en las Figuras 1A y 1B). Por ejemplo, A43 estabilizó p53 significativamente por encima del control sin tratamiento a 6 pM sin actividad a 2 pM (Fig. 1A, panel inferior derecho) y así recibió un valor promedio de para la activación de p53. Por el contrario, A35 comenzó a estabilizar p53 a 0,2 pM, con estabilización máxima a 1 pM (Fig. 1A, panel superior derecho) y, por tanto, recibió un valor medio de ++ para la activación de p53. A19-4, no estabilizó p53 ni indujo yH2AX (un indicador de respuesta al daño del ADN [DDR]), pero estabilizó la p-catenina a 2 pM, de manera similar a los mejores compuestos estabilizadores de p-catenina (Figura 1A, panel inferior izquierdo) y, por lo tanto, recibió un valor de ++ para la activación de p-catenina / Wnt.

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_________ _________ Inhibición de IRAK1 con compuestos de la invención. Las células RKO se incubaron durante 16 horas a 37 °C con las concentraciones indicadas de compuestos de la invención A51 (1 pM) y A14 (2 pM) (Figura 10). En los puntos de tiempo indicados, las RKO se trataron con TNFa (100 unidades / ml). Las células se recolectaron y analizaron mediante transferencia Western. Las transferencias se incubaron con los siguientes anticuerpos: Phospho-IRAK1 (Thr209), (A1074, AssayBiothechnology; 1 / 1,000), Phospho-IKKa / p (Ser176 / 180) (16A6, Cell Signaling; 1 / 1,000), IKKa (2682, Cell Signaling; 1 / 1,1000), IKK p (2370, Cell Signaling; 1 / 1,1000), Phospho-c-Jun (Ser 63) (9261, Cell Signaling; 1 / 1,1000), p53 (DO -1 & 1801 mezcla de hibridoma; dilución 1:20 de sobrenadantes de cada uno), CKIa (C-19; 1 / 1.000; Santa Cruz Biotechnology) y fosfohistonaH2AX (S139; 1 / 1.000; Millipore). Los anticuerpos secundarios fueron anticuerpos anti-ratón de cabra ligados a HRP, anti-conejo de cabra y anti-cabra de conejo (todos 1 / 10.000; Jackson). Las transferencias se desarrollaron utilizando ECL (GE Healthcare). La Figura 10 muestra la inhibición de la fosforilación de IRAK1 así como de Phospho-IKKa / p y Phospho-c-Jun, indicativo de la inhibición de la quinasa IRAK1. También se muestra la estabilización de p53 y la fosforilación de H2AX (yH2AX), un marcador de daño al ADN, indicativo de inhibición de la cinasa CKIa. Los niveles de proteína CKIa sirven como control de carga.

El escaneo de afinidad de Kinome para A51 (WXL5846, ver Tabla 2 a continuación), muestra que los objetivos clave de A51 incluyen los miembros de la familia CKI completa e IRAK1, con algunas quinasas de control. KINOMEscan ™ se basa en un ensayo de unión competitiva que mide cuantitativamente la capacidad de un compuesto para competir con un ligando 02429524 \ 45-01 inmovilizado y dirigido al sitio activo. El ensayo se realiza combinando tres componentes: quinasa etiquetada con ADN; ligando inmovilizado; y un compuesto de prueba. La capacidad del compuesto de prueba para competir con el ligando inmovilizado se mide mediante PCR cuantitativa de la etiqueta de ADN; % Ctrl = 0 (cero) indica una inhibición completa de la quinasa probada por una concentración de inhibidor 1 pM (Fabian, M.A. et al. A small molecule-kinase interaction map for clinical kinase inhibitors (Un mapa de interacción molécula pequeña-quinasa para inhibidores de quinasa clínicos). Nat. Biotechnol. 23, 329-336 (2005) y Karaman, M.W. et al. A quantitative analysis of kinase inhibitor selectivity (Un análisis cuantitativo de la selectividad del inhibidor de quinasa). Nat. Biotechnol. 26, 127-132 (2008)).

Tabla 2: Escaneo de afinidad de Kinome para A51 (WXL5846)

La Tabla 3 muestra las medidas de Kd para la interacción de A14 (WXL-4085) y A51 (WXL-5846) con IRAK1

Tabla 3: Kd de A14 (WXL-4085) y A51 (WXL-5846) con IRAK1

Conclusión. IRAK1 como un objetivo superior en una exploración de kinome muestra unión cero de IRAK1 a su objetivo en presencia de los inhibidores. Los compuestos de pirazol pirimidina de la invención A51 y A14 mostraron una excelente unión de Kd a IRAK1. Los compuestos también mostraron inhibición de la activación de IRAK1 e inhibición de la activación de la IKK objetivo de IRAK1 (quinasa Ikappa B) en células RKO (análisis de transferencia Western). Cabe señalar que el compuesto A51 mostró una inhibición completa (100%) de IRAKI fosfo- (activo) a una concentración de 1 pM en la línea celular RKO. Como comparación, Garrett W. Rhyasen et al. mostró que el inhibidor IRAK1-4 de Amgen utilizado en el tratamiento de MDS y cáncer de mama inhibía solo el 70% de IRAK1 / 4 en líneas celulares a 10 pM (Garrett W. Rhyasen et al, 2013, Cancer Cell 24, 90-104, ver especialmente Figura 2 en el mismo). Por lo tanto, se ha descubierto que los compuestos de la invención, como por ejemplo A51, son excelentes inhibidores de IRAK1, un importante regulador aguas arriba de la vía NF-kB que desempeña un papel importante en las neoplasias hematológicas (que incluyen, entre otras, mieloma múltiple, MDS, leucemia y linfoma), cáncer de cabeza y cuello y cáncer de mama).

Efecto del tratamiento de dosis única de un inhibidor de CKI en ratones AML y expresión de PD-L1. Se prepararon ratones AML inoculando células de médula ósea transducidas con oncogén MLL-AF9 a ratones C57 / BL6. La fusión MLL-AF9 representa una AML humana de mal pronóstico inducida por translocación cromosómica.

30 días después de la inoculación de leucemia, los ratones receptores tienen recuentos altos de glóbulos blancos (WBC) (x10 más que un ratón normal) y albergan> 95% de blastos de leucemia en la médula ósea y el 50% de los glóbulos blancos periféricos en estos ratones son blastos de AML. Estos ratones tienen esplenomegalia y sus huesos están pálidos y frágiles debido a la leucemia aguda (Fig. 12). El tratamiento oral con A51 (20 mg / kg) durante 16 horas da como resultado una reducción masiva del total de células leucémicas en la sangre (Fig. 11B), encogimiento del bazo leucémico (Fig. 11C y Fig.12A), 50% y> 90% de reducción de la proporción de blastos leucémicos (células GFP ) en la médula ósea y la sangre, respectivamente (Fig. 11D y Fig. 11E). Los huesos opacos volvieron a su color normal después de un tratamiento de dosis única (Fig. 12B).

Efectos del tratamiento in vitro de inhibidores de CKI en células de AML aisladas de la médula ósea de ratones leucémicos. Se muestra el porcentaje de células muertas (7AAD ) después de un tratamiento con inhibidor de 10 o 100 nM, a las 6 y 9 horas después del tratamiento (Fig. 13B y 13D). El tratamiento con DMSO dio como resultado <10% de células muertas a las 9 h. Además, se muestran los efectos de los inhibidores sobre la expresión leucémica de la proteína principal del punto de control inmunitario PD-L1 mediante análisis de citometría de flujo: reducción de la intensidad de fluorescencia media (MFI) a las 5 horas y disminución de la fracción de células leucémicas positivas PD-L1 después del tratamiento con inhibidores en comparación con las células tratadas con DMSO a las 6 y 9 horas (disminución expresada en% de control con DMSO) (Fig. 13A, 13C y 13E).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que tiene la fórmula (I), o un estereoisómero o sal del mismo:

en que:

R1 y R2 son cada uno independientemente H; o alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado, alcoxi C1 - C5 lineal o ramificado, acilo C1 - C5 lineal o ramificado o heteroarilo C3 - C7, cada uno opcionalmente sustituido por al menos uno de haluro, hidroxilo, un éster, un éter, arilo C1 - C15, heteroarilo C3 -C7 y una amida; o

R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno están conectados para formar un anillo saturado, insaturado o aromático de 4 - 7 miembros que opcionalmente incluye al menos uno de N, O, NH, C = N, C = O y SO2, y es opcionalmente sustituido por al menos uno de alquilo C1 - C5 lineal o ramificado, arilo C3 - C15, heteroarilo C3 - C7, hidroxilo, haluro y ciano;

R3 y R4 son cada uno independientemente H, o alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado opcionalmente sustituido por al menos uno de haluro, hidroxilo, alcoxi, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7, un éster y una amida; o

R1 o R2 junto con R3 y el átomo de carbono y nitrógeno, cada uno de ellos está conectado para formar un anillo saturado, insaturado o aromático de 4 - 7 miembros que opcionalmente incluye al menos uno de N, NH, O, C = N, C = O, y SO2, y es opcionalmente sustituido por al menos uno de alquilo C1 - C5 lineal o ramificado, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7, hidroxilo, carbonilo y haluro;

R5 y R⁸son cada uno independientemente H o haluro; o alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado, alquenilo C2 - C⁸lineal o ramificado, o alquinilo C2 - C⁸lineal o ramificado, cada uno opcionalmente sustituido por al menos un haluro;

R⁶es alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado, alquenilo C2 - C⁸lineal o ramificado, alquinilo C2 - C⁸lineal o ramificado, cicloalquilo C5 - C10 o heterociclilo saturado o insaturado de 4 - 6 miembros, cada uno opcionalmente sustituido por al menos uno de alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado, cicloalquilo C3 - C7, heterociclilo de 4 - 6 miembros, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7, haluro, hidroxilo y haloalquilo C1 - C5; y

R7 es alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado, alquenilo C2 - C⁸lineal o ramificado, o alquinilo C2 - C⁸lineal o ramificado, cada uno sustituido por al menos uno de cicloalquilo C3 - C7, heterociclilo de 4 - 6 miembros, arilo C5 - C15, Heteroarilo C3 - C7, haluro, hidroxilo y haloalquilo C1 - C5; en que "éster" representa -C (= O) OR10 o -OC (= O) R10 en que R10 es un alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado;

"éter" representa -R13OR14' o -OR15' en que R13 se selecciona de un alquileno C1 - C⁸lineal o ramificado y R14' y R15' se seleccionan cada uno independientemente de un alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado; y

"amida" representa -C (= O) NR11R12' o -NR11C (= O) R12' donde R11 y R12' son cada uno independientemente H o un alquilo C1 - C⁸lineal o ramificado.

2. El compuesto, o el estereoisómero o la sal del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en que Ri y R2 son cada uno independientemente H o alquilo C1 - C8 lineal o ramificado opcionalmente sustituido por al menos uno de entre haluro, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7, hidroxilo, un éster, un éter y una amida; o en que R1 y R2 son cada uno independientemente H o alcoxi C1 - C5 lineal o ramificado opcionalmente sustituido por al menos uno de haluro, hidroxilo, un éster y una amida; o en que R1 y R2 se seleccionan cada uno independientemente de H o acilo C1 - C5 opcionalmente sustituido por al menos uno de haluro, hidroxilo, un éster, un éter y una amida.

3. El compuesto, o el estereoisómero o la sal del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en que R4 es H; o

en que R3 y R4 son cada uno H; y / o

en que R5 es H, Cl o alquilo C1 - C4 lineal o ramificado; o

en que R5 es H; y / o

en que R8 es H, Cl o alquilo C1 - C4 lineal o ramificado; o

en que R8 es H.

4. El compuesto, o el estereoisómero o la sal del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en que uno de R5 y R8 es H; y / o

en que al menos uno de R1 y R2 es H; y / o

en que R6 es alquilo C1 - C8 lineal o ramificado, cicloalquilo C5 - C10 o heterociclilo saturado o insaturado de 4 - 6 miembros; y R7 es alquilo C1 - C8 lineal o ramificado sustituido por al menos uno de cicloalquilo C3 - C7, heterociclilo de 4 - 6 miembros, arilo C5 - C15, heteroarilo C3 - C7, haluro, hidroxilo y haloalquilo C1 - C5.

5. El compuesto, o el estereoisómero o la sal del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en que R6 es alquilo C1 - C8 lineal o ramificado, cicloalquilo C5 - C10 o heterociclilo saturado de 4 - 6 miembros; o

en que R6, es alquilo C1 - C8 lineal o ramificado, o heterociclilo de 4 - 6 miembros saturado, insaturado o aromático, cada uno opcionalmente sustituido por al menos uno de alquilo C1 - C8 lineal o ramificado, cicloalquilo C3 - C7, haluro, hidroxilo, y CF3; y / o

en que R7 es un alquilo C1 - C8 lineal o ramificado sustituido por al menos uno de cicloalquilo C3 -C7 e hidroxilo; o

en que R7 es alquilo C1 - C8 lineal o ramificado sustituido por al menos un cicloalquilo C3 - C7,

6. El compuesto, o el estereoisómero o la sal del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en que R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno están conectados para formar un anillo saturado de 4 - 7 miembros que incluye opcionalmente al menos uno de N, O , NH, C = N, C = O y SO2; y opcionalmente sustituido por al menos uno de alquilo C1 - C5 lineal o ramificado, hidroxilo, haluro y ciano, o

en que R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno están conectados para formar un anillo saturado de 4 - 7 miembros; o

en que R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno están conectados para formar un anillo saturado de 4 - 7 miembros que incluye al menos uno de N y O; o

en que R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno están conectados para formar un anillo aromático de 4 - 7 miembros que incluye opcionalmente al menos uno de N y O.

7. El compuesto, o el estereoisómero o la sal del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en que R3 y R4 son cada uno H; o

en que R1 o R2 junto con R3 y el átomo de carbono y nitrógeno están conectados para formar un anillo saturado de 4 - 7 miembros que opcionalmente incluye al menos uno de N, N^h, O, C = O y SO2, y es opcionalmente sustituido por al menos uno de alquilo C1 - C5 lineal o ramificado, hidroxilo, carbonilo y haluro; o

en que R1 o R2 junto con R3 y el átomo de carbono y nitrógeno están conectados para formar un anillo saturado de 4 - 7 miembros que incluye al menos uno de NH, O y C = O.

8. Un compuesto, o un estereoisómero o una sal del mismo seleccionado de:

Ċ

9. El compuesto, o el estereoisómero o la sal del mismo de acuerdo con la reivindicación 8, en que el compuesto es

y en que la sal es una sal farmacéuticamente aceptable.

10. El compuesto, o el estereoisómero o la sal del mismo de acuerdo con la reivindicación 8, en que el compuesto es

y en que la sal es una sal farmacéuticamente aceptable.

11. El compuesto, o el estereoisómero o la sal del mismo de acuerdo con la reivindicación 8, en que el compuesto es

y en que la sal es una sal farmacéuticamente aceptable.

12. Una composición que comprende el compuesto, o el estereoisómero o la sal del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Un compuesto, o un estereoisómero o una sal del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para uso en terapia, o;

para su uso en la inducción de una respuesta antitumoral; preferiblemente en que dicha respuesta antitumoral comprende una respuesta de inmunoterapia contra el cáncer; o

para su uso en el tratamiento del cáncer que tiene WT p53, en que dicho WT p53 es un biomarcador de la eficacia de dicho compuesto; o

para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio y relacionado con el sistema inmunológico; o

para su uso en el tratamiento de una afección, síntoma o enfermedad asociada con una afección maligna.

14. El compuesto, o el estereoisómero o la sal del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en que dicha afección maligna es cáncer; preferiblemente en que dicho cáncer tiene WT p53; o en que dicha afección maligna se selecciona de neoplasias malignas hematológicas (mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia mieloide aguda (AML), melanoma, cáncer de mama ER negativo, linfoma difuso de células B grandes (LDCBG), leucemia mielógena crónica (CML) , leucemia linfocítica crónica (CLL), cáncer de cabeza y cuello.

15. El compuesto, o el estereoisómero o la sal del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en que dicho cáncer se selecciona entre mieloma múltiple, leucemia, melanoma maligno, cáncer de mama, cáncer de próstata y cáncer colorrectal.