ES2900641T3

ES2900641T3 - Proteína DKK2 modificada, ácido nucleico que codifica la misma, su método de preparación y su uso

Info

Publication number: ES2900641T3
Application number: ES16746839T
Authority: ES
Inventors: Il Ho Ha; Seok Ho Yoo; Hye Nan Kim; Yeung Chul Kim; Ju Ry Lim
Original assignee: Biocomplete Inc
Current assignee: Biocomplete Inc
Priority date: 2015-02-04
Filing date: 2016-02-03
Publication date: 2022-03-17
Anticipated expiration: 2036-02-03
Also published as: US20180016313A1; EP3253781A4; KR20160096038A; KR20160096023A; KR101826841B1; PT3253781T; KR101919593B1; JP2018503397A; WO2016126054A1; EP3253781B1; CN107223131B; JP6467070B2; EP3253781A1; US10259850B2; CN107223131A; WO2016126098A1

Abstract

Un polipéptido relacionado con Dickkopf (DKK)2 modificado que comprende uno o más sitios de glicosilación adicionales, en comparación con una secuencia de aminoácidos de un polipéptido DKK2 de tipo salvaje, en donde el sitio de glicosilación se introduce mediante la sustitución de asparagina (Asn, N) por aspartato (Asp, D) que es el aminoácido número 110 desde el extremo N-terminal en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteína DKK2 modificada, ácido nucleico que codifica la misma, su método de preparación y su uso

Campo técnico

La presente descripción se refiere a una proteína DKK2 modificada que se añade con un grupo glicosilo o tiene una afinidad de unión mejorada, un ácido nucleico que codifica la misma, su método de preparación y su uso.

Antecedentes de la técnica

La glicosilación es un proceso mediante el cual los azúcares se unen a las proteínas y se dividen en gran medida en N-glicosilación y O-glicosilación. La glicosilación es catalizada por la glicosiltransferasa y se han informado aproximadamente 200 tipos de glicosiltransferasas. El tipo y la estructura de los azúcares pueden influir en el plegamiento, la estabilidad, la solubilidad y la sensibilidad a la proteasa, la vida media sérica, la antigenicidad, el aumento de la actividad de una proteína, etc.

DKK2, una proteína represora de Wnt, pertenece a la familia Dickkopf y se ha informado que actúa como factor inhibidor o factor estimulante de las vías de señalización de Wnt (Wu W y otros, Curr. Biol., 10(24), págs. 1611-1614, 2000). DKK2 puede contener dos dominios ricos en cisteína (CRD) específicos e incluye varias longitudes de regiones de conexión. Particularmente, DKK2 conserva en gran medida una región de cisteína-2 entre los miembros de la familia Dickkopf que tiene 10 aminoácidos de cisteína (Krupnik VE y otros, Gene, 238(2), páginas 301-313, 1999). DKK2 es una proteína difícil de producir con baja eficiencia de expresión en células animales, por lo que el desarrollo de agentes terapéuticos mediante el uso de DKK2 ha sido retrasado.

En consecuencia, existe una demanda de DKK2 que mantenga una afinidad de unión o tenga una afinidad de unión mejorada por su sustrato y que también muestre un aumento en la eficiencia de expresión.

Descripción

Solución técnica

Un aspecto proporciona un polipéptido DKK2 modificado que incluye uno o más sitios de glicosilación adicionales, en comparación con una secuencia de aminoácidos de un polipéptido DKK2 de tipo salvaje, en donde el sitio de glicosilación se introduce mediante la sustitución de asparagina (Asn, N) por aspartato (Asp, D) que es el aminoácido 110 del extremo N-terminal en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

Otro aspecto proporciona un ácido nucleico que codifica el polipéptido DKK2 modificado.

Otro aspecto más proporciona un método para preparar el polipéptido DKK2 modificado.

Otro aspecto más proporciona una composición farmacéutica para promover la angiogénesis, la composición que incluye el polipéptido DKK2 modificado o el ácido nucleico que codifica el polipéptido DKK2 modificado, y un portador farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto más proporciona una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades relacionadas con la permeabilidad vascular, la composición incluye el polipéptido DKK2 modificado o el ácido nucleico que codifica el polipéptido DKK2 modificado, y un portador farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto más se refiere al polipéptido DKK2 modificado o al ácido nucleico que codifica el polipéptido DKK2 modificado para su uso en un método para promover la angiogénesis de un sujeto.

Otro aspecto más se refiere al polipéptido DKK2 modificado o al ácido nucleico que codifica el polipéptido DKK2 modificado para su uso en un método para prevenir o tratar una enfermedad relacionada con la permeabilidad vascular de un sujeto.

Efectos ventajosos

De acuerdo con un polipéptido DKK2 modificado de un aspecto, un ácido nucleico que codifica el mismo, su método de preparación y su uso, se puede preparar de manera eficiente una proteína DKK2 modificada que tiene grupos glicosilo adicionales o una afinidad de unión mejorada por su sustrato LRP6, de esta manera ser usado para promover la angiogénesis o para prevenir o tratar enfermedades relacionadas con la permeabilidad vascular.

Descripción de las figuras

Estos y/u otros aspectos resultarán evidentes y se apreciarán más fácilmente a partir de la siguiente descripción de las modalidades ilustrativas, tomadas junto con las figuras acompañantes, en los que:

Las Figuras 1Ay 1B son imágenes que muestran los resultados de inmunotransferencia de las proteínas DKK2 de tipo salvaje y proteínas DKK2 mutantes que contienen diversas etiquetas, respectivamente, la Figura 1C es una imagen que muestra los resultados de inmunotransferencia de las proteínas DKK2 N-Gly4 y DKK2 N-Gly5 que contienen la etiqueta Fc, y la Figura 1D es una imagen que muestra el resultado de la electroforesis de las proteínas purificadas;

Las Figuras 2A y 2B son gráficos que muestran la absorbancia a 490 nm de la proteína DKK2 mutante por cada 200 ng de mLRP6 y hLRP6, y las Figuras 2C y 2D son gráficos que muestran la absorbancia a 490 nm de la proteína DKK2 por cada 100 ng de mLRP6 y hLRP6;

Las Figuras 3A y 3B son gráficos que muestran la intensidad de fluorescencia (%) de las retinas de acuerdo con la administración de la proteína DKK2 mutante el día 14 y el día 21 después de la administración de un material de prueba; y

La Figura 4 es un gráfico que muestra la permeabilidad vascular con azul de Evans (%) de acuerdo con la administración de la proteína DKK2.

Modo de la invención

Un aspecto proporciona un polipéptido DKK2 modificado que incluye uno o más sitios de glicosilación adicionales, en comparación con una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de Dickkopf (DKK)2 de tipo salvaje, en donde el sitio de glicosilación se introduce mediante la sustitución de asparagina (Asn, N) por aspartato (Asp, D), que es el aminoácido 110 del extremo N-terminal en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

DKK2 se refiere a la proteína Dickkopf-2, y también se conoce como proteína 2 relacionada con Dickkopf, proteína 2 secretada rica en cisteína, proteína CRSP2, CRISPY2 o CRSP 2. DKK2 es una proteína que en humanos está codificada por el gen DKK2. Este gen codifica una proteína que es miembro de la familia Dickkopf. Se sabe que DKK2, una proteína secretada, contiene dos regiones ricas en cisteína y participa en el desarrollo embrionario a través de sus interacciones con una vía de señalización Wnt. Además, puede actuar como agonista o antagonista de la señalización de Wnt/beta-catenina, en dependencia del contexto celular y la presencia de un cofactor kremen 2. DKK2 puede unirse a la proteína 6 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP6).

El polipéptido DKK2 de tipo salvaje puede ser un polipéptido precursor de DKK2 de tipo salvaje. El polipéptido precursor de DKK2 de tipo salvaje puede ser un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de Genbank número de acceso n P_055236.1 en humano o una secuencia de aminoácidos de Genbank número de acceso NP_064661.2 en ratón. El polipéptido precursor de DKK2 de tipo salvaje puede incluir un péptido señal, y el péptido señal puede escindirse mediante modificación cotraduccional o modificación postraduccional. El polipéptido d KK2 de tipo salvaje puede ser DKK2 maduro. Un DKK2 maduro puede ser un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos obtenida mediante la eliminación de una secuencia de aminoácidos (péptido señal o péptido líder) en las posiciones 1 a 33 del extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. El polipéptido precursor de DKK2 de tipo salvaje puede estar codificado por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 4) de Genbank número de acceso NM_014421 en humanos y un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de Genbank número de acceso NM_020265 en ratón.

La glicosilación se refiere a una reacción de transferencia de grupos glicosilo a las proteínas. La glicosilación es catalizada por una glicosiltransferasa. La glicosilación puede ser N-glicosilación, O-glicosilación, glicosilación de fosfoserina, C-manosilación, glipilación o sus combinaciones. La N-glicosilación se refiere a la unión de moléculas de azúcar al grupo amida de la asparagina.

El sitio de glicosilación se refiere a un sitio al que se puede unir una molécula de azúcar o un grupo glicosilo. Por ejemplo, el sitio de glicosilación puede ser un residuo de asparagina en una secuencia consenso de Asn-Xaa-Ser/Thr, que es el sitio de N-glicosilación. Asn representa asparagina, Xaa representa un aminoácido que excluye a la prolina, Ser representa serina, Thr representa treonina y Ser/Thr representa serina o treonina. Asn-Xaa-Ser/Thr representa un polipéptido compuesto de asparagina-aminoácido (que excluye a la prolina)-serina o aminoácido del extremo N-terminal. Una molécula de azúcar se une a la asparagina de Asn-Xaa-Ser/Thr. El polipéptido precursor de DKK2 de tipo salvaje puede incluir un sitio de glicosilación en la posición 36 desde el extremo N-terminal.

El sitio de glicosilación del polipéptido DKK2 modificado puede introducirse mediante la sustitución de asparagina (Asn, N) por uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en 110D y opcionalmente 51, 31g , 96P, 44P, 2L, 45C, 57C, 62Q, 63G, 85P, 6K, 98T, 1011, 11G, 121H, 135P, 138K, 151L, 152R, 166F, 187K, 203G, 211D, 213T, y 214Y en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. El número representa la posición del aminoácido del extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, y el carácter alfabético representa el código de 1 letra del aminoácido. Por ejemplo, '51' representa a la isoleucina en la posición 5 del N-terminal de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

La modificación puede ser la sustitución de uno o más aminoácidos.

El polipéptido DKK2 modificado puede ser un polipéptido DKK2, en el que se introduce adicionalmente un grupo glicosilo mediante la introducción del sitio de glicosilación. Aunque el polipéptido DKK2 modificado puede variar en el enlace de azúcar, composición de azúcar, estructura de glicosilo o sus combinaciones, la glicosilación se produce en el mismo sitio de glicosilación de la secuencia de aminoácidos del polipéptido DKK2. Como resultado, se puede aumentar la eficiencia de la expresión intracelular. Por ejemplo, aunque el polipéptido DKK2 modificado puede variar en el enlace de azúcar (por ejemplo, N-glicosilación y O-glicosilación), composición de azúcar (por ejemplo, diferencias en el grado de sialilación) y estructura de glicoles de acuerdo con el tipo de célula huésped en el que se expresa el polipéptido DKK2 modificado, la glicosilación puede tener lugar en el mismo sitio de glicosilación del polipéptido DKK2.

El polipéptido DKK2 modificado es un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

Puede incluirse además una etiqueta en el extremo N-terminal o C-terminal del polipéptido DKK2 modificado. La etiqueta puede ser un polipéptido que se une al polipéptido DKK2 para facilitar la expresión, purificación, detección, etc. La etiqueta puede ser, por ejemplo, una región Fc (fragmento cristalizable), un péptido de polihistidina o sus combinaciones. La región Fc puede ser una región Fc humana, una región Fc de ratón, etc. La región Fc puede ser un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 48. La región Fc puede ser un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49. La etiqueta puede ser conocida para los expertos en la técnica.

El polipéptido DKK2 modificado puede incluir además un péptido señal en el extremo N-terminal. El péptido señal se refiere a un péptido (de aproximadamente 5 a 30 aminoácidos de longitud) presente en el extremo N de la mayoría de las proteínas recién sintetizadas que están destinadas a la vía secretora. El péptido señal puede ser una secuencia de aminoácidos en las posiciones 1 a 33 desde el extremo N de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

El polipéptido DKK2 modificado puede ser un polipéptido que tiene una adición de grupos glicosilo, un aumento en la afinidad de unión de LRP6 o sus combinaciones, en comparación con el polipéptido DKK2 de tipo salvaje. La adición de grupos glicosilo en el polipéptido DKK2 modificado puede ser un aumento en la cantidad de grupos glicosilo, en comparación con la del polipéptido DKK2 de tipo salvaje como un grupo de control. Debido a la adición de grupos glicosilo, la cantidad del polipéptido DKK2 modificado puede aumentarse en las células, en comparación con la cantidad del polipéptido DKK2 de tipo salvaje. La cantidad de un transcripto que codifica el polipéptido DKK2 modificado puede aumentarse en las células, en comparación con la de un transcripto que codifica el polipéptido DKK2 de tipo salvaje. El aumento en la cantidad de polipéptido o transcripto puede significar un aumento en la eficiencia de expresión intracelular del polipéptido. La afinidad de unión del polipéptido DKK2 modificado por LRP6 puede aumentar, en comparación con la del polipéptido DKK2 de tipo salvaje. A medida que la afinidad de unión es mayor, una constante de disociación (KD) puede ser menor. La constante de disociación del polipéptido DKK2 modificado para LRP6 puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 10 nM o aproximadamente 5,5 nM.

El polipéptido DKK2 modificado es el mismo como se describió anteriormente.

El ácido nucleico de la presente invención incluye la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 46. Además, las secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 43 a 45 y 47 se describen como no parte de la invención. El ácido nucleico puede incluir además una secuencia de nucleótidos que codifica la etiqueta en el extremo 5' o en el extremo 3' del ácido nucleico que codifica el polipéptido DKK2 modificado. El ácido nucleico puede incluir además una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señal en el extremo 5' del ácido nucleico que codifica el polipéptido DKK2 modificado. El ácido nucleico puede estar unido operativamente a un elemento regulador de la expresión génica tal como un promotor, un operador, un potenciador y/o un terminador de la transcripción.

Otro aspecto proporciona un método para preparar el polipéptido DKK2 modificado, que incluye el método el cultivo de células que se introducen con un vector que incluye el ácido nucleico que codifica el polipéptido DKK2 modificado en presencia de un medio de cultivo para obtener un producto de cultivo; y obtener el polipéptido DKK2 modificado a partir del producto de cultivo.

El polipéptido DKK2 modificado y el ácido nucleico que codifica el polipéptido DKK2 modificado son los mismos como se describió anteriormente.

La célula puede ser una célula eucariota. Por ejemplo, la célula puede ser una célula animal. La célula puede ser, por ejemplo, una célula embrionaria de riñón, una célula de ovario, una célula de mieloma, o una célula derivada de la retina. La célula embrionaria de riñón puede ser una célula 293 de riñón embrionario humano (HEK) o una célula de riñón de hámster bebé (BHK). La célula ovárica puede ser una célula de ovario de hámster chino (CHO). La célula de mieloma puede ser una célula NS0 o una célula SP2/0. La célula derivada de la retina puede ser una célula PerC6. De acuerdo con el tipo de célula, se pueden expresar polipéptidos DKK2 que varían en el enlace de azúcar (por ejemplo, N-glicosilación y O-glicosilación), la composición de azúcar (por ejemplo, diferencia en el grado de sialilación) y la estructura de glicosilo.

El método puede incluir además la introducción de un vector que incluye el ácido nucleico que codifica el polipéptido DKK2 modificado en las células.

El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido, un vector viral, un cósmido o un cromosoma artificial. El vector puede ser un vector de expresión que incluya una secuencia promotora. El vector puede ser un vector capaz de expresar un gen diana en células eucariotas.

La introducción se refiere a la introducción del ácido nucleico en las células. La introducción puede ser, por ejemplo, la introducción por transformación, transyección, transducción, conjugación o electroporación.

El método incluye cultivar las células introducidas en presencia de un medio de cultivo para obtener un producto de cultivo.

El medio de cultivo se refiere a un medio que contiene componentes que son necesarios para o funcionan para promover la supervivencia o proliferación de células. El medio de cultivo puede ser seleccionado por los expertos en la técnica de acuerdo con el tipo de células.

El cultivo se puede realizar mediante incubación mediante el uso de un método conocido por los expertos en la técnica. El cultivo se puede realizar, por ejemplo, en condiciones de una temperatura de aproximadamente 37 °C y 5 % de CO2.

El método incluye obtener el polipéptido DKK2 modificado a partir del producto de cultivo. El producto de cultivo puede ser un caldo de cultivo que excluye las células cultivadas o las células cultivadas.

La obtención del polipéptido DKK2 modificado puede incluir obtener y lisar las células y purificar o filtrar el polipéptido. Los expertos en la técnica pueden conocer el método de obtención del polipéptido.

La angiogénesis se refiere a un proceso mediante el cual se forman nuevos vasos sanguíneos. La angiogénesis incluye un proceso mediante el cual crecen nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes. La angiogénesis es un proceso normal e importante en la cicatrización de la herida y el tejido de granulación, así como también en el crecimiento y desarrollo. Además, la angiogénesis es una etapa fundamental en la transición de los tumores de una etapa latente a una etapa maligna.

La promoción se puede lograr in vitro o in vivo. La promoción puede inducir la formación o regeneración de nuevos vasos sanguíneos en un sujeto que padece una enfermedad vascular isquémica.

La composición farmacéutica puede ser una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades vasculares isquémicas. La enfermedad vascular isquémica puede ser, por ejemplo, quemadura, psoriasis, úlcera, isquemia, cardiopatía isquémica, enfermedad cerebrovascular isquémica, o disfunción eréctil.

La enfermedad relacionada con la permeabilidad vascular se refiere a una enfermedad que tiene un síntoma causado por el aumento de la fuga de fluidos corporales hacia los tejidos circundantes debido al aumento de la permeabilidad vascular. Las enfermedades relacionadas con la permeabilidad vascular pueden ser, por ejemplo, retinopatía diabética, edema macular diabético, edema macular después de la oclusión de la vena retiniana, degeneración macular (por ejemplo, degeneración macular neovascular (Wet) relacionada con la edad), neovascularización conoidea, glaucoma, retinitis pigmentosa, retinopatía de prematurez (ROP), glaucoma, distrofia corneal, retinosquisis, enfermedad de Stargardt, drusen autosómico dominante, distrofia macular de Best, edema macular cistoide, retinopatía isquémica, enfermedad degenerativa retiniana inducida por inflamación, retinosquisis juvenil ligada al cromosoma X, Malattia leventinese (ML) o distrofia de retina en panal de Doyne.

Como se usa en la presente, el término "prevención" significa todas las acciones mediante las cuales la aparición de una enfermedad se restringe o retarda mediante la administración de la composición farmacéutica. El término "tratamiento" significa todas las acciones mediante las cuales los síntomas han mejorado o se han modificado favorablemente mediante la administración de la composición farmacéutica.

La composición farmacéutica puede incluir un portador farmacéuticamente aceptable. El portador incluye un excipiente, un diluyente o una sustancia auxiliar. El portador puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, almidón, goma de acacia, alginato, gelatina, fosfato de calcio, silicato de calcio, celulosa, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, agua, una solución salina fisiológica, un tampón como PBS, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, talco, estearato de magnesio y aceite mineral. La composición puede incluir una carga, un antiaglutinante, un lubricante, un agente humectante, un sabor, un emulsionante, un conservante, etc.

La composición farmacéutica puede prepararse en cualquier formulación. La composición se puede formular en forma de dosificación oral (por ejemplo, polvo, tableta, cápsula, jarabe, píldora, gránulo) o en forma de dosificación parenteral (por ejemplo, formulación inyectable). Además, la composición puede prepararse en formas de dosificación sistémicas o formas de dosificación tópicas.

La composición farmacéutica puede incluir una cantidad efectiva del polipéptido DKK2 modificado o del ácido nucleico que codifica el polipéptido d KK2 modificado. La cantidad efectiva puede seleccionarse adecuadamente de acuerdo con una célula o un sujeto seleccionado por los expertos en la técnica. La cantidad efectiva puede determinarse en dependencia de la gravedad de la enfermedad, la edad del paciente, el peso corporal, las condiciones de salud, el género y la sensibilidad al fármaco, el tiempo de administración, la vía de administración, la tasa de excreción, el período de tratamiento y los fármacos mezclados con o coadministrados con la composición y otros factores bien conocidos en el campo médico. La cantidad efectiva puede ser de aproximadamente 0,5 |jg a aproximadamente 2 g, de aproximadamente 1 jg a aproximadamente 1 g, de aproximadamente 10 jg a aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 100 jg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 mg, según la composición farmacéutica.

Una dosis de administración de la composición farmacéutica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, o de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg por adulto una vez al día, varias veces al día, dos o tres veces por semana, una a cuatro veces al mes, una a doce veces al año.

Otro aspecto más proporciona un polipéptido DKK2 modificado o el ácido nucleico que codifica el polipéptido DKK2 modificado para su uso en un método para promover la angiogénesis de un sujeto.

Otro aspecto más proporciona el polipéptido DKK2 modificado o el ácido nucleico que codifica el polipéptido DKK2 modificado para su uso en un método de prevención o tratamiento de una enfermedad relacionada con la permeabilidad vascular de un sujeto.

El polipéptido DKK2 modificado, el ácido nucleico que codifica el polipéptido DKK2 modificado, la angiogénesis, la promoción, la enfermedad relacionada con la permeabilidad vascular, la prevención y el tratamiento son los mismos como se describió anteriormente.

El sujeto puede ser un mamífero, por ejemplo, un ser humano, una vaca, un caballo, un cerdo, un perro, una oveja, una cabra o un gato. El sujeto puede ser un sujeto que tenga una enfermedad isquémica o una alta posibilidad de tener una enfermedad isquémica. El sujeto puede ser un sujeto que tiene una enfermedad relacionada con la permeabilidad vascular o una alta posibilidad de tener una enfermedad relacionada con la permeabilidad vascular.

La administración puede realizarse directamente a un sujeto por cualquier medio, por ejemplo, administración oral, intravenosa, intramuscular, transdérmica, mucosa, intranasal, intratraqueal o subcutánea. La administración puede ser tópica o sistémica.

En lo sucesivo, la presente invención se describirá con más detalle en base a Ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos son sólo para fines ilustrativos y no se pretende que el alcance de la invención esté limitado por estos ejemplos. DKK2 N-Gly4 es un ejemplo de la presente invención.

Ejemplo 1. Preparación e identificación de la proteína DKK2 mutante N-glicosilada

1. Predicción del sitio de N-glicosilación de la proteína DKK2

Una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) de una proteína DKK2 de tipo salvaje tiene un sitio de N-glicosilación en la posición 3 del extremo N-terminal. Para inducir artificialmente la N-glicosilación en la proteína DKK2 de tipo salvaje, se predijo el sitio de N-glicosilación de la proteína DKK2 de tipo salvaje mediante el uso del servidor NetNGlyc1.0 (www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlvc/).

Se predijeron un total de 26 tipos del sitio de N-glicosilación de la proteína DKK2 a partir del servidor NetNGlyc1.0, y el resultado se muestra en la Tabla 1. En la Tabla 1, el aminoácido representa un aminoácido de la proteína DKK2 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 3) y asparagina (Asn, N) mutada de la misma, y el número representa la posición del aminoácido mutado del N-terminal de la proteína DKK2 de tipo salvaje.

[Tabla 1]

Entre los 26 tipos de sitios candidatos de N-glicosilación de la proteína DKK2, se seleccionaron 5 tipos de proteínas DKK2 mutantes que muestran un alto potencial de N-glicosilación en el servidor NetNGlyc1.0, y se examinó la eficiencia de producción de las proteínas.

Los potenciales de N-glicosilación de los 5 tipos seleccionados de proteínas DKK2 mutantes se dan en la siguiente Tabla 2.

[Tabla 2]

2. Verificación de la eficiencia de producción de la proteína DKK2 N-glicosilada seleccionada

Para expresar 5 tipos de proteínas DKK2 seleccionadas en el Ejemplo 1.1, cada una de ellas se insertó en un vector de expresión de alta eficiencia para examinar la eficiencia de producción de las proteínas mediante un sistema de expresión transitorio.

(1) Reacción en cadena de la polimerasa

Se usó como plantilla una forma nativa de DKK2 de tipo salvaje (número de acceso de Genbank NP_055236.1, SEQ ID NO: 3) (proporcionada por medpacto, Inc., Corea).

Las secuencias de nucleótidos de los cebadores diseñados para la N-glicosilación de DKK2 se dan en la Tabla 3.

[Tabla 3]

Para la reacción en cadena de la polimerasa, se preparó una mezcla de la siguiente composición

100 ng de plantilla

2,5 unidades de Pfu ADN polimerasa (SPX16-RS500, Solgent Co., Ltd.)

10 pmol de cebador directo

10 pmol de cebador inverso

1 |jl de dNTP 10 mM

5 ul de tampón Pfu polimerasa 10x

50 j l de volumen total

Una mezcla preparada se incubó a 95 °C durante 2 minutos, y luego se repitieron 30 ciclos, con 1 ciclo que consiste en a 95 °C durante 20 segundos, a 64 °C durante 40 segundos y a 72 °C durante 1 minuto, seguido de incubación a 72 °C durante 10 minutos. En consecuencia, se obtuvieron ácidos nucleicos mutantes DKK2 así amplificados.

(2) Clonación de productos de amplificación y examen de la expresión transitoria de proteínas en las células huésped

El ácido nucleico DKK2 mutante amplificado o el ácido nucleico DKK2 de tipo salvaje se incubaron en presencia de 10 unidades de enzima de restricción Sfil (número de cat. R033S, Enzynomics, Corea) y tampón de reacción 1x a 50 °C durante 6 horas. Se sometió a electroforesis un producto de reacción en un gel de agarosa y se purificó el ácido nucleico a insertar en un vector mediante el uso de un kit de purificación en gel (número de cat. 1014876, QIAGEN, EE. UU.). Se mezclaron un vector de expresión de mamífero N293F-FC (ATP-100, ANRT) y el ácido nucleico purificado en una relación en peso de 1:3, seguido de incubación en presencia de 10 unidades de ADN ligasa T4 (número de cat. M001S, Enzynomics, Corea) y tampón de reacción 1x a 22 °C durante 4 horas o más.

Un producto de reacción se transformó en E. coli y una secuencia de nucleótidos que codificaba para DKK2 N-Gly1, DKK2 N-Gly2, DKK2 N-Gly3, DKK2 N-Gly4 o DKK2 N-Gly5 (SEQ ID NO: 43 a 47, respectivamente) se examinó mediante análisis de secuenciación. Se seleccionaron los clones que incluyen el vector N293F-FC que se introdujo con el ácido nucleico DKK2 mutante.

Se obtuvo un vector N293F-FC-mDKK2 introducido con el ácido nucleico DKK2 mutante (mDKK2) a partir de los clones seleccionados. El ácido nucleico Fc era un ácido nucleico (SEQ ID NO: 48) que codifica un fragmento Fc de la inmunoglobulina humana G1.

Se sembró una suspensión celular de HEK293F de mamífero a una densidad de 5X105 células/ml en medio Free style (Cat. No. 1508027, Invitrogen, EE. UU.) y cultivados en condiciones de 37 °C y 5 % de CO². Las células se cultivaron hasta que la densidad de las células alcanzó aproximadamente 1X106 célula/ml (aproximadamente 24 horas).

25 jg de vector N293F-FC introducido con el ácido nucleico DKK2 mutante, 50 jg de polietilenimina (PEI) (Cat. No.

23966, Polysciences, EE. UU.) Y 600 j l de medio PMI (Cat. No. sh30027.01, Hiclone, EE.UU.) se mezclaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadió un producto de reacción a las células HEK293F cultivadas y se cultivaron en condiciones de 37 °C y 5 % de CO²durante aproximadamente 5 días. Posteriormente, para obtener una proteína soluble en agua secretada por las células, las células se eliminaron del producto de cultivo y solo se recogió un caldo de cultivo que excluye las células.

Se sometieron 200 j l de caldo de cultivo a SDS-PAGE al 10 %, seguido de inmunotransferencia. Dado que la proteína DKK2 mutante obtenida y la proteína DKK2 de tipo salvaje incluían ETIQUETA-FC, ETIQUETA-HIS o etiqueta-mFc en su N-terminal, anti-Fc-HRP (Cat. No. 31414, PIERCE, EE. UU.) diluido en 1:4000, se utilizó anti-HIS-HRP (Cat. No. A7058, SIGMA, EE. UU.) diluido a 1:2000, o anti-mFc (Cat. No. 31430, PIERCE, EE. UU.) diluido a 1:2000. Como reactivo de revelado de color, se utilizó un ECL KIT (Cat. No. 0034077 GE EE. UU.) para obtener imágenes.

La Figura 1A muestra el resultado de la inmunotransferencia de proteínas DKK2 de tipo salvaje que contienen varias etiquetas (tiempo de exposición: 1 minuto, M: marcador (KDa), 1: N-Fc-DKK2, 2: N-Fc(IgG4)-DKK2, 3: N-His-DKK2, 4: N-mFc-DKK2). Como se muestra en la Figura 1A, no se detectaron proteínas DKK2 de tipo salvaje a pesar de que se expusieron durante 1 minuto. Por lo tanto, se confirmó que las proteínas DKK2 de tipo salvaje apenas se expresaban.

La Figura 1B muestra el resultado de la inmunotransferencia de proteínas DKK2 mutantes que contienen varias etiquetas (tiempo de exposición: 1 minuto (izquierda) o 1 segundo (derecha), M: marcador (KDa), 1: N-mFc-DKK2-gly1, 2: N-mFc-DKK2-gly2, 3: N-mFc-DKK2-gly3, 4: N-Fc4-DKK2-gly1, 5: N-His-DKK2-gly1, 6: N-Fc-DKK2-gly1, 7: N-His-DKK2-gly2, 8: N-Fc4-DKK2-gly2, 9: N-Fc-DKK2-gly2, 10: N-Fc-DKK2-gly3, 11: N-His-DKK2-gly3, 12: N-Fc4-DKK2-gly3). Como se muestra en la Figura 1B, se detectó la proteína DKK2 mutante que contiene la etiqueta Fc, mientras que las proteínas DKK2 mutantes que contenían las etiquetas distintas de Fc apenas se detectaron. Por tanto, se confirmó que la proteína DKK2 mutante que contiene la etiqueta Fc mostraba una eficiencia de expresión mejorada. La proteína expresada se purificó mediante el uso de una columna abierta desechable y se midió su concentración.

Dado que la proteína que contiene la etiqueta Fc muestra una eficiencia de expresión mejorada, se obtuvieron etiquetas Fc que contenían las proteínas DKK2 N-Gly4 y DKK2 N-Gly5. Las proteínas obtenidas se sometieron a inmunotransferencia y el resultado se muestra en la Figura 1C (tiempo de exposición: 1 segundo (izquierda) o 30 segundos (derecha), M: marcador (KDa), 1: N-Fc-DKK2-gly4, 2: N-Fc-DKK2-gly5). Como se muestra en la Figura 1C, se confirmó que N-Fc-DKK2-N-Gly4 mostró una mayor eficiencia de expresión que N-Fc-DKK2-N-Gly5.

(3) Producción masiva y purificación de proteínas.

Como se describió en el Ejemplo 1(2), se seleccionaron las células transformadas con el vector que contiene la etiqueta Fc y el ácido nucleico DKK2 mutante. Las células seleccionadas se cultivaron en condiciones de 37 °C y 5 % de CO²durante aproximadamente 5 días. El caldo de cultivo que excluye las células se centrifugó a temperatura ambiente a una velocidad de 4800 rpm durante 20 minutos para obtener un sobrenadante. La filtración se realizó mediante el uso de un filtro de 0,22 pm (número de catálogo PR02890, Millipore, EE.UU.). Se preparó una columna de 5 ml empaquetada con perlas de proteína A (número de cat. 17-1279-03, GE healthcare, Suecia) y se aplicó un filtrado a las perlas a 4 °C durante la noche a una velocidad de 0,9 ml/min. Las perlas se lavaron con 100 ml o más de PBS (solución salina tamponada con fosfato) (número de catálogo 70011, Gibco, EE.UU.). A continuación, se aplicó glicina-HCl 0,1 M (número de cat. G7126, Sigma, EE.UU.) a las perlas para eluir 6 fracciones. Se añadió Tris 1 M (número de catálogo T-1503-5KG, Sigma, EE.UU.) (pH 9,0) para neutralizar las fracciones. Se cuantificaron las proteínas de las fracciones y se recogieron las fracciones que contenían las proteínas. Las fracciones se aplicaron a amicon ultra (Cat. No. UFC805024, Millipore, EE.UU.) y se centrifugaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se añadió IX PBS a un concentrado y se repitió la centrifugación tres veces para ser reemplazado por PBS como tampón de almacenamiento.

Se cuantificó la proteína purificada. La cantidad de N-Fc-DKK2-gly1 fue de 130 pg en 40 ml de caldo de cultivo, la cantidad de N-Fc-DKK2-gly2 fue de 860 pg en 40 ml de caldo de cultivo, la cantidad de N-Fc-DKK2-gly3 fue de 150 pg en 40 ml de caldo de cultivo, la cantidad de N-Fc-DKK2-gly4 fue de 462 pg en 40 ml de caldo de cultivo y la cantidad de N-Fc-DKK2-gly5 fue de 27 pg en 40 ml de caldo de cultivo. Entre las proteínas DKK2 mutantes introducidas con sitios de N-glicosilación, N-Fc-DKK2-Gly2 mostró la mayor eficiencia de expresión y N-Fc-DKK2-Gly4 mostró la siguiente mayor eficiencia de expresión. Por lo tanto, la proteína DKK2 mutante introducida con el sitio de N-glicosilación se expresó altamente, en comparación con la proteína DKK2 de tipo salvaje, y N-Fc-DKK2-Gly2 y N-Fc-DKK2-Gly4 mostraron una eficiencia de expresión aproximadamente 80 veces y aproximadamente 50 veces mayor que la del DKK2 de tipo salvaje, respectivamente.

Para examinar la pureza de la proteína purificada, se sometieron a electroforesis 3 pg de la proteína mediante SDS-PAGE al 10 %, y el resultado se muestra en la Figura 1D (M: marcador (KDa), 1: N-Fc-DKK2-gly1,2: N-Fc-DKK2-gly2, 3: N-Fc-DKK2-gly3, 4: N-Fc-DKK2-gly4, 5: N-Fc-DKK2-gly5). Como se muestra en la Figura 1D, se encontró que N-Fc-DKK2-gly2 y N-Fc-DKK2-gly4 eran similares entre sí en pureza.

3. Examen de la afinidad de unión de la proteína DKK2 mutante

Dado que se sabe que la proteína DKK2 se une a LRP6 de ratón (mLRP6) y LRP6 humana (hLRP6), se examinaron las afinidades de unión de las proteínas DKK2 de tipo salvaje y DKK2 mutante por LRP6.

En detalle, se aplicaron 200 ng de proteína hLRP6 (número de cat. 1505-LR-025, R&D, EE. UU.) o proteína mLRP6 (número de cat. 2960-LR-025, R&D, EE. UU.) a cada pocillo de la placa de ELISA (Cat. No. 439454, Nunc, Dinamarca), y se incubaron a 4 °C durante la noche para recubrir la placa con la proteína. Se aplicaron 200 pl de leche desnatada al 4 % (p/v) (número de cat. 232100, Difco, Francia)/1xPBS a los pocillos de la placa de ELISA y se incubaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora para el bloqueo. A continuación, se retiró la solución de bloqueo de la placa de ELISA.

Cada proteína DKK2 purificada y 100 pl de leche desnatada al 1 % (p/v)/1xPBS se mezclaron para preparar 100 nM de proteína DKK2 y 100 nM de proteína DKK2 se sometieron a una dilución en serie de 1/4. La proteína diluida se aplicó a la placa ELISA preparada y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas. Posteriormente, la placa se lavó cinco veces con 200 pl de PBST.

Se mezclaron 2 pl de anticuerpo anti-Fc-HRP humano (número de cat. 31413, Thermo, EE. UU.) con 4 ml de PBS que contiene leche desnatada al 1 % (p/v) y se añadieron 200 pl de esta mezcla a cada pocillo de placa de ELISA y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se eliminó el anticuerpo secundario de la placa de ELISA y se lavó la placa con 200 pl de PBS cinco veces. 10 pl de una solución de H²O²(Cat. No. H1009-100ML, Sigma, EE. UU.), 10 ml de tampón PC (5,1 g de ácido cítrico monohidrato, 7,3 g de fosfato de sodio/l (pH 5,0)) y una tableta de OPD (Cat. No P8787-100TAB, Sigma, EE. UU.) se mezclaron para preparar una mezcla y se añadió un volumen total de 100 pl de la mezcla a cada pocillo. La incubación se realizó a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos, seguida del desarrollo del color. Posteriormente, se añadieron 50 pl de un tampón de parada a cada pocilio para terminar el desarrollo del color. La absorbancia a 490 nm se midió mediante el uso de un lector de ELISA y un valor (M) de constante de disociación Kd se calculó a partir de la absorbancia medida.

La Figura 2A muestra la absorbancia a 490 nm de la proteína DKK2 mutante para 200 ng de mLRP6, y la Figura 2B muestra la absorbancia a 490 nm de la proteína DKK2 mutante para 200 ng de hLRP6 (■: N-Fc-DKK2-Gly1, ▲: N-Fc-DKK2-Gly2, ▼: N-Fc-DKK2-Gly3, ♦ : N-Fc-DKK2-Gly4, •: N-Fc-DKK2-Gly5). Como se muestra en las Figuras 2A y 2B, N-Fc-DKK2-Gly4 mostró la afinidad de unión más mejorada para mLRP6 y hLRP6. Se confirmó que N-Fc-DKK2-Gly2 mostró la mayor eficiencia de expresión, pero su afinidad de unión por mLRP6 y hLRP6 no fue alta. En consecuencia, se confirmó que N-Fc-DKK2-Gly4 era una proteína DKK2 mutante que mostraba una eficiencia de expresión mejorada y una alta afinidad de unión por mLRP6 y hLRP6.

Para comparar la afinidad de unión por mLRP6 y hLRP6 entre N-Fc-DKK2-Gly4 y DKK2 de tipo salvaje (Cat. No. 6628-DK-010, R&D, EE. UU.), se realizó un ELISA de la misma manera que antes, excepto que se usaron 100 ng de LRP6.

La Figura 2C muestra la absorbancia a 490 nm de la proteína DKK2 para 100 ng de mLRP6 y la Figura 2D muestra la absorbancia a 490 nm de la proteína DKK2 para 100 ng de hLRP6 (■: N-Fc-DKK2-Gly4, ▲: Dk K2 de tipo salvaje). La constante de disociación (Kd) y los valores de R2 calculados a partir de la absorbancia medida se dan en la Tabla 4.

[Tabla 4]

Se confirmó que la afinidad de unión de N-Fc-DKK2-Gly4 por hLRP6 y mLRP6 era de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 veces mayor que la de la DKK2 de tipo salvaje.

4. Examen de la angiogénesis por proteína DKK2 mutante

Para examinar si la proteína DKK2 mutante es capaz de inducir angiogénesis, se realizó un ensayo de bolsillo corneal (CPA).

Se compraron ratones C57BL6 (machos, 9 semanas de edad, que pesaban 21,81 g-23,81 g) de Orientbio Inc. (Corea), y luego se aclimataron durante aproximadamente 7 días en una instalación para animales donde se realizaron los experimentos.

Para administrar un fármaco a la córnea, se preparó un gránulo de fármaco. En detalle, se disolvieron 10 g de complejo de sacarosa octasulfato-aluminio (S0652, Sigma-aldrich) en 100 ml de PBS (solución salina tamponada con fosfato) para preparar una solución de sucralfato al 10 % (p/v). Se disolvieron 12 g de metacrilato de poli-2-hidroxietilo (P3932, Sigma-aldrich) en 100 ml de etanol absoluto para preparar una solución de poli-HEMA al 12 % (p/v). Se colocó una parafilm en una placa de Petri y se dejó bajo la luz ultravioleta durante aproximadamente 15 minutos. Se mezclaron 5 |jl de solución de poli-HEMA al 12 % (p/v), 1 j l de solución de sucralfato al 10 % (p/v) y 4 j l del fármaco. Se dispensó cada 0,2 j l de esta mezcla sobre el parafilm y los gránulos distribuidos se secaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 horas. Los gránulos secos se almacenaron en un frigorífico antes de su uso.

Los ratones aclimatados (machos, 10 semanas de edad, con un peso de 2123,43 g-26,11 g) se dividieron en 2 grupos (n=5 por grupo) y se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de una mezcla 4:1 (v/v) de ketamina y xilacina ((Rompun™), Bayer AG, Alemania). Aproximadamente 10 minutos después, se vertió proparacaína al 0,5 % en sus córneas. Con un cuchillo de cataratas de von Graefe, se hizo un microbolsillo en la córnea bajo un microscopio. Los gránulos preparados se implantaron en el microbolsillo corneal (Día 1). Para prevenir la infección, se aplicó un ungüento oftálmico de terramicina en el ojo. Como material de prueba, se usó N-Fc-DKK2-Gly4 y se administraron 475 ng de N-Fc-DKK2-Gly4 por ratón. Como grupo de control negativo, se utilizó PBS. A continuación, se examinaron las córneas con un microscopio y un analizador de imágenes observó la angiogénesis y las características estructurales. No se detectó angiogénesis en el grupo de control negativo, mientras que se detectó angiogénesis en el grupo tratado con N-Fc-DKK2-Gly4 el día 5. El área (mm2) de la angiogénesis en el grupo tratado con N-Fc-DKK2-Gly4 y el resultado se da en la Tabla 5.

[Tabla 5]

Como se muestra en la Tabla 5, se observó angiogénesis en el grupo tratado con N-Fc-DKK2-Gly4, en comparación con el grupo de control negativo.

5. Efecto mejorador de la retinopatía diabética de la proteína DKK2 mutante

Se examinó si la proteína DKK2 mutante es capaz de mejorar los síntomas de la retinopatía diabética.

Se compraron conejos chinchilla (macho, de 10-11 semanas de edad, con un peso de 2,0 kg-2,5 kg) de DREAMBIO Inc. (Corea) y luego se aclimataron durante aproximadamente 7 días en una instalación para animales donde se realizaron los experimentos. Se administró aloxano monohidrato (Sigma-Aldrich Co.) como inductor de la diabetes en la vena de la oreja de los conejos aclimatados. Los niveles de glucosa en sangre se midieron a los 7 días después de la administración (día 0), y los animales que tenían un nivel de glucosa en sangre de 300 mg/dl fueron seleccionados. Los conejos seleccionados se dividieron aleatoriamente de modo que el nivel promedio de glucosa en sangre de cada grupo se distribuyera por igual.

El conejo inducido por diabetes se anestesió mediante inyección intravenosa de Zoletil 50 (VIRBAC, Francia) y xilacina (Rompun™, Bayer AG, Alemania). Como material de prueba, se administró N-Fc-DKK2-Gly4 (en PBS) mediante inyección intravítrea el día 0 (7 días después de la administración de Alloxan) y el día 7 una vez al día en una cantidad total de 10 pl/ojo durante dos administraciones. Como grupo de control normal, se inyectó PBS en lugar de Alloxan. Como grupo de control de la diabetes, se administró Alloxan, y como grupo de control positivo, se administró EYLEA® (Bayer Korea Ltd.) mediante inyección intravítrea el día 0 en una cantidad de 50 pl/ojo una vez. Los fármacos administrados se dan en la siguiente Tabla 6.

[Tabla 6]

El día 0 (día de inicio de la administración del material de prueba), el día 14 y el día 21, se dejó caer un midriático (Mydriacyl colirio al 1 %) en los ojos de los conejos y se anestesió con Zoletil 50 (VIRBAC, Francia) y xilacina. ((Rompun™), Bayer AG, Alemania). Posteriormente, se inyectó una solución de sal sódica de fluoresceína al 2 % (p/v) (Sigma Aldrich) a través de la vena de la oreja y se fotografiaron los ojos de los conejos mediante el uso de una cámara de fondo de ojo (TRC-50IX, TOPCON, Japón) durante aproximadamente 2 minutos o más corto. El examen de la retina y la eficacia se evaluaron mediante imágenes de fondo de ojo fluorescentes. El análisis de imágenes se realizó mediante el uso del software ImageJ (NIH, Bethesda, MD) para medir la intensidad de la fluorescencia en las regiones no vasculares de la retina, y en base a un valor medio (100 %) del Grupo 1 (grupo de control normal), se calculó un nivel relativo (%) del valor de medición de cada sujeto. La intensidad de fluorescencia calculada se muestra en las Figuras 3A y 3B (Figura 3A: Día 14, Figura 3B: Día 21; * y ***: p<0,05 y p<0,001, respectivamente, en comparación con el Grupo 1; #, ## y ###: p<0,05, p<0,01 y p<0,001, respectivamente, en comparación con el Grupo 2; y $: p<0,05, en comparación con el Grupo 3). Como se muestra en las Figuras 3A y 3B, el grupo tratado con N-Fc-DKK2-Gly4

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido relacionado con Dickkopf (DKK)2 modificado que comprende uno o más sitios de glicosilación adicionales, en comparación con una secuencia de aminoácidos de un polipéptido DKK2 de tipo salvaje, en donde el sitio de glicosilación se introduce mediante la sustitución de asparagina (Asn, N) por aspartato (Asp, D) que es el aminoácido número 110 desde el extremo N-terminal en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

2. El polipéptido DKK2 modificado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido DKK2 de tipo salvaje comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

3. El polipéptido DKK2 modificado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la glicosilación es N-glicosilación.

4. El polipéptido DKK2 modificado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sitio de glicosilación es Asn-Xaa-Ser/Thr, yXaa representa cualquier aminoácido que excluye la prolina.

5. El polipéptido DKK2 modificado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido DKK2 modificado comprende una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8.

6. El polipéptido DKK2 modificado de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además una etiqueta en su extremo N-terminal o C-terminal o que comprende además un péptido señal en su extremo N-terminal.

7. El polipéptido DKK2 modificado de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la etiqueta es una región Fc (fragmento cristalizable), un péptido de polihistidina o una de sus combinaciones.

8. El polipéptido DKK2 modificado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido DKK2 modificado tiene una adición de grupos glicosilo, un aumento en la afinidad de unión por la proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP6), o una de sus combinaciones, en comparación con el polipéptido DKK2 de tipo salvaje.

9. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido DKK2 modificado de acuerdo con la reivindicación 1.

10. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el ácido nucleico comprende cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 46.

11. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una etiqueta en el extremo 5' o en el extremo 3' del ácido nucleico que codifica el polipéptido DKK2 modificado o que comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal en el extremo 5' del ácido nucleico que codifica el polipéptido DKK2 modificado.

12. Un método para preparar el polipéptido DKK2 modificado de acuerdo con la reivindicación 1, el método comprende:

cultivar células que se introducen con un vector que incluye el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9 en presencia de un medio de cultivo para obtener un producto de cultivo; y

obtener el polipéptido DKK2 modificado de acuerdo con la reivindicación 1 a partir del producto de cultivo.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula 293 de riñón embrionario humano (HEK), una célula de riñón de cría de hámster (BHK), una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula NS0, una célula SP2/0 y una célula PerC6.

14. Una composición farmacéutica para su uso en la promoción de la angiogénesis o para su uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades relacionadas con la permeabilidad vascular, la composición comprende el polipéptido DKK2 modificado de acuerdo con la reivindicación 1 o el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, y un portador farmacéuticamente aceptable.