KR101826841B1

KR101826841B1 - 변형된 ｄｋｋ2 단백질 또는 그 유전자를 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 방법

Info

Publication number: KR101826841B1
Application number: KR1020160011878A
Authority: KR
Inventors: 하일호; 이이영; 백인선; 서준규; 류지간; 윤국남
Original assignee: 주식회사 메드팩토
Priority date: 2015-02-04
Filing date: 2016-01-29
Publication date: 2018-02-08
Also published as: KR20160096038A; WO2016126054A1; WO2016126098A1; CN107223131A; ES2900641T3; CN107223131B; EP3253781B1; US10259850B2; KR101919593B1; JP6467070B2; PT3253781T; US20180016313A1; EP3253781A4; EP3253781A1; JP2018503397A; KR20160096023A

Abstract

일 양상에 따른 변형된 DKK2 폴리펩티드 또는 그를 코딩하는 핵산을 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 변형된 DKK2 폴리펩티드 또는 그를 코딩하는 핵산을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 발기 부전을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 이에 따르면, 개체의 발기 부전을 예방 또는 치료하는데 이용할 수 있다.

Description

변형된 ＤＫＫ2 단백질 또는 그 유전자를 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 방법{Pharmaceutical composition for preventing or treating erectile dysfuction containing modified DKK2 protein or gene therefor, and method of using the same}

변형된 ＤＫＫ2 단백질 또는 그 유전자를 포함하는 발기부전 치료 또는 예방용 조성물 및 이를 이용하여 발기부전을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

DKK2는 Wnt의 억제 단백질인 Dickkopf 류의 일종으로서, Wnt 신호전달경로의 저해 혹은 활성 인자로 작용하는 것으로 보고되고 있다(Wu W et al., Curr. Biol., 10(24), pp.1611-1614, 2000). DKK2는 두 개의 특징적인 시스테인이 많은 부위(cysteine-rich domain; CRD)를 갖고 있으며 다양한 길이의 연결부위로 구분되어 있다. 시스테인-2 부분은 이들 Dickkopf 류 간에 고도로 보존되어 있으며 10개의 보존된 시스테인 아미노산을 포함하고 있다(Krupnik VE et al., Gene, 238(2), pp.301-313, 1999). DKK2는 동물 세포에서 발현 효율이 낮은 난발현성 단백질이어서 DKK2를 이용한 치료제의 개발이 지연되고 있는 실정이다.

한편, 발기부전은 남성 성기능 장애의 일종으로써, 남성의 성기가 발기되지 않거나 발기 상태가 지속되지 않아 성행위를 할 수 없는 현상이다. 발기부전의 원인은 크게 심인성 원인과 기질성 원인으로 구별된다. 심인성 발기부전은 심리적, 정신적 영향에 의한 교감신경의 과다한 작용으로 인한 노르아드레날린 (noradrenaline)의 과도한 분비, 음경해면체 평활근 긴장도 증가, 신경 전달물질의 분비 억제 등에 기인한다. 또한, 기질성 발기 부전은 그 원인에 따라, 신경인성, 혈관성, 및 내분비성 발기부전으로 분류된다. 최근 연구는 기질성 원인에 더 비중을 두고 있고, 그의 치료로서 주로 비아그라 (viagra, 성분명: 실데나필)을 포함한 경구용 PDE-5 (phosphodiesterase-5) 저해제가 전세계적으로 사용되고 있다. 그러나 두통, 안면홍조, 소화불량, 및 심장마비 등 여러 가지 부작용이 보고되고 있을 뿐만 아니라, 비아그라와 같은 PDE-5 계열의 약물들은 분자적 수준에서 일시적인 단백질 발현 및 관련 인자들을 조절하는 것으로 근본적인 치료라 할 수 없다. 더욱이 당뇨에 의한 발기부전의 경우 이와 같은 치료제의 효과가 잘 나타나지 않을 뿐만 아니라, 설령 효과가 있다 해도 그 효능이 장기간 지속되지 못한다.

따라서, 발기부전 음경내의 비정상화된 혈관 구조를 근본적으로 치료하고, 그 효능도 장기간 지속되는 발기부전 치료제의 필요성이 요구되고 있는 실정이다.

일 양상은 야생형 DKK2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 1 개 이상의 추가적인 당화 부위를 포함하는 변형된 DKK2 폴리펩티드, 또는 그를 코딩하는 핵산을 포함하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

다른 양상은 야생형 DKK2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 1 개 이상의 추가적인 당화 부위를 포함하는 변형된 DKK2 폴리펩티드, 또는 그를 코딩하는 핵산을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 발기 부전을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 DKK2는 디코프(Dickkopf) 단백질 2를 의미하는 것으로, 디코프-관련 단백질(Dickkopf-related protein) 2, 시스테인-리치 분비된 단백질(cyteine-rich secreted protein) 2, CRSP2, CRISPY2, 또는 CRSP 단백질 2라고도 한다. DKK2는 인간의 경우 DKK2 유전자에 의하여 코딩되는 단백질이다. 이 유전자는 디코프 패밀리의 구성원인 단백질을 코딩한다. DKK2는 분비된 단백질로서 2개의 시스테인 리치 영역을 포함하고, Wnt 신호 전달 경로와의 상호작용을 통하여 배아 발생에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, DKK2는 보조인자 kremen 2 및 세포 상태(context)에 따라 Wnt/beta-catenin 신호전달의 촉진제 또는 길항제로서 작용할 수 있다. 상기 DKK2는 LRP6(Low-density lipoprotein receptor-related protein 6)와 결합할 수 있다.

상기 야생형 DKK2 폴리펩티드는 야생형 DKK2 전구체 폴리펩티드일 수 있다. 상기 야생형 DKK2 전구체 폴리펩티드는 인간에서 Genbank accession no. NP_055236.1의 아미노산 서열(서열번호 1)을 갖는 폴리펩티드, 또는 마우스에서 Genbank accession no. NP_064661.2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 야생형 DKK2 전구체 폴리펩티드는 신호 펩티드(signal peptide)를 포함할 수 있고, 신호 펩티드는 번역 중 변형(co-translational modification) 또는 번역후 변형(post-translational modification)에 의해 절단될 수 있다. 상기 야생형 DKK2 폴리펩티드는 성숙한(mature) DKK2일 수 있다. 상기 성숙한 DKK2는 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 1 내지 33번째 아미노산 서열(신호 펩티드 또는 리더 펩티드)이 제거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이거나 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 야생형 DKK2 전구체 폴리펩티드는 사람에서 Genbank accession no. NM_014421의 핵산 서열(서열번호 4)을 갖는 핵산, 또는 마우스에서 Genbank accession no. NM_020265의 핵산 서열을 갖는 핵산에 의해 암호화될 수 있다.

상기 당화(glycosylation)는 글리코실기를 단백질에 전달하는 반응을 말한다. 당화는 당 전이 효소(glycosyltransferase)에 의해 촉매된다. 상기 당화는 N-당화, O-당화, 포스포-세린 당화, C-만노실화(mannosylation), 글리피화(glypiation), 또는 이들의 조합일 수 있다. N-당화는 아스파라긴의 아미드에 당 분자가 부착되는 것을 말한다.

상기 당화 부위(glycosylation site)는 당 분자 또는 글리코실기가 부착될 수 있는 부위를 말한다. 예를 들어, 상기 당화 부위는 N-당화 부위인, Asn-Xaa-Ser/Thr의 공통 서열(consensus sequence)에서 아스파라긴 잔기일 수 있다. Asn은 아스파라긴을 의미하고, Xaa는 프롤린을 제외한 아미노산을 의미하고, Ser은 세린을 의미하고, Thr은 트레오닌을 의미하고, Ser/Thr은 세린 또는 트레오닌을 의미한다. 상기 Asn-Xaa-Ser/Thr은 N-말단으로부터 아스파라긴-프롤린을 제외한 아미노산-세린 또는 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 말하고, Asn-Xaa-Ser/Thr의 아스파라긴에 당 분자가 부착될 수 있다. 상기 야생형 DKK2 전구체 폴리펩티드는 N-말단으로부터 36번째 아미노산에 1개의 당화 부위를 포함할 수 있다.

상기 변형된 DKK2 폴리펩티드의 당화 부위는 서열번호 3의 아미노산 서열에서 5I, 31G, 96P, 110D, 44P, 2L, 45C, 57C, 62Q, 63G, 85P, 6K, 98T, 101I, 11G, 121H, 135P, 138K, 151L, 152R, 166F, 187K, 203G, 211D, 213T, 및 214Y로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 아스파라긴(Asn, N)으로 치환함으로써 도입된 것일 수 있다. 상기 숫자는 서열번호 3의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 아미노산의 번호를 의미하고, 영문자는 아미노산의 1 문자(letter) 코드를 나타낸다. 예를 들어, '5I'는 서열번호 3의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 5번째 아미노산인 이소류신을 의미한다.

상기 변형은 하나 이상의 아미노산의 치환일 수 있다.

상기 변형된 DKK2 폴리펩티드는 당화 부위의 도입되어 글리코실기가 추가로 도입된 DKK2 폴리펩티드일 수 있다. 당의 결합 방식, 당의 구성, 당의 구조(glycostructure), 또는 이들의 조합이 상이할 수 있지만, 상기 DKK2 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 동일한 당화 부위에 당화된다. 그 결과, 세포내 발현 효율이 증가될 수 있다. 예를 들어, 상기 변형된 DKK2 폴리펩티드가 발현된 숙주 세포의 종류에 따라 당의 결합 방식(예, N-당화 및 O-당화), 당의 구성(예, 시알릴화(sialylation) 수준 차이), 및 당의 구조가 상이할 수 있지만, 상기 DKK2 폴리펩티드의 동일한 당화 부위에 당화될 수 있다.

상기 변형된 DKK2 폴리펩티드는 서열번호 5 내지 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.

상기 변형된 DKK2 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 태그(tag)를 더 포함할 수 있다. 상기 태그는 발현, 정제, 검출 등을 돕기 위해 DKK2 폴리펩티드에 부착시킨 폴리펩티드일 수 있다. 상기 태그는 예를 들어 Fc(fragment crystallizable) 영역, 폴리-히스티딘 펩티드, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 Fc 영역은 인간 Fc 영역, 마우스 Fc 영역 등일 수 있다. 상기 Fc 영역은 서열번호 48의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드일 수 있다. 상기 Fc 영역은 서열번호 49의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 상기 태그는 당업자에게 알려진 것일 수 있다.

상기 변형된 DKK2 폴리펩티드는 N-말단에 신호 펩티드(signal peptide)를 더 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 분비 경로로 운명지어진 새로 합성되는 다수의 단백질의 N-말단에 존재하는 약 5 내지 30 개의 아미노산으로 이루어진 펩티드를 말한다. 상기 신호 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 1 내지 33번째 아미노산 서열이거나, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.

상기 변형된 DKK2 폴리펩티드는 야생형 DKK2 폴리펩티드에 비해 글리코실기의 추가, LRP6 결합 친화도의 증가, 또는 이들의 조합을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 변형된 DKK2 폴리펩티드의 글리코실기의 추가는 대조군으로서 야생형 DKK2 폴리펩티드의 글리코실기의 양 보다 증가할 수 있다. 글리코실기의 추가로 인해, 상기 변형된 DKK2 폴리펩티드의 양은 세포에서 야생형 DKK2 폴리펩티드의 양 보다 증가할 수 있다. 세포에서 변형된 DKK2 폴리펩티드를 코딩하는 전사체의 양이 야생형 DKK2 폴리펩티드를 코딩하는 전사체의 양 보다 증가할 수 있다. 폴리펩티드의 양 또는 전사체의 양이 증가한 것은 폴리펩티드의 세포 내 발현 효율이 증가한 것을 의미할 수 있다. LRP6에 대한 상기 변형된 DKK2 폴리펩티드의 결합 친화도(binding affinity)는 야생형 DKK2 폴리펩티드의 결합 친화도 보다 증가할 수 있다. 결합 친화도가 높을수록 해리 상수(K_D)는 낮아질 수 있다. LRP6에 대한 상기 변형된 DKK2 폴리펩티드의 해리 상수는 예를 들어, 약 0.1 nM 내지 약 100 nM, 약 1 nM 내지 약 50 nM, 약 2 nM 내지 약 40 nM, 약 3 nM 내지 약 30 nM, 약 4 nM 내지 약 20 nM, 약 5 nM 내지 약 10 nM, 또는 약 5.5 nM일 수 있다.

상기 핵산은 서열번호 43 내지 47로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 변형된 DKK2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 5'-말단 또는 3'-말단에 태그를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산은 변형된 DKK2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 5'-말단에 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산은 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서 및/또는 전사 종결 인자와 같은 유전자 발현 조절 인자와 작동가능하게 연결된 것일 수 있다.

용어 "발기 부전(erectile dysfunction)"은 성생활에 충분한 발기가 되지 않거나 유지되지 않은 상태를 말한다. 상기 발기는 음경 내로 유입되는 혈액량이 증가하면서 음경이 팽창하고 길이가 길어지는 것을 말한다. 증가된 혈액이 음경해면체 내압을 증가시켜 정맥을 압박하면 발기가 유지된다. 상기 발기 부전은 고령, 흡연, 음주, 당뇨, 고혈압, 비만, 고콜레스테롤혈증, 뇌혈관 질환, 및 심리적 요인에 의해 야기될 수 있다. 예를 들어, 상기 발기 부전은 당뇨병에 의해 야기된 것이다.

상기 약학적 조성물은 음경해면체 내압을 증가시킬 수 있다. 상기 음경해면체는 음경 등쪽에 존재하는 좌우 2개의 커다란 해면체를 말한다. 상기 약학적 조성물은 음경 해면체 내압을 증가시킴으로써 발기 부전을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 발기력이 약화되거나 발기력 지속시간이 감소되는 것을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 용어 "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 약화된 발기력 또는 감소된 발기 지속시간을 더 회복시키는 모든 행위를 말한다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 담체는 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 마니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 생리식염수, PBS와 같은 버퍼, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 풍미제, 유화제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 임의의 제형으로 준비될 수 있다. 상기 조성물은 예를 들면, 경구 투여 제형 (예, 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 알약, 과립), 또는 비경구 제형 (예, 주사제, 피부 외용제)으로 제형화될 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 전신 제형, 또는 국부 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 약학적 조성물은 주사용 제형 또는 피부 외용제이다. 상기 외용제는 크림, 로션, 또는 패치의 형태일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 상기 변형된 DKK2 폴리펩티드 또는 상기 변형된 DKK2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 유효한 양으로 포함할 수 있다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 약학적 조성물 당 약 0.5 ㎍ 내지 약 2 g, 약 1 ㎍ 내지 약 1 g, 약 10 ㎍ 내지 약 500 mg, 약 100 ㎍ 내지 약 100 mg, 약 1 mg 내지 약 50 mg일 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg, 약 0.005 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내이고, 1일 수회, 1일 1 내지 12회, 1주 1 내지 7회, 1월 1 내지 4회, 또는 1년 1 내지 12회 투여될 수 있다.

상기 야생형 DKK2 폴리펩티드, 당화, 변형, 변형된 DKK2 폴리펩티드, 핵산, 발기 부전, 예방, 및 치료는 전술한 바와 같다.

상기 개체는 발기 부전을 앓거나 앓을 가능성이 큰 개체일 수 있다. 상기 발기부전은 음경신경손상, 고지질혈증 (고콜레스텔롤혈증 발기부전을 포함), 및 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 의하여 야기된 것일 수 있다. 상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 생쥐, 래트, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다.

상기 투여는 경구, 정맥내, 근육내, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 상기 투여는 음경 해면체 내에 투여이다. 상기 투여는 예를 들어 음경 정맥 내 투여이다.

일 양상에 따른 변형된 DKK2 폴리펩티드 또는 그를 코딩하는 핵산을 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 변형된 DKK2 폴리펩티드 또는 그를 코딩하는 핵산을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 발기 부전을 예방 또는 치료하는 방법에 따르면, 개체의 발기 부전을 예방 또는 치료하는데 이용할 수 있다.

도 1a 및 도 1b는 각각, 여러 태그를 포함한 야생형 DKK2 단백질 및 돌연변이 DKK2 단백질의 면역 블로팅 결과를 나타내는 이미지이고, 도 1c는 Fc 태그를 포함하는 DKK2 N-Gly4와 DKK2 N-Gly5 단백질의 면역 블로팅 결과를 나타내는 이미지이고, 도 1d는 정제된 단백질을 전기영동한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 2a 및 도 2b는 각각, 200 ng의 mLRP6 및 hLRP6에 대한 돌연변이 DKK2 단백질에 대해 490 nm의 파장에서 측정된 흡광도를 나타내는 그래프이고, 도 2c 및 도 2d는 각각, 100 ng의 mLRP6 및 hLRP6에 대한 DKK2 단백질에 대해 490 nm의 파장에서 측정된 흡광도를 나타내는 그래프이다.
도 3a 및 도 3b는 각각 돌연변이 DKK2 투여에 따른 최고 음경해면체내압 (Maximal ICP) 또는 총 음경해면체내압 (음경해면체내압 곡선 하 면적)을 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. N-당화된 돌연변이 DKK2 단백질의 제조 및 확인

1. DKK2 단백질 N-당화 위치의 예측

야생형 DKK2 단백질의 아미노산 서열(서열번호 3)은 N-말단으로부터 3번째 아미노산에 N-당화(glycosylation) 위치를 갖는다. 야생형 DKK2 단백질로부터 N-당화를 인위적으로 생성시키기 위해, NetNGlyc1.0 server(www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)를 이용하여 야생형 DKK2 단백질의 N-당화 위치를 예측하였다.

NetNGlyc1.0 server로부터 총 26 종의 DKK2 단백질의 N-당화 위치를 예측하고, 그 결과를 표 1에 기재하였다. 표 1에서 아미노산은 야생형 DKK2 단백질(서열번호 3)의 아미노산과 이로부터 돌연변이된 아스파라긴(Asn, N)을 나타내고, 숫자는 야생형 DKK2 단백질의 N-말단으로부터 돌연변이된 아미노산의 위치를 나타낸다.

DKK2 돌연변이 단백질	N- 당화를 위한 아미노산의 변경	아미노산 서열
DKK2 N-Gly1	5I -> 5N	서열번호 5
DKK2 N-Gly2	31G -> 31N	서열번호 6
DKK2 N-Gly3	96P -> 96N	서열번호 7
DKK2 N-Gly4	110D -> 110N	서열번호 8
DKK2 N-Gly5	44P -> 44N	서열번호 9
DKK2 N-Gly6	2L -> 2N	서열번호 10
DKK2 N-Gly7	45C -> 45N	서열번호 11
DKK2 N-Gly8	57C -> 57N	서열번호 12
DKK2 N-Gly9	62Q -> 62N	서열번호 13
DKK2 N-Gly10	63G -> 63N	서열번호 14
DKK2 N-Gly11	85P -> 85N	서열번호 15
DKK2 N-Gly12	6K -> 6N	서열번호 16
DKK2 N-Gly13	98T -> 98N	서열번호 17
DKK2 N-Gly14	101I -> 101N	서열번호 18
DKK2 N-Gly15	11G -> 11N	서열번호 19
DKK2 N-Gly16	121H -> 121N	서열번호 20
DKK2 N-Gly17	135P -> 135N	서열번호 21
DKK2 N-Gly18	138K -> 138N	서열번호 22
DKK2 N-Gly19	151L -> 151N	서열번호 23
DKK2 N-Gly20	152R -> 152N	서열번호 24
DKK2 N-Gly21	166F -> 166N	서열번호 25
DKK2 N-Gly22	187K -> 187N	서열번호 26
DKK2 N-Gly23	203G -> 203N	서열번호 27
DKK2 N-Gly24	211D -> 211N	서열번호 28
DKK2 N-Gly25	213T -> 213N	서열번호 29
DKK2 N-Gly26	214Y -> 214N	서열번호 30

26 종의 DKK2 단백질의 N-당화 위치 후보자 중에서, NetNGlyc1.0 server에서 N-당화 가능성(potential) 수치가 높은 5 종의 DKK2 돌연변이 단백질을 선별하여 단백질의 생산 효율을 확인하였다.

선별된 5 종의 DKK2 돌연변이 단백질의 N-당화 가능성 수치를 하기 표 2에 기재하였다.

DKK2 돌연변이 단백질	N- 당화의 가능성
DKK2 N-Gly1	0.7342
DKK2 N-Gly2	0.7206
DKK2 N-Gly3	0.7010
DKK2 N-Gly4	0.7541
DKK2 N-Gly5	0.7372

2. 선별된 N-당화 DKK2 단백질의 생산 효율의 확인

실시예 1.1에서 선별된 5 종의 DKK2 단백질의 발현을 위해 고효율 발현벡터에 삽입하여 임시 발현 시스템(Transient expression system)으로 단백질 생산 효율을 확인하였다.

(1) 중합효소 연쇄 반응의 수행

야생형 DKK2 자연형(Genbank accession no. NP_055236.1, 서열번호 3)(대한민국, (주)메드팩토 제공)을 주형으로 이용하였다.

DKK2 N-당화를 위해 디자인한 프라이머의 핵산 서열을 표 3에 나타내었다.

증폭 대상	프라이머	핵산 서열
DKK2 N-Gly1	정방향 프라이머	5'-ggcatgtgctgcaacagtacccgctgcaataatggcatct-3' (서열번호 31)
DKK2 N-Gly1	역방향 프라이머	5'-gcagcgggtactgttgcagcacatgccatctcggtggc-3' (서열번호 32)
DKK2 N-Gly2	정방향 프라이머	5'-aatctaggaagaaatcacactaagatgtcacatataaaaggg-3' (서열번호 33)
DKK2 N-Gly2	역방향 프라이머	5'-catcttagtgtgatttcttcctagattctgccatcccaagtc-3' (서열번호 34)
DKK2 N-Gly3	정방향 프라이머	5'-catcagggggaaaactgtaccaaacaacgcaagaagggttc-3' (서열번호 35)
DKK2 N-Gly3	역방향 프라이머	5'-ttgtttggtacagttttccccctgatggagcactggtttg-3' (서열번호 36)
DKK2 N-Gly4	정방향 프라이머	5'-atcccggctctgaatggtactcggcacagagatcgaaac-3' (서열번호 37)
DKK2 N-Gly4	역방향 프라이머	5'-gtgccgagtaccattcagagccgggatgtgaggggttaa-3' (서열번호 38)
DKK2 N-Gly5	정방향 프라이머	5'-gggcaggcctacaattgtagcagtgataaggagtgtgaagtt-3' (서열번호 39)
DKK2 N-Gly5	역방향 프라이머	5'-atcactgctacaattgtaggcctgccccaggtttttgcc-3' (서열번호 40)
벡터	정방향 프라이머	5'-accggtggtaccgccaccatgggatggag-3' (서열번호 41)
벡터	역방향 프라이머	5'-ggatttatacaaggaggagaaaatgaaag-3' (서열번호 42)

중합효소 연쇄 반응을 위해, 하기 조성의 혼합물을 준비하였다.

100 ng 주형

2.5 유닛 pfu DNA 중합효소 (SPX16-RS500, (주) 솔젠트)

10 pmol 정방향 프라이머

10 pmol 역방향 프라이머

1 ㎕ 10 mM dNTP

5 ㎕ 10x pfu 중합효소 완충액

50 ㎕ 총 부피

준비된 혼합물을 95℃에서 2 분 동안 인큐베이션한 후, 95℃에서 20 초, 64℃에서 40 초, 및 72℃에서 1 분을 1 사이클로 하여 30 사이클을 반복하고, 72℃에서 10 분 동안 인큐베이션하여, 증폭된 돌연변이 DKK2 핵산을 수득하였다.

(2) 증폭 산물의 클로닝 및 숙주 세포에서 일시적인 단백질 발현의 확인

증폭된 돌연변이 DKK2 핵산 또는 야생형 DKK2 핵산을 10 유닛의 제한효소 SfiI(Cat. No. R033S, Enzynomics, korea) 및 1x 반응 완충액의 존재에서 50℃에서 6 시간 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 아가로스 젤에 전기영동하고, 벡터에 삽입될 핵산을 Gel Purification kit(Cat. No. 1014876, QIAGEN, USA)을 사용하여 정제하였다. 포유류 발현 벡터인 N293F-FC 벡터(ATP-100, ㈜ANRT)와 정제된 핵산을 질량비 1:3의 비율로 혼합하고, 10 유닛의 T4 DNA 연결효소(Cat. No. M001S, Enzynomics, korea) 및 1x 반응 버퍼의 존재에서 22℃에서 4시간 이상 인큐베이션하였다.

반응물을 대장균에 형질전환시키고, 핵산 서열 분석을 통해 DKK2 N-Gly1, DKK2 N-Gly2, DKK2 N-Gly3, DKK2 N-Gly4, 및 DKK2 N-Gly5를 코딩하는 핵산의 핵산 서열(각각, 서열번호 43 내지 47)를 확인하였다. 돌연변이 DKK2 핵산이 도입된 N293F-FC 벡터를 포함하는 클론을 선별하였다.

선별된 클론으로부터 돌연변이 DKK2 핵산(mDKK2)이 도입된 N293F-FC-mDKK2 벡터를 수득하였다. Fc 핵산은 인간 면역글로불린 G1의 Fc 단편을 암호화하는 핵산(서열번호 48)을 이용하였다.

포유류 세포인 HEK293F 부유세포를 5X10⁵ 세포/㎖로 Free style media(Cat. No. 1508027, Invitrogen, USA)에 접종하고 37℃ 및 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 세포의 수가 약 1X10⁶세포/㎖에 도달할 때까지(약 24 시간) 배양하였다.

25 ㎍의 돌연변이 DKK2 핵산이 도입된 N293F-FC 벡터, 50 ㎍의 폴리에틸렌이민(polyethylenimine; PEI)(Cat. No. 23966, Polysciences, USA) 및 600 ㎕의 PMI 배지(Cat. No. sh30027.01, Hiclone, USA)를 혼합하고, 실온에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 배양된 HEK293F 세포에 첨가하고, 37℃ 및 5% CO₂ 조건 하에서 약 5일 동안 배양하였다. 그 후, 세포에서 분비된 수용성 단백질을 수득하기 위해 세포를 제거하고 배양 용액만 회수하였다.

200 ㎕의 배양 용액을 10% SDS-PAGE하고, 면역블로팅을 수행하였다. 수득된 돌연변이 DKK2 단백질 및 야생형 DKK2 단백질은 그의 N-말단에 FC-TAG, HIS-TAG, 또는 mFc-tag을 포함하기 때문에, 1:4000로 희석된 항-Fc-HRP(Cat. No. 31414, PIERCE, USA), 1:2000로 희석된 항-HIS-HRP(Cat. No. A7058, SIGMA, USA), 또는 1:2000로 희석된 항-mFc(Cat. No. 31430, PIERCE, USA)을 사용하였다. 발색 시약으로서 ECL KIT(Cat. No. 0034077 GE USA)를 사용하여 이미지를 수득하였다.

도 1a는 여러 태그를 포함한 야생형 DKK2 단백질의 면역 블로팅 결과를 나타낸다(노출 시간: 1 분, M: 마커(KDa), 1: N-Fc-DKK2, 2: N-Fc(IgG4)-DKK2, 3: N-His-DKK2, 4: N-mFc-DKK2). 도 1a에 나타난 바와 같이, 노출을 1 분 정도 해도 야생형 DKK2 단백질이 검출되지 않았다. 따라서, 야생형 DKK2 단백질은 거의 발현되지 않음을 확인하였다.

도 1b는 여러 태그를 포함한 돌연변이 DKK2 단백질의 면역 블로팅 결과를 나타낸다(노출 시간: 1 분(좌) 또는 1 초(우), M: 마커(KDa), 1: N-mFc-DKK2-gly1, 2: N-mFc-DKK2-gly2, 3: N-mFc-DKK2-gly3, 4: N-Fc4-DKK2-gly1, 5: N-His-DKK2-gly1, 6: N-Fc-DKK2-gly1, 7: N-His-DKK2-gly2, 8: N-Fc4-DKK2-gly2, 9: N-Fc-DKK2-gly2, 10: N-Fc-DKK2-gly3, 11: N-His-DKK2-gly3, 12: N-Fc4-DKK2-gly3). 도 1b에 나타난 바와 같이, Fc 태그를 포함한 돌연변이 DKK2 단백질은 검출되었으나, 반면에 Fc 이외의 태그를 포함한 돌연변이 DKK2 단백질은 거의 검출되지 않았다. 따라서, Fc 태그를 포함한 돌연변이 DKK2 단백질의 발현 효율이 우수함을 확인하였다. 발현된 단백질을 일회용 오픈 컬럼을 이용하여 정제하고 농도를 측정하였다.

Fc 태그를 포함하는 단백질의 발현 효율이 우수하므로, Fc 태그를 포함하는 DKK2 N-Gly4와 DKK2 N-Gly5 단백질을 수득하였다. 수득된 단백질을 면역 블로팅하고, 그 결과를 도 1c에 나타내었다(노출 시간: 1 초(좌) 또는 30 초(우), M: 마커(KDa), 1: N-Fc-DKK2-gly4, 2: N-Fc-DKK2-gly5). 도 1c에 나타난 바와 같이, N-Fc-DKK2-N-Gly4가 N-Fc-DKK2-N-Gly5 보다 발현 효율이 더 좋은 것을 확인하였다.

(3) 단백질의 대량 생산 및 정제

실시예 1(2)에 기재된 바와 같이 Fc 태그와 돌연변이 DKK2 핵산을 포함하는 벡터가 형질도입된 세포를 선별하였다. 선별된 세포를 37℃ 및 5% CO₂ 조건 하에서 약 5일 동안 배양하였다. 세포를 제외한 배양액을 실온에서 4800 rpm의 속도로 20 분 동안 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 0.22 ㎛ 필터(Cat. No. PR02890, Millipore, USA)를 사용하여 여과하였다. 5 ㎖ 컬럼에 충진된 단백질 A 비드(Cat. No. 17-1279-03, GE healthcare, Sweden)를 준비하고, 여과액을 4℃에서 밤새 0.9 ㎖/분의 속도로 비드에 가하였다. 100 ㎖ 이상의 PBS(Phosphate Buffered Saline)(Cat. No. 70011, Gibco, USA)로 비드를 세척하였다. 그 후, 비드에 0.1M 글리신-HCl(Cat. No. G7126, Sigma, USA)을 가하여 6개 분획으로 나누어 용출시켰다. 1M Tris(Cat. No. T-1503-5KG, Sigma, USA)(pH 9.0)을 첨가하여 분획물을 중화시켰다. 분획물 중 단백질을 정량하고, 단백질을 포함하는 이 있는 분획을 모았다. 분획물을 amicon ultra(Cat. No. UFC805024, Millipore, USA)에 가하고 제조자의 지시에 따라 원심분리하였다. 농축물에 1X PBS를 첨가하고 원심분리하는 과정을 3회 반복하여 보관 완충액을 PBS로 교환하였다.

정제된 단백질의 양을 측정하였다. N-Fc-DKK2-gly1의 양은 130 ㎍/40 ㎖ 배양액이고, N-Fc-DKK2-gly2의 양은 860 ㎍/40 ㎖ 배양액이고, N-Fc-DKK2-gly3의 양은 150 ㎍/40 ㎖ 배양액이고, N-Fc-DKK2-gly4의 양은 462 ㎍/40 ㎖ 배양액이고, N-Fc-DKK2-gly5의 농도는 27 ㎍/40 ㎖였다. N-당화 위치를 도입한 돌연변이 DKK2 단백질 중 가장 발현 효율이 높은 것은 N-Fc-DKK2-Gly2이고, 그 다음은 N-Fc-DKK2-Gly4임을 확인하였다. 따라서, N-당화 위치를 도입한 돌연변이 DKK2 단백질이 야생형 DKK2 단백질에 비해 고발현되고, N-Fc-DKK2-Gly2 및 N-Fc-DKK2-Gly4의 발현 효율이 야생형 DKK2의 발현 효율에 비해 각각 약 80배 및 약 50배 우수함을 확인하였다.

정제된 단백질의 순도를 확인하기 위해, 3 ㎍의 단백질을 10% SDS-PAGE 방법으로 전기영동하고, 그 결과를 도 1d에 나타내었다(M: 마커(KDa), 1: N-Fc-DKK2-gly1, 2: N-Fc-DKK2-gly2, 3: N-Fc-DKK2-gly3, 4: N-Fc-DKK2-gly4, 5: N-Fc-DKK2-gly5). 도 1d에 나타난 바와 같이, N-Fc-DKK2-gly2와 N-Fc-DKK2-gly4의 순도가 유사한 것으로 확인되었다.

3. 돌연변이 DKK2 단백질의 결합 친화도의 확인

DKK2 단백질이 마우스 LRP6(mLRP6)와 인간 LRP6(hLRP6)에 결합하는 것이 알려져 있으므로, LRP6에 대한 야생형 DKK2와 돌연변이 DKK2 단백질의 결합 친화도를 확인하였다.

구체적으로, ELISA 플레이트(Cat. No. 439454, Nunc, Denmark)에 웰(well) 당 200 ng의 hLRP6 단백질(Cat. No. 1505-LR-025, R&D, USA) 또는 mLRP6 단백질(Cat. No. 2960-LR-025, R&D, USA)을 가하고, 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하여 단백질을 코팅하였다. 200 ㎕의 4%(w/v) 탈지분유(Cat. No. 232100, Difco, France)/1xPBS를 ELISA 플레이트의 웰에 가하고, 상온에서 약 1 시간 동안 인큐베이션하여 블로킹(blocking)시켰다. 그 후, 블로킹 용액을 ELISA 플레이트에서 제거하였다.

각각의 정제된 DKK2 단백질과 100 ㎕의 1%(w/v) 탈지분유/1xPBS를 혼합하여 100 nM의 DKK2 단백질을 준비하고, 100 nM의 DKK2 단백질을 1/4의 희석농도로 순차 희석하였다. 희석된 단백질을 준비된 ELISA 플레이트에 가하고, 상온에서 약 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 200 ㎕의 PBST로 플레이트를 5회 세척하였다.

2 ㎕의 항-Human Fc-HRP(Cat. No. 31413, Thermo, USA) 항체를 1%(w/v) 탈지분유가 함유된 4 ㎖의 PBS와 혼합하고, 혼합물을 ELISA 플레이트의 웰 당 200 ㎕씩 첨가하고, 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, ELISA 플레이트의 2차 항체를 제거하고, 200 ㎕의 PBS로 5회 세척하였다. 10 ㎕의 H₂O₂ 용액(Cat. No. H1009-100ML, Sigma, USA), 10 ㎖의 PC 완충액(5.1 g 시트르산 모노수화물, 7.3 g 소듐 포스페이트/L (pH5.0)), 1개의 OPD 정제(Cat. No. P8787-100TAB, Sigma, USA)를 혼합한 혼합물을 준비하고 각 웰에 총 100 ㎕의 혼합물을 가하였다. 상온의 어두운 상태에서 10 분 동안 인큐베이션한 다음 발색을 확인하였다. 그 후, 웰 당 50 ㎕의 정지 완충액을 가하여 발색 반응을 종료시켰다. ELISA 리더기(reader)를 이용하여 490 nm의 파장에서 흡광도를 측정하고, 측정된 흡광로부터 해리 상수 K_D 값(M)을 산출하였다.

도 2a는 200 ng의 mLRP6에 대한 돌연변이 DKK2 단백질의 490 nm의 파장에서 측정된 흡광도를 나타내고, 도 2b는 200 ng의 hLRP6에 대한 돌연변이 DKK2 단백질의 490 nm의 파장에서 측정된 흡광도를 나타낸다(■: N-Fc-DKK2-Gly1, ▲: N-Fc-DKK2-Gly2, ▼: N-Fc-DKK2-Gly3, ◆: N-Fc-DKK2-Gly4, ●: N-Fc-DKK2-Gly5). 도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, N-Fc-DKK2-Gly4가 mLRP6와 hLRP6에 대한 결합 친화도가 가장 우수하였다. N-Fc-DKK2-Gly2는 발현 효율이 가장 높았으나, mLRP6와 hLRP6에 대한 결합 친화도는 높지 않은 것을 확인하였다. 따라서, N-Fc-DKK2-Gly4가 발현 효율이 우수하고, mLRP6와 hLRP6에 대한 결합 친화도가 높은 돌연변이 DKK2 단백질임을 확인하였다.

N-Fc-DKK2-Gly4와 야생형 DKK2(Cat. No. 6628-DK-010, R&D, USA)의 hLRP6와 mLRP6에 대한 결합 친화도를 비교하기 위해 전술한 바와 같이 ELISA를 수행하였다. 다만, 100 ng의 LRP6를 사용하였다.

도 2c는 100 ng의 mLRP6에 대한 DKK2 단백질의 490 nm의 파장에서 측정된 흡광도를 나타내고, 도 2d는 100 ng의 hLRP6에 대한 DKK2 단백질의 490 nm의 파장에서 측정된 흡광도를 나타낸다(■: N-Fc-DKK2-Gly4, ▲: 야생형 DKK2).측정된 흡광도로부터 산출된 해리 상수(K_D)와 R² 값을 표 4에 나타내었다.

	mLRP6		hLRP6
	DKK2 N-Gly4	야생형 DKK2	DKK2 N-Gly4	야생형 DKK2
K_D(M)	1 x 10^-8	2.7 x 10^-7	5.5 x 10^-9	9.0 x 10^-8
R²	0.99	0.86	0.99	0.98

hLRP6와 mLRP6에 대해, N-Fc-DKK2-Gly4의 결합 친화도가 야생형 DKK2의 결합 친화도 보다 약 5 내지 약 10배 우수함을 확인하였다.

4. 유형 1 당뇨 마우스에서 돌연변이 DKK2 단백질의 발기부전 치료 효과

(1) 유형 1 당뇨 마우스의 준비

생후 8주 된 수컷 마우스(C57BL/6J)를 준비하고, 준비된 마우스를 5개의 군으로 나누었다(각 군에서 n=6). 당뇨 유발군(2 내지 5군)에 50 mg/kg의 스트렙토조토신(streptozotocin: STZ)(Sigma-Aldrich)을 5일 연속으로 복강 내 투여하여 당뇨를 유발시켰다. 정상 대조군(1군)은 당뇨를 유발시키지 않았다. 당뇨 유발군에서 돌연변이 DKK2의효과를 확인하기 위해 N-Fc-DKK2-Gly4를 투여하였다.

1군: 정상 대조군

2군: 당뇨 유발 및 20 ㎕의 PBS (3일 간격으로 2회 복강 내 투여)

3군: 당뇨 유발 및 1.0 ㎍/20 ㎕의 N-Fc-DKK2-Gly4 (3일 간격으로 2회 음경해면체 내 투여)

4군: 당뇨 유발 및 5.0 ㎍/20 ㎕의 N-Fc-DKK2-Gly4 (3일 간격으로 2회 음경해면체 내 투여)

5군: 당뇨 유발 및 10.0 ㎍/20 ㎕의 N-Fc-DKK2-Gly4 (3일 간격으로 2회 음경해면체 내 투여)

(2) 음경해면체 내압의 측정

4.(1)에서 준비된 마우스에 단백질을 투여한 후 2주 후 음경해면체 신경자극 후 발기력을 측정하였다.

발기력을 측정할 마우스에 100 mg/kg의 케타민(유한양행) 및 5 mg/kg의 자일라진(바이엘코리아)을 복부 주사하여 마취시켰다. 마취된 마우스의 하복부에서 좌측 표피 부분을 개복하고, 전립선의 후외측에 위치한 음경해면체신경(음경신경)이 보이도록 준비하였다. 음경해면체 신경을 전기자극하기 위해서 백금 전극을 음경해면체 신경에 위치시킨 후, 약 1 내지 약 5 볼트 및 12 헤르츠의 강도로 약 1분 동안 전기자극을 가하였다. 전기자극을 하게 되면, 음경은 발기를 하게 된다. 이때 음경 해면체에 삽입된 카테터를 통해서 발기시 음경내부의 압력 (음경해면체 내압)을 측정하였다. 데이터 수집을 위하여 컴퓨터와 연결되어 있는 압력 전달기 (Biopac Systems Inc., 미국)로 측정하고, 측정된 압력 수치는 MP-100 (Biopac Systems Inc., 미국)를 통해서 분석하였다. 측정된 압력 수치를 도 3a 및 도 3b에 나타내었다. ICP(Intracavernous Pressure: 음경해면체내 압력)는 발기시 음경내부의 압력(음경해면체 내압)을 말하고, 일반적으로 발기력을 나타내는 지표이다.

도 3a 및 도 3b는 각각 돌연변이 DKK2 투여에 따른 최고 음경해면체내압 (Maximal ICP) 또는 총 음경해면체내압(total ICP)(즉, 음경해면체내압 곡선 하 면적)을 나타낸다.

도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, 최고 음경해면체 내압과 음경압력 곡선의 면적은 당뇨 유발에 의해 감소하였으나, 돌연변이 DKK2의 투여에 의해 투여량에 비례하여 유의하게 증가하였다. 따라서, 돌연변이 DKK2 단백질은 당뇨로 인한 발기부전을 예방 또는 치료하는데 효과가 있다는 것을 확인하였다.

<110> Medpacto Inc. <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating erectile dysfuction containing modified DKK2 protein or gene therefor, and method of using the same <130> PN112926 <160> 49 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human wildtype DKK2 precursor <400> 1 Met Ala Ala Leu Met Arg Ser Lys Asp Ser Ser Cys Cys Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ala Ala Val Leu Met Val Glu Ser Ser Gln Ile Gly Ser Ser Arg 20 25 30 Ala Lys Leu Asn Ser Ile Lys Ser Ser Leu Gly Gly Glu Thr Pro Gly 35 40 45 Gln Ala Ala Asn Arg Ser Ala Gly Met Tyr Gln Gly Leu Ala Phe Gly 50 55 60 Gly Ser Lys Lys Gly Lys Asn Leu Gly Gln Ala Tyr Pro Cys Ser Ser 65 70 75 80 Asp Lys Glu Cys Glu Val Gly Arg Tyr Cys His Ser Pro His Gln Gly 85 90 95 Ser Ser Ala Cys Met Val Cys Arg Arg Lys Lys Lys Arg Cys His Arg 100 105 110 Asp Gly Met Cys Cys Pro Ser Thr Arg Cys Asn Asn Gly Ile Cys Ile 115 120 125 Pro Val Thr Glu Ser Ile Leu Thr Pro His Ile Pro Ala Leu Asp Gly 130 135 140 Thr Arg His Arg Asp Arg Asn His Gly His Tyr Ser Asn His Asp Leu 145 150 155 160 Gly Trp Gln Asn Leu Gly Arg Pro His Thr Lys Met Ser His Ile Lys 165 170 175 Gly His Glu Gly Asp Pro Cys Leu Arg Ser Ser Asp Cys Ile Glu Gly 180 185 190 Phe Cys Cys Ala Arg His Phe Trp Thr Lys Ile Cys Lys Pro Val Leu 195 200 205 His Gln Gly Glu Val Cys Thr Lys Gln Arg Lys Lys Gly Ser His Gly 210 215 220 Leu Glu Ile Phe Gln Arg Cys Asp Cys Ala Lys Gly Leu Ser Cys Lys 225 230 235 240 Val Trp Lys Asp Ala Thr Tyr Ser Ser Lys Ala Arg Leu His Val Cys 245 250 255 Gln Lys Ile <210> 2 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide of human wildtype DKK2 <400> 2 Met Ala Ala Leu Met Arg Ser Lys Asp Ser Ser Cys Cys Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ala Ala Val Leu Met Val Glu Ser Ser Gln Ile Gly Ser Ser Arg 20 25 30 Ala <210> 3 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human wildtype mature DKK2 <400> 3 Lys Leu Asn Ser Ile Lys Ser Ser Leu Gly Gly Glu Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ala Ala Asn Arg Ser Ala Gly Met Tyr Gln Gly Leu Ala Phe Gly Gly 20 25 30 Ser Lys Lys Gly Lys Asn Leu Gly Gln Ala Tyr Pro Cys Ser Ser Asp 35 40 45 Lys Glu Cys Glu Val Gly Arg Tyr Cys His Ser Pro His Gln Gly Ser 50 55 60 Ser Ala Cys Met Val Cys Arg Arg Lys Lys Lys Arg Cys His Arg Asp 65 70 75 80 Gly Met Cys Cys Pro Ser Thr Arg Cys Asn Asn Gly Ile Cys Ile Pro 85 90 95 Val Thr Glu Ser Ile Leu Thr Pro His Ile Pro Ala Leu Asp Gly Thr 100 105 110 Arg His Arg Asp Arg Asn His Gly His Tyr Ser Asn His Asp Leu Gly 115 120 125 Trp Gln Asn Leu Gly Arg Pro His Thr Lys Met Ser His Ile Lys Gly 130 135 140 His Glu Gly Asp Pro Cys Leu Arg Ser Ser Asp Cys Ile Glu Gly Phe 145 150 155 160 Cys Cys Ala Arg His Phe Trp Thr Lys Ile Cys Lys Pro Val Leu His 165 170 175 Gln Gly Glu Val Cys Thr Lys Gln Arg Lys Lys Gly Ser His Gly Leu 180 185 190 Glu Ile Phe Gln Arg Cys Asp Cys Ala Lys Gly Leu Ser Cys Lys Val 195 200 205 Trp Lys Asp Ala Thr Tyr Ser Ser Lys Ala Arg Leu His Val Cys Gln 210 215 220 Lys Ile 225 <210> 4 <211> 3659 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human DKK2 mRNA <400> 4 cgggagcccg cggcgagcgt agcgcaagtc cgctccctag gcatcgctgc gctggcagcg 60 attcgctgtc tcttgtgagt caggggacaa cgcttcgggg caactgtgag tgcgcgtgtg 120 ggggacctcg attctcttca gatctcgagg attcggtccg gggacgtctc ctgatcccct 180 actaaagcgc ctgctaactt tgaaaaggag cactgtgtcc tgcaaagttt gacacataaa 240 ggataggaaa agagaggaga gaaaagcaac tgagttgaag gagaaggagc tgatgcgggc 300 ctcctgatca attaagagga gagttaaacc gccgagatcc cggcgggacc aaggaggtgc 360 ggggcaagaa ggaacggaag cggtgcgatc cacagggctg ggttttcttg caccttgggt 420 cacgcctcct tggcgagaaa gcgcctcgca tttgattgct tccagttatt gcagaacttc 480 ctgtcctggt ggagaagcgg gtctcgcttg ggttccgcta atttctgtcc tgaggcgtga 540 gactgagttc atagggtcct gggtccccga accaggaagg gttgagggaa cacaatctgc 600 aagcccccgc gacccaagtg aggggccccg tgttggggtc ctccctccct ttgcattccc 660 acccctccgg gctttgcgtc ttcctgggga ccccctcgcc gggagatggc cgcgttgatg 720 cggagcaagg attcgtcctg ctgcctgctc ctactggccg cggtgctgat ggtggagagc 780 tcacagatcg gcagttcgcg ggccaaactc aactccatca agtcctctct gggcggggag 840 acgcctggtc aggccgccaa tcgatctgcg ggcatgtacc aaggactggc attcggcggc 900 agtaagaagg gcaaaaacct ggggcaggcc tacccttgta gcagtgataa ggagtgtgaa 960 gttgggaggt attgccacag tccccaccaa ggatcatcgg cctgcatggt gtgtcggaga 1020 aaaaagaagc gctgccaccg agatggcatg tgctgcccca gtacccgctg caataatggc 1080 atctgtatcc cagttactga aagcatctta acccctcaca tcccggctct ggatggtact 1140 cggcacagag atcgaaacca cggtcattac tcaaaccatg acttgggatg gcagaatcta 1200 ggaagaccac acactaagat gtcacatata aaagggcatg aaggagaccc ctgcctacga 1260 tcatcagact gcattgaagg gttttgctgt gctcgtcatt tctggaccaa aatctgcaaa 1320 ccagtgctcc atcaggggga agtctgtacc aaacaacgca agaagggttc tcatgggctg 1380 gaaattttcc agcgttgcga ctgtgcgaag ggcctgtctt gcaaagtatg gaaagatgcc 1440 acctactcct ccaaagccag actccatgtg tgtcagaaaa tttgatcacc attgaggaac 1500 atcatcaatt gcagactgtg aagttgtgta tttaatgcat tatagcatgg tggaaaataa 1560 ggttcagatg cagaagaatg gctaaaataa gaaacgtgat aagaatatag atgatcacaa 1620 aaagggagaa 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gtattcatac atactctgtg gtaatagaga cttgagctgg atctgtactg 2520 cactggagta agcaagaaaa ttgggaaaac tttttcgttt gttcaggttt tggcaacaca 2580 tagatcatat gtctgaggca caagttggct gttcatcttt gaaaccaggg gatgcacagt 2640 ctaaatgaat atctgcatgg gatttgctat cataatattt actatgcaga tgaattcagt 2700 gtgaggtcct gtgtccgtac tatcctcaaa ttatttattt tatagtgctg agatcctcaa 2760 ataatctcaa tttcaggagg tttcacaaaa tggactcctg aagtagacag agtagtgagg 2820 tttcattgcc ctctataagc ttctgactag ccaatggcat catccaattt tcttcccaaa 2880 cctctgcagc atctgcttta ttgccaaagg gctagtttcg gttttctgca gccattgcgg 2940 ttaaaaaata taagtaggat aacttgtaaa acctgcatat tgctaatcta tagacaccac 3000 agtttctaaa ttctttgaaa ccactttact acttttttta aacttaactc agttctaaat 3060 actttgtctg gagcacaaaa caataaaagg ttatcttata gtcgtgactt taaacttttg 3120 tagaccacaa ttcacttttt agttttcttt tacttaaatc ccatctgcag tctcaaattt 3180 aagttctccc agtagagatt gagtttgagc ctgtatatct attaaaaatt tcaacttccc 3240 acatatattt actaagatga ttaagactta cattttctgc acaggtctgc aaaaacaaaa 3300 attataaact agtccatcca agaaccaaag tttgtataaa caggttgcta taagcttggt 3360 gaaatgaaaa tggaacattt caatcaaaca tttcctatat aacaattatt atatttacaa 3420 tttggtttct gcaatatttt tcttatgtcc acccttttaa aaattattat ttgaagtaat 3480 ttatttacag gaaatgttaa tgagatgtat tttcttatag agatatttct tacagaaagc 3540 tttgtagcag aatatatttg cagctattga ctttgtaatt taggaaaaat gtataataag 3600 ataaaatcta ttaaattttt ctcctctaaa aactgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 3659 <210> 5 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK2 N-Gly1 <400> 5 Lys Leu Asn Ser Asn Lys Ser Ser Leu Gly Gly Glu Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ala Ala Asn Arg Ser Ala Gly Met Tyr Gln Gly Leu Ala Phe Gly Gly 20 25 30 Ser Lys Lys Gly Lys Asn Leu Gly Gln Ala Tyr Pro Cys Ser Ser Asp 35 40 45 Lys Glu Cys Glu Val Gly Arg Tyr Cys His Ser Pro His Gln Gly Ser 50 55 60 Ser Ala Cys Met Val Cys Arg Arg Lys Lys Lys Arg Cys His Arg Asp 65 70 75 80 Gly Met Cys Cys Pro Ser Thr Arg Cys Asn Asn Gly Ile Cys Ile Pro 85 90 95 Val Thr Glu Ser Ile Leu Thr Pro His Ile Pro Ala Leu Asp 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29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for vector <400> 41 accggtggta ccgccaccat gggatggag 29 <210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for vector <400> 42 ggatttatac aaggaggaga aaatgaaag 29 <210> 43 <211> 678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding DKK2 N-Gly1 polypeptide <400> 43 aaactcaact ccaacaagtc ctctctgggc ggggagacgc ctggtcaggc cgccaatcga 60 tctgcgggca tgtaccaagg actggcattc ggcggcagta agaagggcaa aaacctgggg 120 caggcctacc cttgtagcag tgataaggag tgtgaagttg ggaggtattg ccacagtccc 180 caccaaggat catcggcctg catggtgtgt cggagaaaaa agaagcgctg ccaccgagat 240 ggcatgtgct gccccagtac ccgctgcaat aatggcatct gtatcccagt tactgaaagc 300 atcttaaccc ctcacatccc ggctctggat ggtactcggc acagagatcg aaaccacggt 360 cattactcaa accatgactt gggatggcag aatctaggaa gaccacacac taagatgtca 420 catataaaag ggcatgaagg agacccctgc ctacgatcat cagactgcat tgaagggttt 480 tgctgtgctc gtcatttctg gaccaaaatc tgcaaaccag tgctccatca gggggaagtc 540 tgtaccaaac aacgcaagaa gggttctcat gggctggaaa ttttccagcg ttgcgactgt 600 gcgaagggcc tgtcttgcaa agtatggaaa gatgccacct actcctccaa agccagactc 660 catgtgtgtc agaaaatt 678 <210> 44 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding DKK2 N-Gly2 polypeptide <400> 44 aaactcaact ccatcaagtc ctctctgggc ggggagacgc ctggtcaggc cgccaatcga 60 tctgcgggca tgtaccaagg actggcattc aatggcagta agaagggcaa aaacctgggg 120 caggcctacc cttgtagcag tgataaggag tgtgaagttg ggaggtattg ccacagtccc 180 caccaaggat catcggcctg catggtgtgt cggagaaaaa agaagcgctg ccaccgagat 240 ggcatgtgct gccccagtac ccgctgcaat aatggcatct gtatcccagt tactgaaagc 300 atcttaaccc ctcacatccc ggctctggat ggaattactc ggcacagaga tcgaaaccac 360 ggtcattact caaaccatga cttgggatgg cagaatctag gaagaccaca cactaagatg 420 tcacatataa aagggcatga aggagacccc tgcctacgat catcagactg cattgaaggg 480 ttttgctgtg ctcgtcattt ctggaccaaa atctgcaaac cagtgctcca tcagggggaa 540 gtctgtacca aacaacgcaa gaagggttct catgggctgg aaattttcca gcgttgcgac 600 tgtgcgaagg gcctgtcttg caaagtatgg aaagatgcca cctactcctc caaagccaga 660 ctccatgtgt gtcagaaaat t 681 <210> 45 <211> 678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding DKK2 N-Gly3 polypeptide <400> 45 aaactcaact ccatcaagtc ctctctgggc ggggagacgc ctggtcaggc cgccaatcga 60 tctgcgggca tgtaccaagg actggcattc ggcggcagta agaagggcaa aaacctgggg 120 caggcctacc cttgtagcag tgataaggag tgtgaagttg ggaggtattg ccacagtccc 180 caccaaggat catcggcctg catggtgtgt cggagaaaaa agaagcgctg ccaccgagat 240 ggcatgtgct gccccagtac ccgctgcaat aatggcatct gtatcaatgt tactgaaagc 300 atcttaaccc ctcacatccc ggctctggat ggtactcggc acagagatcg aaaccacggt 360 cattactcaa accatgactt gggatggcag aatctaggaa gaccacacac taagatgtca 420 catataaaag ggcatgaagg agacccctgc ctacgatcat cagactgcat tgaagggttt 480 tgctgtgctc gtcatttctg gaccaaaatc tgcaaaccag tgctccatca gggggaagtc 540 tgtaccaaac aacgcaagaa gggttctcat gggctggaaa ttttccagcg ttgcgactgt 600 gcgaagggcc tgtcttgcaa agtatggaaa gatgccacct actcctccaa agccagactc 660 catgtgtgtc agaaaatt 678 <210> 46 <211> 678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding DKK2 N-Gly4 polypeptide <400> 46 aaactcaact ccatcaagtc ctctctgggc ggggagacgc ctggtcaggc cgccaatcga 60 tctgcgggca tgtaccaagg actggcattc ggcggcagta agaagggcaa aaacctgggg 120 caggcctacc cttgtagcag tgataaggag tgtgaagttg ggaggtattg ccacagtccc 180 caccaaggat catcggcctg catggtgtgt cggagaaaaa agaagcgctg ccaccgagat 240 ggcatgtgct gccccagtac ccgctgcaat aatggcatct gtatcccagt tactgaaagc 300 atcttaaccc ctcacatccc ggctctgaat ggtactcggc acagagatcg aaaccacggt 360 cattactcaa accatgactt gggatggcag aatctaggaa gaccacacac taagatgtca 420 catataaaag ggcatgaagg agacccctgc ctacgatcat cagactgcat tgaagggttt 480 tgctgtgctc gtcatttctg gaccaaaatc tgcaaaccag tgctccatca gggggaagtc 540 tgtaccaaac aacgcaagaa gggttctcat gggctggaaa ttttccagcg ttgcgactgt 600 gcgaagggcc tgtcttgcaa agtatggaaa gatgccacct actcctccaa agccagactc 660 catgtgtgtc agaaaatt 678 <210> 47 <211> 678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding DKK2 N-Gly5 polypeptide <400> 47 aaactcaact ccatcaagtc ctctctgggc ggggagacgc ctggtcaggc cgccaatcga 60 tctgcgggca tgtaccaagg actggcattc ggcggcagta agaagggcaa aaacctgggg 120 caggcctaca attgtagcag tgataaggag tgtgaagttg ggaggtattg ccacagtccc 180 caccaaggat catcggcctg catggtgtgt cggagaaaaa agaagcgctg ccaccgagat 240 ggcatgtgct gccccagtac ccgctgcaat aatggcatct gtatcccagt tactgaaagc 300 atcttaaccc ctcacatccc ggctctggat ggtactcggc acagagatcg aaaccacggt 360 cattactcaa accatgactt gggatggcag aatctaggaa gaccacacac taagatgtca 420 catataaaag ggcatgaagg agacccctgc ctacgatcat cagactgcat tgaagggttt 480 tgctgtgctc gtcatttctg gaccaaaatc tgcaaaccag tgctccatca gggggaagtc 540 tgtaccaaac aacgcaagaa gggttctcat gggctggaaa ttttccagcg ttgcgactgt 600 gcgaagggcc tgtcttgcaa agtatggaaa gatgccacct actcctccaa agccagactc 660 catgtgtgtc agaaaatt 678 <210> 48 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding Fc region of human Immunoglobulin G1 <400> 48 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60 gggggaccgt cagtcttcct ctttccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 696 <210> 49 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc region of human Immunoglobulin G1 <400> 49 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230

Claims

야생형 DKK(Dickkopf-related protein)2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 1 개 이상의 추가적인 당화(glycosylation) 부위를 포함하고,
상기 변형된 DKK2 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 110번째 아미노산인 아스파르트산(Asp, D)을 아스파라긴(Asn, N)으로 치환된 것인,
변형된 DKK2 폴리펩티드, 또는 그를 코딩하는 핵산을 포함하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 야생형 DKK2 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 변형된 DKK2 폴리펩티드는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 46의 핵산 서열을 포함하는 것인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 발기 부전은 당뇨병에 의하여 야기된 것인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 음경해면체 내압을 증가시키는 것인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 주사용 제형인 것인 약학적 조성물.
야생형 DKK2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 1 개 이상의 추가적인 당화 부위를 포함하는 변형된 DKK2 폴리펩티드, 또는 그를 코딩하는 핵산을 개체에 투여하는 단계를 포함하고,
상기 변형된 DKK2 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 110번째 아미노산인 아스파르트산(Asp, D)을 아스파라긴(Asn, N)으로 치환된 것인,
인간을 제외한 포유동물의 발기 부전을 예방 또는 치료하는 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 투여는 음경 해면체 내에 투여하는 것인 방법.