ES2894731T3 - Compuestos de benzazepina, conjugados y usos de los mismos - Google Patents

Compuestos de benzazepina, conjugados y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Compuesto o sal seleccionado de: **(Ver fórmula)** y **(Ver fórmula)** y una sal de uno cualquiera de los mismos, en el que el RX* es un enlace, un resto de succinimida o un resto de succinimida hidrolizada unido a un residuo de un constructo de anticuerpo, en el que en RX* representa el punto de unión al residuo del constructo de anticuerpo, en el que el constructo de anticuerpo comprende un dominio de unión a antígeno HER2.

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos de benzazepina, conjugados y usos de los mismos
Antecedentes de la invención
Una de las principales causas de muerte en los Estados Unidos es el cáncer. Los métodos convencionales de tratamiento del cáncer, como la quimioterapia, la cirugía o la radioterapia, tienden a ser o bien altamente tóxicos o bien inespecíficos para el cáncer, o ambos, lo que da como resultado una eficacia limitada y efectos secundarios dañinos. Sin embargo, el sistema inmunitario tiene el potencial de ser una herramienta poderosa y específica en la lucha contra el cáncer. En muchos casos, los tumores pueden expresar específicamente genes cuyos productos son necesarios para inducir o mantener el estado maligno. Estas proteínas pueden servir como marcadores de antígeno para el desarrollo y el establecimiento de una respuesta inmunitaria contra el cáncer más específica. El refuerzo de esta respuesta inmunitaria específica tiene el potencial de ser un poderoso tratamiento contra el cáncer que puede ser más eficaz que los métodos convencionales de tratamiento del cáncer y puede tener menos efectos secundarios.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un compuesto o a una sal seleccionado de:
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y a una sal de uno cualquiera de los mismos, en el que el RX* es un enlace, un resto de succinimida o un resto de succinimida hidrolizada unido a un residuo de un constructo de anticuerpo, en el que ^ en RX* representa el punto de unión al residuo del constructo de anticuerpo, en el que el constructo de anticuerpo comprende un dominio de unión a antígeno HER2. Los aspectos preferidos de la presente invención se definen en las reivindicaciones dependientes adjuntas.
En algunas realizaciones, RX* comprende un resto de succinamida y está unido a un residuo de cisteína de un constructo de anticuerpo. En algunas realizaciones, RX* comprende un resto de succinamida hidrolizada y está unido a un residuo de cisteína de un constructo de anticuerpo. El constructo de anticuerpo comprende un dominio de unión a antígeno HER2. En algunas realizaciones, el constructo de anticuerpo es pertuzumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el constructo de anticuerpo es trastuzumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
El constructo de anticuerpo comprende un dominio de unión a antígeno HER2. En algunas realizaciones, el constructo de anticuerpo es pertuzumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el constructo de anticuerpo es trastuzumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende el conjugado divulgado en el presente documento y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En algunos aspectos, la DAR promedio del conjugado es de desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8, o desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3, o desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 5.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método de destrucción de células tumorales in vivo, que comprende poner en contacto una población de células tumorales con un conjugado divulgado en el presente documento.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento, que comprende administrar a un sujeto un conjugado divulgado en el presente documento.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para el tratamiento del cáncer, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita un conjugado divulgado en el presente documento.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un conjugado divulgado en el presente documento para su uso en un método de tratamiento del cuerpo de un sujeto mediante terapia.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un conjugado divulgado en el presente documento para su uso en un método de tratamiento del cáncer.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método de administración de un compuesto de benzazepina a una célula cancerosa en un sujeto, que comprende administrar un conjugado divulgado en el presente documento a un sujeto que lo necesita.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para el tratamiento del cáncer, que comprende administrar una cantidad eficaz de un conjugado de anticuerpo, en el que el conjugado de anticuerpo comprende un constructo de anticuerpo unido covalentemente a través de un grupo de unión a un agonista de TLR8, en el que el agonista de TLR8 tiene una Kd para TLR7 que es dos veces o más de dos veces la Kd para TLR8, y en el que el conjugado de anticuerpo comprende desde 1 hasta 20 agonistas de TLR8 por constructo de anticuerpo, preferiblemente desde 1-8, 3-5 ó 1-3.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para el tratamiento del cáncer, que comprende administrar una cantidad eficaz de un conjugado de anticuerpo, en el que el conjugado de anticuerpo comprende un constructo de anticuerpo unido covalentemente a través de un grupo de unión a un agonista de TLR8, en el que el agonista de TLR8 agoniza a TLR8 con al menos una CE50 de un orden de magnitud menor que la cantidad del mismo compuesto requerida para mostrar un efecto agonista sobre TLR7, y en el que el conjugado de anticuerpo comprende desde 1 hasta 20 agonistas de TLR8 por constructo de anticuerpo, preferiblemente desde 1-8, 3-5 ó 1-3.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para el tratamiento del cáncer, que comprende administrar una cantidad eficaz de un conjugado de anticuerpo, en el que el conjugado de anticuerpo comprende un constructo de anticuerpo unido covalentemente a través de un grupo de unión a un agonista de TLR8, en el que el agonista de TLR8 comprende una benzazepina sustituida con un heterociclo bicíclico, y en el que el conjugado de anticuerpo comprende desde 1 hasta 20 agonistas de TLR8 por constructo de anticuerpo, preferiblemente desde 1-8, 3-5 ó 1-3.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método de preparación de un conjugado de anticuerpo
^D-----L3 A " Anticuerpo
'1-8
de la fórmula 5 en la que el anticuerpo es un constructo de anticuerpo y L3-D se selecciona de un compuesto o una sal divulgado en el presente documento, que comprende poner en contacto L3-D con un constructo de anticuerpo.
El constructo de anticuerpo comprende un dominio de unión a antígeno HER2. En algunas realizaciones, el constructo de anticuerpo es pertuzumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el constructo de anticuerpo es trastuzumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además purificar el conjugado de anticuerpo. Los documentos US 2017/014423 y US 2008/234251 divulgan compuestos similares para tratar, entre otros, el cáncer. Los presentes compuestos difieren en varios restos.
Breve descripción de los dibujos
Las nuevas características de la divulgación se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente divulgación mediante referencia a la siguiente descripción detallada que expone aspectos ilustrativos, en los que se utilizan los principios de la divulgación, y a los dibujos adjuntos, en los que:
La figura 1 muestra que los conjugados de HER2-agonista de TLR8 y los conjugados de HER2 x CD40-agonista de TLR8 fueron activos en presencia de PBMC y células SKBR3 que expresan HER2, tal como se mide mediante la producción de TNFa.
La figura 2 muestra que los conjugados de TROP2-agonista de TLR8 fueron activos en presencia de PBMC y células SKBR3 que expresan HER2, tal como se mide mediante la producción de TNFa.
La figura 3 muestra que un conjugado de CEA-agonista de TLR8 fue activo en presencia de monocitos y células CHO modificados por ingeniería para expresar CEA, mientras que el anticuerpo contra CEA solo y los anticuerpos y conjugados de control no fueron activos, tal como se mide mediante la producción de TNFa.
La figura 4 muestra que un conjugado de anticuerpo anti-CEA-agonista de TLR8 y un conjugado de CEA x CD40-agonista de TLR8 fueron activos en presencia de monocitos y células SKCO-1, tal como se mide mediante la producción de TNFa.
La figura 5 muestra que un conjugado de TROP-agonista de TLR8 fue activo de manera dependiente de la dosis en diversas líneas celulares que expresan TROP2.
La figura 6 muestra que un conjugado de TROP2-agonista de TLR8 fue activo de manera dependiente de la dosis en diversas líneas celulares que expresan TROP2.
La figura 7 muestra la inducción de TNF-a en células
Figure imgf000004_0001
SKBR3 por conjugados de aTROP2.
La figura 8 muestra la inducción de TNF-a en células
Figure imgf000004_0002
MCF7 por conjugados de aTROP2.
La figura 9 muestra la inducción de TNF-a en células
Figure imgf000004_0003
87 por conjugados de aHER2.
La figura 10 muestra la inducción de TNF-a en células MDA-MB-453 por conjugados de aHER2.
Descripción detallada de la invención
Aunque se han mostrado y descrito en el presente documento realizaciones preferidas de la presente invención, resultará obvio para los expertos en la técnica que tales realizaciones se proporcionan a modo de ejemplo únicamente. Ahora, a los expertos en la técnica se les ocurrirán numerosas variaciones, cambios y sustituciones sin apartarse de la invención. Debe entenderse que pueden emplearse diversas alternativas a las realizaciones de la invención descritas en el presente documento en la práctica de la invención. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la invención y que los métodos y las estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes queden cubiertos por las mismas.
La presente divulgación proporciona compuestos, conjugados y composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de enfermedades. En determinadas realizaciones, los compuestos de la divulgación son moduladores de TLR8. En determinadas realizaciones, los compuestos son agonistas de TLR8. Los receptores de tipo Toll (TLR) son una familia de receptores transmembrana que se expresan en células del sistema inmunitario tales como células dendríticas, macrófagos, monocitos, células T, células B, células NK y mastocitos, pero también en una variedad de células no inmunitarias, tales como células endoteliales, células epiteliales e incluso células tumorales. Los TLR pueden tener muchas isoformas, incluyendo TLR4, TLR7 y TLR8.
El TLR8 se localiza en el compartimento endolisosómico/fagosómico y se expresa predominantemente por células del linaje mieloide. La ligación de TLR conduce a la activación de rutas dependientes de NF- k B y de IRF con la secuencia de activación específica y la respuesta con respecto al TLR específico y el tipo de célula. Mientras que la expresión de TLR7 se produce principalmente en todos los subtipos de células dendríticas (DC y, en este caso, con una alta expresión en pDC, DC plasmocitoides) y puede inducirse en células B tras la estimulación con IFNa, la expresión de TLR8 está más bien restringida a monocitos, macrófagos y DC mieloides. La señalización de TLR8 a través de MyD88 puede activarse por ARN monocatenario bacteriano, agonistas de molécula pequeña y microARN. La activación de TLR8 da como resultado la producción de diversas citocinas proinflamatorias tales como IL-6, IL-12 y TNF-a así como la expresión potenciada de moléculas coestimuladoras, tales como CD80, CD86 y receptores de quimiocinas. Además, la activación de TLR8 puede inducir interferón de tipo I (IFNp) en monocitos humanos primarios.
Pueden usarse varios agonistas que seleccionan como diana la activación de diferentes TLR en diversas inmunoterapias, incluyendo adyuvantes de vacuna y en inmunoterapias contra el cáncer. Los agonistas de TLR pueden variar desde moléculas sencillas hasta macromoléculas complejas. Del mismo modo, los tamaños de agonistas de TLR pueden variar desde pequeños hasta grandes. Los agonistas de TLR pueden ser agonistas sintéticos o biosintéticos. Los agonistas de TLR también pueden ser moléculas de patrón molecular asociado a patógenos (PAMP).
Los compuestos de la presente divulgación pueden ser útiles para el tratamiento y la prevención, por ejemplo, vacunación, del cáncer, enfermedades autoinmunitarias, inflamación, septicemia, alergia, asma, rechazo de injerto, enfermedad de injerto contra huésped, inmunodeficiencias y enfermedades infecciosas.
En determinadas realizaciones, los compuestos tienen utilidad en el tratamiento del cáncer, o bien como agentes individuales o bien en terapia de combinación. En determinadas realizaciones, los compuestos tienen utilidad como inmunomoduladores de agente individual, adyuvantes de vacuna y en combinación con terapias convencionales contra el cáncer. En determinadas realizaciones, los compuestos se incorporan en un conjugado que puede utilizarse, por ejemplo, para potenciar una respuesta inmunitaria. En determinadas realizaciones, la divulgación proporciona conjugados de constructo de anticuerpo-compuesto de benzazepina y su uso para el tratamiento del cáncer.
Definiciones
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Todas las patentes y publicaciones a las que se hace referencia en el presente documento se incorporan como referencia.
Tal como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, la forma en singular “un”, “uno/una” y “el/la” incluye las referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.
Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” puede referirse a una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a, o es inmunológicamente reactiva con respecto a, un antígeno específico. El anticuerpo puede incluir, por ejemplo, fragmentos policlonales, monoclonales, modificados por ingeniería genética y de unión a antígeno de los mismos. Un anticuerpo puede ser, por ejemplo, murino, quimérico, humanizado, heteroconjugado, biespecífico, un diacuerpo, un triacuerpo o un tetracuerpo. El fragmento de unión a antígeno puede incluir, por ejemplo, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG y scFv.
Tal como se usa en el presente documento, un “dominio de unión a antígeno” se refiere a una región de una molécula que se une a un antígeno. Un dominio de unión a antígeno de la divulgación puede ser un dominio que puede unirse específicamente a un antígeno. Un dominio de unión a antígeno puede ser una porción de unión a antígeno de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Un dominio de unión a antígeno puede ser uno o más fragmentos de un anticuerpo que pueden conservar la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Un dominio de unión a antígeno puede ser un fragmento de unión a antígeno. Un dominio de unión a antígeno puede reconocer un único antígeno. Un dominio de unión a antígeno puede reconocer, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más antígenos.
Tal como se usa en el presente documento, un “constructo de anticuerpo” se refiere a una molécula, por ejemplo, una proteína, un péptido, un anticuerpo o una porción de los mismos, que contiene un dominio de unión a antígeno y un dominio Fc. Un constructo de anticuerpo puede reconocer, por ejemplo, múltiples antígenos.
Tal como se usa en el presente documento, las abreviaturas para los aminoácidos son convencionales y pueden ser las siguientes: alanina (A, Ala); arginina (R, Arg); asparagina (N, Asn); ácido aspártico (D, Asp); cisteína (C, Cys); ácido glutámico (E, Glu); glutamina (Q, Gln); glicina (G, Gly); histidina (H, His); isoleucina (I, Ile); leucina (L, Leu); lisina (K, Lys); metionina (M, Met); fenilalanina (F, Phe); prolina (P, Pro); serina (S, Ser); treonina (T, Thr); triptófano (W, Trp); tirosina (Y, Tyr); valina (V, Val). Otros aminoácidos incluyen citrulina (Cit); homocisteína (Hey); hidroxiprolina (Hyp); ornitina (Orn); y tiroxina (Thx).
“Conjugado”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un constructo de anticuerpo que se une, por ejemplo, se une covalentemente, o bien directamente o bien a través de un grupo de unión, a un compuesto o compuesto-grupo de unión descrito en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, un “dominio Fc” puede ser un dominio Fc de un anticuerpo o de una molécula distinta de anticuerpo que puede unirse a un receptor de Fc.
Tal como se usa en el presente documento, “reconocer” con respecto a interacciones de anticuerpo puede referirse a la asociación o unión entre un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo o una porción del mismo y un antígeno.
Tal como se usa en el presente documento, un “dominio de unión a diana” puede referirse a un constructo que contiene un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo o de una molécula distinta de anticuerpo que puede unirse al antígeno.
Tal como se usa en el presente documento, un “antígeno tumoral” puede ser una sustancia antigénica asociada con una célula tumoral o cancerosa, y puede desencadenar una respuesta inmunitaria en un huésped.
El término “sal” o “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a sales derivadas de una variedad de contraiones orgánicos e inorgánicos bien conocidos en la técnica. Pueden formarse sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables con ácidos inorgánicos y ácidos orgánicos. Los ácidos inorgánicos a partir de los cuales pueden derivarse las sales incluyen, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares. Los ácidos orgánicos a partir de los cuales pueden derivarse las sales incluyen, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido salicílico y similares. Las sales de adición de base farmacéuticamente aceptables pueden formarse con bases inorgánicas y orgánicas. Las bases inorgánicas a partir de las cuales pueden derivarse las sales incluyen, por ejemplo, sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Las bases orgánicas a partir de las cuales pueden derivarse las sales incluyen, por ejemplo, aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas incluyendo aminas sustituidas que se producen de manera natural, aminas cíclicas, resinas básicas de intercambio iónico y similares, específicamente tales como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina y etanolamina. En algunas realizaciones, la sal de adición de base farmacéuticamente aceptable se elige de sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio.
Las expresiones “administración parenteral” y “administrado por vía parenteral”, tal como se usan en el presente documento, significan modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, habitualmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, infusión e inyección intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal y intraesternal.
La expresión “farmacéuticamente aceptable” se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.
La expresión “excipiente farmacéuticamente aceptable” o “portador farmacéuticamente aceptable”, tal como se usa en el presente documento, significa un material, una composición o un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, un diluyente, excipiente, disolvente o material de encapsulación. Cada portador debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros componentes de la formulación y no perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorio; (9) aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles tales como propilenglicol; (11) polioles tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponantes tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) disoluciones tamponadas con fosfato; y (21) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.
La expresión “resto de direccionamiento” se refiere a una estructura que tiene una afinidad selectiva por una molécula diana en relación con otras moléculas no diana. El resto de direccionamiento se une a una molécula diana. Un resto de direccionamiento puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo, un péptido, un ligando, un receptor o una porción de unión de los mismos. La molécula biológica diana puede ser un receptor biológico u otra estructura de una célula, tal como un antígeno tumoral.
Constructo de anticuerpo
En el presente documento se divulgan constructos de anticuerpo que pueden usarse junto con compuestos de la divulgación. En determinadas realizaciones, los compuestos de la divulgación se unen, por ejemplo, se unen covalentemente, o bien directamente o bien a través de un grupo de unión, a un compuesto de la divulgación formando conjugados. En determinadas realizaciones, los conjugados de la divulgación están representados por la siguiente fórmula:
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en la que A es un constructo de anticuerpo especificado, L3 es un grupo de unión especificado, D es un compuesto o una sal especificado y n es desde 1 hasta 20. En determinadas realizaciones, n es desde 1 hasta 10, tal como desde 1 hasta 9, tal como desde 1 hasta 8, tal como desde 2 hasta 8, tal como desde 1 hasta 6, tal como desde 3 hasta 5 o tal como desde 1 hasta 3. En determinadas realizaciones, n es 4.
En determinadas realizaciones, un compuesto o una sal de la divulgación representado por D en la fórmula anterior puede denominarse en el presente documento fármaco, D, un compuesto de benzazepina, un compuesto inmunoestimulador, un ISC o una carga activa, particularmente cuando se hace referencia como parte de un conjugado. “LP”, “grupo de unión-carga activa”, “L3-D” o “compuesto-grupo de unión” puede usarse en el presente documento para referirse a un compuesto o a una sal de la divulgación unido a un grupo de unión.
Un constructo de anticuerpo de la divulgación puede contener, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más dominios de unión a antígeno. Un constructo de anticuerpo puede contener dos dominios de unión a antígeno en el que cada dominio de unión a antígeno puede reconocer el mismo antígeno. Un constructo de anticuerpo puede contener dos dominios de unión a antígeno en el que cada dominio de unión a antígeno puede reconocer antígenos diferentes. Un dominio de unión a antígeno puede estar en un armazón, en el que un armazón es una estructura de soporte para el dominio de unión a antígeno. Un dominio de unión a antígeno puede estar en un armazón distinto de anticuerpo. Un dominio de unión a antígeno puede estar en un armazón de anticuerpo. Un constructo de anticuerpo puede comprender un dominio de unión a antígeno en un armazón. El constructo de anticuerpo puede comprender una proteína de fusión de Fc. En algunas realizaciones, el constructo de anticuerpo es una proteína de fusión de Fc. Un dominio de unión a antígeno puede unirse específicamente a un antígeno tumoral. Un dominio de unión a antígeno puede unirse específicamente a un antígeno que es al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 99% o el 100% homólogo a un antígeno tumoral. Un dominio de unión a antígeno puede unirse específicamente a un antígeno en una célula presentadora de antígeno (APC). Un dominio de unión a antígeno puede unirse específicamente a un antígeno que es al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 99% o el 100% homólogo a un antígeno en una célula presentadora de antígeno (APC).
Un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender una o más CDR de cadena ligera (LC) y una o más CDR de cadena pesada (HC). Por ejemplo, un dominio de unión de anticuerpo de un anticuerpo puede comprender una o más de las siguientes: una región determinante de complementariedad de cadena ligera 1 (CDR1 de LC), una región determinante de complementariedad de cadena ligera 2 (CDR2 de LC) o una región determinante de complementariedad de cadena ligera 3 (CDR3 de LC). En otro ejemplo, un dominio de unión de anticuerpo puede comprender una o más de las siguientes: una región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (CDR1 de HC), una región determinante de complementariedad de cadena pesada 2 (CDR2 de HC) o una región determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (CDR3 de HC). Como ejemplo adicional, un dominio de unión de anticuerpo de un anticuerpo puede comprender una o más de las siguientes: CDR1 de LC, CDR2 de LC, CDR3 de LC, CDR1 de HC, CDR2 de HC y CDR3 de HC.
El dominio de unión a antígeno de un constructo de anticuerpo puede seleccionarse de cualquier dominio que se una al antígeno, incluyendo, pero sin limitarse a, de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada (V h ) y un dominio variable de cadena ligera (V l ), un DARPin, un afímero, un avímero, una knotina, un monocuerpo, una abrazadera de afinidad, un ectodominio, un ectodominio de receptor, un receptor, un receptor de células T o un receptor de células T recombinante.
El dominio de unión a antígeno de un constructo de anticuerpo puede ser al menos el 80% homólogo a un dominio de unión a antígeno seleccionado de, pero sin limitarse a, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante o un fragmento funcional de los mismos, por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada (V h ) y un dominio variable de cadena ligera (V l ), un DARPin, un afímero, un avímero, una knotina, un monocuerpo, una abrazadera de afinidad, un ectodominio, un ectodominio de receptor, un receptor, una citocina, un ligando, una inmunocitocina, un receptor de células T o un receptor de células T recombinante.
En determinadas realizaciones, un constructo de anticuerpo de la divulgación comprende un dominio Fc que puede comprender además un dominio Fc en el que el dominio Fc puede ser la parte de una región Fc que interacciona con los receptores de Fc. El dominio Fc de un constructo de anticuerpo puede interaccionar con los receptores de Fc (FcR) hallados en células inmunitarias. El dominio Fc también puede mediar la interacción entre moléculas y células efectoras, lo que puede conducir a la activación del sistema inmunitario. El dominio Fc puede derivarse de los isotipos de anticuerpo IgG, IgA o IgD, y puede comprender dos fragmentos de proteína idénticos, que se derivan de los dominios constantes segundo y tercero de las cadenas pesadas de anticuerpo. En un dominio Fc derivado de un isotipo de anticuerpo IgG, la región Fc puede comprender un sitio de N-glicosilación altamente conservado, que puede ser esencial para los efectos aguas abajo mediados por FcR. El dominio Fc puede derivarse de los isotipos de anticuerpo IgM o IgE, en los que el dominio Fc puede comprender tres dominios constantes de cadena pesada.
Un dominio Fc puede interaccionar con diferentes tipos de FcR. Los diferentes tipos de FcR pueden incluir, por ejemplo, FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA, FcyRIIIB, FcaRI, Fc|iR, FceRI, FceRII y FcRn. Los FcR pueden estar ubicados en la membrana de determinadas células inmunitarias, incluyendo, por ejemplo, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas foliculares, eosinófilos, basófilos, plaquetas y mastocitos. Una vez que el FcR se acopla al dominio Fc, el FcR puede iniciar funciones, incluyendo, por ejemplo, aclaramiento de un complejo antígeno-anticuerpo a través de endocitosis mediada por receptor, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP) y transmisión de señales desencadenada por ligandos a través de la membrana plasmática, que pueden dar como resultado alteraciones en la secreción, la exocitosis y el metabolismo celular. Los FcR pueden enviar señales cuando los FcR se agregan por anticuerpos y antígenos multivalentes en la superficie celular. La agregación de los FcR con motivos de activación inmunorreceptores basados en tirosina (ITAM) pueden activar secuencialmente las tirosina cinasas de la familia SRC y las tirosina cinasas de la familia SYK. El ITAm comprende una secuencia YxxL repetida dos veces que flanquea siete residuos variables. Las cinasas de SRC y SYK pueden conectar las señales transducidas con rutas de activación comunes.
Un anticuerpo de la divulgación puede consistir en dos cadenas ligeras de proteína idénticas y dos cadenas pesadas de proteína idénticas, todas ellas unidas covalentemente mediante enlaces disulfuro. Las regiones N-terminales de las cadenas ligeras y pesadas juntas pueden formar el sitio de reconocimiento de antígeno de un anticuerpo. Estructuralmente, diversas funciones de un anticuerpo pueden limitarse a dominios (es decir, regiones) de proteína discretos. Los sitios que pueden reconocer y unirse al antígeno pueden consistir en tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que pueden estar dentro de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera en el extremo N-terminal de la cadena pesada y la cadena ligera. Los dominios constantes pueden proporcionar la estructura general del anticuerpo y pueden no estar implicados directamente en la unión del anticuerpo a un antígeno, pero sí estar implicados en diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, y pueden unirse a receptores de Fc. Los dominios constantes pueden incluir una región Fc. Los dominios constantes pueden incluir un dominio Fc. Los dominios de cadenas ligeras y pesadas naturales pueden tener las mismas estructuras generales, y cada dominio puede comprender cuatro regiones de entramado, cuyas secuencias pueden ser algo conservadas, conectadas por tres regiones hipervariables o CDR. Las cuatro regiones de entramado (FR) pueden adoptar en gran medida una conformación de lámina p y las CDR pueden formar bucles que conectan, y en algunos aspectos forman parte de, la estructura de lámina p. Las CDR en cada cadena pueden mantenerse muy próximas por las regiones de entramado y, con las CDR de la otra cadena, pueden contribuir a la formación del sitio de unión a antígeno.
Un constructo de anticuerpo puede comprender una cadena ligera de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez modificaciones y, en determinadas realizaciones, no más de 40, 35, 30, 25, 20, 15 ó 10 modificaciones de la secuencia de aminoácidos en relación con la secuencia de aminoácidos natural u original. Un constructo de anticuerpo puede comprender una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez modificaciones y, en determinadas realizaciones, no más de 40, 35, 30, 25, 20, 15 ó 10 modificaciones de la secuencia de aminoácidos en relación con la secuencia de aminoácidos natural u original.
Un anticuerpo de un constructo de anticuerpo puede incluir un anticuerpo de cualquier tipo, que puede asignarse a diferentes clases de inmunoglobinas, por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Varias clases diferentes pueden dividirse adicionalmente en isotipos, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Un anticuerpo puede comprender además una cadena ligera y una cadena pesada, a menudo más de una cadena. Las regiones constantes de cadena pesada (Fc) que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas pueden ser a,8,e,y y ,^ respectivamente. Las cadenas ligeras pueden ser una de o bien kappa ( k ) o bien lambda (X), basándose en las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes. La región Fc puede contener un dominio Fc. Un receptor de Fc puede unirse a un dominio Fc. Los constructos de anticuerpo también pueden incluir cualquier fragmento o formas recombinantes de los mismos, incluyendo, pero sin limitarse a, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), “T-bodies”, anticalinas, centirinas, aficuerpos, anticuerpos de dominio o pepticuerpos.
Un constructo de anticuerpo puede comprender un fragmento de anticuerpo. Un fragmento de anticuerpo puede incluir (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios V l , V h , C l y C h1 (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región bisagra; y (iii) un fragmento Fv que consiste en los dominios V l y V h de un único brazo de un anticuerpo. Aunque los dos dominios del fragmento Fv, V l y V h , pueden estar codificados por genes independientes, pueden estar unidos mediante un grupo de unión sintético para formar una única cadena de proteína en la que las regiones V l y V h se aparean para formar moléculas monovalentes.
Los restos F(ab')2 y Fab' pueden producirse mediante ingeniería genética o mediante el tratamiento de una inmunoglobulina (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) con una proteasa tal como pepsina y papaína, y pueden incluir un fragmento de anticuerpo generado mediante la digestión de la inmunoglobulina cercana a los enlaces disulfuro existentes entre las regiones bisagra en cada una de las dos cadenas H. El fragmento Fab también puede contener el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (C h - i ) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' pueden diferir de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxilo-terminal del dominio de cadena pesada Ch1, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo.
Un Fv puede ser el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento de antígeno y de unión a antígeno. Esta región puede consistir en un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y una cadena ligera en asociación estrecha non covalente. En esta configuración, las tres regiones hipervariables de cada dominio variable pueden interaccionar para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero Vh-Vl. Un dominio variable individual (o la mitad de un Fv que comprende únicamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) puede reconocer y unirse al antígeno, aunque la unión puede tener una afinidad más baja que la afinidad del sitio de unión completo.
Un anticuerpo puede incluir una región Fc que comprende un dominio Fc. El dominio Fc de un anticuerpo puede interaccionar con los FcR encontrados en células inmunitarias. El dominio Fc también puede mediar la interacción entre moléculas y células efectoras, lo que puede conducir a la activación del sistema inmunitario. En los isotipos de anticuerpo IgG, IgA e IgD, la región Fc puede comprender dos fragmentos de proteína idénticos, que pueden derivarse de los dominios constantes segundo y tercero de las cadenas pesadas de anticuerpo. En los isotipos de anticuerpo IgM e IgE, las regiones Fc pueden comprender tres dominios constantes de cadena pesada. En el isotipo de anticuerpo IgG, las regiones Fc pueden comprender un sitio de N-glicosilación altamente conservado, que puede ser importante para los efectos aguas abajo mediados por FcR.
Un anticuerpo usado en el presente documento puede ser “humanizado”. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) pueden ser inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otros subdominios de unión a diana de anticuerpos), que pueden contener secuencias mínimas derivadas de una inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado puede comprender sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones de entramado son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana.
Un anticuerpo descrito en el presente documento puede ser un anticuerpo humano. Tal como se usa en el presente documento, los “anticuerpos humanos” pueden incluir anticuerpos que tienen, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y pueden incluir anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas que no expresan inmunoglobulinas endógenas. Los anticuerpos humanos pueden producirse usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que sí pueden expresar genes de inmunoglobulina humanos. Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado pueden generarse usando selección guiada. En este enfoque, puede usarse un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo.
Un anticuerpo descrito en el presente documento puede ser un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo de dominio variable doble (DVD). Los anticuerpos biespecíficos y de DVD pueden ser anticuerpos monoclonales, a menudo humanos o humanizados, que pueden tener especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes.
Un anticuerpo descrito en el presente documento puede ser un anticuerpo derivatizado. Por ejemplo, los anticuerpos derivatizado pueden modificarse mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína.
Un anticuerpo descrito en el presente documento puede tener una secuencia que se ha modificado para alterar al menos una función efectora biológica mediada por la región constante en relación con la secuencia de tipo natural correspondiente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el anticuerpo puede modificarse para reducir al menos una función efectora biológica mediada por la región constante en relación con un anticuerpo no modificado, por ejemplo, unión reducida al receptor de Fc (FcR). La unión al FcR puede reducirse, por ejemplo, mutando el segmento de región constante de inmunoglobulina del anticuerpo en regiones particulares necesarias para las interacciones de FcR.
Un anticuerpo o dominio Fc, tal como se describe en el presente documento, puede modificarse para adquirir o mejorar al menos una función efectora biológica mediada por la región constante en relación con un anticuerpo o dominio Fc no modificado, por ejemplo, para potenciar las interacciones de FcyR. Por ejemplo, puede producirse un anticuerpo con una región constante que se une a FcyRIIA, FcyRIIB y/o FcyRIIIA con una afinidad mayor que la región constante de tipo natural correspondiente según los métodos descritos en el presente documento. Puede producirse un dominio Fc que se une a FcyRIIA, FcyRIIB y/o FcyRIIIA con una afinidad mayor que el dominio Fc de tipo natural correspondiente según los métodos descritos en el presente documento.
En determinadas realizaciones, el constructo de anticuerpo comprende un dominio de unión a antígeno y un dominio Fc de IgG, en el que una Kd para la unión del dominio de unión a antígeno a un primer antígeno en presencia del compuesto inmunoestimulador es menor de aproximadamente 100 nM y no mayor de aproximadamente 100 veces la Kd para la unión del dominio de unión a antígeno al primer antígeno en ausencia del compuesto inmunoestimulador. En determinadas realizaciones, el constructo de anticuerpo comprende una Kd para la unión del dominio Fc de IgG a un receptor de Fc en presencia del compuesto inmunoestimulador que no es mayor de aproximadamente 100 veces la Kd para la unión del dominio Fc de IgG al receptor de Fc en ausencia del compuesto inmunoestimulador. En determinadas realizaciones, el primer antígeno es HER2.
En determinadas realizaciones, el constructo de anticuerpo comprende un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado o una porción de unión a antígeno de los mismos, por ejemplo, un anticuerpo contra HER2 humanizado. El constructo de anticuerpo comprende un anticuerpo contra HER2, por ejemplo, pertuzumab, trastuzumab o una porción de unión a antígeno de los mismos. En determinadas realizaciones, el constructo de anticuerpo comprende las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de pertuzumab (SEQ ID NO:1 y 2). En determinadas realizaciones, el constructo de anticuerpo comprende la CDR1 de LC, CDR2 de Lc y CDR3 de LC de la región variable de cadena ligera de pertuzumab (SEQ ID NO:2) y la CDR1 de HC, Cd R2 de HC y CDR3 de HC de la región variable de cadena pesada de pertuzumab (SEQ ID NO:1), tal como se determina mediante el índice de Kabat. En determinadas realizaciones, el constructo de anticuerpo comprende la CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC de la región variable de cadena ligera de pertuzumab (s Eq ID NO:2) y la CDR1 de HC, CDR2 de HC y CDR3 de HC de la región variable de cadena pesada de pertuzumab (SEQ ID NO:1), tal como se determina mediante IMGT. En determinadas realizaciones, el constructo de anticuerpo comprende las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de trastuzumab (SEQ ID NO:7 y 8). En determinadas realizaciones, el constructo de anticuerpo comprende la CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC de la región variable de cadena ligera de trastuzumab (SEQ ID NO:8) y la CDR1 de HC, CDR2 de HC y CDR3 de HC de la región variable de cadena pesada de trastuzumab (SEQ ID NO:7), tal como se determina mediante el índice de Kabat. En determinadas realizaciones, el constructo de anticuerpo comprende la CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC de la región variable de cadena ligera de trastuzumab (s Eq ID NO:8) y la CDR1 de HC, CDR2 de HC y CDR3 de HC de la región variable de cadena pesada de trastuzumab (SEQ ID n O:7), tal como se determina mediante IMGT.
Un constructo de anticuerpo puede comprender un anticuerpo con modificaciones de al menos un residuo de aminoácido. Las modificaciones pueden ser sustituciones, adiciones, mutaciones, deleciones o similares. Una modificación de anticuerpo puede ser una inserción de un aminoácido no natural.
A continuación en la tabla A se ilustran secuencias de Vh y secuencias de Vl de constructos de anticuerpo a modo de ejemplo.
Tabla A: secuencias de Vh y secuencias de Vl de constructos de anticuerpo a modo de ejemplo
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Dominio de unión a diana de un constructo de anticuerpo
Un constructo de anticuerpo puede comprender además un dominio de unión a diana. Un dominio de unión a diana puede comprender un dominio que se une a una diana. Una diana puede ser un antígeno. Un dominio de unión a diana puede comprender un dominio de unión a antígeno. Un dominio de unión a diana puede ser un dominio que puede unirse específicamente a un antígeno. Un dominio de unión a diana puede ser una porción de unión a antígeno de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo. Un dominio de unión a diana puede ser uno o más fragmentos de un anticuerpo que pueden conservar la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Un dominio de unión a diana puede ser cualquier fragmento de unión a antígeno. Un dominio de unión a diana puede estar en un armazón, en el que un armazón es una estructura de soporte para el dominio de unión a antígeno. Un dominio de unión a diana puede comprender un dominio de unión a antígeno en un armazón.
Un dominio de unión a diana puede comprender un dominio de unión a antígeno que puede referirse a una porción de un anticuerpo que comprende la porción de reconocimiento de antígeno, es decir, una región variable determinante antigénica de un anticuerpo suficiente para conferir reconocimiento y unión de la porción de reconocimiento de antígeno a una diana, tal como un antígeno, es decir, el epítopo. Un dominio de unión a diana puede comprender un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo. En determinadas realizaciones, un dominio de unión a diana es un agonista de CD40.
Un Fv puede ser el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento de antígeno y de unión a antígeno. Esta región puede consistir en un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y de una cadena ligera en asociación estrecha no covalente. En esta configuración, las tres regiones hipervariables de cada dominio variable pueden interaccionar para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero V h -V l . Un dominio variable individual (o la mitad de un Fv que comprende únicamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) puede reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad más baja que el sitio de unión completo.
Un dominio de unión a diana puede ser al menos el 80% homólogo a un dominio de unión a antígeno seleccionado de, pero sin limitarse a, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante o un fragmento funcional de los mismos, por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada (V h ) y un dominio variable de cadena ligera (V l ), un fragmento variable de cadena sencilla (scFv), un DARPin, un afímero, un avímero, una knotina, un monocuerpo, una abrazadera de afinidad, un ectodominio, un ectodominio de receptor, un receptor, una citocina, un ligando, una inmunocitocina, un receptor de células T o un receptor de células T recombinante.
Un dominio de unión a diana puede unirse a un constructo de anticuerpo. Por ejemplo, un constructo de anticuerpo puede fusionarse con un dominio de unión a diana para crear una fusión de constructo de anticuerpo-dominio de unión a diana. La fusión de constructo de anticuerpo-dominio de unión a diana puede ser el resultado de la expresión de la secuencia de ácido nucleico del dominio de unión a diana en marco con la secuencia de ácido nucleico del constructo de anticuerpo. La fusión de constructo de anticuerpo-dominio de unión a diana puede ser el resultado de la codificación del constructo de anticuerpo con el dominio de unión a diana por parte de una secuencia de nucleótidos genética en marco o de una secuencia de péptidos contigua. Como otro ejemplo, un dominio de unión a diana puede unirse a un constructo de anticuerpo. Un dominio de unión a diana puede unirse a un constructo de anticuerpo mediante conjugación química. Un dominio de unión a diana puede unirse a un extremo terminal de una región Fc. Un dominio de unión a diana puede unirse a un extremo terminal de una región Fc. Un dominio de unión a diana puede unirse a un extremo terminal de un constructo de anticuerpo. Un dominio de unión a diana puede unirse a un extremo terminal de un anticuerpo. Un dominio de unión a diana puede unirse a una cadena ligera de un anticuerpo. Un dominio de unión a diana puede unirse a un extremo terminal de una cadena ligera de un anticuerpo. Un dominio de unión a diana puede unirse a una cadena pesada de un anticuerpo. Un dominio de unión a diana puede unirse a un extremo terminal de una cadena pesada de un anticuerpo. El extremo terminal puede ser un extremo C-terminal. Un constructo de anticuerpo puede unirse a 1, 2, 3 y/ó 4 dominios de unión a diana. El dominio de unión a diana puede dirigir el constructo de anticuerpo a, por ejemplo, una célula o un tipo de célula particular. Un dominio de unión a diana de un constructo de anticuerpo puede seleccionarse con el fin de reconocer un antígeno, por ejemplo, un antígeno expresado en una célula inmunitaria. Un antígeno puede ser un péptido o un fragmento del mismo. Un antígeno puede expresarse en una célula presentadora de antígeno. Un antígeno puede expresarse en una célula dendrítica, un macrófago o una célula B. Como otro ejemplo, un antígeno puede ser un antígeno tumoral. El antígeno tumoral puede ser cualquier antígeno tumoral descrito en el presente documento. Cuando se unen múltiples dominios de unión a diana a un constructo de anticuerpo, los dominios de unión a diana pueden unirse al mismo antígeno. Cuando se unen múltiples dominios de unión a diana a un constructo de anticuerpo, los dominios de unión a diana pueden unirse a antígenos diferentes.
En determinadas realizaciones, un constructo de anticuerpo descrito en el presente documento se une específicamente a un segundo antígeno. En determinadas realizaciones, el dominio de unión a diana se une, por ejemplo, se une covalentemente, al constructo de anticuerpo en un extremo C-terminal del dominio Fc.
Compuestos
Lo siguiente es una discusión de compuestos y sales de los mismos que pueden usarse en los métodos de la divulgación. Los compuestos y las sales descritos en el presente documento se unen covalentemente a grupos de unión, L3, que, además, se unen covalentemente a constructos de anticuerpo. La presente invención usa un compuesto o una sal de uno cualquiera de los compuestos 1.50, 1.60 y 1.67 a continuación.
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En determinados aspectos de la presente divulgación, uno cualquiera de los compuestos 1.1 a 1.67 se une covalentemente a un grupo de unión (L3). El grupo de unión puede unirse covalentemente en cualquier posición, si la valencia lo permite, en un compuesto o una sal de los compuestos 1.1 a 1.67. El grupo de unión puede unirse a una amina en el núcleo de benzazepina. El grupo de unión puede unirse a un átomo de nitrógeno o de oxígeno que puede sustituirse de uno cualquiera de los compuestos 1.1a 1.67. El grupo de unión puede comprender un resto reactivo, por ejemplo, un electrófilo, que puede reaccionar para formar un enlace covalente con un resto de un constructo de anticuerpo tal como, por ejemplo, un residuo de lisina, serina, treonina, cisteína, tirosina, ácido aspártico, glutamina, aminoácido no natural o ácido glutámico de cualquier anticuerpo. En algunos aspectos de la presente divulgación, un compuesto o una sal de los compuestos 1.1 a 1.67 puede unirse covalentemente a través del grupo de unión a un constructo de anticuerpo.
Un compuesto puede estar representado por
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una sal del mismo. Un compuesto
puede estar representado por
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o una sal del mismo. Un compuesto puede estar
representado por
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una sal del mismo. Un compuesto puede estar representado
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.
Las entidades químicas que tienen dobles enlaces carbono-carbono o dobles enlaces carbono-nitrógeno pueden existir en forma Z o E (o forma cis o trans). Además, algunas entidades químicas pueden existir en diversas formas tautoméricas. A menos que se especifique lo contrario, se pretende que los compuestos descritos en el presente documento incluyan todas las formas Z, E y también las tautoméricas.
Un “tautómero” se refiere a una molécula en la que es posible el desplazamiento de un protón de un átomo de una molécula a otro átomo de la misma molécula. Los compuestos presentados en el presente documento, en determinadas realizaciones, existen como tautómeros. En circunstancias en las que es posible la tautomerización, existirá un equilibrio químico de los tautómeros. La razón exacta de los tautómeros depende de varios factores, incluyendo el estado físico, la temperatura, el disolvente y el pH. Algunos ejemplos de equilibrio tautomérico incluyen:
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Los compuestos divulgados en el presente documento, en algunas realizaciones, se usan en diferentes formas isotópicas enriquecidas, por ejemplo, enriquecidas en el contenido de 2H, 3H, 11C, 13C y/o 14C. En una realización particular, el compuesto está deuterado en al menos una posición. Tales formas deuteradas pueden elaborarse mediante el procedimiento descrito en las patentes estadounidenses n.os 5.846.514 y 6.334.997. Tal como se describe en las patentes estadounidenses n.os 5.846.514 y 6.334.997, la deuteración puede mejorar la eficacia y/o la estabilidad metabólica, aumentando de ese modo la duración de la acción de los fármacos.
A menos que se indique lo contrario, se pretende que los compuestos descritos en el presente documento incluyan compuestos que difieren únicamente en la presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, los compuestos que tienen las presentes estructuras, salvo el reemplazo de un hidrógeno por un deuterio o tritio, o el reemplazo de un carbono por carbono enriquecido en 13C o 14C, están dentro del alcance de la presente divulgación.
Los compuestos de la presente divulgación contienen opcionalmente proporciones no naturales de isótopos atómicos en uno o más átomos que constituyen tales compuestos. Por ejemplo, los compuestos pueden marcarse con isótopos tales como, por ejemplo, deuterio (2H), tritio (3H), yodo-125 (125I) o carbono-14 (14C). La sustitución isotópica con 2H,
11C, 13C, 14C, 15C, 12N, 13N, 15N, 16N, 16O, 17O, 14F, 15F, 16F, 17F, 18F, 33S, 34S, 35S, 36S, 35Cl, 37Cl, 79Br, todas ellas contempladas. Todas las variaciones isotópicas de los compuestos de la presente invención, ya sean radiactivas o no, están abarcadas dentro del alcance de la presente invención.
En determinadas realizaciones, los compuestos divulgados en el presente documento tienen algunos o la totalidad de los átomos de 1H reemplazados por átomos de 2H. Los métodos de síntesis de compuestos que contienen deuterio se conocen en la técnica e incluyen, únicamente a modo de ejemplo no limitativo, los siguientes métodos de síntesis.
Los compuestos sustituidos con deuterio se sintetizan usando diversos métodos tales como los descritos en: Dean, Dennis C.; Editor. Recent Advances in the Synthesis and Applications of Radiolabeled Compounds for Drug Discovery and Development. [En: Curr., Pharm. Des., 2000; 6(10)] 2000, pág. 110; George W.; Varma, Rajender S. The Synthesis of Radiolabeled Compounds via Organometallic Intermediates, Tetrahedron, 1989, 45(21), 6601-21; y Evans, E.
Anthony. Synthesis of radiolabeled compounds, J. Radioanal. Chem., 1981,64(1-2), 9-32.
Los materiales de partida deuterados están fácilmente disponibles y están sujetos a los métodos de síntesis descritos en el presente documento para proporcionar la síntesis de compuestos que contienen deuterio. Hay una gran cantidad de reactivos y elementos estructurales que contienen deuterio disponibles comercialmente a partir de proveedores de productos químicos tales como Aldrich Chemical Co.
Los compuestos de la presente invención también incluyen formas cristalinas y amorfas de esos compuestos, sales farmacéuticamente aceptables y metabolitos activos de estos compuestos que tienen el mismo tipo de actividad, incluyendo, por ejemplo, polimorfos, pseudopolimorfos, solvatos, hidratos, polimorfos no solvatados (incluyendo anhídridos), polimorfos conformacionales y formas amorfas de los compuestos, así como mezclas de los mismos.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método que comprende administrar un conjugado, un compuesto o una sal tal como se define en la reivindicación 1 a un sujeto que lo necesita.
En algunos aspectos, los compuestos de la divulgación muestran unión selectiva o propiedades agonistas para un receptor con respecto a otro receptor. En algunas realizaciones, un compuesto descrito en el presente documento se une a o modula de manera selectiva la actividad de un receptor de tipo Toll con respecto a otro, por ejemplo, TLR8 y
TLR7. Por ejemplo, un compuesto o una sal puede tener una unión más débil a TLR7 en comparación con TLR8, tal como se mide mediante los valores de Kd, por ejemplo, la Kd para TLR7 de un compuesto es dos veces o más de dos veces la Kd para TLR8, o un orden de magnitud o mayor, o incluso dos órdenes de magnitud o mayor, que la Kd para
TLR8. En determinados aspectos, un compuesto o una sal tiene una mayor actividad para un receptor de tipo Toll con respecto a otro, por ejemplo, TLR8 y TLR7. En determinados aspectos, un compuesto de la divulgación agoniza TLR8 con una CE5o de 500 nM o menos, mientras que el mismo compuesto agoniza TLR7 con una DE5o de más de 1 ^M.
En determinados aspectos, un compuesto de la divulgación agoniza TLR8 con una CE50 de al menos un orden de magnitud o incluso dos órdenes de magnitud menor que la cantidad del mismo compuesto requerida para mostrar un efecto agonista sobre TLR7.
En la presente divulgación se incluyen sales, particularmente sales farmacéuticamente aceptables, de los compuestos descritos en el presente documento. Los compuestos de la presente divulgación que poseen un grupo funcional suficientemente ácido, un grupo funcional suficientemente básico o ambos grupos funcionales pueden reaccionar con cualquiera de varias bases inorgánicas y ácidos inorgánicos y orgánicos para formar una sal. Alternativamente, los compuestos que están inherentemente cargados, tales como aquellos con un nitrógeno cuaternario, pueden formar una sal con un contraión apropiado, por ejemplo, un haluro tal como bromuro, cloruro o fluoruro, particularmente bromuro.
Los compuestos descritos en el presente documento pueden existir, en algunos casos, como diastereómeros, enantiómeros u otras formas estereoisoméricas. Los compuestos presentados en el presente documento incluyen todas las formas diastereoméricas, enantioméricas y epiméricas, así como mezclas apropiadas de las mismas. La separación de estereoisómeros puede realizarse mediante cromatografía o mediante la formación de diastereómeros y separación por recristalización, o cromatografía, o cualquier combinación de los mismos (Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen, “Enantiomers, Racemates and Resolutions”, John Wiley and Sons, Inc., 1981, incorporado en el presente documento mediante referencia para esta divulgación). Los estereoisómeros también pueden obtenerse mediante síntesis estereoselectiva.
Los métodos y las composiciones descritos en el presente documento incluyen el uso de formas amorfas así como formas cristalinas (también conocidas como polimorfos). Los compuestos descritos en el presente documento pueden estar en forma de sales farmacéuticamente aceptables. Además, los metabolitos activos de estos compuestos que tienen el mismo tipo de actividad se incluyen en el alcance de la presente divulgación. Además, los compuestos descritos en el presente documento pueden existir en formas no solvatadas así como solvatadas con disolventes farmacéuticamente aceptables tales como agua, etanol y similares. También se considera que en el presente documento se divulgan las formas solvatadas de los compuestos presentados en el presente documento.
En determinados aspectos, los compuestos o las sales pueden ser profármacos, por ejemplo, en los que un hidroxilo en el compuesto original se presenta como un éster o un carbonato, o un ácido carboxílico presente en el compuesto original se presenta como un éster. Se pretende que el término “profármaco” abarque compuestos que, en condiciones fisiológicas, se conviertan en los agentes farmacéuticos de la presente divulgación. Un método para elaborar un profármaco es incluir uno o más restos seleccionadas que se hidrolizan en condiciones fisiológicas para revelar la molécula deseada. En otras realizaciones, el profármaco se convierte mediante una actividad enzimática del animal huésped, tal como células diana específicas en el animal huésped. Por ejemplo, los ésteres o carbonatos (por ejemplo, ésteres o carbonatos de alcoholes o ácidos carboxílicos y ésteres de ácidos fosfónicos) son profármacos preferidos de la presente divulgación.
Las formas de profármaco de los compuestos descritos en el presente documento, en los que el profármaco se metaboliza in vivo para producir un compuesto tal como se expone en el presente documento, se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones. En algunos casos, algunos de los compuestos descritos en el presente documento pueden ser un profármaco para otro derivado o compuesto activo.
Los profármacos suelen ser útiles porque, en algunas situaciones, pueden ser más fáciles de administrar que el fármaco original. Por ejemplo, pueden estar biodisponibles mediante administración oral mientras que el fármaco original no. Los profármacos pueden ayudar a potenciar la permeabilidad celular de un compuesto en relación con el fármaco original. El profármaco también puede tener una solubilidad mejorada en las composiciones farmacéuticas con respecto al fármaco original. Los profármacos pueden diseñarse como derivados de fármaco reversibles para su uso como modificadores para potenciar el transporte del fármaco a tejidos específicos del sitio o para aumentar la residencia del fármaco en el interior de una célula.
En algunas realizaciones, el diseño de un profármaco aumenta la lipofilia del agente farmacéutico. En algunas realizaciones, el diseño de un profármaco aumenta la solubilidad efectiva en agua. Véase, por ejemplo, Fedorak et al., Am. J. Physiol., 269:G210-218 (1995); McLoed et al., Gastroenterol, 106:405-413 (1994); Hochhaus et al., Biomed. Chrom., 6:283-286 (1992); J. Larsen y H. Bundgaard, Int. J. Pharmaceutics, 37, 87 (1987); J. Larsen et al., Int. J. Pharmaceutics, 47, 103 (1988); Sinkula et al., J. Pharm. Sci., 64:181-210 (1975); T. Higuchi y V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems, vol. 14 de la A.C.S. Symposium Series; y Edward B. Roche, Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, todos incorporados en el presente documento para tal divulgación). Según otra realización, la presente divulgación proporciona métodos de producción de los compuestos anteriormente definidos. Los compuestos pueden sintetizarse usando técnicas convencionales. Ventajosamente, estos compuestos se sintetizan de manera conveniente a partir de materiales de partida fácilmente disponibles.
Las transformaciones y metodologías de química sintética útiles para sintetizar los compuestos descritos en el presente documento se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, las descritas en R. Larock, Comprehensive Organic Transformations (1989); T. W. Greene y P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2a ed. (1991); L. Fieser y M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis (1994); y L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis (1995).
Grupos de unión
Los compuestos y las sales descritos en el presente documento se unen a grupos de unión especificados. En general, un grupo de unión también se denomina en el presente documento L3, por ejemplo, un grupo de unión peptídico. El grupo de unión también se une a un constructo de anticuerpo y se denomina conjugado de constructo de anticuerpo o conjugado. Los grupos de unión de los conjugados descritos en el presente documento pueden no afectar a la unión de porciones activas de un conjugado, por ejemplo, dominios de unión a antígeno, dominios Fc, dominios de unión a diana, anticuerpos, agonistas o similares, a una diana, que puede ser una pareja de unión relacionada tal como un antígeno. Un conjugado puede comprender múltiples grupos de unión, teniendo cada uno uno o más compuestos unidos. Estos grupos de unión pueden ser los mismos grupos de unión o grupos de unión diferentes. En la sección anterior titulada “Compuestos” se describen algunos grupos de unión (L3) a modo de ejemplo, y en esta sección se describen grupos de unión adicionales.
Un grupo de unión puede ser corto, flexible, rígido, escindible, no escindible, hidrófilo o hidrófobo. Un grupo de unión puede contener segmentos que tienen características diferentes, tales como segmentos de flexibilidad o segmentos de rigidez. El grupo de unión puede ser químicamente estable frente a entornos extracelulares, por ejemplo, químicamente estable en el torrente sanguíneo, o puede incluir uniones que no son estables o que son selectivamente estables. El grupo de unión puede incluir uniones que se diseñan para escindirse y/o romperse o descomponerse de otro modo de manera específica o inespecífica en el interior de las células. Un grupo de unión escindible puede ser sensible a enzimas. Un grupo de unión escindible puede escindirse por enzimas tales como proteasas. Un grupo de unión escindible puede comprender un grupo de unión valina-citrulina o un péptido valina-alanina. Un grupo de unión que contiene valina-citrulina o valina-alanina puede contener un grupo pentafluorofenilo. Un grupo de unión que contiene valina-citrulina o valina-alanina puede contener un grupo maleimida o succinimida. Un grupo de unión que contiene valina-citrulina o valina-alanina puede contener un grupo alcohol para-aminobencílico (PABA) o carbamato de para-aminobencilo (PABC).
Un grupo de unión que contiene valina-citrulina o valina-alanina puede contener un grupo PABA y un grupo pentafluorofenilo. Un grupo de unión que contiene valina-citrulina o valina-alanina puede contener un grupo PABA y un grupo maleimida o succinimida.
Un grupo de unión no escindible puede ser insensible a la proteasa. Un grupo de unión no escindible puede ser un grupo de unión de maleimidocaproílo. Un grupo de unión de maleimidocaproílo puede comprender N-maleimidometilciclohexano-1-carboxilato. Un grupo de unión de maleimidocaproílo puede contener un grupo succinimida. Un grupo de unión de maleimidocaproílo puede contener un grupo pentafluorofenilo. Un grupo de unión puede ser una combinación de un grupo maleimidocaproílo y una o más moléculas de polietilenglicol. Un grupo de unión puede ser un grupo de unión de maleimida-PEG4. Un grupo de unión puede ser una combinación de un grupo de unión de maleimidocaproílo que contiene un grupo succinimida y una o más moléculas de polietilenglicol. Un grupo de unión puede ser una combinación de un grupo de unión de maleimidocaproílo que contiene un grupo pentafluorofenilo y una o más moléculas de polietilenglicol. Un grupo de unión puede contener maleimidas unidas a moléculas de polietilenglicol en las que el polietilenglicol puede permitir una mayor flexibilidad del grupo de unión o puede usarse para alargar el grupo de unión. Un grupo de unión puede ser un grupo de unión de (maleimidocaproílo)-(valina-citrulina)-(para-aminobenciloxicarbonilo). Un grupo de unión puede ser un grupo de unión adecuado para la unión a una cisteína modificada por ingeniería (THIOMAb ). Un grupo de unión de THIOMAB puede ser un grupo de unión de (maleimidocaproílo)-(valina-citrulina)-(para-aminobenciloxicarbonilo).
Un grupo de unión también puede comprender grupo(s) alquileno, alquenileno, alquinileno, poliéter, poliéster, poliamida y también poliaminoácidos, polipéptidos, péptidos escindibles o aminobencilcarbamatos. Un grupo de unión puede contener una maleimida en un extremo y un éster de N-hidroxisuccinimidilo en el otro extremo. Un grupo de unión puede contener una lisina con una amina N-terminal acetilada y un sitio de escisión de valina-citrulina. Un grupo de unión puede ser una unión creada mediante una transglutaminasa microbiana, en el que la unión puede crearse entre un resto que contiene amina y un resto modificado por ingeniería para contener glutamina como resultado de la enzima que cataliza la formación de un enlace entre el grupo acilo de una cadena lateral de glutamina y la amina primaria de una cadena de lisina. Un grupo de unión puede contener una amina primaria reactiva. Un grupo de unión puede ser un grupo de unión de sortasa A. Un grupo de unión de sortasa A puede crearse mediante una enzima sortasa A que fusiona un motivo de reconocimiento LXPTG a un motivo GGG N-terminal para regenerar un enlace de amida nativo. Por tanto, el grupo de unión creado puede unir un resto unido al motivo de reconocimiento LXPTG con un resto unido al motivo GGG N-terminal.
En los conjugados descritos en el presente documento, un compuesto o una sal se une al constructo de anticuerpo por medio de un(os) grupo(s) de unión, también denominado(s) en el presente documento L3. En la presente divulgación, L3, tal como se usa en el presente documento, puede seleccionarse de cualquiera de los restos de grupo de unión comentados en el presente documento. El grupo de unión que une el compuesto o la sal al constructo de anticuerpo de un conjugado puede ser corto, largo, hidrófobo, hidrófilo, flexible o rígido, o puede estar compuesto por segmentos que tienen cada uno independientemente una o más de las propiedades anteriormente, mencionadas de tal manera que el grupo de unión puede incluir segmentos que tienen propiedades diferentes. Los grupos de unión pueden ser polivalentes, de tal manera que unen covalentemente más de un compuesto o una sal a un sitio individual en el constructo de anticuerpo, o monovalentes, de tal manera que unen covalentemente un compuesto o una sal individual a un sitio individual en el constructo de anticuerpo.
Los grupos de unión (L3) de la divulgación pueden tener desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 500 átomos en un grupo de unión, tal como desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 400 átomos, tal como desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 300 átomos en un grupo de unión. En determinadas realizaciones, los grupos de unión de la divulgación tienen desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 400 átomos, tal como desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 300 átomos en el grupo de unión.
Tal como apreciarán los expertos en la técnica, los grupos de unión pueden unir un compuesto o una sal al constructo de anticuerpo mediante uniones covalentes entre el grupo de unión y el constructo de anticuerpo y compuesto. Tal como se usa en el presente documento, se pretende que la expresión “grupo de unión” incluya (i) formas no conjugadas del grupo de unión que incluyen un grupo funcional capaz de unir covalentemente el grupo de unión a un(os) compuesto(s) de benzazepina y un grupo funcional capaz de unir covalentemente el grupo de unión a un constructo de anticuerpo; (ii) formas parcialmente conjugadas del grupo de unión que incluyen un grupo funcional capaz de unir covalentemente el grupo de unión a un constructo de anticuerpo y que se une covalentemente a uno(s) compuesto(s) o a una(s) sal(es) tal como se definió anteriormente, o viceversa; y (iii) formas completamente conjugadas del grupo de unión que se unen covalentemente tanto a uno(s) compuesto(s) o a una(s) sal(es) como a un constructo de anticuerpo. Una realización se refiere a un conjugado formado poniendo en contacto un constructo de anticuerpo que se une a un receptor de superficie celular o a un antígeno asociado a tumor expresado en una célula tumoral con un grupo de unión-compuesto descrito en el presente documento en condiciones en las que el grupo de unión-compuesto se une covalentemente al constructo de anticuerpo. Una realización se refiere a un método de elaboración de un conjugado formado poniendo en contacto un grupo de unión-compuesto descrito en el presente documento en condiciones en las que el grupo de unión-compuesto se une covalentemente al constructo de anticuerpo. Una realización se refiere a un método de estimulación de la actividad inmunitaria en una célula que expresa CD40, que comprende poner en contacto la célula con un conjugado descrito en el presente documento que es capaz de unirse a la célula, en condiciones en las que el conjugado se une a la célula.
Se describen grupos de unión polivalentes a modo de ejemplo que pueden usarse para unir muchos compuestos de benzazepina a un constructo de anticuerpo. Por ejemplo, la tecnología de grupo de unión Fleximer® tiene el potencial de permitir conjugados de alta DAR con buenas propiedades fisicoquímicas. Tal como se muestra a continuación, la tecnología de grupo de unión Fleximer® se basa en incorporar moléculas de fármaco en una estructura principal de poliacetal solubilizante a través de una secuencia de enlaces éster. La metodología produce conjugados altamente cargados (DAR de hasta 20) mientras mantiene buenas propiedades fisicoquímicas. Esta metodología podría utilizarse con un compuesto de benzazepina tal como se muestra en el esquema a continuación.
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Para utilizar la tecnología de grupo de unión Fleximer® representada en el esquema anterior, puede estar presente un alcohol alifático o introducirse en el compuesto de benzazepina. Después se conjuga el resto de alcohol con un resto de alanina, que después se incorpora sintéticamente en el grupo de unión Fleximer®. El procesamiento liposómico del conjugado in vitro libera el fármaco original que contiene alcohol.
A modo de ejemplo y no de limitación, a continuación se describen algunos grupos de unión escindibles y no escindibles que pueden incluirse en los conjugados descritos en el presente documento.
Los grupos de unión escindibles pueden ser escindibles in vitro e in vivo. Los grupos de unión escindibles pueden incluir uniones química o enzimáticamente inestables o degradables. Los grupos de unión escindibles pueden depender de procesos en el interior de la célula para liberar un compuesto de benzazepina, tales como la reducción en el citoplasma, la exposición a condiciones ácidas en el lisosoma o la escisión mediante proteasas específicas u otras enzimas dentro de la célula. Los grupos de unión escindibles pueden incorporar uno o más enlaces químicos que son química o enzimáticamente escindibles mientras que la parte restante del grupo de unión puede ser no escindible.
Un grupo de unión puede contener un grupo químicamente lábil, tal como los grupos hidrazona y/o disulfuro. Los grupos de unión que comprenden grupos químicamente lábiles pueden aprovechar las propiedades diferenciales entre el plasma y algunos compartimentos citoplásmicos. Las condiciones intracelulares que pueden facilitar la liberación del compuesto de benzazepina para grupos de unión que contienen hidrazona pueden ser el entorno ácido de los endosomas y lisosomas, mientras que los grupos de unión que contienen disulfuro pueden reducirse en el citosol, que puede contener altas concentraciones de tiol, por ejemplo, glutatión. La estabilidad en plasma de un grupo de unión que contiene un grupo químicamente lábil puede aumentarse introduciendo impedimento estérico usando sustituyentes próximos al grupo químicamente lábil.
Los grupos lábiles a los ácidos, tales como la hidrazona, pueden permanecer intactos durante la circulación sistémica en el entorno de pH neutro de la sangre (pH 7,3-7,5) y pueden experimentar hidrólisis y pueden liberar el compuesto de benzazepina una vez que el conjugado de constructo de anticuerpo-compuesto de benzazepina se internaliza al interior de los compartimentos ligeramente ácidos endosómicos (pH 5,0-6,5) y lisosómicos (pH 4,5-5,0) de la célula. Este mecanismo de liberación dependiente del pH puede asociarse con la liberación no específica del fármaco. Para aumentar la estabilidad del grupo hidrazona del grupo de unión, el grupo de unión puede variarse mediante modificación química, por ejemplo, sustitución, permitiendo el ajuste para lograr una liberación más eficiente en el lisosoma con una pérdida minimizada en circulación.
Un tipo de grupo de unión que puede usarse en la presente divulgación es un grupo de unión que se escinde específicamente por una enzima. Por ejemplo, el grupo de unión puede escindirse por una enzima lisosómica. Tales grupos de unión pueden estar basados en péptidos o pueden incluir regiones peptídicas que pueden actuar como sustratos para las enzimas. Los grupos de unión basados en péptidos pueden ser más estables en el plasma y el medio extracelular que los grupos de unión químicamente lábiles.
Los enlaces peptídicos pueden tener una buena estabilidad en suero, ya que las enzimas proteolíticas lisosómicas pueden tener una actividad muy baja en sangre debido a los inhibidores endógenos y al valor de pH desfavorablemente alto de la sangre en comparación con los lisosomas. La liberación de un compuesto de benzazepina a partir de un constructo de anticuerpo puede producirse debido a la acción de proteasas lisosómicas, por ejemplo, catepsina y plasmina. Estas proteasas pueden estar presentes a niveles elevados en determinados tejidos tumorales. El grupo de unión puede ser escindible por una enzima lisosómica. La enzima lisosómica puede ser, por ejemplo, catepsina B, catepsina S, p-glucuronidasa o p-galactosidasa.
El péptido escindible puede seleccionarse de tetrapéptidos tales como Gly-Phe-Leu-Gly, Ala-Leu-Ala-Leu o dipéptidos tales como Val-Cit, Val-Ala y Phe-Lys. Los dipéptidos pueden tener una menor hidrofobicidad en comparación con los péptidos más largos.
Puede usarse una variedad de grupos de unión escindibles basados en dipéptidos en los conjugados de constructo de anticuerpo-compuesto de benzazepina descritos en el presente documento.
Los grupos de unión enzimáticamente escindibles pueden incluir un espaciador rompible por sí mismo para separar espacialmente el compuesto de benzazepina del sitio de escisión enzimática. La unión directa de un compuesto de benzazepina a un grupo de unión peptídico puede dar como resultado la liberación proteolítica del compuesto de benzazepina o de un aducto de aminoácidos del compuesto de benzazepina, alterando de ese modo su actividad. El uso de un espaciador rompible por sí mismo puede permitir la eliminación del compuesto de benzazepina completamente activo y no modificado químicamente tras la hidrólisis del enlace de amida.
Un espaciador rompible por sí mismo puede ser un grupo alcohol para-aminobencílico bifuncional, que puede unirse al péptido a través del grupo amino, formando un enlace de amida, mientras que los compuestos de benzazepina que contienen amina pueden unirse a través de funcionalidades de carbamato al grupo hidroxilo bencílico del grupo de unión (para dar un p-amidobencilcarbamato, PABC). El pro-compuesto de benzazepina resultante puede activarse tras la escisión mediada por proteasas, lo que conduce a una reacción de 1,6-eliminación que libera el compuesto de benzazepina no modificado, dióxido de carbono y restos del grupo de unión. El siguiente esquema representa la fragmentación de carbamato de p-amidobencilo y la liberación del compuesto de benzazepina:
Figure imgf000028_0001
También se han descrito variantes heterocíclicas de este grupo rompible por sí mismo.
El grupo de unión enzimáticamente escindible puede ser un grupo de unión basado en ácido p-glucurónico. La fácil liberación del compuesto de benzazepina puede realizarse mediante escisión del enlace glicosídico p-glucurónido por la enzima lisosómica p-glucuronidasa. Esta enzima puede estar presente de manera abundante dentro de los lisosomas y puede sobreexpresarse en algunos tipos de tumores, mientras que la actividad enzimática fuera de las células puede ser baja. Los grupos de unión basados en ácido p-glucurónico pueden usarse para eludir la tendencia de un conjugado de constructo de anticuerpo-compuesto de benzazepina de experimentar agregación debido a la naturaleza hidrófila de los p-glucurónidos. En determinadas realizaciones, los grupos de unión basados en ácido pglucurónico pueden unir un constructo de anticuerpo a un compuesto de benzazepina hidrófobo. El siguiente esquema representa la liberación de un compuesto de benzazepina (D) a partir de un conjugado de constructo de anticuerpocompuesto de benzazepina que contiene un grupo de unión basado en ácido p-glucurónico:
Figure imgf000028_0002
en el que Ac indica el constructo de anticuerpo.
Se ha descrito una variedad de grupos de unión basados en ácido p-glucurónico escindibles útiles para unir fármacos tales como auristatinas, camptotecina y análogos de doxorrubicina, aglutinantes del surco menor de CBI y psimberina con anticuerpos. Estos grupos de unión basados en ácido p-glucurónico pueden usarse en los conjugados descritos en el presente documento. En determinadas realizaciones, el grupo de unión enzimáticamente escindible es un grupo de unión basado en p-galactosida. La p-galactosida está presente de manera abundante dentro de los lisosomas, aunque la actividad enzimática fuera de las células es baja.
Además, los compuestos de benzazepina que contienen un grupo fenol pueden unirse covalentemente a un grupo de unión a través del oxígeno fenólico. Un grupo de unión de este tipo se basa en una metodología en la que se usa una “unión espacial” de diaminoetano junto con grupos rompibles por sí mismos basados en “PABO” tradicionales para suministrar fenoles.
Los grupos de unión escindibles pueden incluir porciones o segmentos no escindibles, y/o los segmentos o las porciones escindibles pueden incluirse en un grupo de unión de otro modo no escindible para hacerlo escindible. A modo de ejemplo únicamente, el polietilenglicol (PEG) y polímeros relacionados pueden incluir grupos escindibles en la estructura principal de polímero. Por ejemplo, un grupo de unión de polietilenglicol o polímero puede incluir uno o más grupos escindibles tales como un disulfuro, una hidrazona o un dipéptido.
Otras uniones degradables que pueden incluirse en los grupos de unión pueden incluir uniones de éster formadas mediante la reacción de ácidos PEG-carboxílicos o ácidos PEG-carboxílicos activados con los grupos alcohol en un compuesto de benzazepina, en el que tales grupos éster pueden hidrolizarse en condiciones fisiológicas para liberar el compuesto de benzazepina. Las uniones hidrolíticamente degradables pueden incluir, pero no se limitan a, uniones de carbonato; uniones de imina que resultan de la reacción de una amina y un aldehído; uniones de éster de fosfato formadas haciendo reaccionar un alcohol con un grupo fosfato; uniones de acetal que son el producto de reacción de un aldehído y un alcohol; uniones de ortoéster que son el producto de reacción de un formiato y un alcohol; y uniones oligonucleotídicas formadas mediante un grupo fosforamidito, incluyendo, pero sin limitarse a, en el extremo de un polímero, y un grupo hidroxilo 5' de un oligonucleótido.
Un grupo de unión según la presente divulgación puede contener un resto peptídico enzimáticamente escindible, por ejemplo, un grupo de unión que comprende la fórmula estructural (IIIb):
Figure imgf000029_0001
o una sal del mismo, en la que: “péptido” representa un péptido (ilustrado en la orientación N^-C, en el que péptido incluye los “extremos terminales” amino y carboxilo) que es escindible por una enzima lisosómica; T representa un polímero que comprende una o más unidades de etilenglicol o una cadena de alquileno, o combinaciones de los mismos; Ra se selecciona de hidrógeno, alquilo, sulfonato y sulfonato de metilo; Ry es hidrógeno o alquil C1-4-(O)r-(alquilen C1-4)s-G1 o alquil C1-4-(N)-[(alquilen C1-4)-G1]2; Rz es alquil C1-4-(O)r (alquilen C1-4)s-G2; G1 es SO3H, c O2H, PEG 4-32 o un resto de azúcar; G2 es S 03H, C 02H o un resto de PEG 4-32; r es 0 ó 1; s es 0 ó 1; p es un número i
entero que oscila desde 0 hasta 5; q es 0 ó 1; x es 0 ó 1; y es 0 ó 1; * representa el punto de unión del grupo de unión a un compuesto o a una sal tal como se definió anteriormente; y * representa el punto de unión a la parte restante del grupo de unión.
En determinados aspectos de la presente divulgación, el péptido puede seleccionarse de aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales o combinaciones de los mismos. En determinadas realizaciones, el péptido puede seleccionarse de un tripéptido o un dipéptido. En realizaciones particulares, el dipéptido puede comprender L-aminoácidos y seleccionarse de: Val-Cit; Cit-Val; Ala-Ala; Ala-Cit; Cit-Ala; Asn-Cit; Cit-Asn; Cit-Cit; Val-Glu; Glu-Val; Ser-Cit; Cit-Ser; Lys-Cit; Cit-Lys; Asp-Cit; Cit-Asp; Ala-Val; Val-Ala; Phe-Lys; Lys-Phe; Val-Lys; Lys-Val; Ala-Lys; Lys-Ala; Phe-Cit; Cit-Phe; Leu-Cit; Cit-Leu; Ile-Cit; Cit-Ile; Phe-Arg; Arg-Phe; Cit-Trp; y Trp-Cit, o sales de los mismos. Las realizaciones a modo de ejemplo de grupos de unión según la fórmula estructural (IIIb) que pueden incluirse en los conjugados descritos en el presente documento pueden incluir los grupos de unión ilustrados a continuación (tal como se ilustra, los grupos de unión pueden incluir un grupo reactivo adecuado para unir covalentemente el grupo de unión a un constructo de anticuerpo). De estos, se usa el grupo de unión IIIb.2 en la invención reivindicada:
Figure imgf000032_0001
en los que indica un sitio de unión a un compuesto o tal como se definió anteriormente.
Los grupos de enlace que se usan para unir los grupos de unión a un constructo de anticuerpo pueden ser de naturaleza electrófila e incluyen, por ejemplo, grupos maleimida, alquinos, alquinoatos, alenos y alenoatos, disulfuros activados, ésteres activos tales como ésteres de NHS y ésteres de HOBt, haloformiatos, haluros de ácido, alquilo y haluros de bencilo tales como haloacetamidas. También existen tecnologías emergentes relacionadas con maleimidas “autoestabilizantes” y “disulfuros de puente” que pueden usarse según la divulgación.
Los grupos maleimida se usan con frecuencia en la preparación de conjugados debido a su especificidad para reaccionar con los grupos tiol de, por ejemplo, los grupos cisteína del anticuerpo de un conjugado. La reacción entre un grupo tiol de un anticuerpo y un fármaco con un grupo de unión que incluye un grupo maleimida avanza según el siguiente esquema:
Figure imgf000033_0001
También pueden tener lugar la reacción inversa que conduce a la eliminación de maleimida a partir de una succinimida tio-sustituida. Esta reacción inversa es indeseable ya que el grupo maleimida puede reaccionar posteriormente con otro grupo tiol disponible, tal como otras proteínas en el cuerpo que tienen cisteínas disponibles. Por consiguiente, la reacción inversa puede perjudicar la especificidad de un conjugado. Un método de prevención de la reacción inversa es incorporar un grupo básico en el grupo de enlace mostrado en el esquema anterior. Sin querer restringirse a la teoría, la presencia del grupo básico puede aumentar la nucleofilia de las moléculas de agua cercanas para fomentar la hidrólisis de apertura de anillo del grupo succinimida. La forma hidrolizada del grupo de enlace es resistente a la desconjugación en presencia de proteínas plasmáticas. Los denominados grupos de unión “autoestabilizantes” proporcionan conjugados con estabilidad mejorada. A continuación se muestra un esquema representativo:
Figure imgf000033_0002
La reacción de hidrólisis representada de manera esquemática anteriormente puede producirse en cualquier grupo carbonilo del grupo succinimida. Por consiguiente, pueden resultar dos posibles isómeros, tal como se muestra a continuación:
Figure imgf000033_0003
La identidad de la base así como la distancia entre la base y el grupo maleimida pueden modificarse para ajustar la tasa de hidrólisis del grupo succinimida tio-sustituida y optimizar el suministro de un conjugado a una diana, por ejemplo, mejorando la especificidad y estabilidad del conjugado.
Bases adecuadas para su inclusión en un grupo de unión descrito en el presente documento, por ejemplo, cualquier L3 descrito en el presente documento con un grupo maleimida antes de la conjugación con un constructo de anticuerpo, pueden facilitar la hidrólisis de un grupo succinimida cercano formado después de la conjugación del constructo de anticuerpo con el grupo de unión. Las bases pueden incluir, por ejemplo, aminas (por ejemplo, -N(R26)(R27), en las que R26 y R27 se seleccionan independientemente de H y alquilo C1-6), heterociclos que contienen nitrógeno (por ejemplo, un heterociclo de 3 a 12 miembros que incluye uno o más átomos de nitrógeno y opcionalmente uno o más dobles enlaces), amidinas, guanidinas y carbociclos o heterociclos sustituidos con uno o más grupos amina (por ejemplo, un ciclo aromático o no aromático de 3 a 12 miembros que opcionalmente incluye un heteroátomo, tal como un átomo de nitrógeno, y sustituido con una o más aminas del tipo -N(R26)(R27), en las que R26 y R27 se seleccionan independientemente de H o alquilo C1-6). Una unidad básica puede estar separada de un grupo maleimida mediante, por ejemplo, una cadena de alquileno de la forma -(CH2)m-, en la que m es un número entero de desde 0 hasta 10. Una cadena de alquileno puede estar opcionalmente sustituida con otros grupos funcionales tal como se describe en el presente documento.
Un grupo de unión (L3) descrito en el presente documento con un grupo maleimida puede incluir un grupo electroatractortal como, pero sin limitarse a, -C(O)R, =O, -CN, -NO2, -CX3, -X, -COOR, -CONR2, -COR, -COX, -SO2R, -SO2OR, -SO2NHR, -SO2NR2, PO3R2 , -P(O)(CH3)NHR, -NO, -NR3+, -CR=CR2 y -CeCR, en los que cada R se selecciona independientemente de H y alquilo C i-6 y cada X se selecciona independientemente de F, Br, Cl y I. Los grupos de unión autoestabilizantes también pueden incluir grupos arilo, por ejemplo, fenilo, o heteroarilo, por ejemplo, piridina, opcionalmente sustituidos con grupos electroatractores tales como los descritos en el presente documento.
Los ejemplos de grupos de unión autoestabilizantes se proporcionan en, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 2013/0309256. Se entenderá que un grupo de unión autoestabilizante útil junto con los compuestos de la presente invención puede describirse de manera equivalente como grupos de unión que incluyen maleimida no sustituida, grupos de unión que incluyen succinimida tio-sustituida o grupos de unión que incluyen succinimida tiosustituida con anillo abierto e hidrolizada.
En determinadas realizaciones, un grupo de unión de la divulgación (L3) comprende un resto de grupo de unión estabilizante seleccionado de:
Figure imgf000034_0001
En el esquema proporcionado anteriormente, la estructura inferior puede denominarse (maleimido)-DPR-Val-Cit-PAB, en la que DPR se refiere a ácido diaminopropiónico, Val se refiere a valina, Cit se refiere a citrulina y PAB se refiere a para-aminobencilcarbonilo. ^ representa el punto de unión a un compuesto o a una sal tal como se definió anteriormente.
Se ha divulgado un método para formar un puente entre un par de grupos sulfhidrilo derivados de la reducción de un enlace disulfuro bisagra nativo y se representa en el esquema a continuación. Una ventaja de esta metodología es la capacidad para sintetizar conjugados de DAR4 homogéneos mediante la completa reducción de IgG (para dar 4 pares de sulfhidrilos a partir de disulfuros intercatenarios) seguido de la reacción con 4 equivalentes del agente alquilante. También se afirma que los conjugados que contienen “disulfuros de puente” tienen una estabilidad aumentada.
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De manera similar, tal como se representa a continuación, se ha desarrollado un derivado de maleimida que es capaz de formar un puente entre un par de grupos sulfhidrilo.
Figure imgf000035_0001
Tal como conocen los expertos en la técnica, el grupo de unión seleccionado para un conjugado particular puede verse influido por una variedad de factores, incluyendo, pero sin limitarse a, el sitio de unión al constructo de anticuerpo (por ejemplo, Lys, Cys u otros residuos de aminoácido), restricciones estructurales del farmacóforo del fármaco y la lipofilia del fármaco. El grupo de unión específico seleccionado para un conjugado debe buscar el equilibrio entre estos factores diferentes para la combinación de constructo de anticuerpo/fármaco específica.
Por ejemplo, se ha observado que los conjugados efectúan la destrucción de células inespecíficas negativas para el antígeno presentes en la vecindad de las células tumorales positivas para el antígeno. El mecanismo de destrucción inespecífica de células por los conjugados ha indicado que los productos metabólicos formados durante el procesamiento intracelular de los conjugados pueden desempeñar un papel. Parece que los metabolitos citotóxicos neutros generados por el metabolismo de los conjugados en células positivas para el antígeno desempeñan un papel en la destrucción inespecífica de células, mientras que puede prevenirse la difusión de los metabolitos cargados a través de la membrana al medio o desde el medio a través de la membrana y, por tanto, no pueden afectar a la destrucción inespecífica. En determinadas realizaciones, el grupo de unión se selecciona para atenuar el efecto de destrucción inespecífica provocado por los metabolitos celulares del conjugado. En determinadas realizaciones, el grupo de unión se selecciona para aumentar el efecto de destrucción inespecífica.
Las propiedades del grupo de unión, o grupo de unión-compuesto, también pueden tener un impacto sobre la agregación del conjugado en condiciones de uso y/o almacenamiento. Normalmente, los conjugados notificados en la bibliografía no contienen más de 3-4 moléculas de fármaco por molécula de anticuerpo. Los intentos para obtener razones de fármaco con respecto a anticuerpo (“DAR”) más altas suelen fracasar, particularmente si tanto el fármaco como el grupo de unión eran hidrófobos, debido a la agregación del conjugado. En muchos casos, DAR mayores de 3-4 podrían ser beneficiosas como medio para aumentar la potencia. En casos en los que el compuesto de benzazepina tiene una naturaleza más hidrófoba, puede ser deseable seleccionar grupos de unión que sean relativamente hidrófilos como medio para reducir la agregación del conjugado, especialmente en casos en los que se desean DAR mayores de 3-4. Por tanto, en determinadas realizaciones, el grupo de unión incorpora restos químicos que reducen la agregación de los conjugados durante el almacenamiento y/o uso. Un grupo de unión puede incorporar grupos polares o hidrófilos, tales como grupos cargados o grupos que se vuelven cargados a pH fisiológico, para reducir la agregación de los conjugados. Por ejemplo, un grupo de unión puede incorporar grupos cargados, tales como sales o grupos que se desprotonan, por ejemplo, carboxilatos, o que se protonan, por ejemplo, aminas, a pH fisiológico.
En realizaciones particulares, la agregación de los conjugados durante el almacenamiento o uso es menor de aproximadamente el 40%, tal como se determina mediante cromatografía de exclusión molecular (SEC). En realizaciones particulares, la agregación de los conjugados durante el almacenamiento o uso es menor del 35%, tal como menor de aproximadamente el 30%, tal como menor de aproximadamente el 25%, tal como menor de aproximadamente el 20%, tal como menor de aproximadamente el 15%, tal como menor de aproximadamente el 10%, tal como menor de aproximadamente el 5%, tal como menor de aproximadamente el 4%, o incluso menor, tal como se determina mediante cromatografía de exclusión molecular (SEC).
Unión de los grupos de unión al constructo de anticuerpo
Los conjugados descritos en el presente documento pueden comprender un grupo de unión, por ejemplo, un grupo de unión escindible tal como un grupo de unión peptídico o un grupo de unión no escindible. Los grupos de unión de los conjugados y métodos descritos en el presente documento pueden no afectar a la unión de porciones activas de un conjugado (por ejemplo, las porciones activas incluyen dominios de unión a antígeno, dominios Fc, dominios de unión a diana, anticuerpos, compuestos o sales tal como se definió anteriormente, o compuestos-grupos de unión tal como se definió anteriormente) a una diana, que puede ser una pareja de unión relacionada tal como un antígeno. Una secuencia de grupo de unión puede formar una unión entre diferentes partes de un conjugado, por ejemplo, entre un constructo de anticuerpo y un compuesto o una sal de la divulgación. En determinadas realizaciones, un conjugado comprende múltiples grupos de unión. En determinadas realizaciones, en las que un conjugado comprende múltiples grupos de unión, los grupos de unión pueden ser los mismos grupos de unión o grupos de unión diferentes.
Un grupo de unión puede unirse a un constructo de anticuerpo mediante un enlace entre el constructo de anticuerpo y el grupo de unión. Un grupo de unión puede unirse a un constructo de anticuerpo contra antígeno anti-tumoral mediante un enlace entre el constructo de anticuerpo contra antígeno anti-tumoral y el grupo de unión. Un grupo de unión puede unirse a un extremo terminal de una secuencia de aminoácidos de un constructo de anticuerpo, o puede unirse a una modificación de cadena lateral al constructo de anticuerpo, tal como la cadena lateral de un residuo de lisina, serina, treonina, cisteína, tirosina, ácido aspártico, glutamina, aminoácido no natural o ácido glutámico. Un grupo de unión puede unirse a un extremo terminal de una secuencia de aminoácidos de un dominio Fc o una región Fc de un constructo de anticuerpo, o puede unirse a una modificación de cadena lateral de un dominio Fc o una región Fc de un constructo de anticuerpo, tal como la cadena lateral de un residuo de lisina, serina, treonina, cisteína, tirosina, ácido aspártico, glutamina, aminoácido no natural o ácido glutámico. Un grupo de unión puede unirse a un extremo terminal de una secuencia de aminoácidos de un dominio Fc de un constructo de anticuerpo, o puede unirse a una modificación de cadena lateral de un dominio Fc de un constructo de anticuerpo, tal como la cadena lateral de un residuo de lisina, serina, treonina, cisteína, tirosina, ácido aspártico, glutamina, aminoácido no natural o ácido glutámico.
Un grupo de unión puede unirse a un constructo de anticuerpo en una cisteína bisagra. Un grupo de unión puede unirse a un constructo de anticuerpo en una lisina de dominio constante de cadena ligera. Un grupo de unión puede unirse a un constructo de anticuerpo en una lisina de dominio constante de cadena pesada. Un grupo de unión puede unirse a un constructo de anticuerpo en una cisteína modificada por ingeniería en la cadena ligera. Un grupo de unión puede unirse a un constructo de anticuerpo en una lisina de región Fc. Un grupo de unión puede unirse a un constructo de anticuerpo en una lisina de dominio Fc. Un grupo de unión puede unirse a un constructo de anticuerpo en una cisteína de región Fc. Un grupo de unión puede unirse a un constructo de anticuerpo en una cisteína de dominio Fc. Un grupo de unión puede unirse a un constructo de anticuerpo en una glutamina de cadena ligera, tal como una glutamina modificada por ingeniería. Un grupo de unión puede unirse a un constructo de anticuerpo en una glutamina de cadena pesada, tal como una glutamina modificada por ingeniería. Un grupo de unión puede unirse a un constructo de anticuerpo en un aminoácido no natural introducido por ingeniería en la cadena ligera. Un grupo de unión puede unirse a un constructo de anticuerpo en un aminoácido no natural introducido por ingeniería en la cadena pesada. Los aminoácidos pueden modificarse por ingeniería en una secuencia de aminoácidos de un constructo de anticuerpo, por ejemplo, un grupo de unión de un conjugado. Los aminoácidos modificados por ingeniería pueden añadirse a una secuencia de aminoácidos existente. Los aminoácidos modificados por ingeniería pueden sustituirse por uno o más aminoácidos existentes de una secuencia de aminoácidos.
Un grupo de unión puede conjugarse con un constructo de anticuerpo a través de un grupo sulfhidrilo en el constructo de anticuerpo. Un grupo de unión puede conjugarse con un constructo de anticuerpo a través de una amina primaria en el constructo de anticuerpo. Un grupo de unión puede conjugarse con un constructo de anticuerpo a través de un residuo de un aminoácido no natural en un constructo de anticuerpo, por ejemplo, un resto de cetona.
Cuando se unen uno o más grupos de unión a un constructo de anticuerpo en los sitios descritos en el presente documento, un dominio Fc del constructo de anticuerpo puede unirse a receptores de Fc. En determinadas realizaciones, un constructo de anticuerpo unido a través de un grupo de unión o un constructo de anticuerpo unido a un grupo de unión unido a un compuesto o a una sal tal como se definió anteriormente conserva la capacidad del dominio Fc del anticuerpo para unirse a receptores de Fc. En determinadas realizaciones, cuando un grupo de unión se conecta con un constructo de anticuerpo en los sitios descritos en el presente documento, el dominio de unión a antígeno de un constructo de anticuerpo unido a un grupo de unión o un constructo de anticuerpo unido a través de un grupo de unión unido a un compuesto o a una sal tal como se definió anteriormente puede unirse a su antígeno. En determinadas realizaciones, cuando un grupo de unión se conecta con un constructo de anticuerpo en los sitios descritos en el presente documento, un dominio de unión a diana de un constructo de anticuerpo unido a un grupo de unión o un constructo de anticuerpo unido a un grupo de unión unido a un compuesto o a una sal tal como se definió anteriormente puede unirse a su antígeno.
En determinados aspectos de la presente divulgación, un compuesto o un compuesto-grupo de unión divulgado en el presente documento se une a un dominio o a una región Fc de anticuerpo en un residuo de cisteína modificada por ingeniería. En algunos aspectos de la presente divulgación, el residuo de cisteína modificada por ingeniería está en una o más de las posiciones S239C de HC, V205C de LC, A114C de LC, A140C de HC, K149C de LC, S168C de LC, S153C de LC, A127C de LC, T116C de HC y S115C de HC, en las que HC se refiere a cadena pesada, LC se refiere a cadena ligera y la numeración de los residuos de aminoácido en la región Fc es según el índice de EU como en Kabat. En determinados aspectos de la presente divulgación, un compuesto o un compuesto-grupo de unión tal como se divulgó anteriormente puede no estar unido a un residuo de aminoácido de un dominio Fc de IgG divulgado en el presente documento seleccionado de: 221, 222, 224, 227, 228, 230, 231, 223, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 258, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 283, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 302, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335336, 396, 428 o cualquier subconjunto de los mismos, en el que la numeración de residuos de aminoácido en el dominio Fc es según el índice de EU como en Kabat.
Bioconjugación basada en lisina
Un constructo de anticuerpo puede conjugarse con un grupo de unión a través de bioconjugación basada en lisina. Un constructo de anticuerpo puede intercambiarse en un tampón apropiado, por ejemplo, fosfato, borato, PBS, Trisacetato, Tris-glicina, HEPES, MOPS, MES, EPS, HEPPS, histidina o HEp Bs a una concentración de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml. Puede añadirse un número apropiado de equivalentes de un compuesto-grupo de unión descrito en el presente documento como una disolución con agitación. Dependiendo de las propiedades físicas del constructo de benzazepina-grupo de unión, puede introducirse un codisolvente antes de la adición del constructo de benzazepina-grupo de unión para facilitar la solubilidad. La reacción puede agitarse a temperatura ambiente durante de 2 horas a aproximadamente 12 horas dependiendo de la reactividad observada. El avance de la reacción puede monitorizarse mediante CL-EM. Una vez que se da por finalizada la reacción, pueden retirarse los constructos de benzazepina-grupo de unión restantes mediante métodos aplicables y puede intercambiarse el conjugado de constructo de anticuerpo-benzazepina en el tampón de formulación deseado. Pueden sintetizarse conjugados unidos a lisina partiendo de anticuerpo (AcM) o anticuerpo biespecífico (AcB) y constructo de benzazepina-grupo de unión, por ejemplo, 10 equivalentes, siguiendo el esquema A a continuación (conjugado = conjugado de constructo de anticuerpo-benzazepina). El contenido de monómeros y las razones de benzazepinaconstructo de anticuerpo (razones molares) pueden determinarse mediante los métodos descritos en el presente documento.
Esquema A:
10 equiv. de compuesto-grupo de unión
fosfato de sodio
AcM ------------------------------------------- ► Conjugado
pH = 8
DMSO al 20% v/v
Bioconjugación basada en cisteína
Un constructo de anticuerpo puede conjugarse con un grupo de unión a través de bioconjugación basada en cisteína. Un constructo de anticuerpo puede intercambiarse en un tampón apropiado, por ejemplo, fosfato, borato, PBS, Trisacetato, Tris-glicina, HEPES, MOPS, MES, EPS, HEPPS, histidina o HEPBS a una concentración de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml con un número apropiado de equivalentes de un agente reductor, por ejemplo, ditiotreitol o tris(2-carboxietil)fosfina. La disolución resultante puede agitarse durante una cantidad de tiempo y a una temperatura apropiadas para efectuar la reducción deseada. Puede añadirse un compuesto-grupo de unión, por ejemplo, un compuesto o una sal de fórmula (IVA), (IVB) o (IVC), descrito en el presente documento como una disolución con agitación. Dependiendo de las propiedades físicas del constructo de benzazepina-grupo de unión, puede introducirse un codisolvente antes de la adición del constructo de benzazepinagrupo de unión para facilitar la solubilidad. La reacción puede agitarse a temperatura ambiente durante de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 12 horas dependiendo de la reactividad observada. El avance de la reacción puede monitorizarse mediante cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (CL-EM). Una vez que se da por finalizada la reacción, pueden retirarse el constructo de benzazepina-grupo de unión libre restante mediante métodos aplicables y puede intercambiarse el conjugado de constructo de anticuerpo-benzazepina en el tampón de formulación deseado. Pueden sintetizarse tales conjugados basados en cisteína partiendo de anticuerpo (AcM) y constructo de benzazepina-grupo de unión, por ejemplo, 7 equivalentes, usando las condiciones descritas en el esquema B a continuación (conjugado = conjugado de constructo de anticuerpo-compuesto de benzazepina). El contenido de monómeros y las razones de fármaco-anticuerpo pueden determinarse mediante los métodos descritos en el presente documento.
Esquema B:
1. agente reductor
AcM ---------------------------------------------► Conjugado
2. 7 equiv. de compuesto-grupo de unión
fosfato de sodio
pH = 8
DMSO al 20% v/v
Formulaciones farmacéuticas
Las composiciones, los conjugados y los métodos descritos en el presente documento pueden considerarse útiles como composiciones farmacéuticas para su administración a un sujeto que lo necesita. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender al menos los compuestos, las sales o los conjugados descritos en el presente documento y uno o más portadores, diluyentes, excipientes, estabilizadores, agentes dispersantes, agentes de suspensión y/o agentes espesantes farmacéuticamente aceptables. La composición puede comprender el conjugado que tiene un constructo de anticuerpo y un compuesto o una sal, tal como se divulgó anteriormente, conectados a través de un grupo de unión, tal como se describe en el presente documento. La composición puede comprender el conjugado que tiene un constructo de anticuerpo, un dominio de unión a diana y un compuesto o una sal, tal como se divulgó anteriormente, conectados a través de un grupo de unión. La composición puede comprender cualquier conjugado descrito en el presente documento. El constructo de anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CD40. Un conjugado puede comprender un anticuerpo anti-CD40 y una benzazepina. Un conjugado puede comprender un anticuerpo anti-HER2 y una benzazepina. Un conjugado puede comprender un anticuerpo anti-TROP2 y una benzazepina. Una composición farmacéutica puede comprender al menos los compuestos, las sales o los conjugados descritos en el presente documento y uno o más de tampones, antibióticos, esteroides, hidratos de carbono, fármacos (por ejemplo, fármacos quimioterápicos), radiación, polipéptidos, quelantes, adyuvantes y/o conservantes.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse usando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y sustancias auxiliares. La formulación puede modificarse dependiendo de la vía de administración elegida. Las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto, una sal o un conjugado tal como se describe en el presente documento pueden fabricarse, por ejemplo, liofilizando el compuesto, la sal o el conjugado, mezclando, disolviendo, emulsionando, encapsulando o atrapando el conjugado. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir los compuestos, las sales o los conjugados descritos en el presente documento en forma de base libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.
Los métodos para la formulación de los conjugados descritos en el presente documento pueden incluir formular cualquiera de los compuestos, las sales o los conjugados descritos en el presente documento con uno o más excipientes o portadores inertes farmacéuticamente aceptables para formar una composición sólida, semisólida o líquida. Las composiciones sólidas pueden incluir, por ejemplo, polvos, comprimidos, gránulos dispersables y cápsulas y, en algunos aspectos, las composiciones sólidas contienen además sustancias auxiliares no tóxicas, por ejemplo, agentes humectantes o emulsionantes, agentes reguladores del pH y otros aditivos farmacéuticamente aceptables. Alternativamente, los compuestos, las sales o los conjugados descritos en el presente documento pueden estar liofilizados o en forma de polvo para su reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden comprender al menos un principio activo (por ejemplo, un compuesto, una sal o un conjugado). Los principios activos pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente), en sistemas coloidales de suministro de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones.
Las composiciones farmacéuticas tal como se describen en el presente documento a menudo pueden comprender además más de un compuesto activo (por ejemplo, un compuesto, una sal o un conjugado y otros agentes), según sea necesario, para la indicación particular que está tratándose. Los compuestos activos pueden tener actividades complementarias que no se vean afectadas de manera adversa entre sí. Por ejemplo, la composición también puede comprender un agente quimioterápico, un agente citotóxico, una citocina, un agente inhibidor del crecimiento, un agente anti-hormonal, un agente anti-angiogénico y/o un cardioprotector. Tales moléculas pueden estar presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito previsto.
Las composiciones y formulaciones pueden esterilizarse. La esterilización puede lograrse mediante filtración a través de filtración estéril.
Las composiciones descritas en el presente documento pueden formularse para su administración como inyección. Los ejemplos no limitativos de formulaciones para inyección pueden incluir una suspensión, disolución o emulsión estéril en vehículos oleosos o acuosos. Los vehículos oleosos adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, disolventes o vehículos lipófilos, tales como aceites grasos o ésteres de ácidos grasos sintéticos, o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión. La suspensión también puede contener estabilizadores adecuados. Las inyecciones pueden formularse para inyección en bolo o infusión continua. Alternativamente, las composiciones descritas en el presente documento pueden estar liofilizadas o en forma de polvo para su reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.
Para la administración parenteral, los compuestos, las sales o los conjugados pueden formularse en una forma inyectable de dosificación unitaria (por ejemplo, usar disolución, suspensión, emulsión de letras) en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos pueden ser inherentemente no tóxicos y no terapéuticos. Los vehículos pueden ser agua, solución salina, disolución de Ringer, disolución de dextrosa y albúmina sérica humana al 5%. También pueden usarse vehículos no acuosos tales como aceites fijos y oleato de etilo. Pueden usarse liposomas como portadores. El vehículo puede contener cantidades menores de aditivos tales como sustancias que potencian la isotonicidad y la estabilidad química (por ejemplo, tampones y conservantes).
También pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos de preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que pueden contener el compuesto, la sal o el conjugado, y estas matrices pueden tener la forma de artículos conformados (por ejemplo, películas o microcápsulas). Los ejemplos de matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli (alcohol vinílico)), polilactidas, copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de y-etilo, copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradables, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPO™ (es decir, microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y poli(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico).
Las formulaciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden prepararse para el almacenamiento mezclando un compuesto, una sal o un conjugado con un portador, excipiente y/o estabilizador farmacéuticamente aceptable. Esta formulación puede ser una formulación liofilizada o una disolución acuosa. Los portadores, excipientes y/o estabilizadores aceptables pueden ser no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones usadas. Los portadores, excipientes y/o estabilizadores aceptables pueden incluir tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes; polipéptidos; proteínas tales como albúmina sérica o gelatina; polímeros hidrófilos; aminoácidos; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos; y/o tensioactivos no iónicos o polietilenglicol.
Las formulaciones farmacéuticas de los conjugados descritos en el presente documento pueden tener una razón de fármaco-constructo de anticuerpo (“DAR”) promedio seleccionada de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10, en las que el fármaco es un compuesto o una sal tal como se divulgó anteriormente. En determinadas realizaciones, la DAR promedio de la formulación es de desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8 , tal como desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 8 , tal como desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 7. En determinadas realizaciones, una formulación farmacéutica tiene una DAR promedio de aproximadamente 3, aproximadamente 3,5, aproximadamente 4, aproximadamente 4,5, aproximadamente 5, aproximadamente 5,5, aproximadamente 6 o aproximadamente 6 ,6.
Aplicaciones terapéuticas
Las composiciones, los conjugados y los métodos de la presente divulgación pueden ser útiles para una pluralidad de sujetos diferentes, incluyendo, pero no se limitan a, un mamífero, humano, mamífero no humano, un animal domesticado (por ejemplo, animales de experimentación, mascotas o ganado), un animal no domesticado (por ejemplo, salvaje), perro, gato, roedor, ratón, hámster, vaca, ave, gallina, pez, cerdo, caballo, cabra, oveja, conejo y cualquier combinación de los mismos.
Las composiciones, los conjugados y los métodos descritos en el presente documento pueden ser útiles como producto terapéutico, por ejemplo, un tratamiento que puede administrarse a un sujeto que lo necesita. Puede obtenerse un efecto terapéutico de la presente divulgación en un sujeto mediante la reducción, supresión, remisión o erradicación de un estado patológico, incluyendo, pero sin limitarse a, un síntoma del mismo. Puede obtenerse un efecto terapéutico en un sujeto que tiene una enfermedad o un estado, o tiene predisposición a padecer o está comenzando a padecer la enfermedad o el estado, mediante una reducción, supresión, prevención, remisión o erradicación del estado o la enfermedad, o del estado previo al estado o la enfermedad.
En la práctica de los métodos descritos en el presente documento, pueden administrarse cantidades terapéuticamente eficaces de las composiciones y los conjugados descritos en el presente documento a un sujeto que lo necesita, a menudo para tratar y/o prevenir un estado o la evolución del mismo. Una composición farmacéutica puede afectar a la fisiología del sujeto, tal como al sistema inmunitario, una respuesta inflamatoria u otro efecto fisiológico. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar dependiendo de la gravedad de la enfermedad, la edad y salud relativa del sujeto, la potencia de los compuestos usados y otros factores.
Tratar y/o tratamiento pueden referirse a cualquier indicio de éxito en el tratamiento o la mejora de la enfermedad o el estado. Tratamiento puede incluir, por ejemplo, la reducción, la ralentización o el alivio de la gravedad de uno o más síntomas de la enfermedad o el estado, o puede incluir la reducción de la frecuencia con la que un paciente experimenta los síntomas de una enfermedad, un defecto, trastorno o estado adverso, y similares. Tratar pueden usarse en el presente documento para referirse a un método que da como resultado cierto nivel de tratamiento o mejora de la enfermedad o el estado, y puede contemplar una variedad de resultados dirigidos a ese fin, incluyendo, pero sin restringirse a, la prevención del estado por completo.
Prevenir, prevención y similares pueden referirse a la prevención de la enfermedad o el estado, por ejemplo, la formación de tumores, en el paciente. Por ejemplo, si un individuo en riesgo de desarrollar un tumor u otra forma de cáncer se trata con los métodos de la presente divulgación y no desarrolla posteriormente el tumor u otra forma de cáncer, entonces se ha prevenido la enfermedad, al menos a lo largo de un periodo de tiempo, en ese individuo. Prevención también puede referirse a prevenir la reaparición de una enfermedad o un estado en un paciente que se ha tratado previamente de la enfermedad o el estado, por ejemplo, prevenir la recidiva.
Una cantidad terapéuticamente eficaz puede ser la cantidad de una composición o un componente activo de la misma suficiente para proporcionar un efecto beneficioso o reducir de otro modo un acontecimiento no beneficioso perjudicial al individuo al que se le administra la composición. Una dosis terapéuticamente eficaz puede ser una dosis que produce uno o más efectos deseados o deseables (por ejemplo, beneficiosos) para los que se administra, produciéndose tal administración una o más veces a lo largo de un periodo de tiempo dado. Una dosis exacta puede depender del propósito del tratamiento, y puede determinarla un experto en la técnica usando técnicas conocidas.
Los conjugados descritos en el presente documento que pueden usarse en terapia pueden formularse y establecerse las dosificaciones de una manera compatible con la buena práctica médica teniendo en cuenta la enfermedad o el estado que va a tratarse, el estado del paciente individual, el sitio de suministro de la composición, el método de administración y otros factores conocidos para los médicos. Las composiciones descritas en el presente documento pueden prepararse según la descripción de preparación descrita en el presente documento.
Las composiciones farmacéuticas pueden usarse en los métodos descritos en el presente documento y pueden administrarse a un sujeto que lo necesita usando una técnica conocida para un experto habitual en la técnica que puede ser adecuada como terapia para la enfermedad o el estado que afecta al sujeto. Un experto habitual en la técnica entendería que la cantidad, duración y frecuencia de administración de una composición farmacéutica descrita en el presente documento a un sujeto que lo necesita depende de varios factores, incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a, la salud del sujeto, la enfermedad o el estado específico del paciente, el grado o nivel de una enfermedad o un estado específico del paciente, los productos terapéuticos adicionales que están administrándose o se han administrado al sujeto, y similares.
Los métodos y las composiciones descritos en el presente documento pueden ser para su administración a un sujeto que lo necesita. A menudo, la administración de las composiciones descritas en el presente documento puede incluir vías de administración, incluyendo los ejemplos no limitativos de vías de administración las vías intravenosa, intraarterial, subcutánea, subdural, intramuscular, intracraneal, intraesternal, intratumoral o intraperitoneal. Además, una composición farmacéutica puede administrarse a un sujeto por vías de administración adicionales, por ejemplo, mediante administración por inhalación, por vía oral, dérmica, intranasal o intratecal.
Las composiciones y los conjugados de la presente divulgación pueden administrarse a un sujeto que lo necesita en una primera administración y en una o más administraciones adicionales. La una o más administraciones adicionales pueden administrarse al sujeto que lo necesita minutos, horas, días, semanas o meses tras la primera administración. Una cualquiera de las administraciones adicionales puede administrarse al sujeto que lo necesita menos de 21 días, menos de 14 días, menos de 10 días, menos de 7 días, menos de 4 días o menos de 1 día después de la primera administración. La una o más administraciones pueden producirse más de una vez al día, más de una vez a la semana o más de una vez al mes. Las administraciones pueden ser semanalmente, bisemanalmente (cada dos semanas), cada tres semanas, mensualmente o bimensualmente.
Las composiciones, los conjugados y los métodos proporcionados en el presente documento pueden ser útiles para el tratamiento de una pluralidad de enfermedades, estados, la prevención de una enfermedad o un estado en un sujeto u otras aplicaciones terapéuticas para sujetos que lo necesitan. A menudo, las composiciones, los conjugados y los métodos proporcionados en el presente documento pueden ser útiles para el tratamiento de estados hiperplásicos, incluyendo, pero sin limitarse a, neoplasias, cánceres, tumores y similares. Las composiciones, los conjugados y los métodos proporcionados en el presente documento pueden ser útiles para seleccionar como diana específicamente TLR8. En una realización, los compuestos de la presente divulgación sirven como agonistas de TLR8 y activan una respuesta inmunitaria. En otra realización, los conjugados de la presente divulgación sirven como agonistas de TLR8 y activan una respuesta inmunitaria. Un estado, tal como un cáncer, puede estar asociado con la expresión de una molécula en las células cancerosas. A menudo, la molécula expresada por las células cancerosas puede comprender una porción extracelular capaz de ser reconocida por el constructo de anticuerpo del conjugado. Una molécula expresada por las células cancerosas puede ser un antígeno tumoral. Una porción de constructo de anticuerpo del conjugado puede reconocer un antígeno tumoral. Un antígeno tumoral puede incluir CD5, CD19, CD20, CD25, CD37, CD30, CD33, CD40, CD45, CAMPATH-1, BCMA, CS-1, PD-L1, B7-H3, B7-DC, HLD-DR, antígeno carcinoembrionario (CEA), TAG-72, EpCAM, MUC1, proteína de unión a folato, A33, G250, antígeno prostático específico de membrana (PMSA), ferritina, GD2, GD3, GM2, Ley, CA-125, CA19-9, factor de crecimiento epidérmico, p185HER2, receptor de IL-2, EGFRvIII (de2-7 EGFR), proteína de activación de fibroblastos, tenascina, una metaloproteinasa, endosialina, factor de crecimiento endotelial vascular, avB3, WT1, LMP2, E6 de VPH, E7 de VPH, Her-2/neu, MAGE A3, p53 no mutante, NY-ESO-1, MelanA/MART1, Ras mutante, gp100, p53 mutante, PR1, bcr-abl, tirosinasa, survivina, PSA, hTERT, una proteína del punto de ruptura de la translocación de sarcoma, EphA2, PAP, ML-IAP, AFP, ERG, NA17, PAX3, ALK, receptor de andrógenos, ciclina B1, poli(ácido siálico), MYCN, RhoC, TRP-2, fucosil GM1, mesotelina (MSLN), PSCA, MAGE A1, sLe(animal), CYP1B1, PLAV1, GM3, BORIS, Tn, GloboH, ETV6 -AML, NY-BR-1, RGS5, SART3, STn, anhidrasa carbónica IX, PAX5, OY-TES1, proteína del semen 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, legumaína, Tie 3, VEGFR2, MAD-CT-1, PDGFR-B, MAD-CT-2, ROR2, TRAIL1, MUC16, MAGE A4, MAGE C2, GAGE, EGFR, CMET, HER3, MUC15, CA6 , NAPI2B, TROP2, CLDN6 , CLDN16, CLDN18,2, CLorf186, RON, LY6 E, FRA, DLL3, PTK7, STRA6 , TMPRSS3, TMPRSS4, TMEM238, UPK1B, VTCN1, LIV1, ROR1 o antígeno relacionado con Fos 1.
Tal como se describe en el presente documento, una porción de dominio de unión a antígeno del conjugado puede configurarse para reconocer una molécula expresada por una célula cancerosa, tal como, por ejemplo, un antígeno patológico, un antígeno tumoral o un antígeno canceroso. A menudo, tales antígenos son conocidos por los expertos habituales en la técnica, o recientemente se ha descubierto que están asociados con un estado de este tipo, que están asociados habitualmente con y/o son específicos para tales estados. Por ejemplo, un antígeno patológico, un antígeno tumoral o un antígeno canceroso es, pero no se limita a, CD5, CD19, CD20, CD25, CD37, CD30, CD33, CD40, CD45, CAMPATH-1, BCMA, CS-1, PD-L1, B7-H3, B7-DC, HLD-DR, antígeno carcinoembrionario (CEA), TAG-72, EpCAM, MUC1, proteína de unión a folato, A33, G250, antígeno prostático específico de membrana (PSMA), ferritina, GD2, GD3, GM2, Ley, CA-125, CA19-9, factor de crecimiento epidérmico, p185HER2, receptor de IL-2, Eg FRVIII (de2-7 EGFR), proteína de activación de fibroblastos, tenascina, una metaloproteinasa, endosialina, factor de crecimiento endotelial vascular, avB3, WT1, LMP2, E6 de VPH, E7 de VPH, Her-2/neu, MAGE A3, p53 no mutante, NY-ESO-1, MelanA/MART1, Ras mutante, gp100, p53 mutante, PR1, bcr-abl, tirosinasa, survivina, PSA, hTERT, una proteína del punto de ruptura de la translocación de sarcoma, EphA2, PAP, ML-IAP, AFP, ERG, NA17, PAX3, ALK, receptor de andrógenos, ciclina B1, poli(ácido siálico), MYCN, RhoC, TRP-2, fucosil GM1, mesotelina (MSLN), PSCA, MAGE A1, sLe(animal), CYP1B1, PLAV1, GM3, BORIS, Tn, GloboH, ETV6-AML, NY-BR-1, RGS5, SART3, STn, anhidrasa carbónica IX, PAX5, OY-TES1, proteína del semen 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, legumaína, Tie 3, VEGFR2, MAD-CT-1, PDGFR-B, MAD-CT-2, ROR2, TRAIL1, MUC16, MAGE A4, MAGE C2, GAGE, EGFR, CMET, HER3, MUC15, CA6, NAPI2B, TROP2, CLDN6, CLDN16, CLDN18,2, CLorf186, RON, LY6E, FRA, DLL3, PTK7, STRA6, TMPRSS3, TMPRSS4, TMEM238, UPK1B, VTCN1, LIV1, ROR1 o antígeno relacionado con Fos 1. Además, tales antígenos tumorales pueden derivarse de los siguientes estados y/o familias de estados específicos, incluyendo, pero sin limitarse a, cánceres tales como cánceres de cerebro, cánceres de piel, linfomas, sarcomas, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, leucemias, cáncer uterino, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, hemangiosarcomas, cánceres óseos, cánceres de sangre, cáncer de testículos, cáncer de próstata, cáncer de estómago, cánceres de intestino, cáncer de páncreas y otros tipos de cánceres, así como estados precancerosos tales como hiperplasia o similares.
Los ejemplos no limitativos de cánceres pueden incluir leucemia linfoblástica aguda (LLA); leucemia mieloide aguda; carcinoma corticosuprarrenal; astrocitoma cerebelar o cerebral infantil; carcinoma de células basales; cáncer de vejiga; tumor óseo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno; cáncer de cerebro; tumores de cerebro, tales como astrocitoma cerebelar, glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, glioma de la vía óptica e hipotalámico; glioma del tronco encefálico; cáncer de mama; adenomas/carcinoides bronquial; linfoma de Burkitt; astrocitoma cerebelar; cáncer de cuello uterino; colangiocarcinoma; condrosarcoma; leucemia linfocítica crónica; leucemia mielógena crónica; trastornos mieloproliferativos crónicos; cáncer de colon; linfoma cutáneo de células T; cáncer de endometrio; ependimoma; cáncer de esófago; cánceres oculares, tales como melanoma intraocular y retinoblastoma; cáncer de vesícula biliar; glioma; tricoleucemia; cáncer de cabeza y cuello; cáncer de corazón; cáncer hepatocelular (de hígado); linfoma de Hodgkin; cáncer de hipofaringe; insulinoma (carcinoma endocrino de páncreas); sarcoma de Kaposi; cáncer de riñón (cáncer de células renales); cáncer de laringe; leucemia, tal como linfoblástica aguda, mieloide aguda, linfocítica crónica, mielógena crónica y tricoleucemia; cáncer de labio y de la cavidad bucal; liposarcoma; cáncer de pulmón, tal como de células no pequeñas y de células pequeñas; linfoma, tal como relacionado con el SIDA, de Burkitt; linfoma cutáneo de células T, de Hodgkin y no Hodgkin, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno de huesos/osteosarcoma; melanoma; cáncer de células de Merkel; mesotelioma; mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas; micosis fungoide; síndromes mielodisplásicos; enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas; trastornos mieloproliferativos crónicos; cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal; carcinoma de nasofaringe; neuroblastoma; oligodendroglioma; cáncer de orofaringe; osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de huesos; cáncer de ovarios; cáncer de páncreas; cáncer de paratiroides; cáncer de faringe; feocromocitoma; adenoma hipofisario; neoplasia de células plasmáticas; blastoma pleuropulmonar; cáncer de próstata; cáncer rectal; carcinoma de células renales (cáncer de riñón); cáncer renal de células transicionales de pelvis y uréter; rabdomiosarcoma; cáncer de glándulas salivales; sarcoma, familia Ewing de tumores; sarcoma de Kaposi; sarcoma de tejidos blandos; sarcoma uterino; síndrome de Sézary; cáncer de piel (distinto de melanoma); carcinoma de piel; cáncer de intestino delgado; sarcoma de tejidos blandos; carcinoma de células escamosas; cáncer escamoso metastásico de cuello con tumor primario oculto; cáncer de estómago; cáncer de testículos; cáncer de garganta; timoma y carcinoma tímico; timoma; cáncer de tiroides; cáncer de tiroides infantil; cáncer uterino; cáncer de vagina; macroglobulinemia de Waldenstrom; tumor de Wilms y cualquier combinación de los mismos.
La invención proporciona cualquier compuesto o conjugado terapéutico divulgado en el presente documento para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. La terapia puede ser mediante cualquier mecanismo divulgado en el presente documento, tal como mediante estimulación del sistema inmunitario. La invención proporciona cualquier compuesto o conjugado terapéutico divulgado en el presente documento para su uso en la estimulación del sistema inmunitario, vacunación o inmunoterapia, incluyendo, por ejemplo, la potenciación de una respuesta inmunitaria. La invención proporciona además cualquier compuesto o conjugado terapéutico divulgado en el presente documento para la prevención o el tratamiento de cualquier estado divulgado en el presente documento, por ejemplo, cáncer, enfermedad autoinmunitaria, inflamación, septicemia, alergia, asma, rechazo de injerto, enfermedad de injerto contra huésped, inmunodeficiencia o enfermedad infecciosa (normalmente provocada por un patógeno infeccioso). La invención también proporciona cualquier compuesto o conjugado terapéutico divulgado en el presente documento para la obtención de cualquier resultado clínico divulgado en el presente documento para cualquier estado divulgado en el presente documento, tal como la reducción de células tumorales in vivo. La invención también proporciona el uso de cualquier compuesto o conjugado terapéutico divulgado en el presente documento en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de cualquier estado divulgado en el presente documento.
Esquemas generales de síntesis y ejemplos
Los siguientes esquemas de síntesis se proporcionan con propósitos de ilustración, no de limitación. Los siguientes ejemplos ilustran los diversos métodos de elaboración de los compuestos descritos en el presente documento. Se entiende que un experto en la técnica puede ser capaz de elaborar estos compuestos mediante métodos similares o combinando otros métodos conocidos por el experto en la técnica. También se entiende que un experto en la técnica sería capaz de la elaboración, de una manera similar a la descrita a continuación, usando los materiales de partida apropiados y modificando la ruta de síntesis según sea necesario. En general, los materiales de partida y los reactivos pueden obtenerse de proveedores comerciales o sintetizarse según fuentes conocidas por los expertos en la técnica o prepararse tal como se describe en el presente documento.
Figure imgf000042_0001
Hacer reaccionar un aldehído (i) con un reactivo de Wittig apropiado, tal como 3-ciano-2-(trifenilfosforiliden)propanoato de terc-butilo, a temperaturas elevadas para proporcionar una olefina (ii), que se somete a ciclización reductora tratando la olefina (ii) con un agente reductor, tal como polvo de hierro en ácido acético caliente, para proporcionar azepinas (iii). Desproteger el grupo éster C-4 usando un ácido fuerte, tal como HCl, para dar los compuestos (iv), que a su vez se acoplan con una amina sustituida usando un agente de acoplamiento, tal como el reactivo BOP. Proteger el sustituyente 2-amino de los compuestos (v) con un grupo terc-butoxicarbonilo. Hidrolizar los compuestos (vi) resultantes con reactivos tales como LiOH en una mezcla de THF y metanol para proporcionar los compuestos (vii). Convertir el ácido carboxílico C-8 de (vii) en el grupo amida usando reactivos conocidos tales como HBTU y una base de amina terciaria. La desprotección mediada por ácido de los compuestos (viii) usando un reactivo tal como TFA en diclorometano proporciona los compuestos objetivo (ix).
Figure imgf000043_0001
Hacer reaccionar (i) en condiciones convencionales usadas para la carbonilación de haluros de arilo, tales como monóxido de carbono, un catalizador de paladio tal como Pd(OAc)2 y un ligando tal como 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno (XantPhos), y una base tal como fosfato de potasio en una mezcla de THF y agua para proporcionar los ácidos carboxílicos (ii). Después puede llevarse a cabo la conversión en los productos finales de manera similar a la descrita en el esquema 1 (vii ^ ix).
Figure imgf000043_0002
Hacer reaccionar un aldehido (i) con una reactivo de Wittig apropiado, tal como 3-ciano-2-(trifenilfosforiliden)propanoato de etilo, a temperatura ambiental para proporcionar una olefina (ii), que se somete a ciclización reductora tratando la olefina (ii) con un agente reductor, tal como polvo de hierro en ácido acético caliente, para proporcionar azepinas (iii). Proteger el grupo amina C-2 usando anhídrido de Boc para dar los compuestos (iii), que a su vez se saponifican con un hidróxido de metal alcalino tal como LiOH para proporcionar el ácido carboxílico que se acopla con una amina sustituida usando un agente de acoplamiento, tal como el reactivo BOP, para proporcionar los compuestos (iv). Convertir el ácido carboxílico C-8 de (v) en el grupo amida usando reactivos conocidos tales como EDCI/HOBT y una base de amina terciaria. El intercambio halógeno-amina puede efectuarse usando una metodología convencional, tal como acoplamientos mediados por cobre o catalizados por paladio (benzofenona imina/Pd(II)), para proporcionar las anilinas C-8 (vi). La funcionalización de las aminas (vi) mediante acilación o sulfonilación proporciona compuestos (vii) de anilidas (X=C) o las sulfonamidas (X=SO). Alternativamente, los compuestos (vii) pueden prepararse directamente a través de un acoplamiento mediado por paladio del bromuro (v) y una amida o sulfonamida sustituida de manera apropiada. La desprotección mediada por ácido de los compuestos (vii) usando un reactivo tal como TFA en diclorometano proporciona los compuestos objetivo (viii).
Figure imgf000044_0001
Hacer reaccionar (i) con benciltiol en presencia de un catalizador de paladio tal como Pd2(dba)3 y un ligando tal como XantPhos a temperaturas elevadas para proporcionar los sulfuros C-8 (ii). La cloración oxidante de los sulfuros (ii) con un reactivo tal como 1,3-dicloro-5,5-dimetilhidantoína (DCDMH) proporciona los cloruros de sulfonilo como productos intermedio que pueden hacerse reaccionar con una amina sustituida de manera apropiada de estructura R'''NH2 para proporcionar las sulfonamidas (iii). La desprotección mediada por ácido de los compuestos (iii) usando un reactivo tal como TFA en diclorometano proporciona los compuestos objetivo (iv).
Esquema 5
Síntesis de grupo de unión-cargas activas
Puede sintetizarse un grupo de unión-carga activa (LP) mediante diversos métodos. Por ejemplo, los compuestos de LP pueden sintetizarse tal como se muestra en el esquema 5-1.
Esquema 5-1:
Figure imgf000044_0002
¡i
R = NHS, pentafluorofenilo
ISC: com puesto ¡nm unoestim ulador
Puede hacerse reaccionar un ácido carboxílico pegilado (i) que se ha activado para la formación de enlaces de amida con un compuesto inmunoestimulador que contiene una amina sustituida de manera apropiada para proporcionar una amida como producto intermedio. La formación de un éster activado (ii) puede lograrse mediante la reacción del compuesto carboxílico que contiene la amida como producto intermedio usando un reactivo tal como N-hidroxisuccinimida o pentafluorofenol en presencia de un agente de acoplamiento tal como diisopropilcarbodiimida (DIC) para proporcionar los compuestos (ii).
Puede sintetizarse un LP tal como se muestra en el esquema 5-2.
Figure imgf000045_0001
Puede hacerse reaccionar un carbonato activado tal como (i) con un compuesto inmunoestimulador que contiene una amina sustituida de manera apropiada para proporcionar los carbamatos (ii), que pueden desprotegerse usando métodos convencionales basados en la naturaleza del grupo éster R3. Después puede acoplarse el ácido carboxílico (iii) resultante con un agente activante tal como N-hidroxisuccinimida o pentafluorofenol para proporcionar los compuestos (iv).
Puede sintetizarse un compuesto de LP tal como se muestra en el esquema 5-3.
Figure imgf000045_0002
Puede hacerse reaccionar un éster carboxílico activado tal como (i-a) con un compuesto inmunoestimulador que contiene una amina sustituida de manera apropiada para proporcionar las amidas (ii). Alternativamente, los ácidos carboxílicos del tipo (i-b) pueden acoplarse con un compuesto inmunoestimulador que contiene una amina sustituida de manera apropiada en presencia de un agente de formación de enlaces de amida tal como diciclohexilcarbodiimda (DCC) para proporcionar el LP deseado.
Puede sintetizarse un compuesto de LP mediante diversos métodos tales como el mostrado en el esquema 5-4.
Figure imgf000046_0001
Puede hacerse reaccionar un carbonato activado tal como (i) con un compuesto inmunoestimulador que contiene una amina sustituida de manera apropiada para proporcionar carbamatos (ii) como el ISC objetivo.
También puede sintetizarse un compuesto de LP tal como se muestra en el esquema 5-5.
Figure imgf000046_0002
Puede hacerse reaccionar un ácido carboxílico activado tal como (i-a, i-b, i-c) con un compuesto inmunoestimulador que contiene una amina sustituida de manera apropiada para proporcionar amidas (ii-a, ii-b, ii-c) como el grupo de unión-carga activas (LP) objetivo.
EJEMPLO 1
Síntesis de sal de TFA de 2-am¡no-W4, W4-d¡prop¡l-N8-(1,2,3,4-tetrah¡droqu¡nol¡n-7-¡l)-3H-benzo[b]azep¡n-4,8-dicarboxamida (compuesto 1.1)
Figure imgf000047_0001
Etapa A: Preparación del prod. int. 1.1a
Figure imgf000047_0002
Se añad¡ó bromoaceton¡tr¡lo (8,60 g, 71,7 mmol, 4,78 ml) a una d¡soluc¡ón de (tr¡fen¡lfosfor¡l¡d¡n)acetato de terc-but¡lo (45,0 g, 119 mmol, 1,00 equ¡v.) en EtOAc (260 ml) a 25°C. Se calentó la reacc¡ón a 80°C durante 16 h después de lo cual la CCF (DCM:MeOH=10:1; Rf=0,4) y la CL-EM mostraron que la reacc¡ón había f¡nal¡zado. Se enfr¡ó la mezcla, se f¡ltró y se lavó con EtOAc (200 ml) y se concentró para proporc¡onar el prod. ¡nt. 1.1a en bruto como un sól¡do rojo que se usó d¡rectamente s¡n pur¡f¡cac¡ón.
Etapa B: Preparación del prod. int. 1.1b
Figure imgf000047_0003
Se ag¡tó una d¡soluc¡ón de prod. ¡nt. 1.1a (11,4 g, 54,4 mmol, 1,00 equ¡v.) y 4-form¡l-3-n¡trobenzoato de met¡lo (24,8 g, 59,8 mmol, 1,10 equ¡v.) en tolueno (200 ml) a 25°C durante 18 h. La Cc F (éter de petróleo:EtOAc=1:2) mostró que la reacc¡ón había f¡nal¡zado, y se concentró la mezcla para proporc¡onar un producto en bruto que se pur¡f¡có med¡ante cromatografía sobre gel de síl¡ce (éter de petróleo:EtOAc=de 10:1 a 8:1 a 4:1) para dar el prod. ¡nt. 1.1b (11,3 g) como un sól¡do amar¡llo. 1H-RMN (CDCla) 8 8,86 (d, J=1,3 Hz, 1H), 8,40 (dd, J=7,9, 1,3 Hz, 1H), 8,11 (s, 1H), 7,54 (d, J=7,9 Hz, 1H), 3,97-4,05 (m, 3H), 3,27 (s, 2H), 1,60 ppm (s, 9H).
Etapa C: Preparación del prod. int. 1.1c
Figure imgf000047_0004
Se añad¡ó polvo de h¡erro (6,79 g, 122 mmol) a una d¡soluc¡ón de prod. ¡nt. 1.1b (23,4 g, 20,3 mmol, 1,00 equ¡v.) en ác¡do acét¡co glac¡al (230 ml) a 60°C. Se ag¡tó la mezcla a 85°C durante 3 h. La CCF (éter de petróleo:EtOAc=1:2; Rf=0,43) mostró que la reacc¡ón había f¡nal¡zado, y se enfr¡ó la mezcla, se f¡ltró, se lavó con ác¡do acét¡co (100 ml*2) y se concentró. Se diluyó el residuo en bruto con EtOAc (100 ml) y se lavó con NaHCO3 ac. (50 ml*3) y se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. Se purificó el residuo mediante cromatografía sobre gel de sílice para proporcionar 15,9 g del prod. int. 1.1c como un sólido amarillo. 1H-RMN (CDCh) 87,95 (s, 1H), 7,76 (dd, J=8,2, 1,5 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,46 (d, J=8,2 Hz, 1H), 3,93 (s, 3H), 2,99 (s, 2H), 1,56 (s, 9H).
Etapa D: Preparación del prod. int. 1.1d
Figure imgf000048_0001
Se agitó una disolución de prod. int. 1.1c (8,00 g, 25,3 mmol) en HCl/dioxano (160 ml) a 25°C durante 16 h, después de lo cual la CL-EM mostró que la reacción había finalizado. Se concentró la mezcla para proporcionar 12,5 g del prod. int. 1.1d como un sólido amarillo claro que se usó directamente sin purificación. 1H-RMN (DMSO-d6) 8 13,43 (s a, 1H), 13,00 (s a, 1H), 10,20 (s, 1H), 9,22 (s, 1H), 7,96 (s, 1H), 7,85-7,92 (m, 2H), 7,78-7,83 (m, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,52 (s, 2H).
Etapa E: Preparación del prod. int. 1.1e
Figure imgf000048_0002
Se añadieron 5,0 g (13,3 mmol) de HBTU y 7,7 ml (44,4 mmol) de DIPEA a una disolución que contenía 3,3 g (11,1 mmol) de prod. int. 1.1d en 60 ml de d Mf a 0°C. Después de 5 minutos, se añadieron 2,2 g (21,7 mmol) de din-propilamina y se agitó la reacción hasta temperatura ambiente durante la noche. Se extinguió la reacción con 20 ml de NH4Cl saturado y después 20 ml de agua. Se extrajo la mezcla con EtOAc (3 x 30 ml) y se lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera (2x), después se secaron sobre Na2SO4. Después de la retirada del agente desecante y la concentración de la disolución de EtOAc, se purificó el residuo sobre gel de sílice (80 g de columna; del 0% al 20% de metanol/DCM) para proporcionar 3,0 g del prod. int. 1.1e. 1H-RMN (CDCla) 87,92 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,86 (dd, J=8,2, 1,5 Hz, 1H), 7,38 (d, J=8,2 Hz, 1H), 6,89 (s, 1H), 3,92 (s, 3H), 3,39 (t, J=7,5 Hz, 4H), 3,22 (s, 2H), 1,68 (m, 4H), 0,91 (s a, 6H). ESI, m/z 343 [M+H].
Etapa F: Preparación del prod. int. 1.1f
Figure imgf000048_0003
Se enfrió una disolución que contenía 1,8 g (5,3 mmol) de prod. int. 1.1e en 30 ml de diclorometano hasta 0°C y se trató con 2,2 ml (7,9 mmol) de TEA y después 1,7 g (7,9 mmol) de Boc2O. Se agitó la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente durante la noche y después se extinguió con 10 ml de agua. Se separaron las fases y volvió a extraerse la fase acuosa con diclorometano (3 x 30 ml). Se lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera y se secaron sobre Na2SO4. Se retiró el disolvente y se purificó el residuo mediante cromatografía sobre gel de sílice (80 g de columna; del 0% al 75% de EtOAc/hexanos) para proporcionar el prod. int. 1.1f deseado como un sólido blanco.
Etapa G: Preparación del prod. int. 1.1g
Figure imgf000049_0001
Se enfrió una disolución que contenía 500 mg (1,13 mmol) de prod. int. 1.1f en 10 ml de una mezcla 1:1 de THF y agua hasta 0°C y se trató con 1,7 ml (1,7 mmol) de LiOH 1 N. Después de agitar durante 16 h, se añadieron trozos de hielo, seguido de suficiente disolución de ácido cítrico al 5% como para producir un precipitado (pH~5,5). Se lavó la mezcla resultante tres veces con EtOAc y se lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera y se secaron sobre Na2SO4. Se evaporó la disolución para proporcionar 419 mg del prod. int. 1.1g como un sólido amarillo pálido, que se usó sin purificación.
Etapa H: Preparación del compuesto 1.1
Figure imgf000049_0002
Se añadieron 46 mg (0,12 mmol) de HATU a una disolución que contenía 43 mg (0,10 mmol) de prod. int. 1.1f en 1,0 ml de DMF. Se agitó la mezcla de reacción durante 5 minutos y después se trató con 30 mg (0,12 mmol) de 7-N-Boc-amino-1,2,3,4-tetrahidroquinolina y 0,022 ml (0,20 mmol) de NMM Se agitó la mezcla de reacción durante 16 h, después se trató con 5 ml de disolución saturada de NH4Cl y 5 ml de agua. Se extrajo la mezcla resultante tres veces con EtOAc y se lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera, después se secaron sobre Na2SO4. Después de la evaporación del disolvente, se disolvió el aceite en bruto en 3 ml de DCM y después se enfrió hasta 0°C. Después se añadieron a la mezcla 0,6 ml de TFA. Se agitó la mezcla durante 4 h, se evaporó y se purificó el residuo resultante mediante cromatografía de fase inversa para proporcionar la sal de TFA del compuesto 1.1 como un sólido blanco. 1H-RMN (CD3OD) 8 7,96 (s, 1H), 7,95 (s, 1H), 7,85 (d, J=2,4 Hz, 1H), 7,79 (d, J=8 , 8 Hz, 1H), 7,38 (d, J=7,5 Hz, 1H), 7,25 (d, J=7,5 Hz, 1H), 7,10 (s, 1H), 3,55 (t, J=7,5 Hz, 6 H), 3,33 (m, 2H), 2,90 (t, J=6 , 6 Hz, 2H), 2,10 (m, 1H), 1,69 (m, 4H), 0,77 (s a, 6 H). CL-EM [M+H] = 460,25.
EJEMPLO 2
Compuestos 1.1-1.67
La tabla 1 muestra los compuestos 1.1-1.67. Los compuestos 1.2-1.67 (tabla 1) pueden prepararse de una manera similar a la usada para la síntesis del compuesto 1.1 (ejemplo 1 ) usando el producto intermedio 1.1 f y una amina sustituida de manera apropiada. Los compuestos 1.50, 1.60 y 1.67 se usan en los compuestos reivindicados.
Tabla 1: Compuestos 1.1-1.67 (de los cuales los compuestos 1.50, 1.60y 1.67 son según la presente invención, siendo compuestos de referencia los demás compuestos)
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000053_0001
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Figure imgf000065_0001
Figure imgf000066_0001
EJEMPLO 3
Síntesis de anilidas 8 -sustituidas
Preparación de 2-amino-8-(nicotinamido)-N,N-dipropil-3H-benzo[b]azepin-4-carboxamida (compuesto 1.62)
Figure imgf000067_0001
Etapa A: Preparación del compuesto 1.62
A una disolución que contenía 46 mg (0,10 mmol) de (8-bromo-4-(dipropilcarbamoil)-3H-benzo[b]azepin-2-il)carbamato de terc-butilo en 5 ml de DMF se le añadieron 65 mg (0,20 mmol) de Cs2CO3 y 15 mg (0,12 mmol) de nicotinamida. Se desgasificó la disolución, después se trató con 18 mg (0,2 equiv.) de BrettPhos Pd G3 y 11 mg (0,2 equiv.) de BrettPhos y se calentó a 90°C durante 12 h. Se enfrió la mezcla de reacción y se sometió a cromatografía mediante HPLC preparativa para proporcionar 6 mg del compuesto acoplado y desprotegido deseado como un sólido blanquecino. 1H-RMN (DMSO-d6) 810,4 (s, 1H), 9,10 (d, J=1,6 Hz, 1H), 8,76 (d, J=8,0 Hz, 1H), 8,28 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,55 (m, 1H), 7,52 (s, 1H), 7,36 (d, J=8,2 Hz, 1H), 7,27 (d, J=8,0 Hz, 1H), 6,80 (s a, 1H), 6,68 (s, 1H), 3,44 (m, 4H), 2,69 (m, 1H), 1,54 (m, 4H), 0,89 (s a, 6H). CL-EM (M+H) = 406,2.
EJEMPLO 4
Síntesis de sulfonamidas 8-sustituidas
Preparación de 2-amino-A/,W-dipropil-8-(A/-(piridin-3-il)sulfamoil)-3H-benzo[b]azepin-4-carboxamida (compuesto 1.63)
Figure imgf000067_0002
Etapa A: Preparación del compuesto 1.63
A una disolución que contenía 460 mg (1,0 mmol) de (8-bromo-4-(dipropilcarbamoil)-3H-benzo[b]azepin-2-il)carbamato de terc-butilo en 50 ml de dioxano se le añadieron 210 mg (2,0 mmol) de W,W-diisopropiletilamina y 140 mg (1,2 mmol) de benciltiol. Se desgasificó la disolución, después se trató con 180 mg (0,20 mmol) de Pd2(dba)3 y 116 mg (0,20 mmol) de XantPhos y se calentó a 90°C durante 6 h. Se enfrió la mezcla de reacción y se filtró a través de Celite, después se sometió a cromatografía mediante cromatografía de fase inversa para proporcionar 250 mg del tiol éter deseado, que se disolvió inmediatamente en DCM (20 ml) y ácido acético (0,5 ml). Se enfrió la disolución resultante en un baño de agua helada y se añadieron 1,3-dicloro-5,5-dimetil-2-imidazolidin-diona (197 mg, 1,0 mmol). Después de 2 h, se extrajo la mezcla con DCM y salmuera y se secaron y evaporaron los extractos orgánicos. Se disolvió el residuo en MeCN y se trató con 1-metil-1H-imidazol y 3-aminopiridina a 0°C y se agitó hasta temperatura ambiente a lo largo de 2 h. Se extrajo la disolución con salmuera y se secó sobre Na2SO4. Después se disolvió el residuo en 4 ml de DCM y se trató con 1 ml de TFA y se agitó durante 2 h. La evaporación del disolvente y la purificación mediante HPLC de fase inversa proporcionaron 30 mg del compuesto 1.63 deseado. 1H-RMN (DMSO-d6) 8 10,5 (s a, 1H), 8,32 (s, 1H), 8,25 (d, J=2,0 Hz, 1H), 7,54 (d, 8,0 Hz, 1H), 7,52 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,22 (dd, J=8,0, 2,0 Hz, 1H), 7,07 (m, 2H), 6,73 (s, 1H), 3,30 (m, 4H), 2,95 (s, 2H), 2,11 (s, 1H), 1,54 (m, 4H), 0,85 (s a, 6 H). CL-EM (M+H) = 442,1.
EJEMPLO 5
Síntesis de grupo de unión-cargas activas modificadas (LP):
Preparación de ((5-(2-amino-4-(dipropil-carbamoil)-3H-benzo[b]azepin-8-carboxamido)piridin-3-il)metil)carbamato de 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo (compuesto-grupo de unión 2.1 )
Figure imgf000068_0001
Se añadieron 54 mg (0,07 mmol) de MC-Val-Cit-PAB-PNP (n.° de CAS 159857-81-5) a una disolución que contenía 40 mg (0,07 mmol) de 2-amino-N8-(5-(aminometil)piridin-3-il)-N4,N4-dipropil-3H-benzo[b]azepin-4,8-dicarboxamida en 1,0 ml de DMF y 32 |il (0,18 mmol) de DIPEA. Se agitó la mezcla de reacción durante 16 h, después se purificó directamente mediante cromatografía de fase inversa (sin TFA). Se liofilizaron las fracciones limpias para proporcionar 60 mg (71%) del producto deseado, que se disolvió en 5 ml de DCM y se trató con 1 ml de TFA a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla durante 45 minutos y después se evaporó. Se purificó el residuo resultante mediante cromatografía de fase inversa (sin TFA) para proporcionar 34 mg (62%) del compuesto-grupo de unión 2.1 como un sólido blanco.
1H-RMN (CD3OD) 8 8,81 (s, 1H), 8,25 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 7,72 (s, 1H), 7,58 (m, 2H), 7,45 (d, J=8,2 Hz, 2H), 7,33 (d, J=8,4 Hz, 2H), 6,91 (s, 1H), 6,75 (s, 2H), 5,08 (s, 2H), 4,49 (m, 1H), 4,39 (m, 2H), 4,14 (d, J=6,5 Hz, 1H), 3,47 (t, J=7,1 Hz, 2H), 3,42 (m, 4H), 3,15 (m, 1H), 3,10 (m, 1H), 2,27 (t, J=7,4 Hz, 2H), 2,05 (m, 1H), 1,88 (m, 1H), 1,75-1,52 (m, 13H), 1,31 (m, 2H), 0,97 (t, J=6,5 Hz, 6 H). CL-EM [M+H] = 1033.
EJEMPLO 6
Síntesis de grupo de unión-cargas activas modificadas (LP):
Preparación de 2-amino-W8-(5-((6-(4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)metil)ciclohexano-1-carboxamido)hexanamido)metil)piridin-3-il)-W4,W4-dipropil-3H-benzo[b]azepin-4,8-dicarboxamida (compuesto-grupo de unión 2.2 )
Figure imgf000069_0001
Etapa A: Preparación del compuesto-grupo de unión 2.2
Figure imgf000069_0002
Se añadieron 50 mg (0,11 mmol) de 6-[[4-(maleimidometil)ciclohexil]carboxamido]caproato de N-succinimidilo (n.° de CAS 125559-00-4) a una disolución que contenía 60 mg (0 ,11 mmol) de 2-amino-N8-(5-(aminometil)piridin-3-il)-N4,N4-dipropil-3H-benzo[b]azepin-4,8-dicarboxamida en 2,0 ml de DCM y 15 |il (0,11 mmol) detrietilamina. Se agitó la mezcla de reacción durante 16 h y después se purificó directamente mediante cromatografía de fase inversa (sin TFA). Se liofilizaron las fracciones limpias para proporcionar el producto deseado, que se disolvió en 5 ml de DCM y se trató con 1 ml de TFA a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla durante 2 h y después se evaporó. Se purificó el residuo resultante mediante cromatografía de fase inversa (sin TFA) para proporcionar 49 mg del compuesto-grupo de unión 2.2 como un sólido blanco. 1H-RMN (CD3OD) 8 8,78 (s, 1H), 8,25 (s, 2H), 7,70 (d, J=1,8 Hz, 1H), 7,58 (dd, J=1,8, 8,1 Hz, 1H), 7,46 (d, J=8,3 Hz, 1H), 6,91 (s, 1H), 6,77 (s, 2H), 4,42 (s, 2H), 3,43 (m, 4H), 3,13 (t, J=6,9 Hz, 2H), 2,85 (d, J=16,6 Hz, 1H), 2,29 (t, J=7,3 Hz, 2H), 2,05 (m, 1H), 1,8-1,6 (m, 12H), 1,51 (m, 1H), 1,37 (m, 4H), 1,11-0,84 (m, 9H). CL-EM (M+H) = 767.
EJEMPLO 7
Síntesis de grupo de unión-cargas activas modificadas (LP)
Ejemplo 7A: Preparación de 2-amino-W8-(5-((6-(4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)metil)ciclohexano-1-carboxamido)hexanamido)metil)piridin-3-il)-W4,W4-dipropil-3H-benzo[b]azepin-4,8-dicarboxamida (compuesto-grupo de unión 2.3)
Figure imgf000070_0001
Se trató una disolución que contenía 58 mg (0,10 mmol) de compuesto 1.35 y 30 mg (0,1 mmol) de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo en 2 ml de DCM con 0,07 ml (0,4 mmol) de DIPEA y se agitó la reacción durante 4 h a temperatura ambiente. Se purificó la mezcla de reacción sin tratamiento final mediante cromatografía de fase inversa para proporcionar 28 mg del compuesto-grupo de unión 2.3 como un sólido blanco. 1H-RMN (CD3OD) 8 8,81 (d, J=2,3 Hz, 1H), 8,19 (d, J=1,9 Hz, 1H), 8,08 (t, J=2,1 Hz, 1H), 7,90 (m, 2H), 7,64 (dd, J=1,9, 8,1 Hz, 1H), 7,25-7,15 (m, 5H), 7,06 (s, 1H), 6,77 (s, 2H), 4,62-4,57 (m, 3H), 4,39 (s, 2H), 3,45-3,40 (m, 4H), 3,39 (t, J=7,5 Hz, 2H), 3,10 (m, 1H), 2,90 (m, 1H), 2,16 (t, J=7,5 Hz, 2H), 1,70 (m, 4H), 1,50 (m, 4H), 1,10 (m, 4H), 0,95 (m, 6 H). CL-EM (M+H) = 775,8.
Pudieron prepararse los siguientes compuestos-grupos de unión, los compuestos-grupos de unión 2.4 a 2.7, de una manera similar a la descrita para el compuesto-grupo de unión 2.3 anterior haciendo reaccionar el compuesto 1.35 con un grupo de unión sustituido de manera apropiada.
Compuesto-grupo de unión 2.4
(S)-2-amino-N8-(5-((2-(6-(4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)metil)ciclohexano-1-carboxamido)hexanamido)-3-fenilpropanamido)metil)piridin-3-il)-N4 ,N4-dipropil-3H-benzo[b]azepin-4,8-dicarboxamida
Figure imgf000070_0002
A partir de LC-smcc para proporcionar un sólido blanco. 1H-RMN (CD3OD) 8 8,79 (d, J=2,0 Hz, 1H), 8,17 (d, J=2,0 Hz, 1H), 8,09 (t, J=2,0 Hz, 1H), 7,78 (s, 1H), 7,69 (m, 1H), 7,55 (m, 1H), 7,25-7,15 (m, 5H), 6,96 (s, 1H), 6,79 (s, 2H), 4,62­ 4,57 (m, 1H), 4,38 (s, 2H), 3,45-3,40 (m, 6 H), 3,14 (m, 1H), 3,05 (t, J=7,5 Hz, 2H), 2,90 (m, 1H), 2,18 (t, J=7,5 Hz, 2H), 2,10 (m, 1H), 1,80-1,60 (m, 10H), 1,50-1,30 (m, 6 H), 1,20-1,10 (m, 3H), 0,95 (m, 6 H). CL-EM (M+H) = 914,9.
Compuesto-grupo de unión 2.5
(S)-2-amino-N8-(5-(4-bencil-24-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-3,6,22-trioxo-9,12,15,18-tetraoxa-2,5,21-triazatetracosil)piridin-3-il)-N4,N4-dipropil-3H-benzo[b]azepin-4,8-dicarboxamida
Figure imgf000071_0001
A partir de mal-PEG4-NHS para proporcionar un sólido blanco. 1H-RMN (CD3OD) 8 8,91 (d, J=2,0 Hz, 1H), 8,24 (d, J=2,0 Hz, 1H), 8,15 (t, J=2,0 Hz, 1H), 8,01-7,98 (m, 2H), 7,72 (d, 8,0 Hz, 1H), 7,25-7,15 (m, 5H), 7,12 (s, 1H), 6,78 (s, 2H), 4,60 (m, 1H), 4,43 (s, 2H), 3,73 (t, J=7,5 Hz, 2H), 3,70-3,40 (m, 20H), 3,39 (s, 2H), 3,15 (m, 1H), 2,95 (m, 1H), 2,45 (t, J=7,5 Hz, 2H), 1,70 (q, J=7,5 Hz, 4H), 0,97-0,91 (m, 6 H). CL-EM (M+H) = 980,9.
Compuesto-grupo de unión 2.6
Sal de trifluoroacetato de (S)-2-amino-N8-(5-((2-(4-(4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)fenil)butanamido)-3-fenilpropanamido)metil)piridin-3-il)-N4 ,N4-dipropil-3H-benzo[b]azepin-4,8-dicarboxamida
Figure imgf000071_0002
A partir de éster de NHS-SMPB para proporcionar un sólido blanco. 1H-RMN (CD3OD) 8 8,95 (d, J=2,0 Hz, 1H), 8,63 (d, J=2,0 Hz, 1H), 8,28 (s, 1H), 8,24 (m, 2H), 7,98 (m, 2H), 7,70 (d, J=9,0 Hz, 1H), 7,25-7,15 (m, 9H), 7,16 (s, 1H), 6,94 (s, 2H), 4,60 (m, 1H), 4,51-4,37 (m, 2H), 3,15 (m, 1H), 2,91 (m, 1H), 2,51 (t, J=7,5 Hz, 2H), 2,22 (m, 2H), 1,81 (t, J=7,5 Hz, 2H), 1,70 (q, J=7,5 Hz, 4H), 0,95 (m, 6 H). CL-EM (M+H) = 823,8.
Compuesto-grupo de unión 2.7
((S)-1-(((5-(2-amino-4-(dipropilcarbamoil)-3H-benzo[b]azepin-8-carboxamido)piridin-3-il)metil)amino)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)carbamato de 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo
Figure imgf000071_0003
A partir de mc-VC-PABA-PNP para proporcionar un sólido blanco. 1H-RMN (CD3OD) 8 8,78 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 8,11 (s, 1H), 7,89 (m, 2H), 7,64 (dd, J=1,9, 8,1 Hz, 1H), 7,49 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,25-7,15 (m, 7H), 7,06 (s, 1H), 6,77 (s, 2H), 4,96 (s, 2H), 4,48 (m, 1H), 4,49-4,34 (m, 3H), 4,14 (d, J=7,5 Hz, 1H), 3,46-3,44 (m, 6 H), 3,22 (m, 1H), 3,11 (m, 1H), 2,90 (m, 1H), 2,33-2,25 (m, 2H), 2,08 (m, 1H), 1,91 (m, 1H), 1,75-1,50 (m, 13H), 1,30 (m, 2H), 1,00-0,85 (m, 12H). CL-EM (M+H) = 1181,4.
Compuesto-grupo de unión 2.8
(2-(1-(5-(2-amino-4-(dipropilcarbamoil)-3H-benzo[b]azepin-8-carboxamido)piridin-2-il)piperidin-4-carboxamido)etil)carbamato de 4-((R)-2-((R)-2-(5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)pentanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo
Figure imgf000072_0001
A partir del compuesto 1.61 y mc-VC-PABA-PNP para proporcionar un sólido blanco. 1H-RMN (CD3OD) 8 10,1 (s, 1H), 9,49 (s, 1H), 9,33 (s a, 2H), 7,88 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,80 (s, 1H), 7,64 (s, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,45 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,35 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,02 (s, 1H), 6,85-6,80 (m, 2H), 6,75 (s, 1H), 4,25 m, 2H), 3,54-3,34 (m, 10H), 3,05 (s, 4H), 2,85­ 2,75 (m, 4H), 2,44 (m, 1H), 1,99 (m, 1H), 1,70-1,60 (m, 12H), 0,95 (s a, 6 H).
Compuesto-grupo de unión 2.9
(1-(5-(2-amino-4-(dipropilcarbamoil)-3H-benzo[b]azepin-8-carboxamido)piridin-2-il)piperidin-4-il)carbamato de 4-((R)-2-((R)-2-(5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)pentanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo
Figure imgf000072_0002
A partir del compuesto 1.57 y mc-VC-PABA-PNP para proporcionar un sólido blanco. 1H-RMN (CD3OD) 8 8,37 (d, J=2,5 Hz, 1H), 7,88 (dd, J=8,0, 2,5 Hz, 1H), 7,57-7,54 (m, 3H), 7,43 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,31 (d, J=8,0 Hz, 2H), 6,89 (s, 1H), 6,85-6,80 (m, 1H), 6,78 (s, 2H), 5,03 (s, 2H), 4,45 (m, 2H), 4,12 (m, 3H), 3,65 (m, 1H), 3,54 (t, J=7,5 Hz, 2H), 3,44 (m, 4H), 3,20-2,96 (m, 4H), 2,26 (t, J=7,5 Hz, 2H), 2,05 (m, 1H), 1,99-1,50 (m, 18H), 1,30 (m, 2H), 0,97 (t, J=7,5 Hz, 6 H), 0,89 (s a, 6 H).
Compuesto-grupo de unión 2.20
(2-(((5-(2-amino-4-(dipropilcarbamoil)-3H-benzo[b]azepin-8-carboxamido)piridin-3-il)metil)amino)-2-oxoetil)carbamato de 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo
Figure imgf000072_0003
A partir del compuesto 1.64 y mc-VC-PABA-PNP para proporcionar un sólido blanco. 1H-RMN (CD3OD) 88,81 (s, 1H), 8,25 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 7,72 (s, 1H), 7,58 (m, 2H), 7,45 (d, J=8,2 Hz, 2H), 7,33 (d, J=8,4 Hz, 2H), 6,91 (s, 1H), 6,75 (s, 2H), 4,96 (s, 2H), 4,48 (m, 1H), 4,49-4,34 (m, 3H), 4,14 (d, J=7,5 Hz, 1H), 3,46-3,44 (m, 6 H), 3,22 (m, 1H), 3,11 (m, 1H), 2,90 (m, 1H), 2,33-2,25 (m, 2H), 2,08 (m, 1H), 1,91 (m, 1H), 1,75-1,50 (m, 13H), 1,30 (m, 2H), 1,00-0,85 (m, 12H). CL-EM (M+H) = 1090,2.
Compuesto-grupo de unión 2.21
2-amino-N8-(6-(4-((2-(4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)metil)ciclohexano-1-carboxamido)etil)carbamoil)piperidin-1-il)piridin-3-il)-N4,N4-dipropil-3H-benzo[b]azepin-4,8-dicarboxamida
Figure imgf000073_0001
A partir del compuesto 1.61 y 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo para proporcionar un sólido blanco. 1H-RMN (DMSO-d6) 8 10,1 (s, 1H), 8,46 (s, 1H), 8,61 (s a, 2H), 7,92 (dd, J=8,0, 2,5 Hz, 1H), 7,81 (m, 1H), 7,72 (m, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,53 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,41 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,03 (s, 2H), 6,85-6,80 (m, 2H), 6,78 (s, 1H), 4,25 (m, 2H), 3,65 (m, 1H), 3,54 (t, J=7,5 Hz, 2H), 3,44 (m, 4H), 3,20-2,96 (m, 4H), 2,26 (t, J=7,5 Hz, 2H), 2,05 (m, 1H), 1,99-1,50 (m, 18H), 1,30 (m, 2H), 0,97 (t, J=7,5 Hz, 6 H), 0,89 (s a, 6 H). CL-EM (M+H) = 794,5.
Ejemplo 7B: Síntesis de (2-(4-((3-(2-amino-4-(dipropilcarbamoil)-3H-benzo[b]azepin-8-carboxamido)-7,8-dihidro-1,6-naftiridin-6(5H)-il)metil)benzamido)etil)carbamato de 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo (compuesto-grupo de unión 2.10)
Figure imgf000073_0002
Etapa A: Preparación del prod. in t 7B-1
Figure imgf000073_0003
A una disolución con agitación de diclorhidrato de 3-nitro-5,6,7,8-tetrahidro-1,6-naftiridina (1,0 g, 3,97 mmol) y 4-(bromometil)benzoato de terc-butilo (1,18 g, 4,36 mmol) en DMF (40 ml) enfriada en un baño de agua helada se le añadió gota a gota TEA (2,76 ml, 19,8 mmol). Se agitó la disolución transparente resultante durante la noche mientras se finalizaba el baño de enfriamiento. La CL-EM mostró principalmente el producto deseado con una pequeña cantidad de SM restante. Se concentró la mezcla de reacción a vacío y se diluyó el residuo con agua (45 ml) y disolución saturada de NaHCO3 (5 ml), después se extrajo con EtOAc (3x). Se secaron los extractos combinados (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. Se absorbió el residuo sobre gel de sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna (ISCO Gold 40 g; carga seca, el 0-20% de CH2Ch/MeOH) para proporcionar 1,32 g de 4-((3-nitro-7,8-dihidro-1,6-naftiridin-6(5H)-il)metil)benzoato de terc-butilo como un jarabe de color naranja. 1H-RMN (DMSO-d6) 8 9,15 (d, J=2,5 Hz, 1H), 8,36 (d, J=2,5 Hz, 1H), 7,88 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,49 (d, J=8,0 Hz, 2H), 4,00 (s, 3H), 3,79 (s, 2H), 3,71 (s, 2H), 3,04 (m, 2H), 2,85 (m, 2H), 1,55 (s, 9H).
Etapa B: Preparación del prod. int. 7B-2
Figure imgf000074_0001
A una disolución con agitación de 4-((3-nitro-7,8-dihidro-1,6-naftiridin-6(5H)-il)metil)benzoato de terc-butilo (1,32 g, 3,57 mmol) en 27 ml de DCM se le añadió HCl 4 M (9 ml, 36,0 mmol) en dioxano a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla de reacción durante 3 h, después se concentró a presión reducida. Se secó el residuo a vacío para proporcionar un sólido amarillo claro que se usó directamente sin purificación adicional. 1H-RMN (CD3OD) 8 9,33 (d, J=2,5 Hz, 1H), 8,53 (d, J=2,5 Hz, 1H), 8,19 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,72 (d, J=8,0 Hz, 2H), 4,82 (m, 2H), 4,66 (m, 2H), 4,61 (s, 2H), 3,44 (m, 2H).
Etapa C: Preparación del prod. int. 7B-3
Figure imgf000074_0002
A una disolución con agitación de diclorhidrato de ácido 4-((3-nitro-7,8-dihidro-1,6-naftiridin-6(5H)-il)metil)benzoico (1,28 g, 3,32 mmol), clorhidrato de (2-aminoetil)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metilo (1 , 060 g, 3,32 mmol) y diisopropiletilamina (4,65 ml, 26,6 mmol) en 30 ml de DCM enfriada en un baño de agua helada se le añadió gota a gota 2,4,6-trióxido de 2,4,6-tripropil-1,3,5,2,4,6-trioxatrifosfinano (T3P®; 3,0 ml, 5,0 mmol). Se agitó la mezcla durante la noche mientras finalizaba el baño de enfriamiento. Se sometió a reparto la mezcla de reacción entre NaHCO3 saturado y EtOAc. Se extrajo la fase acuosa con EtOAc (2x) y se lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron para dar 2 , 2 g del producto deseado como un sólido rojo anaranjado.
Etapa D: Preparación del prod. int. 7B-4
Figure imgf000074_0003
Se agitó una mezcla de (2-(4-((3-nitro-7,8-dihidro-1,6-naftiridin-6(5H)-il)metil)benzamido)etil)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metilo (2,0 g, 3,5 mmol) y hierro (1,930 g, 34,6 mmol) en ácido acético (30 ml)/agua (3 ml) a 50°C durante 45 min. Se enfrió la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente, se filtró y se concentró. Se diluyó el residuo con NaHCO3 saturado (90 ml) y EtOAc (90 ml). Se recogió el precipitado, se lavó con agua y EtOAc y se secó a vacío para proporcionar 1,9 g de un sólido marrón amarillento, que se suspendió en CH2Ch/MeOH 1:1 y se absorbió sobre gel de sílice. La purificación mediante cromatografía ultrarrápida en columna (ISCO Gold 80 g; carga seca, el 0-50% de B en gradiente de CH2Ch, B: CH2Ch/MeOH/NH4OH conc. 80:18:2) dio 1,12 g del producto deseado como un sólido blanquecino.
apa : reparac n e pro . n. -
Figure imgf000075_0001
A una disolución con agitación de ácido 2-((terc-butoxicarbonil)amino)-4-(dipropilcarbamoil)-3H-benzo[b]azepin-8-carboxílico (350 mg, 0,815 mmol) en DMF (5 ml) a temperatura ambiente se le añadió HATU (341 mg, 0,896 mmol). Se agitó la reacción durante 15 min antes de la adición de 669 mg (1,22 mmol) de (2-(4-((3-amino-7,8-dihidro-1,6-naftiridin-6(5H)-il)metil)benzamido)etil)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metilo en DMF (11 ml). Se agitó la reacción durante 35 min antes de la adición de 0,427 ml (2,44 mmol) de base de Hünig. Se agitó la disolución amarilla resultante durante 18 h, después se concentró a vacío. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida en columna (ISCO Gold 40 g; carga seca, el 0-50% de B en gradiente de CH2Ch, B: CH2Ch/MeOH/NH4OH conc. 80:18:2) para proporcionar 435 mg del producto deseado como un sólido amarillo claro.
Etapa F: Preparación del prod. int. 7B-6
Figure imgf000075_0002
A una disolución con agitación de (8-((6-(4-((2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)etil)carbamoil)bencil)-5,6,7, 8 -tetrahidro-1,6-naftiridin-3-il)carbamoil)-4-(dipropilcarbamoil)-3H-benzo[b]azepin-2-il)carbamato de terc-butilo (435 mg, 0,454 mmol) en 3,6 ml de DMF se le añadieron 0,90 ml (9,1 mmol) de piperidina a temperatura ambiente. Se agitó la reacción durante 1 h, después se concentró. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida en columna (ISCO Gold 24 g, el 0-50% de B en gradiente de CH2Ch, B: CH2Ch/MeOH/NH4OH conc. 80:18:2) para proporcionar 241 mg del producto deseado como un sólido amarillo claro.
Etapa G: Preparación del compuesto-grupo de unión 2.10
Figure imgf000075_0003
A una disolución con agitación de (8-((6-(4-((2-aminoetil)carbamoil)bencil)-5,6,7,8-tetrahidro-1,6-naftiridin-3-il)carbamoil)-4-(dipropilcarbamoil)-3H-benzo[b]azepin-2-il)carbamato de terc-butilo (80 mg, 0,109 mmol) y base de Hünig (0,057 ml, 0,326 mmol) en DMF (3,4 ml) bajo nitrógeno enfriada en un baño de agua helada se le añadió gota a gota una disolución de (4-nitrofenil)carbonato de 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo (80 mg, 0,109 mmol) en DMF (2 ml). Se agitó la reacción durante la noche mientras finalizaba el baño de enfriamiento. Después se concentró la mezcla de reacción y se neutralizó el residuo con NaHCO3 saturado y se purificó mediante una columna de fase inversa (Gold C1830 g; el 5-60% de CH3CN en agua, sin TFA). Se agruparon las fracciones, se concentraron para proporcionar 100 mg de un sólido amarillento, que se disolvió directamente en 50 ml de DCM y se trató con 10 ml de TFA. Se agitó la disolución resultante durante 1 h, después se concentró a presión reducida. Se secó el residuo a vacío, se neutralizó con NaHCO3 saturado y se purificó mediante cromatografía en columna de fase inversa (ISCO Gold C18 30 g; el 5-70% de MeCN en gradiente de agua, sin TFA). Se combinaron las fracciones principales y se liofilizaron para proporcionar 22 mg de un sólido blanquecino. 1H-RMN (CD3OD) 8 8,67 (d, J=2,5 Hz, 1H), 7,91 (d, J=2,5 Hz, 1H), 7,80 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,69 (d, J=2,5 Hz, 1H), 7,58-7,50 (m, 5H), 7,45 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,26 (d, J=8,5 Hz, 2H), 6,89 (s, 1H), 6,77 (s, 2H), 5,04 (s, 2H), 4,90 (m, 1H), 4,14 (d, J=7,5 Hz, 1H), 3,81 (s, 2H), 3,69 (s, 2H), 3,51-3,40 (m, 8 H), 3,34 (m, 2H), 3,22 (m, 1H), 3,11 (m, 2H), 2,97 (m, 2H), 2,90 (m, 3H), 2,25 (t, J=7,5 Hz, 2H), 2,06 (m, 1H), 1,88 (m, 1H), 1,75-1,52 (m, 12H), 1,28 (m, 2H), 0,95 (t, J=7,5 Hz, 6 H), 0,89 (s a, 6 H). CL-EM (M+H) = 1235,9.
Ejemplo 7C: Síntesis de (2-(4-((3-(2-amino-4-(dipropilcarbamoil)-3H-benzo[b]azepin-8-carboxamido)-7,8-dihidro-1,6-naftiridin-6(5H)-il)metil)benzamido)etil)carbamato de 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo (compuesto-grupo de unión 2.11)
Figure imgf000076_0001
Etapa A: Preparación del compuesto-grupo de unión 2.11
Figure imgf000076_0002
Se agitó una disolución de 84,5 mg (0,115 mmol) de (8-((6-(4-((2-aminoetil)carbamoil)bencil)-5,6,7,8-tetrahidro-1,6-naftiridin-3-il)carbamoil)-4-(dipropilcarbamoil)-3H-benzo[b]azepin-2-il)carbamato de terc-butilo de la etapa F anterior, 4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)metil)ciclohexano-1-carboxilato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (38,3 mg, 0,115 mmol) y base de Hünig (0,040 ml, 0,229 mmol) en DCM (2,5 ml) a temperatura ambiente durante 16 h. Se concentró la mezcla de reacción hasta sequedad y se purificó el residuo mediante cromatografía en columna de fase inversa (ISCO Gold C18 100 g, el 5-70% de MeCN en gradiente de agua, sin TFA). Se agruparon y concentraron las fracciones deseadas para proporcionar 79 mg del producto deseado como un sólido amarillo, que posteriormente se disolvió en 2,5 ml de DCM a temperatura ambiente y después se trató con TFA (500 |al, 6,49 mmol). Después de 1 h, se concentró la mezcla de reacción, se secó el residuo a vacío, se neutralizó con NaHCO3 saturado y se purificó mediante cromatografía en columna de fase inversa (ISCO Gold C18 100 g; el 5-60% de MeCN en gradiente de agua, sin TFA). Se agruparon y concentraron las fracciones principales. Se liofilizó el residuo a partir de MeCN/agua para proporcionar 25 mg del producto deseado como un sólido blanquecino. 1H-RMN (CD3OD) 8 8,67 (d, J=2,5 Hz, 1H), 7,91 (d, J=2,5 Hz, 1H), 7,80 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,68 (d, J=2,5 Hz, 1H), 7,55 (dd, J=2,0, 8,0 Hz, 1H), 7,53 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,45 (d, J=8,0 Hz, 1H), 6,89 (s, 1H), 6,77 (s, 2H), 4,57 (s, 1H), 3,81 (s, 2H), 3,49-3,38 (m, 8 H), 3,00 (m, 2H), 2,90 (m, 2H), 2,84 (m, 1H), 2,11 (m, 1H), 1,88 (m, 1H), 1,70-1,58 (m, 8 H), 1,39 (m, 2H), 1,0-0,89 (m, 10H). CL-EM (M+H) = 856,8.
Ejemplo 7D: Síntesis de sal triple de TFA de 4-((3-((2-(4-((3-(2-amino-4-(dipropilcarbamoil)-3H-benzo[b]azepin-8-carboxamido)-7,8-dihidro-1,6-naftiridin-6(5H)-il)metil)benzamido)etil)tio)-2,5-dioxopirrolidin-1-il)metil)ciclohexano-1-carboxilato de perfluorofenilo (compuesto-grupo de unión 2.12 )
Figure imgf000077_0001
Preparación del compuesto-grupo de unión 2.12
Figure imgf000077_0002
ompuesto-grupo e un n 2 .1 2
Se agitó una disolución de 2-amino-N4,N4-dipropil-N8-(6-(4-((2-(piridin-2-ildisulfanil)etil)carbamoil)bencil)-5,6,7,8-tetrahidro-1,6-naftiridin-3-il)-3H-benzo[b]azepin-4,8-dicarboxamida (100 mg, 0,090 mmol) (sal triple de TFA) y clorhidrato de ácido 3,3’,3”-fosfanotriiltripropiónico (38,9 mg, 0,136 mmol) en 3 ml de acetonitrilo/agua 1:1 a temperatura ambiente durante 0,5 h. Se concentró la mezcla de reacción a vacío hasta sequedad para proporcionar el prod. int. 7D-1, un sólido espumoso amarillo que se usó directamente sin ninguna purificación adicional. Se convirtió este producto intermedio en el compuesto-grupo de unión 2.12 final según el esquema anterior. 1H-RMN (CD3OD) 8 8,77 (d, J=2,0 Hz, 1H), 8,22 (d, J=2,5 Hz, 1H), 8,00-7,95 (m, 3H), 7,10 (s, 1H), 4,57 (s a, 2H), 4,47 (s a, 2H), 4,11 (dd, J=9,0, 3,5 Hz, 1H), 3,76-3,62 (m, 3H), 3,45-3,35 (m, 4H), 3,40-3,35 (m, 4H), 3,24-3,18 (m, 4H), 2,98 (m, 1H), 2,71 (m, 1H), 2,54 (d, J=3,5 Hz, 0,5H), 2,50 (d, J=3,5 Hz, 0,5H), 2,15 (m, 2H), 1,83-1,79 (m, 2H), 1,74-1,64 (m, 6 H), 1,55-1,45 (m, 2H), 1,17-1,10 (m, 2H), 0,96 (s a, 3H), 0,91 (s a, 3H). CL-EM (M+H) = 1057,7.
Ejemplo 7E: Preparación de sal de TFA de 3-(2-amino-4-(dipropilcarbamoil)-7-metoxi-3H-benzo[b]azepin-8-carboxamido)-7,8-dihidro-1,6-naftiridin-6(5H)-carboxilato de 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo (compuesto-grupo de unión 2.14)
Figure imgf000078_0001
Preparado de manera similar al compuesto 1.1 usando ácido 2-amino-4-(dipropilcarbamoil)-3H-benzo[b]azepin-8-carboxílico y 3-amino-7,8-dihidro-1,6-naftiridin-6(5H)-carboxilato de terc-butilo comercialmente disponible (n.° de CAS 355819-02-2).
1H-RMN (DMSO-d6) 8 12,1 (s, 1H), 10,4 (s, 1H), 10,0 (s, 1H), 9,14 (s, 1H), 8,73 (d, J=2,4 Hz, 1H), 8,08 (d, J=7,6 Hz, 2H), 7,80 (d, J=8 , 8 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,60 (d, J=8,4 Hz, 2H), 7,41 (s, 1H), 7,34 (d, J=8 , 8 Hz, 2H), 7,03 (s, 1H), 7,00 (s, 1H), 5,99 (s a, 1H), 5,07 (s, 2H), 4,65 (m, 4H), 4,40 (m, 2H), 4,21 (m, 2H), 3,97 (s, 3H), 3,74 (t a, 2H), 3,37 (t, J=6 , 8 Hz, 5H), 3,29 (s, 2H), 3,11-2,95 (m, 4H), 2,22-1,95 (m, 4H), 1,60-1,15 (m, 12H), 0,88 (d, J=7,0 Hz, 6 H), 0,82 (d, J=7,0 Hz, 6 H). CL-EM [M+H] = 1090,5. 19F-RMN (DMSO-d6) 8 -74,5.
EJEMPLO 7F: Preparación de 3-(2-amino-4-(dipropilcarbamoil)-7-metoxi-3H-benzo[b]azepin-8-carboxamido)-7,8-dihidro-1,6-naftiridin-6(5H)-carboxilato de 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo (compuesto-grupo de unión 2.15)
Figure imgf000078_0002
Preparado de manera similar al compuesto 1.1 partiendo de ácido 2-amino-4-(dipropilcarbamoil)-7-metoxi-3H-benzo[b]azepin-8 -carboxílico.
EJEMPLO 7G: Preparación de 3-(2-amino-4-(dipropilcarbamoil)-7-fluoro-3H-benzo[b]azepin-8-carboxamido)-7,8-dihidro-1,6-naftiridin-6(5H)-carboxilato de 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo (compuesto-grupo de unión 2.16)
Figure imgf000078_0003
Preparado de manera similar al compuesto 1.1 partiendo de ácido 2-amino-4-(dipropilcarbamoil)-7-fluoro-3H-benzo[b]azepin-8 -carboxílico.
1H-RMN (DMSO-d6) 8 12,2 (s, 1H), 10,8 (s, 1H), 10,0 (s, 1H), 9,89 (s, 1H), 9,27 (s, 1H), 8 , 66 (s, 1H), 8,08 (d, J=2,4 Hz, 1H), 8,03 (s, 1H), 7,80 (d, J=8 , 8 Hz, 2H), 7,70-7,64 (m, 2H), 7,60 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,34 (d, J=8 , 8 Hz, 2H), 7,02 (s, 1H), 7,00 (s, 2H), 5,99 (s a, 1H), 5,07 (s, 2H), 4,65 (m, 4H), 4,40 (m, 2H), 4,21 (m, 2H), 3,73 (t a, 2H), 3,36 (m, 5H), 3,29 (s, 2H), 3,11-2,95 (m, 4H), 2,22-1,95 (m, 4H), 1,60-1,15 (m, 12H), 0,88 (d, J=7,0 Hz, 6 H), 0,82 (d, J=7,0 Hz, 6 H). CL-EM [M+H] = 1079,5.
Ejemplo 7F: Preparación de (3-(4-((3-(2-amino-4-(dipropilcarbamoil)-3H-benzo[b]azepin-8-carboxamido)-7,8-dihidro-1,6-naftiridin-6(5H)-N)metil)benzamido)-2,2-difluoropropil)carbamato de 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo (compuesto-grupo de unión 2.17)
Figure imgf000079_0001
Preparado de manera similar al compuesto 1.1.
La tabla 2 muestra los compuestos-grupos de unión 2.1-2.21. De estos, se usan 2.10, 2.14 y 2.17 en la invención reivindicada.
Tabla 2: Compuestos-grupos de unión 2.1-2.21 (de los cuales los compuestos-grupos de unión 2.10, 2.14 y 2.17 son según la presente invención, incluyéndose con propósitos de referencia los demás compuestos-grupos de unión)
Figure imgf000079_0002
Figure imgf000080_0001
Figure imgf000081_0001
Figure imgf000082_0001
EJEMPLO 8
Síntesis de conjugados de anticuerpo-benzazepina
Protocolo para la preparación del conjugado anticuerpo-benzazepina
Se intercambió el AcM (155 mg, 35,57 ml, 4,38 mg/ml en PBS) en HEPES (100 mM, pH 7,0, DTPA 1 mM) mediante filtración centrífuga de corte de peso molecular (Millipore, 30 kDa). Se transfirió la disolución de AcM resultante a un tubo cónico de 50 ml (31,873 ml en peso). Se determinó que la concentración de AcM era de 4,39 mg/ml mediante A280 (el contenido total de AcM era de 140 mg, se retiraron 3 mg para aplicaciones analíticas). A la disolución de AcM se le añadió TCEP (2,0 equiv., 1,85 ml, reserva 1 mM) a temperatura ambiente y se incubó la mezcla resultante a 37°C durante 1 h, con agitación suave. Tras enfriar hasta temperatura ambiente, se añadió una barra de agitación al tubo de reacción. Con agitación, se añadió DMA (10% v/v, 3,0 ml) gota a gota a la mezcla de reacción. Se añadió el compuesto-grupo de unión 2.1 (7,0 equiv., 647 ^l, DMA 10 mM) gota a gota y se permitió agitar la mezcla de reacción resultante a temperatura ambiental durante 30 minutos, momento en el cual N-etilmaleimida (3,0 equiv., DMA 100 mM, 28 |al). Después de 15 minutos adicionales de agitación, se añadió cisteína (6,0 equiv., HEPES 50 mM, 111 ^l). Después se intercambió el conjugado en bruto en PBS y se purificó mediante SEC preparativa (HiLoad 26/600, Superdex 200 pg) usando PBS como fase móvil. Se concentraron las fracciones puras mediante filtración centrífuga de corte de peso molecular (Millipore, 30 kDa), se esterilizaron por filtración y se transfirieron a tubos cónicos de 15 ml. Se determinaron las razones de fármaco-constructo de anticuerpo (razones molares) mediante los métodos descritos en el ejemplo 9.
EJEMPLO 9
Procedimiento general para la determinación de las razones de fármaco-anticuerpo
Cromatografía de interacción hidrófoba
Se inyectaron 10 ^l de una disolución 6 mg/ml del conjugado en una configuración de sistema de HPLC con una columna de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) TSKgel Butyl-NPR TM de TOSOH (tamaño de partícula de 2,5 |aM, 4,6 mm x 35 mm) acoplada. Después, a lo largo de un periodo de 18 minutos, se ejecutó un método en el que se desarrolló el gradiente de fase móvil desde el 100% de fase móvil A hasta el 100% de fase móvil B a lo largo del periodo de 12 minutos, seguido de un reequilibrado de seis minutos al 100% de fase móvil A. La velocidad de flujo era de 0,8 ml/min y se ajustó el detector a 280 nM. La fase móvil A era sulfato de amonio 1,5 M, fosfato de sodio 25 mM (pH 7). La fase móvil B era isopropanol al 25% en fosfato de sodio 25 mM (pH 7). Tras la ejecución, se integró el cromatograma y se determinó la razón molar sumando el área de pico ponderada.
Espectrometría de masas
Se inyectó un microgramo de conjugado en un dispositivo de CL/EM tal como un dispositivo Agilent 6550 iFunnel Q-TOF equipado con una fuente de ESI Dual Jet Stream de Agilent acoplada con el sistema de UHPLC 1290 Infinity de Agilent. Se obtuvieron datos sin procesar y se deconvolucionaron con un software tal como el software de análisis cuantitativo MassHunter de Agilent con BioConfirm usando el algoritmo de deconvolución de entropía máxima. Se calculó la masa promedio de los conjugados intactos de constructo de anticuerpo-compuesto inmunoestimulador mediante el software, que usó la altura de pico máximo al 25% para el cálculo. Después se importan estos datos a otro programa para calcular la razón molar del conjugado, tal como el calculador de razones molares de Agilent. EJEMPLO 10
Ensayos indicadores de TLR7/TLR8
Materiales y procedimientos generales
Las líneas de células indicadoras (concretamente HEK-Blue Null1, HEK-Blue hTLR7 y HEK-Blue hTLR8 ) se obtienen de InvivoGen. Las células se hacen pasar/expanden/almacenan en nitrógeno líquido según las instrucciones del proveedor. Normalmente, las células se dividen dos veces a la semana en los medios de crecimiento de DMEM complementado con suero bovino fetal al 10%, 1X NEAA, piruvato 1 mM, glutamina 2 mM, penicilina 50 |ig/ml, estreptomicina 50 U/ml (cada uno de Gibco) en presencia de los siguientes antibióticos, tal como se muestra en la tabla 3:
Tabla 3: Líneas de células indicadoras tratadas con antibióticos
Figure imgf000083_0001
Procedimiento general para la selección de moléculas pequeñas in vitro
Se añaden muestras de prueba (a las concentraciones deseadas diluidas en DMEM) a la placa de ensayo de 96 pocillos, 20 |il por pocillo. Se recogen las células indicadoras a partir de los matraces de cultivo tisular mediante incubación en PBS a 37°C durante dos minutos, después se retiran los medios en el matraz y se enjuagan las células con PBS. Se cuentan las células y se diluyen en los medios de detección HEK-Blue a 0,22 x 106 células/ml. Después se añaden 180 |il de células a la placa de ensayo que contiene los 20 |il de muestras de prueba y se incuban durante 17 horas a 37°C en una incubadora humidificada con el 5% de CO2. Se analiza la densidad óptica a 640 nm usando un lector de placas Envision (Perkin Elmer). Tal como se describe en la tabla 4, los compuestos de la divulgación con un valor de CE50 menor de 500 nM tienen actividad “A”, de desde 500 nM hasta 1 |iM tienen actividad “B” y mayor de 1 |iM tienen actividad “C”.
Tabla 4: Selección de moléculas pequeñas in vitro
Figure imgf000083_0002
EJEMPLO 11
Ensayo de selección de PBMC
Materiales y procedimientos generales
Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas de BenTek, se congelaron a 25 x 106 células/ml en DMSO al 10% (Sigma) preparado en suero bovino fetal (Gibco) y se almacenaron en nitrógeno líquido. Para el cultivo, se descongelaron rápidamente las PBMC en un baño de agua a 37°C y se diluyeron en RPMI 1640 (Lonza) precalentado complementado con suero bovino fetal al 10%, glutamina 2 mM, penicilina 50 |ig/ml, estreptomicina 50 U/ml (todos de Gibco) y se centrifugaron durante 5 minutos a 500 x g. Se suspendieron las PBMC en los medios de crecimiento descritos anteriormente y se cultivaron a una concentración de 1 x 106 células por ml a 37°C en una incubadora con el 5% de CO2.
Procedimiento general para la selección de moléculas pequeñas in vitro
Se descongelaron las PBMC, se suspendieron a una concentración de 1 x 106 célula/ml en medios de crecimiento y se dividieron en alícuotas de 200 |il en cada pocillo de una placa de 96 pocillos para un total de 0,2 x 106 células por pocillo. Se incubaron las PBMC durante 16-18 horas a 37°C en una incubadora humidificada con el 5% de CO2. Al siguiente día, se centrifugaron las placas con PBMC a 500 x g durante 5 minutos y se retiraron los medios de crecimiento. Se añadieron a las PBMC 150 |il de doce concentraciones que oscilaban desde 1000 hasta 0,000238 nM de moléculas pequeñas preparadas en medios de crecimiento por duplicado y se incubaron durante 24 horas a 37°C en una incubadora con el 5% de CO2. Antes de la recogida del sobrenadante, se centrifugaron las células a 500 x g durante 5 minutos para retirar el residuo celular. Se evaluó la actividad de TNF-a en el sobrenadante mediante ELISA (eBioscience) o HTRF (CisBio) según las instrucciones del fabricante. Se analizó la densidad óptica a 450 nm y a 570 nm (ELISA) o la luminiscencia (HTRF) usando un lector de placas Envision (Perkin Elmer), tal como se muestra en la tabla 5. Los compuestos de la divulgación con un valor de CE50 menor de 500 nM tienen actividad “A”, de desde 500 nM hasta 1 |iM tienen actividad “B” y mayor de 1 |iM hasta 3 |iM tienen actividad “C”.
Tabla 5: Selección de moléculas pequeñas in vitro
Figure imgf000084_0001
Figure imgf000085_0001
EJEMPLO 12
La producción de TNFa por parte de PBMC se indujo mediante los conjugados inmunoestimuladores
Este ejemplo muestra que los conjugados inmunoestimuladores pueden aumentar la producción de una citocina proinflamatoria, TNFa, por parte de PBMC en presencia de células tumorales.
Se aislaron PBMC a partir de sangre humana tal como se describió anteriormente. En resumen, se aislaron PBMC mediante centrifugación de gradiente de Ficoll, se resuspendieron en RPMI y se sembraron en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos (125.000/pocillo). Después se añadieron células tumorales que expresan antígeno (25.000/pocillo) junto con concentraciones de titulación de conjugados o anticuerpos originales no conjugados como controles. Después del cultivo durante la noche, se recogieron los sobrenadantes y se determinaron los niveles de TNFa mediante AlphaLISA.
Haciendo referencia a la figura 1, se añadieron células tumorales SKBR3 a las PBMC, preparadas tal como se describió anteriormente. Las células tumorales SKBR3 expresan el antígeno tumora1HER2. Se añadieron conjugados de anticuerpo anti-HER2-agonista de benzazepina de TLR8 , o bien monoespecíficos o bien biespecíficos con CD40, y conjugados con diversos agonistas de benzazepina de TLR8. Los conjugados y compuestos-grupos de unión en los mismos que se usaron en el estudio se describen en la tabla 6.
Tabla 6: Conjugados y compuestos-grupos de unión de los mismos a modo de ejemplo
Figure imgf000085_0002
Se midió la producción de TNFa después de 24 horas. Todos los conjugados eran activos, estimulando la producción de TNFa de una manera dependiente de la dosis. En cambio, el anticuerpo contra HER2 no conjugado (HER2 G1WT) y el anticuerpo contra HER2 x CD40 biespecífico (HER2 x CD40) no estimularon la producción de TNFa.
Haciendo referencia a la figura 2, se realizó un estudio similar usando conjugados de anticuerpo anti-TROP2. El/los conjugado(s) y los compuestos-grupos de unión del/de los mismo(s) usados en el estudio se ilustran en la tabla 6. Los anticuerpos contra TROP2 conjugados con diversas cargas activas estimularon la producción de TNFa en presencia de PBMC, mientras que el anticuerpo de control no conjugado no.
EJEMPLO 13
La producción de TNFa por parte de monocitos se indujo mediante conjugados inmunoestimuladores
Este ejemplo muestra que los conjugados inmunoestimuladores pueden aumentar la producción de una citocina proinflamatoria, TNFa, por parte de monocitos en presencia de células tumorales.
Se prepararon los monocitos de la siguiente manera: se aislaron PBMC a partir de sangre humana normal usando purificación de Ficoll y se enriquecieron los monocitos a partir de las PBMC usando kits de selección negativa de monocitos humanos sin agotamiento de CD16 de Stem Cell Technologies según las instrucciones del fabricante. Después se congelaron lentamente los monocitos y se almacenaron en nitrógeno líquido. Antes del ensayo, se descongelaron los monocitos y se dejaron reposar durante la noche a 37°C en el 5% de CO2 en medios de ensayo (medios RPMI 1640 complementados con FBS al 10%, penicilina 50 |ig/ml, estreptomicina 50 U/ml, HEPES 1 mM, 1X aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 0,1 mM). Al siguiente día, se sembraron los monocitos a 4 x 104 células/pocillo con o sin células tumorales a 4 x 104 células/pocillo en placas de fondo plano de 96 pocillos en los medios de ensayo descritos anteriormente. Después del cultivo durante la noche, se recogieron los sobrenadantes y se determinaron los niveles de TNFa mediante AlphaLISA.
Haciendo referencia a la figura 3, se determinó la actividad de un conjugado de CEA-agonista de benzazepina de TLR8 en células CHO que expresan CEA y en células que no expresan CEA de control. Se usaron el anticuerpo contra CEA (CEA-G1 WT), el anticuerpo contra HER2 (anticuerpo HER2-G1 WT) y el conjugado de HER2 (conjugado HER2-G1 WT) como controles. El conjugado y el compuesto-grupo de unión en el mismo que se usaron en el estudio se describen en la tabla 6. Haciendo referencia a la figura, sólo el conjugado de CEA mostró actividad, tal como se mide mediante la producción de TNFa, en presencia de monocitos y células tumorales. Los anticuerpos y los conjugados no estimularon ninguna producción de TNFa en presencia de células CHO que no expresan HER2 o CEA detectable.
Haciendo referencia a la figura 4, se añadieron células tumorales SKCO-1 a los monocitos, preparados tal como se describió anteriormente. Las células SKCO-1 expresan el antígeno tumoral CEA. Se añadieron conjugados de anticuerpo anti-CEA-agonista de benzazepina de TLR8 , o bien monoespecíficos o bien biespecíficos con CD40, y conjugados con un agonista de TLR8. Los conjugados y los compuestos-grupos de unión en los mismos que se usaron en el estudio se describen en la tabla 6. Se midió la producción de TNFa después de 24 horas. Ambos conjugados eran activos, estimulando la producción de TNFa de una manera dependiente de la dosis. De manera notable, el conjugado de CEA x CD40 específico era más activo. En cambio, el anticuerpo contra CEA no conjugado (CEA-G1 WT) y el anticuerpo contra CEAx CD40 biespecífico (CEA x CD40) no estimularon la producción de TNFa.
Haciendo referencia a la figura 5, se realizó otro estudio usando un conjugado de anticuerpo anti-TROP2 y diez líneas celulares diferentes que expresan niveles variados de TROP2. Los conjugados y el compuesto-grupo de unión en los mismos usados en el estudio se describen en la tabla 6. Tal como se muestra en la figura, la actividad de los conjugados de TROP2-agonista de benzazepina de TLR8 , tal como se mide mediante la producción de TNFa, varió de una manera dependiente de la dosis y, en general, según el nivel de expresión de TROP2 por la línea celular. La línea celular de control, wt-CHO, no expresa niveles detectables de TROP2 y se detectó una escasa producción de TNFa cuando se usó esta línea celular.
EJEMPLO 14
La producción de TNFa por parte de macrófagos se indujo mediante conjugados inmunoestimuladores
Este ejemplo muestra que los conjugados inmunoestimuladores pueden aumentar la producción de una citocina proinflamatoria, TNFa, por parte de macrófagos en presencia de células tumorales.
Se generaron los macrófagos de la siguiente manera: se aislaron monocitos a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas usando selección negativa basada en perlas magnéticas y se cultivaron durante 7 días en presencia de GM-CSF para generar macrófagos. Se sembraron los macrófagos en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos (40.000/pocillo). Después se añadieron células tumorales que expresan antígeno (40.000/pocillo) junto con concentraciones de titulación de conjugados o anticuerpos originales no conjugados como controles. Después del cultivo durante la noche, se recogieron los sobrenadantes y se determinaron los niveles de TNFa mediante AlphaLISA. Haciendo referencia a la figura 6 , se realizó un estudio usando un conjugado de anticuerpo anti-TROP2 y diez líneas celulares diferentes que expresan niveles variados de TROP2. Los conjugados y el compuesto-grupo de unión en los mismos usados en el estudio se ilustran en la tabla 6. Tal como se muestra en la figura, la actividad de los conjugados de TROP2-agonista de benzazepina de TLR8 , tal como se mide mediante la producción de TNFa, varió de una manera dependiente de la dosis y, en general, según el nivel de expresión de TROP2 por la línea celular. La línea celular de control, wt-CHO, no expresa niveles detectables de TROP2 y se detectó una escasa producción de TNFa cuando se usó esta línea celular.
EJEMPLO 15
La producción de TNFa por parte de PBMC se indujo mediante conjugados inmunoestimuladores
Este ejemplo muestra que los conjugados inmunoestimuladores pueden aumentar la producción de una citocina proinflamatoria, TNFa (TNFa), por parte de PBMC en presencia de diversas líneas de células tumorales.
Se aislaron PBMC a partir de sangre humana tal como se describió anteriormente. En resumen, se aislaron PBMC mediante centrifugación de gradiente de Ficoll, se resuspendieron en RPMI y se sembraron en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos (125.000/pocillo). Después se añadieron células tumorales que expresan antígeno (25.000/pocillo) junto con concentraciones de titulación de conjugados o anticuerpos originales no conjugados como controles. Después cultivo del durante la noche, se recogieron los sobrenadantes y se determinaron los niveles de TNFa mediante AlphaLISA.
Se conjugaron los AcM anti-TROP2 (aTROP2) o los AcM anti-HER2 (aHER2) con diversos agonistas de benzazepina de TLR8 unidos a grupos de unión. Los compuestos agonista de benzazepina de TLR8 -grupo de unión se identifican por el número de compuesto y se refieren a aquellos en los ejemplos anteriores.
Haciendo referencia a la figura 7, se añadieron conjugados de aTROP2 y anticuerpo aTROP2 de control a células tumorales SKBR3 (que expresan niveles altos de TROP2). Todos los conjugados eran activos, estimulando la producción de TNFa por parte de PBMC en presencia de células tumorales positivas para el antígeno. El anticuerpo de control no estimuló la producción de TNFa.
Haciendo referencia a la figura 8 , se añadieron conjugados de aTROP2 y anticuerpo aTROP2 de control a células tumorales MCF7 (que expresan niveles moderados de TROP2). Todos los conjugados eran activos, estimulando la producción de TNFa por parte de PBMC, aunque la actividad varió dependiendo del compuesto unido al anticuerpo. El anticuerpo de control no estimuló la producción de TNFa.
Haciendo referencia a la figura 9, se añadieron conjugados de aHER2 y anticuerpo aHER2 de control a células tumorales NCI-N87 (que expresan niveles altos de HER2). Todos los conjugados eran activos, estimulando la producción de TNFa por parte de PBMC en presencia de células tumorales positivas para el antígeno. El anticuerpo de control no estimuló la producción de TNFa.
Haciendo referencia a la figura 10, se añadieron conjugados de aHER2 y anticuerpo aHER2 de control a células tumorales MDA-MB-453 (que expresan niveles moderados de HER2). Todos los conjugados eran activos, estimulando la producción de TNFa por parte de PBMC, aunque la actividad varió dependiendo del compuesto unido al anticuerpo. El anticuerpo de control no estimuló la producción de TNFa.
EJEMPLO 16
Activación de monocitos dependiente del antígeno mediante un conjugado de TROP2-benzazepina de TLR8 en un modelo de ratón
Este ejemplo muestra que un conjugado de un anticuerpo contra TROP2 unido a un agonista de benzazepina de TLR8 puede activar monocitos humanos en un modelo de ratón.
Se prepararon los monocitos humanos tal como se describió anteriormente. Se cultivaron células MDA-MB-453 Trop2+ o células MiaPaca2 Trop2‘ mediante métodos convencionales. Se preparó un grupo de unión-carga activa (LP) de benzazepina de TLR8 uniendo un grupo de unión MCC (N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato) en lugar del grupo de unión mc-vc-PABA en el compuesto-grupo de unión 2.1 para formar el compuesto-grupo de unión 2.22. Se prepararon conjugados de TROP2-benzazepina de TLR8 mediante conjugación del compuesto-grupo de unión 2.22 con un anticuerpo contra TROP2 (sacituzumab) para formar un conjugado con una DAR promedio de aproximadamente 4.
El día 1, se les inyectó a ratones NOD SCID 5x105 células MDA-MB-453 Trop2+ o células MiaPaca2 Trop2‘. De siete a diez días más tarde, cuando el tamaño del tumor alcanzó aproximadamente 300 mm3, se les inyectó a los ratones por vía intravenosa 5-20 mg/kg del conjugado de TROP2-benzazepina de TLR8 o el anticuerpo contra TROP2 solo. Dieciséis horas más tarde, se inyectaron 106 monocitos humanos por vía intratumoral. De cuatro a seis horas más tarde, se recogieron los tumores y se digirieron. Se identificaron los monocitos mediante tinción para marcadores de superficie celular y se determinó la activación de monocitos mediante tinción intracelular para IL-6.
En ratones que tienen un tumor TROP2+ y que recibieron el conjugado de TROP2-agonista de benzazepina de TLR8 , se activaron los monocitos humanos. En cambio, en ratones que tienen un tumor TROP2-, el conjugado de TROP2-agonista de benzazepina de TLR8 no provocó la activación de monocitos humanos. De manera similar, el anticuerpo de control solo no provocó la activación de monocitos humanos en ningún modelo.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Compuesto o sal seleccionado de:
Figure imgf000104_0001
y una sal de uno cualquiera de los mismos, en el que el RX* es un enlace, un resto de succinimida o un resto de succinimida hidrolizada unido a un residuo de un constructo de anticuerpo, en el que ^ en RX* representa el punto de unión al residuo del constructo de anticuerpo, en el que el constructo de anticuerpo comprende un dominio de unión a antígeno HER2.
2. Compuesto o sal según la reivindicación 1, que se selecciona de:
Figure imgf000104_0002
Figure imgf000105_0001
y una sal de uno cualquiera de los mismos, en el que el RX* es un enlace, un resto de succinimida o un resto de succinimida hidrolizada unido a un residuo de un constructo de anticuerpo, en el que ^ en RX* representa el punto de unión al residuo del constructo de anticuerpo, en el que el constructo de anticuerpo comprende un dominio de unión a antígeno HER2.
3. Compuesto o sal según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que RX* comprende un resto de succinamida y está unido a un residuo de cisteína de un constructo de anticuerpo.
4. Compuesto o sal según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que RX* comprende un resto de succinamida hidrolizada y está unido a un residuo de cisteína de un constructo de anticuerpo.
5. Compuesto o sal según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el constructo de anticuerpo es un anticuerpo que comprende la CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera expuestas en la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:2 y la CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada expuestas en la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:1, tal como se determina mediante el índice de Kabat.
6. Compuesto o sal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el constructo de anticuerpo es pertuzumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
7. Compuesto o sal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el constructo de anticuerpo es trastuzumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
8. Compuesto o sal según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene la fórmula:
Figure imgf000105_0002
9.
Figure imgf000106_0001
10.
Figure imgf000106_0002
11. Compuesto o sal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene la fórmula:
Figure imgf000106_0003
12. Compuesto o sal según cualquier reivindicación anterior, que tiene una DAR (razón de fármaco con respecto a anticuerpo) promedio de desde 2 hasta 8, o desde 1 hasta 3, o desde 3 hasta 5.
13. Composición farmacéutica que comprende el compuesto o la sal según cualquier reivindicación anterior y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
14. Compuesto o sal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o composición farmacéutica según la reivindicación 13, para su uso en un método de tratamiento del cáncer.
15. Compuesto para su uso según la reivindicación 14, en el que el cáncer es: cáncer de mama; cáncer de colon;
cáncer de pulmón, tal como de células no pequeñas y de células pequeñas; cáncer rectal; cáncer de intestino delgado; cáncer de estómago y cualquier combinación de los mismos.
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