ES2894257T3

ES2894257T3 - Epítopos restringidos por MHC-E, moléculas de unión y métodos y usos relacionados

Info

Publication number: ES2894257T3
Application number: ES17740170T
Authority: ES
Inventors: Semih Tareen; James Sissons; Mark Frohlich; Allen Ebens
Original assignee: Juno Therapeutics Inc
Current assignee: Juno Therapeutics Inc
Priority date: 2016-06-27
Filing date: 2017-06-27
Publication date: 2022-02-14
Anticipated expiration: 2037-06-27
Also published as: JP2019520591A; CN109937364B; JP2022081490A; JP7340638B2; JP7054397B2; US20190324030A1; EP3992632A1; MA45491A; EP3475706A1; CN109937364A; EP3475706B1; CA3027999A1; WO2018005556A1

Abstract

Un método para identificar un epítopo peptídico in vitro, que comprende: a) introducir una combinación de moléculas de ácidos nucleicos sintéticas en células que expresan una molécula de MHC-E, en donde la combinación de moléculas de ácidos nucleicos sintéticas comprende moléculas de ácidos nucleicos de una biblioteca de ADNc, cada una comprendiendo individualmente una secuencia codificante de uno de una combinación de antígenos proteicos; b) incubar las células en condiciones mediante las cuales los antígenos proteicos codificados se procesan a péptidos que comprenden uno o más péptidos de un antígeno proteico, en donde el uno o más péptidos del antígeno proteico se presenta en la superficie celular en el contexto de la molécula de MHC-E; y c) detectar o identificar el uno o más péptidos del antígeno proteico en el contexto de la molécula de MHC-E

Description

DESCRIPCIÓN

Epítopos restringidos por MHC-E, moléculas de unión y métodos y usos relacionados

Campo

La presente divulgación se refiere en algunos aspectos a métodos para identificar epítopos peptídicos de un antígeno reconocido por la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) no clásica designada MHC-E. En algunos casos, el antígeno es un antígeno tumoral, un antígeno autoinmune o un antígeno patógeno. La presente divulgación se refiere además a métodos para identificar moléculas de unión a péptidos que se unen a un péptido en el contexto de una molécula de MHC-E. En algunos casos, la molécula de unión a péptidos es un receptor de células T (TCR) o un anticuerpo, incluyendo sus fragmentos de unión a antígeno y sus receptores de antígenos quiméricos (CAR). La divulgación se refiere además a métodos para modificar genéticamente células que contienen tales moléculas de unión a péptidos restringidos por MHC-E, y dichas células modificadas genéticamente, incluyendo las composiciones y usos de las mismas en terapia celular adoptiva.

Antecedentes

Hay varias estrategias disponibles para identificar epítopos de antígenos de células T, que pueden usarse para diseñar vacunas o para desarrollar moléculas de unión terapéuticas (por ejemplo, TCR o anticuerpos) contra tales epítopos. En la mayoría de los casos, los métodos existentes usados para identificar epítopos peptídicos se limitan a identificar epítopos peptídicos canónicos de antígenos conocidos, típicamente en base a análisis bioinformáticos y/o en base a la presentación de epítopos en las moléculas clásicas de MHC de clase I y/o MHC de clase II. Se necesitan estrategias mejoradas para identificar epítopos de células T únicos, que pueden aumentar los objetivos disponibles para el diseño y desarrollo de TCR y otras moléculas de unión para el desarrollo de moléculas terapéuticas, incluyendo la inmunoterapia adoptiva, para su uso en el tratamiento del cáncer, enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunes. Se proporcionan métodos, células y composiciones que cumplen tales necesidades.

Braud et al., 1998 (Current Biology, Vol. 8, No. 1, p 1-10) investiga la relación entre la expresión de superficie celular de HLA-E y la unión de un péptido líder de MHC de clase 1.

Braud et al., 1998 (Nature, Vol. 391, No. 6669, p 795-799) investiga ligandos para HLA-E y la unión de HLA-E a receptores de células asesinas naturales.

Sumario

La presente invención proporciona un método para identificar un epítopo peptídico in vitro, que comprende: a) introducir una combinación de moléculas de ácidos nucleicos sintéticas en células que expresan una molécula de MHC-E, en donde la combinación de moléculas de ácidos nucleicos sintéticas comprende moléculas de ácidos nucleicos de una biblioteca de ADNc, cada una comprendiendo individualmente una secuencia codificante de uno de una combinación de antígenos proteicos;

b) incubar las células en condiciones mediante las cuales los antígenos proteicos codificados se procesan a péptidos que comprenden uno o más péptidos de un antígeno proteico, en donde el uno o más péptidos del antígeno proteico se presenta en la superficie celular en el contexto de la molécula de MHC-E; y

c) detectar o identificar el uno o más péptidos del antígeno proteico en el contexto de la molécula de MHC-E La invención proporciona además un método para identificar una molécula de unión a péptidos o un fragmento de unión al antígeno de la misma que se una a un péptido restringido por MHC-E, que comprende:

a) identificar un péptido mediante el método de la invención;

b) evaluar la unión de una pluralidad de moléculas de unión de péptidos candidatas o fragmentos de unión al antígeno de las mismas para una molécula de MHC-E que comprende el péptido de a) unido a la misma; y c) identificar de entre la pluralidad una o más moléculas de unión al péptido que se unen al péptido en el contexto de la molécula de MHC-E

Las realizaciones de la invención se describen en algunos de los casos y aspectos siguientes.

En la presente se divulgan células que comprenden una molécula de MHC-E, como células que expresan MHC-E, y métodos que usan tales células y otros reactivos para la identificación de epítopos peptídicos unidos en el contexto de una molécula de MHC-E, por ejemplo, epítopos restringidos con MHC-E. También se divulgan métodos para identificar moléculas de unión a péptidos, como TCR u otros receptores de antígenos recombinantes capaces de dirigirse o unirse a tales epítopos. En algunos casos, los métodos divulgados pueden incluir poner en contacto tales células con epítopos peptídicos potenciales, por ejemplo mediante la introducción en tales células de un antígeno proteico en condiciones para provocar el procesamiento y presentación de epítopos peptídicos potenciales del antígeno en la superficie en el contexto de la molécula de MHC. En algunos casos, los epítopos peptídicos unidos o en complejo con una molécula de MHC-E pueden identificarse o detectarse. En algunos casos, las células en las que los epítopos peptídicos están unidas o presentes en el contexto de una molécula de MHC-E en la superficie pueden cribarse o seleccionarse frente a bibliotecas (por ejemplo, bibliotecas de presentación de fase u otras bibliotecas como se describe) de moléculas de unión candidatas, como TCR o TCR similares a CAR, para identificar moléculas de unión que se unen al epítopo peptídico en el contexto de MHC-E. En algunos casos, los métodos pueden usarse para identificar dominios de unión a antígenos que pueden usarse, por ejemplo, en el contexto de la terapia celular adoptiva.

En la presente se divulga un método para identificar un epítopo peptídico, el método comprendiendo o implicando a) poner en contacto una molécula de MHC-E (también denominada HLA-E) con uno o más péptidos; y b) detectar o identificar el péptido o péptidos en el contexto de la molécula de MHC-E. En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, la molécula de MHC-E se expresa en la superficie de una célula.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, los métodos incluyen además identificar una molécula de unión a péptidos o un fragmento de unión a antígenos de la misma que se une a por lo menos uno de los uno o más péptidos en el contexto de la molécula de MHC-E. En algunos casos, se divulga en la presente un método para identificar una molécula de unión a péptidos que se une a uno o más péptidos en el contexto de una molécula de MHC-E, el método comprendiendo o implicando a) proporcionar una célula que comprende uno o más péptidos en el contexto de una molécula de MHC-E en la superficie de la célula; y b) identificar una molécula de unión a péptidos o un fragmento de unión a antígeno de la misma que se une a por lo menos uno de los uno o más péptidos en el contexto de la molécula de MHC-E. En algunos casos, proporcionar una célula que comprende uno o más péptidos en el contexto de una molécula de MHC-E comprende poner en contacto la molécula de MHC-E en la superficie de la célula con el uno o más péptidos. En algunos casos, el método incluye detectar o identificar si el péptido o péptidos en el contexto de una molécula de MHC-E está presente o formado en la superficie de la célula antes de proporcionar la célula en a).

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, el uno o más péptidos son o incluyen péptidos de uno o más antígenos proteicos. En algunos casos, el uno o más péptidos en el contexto de la molécula de MHC-E se identifican como epítopos peptídicos de uno o más antígenos proteicos. En algunos casos, el antígeno es un antígeno tumoral. En algunos casos, el antígeno es un antígeno patógeno. En algunos casos, el antígeno patógeno es un antígeno bacteriano o un antígeno viral.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, el antígeno es un antígeno viral y el antígeno viral es de hepatitis A, hepatitis B, virus de la hepatitis C (VHC), virus del papiloma humano (VPH), infecciones virales de la hepatitis, virus de Epstein-Barr. (EBV), virus del herpes humano 8 (HHV-8), virus de la leucemia de células T humanas-1 (HTLV-1), virus de la leucemia de células T humanas-2 (HTLV-2) o un citomegalovirus (CMV). En algunos casos, el antígeno es un antígeno de HPV seleccionado entre HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 y HPV-35. En algunos casos, el antígeno viral es un antígeno de EBV seleccionado entre el antígeno nuclear de Epstein-Barr (EBNA)-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, proteína líder de EBNA (EBNA-LP), proteínas de membrana latente LMP-1, LMP-2A y LMP-2B, EBV-EA, EBV-MA y EBV-VCA. En algunos casos, el antígeno viral es un antígeno de HTLV que es TAX. En algunos casos, el antígeno viral es un antígeno de HBV que es un antígeno de núcleo de la hepatitis B o un antígeno de envoltura de la hepatitis B.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, el antígeno es un antígeno tumoral. En algunos casos, el antígeno tumoral se selecciona entre antígeno asociado a glioma, gonadotropina coriónica humana p, alfafetoproteína (AFP), AFP reactiva a lectina, tiroglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, transcriptasa inversa de telomerasa humana, RU1, Ru2 (AS), carboxil esterasa intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, Melanina-A/MART-1, WT-1, S-100, MBP, CD63, MUC1 (por ejemplo, MUC1-8), p53, Ras, ciclina B1, HER-2/neu, antígeno carcinoembrionario (CEA), gp100, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A11, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-C1, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15, tirosinasa (por ejemplo proteína relacionada con tirosinasa 1 (TRP-1) o proteína relacionada con tirosinasa 2 (Tr P-2)), p-catenina, Ny -Es O-1, LAGE-1a, PP1, MDM2, MDM4, EGVFvIII, Tax, SSX2, telomerasa, TARP, pp65, CDK4, vimentina, S100, eIF-4A1, p78 inducible por IFN, melanotransferrina (p97), Uroplakin II, antígeno prostático específico (PSA), calicreína humana (huK2), antígeno de membrana específico de la próstata (PSM) y fosfatasa de ácido prostático (PAP), elastasa de neutrófilos, efrina B2, BA-46, Bcr-abl, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, Caspasa 8, FRa, CD24, CD44, CD133, CD 166, epCAM, CA-125, HE4, Oval, receptor de estrógenos, receptor de progesterona, uPA, PAI-1, CD19, CD20, C^d22, ^rO^r1, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, glucolípido F77, GD-2, factor de crecimiento de insulina (IGF)-I, IGF-II, receptor de IGF-I y mesotelina.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, el uno o más péptidos comprenden uno o más péptidos que tienen una longitud de aproximadamente 8 a 20 aminoácidos o de 9 a 15 aminoácidos. En algunos casos, uno o más péptidos comprenden péptidos que tienen una longitud de aproximadamente 9 aminoácidos, aproximadamente 10 aminoácidos, aproximadamente 11 aminoácidos, aproximadamente 12 aminoácidos, aproximadamente 13 aminoácidos, aproximadamente 14 aminoácidos o aproximadamente 15 aminoácidos. En algunos casos, el uno o más péptidos comprenden péptidos superpuestos del antígeno o una región del antígeno.

En algunos casos, los péptidos superpuestos, colectivamente, comprenden péptidos que representan por lo menos el 30%, por lo menos el 40%, por lo menos el 50%, por lo menos el 60%, por lo menos el 70%, por lo menos el 80%, por lo menos el 90% o más de una secuencia contigua de aminoácidos del antígeno.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, los péptidos comprendidos por el uno o más péptidos están presentes en grupos ortogonales, cada uno de dichos grupos ortogonales comprendiendo por lo menos dos o más péptidos diferentes, en donde por lo menos un péptido en cada grupo ortogonal es lo mismo que un péptido presente en por lo menos otro grupo ortogonal. En algunos casos, un péptido en el contexto de la molécula de MHC-E se detecta o identifica si el péptido se eluye o extrae de la molécula de MHC-E o de una célula que expresa la molécula de MHC-E en por lo menos dos grupos ortogonales que comprenden la mismo péptido.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, la célula que expresa MHC-E comprende uno o una combinación de antígenos heterólogos o exógenos a la célula, en los que, en algunos casos, tales antígenos pueden ser una fuente de uno o más péptidos en contacto con el MHC-E. En algunos casos, el uno o la combinación de antígenos presentes en la célula se procesa a uno o más péptidos, poniendo de este modo en contacto la molécula de MHC-E con uno o más péptidos. En algunos casos, los antígenos heterólogos o exógenos son moléculas de ácidos nucleicos sintéticas que se introducen en la célula. En algunos casos, la célula comprende una o una combinación de moléculas de ácidos nucleicos sintéticas que comprenden una o más secuencias codificantes que codifican el uno o la combinación de antígenos.

En la presente se divulga un método para identificar un epítopo peptídico, el método comprendiendo a) introducir una molécula de ácido nucleico sintética o una combinación de moléculas de ácidos nucleicos sintéticas que comprenden una o más secuencias codificantes que codifican un antígeno o una combinación de antígenos en una célula que expresa una molécula de MHC-E; b) incubar la célula en condiciones en las que el antígeno o antígenos codificados se procesan en péptidos; y c) detectar o identificar péptido o péptidos del antígeno en el contexto de la molécula de MHC-E. En algunos casos, el método incluye además identificar una molécula de unión a péptidos o un fragmento de unión a antígeno de la misma que se une a por lo menos uno de los uno o más péptidos del antígeno en el contexto de la molécula de MHC-E. También se divulga en la presente un método para identificar una molécula de unión a péptidos que se une a un péptido en el contexto de una molécula de MHC-E, que comprende a) introducir una molécula de ácido nucleico sintética o una combinación de moléculas de ácidos nucleicos sintéticas que comprenden una o más secuencias codificantes que codifican un antígeno o combinación de antígenos en una célula que expresa una molécula de MHC-E; b) incubar la célula en condiciones en las que el antígeno o la combinación de antígenos codificado se procesa a péptidos; y c) identificar una molécula de unión a péptidos o fragmento de unión a antígeno de la misma que se une a por lo menos uno de los uno o más péptidos del antígeno en el contexto de la molécula de MHC-E. En algunos casos, el antígeno o una combinación de antígenos puede ser cualquiera de los descritos anteriormente, como un antígeno proteico, incluyendo un antígeno tumoral o un antígeno patógeno. En algunos casos, el uno o más péptidos en el contexto de la molécula de MHC-E se identifican como epítopos peptídicos del uno o más antígenos proteícos.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, el ácido nucleico sintético es ADN sintético. En algunos casos, el ADN sintético es ADN complementario (ADNc). En algunos casos, la célula que expresa MHC-E comprende un ácido nucleico sintético que comprende una secuencia codificante que codifica el antígeno. En algunos casos, la célula que expresa MHC-E comprende una combinación de ácidos nucleicos sintéticos, cada uno de los cuales comprendiendo individualmente una secuencia codificante de una de las combinaciones de antígenos. En algunos casos, la combinación de ácidos nucleicos sintéticos comprende una o más moléculas de ácidos nucleicos de una biblioteca de ADNc. En algunos casos, la biblioteca de ADNc es una biblioteca de ADNc derivada de tumores. En algunos casos, el tumor es un melanoma, sarcoma, carcinoma de mama, carcinoma renal, carcinoma de pulmón, carcinoma de ovario, carcinoma de próstata, carcinoma colorrectal, carcinoma de páncreas, tumor escamoso de cabeza y cuello, o carcinoma escamoso de pulmón. En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, la combinación de moléculas de ácidos nucleicos sintéticas y/o la combinación de antígenos codificados está presente en grupos ortogonales, comprendiendo cada una de dichos grupos ortogonales por lo menos dos o más moléculas de ácidos nucleicos sintéticas diferentes y/o antígenos codificados, en donde por lo menos una molécula de ácido nucleico sintética y/o antígeno codificado es el mismo en por lo menos dos grupos ortogonales. En algunos casos, un péptido en el contexto de una molécula de MHC-E se detecta o identifica si el péptido se eluye o se extrae de una molécula de MHC-E o de una célula que expresa una molécula de MHC-E en por lo menos dos grupos ortogonales que comprenden el mismo péptido.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, el método se realiza en una matriz. En algunos casos, la matriz es una matriz espacial o direccionable.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, la molécula de MHC-E es una HLAE*01:01 o HLA E*01:03.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, la célula es una célula primaria o es una línea celular. En algunos casos, la célula es una célula humana. En algunos casos, la célula se selecciona entre un fibroblasto, una célula B, una célula dendrítica y un macrófago. En algunos casos, la célula es una línea celular y la línea celular es o se deriva de una célula seleccionada entre K562, C1R, KerTr, HCT-15, DLD-1, Daudi, 221, 721.221, BLS-1, BLS- 2, JEG-3 y JAR. En algunos casos, la célula es o se deriva de una línea celular 221 o K562. En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, la célula que expresa MHC-E es una célula presentadora de antígeno artificial. En algunos casos, la célula presentadora de antígeno artificial expresa la molécula de MHC-E y una o más moléculas estimuladoras o coestimuladoras, un receptor Fc, una molécula o moléculas de adhesión o una citoquina. En algunos casos, la célula se modifica genética o recombinantemente para expresar la molécula de MHC-E.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, la célula se activa o estimula. En algunos casos, la célula se ha incubado o se incuba con un agente activador o estimulador antes o simultáneamente con el contacto de la molécula de MHC-E con el uno o más péptidos. En algunos casos, el método comprende además incubar la célula con un agente activador o estimulador antes o simultáneamente con el contacto de la molécula de MHC-E con el uno o más péptidos. En algunos casos, la célula se ha incubado o se incuba con un agente activador 0 estimulador antes o simultáneamente con la introducción de la molécula de ácido nucleico sintética o combinación de moléculas de ácidos nucleicos sintéticas en la célula. En algunos casos, el método comprende además incubar la célula con un agente activador o estimulador antes o simultáneamente con la introducción de la molécula de ácido nucleico sintética o combinación de moléculas de ácidos nucleicos sintéticas en la célula. En algunos casos, la incubación con el agente activador o estimulador aumenta la expresión de la molécula de MHC-E en la superficie de la célula en comparación con la expresión de la molécula de MHC-E en ausencia de dicho activador o estimulador. En algunos casos, la expresión de la molécula de MHC-E aumenta por lo menos 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces. En algunos casos, la activación o estimulación se efectúa o se lleva a cabo en presencia de interferón gamma. En algunos casos, la activación o estimulación comprende incubar la célula con un virus o partícula viral. En algunos casos, el virus o la partícula viral es un citomegalovirus (CMV).

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, la célula que expresa MHC-E se reprime y/o se altera en un gen que codifica una molécula de MHC de clase I clásica y/o no expresa una molécula de MHC de clase 1 clásica. En algunos casos, la represión se efectúa mediante una molécula de ácido nucleico inhibidora. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico inhibidor comprende un agente de ARN interferente. En algunos casos, el ácido nucleico inhibidor es o comprende o codifica un ARN interferente pequeño (ARNip), un ARNhc adaptado a microARN, un ARN de horquilla corta (ARNhc), un ARNip de horquilla, un microARN (precursor de miARN) o un microARN (miARN). En algunos casos, la célula que expresa MHC está alterada en un gen que codifica un MHC de clase I clásico o comprende una alteración en un gen que codifica el MHC de clase I y la alteración del gen está mediada por una nucleasa de edición de genes, una nucleasa de dedo de zinc (ZFN), un ácido nucleico palindrómico corto agrupado regularmente interespaciado (CRISPR)/Cas9 y/o una nucleasa efectora de TAL (TALEN). En algunos casos, la expresión de la molécula clásica de MHC de clase I en la célula se reduce en por lo menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% en comparación con la expresión en la célula en ausencia de la represión o alteración génica. En algunos casos, la molécula de MHC de clase I clásica es una molécula de HLA-A, HLA-B o HLA-C o es una combinación de las mismas.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, la detección o identificación del uno o más péptidos en el contexto de una molécula de MHC-E comprende extraer péptidos de un lisado de la célula, eluir péptidos de la superficie celular o aislar la molécula o moléculas de MHC-E y eluir el uno o más péptidos de la molécula de MHC-E. En algunos casos, se aísla el MHC-E, que comprende o implica solubilizar la célula y seleccionar la molécula de MHC-E mediante inmunoprecipitación o cromatografía de inmunoafinidad. En algunos casos, la elución de péptidos de una molécula de MHC-E se efectúa en presencia de un ácido suave o un ácido diluido. En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, el método incluye fraccionar, separar o purificar el péptido o los péptidos identificados o detectados. En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, el método incluye secuenciar el péptido o los péptidos identificados o detectados.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, el método incluye además determinar si el péptido o los péptidos identificados o detectados provocan una respuesta inmune específica de antígeno. En algunos casos, la respuesta inmune específica de antígeno es una respuesta humoral de células T. En algunos casos, la respuesta inmune específica de antígeno es una respuesta de linfocitos T citotóxicos.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, la célula que expresa MHC es una célula de prueba y el método incluye además la evaluación o comparación de uno o más epítopos peptídicos presentes o encontrados en el contexto de una molécula de MHC-E u otra molécula de MHC en la superficie de una célula de control. En algunos casos, el método comprende además detectar o identificar péptidos en el contexto de una molécula de MHC-E en la superficie de una célula de control, dicha célula de control no habiendo estado en contacto con el uno o más péptidos, como uno o más péptidos del antígeno de la proteína y el péptido o péptido de identificación en el contexto de una molécula de MHC-E que es única para la célula de prueba en comparación con la célula de control, identificando de este modo el uno o más péptidos del antígeno en el contexto de una molécula de MHC-E.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, el método se realiza in vitro.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, el péptido o péptidos identificados en el contexto de la molécula de MHC-E comprenden una longitud de o de aproximadamente 8 a 13 aminoácidos. En algunos casos, el péptido o los péptidos identificados en el contexto de la molécula de MHC-E comprenden una longitud de aproximadamente 8 aminoácidos, 9 aminoácidos, 10 aminoácidos u 11 aminoácidos.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, el péptido o los péptidos en el contexto de la molécula de MHC-E tienen una afinidad de unión con una IC50 por la molécula de MHC-E de más de 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM, 900 nM o 1000 nM. En algunos casos, el péptido o los péptidos en el contexto de la molécula de MHC-E tiene una afinidad de unión con una IC50 por la molécula de MHC-E de menos de 500 nm, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM o 50 nM.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, el péptido o los péptidos en el contexto de la molécula de MHC-E son capaces de inducir una respuesta inmune de CD8+ en un sujeto. En algunos casos, el péptido o los péptidos en el contexto de la molécula de MHC-E son capaces de generar una respuesta inmune universal en la mayoría de los sujetos de una población. En algunos casos, la respuesta inmune universal se provoca en más del 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de los sujetos de una población. En algunos casos, los sujetos son sujetos humanos.

En la presente se divulga un epítopo peptídico identificado mediante cualquiera de los métodos divulgados. En la presente se divulga un complejo de MHC-E-péptido estable que comprende cualquiera de los epítopos peptídicos divulgados. En algunos casos, el complejo MHC-E-péptido estable está presente en la superficie de una célula. También se divulga una célula que expresa cualquiera de los complejos de MHC-E péptido estables proporcionados.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados para identificar una molécula de unión a péptido o un fragmento de unión a antígeno de la misma que se une a un péptido en el contexto de una molécula de MHC-E, el método puede incluir a) evaluar la unión de una pluralidad de moléculas de unión a péptidos candidatas o fragmentos de unión a antígeno de las mismas para cualquiera de los complejos MHC-E-péptido estables divulgados; y b) identificar de entre la pluralidad una o más moléculas de unión a péptidos que se unen al péptido en el contexto de una molécula de MHC-E. En la presente se divulga un método para identificar una molécula de unión a péptidos o un fragmento de unión a antígeno de la misma que se une a un péptido restringido por MHC-E, en el que el método comprende a) identificar un epítopo peptídico de acuerdo con cualquiera de los métodos divulgados, b) evaluar la unión de una pluralidad de moléculas de unión a péptidos candidatas o fragmentos de unión de antígenos de las mismas para una molécula de MHC-E que comprende el péptido de a) unido a la misma; y c) identificar de entre la pluralidad una o más moléculas de unión a péptidoa que se unen al péptido en el contexto de la molécula de MHC-E.

En algunos casos, la pluralidad de moléculas de unión a péptidos candidatas comprende uno o más receptores de células T (TCR), fragmentos de unión a antígeno de un TCR, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunos casos, la pluralidad de moléculas de unión a péptidos candidatas comprende por lo menos 2, 5, 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, o más moléculas diferentes. En algunos casos, la pluralidad de moléculas de unión a péptidos candidatas comprenden moléculas de unión a péptidos que comprenden una o más mutaciones en comparación con una molécula de unión de péptidos original o de andamiaje, en donde las moléculas de unión a péptidos candidatas individuales comprenden una o más mutaciones diferentes en comparación con otras moléculas de unión a péptidos candidatas en la pluralidad. En algunos casos, la una o más mutaciones de aminoácidos comprenden una mutación o mutaciones en una región determinante de la complementariedad (CDR) o CDR de la molécula.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados para identificar una molécula de unión a péptidos o un fragmento de unión a antígeno de la misma, las moléculas de unión a péptidos candidatas se obtienen a partir de una muestra de un sujeto o una población de sujetos. En algunos casos, el sujeto o la población de sujetos comprende sujetos normales o sanos o sujetos enfermos. En algunos casos, los sujetos enfermos son sujetos portadores de tumores. En algunos casos, el sujeto ha sido vacunado con el epítopo peptídico del antígeno. En algunos casos, el sujeto es un mamífero humano o no humano, como un roedor. En algunos casos, el sujeto es un ratón transgénico HLA y/o es un ratón transgénico TCR humano.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados para identificar una molécula de unión a péptidos o un fragmento de unión a antígeno de la misma, la muestra de la cual se obtienen las moléculas de unión a péptidos candidatas comprende células T. En algunos casos, la muestra comprende células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados para identificar una molécula de unión a péptidos candidata o un fragmento de unión a antígeno de la misma, la molécula de unión a péptidos candidata comprende un receptor de células T (TCR) o un fragmento de unión a antígeno de un TCR. En algunos casos, el fragmento de unión a antígeno de un TCR es un TCR de cadena sencilla (scTCR).

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados para identificar una molécula de unión a péptidos o un fragmento de unión a antígeno de la misma, la muestra de la que se obtienen las moléculas de unión a péptidos candidatas comprende células B. En algunos casos, la muestra se selecciona entre sangre, médula ósea y bazo y/o la muestra comprende PBMC, esplenocitos o células de médula ósea. En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados para identificar una molécula de unión a péptidos o un fragmento de unión a antígeno de la misma, las moléculas de unión a péptidos candidatas comprenden anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunos casos, las moléculas de unión a péptidos candidatas comprenden anticuerpos derivados de

IgM o fragmentos de unión a antígenos y/o son vírgenes. En algunos casos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se producen inmunizando un huésped con un inmunógeno que comprende el complejo

MHC-péptido. En algunos casos, la molécula de unión a péptidos candidata es un fragmento variable de cadena sencilla (scFv).

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados para identificar una molécula de unión a péptidos o un fragmento de unión a antígeno de la misma, las moléculas de unión a péptidos candidatas están presentes en una biblioteca de presentación. En algunos casos, la biblioteca de presentación se selecciona entre una biblioteca de presentación de la superficie celular, una biblioteca de presentación de fagos, una biblioteca de presentación de ribosomas, una biblioteca de presentación de ARNm y una biblioteca de presentación de ADNdc.

En algunos casos, de cualquiera de los métodos divulgados para identificar una molécula de unión a péptidos o un fragmento de unión a antígeno de la misma, la molécula de unión a péptidos identificada muestra afinidad de unión por el péptido en el contexto de una molécula de MHC-E con una constante de disociación (K^d) de o de aproximadamente 10-5 M a 10-13 M, 10-5 M a 10-9 o 10-7 M a 10-12. En algunos casos, la molécula de unión a péptidos identifica muestra afinidad de unión por el péptido en el contexto de una molécula de MHC-E con una KD de menos de o menos de aproximadamente 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M o En la presente se divulga una molécula de unión a péptidos identificada mediante cualquiera de los métodos divulgados. En algunos casos, la molécula de unión a péptidos es un TCR o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos casos, la molécula de unión a péptidos es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

En la presente se divulga un receptor de antígeno recombinante que contiene un dominio de unión a antígeno extracelular que es o comprende una cualquiera de las moléculas de unión a péptidos divulgadas. En algunos casos, el receptor de antígeno recombinante es un receptor de antígeno quimérico (CAR).

En la presente se divulga una célula modificada genéticamente que comprende cualquiera de las moléculas de unión a péptidos divulgadas o cualquiera de los receptores recombinantes divulgados. En algunos casos, la molécula de unión a péptidos y/o el receptor recombinante se expresan en la superficie de la célula. En algunos casos, la célula es una célula T. En algunos casos, la célula es una célula T CD8+. En la presente se divulga una célula T, como una célula T CD8+, que expresa cualquiera de las moléculas de unión a péptidos divulgadas o cualquiera de los receptores recombinantes divulgados que contienen la molécula de unión de péptidos. En algunos casos, la molécula de unión de péptidos se une específicamente a un epítopo peptídico en el contexto de una molécula de MHC-E. En algunos casos, la molécula de unión a péptidos es un receptor de células T (TCR), un fragmento de unión a antígeno de un TCR, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo. En algunos casos, el receptor de antígeno recombinante es un receptor de antígeno quimérico (CAR).

En la presente se divulga una composición que comprende cualquiera de las moléculas de unión a péptidos divulgadas, cualquiera de los receptores recombinantes divulgados o cualquiera de las células modificadas genéticamente divulgadas. En algunos casos, la composición comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En la presente se divulga un método para tratar una enfermedad o afección administrando a un sujeto, como un sujeto humano, cualquiera de las composiciones divulgadas, por ejemplo, composiciones farmacéuticas. En algunos casos, la molécula de unión a péptidos o el receptor recombinante que comprende la molécula de unión a péptidos de cualquiera de las composiciones divulgadas se une a un antígeno asociado con la enfermedad o afección. En algunos casos, la enfermedad o afección es un tumor o un cáncer.

Descripción detallada

I. Complejo mayor de histocompatibilidad E (MHC-E) no clásico y epítopos restringidos con MHC-E dirigidos

Se divulgan métodos para identificar péptidos de un antígeno capaces de unirse o que se unen o son reconocidos por una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC)-E. En algunos casos, el péptido es

un epítopo peptídico restringido por MHC-E de un antígeno y/o puede mostrarse o presentarse en el contexto de o formar un complejo con una molécula de MHC-E expresada en la superficie de una célula. En algunos casos, el péptido es un epítopo de un antígeno tumoral, un antígeno autoinmune o un antígeno patógeno (por ejemplo, un antígeno bacteriano o viral). En algunos casos, el péptido es un epítopo peptídico universal, supertopo y/o no canónico.

En algunos casos, el epítopo peptídico restringido por MHC-E puede ser un objetivo de antígeno de un receptor de células T (TCR) o un anticuerpo similar a TCR, incluyendo un anticuerpo similar a TCR presente en un receptor de antígeno quimérico (CAR), por ejemplo, un CAR similar a TCR. En algunos aspectos, también se divulgan métodos para identificar una molécula que se une a un complejo MHC-péptido que contiene un epítopo peptídico restringido por MHC-E, como métodos para identificar un TCR o una molécula de anticuerpo que se une a un complejo MHC-péptido que contiene tal epítopo peptídico. En algunos casos, tales moléculas identificadas pueden usarse para generar receptores recombinantes, incluyendo TCR transgénicos o receptores de anticuerpos quiméricos. Tales receptores recombinantes, en algunos aspectos, pueden usarse para manipular células, como células T, para terapia celular adoptiva.

En general, los métodos para identificar epítopos peptídicos en la técnica se han centrado principalmente en la identificación de epítopos peptídicos canónicos, que son péptidos que muestran un motivo de secuencia conservada y/o una longitud para las moléculas de MHC clásicas, es decir, MHC de clase I o MHC de clase II. En algunos casos, se han desarrollado varios algoritmos para predecir si un péptido de interés debería unirse a una molécula de MHC dada, pero tales enfoques están sesgados hacia moléculas de MHC de clase I y/o MHC de clase II clásicas. Por ejemplo, se han utilizado enfoques bioinformáticos para predecir epítopos peptídicos de MHC de clase I y MHC de clase II clásicos en base a consideraciones de afinidad de unión, longitud y/o la presencia de uno o más residuos de anclaje canónicos (ver, por ejemplo, Southwood, et al., J. Immunol. 160:3363 (1998); Honeyman, et al., Nat. Biotechnol. 16:966-969 (1998); Breisie, et al., Bioinformatics 14:121-131 (1998); Larsen et al. (2005) Eur. J. Immunol., 35:2295-2303; Nielsen et al. (2004) Bioinformatics, 20:1388-1397). Además, dado el interés en la identificación de epítopos peptídicos usando estos enfoques, y otros enfoques para la identificación de epítopos de MHC de clase I y MHC de clase II, se han identificado la mayoría de los epítopos peptídicos canónicos de antígenos relevantes, por ejemplo, antígenos tumorales, que pueden identificarse a partir de tales enfoques. y/o se ha agotado la información obtenida de tales enfoques.

Sin embargo, en algunos casos, no todos los epítopos peptídicos se presentan en el contexto de moléculas de MHC clásicas. En un estudio ejemplar, se descubrió que un antígeno de carcinoma de próstata/colon compartido se presentaba en una molécula similar a MHC I no clásica con polimorfismo limitado o sin polimorfismo (Housseau et al. (1999) J of Immunol., 163: 6330-6337). El MHC-E (también llamado HLA-E) es una molécula similar al MHC I no clásica que puede sobreexpresarse en las células tumorales. En algunos casos, se ha demostrado que MHC-E se une a péptidos virales, péptidos bacterianos y péptidos derivados de antígenos asociados a células. En algunos aspectos, las células T CD8+ pueden reconocer péptidos en el contexto de una molécula de MHC-E, es decir, complejos MHC-E-péptidos, a través de su ap TCR para inducir respuestas de células T CD8+ restringidas por MHC-E (Pietra et al. (2010) Journal of Biomedicine and Biotechnology, 1-8). En algunos aspectos, el MHC-E puede unirse a péptidos también reconocidos por el MHC de clase Ia, aunque con menor afinidad (Pietra et al. (2010)). En algunos aspectos, MHC-E también puede presentar péptidos y/o supertopos no canónicos o no convencionales (Pietra et al. (2010)).

Como la reactividad inmunitaria, incluyendo la respuesta antitumoral, en muchos aspectos no está limitada por el procesamiento y la presentación de los epítopos de MHC de clase I y de MHC de clase clásicos I, hay una necesidad de otros enfoques para identificar los epítopos peptídicos restringidos por MHC, incluyendo epítopos capaces de provocar una respuesta inmune para un antígeno de interés, como un antígeno tumoral. Los métodos divulgados ofrecen un enfoque alternativo para la identificación de epítopos, incluyendo la identificación de epítopos peptídicos no convencionales que no están necesariamente restringidos a moléculas de MHC clásicas. En particular, los métodos divulgados usan MHC-E para presentar epítopos peptídicos no canónicos. En algunos aspectos, se cree que tales epítopos pueden incluir antígenos tumorales.

En general, un MHC, que incluye un MHC-E, contiene un sitio de unión a péptido polimórfico o una ranura de unión que, en algunos casos, puede formar un complejo con antígenos peptídicos de polipéptidos, incluyendo antígenos peptídicos procesados por la maquinaria celular. En general, una molécula de MHC puede incluir una parte eficaz de un MHC que contenga un sitio o sitios de unión a antígeno para unirse a un péptido y las secuencias necesarias para el reconocimiento por la molécula de unión apropiada, como TCR u otra molécula de unión a péptidos. En algunos casos, las moléculas de MHC pueden mostrarse o expresarse en la superficie celular, incluso como un complejo con péptido (complejo MHC-péptido) para la presentación de un antígeno en una conformación reconocible por los TCR en células T u otras moléculas de unión de péptidos. Generalmente, las moléculas de MHC están codificadas por un grupo de loci enlazados, que se denominan colectivamente H-2 en el antígeno leucocitario de ratón y humano (HLA) en los humanos. Por tanto, al MHC típicamente humano también puede hacerse referencia como antígeno leucocitario humano (HLA).

Las moléculas de MHC pueden incluir moléculas de MHC de clase I y clase II. Entre las moléculas de MHC de clase I se encuentran las moléculas de MHC clásicas y no clásicas, que difieren en su polimorfismo. Por ejemplo, las moléculas de clase I incluyen moléculas MHC clásicas altamente polimórficas de clase Ia o HLA de clase Ia (por ejemplo, HLA-A: 3129 alelos, proteínas 2245; HLA-B: 39779 alelos, proteínas 2938; y HLA-C (o HLA-CW): 2740 alelos, 1941 proteínas) y las moléculas de MHC de clase Ib menos polimórficas no clásicas o HLA-Ib (HLA-E: 17 alelos, 6 proteínas; HLA-F: 22 alelos, 4 proteínas; y HLA-G: 50 alelos, 16 proteínas), en base a la información publicada en agosto de 2015 en el sitio web de EBML-EBI en www.ebi.ac.uk/imgt/h1a/stats.html. Por tanto, MHC-E (o HLA-E) es una molécula de clase I de MHC no clásica.

Generalmente, las moléculas de MHC de clase I, incluyendo las clásicas (es decir, MHC de clase Ia) y las no clásicas (es decir, MHC de clase Ib, por ejemplo, MHC-E), son heterodímeros que tienen una membrana que abarca una cadena a, en algunos casos con tres dominios a, y una microglobulina p2 no covalentemente asociada. En algunos casos, las moléculas de MHC de clase I suministran péptidos que se originan en el citosol a la superficie celular, donde un complejo péptido:MHC es reconocido por las células T, como generalmente las células T CD8+. Por el contrario, Las moléculas de MHC de clase II generalmente están compuestas por dos glicoproteínas a y p transmembrana, las cuales generalmente abracan la membrana, y generalmente suministran péptidos que se originan en el sistema vesicular a la superficie celular, donde generalmente son reconocidas por las células T CD4+, pero, en algunos casos, células T CD8+.

En algunos casos, una molécula de MHC-E (o puede designarse como una molécula de HLA-E) es una molécula de MHC de clase I no clásica que está codificada por el gen HLA-E en humanos o un ortólogo u homólogo en otra especie. Por ejemplo, el homólogo en ratones se llama Qa-1b. El gen HLA-E se expresa de manera ubicua en todos los tejidos, aunque, en algunos casos, a niveles mucho más bajos que los otros genes de MHC Clase I no clásicos, HLA-G y HLA-F (ver Strong et al., J Biol Chem.febrero de 2003 14;278(7):5082-90). El MHC-E muestra un polimorfismo limitado, especialmente en comparación con las moléculas del MHC de clase I; sólo hay dos alelos conocidos de MHC-E en humanos, los alelos E*0101 y E*0103, que se encuentran en frecuencias aproximadamente iguales en diversas poblaciones. Generalmente, el MHC-E es estructuralmente similar a otras moléculas del MHC de clase I y existe como un heterodímero que contiene una cadena pesada a y una cadena ligera (también llamada microglobulina p-2). Se sabe que las moléculas de MHC-E se unen a péptidos (por ejemplo, oéptidos no naméricos) derivados de péptidos señal de moléculas de MHC de clase I clásicas, que estabilizan el MHC-E en la superficie de las células y, en algunos casos, pueden ser reconocidas por las células Nk para modular la activación de las células NK. Por ejemplo, en algunos aspectos, MHC-E puede unirse al receptor inhibidor de células NK CD94/NKG2A para inhibir la actividad de las células NK. En algunos casos, MHC-E en complejo con péptidos también puede interactuar con TCR expresados en células CD8+ (Pietra et al. (2010) Journal of Biomedicine and Biotechnology, ID de artículo 907092).

En algunos casos, el método divulgado implica preparar células, como células que expresan MHC-E, que son capaces de mostrar uno o más epítopos peptídicos en la superficie celular en el contexto de la molécula de MHC-E. En algunos casos, el método da como resultado la presentación o exposición de epítopos peptídicos, que incluyen, en algunos casos, epítopos peptídicos no canónicos en la superficie celular. En algunos casos, tales células se preparan poniendo en contacto, exponiendo y/o incubando la célula que expresa MHC-E con uno o más péptidos derivados de un antígeno objetivo, como un antígeno tumoral o un antígeno patógeno, incluyendo un antígeno bacteriano o viral. En algunos casos, el método incluye identificar o detectar un epítopo peptídico unido en el contexto de una molécula de MHC-E. El método puede incluir uno o más de identificar y/o aislar el epítopo peptídico, detectar y/o identificar un epítopo peptídico que muestra una respuesta inmune restringida por MHC-E (por ejemplo, respuesta inmune de CTL), y/o identificar o seleccionar una molécula de unión, por ejemplo, un TCR o un anticuerpo similar a TCR o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que se une a dicho epítopo peptídico restringido por MHC-E. Por ejemplo, en algunos casos, los métodos incluyen identificar o determinar la secuencia del péptido presentado o expuesto, evaluar la afinidad del péptido presentado o expuesto y/o evaluar o determinar la reactividad inmune (por ejemplo, respuesta de CTL) del péptido presentado o expuesto. En algunos casos, el epítopo peptídico es un epítopo peptídico universal, supertopo y/o no canónico (no convencional).

En algunos casos, el antígeno es un antígeno tumoral o es un antígeno viral relacionado con un tumor, como un antígeno viral oncogénico. En algunos aspectos, los casos divulgados se basan en observaciones de que MHC-E representa un objetivo específico de tumor para intervenciones terapéuticas. En general, el MHC-E se expresa en la mayoría de los tejidos humanos de manera similar al MHC de clase Ia clásico, aunque a niveles mucho más bajos que las moléculas de MHC de clase Ia clásico. En algunos casos, sin embargo, se han detectado niveles altos de MHC-E en células neoplásicas, como en tumores, incluyendo linfomas frescos, carcinomas de ovario, gliomas, cáncer de colon, melanomas y otros y, en algunos casos, se ha descubierto que se correlacionan con un peor resultado clínico (Pietra et al. 2010; Kruijf et al. (2010) J. Immunol., 185:7452-7459. Por el contrario, la clase de MHC Ia clásica está regulada por disminución en muchas células malignas, incluyendo en muchos tumores, lo que puede limitar la capacidad de dirigirse a epítopos peptídicos restringidos por ^mH^cde clase Ia en terapias tumorales. En la presente se contempla que el alto nivel de expresión de MHC-E en tumores y otros entornos inflamatorios convierte al MHC-E en un objetivo atractivo para las terapias dirigidas a tumores y otras terapias relacionadas con enfermedades en las que el MHC-E está altamente expresado, incluyendo afecciones relacionadas con el estrés y asociadas a patógenos.

En algunos casos, una ventaja de dirigirse a epítopos peptídicos restringidos por MHC-E, en oposición a otros epítopos restringidos por MHC de clase I clásicos, es que MHC-E es la menos polimórfica de todas las moléculas de MHC de clase I. Por ejemplo, los alelos de MHC E*0101 (HLA-E107R) y E*0103 (HLA-E107G) se encuentran en frecuencias aproximadamente iguales en diversas poblaciones y difieren en un solo aminoácido en la posición 107 (Pietra et al. (2010) Journal of Biomedicine and Biotechnology)

En algunos casos, un problema de muchas terapias relacionadas con TCR, incluyendo las terapias con anticuerpos similares a TCR, es que el agente terapéutico debe ser compatible con MHC (o HLA) con el sujeto, ya que las moléculas de MHC clásicas son altamente polimórficas. Por ejemplo, en todo el mundo, el alelo de m Hc más frecuente, HLA-A*2402, solo está presente en el 18,8% de las poblaciones (Solberg et al., (2008) Hum Immunol. julio 2008; 69(7):443-6). Aunque la frecuencia de las moléculas de MHC clásicas puede ser más alta en poblaciones específicas, puede ser difícil generar un agente terapéutico universal que esté restringido a la clase Ia de MHC. Por otro lado, las moléculas de MHC-E son mucho menos diversas entre las poblaciones de sujetos, ya que solo existen dos alelos de HLA-E que son, en la mayoría de los casos, funcionalmente idénticos.

En algunos casos, el epítopo peptídico identificado puede ser un epítopo peptídico universal y/o provocar una respuesta universal de células T. En algunos casos, un epítopo peptídico universal es un péptido que es reconocido y mostrado por una molécula o moléculas de MHC, como una molécula de MHC-E, incluyendo alelos, de una manera que puede provocar una respuesta inmune, como una respuesta inmune de CD8+, en la mayoría de sujetos de la misma especie. En algunos casos, un epítopo peptídico universal puede provocar tal respuesta inmune en más del 50% de los sujetos dentro de una población de una especie en particular, como especies de mamíferos o humanos, como generalmente en más del 60%, 70%, 80%, 90% o más de una población de sujetos expuestos a tal antígeno peptídico. Por ejemplo, en algunos casos, un péptido que tiene una secuencia de epítopo universal puede inducir una respuesta inmune, por ejemplo una respuesta de células T citotóxicas, de muestras de la mayoría de sujetos de la misma especie que son genéticamente divergentes en los loci de MHC, por ejemplo, difieren en el alelo de MHC-E. En algunos casos, un epítopo universal es una supertopo.

En algunos casos, el epítopo peptídico identificado puede ser una supertopo y/o provocar una respuesta de supertopo. En algunos casos, un supertopo es un epítopo peptídico que, en algunos casos, puede ser un epítopo altamente promiscuo que representa un epítopo o péptido común reconocido o presentado por MHC de una población de sujetos. En algunos casos, un supertopo o respuesta de supertopo se asocia con el reconocimiento por una molécula de MHC-E, como un HLA-E, que es capaz de reconocer un repertorio de péptidos más amplio que el MHC clásico, como las moléculas de MHC de clase Ia. Para otras moléculas de MHC, un supertopo puede ser un epítopo peptídico que representa un epítopo o péptido común reconocido por diferentes alelos de MHC del mismo supertipo de MHC (o HLA), como por ejemplo debido a una similitud estructural primaria o terciaria y/o una superposición o motivo de unión a péptidos compartido. En algunos casos, un supertopo puede provocar una respuesta de células T CD8+. En algunos casos, el epítopo peptídico identificado es uno que puede provocar una respuesta inmune, por ejemplo, una respuesta inmune de CD8+, en más del 50% de los sujetos dentro de una población de una especie particular, como una especie de mamífero o humana, como generalmente en más del 60%, 70%, 80%, 90% o más de la población de sujetos expuestos a dicho antígeno peptídico. En algunos casos, la población puede ser genéticamente divergente en los loci del MHC.

En algunos casos, el epítopo peptídico identificado puede ser un epítopo no canónico (o no convencional) y/o provocar una respuesta no canónica. En algunos casos, un epítopo no convencional o un epítopo no canónico es un epítopo peptídico mostrado o presentado en una molécula de MHC que puede no mostrar un motivo de secuencia conservado para la unión de MHC, por ejemplo, debido a la ausencia de uno o más residuos de anclaje, puede mostrar una interacción de unión de afinidad baja o media a las moléculas de MHC y/o pueden ser de una longitud más larga en comparación con los epítopos peptídicos convencionales o canónicos. Por tanto, un epítopo no canónico puede ser uno que no muestra un motivo de secuencia, longitud y/o afinidad de unión para la interacción MHC canónicos. En general, un epítopo peptídico canónico es generalmente reconocido por epítopos peptídicos de MHC de clase I o MHC de clase II clásicos, en el que el reconocimiento se basa en la presencia de un residuo o residuos, longitud y/o afinidad de unión conservados. En algunos casos, un epítopo no canónico es un epítopo que se muestra o se presenta en una molécula de MHC no clásica, como una molécula de MHC-E.

En algunos casos, los métodos permiten la identificación de epítopos que son péptidos unidos o reconocidos en el contexto de una molécula de MHC-E y que tienen una longitud de 8 a 13 aminoácidos, como generalmente por lo menos o aproximadamente por lo menos 8 aminoácidos, 9 aminoácidos, 10 aminoácidos, 11 aminoácidos o 12 aminoácidos. En algunos casos, el péptido unido o reconocido en el contexto de una molécula de MHC-E es un nonámero, es decir, 9 aminoácidos de longitud.

En algunos casos, los métodos permiten la identificación de un epítopo peptídico con una afinidad de unión, como se determina mediante la concentración inhibidora máxima (IC50), para un MHC unido que es de alta afinidad, afinidad intermedia o, en algunos casos, baja afinidad.. En algunos casos, la capacidad o afinidad de unión relativa de un péptido puede evaluarse midiendo la IC50 para la unión determinando la concentración necesaria para reducir la unión de un péptido informador marcado en un 50%. En algunos casos, un péptido no canónico puede incluir péptidos que muestran una afinidad más baja por una molécula de MHC que la que se observa de otro modo por los epítopos peptídicos canónicos. En algunos casos, un epítopo peptídico identificado por los métodos divulgados tiene una afinidad de unión con una IC50 de entre o aproximadamente 200 nM y 5000 nM, como generalmente mayor de 200 nM y menor de 4000 nM, 2000 nM, 1000 nM o 500 nM.

En algunos casos, los métodos divulgados pueden usarse para identificar epítopos peptídicos asociados con una enfermedad o afección en la que tales epítopos peptídicos se procesan o presentan de manera natural. En algunos aspectos, tales epítopos peptídicos pueden incluir o ser epítopos peptídicos universales, supertopos o no canónicos. En algunos aspectos, la presencia de mecanismos inmunorreguladores y/o cambios en la regulación inmune asociados con estados patogénicos pueden apoyar el procesamiento o presentación de epítopos universales, supertopos y/o no canónicos sobre epítopos convencionales en una enfermedad o afección particular. En algunos casos, los métodos pueden usarse para identificar epítopos peptídicos asociados con tumores o cánceres. En algunos casos, los métodos pueden usarse para identificar epítopos peptídicos relacionados con cánceres asociados con virus.

En algunos casos, los métodos pueden usarse para identificar péptidos restringidos por MHC-E asociados con un estado patógeno o de enfermedad. En algunos casos, los métodos pueden usarse para identificar péptidos restringidos por MHC E derivados de un antígeno asociado a tumor (TAA). En algunos casos, los métodos pueden usarse para identificar péptido restringido por MHC-E derivado de un antígeno viral, incluyendo un antígeno encontrado en un cáncer asociado a virus. En algunos casos, el complejo MHC-E-péptido es reconocido por una célula T CD8+ y/o está asociado con una respuesta de CTL. En algunos casos, los péptidos o epítopos restringidos por MHC E identificados pueden usarse como objetivos en el desarrollo o identificación de moléculas que reconocen específicamente el péptido objetivo en el contexto de MHC-E.

En algunos casos, un péptido o epítopo identificado provoca una respuesta de células T. En algunos casos, el péptido o epítopo identificado que provoca una respuesta de células T es un péptido o epítopo universal, supertopo y/o no canónico. En algunos casos, la respuesta o respuestas de células T se provoca en el contexto de una población de células que contiene células CD8+ que han sido expuestas o puestas en contacto con el péptido. En un ejemplo particular, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de un sujeto, como un sujeto con un tumor o cáncer, pueden estimularse con el péptido y evaluar su activación. En la se conocen bien técnica varios ensayos para evaluar la activación de células T. En algunos casos, el epítopo identificado puede activar una respuesta de células T CD8+. En un caso, las respuestas de células T CD8+ puede evaluarse monitorizando la reactividad de CTL usando ensayos que incluyen, pero no se limitan a, lisis de células objetivo mediante liberación de 51Cr o detección de la liberación de interferón gamma, como por ejemplo mediante ensayo inmunoabsorbente de manchas ligado a enzimas (ELISA), tinción de citoquinas intracelulares o ELISPOT.

En algunos casos, también se divulgan métodos para seleccionar o cribar una molécula de unión que se une a un péptido restringido por MHC-E particular. En algunos casos, el péptido restringido por MHC-E es un epítopo peptídico identificado por cualquiera de los métodos anteriores que, en algunos casos, puede ser un epítopo peptídico universal, supertopo y/o no canónico. En algunos casos, la molécula de unión es un TCR o una porción de unión a antígeno del mismo. En algunos casos, la molécula de unión es un anticuerpo, como un anticuerpo similar a TCR, o una porción de unión a antígeno del mismo. En algunos casos, los métodos incluyen poner en contacto una molécula de unión (por ejemplo, un TCR, un anticuerpo o porciones de unión a antígeno del mismo) o una biblioteca de moléculas de unión (por ejemplo, una biblioteca de TCR, anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos) con un epítopo restringido por MHC-E e identificar o seleccionar moléculas que se unen específicamente a dicho epítopo. En algunos casos, los métodos pueden realizarse in vivo, ex vivo o in vitro. En algunos casos, puede cribarse o evaluarse una biblioteca o colección que contiene una pluralidad de moléculas de unión diferentes, como una pluralidad de TCR diferentes o una pluralidad de anticuerpos diferentes, para determinar la unión a un epítopo restringido por MHC-E. En algunos casos, como para seleccionar una molécula de anticuerpo que se une específicamente a un péptido restringido por MHC-E, pueden emplearse métodos de hibridoma.

En algunos casos, los métodos pueden emplearse para identificar una molécula de unión de MHC-E-péptido, como un TCR o anticuerpo que muestra unión promiscua y/o de reacción cruzada entre ambos alelos de MHC-E. En algunos casos, la molécula de unión de MHC-E-péptido, como un TCR o un anticuerpo, se une o reconoce específicamente un péptido presentado en el contexto de los alelos de MHC-E, como los alelos HLA-E*0101 y/o HLA-E*0103.

En algunos casos, puede usarse un anticuerpo identificado, como un anticuerpo similar a TCR, para producir o generar receptores de antígenos quiméricos (CAR) que contienen un anticuerpo no TCR que se une específicamente a un complejo MHC-péptido.

En algunos casos, pueden usarse métodos para identificar una molécula de unión de MHC-E-péptido, como un anticuerpo TCR o similar a TCR o CAR similar a TCR, para diseñar células que expresan o contienen una molécula de unión de MHC-E-péptido. En algunos casos, una célula o célula modificada es una célula T. En algunos casos, la célula T es una célula T CD8+. En algunos casos, la molécula de unión de MHC-E-péptido reconoce péptidos en el contexto de una molécula de MHC-E, es decir, un complejo MHC-E péptido. En algunos casos, también se divulga una composición de células T CD8+ modificadas que expresan o contienen la molécula de unión de MHC-E, como un TCR, un anticuerpo similar a TCR o un CAR similar a TCR, para el reconocimiento de un péptido presentado en el contexto de la molécula de MHC-E. En cualquiera de tales casos, las células pueden usarse en métodos de terapia celular adoptiva.

II. Métodos para identificar epítopos de células T restringidos por MHC-E

En algunos aspectos se divulgan métodos para identificar o detectar un epítopo peptídico en el contexto de una molécula de MHC-E, incluyendo los epítopos peptídicos derivados de un antígeno proteico objetivo, como un antígeno tumoral. En algunos casos, el epítopo peptídico identificado o detectado puede ser un epítopo peptídico universal, supertopo y/o no canónico. En algunos casos, el antígeno objetivo es un antígeno tumoral. En algunos casos, el antígeno objetivo es un antígeno viral. En algunos casos, el antígeno objetivo es un antígeno tumoral viral oncogénico.

En algunos casos, los métodos implican poner en contacto, exponer y/o incubar una molécula de MHC-E con uno o más péptidos derivados del antígeno objetivo, como un antígeno tumoral o viral. En algunos casos, la molécula de MHC-E se expresa en la superficie de una célula. En algunos casos, el contacto o la exposición de una molécula de MHC-E con uno o más péptidos puede ser extracelular o puede ser intracelular. En algunos casos, el péptido o péptidos se derivan de un grupo de péptidos, como péptidos superpuestos presentes en el antígeno objetivo, que se incuban con la célula. En algunos casos, el péptido o péptidos se derivan de una molécula de ácido nucleico sintética, por ejemplo, una molécula de ADNc, que se transfiere a la célula para la expresión de antígeno de un antígeno objetivo heterólogo o exógeno en condiciones en las que el antígeno objetivo expresado se procesa para producir epítopos peptídicos del antígeno objetivo mostrado en una molécula mayor de histocompatibilidad (MHC) de la célula para generar un complejo MHC-péptido.

En algunos casos, los métodos divulgados incluyen identificar o detectar un epítopo peptídico, reconocido o unido en el contexto de un MHC de clase Ib no clásico, como en el contexto de un MHC-E (por ejemplo, HLA-E). En algunos casos, el péptido unido o reconocido en el contexto de una molécula de MHC-E es un epítopo peptídico universal, supertopo y/o no canónico. En algunos casos, el epítopo peptídico identificado o detectado por el presente método no son péptidos presentados, reconocidos o unidos en el contexto de un MHC de clase Ia clásico (por ejemplo, HLA-A, B o C).

En algunos casos, después de identificar o detectar un epítopo peptídico que se reconoce o se une a una molécula de MHC-E, el método incluye además aislar o purificar el péptido unido o reconocido en el contexto de una molécula de MHC-E. En algunos casos, los métodos divulgados incluyen evaluar o determinar una respuesta inmune, como una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) provocada por un péptido unido en el contexto de una molécula de MHC-E. En algunos casos, los epítopos peptídicos que provocan una respuesta inmune en el contexto de una molécula de MHC-E, como provocan una respuesta de CTL, se identifican, aíslan y/o purifican.

En algunos casos, se divulgan métodos que incluyen poner en contacto, exponer y/o incubar una molécula de MHC-E (por ejemplo, expresada en la superficie de una célula) con uno o más péptidos derivados del antígeno objetivo (por ejemplo, grupo de péptidos superpuestos o péptidos derivados a partir de un antígeno exógeno o heterólogo expresado en la célula), y detectar o identificar epítopos peptídicos, como epítopos peptídicos de un antígeno tumoral, que provocan una respuesta inmune (por ejemplo, respuesta de CTL) en el contexto de una molécula de MHC-E. En algunos casos, las células que expresan MHC-E que se han puesto en contacto, expuesto y/o incubado con uno o más péptidos derivados de un antígeno objetivo (por ejemplo, antígeno tumoral o viral) pueden evaluarse para una respuesta inmune de CTL. En algunos casos, los métodos incluyen además aislar o purificar un péptido que, en el contexto de una molécula de MHC-E, provoca una respuesta inmune, por ejemplo respuesta de CTL.

En algunos casos, el método incluye determinar la secuencia del péptido unido o reconocido por la molécula de MHC-E y/o que provoca una respuesta inmune, por ejemplo, respuesta inmune de CTL, en el contexto de una molécula de MHC-E.

En algunos casos, puede identificarse una molécula de unión, como un TCR, un anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que reconocen, por ejemplo, se unen específicamente, a un péptido reconocido o unido a una molécula de MHC-E.

A. Células que expresan MHC-E

En algunos casos, las células que expresan una molécula de MHC-E se usan en los métodos divulgados. Una célula que expresa MHC-E puede ser cualquier célula que exprese MHC-E en la superficie celular. En algunos casos, la célula es una célula primaria. En algunos casos, la célula es una línea celular. En algunos casos, la célula es una célula humana.

En algunos casos, las células que expresan MHC-E son células o líneas celulares que contienen expresión endógena de MHC-E en la superficie celular. Las células que expresan MHC-E son conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Grimsley et al. (2002) Tissue Antigens, 60:206-212; Monaco et al. (2008) J. Immunol., 181:5442-5450). En algunos casos, está dentro del nivel de un experto en la técnica realizar la tipificación estándar de células para determinar o confirmar el genotipo de MHC (por ejemplo, HLA), como mediante el uso de tipificación basada en secuencia (SBT), PCR-SSP u otro método de tipificación (ver, por ejemplo, Grimsley et al. (2002); Adams et al., (2004) J. Transl. Med., 2:30; Smith (2012) Methods Mol Biol., 882: 67-86).

En general, las moléculas de MHC-E se expresan comúnmente en células endoteliales, fibroblastos y células inmunes (por ejemplo, células B, células T, células NK, monocitos, macrófagos, células dendríticas). En algunos casos, puede inducirse a las células a expresar una molécula de MHC-E. En algunos aspectos, la infección de células con CMV induce la expresión de MHC-E en la superficie de tales células, por ejemplo, hasta 6 horas, 8 horas, 12 horas o 24 horas después de poner en contacto o introducir las células con CMV (por ejemplo, Rolle et al. (2014) J. Clin. Invest., 124:5305-5316). En algunos casos, una célula puede estimularse o activarse para regular por incremento la expresión de MHC-E en la superficie celular, por ejemplo, usando interferón gamma u otro agente estimulador. Los agentes estimuladores o activadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, uno o más de IFN^y, TNFa, IL1p, mitomicina C, acetato de miristato de forbol (PMA) o ionomicina, como generalmente IFN^y. En algunos casos, la expresión en la superficie celular de una molécula de MHC-E puede inducirse o regularse por incremento mediante la incubación de células, como un cultivo de células, en una confluencia de o de aproximadamente el 30% al 60%, por ejemplo aproximadamente el 40%, en presencia de una cantidad estimuladora de un agente estimulador, por ejemplo interferón gamma, generalmente de 50 U/ml a 500 U/ml, como generalmente por lo menos 100 U/ml o por lo menos 200 U/ml. En algunos casos, una célula puede incubarse con el agente estimulador, como el interferón gamma, durante entre o entre aproximadamente 10 minutos y 96 horas, como durante por lo menos 30 minutos, 1 hora, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas o 72 horas.

En algunos casos, la célula es una línea celular, como una línea celular disponible de fuentes privadas y comerciales, como American Type Culture Collection (ATCC); National Institute of Medical Sciences (NGIMS); ASHI Repository; the European Collection of Cell Cultures (ECACC); o el Banco de ADN y células del Grupo de Trabajo de Histocompatibilidad Internacional (IHW). En algunos casos, las líneas celulares están disponibles comercialmente.

En algunos casos, la célula es una línea de células B inmortalizadas con EBV. Ejemplos de tales líneas celulares incluyen, pero no se limitan a, CJO (IHW N° 9243), LBF, LG2, Molt4 (IHW N° 9226), BSM (IHW N° 9032), JVM (IHW N29039), MGAR (IHW N29014), WT51 (IHW N29029), JY, RM-13 y LKT-3. Ver, por ejemplo, Monaco et al. (2008) J. Immunol., 181:5442-5450.

En algunos casos, la célula se modifica o se transfecta para expresar una molécula de MHC-E. En algunos casos, las líneas celulares pueden prepararse modificando genéticamente una línea celular parental. En algunos casos, las células normalmente son deficientes en MHC-E y están diseñadas para expresar una molécula de MHC-E. En algunos casos, la célula puede ser una línea celular estable o puede transfectarse transitoriamente. En algunos casos, las células son deficientes en una o ambas moléculas de MHC de clase Ia (por ejemplo, HLA-A, B y C) o moléculas de MHC de clase II.

En algunos casos, una célula que expresa MHC-E, como una célula que se modifica o transfecta para expresar una molécula de MHC-E, es una que carece o se hace que carezca de expresión de otra molécula de MHC de clase I, generalmente una molécula de HLA-A, B o C. En algunos casos, una célula que expresa MHC-E o que está modificada para expresar MHC-E carece de expresión endógena de otra molécula de MHC de clase I, generalmente una molécula de HLA-A, B o C. Las líneas celulares ejemplares que carecen de expresión endógena de otra molécula de MHC de clase I, como una molécula de HLA-A, B o C, pueden incluir, pero no se limitan a, una línea celular expuesta en la Tabla 1. En algunos casos, la célula modificada es o se deriva de una línea celular 221 o K562. Por ejemplo, la línea celular LCL 721.221 es una línea celular mutante derivada de LCL 721 por inmunoselección después de mutagénesis de rayos gamma para eliminar la expresión de las cadenas alfa de HLA-A-B y C de MHC de clase I (Shimizu et al. (1988) PNAS) 85:227- 231). Las células transfectadas con HLA-E ejemplares incluyen, pero no se limitan a, K562 HLA-E B5 (ver, por ejemplo, Ulbrecht et al. (2000) Journal of Immunol., 164:5019-5022) y RMA-S-EM (Borrego et al. al. (1998) J. Exp. Med., 187: 813).

En algunos casos, una célula que expresa un MHC-E, como una célula que se modifica o transfecta para expresar una molécula de MHC-E, es una en la que otra molécula de MHC de clase I, como un HLA-A, B o C, puede expresarse normalmente, pero en la que la expresión, actividad y/o función de un gen que codifica tal MHC de clase I, como un gen de HLA A, B o C, está reprimida o alterada. A continuación se describen métodos ejemplares para reprimir o alterar un gen, como un gen de HLA A, B o C.

En algunos casos, puede introducirse una molécula de ácido nucleico que codifica MHC-E en una célula, como una célula que normalmente no expresa MHC-E, no expresa MHC-E en la superficie celular y/o que puede expresar MHC- E a un nivel bajo, por ejemplo, cualquiera de las células descritas anteriormente. Típicamente, las células se modifican genéticamente usando técnicas de ADN recombinante. La secuencia de un MHC-E ejemplar (por ejemplo, el alelo E*01:01) se expone en la SEQ ID NO: 1 (GenBank N° AAH02578.1 o UniProt N° P13747.3) y está codificada por una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 (GenBank N° BC002578). La secuencia de un MHC-E ejemplar (por ejemplo, el alelo E*0103) se expone en la SEQ ID NO: 3 (GenBank N° NP_005507) y está codificada por una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 (GenBank N° NM_005516.5). En algunos casos, el gen de la cadena pesada de MHC-E puede aislarse de la sangre de un sujeto, como amplificarse mediante PCR usando cebadores degenerados. En algunos casos, el gen de la cadena pesada de MHC-E puede generarse sintéticamente, por ejemplo, basándose en información de secuencia conocida fácilmente disponible para los alelos de MHC.

En algunos casos, la secuencia puede clonarse en un vector de expresión. En algunos casos, los métodos para generar un vector de expresión pueden ser mediante técnicas estándar de ADN recombinante. La construcción de vectores de expresión y la producción recombinante a partir de las secuencias de ADN apropiadas se realizan mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se usan técnicas estándar para el aislamiento, la amplificación y la clonación de ADN y ARN. Generalmente, las reacciones enzimáticas que implican ADN ligasa, ADN polimerasa y endonucleasas de restricción se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Estas técnicas y varias otras técnicas se realizan generalmente de acuerdo con Sambrook et al., Molecular Cloning -A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Tales procedimientos son bien conocidos en la técnica.

En algunos casos, pueden incluirse sitios de restricción en la secuencia del gen para ayudar a la inserción en los vectores de expresión y la manipulación de la secuencia génica. La secuencia puede insertarse en un vector de expresión. En algunos casos, el vector de expresión es un vector de expresión de mamífero o un vector de expresión viral. En algunos casos, el vector de expresión puede ser un vector pCR2.1, pLNCx, pcDNA, pEAK, pBluescript o pUC18. En algunos casos, el vector de expresión es un vector de expresión retroviral, como un vector de expresión lentiviral.

En algunos casos, los ácidos nucleicos, como los vectores, incluyendo los alelos de HLA particulares, están disponibles de fuentes comerciales o privadas. Por ejemplo, los plásmidos de expresión de MHC-E, es decir, HLA-E, incluyendo los vectores de expresión de mamíferos y lentivirales, están disponibles de fuentes comerciales, como Sino Biological, Inc. (ver, por ejemplo, N° de catálogo HG13375), GeneCopoeia (N° de Cat. LPP-Q0324) y otros.

En algunos casos, el vector de expresión que codifica el MHC-E puede introducirse en una célula huésped para su expresión. Generalmente, la transfección o transformación se realiza usando técnicas estándar apropiadas para tales células dependiendo de la célula huésped usada. Los métodos de transfección comunes incluyen, pero no se limitan a, lipofección, microinyección, electroporación, métodos que usan fosfato de calcio o métodos de administración basados en virus. Por ejemplo, en algunos casos, las células pueden transducirse usando vectores lentivirales o retrovirales. En algunos casos, las células transformadas pueden cultivarse en condiciones que favorezcan la expresión de la molécula de MHC-E y la expresión en la superficie celular.

En algunos casos, la expresión de MHC-E en la superficie de la célula puede estabilizarse mediante la adición de un péptido derivado de una molécula de MHC de clase Ia. En algunos casos, el péptido es un péptido de una secuencia líder de una molécula de MHC de clase Ia. Por ejemplo, en algunos casos, la expresión de MHC-E en la superficie de las células se aumenta en presencia de un péptido derivado de una secuencia líder de MHC de clase Ia para el ensamblaje del complejo de MHC-E (Lee et al. (1998) Journal of Immunology, 1604951-4960; Braud et al. (1998) Current Biology, 8:1-10). En algunos casos, el péptido puede añadirse de forma exógena e incubarse con células, en cuyo caso puede que no sea necesario un transportador asociado con el procesamiento de antígenos (TAP). En algunos casos, el péptido es procesado por la célula donde puede ser suministrado al retículo endoplásmico (ER) por TAP para unirse a una molécula naciente de MHC-E. Por tanto, en algunos casos, la célula puede contener un TAP. En algunos casos, la célula puede ser deficiente en TAP.

En algunos casos, un péptido exógeno correspondiente a una secuencia líder de una molécula de MHC de clase Ia se incuba con una célula transfectada con MHC-E. En algunos casos, la incubación se produce a una temperatura de aproximadamente 22° C a 30° C, como generalmente 26° C ± 3° C. En algunos casos, el péptido es un nonámero. En algunos casos, el péptido se deriva de una secuencia líder de una molécula de MHC de clase Ia en la que está presente una metionina en la posición 2 y una leucina en la posición terminal carboxilo del nonámero. En algunos casos, el péptido se deriva de una secuencia líder de una molécula de MHC de clase Ia que es un HLA-A, HLA-B, HLA-C o un HLA-G. En algunos casos, el péptido se deriva de una secuencia líder de una molécula de MHC de clase Ia que es HLA-A*0101, HLA-A*0201, HLA-A*0211, HLA-A*0301, HLA-A*2403, HLA-A*2501, HLA-A*3601, HLA-A*0702, HLA-A*0801, HLA-B*6501, HLA-Cw*0401, HLA-Cw*1502, HLA-G. En algunos casos, el péptido tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 3-11 de una secuencia líder de MHC de clase Ia. En algunos casos, el péptido tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NOS: 5-9.

En algunos casos, una célula se cotransfecta con una molécula de MHC de clase Ia y un MHC-E. En algunos casos, la molécula de MHC de clase Ia es una en la que, dentro de los residuos 3-11 de su secuencia líder, hay una metionina presente en la posición 2 y una leucina en la posición terminal carboxilo. En algunos casos, la molécula de MHC de clase Ia es un HLA-A, HLA-B, HLA-C o un HLA-G. En algunos casos, la molécula de MHC de clase Ia es HLA-A*0101, HLA-A*0201, HLA-A*0211, HLA-A*0301, HLA-A*2403, HLA-A*2501, HLA-A*3601, HLA-A*0702, HLA-A*0801, HLA-B*6501, HLA-Cw*0401, HLA-Cw*1502 o HLA-G.

En algunos casos, un gen híbrido de MHC-E que contiene una secuencia líder de una molécula de MHC de clase Ia fusionada con la proteína madura de HLA-E puede transfectarse en una célula. En algunos casos, la molécula híbrida contiene un promotor y una secuencia líder de una molécula de MHC de clase Ia fusionada con la proteína madura de HLA-E. En algunos casos, la molécula de MHC de clase Ia es una en la que, dentro de los residuos 3-11 de su secuencia líder, hay una metionina presente en la posición 2 y una leucina en la posición terminal carboxilo. En algunos casos, la secuencia líder puede derivarse de una molécula de MHC de clase Ia que es un HLA-A, HLA-B, HLA-C o un HLA-G. En algunos casos, la secuencia líder es de una molécula de MHC de clase I que es HLA-A*0101, HLA-A*0201, HLA-A*0211, HLA-A*0301, HLA-A*2403, HLA-A*2501, HLA-A*3601, HLA-A*0702, HLA-A*0801, HLA-B*6501, HLA-Cw*0401, HLA-Cw*1502 o HLA-G. Por ejemplo, un ejemplo de dicho híbrido es un gen híbrido de AEH que contiene el promotor HLA-A2 y la secuencia señal y la secuencia de la proteína madura de HLA-E, que, en algunos casos, puede dar como resultado una proteína madura idéntica a la codificada por el gen de HLA-E pero que puede expresarse de manera estable en la superficie celular (ver, por ejemplo, Lee et al. (1998) Journal of Immunology, 160:4951 -4960).

En algunos casos, la célula es una célula LCL 721.221, K562 o una célula RMA-S que se transfecta para expresar una molécula de MHC-E estabilizada en presencia de una secuencia líder de MHC de clase Ia. En la técnica se conocen las líneas celulares que se modifican para expresar el MHC-E de la superficie celular estabilizado en presencia de un péptido de secuencia líder del MHC de clase Ia (Lee et al. (1998) Journal of Immunology, 160: 4951-4960; Zhongguo et al. (2005) 13:464-467; García et al. (2002) Eur J. Immunol., 32:936-944). Ejemplos de tales líneas celulares para su uso en los métodos divulgados en la presente son las células 221-AEH.

En algunos casos, la célula es una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC). Típicamente, las aAPC incluyen características de las APC naturales, incluyendo la expresión de una molécula de MHC, molécula o moléculas estimuladoras y coestimuladoras, receptor de Fc, molécula o moléculas de adhesión y/o la capacidad de producir o secretar citoquinas (por ejemplo, IL-2). Normalmente, una aAPC es una línea celular que carece de expresión de uno o más de los anteriores, y se genera mediante la introducción (por ejemplo, mediante transfección 0 transducción) de uno o más de los elementos faltantes entre una molécula de MHC, un receptor Fc de baja afinidad. (CD32), un receptor Fc de alta afinidad (CD64), una o más señales coestimuladoras (por ejemplo, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4- 1BBL, OX40L, ICOS-L, ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, ILT3, ILT4, 3/TR6 o un ligando de B7-H3; o un anticuerpo que se une específicamente a CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, receptor de ligando Toll o un ligando de CD83), una molécula de adhesión celular (por ejemplo, ICAM-1 o LFA-3) y/o una citoquina (por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL- 15, IL-21, interferón-alfa (IFNa), interferón-beta (IFNp), interferón-gamma (IFNy ), factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), factor de necrosis tumoral beta (TNFp), factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF) y factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF)). En algunos casos, una aAPC normalmente no expresa una molécula de MHC, pero puede modificarse para que exprese una molécula de MHC o, en algunos casos, se induce o puede inducirse a que exprese una molécula de MHC, como por estimulación con citoquinas. En algunos casos, las aAPC también pueden cargarse con un ligando estimulador o coestimulador, que puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD28 o un anticuerpo anti-CD2. Un ejemplo de una línea celular que puede usarse como estructura principal para generar una aAPC es una línea celular K562 o una línea celular de fibroblastos. Se conocen varias aAPC en la técnica, ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 8.722.400, solicitud publicada N° US2014/0212446; Butler y Hirano (2014) Immunol Rev., 257(1): 10. 1111/imr.12129; Suhoshki et al. (2007) Mol. Ther., 15: 981-988).

En algunos casos, la línea celular puede, opcionalmente, modificarse genéticamente con una p2-microglobulina, como si la célula madre no expresara p2-microglobulina endógena. En algunos casos, se introduce una única cadena pesada de MHC-E en las células, por ejemplo, usando un vector de expresión. En algunos casos, se introducen una cadena pesada de MHC-E y p2-microglobulina, ya sea simultánea o secuencialmente en cualquier orden, como usando uno o más vectores de expresión.

En algunos casos, las células transfectadas que expresan la molécula de MHC-E expresada, como modificada genéticamente, pueden seleccionarse mediante procedimientos estándar. En algunos casos, puede usarse un anticuerpo específico de HLA para seleccionar o identificar las células. En la técnica se conocen anticuerpos ejemplares y los ejemplos no limitativos se describen en otra parte en la presente. En algunos casos, la expresión de MHC particular se confirma mediante citometría de flujo.

En algunos casos, los métodos divulgados pueden emplear una línea celular de control que expresa un MHC de clase I clásico (es decir, MHC de clase Ia) y/o un MHC de clase II en la superficie celular. En algunos casos, pueden usarse células de control en métodos sustractivos para eliminar epítopos peptídicos presentados en el contexto de una molécula de MHC de clase Ia o en el contexto de una molécula de MHC de clase II. En algunos casos, pueden usarse células de control para la selección negativa de moléculas de unión que se unen o reconocen un epítopo peptídico presentado en el contexto de una molécula de MHC de clase Ia o una molécula de MHC de clase II. En algunos casos, la célula original o principal o la línea celular es la misma que las células que expresan MHC-E, excepto que tales células de control expresan adicionalmente MHC clase Ia o expresan MHC clase Ia en lugar de MHC-E. En algunos casos, se usa una célula que expresa MHC-E (por ejemplo. célula de prueba) para la selección positiva y una molécula clásica de MHC de clase I (por ejemplo, HLA-A, -B o -C) y/o una molécula de MHC de clase II (por ejemplo, HLA-DR o HLA-DQ) para la selección negativa.

Generalmente, la mayoría de las células nucleadas expresan moléculas de MHC de clase Ia. En algunos casos, puede inducirse a las células para que expresen una molécula de MHC de clase Ia. En algunos casos, las células pueden modificarse para expresar una molécula de MHC de clase Ia, como un alelo de MHC de clase Ia particular. Por ejemplo, en algunos casos, la célula que expresa MHC de clase Ia es una que se ha preparado modificando genéticamente una línea celular original, como una línea celular de mamífero (por ejemplo, línea celular humana), con una cadena HLAa de clase Ia. En algunos casos, la línea celular puede, opcionalmente, modificarse genéticamente con una p2-microglobulina, como si la célula madre no expresara p2-microglobulina endógena. En algunos casos, puede introducirse un único alelo a de clase Ia a en las células, por ejemplo, usando un vector de expresión. En algunos casos, puede introducirse un único alelo a de clase Ia y p2-microglobulina en las células, ya sea simultánea o secuencialmente en cualquier orden, como usando uno o más vectores de expresión.

En algunos casos, la célula que expresa el MHC de clase Ia expresa un alelo de MHC de clase Ia que puede ser cualquiera que se sepa que esté presente en un sujeto, como un sujeto humano. En algunos casos, el alelo del MHC clase Ia es un alelo HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-A28, HLA-A31, HLA-A33, HLA-A34, HLA-B7, HLA-B45 o HLA-Cw8. En algunos casos, el alelo de MHC de clase Ia puede ser cualquiera que se exponga en la Tabla 2, que se encuentran entre los alelos de MHC de clase Ia más frecuentes en la población de Estados Unidos.

En algunos casos, el alelo del MHC de clase la es un alelo HLA-A2, que en algunas poblaciones es expresado por aproximadamente el 50% de la población. En algunos casos, el alelo HLA-A2 puede ser un producto génico HlA-A*0201,*0202,*0203,*0206 o*0207. En algunos casos, puede haber diferencias en la frecuencia de subtipos entre diferentes poblaciones. Por ejemplo, en algunos casos, más del 95% de la población caucásica positiva para HLA-A2 es HLA-A*0201, mientras que en la población china se ha informado que la frecuencia es de aproximadamente el 23% de HLA-A*0201, 45% de HLA -A*0207, 8% de HLA-A*0206 y 23% de HLA-A*0203. En algunos casos, la molécula de MHC es HLA-A*0201. En algunos casos, los ácidos nucleicos, como los vectores, que codifican alelos de HLA particulares están disponibles en fuentes comerciales o privadas, por ejemplo, el Grupo de Trabajo Internacional de Histocompatibilidad disponible en at www.ihwg.org/hla., Sino Biological, Inc. (Beijing, CN), GeneCopoeia (Rockville, MD), DNASU Plasmid Repository (Universidad Estatal de Arizona, Tempe, AZ), Addgene (Cambridge, m A) y otros.

Métodos para reprimir o alterar un gen no MHC-E en una célula

En algunos casos, una célula que expresa un MHC-E, como una célula que está modificada o transfectada para expresar una molécula de MHC-E, es una en la que otra molécula de MHC de clase I, como un HLA-A, B o C, puede expresarse normalmente, pero en la que la expresión, actividad y/o función de un gen que codifica otro MHC de clase I, como un gen HLA-A, -B o -C, está reprimida o alterada. En ejemplos particulares, la represión o alteración génica se produce al dirigirse a una cadena pesada de otra molécula de MHC de clase I, como una molécula HLA-A, -B o -C. Los métodos para reprimir o alterar genes son bien conocidos en la técnica y, en algunos aspectos, pueden incluir el uso de moléculas de ácidos nucleicos inhibidoras o métodos de edición génica. En algunos casos, después de la represión o alteración del gen usando tales métodos, incluyendo cualquiera de los descritos en la presente, la expresión de una molécula de MHC de clase I (distinta de MHC-E) en la superficie celular no es más del 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% o menos de la expresión de la molécula en las mismas células en las que el mismo gen del MHC de clase I no fue reprimido o alterado. En algunos casos, el nivel o grado de expresión puede evaluarse mediante procedimientos estándar. En algunos casos, puede usarse un anticuerpo específico de HLA para seleccionar o identificar las células. Los anticuerpos ejemplares se conocen en la técnica y los ejemplos no limitativos se describen en otra parte en la presente. En algunos casos, la expresión de un MHC particular se determina mediante citometría de flujo. En algunos casos, puede usarse PCR específica de alelo para determinar el nivel de expresión génica y, por tanto, la modificación génica.

En algunos casos, la represión génica se logra usando una molécula de ácido nucleico inhibidora que es un agente de ARN interferente, que puede usarse para suprimir o reprimir selectivamente la expresión del gen. Por ejemplo, la represión génica puede llevarse a cabo mediante ARN interferente (ARNi), ARN interferete corto (ARNip), horquilla corta (ARNhc), antisentido y/o ribozimas. En algunos casos, los agentes de ARN interferente también pueden incluir otras especies de ARN que pueden procesarse intracelularmente para producir ARNhc, incluyendo especies de ARN idénticas a un precursor de miARN de oriten natural o un precursor diseñado de un ARN similar a miARN.

En algunos casos, un agente de ARN interferente es por lo menos un ARN parcialmente de cadena doble que tiene una estructura característica de moléculas que se sabe en la técnica que median la inhibición de la expresión génica a través de un mecanismo de ARNi o una cadena de ARN que comprende porciones por lo menos parcialmente complementarias que hibridan entre sí para formar tal estructura. Cuando un ARN contiene regiones complementarias que hibridan entre sí, se dirá que el ARN se autohibrida. En algunos casos, un ácido nucleico inhibidor, como un agente de ARN interferente, incluye una porción que es sustancialmente complementaria a un gen objetivo. En algunos casos, un agente de ^aRⁿinterferente dirigido a una transcripción también puede considerarse dirigido al gen que codifica y dirige la síntesis de la transcripción. En algunos casos, una región objetivo puede ser una región de una transcripción objetivo que hibrida con una cadena antisentido de un agente de ARN interferente. En algunos casos, una transcripción objetivo puede ser cualquier ARN que sea un objetivo para la inhibición por ARN interferente.

En algunos casos, se considera que un agente de ARN interferente está "dirigido" a una transcripción y al gen que codifica la transcripción si (1) el agente de ARNi comprende una porción, por ejemplo, una cadena, que es por lo menos aproximadamente un 80%, aproximadamente un 85%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 91%, aproximadamente un 92%, aproximadamente un 93%, aproximadamente un 94%, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 96%, aproximadamente un 97%, aproximadamente un 98%, aproximadamente un 99% o aproximadamente un 100% complementaria a la transcripción sobre una región de aproximadamente 15-29 nucleótidos de longitud, por ejemplo, una región de por lo menos aproximadamente 15, aproximadamente 17, aproximadamente 18 o aproximadamente 19 nucleótidos de longitud; y/o (2) la T^mde un dúplex formado por un tramo de 15 nucleótidos de una cadena del agente de ARNi y una porción de 15 nucleótidos de la transcripción, en condiciones (excluyendo la temperatura) encontradas típicamente dentro del citoplasma o núcleo de las células de mamíferos no es más de aproximadamente 15° C menor o no más de aproximadamente 10° C menor, que la T^mde un dúplex que estaría formado por los mismos 15 nucleótidos del agente de ARN interferente y su complemento exacto; y/o (3) la estabilidad de la transcripción se reduce en presencia del agente de ARN interferente en comparación con su ausencia.

En algunos casos, un agente de ARN interferente incluye opcionalmente uno o más análogos o modificaciones de nucleótidos. Un experto en la técnica reconocerá que los agentes de ARNi pueden incluir ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, análogos de nucleótidos, nucleótidos modificados o cadenas principales. En algunos casos, los agentes de ARN interferente pueden modificarse después de la transcripción. En algunos casos, los agentes de ARN interferente pueden contener una o más cadenas que hibridan o autohibridan para formar una estructura que incluye una porción dúplex de entre aproximadamente 15-29 nucleótidos de longitud, teniendo opcionalmente uno o más nucleótidos malapareados o desapareados dentro del dúplex.

En algunos casos, el término "ARN interferente corto" (ARNip) se refiere a un ácido nucleico que incluye una porción de cadena doble de entre aproximadamente 15-29 nucleótidos de longitud y opcionalmente incluye además un saliente de cadena sencilla (por ejemplo, de 1-6 nucleótidos de longitud) en una o ambas cadenas. En algunos casos, la porción de cadena doble puede tener entre 17 y 21 nucleótidos de longitud, por ejemplo, 19 nucleótidos de longitud. En algunos casos, los salientes están presentes en el extremo 3' de cada cadena, pueden tener una longitud de alrededor de o aproximadamente 2 a 4 nucleótidos, y pueden estar compuestos de ADN o análogos de nucleótidos. Un ARNip puede formarse a partir de dos cadenas de ARN que hibridan juntas, o alternativamente puede generarse a partir de un ARN de cadena doble más largo o de una única cadena de ARN que incluye una porción autohibridante, como un ARN de horquilla corta. Un experto en la técnica apreciará que pueden estar presentes uno o más malapareamientos o nucleótidos desapareados en el dúplex formado por las dos cadenas de ARNip. En algunos casos, una cadena de un ARNip (la cadena "antisentido" o "guía") incluye una porción que hibrida con un ácido nucleico objetivo, por ejemplo, una transcripción de ARNm. En algunos casos, la cadena antisentido es perfectamente complementaria al objetivo en aproximadamente 15-29 nucleótidos, algunas veces entre 17-21 nucleótidos, por ejemplo, 19 nucleótidos, lo que significa que el ARNip hibrida con la transcripción objetivo sin un solo malapareamiento en esta longitud. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará que pueden estar presentes uno o más malapareamientos o nucleótidos desapareados en un dúplex formado entre la cadena de ARNip y la transcripción objetivo.

En algunos casos, un ARN de horquilla corto (ARNhc) es una molécula de ácido nucleico que comprende por lo menos dos porciones complementarias hibridadas o capaces de hibridar para formar una estructura dúplex lo suficientemente larga para mediar ARNi (típicamente entre 15-29 nucleótidos de longitud), y por lo menos una porción de cadena sencilla, típicamente entre aproximadamente 1 y 10 nucleótidos de longitud que forma un giro que conecta los extremos de las dos secuencias que forman el dúplex. En algunos casos, la estructura puede comprender además un saliente. En algunos casos, el dúplex formado por hibridación de porciones autocomplementarias del ARNhc puede tener propiedades similares a las de los ARNip y, en algunos casos, los ARNhc pueden procesarse en ARNip por la maquinaria de ARNi celular conservada. Por tanto, los ARNhc pueden ser precursores de los ARNip y pueden ser de manera similar capaces de inhibir la expresión de una transcripción objetivo. En algunos casos, un ARNhc incluye una porción que se hibrida con un ácido nucleico objetivo, por ejemplo, una transcripción de ARNm, y puede ser perfectamente complementaria al objetivo en aproximadamente 15-29 nucleótidos, a veces entre 17-21 nucleótidos, por ejemplo, 19 nucleótidos. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará que pueden estar presentes uno o más malapareamientos o nucleótidos desapareados en un dúplex formado entre la cadena de ARNhc y la transcripción objetivo.

En algunos casos, el ARNhc comprende una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, ADN) de estructura A-B-C o C-B-A. En algunos casos, el casete comprende por lo menos dos segmentos de ADN A y C o C y A, en donde cada uno de dichos por lo menos dos segmentos está bajo el control de un promotor separado como se ha definido anteriormente (como el promotor Pol III que incluye U6 inducible, H1 o similar). En los segmentos anteriores: A puede ser una secuencia de ADN de 15 a 35 pb o de 19 a 29 pb que es por lo menos un 90% o un 100% complementaria a la del gen que se va a anular (por ejemplo, un gen HLA-A, B o C); B puede ser una secuencia de ADN espaciador que tiene de 5 a 9 pb que forma el giro de la molécula de ARN de horquilla expresada, y C puede ser una secuencia de ADN de 15 a 35 o de 19 a 29 pb que es por lo menos un 85% complementaria a la secuencia A.

Los métodos que usan tecnología de ARN interferente, como ARNip o ARNhc, para reprimir la expresión celular de una molécula de MHC, como una molécula de HLA-A, -B o -C, están dentro del nivel de un experto en la técnica. En algunos casos, puede emplearse una secuencia específica de alelo para reprimir específicamente, regular por disminución y/o alterar la expresión de un alelo de HLA particular. En algunos casos, puede emplearse una secuencia consenso de HLA-A, -B, -C para reprimir, regular por disminución y/o alterar la expresión de cada uno de los loci de HLA-A, -B y -C. Por ejemplo, se han descrito métodos que usan tecnología de ARN interferente, incluyendo secuencias de consenso o específicas de alelos, para dirigirse a tales moléculas (ver, por ejemplo, Gonzalez et al. (2004) Molecular Therapy, 11:811-818; Haga et al. (2006)) Transplant Proc., 38:3184-3188; Figueiredo et al. (2006) J. Mol. Med., 84:425-37; Figueiredo et al. (2007) Transfusion, 47: 8-27; Hacke et al. (2009) Immunol. Res. 44: 112-126; Lemp et al. (2013) Clin. Transpl., 93-101). Los ejemplos no limitativos de secuencias de ARNip que son específicas de alelos (por ejemplo, HLA-A) se exponen en las SEQ ID NO: 28-31 y que son panespecíficas (es decir, consenso, como contra regiones conservadas en HLA-A,-B, -C) se exponen en las SEQ ID NO: 32-35. Los ejemplos no limitativos de secuencias de ARNhc que son específicas de alelos (por ejemplo, HLA-A) o son secuencias de consenso de HLA-A, -B, -C se exponen en la SEQ ID NO: 36 o 37, respectivamente. Los reactivos disponibles comercialmente, como los reactivos de ARNip o ARNhc, también están fácilmente disponibles, ver, por ejemplo, de Santa Cruz Biotechnology (HLA-A, número de catálogo sc-42908 y reactivos relacionados; HLA-B, número de catálogo sc-42922 y reactivos relacionados; y HLA-C, número de catálogo sc-105525 y reactivos relacionados).

En algunos casos, la represión génica se lleva a cabo efectuando una alteración en el gen, como una mutación de desactivación, inserción, sentido erróneo o cambio de marco, como una mutación bialélica de cambio de marco, deleción de todo o parte del gen, por ejemplo, uno o más exones o porción del mismo, y/o activación. En algunos aspectos, la alteración de otro MHC de clase I (por ejemplo, HLA-A, B o C) se lleva a cabo mediante edición génica, como usando una proteína de unión al ADN o un ácido nucleico de unión a ADN, que se une específicamente o hibrida con el gen en una región objetivo de alteración. En algunos aspectos, la alteración da como resultado una deleción, mutación o inserción dentro de un exón del gen, como dentro del primer o segundo exón.

En algunos aspectos, la proteína o el ácido nucleico se acopla o forma un complejo con una nucleasa de edición génica, como en una proteína quimérica o de fusión. En algunos casos, tales alteraciones son efectuadas por una molécula de ácido nucleico inhibidora, que puede codificar nucleasas específicas o dirigidas a secuencia, incluyendo nucleasas dirigidas que se unen al ADN y nucleasas de edición génica como nucleasas con dedos de zinc (ZFN) y nucleasas efectoras similares al activador de la transcripción (TALEN) y nucleasas guiadas por ARN, como una nucleasa asociada a CRISPR (Cas), diseñadas específicamente para dirigirse a la secuencia de un gen o una porción del mismo.

Los dominios de unión del sistema de dedo de zinc, TALE y CRISPR pueden "modificarse" para unirse a una secuencia de nucleótidos predeterminada, por ejemplo, mediante modificación (por ejemplo, alterando uno o más aminoácidos) de la región de la hélice de reconocimiento de una proteína de dedo de zinc o TALE de origen natural. Las proteínas de unión al ADN modificadas (dedos de zinc o TALE) son proteínas que no son de origen natural. Los criterios racionales para el diseño incluyen la aplicación de reglas de sustitución y algoritmos computarizados para procesar información en una base de datos que almacena información de diseños existentes de ZFP y/o TALE y datos vinculantes. Ver, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 6.140.081; 6.453.242; y 6.534.261; ver también WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496 y la Publicación de Estados Unidos N° 20110301073.

En algunos casos, la represión se lleva a cabo usando una molécula de direccionamiento de ADN que incluye una proteína de unión al ADN, como una o más proteínas con dedos de zinc (ZFP) o proteínas similares a un activador de la transcripción (TAL), fusionadas con una proteína efectora, como una endonucleasa. Los ejemplos incluyen ZFN, TALE y TALEN. Ver Lloyd et al., Frontiers in Immunology, 4(221), 1-7 (2013).

Una ZFP o dominio de la misma es una proteína o dominio dentro de una proteína más grande que se une al ADN de una manera específica de secuencia a través de uno o más dedos de zinc, regiones de la secuencia de aminoácidos dentro del dominio de unión cuya estructura se estabiliza mediante la coordinación de un ion de zinc. El término proteína de unión al ADN con dedos de zinc a menudo se abrevia como proteína con dedos de zinc o ZFP. Entre las ZFP se encuentran los dominios de ZFP artificiales que se dirigen a secuencias de ADN específicas, típicamente de 9-18 nucleótidos de longitud, generadas por ensamblaje de dedos individuales. Las ZFP incluyen aquellas en las que un solo dominio de dedos tiene aproximadamente 30 aminoácidos de longitud y contiene una hélice alfa que contiene dos residuos de histidina invariantes coordinados a través del zinc con dos cisteínas de un solo giro beta y que tienen dos, tres, cuatro, cinco o seis dedos. En general, La especificidad de secuencia de una ZFP puede alterarse haciendo sustituciones de aminoácidos en las cuatro posiciones de la hélice (-1, 2, 3 y 6) en una hélice de reconocimiento de dedos de zinc. Por tanto, en algunos casos, la ZFP o la molécula que contiene ZFP no es de origen natural, por ejemplo, está modificada para unirse a un sitio objetivo de elección.

En algunos casos, la molécula de direccionamiento de ADN es o comprende un dominio de unión a ADN con dedos de zinc fusionado a un dominio de escisión de ADN para formar una nucleasa con dedos de zinc (ZFN). En algunos casos, las proteínas de fusión comprenden el dominio de escisión (o semidominio de escisión) de por lo menos una enzima de restricción de Tipo IIS y uno o más dominios de unión con dedos de zinc, que pueden estar o no modificados. En algunos casos, el dominio de escisión es de la endonucleasa de restricción de tipo IIS Fok I. Fok I generalmente cataliza la escisión de cadena doble del ADN, en 9 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en una cadena y 13 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en la otra. Ver, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N25.356.802; 5.436.150 y 5.487.994; así como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269: 31,978-31,982].

Muchos dedos de zinc modificados para genes específicos están disponibles comercialmente. Por ejemplo, Sangamo Biosciences (Richmond, California, USA) Ha desarrollado una plataforma (CompoZr) para la construcción de dedos de zinc en asociación con Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA), lo que permite a los investigadores evitar la construcción de dedos de zinc y la validación en conjunto, y proporciona dedos de zinc específicamente dirigidos a miles de proteínas. Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405. En algunos casos, se usan dedos de zinc disponibles comercialmente o se diseñan a medida. (Ver, por ejemplo, los números de catálogo de Sigma-Aldrich C^sT^zFND, CSTZFN, CTI1-1KT y PZD0020). En la técnica se conocen métodos para reprimir o alterar la expresión celular de una molécula de MHC de clase I usando ZFN (ver, por ejemplo, Torikai et al. (2013) Blood, 122: 1341-1349, que describe métodos para alterar el locus de HLA-A, como en los alelos de HLA HLA-A*03:01 o HLA-A*02:01).

En algunos casos, la represión se lleva a cabo usando repeticiones palindrómicas cortas agrupadas interespaciadas regularmente (CRISPR) y proteínas asociadas a CRISPR (Cas). Ver Sander and Joung, Nature Biotechnology, 32(4): 347-355. En general, el "sistema CRISPR" se refiere colectivamente a las transcripciones y otros elementos implicados en la expresión o direccionamiento de la actividad de genes asociados con CRISPR ("Cas"), incluyendo las secuencias que codifican un gen Cas, una secuencia tracr (CRISPR trans-activante) (por ejemplo, tracrARN o un tracrARN parcial activo), una secuencia de tracr-mate (que abarca una "repetición directa" y una repetición directa parcial procesada con tracrARN en el contexto de un sistema CRISPR endógeno), una secuencia guía (también denominada un "espaciador” en el contexto de un sistema CRISPR endógeno) y/u otras secuencias y transcripciones de un locus CRISPR.

En algunos casos, el sistema de nucleasa CRISPR/Cas o nucleasa CRISPR/Cas incluye una molécula de ARN no codificante ARN (guía) (ARNg), cuya secuencia se une específicamente al ADN, y una proteína Cas (por ejemplo, Cas9), con funcionalidad de nucleasa (por ejemplo, dos dominios nucleasa). En general, una secuencia guía es cualquier secuencia de polinucleótidos que tiene suficiente complementariedad con una secuencia de polinucleótidos objetivo, como un gen que codifica una molécula MHC de clase I (por ejemplo, HLA-A, -B o -C) para hibridar con la secuencia objetivo y la unión específica a secuencia directa del complejo CRISPR a la secuencia objetivo. Típicamente, en el contexto de la formación de un complejo CRISPR, "secuencia objetivo" se refiere generalmente a una secuencia para la cual se ha diseñado una secuencia guía para que tenga complementariedad, donde la hibridación entre la secuencia objetivo y una secuencia guía promueve la formación de un complejo CRISPR. No se requiere necesariamente una complementariedad completa, siempre que haya suficiente complementariedad para provocar la hibridación y promover la formación de un complejo CRISPR. En algunos casos, el grado de complementariedad entre una secuencia guía y su secuencia objetivo correspondiente, cuando se alinea óptimamente usando un algoritmo de alineación adecuado, es de aproximadamente o más de aproximadamente el 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% o más. En algunos casos, se selecciona una secuencia guía para reducir el grado de estructura secundaria dentro de la secuencia guía. La estructura secundaria puede determinarse mediante cualquier algoritmo de plegamiento de polinucleótidos adecuado.

En algunos casos, se administra a la célula una enzima CRISPR (por ejemplo, nucleasa Cas9) en combinación con (y opcionalmente formando complejo con) una secuencia guía. En algunos casos, uno o más elementos de un sistema CRISPR se derivan de un sistema CRISPR de tipo I, tipo II o tipo III. En algunos casos, uno o más elementos de un sistema CRISPR se derivan de un organismo particular que comprende un sistema CRISPR endógeno, como Streptococcus pyogenes.

En la técnica se conocen métodos que usan sistemas CRISPR para la desactivación de un MHC de clase I particular, como un HLA-A, -B- o -C, (ver, por ejemplo, Sanjana et al. (2014) Nat. Methods, 11:783- 4). En un método ejemplar, la nucleasa Cas9 (por ejemplo, la codificada por ARNm de Staphylococcus aureus o de Streptococcus pyogenes, por ejemplo, pCW-Cas9, Addgene N° 50661, Wang et al. (2014) Science, 3:343-80-4; o vectores lentivirales de nucleasa o nickasa disponibles de Applied Biological Materials (ABM; Canadá) como N° de Cat. K002, K003, K005 o K006) y un ARN guía específico para el gen del antígeno objetivo se introducen en las células, por ejemplo, usando vectores de administración lentivirales o cualquiera de una serie de métodos de administración o vehículos conocidos para la transferencia a las células, como cualquiera de una serie de métodos o vehículos conocidos para administrar moléculas Cas9 y ARN guía. También pueden generarse células de control de vectores vacías o no específicas. El grado de desactivación de un gen (por ejemplo, de 24 a 72 horas después de la transferencia) puede evaluarse usando cualquiera de una serie de ensayos bien conocidos para evaluar la alteración del gen en las células. Por ejemplo, las secuencias de ARN guía ejemplares pueden incluir cualquiera de las expuestas en las SEQ ID NO: 10-27. También se encuentran fácilmente disponibles kits, vectores de ARNg y vectores de donantes disponibles comercialmente, para la desactivación de un MHC de clase I particular, como un HLA-A, -B o -C, mediante CRISPR. Por ejemplo, los reactivos para la desactivación de un gen HLA-A están disponibles, por ejemplo, de GeneCopoeia (ver, por ejemplo, los números de catálogo HTN262410 o HTN208849, Origene Technologies (N° de catálogo KN200661). En otro ejemplo, los reactivos para la desactivación de un gen HLA-B están disponibles, por ejemplo, de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (ver, por ejemplo, el número de catálogo sc-400627). En un ejemplo adicional, los reactivos para la desactivación de un gen de HLA-C están disponibles, por ejemplo, de Santa Cruz Biotechnology, Inc (ver, por ejemplo, el número de catálogo sc-401517).

En algunos casos, un agente capaz de inducir una alteración genética, como un silenciamiento o desactivación de genes que codifican un MHC de clase I clásico, como un HLA-A, -B- o -C, se introduce como un complejo, como como un complejo de ribonucleoproteína (RNP). Los complejos de RNP incluyen una secuencia de ribonucleótidos, como una molécula de ARN o ARNg, y un polipéptido, como una proteína Cas9 o una variante de la misma. En algunos casos, la proteína Cas9 se administra como un complejo de RNP que comprende una proteína Cas9 y una molécula de ARNg, por ejemplo, un ARNg dirigido a un gen que codifica un MHC de clase I clásico, como un HLA-A, -B- o-C. En algunos casos, el RNP que incluye una o más moléculas de ARNg dirigidas a un gen que codifica una clase de MHC clásica (por ejemplo, un gen que codifica HLA-A, -B- o -C) y una enzima Cas9 o una variante de la misma, se introduce directamente en la célula mediante administración física (por ejemplo, electroporación, pistola de partículas, transfección de fosfatasa cálcica, compresión celular o exprimido), liposomas o nanopartículas.

En algunos casos, e puede evaluarse l grado de desactivación de un gen (por ejemplo, un gen que codifica una molécula clásica de MHC de clase I, por ejemplo, HLA-A, -B- o -C) en varios puntos temporales, por ejemplo, de 24 a 72 horas después de la introducción de agente, usando cualquiera de una serie de ensayos bien conocidos para evaluar la alteración génica en las células. El grado de silenciamiento de un gen en varios puntos temporales, por ejemplo, de 24 a 72 horas después de la introducción del agente, puede evaluarse usando cualquiera de una serie de ensayos bien conocidos para evaluar la expresión génica en las células, como ensayos para determinar el nivel de transcripción o expresión de proteínas o expresión de la superficie celular.

B. Fuentes de péptidos, que muestran epítopos peptídicos y/o generación de complejos MHC-péptido en las células

En algunos casos, los péptidos derivados de un antígeno objetivo o un fragmento inmunogénico y/o antigénico de un antígeno objetivo, se ponen en contacto, se exponen, se incuban o se proporcionan a una molécula de MHC-E, como una molécula de MHC-E expresada en la superficie de las células. En algunos casos, la porción o fragmento inmunogénico y/o antigénico de un antígeno objetivo puede ser cualquier secuencia inmunogénica adecuada que sea conocida o que pueda determinarse usando métodos rutinarios conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, capítulo 11.15. Típicamente, el antígeno objetivo o fragmento inmunogénico o antigénico del mismo tiene por lo menos 6 aminoácidos de longitud, como por lo menos aproximadamente 8, por lo menos aproximadamente 10, por lo menos aproximadamente 20, por lo menos aproximadamente 50 residuos, por lo menos aproximadamente 100 residuos o la secuencia de longitud completa del antígeno.

En algunos casos, los péptidos se derivan o se obtienen a partir de o representan una pluralidad de péptidos del antígeno objetivo, en los que dicha pluralidad de péptidos incluye o es un panel superpuesto de epítopos peptídicos potenciales. En algunos casos, una pluralidad de tales péptidos superpuestos puede ponerse en contacto, exponerse o incubarse con una molécula de MHC-E y evaluarse para la unión o reactividad inmune.

En algunos casos, los péptidos se derivan de un antígeno objetivo exógeno o heterólogo presente en las células que expresan MHC-E, por lo que, tras el procesamiento del antígeno y la presentación de los péptidos en la superficie celular, la molécula de MHC-E se pone en contacto con uno o más péptidos derivados del antígeno objetivo. Por tanto, en algunos casos, los péptidos que son procesados de manera natural por la célula se ponen en contacto o se exponen a la molécula de MHC-E expresada por la célula para su presentación en la superficie celular como un complejo de MHC-E-péptido.

En algunos casos, el antígeno objetivo es un antígeno predeterminado o conocido que se sabe que contiene o se sospecha que contiene un epítopo de células T o un epítopo peptídico y que puede, en algunos casos, desencadenar una respuesta inmune y/o incluir una región inmunogénica que contiene el epítopo peptídico para el reconocimiento por parte del sistema inmunitario. En algunos casos, el péptido puede ser uno que se deriva o se basa en un fragmento del antígeno objetivo, que generalmente es una molécula biológica más larga, como un polipéptido o una proteína.

En algunos casos, el péptido es generalmente una porción de un polipéptido (por ejemplo, antígeno heterólogo) menor que la longitud completa pero que es mayor o igual a 2 aminoácidos de longitud, como uno que es mayor o igual a 2 aminoácidos. y menor o igual a 50 o 40 aminoácidos de longitud. En algunos casos, el péptido tiene entre 7 y 40 aminoácidos, 8 y 20 aminoácidos, 10 y 17 aminoácidos, 7 y 13 aminoácidos u 8 y 10 aminoácidos. En algunos casos, el péptido tiene una longitud de entre 7 y 20 aminoácidos. En algunos casos, el péptido tiene una longitud de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos. En algunos casos, el péptido típicamente tiene una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 24 aminoácidos. En algunos casos, el péptido tiene una longitud de aproximadamente 8 a 13 aminoácidos, como para el reconocimiento en el complejo de MHC clase Ib (MHC-E). En algunos casos, el péptido puede asociarse con una molécula de MHC, lo que, en algunos casos, da como resultado el reconocimiento por células T específicas a través de su receptor de células T después de la presentación en el contexto de una molécula de MHC. En algunos casos, el péptido es capaz de inducir una respuesta inmune en un animal por sus características de unión a moléculas de MHC. En algunos casos, tras el reconocimiento del epítopo peptídico (por ejemplo, complejo MHC-péptido) por una molécula de unión a péptidos (por ejemplo, TCR o anticuerpo similar a TCR), el TCR (u otra molécula de unión de péptidos) puede producir o desencadenar una señal de activación para la T célula que induce una respuesta de células T, como la proliferación de células T, la producción de citoquinas, una respuesta de células T citotóxicas u otra respuesta.

En algunos casos, la molécula de MHC-E, como una molécula de MHC-E expresada en una célula, se pone en contacto, se expone y/o se incuba con uno o una pluralidad de péptidos durante un período de tiempo suficiente para formar un complejo o complejos MHC-E-péptido en la superficie celular si la molécula de unión al péptido de MHC-E tiene actividad de unión para uno de los péptidos. En algunas de tales casos, los péptidos son péptidos superpuestos o péptidos procesados a partir de un antígeno transferido. Está dentro de la capacidad de un experto en la técnica determinar empíricamente el tiempo necesario para formar el complejo MHC-péptido. En algunos casos, las células se incuban durante de aproximadamente 15 minutos a 24 horas después de poner en contacto la molécula de MHC-E con el uno o la pluralidad de péptidos.

En algunos casos, las células que han sido puestas en contacto, expuestas y/o incubadas con uno o una pluralidad de péptidos, pueden evaluarse para la formación de un complejo MHC-E-péptido formado por reconocimiento de un péptido por la molécula de MHC-E. En algunos de tales casos, los péptidos son péptidos superpuestos o péptidos procesados a partir de un antígeno transferido. En algunos casos, el complejo MHC-E-péptido formado puede identificarse y detectarse, por ejemplo, usando los métodos que se describen a continuación. En algunos casos, una o más moléculas de unión, por ejemplo, un TCR o un anticuerpo similar a TCR o un fragmento de unión a antígeno del mismo, pueden evaluarse directamente para la unión a un complejo de MHC-E-péptido formado en la célula. En algunos casos, la detección y/o identificación de un complejo MHC-E-péptido y/o la identificación de una molécula de unión que se une al complejo MHC-E-péptido puede incluir la evaluación de la actividad de linfocitos T citotóxicos (CTL).

En las siguientes subsecciones se describen aspectos ejemplares de tales métodos.

1. Antígenos objetivo ejemplares

En algunos casos, el antígeno objetivo del que se derivan los péptidos puede ser un antígeno polipeptídico o un fragmento del mismo, incluyendo un antígeno de un gen celular. En algunos casos, el antígeno es un antígeno asociado a un tumor, un antígeno expresado en un tipo celular particular asociado con una enfermedad autoinmune o inflamatoria o un antígeno derivado de un patógeno viral o un patógeno bacteriano. En algunos casos, el antígeno objetivo es un antígeno asociado con una enfermedad. En algunos casos, la enfermedad puede estar provocada por una enfermedad maligna o transformación de células, como un cáncer. En algunos casos, el antígeno puede ser un antígeno proteico de un tumor o una célula cancerosa, como un antígeno asociado a un tumor. En algunos casos, la enfermedad puede estar provocada por una infección, como una infección bacteriana o viral. En algunos casos, el antígeno es un antígeno de cáncer asociado a virus. En algunos casos, la enfermedad puede ser una enfermedad autoinmune. Otros objetivos incluyen los enumerados en The HLA Factsbook (Marsh et al. (2000)) y otros conocidos en la técnica.

En algunos casos, el antígeno objetivo es uno que está asociado con un tumor o cáncer. En algunos casos, un antígeno tumoral o canceroso es uno que puede encontrarse en una célula maligna, que se encuentra dentro de una célula maligna o es un mediador del crecimiento de las células tumorales. En algunos casos, un antígeno tumoral o canceroso es uno que se expresa predominantemente o se sobreexpresa por una célula tumoral o cancerosa. En algunos casos, los antígenos tumorales incluyen, pero no se limitan a, péptidos mutados, antígenos de diferenciación y antígenos sobreexpresados, todos los cuales podrían servir como objetivos para terapias.

En algunos casos, el antígeno tumoral o canceroso es un antígeno de linfoma (por ejemplo, linfoma no Hodgkin o linfoma de Hodgkin), un antígeno de cáncer de linfoma de células B, un antígeno de leucemia, un antígeno de mieloma (es decir, mieloma múltiple o mieloma de células plasmáticas), un antígeno de leucemia linfoblástica aguda, un antígeno de leucemia mieloide crónica o un antígeno de leucemia mielógena aguda. En algunos casos, el antígeno del cáncer es un antígeno que se sobreexpresa o está asociado con un cáncer que es un adenocarcinoma, como páncreas, colon, mama, ovario, pulmón, próstata, cabeza y cuello, incluyendo mielomas múltiples y algunos linfomas de células B. En algunos casos, el antígeno está asociado con un cáncer, como cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de hígado (por ejemplo, adenocarcinoma hepatocelular), cáncer de intestino o cáncer de vejiga.

En algunos casos, el antígeno objetivo o fragmento del mismo es un antígeno tumoral que puede ser un antígeno asociado a glioma, antígeno de maduración de células B (BCMA, BCM), receptor del factor de activación de células B (BAFFR, BR3) y/o activador transmembrana e interactor CAML (TACI), receptor de Fc tipo 5 (FCRL5, FcRH5), gonadotropina coriónica humana p, alfafetoproteína (AFP), AFP reactiva a lectina, tiroglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, transcriptasa inversa de telomerasa humana, RU1, RU2 (AS), carboxil esterasa intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, Melanina-A/MART-1, WT-1, S-100, MBP, CD63, MUC1 (por ejemplo, MUC1-8), p53, Ras, ciclina B1, HER-2/neu, antígeno carcinoembrionario (CEA), gp100, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, Ma GE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A11, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-C1, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15, tirosinasa (por ejemplo proteína relacionada con tirosinasa 1 (TRP-1) o proteína relacionada con tirosinasa 2 (T^rP-2)), p-catenina, NY-ESO-1, LAGE-1a, PP1, MDM2, MDM4, EGVFvlII, Tax, SSX2, telomerasa, TARP, pp65, CDK4, vimentina, S100, eIF-4A1, p78 inducible por IFN, y melanotransferrina (p97), Uroplakin II, antígeno específico de la próstata (PSA), calicreína humana (huK2), antígeno de membrana específico de la próstata (PSM)), y fosfatasa de ácido prostático (PAP), elastasa de neutrófilos, efrina B2, BA-46, Bcr-abl, E2A-PRL, H4-RET, Ig H-iGk , MYL-RAR, caspasa 8 o un antígeno B-Raf. Otros antígenos tumorales pueden incluir cualquiera derivado de FRa, CD24, CD44, CD133, CD 166, epCAM, CA-125, HE4, Oval, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, uPA, PAI-1, c D19, CD20, CD22, Ro R1, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, glicolípido F77, GD-2, factor de crecimiento de insulina (IGF)-I, IGF-II, receptor de IGF-I y mesotelina,

En algunos casos, el antígeno objetivo es un antígeno viral. Se han identificado y se conocen muchos objetivos de antígenos virales, incluyendo péptidos derivados de genomas virales en VIH, HTLV y otros virus (ver, por ejemplo, Addo et al. (2007) PLoS ONE, 2, e321; Tsomides et al. (1994) J Exp Med, 180, 1283-93; Utz et al. (1996) J Virol, 70, 843-51). Los antígenos virales ejemplares incluyen, pero no se limitan a, un antígeno de hepatitis A, hepatitis B (por ejemplo, antígenos del núcleo y de superficie del VHB (VHBc, VHB)), hepatitis C (VHC), virus de Epstein-Barr (por ejemplo, EBVA), virus del papiloma humano (VPH; por ejemplo, E6 y E7), virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH1), virus del herpes del sarcoma de Kaposi (KSHV), virus del papiloma humano (VPH), virus de la gripe, virus de Lassa, HTLN-1 HIN-1, CMN, EBN o h Pn . En algunos casos, la proteína objetivo es un antígeno bacteriano u otro antígeno patógeno, como antígenos de Mycobacterium tuberculosis (MT), tripanosoma, por ejemplo, Tiypansoma cruzi (T. cruzi), antígenos como el antígeno de superficie (TSA) o antígenos de la malaria. Se conocen antígenos o epítopos virales específicos u otros antígenos patógenos o epítopos peptídicos (ver, por ejemplo, Addo et al. (2007) PLoS ONE, 2, e321; Anikeeva et al. (2009) Clin Immunol, 130, 98 109).

En algunos casos, el antígeno es un antígeno derivado de un virus asociado con el cáncer, como un virus oncogénico. Por ejemplo, un virus oncogénico es aquel en el que se sabe que la infección de ciertos virus lleva al desarrollo de diferentes tipos de cánceres, por ejemplo, hepatitis A, hepatitis B (VHB), hepatitis C (VHC), virus del papiloma humano (VPH), infecciones virales de la hepatitis, virus de Epstein-Barr (EBV), virus del herpes humano 8 (HHV-8), virus 1 de la leucemia de células T humanas (HTLV-1), virus 2 de la leucemia de células T humanas (HTLV-2)) o un antígeno de citomegalovirus (CMV).

En algunos casos, el antígeno viral es un antígeno del VPH que, en algunos casos, puede llevar a un mayor riesgo de desarrollar cánceres de cuello uterino y/o de cabeza y cuello. En algunos casos, el antígeno puede ser un antígeno de HPV-16 y un antígeno de HPV-18 y un antígeno de HPV-31, un antígeno de HPV-33 o un antígeno de HPV-35. En algunos casos, el antígeno viral es un antígeno de HPV-16 (por ejemplo, regiones serorreactivas de las proteínas E1, E2, E6 o E7 de HPV-16, ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.531.127) o un antígeno de HPV-18 (por ejemplo, regiones serorreactivas de las proteínas L1 y/o L2 de HPV-18, como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5.840.306).

En algunos casos, el antígeno viral es un antígeno del VHB o del VHC, que, en algunos casos, puede llevar a un mayor riesgo de desarrollar cáncer de hígado que los sujetos negativos para el VHB o al VHC. Por ejemplo, en algunos casos, el antígeno heterólogo es un antígeno del VHB, como un antígeno del núcleo de la hepatitis B o un antígeno de la envoltura de la hepatitis B (US2012/0308580).

En algunos casos, el antígeno viral es un antígeno de EBV que, en algunos casos, puede llevar a un mayor riesgo de desarrollar linfoma de Burkitt, carcinoma nasofaríngeo y enfermedad de Hodgkin que los sujetos negativos EBV. Por ejemplo, el EBV es un virus del herpes humano que, en algunos casos, se encuentra asociado con numerosos tumores humanos de diverso origen tisular. Aunque se encuentran principalmente como una infección asintomática, los tumores positivos para el EBV pueden caracterizarse por la expresión activa de productos génicos virales, como EBNA-1, LMP-1 y LMP-2A. En algunos casos, el antígeno heterólogo es un antígeno de EBV que puede incluir el antígeno nuclear de Epstein-Barr (EBNA)-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, proteína líder de EBNA (EBNA-LP), proteínas de membrana latente LMP-1, LMP-2A y LMP-2B, EBV-EA, EBV-MA o EBV-VCA.

En algunos casos, el antígeno viral es un antígeno de HTLV-1 o HTLV-2, que, en algunos casos, puede llevar a un mayor riesgo de desarrollar leucemia de células T que los sujetos negativos para HTLV-1 o HTLV-2. Por ejemplo, en algunos casos, el antígeno heterólogo es un antígeno de HTL^v, como TAX.

En algunos casos, el antígeno viral es un antígeno del HHV-8 que, en algunos casos, puede llevar a un mayor riesgo de desarrollar sarcoma de Kaposi que los sujetos negativos para HHV-8. En algunos casos, el antígeno heterólogo es un antígeno de CMV, como pp65 o pp64 (ver la Patente de Estados Unidos N° 8361473).

En algunos casos, el antígeno heterólogo es un autoantígeno, como un antígeno de un polipéptido asociado con una enfermedad o trastorno autoinmune. En algunos casos, la enfermedad o trastorno autoinmune puede ser esclerosis múltiple (EM), artritis reumatoide (AR), síndrome de Sjogren, esclerodermia, polimiositis, dermatomiositis, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide juvenil, espondilitis anquilosante, miastenia gravis (MG), penfigoide bulloso (anticuerpos contra la membrana basal en la unión dermoepidérmica), pénfigo (anticuerpos contra el complejo proteico mucopolisacárido o sustancia de cemento intracelular), glomerulonefritis (anticuerpos contra la membrana basal glomerular), síndrome de Goodpasture, anemia hemolítica autoinmune (anticuerpos contra eritrocitos), enfermedad de Hashimoto (anticuerpos contra la tiroides), anemia perniciosa (anticuerpos contra el factor intrínseco), púrpura trombocitopénica idiopática (anticuerpos contra las plaquetas), enfermedad de Grave o enfermedad de Addison (anticuerpos contra la tiroglobulina). En algunos casos, el autoantígeno, como un autoantígeno asociado con una de las enfermedades autoinmunes anteriores, puede ser colágeno, como colágeno tipo II, proteína de choque térmico por micobacterias, tiroglobulina, receptor de acetilcolina (AcHR), proteína básica de mielina (MBP) o proteína proteolípida (PLP). Se conocen epítopos o antígenos específicos autoinmunes asociados (ver, por ejemplo, Bulek et al. (2012) Nat Immunol, 13, 283-9; Harkiolaki et al. (2009) Immunity, 30, 348 57; Skowera et al. (2008) J Clin Invest, 11 18, 3390-402).

2. Péptidos superpuestos de un antígeno objetivo

En algunos casos, se divulga un método para identificar un epítopo peptídico que está unido o es reconocido por una molécula de MHC-E o que es capaz de inducir de otra manera una respuesta inmune (por ejemplo, respuesta de CTL) en el contexto de un MHC-E en el que un panel superpuesto de los epítopos peptídicos potenciales dentro de un antígeno objetivo se pone en contacto, se exponen o se incuban con una molécula de MHC-E. Por ejemplo, pueden emplearse métodos que emplean una pluralidad de péptidos como fuente de péptidos cuando se conoce la secuencia de un antígeno objetivo, incluyendo cualquiera de los antígenos tumorales o virales conocidos descritos. En algunos casos, los péptidos que contienen una secuencia contigua de aminoácidos presentes en un antígeno objetivo pueden sintetizarse y seleccionarse para la unión a células que expresan MHC-E y/o para determinar la capacidad de inducir una respuesta inmune (por ejemplo, respuesta de CTL) en el contexto de MHC-E. A continuación se describen ensayos ejemplares para evaluar respuestas restringidas por MHC. En algunos casos, los péptidos del antígeno objetivo tienen de 8 a 20 aminoácidos, como de 8 a 13 aminoácidos, generalmente de 8 a 10 aminoácidos de longitud.

En algunos casos, los péptidos típicamente se superponen (es decir, comparten una región de identidad de secuencia de aminoácidos) con uno o más de otros péptidos entre la pluralidad de péptidos del antígeno objetivo. En algunos casos, los péptidos se superponen en 2 a 15 aminoácidos, como 2 a 10 aminoácidos o 2 a 5 aminoácidos. Como ejemplo, un primer péptido pueden ser los residuos 1-9 de un antígeno objetivo y un péptido que se superpone al mismo pueden ser los residuos 7-15 del antígeno predeterminado. El experto en la técnica apreciará, sin embargo, que la longitud de los péptidos y la cantidad de superposición de residuos entre péptidos pueden variar, dependiendo de la longitud del antígeno objetivo, la región de interés, el grado de resolución y otros factores.

En algunos casos, los péptidos superpuestos de un antígeno objetivo pueden incluir una pluralidad de péptidos de 9mer superpuestos del antígeno, una pluralidad de péptidos de 10mer superpuestos del antígeno, una pluralidad de péptidos de 11mer superpuestos del antígeno, una pluralidad de péptidos de 12mer superpuestos del antígeno, una pluralidad de péptidos de 13mer superpuestos del antígeno, una pluralidad de péptidos de 14mer superpuestos del antígeno, o una pluralidad de péptidos de 15mer superpuestos del antígeno.

En algunos casos, los péptidos más largos, como de 10 a 20 aminoácidos de longitud, pueden ponerse en contacto, incubarse y/o exponerse a las células, en cuyo caso tales péptidos se fragmentarán en péptidos más pequeños por la acción del procesamiento extracelular (Kern et al. al. (2000) Eur. J. Immunol., 30:1676-1682). En algunos casos, la biblioteca de péptidos superpuestos contiene péptidos de más de 12 aminoácidos de longitud, como más de 13, 14, 15 o más aminoácidos de longitud. Por ejemplo, la biblioteca de péptidos superpuestos contiene una pluralidad de péptidos de 15mer superpuestos del antígeno. En un caso ejemplar, los péptidos de 15 aminoácidos superpuestos pueden incluir la superposición de por lo menos 9 aminoácidos con uno o más de otros péptidos.

En algunos casos, los péptidos candidatos potenciales se sintetizan y se ponen en contacto, se exponen y/o se incuban individualmente con una molécula de MHC-E y se analizan para determinar su unión a la molécula de MHC-E. En algunos casos, la molécula de MHC-E es un MHC-E soluble, y la unión puede evaluarse monitorizando los cambios en el plegamiento o la estabilidad (Miller et al. (2003) 171:1369-1375; Strong et al. (1998) J Biol. Chem, 278:5082-5090). Por ejemplo, en un caso ejemplar, el HLA-E soluble puede incubarse con un péptido o péptidos candidatos y el HLA-E plegado puede detectarse usando un ELISA sándwich con un anticuerpo monoclonal específico de HLA-E. En algunos casos, la molécula de MHC-E se expresa en la superficie de una célula, por ejemplo, una célula que se sabe que expresa o modificada para expresar MHC-E como se ha descrito anteriormente, y las células que expresan MHC-E se ponen en contacto, se exponen y/o se incuban con un péptido o péptidos candidatos. En algunos casos, uno o más péptidos candidatos son capaces de unirse a la molécula de MHC-E, por ejemplo, los péptidos pueden cargarse directamente sobre la superficie celular. Por tanto, en algunos casos, los péptidos pueden presentarse en moléculas de MHC sin procesamiento. En algunos casos, los péptidos candidatos requieren un procesamiento adicional. Por ejemplo, en algunos casos, algunos epítopos se unen al MHC de una manera que depende de la carga del MHC en los endosomas y, por lo tanto, requieren procesamiento (Viner et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:2214-2218).

En algunos casos, pueden prepararse grupos o mezclas de péptidos, como péptidos superpuestos, donde cada grupo contiene por lo menos dos péptidos que tienen una secuencia contigua de aminoácidos del antígeno objetivo. Combinando miembros en grupos, el método puede permitir la selección de un gran número de péptidos usando un número menor de muestras. En algunos casos, cuando el antígeno objetivo es un polipéptido más largo, la eficacia de la selección puede aumentarse seleccionando una pluralidad de péptidos como un grupo de péptidos, aunque dicho método también puede realizarse cuando la secuencia del antígeno objetivo es más corta. En algunos casos, cada grupo de péptidos puede contener de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 péptidos diferentes, como de aproximadamente 2 a 15 péptidos diferentes, aproximadamente 2 a 10 péptidos diferentes o aproximadamente 2 a 5 péptidos diferentes. En algunos casos, los péptidos contienen una secuencia contigua del antígeno objetivo y comparten una región de identidad de secuencia de aminoácidos con por lo menos otro péptido en la biblioteca. Típicamente, los criterios para clasificar los péptidos en grupos pueden variar, como apreciará un experto en la técnica. En algunos casos, se proporcionan grupos de por lo menos o aproximadamente 2, por lo menos o aproximadamente 3, por lo menos o aproximadamente 4, por lo menos o aproximadamente 6, por lo menos o aproximadamente 8, por lo menos o aproximadamente 10 o más péptidos superpuestos (por ejemplo, abarcando una región contigua del antígeno objetivo). En algunos casos, se identifican o detectan uno o más grupos de péptidos que se unen o reconocen células que expresan MHC-E y/o que provocan una respuesta inmune en el contexto de MHC-E.

En algunos casos, pueden realizarse una o más rondas (o ciclos) adicionales de selección, en las que los péptidos individuales del grupo o grupos de péptidos identificados o detectados se prueban adicionalmente para determinar la unión a un MHC-E y/o la reactividad inmune en el contexto de un MHC-E. Mediante el análisis de los péptidos individuales, el epítopo peptídico puede localizarse en un péptido o péptidos, o en una porción de uno o más péptidos.

En algunos casos, los grupos de péptidos superpuestos pueden seleccionarse o probarse en una estrategia de agrupación ortogonal. Por ejemplo, en algunos casos, se generan grupos de péptidos que contienen cada uno una pluralidad de péptidos superpuestos diferentes, donde por lo menos un péptido superpuesto está presente o es el mismo en por lo menos dos grupos de péptidos. Típicamente, cada péptido presente en un grupo particular también está presente en otro grupo, de tal manera que cada péptido está presente en dos grupos diferentes. En algunos casos, se conoce la identidad de los miembros de cada grupo de péptidos. En algunos casos, puede identificarse o detectarse un epítopo peptídico desconvolucionando los grupos, mediante lo cual una señal positiva para la unión y/o reactividad inmunitaria que se identifica o detecta en múltiples grupos puede asignarse al péptido particular que es común o único solo para esos grupos.

En algunos casos, la selección de péptidos puede realizarse en una matriz, como en una matriz espacial o direccionable. Como se usa en la presente, "una matriz espacial" se refiere a una colección o biblioteca de péptidos individuales o grupos de péptidos en los que los miembros están separados u ocupan un espacio distinto en la matriz, de tal manera que cada miembro de la biblioteca se localiza posicionalmente en una matriz para permitir identificación o detección de otros miembros de la biblioteca. En algunos casos, la matriz puede contener un soporte sólido que contiene una pluralidad de localizaciones conocidas diferentes en las que puede colocarse un componente o una muestra. En algunos casos, una matriz espacial puede incluir, por ejemplo, placas de microtitulación con pocillos direccionables. Por ejemplo, los miembros de la biblioteca pueden organizarse colocando cada uno en un pocillo de una placa de múltiples pocillos, por ejemplo, placas de 48 pocillos, 96 pocillos, 144 pocillos, 192 pocillos, 240 pocillos, 288 pocillos, 336 pocillos, 384 pocillos, 432 pocillos, 480 pocillos, 576 pocillos, 672 pocillos, 768 pocillos, 864 pocillos, 960 pocillos, 1056 pocillos, 1152 pocillos, 1248 pocillos, 1344 pocillos, 1440 pocillos o 1536 pocillos. En algunos casos, la evaluación de la unión a una molécula de MHC-E y/o la inmunorreactividad en el contexto de una molécula de MHC-E puede realizarse en la matriz.

En algunos casos, una molécula de MHC-E y/o una célula que expresa MHC-E se pone en contacto con una matriz de péptidos, donde cada péptido o grupo de péptidos se coloca en una dirección espacial de la matriz (por ejemplo, pocillo de una placa de múltiples pocillos). En algunos casos, se conoce la identidad de los miembros de la biblioteca de péptidos en cada posición de la matriz. En algunos casos, como cuando el ensayo se realiza en un formato direccionable, puede usarse la localización espacial de un péptido o grupo de péptidos que muestra una interacción positiva con una molécula de MHC-E, por ejemplo, unión a la molécula y/o capacidad de MHC-E para provocar una respuesta inmune en el contexto de la molécula de MHC-E, para identificar la fuente del epítopo peptídico detectado o identificado.

En algunos casos, los ensayos de selección que emplean péptidos superpuestos pueden indicar la localización del epítopo en el antígeno o el área o región del antígeno en la que se encuentra el epítopo. En algunos casos, el epítopo restringido por MHC-E del péptido mínimo puede evaluarse midiendo adicionalmente la respuesta a péptidos truncados de un epítopo peptídico identificado o detectado. Por ejemplo, si se identifica o detecta una respuesta a un péptido que tiene 15 residuos de aminoácidos de longitud en la biblioteca de péptidos superpuestos, pueden generarse péptidos truncados o conjuntos de péptidos truncados a los que les faltan uno o más aminoácidos en ambos extremos (por ejemplo 1-14, 1-13, 1-12 y 2-15, 3-15, 4-15). En algunos casos, el uno o más péptidos truncados o conjuntos de péptidos truncados pueden ponerse en contacto con una molécula de MHC-E (por ejemplo, como se expresa en células que expresan MHC) y puede identificarse que un epítopo peptídico mínimo está unido o es reconocido por una molécula de MHC-E o es capaz de otro modo de inducir una respuesta inmune (por ejemplo, respuesta de CTL) en el contexto de una molécula de MHC-E.

En algunos casos, antes o simultáneamente con el contacto, la incubación y/o la exposición de una célula con uno o más péptidos, las interacciones de MHC-E con péptidos endógenos se reducen, invierten y/o inhiben. En algunos casos, la célula puede despojarse de péptidos endógenos unidos a MHC en la superficie celular. En algunos casos, los péptidos endógenos pueden despojarse de la superficie de las células incubando las células a un pH bajo, por ejemplo, un pH de o de aproximadamente 2-3, durante un período corto de tiempo, como incubadas de o de aproximadamente 1 minuto a 1 hora, como de 5 minutos a 30 minutos. En algunos casos, el gen que codifica el transportador asociado con la presentación de antígeno (TAP) se altera y/o reprime en la célula, bloqueando de este modo el suministro de péptido intracelular para la molécula. Por ejemplo, en algunos casos, se introduce en la célula una molécula de ácido nucleico inhibidora, por ejemplo, ARNi, que muestrs complementariedad para el gen de TAP.

En algunos casos, el contacto, la exposición y/o la incubación se realiza a una temperatura de aproximadamente 15° C a 42° C, como de 20° C a 28° C (por ejemplo, 24° C ± 2° C) o de 32° C a 40° C (por ejemplo, 37 ± 2° C). En algunos casos, la puesta en contacto, la exposición y/o la incubación se realiza a o a aproximadamente 26° C.

En algunos casos, antes o simultáneamente con el contacto, la incubación y/o la exposición de una célula con uno o más péptidos, se estabiliza la expresión de la molécula de MHC-E en la superficie celular. En algunos casos, se añade beta-2-microglobulina exógena al medio que, en algunos casos, puede estabilizar la cadena pesada libre en la superficie de las células (ver, por ejemplo, Marin et al. (2003) Immunogenetics, 54:767- 775). Está dentro de la capacidad de un experto en la técnica determinar empíricamente la concentración de beta-2-microglobulina a añadir. En algunos aspectos, se añade aproximadamente de 1 gg/ml a 100 gg/ml, generalmente de 1 gg/ml a 20 gg/ml.

3. Péptidos procesados, presentados o mostrados de un antígeno objetivo en el contexto de una molécula de MHC

En algunos casos, se divulga un método para identificar un epítopo peptídico o epítopos peptídicos en el contexto de un MHC-E en el que el péptido o péptidos candidatos potenciales se ponen en contacto con la molécula de MHC-E tras el procesamiento de antígenos de péptidos derivados de un antígeno objetivo exógeno o heterólogo presente en células que expresan MHC-E. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica el antígeno objetivo o un fragmento del mismo se transfiere a la célula mediante la introducción de un ácido nucleico exógeno o heterólogo que codifica el antígeno objetivo o una porción inmunogénica o antigénica del mismo en la célula. En algunos casos, la célula que expresa MHC-E que contienen el antígeno objetivo exógeno o heterólogo o fragmento del mismo se cultiva o incuba en condiciones en las que el antígeno objetivo se expresa y los péptidos procesados de manera natural del mismo se presentan o muestran en la superficie celular en el contexto de la molécula de MHC-E.

Como se usa en la presente, "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquiera de ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) y análogos de los mismos, incluyendo ácidos nucleicos peptídicos (PNA) y mezclas de los mismos. Las moléculas de ácidos nucleicos incluyen las generadas, por ejemplo, por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o por traducción in vitro, y los fragmentos generados por cualquiera de ligación, escisión, acción de endonucleasa o acción de exonucleasa. En ciertos casos, los ácidos nucleicos pueden producirse mediante PCR. Los ácidos nucleicos pueden estar compuestos de monómeros que son nucleótidos de origen natural (como desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos), análogos de nucleótidos de origen natural (por ejemplo, formas a-enantioméricas de nucleótidos de origen natural) o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener modificaciones o reemplazo de fracciones de azúcar, o fracciones de base pirimidina o purina. Los monómeros de ácidos nucleicos pueden unirse mediante enlaces fosfodiéster o análogos de tales enlaces. Los análogos de los enlaces fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato y similares. Las moléculas de ácidos nucleicos pueden ser de cadena sencilla o de cadena doble.

El término "exógeno", por ejemplo, con referencia a un ácido nucleico o proteína, se refiere a moléculas que no están presentes en una célula y/o se introducen desde el exterior de una célula. Las moléculas exógenas pueden transferirse o introducirse en las células desde el exterior. Las moléculas exógenas pueden incluir material genético (como ADN o ARN), proteínas, péptidos o moléculas pequeñas (por ejemplo, colorantes). En algunos casos, una molécula exógena puede ser una molécula endógena a la célula, pero que, no obstante, se introduce desde fuera de la célula. En algunos casos, una molécula exógena puede ser heteróloga a la célula.

El término "heterólogo", por ejemplo, con referencia a un ácido nucleico o proteína, se refiere a una molécula que normalmente no está presente o no se produce en una célula, es decir, una molécula que normalmente no es endógena a una célula en la que se introduce. Típicamente, la molécula heteróloga se transfiere o se introduce en la célula desde el exterior. En algunos casos, una molécula heteróloga puede referirse a una molécula de otra célula, como de otro organismo, incluyendo de la misma especie o de otra especie. Las moléculas heterólogas pueden incluir material genético (como ADN o ARN), proteínas, péptidos o moléculas pequeñas.

En algunos casos, la molécula de ácido nucleico es un ácido nucleico sintético. Como se usa en la presente, "ácido nucleico sintético" se refiere a un ácido nucleico que no es de origen natural, sino que es artificial usando métodos como síntesis química o tecnología de ADN recombinante. En algunos casos, el ^aDⁿsintético es ADN complementario (ADNc). En algunos casos, el ácido nucleico sintético es de origen humano. En algunos casos, el ADN sintético, como el ADNc, contiene un marco de lectura abierto (ORF) que codifica el antígeno objetivo. El término ORF generalmente se refiere a la secuencia que codifica la proteína de un gen desde su codón de inicio hasta su codón de terminación y excluyendo las UTR 5' y 3'.

En algunos casos, se introducen en las células bibliotecas o colecciones de moléculas de ácidos nucleicos sintéticas, como bibliotecas de ADNc, que codifican una pluralidad de antígenos objetivo o porciones de los mismos, como fuente de péptidos antigénicos. En algunos casos, tales bibliotecas pueden construirse a partir de una muestra de tumor primario, una lesión metastásica o una línea de células tumorales. En algunos casos, se usarán múltiples muestras de tumores, múltiples lesiones metastásicas y/o múltiples líneas de células tumorales para generar la biblioteca. En algunos casos, la biblioteca se genera a partir de una pluralidad de sujetos que tienen el mismo tumor. Se conocen varias bibliotecas de ADNc de muestras primarias y líneas celulares y están disponibles de fuentes públicas o comerciales, o pueden generarse usando técnicas estándar.

En algunos casos, puede prepararse una biblioteca de ácidos nucleicos sintéticos, como una biblioteca de ADNc, purificando o aislando ARN mensajero, como usando kits o reactivos disponibles comercialmente. Normalmente, el ARN poli(A)+ se aísla de una preparación de ARN total, por ejemplo, usando cromatografía de oligo(dT)-celulosa. En algunos casos, las moléculas de ADNc de cadena doble pueden sintetizarse a partir de ARN poli (A)+ usando técnicas bien conocidas en la técnica, incluyendo el uso de kits disponibles comercialmente. En algunos casos, puede clonarse ADNc individual en un vector de expresión. En algunos casos, la amplificación de las bibliotecas se logra usando técnicas conocidas por un experto en la técnica, por ejemplo, mediante colocación en placas, crecimiento, elución, purificación y concentración.

En algunos casos, los ácidos nucleicos individuales pueden insertarse en cualquier vector de clonación apropiado, como un vector de expresión, para su transferencia o introducción en una célula. Pueden usarse un gran número de sistemas vector-huésped conocidos en la técnica. Los posibles vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos de mamíferos o vectores virales. Generalmente, el sistema de vector es compatible con la célula huésped usada. En algunos casos, el vector contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante de la proteína insertada, como para la expresión recombinante de uno o más de los antígenos objetivo o fragmentos de los mismos en las células. En algunos casos, el ADNc puede insertarse en el vector, por ejemplo, usando técnicas estándar de ADN recombinante. En algunos casos, los grupos de vectores o plásmidos pueden transformarse en bacterias para amplificar el ácido nucleico sintético, por ejemplo, ADNc. Pueden usarse grupos de clones bacterianos para aislar el ADN plasmídico, que luego puede usarse para la transfección o transducción de las células que pueden procesar y expresar la proteína derivada del ácido nucleico insertado, por ejemplo, ADNc. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica una molécula de MHC-E y el ácido nucleico que codifica el antígeno objetivo o una parte del mismo se cotransfectan juntos en una célula.

En algunos casos, las bibliotecas correspondientes pueden prepararse a partir de contrapartidas normales agrupadas, es decir, tejido normal primario o líneas celulares normales. En algunos casos, puede realizarse selección por sustracción comparando el perfil de los epítopos peptídicos identificados o detectados obtenidos de bibliotecas de control o específicas de tumores, y los epítopos peptídicos únicos para un tumor identificado.

En algunos casos, pueden proporcionarse bibliotecas de ácidos nucleicos, como bibliotecas de ADNc, como grupos ortogonales. En algunos casos, una estrategia de agrupación ortogonal incluye expresar un grupo o mezcla de moléculas de ácidos nucleicos en las mismas células que expresan MHC-E. En algunos aspectos, se conoce la identidad de los miembros de un grupo. En algunos casos, al combinar miembros en grupos, el método puede permitir la expresión y evaluación de un gran número de moléculas potencialmente antigénicas usando un número menor de muestras. Por ejemplo, en algunos casos, un grupo ortogonal de moléculas de ácidos nucleicos, como una biblioteca de ADNc preparada como grupo ortogonal, puede incluir un tamaño de grupo deseado de mezcla, típicamente de 5 a 30, y generalmente hasta 10 o hasta 20 miembros únicos. Típicamente, cada miembro presente en un grupo particular también está presente en otro grupo, de tal manera que cada molécula de ácido nucleico está presente en dos grupos diferentes. En general, la identidad de cualquier acierto se determina desconvolucionando los grupos, lo que puede producirse al incluir cada molécula en solo dos grupos diferentes, de tal manera que una señal positiva en ambos grupos indica que la molécula única particular de esos grupos es responsable de la lectura positiva.

En algunos casos, la biblioteca de moléculas de ácidos nucleicos es clonal y cada una contiene un único marco de lectura abierto (ORF) o secuencia codificante que está presente como un único aislado clonal. En algunos casos, se secuencia el ácido nucleico y se conoce la secuencia del aislado clonal. En algunos aspectos, la biblioteca de ácidos nucleicos, como la biblioteca de ADNc, se proporciona en un formato de matriz direccionable, como un formato espacialmente direccionable, donde cada dirección o posición (por ejemplo, dirección espacial) de la matriz contiene una molécula de ácido nucleico exógena o heteróloga única o distinta, o en algunos casos un grupo de tales moléculas de ácidos nucleicos, en comparación con una o más direcciones de la matriz. En algunos casos, una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia codificante u ORF o un grupo de tales moléculas de ácidos nucleicos es/son distintas de las moléculas de ácidos nucleicos o grupos de moléculas de ácidos nucleicos presentes en otras direcciones de la matriz. En algunos casos, una célula que expresa MHC-E se pone en contacto con una matriz de moléculas de ácidos nucleicos sintéticas (por ejemplo, biblioteca de ADNc) donde cada molécula de ácido nucleico o grupo de moléculas de ácidos nucleicos se coloca en una dirección espacial de la matriz (por ejemplo placa de múltiples pocillos). En algunos casos, se conoce la identidad de la secuencia de ácidos nucleicos sintética (por ejemplo, molécula de ADNc) en cada dirección, por lo que la identificación de una lectura positiva de la actividad de unión o reactividad inmune en una dirección particular puede correlacionarse con la molécula de ácido nucleico heteróloga o exógena particular (por ejemplo, miembro de ADNc) que es única para la dirección espacial particular.

En algunos aspectos, entre la pluralidad de tipos de células que pueden probarse pueden incluirse células que contienen un proteasoma estándar y/o un inmunoproteasoma. Por ejemplo, en algunos casos, el procesamiento de péptidos puede diferir en células que tienen un proteasoma convencional frente a un inmunoproteasoma o inflamasoma. En particular, tras la estimulación de las células, como con interferón-gamma (IFNy ), la maquinaria del proteasoma puede cambiar estructural y/o funcionalmente para producir un inmunoproteasoma, lo que puede dar como resultado un procesamiento de péptidos alterado. En algunos aspectos, las células que contienen un inmunoproteasoma son células que se estimulan o activan, como las estimuladas o activadas con IFNy . En algunos casos, las células que se han puesto en contacto, expuesto y/o incubado con uno o una pluralidad de péptidos, por ejemplo, péptidos superpuestos o péptidos procesados de antígeno transferido, pueden estimularse o activarse adicionalmente, como con una citoquina u otro agente estimulador, como con IFNy .

C. Identificación y evaluación de epítopos peptídicos

En algunos casos, los métodos divulgados en la presente incluyen detectar y/o identificar un epítopo peptídico presentado en la superficie de las células en el contexto de una molécula de MHC-E. En algunos casos, detectar y/o identificar un epítopo peptídico en el contexto de una molécula de MHC-E incluye extraer uno o más péptidos de un lisado de una célula que expresa MHC-E o eluir uno o más péptidos de la superficie de una célula que expresa una molécula de MHC-E. En algunos casos, detectar y/o identificar un epítopo peptídico en el contexto de una molécula de MHC-E implica aislar la molécula o moléculas de MHC-E, como de la célula, y eluir el uno o más péptidos de la misma. En algunos casos, el método puede incluir además determinar si el epítopo peptídico identificado en el contexto de la molécula de MHC-E provoca una respuesta inmune específica de antígeno. En algunos casos, evaluar una respuesta inmune específica de antígeno incluye determinar si un complejo MHC-péptido en la superficie de las células es capaz de inducir una respuesta de células T, como una respuesta de células T citotóxicas (por ejemplo, CD8+). En algunos casos, puede aislarse o purificarse un epítopo peptídico que está unido o es reconocido por una molécula de MHC-E y/o que es capaz de inducir una respuesta inmune en el contexto de una molécula de MHC-E. En algunos casos, se determina la secuencia del epítopo peptídico.

En algunos casos, el reconocimiento o la unión de un epítopo o epítopos peptídicos por una molécula de MHC-E puede determinarse mediante elución de péptidos de MHC seguido de secuenciación por espectrometría de masas. En algunos casos, pueden seleccionarse los mejores aglutinantes para una caracterización adicional con respecto a su reactividad con las células T. En algunos casos, la reactividad de los péptidos a las células T en el contexto de MHC-E puede evaluarse directamente. En algunos casos, los péptidos candidatos potenciales se sintetizan y se ponen en contacto o se exponen individualmente a una molécula de MHC-E, como una célula que expresa MHC-E, y se seleccionan usando un ensayo biológico como lectura para la activación inmune. En algunos casos, los ensayos para evaluar una respuesta inmune incluyen, pero no se limitan a, ELISPOT, ELISA, proliferación celular, ensayo de linfocitos citotóxicos (CTL) o tinción de citoquinas intracelulares. En algunos casos, la unión y/o la inmunorreactividad para un péptido dado dentro de la biblioteca o mezcla en cualquiera de los ensayos es una indicación de que está presente un epítopo antigénico. A continuación se describen ensayos ejemplares para probar la unión o la inducción de una respuesta inmune (por ejemplo, respuesta de CTL). Tales ensayos son conocidos y se han utilizado para identificar epítopos de células T, incluso a partir de bibliotecas de péptidos superpuestos (ver, por ejemplo, Martin (2003) Methods., 29:236-47; Giginat et al. (2001) J. Immunol., 166:1877 -84; Mutch (1994) Scquir. Immune Defic. Syndr., 7:879-90; Karlsson (2003) J. Immunol. Methods, 283:141-53; Hunt (1992) Science, 255:1261-3).

En algunos casos, los métodos para detectar y/o identificar un complejo MHC-E-péptido pueden incluir evaluar la estabilización de MHC-E en la superficie de las células (Terrazzano et al. (2007) Journal of Immunology,179:372-381). En algunos casos, después de poner en contacto, incubar y/o exponer las células con el uno o pluralidad de péptidos, las células pueden recuperarse y analizarse para determinar la expresión en la superficie celular de MHC-E, como mediante citometría de flujo. Un experto en la técnica está familiarizado con los ensayos de estabilización y puede determinar empíricamente las condiciones para realizar tales ensayos. En un caso ejemplar, las células se cultivan con péptidos, como a una concentración de o de aproximadamente 10 pM a 1000 pM, como de 50 pM a 500 pM, por ejemplo, aproximadamente 100 pM. Las células pueden cultivarse, como ponerse en contacto, exponerse y/o incubarse, con los péptidos durante aproximadamente de 1 hora a 24 horas, como de o de aproximadamente 12 horas a 18 horas. En algunos casos, la expresión superficial de una molécula de MHC-E puede determinarse con un anticuerpo específico anti-MHC-E, como cualquiera conocido en la técnica, incluyendo los anticuerpos ejemplares descritos en la presente. También pueden evaluarse las células de control que no se pusieron en contacto, incubaron y/o expusieron a uno o varios péptidos.

En algunos casos, los métodos para detectar y/o identificar un complejo MHC-E-péptido pueden incluir el aislamiento o separación de moléculas de MHC de la superficie de una célula o línea celular particular, como una célula que ha sido puesta en contacto, expuesta y/o incubada con epítopos peptídicos candidatos potenciales de acuerdo con los métodos divulgados, y determinando o evaluando la unión de un péptido al mismo. Por ejemplo, los métodos para detectar, aislar y/o identificar péptidos pueden implicar la lisis de las células, la purificación por afinidad de la molécula de MHC a partir de lisados celulares y la elución y análisis posteriores de péptidos del MHC (Falk et al. (1991) Nature, 351:290; Kowalewski and Stevanovic (2013). Biochemical Large-Scale Identification of Class I Ligands. In Antigen Processing: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 960, Ch. 12 (pp.

145-157; y Patente de Estados Unidos N° 5.989.565). En algunos casos, la purificación por afinidad puede implicar inmunoprecipitación o cromatografía de afinidad. En algunos casos, pueden usarse una o más de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de lectina, cromatografía líquida de alta resolución de exclusión por tamaño y una combinación de cualquiera de los anteriores.

En algunos casos, se emplea inmunoprecipitación para aislar una molécula de MHC, como una clase de MHC particular o un alelo de MHC particular. Típicamente, los métodos de inmunoprecipitación utilizan anticuerpos, como anticuerpos monoclonales, que son específicos para una clase de MHC o un alelo de MHC particular. Por ejemplo, en algunos aspectos, pueden usarse anticuerpos específicos de alelos. En algunos casos, pueden usarse anticuerpos ampliamente reactivos o monomórficos que generalmente reconocen más de un alelo de MHC, como una clase o clases de MHC particulares. Está dentro de la capacidad de un experto en la técnica elegir el anticuerpo particular dependiendo del MHC particular expresado por la célula y/o la especificidad de detección de MHC que se desee. Varios anticuerpos anti-MHC, incluyendo los anticuerpos anti-HLA, son bien conocidos en la técnica y están disponibles en fuentes comerciales y privadas. Los anticuerpos ejemplarse que pueden usarse para inmunoprecipitación de una molécula de MHC-E se describen en la Tabla 3.

En algunos casos, las fracciones de péptidos pueden separarse adicionalmente del complejo MHC-péptido. En algunos casos, los péptidos pueden disociarse de la molécula de MHC mediante métodos bien conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo, mediante la exposición del complejo a cualquiera de una variedad de métodos desnaturalizantes, como calor, pH, detergentes, sales, agente caotrópico. o combinación de los mismos. Por ejemplo, en algunos casos, después del aislamiento, los péptidos unidos a la ranura de unión del péptido de las moléculas de MHC aisladas pueden eluirse, por ejemplo, usando tratamiento con ácido.

En algunos casos, las fracciones de péptidos pueden separarse adicionalmente de las moléculas de MHC mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de fase inversa y secuenciarse. En algunos casos, los péptidos pueden separarse mediante otros métodos bien conocidos por un experto en la técnica, como filtración, ultrafiltración, electroforesis y cromatografía de tamaño, precipitación con anticuerpos específicos, cromatografía de intercambio iónico o isoelectrofoco. En algunos casos, los péptidos eluidos pueden analizarse mediante espectrometría de masas (MS), cromatografía líquida MS (LC-MS), MS en tándem (LC-MS/MS) o MALDI-MS.

En algunos casos, los péptidos unidos a moléculas de MHC en la superficie de las células pueden separarse o aislarse mediante extracción con ácido y separación por HPLC. Por ejemplo, las células pueden acidificarse a un pH de aproximadamente 2 ± 0,5 a 3 ± 0,5, por ejemplo con ácido trifluoroacético, tampón de citrato fosfato u otro tampón ácido adecuado. En algunos casos, las células tratadas con ácido pueden homogeneizarse y los péptidos eluirse en el sobrenadante después de la centrifugación. En algunos casos, pueden extraerse u obtenerse del sobrenadante los compuestos de bajo peso molecular mediante métodos que pueden incluir cromatografía de exclusión por tamaño, extracción en fase sólida, centrifugación al vacío y una combinación de los mismos. En algunos casos, la separación de péptidos puede realizarse mediante HPLC y los péptidos pueden eluirse como diferentes fracciones ajustando la velocidad de flujo, el tipo de gradiente y otros parámetros conocidos por el experto en la técnica.

En algunos casos, pueden realizarse métodos sustractivos realizando purificación por inmunoafinidad y elución de péptidos en células de control que no se pusieron en contacto, expusieron y/o incubaron con el péptido candidato o epítopos peptídicos (por ejemplo, de una biblioteca de péptidos superpuestos o sintéticos de ADNc) y/o células de control que pueden expresar una molécula de MHC distinta o además de una molécula de MHC-E. En algunos casos, las células de control son células introducidas con un vector vacío que no contienen la molécula de ácido nucleico que codifica el antígeno objetivo. En algunos casos, las células de control son células que se incuban en ausencia de contacto, exposición y/o incubación con péptidos candidatos o epítopos peptídicos. En algunos casos, las células de control son células que expresan una molécula clásica de MHC de clase I (por ejemplo, HLA-A, -B o -C) en lugar o además de expresar una molécula de MHC-E. En algunos casos, los péptidos de las muestras de células de prueba y de control pueden compararse, por ejemplo, mediante espectrometría de masas. En algunos casos, solo el péptido o péptidos contenidos en el perfil de células que expresan MHC-E de prueba puestas en contacto, expuestas y/o incubadas con el péptido candidato o epítopos peptídicos se usan para identificar epítopos peptídicos, como mediante secuenciación posterior.

En algunos casos, puede aislarse o purificarse un epítopo peptídico que está unido o es reconocido por una molécula de MHC-E. En algunos casos, se determina la secuencia del epítopo peptídico.

En algunos casos, los péptidos aislados pueden secuenciarse. En algunos casos, la secuenciación de los péptidos aislados puede realizarse de acuerdo con técnicas estándar como degradación de Edman. En algunos casos, puede realizarse la secuenciación por espectrometría de masas de péptidos individuales. En algunos casos, los péptidos secuenciados pueden compararse con la secuencia del antígeno objetivo y pueden identificarse péptidos particulares que están presentes en el antígeno objetivo.

En algunos casos, el péptido puede prepararse, por ejemplo, para análisis o pruebas adicionales. En algunos casos, el péptido puede sintetizarse en solución o sobre un soporte sólido usando técnicas conocidas en la técnica. En algunos casos, los péptidos pueden sintetizarse usando un sintetizador de péptidos automatizado. Varios sintetizadores automáticos están disponibles comercialmente y pueden usarse de acuerdo con protocolos conocidos. En algunos casos, los péptidos pueden sintetizarse manualmente. Los métodos para la síntesis de péptidos son conocidos o se describen en la técnica, ver, por ejemplo, Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. (1984); Hunkapiller et al., (1984) Nature, 310:105-11; Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag (1984).

En algunos casos, los péptidos pueden aislarse y purificarse antes de ponerse en contacto con una molécula de MHC-E. En algunos casos, los métodos adecuados para la purificación o aislamiento incluyen, por ejemplo, cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía en columna de exclusión por tamaño, cromatografía líquida de alta presión), centrifugación, solubilidad diferencial u otra técnica adecuada para la purificación de péptidos o proteínas. En algunos casos, los péptidos pueden marcarse (por ejemplo, con un marcador radiactivo, un marcador luminiscente, un marcador quimioluminiscente o un marcador de afinidad), para facilitar la purificación, aislamiento y/o evaluación de una actividad (por ejemplo, unión).

En algunos casos, se determina la afinidad de unión del epítopo peptídico. Los métodos para determinar la afinidad de un péptido por una molécula de MHC son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, las publicaciones de PCT WO 94/20127 y WO 94/03205). En algunos casos, los ensayos de unión pueden implicar la evaluación de la unión de péptidos a moléculas de MHC purificadas con respecto a la unión de un péptido de referencia radioyodado. Alternativamente, las células que expresan moléculas de MHC vacías (es decir, moléculas de HLA de la superficie celular que carecen de cualquier péptido unido) pueden evaluarse para la unión al péptido mediante tinción inmunofluorescente y microfluorimetría de flujo. Otros ensayos que pueden usarse para evaluar la unión de péptidos incluyen ensayos de ensamblaje de clase I dependientes de péptidos y/o la inhibición del reconocimiento de CTL por competencia de péptidos. En algunos casos, la unión también puede determinarse usando otros sistemas de ensayo, incluyendo los que usan: células vivas (por ejemplo, Ceppellini et al., Nature 339:392 (1989); Christnick et al., Nature 352:67 (1991); Busch et al., Int.. Immunol. 2:443 (1990); Hill et al., J Immunol. 147:189 (1991); del Guercio et al., J Immunol. 154: 685 (1995)), sistemas libres de células que usan lisados de detergentes (por ejemplo, Cerundolo et al., J Immunol. 21:2069 (1991)), MHC purificado inmovilizado (por ejemplo, Hill et al., J Immunol. 152, 2890 (1994); Marshall et al., J Immunol. 152:4946 (1994)), sistemas ELISA (por ejemplo, Reay et al., EMBO J 11:2829 (1992)), resonancia de plasmones de superficie (por ejemplo, Khilko et al., J Biol. Chem. 268:15425 (1993)); ensayos de fase soluble de alto flujo (Hammer et al., J. Exp. Med. 180:2353 (1994) y ensayos de replegamiento basados en ELISA usando moléculas MHC desnaturalizadas (Sylvester-Hyid et al. (2002) Tissue Antigens, 59:251-8)).

En algunos casos, la afinidad se determina mediante ensayos de estabilización basados en la capacidad de un péptido para estabilizar una molécula de MHC de clase I, como una molécula de MHC-E, expresada en la superficie celular. En algunos casos, una línea celular deficiente en TAP, como T2, K562 o RMA-S, puede transfectarse con un alelo de MHC de interés. Un complejo de MHC de clase I estabilizado puede detectarse usando un anticuerpo anti-MHC, como un anticuerpo pan-MHC de clase I, en cualquiera de una variedad de ensayos, como por citometría de flujo. En algunos casos, la unión puede evaluarse o compararse con respecto a un control negativo no de unión.

En algunos casos, la afinidad se determina usando un ensayo de replegamiento dependiente de péptidos (Strong et al. (2003) J Biol. Chem., 278:5082-5090). Por ejemplo, en un caso ejemplar, el replegamiento de una molécula de MHC de clase I, como el MHC-E, puede evaluarse en presencia de p2m, cadena pesada y péptido a diversas concentraciones, que pueden incubarse durante un tiempo apropiado para que se produzca el replegamiento (por ejemplo, de 30 minutos a 3 horas (por ejemplo, aproximadamente de 1 a 2 horas) a o aproximadamente entre 4° C y 8, y en algunos casos a temperatura ambiente, por ejemplo, entre o aproximadamente entre 21° C y 25° C). El MHC replegado, por ejemplo, MHC-E, puede detectarse usando un anticuerpo específico de MHC, por ejemplo, MHC-E, como en un ELISA tipo sándwich u otro método similar. En algunos casos, la cantidad relativa de MHC replegada en presencia o ausencia de varias concentraciones de péptido puede compararse con un estándar. Por ejemplo, para el replegamiento de MHC-E puede compararse con el ensamblaje logrado usando un péptido nonámero que se sabe que se une a MHC-E (por ejemplo, un nonámero de HLA-B7; VMAPRTLVL, SEQ ID NO: 6). En algunos casos, la afinidad de unión relativa puede determinarse en base a las concentraciones de péptido que producen la mitad del ensamblaje máximo.

En algunos casos, la afinidad de unión se determina usando un ensayo de competición, como un radioinmunoensayo de competición, con un péptido conocido o de referencia. Por ejemplo, en algunos aspectos, pueden determinarse las afinidades relativas mediante la comparación de concentraciones crecientes del péptido de prueba frente a un péptido de unión conocido o de referencia. En algunos casos, puede determinarse la CI50 para la unión, que es la concentración de péptido en un ensayo de unión en la que se observa una inhibición del 50% de la unión de un péptido conocido o de referencia. En algunos casos, dependiendo de las condiciones en las que se realizan los ensayos (es decir, limitando las proteínas del MHC y las concentraciones de péptidos marcados), estos valores pueden aproximarse a los valores de K^d. En algunos casos, la unión puede expresarse con respecto a un péptido conocido o de referencia.

En algunos casos, puede evaluarse la unión de un péptido a MHC en la superficie de células de un tipo de MHC específico, como una línea celular modificada, PBMC, líneas de células de leucemia o líneas de células T transformadas con EBV. En algunos casos, los ensayos de unión, como los ensayos de competición, pueden realizarse con un exceso de péptido no marcado que se sabe que se une a las mismas o diferentes moléculas de MHC. En algunos casos, puede evaluarse la unión a células que expresan los mismos o diferentes tipos de MHC. En algunos casos, puede probarse un péptido para determinar la unión a otras moléculas de MHC del mismo supertipo. En algunos casos, puede determinarse la especificidad y/o la selectividad para la unión a un MHC a alelo de MHC particulares.

En algunos casos, el péptido tiene una afinidad para unirse a un MHC que es una afinidad alta, intermedia o baja. Típicamente, “afinidad alta” con respecto a una molécula de MHC de clase I se define como la unión con una IC⁵⁰, o valor de K^d, de 50 nM o menos, “afinidad intermedia” con respecto a las moléculas de MHC de clase I se define como la unión con una IC⁵⁰o valor de K^dde entre aproximadamente 50 y aproximadamente 500 nM y “afinidad baja” con respecto a las moléculas de MHC de clase I se define como la unión con una IC⁵⁰o valor de K^dde más de 500 nM, como generalmente entre aproximadamente 500 nM y aproximadamente 5000 nM. Para las moléculas de MHC de clase II, por lo general, “afinidad alta” con respecto a la unión a moléculas MHC de clase II se define como la unión con una IC⁵⁰o valor de K^dde 100 nM o menos; afinidad “intermedia” con respecto a la unión a moléculas de MHC de clase II se define como la unión con una IC⁵⁰o valor de K^dde entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1000 nM, y “afinidad baja” con respecto a la unión a moléculas de MHC de clase II se define como la unión con una IC⁵⁰o valor de K^dde más de 1000 nM, como generalmente entre aproximadamente 1000 nM y aproximadamente 5000 nM.

En algunos casos, un epítopo peptídico puede incluir péptidos que tienen una afinidad por una molécula de MHC, como una molécula de MHC-E, con una IC⁵⁰o valor de K^dde menos de o aproximadamente menos de 5000 nM, 4000 nM, 3000 nM, 2000 nM, 1000 nM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM o menos. En algunos casos, la afinidad de unión es intermedia o baja. Por ejemplo, en algunos casos, el péptido tiene una afinidad de unión para una molécula de MHC, como una molécula de MHC-E, con una IC⁵⁰o valor de K^dde más de 50 nM o 100 nM o mayor, como mayor de 200 nM, 500 nM o 1000 nM, pero generalmente menos de 5000 nM.

En algunos casos, los métodos para detectar y/o identificar un epítopo peptídico incluyen evaluar si un péptido presentado en el contexto de una molécula de MHC-E en la superficie de una célula, es un epítopo de células T capaz de inducir una respuesta inmune.

En algunos casos, después de detectar y/o identificar un epítopo peptídico que está unido a una molécula de MHC-E, por ejemplo usando cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, los métodos divulgados incluyen además probar una respuesta de células T al péptido, como un péptido purificado o aislado. En algunos casos, puede identificarse un epítopo peptídico que provoca una respuesta de células T.

En algunos casos, puede verificarse que el péptido es un epítopo inmune evaluando la actividad funcional del péptido para inducir una respuesta inmune auxiliar o mediada por células. En algunos casos, el péptido puede evaluarse por su capacidad para servir como objetivo para linfocitos T citotóxicos (CTL) derivados de sujetos sanos cebados in vitro con el péptido o derivados de sujetos infectados o enfermos (por ejemplo, portadores de tumores). En algunos casos, la actividad de CTL puede evaluarse usando clones de CTL específicos de tumores. Tales ensayos pueden realizarse in vitro o in vivo. En algunos casos, los métodos para detectar respuestas de células T incluyen ensayos de proliferación, ensayos de secreción de linfocinas, ensayos de citotoxicidad directa y ensayos de dilución limitante.

En algunos casos, las células presentadoras de antígeno que coinciden con la restricción de HLA del péptido (por ejemplo, células que expresan MHC-E) pueden incubarse con un péptido y ensayarse para determinar su capacidad de inducir respuestas de CTL en poblaciones de células respondedoras. En algunos casos, tales respuestas se inducen incubando in vitro, como en cultivo de tejidos, linfocitos precursores de CTL junto con una fuente de células presentadoras de antígeno y el péptido. En algunos casos, las células presentadoras de antígenos pueden ser células mononucleares de sangre periférica, macrófagos, células dendríticas o células B activadas. En algunos casos, pueden usarse células modificadas o transfectadas con una molécula de MHC. En algunos casos, pueden usarse células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o células CD8+ como fuente de precursores de CTL o células de respuesta. En algunos casos, las PBMC se fraccionan para obtener una fuente de células presentadoras de antígenos y células T autólogas, como las células T CD8+. Alternativamente, el sistema de presentación de antígenos puede comprender una línea/clon de células T particular y/o un tipo de célula presentadora de antígeno particular. Se han descrito muchos protocolos de estimulación de CTL in vitro y la elección de cuál usar está dentro del conocimiento del experto en la técnica.

En algunos casos, las células presentadoras de antígeno pueden incubarse con péptido, después de lo cual las células presentadoras de antígeno cargadas con péptido se incuban con la población de células respondedoras en condiciones de cultivo optimizadas. En algunos casos, el péptido se proporciona a concentraciones entre 10 y 40 pg/ml. En algunos casos, el péptido se incuba previamente con las células presentadoras de antígeno durante períodos que varían de 1 a 18 horas. En algunos casos, puede añadirse p2-microglobulina (por ejemplo, 4 pg/ml) durante este período de tiempo para mejorar la unión. En algunos casos, las células presentadoras de antígeno pueden mantenerse a temperatura ambiente durante el período de incubación (Ljunggren, H.-G. et al, Nature, 346:476-480, (1990)) o pretratarse con ácido (Zeh, H.J., Ill et al., Hum. Immunol., 39:79-86, (1994)) para promover la generación de moléculas de MHC desnaturalizadas que luego pueden unirse al péptido. Después de la carga de péptidos de las células presentadoras de antígeno, los CTL precursores (respondedores) pueden añadirse a las células presentadoras de antígeno a las que se ha unido el péptido (estimuladoras), por ejemplo, en una proporción de respondedor a estimuladora de entre 5:1 y 50:1, como entre 10:1 y 20:1. En algunos aspectos, el cocultivo de células se lleva a cabo en condiciones en las que pueden generarse células respondedoras a CTL, es decir, en condiciones para cebar células CD8+. Por ejemplo, en algunos casos, el cocultivo se lleva a cabo en presencia de IL-2 u otras citoquinas estimuladoras, como IL-1, IL-7 e IL-12. En un caso ejemplar, el cocultivo de las células se realiza a 37° C en RPMI 1640, suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, e IL-2 (5-20 Unidades/ml) y, opcionalmente, con la adición de uno o más de IL-1, IL7 o IL-12. En algunos casos, se añade medio nuevo que contiene IL-2 a los cultivos cada 2-4 días, por ejemplo, eliminando la mitad del medio antiguo y reponiéndolo con un volumen igual de medio nuevo. En algunos casos, después de 7-10 días, y generalmente cada 7-10 días a partir de entonces, los CTL se vuelven a estimular con células presentadoras de antígeno a las que se ha unido el péptido como se ha descrito anteriormente. En algunos casos, se añade medio nuevo que contiene IL-2 a las células a lo largo de su cultivo como se ha descrito anteriormente. En algunos casos, pueden requerirse de tres a cuatro rondas de estimulación y, a veces, de cinco a ocho rondas de estimulación, para generar una respuesta de CTL que luego puede medirse in vitro. En algunos casos, los CTL específicos del péptido pueden expandirse adicionalmente a un gran número mediante el tratamiento con un anticuerpo anti-CD3. Por ejemplo, ver (Riddell, S.R. y Greenberg, P.D., J. Immunol. Methods, 128: 189-201, (1990); Walter, E.A. et al., N. Engl. J. Med., 333:1038-1044, (1995)).

En algunos casos, la actividad de CTL puede evaluarse directamente de PBMC aisladas de sujetos infectados o enfermos, como sujetos portadores de tumores o cáncer, sin cebado in vitro (ver, por ejemplo, Bredenbeck et al. (2005) J. Immunol., 174:6716 -6724). Por ejemplo, en algunos casos, el péptido puede añadirse directamente a las células PBMC aisladas de la sangre periférica del sujeto. En algunos casos, como un control, las PBMC sin péptido pueden evaluarse para determinar la actividad de CTL del mismo sujeto. En algunos casos, se sabe o es probable que el cáncer exprese el antígeno tumoral del que se deriva el péptido identificado por el método divulgado. En algunos casos, el sujeto tiene un sarcoma, melanoma, carcinoma de mama, carcinoma renal, carcinoma de pulmón, carcinoma de ovario, carcinoma de próstata, carcinoma colorrectal, carcinoma pancreático, tumor escamoso de cabeza y cuello o carcinoma escamoso de pulmón.

En algunos casos, pueden utilizarse clones de CTL, como clones de CTL específicos de tumor, para evaluar la actividad de CTL. Los expertos en la técnica conocen métodos para generar clones de CTL. En un caso ejemplar, pueden obtenerse clones CTL mediante estimulación de células T CD8+ con antígeno en presencia de células presentadoras de antígeno seguido de expansión continua específica de antígeno de células T CD8+ específicas de antígeno para generar líneas de clones CTL.

En algunos casos, puede determinarse la activación de CTL. Existen una variedad de técnicas para analizar la actividad de CTL. En algunos casos, la actividad de los CTL puede evaluarse analizando el cultivo para determinar la presencia de CTL que lisan las células objetivo radio-marcadas, como los objetivos específicos pulsadas con péptidos. Estas técnicas incluyen el marcado de las células objetivo con radionucleidos como Na2, 51CrÜ4 o 3H-timidina, y medir la liberación o retención de los radionucleidos de las células objetivo como índice de muerte celular. En algunos casos, se sabe que los CTL liberan una variedad de citoquinas cuando son estimuladas por una célula objetivo apropiada, como una célula tumoral que expresa la molécula de MHC relevante y el péptido correspondiente, y puede determinarse la presencia de tales CTL específicos del epítopo midiendo la liberación de citoquinas. Los ejemplos no limitativos de tales citoquinas incluyen IFN-^y, TNF-a y GM-CSF. Los ensayos para estas citoquinas son bien conocidos en la técnica y su selección se deja al experto en la técnica. La metodología para medir tanto la muerte de las células objetivo como la liberación de citoquinas como medida de la reactividad de los CTL se dan en Coligan, J.E. et al. (Current Protocols in Immunology, 1999, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York).

En algunos casos, alternativamente, puede identificarse un epítopo peptídico basándose en su capacidad para estimular una respuesta inmune o inducir la reactividad de las células T, como para inducir una respuesta inmune auxiliar o mediada por células. Por tanto, en algunos casos, los métodos pueden realizarse sin la necesidad de determinar primero si un péptido se une y/o se eluye de una molécula de MHC particular. Por ejemplo, en algunos casos, los métodos para detectar y/o identificar un epítopo peptídico incluyen evaluar o determinar si un péptido mostrado en el contexto de una molécula de MHC en la superficie de una célula, como una célula que ha sido puesta en contacto, expuesta y/o incubada con epítopos peptídicos candidatos potenciales de acuerdo con los métodos divulgados, es un epítopo de células T capaz de inducir una respuesta inmune. Tales células que expresan péptidos resultantes pueden usarse directamente como fuente de péptidos para evaluar la estimulación de las células respondedoras o efectoras, como las células mononucleares de sangre periférica completa (PBMC) o las células T CD8+, ya sea obtenidas de sanos, infectados o enfermos (por ejemplo, sujetos portadores de tumores) o clones de células T. Puede evaluarse una respuesta de células T citotóxicas usando métodos conocidos en la técnica, incluyendo cualquiera de los descritos anteriormente. En algunos casos, si se evalúa una respuesta de células T, el péptido puede identificarse, aislarse o purificarse, por ejemplo mediante los métodos de elución y inmunoafinidad descritos anteriormente. En algunos casos, las células que no se pusieron en contacto, expusieron y/o incubaron con los epítopos peptídicos candidatos pueden usarse como control.

III. Métodos para identificar moléculas que se unen a un péptido en el contexto de una molécula de MHC

Se divulgan métodos para identificar y/o generar moléculas de unión a antígeno que se unen a un epítopo peptídico presentado en el contexto de una molécula de MHC, es decir, un complejo MHC-péptido. En algunos casos, el epítopo peptídico se identifica usando los métodos divulgados. En algunos casos, el epítopo peptídico es un epítopo peptídico universal, supertopo y/o no canónico. En algunos casos, la molécula de unión de péptido, es decir, molécula de unión a MHC-péptido, es una molécula o porción de la misma que posee la capacidad de unirse, por ejemplo, unirse específicamente, a un epítopo peptídico que se presenta o muestra en el contexto de una molécula de MHC (complejo MHC-péptido), como en la superficie de una célula. En algunos casos, una molécula de unión puede incluir cualquier molécula de origen natural, sintética, semisintética o producida de manera recombinante que pueda unirse, por ejemplo, unirse específicamente a un complejo MHC-péptido. Las moléculas de unión a péptidos ejemplares incluyen receptores de células T o anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, incluyendo regiones variables de inmunoglobulina de cadena sencilla (por ejemplo, ScTCR, scFv) de las mismas, que muestran capacidad específica para unirse a un complejo MHC-péptido. En algunos casos, la molécula de unión a péptidos es un TCR o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos casos, la molécula de unión a péptidos es un CAR similar a TCR que contiene un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, como un anticuerpo similar a TCR, como uno que ha sido diseñado para unirse a complejos MHC-péptido. En algunos casos, la molécula de unión a péptido puede derivarse de fuentes naturales, o puede producirse parcial o totalmente de manera sintética o recombinante.

En algunos casos, la molécula de unión a péptidos se une, por ejemplo, se une específicamente, a un epítopo peptídico, por ejemplo, en complejo con una molécula de MHC-E, con una afinidad o K^a(es decir, una constante de asociación de equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de 1/M) igual o mayor de 10⁵M^-1(que es igual a la relación entre la constante de asociación [k^on] y la constante de disociación [k^off] para esta reacción de asociación). En algunos casos, el TCR (u otra molécula de unión de péptidos) muestra una afinidad de unión por un epítopo de células T del polipéptido objetivo con una constante de asociación K^avida media que varía de o de aproximadamente 10⁶M^-1a 10¹⁰M^{- 1}, como de o de aproximadamente 10⁶M^-1a 10⁸M^{- 1}. En algunos casos, la afinidad de unión puede clasificarse como alta afinidad o baja afinidad. Por ejemplo, en algunos casos, una molécula de unión (por ejemplo, TCR) que muestra una unión de alta afinidad para un epítopo particular interactúa con dicho epítopo con una K^ade por lo menos 10⁷M^{- 1}, por lo menos 10⁸M^{- 1}, por lo menos 10⁹M^{- 1}, por lo menos 10¹⁰M^{- 1}, por lo menos 10¹¹M^{- 1}, por lo menos 10¹²M^{- 1}, o por lo menos 10¹³M^{- 1}. En algunos casos, una molécula de unión (por ejemplo, TCR) que muestra unión de baja afinidad muestra una K^ade hasta 10⁷M^{- 1}, hasta 10⁶M^{- 1}, hasta 10⁵M^{- 1}. Alternativamente, la afinidad puede definirse como una constante de disociación de equilibrio (K^d) de una interacción de unión particular con unidades de M (por ejemplo, 10^-5M a 10^-13M). En algunos casos, la molécula de unión del péptido identificada muestra una afinidad de unión por el péptido en el contexto de una molécula de MHC-E con una K^dque es de 10^-5M a 10^-13M, 10^-5M a 10^-9M, o 10^-7M a 10^{-1 2}M, como menos de o menos de aproximadamente 10^-5M, 10^-6M, 10^-7M, 10^-8M, 10^-9M, 10^{-1 0}M, 10^-11M, 10^{-1 2}M, 10^{-1 3}M o menos.

Típicamente, la unión específica de una molécula de unión a péptido a un epítopo peptídico, por ejemplo, en un complejo con un MHC-E, está gobernada por la presencia de un sitio de unión de antígeno que contiene una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR). En general, se entiende que se une específicamente no significa que el epítopo peptídico particular, por ejemplo, en un complejo con un MHC-E, sea lo único a lo que puede unirse la molécula del péptido de MHC, ya que también pueden producirse interacciones de unión no específicas con otras moléculas. En algunos casos, la unión de una molécula de unión a péptido a un complejo MHC-péptido tiene una afinidad más alta que la unión a tales otras moléculas, por ejemplo, moléculas distintas de un complejo MHC-péptido o un complejo MHC-péptido irrelevante (control), como por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces, o por lo menos aproximadamente 100 veces más alta que la afinidad de unión a tales otras moléculas.

En algunos casos, una molécula de unión que se une a un epítopo peptídico puede identificarse poniendo en contacto una o más moléculas de unión candidatas, como una o más moléculas de TCR candidatas, anticuerpos o fragmentos de unión de antígeno de los mismos, con un complejo MHC-péptido, y evaluar si cada una de las moléculas de unión candidatas se une, por ejemplo se une específicamente, al complejo MHC-péptido. Los métodos pueden realizarse in vitro, ex vivo o in vivo.

En algunos casos, pueden emplearse métodos de selección en los que una pluralidad de moléculas de unión candidatas, como una biblioteca o colección de moléculas de unión candidatas, se ponen en contacto individualmente con una molécula de unión a péptidos, ya sea simultánea o secuencialmente. Los miembros de la biblioteca que se unen específicamente a un complejo péptido-MHC particular pueden identificarse o seleccionarse. En algunos casos, la biblioteca o colección de moléculas de unión candidatas puede contener por lo menos 2, 5, 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 o más moléculas de unión a péptidos diferentes.

En algunos casos, puede producirse un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que se une, por ejemplo se une específicamente, a un complejo MHC-péptido inmunizando un huésped con una cantidad eficaz de un inmunógeno que contiene un complejo MHC-péptido particular. En algunos casos, el anticuerpo o porción del mismo puede aislarse del huésped y evaluarse la unión al complejo MHC-péptido para confirmar la unión específica al mismo.

Se conocen una variedad de ensayos para evaluar la afinidad de unión y/o determinar si una molécula de unión se une específicamente a un ligando particular (por ejemplo, complejo MHC-péptido). Está dentro de la capacidad de un experto en la técnica determinar la afinidad de unión de un TCR por un epítopo de células T de un polipéptido objetivo, por ejemplo usando cualquiera de una serie de ensayos de unión que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, en algunos casos, puede usarse una máquina BIAcore para determinar la constante de unión de un complejo entre dos proteínas. La constante de disociación del complejo puede determinarse monitorizando los cambios en el índice de refracción con respecto al tiempo a medida que se pasa el tampón por el chip. Otros ensayos adecuados para medir la unión de una proteína a otra incluyen, por ejemplo, inmunoensayos como ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) y radioinmunoensayos (RIA), o determinación de la unión mediante la monitorización del cambio en las propiedades espectroscópicas u ópticas de las proteínas mediante fluorescencia, absorción de UV, dicroísmo circular o resonancia magnética nuclear (NMR). Otros ensayos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, transferencia Western, ELISA, ultracentrifugación analítica, espectroscopia y análisis de resonancia de plasmones de superficie (Biacore®) (ver, por ejemplo, Scatchard et al.,Ana. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949; Wilson, Science 295:2103, 2002; Wolff et al., Cancer Res. 53:2560, 1993; y las Patentes de Estados Unidos N° 5.283.173, 5.468.614, o el equivalente), citometría de flujo, secuenciación y otros métodos para la detección de ácidos nucleicos expresados. En un ejemplo, la afinidad aparente por un TCR se mide evaluando la unión a varias concentraciones de tetrámeros, por ejemplo, mediante citometría de flujo usando tetrámeros marcados. En un ejemplo, la K^daparente de un TCR se mide usando diluciones al doble de tetrámeros marcados en un intervalo de concentraciones, seguido de la determinación de las curvas de unión por regresión no lineal, determinándose la K^daparente como la concentración de ligando que produjo unión media máxima.

En algunos casos, los métodos pueden usarse para identificar moléculas de unión que se unen solo si el péptido particular está presente en el complejo, y no si el péptido particular está ausente o si está presente otro péptido no superpuesto o no relacionado. En algunos casos, la molécula de unión no se une sustancialmente al MHC en ausencia del péptido unido y/o no se une sustancialmente al péptido en ausencia del MHC. En algunos casos, las moléculas de unión son por lo menos parcialmente específicas. En algunos casos, una molécula de unión identificada ejemplar puede unirse a un complejo MHC-péptido si el péptido particular está presente, y también unirse si está presente un péptido relacionado que tenga una o dos sustituciones con respecto al péptido particular. A. Moléculas de unión y bibliotecas

En algunos casos, la molécula de unión a péptidos es un TCR o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos casos, la molécula de unión a péptidos es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, como un anticuerpo similar a TCR. En algunos casos, la molécula de unión a péptidos puede derivarse de fuentes naturales, o puede producirse parcial o totalmente de manera sintética o recombinante.

En algunos casos, se evalúan una o más moléculas de unión para determinar su unión a un epítopo peptídico particular, como un epítopo peptídico identificado usando cualquiera de los métodos descritos anteriormente.

En algunos casos, puede generarse una biblioteca que contiene una pluralidad de variantes de una molécula de unión, como un TCR o un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

En algunos casos, puede generarse una biblioteca o colección que contiene moléculas de unión, cada una de las cuales tiene una secuencia presente en el genoma de un sujeto, y evaluarse para determinar la unión. En algunos casos, puede generarse y evaluar la unión de una biblioteca o colección de moléculas de unión en las que uno o más miembros han evolucionado, se han aleatorizado y/o mutagenizado, por ejemplo, mediante métodos de evolución dirigida.

1. Receptor de células T (TCR)

En aspectos del método divulgado, la molécula de unión a péptidos es un receptor de células T (TCR) o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos casos, un "receptor de células T" o "TCR" es una molécula que contiene cadenas a y p variables (también conocidas como TCRa y TCRp, respectivamente) o cadenas ^yy S variables (también conocidas como TCRy y TCRS, respectivamente), o porciones de unión a antígeno de las mismas, y que es capaz de unirse específicamente a un péptido unido a una molécula de MHC. En algunos casos, el TCR está en forma ap. Típicamente, los TCR que existen en las formas ap y ^yS son generalmente estructuralmente similares, pero las células T que los expresan pueden tener localizaciones o funciones anatómicas distintas. Un TCR puede encontrarse en la superficie de una célula o en forma soluble. En general, un TCR se encuentra en la superficie de células T (o linfocitos T) donde es generalmente responsable de reconocer antígenos unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).

A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término "TCR" abarca los TCR completos, así como las porciones de unión a antígeno o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunos casos, el TCR es un TCR intacto o de longitud completa, incluyendo los TCR en la forma ap o ^yS. En algunos casos, el TCR es una porción de unión a antígeno que es menor que un TCR de longitud completa pero que se une a un péptido específico unido en una molécula de MHC, de tal manera que se une a un complejo MHC-péptido. En algunos casos, una porción de unión a antígeno o un fragmento de un TCR puede contener solo una porción de los dominios estructurales de un TCR de longitud completa o intacto, pero aún es capaz de unirse al epítopo peptídico, como el complejo MHC-péptido, al que se une el TCR completo. En algunos casos, una porción de unión a antígeno contiene los dominios variables de un TCR, como la cadena a variable y la cadena p variable de un TCR, suficiente para formar un sitio de unión para unirse a un complejo MHC-péptido específico. Generalmente, las cadenas variables de un TCR contienen regiones determinantes de la complementariedad (CDR) implicadas en el reconocimiento del péptido, MHC y/o complejo MHC-péptido.

En algunos casos, los dominios variables del TCR contienen giros hipervariables, o CDR, que generalmente son los principales contribuyentes al reconocimiento de antígenos y las capacidades y la especificidad de unión. En algunos casos, una CDR de un TCR o una combinación de las mismas forma todo o sustancialmente todo el sitio de unión al antígeno de una molécula de TCR dada. Las varias CDR dentro de una región variable de una cadena de TCR generalmente están separadas por regiones marco (FR), que generalmente muestran menos variabilidad entre las moléculas de TCR en comparación con las CDR (ver, por ejemplo, Jores et al., Proc. Nat'l Acad Sci. USA 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988; ver también Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol.27:55, 2003). En algunos casos, la CDR3 es la principal CDR responsable de la unión o especificidad del antígeno, o es la más importante entre las tres CDR en una región variable de TCR dada para el reconocimiento de antígeno y/o para la interacción con la porción de péptido procesada del complejo péptido-MHC. En algunos contextos, la CDR1 de la cadena alfa puede interactuar con la parte N-terminal de ciertos péptidos antigénicos. En algunos contextos, la CDR1 de la cadena beta puede interactuar con la parte C-terminal del péptido. En algunos contextos, la CDR2 es la que más contribuye o es la principal CDR responsable de la interacción o el reconocimiento de la porción de MHC del complejo MHC-péptido. En algunos casos, la región variable de la cadena p puede contener una región hipervariable adicional (CDR4 o HVR4), que generalmente está implicada en la unión a superantígeno y no en el reconocimiento de antígeno (Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411 -426).

En algunos casos, un TCR contiene un dominio alfa variable (V^a) y/o un dominio beta variable (V^p) o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunos casos, la cadena a y/o la cadena p de un TCR también puede contener un dominio constante, un dominio transmembrana y/o una cola citoplasmática corta (ver, por ejemplo, Janeway et al., Immunobiology: The Immune Systemin Health and Disease, 3a Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997). En algunos casos, el dominio constante de la cadena a está codificado por el gen TRAC (nomenclatura IMGT) o es una variante del mismo. En algunos casos, la región constante de la cadena p está codificada por genes TRBC1 o TRBC2 (nomenclatura IMGT) o es una variante de los mismos. En algunos casos, el dominio constante está adyacente a la membrana celular. Por ejemplo, en algunos casos, la porción extracelular del TCR formada por las dos cadenas contiene dos dominios constantes proximales a la membrana y dos dominios variables distales a la membrana, cuyos dominios variables contienen cada uno CDR.

Está dentro de la capacidad de un experto en la técnica determinar o identificar los varios dominios o regiones de un TCR. En algunos aspectos, los residuos de un TCR son conocidos o pueden identificarse de acuerdo con el sistema de numeración del Sistema Internacional de Información Inmunogenética (IMGT) (ver, por ejemplo, www.imgt.org; ver también, Lefranc et al. (2003) Developmental and Comparative Immunology, 2&; 55-77; y The T Cell Factsbook 2a Edición, Lefranc y LeFranc Academic Press 2001). Usando este sistema, las secuencias de CDR1 dentro de una cadena Va y/o una cadena Vp de TCR corresponden a los aminoácidos presentes entre los números de residuos 27-38, inclusive, las secuencias de CDR2 dentro de una cadena Va y/o una cadena Vp de TCR corresponden a los aminoácidos presentes entre los números de residuo 56-65, inclusive, y las secuencias de CDR3 dentro de una cadena Va y/o una cadena Vp de TCR corresponden a los aminoácidos presentes entre los números de residuo 105-117, inclusive.

En algunos casos, el TCR puede ser un heterodímero de dos cadenas a y p (u opcionalmente ^yy S) que están enlazadas, como por un enlace disulfuro o enlaces disulfuro. En algunos casos, el dominio constante del TCR puede contener secuencias de conexión cortas en las que un residuo de cisteína forma un enlace disulfuro, enlazando de este modo las dos cadenas del TCR. En algunos casos, un TCR puede tener un residuo de cisteína adicional en cada una de las cadenas a y p, de tal manera que el TCR contiene dos enlaces disulfuro en los dominios constantes. En algunos casos, cada uno de los dominios constante y variable contiene enlaces disulfuro formados por residuos de cisteína.

En algunos casos como se describe, el TCR puede contener un enlace o enlaces disulfuro introducidos. En algunos casos, los enlaces disulfuro nativos no están presentes. En algunos casos, la una o más de las cisteínas nativas (por ejemplo, en el dominio constante de la cadena a y la cadena p) que forman un enlace disulfuro intercatenario nativo se sustituyen por otro residuo, como una serina o alanina. En algunos casos, puede formarse un enlace disulfuro introducido mutando residuos distintos de cisteína en las cadenas alfa y beta, como en el dominio constante de la cadena a y la cadena p, a cisteína. Los enlaces disulfuro no nativos ejemplares de un TCR se describen en los PCT internacionales publicados N° W02006/000830 y WO2006037960. En algunos casos, pueden introducirse cisteínas en el residuo Thr48 de la cadena a y Ser57 de la cadena p, en el residuo Thr45 de la cadena a y Ser77 de la cadena p, en el residuo Tyr10 de la cadena a y SerI7 de la cadena p, en el residuo Thr45 de la cadena a y Asp59 de la cadena p y/o en el residuo SerI5 de la cadena a y Glu15 de la cadena p. En algunos casos, la presencia de residuos de cisteína no nativos (por ejemplo, que dan como resultado uno o más enlaces disulfuro no nativos) en un TCR recombinante puede favorecer la producción del TCR recombinante deseado en una célula en la que se introduce sobre la expresión de un una pareja de TCR malapareada que contiene una cadena de TCR nativa.

En algunos casos, las cadenas de TCR contienen un dominio transmembrana. En algunos casos, el dominio transmembrana está cargado positivamente. En algunos casos, la cadena de TCR contiene una cola citoplásmica. En algunos aspectos, cada cadena (por ejemplo, alfa o beta) del TCR puede poseer un dominio variable de inmunoglobulina N-terminal, un dominio constante de inmunoglobulina, una región transmembrana y una cola citoplasmática corta en el extremo C-terminal. En algunos casos, un TCR, por ejemplo a través de la cola citoplásmica, se asocia con proteínas invariantes del complejo CD3 implicadas en la mediación de la transducción de señales. En algunos casos, la estructura permite que el TCR se asocie con otras moléculas como CD3 y sus subunidades. Por ejemplo, un TCR que contiene dominios constantes con una región transmembrana puede anclar la proteína en la membrana celular y asociarse con subunidades invariantes del aparato o complejo de señalización de CD3. Las colas intracelulares de las subunidades de señalización de CD3 (por ejemplo, cadenas CD3^y, CD35, CD3s y CD3Z) contienen uno o más motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptores o iTAM que están implicados en la capacidad de señalización del complejo TCR.

En algunos casos, el TCR o la porción de unión a antígeno del mismo puede ser una proteína natural producida de manera recombinante o una forma mutada de la misma en la que se han alterado una o más propiedades, como la característica de unión. En algunos casos, un TCR puede derivarse de una de varias especies animales, como humano, ratón, rata u otro mamífero.

En algunos casos, el TCR es un TCR de longitud completa. En algunos casos, el TCR es una porción de unión a antígeno. En algunos casos, el TCR es un TCR dimérico (dTCR). En algunos casos, el TCR es un TCR de cadena sencilla (sc-TCR). Un TCR puede estar unido a células o en forma soluble. En algunos casos, para los propósitos de los métodos divulgados, el TCR está en forma unido a células expresado en la superficie de una célula.

En algunos casos, un dTCR contiene un primer polipéptido en el que una secuencia correspondiente a una secuencia de la región variable de la cadena a de TCR se fusiona al extremo N terminal de una secuencia correspondiente a una secuencia extracelular de la región constante de la cadena a de TCR, y un segundo polipéptido en el que una secuencia correspondiente a una secuencia de la región variable de la cadena p de TCR se fusiona con el extremo N terminal una secuencia correspondiente a una secuencia extracelular de la región constante de la cadena p de TCR, el primer y segundo polipéptidos estando enlazados mediante un enlace disulfuro. En algunos casos, el enlace puede corresponder al enlace disulfuro intercatenario nativo presente en los TCR ap diméricos nativos. En algunos casos, los enlaces disulfuro intercatenarios no están presentes en un TCR nativo. Por ejemplo, en algunos casos, pueden incorporarse una o más cisteínas en las secuencias extracelulares de la región constante de la pareja de polipéptidos de dTCR. En algunos casos, puede ser deseable un enlace disulfuro tanto nativo como no nativo. En algunos casos, el TCR contiene una secuencia transmembrana para anclar a la membrana.

En algunos casos, un dTCR contiene una cadena a de TCR que contiene un dominio a variable, un dominio a constante y un primer motivo de dimerización unido al extremo C-terminal del dominio a constante, y una cadena p de TCR que comprende un dominio p variable, un dominio p constante y un primer motivo de dimerización unido al extremo C-terminal del dominio p constante, en donde el primer y el segundo motivos de dimerización interactúan fácilmente para formar un enlace covalente entre un aminoácido en el primer motivo de dimerización y un aminoácido en el segundo motivo de dimerización que enlazan la cadena a de TCR y la cadena p de TCR.

En algunos casos, el TCR es un scTCR, que es una única cadena de aminoácidos que contiene una cadena a y una cadena p que puede unirse a complejos MHC-péptido. Típicamente, puede generarse un scTCR usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, los PCT internacionales publicados N° WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/18129, WO 04/033685, WO2006/037960, WO2011./044186; Patente de Estados Unidos N° 7.569.664; y Schlueter, C.J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996).

En algunos casos, un scTCR contiene un primer segmento constituido por una secuencia de aminoácidos correspondiente a una región variable de cadena a de TCR, un segundo segmento constituido por una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de región variable de cadena p de TCR fusionada al extremo N terminal de una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia extracelular de dominio constante de la cadena p de TCR, y una secuencia conectora que enlaza el extremo C terminal del primer segmento con el extremo N terminal del segundo segmento.

En algunos casos, un scTCR contiene un primer segmento constituido por una secuencia de aminoácidos correspondiente a una región variable de cadena p de TCR, un segundo segmento constituido por una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de región variable de cadena a de TCR fusionada al extremo N terminal de una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia extracelular de dominio constante de cadena a de TCR, y una secuencia conectora que enlaza el extremo C terminal del primer segmento con el extremo N terminal del segundo segmento.

En algunos casos, un scTCR contiene un primer segmento constituido por una secuencia de región variable de cadena a fusionada al extremo N terminal de una secuencia de dominio constante extracelular de cadena a, y un segundo segmento constituido por una secuencia de región variable de cadena p fusionada al extremo N terminal de una secuencia constante extracelular de cadena p y secuencia transmembrana y, opcionalmente, una secuencia conectora que enlaza el extremo C terminal del primer segmento con el extremo N terminal del segundo segmento.

En algunos casos, un scTCR contiene un primer segmento constituido por una secuencia de la región variable de la cadena p de TCR fusionada al extremo N terminal de una secuencia de dominio constante extracelular de la cadena p, y un segundo segmento constituido por una secuencia de la región variable de la cadena a fusionada al extremo N terminal de una secuencia constante extracelular de la cadena a y una secuencia transmembrana y, opcionalmente, una secuencia conectora que une el extremo C terminal del primer segmento con el extremo N terminal del segundo segmento.

En algunos casos, para que el scTCR se una a un complejo MHC-péptido, las cadenas a y p deben emparejarse para que las secuencias de la región variable de las mismas estén orientadas para tal unión. Se conocen bien en la técnica varios métodos para promover el emparejamiento de a y p en un scTCR. En algunos casos, se incluye una secuencia conectora que une las cadenas a y p para formar la cadena polipeptídica individual. En algunos casos, el conector debe tener una longitud suficiente para abarcar la distancia entre el extremo C terminal de la cadena a y el extremo N terminal de la cadena p, o viceversa, a la vez que se asegura que la longitud del conector no sea tan larga como para bloquear o reducir la unión del scTCR al complejo péptido-MHC objetivo.

En algunos casos, el conector de un scTCR que une el primer y el segundo segmentos de TCR puede ser cualquier conector capaz de formar una única cadena polipeptídica, a la vez que conserva la especificidad de unión a TCR. En algunos casos, la secuencia conectora puede tener, por ejemplo, la fórmula -P-AA-P-, en donde P es prolina y AA representa una secuencia de aminoácidos en la que los aminoácidos son glicina y serina. En algunos casos, el primer y el segundo segmentos están emparejados de tal manera que las secuencias de la región variable de los mismos estén orientadas para tal unión. Por lo tanto, en algunos casos, el conector tiene una longitud suficiente para abarcar la distancia entre el extremo C terminal del primer segmento y el extremo N terminal del segundo segmento, o viceversa, pero no es demasiado largo para bloquear o reducir la unión del scTCR. al ligando objetivo. En algunos casos, el conector puede contener de o de aproximadamente 10 a 45 aminoácidos, como de 10 a 30 aminoácidos o de 26 a 41 residuos de aminoácidos, por ejemplo 29, 30, 31 o 32 aminoácidos. En algunos casos, el conector tiene la fórmula -PGGG-(SGGGG)5-P- o -PGGG-(SGGGG)6-P-, donde P es prolina, G es glicina y S es serina (SEQ ID NO: 54 o 55). En algunos casos, el conector tiene la secuencia GSADDAKKDAAKKDGKS (SEQ ID NO: 53).

En algunos casos, un scTCR contiene un enlace disulfuro entre los residuos de la cadena de aminoácidos unica, que, en algunos casos, puede promover la estabilidad del emparejamiento entre las regiones a y p de la molécula de cadena sencilla (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 7.569.664). En algunos casos, el scTCR contiene un enlace disulfuro covalente que enlaza un residuo de la región de inmunoglobulina del dominio constante de la cadena a a un residuo de la región de inmunoglobulina del dominio constante de la cadena p de la molécula de cadena sencilla. En algunos casos, el enlace disulfuro corresponde al enlace disulfuro nativo presente en un dTCR nativo. En algunos casos, el enlace disulfuro en un TCR nativo no está presente. En algunos casos, el enlace disulfuro es un enlace disulfuro no nativo introducido, por ejemplo, incorporando una o más cisteínas en las secuencias extracelulares de la región constante de las regiones de la primera y segunda cadena del polipéptido de scTCR. Las mutaciones de cisteína ejemplares incluyen cualquiera de las descritas anteriormente. En algunos casos, puede estar presente un enlace disulfuro tanto nativo como no nativo.

En algunos casos, un scTCR es un TCR truncado no enlazado por disulfuro en el que las cremalleras de leucina heterólogas fusionadas a sus extremos C-terminales facilitan la asociación de la cadena (ver, por ejemplo, PCT internacional publicado N° WO99/60120). En algunos casos, un scTCR contiene un dominio variable de TCRa enlazado covalentemente a un dominio variable de TCRp mediante un conector peptídico (ver, por ejemplo, PCT internacional publicado N° WO99/18129).

En algunos casos, el TCR es un TCR soluble. En algunos casos, el TCR soluble tiene una estructura como se describe en la WO99/60120 o la WO 03/020763. En algunos casos, el TCR no contiene una secuencia correspondiente a la secuencia transmembrana, por ejemplo, para permitir el anclaje de la membrana en la célula en la que se expresa. En algunos casos, el TCR no contiene una secuencia correspondiente a secuencias citoplasmáticas.

En algunos casos, cualquiera de los TCR, incluyendo un dTCR o scTCR, puede enlazarse a dominios de señalización que producen un TCR activo en la superficie de una célula T. En algunos casos, el TCR se expresa en la superficie de las células. En algunos casos, el TCR contiene una secuencia correspondiente a una secuencia transmembrana. En algunos casos, el dominio transmembrana puede ser un dominio transmembrana Ca o Cp. En algunos casos, el dominio transmembrana puede ser de un origen no de TCR, por ejemplo, una región transmembrana de CD3z, CD28 o B7.1. En algunos casos, el TCR contiene una secuencia correspondiente a secuencias citoplásmicas. En algunos casos, el TCR contiene un dominio de señalización CD3z. En algunos casos, el TCR es capaz de formar un complejo de TCR con CD3.

En algunos casos, el TCR o fragmento de unión a antígeno del mismo muestra una afinidad con una constante de unión de equilibrio por un complejo o ligando de MHC-péptido de entre aproximadamente 10-5 y 10-12 M y todos los valores e intervalos individuales del mismo.

En algunos casos, el TCR puede obtenerse de secuencias de TCR conocidas, como secuencias de cadenas Va, p, para las que está fácilmente disponible una secuencia codificante sustancialmente de longitud completa. Los métodos para obtener secuencias de TCR de longitud completa, incluyendo las secuencias de cadena V, a partir de fuentes celulares son bien conocidos. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica el TCR puede obtenerse de una variedad de fuentes, como mediante amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) de secuencias de ADN de TCR disponibles públicamente. En algunos casos, el TCR se obtiene de una fuente biológica, como de células como de una célula T (por ejemplo, célula T citotóxica), hibridomas de células T u otra fuente disponible públicamente. En algunos casos, las células T pueden obtenerse de células aisladas in vivo, como de sujetos normales (o sanos) o sujetos enfermos, incluyendo las células T presentes en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). En algunos casos, las células T pueden ser un hibridoma o clon de células T cultivado. En algunos casos, el TCR o la porción de unión a antígeno del mismo puede generarse sintéticamente a partir del conocimiento de la secuencia del TCR.

En algunos casos, el ácido nucleico o los ácidos nucleicos que codifican un TCR, como las cadenas a y p, pueden amplificarse mediante PCR, clonación u otros medios adecuados y clonarse en un vector o vectores de expresión adecuados. El vector de expresión puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado y puede usarse para transformar o transfectar cualquier huésped adecuado. Los vectores adecuados incluyen aquellos diseñados para propagación y expansión o para expresión o ambos, como plásmidos y virus.

En algunos casos, el vector puede ser un vector de la serie pUC (Fermentas Life Sciences), la serie pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), la serie pET (Novagen, Madison, Wis.), La serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) o la serie pEX (Clontech, Palo Alto, Calif). En algunos casos, también pueden usarse vectores de bacteriófagos, como AG10, AGT11, AZaplI (Stratagene), AEMBL4 y ANM1149. En algunos casos, pueden usarse vectores de expresión de plantas e incluyen pBI01, pBI101.2, pBl101.3, pBI121 y pBIN 19 (Clontech). En algunos casos, los vectores de expresión animal incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). En algunos casos, se usa un vector viral, como un vector retroviral.

En algunos casos, pueden prepararse vectores de expresión recombinantes usando técnicas estándar de ADN recombinante. En algunos casos, los vectores pueden contener secuencias reguladoras, como codones de inicio y terminación de la transcripción y traducción, que son específicas del tipo de huésped (por ejemplo, bacteria, hongo, planta o animal) en el que se introducirá el vector, como apropiado y teniendo en cuenta si el vector está basado en ADN o ARN. En algunos casos, el vector puede contener un promotor no nativo enlzado operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el TCR o la porción de unión al antígeno (u otra molécula de unión a péptidos). En algunos casos, el promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral, como un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV, y un promotor que se encuentra en la repetición terminal larga del virus de células madre murinas. También se contemplan otros promotores conocidos por un experto en la técnica.

En algunos casos, para generar un vector que codifica un TCR, las cadenas a y p pueden amplificarse por PCR a partir de ADNc total aislado de un clon de células T que expresa el TCR de interés y clonarse en un vector de expresión. En algunos casos, las cadenas a y p pueden generarse sintéticamente. En algunos casos, las cadenas a y p se clonan en el mismo vector. En algunos casos, las unidades de transcripción pueden modificarse como una unidad bicistrónica que contiene un IRES (sitio de entrada de ribosoma interno), que permite la coexpresión de productos génicos (por ejemplo, que codifican cadenas a y p) mediante un mensaje de un solo promotor. Alternativamente, en algunos casos, un solo promotor puede dirigir la expresión de un ARN que contiene, en un único marco de lectura abierto (ORF), múltiples genes (por ejemplo que codifican cadenas a y p) separados entre sí por secuencias que codifican un péptido de autoescisión (por ejemplo, una secuencia 2A) o un sitio de reconocimiento de proteasa (por ejemplo, furina). Por tanto, el ORF codifica un único polipéptido que, durante (en el caso de 2A) o después de la traducción, se procesa en las proteínas individuales. En algunos casos, el péptido, como T2A, puede hacer que el ribosoma omita (omisión de ribosoma) la síntesis de un enlace peptídico en el extremo C-terminal de un elemento 2A, lo que lleva a la separación entre el final de la secuencia 2A y el siguiente péptido en sentido descendente (ver, por ejemplo, de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) and deFelipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)). En la técnica se conocen muchos elementos 2A. Ejemplos de secuencias 2A que pueden usarse en los métodos y ácidos nucleicos divulgados en la presente, sin limitación, secuencias 2A del virus de la fiebre aftosa (F2A, por ejemplo, SEQ ID NO: 60), virus A de la rinitis equina (E2A, por ejemplo, SEQ ID NO: 59), el virus de Thosea asigna (T2A, por ejemplo, SEQ ID NO: 44 o 56) y el teschovirus-1 porcino (P2A, por ejemplo, S^eQ ID NO: 57 o 58) como se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 20070116690. En algunos casos, las cadenas a y p se clonan en diferentes vectores. En algunos casos, las cadenas a y p generadas se incorporan en un vector retroviral, por ejemplo, lentiviral.

En algunos casos, puede generarse u obtenerse una pluralidad, por ejemplo, una biblioteca, de TCR o fragmentos de unión a antígeno.

En algunos casos, pueden generarse bibliotecas de TCR mediante la amplificación del repertorio de Va y Vp a partir de células T aisladas de un sujeto, incluyendo las células presentes en las PBMC, el bazo u otro órgano linfoide. En algunos casos, las células T pueden amplificarse a partir de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). En algunos casos, las bibliotecas de TCR pueden generarse a partir de células CD4+ o CD8+. En algunos casos, los TCR pueden amplificarse a partir de una fuente de células T de un sujeto normal o sano, es decir, bibliotecas de TCR normales. En algunos casos, los TCR pueden amplificarse a partir de una fuente de células T de un sujeto enfermo, es decir, bibliotecas de TCR enfermas. En algunos casos, se usan cebadores degenerados para amplificar el repertorio de genes de Va y VP, como mediante RT-PCR en muestras, como células T, obtenidas de humanos. En algunos casos, las bibliotecas de scTv pueden ensamblarse a partir de bibliotecas Va y Vp vírgenes en las que los productos amplificados se clonan o ensamblan para ser separados por un conector. Dependiendo de la fuente del sujeto y las células, las bibliotecas pueden ser específicas de alelo HLA.

Alternativamente, en algunos casos, las bibliotecas de TCR pueden generarse mediante mutagénesis o diversificación de una molécula de TCR original o de andamiaje. Por ejemplo, en algunos aspectos, un sujeto, por ejemplo, un humano u otro mamífero como un roedor, puede vacunarse con un péptido, como un péptido identificado por los presentes métodos. En algunos casos, puede obtenerse una muestra del sujeto, como una muestra que contiene linfocitos sanguíneos. En algunos casos, las moléculas de unión, por ejemplo, TCR, pueden amplificarse fuera de la muestra, por ejemplo, células T contenidas en la muestra. En algunos casos, pueden seleccionarse células T específicas de antígeno, por ejemplo mediante selección para evaluar la actividad de CTL contra el péptido. En algunos aspectos, los TCR, por ejemplo, los presentes en las células T específicas de antígeno, pueden seleccionarse, por ejemplo, mediante la actividad de unión, por ejemplo, afinidad o avidez particular por el antígeno. En algunos aspectos, los TCR se someten a evolución dirigida, como por mutagénesis, por ejemplo, de la cadena a o p. En algunos aspectos, se alteran residuos particulares dentro de las CDR del TCR. En algunos casos, los TCR seleccionados pueden modificarse mediante maduración por afinidad. En algunos aspectos, un TCR seleccionado puede usarse como un TCR de andamiaje parental contra el antígeno.

En algunos casos, el sujeto es un humano, como un humano con cáncer, por ejemplo, melanoma. En algunos casos, el sujeto es un roedor, como un ratón. En algunos de tales casos, el ratón es un ratón transgénico, como un ratón que expresa moléculas de MHC (es decir, HLA) humanas, como HLA-A2. Ver Nicholson et. al, Adv Hematol. 2012; 2012: 404081.

En algunos casos, el sujeto es un ratón transgénico que expresa TCR humanos o es un ratón negativo al antígeno. Ver Li et. al, Nat Med. Septiembre de 2010; 16(9):1029-34; Obenaus et. al, Nat Biotechnol. abril 2015; 33(4):402-7. En algunos aspectos, el sujeto es un ratón transgénico que expresa moléculas HLA humanas y TCR humanos.

En algunos casos, como cuando el sujeto es un ratón HLA transgénico, los TCR identificados se modifican, por ejemplo, para que sean quiméricos o humanizados. En algunos aspectos, el andamiaje de TCR se modifica, de manera análoga a los métodos de humanización de anticuerpos conocidos.

En algunos casos, dicha molécula de andamiaje se usa para generar una biblioteca de TCR.

Por ejemplo, en algunos casos, la biblioteca incluye TCR o porciones de unión a antígeno de los mismos que se han modificado o manipulado en comparación con la molécula de TCR original o de andamiaje. En algunos casos, pueden usarse métodos de evolución dirigida para generar TCR con propiedades alteradas, como con mayor afinidad por un complejo MHC-péptido específico. En algunos casos, los enfoques de presentación implican manipular o modificar un TCR conocido, original o de referencia. Por ejemplo, en algunos casos, puede usarse un TCR de tipo salvaje como plantilla para producir TCR mutagenizados en los que en uno o más residuos de las CDR se mutan, y se seleccionan mutantes con una propiedad alterada deseada, como una mayor afinidad por un antígeno objetivo deseado. En algunos casos, la evolución dirigida se logra mediante métodos de presentación que incluyen, entre otros, presentación de levaduras (Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 97, 5387-92), presentación de fagos (Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54) o presentación de células T (Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84).

En algunos casos, las bibliotecas pueden ser solubles. En algunos casos, las bibliotecas son bibliotecas de presentación en las que el TCR se presenta en la superficie de un fago o célula, o unido a una partícula o molécula, como una célula, ribosoma o ácido nucleico, por ejemplo, ARN o ADN. Típicamente, las bibliotecas de TCR, incluyendo las bibliotecas de TCR normales y enfermos o las bibliotecas diversificadas, pueden generarse en cualquier forma, incluso como heterodímero o como forma de cadena sencilla. En algunos casos, uno o más miembros del TCR pueden ser un heterodímero de dos cadenas. En algunos casos, el emparejamiento de las cadenas Va y Vp puede promoverse mediante la introducción de un enlace disulfuro. En algunos casos, los miembros de la biblioteca de TCR pueden ser una cadena sencilla de TCR (scTv o ScTCR), que, en algunos casos, puede incluir una cadena Va y Vp separadas por un conector. Además, en algunos casos, tras el cribado y la selección de un TCR de la biblioteca, puede generarse el miembro seleccionado en cualquier forma, como un heterodímero de TCR de longitud completa o forma de cadena sencilla o como fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

2. Anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno

En aspectos de los métodos divulgados, la molécula de unión a péptidos es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que puede mostrar especificidad de unión para un epítopo de células T o un epítopo peptídico cuando se muestra o presenta en el contexto de una molécula de MHC, es decir, el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo puede ser un anticuerpo similar a TCR. En algunos casos, el anticuerpo o la porción de unión al anticuerpo del mismo es reactivo contra un complejo MHC-péptido específico, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede diferenciar el complejo específico MHC-péptido de la molécula MHC sola, el péptido específico solo y, en algunos casos, un complejo de MHC y un péptido irrelevante. En algunos casos, un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo puede mostrar una mayor afinidad de unión que un receptor de células T, incluyendo un TCR que puede mostrar especificidad de unión para el mismo complejo MHC-péptido.

El término "anticuerpo" en la presente se usa en el sentido más amplio e incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, incluyendo anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos funcionales (de unión a antígeno), incluyendo fragmentos de unión a antígeno de fragmento (Fab), fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rIgG), regiones de cadena pesada variable (V^h) capaces de unirse específicamente al antígeno, fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla, incluyendo fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) y fragmentos de anticuerpos de dominio único (por ejemplo, sdAb, sdFv, nanocuerpo). El término abarca formas de inmunoglobulinas modificadas genéticamente y/o de otro modo, como intracuerpos, pepticuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos heteroconjugados, multiespecíficos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos, di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem. A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término "anticuerpo" abarca fragmentos de anticuerpos funcionales del mismo. El término también abarca anticuerpos intactos o de longitud completa, incluyendo anticuerpos de cualquier clase o subclase, incluyendo IgG y subclases de las mismas, IgM, IgE, IgA e IgD.

En algunos casos, las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo pueden ser de longitud completa o pueden ser una porción de unión a antígeno (un Fab, F(ab')2, Fv o un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv)). En otros casos, la región constante de la cadena pesada del anticuerpo se elige entre, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE, particularmente se elige entre, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, más particularmente, IgG1 (por ejemplo, IgG1 humana). En otro caso, la región constante de la cadena ligera del anticuerpo se elige entre, por ejemplo, kappa o lambda, particularmente kappa.

Entre los anticuerpos divulgados se encuentran fragmentos de anticuerpos. Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; regiones de cadena pesada variable (V^h), moléculas de anticuerpos de cadena sencilla como scFv y anticuerpos únicos V^hde dominio único; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. En casos particulares, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla que comprenden una región de cadena pesada variable y/o una región de cadena ligera variable, como scFv.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena ligera o pesada de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (V^hy V^l, respectivamente) de un anticuerpo nativo tienen generalmente estructuras similares, cada dominio comprendiendo cuatro regiones marco conservadas (FR) y tres CDR. (Ver, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un solo dominio V^ho V^lpuede ser suficiente para conferir especificidad de unión al antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular pueden aislarse usando un dominio V^ho V^lde un anticuerpo que se une al antígeno para seleccionar una biblioteca de dominios V^lo V^hcomplementarios, respectivamente. Ver, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).

Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpos que comprenden todo o una parte del dominio variable de la cadena pesada o todo o una parte del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En ciertos casos, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano.

Los fragmentos de anticuerpos pueden elaborarse mediante varias técnicas, incluyendo digestión proteolítica de un anticuerpo intacto así como la producción por células huésped recombinantes. En algunos casos, los anticuerpos son fragmentos producidos de manera recombinante, como fragmentos que comprenden disposiciones que no se producen de manera natural, como aquellas con dos o más regiones de anticuerpos o cadenas unidas por conectores sintéticos, por ejemplo, conectores peptídicos, y/o que pueden no ser producidos por digestión enzimática de un anticuerpo intacto de origen natural. En algunos aspectos, los fragmentos de anticuerpos son scFv.

Un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo en el que todos o sustancialmente todos los residuos de aminoácidos de la CDR se derivan de CDR no humanas y todos o sustancialmente todos los residuos de aminoácidos de FR se derivan de FR humanas. Un anticuerpo humanizado puede incluir opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo no humano, se refiere a una variante del anticuerpo no humano que se ha sometido a humanización, típicamente para reducir la inmunogenicidad en humanos, a la vez que mantiene la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. En algunos casos, algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de CDR), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

En algunos casos, se genera una biblioteca de fragmentos de unión a antígenos o anticuerpos. En algunos aspectos, la biblioteca contiene un grupo diverso de polipéptidos, cada uno de los cuales incluye un dominio de inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio variable de inmunoglobulina.

En algunos casos, la biblioteca de anticuerpos contiene polipéptidos que incluyen un dominio VH y un dominio VL. La biblioteca puede incluir el anticuerpo como un fragmento Fab (por ejemplo, usando dos cadenas polipeptídicas) o un Fv de cadena sendilla (por ejemplo, usando una cadena polipeptídica sencilla). También pueden usarse otros formatos.

Como en el caso del Fab y otros formatos, el anticuerpo puede incluir una región constante como parte de una cadena ligera o pesada. En un caso, cada cadena incluye una región constante, por ejemplo, como en el caso de un Fab. En otros casos, se incluyen regiones constantes adicionales.

En algunos casos, puede generarse u obtenerse una pluralidad, por ejemplo, una biblioteca, de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno. En algunos casos, tales métodos se han usado para producir un anticuerpo similar a TCR o una porción de unión a antígeno (ver, por ejemplo, las Solicitudes Publicadas de Estados Unidos N° US 2002/0150914; US 2003/0223994; US 2004/0191260; US 2006/0034850; US 2007/00992530; US20090226474; US20090304679; y la publicación internacional de PCT N° WO 03/068201).

En algunos aspectos, las bibliotecas de anticuerpos se construyen a partir de ácido nucleico de genes de inmunoglobulina, incluyendo genes de inmunoglobulina de un sujeto normal (o sano) o un sujeto enfermo. En algunos casos, las moléculas de ácidos nucleicos pueden representar genes de inmunoglobulina de la línea germinal sin tratar. Los ácidos nucleicos generalmente incluyen ácidos nucleicos que codifican el dominio VH y/o VL. Las fuentes de ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas se describen a continuación. En algunos casos, las moléculas de ácidos nucleicos pueden obtenerse mediante amplificación, que puede incluir métodos de amplificación por PCR, por ejemplo, con cebadores que se aparean con la región constante conservada de un isotipo de IgG particular, por ejemplo, IgM, u otro método de amplificación (ver, por ejemplo, Zhu y Dimitrov (2009) Methods Mol Biol., 525:129; Hust et al. (2012) Methods in Molecular Biology, 907:85-107). En algunos casos, las moléculas de ácidos nucleicos pueden obtenerse mediante reordenación in silico de segmentos de la línea germinal conocidos que codifican cadenas VH y/o VL (ver, por ejemplo, la solicitud de PCT publicada N° W02010/054007). Generalmente, ya sea mediante enfoques de amplificación o in silico, pueden recombinarse una pluralidad de dominios VH con una pluralidad de dominios VL. En algunos casos, pueden obtenerse una gran cantidad de genes de VH y genes de VL de tal manera que el número de combinaciones posibles sea tal que la probabilidad de que algunas de las combinaciones recién formadas muestren actividad de unión específica a antígeno sea razonablemente alta, siempre que el tamaño final de la biblioteca sea lo suficientemente grande.

El ácido nucleico que codifica los dominios de inmunoglobulina puede obtenerse de las células inmunes de, por ejemplo, un humano, un primate, un ratón, un conejo, un camello o un roedor. Puede usarse cualquier célula como fuente para una biblioteca. En algunos casos, los genes de inmunoglobulina pueden obtenerse de linfocitos sanguíneos, médula ósea, bazo u otra fuente que contenga inmunoglobulinas. En algunos casos, la fuente de células para la biblioteca puede ser PBMC, esplenocitos o células de médula ósea. En algunos casos, los genes de inmunoglobulina se obtienen de células B. En un ejemplo, las células se seleccionan para una propiedad particular. Pueden seleccionarse células B en diversas etapas de madurez. En otro ejemplo, las células B no han ecibido tratamiento. En algunos casos, pueden usarse células T de un donante humano.

En algunos casos, las bibliotecas de anticuerpos pueden incluir genes de anticuerpos derivados de IgM, que generalmente representan genes de anticuerpos no inmunes o sin tratar, es decir, a veces denominadas biblioteca de anticuerpos sin tratar. Por ejemplo, en algunos casos, se han construido bibliotecas sin tratar de fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, mediante la clonación de los genes V reordenados del ARN de IgM de células B de donantes no inmunizados aislados de linfocitos de sangre periférica, médula ósea o células del bazo. (ver, por ejemplo, Griffiths et al., EMBO Journal, 12(2), 725-734, 1993, Marks et al., J. Mol. Biol., 222, 581-597, 1991). En algunos casos, las bibliotecas de anticuerpos pueden incluir genes de anticuerpos derivados de IgG, aunque las bibliotecas basadas en IgG típicamente están sesgadas hacia antígenos particulares.

En un caso, se usa clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para clasificar las células B que expresan moléculas de IgM, IgD o IgG unidas a la superficie. Además, pueden aislarse células B que expresan diferentes isotipos de IgG. En otro caso, la célula B o T se cultiva in vitro. Las células pueden estimularse in vitro, por ejemplo, cultivando con células alimentadoras o añadiendo mitógenos u otros reactivos moduladores, como anticuerpos contra CD40, ligando de CD40 o CD20, acetato de miristato de forbol, lipopolisacárido bacteriano, concanavalina A, fitohemaglutinina o mitógeno de hierba carmín.

En algunos casos, las células se aíslan de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno, por ejemplo, cáncer o un trastorno inmunológico. El sujeto puede ser un humano o un animal no humano, por ejemplo, un modelo animal para la enfermedad humana, o un animal que tiene un trastorno análogo. En algunos casos, la biblioteca de anticuerpos es una biblioteca inmune, por ejemplo una construida a partir de anticuerpos obtenidos de sujetos infectados o enfermos. En algunos casos, una biblioteca inmune puede contener miembros de anticuerpos que tienen una unión de mayor afinidad que la que puede obtenerse usando bibliotecas de anticuerpos sin tratar o bibliotecas de anticuerpos derivadas de sujetos normales o sanos.

En algunos casos, las células han activado un programa de hipermutación somática. Las células pueden estimularse para que experimenten mutagénesis somática de genes de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante tratamiento con anticuerpos anti-inmunoglobulina, anti-CD40 y anti-CD38 (ver, por ejemplo, Bergthorsdottir et al. (2001) J. Immunol. 166:2228). En otro caso, las células no han sido tratadas.

El ácido nucleico que codifica un dominio variable de inmunoglobulina puede aislarse de un repertorio natural mediante el siguiente método ejemplar. Primero, el ARN se aísla de la célula inmunitaria. Se separan los ARNm de longitud completa (es decir, encapsulados) (por ejemplo, degradando los ARN sin encapsular con fosfatasa intestinal de ternera). Luego, se quita la caperuza con pirofosfatasa ácida del tabaco y se usa transcripción inversa para producir los ADNc.

La transcripción inversa de la primera cadena (antisentido) puede realizarse de cualquier manera con cualquier cebador adecuado. Ver, por ejemplo, de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:18218-30. La región de unión al cebador puede ser constante entre diferentes inmunoglobulinas, por ejemplo, para realizar la transcripción inversa de diferentes isotipos de inmunoglobulina. La región de unión al cebador también puede ser específica para un isotipo particular de inmunoglobulina. Típicamente, el cebador es específico para una región que está en 3' de una secuencia que codifica por lo menos una CDR. En otro caso, pueden usarse cebadores poli-dT (por ejemplo, para los genes de cadena pesada).

Puede ligarse una secuencia sintética al extremo 3' de la cadena de transcripción inversa. La secuencia sintética puede usarse como un sitio de unión al cebador para la unión del cebador directo durante la amplificación por PCR después de la transcripción inversa. El uso de la secuencia sintética puede obviar la necesidad de usar un grupo de diferentes cebadores directos para capturar completamente la diversidad disponible.

Luego, se amplifica el gen que codifica el dominio variable, por ejemplo, usando una o más rondas. Si se usan múltiples rondas, pueden usarse cebadores anidados para aumentar la fidelidad. Luego, el ácido nucleico amplificado se clona en un vector de biblioteca.

Puede usarse cualquier método para amplificar secuencias de ácidos nucleicos para la amplificación. Pueden usarse métodos que maximicen y no sesguen la diversidad. Pueden usarse una variedad de técnicas para la amplificación de ácidos nucleicos. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Patentes de Estados Unidos N° 4.683.195 y 4.683.202, Saiki et al. (1985) Science 230, 1350-1354) utiliza ciclos de temperatura variable para impulsar rondas de síntesis de ácidos nucleicos. Los métodos basados en la transcripción utilizan la síntesis de ARN mediante ARN polimerasas para amplificar el ácido nucleico (Patente de Estados Unidos N° 6.066.457; Patente de Estados Unidos N° 6.132.997; Patente de Estados Unidos N° 5.716.785; Sarkar et al., Science (1989) 244: 331-34; Stofler et al., Science (1988) 239: 491). NASBA (Patentes de Estados Unidos N25.130.238; 5.409.818 y 5.554.517) utiliza ciclos de transcripción, transcripción inversa y degradación basada en RNasaH para amplificar una muestra de ADN. Otros métodos de amplificación más incluyen amplificación por círculo rodante (RCA; Patentes de Estados Unidos N° 5.854.033 y 6.143.495) y amplificación por desplazamiento de cadena (SDA; Patentes de Estados Unidos N25.455.166 y 5.624.825).

Las bibliotecas de anticuerpos pueden construirse mediante una serie de procesos (ver, por ejemplo, WO 00/70023). Además, los elementos de cada proceso pueden combinarse con los de otros procesos. Los procesos pueden usarse de manera que se introduzca una variación en un único dominio de inmunoglobulina (por ejemplo, VH o VL) o en múltiples dominios de inmunoglobulina (por ejemplo, VH y VL). La variación puede introducirse en un dominio variable de inmunoglobulina, por ejemplo, en la región de una o más de CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3 y FR4, refiriéndose a tales regiones de cualquiera y ambos dominios variables de cadena ligera y pesada. En un caso, se introduce variación en las tres CDR de un dominio variable dado. En otro caso, la variación se introduce en la CDR1 y la CDR2, por ejemplo, de un dominio variable de cadena pesada. Cualquier combinación es factible. En un proceso, las bibliotecas de anticuerpos se construyen insertando diversos oligonucleótidos que codifican las CDR en las regiones correspondientes del ácido nucleico. Los oligonucleótidos pueden sintetizarse usando nucleótidos monoméricos o trinucleótidos. Por ejemplo, Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol. 296:57-86 describe un método para construir oligonucleótidos que codifican CDR usando síntesis de trinucleótidos y una plantilla con sitios de restricción modificados para aceptar los oligonucleótidos.

En algunos casos, la biblioteca contiene ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. Las moléculas de ácidos nucleicos pueden generarse por separado, de tal manera que tras la expresión se forma un anticuerpo. Por ejemplo, pueden generarse moléculas nucleicas que codifiquen una cadena VH de un anticuerpo y/o pueden generarse moléculas de ácidos nucleicos que codifiquen una cadena VL de un anticuerpo. En algunos aspectos, tras la coexpresión de las moléculas de ácidos nucleicos en una célula, se genera un anticuerpo. Alternativamente, puede generarse una biblioteca de scFv en la que puede generarse una única molécula de ácido nucleico que codifica las cadenas VH y VL variantes de un anticuerpo, generalmente separadas por un conector.

En cualquiera de las bibliotecas de la presente, las moléculas de ácidos nucleicos también pueden contener además nucleótidos para la región bisagra y/o regiones constantes (por ejemplo, CL o CH1, CH2 y/o CH3) del anticuerpo. Además, las moléculas de ácidos nucleicos pueden incluir opcionalmente nucleótidos que codifican conectores peptídicos. Los métodos para generar y expresar anticuerpos se describen en la presente y pueden adaptarse para su uso en la generación de cualquier biblioteca de anticuerpos. Por tanto, las bibliotecas de anticuerpos pueden incluir miembros que sean anticuerpos de longitud completa o que sean fragmentos de anticuerpos de los mismos. En algunos casos, las bibliotecas de anticuerpos son bibliotecas de scFv. En algunos casos, las bibliotecas de anticuerpos son bibliotecas de Fab. Además, se entiende que tras el cribado y la selección de un anticuerpo de la biblioteca, el miembro seleccionado puede generarse en cualquier forma, como un anticuerpo de longitud completa o como un fragmento de anticuerpo.

B. Métodos de selección

En algunos casos, los métodos incluyen proporcionar una biblioteca de moléculas de unión candidatas, como una biblioteca de anticuerpos o una biblioteca de TCR, incluyendo cualquiera de las descritas anteriormente, y seleccionar la biblioteca para identificar un miembro que se une a un epítopo peptídico restringido por MHC-E (por ejemplo un complejo MHC-E-péptido), como se identifica usando los métodos divulgados. En algunos casos, el formato de la biblioteca puede ser una biblioteca de expresión, como una biblioteca de presentación.

En algunos casos, los métodos de selección dan como resultado la identificación o selección de una proteína, como una molécula de unión, por ejemplo, un TCR, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de una pluralidad de moléculas de unión candidatas, por ejemplo, una pluralidad de TCR, anticuerpos o porciones de los mismos, respectivamente, como una colección o biblioteca de tales moléculas, en base a la determinación de una actividad o propiedad indicativa de unión. En algunos casos, una actividad o propiedad indicativa de la unión puede incluir determinaciones cuantitativas y/o cualitativas de la unión en el sentido de obtener un valor absoluto para la unión y/o modulación de una actividad relacionada con la unión, y también de obtener un índice, proporción, porcentaje, valor visual o de otro tipo o medida del nivel de unión o actividad. La selección puede ser directa o indirecta.

En algunos casos, los métodos de selección implican poner en contacto a miembros de la pluralidad o biblioteca de moléculas de unión con un antígeno o ligando objetivo, por ejemplo, complejo o complejos de MHC-E-péptido, y evaluar una propiedad o actividad, por ejemplo, mediante ensayos que evalúan la unión directa (por ejemplo, afinidad de unión) a un ligando o antígeno objetivo. En algunos casos, los métodos de selección incluyen poner en contacto uno o más miembros de la biblioteca con un complejo MHC-péptido, lavar o eliminar moléculas de unión no unidas y detectar o identificar moléculas, como péptidos (por ejemplo, péptidos de un antígeno tumoral), que se unen al complejo MHC-péptido. En algunos casos, los miembros de la biblioteca pueden marcarse de manera detectable o pueden detectarse, facilitando de este modo la detección de aglutinantes. En otros casos, las moléculas de unión pueden identificarse mediante enriquecimiento y secuenciación posteriores de aglutinantes positivos.

En algunos casos, el ensayo de selección puede ser de alto rendimiento. Por ejemplo, en algunos casos, la selección puede realizarse evaluando la unión o la actividad de un gran número de moléculas, como generalmente decenas a cientos a miles a cientos de miles de moléculas. Los métodos de alto rendimiento pueden realizarse manualmente o pueden automatizarse, como mediante robótica o software.

En algunos casos, cada molécula de unión de la biblioteca puede seleccionarse individualmente y por separado para la unión a un complejo MHC-péptido. En algunos casos, la selección puede realizarse en una biblioteca direccionable. Puede emplearse cualquier tecnología de matriz direccionable conocida en la técnica para la selección de miembros de la biblioteca, incluyendo anticuerpos o TCR. Por ejemplo, las moléculas de unión candidatas pueden separarse físicamente entre sí, por ejemplo, formateando en una matriz espacial, como una placa o placas de múltiples pocillos, de tal manera que cada locus individual de la placa corresponda a un anticuerpo o TCR individual. Las placas de múltiples pocillos pueden incluir, pero no se limitan a, placas de 12 pocillos, 24 pocillos, 48 pocillos, 96 pocillos, placas de 384 pocillos y placas de 1536 pocillos. En algunos casos, se conoce la identidad de cada miembro en una posición de la matriz, por ejemplo, cada pocillo de la matriz. En algunos casos, puede haber un complejo MHC-péptido, ya sea soluble o expresado en células, por ejemplo añadido, a cada posición de la matriz, para permitir el contacto de miembros de la biblioteca con el antígeno o ligando objetivo.

En algunos casos, las moléculas de unión candidatas pueden agruparse y seleccionarse, por ejemplo, en un formato no direccionable. Ejemplos de tales otros formatos no direccionables incluyen por presentación, en particular, cualquier formato de presentación que facilite la selección de los miembros de las bibliotecas para una actividad o actividades, por ejemplo, la unión a un epítopo peptídico, como un complejo MHC-E-péptido que sea o soluble o esté expresado en células. En algunos casos, las bibliotecas se seleccionan usando una técnica de presentación en la que existe un vínculo físico entre las moléculas individuales de la biblioteca (fenotipo) y la información genética que las codifica (genotipo). En algunos casos, las moléculas de unión candidatas pueden proporcionarse como una biblioteca de presentación en la que cada miembro de proteína de la biblioteca está enlazado físicamente a su ácido nucleico (por ejemplo, ADNc) en una partícula definida, como un fago filamentoso, un ribosoma o una célula. Los métodos de biblioteca de presentación son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, presentación de células, presentación de fagos, presentación de ARNm, presentación de ribosomas y presentación de ADN.

En algunos casos, se evalúa la unión de una o más moléculas de unión, como una biblioteca de moléculas de unión candidatas, a un complejo MHC-E-péptido que contiene el epítopo de células T. En algunos casos, las células que expresan MHC en las que se ha transferido un antígeno, por ejemplo, mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico sintético que codifica el antígeno, pueden usarse para realizar un cribado directamente contra dichas bibliotecas para identificar una molécula o moléculas de unión que se unen a un epítopo restringido por MHCE del antígeno presentados en la superficie de las células en un MHC-E. Alternativamente, en casos en los que se conoce la identidad o secuencia del epítopo peptídico, como mediante la identificación del péptido usando los métodos divulgados, el péptido puede formar un complejo con una molécula de MHC-E que coincida con la restricción de péptido para generar un complejo estable de MHC-péptido usando cualquiera de los métodos libres de células o basados en células. En algunos casos, el complejo estable de MHC-péptido, que puede ser soluble o estar expresado en una célula, puede seleccionarse frente a dichas bibliotecas para identificar una molécula o moléculas de unión que se unen al complejo MHC-péptido.

En algunos casos, se realizan ensayos de selección para evaluar la unión a un epítopo peptídico particular, como un epítopo peptídico identificado usando cualquiera de los métodos descritos anteriormente. En algunos aspectos, el péptido se presenta de manera estable en el contexto de una molécula de MHC-E. En algunos casos, puede realizarse cualquiera de una serie de ensayos de unión a péptidos de MHC, como cualquiera de los descritos anteriormente, para confirmar o determinar la afinidad de unión del péptido por la molécula de MHC-E.

Los métodos para preparar o generar complejos MHC-péptido estables son bien conocidos en la técnica. Para evaluar la unión, el complejo MHC-péptido puede, en algunos casos, unirse a un soporte sólido, expresarse a partir de una célula, expresarse en forma soluble o proporcionarse de otro modo de una manera en la que pueda evaluarse la unión al mismo. En algunos casos, el componente de MHC del complejo puede etiquetarse y expresarse de manera recombinante. En algunos casos, el MHC recombinante se reconstituye con el péptido, por ejemplo, que se produce sintéticamente. En algunos casos, el complejo MHC-péptido se une a un soporte, por ejemplo, a perlas paramagnéticas u otra partícula magnéticamente sensible.

En algunos casos, puede prepararse y purificarse una molécula de MHC, y luego estas proteínas pueden desnaturalizarse y replegarse in vitro en presencia del epítopo peptídico particular del complejo MHC-péptido. En algunos casos, la purificación bacteriana y el replegamiento mejoran la homogeneidad del complejo MHC-péptido. En algunos casos, el péptido particular de interés que se incorpora in vitro en el complejo no tiene que competir con un gran número de péptidos celulares para unirse al complejo MHC y, por ejemplo, da como resultado un objetivo homogénea para la unión contra la biblioteca de presentación. En algunos casos, este complejo purificado puede cribarse contra la biblioteca de presentación para identificar los miembros de la biblioteca que se unen al complejo MHC-péptido. En algunos casos, la expresión puede estar en un sistema bacteriano, por lo que las moléculas de MHC pueden purificarse a partir de cuerpos de inclusión. Para las moléculas de MHC de clase I, incluyendo las moléculas de MHC-E no clásicas, también puede prepararse y purificarse p2-microglobulina para el replegamiento del complejo. En algunos casos, la cadena a y la p2-microglobulina pueden enlazarse covalentemente, como mediante un conector de aproximadamente 15 aminoácidos, por ejemplo, como se describe en Denkberg y Reiter (2000) Eur. J Immunol. 30:3522-32. En algunos casos, una de las cadenas, como la cadena a, puede incluir un asa de purificación como la secuencia BirA que está biotinilada o la etiqueta de hexa-histidina. En algunos casos, este complejo purificado puede cribarse contra la biblioteca de presentación para identificar miembros de la biblioteca que se unen al complejo MHC-péptido.

En algunos casos, el complejo MHC puede expresarse en la superficie de una célula. En algunos casos, las células se transfectan con un ácido nucleico que expresa una proteína de MHC que tiene un alelo que coincide con la restricción del péptido de interés y las células transfectadas se cargan con el péptido. En algunos casos, las células de interés que expresan el complejo MHC-péptido se unen a un soporte. En algunos casos, el complejo MHC-péptido expresado en células puede cribarse contra la biblioteca de presentación para identificar miembros de la biblioteca que se unen al complejo MHC-péptido.

En algunos casos, los métodos de selección proporcionados en la presente, como los métodos de selección de bibliotecas de presentación, pueden incluir un proceso de selección o cribado que descarta los miembros de la biblioteca que se unen a una molécula no objetivo. Los ejemplos de moléculas no objetivo pueden incluir un epítopo peptídico que no está unido a un MHC, un MHC que no está unido por un péptido, un MHC que está unido por un péptido que difiere del péptido de interés y/o un MHC que está unido por el péptido de interés, pero tiene un alelo diferente del MHC de interés. Puede usarse un cribado de selección negativa. Por ejemplo, en algunos casos, puede usarse un paso de selección negativa para discriminar entre el complejo MHC-péptido objetivo y una molécula no objetivo relacionada o moléculas no objetivo. En algunos casos, la biblioteca, por ejemplo, TCR o biblioteca de anticuerpos, como una biblioteca de presentación, puede ponerse en contacto con la molécula no objetivo. Los miembros de la muestra que no se unen al no objetivo pueden recogerse y usarse en selecciones o cribados posteriores para unirse al complejo MHC-péptido objetivo y/o incluso para selecciones negativas posteriores. El paso de selección negativa puede ser anterior o posterior a los miembros de la biblioteca de selección que se unen al complejo MHC-péptido objetivo.

En algunos casos, una colección o biblioteca, como una biblioteca de presentación, puede ponerse en contacto con el complejo MHC-péptido objetivo, ya sea en forma soluble o unida a células. En algunos casos, se aíslan y caracterizan los miembros de la biblioteca que se unen al complejo MHC-péptido objetivo, como los que se unen a las células.

1. Bibliotecas de presentación

En algunos casos, el método incluye poner en contacto a miembros de una biblioteca diversa en la que una pluralidad de TCR diversos o moléculas de unión a anticuerpos se muestran en la superficie con un complejo MHC péptido no canónico, detectando la unión entre los miembros de la biblioteca y dicho complejo péptido-MHC dado, aislar un miembro de la biblioteca detectado que se une al complejo péptido-MHC dado y, opcionalmente, multiplicar el miembro de la biblioteca aislado en un proceso de amplificación. En algunos casos, el método se realiza poniendo en contacto una pluralidad de TCR o moléculas de unión a similares a anticuerpos con un complejo péptido-MHC de interés.

En algunos casos, se usa una biblioteca de presentación para identificar moléculas de unión que se unen al complejo MHC-péptido y reconocen la fracción peptídica del complejo. En algunos casos, una biblioteca de presentación es una colección de moléculas de unión, como una biblioteca de TCR o porciones de unión a antígeno o una biblioteca de anticuerpos o porciones de unión a antígeno. En algunos casos, en una selección, se sondea una molécula de unión con el complejo MHC-péptido y si la molécula de unión se une al complejo MHC-péptido, se identifica el miembro de la biblioteca de presentación, típicamente mediante retención en un soporte.

En algunos casos, los miembros de la biblioteca de presentación retenidos se recuperan del soporte y se analizan. En algunos casos, el análisis puede incluir amplificación y una selección posterior en condiciones similares o diferentes. Por ejemplo, en algunos casos, pueden alternarse selecciones positivas y negativas. En algunos casos, el análisis también puede incluir la determinación de la secuencia de aminoácidos de la molécula de unión y la purificación de la molécula de unión, por ejemplo, para una caracterización detallada.

Puede usarse una variedad de formatos para las bibliotecas de presentación. Los ejemplos incluyen los siguientes.

a. Presentación de fagos

En algunos casos, se usa una biblioteca de presentación de fagos, como una biblioteca que utiliza virus, como bacteriófagos. En algunos casos, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo o un TCR o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une potencialmente a un complejo MHC-péptido puede producirse empleando bibliotecas de anticuerpos de fagos. La presentación de fagos es un método ampliamente usado para seleccionar bibliotecas de moléculas de unión potenciales por su capacidad para unirse a un antígeno particular. Generalmente, la presentación de fagos es un método basado en células en el que las proteínas o péptidos se expresan individualmente en la superficie del fago como fusiones a una proteína de la cubierta, mientras que la misma partícula de fago lleva el ADN que codifica la proteína o péptido (Smith, G.P. (1985) Science 228:1315-1317). En algunos casos, la selección del fago se logra mediante una reacción de unión específica que implica el reconocimiento de la proteína o péptido, lo que permite aislar y clonar el fago particular y recuperar y propagar o expresar el ADN para la proteína o péptido. En algunos casos, las bibliotecas de fagos se criban contra un antígeno objetivo de interés, como un antígeno soluble, un antígeno inmovilizado o un antígeno expresado en células.

En algunos casos que emplean la presentación en fagos, la proteína de interés se fusiona al extremo N-terminal de una proteína de cubierta viral (Scott y Smith (1990) Science, 249, 386-90). En algunos de tales casos, la molécula de unión se enlaza covalentemente a una proteína de la cubierta del bacteriófago. En algunos casos, el enlace resulta de la traducción de un ácido nucleico que codifica la molécula de unión fusionada a la proteína de la cubierta. En algunos casos, el enlace puede incluir un conector de péptido flexible, un sitio de proteasa o un aminoácido incorporado como resultado de la supresión de un codón de terminación. La presentación de fagos se describe, por ejemplo, en Ladner et al, Patente de Estados Unidos N° 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) JMol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard pt al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Rebar et al (1996) Methods Enzymol 267:129-49; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; y Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982.

Se han desarrollado sistemas de presentación de fagos para fagos filamentosos (fagos fl, fd y M13) así como para otros bacteriófagos (por ejemplo, bacteriófago T7 y fagos lambdoides; ver, por ejemplo, Santini (1998) J. Mol. Biol 282:125-135; Rosenberg et al. (1996) Innovations 6:1-6; Houshmet et al. (1999) Anal Biochem 268:363-370). En algunos casos, los sistemas de presentación de fagos filamentosos usan fusiones con una proteína de la cubierta menor, como la proteína del gen III, y la proteína del gen VIII, una proteína de la cubierta principal, pero también pueden usarse fusiones con otras proteínas de la cubierta, como la proteína del gen VI, la proteína del gen VII, la proteína del gen IX, o dominios de los mismos (ver, por ejemplo WO 00/71694). En algunos casos, la fusión es con un dominio de la proteína del gen III, por ejemplo, el dominio de anclaje o "muñón" (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.658.727 para una descripción del dominio de anclaje de la proteína del gen III).

En algunos casos, el bacteriófago que presenta la molécula de unión puede cultivarse y recogerse usando métodos estándar de preparación de fagos, por ejemplo, precipitación con PEG a partir de medios de crecimiento.

En algunos casos, después de la selección de fagos de presentación individuales, se identifica el ácido nucleico que codifica la molécula de unión seleccionada, por ejemplo, infectando células usando los fagos seleccionados. En algunos casos, pueden seleccionarse colonias o placas individuales, y el ácido nucleico puede aislarse y secuenciarse.

En algunos casos, pueden usarse bibliotecas de anticuerpos expresadas principalmente en fagos filamentosos. En algunos aspectos, los genes de inmunoglobulina pueden obtenerse como se ha descrito anteriormente para la generación de bibliotecas. En algunos aspectos, la materia prima para estas bibliotecas es ARNm de células B derivadas de humanos o animales de laboratorio inmunes. En algunos casos, los grupos de genes de VH y VL se amplifican mediante RT-PCR por separado, cada uno con un conjunto específico de cebadores. Los genes resultantes que codifican las cadenas de VH y VL pueden, en algunos aspectos, mezclarse aleatoriamente y clonarse en vectores, que pueden impulsar su expresión en fagos como scFv o como fragmentos Fab. De esta manera, pueden formarse y presentarse repertorios grandes de anticuerpos en la superficie del fago filamentoso.

Las bibliotecas de anticuerpos ejemplares incluyen las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 5.969.108, que describe bibliotecas de a Dn que codifican cadenas respectivas de miembros de pares de unión específicos multiméricos, como las cadenas VH y VL de un anticuerpo, en las que dichos miembros de pares de unión se presentan de manera funcional en la superficie de un paquete de presentación genética recombinante secretado que contiene ADN que codifica dicho miembro del par de unión o un componente polipeptídico del mismo, en virtud de que el miembro del par de unión específico o un polipéptido del mismo se expresa como una fusión con un componente de la cápside del paquete de presentación genética recombinante. Los miembros del anticuerpo se obtienen por tanto con las diferentes cadenas de los mismos expresadas, una fusionada al componente de la cápside y la otra en forma libre para su asociación con el polipéptido compañero de fusión. La compactación en un fagémido como un vector de expresión produce bibliotecas de anticuerpos que se dice que tienen una diversidad mucho mayor en las cadenas VL y VH del anticuerpo que con los métodos convencionales. Las bibliotecas de anticuerpos ejemplares también incluyen las descritas en las Patentes de Estados Unidos N° 5.498.531 y 5.780.272, que describen métodos combinatorios in vitro mediados por intrones para generar una población variada de ácidos ribonucleicos que codifican productos génicos quiméricos que comprenden mezclar un conjunto variado de constructos de corte y empalme en condiciones de corte y empalme trans. En algunos casos, tales métodos pueden usarse para generar diversas bibliotecas de anticuerpos.

En algunos casos, pueden generarse bibliotecas de presentación en fagos de Fab mutante, scFV u otras formas de anticuerpos, por ejemplo, en las que los miembros de la biblioteca están mutados en uno o más residuos de una CDR o las CDR. En la técnica se conocen ejemplos de tales métodos (ver, por ejemplo, la solicitud publicada de los Estados Unidos N2 US20020150914, US2014/0294841; y Cohen CJ. et al. (2003) J Mol. Recogn. 16:324-332).

También pueden emplearse bibliotecas de presentación de fagos para la presentación y selección de TCR o porciones de unión al antígeno de los mismos. En algunos casos, se han modificado varios TCR para una mayor afinidad usando tales métodos (Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54; Sami et al. (2007) Protein Eng Des Sel, 20, 397-403; Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med, 14, 1390-5). En algunos casos, la presentación de fagos de TCR puede implicar la introducción de un enlace disulfuro no nativo entre los dos dominios C para promover el emparejamiento de las cadenas a y p. En algunos casos, los sistemas para la presentación en fagos de TCR usan proteínas heterodiméricas de longitud completa (VaCa/VpCp).

B. Presentación de células

En algunos casos, la biblioteca es una biblioteca de presentación de células. Por tanto, en algunos casos, las moléculas de unión se presentan en la superficie de una célula. En algunos casos, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo o un TCR o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une potencialmente a un complejo MHC-péptido puede producirse empleando bibliotecas de presentación de células. La presentación de células es un método ampliamente usado para seleccionar bibliotecas de moléculas de unión potenciales por su capacidad para unirse a un antígeno particular. Generalmente, la presentación de células es un método basado en células en el que las proteínas o péptidos se expresan individualmente en la superficie de una célula. La selección de las células se logra mediante una reacción de unión específica que implica el reconocimiento de la proteína o péptido, permitiendo aislar y clonar las células particulares y recuperar y propagar o expresar la proteína o péptido. En algunos casos, las bibliotecas de presentación de células se criban contra un antígeno objetivo de interés, como un antígeno soluble, un antígeno inmovilizado o un antígeno expresado en células.

En algunos casos, la célula es, por ejemplo, una célula eucariota o procariota. Las células procariotas ejemplares incluyen células de E. coli, células de B. subtilis o esporas. Las células eucariotas ejemplares incluyen levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Hanseula o Pichia pastoris). La presentación de la superficie de la levadura se describe, por ejemplo, en Boder y Wittrup (1997) Nat. Biotechnol.

15:553-557. La Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° de serie 60/326.320, presentada el 1 de octubre de 2001, describe un sistema de presentación de levaduras que puede usarse para presentar proteínas de inmunoglobulina como fragmentos Fab.

En algunos casos, los ácidos nucleicos que codifican dominios variables de inmunoglobulina se clonan en un vector para presentación en levaduras. En algunos casos, la clonación une el ácido nucleico que codifica por lo menos uno de los dominios variables con el ácido nucleico que codifica un fragmento de una proteína de la superficie de la célula de levadura, por ejemplo, Flol, a-aglutinina, a-aglutinina o fragmentos derivados de los mismos, como Aga2p, Agalp. En algunos casos, un dominio de estas proteínas puede anclar el polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico diversificada mediante un anclaje de GPI (por ejemplo, a-aglutinina, aaglutinina o fragmentos derivados de las mismas, como Aga2p, Agalp), o mediante un dominio transmembrana (por ejemplo, Flol). En algunos casos, el vector puede configurarse para expresar dos cadenas polipeptídicas en la superficie celular de tal manera que una de las cadenas esté enlazada a la proteína de la superficie celular de levadura. Por ejemplo, las dos cadenas pueden ser cadenas de inmunoglobulina.

En algunos casos, las moléculas de unión a péptidos, por ejemplo, TCR, se generan y presentan en un sistema de presentación de levaduras, por ejemplo, como se describe en la US20150191524. Por ejemplo, la presentación de levaduras puede permitir que la proteína de interés se exprese en la superficie como una fusión de Aga2 (Boder y Wittrup (1997) Nat. Biotech., 15, 553-557; Boder y Wittrup (2000) Methods Enzymol, 328, 430-44). En el sistema de presentación de levaduras, el TCR puede mostrarse como una proteína de cadena sencilla estabilizada, en formas Vp-conector-Va o Va-conector-Vp (Aggen et al. (2011) Protein Engineering, Design, & Selection, 24, 361-72; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 97, 5387-92; Kieke et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA, 96, 5651-6; Richman et al. (2009) Mol Immunol, 46, 902-16; Weber et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA, 102, 19033-8), o como un heterodímero de dos cadenas (Aggen et al. (2011) Protein Engineering, Design, & Selection, 24, 361-72; Richman et al. (2009) Mol Immunol, 46, 902-16). En algunos casos, los fragmentos de VaVp de cadena sencilla de TCR humano (denominados scTv o scTCR) pueden desarrollarse aprovechando la estabilidad de la región Va humana denominada Va2 (Aggen et al. (2011) Protein Engineering, Design, & Selection, 24, 361 -72). En algunos casos, pueden usarse receptores de células T de alta afinidad, diseñados in vitro en un formato de cadena sencilla para aislar fragmentos de scTv estabilizados humanos (Vp-conector-Va), que pueden expresarse como proteínas estables, tanto en la superficie de levadura como en forma soluble de E. coli.

En algunos casos, pueden expresarse bibliotecas de anticuerpos o TCR para la selección en las superficies de las células, incluyendo las bacterias E. coli, la levadura S. cerevisiaey células de mamífero, fusionándolas con una proteína que se expresa en la superficie de la célula. En algunos casos, la presentación de células puede usarse para seleccionar bibliotecas de anticuerpos o TCR en las que la inmovilización del antígeno objetivo es innecesaria. En otros casos, pueden usarse tecnologías como la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para identificar los anticuerpos deseados. Generalmente, la FACS permite la separación de subpoblaciones de células en base a sus propiedades de dispersión de luz a medida que pasan a través de un rayo láser. Ver, por ejemplo, las solicitudes de Patente publicadas N° US 2003/0100023 y uS 2003/0036092. Los anticuerpos de cadena sencilla o los TCR pueden expresarse en la superficie externa de E. coli fusionándolos con una proteína que ha mostrado anteriormente dirigir proteínas heterólogas a la superficie bacteriana (Francisco et al, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 90: 10444-10448). Los anticuerpos de cadena sencilla y Fab y los TCR de cadena sencilla pueden presentarse en la superficie de una célula de levadura, y puede explotarse la recombinación homóloga en levadura para generar bibliotecas de transformantes (ver, por ejemplo, Kieke et al, (1997) Prot. Eng., 10:1303-1310; Weaver-Feldhaus et al, (2004) FEBS Lett., 564:24-34; y Swers et al, (2004) Nucleic Acids Res., 32:e36). En algunos casos, puede utilizarse la presentación en células de mamíferos para seleccionar bibliotecas de scFv así como IgG (Ho et al, (2005) J. Biol. Chem., 280:07-617).

En algunos casos, la presentación de células de mamíferos se usa para la modificación de TCR (Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84; Kessels et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 97, 14578-83). En algunos casos, este sistema usa un vector retroviral para introducir las cadenas a y p de TCR en un hibridoma de células T negativo para TCR. En el sistema de presentación de células de mamíferos, los TCR introducidos pueden expresarse en la superficie en su conformación nativa, formando complejos con subunidades de CD3, en algunos aspectos permitiendo una célula T completamente funcional (señalización competente). En algunos casos, pueden modificarse los TCR heterodiméricos de longitud completa en su huésped nativo usando este método.

C. Presentación libre de células

En algunos casos, la biblioteca es una biblioteca de presentación libre de células. Por tanto, en algunos casos, las moléculas de unión se presentan unidas a un ribosoma o ácido nucleico, por ejemplo, ADN o ARN. En algunos casos, puede producirse una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une potencialmente a un complejo MHC-péptido, empleando bibliotecas de presentación libres de células. La presentación libre de células es un método ampliamente usado para seleccionar bibliotecas de moléculas de unión potenciales por su capacidad para unirse a un antígeno particular. Generalmente, la presentación libre de células es un método libre de células en el que las proteínas o péptidos se expresan individualmente unidos a un ribosoma o ácido nucleico, por ejemplo, ADN o ARN. La selección de las moléculas de unión se logra mediante una reacción de unión específica que implica el reconocimiento de la proteína o péptido, permitiendo aislar las moléculas de unión particulares y recuperar y propagar o expresar la proteína o el péptido. En algunos casos, las bibliotecas de presentación libres células se criban contra un antígeno objetivo de interés, como un antígeno soluble, un antígeno inmovilizado o un antígeno expresado en células.

Pueden emplearse métodos de generación de bibliotecas conocidos en la técnica para crear bibliotecas adecuadas para su uso con los métodos descritos en la presente. Algunos métodos para la generación de bibliotecas se describen en las Patentes de Estados Unidos N° 6.258.558 y 6.261.804; Szostak et al., WO989/31700; Roberts y Szostak (1997)94:12297-12302; Patente de Estados Unidos N° 6.385.581, WO 00/32823, Patentes de Estados Unidos N2 6.361.943; 7.416.847; 6.258.558; 6.214.553; 6.281.344; 6.518.018; 6.416.950; 7.195.880; 6.429.300. 9.134.304, y en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US 20140113831, que se incorporan en la presente como referencia.

En algunos casos, la biblioteca de presentación es una biblioteca de presentación de ribosomas. En algunos casos, el uso de presentación de ribosomas permite la construcción in vitro de moléculas de unión, por ejemplo, bibliotecas de anticuerpos. Alternativamente, en algunos aspectos, la presentación de ribosomas puede implicar la presentación de proteínas o péptidos en forma naciente en la superficie de los ribosomas, de tal manera que se forma un complejo estable con el ARNm codificante; los complejos pueden seleccionarse con un ligando para la proteína o péptido y la información genética se obtiene mediante transcripción inversa del ARNm aislado (ver, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.643.768 y 5.658.754). En algunos aspectos, las técnicas de selección son similares a las de la presentación de fagos en las que las bibliotecas de presentación de ribosomas se criban contra un antígeno inmovilizado.

En algunos casos, puede utilizarse una interacción biotina-estreptavidina. En algunos aspectos, como la presentación de ADN covalente, una proteína del bacteriófago P2 fusionada genéticamente a un fragmento de anticuerpo puede unirse a su propia secuencia de ADN (Reiersen et al. (2005) Nucl. Acids Res. 33:eI0). Alternativamente, el ADN y el péptido pueden compartimentarse, como en una emulsión de aceite en agua. En algunos casos, las técnicas de selección son similares a las de la presentación de fagos en las que las bibliotecas de presentación de ADN se criban contra un antígeno inmovilizado. Ver, por ejemplo, la Publicación de Patente Internacional N° WO 98/037186.

En algunos casos, se usa una biblioteca de fusión de péptido-ácido nucleico. Una biblioteca de péptidoácido nucleico puede incluir bibliotecas de presentación de ADN y de presentación de ARNm.

En algunos aspectos, cuando se emplea la presentación de ADN, el ADN que codifica el péptido se enlaza al péptido. En algunos casos, puede emplearse la presentación de ADN no covalente, en la que el enlace ADN-proteína se promueve mediante el reconocimiento de la proteína RepA bacteriana, así como su propio origen de secuencia de replicación integrado en el ADN plantilla (Odegrip et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 101:2806-2810).

En algunos casos, la biblioteca se genera y/o se selecciona como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 9.134.304 o la US20140113831. En algunos casos, pueden generarse fusiones de polipéptido-ácido nucleico mediante la traducción in vitro de ARNm que incluye un grupo puromicina unido covalentemente, por ejemplo, como se describe en Roberts y Szostak (1997) Proc Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302 y la Patente de Estados Unidos N° 6.207.446. En algunos casos, el ARNm puede luego transcribirse de manera inversa en ADN y reticularse con el polipéptido.

En algunos casos, los constructos de ácidos nucleicos de la biblioteca contienen el promotor T7. En algunos aspectos, los ácidos nucleicos en la biblioteca pueden manipularse por cualquier medio conocido en la técnica para añadir promotores, potenciadores, espaciadores o etiquetas apropiados que sean útiles para la producción, selección o purificación del ácido nucleico o su producto de traducción. Por ejemplo, en algunos casos, las secuencias de la biblioteca pueden incluir un potenciador de TMV, secuencias que codifican una etiqueta FLAG, una secuencia de extensión de estreptavidina o una secuencia o señal de poliadenilación. En algunos casos, las secuencias de la biblioteca de ácidos nucleicos pueden incluir además una etiqueta de fuente única para identificar la fuente de la secuencia de ARN o ADN. En algunos casos, las secuencias de la biblioteca de ácidos nucleicos pueden incluir una etiqueta de grupo. Una etiqueta de grupo puede usarse para identificar las secuencias seleccionadas durante una ronda particular de selección. En algunos aspectos, esto puede permitir, por ejemplo, que las secuencias de múltiples rondas de selección se agrupen y secuencien en una única serie sin perder la pista de la ronda de selección de la que se originaron.

En algunos casos, el uso de bibliotecas de presentación de ácidos nucleicos, como bibliotecas de presentación de ARNm, permite la construcción in vitro de bibliotecas de moléculas de unión candidatas, incluyendo bibliotecas de anticuerpos. En algunos aspectos, la presentación de ARNm permite la presentación de proteínas o péptidos en los que se hace que la proteína naciente se una covalentemente a su ARNm a través de un enlace de puromicina (Roberts et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 64:12297-12302). La puromicina actúa típicamente como un imitador del ARNt de aminoacilo, entra en el sitio del ribosoma A y la proteína naciente se une covalentemente a él por la actividad de peptidil-transferasa del ribosoma. En algunos casos, la selección se lleva a cabo en estas fusiones de proteína-ARNm después de la disociación del ribosoma. En algunos aspectos, las técnicas de selección son similares a las de la presentación de fagos en donde las bibliotecas de presentación de ARNm se criban contra un antígeno inmovilizado

En algunos casos, la biblioteca de ADN de cadena doble se transcribe in vitro y se asocia a un aceptor de péptidos, como puromicina. En un caso, se aparea luego un conector (por ejemplo, un conector de unión a biotina) unido a un ligando de alta afinidad (por ejemplo, biotina). En algunos casos, el conector está foto-reticulado con el ARNm. En casos particulares, se carga luego un aceptor de ligando, por ejemplo, estreptavidina. En casos adicionales, un segundo ligando de alta afinidad que está unido a un aceptor de péptidos se une a la estreptavidina. En algunos casos, el segundo aceptor de péptido/ligando de alta afinidad es un conector de biotina-puromicina, por ejemplo, BPP.

En algunos casos, puede llevarse a cabo la traducción in vitro en donde el aceptor de péptidos reacciona con el producto de traducción naciente.

En algunos casos, el resultado, después de la purificación, es una biblioteca de complejos péptido-ácido nucleico. Luego, tales complejos pueden someterse a una transcripción inversa después, en algunos casos, de ser purificados. Los complejos pueden purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad, cromatografía en columna, centrifugación en gradiente de densidad, captura de etiquetas de afinidad, etc. En un caso, se emplea una purificación de oligo-dT celulosa en donde se ha diseñado el complejo para incluir un ARNm con una cola poli-A. En tales casos, oligo-dT se une covalentemente a la celulosa en la columna o dispositivo de purificación. En algunos casos, el oligo-dT participa en el apareamiento de bases complementarias con la cola poli-A del ARNm en el complejo, lo que impide su avance a través del dispositivo de purificación. En algunos aspectos, el complejo puede eluirse con agua o tampón.

En algunos casos, la transcripción inversa genera un híbrido de ADNc/ARN que, en algunos aspectos, está enlazado no covalentemente con el péptido transcrito a través de la asociación con el conector, el ligando de alta afinidad, el aceptor de ligandos, el aceptor de péptidos (posiblemente unido a un segundo ligando de alta afinidad), o alguna combinación operativa de los mismos.

En algunos casos, el complejo purificado resultante puede luego tratarse con ARNasa para degradar el ARNm restante, seguido de la síntesis de ADN de la segunda cadena para generar un ADNc completo. En algunos casos, los ácidos nucleicos en el conector NA pueden servir como cebador para la transcripción inversa. Por consiguiente, en algunos aspectos, el ADNc permanece unido al ligando de alta afinidad y parte del complejo.

En algunos casos, el complejo puede purificarse adicionalmente, por ejemplo, si el complejo está diseñado para contener una etiqueta. Puede usarse cualquier etiqueta conocida en la técnica para purificar el complejo. Por ejemplo, es posible usar una etiqueta FLAG, etiqueta myc, etiqueta de histidina (etiqueta His) o etiqueta HA, entre otras. En algunos casos, una secuencia que codifica una etiqueta FLAG se modifica en la secuencia de ADN original de tal manera que la proteína transcrita final contiene la etiqueta FLAG.

En algunos casos, el complejo resultante se selecciona luego usando cualquier método de selección conocido en la técnica. En algunos casos, se usa la selección por afinidad. Por ejemplo, el objetivo o antígeno de unión deseado (por ejemplo, complejo MHC-péptido) puede inmovilizarse sobre un soporte sólido para su uso en una columna de afinidad. Ejemplos de métodos útiles en cromatografía de afinidad se definen en las Patentes de Estados Unidos N24.431.546, 4.431.544, 4.385.991, 4.213.860, 4.175.182, 3.983.001, 5.043.062. La actividad de unión puede evaluarse mediante inmunoensayo estándar y/o cromatografía de afinidad. La selección de complejos para la función catalítica, por ejemplo, la función proteolítica puede lograrse usando un ensayo de placa de hemoglobina estándar como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 5.798.208. La evaluación de la unión de moléculas de unión candidatas (por ejemplo, Anticuerpos o TCR o porciones de unión a antígeno de los mismos) puede ensayarse in vitro usando, por ejemplo, Un instrumento Biacore, que mide las tasas de unión de un anticuerpo a un objetivo o antígeno dado. En algunos casos, el objetivo o antígeno (por ejemplo, complejo MHC-péptido) se expresa en una superficie celular, y el complejo de presentación de moléculas de unión candidatas se evalúa para la unión a la superficie celular. En algunos casos, el complejo de presentación primero se criba o selecciona frente a células que no expresan el objetivo o el antígeno (por ejemplo, complejo MHC-péptido), como para eliminar las moléculas de presentación que se unen a las células pero que no se unen al objetivo de interés, luego el resto del complejo de presentación de moléculas de unión candidatas se seleccionan frente a células que expresan el objetivo de interés (por ejemplo, complejo MHC-péptido), por ejemplo, para identificar aglutinantes específicos.

En algunos casos, los complejos seleccionados pueden identificarse mediante secuenciación del componente de ADN. Puede emplearse cualquier tecnología de secuenciación conocida en la técnica, por ejemplo, secuenciación 454, secuenciación de Sanger, secuenciación por síntesis o los métodos descritos en las Patentes de Estados Unidos 5.547.835, 5.171.534, 5.622.824, 5.674.743, 4.811.218, 5.846.727, 5.075.216, 5.405.746, 5.858.671,5.374.527, 5.409.811,5.707.804, 5.821.058, 6.087.095, 5.876.934, 6.258.533, 5.149.625.

En algunos casos, la selección puede realizarse varias veces para identificar aglutinantes de mayor afinidad y puede implementarse además con aglutinantes competitivos o condiciones de lavado más estrictas. Un experto en la técnica apreciará que pueden emplearse variantes del procedimiento descrito en la presente.

2. Métodos iterativos

En algunos casos, las bibliotecas de moléculas de unión a péptidos candidatas, incluyendo las bibliotecas de anticuerpos o porciones de unión a antígeno o bibliotecas de TCR o porciones de unión a antígeno, pueden seleccionarse para identificar moléculas de unión que se unen a un epítopo peptídico particular, como un complejo MHC-péptido, de acuerdo con los métodos divulgados. En casos relacionados, una molécula de unión particular (por ejemplo, anticuerpo o TCR o porción de unión a antígeno del mismo) identificada o seleccionada mediante tales métodos puede alterarse adicionalmente mediante maduración por afinidad o mutagénesis, produciendo de este modo una biblioteca de moléculas de unión relacionadas. En algunos casos, la biblioteca adicional o relacionada de moléculas de unión puede seleccionarse para la unión al mismo epítopo peptídico o uno similar, como el complejo MHC-péptido, para identificar moléculas de unión potenciales que se unen a el objetivo (por ejemplo complejo MHC-péptido) con mayor afinidad de unión. Puede usarse cualquier método para la generación de bibliotecas y la selección de objetivos conocidos en la técnica o descritos en la presente.

En algunos aspectos, los métodos pueden emplearse de manera iterativa. Por ejemplo, el ácido nucleico o la proteína seleccionados mediante uno de los métodos descritos en la presente pueden servir como base para la generación de una nueva biblioteca a partir de la cual el proceso puede comenzar de nuevo. Un ejemplo de tal esquema puede incluir en donde los productos de una ronda de selección se usan para regenerar una nueva biblioteca.

En algunos casos, la tecnología de biblioteca de presentación se usa en un modo iterativo. Se usa una primera biblioteca de presentación para identificar uno o más ligandos para un objetivo. Estos ligandos identificados luego se varían usando un método de mutagénesis para formar una segunda biblioteca de presentación. Luego, se seleccionan ligandos de mayor afinidad de la segunda biblioteca, por ejemplo, usando condiciones de unión y lavado más rigurosas o más competitivas.

En algunos casos, la mutagénesis se dirige a regiones que se sabe o que es probable que estén en la interfaz de unión. En algunos casos, la mutagénesis puede dirigirse a las regiones de CDR de las cadenas pesadas o ligeras del anticuerpo o de las cadenas alfa o beta del TCR. Además, la mutagénesis puede dirigirse a regiones marco cercanas o adyacentes a las CDR. En algunos casos, la mutagénesis puede dirigirse a una o algunas de las CDR, por ejemplo, para realizar mejoras precisas por pasos.

Algunas técnicas de mutagénesis ejemplares incluyen: PCR propensa a errores (Leung et al. (1989) Technique 1:11-15), recombinación, redistribución de ADN mediante escisión aleatoria (Stemmer (1994) Nature 389 391; denominado "redistribución de ácidos nucleicos"), RACHITT™ (Coco et al. (2001) Nature Biotech. 19:354), mutagénesis dirigida al sitio (Zooler et al. (1987) Nucl Acids Res 10:6487-6504), mutagénesis en casete (Reidhaar-Olson (1991) Methods Enzymol. 208: 564-586) e incorporación de oligonucleótidos degenerados (Griffiths et al. (1994) EMBO J. 13: 3245).

En un ejemplo de selección iterativa, los métodos descritos en la presente se utilizan para identificar primero una molécula de unión de una biblioteca de presentación que se une a un complejo MHC-péptido con por lo menos una actividad o especificidad de unión requerida para el ligando, que luego puede mejorarse con las iteraciones posteriores. En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula de unión identificada inicialmente puede usarse luego como un ácido nucleico plantilla para la introducción de variaciones, por ejemplo, para identificar un segundo ligando de proteína que tiene propiedades mejoradas (por ejemplo, afinidad de unión, cinética o estabilidad) con respecto a la molécula de unión inicial.

C. Selección de hibridomas

En algunos casos, puede usarse la tecnología de hibridomas para la generación de anticuerpos que se unen, como se unen específicamente, a un complejo MHC-péptido. En algunos casos, pueden emplearse ratones transgénicos, que contienen el repertorio de inmunoglobulinas humanas, permiten la maduración por afinidad in vivo y, en algunos casos, permiten la generación de anticuerpos humanos mediante la tecnología de hibridomas.

En algunos casos, puede producirse un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que se une potencialmente a un complejo MHC-péptido inmunizando un huésped, por ejemplo, un ratón, con una cantidad eficaz de un inmunógeno que contiene un complejo MHC-péptido específico. En algunos casos, el péptido del complejo MHC-péptido puede ser presentado por una molécula de MHC. En algunos casos, luego se administra una cantidad eficaz del inmunógeno a un huésped para provocar una respuesta inmune, en donde el inmunógeno retiene una forma tridimensional del mismo durante un período de tiempo suficiente para provocar una respuesta inmune contra la presentación tridimensional del péptido en la ranura de unión de la molécula de MHC. En algunos casos, puede recogerse suero del huésped y luego puede analizarse para determinar si se están produciendo los anticuerpos deseados que reconocen una presentación tridimensional del péptido en la ranura de unión de la molécula de MHC. En algunos casos, los anticuerpos producidos pueden evaluarse para confirmar que el anticuerpo puede diferenciar el complejo MHC-péptido de la molécula MHC sola, el péptido solo y un complejo de MHC y un péptido irrelevante. Luego pueden aislarse los anticuerpos deseados.

En algunos casos, un animal, por ejemplo, un roedor, se inmuniza con el complejo MHC-péptido que incluye un péptido específico, como un péptido identificado usando los métodos divulgados. En algunos casos, un animal, por ejemplo, un roedor, se inmuniza con una célula que presenta un péptido específico en su superficie unido al MHC, como una célula en la que se ha introducido un vector de CMV que codifica un antígeno heterólogo de acuerdo con los métodos divulgados. La célula puede tener un alelo particular de la proteína de MHC. El animal se refuerza opcionalmente con el antígeno (por ejemplo, complejo MHC-péptido) para estimular aún más la respuesta. En algunos aspectos, se aíslan células del bazo del animal y los ácidos nucleicos que codifican los dominios VH y/o VL se amplifican y clonan, por ejemplo, para la expresión en una biblioteca.

En algunos casos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se generan mediante la inmunización de ratones de laboratorio o cualquier otro roedor con el antígeno relevante y el aislamiento de esplenocitos, incluyendo las células B productoras de anticuerpos, que luego se inmortalizan mediante fusión con células de mieloma para producir hibridomas de células B. (Harlow y Lane, 1988). Generalmente, los hibridomas conservan la capacidad de las células B para sintetizar anticuerpos específicos de antígenos y pueden obtenerse grandes cantidades de productos. En algunos casos, esto produce anticuerpos de alta afinidad, que se generan y seleccionan in vivo mediante el proceso de maduración por afinidad en el curso de la respuesta inmune, antes del aislamiento de las células B. En algunos casos, pueden generarse líneas de ratones transgénicos que albergan porciones considerables de los loci génicos de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina humana, permitiendo por tanto la producción de hibridomas de células B murinas que secretan mAb completamente humanos (revisado por Bruggemann and Neuberger, 1996).

IV. Receptores recombinantes, receptores de antígenos quiméricos y células modificadas genéticamente Se divulgan receptores recombinantes que incluyen o contienen moléculas de unión (por ejemplo, moléculas de unión a péptidos) identificadas mediante los métodos divulgados. Tales moléculas de unión pueden incluir TCR, anticuerpos similares a TCR o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, así como otros receptores recombinantes que contienen una molécula de unión divulgada o fragmento de unión a antígeno de la misma. Por ejemplo, entre tales receptores recombinantes se encuentran los receptores quiméricos, incluyendo los receptores de antígenos funcionales que no son TCR, como los receptores de antígenos quiméricos (CAR), que contienen un anticuerpo similar al TCR divulgado o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos casos, los métodos incluyen la modificación genética de células, como para introducir en las células genes recombinantes (o transgenes) para la expresión de receptores recombinantes o receptores de antígenos transgénicos, incluyendo TCR y receptores de antígenos quiméricos transgénicos.

También se divulgan células, por ejemplo, células T CD4+ y/o CD8+, que expresan los receptores de antígenos recombinantes y usos de los mismos en terapia celular adoptiva, como el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con el antígeno.

A. Receptores recombinantes y receptores de antígenos quiméricos

La modificación generalmente incluye la introducción de un gen o genes para la expresión de un receptor de antígenos modificado genéticamente. Entre tales receptores recombinantes se encuentran los TCR modificados genéticamente y componentes de los mismos, y los receptores de antígenos en los que el anticuerpo o la porción de unión al antígeno del mismo se expresa en las células como parte de un receptor recombinante. Entre los receptores de antígenos se encuentran los receptores de antígenos funcionales que no son TCR, como los receptores de antígenos quiméricos (CAR). Generalmente, a un CAR que contiene un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que muestra una especificidad similar a TCR dirigida contra complejos péptido-MHC también hacerse referencia como CAR similar a TCR.

Los receptores de antígenos ejemplares, incluyendo los CAR, y los métodos para modificar e introducir tales receptores en las células, incluyen los descritos, por ejemplo, en las publicaciones de solicitud de patente internacional números WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, números de publicación de solicitud de patente de Estados Unidos US2002131960, US2013287748, US20130149337, Patentes de Estados Unidos N2 6.451.995, 7.446.190, 8.252.592, 8.339.645, 8.398.282, 7.446.179, 6.410.319, 7.070.995, 7.265.209, 7.354.762, 7.446.191, 8.324.353, y 8.479.118, y la solicitud de patente europea número EP2537416, y/o los descritos por Sadelain et al., Cancer Discov. abril de 2013; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., octubre de 2012; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, marzo de 2012 18(2): 160-75. En algunos aspectos, los receptores de antígeno incluyen un CAR como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 7.446.190, y los descritos en la publicación de solicitud de patente internacional N° WO/2014055668 A1. Los ejemplos de CAR incluyen los CAR como se divulga en cualquiera de las publicaciones mencionadas anteriormente, como lao WO2014031687, la US 8.339.645, Us 7.446.179, US 2013/0149337, Patente de Estados Unidos N° 7.446.190, Patente de Estados Unidos N° 8.389.282, por ejemplo, y en los que la parte de unión al antígeno, por ejemplo, scFv, se reemplaza por un anticuerpo, por ejemplo, como se divulga en la presente.

En algunos casos, los CAR generalmente incluyen un dominio de unión a antígeno (o ligando) extracelular de un anticuerpo similar a TCR, incluyendo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo específico para un complejo MHC-péptido, enlazado a uno o más componentes de señalización intracelular, en algunos aspectos a través de conectores y/o dominios transmembrana. En algunos casos, tales moléculas pueden imitar o aproximarse típicamente a una señal a través de un receptor de antígeno natural, como un TCR, y, opcionalmente, una señal a través de dicho receptor en combinación con un receptor coestimulador.

En algunos casos, el CAR incluye típicamente en su porción extracelular una o más moléculas de unión a antígeno, como uno o más fragmentos, dominios o porciones de unión a antígeno, o uno o más dominios variables de anticuerpo y/o moléculas de anticuerpo de un anticuerpo similar a TCR identificado por los métodos divulgados. En algunos casos, el CAR incluye una porción de unión a antígeno o porciones de una molécula de anticuerpo, como un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) derivado de las cadenas pesada variable (VH) y ligera variable (VL) de un anticuerpo monoclonal (mAb).

En algunos casos, la molécula de unión a antígeno del CAR puede incluir además un espaciador, que puede ser o incluir por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina o una variante o versión modificada de la misma, como una región bisagra, por ejemplo, una región bisagra de IgG4 y/o una región CH1/CL y/o Fc. En algunos casos, la región constante o porción es de una IgG humana, como IgG4 o IgG1. En algunos aspectos, la porción de la región constante sirve como región espaciadora entre el componente de reconocimiento de antígeno, por ejemplo, scFv, y el dominio transmembrana. El espaciador puede tener una longitud que proporcione una capacidad de respuesta aumentada de la célula después de la unión del antígeno, en comparación con la ausencia del espaciador. En algunos ejemplos, el espaciador tiene o tienen aproximadamente 12 aminoácidos de longitud o no tiene más de 12 aminoácidos de longitud. Los espaciadores ejemplares incluyen aquellos que tienen por lo menos aproximadamente de 10 a 229 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 200 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 175 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 150 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 125 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 100 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 75 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 50 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 40 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 30 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 20 aminoácidos o aproximadamente de 10 a 15 aminoácidos, e incluyendo cualquier número entero entre los puntos finales de cualquiera de los intervalos enumerados. En algunos casos, una región espaciadora tiene aproximadamente 12 aminoácidos o menos, aproximadamente 119 aminoácidos o menos, o aproximadamente 229 aminoácidos o menos. Los espaciadores ejemplares incluyen bisagra de IgG4 sola, bisagra de IgG4 enlazada a los dominios de CH2 y CH3, o bisagra de IgG4 enlazada al dominio CH3. Los espaciadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153 o la solicitud de patente internacional número de publicación WO2014031687, Patente de Estados Unidos N° 8.822.647 o solicitud publicada N° US2014/0271635.

En algunos casos, la región constante o porción es de una IgG humana, como IgG4 o IgG1. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia ESKYGPPCPPCp (expuesta en la SEQ ID NO: 38), y está codificado por la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 39. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 40. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 41. En algunos casos, la región constante o porción es de IgD. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 42. En algunos casos, el espaciador tiene una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 38, 40, 41 o 42.

El dominio de reconocimiento de antígeno generalmente está enlazado a uno o más componentes de señalización intracelular, como componentes de señalización que imitan la activación a través de un complejo de receptor de antígeno, como un complejo de TCR, en el caso de un CAR, y/o señal a través de otro receptor de superficie celular. Por tanto, en algunos casos, la molécula de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo similar a TCR o fragmento de unión a antígeno) se enlaza a uno o más dominios de señalización transmembrana e intracelular. En algunos casos, el dominio transmembrana se fusiona con el dominio extracelular. En un caso, se usa un dominio transmembrana que está asociado de manera natural con uno de los dominios en el receptor, por ejemplo, CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana se selecciona o modifica mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de tales dominios a los dominios transmembrana de las mismas proteínas de la membrana de superficie o unas diferentes para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor.

El dominio transmembrana en algunos casos se deriva de una fuente natural o sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio en algunos aspectos se deriva de cualquier proteína unida a membrana o transmembrana. Las regiones transmembrana incluyen las derivadas de (es decir, comprenden por lo menos la región o regiones transmembrana de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Alternativamente, el dominio transmembrana en algunos casos es sintético. En algunos aspectos, el dominio transmembrana sintético comprende residuos predominantemente hidrófobos como leucina y valina. En algunos aspectos, se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo de un dominio transmembrana sintético. En algunos casos, el enlace es mediante conectores, espaciadores, y/o dominios transmembrana.

En algunos casos, un conector oligo- o polipéptido corto, por ejemplo, un conector de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, como uno que contiene glicinas y serinas, por ejemplo, doblete de glicina-serina, está presente y forma un enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización citoplásmica del CAR.

El CAR incluye generalmente por lo menos un componente o componentes de señalización intracelular. Entre los dominios de señalización intracelular se encuentran aquellos que imitan o se aproximan a una señal a través de un receptor de antígeno natural, una señal a través de dicho receptor en combinación con un receptor coestimulador y/o una señal a través de un receptor coestimulador solo. En algunos casos, el CAR incluye un componente intracelular del complejo TCR, como una cadena CD3 de TCR que media la activación y citotoxicidad de las células T, por ejemplo, la cadena zeta de CD3. Por tanto, en algunos aspectos, la molécula de unión al antígeno se enlaza a uno o más módulos de señalización celular. En algunos casos, los módulos de señalización celular incluyen el dominio transmembrana de CD3, los dominios de señalización intracelular de CD3 y/u otros dominios transmembrana de CD. En algunos casos, el CAR incluye además una porción de una o más moléculas adicionales como el receptor y de Fc, CD8, CD4, CD25 o CD16. Por ejemplo, en algunos aspectos, el CAR incluye una molécula quimérica entre CD3-zeta (CD3-Z) o receptor y de Fc y c D8, CD4, CD25 o CD16.

En algunos casos, tras la ligación del CAR, el dominio citoplásmico o el dominio de señalización intracelular del CAR activa por lo menos una de las funciones efectoras normales o respuestas de la célula inmunitaria, por ejemplo, célula T modificada para expresar la célula. Por ejemplo, en algunos contextos, el CAR induce una función de una célula T, como la actividad citolítica o la actividad T adyuvante, como la secreción de citoquinas u otros factores. En algunos casos, se usa una porción truncada de un dominio de señalización intracelular de un componente receptor de antígeno o molécula coestimuladora en lugar de una cadena inmunoestimuladora intacta, por ejemplo, si transduce la señal de la función efectora. En algunos casos, el dominio o dominios de señalización intracelular incluyen las secuencias citoplásmicas del receptor de células T (TCR), y en algunos aspectos también las de los coreceptores que en el contexto natural actúan junto con tal receptor para iniciar la transducción de señales después del acoplamiento con el receptor de antígenos, y/o cualquier derivado o variante de tales moléculas, y/o cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional

En el contexto de un TCR natural, la activación completa generalmente requiere no solo la señalización a través del TCR, sino también una señal coestimuladora. Por tanto, en algunos casos, para promover la activación completa, también se incluye en el CAR un componente para generar una señal secundaria o coestimuladora. En otros casos, el CAR no incluye un componente para generar una señal coestimuladora. En algunos aspectos, se expresa un CAR adicional en la misma célula y proporciona el componente para generar la señal secundaria o coestimuladora. En algunos aspectos, la célula comprende un primer CAR que contiene dominios de señalización para inducir la señal primaria y un segundo CAR que se une a un segundo antígeno y contiene el componente para generar una señal coestimuladora. Por ejemplo, un primer CAR puede ser un CAR activador y el segundo CAR puede ser un CAR coestimulador. En algunos aspectos, ambos CAR deben ligarse para inducir una función efectora particular en la célula, que puede proporcionar especificidad y selectividad para el tipo de célula al que se está apuntando.

La activación de las células T se describe en algunos aspectos como mediada por dos clases de secuencias de señalización citoplasmática: las que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (secuencias de señalización citoplasmáticas primarias) y las que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (secuencias de señalización citoplásmicas secundarias). En algunos aspectos, el CAR incluye uno o ambos de tales componentes de señalización.

En algunos aspectos, el CAR incluye una secuencia de señalización citoplásmica primaria que regula la activación primaria del complejo TCR. Los ejemplos de secuencias de señalización citoplásmicas primarias incluyen las derivadas de CD3 zeta, FcR gamma, CD3 gamma, CD3 delta y CD3 épsilon. En algunos casos, la molécula o las moléculas de señalización citoplásmica en el CAR contienen un dominio de señalización citoplásmico, una porción del mismo o una secuencia derivada de CD3 zeta.

En algunos casos, el CAR incluye un dominio de señalización y/o una porción transmembrana de un receptor coestimulador, como CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 e ICOS. En algunos aspectos, el mismo CAR incluye tanto el componente activador como el coestimulador; en otros aspectos, el dominio de activación es proporcionado por un CAR mientras que el componente coestimulador es proporcionado por otro CAR que reconoce otro antígeno.

En algunos casos, el dominio de activación se incluye dentro de un CAR, mientras que el componente coestimulador es proporcionado por otro CAR que reconoce otro antígeno. En algunos casos, los CAR incluyen los CAR activadores o estimuladores y los CAR coestimuladores, ambos expresados en la misma célula (ver la WO2014/055668). En algunos aspectos, el CAR similar a TCR es el CAR estimulador o activador; en otros aspectos, es el CAR coestimulador. En algunos casos, las células incluyen además CAR inhibidores (iCAR, ver Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (diciembre de 2013), como un CAR que reconoce un antígeno distinto del complejo MHC-péptido particular reconocido por el anticuerpo similar a TCR, mediante lo cual una señal de activación suministrada a través del CAR similar al TCR se reduce o inhibe mediante la unión del CAR inhibidor a su ligando, por ejemplo, para reducir los efectos fuera del objetivo.

En ciertos casos, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización y transmembrana de CD28 enlazado a un dominio intracelular de CD3 (por ejemplo, CD3-zeta). En algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende dominios coestimuladores de CD28 y CD137 (4-1BB, TNFRSF9) quiméricos, enlazados a un dominio intracelular de CD3 zeta.

En algunos casos, el CAR similar a TCR abarca dos o más dominios coestimuladores combinados con un dominio de activación, por ejemplo, dominio de activación primario, en la porción citoplásmica. Un ejemplo es un receptor que incluye componentes intracelulares de CD3-zeta, CD28 y 4-1BB.

En algunos casos, el receptor de CAR u otro antígeno incluye además un marcador, que puede usarse para confirmar la transducción o modificación de la célula para expresar el receptor. En algunos casos, el marcador es una molécula, por ejemplo, una proteína de la superficie celular, que no se encuentra de manera natural en las células T o no se encuentra de manera natural en la superficie de las células T, o una porción de la misma. En algunos casos, la molécula es una molécula no propia, por ejemplo, una proteína no propia, es decir, una que no es reconocida como "propia" por el sistema inmunitario del huésped al que se transferirán adoptivamente las células. En algunos casos, el marcador no tiene ninguna función terapéutica y/o no produce ningún efecto que no sea el de ser usado como marcador para modificación genética, por ejemplo, para seleccionar células diseñadas con éxito. En otros casos, el marcador puede ser una molécula terapéutica o molécula que ejerce de otro modo el efecto deseado, como un ligando para una célula que se va a encontrar in vivo, como una molécula de punto de control inmune o coestimuladora para potenciar y/o amortiguar las respuestas de las células tras la transferencia adoptiva y el encuentro con el ligando.

En algunos aspectos, el marcador incluye todo o parte (por ejemplo, forma truncada) de CD34, un NGFR o receptor del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, tEGFR). En algunos casos, el marcador es una versión truncada de un receptor de la superficie celular, como EGFR truncado, es decir, tEGFR. Un polipéptido ejemplar para un EGFR truncado (por ejemplo, tEGFR) comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 43 o 61, o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 43 o 61. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica el marcador está enlazado operativamente a un polinucleótido que codifica una secuencia conectora, como una secuencia conectora escindible, por ejemplo, T2A. Por ejemplo, un marcador, y opcionalmente una secuencia conectora, puede ser cualquiera como se divulga en la solicitud de patente publicada N° WO2014031687. Por ejemplo, el marcador puede ser un EGFR truncado (tEGFR) que está, opcionalmente, enlazado a una secuencia conectora, como una secuencia conectora escindible T2A. Una secuencia conectora T2A ejemplar comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 44 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 44.

En algunos casos, a los CAR se hace referencia como CAR de primera, segunda y/o tercera generación. En algunos aspectos, un CAR de primera generación es uno que proporciona únicamente una señal inducida por la cadena CD3 tras la unión del antígeno; en algunos aspectos, un CAR de segunda generación es uno que proporciona dicha señal y una señal coestimuladora, como uno que incluye un dominio de señalización intracelular de un receptor coestimulador como CD28 o CD137; en algunos aspectos, un CAR de tercera generación en algunos aspectos es uno que incluye múltiples dominios coestimuladores de diferentes receptores coestimuladores.

En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico incluye una porción extracelular que contiene un anticuerpo similar a TCR o fragmento identificado en los métodos divulgados y un dominio de señalización intracelular. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento incluye un scFv y el dominio intracelular contiene un ITAM. En algunos aspectos, el dominio de señalización intracelular incluye un dominio de señalización de una cadena zeta de una cadena CD3-zeta (CD3Z). En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico incluye un dominio transmembrana que enlaza el dominio extracelular y el dominio de señalización intracelular. En algunos aspectos, el dominio transmembrana contiene una porción transmembrana de CD28. El dominio extracelular y la transmembrana pueden enlazarse directa o indirectamente. En algunos casos, el dominio extracelular y la transmembrana están enlazados por un espaciador, como cualquiera de los descritos en la presente. En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico contiene un dominio intracelular de una molécula coestimuladora de células T, como entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular. En algunos aspectos, la molécula coestimuladora de células T es CD28 o 41 BB.

Por ejemplo, en algunos casos, el CAR contiene un anticuerpo similar a TCR, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, como se divulga en la presente, un dominio transmembrana que es o contiene una porción transmembrana de CD28 o una variante funcional del mismo, y un dominio de señalización intracelular que contiene una parte de señalización de CD28 o una variante funcional de la misma y una porción de señalización de CD3 zeta o una variante funcional de la misma. En algunos casos, el CAR contiene un anticuerpo similar a TCR, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, como se divulga en la presente, un dominio transmembrana que es o contiene una porción transmembrana de CD28 o una variante funcional del mismo, y un dominio de señalización intracelular que contiene una porción de señalización de un 4-1BB o variante funcional del mismo y una porción de señalización de CD3 zeta o variante funcional del mismo. En algunos de tales casos, el receptor incluye además un espaciador que contiene una porción de una molécula de Ig, como una molécula de Ig humana, como una bisagra de Ig, por ejemplo una bisagra de IgG4, como un espaciador de solo bisagra.

En algunos casos, el dominio transmembrana del receptor, por ejemplo, el CAR similar a TCR, es un dominio transmembrana de CD28 humano (por ejemplo, N° de registro P01747.1) o una variante del mismo, como un dominio transmembrana que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 45. En algunos casos, la porción que contiene el dominio transmembrana del receptor recombinante comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 46 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos o aproximadamente un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 46.

En algunos casos, el o los componentes de señalización intracelular del receptor recombinante, por ejemplo, el CAR similar a TCR, contiene un dominio de señalización coestimulador intracelular de CD28 humano o una variante funcional o porción del mismo, como un dominio con una sustitución de LL a GG en las posiciones 186 187 de una proteína CD28 nativa. Por ejemplo, el dominio de señalización intracelular puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 47 o 48 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 47 o 48. En algunos casos, el dominio intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador intracelular de 4-1BB (por ejemplo, N° de registro Q07011.1) o variante funcional o porción del mismo, como la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 49.

En algunos casos, el dominio de señalización intracelular del receptor recombinante, por ejemplo, el CAR, comprende un dominio de señalización estimulador zeta de CD3 humano o una variante funcional del mismo, como un dominio citoplásmico de 112 AA de la isoforma 3 de CD3Z humano (N° de registro: P20963.2) o un dominio de señalización zeta de CD3 como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 7.446.190 o la Patente de Estados Unidos N° 8.911.993. Por ejemplo, en algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50, 51 o 52 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 50, 51 o 52.

En algunos aspectos, el espaciador contiene solo una región bisagra de una IgG, como solo una bisagra de IgG4 o IgG1, como el espaciador de solo bisagra expuesto en la SEQ ID NO: 38. En otros casos, el espaciador es o contiene una bisagra de Ig, por ejemplo, una bisagra derivada de IgG4, opcionalmente enlazada a los dominios CH2 y/o CH3. En algunos casos, el espaciador es una bisagra de Ig, por ejemplo, una bisagra de IgG4, enlazada a los dominios CH2 y CH3, como se expone en la SEQ ID NO: 40. En algunos casos, el espaciador es una bisagra de Ig, por ejemplo, una bisagra de IgG4, enlazada a un dominio CH3 solo, como se expone en la SEQ ID NO: 41. En algunos casos, el espaciador es o comprende una secuencia rica en glicina-serina u otro conector flexible como conectores flexibles conocidos.

Por ejemplo, en algunos casos, el CAR similar a TCR incluye un anticuerpo o fragmento similar a TCR, como cualquiera identificado en los métodos divulgados en la presente, incluyendo scFv, un espaciador como cualquiera de los espaciadores que contienen bisagra de Ig, un dominio transmembrana de CD28, un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización zeta de CD3. En algunos casos, el CAR similar a TCR incluye un anticuerpo o fragmento similar a TCR, como cualquiera identificado en los métodos divulgados en la presente, incluyendo scFv, un espaciador como cualquiera de los espaciadores que contienen bisagra de Ig, un dominio transmembrana de CD28, un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización zeta de CD3. En algunos casos, tales constructos de CAR similares a TCR incluyen además un elemento de salto ribosómico T2A y/o una secuencia de tEGFR, por ejemplo, en sentido descendente del CAR.

En algunos casos, tales constructos de CAR incluyen además un elemento de salto ribosómico T2A y/o una secuencia tEGFR, por ejemplo, en sentido descendente del CAR, como se expone en la SEQ ID NO: 44 y/o 43, respectivamente, o una secuencia de amino ácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la SEQ ID nO: 44 o 43.

B. Células modificadas

También se divulgan células, por ejemplo, células modificadas, diseñadas para contener un receptor de antígeno transgénico que contiene una molécula de unión para el reconocimiento específico de un epítopo peptídico en el contexto de una molécula MHC, es decir, un complejo MHC-péptido. Entre tales células se encuentran las células modificadas con un TCR transgénico o un CAR similar al TCR. En algunos casos, el epítopo peptídico es un epítopo restringido por MHC de un antígeno, que incluye un antígeno intracelular, como cualquier antígeno restringido por MHC asociado con enfermedad maligna o transformación de células (por ejemplo, cáncer), una enfermedad autoinmune o inflamatoria, o un antígeno. derivado de una enfermedad infecciosa, por ejemplo, un patógeno viral o un patógeno bacteriano. También se divulgan poblaciones de tales células y composición que contiene la célula o población de células. Entre las composiciones se encuentran composiciones farmacéuticas y formulaciones para administración, como para terapia celular adoptiva. También se divulgan métodos terapéuticos para administrar las células y composiciones a sujetos, por ejemplo, pacientes.

Las células generalmente son células eucariotas, como células de mamífero, y típicamente son células humanas. En algunos casos, las células se derivan de la sangre, la médula ósea, la linfa o los órganos linfoides, son células del sistema inmunitario, como células de la inmunidad innata o adaptativa, por ejemplo, células mieloides o linfoides, incluyendo linfocitos, típicamente células T y/o células NK. Otras células ejemplares incluyen células madre, como células madre multipotentes y pluripotentes, incluyendo células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En algunos casos, las células son monocitos o granulocitos, por ejemplo, células mieloides, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, mastocitos, eosinófilos y/o basófilos. Las células son típicamente células primarias, como las aisladas directamente de un sujeto y/o aisladas de un sujeto y congeladas. Con referencia a la materia a tratar, las células pueden ser alogénicas y/o autólogas. Entre los métodos se incluyen los métodos ya existentes. En algunos aspectos, como para las tecnologías ya existentes, las células son pluripotentes y/o multipotentes, como células madre, como células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En algunos casos, los métodos incluyen aislar células del sujeto, prepararlas, procesarlas, cultivarlas y/o modificarlas, como se describe en la presente, y reintroducirlas en el mismo paciente, antes o después de la crioconservación.

En algunos casos, las células incluyen uno o más subconjuntos de células T u otros tipos de células, como poblaciones de células T completas, células CD4+, células CD8+ y subpoblaciones de las mismas, como las definidas por función, estado de activación, madurez, potencial para capacidad de diferenciación, expansión, recirculación, localización y/o capacidades de persistencia, especificidad de antígeno, tipo de receptor de antígeno, presencia en un órgano o compartimento particular, perfil de secreción de marcador o citoquina y/o grado de diferenciación. Entre los subtipos y subpoblaciones de células T y/o de células T CD4+ y/o CD8+ se encuentran las células T vírgenes (Tⁿ), las células T efectoras (T^{e f f}), las células T de memoria y subtipos de las mismas, como células T de memoria de células madre T (T^{s c m}), T de memoria central(T^CM), T de memoria efectora (T^{e m}) o células T de memoria efectora diferenciadas terminalmente, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células T inmaduras, células T maduras, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T invariantes asociadas a mucosas (MAIT) células T reguladoras adaptativas y de origen natural (Treg), células T auxiliares, como células TH1, células TH2, células TH3, células TH17, células TH9, células TH22, células T auxiliares foliculares, células T alfa/beta y células T delta/gamma.

En algunos casos, las células son células T CD8+ y tales células se modifican con un receptor de antígeno, por ejemplo, TCR o CAR similar a TCR, que se une específicamente a un epítopo peptídico en el contexto de una molécula de MHC de clase I. En algunos casos, la molécula de MHC de clase I es una molécula de MHC de clase I clásica o una molécula de MHC de clase I no clásica. En algunos casos, la molécula de MHC de clase I es un MHC-E. En algunos casos, se divulgan métodos para modificar células CD8+ para que expresen un receptor de antígeno modificado mediante la introducción en dichas células de una o más moléculas de ácidos nucleicos que codifican un TCR o un CAR similar a TCR específico para un epítopo peptídico en el contexto de una molécula de MHC de clase I, por ejemplo, una molécula de MHC de clase Ia y/o una molécula de MHC-E.

En algunos casos, las células son células T CD8+ y tales células se modifican con un receptor de antígeno, por ejemplo, TCR o CAR similar a TCR, que se une específicamente a un epítopo peptídico en el contexto de una molécula de MHC de clase II. En algunos casos, se divulgan métodos para modificar células CD8+ para que expresen un receptor de antígeno modificado mediante la introducción en tales células de una o más moléculas de ácidos nucleicos que codifican un TCR o un CAR similar a TCR específico para un epítopo peptídico en el contexto de una molécula de MHC de clase II.

En algunos casos, las células son células T CD4+ y tales células se modifican con un receptor de antígeno, por ejemplo, TCR o CAR similar a TCR, que se une específicamente a un epítopo peptídico en el contexto de una molécula de MHC de clase II. En algunos casos, se divulgan métodos para modificar células CD4+ para que expresen un receptor de antígeno modificado mediante la introducción en tales células de una o más moléculas de ácidos nucleicos que codifican un TCR o un CAR similar a TCR específico para un epítopo peptídico en el contexto de una molécula de MHC de clase II.

En algunos casos, se divulgan células CD4+ y células CD8+ modificadas con un receptor de antígeno, por ejemplo, TCR o CAR similar a TCR, que se une específicamente a un epítopo peptídico en el contexto de una molécula de MHC de clase II. En algunos casos, el receptor de antígeno expresado en las células CD4+ y en las células CD8+ es el mismo. En algunos casos, el receptor de antígeno expresado en las células CD4+ es diferente del receptor de antígeno expresado en las células CD8+, pero ambos receptores de antígeno expresados se unen específicamente a un epítopo peptídico en el contexto de una molécula de MHC de clase II. En algunos casos, se divulgan métodos para modificar una población de células CD4+ y/o CD8+ para que expresen un receptor de antígeno modificado mediante la introducción en tales células de una o más moléculas de ácidos nucleicos que codifican un TCR o CAR similar a TCR específico para un epítopo peptídico en el contexto de una molécula de MHC de clase II.

En algunos casos, la molécula de unión del receptor de antígeno modificado, por ejemplo, TCR o anticuerpo similar a TCR o fragmentos de unión a antígeno del mismo, es una identificada por los métodos divulgados.

Células para modificación

En algunos casos, la preparación de las células modificadas incluye uno o más pasos de cultivo y/o preparación. Las células para la introducción del receptor de antígeno, por ejemplo, TCR o CAR similar a TCR, pueden aislarse de una muestra, como una muestra biológica, por ejemplo, una obtenida o derivada de un sujeto. En algunos casos, el sujeto del que se aísla la célula es uno que tiene la enfermedad o afección o con necesidad de una terapia celular o al que se administrará la terapia celular. En algunos casos, el sujeto es un humano con necesidad de una intervención terapéutica particular, como la terapia celular adoptiva para la que se aíslan, procesan y/o manipulan las células.

Por consiguiente, las células en algunos casos son células primarias, por ejemplo, células humanas primarias. Las muestras incluyen tejidos, fluidos y otras muestras tomadas directamente del sujeto, así como muestras resultantes de uno o más pasos de procesamiento, como separación, centrifugación, modificación genética (por ejemplo, transducción con vector viral), lavado y/o incubación.. La muestra biológica puede ser una muestra obtenida directamente de una fuente biológica o una muestra que se procesa. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, fluidos corporales, como sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, orina y sudor, muestras de tejidos y órganos, incluyendo muestras procesadas derivadas de las mismas.

En algunos aspectos, la muestra de la que se derivan o aíslan las células es sangre o una muestra derivada de sangre, o es o se deriva de un producto de aféresis o leucoféresis. Las muestras ejemplares incluyen sangre total, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), leucocitos, médula ósea, timo, biopsia de tejido, tumor, leucemia, linfoma, ganglio linfático, tejido linfoide asociado al intestino, tejido linfoide asociado a mucosas, bazo, otros tejidos linfoides, hígado, pulmón, estómago, intestino, colon, riñón, páncreas, mama, hueso, próstata, cuello uterino, testículos, ovarios, amígdalas u otro órgano y/o células derivadas de los mismos. Las muestras incluyen, en el contexto de la terapia celular, por ejemplo, la terapia celular adoptiva, muestras de fuentes autólogas y alogénicas.

En algunos casos, las células se derivan de líneas celulares, por ejemplo, líneas de células T. Las células en algunos casos se obtienen de una fuente xenogénica, por ejemplo, de ratón, rata, primate no humano y cerdo.

En algunos casos, el aislamiento de las células incluye uno o más pasos de preparación y/o separación de células no basados en afinidad. En algunos ejemplos, las células se lavan, centrifugan y/o incuban en presencia de uno o más reactivos, por ejemplo, para eliminar componentes no deseados, enriquecer para obtener componentes deseados, lisar o eliminar células sensibles a reactivos particulares. En algunos ejemplos, las células se separan basándose en una o más propiedades, como densidad, propiedades adherentes, tamaño, sensibilidad y/o resistencia a componentes particulares.

En algunos ejemplos, se obtienen células de la sangre circulante de un sujeto, por ejemplo, mediante aféresis o leucoféresis. Las muestras, en algunos aspectos, contienen linfocitos, incluyendo células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y/o plaquetas, y en algunos aspectos contienen células distintas de glóbulos rojos y plaquetas.

En algunos casos, las células sanguíneas recogidas del sujeto se lavan, por ejemplo, para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para los pasos de procesamiento posteriores. En algunos casos, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En algunos casos, la solución de lavado carece de calcio y/o magnesio y/o muchos o todos los cationes divalentes. En algunos aspectos, un paso de lavado se realiza con una centrífuga de "flujo continuo" semiautomatizada (por ejemplo, el procesador de células Cobe 2991, Baxter) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos aspectos, un paso de lavado se logra mediante filtración de flujo tangencial (TFF) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos casos, las células se vuelven a suspender en una variedad de tampones biocompatibles después del lavado, como, por ejemplo, PBS libre de Ca++/Mg++. En ciertos casos, los componentes de una muestra de células sanguíneas se extraen y las células se vuelven a suspender directamente en el medio de cultivo.

En algunos casos, los métodos incluyen métodos de separación celular basados en la densidad, como la preparación de glóbulos blancos a partir de sangre periférica mediante la lisis de los glóbulos rojos y la centrifugación a través de un gradiente de Percoll o Ficoll.

En algunos casos, los métodos de aislamiento incluyen la separación de diferentes tipos de células en base a la expresión o presencia en la célula de una o más moléculas específicas, como marcadores de superficie, por ejemplo, proteínas de superficie, marcadores intracelulares o ácido nucleico. En algunos casos, puede usarse cualquier método conocido para la separación en base a tales marcadores. En algunos casos, la separación es una separación basada en afinidad o inmunoafinidad. Por ejemplo, el aislamiento en algunos aspectos incluye la separación de células y poblaciones de células en base a la expresión de las células o el nivel de expresión de uno o más marcadores, típicamente marcadores de superficie celular, por ejemplo, mediante incubación con un anticuerpo o compañero de unión que se une específicamente a tales marcadores, seguido generalmente por pasos de lavado y separación de las células que se han unido al anticuerpo o al compañero de unión, de las células que no se han unido al anticuerpo o al compañero de unión.

Tales pasos de separación pueden basarse en la selección positiva, en la que las células que se han unido a los reactivos se retienen para uso posterior, y/o en la selección negativa, en la que se retienen las células que no se han unido al anticuerpo o al compañero de unión. En algunos ejemplos, ambas fracciones se conservan para su uso posterior. En algunos aspectos, la selección negativa puede ser particularmente útil cuando no hay ningún anticuerpo disponible que identifique específicamente un tipo de célula en una población heterogénea, de tal manera que la separación se lleve a cabo mejor en base a marcadores expresados por células distintas de la población deseada.

No es necesario que la separación dé como resultado un enriquecimiento o la eliminación del 100% de una población celular particular o células que expresan un marcador particular. Por ejemplo, la selección positiva o el enriquecimiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere al aumento del número o porcentaje de tales células, pero no tiene por qué dar como resultado una ausencia completa de células que no expresan el marcador. De igual manera, la selección negativa, la eliminación o la reducción de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere a la disminución del número o porcentaje de tales células, pero no tiene por qué dar como resultado una eliminación completa de todas esas células.

En algunos ejemplos, se llevan a cabo múltiples rondas de pasos de separación, en donde la fracción seleccionada positiva o negativamente de un paso se somete a otro paso de separación, como una selección positiva o negativa posterior. En algunos ejemplos, un solo paso de separación puede reducir las células que expresan múltiples marcadores simultáneamente, como incubando células con una pluralidad de anticuerpos o compañeros de unión, cada uno específico para un marcador dirigido para selección negativa. De igual manera, pueden seleccionarse positivamente múltiples tipos de células simultáneamente incubando células con una pluralidad de anticuerpos o compañeros de unión expresados en los varios tipos de células.

Por ejemplo, en algunos aspectos, subpoblaciones específicas de células T, como células positivas o que expresan niveles altos de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, células T CD28+, CD62L+, CCR7+, c D27⁺, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ y/o CD45RO+, se aíslan mediante técnicas de selección positiva o negativa.

Por ejemplo, las células T CD3+, CD28+ pueden seleccionarse positivamente usando perlas magnéticas conjugadas anti-CD3/anti-CD28.

En algunos casos, el aislamiento se lleva a cabo mediante el enriquecimiento de una población celular particular mediante selección positiva, o la reducción de una población celular particular, mediante selección negativa. En algunos casos, la selección positiva o negativa se logra incubando células con uno o más anticuerpos u otro agente de unión que se unen específicamente a uno o más marcadores de superficie expresados o expresados (marcador+) a un nivel relativamente más alto (marcadoralto) en las células seleccionadas positiva o negativamente, respectivamente.

En algunos casos, las células T se separan de una muestra de PBMC mediante la selección negativa de marcadores expresados en células que no son T, como células B, monocitos u otros glóbulos blancos, como CD14. En algunos aspectos, se usa un paso de selección de CD4+ o CD8+ para separar las células T auxiliares CD4+ y las citotóxicas CD8+. Tales poblaciones de CD4+ y CD8+ pueden clasificarse adicionalmente en subpoblaciones mediante selección positiva o negativa de marcadores expresados o expresados a un grado relativamente mayor en una o más subpoblaciones de células T vírgenes, de memoria y/o efectoras.

En algunos casos, las células CD8+ se enriquecen adicionalmente o se empobrecen de células madre de memoria central, memoria efectora y/o memoria central vírgenes, como mediante selección positiva o negativa en base a los antígenos de superficie asociados con la subpoblación respectiva. En algunos casos, el enriquecimiento de las células T de memoria central (T^{c m}) se lleva a cabo para aumentar la eficacia, como para mejorar la supervivencia a largo plazo, la expansión y/o el injerto después de la administración, que en algunos aspectos es particularmente robusta en tales subpoblaciones. Ver Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701. En algunos casos, la combinación de células T CD8+ y las células T CD4+ enriquecidas con T^{c m}mejoran adicionalmente la eficacia.

En casos, las células T de memoria están presentes en los subconjuntos CD62L+ y CD62L- de los linfocitos de sangre periférica CD8 . Las PBMC pueden enriquecerse o reducirse en las fracciones CD62L-CD8+ y/o CD62L+CD8+, como usando anticuerpos anti-CD8 y anti-CD62L.

En algunos casos, el enriquecimiento de las células T de memoria central (T^{c m}) se basa en una expresión de superficie alta o positiva de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 y/o CD 127; en algunos aspectos, se basa en la selección negativa de células que expresan o expresan altamente CD45RA y/o granzima B. En algunos aspectos, el aislamiento de una población de CD8+ enriquecida para células T^{c m}se lleva a cabo mediante la reducción de las células que expresan CD4, CD14, CD45RA y selección positiva o enriquecimiento de células que expresan CD62L. En un aspecto, el enriquecimiento de células T de memoria central (T^{c m}) se lleva a cabo partiendo de una fracción negativa de células seleccionadas en base a la expresión de CD4, que se somete a una selección negativa en base a la expresión de CD14 y CD45RA, y a una selección positiva en base a CD62L. Tales selecciones en algunos aspectos se llevan a cabo simultáneamente y en otros aspectos se llevan a cabo secuencialmente, en cualquier orden. En algunos aspectos, también se usa el mismo paso de selección basado en la expresión de CD4 usado en la preparación de la población o subpoblación de células CD8+ para generar la población o subpoblación de células CD4+, de tal manera que tanto las fracciones positivas como negativas de la separación basada en CD4 se retienen y usan en pasos posteriores de los métodos, opcionalmente siguiendo uno o más pasos de selección positiva o negativa adicionales.

En un ejemplo particular, una muestra de PBMC u otra muestra de glóbulos blancos se somete a selección de células CD4+, donde se retienen tanto las fracciones negativas como las positivas. Luego, la fracción negativa se somete a una selección negativa basada en la expresión de CD14 y CD45RA o CD19, y una selección positiva basada en un marcador característico de células T de memoria central, como CD62L o CCR7, donde las selecciones positivas y negativas se llevan a cabo en orden.

Las células auxiliares T CD4+ se clasifican en células vírgenes, de memoria central y efectoras mediante la identificación de poblaciones de células que tienen antígenos de superficie celular. Los linfocitos CD4+ pueden obtenerse mediante métodos estándar. En algunos casos, los linfocitos T CD4+ vírgenes son células T CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+. En algunos casos, las células CD4+ de memoria central son CD62L+ y CD45RO+. En algunos casos, las células efectoras CD4+ son CD62L- y CD45RO-.

En un ejemplo, para enriquecer las células CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales típicamente incluye anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. En algunos casos, el anticuerpo o compañero de unión se une a un soporte sólido o matriz, como una perla magnética o una perla paramagnética, para permitir la separación de células para la selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, en algunos casos, las células y las poblaciones de células se separan o aíslan usando técnicas de separación inmunomagnéticas (o de afinidad magnética) (revisadas en Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p. 17-25 Editado por: S.A. Brooks y U. Schumacher© Humana Press Inc., Totowa, NJ).

En algunos aspectos, la muestra o composición de células que se van a separar se incuba con material pequeño, magnetizable o magnéticamente sensible, como partículas o micropartículas magnéticamente sensibles, como perlas paramagnéticas (por ejemplo, perlas Dynabeads o MACS). El material magnéticamente sensible, por ejemplo, una partícula, generalmente se une directa o indirectamente a un compañero de unión, por ejemplo, un anticuerpo, que se une específicamente a una molécula, por ejemplo, un marcador de superficie, presente en la célula, células o población de células que se desea separar, por ejemplo, que se desea seleccionar negativa o positivamente.

En algunos casos, la partícula o perla magnética comprende un material magnéticamente sensible unido a un miembro de unión específico, como un anticuerpo u otro compañero de unión. Hay muchos materiales magnéticamente sensibles bien conocidos que se usan en los métodos de separación magnética. Las partículas magnéticas adecuadas incluyen las descritas en Molday, Patente de Estados Unidos N° 4.452.773 y en la Memoria descriptiva de la Patente Europea EP 452342 B, que se incorporan en la presente como referencia. Otros ejemplos son las partículas de tamaño coloidal, como las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 4.795.698 de Owen, y Liberti et al., Patente de Estados Unidos N° 5.200.084.

La incubación generalmente se lleva a cabo en condiciones en las que los anticuerpos o compañeros de unión, o moléculas, como anticuerpos secundarios u otros reactivos, que se unen específicamente a tales anticuerpos o compañeros de unión, que están unidos a la partícula o perla magnética, se unen específicamente a las moléculas de la superficie celular si están presentes en las células dentro de la muestra.

En algunos aspectos, la muestra se coloca en un campo magnético, y aquellas células que tienen partículas magnéticamente sensibles o magnetizables unidas a las mismas serán atraídas por el imán y separadas de las células no marcadas. Para la selección positiva, se retienen las células que son atraídas por el imán; para la selección negativa, se retienen las células que no son atraídas (células sin marcar). En algunos aspectos, se realiza una combinación de selección positiva y negativa durante el mismo paso de selección, donde las fracciones positivas y negativas se retienen y se procesan adicionalmente o se someten a pasos de separación adicionales.

En ciertos casos, las partículas magnéticamente sensibles se recubren con anticuerpos primarios u otros compañeros de unión, anticuerpos secundarios, lectinas, enzimas o estreptavidina. En ciertos casos, las partículas magnéticas se unen a las células mediante un recubrimiento de anticuerpos primarios específicos para uno o más marcadores. En ciertos casos, las células, en lugar de las perlas, se marcan con un anticuerpo primario o un compañero de unión, y luego se añaden partículas magnéticas recubiertas con un anticuerpo secundario específico de tipo celular u otro compañero de unión (por ejemplo, estreptavidina). En ciertos casos, las partículas magnéticas recubiertas con estreptavidina se usan junto con anticuerpos primarios o secundarios biotinilados.

En algunos casos, las partículas magnéticamente sensibles se dejan unidas a las células que posteriormente se incubarán, cultivarán y/o modificarán; en algunos aspectos, las partículas se dejan unidas a las células para su administración a un paciente. En algunos casos, las partículas magnetizables o magnéticamente sensibles se eliminan de las células. Los métodos para eliminar partículas magnetizables de las células son conocidos e incluyen, por ejemplo, el uso de anticuerpos competidores no marcados, partículas magnetizables o anticuerpos conjugados con conectores escindibles, etc. En algunos casos, las partículas magnetizables son biodegradables.

En algunos casos, la selección basada en afinidad se realiza mediante clasificación celular activada magnéticamente (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Los sistemas de clasificación celular activada magnéticamente (MACS) son capaces de realizar una selección de alta pureza de células que tienen partículas magnetizadas unidas a las mismas. En ciertos casos, MACS funciona en un modo en el que las especies objetivo y no objetivo se eluyen secuencialmente después de la aplicación del campo magnético externo. Es decir, las células unidas a las partículas magnetizadas se mantienen en su lugar mientras se eluyen las especies no unidas. Luego, una vez que se ha completado este primer paso de elución, las especies que quedaron atrapadas en el campo magnético y se impidió que fueran eluidas se liberan de alguna manera para que puedan eluirse y recuperarse. En ciertos casos, las células no objetivo se marcan y reducen de la población de células heterogénea.

En ciertos casos, el aislamiento o separación se lleva a cabo usando un sistema, dispositivo o aparato que lleva a cabo uno o más de los pasos de aislamiento, preparación celular, separación, procesamiento, incubación, cultivo y/o formulación de los métodos. En algunos aspectos, el sistema se usa para realizar cada uno de estos pasos en un entorno cerrado o estéril, por ejemplo, para minimizar el error, la manipulación por parte del usuario y/o la contaminación. En un ejemplo, el sistema es un sistema como se describe en la Solicitud de Patente Internacional, Número de Publicación WO2009/072003, o US 20110003380 A1.

En algunos casos, el sistema o aparato lleva a cabo uno o más, por ejemplo, todos los pasos de aislamiento, procesamiento, modificación y formulación en un sistema integrado o autónomo, y/o de manera automatizada o programable. En algunos aspectos, el sistema o aparato incluye un ordenador y/o programa informático en comunicación con el sistema o aparato, lo que permite al usuario programar, controlar, evaluar el resultado y/o ajustar varios aspectos de los pasos de procesamiento, aislamiento, modificación y formulación.

En algunos aspectos, la separación y/u otros pasos se llevan a cabo usando el sistema CliniMACS (Miltenyi Biotec), por ejemplo, para la separación automatizada de células a nivel clínico en un sistema cerrado y estéril. Los componentes pueden incluir un microordenador integrado, una unidad de separación magnética, una bomba peristáltica y varias válvulas de pellizco. En algunos aspectos, el ordenador integrado controla todos los componentes del instrumento y dirige el sistema para que realice procedimientos repetidos en una secuencia estandarizada. La unidad de separación magnética en algunos aspectos incluye un imán permanente móvil y un soporte para la columna de selección. La bomba peristáltica controla el caudal en todo el conjunto de tubos y, junto con las válvulas de pellizco, asegura el flujo controlado de tampón a través del sistema y la suspensión continua de las células.

El sistema CliniMACS en algunos aspectos usa partículas magnetizables acopladas a anticuerpos que se suministran en una solución estéril no pirogénica. En algunos casos, después de marcar las células con partículas magnéticas, las células se lavan para eliminar el exceso de partículas. Luego se conecta una bolsa de preparación de células al conjunto de tubos, que a su vez está conectada a una bolsa que contiene tampón y una bolsa de recogida de células. El conjunto de tubos consiste de tubos estériles preensamblados, que incluyen una precolumna y una columna de separación, y son para un solo uso. Una vez iniciado el programa de separación, el sistema aplica automáticamente la muestra de la célula sobre la columna de separación. Las células marcadas se retienen dentro de la columna, mientras que las células no marcadas se eliminan mediante una serie de pasos de lavado. En algunos casos, las poblaciones de células para su uso con los métodos descritos en la presente no están marcadas y no se retienen en la columna. En algunos casos, las poblaciones de células para su uso con los métodos descritos en la presente se marcan y se retienen en la columna. En algunos casos, las poblaciones de células para su uso con los métodos descritos en la presente se eluyen de la columna después de la eliminación del campo magnético y se recogen dentro de la bolsa de recogida de células.

En ciertos casos, la separación y/u otros passos se llevan a cabo utilizando el sistema CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). El sistema CliniMACS Prodigy en algunos aspectos está equipado con una unidad de procesamiento de células que permite el lavado y el fraccionamiento automatizados de las células por centrifugación. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara integrada y un software de reconocimiento de imágenes que determina el criterio de valoración óptimo del fraccionamiento celular al discernir las capas macroscópicas del producto de la célula de origen. Por ejemplo, la sangre periférica se separa automáticamente en eritrocitos, glóbulos blancos y capas de plasma. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara de cultivo celular integrada que logra protocolos de cultivo celular como, por ejemplo, diferenciación y expansión celular, carga de antígeno y cultivo celular a largo plazo. Los puertos de entrada pueden permitir la extracción estéril y la reposición de medios y las células pueden monitorizarse usando un microscopio integrado. Ver, por ejemplo, Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82 y Wang et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 689-701.

En algunos casos, una población celular descrita en la presente se recoge y se enriquece (o se reduce) mediante citometría de flujo, en la que las células teñidas para múltiples marcadores de superficie celular se transportan en una corriente fluídica. En algunos casos, una población celular descrita en la presente se recoge y se enriquece (o se reduce) mediante clasificación a escala preparativa (FACS). En ciertos casos, una población celular descrita en la presente se recoge y enriquece (o reduce) mediante el uso de chips de sistemas microelectromecánicos (MEMS) en combinación con un sistema de detección basado en FACS (ver, por ejemplo, WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; y Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376. En ambos casos, las células pueden marcarse con múltiples marcadores, lo que permite el aislamiento de subconjuntos de células T de alta pureza.

En algunos casos, los anticuerpos o compañeros de unión se marcan con uno o más marcadores detectables, para facilitar la separación para la selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, la separación puede basarse en la unión a anticuerpos marcados fluorescentemente. En algunos ejemplos, la separación de células basada en la unión de anticuerpos u otros compañeros de unión específicos para uno o más marcadores de superficie celular se lleva a cabo en una corriente fluídica, como por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), incluyendo la escala preparativa (FACS) y/o chips de sistemas microelectromecánicos (MEMS), por ejemplo, en combinación con un sistema de detección de citometría de flujo. Tales métodos permiten la selección positiva y negativa basada en múltiples marcadores simultáneamente.

En algunos casos, los métodos de preparación incluyen pasos para congelar, por ejemplo, crioconservar las células, antes o después del aislamiento, incubación y/o modificación. En algunos casos, el paso de congelación y descongelación posterior elimina los granulocitos y, hasta cierto punto, los monocitos de la población celular. En algunos casos, las células se suspenden en una solución de congelación, por ejemplo, después de un paso de lavado para eliminar el plasma y las plaquetas. Puede usarse cualquiera de una variedad de soluciones y parámetros de congelación conocidos en algunos aspectos. Un ejemplo implica usar PBS que contiene un 20% de DMSO y un 8% de albúmina de suero humano (HSA), u otros medios de congelación de células adecuados. Luego esto se diluye 1:1 con medio de tal manera que la concentración final de DMSO y HSA sea del 10% y el 4%, respectivamente. Luego, las células se congelan a -80° C a una velocidad de 1° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido.

Preparación de células, vectores y métodos de modificación

En algunos casos, la modificación genética generalmente implica la introducción de un ácido nucleico que codifica el componente recombinante o modificado en la célula, como por transducción, transfección o transformación retroviral. En algunos casos, la transferencia génica se logra estimulando primero la célula, por ejemplo, combinándola con un estímulo que induce una respuesta como proliferación, supervivencia y/o activación, por ejemplo, medida por la expresión de una citoquina o marcador de activación, seguido de la transducción de las células activadas y la expansión en cultivo hasta cantidades suficientes para aplicaciones clínicas.

En algunos casos, las células se incuban y/o cultivan antes o en conexión con modificación genética. Los pasos de incubación pueden incluir cultivo, estimulación, activación y/o propagación. En algunos casos, las composiciones o células se incuban en presencia de condiciones estimuladoras o un agente estimulador. Tales condiciones incluyen aquellas diseñadas para inducir la proliferación, expansión, activación y/o supervivencia de células en la población, para imitar la exposición al antígeno y/o cebar las células para modificación genética, como para la introducción de un receptor de antígeno recombinante. La incubación y/o la modificación pueden llevarse a cabo en un recipiente de cultivo, como una unidad, cámara, pocillo, columna, tubo, conjunto de tubos, válvula, vial, placa de cultivo, bolsa u otro recipiente para el cultivo de células.

Las condiciones pueden incluir uno o más medios particulares, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes, por ejemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones y/o factores estimuladores, como citoquinas, quimiocinas, antígenos, compañeros de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes y cualquier otro agente diseñado para activar las células.

En algunos casos, las condiciones o agentes estimuladores incluyen uno o más agentes, por ejemplo, ligando, que es capaz de activar un dominio de señalización intracelular de un complejo de TCR. En algunos aspectos, el agente enciende o inicia la cascada de señalización intracelular de TCR/CD3 en una célula T. Tales agentes pueden incluir anticuerpos, como los específicos de un TCR, por ejemplo, anti-CD3. En algunos casos, las condiciones estimuladoras incluyen uno o más agentes, por ejemplo, ligando, que es capaz de estimular un receptor coestimulador, por ejemplo, anti-CD28. En algunos casos, tales agentes y/o ligandos pueden estar unidos a un soporte sólido, como una perla, y/o una o más citoquinas. Opcionalmente, el método de expansión puede comprender además el paso de añadir anticuerpo anti-CD3 y/o anti CD28 al medio de cultivo (por ejemplo, a una concentración de por lo menos aproximadamente 0,5 ng/ml). En algunos casos, los agentes estimuladores incluyen IL-2, IL-15 y/o IL-7. En algunos aspectos, la concentración de IL-2 es de por lo menos aproximadamente 10 unidades/ml.

En algunos aspectos, la incubación se lleva a cabo de acuerdo con técnicas como las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 6.040.177 de Riddell et al., Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82 y/o Wang et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 689-701.

En algunos casos, las células T se expanden añadiendo a la composición células alimentadoras, como células mononucleares de sangre periférica que no se dividen (PBMC), (por ejemplo, de tal manera que la población de células resultante contenga por lo menos aproximadamente 5, 10, 20, o 40 o más células alimentadoras de PBMC por cada linfocito T en la población inicial a expandir); e incubar el cultivo (por ejemplo, durante un tiempo suficiente para expandir el número de células T). En algunos aspectos, las células alimentadoras que no se dividen pueden comprender células alimentadoras de PBMC irradiadas con rayos gamma. En algunos casos, las PBMC se irradian con rayos gamma en el intervalo de aproximadamente 3000 a 3600 rads para evitar la división celular. En algunos aspectos, las células alimentadoras se añaden al medio de cultivo antes de la adición de las poblaciones de células T.

En algunos casos, las condiciones estimuladoras incluyen temperatura adecuada para el crecimiento de linfocitos T humanos, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 25 grados Celsius, generalmente por lo menos aproximadamente 30 grados y generalmente a o aproximadamente 37 grados Celsius. Opcionalmente, la incubación puede comprender además la adición de células linfoblastoides (LCL) transformadas con EBV que no se dividen como células alimentadoras. Las LCL pueden irradiarse con rayos gamma en el intervalo de aproximadamente 6000 a 10.000 rads. Las células alimentadoras de LCL en algunos aspectos se proporcionan en cualquier cantidad adecuada, como una proporción de células alimentadoras de LCL a linfocitos T iniciales de por lo menos aproximadamente 10:1.

En algunos aspectos, las células se modifican además para promover la expresión de citoquinas u otros factores.

En algunos contextos, la sobreexpresión de un factor estimulante (por ejemplo, una linfocina o una citoquina) puede ser tóxica para un sujeto. Por tanto, en algunos contextos, las células modificadas incluyen segmentos de genes que hacen que las células sean susceptibles a la selección negativa in vivo, como tras la administración en inmunoterapia adoptiva. Por ejemplo, en algunos aspectos, las células están modificadas de tal manera que puedan eliminarse como resultado de un cambio en la condición in vivo del paciente al que se administran. El fenotipo seleccionable negativo puede resultar de la inserción de un gen que confiere sensibilidad a un agente administrado, por ejemplo, un compuesto. Los genes seleccionables negativos incluyen el gen de la timidina quinasa de tipo I del virus del Herpes simple (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell 2: 223, 1977) que confiere sensibilidad al ganciclovir; el gen de la hipoxantina fosforibosiltransferasa celular (HPRT), el gen de la adenina fosforibosiltransferasa celular (APRT), la citosina deaminasa bacteriana, (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

89:33 (1992)).

Se conocen bien varios métodos para la introducción de componentes modificados genéticamente, por ejemplo, receptores de antígenos, por ejemplo, CAR, y pueden usarse con los métodos y composiciones divulgados. Los métodos ejemplares incluyen aquellos para la transferencia de ácidos nucleicos que codifican los receptores, incluyendo por vía viral, por ejemplo, retroviral o lentiviral, transducción, transposones y electroporación.

En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células usando partículas de virus infecciosos recombinantes, como, por ejemplo, vectores derivados del virus de simio 40 (SV40), adenovirus, virus adenoasociado (AAV). En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T usando vectores lentivirales recombinantes o vectores retrovirales, como vectores gamma-retrovirales (ver, por ejemplo, Koste et al. (2014) Gene Therapy 3 de abril de 2014. Doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. noviembre de 2011 29(11): 550-557.

En algunos casos, el vector retroviral tiene una secuencia de repetición terminal larga (LTR), por ejemplo, un vector retroviral derivado del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV), virus de células madre embrionarias murinas (MESV), virus de células madre murinas (MSCV), virus formador de focos del bazo (SFFV) o virus adenoasociado (AAV). La mayoría de los vectores retrovirales se derivan de retrovirus murinos. En algunos casos, los retrovirus incluyen los derivados de cualquier fuente de células de aves o mamíferos. Los retrovirus son típicamente anfotrópicos, lo que significa que son capaces de infectar células huésped de varias especies, incluyendo los humanos. En un caso, el gen que se va a expresar reemplaza las secuencias retrovirales gag, pol y/o env. Se han descrito una serie de sistemas retrovirales ilustrativos (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 5.219.740; 6.207.453; 5.219.740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A.D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037; y Boris-Lawrie y Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.

Se conocen métodos de transducción lentiviral. Métodos ejemplares se describen en, por ejemplo, Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101: 1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Métodos Mol Biol. 506: 97-114; y Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505.

En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T mediante electroporación (ver, por ejemplo, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 y Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T mediante transposición (ver, por ejemplo, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; y Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Otros métodos de introducción y expresión de material genético en células inmunes incluyen transfección con fosfato de calcio (por ejemplo, como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York. N.Y.), fusión de protoplastos, transfección mediada por liposomas catiónica; bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de tungsteno (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); y coprecipitación de ADN de fosfato de estroncio (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).

Otros enfoques y vectores para la transferencia de los ácidos nucleicos que codifican los productos recombinantes son los descritos, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional, N° de publicación: WO2014055668 y la Patente de Estados Unidos N° 7.446.190.

Entre los ácidos nucleicos adicionales, por ejemplo, los genes para la introducción están los que mejoran la eficacia de la terapia, por ejemplo, promoviendo la viabilidad y/o función de las células transferidas; genes para proporcionar un marcador genético para la selección y/o evaluación de las células, como para evaluar la supervivencia o localización in vivo; genes para mejorar la seguridad, por ejemplo, haciendo que la célula sea susceptible a la selección negativa in vivo como se describe por Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); y Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); ver también las publicaciones PCT/US91/08442 y PCT/US94/05601 de Lupton et al. que describe el uso de genes de fusión seleccionables bifuncionales derivados de la fusión de un marcador seleccionable positivo dominante con un marcador seleccionable negativo. Ver, por ejemplo, Riddell et al., Patente de Estados Unidos N° 6.040.177, en las columnas 14-17.

V. Composiciones, formulaciones y métodos de administración

También se divulgan composiciones que contienen el TCR, moléculas de unión a anticuerpos similares a TCR o fragmentos de antígeno de las mismas, receptores quiméricos (por ejemplo, CAR) y composiciones que contienen las células modificadas, incluyendo las composiciones y formulaciones farmacéuticas. También se divulgan métodos de usar y usos de las moléculas y composiciones, como en el tratamiento de enfermedades, afecciones y trastornos en los que se expresa el antígeno, o en métodos de detección, diagnóstico y pronóstico. A. Composiciones y formulaciones farmacéuticas

Se divulgan formulaciones farmacéuticas que incluyen TCR o moléculas de unión similares a TCR o fragmentos de unión a antígeno, que incluyen receptores quiméricos (por ejemplo, CAR) y/o células modificadas que expresan las moléculas o receptores de antígeno. Por ejemplo, en algunos casos, se divulgan composiciones y formulaciones farmacéuticas que incluyen células T CD4+ y/o CD8+ modificadas que expresan un receptor de antígeno o un receptor de antígeno quimérico, como un TCR o un CAR similar a TCR, que se dirigen a un epítopo restringido por MHC, como como un epítopo restringido por MHC de clase la-, MHC-E-. o MHC de clase II. Ejemplos de tales son composiciones y formulaciones farmacéuticas que incluyen células CD4+ y CD8+ que están modificadas para expresar un receptor de antígeno, por ejemplo, TCR o CAR similar a TCR, que se dirigen al mismo epítopo restringido por MHC de clase II.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administrará la formulación.

Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, que no es un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizador o conservante.

En algunos aspectos, la elección del portador está determinada en parte por la célula, molécula de unión y/o anticuerpo, y/o por el método de administración particulares. Por consiguiente, hay una variedad de formulaciones adecuadas. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede contener conservantes. Los conservantes adecuados pueden incluir, por ejemplo, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sodio y cloruro de benzalconio. En algunos aspectos, se usa una mezcla de dos o más conservantes. El conservante o mezclas de los mismos están presentes típicamente en una cantidad de aproximadamente el 0,0001% a aproximadamente el 2% en peso de la composición total. Los portadores se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980). Los portadores farmacéuticamente aceptables generalmente no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no se limitan a: tampones como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquil parabenos como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos como polietilenglicol (PEG).

Los agentes tamponadores en algunos aspectos se incluyen en las composiciones. Los agentes tamponadores adecuados incluyen, por ejemplo, ácido cítrico, citrato de sodio, ácido fosfórico, fosfato de potasio y varios otros ácidos y sales. En algunos aspectos, se usa una mezcla de dos o más agentes tamponadores. El agente tamponador o mezclas de los mismos están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 4% en peso de la composición total. Se conocen métodos para preparar composiciones farmacéuticas administrables. Los métodos ejemplares se describen con más detalle en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21a ed. (1 de mayo de 2005).

Las formulaciones pueden incluir formulaciones liofilizadas y soluciones acuosas.

La formulación o composición también puede contener más de un ingrediente activo útil para la indicación, enfermedad o afección particular que se está tratando con las moléculas o células de unión, preferiblemente aquellas con actividades complementarias a la molécula o célula de unión, donde las actividades respectivas no afectan de manera adversa unas a otras. Tales ingredientes activos están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. Por tanto, en algunos casos, la composición farmacéutica incluye además otros agentes o fármacos farmacéuticamente activos, como agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, asparaginasa, busulfán, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc. En algunos casos, las células o los anticuerpos se administran en forma de sal, por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen las derivadas de ácidos minerales, como los ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, y los ácidos orgánicos, como ácidos tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzoico, glicólico, glucónico, succínico y arilsulfónico, por ejemplo, ácido p-toluenosulfónico.

Los ingredientes activos pueden estar atrapados en microcápsulas, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. En ciertos casos, la composición farmacéutica se formula como un complejo de inclusión, como un complejo de inclusión de ciclodextrina, o como un liposoma. Los liposomas pueden servir para dirigir las células huésped (por ejemplo, células T o células NK) a un tejido particular. Se encuentran disponibles muchos métodos para preparar liposomas, como los descritos, por ejemplo, en Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980) y las Patentes de Estados Unidos N° 4.235.871,4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.

En algunos aspectos, la composición farmacéutica puede emplear sistemas de administración de liberación prolongada, de liberación retardada y de liberación sostenida de tal manera que la administración de la composición se produzca antes y con tiempo suficiente para provocar la sensibilización del sitio a tratar. Hay disponibles y se conocen muchos tipos de sistemas de administración de liberación. Tales sistemas pueden evitar administraciones repetidas de la composición, aumentando de este modo la comodidad para el sujeto y el médico.

La composición farmacéutica en algunos casos contiene las moléculas de unión y/o células en cantidades eficaces para tratar o prevenir la enfermedad o afección, como una cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz. La eficacia terapéutica o profiláctica en algunos casos se monitoriza mediante la evaluación periódica de los sujetos tratados. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se repite hasta que se produce la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles y pueden determinarse. La dosificación deseada puede administrarse mediante la administración de un solo bolo de la composición, mediante múltiples administraciones de bolo de la composición o mediante la administración de infusión continua de la composición.

Las células pueden administrarse usando técnicas, formulaciones y/o dispositivos de administración estándar. Se divulgan formulaciones y dispositivos, como jeringuillas y viales, para el almacenamiento y administración de las composiciones. La administración de las células puede ser autóloga o heteróloga. Por ejemplo, las células o progenitores inmunorespondedores pueden obtenerse de un sujeto y administrarse al mismo sujeto o a un sujeto compatible diferente. Las células inmunorespondedoras derivadas de sangre periférica o su progenie (por ejemplo, derivadas in vivo, ex vivo o in vitro) pueden administrarse mediante inyección localizada, incluyendo la administración por catéter, inyección sistémica, inyección localizada, inyección intravenosa o administración parenteral. Cuando se administra una composición terapéutica (por ejemplo, una composición farmacéutica que contiene una célula inmunorespondedora modificada genéticamente), generalmente se formulara en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión, emulsión).

Las formulaciones incluyen aquellas para administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o en supositorios. En algunos casos, las poblaciones de células se administran por vía parenteral. El término "parenteral", como se usa en la presente, incluye la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal e intraperitoneal. En algunos casos, las poblaciones de células se administran a un sujeto usando administración sistémica periférica mediante inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.

Las composiciones en algunos casos se divulgan como preparaciones líquidas estériles, por ejemplo, soluciones acuosas isotónicas, suspensiones, emulsiones, dispersiones o composiciones viscosas, que en algunos aspectos pueden tamponarse a un pH seleccionado. Las preparaciones líquidas son normalmente más fáciles de preparar que los geles, otras composiciones viscosas y composiciones sólidas. Además, las composiciones líquidas son algo más cómodas de administrar, especialmente mediante inyección. Las composiciones viscosas, por otro lado, pueden formularse dentro del intervalo de viscosidad apropiado para proporcionar períodos de contacto más largos con tejidos específicos. Las composiciones líquidas o viscosas pueden comprender portadores, que pueden ser un medio solvente o dispersante que contenga, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando la molécula de unión en un solvente, como una mezcla con un portador, diluyente o excipiente adecuado como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, dextrosa o similares. Las composiciones también pueden liofilizarse. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares como agentes humectantes, dispersantes o emulsionantes (por ejemplo, metilcelulosa), agentes tamponadores del pH, aditivos gelificantes o potenciadores de la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes, colorantes, dependiendo de la vía de administración y la preparación deseadas. En algunos aspectos, pueden consultarse textos estándar para preparar preparaciones adecuadas.

Pueden añadirse varios aditivos que mejoran la estabilidad y esterilidad de las composiciones, incluyendo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevención de la acción de los microorganismos puede asegurarse mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante el uso de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas.

Las formulaciones que se usarán para la administración in vivo son generalmente estériles. La esterilidad puede lograrse fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

B. Métodos de administración y usos de las células en la terapia celular adoptiva

También se divulgan métodos para usar y usos de TCR o moléculas de unión similares a TCR o fragmentos de unión a antígeno, incluyendo receptores quiméricos y/o células modificadas que expresan las moléculas o receptores de antígeno. Tales métodos y usos incluyen métodos y usos terapéuticos, por ejemplo, que implican la administración de moléculas, células o composiciones que contienen las mismas, a un sujeto para dirigirse a epítopos peptídicos restringidos por MHC de un antígeno asociado con una enfermedad, afección o trastorno, incluyendo antígenos implicados en enfermedades malignas o transformación de células (por ejemplo, cáncer), una enfermedad autoinmune o inflamatoria, o un antígeno derivado de un patógeno viral o patógeno bacteriano.

En algunos casos, la molécula, célula y/o composición se administra en una cantidad eficaz para efectuar el tratamiento de la enfermedad o trastorno. Los usos incluyen usos de las moléculas o células en tales métodos y tratamientos, y en la preparación de un medicamento para llevar a cabo tales métodos terapéuticos. En algunos casos, los métodos se llevan a cabo administrando las moléculas o células, o las composiciones que las comprenden, al sujeto que tiene o se sospecha que tiene la enfermedad o afección. En algunos casos, los métodos tratan de este modo la enfermedad o afección o trastorno en el sujeto.

Como se usa en la presente, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo como "tratar" o "tratando") se refiere a la mejora o reducción completa o parcial de una enfermedad o afección o trastorno, o un síntoma, efecto adverso o resultado, o fenotipo asociado con las mismas. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, la prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la disminución de las consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, la prevención de la metástasis, la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad y la remisión o mejoría del pronóstico. Los términos no implican la curación completa de una enfermedad o la eliminación completa de cualquier síntoma o efectos en todos los síntomas o resultados.

Como se usa en la presente, "retrasar el desarrollo de una enfermedad" significa aplazar, obstaculizar, ralentizar, retrasar, estabilizar, suprimir y/o posponer el desarrollo de la enfermedad (como el cáncer). Este retraso puede ser de diferentes períodos de tiempo, dependiendo del historial de la enfermedad y/o del individuo que está siendo tratado. Como es evidente para un experto en la técnica, un retraso suficiente o significativo puede, en efecto, abarcar la prevención, ya que el individuo no desarrolla la enfermedad. Por ejemplo, puede retrasarse un cáncer en etapa tardía, como el desarrollo de metástasis.

"Prevenir", como se usa en la presente, incluye proporcionar profilaxis con respecto a la aparición o recurrencia de una enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero al que aún no se le ha diagnosticado con la enfermedad. En algunos casos, las moléculas y composiciones divulgadas se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

Como se usa en la presente, "suprimir" una función o actividad es reducir la función o actividad cuando se compara con las mismas condiciones, excepto por una condición o parámetro de interés, o alternativamente, en comparación con otra condición. Por ejemplo, un anticuerpo o composición o célula que suprime el crecimiento tumoral reduce la tasa de crecimiento del tumor en comparación con la tasa de crecimiento del tumor en ausencia del anticuerpo o composición o célula.

Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, molécula de unión, anticuerpo o células, o composición, en el contexto de la administración, se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones/cantidades y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado deseado, como un resultado terapéutico o profiláctico.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, anticuerpo o células, se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado, como para el tratamiento de una enfermedad, afección o trastorno y/o efecto farmacocinético o farmacodinámico del tratamiento. La cantidad terapéuticamente eficaz puede variar de acuerdo con factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del sujeto y las poblaciones de células administradas. En algunos casos, los métodos divulgados implican la administración de las moléculas, células y/o composiciones en cantidades eficaces, por ejemplo, cantidades terapéuticamente eficaces.

Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaicones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, pero no necesariamente, como se usa una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

La enfermedad o afección que se trata puede ser cualquiera en la que la expresión de un antígeno esté asociada y/o involucrada en la etiología de una afección o trastorno, por ejemplo, provoca, exacerba o está implicada de otra manera en dicha enfermedad, afección o trastorno. Las enfermedades y afecciones ejemplares pueden incluir enfermedades o afecciones asociadas con enfermedades malignas o transformación de células (por ejemplo, cáncer), enfermedad autoinmune o inflamatoria, o una enfermedad infecciosa, por ejemplo provocada por un patógeno bacteriano, viral u otro. Los antígenos ejemplares, que incluyen antígenos asociados con varias enfermedades y afecciones que pueden tratarse, se han descrito anteriormente. En casos particulares, el receptor de antígeno quimérico o TCR transgénico se une específicamente a un antígeno asociado con la enfermedad o afección.

En algunos casos, los métodos incluyen terapia celular adoptiva, mediante la cual se administran a sujetos células modificadas genéticamente que expresan las moléculas divulgadas que se dirigen a un epítopo restringido por MHC (por ejemplo, células que expresan un TCR o CAR similar a TCR). Dicha administración puede promover la activación de las células (por ejemplo, la activación de las células T) de una manera dirigida al antígeno, de tal manera que las células de la enfermedad o trastorno son objetivo de destrucción.

Por tanto, los métodos y usos divulgados incluyen métodos y usos para terapia celular adoptiva. En algunos casos, los métodos incluyen la administración de las células o una composición que contiene las células a un sujeto, tejido o célula, como uno que tiene, está en riesgo o se sospecha que tiene la enfermedad, afección o trastorno. En algunos casos, las células, poblaciones y composiciones se administran a un sujeto que tiene la enfermedad o afección particular que se va a tratar, por ejemplo, mediante terapia celular adoptiva, como terapia de células T adoptivas. En algunos casos, las células o composiciones se administran al sujeto, como un sujeto que tiene o está en riesgo de padecer la enfermedad o afección. En algunos aspectos, los métodos tratan de este modo, por ejemplo, mejoran uno o más síntomas de la enfermedad o afección.

Los métodos para la administración de células para terapia celular adoptiva son conocidos y pueden usarse en relación con los métodos y composiciones divulgados. Por ejemplo, los métodos de terapia adoptiva de células T se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2003/0170238 de Gruenberg et al; Patente de Estados Unidos N° 4.690.915 de Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol.

8(10):577-85). Ver, por ejemplo, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338.

En algunos casos, la terapia celular, por ejemplo, la terapia celular adoptiva, por ejemplo, la terapia con células T adoptiva, se lleva a cabo mediante transferencia autóloga, en la que las células se aíslan y/o preparan de otro modo a partir del sujeto que va a recibir la terapia celular, o de una muestra derivada de dicho sujeto. Por tanto, en algunos aspectos, las células se derivan de un sujeto, por ejemplo, un paciente, que necesita un tratamiento y las células, tras el aislamiento y el procesamiento, se administran al mismo sujeto.

En algunos casos, la terapia celular, por ejemplo, la terapia celular adoptiva, por ejemplo, la terapia con células T adoptiva, se lleva a cabo mediante transferencia alogénica, en la que las células se aíslan y/o preparan de otro modo a partir de un sujeto que no sea un sujeto que va a recibir o quién finalmente recibe la terapia celular, por ejemplo, un primer sujeto. En tales casos, las células se administran luego a un sujeto diferente, por ejemplo, un segundo sujeto, de la misma especie. En algunos casos, el primer y el segundo sujetos son genéticamente idénticos. En algunos casos, el primer y el segundo sujetos son genéticamente similares. En algunos casos, el segundo sujeto expresa la misma clase o supertipo de HLA que el primer sujeto.

En algunos casos, el sujeto, al que se administran las células, poblaciones de células o composiciones, es un primate, como un humano. En algunos casos, el primate es un mono o un simio. El sujeto puede ser hombre o mujer y puede tener cualquier edad adecuada, incluyendo sujetos lactantes, juveniles, adolescentes, adultos y geriátricos. En algunos casos, el sujeto es un mamífero que no es un primate, como un roedor. En algunos ejemplos, el paciente o sujeto es un modelo animal validado para enfermedad, terapia celular adoptiva y/o para evaluar resultados tóxicos como el síndrome de liberación de citoquinas (SRC).

Las moléculas de unión, como TCR, anticuerpos similares a TCR y receptores quiméricos (por ejemplo, CAR) que contienen los anticuerpos similares a TCR y las células que expresan los mismos, pueden administrarse mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo, mediante inyección, por ejemplo, inyecciones intravenosas o subcutáneas, inyección intraocular, inyección periocular, inyección subretiniana, inyección intravítrea, inyección transseptíca, inyección subescleral, inyección intracoroidea, inyección intracameral, inyección subconjuntival, inyección subconjuntival, inyección sub-Tenon, inyección retrobulbar, inyección peribulbar o administración yuxtaescleral posterior. En algunos casos, se administran por vía parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, por administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación y la administración pueden depender en parte de si la administración es breve o crónica. Varios programas de dosificación incluyen, pero no se limitan a, administraciones únicas o múltiples en varios puntos temporales, administración de bolo e infusión por pulsos.

Para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, la dosificación apropiada de la molécula o célula de unión puede depender del tipo de enfermedad a tratar, el tipo de molécula de unión, la gravedad y el curso de la enfermedad, si la molécula de unión se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta a la molécula de unión, y la discreción del médico tratante. En algunos casos, las composiciones, moléculas y células se administran adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos.

Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, las dosificaciones de una molécula de unión (por ejemplo, TCR o anticuerpo similar a TCR) pueden incluir aproximadamente de 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg), aproximadamente de 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, aproximadamente de 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg. Pueden administrarse múltiples dosis de manera intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas. Puede administrarse una dosis de carga inicial más alta, seguido de una o más dosis más bajas.

En ciertos casos, en el contexto de células modificadas genéticamente que contienen las moléculas de unión, a un sujeto se le administra el intervalo de aproximadamente un millón a aproximadamente 100 billones de células y/o la cantidad de células por kilogramo de peso corporal, como por ejemplo, de 1 millón a aproximadamente 50 billones de células (por ejemplo, aproximadamente 5 millones de células, aproximadamente 25 millones de células, aproximadamente 500 millones de células, aproximadamente 1 billón de células, aproximadamente 20 billones de células, aproximadamente 30 billones de células, aproximadamente 40 billones de células, o un intervalo definido por dos cualquiera de los valores anteriores, domo aproximadamente de 10 millones a aproximadamente 100 billones de células (por ejemplo, aproximadamente 20 millones de células, aproximadamente 30 millones de células, aproximadamente 40 millones de células, aproximadamente 60 millones de células, aproximadamente 70 millones de células, aproximadamente 80 millones de células, aproximadamente 90 millones de células, aproximadamente 10 billones de células, aproximadamente 25 billones de células, aproximadamente 50 billones de células, aproximadamente 75 billones de células, aproximadamente 90 billones de células, o un intervalo definido por dos cualquiera de los valores anteriores), y en algunos casos aproximadamente de 100 millones de células a aproximadamente 50 billones de células (por ejemplo, aproximadamente 120 millones de células, aproximadamente 250 millones de células, aproximadamente 350 millones de células, aproximadamente 450 millones de células, aproximadamente 650 millones de células, aproximadamente 800 millones de células, aproximadamente 900 millones de células, aproximadamente 3 billones de células, aproximadamente 30 billones de células, aproximadamente 45 billones de células) o cualquier valor entre estos intervalos y/o por kilogramo de peso corporal. De nuevo, las dosificaciones pueden variar dependiendo de los atributos particulares de la enfermedad o trastorno y/o del paciente y/u otros tratamientos.

En algunos casos, las células o moléculas de unión (por ejemplo, TCR o anticuerpos similares a TCR) se administran como parte de un tratamiento de combinación, como simultáneamente o secuencialmente con, en cualquier orden, otra intervención terapéutica, como otro anticuerpo o célula o receptor o agente modificados, como un agente citotóxico o terapéutico.

Las células o moléculas de unión (por ejemplo, TCR o anticuerpos similares a TCR) en algunos casos se coadministran con uno o más agentes terapéuticos adicionales o en conexión con otra intervención terapéutica, ya sea simultánea o secuencialmente en cualquier orden. En algunos contextos, las células se coadministran con otra terapia lo suficientemente cercana en el tiempo como para que las poblaciones de células potencien el efecto de uno o más agentes terapéuticos adicionales, o viceversa. En algunos casos, las células o moléculas de unión (por ejemplo, TCR o anticuerpos similares a TCR) se administran antes del uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunos casos, las células o moléculas de unión (por ejemplo, TCR o anticuerpos similares a TCR) se administran después del uno o más agentes terapéuticos adicionales.

Una vez que las células se han administrado a un mamífero (por ejemplo, un humano), la actividad biológica de las poblaciones de células y/o moléculas de unión modificadas (por ejemplo, TCR o anticuerpos similares a TCR) en algunos aspectos se mide mediante cualquiera de una serie de métodos conocidos. Los parámetros para evaluar incluyen la unión específica de una célula T natural o modificada u otra célula inmunitaria al antígeno, in vivo, por ejemplo, mediante imagenología, o ex vivo, por ejemplo, mediante ELISA o citometría de flujo. En ciertos casos, la capacidad de las células modificadas para destruir células objetivo puede medirse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, como los ensayos de citotoxicidad descritos en, por ejemplo, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009) y Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25 40 (2004). En ciertos casos, la actividad biológica de las células también puede medirse ensayando la expresión y/o secreción de ciertas citoquinas, como CD 107a, IFN^y, IL-2 y TNF. En algunos aspectos, la actividad biológica se mide evaluando el resultado clínico, como la reducción de la carga tumoral.

En ciertos casos, las células modificadas se modifican de varias maneras, de tal manera que se incrementa su eficacia terapéutica o profiláctica. Por ejemplo, el CAR o TCR modificados expresados por la población pueden conjugarse directa o indirectamente a través de un conector a una fracción direccionamiento. La práctica de conjugar compuestos, por ejemplo, el CAR o TCR, con fracciones de direccionamiento es conocida en la técnica. Ver, por ejemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3:1 11 (1995) y la Patente de Estados Unidos N° 5.087.616.

VI. Definiciones

Como se usa en la presente, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, "un" o "uno" significa "por lo menos uno" o "uno o más". Se entiende que los aspectos y variaciones descritos en la presente incluyen aspectos y variaciones "que consisten" y/o "que consisten esencialmente de" aspectos y variaciones.

A lo largo de esta divulgación, se presentan varios aspectos de la materia reivindicada en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la materia reivindicada. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los posibles subintervalos, así como valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor expuesto o intermedio en ese intervalo expuesto está incluido dentro de la materia reivindicada. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños, y también se incluyen dentro de la materia reivindicada, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo expuesto. Cuando el intervalo expuesto incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos de los límites incluidos también se incluyen en la materia reivindicada. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

El término "aproximadamente" como se usa en la presente se refiere al intervalo de error habitual para el valor respectivo fácilmente conocido por el experto en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en la presente incluye (y describe) realizaciones que están dirigidas a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".

Como se usa en la presente, "aislado" o "purificado con referencia a un péptido, proteína o polipéptido se refiere a una molécula que está sustancialmente libre de todos los demás polipéptidos, contaminantes, reactivos de partida u otros materiales, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Puede determinarse que las preparaciones están sustancialmente libres si parecen estar libres de impurezas fácilmente detectables según se determina mediante métodos estándar de análisis, como cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografía en capa fina (TLC) o electroforesis capilar (CE), usados por los expertos en la técnica para evaluar dicha pureza, o suficientemente pura para que una purificación adicional no altere detectablemente las propiedades físicas y químicas de la sustancia.

Como se usa en la presente, el término "recombinante" se refiere a una célula, microorganismo, molécula de ácido nucleico o vector que ha sido modificado mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico exógena, como heteróloga, o se refiere a una célula o microorganismo que ha sido alterado de tal manera que se controla, desregula o constituye la expresión de una molécula o gen de ácido nucleico endógeno, donde dichas alteraciones o modificaciones pueden introducirse mediante ingeniería genética. Las alteraciones genéticas pueden incluir, por ejemplo, modificaciones que introducen moléculas de ácidos nucleicos (que pueden incluir un elemento de control de la expresión, como un promotor) que codifican una o más proteínas o enzimas, u otras adiciones, deleciones, sustituciones u otras alteraciones funcionales de moléculas de ácidos nucleicos o la adición al material genético de una célula. Las modificaciones ejemplares incluyen aquellas en regiones codificantes o fragmentos funcionales de las mismas de polipéptidos heterólogos u homólogos de un molécula de referencia u original.

Como se usa en la presente, una composición se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos, sustancias o compuestos, incluyendo las células. Puede ser una solución, una suspensión, líquido, polvo, pasta, acuoso, no acuoso o cualquier combinación de los mismos.

Como se usa en la presente, una afirmación de que una célula o población de células es "positiva" para un marcador particular se refiere a la presencia detectable sobre o en la célula de un marcador particular, típicamente un marcador de superficie. Cuando se hace referencia a un marcador de superficie, el término se refiere a la presencia de expresión de superficie detectada por citometría de flujo, por ejemplo, mediante tinción con un anticuerpo que se une específicamente al marcador y detectando dicho anticuerpo, en donde la tinción es detectable mediante citometría de flujo a un nivel sustancialmente por encima de la tinción detectada llevando a cabo el mismo procedimiento con un control de isotipo coincidente en condiciones por lo demás idénticas y/o a un nivel sustancialmente similar al de la célula que se sabe que es positiva para el marcador, y/o a un nivel sustancialmente más alto que el de una célula que se sabe que es negativa para el marcador.

Como se usa en la presente, una afirmación de que una célula o población de células es "negativa" para un marcador particular se refiere a la ausencia de presencia sustancial detectable sobre o en la célula de un marcador particular, típicamente un marcador de superficie. Cuando se hace referencia a un marcador de superficie, el término se refiere a la ausencia de expresión de superficie detectada por citometría de flujo, por ejemplo, mediante tinción con un anticuerpo que se une específicamente al marcador y detectando dicho anticuerpo, en donde la tinción no se detecta mediante citometría de flujo a un nivel sustancialmente por encima de la tinción detectada llevando a cabo el mismo procedimiento con un control de isotipo coincidente en condiciones por lo demás idénticas, y/o a un nivel sustancialmente más bajo que el de la célula que se sabe que es positiva para el marcador, y/o a un nivel sustancialmente similar en comparación con el de una célula que se sabe que es negativa para el marcador.

El término "constructo" se refiere a cualquier polinucleótido que contiene una molécula de ácido nucleico recombinante. Un constructo puede estar presente en un vector (por ejemplo, un vector bacteriano, un vector viral) o puede estar integrado en un genoma.

El término "vector", como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al que está enlazado. Los vectores pueden ser, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, virus, un vector de ARN o una molécula de ADN o ARN lineal o circular que puede incluir moléculas de ácidos nucleicos cromosómicas, no cromosómicas, semisintéticas o sintéticas. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están enlazados operativamente. A tales vectores se hace referencia en la presente como "vectores de expresión". Entre los vectores se encuentran los vectores virales, como los vectores CMV, incluyendo aquellos que tienen un genoma que lleva otro ácido nucleico y capaz de insertarse en un genoma huésped para la propagación del mismo.

Como se usa en la presente, "operativamente enlazado" se refiere a la asociación de componentes, como una secuencia codificante (por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo) y una secuencia de control de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia o secuencias reguladoras), de tal manera que permita la expresión génica cuando se enlazan covalentemente de tal manera que colocan la expresión o transcripción y/o traducción de la secuencia codificante bajo la influencia o el control de la secuencia de control del ácido nucleico. Por lo tanto, significa que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera pretendida.

El término "expresión", como se usa en la presente, se refiere al proceso mediante el cual se produce un polipéptido en base a la secuencia codificante de una molécula de ácido nucleico, como un gen. El proceso puede incluir transcripción, control postranscripcional, modificación postranscripcional, traducción, control postraduccional, modificación postraduccional o cualquier combinación de los mismos.

El término "introducido" en el contexto de insertar una molécula de ácido nucleico en una célula, significa "transfección" o "transformación" o "transducción" e incluye una referencia a la incorporación de una molécula de ácido nucleico en una célula eucariota o procariota en donde la molécula de ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de una célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido o ADN mitocondrial), convertirse en un replicón autónomo o expresarse transitoriamente (por ejemplo, ARNm transfectado).

Como se usa en la presente, un "sujeto" es un mamífero, como un humano u otro animal, y típicamente es un humano.

Como se usa en la presente, un control se refiere a una muestra que es sustancialmente idéntica a la muestra de prueba, excepto que no se trata con un parámetro de prueba, o, si es una muestra de plasma, puede ser de un voluntario normal no afectado con la afección de interés. Un control también puede ser un control interno.

A menos que se defina lo contrario, se pretende que todos los términos de la técnica, notaciones y otros términos o terminología técnicos y científicos usados en la presente tengan el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la materia reivindicada. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen en la presente para mayor claridad y/o para una fácil referencia, y no debe interpretarse necesariamente la inclusión de tales definiciones en la presente como una diferencia sustancial con respecto a lo que se entiende generalmente en la técnica.

Si una definición expuesta en la presente es contraria o incompatible con una definición establecida en las patentes, solicitudes, solicitudes publicadas y otras publicaciones a las que se hace referencia en la presente, prevalecerá la definición expuesta en la presente.

Los títulos de las secciones que se usan en la presente son solo con propósitos organizativos y no deben interpretarse como limitativos de la materia descrita.

TABLAS DE SECUENCIAS

(continuación)

(continuación)

(continuación)

continuación

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar un epítopo peptídico in vitro, que comprende:

a) introducir una combinación de moléculas de ácidos nucleicos sintéticas en células que expresan una molécula de MHC-E, en donde la combinación de moléculas de ácidos nucleicos sintéticas comprende moléculas de ácidos nucleicos de una biblioteca de ADNc, cada una comprendiendo individualmente una secuencia codificante de uno de una combinación de antígenos proteicos;

c) detectar o identificar el uno o más péptidos del antígeno proteico en el contexto de la molécula de MHC-E

2. El método de la reivindicación 1, en donde la biblioteca de ADNc es un biblioteca de ADNc derivada de tumores.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el tumor es un melanoma, sarcoma, carcinoma de mama, carcinoma renal, carcinoma de pulmón, carcinoma de ovario, carcinoma de próstata, carcinoma colorrectal, carcinoma de páncreas, tumor escamoso de cabeza y cuello o carcinoma escamoso de pulmón.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la combinación de moléculas de ácidos nucleicos sintéticas y/o la combinación de antígenos proteicos codificados está presente en grupos ortogonales, cada uno de dichos grupos ortogonales comprendiendo por lo menos dos o más moléculas de ácidos nucleicos sintéticas diferentes y/o antígenos proteicos codificados, en donde por lo menos una molécula de ácido nucleico sintética y/o antígeno proteico codificado es el mismo en por lo menos dos grupos ortogonales.

5. El método de la reivindicación 4, en donde un péptido en el contexto de una molécula de MHC-E se detecta o identifica si el péptido se eluye o se extrae de una molécula de MCH-E o de una célula que expresa una molécula de MHC-E en por lo menos dos grupos ortogonales que comprenden el mismo péptido.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5-, en donde el método se realiza en una matriz; opcionalmente en donde la matriz está en una matriz direccionable o espacial.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde las células son células primarias o son una línea celular;

opcionalmente en donde las células son células humanas;

y/o e donde las células se seleccionan entre fibroblastos, una célula B, una célula dendrítica y un macrófago; y/o en donde las células son células que presentan antígenos artificiales.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde las células se modifican genéticamente o recombinantemente para expresar la molécula de MHC-E.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde:

(1) las células se han o se incuban con un agente activador o estimulador antes de o simultáneamente con la introducción de la combinación de las moléculas de ácidos nucleicos sintéticas en las células; o

(2) el método comprende además incubar las células con un agente activador o estimulador antes de o simultáneamente con la introducción de la combinación de moléculas de ácidos nucleicos sintéticos en las células;

en donde la incubación con el agente activador o estimulador aumenta la expresión de la molécula de MHC-E en la superficie de la célula en comparación con la expresión de la molécula de MHC-E en ausencia de dicha activación o estimulación;

opcionalmente en donde dicha activación o estimulación se efectúa en presencia de interferón gamma.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde las células se reprimen y/o alteran en un gen que codifica una molécula de MHC de clase I clásica y/o no expresa una molécula de MHC de clase I clásica.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende además determinar si el péptido o péptidos identificados o detectados provocan una respuesta inmune específica del antígeno;

opcionalmente en donde la respuesta inmune específica del antígeno es una respuesta de células T humoral o una respuesta de linfocitos T citotóxicos.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde las células son células probadas y el método comprende además:

detectar o identificar péptidos en el contexto de una molécula de MHC-E en la superficie de una célula de control, dicha célula de control no habiendo sido puesta en contacto con el uno o más péptidos; y

identificar el péptido o los péptidos en el contexto de una molécula de MHC-E que son únicos para las células de prueba en comparación con la célula de control , identificando de este modo el uno o más péptidos del antígeno en el contexto de una molécula de MHC-E.

13. Un método para identificar una molécula de unión a péptidos o un fragmento de unión al antígeno de la misma que se una a un péptido restringido por MHC-E, que comprende:

a) identificar un péptido mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12;

b) evaluar la unión de una pluralidad de moléculas de unión al péptido candidatas o fragmentos de unión al antígeno de las mismas para una molécula de MHC-E que comprende el péptido de a) unido a la misma; y c) identificar de entre la pluralidad una o más moléculas de unión al péptido que se unen al péptido en el contexto de la molécula de MHC-E

14. El método de la reivindicación 13, en donde la pluralidad de moléculas de unión a péptido candidatas comprende uno o más receptores de células T (TCR), fragmentos de unión a antígeno de un TCR, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

15. El método de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en donde la pluralidad de moléculas de unión a péptidos candidatas comprende por lo menos 2, 5, 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, o más moléculas diferentes.