CN103933560B - 一种应用Ii‑Key活性四肽携带法氏囊VP2和新城疫HN抗原肽表位嵌合疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种应用Ii‑Key活性四肽携带法氏囊VP2和新城疫HN抗原肽表位嵌合疫苗的制备方法，通过人工合成Ii‑Key与鸡传染性法氏囊病毒VP2肽表位（197‑209）和新城疫病毒HN肽表位（345‑353）的嵌合体基因，分别插入pET‑32a原核表达载体后转化大肠杆菌Rosetta，经镍亲和柱层析纯化后，将重组蛋白免疫SPF级BAL b/c小鼠，采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠体内的抗体水平；与单纯VP2197‑209/HN345‑353串联表位对照组相比较，本发明构建的基于活性Ii‑Key四肽的嵌合体疫苗组抗体效价平均提高了13.72倍。该疫苗具有特异性强、易于制备、免疫效果好的特点。
Description
技术领域
本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及构建一种活性四肽Ii-Key（LRMK）与鸡传染性法氏囊病毒VP2肽表位和新城疫病毒HN肽表位的嵌合体疫苗。
背景技术
主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex,MHC）Ⅱ类分子在抗原递呈细胞中结合抗原肽并将其递呈到细胞表面，激活免疫应答反应，而在结合抗原肽之前需要伴侣分子－恒定链（invariant chain，Ii）占据其α、β链的抗原结合槽，在内质网中形成九聚体。恒定链主要协助MHCⅡ类分子转运外源性抗原肽，并阻止内源性抗原肽的结合。传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease virus，IBDV）和新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是常见危害鸡群的重要传染性疾病的病原。研究表明IBDV的VP2蛋白的197CDSSDRPRVYTIT209和NDV HN蛋白的346DEQDYQIR353肽分别为IBDV和NDV的线性中和表位，分别具有抗这两种病毒的活性。但是同时将两种表位与恒定链关键基元（Ii-Key）连接设计能携带两种病毒抗原表位并能够显著增强免疫应答的疫苗还是空白。
发明内容
本发明的目的通过串联鸡传染性法氏囊病毒VP2肽表位（197-209）和新城疫病毒HN肽表位（345-353）的线性中和表位基因，并获得可溶性表达的蛋白，在N端与抗原递呈中重要分子－恒定链中关键基元（LRMK）四肽连接，有效提高MHC II类分子对抗原的递呈效率，达到增强免疫应答水平的目的。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
应用Ii-Key活性四肽携带法氏囊VP2和新城疫HN抗原肽表位嵌合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
（1）人工合成Ii-Key四肽与VP2（197-209）表位肽和HN（345-353）表位肽的基因序列，获得pMD-19T-Ii-Key/VP2197-209/HN345-353重组质粒；
（2）根据目的基因序列设计特异性引物，从上述重组质粒中以PCR方法分别扩增目的基因片段后插入原核表达载体pET-32a，获得重组表达载体转化大肠杆菌Rosetta，获得重组菌；
（3）将重组菌通过IPTG诱导表达后，经超声波裂解菌体，收集上清后用NiSepharoseTM6Fast Flow镍亲和层析柱纯化，与弗氏佐剂混匀后，获得His-Ii-Key/VP2197-209/HN345-353嵌合体疫苗，对照组分别设His-VP2197-209/HN345-353和His标签蛋白组；
（4）通过腹腔注射免疫SPF级BAL b/c小鼠，采集免疫鼠的血清，以间接ELISA方法检测各组血清抗体水平。
所述的活性四肽Ii-Key（LRMK）与鸡传染性法氏囊病毒VP2（197-209）肽表位和新城疫病毒HN（345-353）肽表位的嵌合体构建过程如下：
（1）Ii-Key四肽与VP2197-209和HN345-353串联表位的设计及基因合成：
首先设计VP2197-209和HN345-353串联表位，表位通过连接肽AAY（Ala-Ala-Tyr）连接，Ii-Key再与上述串联表位连接，如图4 Ii-Key-VP2197-209/HN345-353嵌合体疫苗构建示意图所示；
疫苗肽氨基酸序列：N-LRMKAAYCDSSDRPRVYTITAAYDGQDYQIR-C
设计疫苗氨基酸对应的核苷酸序列，在所述基因序列5’端添加EcoR I,3’端添加终止密码子TGA和SalI酶切位点，全基因合成，该合成序列插入到pMD-19T克隆载体中发回；
（2）Ii-Key/VP2197-209/HN345-353嵌合体基因的克隆、表达与蛋白纯化：
以pMD19-T重组质粒为模板，设计合成所述特异性引物如下：
P1：5'-CGGAATTCCTTCGCATGAAG-3'，下划线部分为EcoR I酶切位点；
P2：5'-ACGCGTCGACTCACCGAATTTG-3'，下划线部分为Sal I酶切位点；
对照序列VP2197-209/HN345-353特异性引物设计如下：
P1：5'-CGGAATTCATGTGTGACAGC-3'，下划线部分为EcoR I酶切位点；
P2：5'-GCGTCGACTCACCGAATTTG-3'，下划线部分为Sal I酶切位点；
将所述Ii-Key/VP2197-209/HN345-353基因片段及对照VP2197-209/HN345-353采用相同的PCR扩增条件，扩增目的片段。通过DNA Extraetion Kit纯化回收和EcoR I与SalI双酶切后与同样双酶切的pET-32a原核表达载体连接、转化E.coli Rosetta菌，获得pET-32a-Ii-Key/VP2197-209/HN345-353和对照pET-32a-VP2197-209/HN345-353重组质粒；
挑取单克隆重组菌接种Ampr LB液体培养基，37℃振荡培养4h，加入0.8mmol/LIPTG诱导5h后收集菌体，通过反复冻融和超声波裂解细胞，离心后分别收集上清和沉淀以15%SDS-PAGE凝胶电泳对融合蛋白表达形式进行鉴定，对重组蛋白大量诱导表达，取裂解液上清用Ni SepharoseTM6Fast Flow镍层析柱进行亲和层析，用HiTrap Desalting的Sephadex G-25柱对纯化蛋白进行脱盐，获得纯化的融合蛋白。
所述的嵌合疫苗的制备过程如下：
（1）抗原乳化：
对所述嵌合体蛋白His-Ii-Key/VP2197-209/HN345-353采用Folin酚法测蛋白浓度，取100μg所述蛋白与等体积弗氏完全/不完全佐剂充分混匀，乳化；
（2）疫苗免疫：
选取18～20g SPF级BAL b/c小鼠，首次免疫采用弗氏完全佐剂与等体积嵌合体蛋白乳化，每只小鼠经腹腔注射100μg左右的嵌合体蛋白；15d后采用弗氏不完全佐剂与等体积嵌合体蛋白乳化，免疫；间隔10d后再加强免疫2次；最后一次免疫后第7天进行采血，分离抗血清备用。
所述的步骤（4）中采用间接ELISA方法检测免疫效应的过程如下：
（1）抗原包被：以每孔100μL人工合成10μg/ml VP2197-209/HN345-353多肽4℃过夜包被96孔酶标板，置于微量振荡器上洗涤3次，每次2min；
（2）一抗反应：将所述抗血清倍比稀释后每孔加入100μL，37℃反应40min，洗涤同上；
（3）酶标二抗反应：每孔加入100μL HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，37℃反应40min，洗涤同上；
（4）显色：加入邻苯二胺（OPD）底物液，15min避光显色；
（5）终止反应：每孔加入100μL2mol/L H2SO4溶液；
（6）检测：使用酶标仪检测OD492nm吸光值，当待检孔OD值大于阴性对照孔2.1倍的抗体稀释度判读为抗体效价。
基于Ii-Key的VP2/HN嵌合体疫苗处理组比肽表位串联组的抗体水平明显增高（p<0.05），平均效价提高了13.72倍。
融合蛋白的反应原性：
以15%SDS-PAGE凝胶电泳融合蛋白后转PVDF膜，恒流1.5mA/cm2，1.5h，以5％脱脂乳室温封闭2h，PBST洗涤3次，每次10min，加入适量稀释的抗His的单克隆抗体4℃过夜结合，洗涤后加入HRP标记的羊抗小鼠抗体，室温结合2h，PBST洗涤，加入DAB显色剂显色后终止反应,图3表明，嵌合体蛋白具有良好的免疫原性。
本发明的有益效果：
与单纯VP2197-209/HN345-353串联表位对照组相比较，本发明构建的基于活性Ii-Key四肽的嵌合体疫苗组抗体效价平均提高了13.72倍,该疫苗具有特异性强、易于制备、免疫效果好的特点。
附图说明
图1为SDS-PAGE电泳分析嵌合体蛋白的表达形式，泳道1蛋白marker；2:pET-32a-His上清;3:pET-32a-His沉淀;4:His-VP2/HN上清;5:His-VP2/HN沉淀;6:His-Ii-Key/VP2/HN上清；7:His-Ii-Key/VP2/HN沉淀
图2为融合蛋白的纯化鉴定结果：泳道1为蛋白Marker;泳道2：纯化的His标签蛋白；泳道3：纯化的Ii-Key/VP2/HN；纯化的4：His-VP2/HN
图3为嵌合体诱导的抗体水平及其免疫原性的检测。图A为间接ELISA检测的抗体水平（采用Origin8.0软件分析）；图B为Western blot检测融合蛋白的免疫原性
图4为Ii-Key-VP2197-209/HN345-353嵌合体疫苗构建示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明,但不限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
下述实施例中的比例，如无特别说明，均为体积比例。
1、嵌合体设计和基因合成
首先设计VP2197-209和HN345-353串联表位，表位通过AAY连接肽（Ala-Ala-Tyr）连接，Ii-Key再与上述串联表位连接。具体序列如下：5’-CGgaattcCTTCGCATGAAGGCCGCCTACTGTGACAGCAGTGACAGGCCCAGAGTCTACACTATAACTGCCGCCTACGATGGACAAGATTACCAAATTCGGTGAgtcgacgcGT-3’
在所述基因序列5’端添加EcoR I,3’端添加终止密码子TGA和SalI酶切位点，全基因合成，插入到pMD-19T克隆载体。
2、嵌合体基因的克隆、表达与蛋白纯化
以pMD19-T重组质粒为模板，设计合成所述特异性引物如下：
采用相同的PCR扩增条件为：94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸5min，扩增片段通过DNA Extraetion Kit纯化回收和EcoR I与Sal I双酶切后与同样双酶切的pET-32a原核表达载体4℃冰箱过夜连接，第二天转化E.coli Rosetta菌。
挑取阳性单克隆接种Ampr LB液体培养基，37℃振荡培养4h，加入0.8mmol/L IPTG诱导5h后收集菌体，通过反复冻融和超声波裂解细胞，离心后分别收集上清和沉淀以15%SDS-PAGE凝胶电泳对融合蛋白表达形式进行鉴定。对重组蛋白大量诱导表达，取裂解液上清用Ni SepharoseTM6Fast Flow镍层析柱进行亲和层析，用HiTrap Desalting的SephadexG-25柱对纯化蛋白进行脱盐，获得纯化的融合蛋白。
3、嵌合体疫苗的制备：
3.1蛋白检测及乳化
对纯化的嵌合体蛋白His-Ii-Key/VP2197-209/HN345-353采用Folin酚法测蛋白浓度，取蛋白与等体积弗氏完全或者不完全佐剂充分混匀，乳化。
3.2小鼠免疫
首免：选取18～20g SPF级BAL b/c雌鼠，免疫采用弗氏完全佐剂与等体积嵌合体蛋白乳化，采用腹腔注射法，每只小鼠注射100μg嵌合体蛋白
强化免疫：15d后采用弗氏不完全佐剂与等体积嵌合体蛋白乳化，免疫。间隔10d后再加强免疫2次，免疫方法同前。最后一次免疫后第7天进行采血，分离抗血清备用。
4、间接ELISA方法检测抗体水平：
4.1工作液配制
（1）磷酸盐缓冲液（0.01mol/L PBS）：NaCl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KCL0.2g，加蒸馏水定容至1000mL，调pH7.4。
（2）洗涤液（PBST）：1000mL、0.01mol/L pH7.4PBS中加入0.5mL Tween-20，混匀即可。
（3）封闭液：将5g脱脂奶粉溶于100mL的0.01mol/L pH7.4PBS溶液中，混匀即可。
（4）稀释液：1000mL、0.01mol/L pH7.4PBS中加入1mL Tween-20，1g明胶，稍加热溶解。
（5）包被缓冲液：Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，加去离子水至1000mL，调pH9.6。
（6）底物液（现配现用，避光保存）：
A液：柠檬酸9.6g，加去离子水至500mL；
B液：HPO4·12H2O35.85g，加去离子水定容至500mL；
A液48.6mL与B液51.4mL混合，加入邻苯二胺40mg，待充分溶解后加入30%（V/V）H2O250μL，即成底物液。
（7）终止液：2mol/L H2SO4溶液。
（8）多表位串联肽SE A/G系列浓度标准品溶液
取纯化后的多表位串联肽SE A/G（1mg/mL）用稀释液稀释成1000、500、100、50、10、5.0、1.0ng/mL系列浓度溶液。
（9）包被抗原工作液
取纯化后的多表位串联肽SE A/G（1mg/mL）用稀释液稀释成0.75μg/mL。
（10）特异性抗体工作液
用稀释液将纯化后的兔抗多表位串联肽SE A/G特异性抗体稀释成1:256000。
（11）酶标二抗工作液：用稀释液将羊抗兔HRP-IgG做1:5000稀释。
4.2器材
（1）乳白色聚苯乙烯96孔酶联免疫板
（2）酶标仪
4.3间接ELISA的操作步骤
（1）包被：用包被缓冲溶液将10μg/ml合成肽VP2197-209/HN345-353多肽（生物公司合成）加入酶标孔，4℃过夜；
（2）洗板：以PBST为洗涤液，300μL/孔，在洗板机上洗涤3次，2min/次，拍干。
（3）从第1孔至倒数第三孔加入100μL将所述抗血清倍比稀释后，倒数第二孔加阴性血清，最后一空空白对照，37℃反应40min。
（4）洗板1次，拍干。
（5）加酶标二抗：每孔加100μL1:5000稀释的羊抗兔HRP-IgG，混匀，37℃孵育40min。
（6）洗板：同（2），拍干。
（7）显色：将底物液加入到酶标板中，100μL/孔，常温下显色10-15min，然后每孔加入100μL2mol/L H2SO4溶液终止反应。
（8）结果测定：在492nm处测量阴性对照和待检样品的光密度（OD）值，推算出抗体效价。
Claims (4)
1.一种Ii-Key活性四肽携带法氏囊VP2 和新城疫HN 抗原肽表位嵌合体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）人工合成Ii-Key 四肽与VP2197-209表位肽和HN345-353表位肽的基因序列，获得pMD-19T-Ii-Key/VP2197-209/HN345-353重组质粒；
（2）根据目的基因序列设计特异性引物，从上述重组质粒中以PCR 方法分别扩增目的基因片段后插入原核表达载体pET-32a，获得重组表达载体转化大肠杆菌Rosetta，获得重组菌；
（3）将重组菌通过IPTG 诱导表达后，经超声波裂解菌体，收集上清后用NiSepharoseTM6Fast Flow 镍亲和层析柱纯化，获得His-Ii-Key/VP2197-209/HN345-353嵌合体蛋白，与弗氏佐剂混匀后，获得His-Ii-Key/VP2197-209/HN345-353嵌合体疫苗， Ii-Key/VP2197-209/HN345-353嵌合体的氨基酸序列为：N-LRMKAAYCDSSDRPRVYTITAAYDGQDYQIR-C，对照组分别设His-VP2197-209/HN345-353和His 标签蛋白组；
（4）通过腹腔注射免疫SPF 级BAL b/c 小鼠，采集免疫鼠的血清，以间接ELISA 方法检测各组血清抗体水平。
2.根据权利要求1 所述的一种Ii-Key 活性四肽携带法氏囊VP2 和新城疫HN 抗原肽表位嵌合体的制备方法，其特征在于：所述的活性四肽Ii-Key 与鸡传染性法氏囊病毒VP2197-209肽表位和新城疫病毒HN345-353肽表位的嵌合体构建过程如下：
(1)Ii-Key 四肽与VP2197-209和HN345-353串联表位的设计及基因合成：
首先设计VP2197-209和HN345-353串联表位，表位通过连接肽AAY连接，所述AAY为Ala-Ala-Tyr，Ii-Key 再与上述串联表位连接，形成Ii-Key-VP2197-209/HN345-353嵌合体；
嵌合体氨基酸序列：N-LRMKAAYCDSSDRPRVYTITAAYDGQDYQIR-C
设计嵌合体氨基酸对应的核苷酸序列，在所述基因序列5’端添加EcoR I，3’端添加终止密码子TGA和Sal I酶切位点，全基因合成，该合成序列插入到pMD-19T 克隆载体中；
(2)Ii-Key/VP2197-209/HN345-353嵌合体基因的克隆、表达与蛋白纯化：
以pMD19-T 重组质粒为模板，设计合成所述特异性引物如下：
P1 ：5'-CGGAATTCCTTCGCATGAAG-3'，下划线部分为EcoR I 酶切位点；
P2 ：5'-ACGCGTCGACTCACCGAATTTG-3'，下划线部分为Sal I 酶切位点；
对照序列VP2197-209/HN345-353特异性引物设计如下：
P1 ：5'-CGGAATTCATGTGTGACAGC-3'，下划线部分为EcoR I 酶切位点；
P2 ：5'-GCGTCGACTCACCGAATTTG-3'，下划线部分为Sal I 酶切位点；
将所述Ii-Key/VP2197-209/HN345-353基因片段及对照VP2197-209/HN345-353采用相同的PCR 扩增条件，扩增目的片段；
通过DNA Extraction Kit纯化回收和EcoR I与Sal I双酶切后与同样双酶切的pET-32a原核表达载体连接、转化E.coliRosetta菌，获得pET-32a-Ii-Key/VP2197-209/HN345-353和对照pET-32a-VP2197-209/HN345-353重组质粒；
挑取单克隆重组菌接种AmprLB 液体培养基，37℃振荡培养4h，加入0.8mmol/L IPTG诱导5h 后收集菌体，通过反复冻融和超声波裂解细胞，离心后分别收集上清和沉淀以15％SDS-PAGE 凝胶电泳对融合蛋白表达形式进行鉴定，对重组蛋白大量诱导表达，取裂解液上清用Ni SepharoseTM6Fast Flow镍层析柱进行亲和层析，用HiTrap Desalting的SephadexG-25 柱对纯化蛋白进行脱盐，获得纯化的融合蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种Ii-Key活性四肽携带法氏囊VP2和新城疫HN 抗原肽表位嵌合体的制备方法，其特征在于：抗原乳化和免疫过程如下：
（1）抗原乳化：
对嵌合体蛋白His-Ii-Key/VP2197-209/HN345-353采用Folin酚法测蛋白浓度，取100μg所述蛋白与等体积弗氏完全/不完全佐剂充分混匀，乳化；
（2）免疫：
选取18 ~20g SPF级BAL b/c小鼠，首次免疫采用弗氏完全佐剂与等体积嵌合体蛋白乳化，每只小鼠经腹腔注射100μg 的嵌合体蛋白；15d 后采用弗氏不完全佐剂与等体积嵌合体蛋白乳化，免疫；间隔10d 后再加强免疫2 次；最后一次免疫后第7 天进行采血，分离抗血清备用。
4.根据权利要求1 所述的一种Ii-Key 活性四肽携带法氏囊VP2 和新城疫 HN抗原肽表位嵌合体的制备方法，其特征在于：所述的步骤（4）中采用间接ELISA方法检测免疫效应的过程如下：
（1）抗原包被：以每孔100μL 人工合成10μg/ml VP2197-209/HN345-353多肽4℃过夜包被96孔酶标板，置于微量振荡器上洗涤3次，每次2min ；
（2）一抗反应：将抗血清倍比稀释后每孔加入100μL，37℃反应40min，洗涤同上；
（3）酶标二抗反应：每孔加入100μL HRP 标记的羊抗小鼠IgG 抗体，37℃反应40min，洗涤同上；
（4）显色：加入邻苯二胺底物液，15min避光显色；
（5）终止反应：每孔加入100μL 2mol/L H2SO4溶液；
（6）检测：使用酶标仪检测OD492nm 吸光值，当待检孔OD 值大于阴性对照孔2.1 倍的抗体稀释度判读为抗体效价。
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