CN1659436A - 分离配体的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了一种分离具有结合MHC/HLA分子的能力的配体和含有该配体和该MHC/HLA分子的复合物的方法，该方法包括下列步骤：—提供配体集合，该集合含有可与该MHC/HLA分子结合的配体和不与该MHC/HLA分子结合的配体，—使该MHC/HLA分子接触该配体集合，从而使具有结合该MHC/HLA分子的能力的配体与该MHC/HLA分子结合，形成含有该配体和该MHC/HLA分子的复合物，—检测该复合物，任选地使该复合物与不与该MHC/HLA分子结合的配体分离，—任选地从该复合物中分离并表征该配体，以及一种分离具有结合MHC/HLA分子的能力的T细胞表位的方法。

Description

分离配体的方法
本发明涉及一种分离配体的方法，特别是分离具有结合MHC/HLA分子的能力的T细胞表位的方法。
免疫系统是相关细胞型和分子的一个复杂网络，为了保护多细胞生物抵抗传染性微生物它们已经进化。能够分为进化较早的先天(或自然)免疫和适应性(或获得性)免疫。先天免疫系统识别模式是针对病原体通常共有的和基本的模式。对于数量有限的分子结构，种系编码的受体已经进化。相反，适应性免疫系统的细胞——B和T淋巴细胞——能够识别多种抗原结构。这些受体，根据表达它们的细胞型，被命名为B细胞受体(BCR，其可溶性形式称为抗体)和T细胞受体(TCR，只是细胞表面结合形式)，通过体细胞重组产生，显示克隆分布。因此，最初只有少量细胞具有某种特异性。在抗原遇到这些细胞后，开始分裂(克隆扩增)，产生能够对付该抗原的效应群体。在抗原清除后，特异识别这种抗原的特化细胞亚群仍然具有免疫记忆。总之，适应性免疫系统是缓慢的(与先天免疫相比)，然而是特异的，在重复暴露于一种给定病原体/抗原后增强。
T细胞在适应性免疫中具有中心作用。它们的受体(TCR)识别细胞表面上的“主要组织相容性复合物”(MHC或HLA)：肽复合物。这些肽被称为T细胞表位，代表抗原的降解产物。T细胞有两个主要类别：CD8阳性细胞毒性T细胞(CTL)限于MHC I类。CD4阳性辅助T细胞(HTL)限于MHC II类。HTL是适应性免疫的多种特征所必需的：所谓“专业抗原呈递细胞”(APC)的激活，免疫球蛋白(Ig)类别转换，生发中心反应和Ig亲和力成熟，CTL的激活，免疫记忆，免疫应答的调节等。
MHC分子收集细胞内的肽，在细胞表面将它们呈递给T细胞的TCR。MHC有两个主要类别：被CD8阳性CTL识别的I类，和被CD4阳性HTL识别的II类。
MHC I类分子由45kDa的膜锚定α链和非共价连接的12kDa的β2-微球蛋白(b2m)组成。通过X射线结晶学解析三维结构(Stern和Wiley 1994)显示α链有一个裂口，它在两端封闭，适应8-11个氨基酸长度的肽。I类分子普遍表达，它们呈递的肽来源于胞质蛋白质。它们被蛋白酶体降解，产生的肽被主动转运到内质网(ER)内。在几种侣伴蛋白的辅助下，在此形成MHC：肽复合物，转运到细胞表面(Heemels1995)。因此，MHC I类反映了细胞表面上的蛋白质组，使得T细胞能够识别细胞内病原体或恶性细胞。
MHC II类分子由分别为35kDa和30kDa的两种膜锚定蛋白质(α和β链)组成。它们一起构成了一个裂口，在两端开口，能够适应可变长度的肽，通常12-25个氨基酸。尽管有这些不同，但是I类和II类分子共有惊人的结构相似性(Stern和Wiley 1994)。II类分子只在专业APC上表达，包括树突细胞(DC)、B细胞和巨噬细胞/单核细胞。这些细胞专门以内体途径摄取并加工抗原。在生物合成后，II类分子立即被所谓的恒定链(Ii)复合，阻止ER中肽的结合。当含有II类：Ii复合物的小泡(vesicles)与含有外源抗原的降解产物的内体融合时，Ii被降解，直到MHC结合的裂口只被所谓的CLIP肽复合。后者在侣伴蛋白如HLA-DM的帮助下，与抗原肽互换(Villadangos 2000)。最后，MHC：肽复合物再次在APC表面呈递，它们以多种方式与HTL相互作用。
MHC系统是多基因和极其多态性的，是高度复杂的。人类的I类α链，有三个基因座，被称为HLA-A、-B和-C。同样，有三个II类α链基因座(DRA、DQA、DPA)。至于II类β链基因座，情况更加复杂，因为有4个不同的DRβ链(DRB1、2、3、5)加DQB和DPB。除了单态的DRα链DRA之外，每个基因座存在于群体中的多个不同的等位基因中(几十个到几百个)(Klein 1986)。不同的等位基因具有很大不同的肽结合特异性。例如，等位基因被命名为HLA-A*0201或HLA-DRB1*0401或HLA-DPA*0101/DPB*0401。
T细胞表位已经用多种方法鉴定(Van den Eynde 1997)。例如，T细胞系和克隆已经用来在适当HLA分子转染的COS细胞中筛查cDNA表达文库。此外，也利用生物化学方法。后者包括从靶细胞表面上的MHC分子中洗脱天然配体，通过几个层析步骤分离这些肽，利用表位重建测定分析它们与淋巴细胞的反应性，通过质谱法测序(Wolfel等人1994，Cox等人1994)。
最近，高度灵敏的细胞因子检测试验如IFN-γ酶联印迹(ELIspot)的出现，允许利用直接来自体内的淋巴细胞筛选重叠的合成肽(Maecker 2001，Kern 2000，Tobery 2001)。首先，Kern等人(1999和2000)使用重叠的9mer肽集合的阵列在体外对CD8+T细胞表位作图。后来，Tobery等人，2001改进了这一方法，证实含有多达64个20mer肽的集合可以用来在小鼠中筛选CD8+和CD4+T细胞表位。这两种方法都是基于通过细胞内染色(Kern等人2000)或ELIspot测定(Tobery等人，2001)测定INF-γ的产生，监测抗原特异的应答。利用15-mers的混合物，CD4+T细胞应答大约等于在使用完整可溶性蛋白作为抗原时检测到的应答，而CD8+T细胞应答显著高于利用可溶性蛋白刺激检测到的通常可以忽略的应答，这并不令人惊讶。而且，对15氨基酸肽的混合物的CD8+T细胞应答类似于利用选择代表已知MHC I类最小表位的8-12氨基酸肽的混合物获得的应答。最可能的是，在这些情况下，与细胞膜结合的肽酶负责将肽“修剪”成最佳长度(Maecker等人，2001)。
一个令人感兴趣的备选方法是用特异淋巴细胞筛查合成组合肽库。例如，由以位置扫描方式排列的200种混合物组成的十肽文库已经成功用于鉴定刺激T细胞的克隆型群体的肽配体(Wilson等人，J.Immunol.，1999，163：6424-6434)。
许多T细胞表位已经用所谓的“反向免疫法”测定(Rammensee1999)。在这种情况下，产生可能的T细胞表位的蛋白质已知，扫描其一级序列的HLA结合基序。一般合成几十到几百个候选肽，乃至全套重叠肽，检测它与HLA分子的结合。通常选择最佳结合剂进一步表征它与T细胞的反应性。例如，借助HLA转基因小鼠，通过在体外或体内引发T细胞，能够实现该目的。
本发明的一个目的是提供一种方法，用于筛选特异MHC分子的配体，优选地用于输送适合且特异的T细胞表位，其选自具有对给定MHC分子的未知特异性的多种配体。
因此，本发明提供一种方法，用于分离具有结合MHC/HLA分子的能力的配体，或含有该配体与该MHC/HLA分子的复合物，该方法包括下列步骤：
—提供配体集合，该集合含有可与该MHC/HLA分子结合的配体和不与该MHC/HLA分子结合的配体，
—使该MHC/HLA分子接触该配体集合，从而使具有结合该MHC/HLA分子的能力的配体与该MHC/HLA分子结合，形成含有该配体和该MHC/HLA分子的复合物，
—检测该复合物，任选地使该复合物与不与该MHC/HLA分子结合的配体分离，
—任选地从该复合物中分离并表征该配体。
本发明也提供一种方法，用于分离具有结合MHC/HLA分子的能力的T细胞表位或含有该表位与该MHC/HLA分子的复合物，该方法包括下列步骤：
—提供配体集合，该集合含有可与一种MHC/HLA分子结合的配体和不与该MHC/HLA分子结合的配体，
—使该MHC/HLA分子接触该配体集合，从而使具有结合该MHC/HLA分子的能力的配体与该MHC/HLA分子结合，形成含有该配体和该MHC/HLA分子的复合物，
—检测该复合物，任选地使其与不与该MHC/HLA分子结合的配体分离，
—任选地从该复合物中分离并表征该配体，
—用T细胞测定法测定任选地分离的该配体或该复合物的T细胞激活能力，和
—提供具有T细胞激活能力的任选地分离的配体作为T细胞表位或复合物。
根据本发明的方法使得一种筛选系统能够筛选与特异MHC/HLA分子的结合能力。鉴定MHC结合分子是病原体、肿瘤等的分子表征的一种重要工具。因此，本发明能够根据它们与MHC分子的功能亲和力立即筛选多种(集合)可能的配体。与MHC分子的结合亲和力也是旨在用作T细胞表位的配体的必要条件，尽管不是充分条件。也筛选适合的候选T细胞表位，并测定其T细胞激活能力。因此，根据本发明的结合筛选方法与适合的T细胞测定的组合提供了根据本发明分离T细胞表位的方法，其中利用MHC结合测定，能够从可能的配体集合中鉴定这些T细胞表位。
在现有技术中，总是对具有已知结合/MHC特异性的配体进行这些测定，与之不同，根据本发明的方法提供这些测定法作为对含有未知特异性的配体的集合的筛查工具。在现有技术中，这些测定法一般对各个单配体进行，以检测它们与MHC/HLA分子的结合亲和力。Kwok等人(2001)利用最多可达5种重叠合成肽的集合产生MHC II类四聚体；然后用后者染色PBMC中对特定MHC II类：肽复合物特异的T细胞，该复合物是在与5种肽的集合的结合反应中产生的。然而，由于敏感性和特异性的原因，不认为在这种方法中能够增加每个集合的配体数量(Novak等人2001)。关于特异性的一个问题是，如果集合中存在一种以上的结合剂，则产生MHC四聚体，每个四聚体有一种以上的结合剂。这将排除T细胞染色，在现有技术所述的方法中后者可用于表位的鉴定。与它非常不同，根据本发明的方法允许从含有一种以上结合剂的高度复杂的混合物中鉴定一种以上的结合剂。
将要用本发明筛选的集合的性质并不重要：该集合可含有任何天然或非天然存在的物质，它们a)特异结合MHC/HLA分子，和/或b)可被T细胞特异识别。该集合的这组配体与MHC分子的结合性质未知；因此，该集合中通常含有一种给定MHC分子的结合剂和至少一种非结合剂。因此该集合含有至少10种不同的配体。实际上，根据本发明使用含有明显更多不同配体种的集合，例如20个或更多，100个或更多，1000个或更多，或者10000个或更多。也能够筛查更大的文库(例如含有106以上，108以上，乃至1010以上的不同配体种)。然而，这主要取决于这些配体文库的可用性。
显然，MHC：肽复合物不是典型的受体-配体系统，至今仍未被视为合适的筛选工具的基础。在体内，通常只存在MHC：肽复合物，而没有空MHC分子。一种肽与空MHC分子简单结合不会产生MHC：肽复合物，而是通过非常复杂的、但是仍未完全理解的所谓“抗原加工和呈递”方法产生。这是一种高度组织化的细胞内方法，涉及多种酶(细胞溶质和溶酶体蛋白酶，转运蛋白，侣伴蛋白，肽-交换因子等)。实际上众所周知，不含配体的MHC分子是不稳定的，经历快速降解。
因此，本发明的一个主要特征是提供重组“空”MHC分子并使其能够用来从集合中“捕获”配体的生产、纯化和反应条件的发展。现有技术中没有例子证明类似的可能性。以上引用的Novak等人的参考文献公开了一种生产(昆虫细胞)和纯化策略，用来获得重组MHC分子，随后与少数肽温育，并四聚化。利用MHC四聚体染色来自个体的细胞，这些个体可能含有针对这些肽代表的抗原的T细胞，从而提供了该配体也是一种真正的T细胞表位的必要证据。然而，所述现有技术明确地表明，只有多达5种肽能够成功使用。这与本方法非常不同，本方法可以成功使用每个集合10、21种、甚至几百或几千种肽。
根据本发明的方法使用的优选的配体集合选自：肽集合，特别是重叠肽的集合，蛋白质片段的集合，糖脂的集合，鞘糖脂的集合，脂肽的集合，脂类的集合，聚糖的集合，修饰肽的集合，由抗原呈递细胞获得的集合，优选地是其总裂解物或级分的形式，特别是从这些细胞的表面或MHC/HLA分子上洗脱的级分，包含细胞片段(特别是病原体细胞、肿瘤细胞或组织)的集合，包含肽库的集合，由重组DNA文库产生的(聚)肽的集合，特别是来源于病原体或肿瘤细胞的，来自特定病原体的蛋白质和/或蛋白质片段的集合，或其混合物。
该集合的配体可能来自于天然来源(天然和/或衍生的形式)，也可能合成产生(例如通过化学合成或重组技术)。如果该集合中提供(聚)肽配体，优选地用肽合成仪或通过重组技术产生这些肽。根据一个优选实施方案，(聚)肽集合可由重组DNA文库产生，例如来源于病原体或肿瘤细胞，通过体外翻译(例如核糖体展示)或通过异种宿主如大肠杆菌等表达。
因此，配体优选的是肽，是能够用作T细胞表位的抗原片段。这些肽优选地长于6个、特别是长于8个氨基酸，优选的最大长度为40、30、20、15乃至11或12个氨基酸。
能够从中获得这些肽的优选的病原体选自：人类免疫缺陷病毒(HIV)，甲型肝炎和乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒(HCV)，劳斯肉瘤病毒(RSV)，EB病毒(EBV)，流感病毒，轮状病毒，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)，沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)，结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，炭疽芽孢杆菌(Bacillus antracis)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，疟原虫属(Plasmodium)的种(恶性疟原虫(Pl.falciparum)、间日疟原虫(Pl.vivax)等)，曲霉属(Aspergillus)的种或白色念珠菌(Candida albicans)。抗原也可以是癌细胞表达的分子(肿瘤抗原)。同样也可以使用肿瘤抗原(癌症疫苗)或自身免疫抗原，为本发明提供适合的(肽)配体。
本方法所选择的具体MHC分子(该术语当然也包括MHC样分子)的性质也不重要。因此，这些分子原则上可选自任何种，特别是灵长类动物，如人(HLA，见下文)，黑猩猩，其它哺乳动物，例如maquaques、兔、猫、狗或啮齿动物，如小鼠、大鼠、豚鼠等，在农业上重要的动物，如牛、马、绵羊和鱼，但是为人类提供疫苗当然优选人(或“人源化”)分子。为了为具体动物，特别是农业上重要的动物，如牛、马、绵羊和鱼提供疫苗，优选使用这些动物特异的MHC分子。
因此优选的HLA分子含有I类分子，其来源于HLA-A、-B或-C基因座，具体的是A1、A2、A3、A24、A11、A23、A29、A30、A68；B7、B8、B15、B16、B27、B35、B40、B44、B46、B51、B52、B53；Cw3、Cw4、Cw6、Cw7；II类分子，来源于HLA-DP、-DQ或-DR基因座，具体的是DR1、DR2、DR3、DR4、DR7、DR8、DR9、DR11、DR12、DR13、DR51、DR52、DR53；DP2、DP3、DP4；DQ1、DQ3、DQ5、DQ6；和非传统的MHC/HLA和MHC/HLA样分子，它们能特异结合配体，特别是HLA-E、HLA-G、MICA、MICB、Qa1、Qa2、T10、T18、T22、M3和CD1家族的成员。
根据一个优选实施方案，根据本发明的方法的特征在于该MHC/HLA分子选自HLAI类分子、HLAII类分子、非传统的MHC/HLA和MHC/HLA样分子或其混合物，或者它们的混合物。
优选地，使用一种方法进行复合物的配体的任选表征步骤，该方法选自：质谱法，多肽测序，结合测定，特别是SDS-稳定性测定，通过层析，特别是HPLC测定保留因子(retention factor)鉴定配体，或其它光谱技术，特别是紫外线(UV)、红外线(IR)、核磁共振(NMR)、圆二色性(CD)或电子自旋共振(ESR)，或其组合。
根据一个优选实施方案，本发明的方法的特征在于它与一种细胞因子分泌测定相组合，优选地与酶联印迹(Elispot)测定、细胞内细胞因子染色、FACS或ELISA(酶联免疫测定)(例如见《现代免疫学方法》)组合。
优选的T细胞测定法包括该复合物与分离的T细胞混合并温育，然后测定该分离的T细胞的细胞因子分泌或增殖，和/或测定激活标记(特别是CD69、CD38)的上调，或表面标记(特别是CD3、CD8或TCR)的下调，和/或特别是通过实时RT-PCR测定与T细胞激活有关的mRNAs的上调/下调(参见，例如《现代免疫学方法》、《现代分子生物学方法》)。根据本发明的T细胞激活能力检测(在此称为“T细胞测定”)优选地也可以在小鼠中实现，具体地使用适当设计的人MHC/HLA设置(例如，在其基因组中整合有一种或多种人MHC/HLA分子)。
进一步优选的T细胞测定选自：测定T细胞受体下游成分(特别是p56lck、TCR的ITAMS和ζ链、ZAP70、LAT、SLP-76、fyn和lyn)的磷酸化/去磷酸化的T细胞测定，测定细胞内Ca++浓度或Ca++-依赖的蛋白质激活的T细胞测定，测定免疫突触形成的T细胞测定，测定效应分子(特别是穿孔素、粒酶或granulolysin)释放的T细胞测定，或这些T细胞测定的组合(参见，例如，《现代免疫学方法》、《现代细胞生物学方法》)。
WO00/31542提出了鉴定只是来自肿瘤细胞的抗原的方法。抗原肽从位于半抗原修饰的恶性细胞表面的MHC-肽复合物中提取。然后能够通过半抗原特异的亲和层析分离半抗原化的肽，并测序。本发明的实施方案是，最初从位于肿瘤细胞表面的MHC分子中分离的肽具有刺激T细胞的性质。刺激是指添加细胞提取物引起的T细胞增殖，以及细胞因子(如INF-γ、TNF、IL-2等)的产生。根据分离的肽的序列，能够鉴定抗原的来源。
尽管该方法的最终结果也是T细胞表位，但是该方法与本发明大大不同：在现有技术中，从细胞系统中分离天然MHC：肽复合物，在本发明中利用纯化、重组的MHC分子从任何来源(细胞或合成的，天然或人工的)中分离配体；在现有技术中，随后通过半抗原亲和层析的分离需要表位的半抗原化，而本发明不依赖该步骤。
Tana等人(1998)描述了从根据MHC分子类型的已知结合基序设计的合成组合肽库中筛选可被T细胞识别的抗原肽的方法。因此，与由209种所有可能的肽组成的“全面”文库相比，将要筛选的肽的数量大大减少(～103)。这些肽在含有不同氨基酸的9种肽的混合物中在两个固定位置处组合。然后检测该混合物引发T细胞增殖反应。因此，该方法限于检测适于结合这组MHC分子以及被TCR受体识别的氨基酸残基。
Bitmansour等人(2001)称，以前Kern等人(1999，2000)描述的矩阵方法已经用于CMV pp65蛋白内免疫显性CD4+表位的鉴定。构建24个肽集合的矩阵，每个集合含有12种肽(15-mers，重叠11个氨基酸)(共138种肽)，代表整个pp65蛋白。首先，检验肽集合随后检验各个肽引起特异T细胞应答的能力。该方法与其它方法(Maeker，2001；Tobery等人，2001)的不同在于，它依赖于不同的监测T细胞应答的技术，如流式细胞分析(表面INF-γ染色，CD4和CD69标记)和分子方法(CMV-特异的CD4+细胞的TCR-Vβ内容物的RT-PCR)。使用的技术被称为细胞因子流式细胞分析，允许在抗原诱导的增殖或细胞死亡之前检测CMV-特异的T细胞，因此当其在体内存在，不被长期体外培养改变时，该技术提供了测定CMV-特异T细胞的克隆型内容物的可能性。因此，在CMV血清阳性的健康受试者中发现了可能引起保护性CMV特异CD4+应答的两种pp65表位(aa489-503和aa509-523)。
Tana等人和Bitmansour等人都描述了复杂的因此难以控制生物学细胞测定的方法，而本发明描述了特别是在可操作性和可重复性上现有技术根本无法比拟的直接生物化学分离。根据本发明使用“空”MHC/HLA分子使得所有使用与位于活细胞表面的MHC/HLA分子结合事件的复杂方法均已过时。
根据本发明分离T细胞表位的一种方法，其中配体集合与(“空”)MHC/HLA分子接触(不依赖于细胞系统)，然后(优选地)用T细胞试验检测结合的配体的T细胞激活能力，因此该方法是一种全新的方法，特别是与描述的依赖细胞的测定相比。与“在硅片上的(insilicio)”方法相比，本发明也提供了可容易、快速处理的“真实世界”中的应用。
根据本发明的方法的实施和应用在关于一种具体病原体蛋白质——巨细胞病毒(CMV)的pp65的实施例部分得到证明。该实施例显示了本发明的有效性和优点，并与现有技术方法进行了比较。
CMV是一种β疱疹病毒，是普通人群中非EB病毒(EBV)传染性单核细胞增多症的主要原因，是无免疫应答的宿主中的一种重要病原体，包括感染人类免疫缺陷病毒(HIV)患获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的患者、新生儿和移植受体(Drew等人，1999)。根据所调查的人群，不同地区CMV血清阳性的普及率为40-100％。至于其它疱疹病毒，最初是CMV感染，随后是持续感染；在某些情况下也发生再感染和重复感染(Britt，1999)，然而，由于预先存在免疫，免疫活性宿主大多数没有病理结果(Plotkin等人，1999)。CMV在人体中引起缓慢、持续的感染。这在免疫活性宿主中得到控制，但是决不会消除。其中(例如免疫抑制基因的活性表达，它干扰抗原的加工和呈递)，两个因素似乎有助于持续逃脱免疫监视：一方面，免疫特权(immunopriviliged)部位如唾液腺上皮中的复制，和CD33+单核细胞中潜在贮存库(reservoir)的形成。这些巨噬细胞前体不支持CMV的复制，因此停止，直到细胞分化为巨噬细胞。只有在分化后，细胞环境才似乎允许裂解性感染。免疫活性个体中90％的初次感染在临床上未被识别(Nichols等人，2000)，发展为长期免疫，控制病毒的持久性，虽然不是灭菌，但是是保护性的。
以下几组具有感染/再激活的高度危险，他们具有发展为CMV疾病的高度危险：
a)血清阴性妊娠妇女的胎儿，
b)血清阴性的移植患者，因为难以发现CMV阴性移植物，
c)血清阳性的移植和HIV患者，因为它们诱导或获得的免疫缺陷允许CMV从潜伏期再激活。
先天CMV感染可能导致耳聋，更重要的是，象普通遗传综合征三体21和脆性X染色体一样频繁的引起智力低下的原因。根据FowlerKB，Stagno S，Pass RF等人(Fowler等人，1992)的研究能够推断，每年约有9000名欧洲和8000名美洲婴儿(在美国每500名新生婴儿有一个)由于子宫内CMV感染受到伤害，其中只有10％在出生时临床上明显。尽管先天CMV感染在出生时大部分沉默，但是它在临床后遗症和公共卫生影响方面的累积作用较大(Plotkin等人，1999)。与较差的结果最密切相关的因素是妊娠期间的初次母亲感染，这在血清阴性的母亲中不易预防，因为密切的人-人接触使病毒容易扩散，血清阳性的幼儿大量释放病毒(Field等人，1999)。在无免疫应答成人中，疾病在实体器官移植(SOT)患者和异体造血干细胞移植(HCT)患者以及HIV感染个体中最常见。在异体HCT患者中，大约15％的患者中仍然发生严重CMV疾病，死亡率约为50％。与HCT中的CMV疾病有关的危险因素是CMV阳性移植物供体和未感染的移植物受体、伴随的细菌感染、暴发型肝炎和移植物抗宿主疾病。对于SOT，如肾脏、肝脏、心脏、肺或胰的SOT，CMV疾病与移植物和患者存活率的降低有关。CMV本身引起多种传染性疾病综合征。CMV疾病的后果在所有移植患者中相似，尽管具体的器官累及通常对应于移植的器官。肝脏、胰、肺、肠和心脏移植受体通常比肾移植受体有较高的CMV疾病发病率。未接受抗病毒预防的大约39-41％的心脏-肺、9-35％的心脏、22-29％的肝脏和胰、8-32％的肾移植受体发生有症状的感染。而且，CMV感染与免疫抑制状态增强有关，可以解释移植患者频发的机会性重复感染。此外，这似乎与同种异体移植功能障碍有关，间接与患者存活率降低以及成本增加、住院时间延长有关(Sia等人，2000)。对于后三点，一方面CMV可能与心脏移植后CMV感染患者中发现的进展性冠状动脉粥样硬化症有关(Van Son等人，1999和Field等人，1999)，另一方面与CMV/EBV双阳性移植患者中EB病毒(EBV)相关移植后淋巴组织增生性疾病的危险增加有关(Sia等人，2000)。CMV视网膜炎是AIDS患者中最常见的疾病表现之一，已经报告在大约30％的患者中发生，使患者面临失明的威胁。最近的证据表明，AIDS患者中CD4+淋巴细胞的损失与CMV疾病的发展有关，因此使用HIV蛋白酶抑制剂和高活性抗逆转录病毒治疗(HART)，CMV视网膜炎的发病率显著降低(Field等人，1999)。然而，CMV疾病在HAART开始4个月之内仍然发生，尽管HIV复制被充分抑制。此外，抗逆转录病毒治疗的失败是正在出现的一个问题(Nichols等人，2000)。
最近十年，利用抗病毒化学治疗预防和治疗CMV感染已经取得了相当大的进展。目前美国已经批准了5种药物用于CMV的治疗：更昔洛韦(Cytovene，用作静脉内和口服制剂时，或者Vitrasert，用作玻璃体内植物制剂时)、膦甲酸(膦甲酸钠)、Cidofovir(Vistide)和Fomivirsen(Vitravene)。更昔洛韦和Cidofovir的三磷酸酯相当物(前者需要病毒和细胞酶磷酸化，后者只需要细胞酶磷酸化)是对于病毒DNA聚合酶的脱氧核糖核苷酸三磷酸的竞争性抑制剂，而焦磷酸盐类似物膦甲酸阻断该酶的焦磷酸盐结合部位。Fomivirsen是获得FDA批准的第一个反义设计的寡核苷酸。然而，Fomivirsen的作用机制还未完全证实，除了反义之外可能还有许多成分(Field等人，1999)。由于固有的高毒性、晚期CMV疾病的高发病率和普遍预防的高成本，抗病毒治疗的先发制人(preemptive)策略是基于对具有发展CMV疾病的高危险的患者的选择性治疗，这是根据HCT后再激活的CMV的早期检测(Zaia等人，2000)。在SOT患者中，预防策略在移植物供体CMV载体和未感染的移植物受体的设置中特别有吸引力。施用三个月Valganciclovir，口服生物利用性显著提高的活性药物的缬氨酸酯，显著减少肾移植患者中CMV疾病的发病率。而且，移植后6个月活组织检查证明排斥的患者的比例也显著减少。然而，特别是用可以获得的口服制剂长期预防，这种治疗形式比常规静脉内制剂更方便患者，也可提高耐药性的发生率(Nichols等人，2000)。已经观察到对更昔洛韦、Cidofuvir和膦甲酸的多药耐药性，这都是由于病毒DNA聚合酶的改变引起的(Field等人，1999)。Fomivirsen似乎对这些突变体有效(Nichols等人，2000)，但是由于除了反义作用模式之外的可能的抗病毒活性(Field等人，1999)，Fomivirsen耐药株似乎可能出现。
因此，焦点集中于移植后CMV特异性免疫的(重)构建，这也可防止对血清阴性母亲的婴儿的损伤。这涉及到一个问题，免疫活性宿主如何控制CMV感染，以便了解非免疫活性宿主中什么是恢复必需的。汇集的数据证明，CMV抗体通过减少病毒血症(无细胞病毒的传播)是部分保护性的，但是在HCT患者中无效，在单核细胞群体内，使用抗体不能破坏的贮存库(reservoir)，病毒持续与细胞结合(Plotkin等人，1999)。这强烈地要求发展恢复CD8+和CD4+T细胞应答的疫苗。通过在移植后早期过继转移这些细胞，最终能够建立CMV特异的alphabeta/T细胞的保护功能。在I期研究中，在过继转移的CD8+CMV特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的受体中，与免疫活性骨髓供体相当的细胞溶解反应在第4次输注后立即达到。然而，在不能恢复内源CD4+CMV特异的T辅助反应的患者亚组中，它们在随后的几周下降，这强调了同时产生CD8+和CD4+T细胞应答的重要性(Zaia等人，2000)。正常CMV血清阳性个体中极高频率的特异性CD4+记忆细胞(总CD4+T细胞的约2.0％)也提示CMV对照中CD4+T细胞的可能的重要性(Waldrop等人，1998)。HIV感染中CD4+T细胞缺陷程度与CMV疾病的密切相关性也被认为与CD4+T细胞在控制CMV再激活中的重要作用相一致(Komanduri等人，1998)。已经描述了5种普通类型的CMV相关疫苗：减毒活病毒疫苗、重组活病毒疫苗、DNA疫苗、全蛋白质疫苗和肽疫苗。在二十世纪七十年代发展并在肾移植患者和分娩当年的妇女中测试了一种减毒活病毒疫苗，“Towne株”。尽管该疫苗显示免疫原性，但是在移植群体中使用活病毒仍具有潜在的危险。较低程度上这也适用于在人体中复制能力有限的重组痘病毒(禽痘)。在动物模型中显示前途的方法包括导入编码免疫原性蛋白质的DNA载体，作为引发TCL的工具。DNA疫苗技术的改进，包括使用最低细胞毒性和辅助T细胞表位作为免疫原，可产生更加有效的疫苗(Zaia等人，2000)。
总之，抗病毒药物的副作用和高成本，上述用于CMV疫苗的方法的有限应用范围/成功，和过继转移的T细胞克隆的良好效能，突出了发现新MHC I类和II类限制性T细胞表位的重要性。这些表位应当被最普遍的HLA分子呈递，因此使大多数群体具有保护性，与个体HLA设置无关。CMV是已知的具有最高蛋白质编码能力的病毒之一，含有170-200个开放阅读框(Reddehase，2000)。然而，对显然成功控制病毒的无症状供体的T细胞应答的分析显示CMV pp65、pp150、IE-1和gB的免疫显性(Zaia等人，2000)。这可能是因为几种免疫抑制基因的表达，干扰了加载肽的MHC I类和II类分子的形成和释放(egress)。显著地，MHC I类分子的下调似乎很少干扰CMVpp65或pp150-特异的CTL对CMV感染的细胞的识别。在病毒进入后的极早期，这两种结构蛋白被输送到细胞质中，这能够用下列事实解释：在免疫抑制病毒基因表达之前，这些结构蛋白能够加工并呈递。然而，在较后期，当MHC水平已经降低时，CMV pp65或pp150特异的CTL也能有效地识别感染的细胞。这似乎是由于宿主的逆向逃避(counter evasion)策略。在CMV感染后，一种细胞基因被诱导，甚至在靶细胞只表达低肽/MHC密度时，它也与T细胞上的一种受体结合，促进T细胞激活(Zaia等人，2000)。另一方面，有迹象表明，pp65干扰IE-1的呈递，IE-1是随后所有免疫抑制基因产物的激活剂(Reddehase，2000)，这能够解释pp65抗原的免疫显性。因此，pp65特异的T细胞能够在复制周期的所有阶段裂解病毒感染的细胞，可能是在体内去除感染的细胞所必需的(Zaia等人，2000)。
根据另一方面，本发明也提供可以利用根据本发明的方法鉴定的T细胞表位，该T细胞表位选自含有序列KMQVIGDQYVK、FTWPPWQAGI、AMAGASTSA、SDNEIHNPAV、KYQEFFWDA的多肽或其组合。
本发明也提供具有T细胞激活能力的HLA A0201结合表位，该表位可以利用HLA A0201分子作为MHC/HLA分子，通过根据本发明的方法鉴定，该HLAA0201结合表位选自含有序列RLLQTGIHV、VIGDQYVKV、YLESFCEDV的多肽或其组合。尽管已知这些序列可结合HLA A0201，但是本发明提供了它们激活T细胞的可用性。
本发明进一步提供含有序列RPHERNGFTV的肽在制备用于在B7阴性个体中激活T细胞的组合物中的用途。
另外，本发明也提供含有序列DDVWTSGSDSDE的肽在制备用于在B35阴性个体中激活T细胞的组合物中的用途。
而且，本发明也提供含有序列TPRVTGGGAM的肽在制备用于在B7阴性个体中激活T细胞的组合物中的用途。
尽管已经描述这些序列具有特异HLA限制(RPHERNGFTV：B7，DDVWTSGSDSDE：B35，TPRVTGGGAM：B7)，但是令人吃惊的是这些序列具有不同于已知限制的特异性(RPHERNGFTV：非B7，DDVWTSGSDSDE：非B35，TPRVTGGGAM：非B7)。这使得这些序列的有效性能够扩展，例如通过使这些序列作为合适的疫苗，可用于表达不同于描述的其它HLA的个体。
本发明进一步提供可与II类HLA分子结合的肽，选自根据实施例部分的表3肽55-64、109、383、384、421、449-454、469和470。
优选地，根据本发明的表位或肽在N端、C端或N端和C端还含有1-30个、优选地2-10个、特别是2-6个天然存在的氨基酸残基。对于本发明，术语“天然存在的”氨基酸残基涉及在天然存在的蛋白质中，在相对于表位或肽的特定位置处存在的氨基酸残基。例如，对于“AMAGASTSA”表位，在N端天然存在的氨基酸残基是Gly；在C端天然存在的3个氨基酸残基是Gly-Arg-Lys。因此，“非天然存在的”氨基酸残基是与相对于表位或肽的特定位置处的氨基酸残基不同的任何氨基酸残基。
根据本发明的一个优选实施方案，该表位或肽还含有非天然存在的氨基酸，优选地1-1000个，更优选地2-100个，特别是2-20个非天然存在的氨基酸残基，特别是在N端、C端或在N端和C端。在具体优选实施方案中，非天然和天然存在的氨基酸残基的组合也是可能的。该表位也可含有修饰的氨基酸(即不同于20种“标准”氨基酸的氨基酸残基，如D-氨基酸或Cys的S-S结合)作为另外的氨基酸残基或代替天然存在的氨基酸残基。
显然，通过可提高、保持或至少不显著阻碍表位的T细胞激活能力的氨基酸交换，由该表位或肽衍生的表位或肽，也包括于根据本发明的表位或肽中。因此，该表位或肽也包括不含如来源于CMV pp65的原始序列，但是触发相同或者优选地提高的T细胞应答的表位或肽。这些表位被称为“不规则的(heteroclitic)”。包括能够触发与原始表位相同的T细胞，优选地在体内或者也在体外具有更强的T细胞激活能力的任何表位。
不规则的表位能够通过合理设计获得，即考虑各个残基对结合MHC/HLA的作用，如Ramensee等人1999或Sturniolo等人1999所述，结合可能与TCR相互作用的残基的系统交换，用针对原始表位的T细胞检测产生的序列。本领域技术人员不需要更多实验即能够使用这种设计。
另一种可能性包括用针对原始表位的T细胞筛查肽库。一种优选的方法是合成肽库的位置扫描。例如，Blake等人1996和Hemmer等人1999以及此处的参考文献已经详细描述了这些方法。
作为同源CMV pp65衍生的氨基酸序列代表的表位或不规则表位的备选，也能够使用模拟这些表位的物质，例如“拟肽”或“retro-inverso-肽”。
设计改进的表位的另一方面是它们与可提高它们刺激T细胞的能力的物质配制或修饰。包括T辅助细胞表位、脂类或脂质体或优选的修饰，如WO01/78767所述。
提高表位的T细胞刺激能力的另一种方法是与免疫刺激物质一起配制，例如细胞因子或趋化因子，如白介素-2、-7、-12、-18，I类和II类干扰素(IFN)，特别是IFN-γ，GM-CSF，TNF-α，flt3-配体等。
根据另一方面，本发明涉及根据本发明的表位或肽在制备用于治疗或预防巨细胞病毒(CMV)感染的HLA限制的疫苗中的用途。
本发明也包括含有序列KMQVIGDQYV、FTWPPWQAGI、AMAGASTSA、SDNEIHNPAV和/或KYQEFFWDA的表位在制备用于治疗或预防巨细胞病毒(CMV)感染的疫苗中的用途。
因此，本发明也包括一种用于治疗或预防巨细胞病毒(CMV)感染的疫苗，它包含含有序列KMQVIGDQYV、FTWPPWQAGI、AMAGASTSA、SDNEIHNPAV和/或KYQEFFWDA的表位。而且，用于治疗或预防巨细胞病毒(CMV)感染的HLA特异的疫苗，其包含根据本发明的表位或肽，也是本发明的一个方面。编码根据本发明的肽的相应核酸的用途，例如用作DNA疫苗，也属于本发明的范围，至少是要求保护的肽疫苗的相当物。
Parker等人(1994)描述了根据个别肽结合的实验数据预测肽与MHC I类分子结合的方法。通过监测肽促进β2-微球蛋白(β2m)掺入HLA-A2/β2m/肽杂二聚复合物中的能力间接评价肽结合能力。实验数据(测定的β2m的分解速度)允许产生相应的系数值，然后用来计算与HLA-A2分子的复合物中对任何九肽的理论结合稳定性。在该研究中，第一次显示CMV pp65衍生的肽序列RLLQTGIHV能够稳定HLA-A2/β32m/肽复合物。
Morgan等人(1998)描述了测定肽与纯化HLA分子的结合亲和力的方法，也是根据间接测定β2m向HLA/肽复合物中的掺入。在该研究中，RLLQTGIHV肽的体外结合已经得到证明，并测定它与HLA-A2分子的相对结合亲和力(结合及解离常数)。
尽管Parker等人和Morgan等人证实了与HLA-A2的结合，但是缺乏证明该配体也是一种真正的T细胞表位的最终证据，而在本发明中，通过干扰素-γ酶联印迹证实，RLLQTGIHV不仅能结合HLA-A2，而且只能诱导功能性T细胞。这不是一个没有价值的发现：在该领域众所周知，以高亲和力结合的多种配体不是T细胞靶标，因为例如通过上述“抗原加工和呈递途径”它们不会产生或者不会高效产生。因此，RLLQTGIHV的HLA A0201结合活性不仅令人吃惊，而且也可选择用于例如为某些等位基因群体具体设计的疫苗。
优选地，根据本发明的这种疫苗还含有一种免疫调节物，优选地选自聚阳离子物质，特别是聚阳离子多肽，免疫调节核酸，特别是含有寡脱氧核苷酸的脱氧肌苷和/或脱氧尿苷，或其混合物。
优选地，该疫苗还含有一种聚阳离子聚合物，优选地一种聚阳离子肽，特别是聚精氨酸、聚赖氨酸或抗微生物肽。
根据本发明使用的聚阳离子化合物可以是显示根据WO97/30721的特征的任何聚阳离子化合物。优选的聚阳离子化合物选自碱性多肽、有机聚阳离子、碱性聚氨基酸或其混合物。这些聚氨基酸的链长应当至少为4个氨基酸残基。特别优选的是含有肽结合的物质，如聚赖氨酸、聚精氨酸和含有8个以上、特别是20个以上氨基酸残基且含有20％以上、特别是50％以上碱性氨基酸的多肽，或其混合物。其它优选的聚阳离子及其药物组合物在WO97/30721(例如聚聚乙烯亚胺)和WO99/38528中描述。优选地，这些多肽含有20-500个氨基酸残基，特别是30-200个残基。
这些聚阳离子化合物可以化学产生或重组产生，或者可以来自于天然来源。
阳离子(多)肽也可以是聚阳离子抗细菌微生物肽。这些(多)肽可以是原核或动物或植物来源的，或者可以化学产生或重组产生。这些肽也可能属于防卫素类。这些宿主防御肽或防卫素也是根据本发明的聚阳离子聚合物的一种优选形式。可以作为终产物激活(或者下调)适应性免疫系统、优选地被APC(包括树突细胞)介导的化合物，用作聚阳离子聚合物。
本发明特别优选的用作聚阳离子物质的是cathelicidin衍生的抗微生物肽或其衍生物(A 1416/2000，在此引用作为参考)，特别是来源于哺乳动物cathelicidin的抗微生物肽，优选地来源于人、牛或小鼠，或神经活性化合物，如(人)生长激素(如WO01/24822所述)。
来自于天然来源的聚阳离子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(衍生的阳离子肽，触角(antennapedia)肽，脱乙酰壳多糖或壳多糖的其它衍生物)或通过生物化学或重组生产由这些肽或蛋白质衍生的其它肽。其它优选的聚阳离子化合物有cathelin或者与cathelin有关的或其衍生的物质，特别是小鼠、牛或人cathelins，和/或cathelicidin。有关或衍生的cathelin物质含有全部或部分cathelin序列，至少含有15-20个氨基酸残基。衍生可包括天然氨基酸被置换或修饰为不属于20种标准氨基酸的氨基酸。而且，也可以向这些cathelin分子中引入其它阳离子残基。这些cathelin分子优选地与根据本发明的抗原/疫苗组合物组合。然而，在不添加其它佐剂的情况下，这些cathelin分子作为抗原的一种佐剂也令人吃惊地有效。因此，在使用或不使用其它免疫激活物的情况下，在疫苗制剂中使用这些cathelin分子作为有效佐剂是可能的。
根据本发明使用的另外一种优选聚阳离子物质是一种合成肽，它含有至少2个KLK-基序，被一个3-7个疏水氨基酸的接头隔开，特别是L(例如KIKL5KLK；PCT/EP01/12041，在此引用作为参考)。
根据本发明使用的免疫调节(或免疫原性)核酸可以是合成的、原核或真核来源的。对于原核来源，根据系统进化树，DNA应当来源于发育较低的种(例如昆虫等)。在本发明的一个优选实施方案中，免疫原性寡脱氧核苷酸(ODN)是一种合成产生的DNA分子或这些分子的混合物。也包括ODN的衍生物或修饰，如硫代磷酸酯取代的类似物(硫代磷酸残基代替磷酸)，如美国专利号US 5,723,335和US 5,663,153所述，以及优选地稳定免疫刺激组合物但不改变其免疫性质的其它衍生物和修饰。一种优选的序列基序是一个6碱基的DNA基序，它含有一个(非甲基化)CpG二核苷酸，侧翼为两个5′嘌呤和两个3′嘧啶(5′-Pur-Pur-C-G-Pyr-Pyr-3′)。根据本发明的ODN中所含的CpG基序在微生物中比在高等脊椎动物DNA中更常见，在甲基化模式上显示差异。令人吃惊的是，刺激小鼠APC的序列对于人细胞不是非常有效。根据本发明使用的优选的回文或非回文ODN例如在澳大利亚专利申请A 1973/2000、A 805/2001、EP 0 468 520 A2、WO96/02555、WO98/16247、WO98/18810、WO98/37919、WO98/40100、WO98/52581、WO98/52962、WO99/51259和WO99/56755中公开，均在此引用作为参考。除了刺激免疫系统之外，某些ODN也中和某些免疫应答。本发明也包括这些序列，例如用于自身免疫病的治疗。ODNs/DNAs可以化学产生或重组产生，或者来自于天然来源。优选的天然来源是昆虫。
此外，基于肌苷和胞苷的核酸(例如PCT/EP01/06437所述)或含有脱氧肌苷和/或脱氧尿苷残基的脱氧核酸(澳大利亚专利申请A1973/2000和A805/2001描述，在此引用作为参考)也可以优选地作为免疫刺激核酸用于本发明。
当然，根据本发明也可以使用不同免疫原性核酸的混合物。
优选地，该疫苗还含有一种药学可接受的载体。
根据另一个优选实施方案，该疫苗含有以选自下列的形式提供的表位或肽：肽、肽类似物、蛋白质、裸DNA、RNA、病毒载体、病毒样颗粒、重组/嵌合病毒、重组细菌或用蛋白质/肽/RNA脉冲或用含有该表位或肽的DNA转染的树突细胞。
根据另一方面，本发明涉及T细胞、T细胞克隆或T细胞群体(制品)，特别是能够识别根据本发明的任何表位或肽，尤其是如上所述的CMV表位。这些T细胞的一种优选用途是它们的体外表达和例如通过过继转移对患者的治疗用途。因此，本发明也提供T细胞、T细胞克隆或T细胞群体(制品)在制备用于治疗CMV患者的组合物中的用途。
根据本发明的这些T细胞(克隆或系)，特别是可以识别上述CMV肽的T细胞，也可用于鉴定不规则表位，不规则表位不同于最初鉴定的表位，但是引发相同的T细胞。
根据本发明的这些细胞、组合物或疫苗以有效的量对个体施用。
本发明将通过下列实施例和附图更详细地说明，但是不限于此。
图1显示肽与可溶性DR4分子的结合亲和力；
图2显示能够结合空DR4分子的肽的鉴定(A.HLA-肽复合物的纯化；B.结合的肽的MS分析)；
图3显示在过量的低亲和力肽存在下，高亲和力肽与DR4分子的结合；
图4显示个别肽和肽混合物与DR4分子的结合；
图5显示使用(5a)分离的CD4+T细胞和DR0401分子(用抗CD28共刺激)，使用(5b)分离的CD8+T细胞和HLAA0201分子(用抗CD28mab共刺激)的酶联印迹；
图6显示CMV pp65肽集合阵列；
图7显示：(7a)来源于pp65蛋白的肽集合与DR4分子的结合，(7b)单个pp65肽与DR4分子的结合；
图8显示用肽混合物(每个含有21种肽，供体#10736 HLA A2/3，HLA B15/35；8a)进行的第一次筛查，和用肽混合物(每个含有21种肽，供体#10687 HLA A2/11，HLA B7/13；8b)进行的第一次筛查；
图9显示用单个肽(供体#10736 HLA A2/3，HLAB15/35)进行的第二次筛查；
图10显示来自受试者10788的PBMC，用于使用CMVpp6515mers 57、59和对照(med：不含肽，HIV：无关HIV衍生肽，ConA：多克隆刺激)的IFN-γELIspot；
图11显示通过细胞内IFN-γ染色证实针对CMVpp65 15mers 469、470的同时的CD4+和CD8+T细胞应答；
图12显示利用IFN-γ酶联印迹测定，在转基因小鼠中用重叠的15mers对DRB1*0401表位的作图：最后一次接种一周后，取出脾脏，用有关的肽(编号1500-1505)来自体内地激活细胞，重叠的15mers代表这些较长的肽和无关的流感血凝素衍生肽(编号1171)，用来测定产生IFN-γ的特定细胞(减去培养基对照)。
实施例
实施例概述
这些实施例显示本发明对具体病原体蛋白CMV的pp65的实施。
第一部分应用根据本发明的方法，该方法基于使用“空HLA分子”。这些分子与可能的CMV衍生肽配体混合物一起温育，筛查特异性结合事件。分离这样形成的复合物，用于鉴定特异结合的配体。使用高度复杂的混合物的可能性允许从几百乃至几千种可能的配体中极快地鉴定出少数结合剂。使用HLA-DRB1*0401和重叠15-mers的集合证实了这一点。
然而，I类分子和适当长度(即8-11-mers)的肽能够使用相同的方法。配体集合可以是合成的重叠肽。另一种可能性是酶或非酶消化所述抗原。后者通过碱水解实现，产生所有可能的降解产物，已经成功地用于鉴定T细胞表位(Gavin 1993)。酶消化能够用蛋白酶进行。一个合理的方法是进一步使用参与天然抗原加工途径的蛋白酶，如用于I类限制的表位的蛋白酶体(Heemels 1995)，或者用于II类限制的表位的组织蛋白酶(Villadangos 2000)。配体集合也可能由天然存在的配体组成，这些配体例如通过携带各自表位的细胞的裂解或洗脱获得。就此而言，重要地指出，也能够使用非肽配体，例如糖脂。众所周知，可能由MHC(例如HLA-G、HLA-E、MICA、MICB)编码或MHC之外(例如CD1家族)的非传统的I类分子，能够为淋巴细胞呈递多种非肽配体(Kronenberg 1999)。使用重组“空”非传统I类分子将允许结合剂的结合反应以及用与此处所述相似的方法鉴定。
在快速鉴定能够结合HLA分子的配体后，根据本发明的加工也提供了直接表征针对这些结合剂的特异T细胞应答的方法。一个可能性是在所谓的“合成T细胞测定”中直接使用分离的HLA：配体复合物。后者包括HLA：配体复合物对T细胞的抗原特异性再刺激，以及提供共刺激如激活抗体激活CD28的第二个信号。如实施例II所证实的，该测定能够以酶联免疫印迹读数进行。
在此，选择合成CMV pp65作为一系列重叠的15mer肽，每个肽的15个氨基酸中的14个与其前体重叠。这些肽作为21种单个肽的集合提供，它们的构建使得每一种肽恰好在2个集合中出现。矩阵形式的肽集合阵列能够确定单个肽为行和列混合物的交叉点(图6)。选择10名表达MHC I类分子A2的CMV血清阳性的健康血液供体作为供体。由于已知pp65抗原被携带该MHC分子的供体特异识别，推断出这种MHC偏性(Saulquin等人，2000；Kern等人，2000)。
平行地使用来自CMV血清阳性个体的外周血单核细胞(PBMC)(在SDS-稳定性测定中与可溶性重组HLA II类分子结合)通过干扰素-γ(IFN-γ)酶联免疫印迹测定筛选相同的肽(集合)。这两种方法都产生表位，尽管选择HLA没有偏向(T细胞测定方法选择I类HLA-A2，肽结合方法选择II类HLA-DR4)显示一定程度的重叠。
材料与方法
肽
用Syro II合成仪(Multisyntech，Witten，Germany)合成547种15个氨基酸残基(15mer)的肽，它们有14个氨基酸重叠，代表CMV pp65抗原的完整序列。利用标准F-moc化学法平行制备288种肽。
每种肽均以～10mg/ml的浓度溶解于100％DMSO中。来源于pp65的42种肽集合的贮存液在100％DMSO中制备，每种肽的终浓度均为0.45mg/ml。
其它肽用标准F-moc化学方法在Syro II合成仪或ABI 433A合成仪(Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)上合成，利用C18柱(来自YMC的ODS ACU或来自Vydac的218TP)通过RP-HPLC(Biocut700E，Applied Biosystems，Langen，Germany)纯化。每种肽的纯度和身份用Reflex III质谱仪(Bruker，Bremen，Germany)通过MALDI-TOF表征。
肽结合测定
可溶性HLA I类A*0201和HLA II类DRA1*0101/DRB1*0101/Ii、DRA1*0101/DRB1*0401/Ii和DRA1*0101/DRB1*0404/Ii分子在SC-2细胞中表达，如Aichinger等人，1997所述纯化。
在肽结合反应中，使用浓度为0.5μM的HLA分子，如果没有提出不同，每种单肽以10倍摩尔过量(5μM)加入。结合反应中DMSO的浓度不超过4％。在蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和0.1％辛基-b-D-葡糖吡喃糖苷(Sigma)存在下，该反应在PBS缓冲液(pH7.4)中进行，室温下48小时。
肽的结合通过SDS-稳定性测定法评价(Gorga等人，1987)：三聚体HLA II类ab-肽复合物耐受SDS，因此在SDS-PAGE Western印迹分析中以～60kDa的带出现。中亲和力到高亲和力的肽结合不能稳定的单个HLA II类α和β链分别作为～35kDa和～30kDa的带迁移。
简言之，HLA-肽复合物用1％SDS在室温下处理，通过20mA的SDS-PAGE电泳在室温下分析约2.5小时。通过电印迹将蛋白质转移到PVDF膜上，用抗-a-链TAL.1B5α或/和β-链MEM136抗体染色。为了检测Western印迹信号，使用ECL溶液(Amersham)。
与DRB1*0701和DRB1*1101的结合亲和力通过肽竞争测定法检测(Reay等人，1992)。简言之，生物素化的CLIP肽(参照肽)的结合用于监测HLA：肽复合物的形成。向结合反应中加入的与CLIP肽等摩尔浓度的检测肽当其亲和力高于CLIP的亲和力时能够竞争CLIP，或者当其亲和力等于CLIP的亲和力时抑制50％的结合。对于较低亲和力的肽，它们应当过量加入参照肽中，以竞争占据HLA结合的沟槽。参照肽结合50％抑制(IC50)所需的竞争肽的浓度值能够用来估计肽结合的亲和力。此外，在存在或不存在竞争肽的情况下，比较与HLA分子结合的参照肽的量，能够测定目的肽的结合活性。
在该肽-竞争测定中，肽结合的条件与以上所述相似。可溶性HLA分子以0.5μM的浓度使用，生物素化的CLIP以2μM的终浓度加入所有样品中。以三个不同浓度加入竞争肽：0.25、5、100μM。结合反应在PBS缓冲液(pH7.4)中进行，37℃18小时。与可溶性HLA分子结合的生物素化CLIPm的量通过ELISA测定。简言之，MaxiSorb 96孔板(Nunc，Denmark)用小鼠抗αβ抗体L243(从ATCC HB-55中纯化)包被，方法是与50μl10μg/ml PBS稀释液4℃温育过夜。与塑料的非特异性结合通过与含有3％BSA的T-PBS在37℃下温育2小时阻断，结合反应然后在室温下“捕获”2小时。用T-PBS充分洗板后，使用碱性磷酸酶-链霉亲和素偶联物(Dako)和Sigma 104磷酸酶底物(SigmaDiagnostics，USA)以比色法检测HLA结合的肽复合物。405nm的光密度用微孔板读板器SUNRISE(Tecan)测量。
来自HLA-肽复合物的肽的鉴定
在肽与可溶性HLA分子的结合反应后，在Superdex-200柱(AKTAdesign，Amersham Pharmacia Biotech)上通过凝胶过滤层析使HLA-肽复合物与游离肽分离。收集含有HLA的级分，通过加入TFA至终浓度为1％，由复合物重建结合的肽。这些肽通过Ziptip纯化脱盐，并通过MALDI-TOF质谱法分析。
合成酶联免疫印迹测定
来自Millipore的96孔过滤板(目录号：MAHA S4510)用1μg/孔来自Bender Med Systems的抗人IFN-γmab B140和0.5μg/孔来自Qiagen的QIAexpress五His抗体的混合物包被，4℃过夜。作为CD8+T细胞的生存力和细胞因子产生的阳性对照，有些孔用抗CD3抗体包被，克隆MEM-57，来自V.Horejsi，Institute of Molecular Genetics，Prag。
用PBS(来自GIBCOBRL，目录号14190-094)洗板2次，用下列ELISPOT培养基封闭：来自GIBCOBRL的RPMI 1640(目录号：31870-025)，补充有1mM来自GIBCOBRL的丙酮酸钠(目录号：11360-039)、2mM来自GIBCOBRL的L-谷氨酰胺(目录号：25030-024)、0.1mM来自GIBCOBRL的非必需氨基酸(目录号：11140-035)、50μg/ml来自  GIBCOBRL的庆大霉素(目录号：15710-049)、50μM来自GIBCOBRL的2-巯基乙醇(目录号：31350-010)和10％来自BioWhittaker的人AB型血清(目录号：14-490E)，37℃30分钟。
在除去封闭培养基后，孔与可溶性HLA DRB1*0401温育，37℃5小时，后者加载来自结核分枝杆菌的肽1242，来自流感血凝素的肽1171(HA-pep：aa 306-318)，或者对于阴性对照，加载来自丙型肝炎病毒的肽84(HCV-pep：NS3 aa 1248-1261)，用ELISPOT培养基稀释为100μg/ml(10μg/孔)(图5a)。对于图5b，使用可溶性HLA A*0201分子，其中加载来源于EBV抗原的肽BMLF1 aa 280-88，来源于流感基质蛋白的肽21，aa 58-66，或者对于阴性对照，加载来源于HIV逆转录酶的肽90，aa 476-484。分子的加载基本如段落“肽结合测定”所述进行。
具有匹配的HLA表型、接种BCG、HIV和HCV阴性的健康供体的外周血单核细胞(PBMC)用Leuco Sep试管(来自Greiner)在Lymphoprep(来自Nycomed Pharma AS，Oslo，Norway)上分离，用PBS(来自GIBCOBRL，目录号14190-094)洗涤3次。
利用MACS技术(Miltenyi，Germany)，按照厂商说明，从PBMC中分离CD4+T细胞(图5a)或CD8+T细胞(图5b)。分离的T细胞重悬浮于含有10μg/ml抗CD28单克隆抗体(克隆37407.111，mab 342，来自R&D systems)的ELISPOT培养基中，浓度为1Mio/ml。
弃去含有可溶性HLA(sHLA)分子的溶液，将分离的T细胞接种到孔中。向各自的样品中再添加5μM(图5a)或10μg/ml(图5b)相应的肽。
细胞与sHLA分子共培养20小时。通过除去内容物并用洗涤缓冲液(PBS；0.1％Tween 20，来自SIGMA)洗涤6次，停止测定。然后，加入100μl1∶10000稀释的生物素化抗人IFN-γmab(B308-BT2，来自BMS)，相当于0.015μg/孔，37℃温育2小时，或者4℃过夜。洗涤后，以1.2μg/ml加入来自DAKO的链霉亲和素-ALP(目录号：D0396)，37℃1小时。加入100μl/孔来自SIGMA的BCIP/NBT碱性磷酸酶底物(目录号：B-5655)，使该测定显色。
用Elispot读数器(Bioreader 2000，来自Biosys，Germany)计数大小为直径130μm到2000μm的斑点。由阴性对照样品(HCV或HIV肽)推断自发诱导的IFN-γ斑点的平均数量。超过平均自发IFN-γ释放的每个应答，其中该值加上阴性对照样品标准差的2倍，被认为是显著的。
为了筛选9名CMV血清阳性HLA A2健康志愿者的PBMC针对CMV pp65抗原的T细胞应答，这次筛选中包括PBMC的收集、制备和冻存。这些供体关于HLA I类A和B的HLA信息可以获得，但是没有关于HLA I类C或HLA II类的信息。
将全血收集到ACD Vacutainer管(BectonDickinson，Europe)中。利用Leuco Sep管(来自Greiner)，在Lymphoprep(来自NycomedPharma AS，Oslo，Norway)上从全血中分离PBMC，用PBS(来自GIBCOBRL，目录号14190-094)洗涤3次，以20Mio c/ml的浓度重悬浮于下列冷冻培养基中：4份来自GIBCOBRL的RPMI 1640(目录号：31870-025)，补充有1mM来自GIBCOBRL的丙酮酸钠(目录号：11360-039)、2mM来自GIBCOBRL的L-谷氨酰胺(目录号：25030-024)、0.1mM来自GIBCOBRL的非必需氨基酸(目录号：11140-035)、50μg/ml来自GIBCOBRL的庆大霉素(目录号：15710-049)、50μM来自GIBCOBRL的2-巯基乙醇(目录号：31350-010)；5份来自PAA的胎牛血清(FCS)(目录号：A11-042)；使用前向细胞培养物中加入1份来自SIGMA的DMSO(目录号D2650)。
PBMC在冷冻容器(Nalgene 1℃冷冻容器，目录号5100-0001)中-80℃贮存过夜，然后转移到液氮容器中。
对单细胞人IFN-γ释放的ELISPOT测定：从冷冻的PBMC中检测pp65特异的效应细胞
该测定基本如Lalvani等人所述进行。简言之，来自Millipore的多筛选96孔过滤板(目录号：MAHA S4510)在4℃下用10μg/ml来自Bender Med Systems的抗人IFN-γmab B140(1μg/孔)包被，过夜。用PBS(来自GIBCOBRL，目录号14190-094)洗板2次，用下列ELISPOT培养基封闭：来自GIBCOBRL的RPMI 1640(目录号：31870-025)，补充有1mM来自GIBCOBRL的丙酮酸钠(目录号：11360-039)、2mM来自GIBCOBRL的L-谷氨酰胺(目录号：25030-024)、0.1mM来自GIBCOBRL的非必需氨基酸(目录号：11140-035)、50μg/ml来自GIBCOBRL的庆大霉素(目录号：15710-049)、50μM来自GIBCOBRL的2-巯基乙醇(目录号：31350-010)和10％来自BioWhittaker的人AB型血清(目录号：14-490E)。
冻存的PBMC在37℃水浴中快速融解，用ELISPOT培养基洗涤两次。在融解后，将PBMC置入孵箱(37℃，5％CO2)中2小时。温育后，使细胞通过70μm渗滤器(Falcon)过滤，调节到浓度为2Mio/ml，以200000个PBMC/孔平板接种。
PBMC与肽集合(其中含有终浓度为5μg/ml的每种单种肽)或者与终浓度为10μg/ml的个别肽共培养20小时。使用伴刀豆球蛋白A(SIGMA)多克隆诱导IFN-γ的分泌作为测定对照。自发的IFN-γ释放如下测定：温育PBMC与单独的培养基，或者由于仅筛选HIV阴性的供体，加入来自HIV的HLA 0201限制的CTL表位(HIV逆转录酶，aa 476-484：ILKEPVHGV)。该筛选中包括通常识别来自流感基质蛋白的HLA A 0201限制的CTL表位(aa 58-65：GILGFVFTL)和EBVBMLF1抗原(aa 280-288：GLCTLVAML)的肽，作为阳性对照。
测定如段落“合成酶联免疫印迹测定”所述显色。
HLA转基因小鼠的免疫
在第一组免疫原性实验中，如下将掺入候选表位序列的较长合成肽注射到HLA-DRB1*0401-转基因小鼠中：每组3只小鼠(雌性小鼠，8周龄)，一次皮下注射到后足垫中(每只小鼠总共300μg肽和5纳摩尔CpG1668)。
在第二组表位作图实验中，合成的CMV衍生肽在HLA-DRB1*0401转基因小鼠中如下检测：每组6只小鼠(雌性小鼠，8周龄)，以一周间隔分3次皮下注射到胁部(每只小鼠总共100μg肽和一次50μl CFA、两次50μlIFA)。
在第三组表位作图实验中，合成的CMV衍生肽在HLA-DRB1*0401转基因小鼠中如下检测：每组8只小鼠(雌性小鼠，8周龄)，一次皮下注射到后足垫中(对于肽1500，每只小鼠总共300μg肽和5纳摩尔CpG1668，对于肽1503和1504，每只小鼠相同含量的肽和50μl IFA)。
鼠脾细胞的分离和CD4+/CD8+T细胞的分离
在最后一次注射后第7天取出脾脏，每组合并在一起。为了制备单细胞悬液，脾脏在补充了5％FCS、2mmole L-谷氨酰胺、50μg/ml庆大霉素、1％丙酮酸钠、0.1％2-巯基乙醇和1％非必需氨基酸(PAA Laboratories，Linz，Austria)的DMEM培养基(完全培养基)中破碎，并通过70μm细胞渗滤器过滤。细胞在完全培养基中洗涤(1200转/分，10分钟)，沉淀重悬浮于红细胞裂解缓冲液(Sigma-Aldrich)中，温育2分钟除去红细胞。洗涤后，用KOVA Glasstic载玻片(Hycor，Biomedical INC.)计数细胞，用完全培养基调节为每ml 10×107、3.3×106、1.1×106个细胞的浓度。
为了检测可能表位的I类或II类限制，利用包括miniMACS和midiMACS柱和抗-CD4和抗-CD8磁珠(Miltenyi Biotec，Germany)的MACS分离系统，按照厂商推荐的程序，将来自鼠脾脏的总细胞分为CD4+和CD8+群体。染色后通过FACS分析检查CD4+和CD8+群体的纯度，简述如下：来自总脾细胞、CD4+和CD8+级分的2×105细胞等份用抗CD8-PE(53-6-7)和抗CD4-FITC(RM4.4)抗体(PharMingen)在室温下染色15分钟。洗涤后，用FACS CALIBUR(BactonDickinson)分析样品。来自幼稚DRB1*0401转基因小鼠的脾细胞用类似于实验样品的方法染色，并且另外用同型对照抗体染色，根据单染色和双染色的样品调节FACS CALUBUR设置。
鼠脾细胞IFN-γ释放的ELISPOT测定
ELISpot测定板(MAHA S4510，Millipore，Germany)用PBS(200μl/孔)漂洗，用抗小鼠IFN-γ(INF-γ)mAb(克隆R46A2，购自ATCC，Manassas，VA；50μl/孔1μg/ml，溶于0.1M NaHCO3，pH9.2-9.5)包被，4℃温育过夜。用含有0.1％Tween-20的PBS洗板4次，与补充1％BSA(200μl/孔)的PBS在室温下温育2小时，阻断非特异性结合。细胞以1×106和3.3×105和1.1×105个细胞/孔的总量接种于100μl，在37℃/5％CO2下与分别加到孔中的10μg/ml(终浓度)不同刺激剂温育过夜，孔中含有体积为100μl的细胞，这些刺激剂是：用于接种的长肽(无关肽)或来源于长肽的重叠的15-mers，或并非用于接种的无关肽HA306-318(编号1171)，或培养基对照。随后，洗板4次，与生物素化抗小鼠IFN-γmAb(克隆AN18.17.24，购自ATCC，Manassas，VA；100ml/孔2μg/ml，溶于PBS/1％BSA)温育，37℃2小时。洗涤后，加入100μl/孔用PBS(Roche Diagnostics，Vienna，Austria)1∶5000稀释的链霉亲和素-过氧化物酶，平板在37℃下再温育1小时。之后，用PBS/0.1％Tween-20洗板4次，加入100μl/孔底物(10ml 10mM TrispH7.5，补充有200μl 40mg/ml DAB、50ml 80mg/ml NiCl2和5μl30％H2O2)。20-30分钟后用自来水洗板终止反应。干燥的平板用BIOREADER 2000(BioSys，Karben，Germany)和MICROSOFTOFFICE EXCEL程序分析。
实施例I.肽混合物中的表位捕获，以及通过质谱法鉴定
在该实施例中，从相对简单的肽混合物中捕获与HLA II类分子结合的高亲和力肽的能力得到证明。
首先，用直接结合测定检测某些肽与可溶性DRB1*0401分子的结合亲和力(图1)。与众所周知的“强”结合剂YAR和HA306-318相比较，肽亲和力被定义为高或低(Valli等人(1993)，SDS-稳定性测定(表1)。1242肽的结合亲和力被认为是最高的，与YAR肽的亲和力相当。
其次，检测了从两种高亲和力配体的混合物中捕获与HLA II类分子结合的肽的能力。结合反应含有1μM可溶性DRB1*0401分子和各5μM YAR和1242肽。在HLA-肽复合物形成后，通过过滤层析使它们与过量的游离肽分离。收集含有MHC分子的级分。从复合物中洗脱结合的肽，通过质谱法分析。读数后，检测的两种高亲和力配体都在与MHC分子的复合物中显示(图2)。
第三，研究了过量的低亲和力肽是否影响高亲和力配体的结合能力。为此，在含量恒定(100μM)的低亲和力肽1236存在下，1μMDRB1*0401分子与加入的浓度为5-50μM的1242肽进行结合反应，使得1236比1242肽过量2-20倍。肽的结合通过SDS-稳定性测定评价，通过MS分析证实(图3)。该实验表明20倍摩尔过量的低亲和力肽不会阻碍与高亲和力配体形成稳定的MHC-复合物。
最后，检测10种不同结合亲和力的肽的集合的结合(见表1)。除了1236肽以55μM的浓度加入以外，结合反应中每种肽的终浓度均为5μM，这意味着每种单个结合肽的浓度比全部肽的终浓度低20倍。DRB1*0401分子以1μM的浓度加入。利用单种肽作为对照，如上所述评价MHC-肽复合物的形成(图4)。纯化DR4捕获的肽，通过MS分析测序。分析结果产生具有最高结合亲和力的两种肽：1242和YAR(见表1)。复合物中没有发现中亲和力和低亲和力的肽，这可能是由于该测定中使用了高浓度的强竞争剂。但是当结合肽的浓度降至0.5μM，使得加入的DR4分子比每种肽都过量时，检测到中亲和力的肽(HA306-318)。这些结果证实了从肽混合物中捕获一种以上的高亲和力肽以及中结合亲和力的肽的可能性。
表1
肽ID  序列 DR4结合# 参考文献
YAR  YARFQSQTTLKQKT +++ Valli etal.，1993
HA 306318  YPKYVKQNTLKLAT ++ Valli etal.，1993
1235  IDELKTNSSLLTSILTYHVV -
1236  TGSGAGIAQAAAGTV +
1237  GVSTANATVYMIDSVL ++
1238  NFAGIEAAASAIQGNV -
1239  AETPGCVAYIGISFLDQ -
1240  VSDLKSSTAVIPGYPV +
1241  NFLLPDAQSIQAAAAG ++
1242  YNINISLPSYYPDQKSL +++
#“+++”高结合亲和力；“++”中结合亲和力；“+”低结合亲和力；“-”不结合。
实施例II.通过合成T细胞测定法测定针对捕获的肽的T细胞应答
在该实施例中证实，如实施例I所述鉴定的肽不仅结合MHC分子，而且能够刺激T细胞，证实它们是T细胞表位。这一问题是相关的，因为肽与MHC分子的结合本身不能确保该肽“在体内”是相关的。该肽在内体蛋白酶(CD4+T细胞的抗原)或蛋白酶体(CD8+T细胞的抗原)加工“体内”抗原过程中可能不产生。甚至“在体内”加工并呈递的肽能够不刺激T细胞，代之以使其无反应性(anergize)(拮抗剂)。当读取T细胞刺激时，选择一种IFN-γELISPOT测定。
对于图5a所述的实施例，来自HCV阴性、接种BCG的健康供体的CD4+T细胞从外周血中分离，与加载p1242和p84的sHLADRB1*0401共培养，p84是一种HCV肽，用作阴性对照。加入抗CD28单克隆抗体实现共刺激。图5a显示诱导的IFN-γ斑的数量，每个斑点代表一个刺激的T细胞。诱导的数量显著高于含阴性对照肽的样品中检测到的自发IFN-γ分泌。
为了显示这不只是适用于MHC II类限制的肽，来自最近感染流感的HIV阴性、感染EBV的健康供体的CD8+T细胞与加载来自流感基质蛋白或EBV BMLF1抗原的肽的sHLA A0201分子一起温育。能够检测到针对两种病毒肽的显著的T细胞应答(图5b)。在与CD8+T细胞共培养之前温育加载的sHLAA0201分子与抗HLAA0201抗体证明了该应答的特异性。这种预温育几乎完全消除了IFN-γ分泌，在这些样品中只检测到自发的IFN-γ分泌。这些实施例证明，“在体内”存在针对捕获的肽的功能性T细胞，因此这些肽是表位，在疫苗中可能有用，诱导保护性免疫应答。
实施例III.通过测定以矩阵形式排列的肽集合对HLA结合肽的快速鉴定
在证实了使用肽集合检测各种结合肽的能力后，利用根据本发明的方法从CMV pp65抗原中鉴定能够结合HLA II类分子的肽。为此，直接肽结合法与以前描述的肽集合阵列法(Kern等人，1999；Tobery等人，2001)相组合。
为了覆盖长560个氨基酸的完整pp65序列，设计了547种15mers，它们有14个氨基酸重叠。所有肽的序列都在表2中显示。
表2.覆盖完整CMV pp65序列的重叠15-mer肽的序列
肽编号        序列                   肽编号           序列                    肽编号            序列
1             MESRGRRCPEMISVL        83               TGSEVENVSVNVHNP         165               GLAWTRQQNQWKEPD
2             ESRGRRCPEMISVLG        84               GSEVENVSVNVHNPT         166               LAWTRQQNQWKEPDV
3             SRGRRCPEMISVLGP        85               SEVENVSVNVHNPTG         167               AWTRQQNQWKEPDVY
4             RGRRCPEMISVLGPI        86               EVENVSVNVHNPTGR         168               WTRQQNQWKEPDVYY
5             GRRCPEMISVLGPIS        87               VENVSVNVHNPTGRS         169               TRQQNQWKEPDVYYT
6             RRCPEMISVLGPISG        88               ENVSVNVHNPTGRSI         170               RQQNQWKEPDVYYTS
7             RCPEMISVLGPISGH        89               NVSVNVHNPTGRSIC         171               QQNQWKEPDVYYTSA
8             CPEMISVLGPISGHV        90               VSVNVHNPTGRSICP         172               QNQWKEPDVYYTSAF
9             PEMISVLGPISGHVL        91               SVNVHNPTGRSICPS         173               NQWKEPDVYYTSAFV
10            EMISVLGPISGHVLK        92               VNVHNPTGRSICPSQ         174               QWKEPDVYYTSAFVF
11            MISVLGPISGHVLKA        93               NVHNPTGRSICPSQE         175               WKEPDVYYTSAFVFP
12            ISVLGPISGHVLKAV        94               VHNPTGRSICPSQEP         176               KEPDVYYTSAFVFPT
13            SVLGPISGHVLKAVF        95               HNPTGRSICPSQEPM         177               EPDVYYTSAFVFPTK
14            VLGPISGHVLKAVFS        96               NPTGRSICPSQEPMS         178               PDVYYTSAFVFPTKD
15            LGPISGHVLKAVFSR        97               PTGRSICPSQEPMSI         179               DVYYTSAFVFPTKDV
16            GPISGHVLKAVFSRG        98               TGRSICPSQEPMSIY         180               VYYTSAFVFPTKDVA
17            PISGHVLKAVFSRGD        99               GRSICPSQEPMSIYV         181               YYTSAFVFPTKDVAL
18            ISGHVLKAVFSRGDT        100              RSICPSQEPMSIYVY         182               YTSAFVFPTKDVALR
19            SGHVLKAVFSRGDTP        101              SICPSQEPMSIYVYA         183               TSAFVFPTKDVALRH
20            GHVLKAVFSRGDTPV        102              ICPSQEPMSIYVYAL         184               SAFVFPTKDVALRHV
21            HVLKAVFSRGDTPVL        103              CPSQEPMSIYVYALP         185               AFVFPTKDVALRHVV
22            VLKAVFSRGDTPVLP        104              PSQEPMSIYVYALPL         186               FVFPTKDVALRHVVC
23            LKAVFSRGDTPVLPH        105              SQEPMSIYVYALPLK         187               VFPTKDVALRHVVCA
24            KAVFSRGDTPVLPHE        106              QEPMSIYVYALPLKM         188               FPTKDVALRHVVCAH
25            AVFSRGDTPVLPHET        107              EPMSIYVYALPLKML         189               PTKDVALRHVVCAHE
26            VFSRGDTPVLPHETR        108              PMSIYVYALPLKMLN         190               TKDVALRHVVCAHEL
27            FSRGDTPVLPHETRL        109              MSIYVYALPLKMLNI         191               KDVALRHVVCAHELV
28            SRGDTPVLPHETRLL        110              SIYVYALPLKMLNIP         192               DVALRHVVCAHELVC
29            RGDTPVLPHETRLLQ        111              IYVYALPLKMLNIPS         193               VALRHVVCAHELVCS
30            GDTPVLPHETRLLQT        112              YVYALPLKMLNIPSI         194               ALRHVVCAHELVCSM
31            DTPVLPHETRLLQTG        113              VYALPLKMLNIPSIN         195               LRHVVCAHELVCSME
32            TPVLPHETRLLQTGI        114              YALPLKMLNIPSINV         196               RHVVCAHELVCSMEN
33            PVLPHETRLLQTGIH        115              ALPLKMLNIPSINVH         197               HVVCAHELVCSMENT
34            VLPHETRLLQTGIHV        116              LPLKMLNIPSINVHH         198               VVCAHELVCSMENTR
35            LPHETRLLQTGIHVR        117              PLKMLNIPSINVHHY         199               VCAHELVCSMENTRA
36            PHETRLLQTGIHVRV        118              LKMLNIPSINVHHYP         200               CAHELVCSMENTRAT
37            HETRLLQTGIHVRVS        119              KMLNIPSINVHHYPS         201               AHELVCSMENTRATK
38            ETRLLQTGIHVRVSQ        120              MLNIPSINVHHYPSA         202               HELVCSMENTRATKM
39            TRLLQTGIHVRVSQP        121              LNIPSINVHHYPSAA         203               ELVCSMENTRATKMQ
40            RLLQTGIHVRVSQPS        122              NIPSINVHHYPSAAE         204               LVCSMENTRATKMQV
41            LLQTGIHVRVSQPSL        123              IPSINVHHYPSAAER         205               VCSMENTRATKMQVI
42            LQTGIHVRVSQPSLI        124              PSINVHHYPSAAERK         206               CSMENTRATKMQVIG
43            QTGIHVRVSQPSLIL        125              SINVHHYPSAAERKH         207               SMENTRATKMQVIGD
44            TGIHVRVSQPSLILV        126              INVHHYPSAAERKHR         208               MENTRATKMQVIGDQ
45            GIHVRVSQPSLILVS        127              NVHHYPSAAERKHRH         209               ENTRATKMQVIGDQY
46            IHVRVSQPSLILVSQ        128              VHHYPSAAERKHRHL         210               NTRATKMQVIGDQYV
47            HVRVSQPSLILVSQY        129              HHYPSAAERKHRHLP         211               TRATKMQVIGDQYVK
48            VRVSQPSLILVSQYT        130              HYPSAAERKHRHLPV         212               RATKMQVIGDQYVKV
49            RVSQPSLILVSQYTP        131              YPSAAERKHRHLPVA         213               ATKMQVIGDQYVKVY
50            VSQPSLILVSQYTPD        132              PSAAERKHRHLPVAD         214               TKMQVIGDQYVKVYL
51            SQPSLILVSQYTPDS        133              SAAERKHRHLPVADA         215               KMQVIGDQYVKVYLE
52            QPSLILVSQYTPDST        134              AAERKHRHLPVADAV         216               MQVIGDQYVKVYLES
53            PSLILVSQYTPDSTP        135              AERKHRHLPVADAVI         217               QVIGDQYVKVYLESF
54            SLILVSQYTPDSTPC        136              ERKHRHLPVADAVIH         218               VIGDQYVKVYLESFC
55            LILVSQYTPDSTPCH        137              RKHRHLPVADAVIHA         219               IGDQYVKVYLESFCE
56            ILVSQYTPDSTPCHR        138              KHRHLPVADAVIHAS         220               GDQYVKVYLESFCED
57            LVSQYTPDSTPCHRG        139              HRHLPVADAVIHASG         221               DQYVKVYLESFCEDV
58            VSQYTPDSTPCHRGD        140              RHLPVADAVIHASGK         222               QYVKVYLESFCEDVP
59        SQYTPDSTPCHRGDN        141        HLPVADAVIHASGKQ        223        YVKVYLESFCEDVPS
60        QYTPDSTPCHRGDNQ        142        LPVADAVIHASGKQM        224        VKVYLESFCEDVPSG
61        YTPDSTPCHRGDNQL        143        PVADAVIHASGKQMW        225        KVYLESFCEDVPSGK
62        TPDSTPCHRGDNQLQ        144        VADAVIHASGKQMWQ        226        VYLESFCEDVPSGKL
63        PDSTPCHRGDNQLQV        145        ADAVIHASGKQMWQA        227        YLESFCEDVPSGKLF
64        DSTPCHRGDNQLQVQ        146        DAVIHASGKQMWQAR        228        LESFCEDVPSGKLFM
65        STPCHRGDNQLQVQH        147        AVIHASGKQMWQARL        229        ESFCEDVPSGKLFMH
66        TPCHRGDNQLQVQHT        148        VIHASGKQMWQARLT        230        SFCEDVPSGKLFMHV
67        PCHRGDNQLQVQHTY        149        IHASGKQMWQARLTV        231        FCEDVPSGKLFMHVT
68        CHRGDNQLQVQHTYF        150        HASGKQMWQARLTVS        232        CEDVPSGKLFMHVTL
69        HRGDNQLQVQHTYFT        151        ASGKQMWQARLTVSG        233        EDVPSGKLFMHVTLG
70        RGDNQLQVQHTYFTG        152        SGKQMWQARLTVSGL        234        DVPSGKLFMHVTLGS
71        GDNQLQVQHTYFTGS        153        GKQMWQARLTVSGLA        235        VPSGKLFMHVTLGSD
72        DNQLQVQHTYFTGSE        154        KQMWQARLTVSGLAW        236        PSGKLFMHVTLGSDV
73        NQLQVQHTYFTGSEV        155        QMWQARLTVSGLAWT        237        SGKLFMHVTLGSDVE
74        QLQVQHTYFTGSEVE        156        MWQARLTVSGLAWTR        238        GKLFMHVTLGSDVEE
75        LQVQHTYFTGSEVEN        157        WQARLTVSGLAWTRQ        239        KLFMHVTLGSDVEED
76        QVQHTYFTGSEVENV        158        QARLTVSGLAWTRQQ        240        LFMHVTLGSDVEEDL
77        VQHTYFTGSEVENVS        159        ARLTVSGLAWTRQQN        241        FMHVTLGSDVEEDLT
78        QHTYFTGSEVENVSV        160        RLTVSGLAWTRQQNQ        242        MHVTLGSDVEEDLTM
79        HTYFTGSEVENVSVN        161        LTVSGLAWTRQQNQW        243        HVTLGSDVEEDLTMT
80        TYFTGSEVENVSVNV        162        TVSGLAWTRQQNQWK        244        VTLGSDVEEDLTMTR
81        YFTGSEVENVSVNVH        163        VSGLAWTRQQNQWKE        245        TLGSDVEEDLTMTRN
82        FTGSEVENVSVNVHN        164        SGLAWTRQQNQWKEP        246        LGSDVEEDLTMTRNP
肽编号    序列                   肽编号     序列                   肽编号     序列
247       GSDVEEDLTMTRNPQ        329        EVQAIRETVELRQYD        411        VTTERKTPRVTGGGA
248       SDVEEDLTMTRNPQP        330        VQAIRETVELRQYDP        412        TTERKTPRVTGGGAM
249       DVEEDLTMTRNPQPF        331        QAIRETVELRQYDPV        413        TERKTPRVTGGGAMA
250       VEEDLTMTRNPQPFM        332        AIRETVELRQYDPVA        414        ERKTPRVTGGGAMAG
251       EEDLTMTRNPQPFMR        333        IRETVELRQYDPVAA        415        RKTPRVTGGGAMAGA
252       EDLTMTRNPQPFMRP        334        RETVELRQYDPVAAL        416        KTPRVTGGGAMAGAS
253       DLTMTRNPQPFMRPH        335        ETVELRQYDPVAALF        417        TPRVTGGGAMAGAST
254       LTMTRNPQPFMRPHE        336        TVELRQYDPVAALFF        418        PRVTGGGAMAGASTS
255       TMTRNPQPFMRPHER        337        VELRQYDPVAALFFF        419        RVTGGGAMAGASTSA
256       MTRNPQPFMRPHERN        338        ELRQYDPVAALFFFD        420        VTGGGAMAGASTSAG
257       TRNPQPFMRPHERNG        339        LRQYDPVAALFFFDI        421        TGGGAMAGASTSAGR
258       RNPQPFMRPHERNGF        340        RQYDPVAALFFFDID        422        GGGAMAGASTSAGRK
259       NPQPFMRPHERNGFT        341        QYDPVAALFFFDIDL        423        GGAMAGASTSAGRKR
260       PQPFMRPHERNGFTV        342        YDPVAALFFFDIDLL        424        GAMAGASTSAGRKRK
261       QPFMRPHERNGFTVL        343        DPVAALFFFDIDLLL        425        AMAGASTSAGRKRKS
262       PFMRPHERNGFTVLC        344        PVAALFFFDIDLLLQ        426        MAGASTSAGRKRKSA
263       FMRPHERNGFTVLCP        345        VAALFFFDIDLLLQR        427        AGASTSAGRKRKSAS
264       MRPHERNGFTVLCPK        346        AALFFFDIDLLLQRG        428        GASTSAGRKRKSASS
265       RPHERNGFTVLCPKN        347        ALFFFDIDLLLQRGP        429        ASTSAGRKRKSASSA
266       PHERNGFTVLCPKNM        348        LFFFDIDLLLQRGPQ        430        STSAGRKRKSASSAT
267       HERNGFTVLCPKNMI        349        FFFDIDLLLQRGPQY        431        TSAGRKRKSASSATA
268       ERNGFTVLCPKNMII        350        FFDIDLLLQRGPQYS        432        SAGRKRKSASSATAC
269       RNGFTVLCPKNMIIK        351        FDIDLLLQRGPQYSE        433        AGRKRKSASSATACT
270       NGFTVLCPKNMIIKP        352        DIDLLLQRGPQYSEH        434        GRKRKSASSATACTS
271       GFTVLCPKNMIIKPG        353        IDLLLQRGPQYSEHP        435        RKRKSASSATACTSG
272       FTVLCPKNMIIKPGK        354        DLLLQRGPQYSEHPT        436        KRKSASSATACTSGV
273       TVLCPKNMIIKPGKI        355        LLLQRGPQYSEHPTF        437        RKSASSATACTSGVM
274       VLCPKNMIIKPGKIS        356        LLQRGPQYSEHPTFT        438        KSASSATACTSGVMT
275       LCPKNMIIKPGKISH        357        LQRGPQYSEHPTFTS        439        SASSATACTSGVMTR
276       CPKNMIIKPGKISHI        358        QRGPQYSEHPTFTSQ        440        ASSATACTSGVMTRG
277       PKNMIIKPGKISHIM        359        RGPQYSEHPTFTSQY        441        SSATACTSGVMTRGR
278       KNMIIKPGKISHIML        360        GPQYSEHPTFTSQYR        442        SATACTSGVMTRGRL
279       NMIIKPGKISHIMLD        361        PQYSEHPTFTSQYRI        443        ATACTSGVMTRGRLK
280       MIIKPGKISHIMLDV        362        QYSEHPTFTSQYRIQ        444        TACTSGVMTRGRLKA
281       IIKPGKISHIMLDVA        363        YSEHPTFTSQYRIQG        445        ACTSGVMTRGRLKAE
282           IKPGKISHIMLDVAF       364           SEHPTFTSQYRIQGK      446           CTSGVMTRGRLKAES
283           KPGKISHIMLDVAFT       365           EHPTFTSQYRIQGKL      447           TSGVMTRGRLKAEST
284           PGKISHIMLDVAFTS       366           HPTFTSQYRIQGKLE      448           SGVMTRGRLKAESTV
285           GKISHIMLDVAFTSH       367           PTFTSQYRIQGKLEY      449           GVMTRGRLKAESTVA
286           KISHIMLDVAFTSHE       368           TFTSQYRIQGKLEYR      450           VMTRGRLKAESTVAP
287           ISHIMLDVAFTSHEH       369           FTSQYRIQGKLEYRH      451           MTRGRLKAESTVAPE
288           SHIMLDVAFTSHEHF       370           TSQYRIQGKLEYRHT      452           TRGRLKAESTVAPEE
289           HIMLDVAFTSHEHFG       371           SQYRIQGKLEYRHTW      453           RGRLKAESTVAPEED
290           IMLDVAFTSHEHFGL       372           QYRIQGKLEYRHTWD      454           GRLKAESTVAPEEDT
291           MLDVAFTSHEHFGLL       373           YRIQGKLEYRHTWDR      455           RLKAESTVAPEEDTD
292           LDVAFTSHEHFGLLC       374           RIQGKLEYRHTWDRH      456           LKAESTVAPEEDTDE
293           DVAFTSHEHFGLLCP       375           IQGKLEYRHTWDRHD      457           KAESTVAPEEDTDED
294           VAFTSHEHFGLLCPK       376           QGKLEYRHTWDRHDE      458           AESTVAPEEDTDEDS
295           AFTSHEHFGLLCPKS       377           GKLEYRHTWDRHDEG      459           ESTVAPEEDTDEDSD
296           FTSHEHFGLLCPKSI       378           KLEYRHTWDRHDEGA      460           STVAPEEDTDEDSDN
297           TSHEHFGLLCPKSIP       379           LEYRHTWDRHDEGAA      461           TVAPEEDTDEDSDNE
298           SHEHFGLLCPKSIPG       380           EYRHTWDRHDEGAAQ      462           VAPEEDTDEDSDNEI
299           HEHFGLLCPKSIPGL       381           YRHTWDRHDEGAAQG      463           APEEDTDEDSDNEIH
300           EHFGLLCPKSIPGLS       382           RHTWDRHDEGAAQGD      464           PEEDTDEDSDNEIHN
301           HFGLLCPKSIPGLSI       383           HTWDRHDEGAAQGDD      465           EEDTDEDSDNEIHNP
302           FGLLCPKSIPGLSIS       384           TWDRHDEGAAQGDDD      466           EDTDEDSDNEIHNPA
303           GLLCPKSIPGLSISG       385           WDRHDEGAAQGDDDV      467           DTDEDSDNEIHNPAV
304           LLCPKSIPGLSISGN       386           DRHDEGAAQGDDDVW      468           TDEDSDNEIHNPAVF
305           LCPKSIPGLSISGNL       387           RHDEGAAQGDDDVWT      469           DEDSDNEIHNPAVFT
306           CPKSIPGLSISGNLL       388           HDEGAAQGDDDVWTS      470           EDSDNEIHNPAVFTW
307           PKSIPGLSISGNLLM       389           DEGAAQGDDDVWTSG      471           DSDNEIHNPAVFTWP
308           KSIPGLSISGNLLMN       390           EGAAQGDDDVWTSGS      472           SDNEIHNPAVFTWPP
309           SIPGLSISGNLLMNG       391           GAAQGDDDVWTSGSD      473           DNEIHNPAVFTWPPW
310           IPGLSISGNLLMNGQ       392           AAQGDDDVWTSGSDS      474           NEIHNPAVFTWPPWQ
311           PGLSISGNLLMNGQQ       393           AQGDDDVWTSGSDSD      475           EIHNPAVFTWPPWQA
312           GLSISGNLLMNGQQI       394           QGDDDVWTSGSDSDE      476           IHNPAVFTWPPWQAG
313           LSISGNLLMNGQQIF       395           GDDDVWTSGSDSDEE      477           HNPAVFTWPPWQAGI
314           SISGNLLMNGQQIFL       396           DDDVWTSGSDSDEEL      478           NPAVFTWPPWQAGIL
315           ISGNLLMNGQQIFLE       397           DDVWTSGSDSDEELV      479           PAVFTWPPWQAGILA
316           SGNLLMNGQQIFLEV       398           DVWTSGSDSDEELVT      480           AVFTWPPWQAGILAR
317           GNLLMNGQQIFLEVQ       399           VWTSGSDSDEELVTT      481           VFTWPPWQAGILARN
318           NLLMNGQQIFLEVQA       400           WTSGSDSDEELVTTE      482           FTWPPWQAGILARNL
319           LLMNGQQIFLEVQAI       401           TSGSDSDEELVTTER      483           TWPPWQAGILARNLV
320           LMNGQQIFLEVQAIR       402           SGSDSDEELVTTERK      484           WPPWQAGILARNLVP
321           MNGQQIFLEVQAIRE       403           GSDSDEELVTTERKT      485           PPWQAGILARNLVPM
322           NGQQIFLEVQAIRET       404           SDSDEELVTTERKTP      486           PWQAGILARNLVPMV
323           GQQIFLEVQAIRETV       405           DSDEELVTTERKTPR      487           WQAGILARNLVPMVA
324           QQIFLEVQAIRETVE       406           SDEELVTTERKTPRV      488           QAGILARNLVPMVAT
325           QIFLEVQAIRETVEL       407           DEELVTTERKTPRVT      489           AGILARNLVPMVATV
326           IFLEVQAIRETVELR       408           EELVTTERKTPRVTG      490           GILARNLVPMVATVQ
327           FLEVQAIRETVELRQ       409           ELVTTERKTPRVTGG      491           ILARNLVPMVATVQG
328           LEVQAIRETVELRQY       410           LVTTERKTPRVTGGG      492           LARNLVPMVATVQGQ
肽编号        序列                  肽编号        序列                 肽编号        序列
493           ARNLVPMVATVQGQN       520           IYRIFAELEGVWQPA      544           QDALPGPCIASTPKK
494           RNLVPMVATVQGQNL       521           YRIFAELEGVWQPAA      545           DALPGPCIASTPKKH
495           NLVPMVATVQGQNLK       522           RIFAELEGVWQPAAQ      546           ALPGPCIASTPKKHR
496           LVPMVATVQGQNLKY       523           IFAELEGVWQPAAQP      547           LPGPCIASTPKKHRG
497           VPMVATVQGQNLKYQ       524           FAELEGVWQPAAQPK
498           PMVATVQGQNLKYQE       525           AELEGVWQPAAQPKR
499           MVATVQGQNLKYQEF       526           ELEGVWQPAAQPKRR
500           VATVQGQNLKYQEFF       527           LEGVWQPAAQPKRRR
501           ATVQGQNLKYQEFFW       528           EGVWQPAAQPKRRRH
502           TVQGQNLKYQEFFWD       529           GVWQPAAQPKRRRHR
503           VQGQNLKYQEFFWDA       530           VWQPAAQPKRRRHRQ
504       QGQNLKYQEFFWDAN       531       WQPAAQPKRRRHRQD
505       GQNLKYQEFFWDAND       532       QPAAQPKRRRHRQDA
506       QNLKYQEFFWDANDI       533       PAAQPKRRRHRQDAL
507       NLKYQEFFWDANDIY       534       AAQPKRRRHRQDALP
508       LKYQEFFWDANDIYR       535       AQPKRRRHRQDALPG
509       KYQEFFWDANDIYRI       536       QPKRRRHRQDALPGP
510       YQEFFWDANDIYRIF       537       PKRRRHRQDALPGPC
511       QEFFWDANDIYRIFA       538       KRRRHRQDALPGPCI
512       EFFWDANDIYRIFAE       539       RRRHRQDALPGPCIA
513       FFWDANDIYRIFAEL       540       RRHRQDALPGPCIAS
514       FWDANDIYRIFAELE       541       RHRQDALPGPCIAST
515       WDANDIYRIFAELEG       542       HRQDALPGPCIASTP
516       DANDIYRIFAELEGV       543       RQDALPGPCIASTPK
517       ANDIYRIFAELEGVW       544       QDALPGPCIASTPKK
518       NDIYRIFAELEGVWQ       545       DALPGPCIASTPKKH
519       DIYRIFAELEGVWQP       546       ALPGPCIASTPKKHR
520       IYRIFAELEGVWQPA       547       LPGPCIASTPKKHRG
521       YRIFAELEGVWQPAA       519       DIYRIFAELEGVWQP
522       RIFAELEGVWQPAAQ       520       IYRIFAELEGVWQPA
523       IFAELEGVWQPAAQP       521       YRIFAELEGVWQPAA
524       FAELEGVWQPAAQPK       522       RIFAELEGVWQPAAQ
525       AELEGVWQPAAQPKR       523       IFAELEGVWQPAAQP
526       ELEGVWQPAAQPKRR       524       FAELEGVWQPAAQPK
527       LEGVWQPAAQPKRRR       525       AELEGVWQPAAQPKR
528       EGVWQPAAQPKRRRH       526       ELEGVWQPAAQPKRR
529       GVWQPAAQPKRRRHR       527       LEGVWQPAAQPKRRR
530       VWQPAAQPKRRRHRQ       528       EGVWQPAAQPKRRRH
531       WQPAAQPKRRRHRQD       529       GVWQPAAQPKRRRHR
532       QPAAQPKRRRHRQDA       530       VWQPAAQPKRRRHRQ
533       PAAQPKRRRHRQDAL       531       WQPAAQPKRRRHRQD
534       AAQPKRRRHRQDALP       532       QPAAQPKRRRHRQDA
535       AQPKRRRHRQDALPG       533       PAAQPKRRRHRQDAL
536       QPKRRRHRQDALPGP       534       AAQPKRRRHRQDALP
537       PKRRRHRQDALPGPC       535       AQPKRRRHRQDALPG
538       KRRRHRQDALPGPCI       536       QPKRRRHRQDALPGP
539       RRRHRQDALPGPCIA       537       PKRRRHRQDALPGPC
540       RRHRQDALPGPCIAS       538       KRRRHRQDALPGPCI
541       RHRQDALPGPCIAST       539       RRRHRQDALPGPCIA
542       HRQDALPGPCIASTP       540       RRHRQDALPGPCIAS
543       RQDALPGPCIASTPK       541       RHRQDALPGPCIAST
544       QDALPGPCIASTPKK       542       HRQDALPGPCIASTP
545       DALPGPCIASTPKKH       543       RQDALPGPCIASTPK
546       ALPGPCIASTPKKHR       544       QDALPGPCIASTPKK
547       LPGPCIASTPKKHRG       545       DALPGPCIASTPKKH
493       ARNLVPMVATVQGQN       546       ALPGPCIASTPKKHR
494       RNLVPMVATVQGQNL       547       LPGPCIASTPKKHRG
495       NLVPMVATVQGQNLK       519       DIYRIFAELEGVWQP
496       LVPMVATVQGQNLKY       520       IYRIFAELEGVWQPA
497       VPMVATVQGQNLKYQ       521       YRIFAELEGVWQPAA
498       PMVATVQGQNLKYQE       522       RIFAELEGVWQPAAQ
499       MVATVQGQNLKYQEF       523       IFAELEGVWQPAAQP
500       VATVQGQNLKYQEFF       524       FAELEGVWQPAAQPK
501       ATVQGQNLKYQEFFW       525       AELEGVWQPAAQPKR
502       TVQGQNLKYQEFFWD       526       ELEGVWQPAAQPKRR
503       VQGQNLKYQEFFWDA       527       LEGVWQPAAQPKRRR
504       QGQNLKYQEFFWDAN       528       EGVWQPAAQPKRRRH
505       GQNLKYQEFTWDAND       529       GVWQPAAQPKRRRHR
506       QNLKYQEFFWDANDI       530       VWQPAAQPKRRRHRQ
507       NLKYQEFFWDANDIY       531       WQPAAQPKRRRHRQD
508       LKYQEFFWDANDIYR       532       QPAAQPKRRRHRQDA
509       KYQEFFWDANDIYRI       533       PAAQPKRRRHRQDAL
510       YQEFFWDANDIYRIF       534       AAQPKRRRHRQDALP
511      QEFFWDANDIYRIFA        535       AQPKRRRHRQDALPG
512      EFFWDANDIYRIFAE        536       QPKRRRHRQDALPGP
513      FFWDANDIYRIFAEL        537       PKRRRHRQDALPGPC
514      FWDANDIYRIFAELE        538       KRRRHRQDALPGPCI
515      WDANDIYRIFAELEG        539       RRRHRQDALPGPCIA
516      DANDIYRIFAELEGV        540       RRHRQDALPGPCIAS
517      ANDIYRIFAELEGVW        541       RHRQDALPGPCIAST
518      NDIYRIFAELEGVWQ        542       HRQDALPGPCIASTP
519      DIYRIFAELEGVWQP        543       RQDALPGPCIASTPK
由于要检测大量的肽，这些肽组合成42个集合，每个集合含有以矩阵形式排列的21种肽，如图6所示。制备混合物，使得每一种肽恰好包含于一“行”集合和一“列”集合中。
通过SDS-稳定性测定检测每个矩阵集合与DR4分子的结合亲和力；HA306-318用作参照肽(图7a)。在第一次筛选中，发现42个阳性肽集合中的18个：来自“行”集合的2、3、6、15、16、19、20号和来自“列”集合的28-38号(参见图6)。通过发现阵列中反应性集合的交叉，确定77种肽为可能的结合剂。然后检测每个15mer分别与DR4分子的结合(图7b，表3)。因此，在第一次筛选中选择的20种肽在第二次筛选中证实是结合剂。在阵列的行中通常发现一种以上的阳性肽。这些重叠14个氨基酸的肽可能代表被CD4+T细胞上TCR受体识别的较长的表位。
以前描述了4种含有部分或全部相同序列的肽(肽177、361、507、508)，能够在暴露于CMV的健康人类受试者中引发特异性CD4+T细胞应答(Khattab等人，1997；Bitmansour等人，2001)。这证实了我们的方法的有效性。
一些鉴定的DRB1*0401结合肽，以及通过预测算法选择的其它肽，也检测它们与下列不同等位基因的可溶性HLA分子的结合：DRB1*0101、DRB1*0404、DRB1*0701和DRB1*1101(表3)。证明有7种肽(58、177、559、360、452、470和496)具有对至少两种HLA分子的亲和力，这支持这些表位的混杂性(promiscuity)。
也发现与DRB1*0404结合的3种肽(421、469和470)能诱导来自CMV血清阳性供体的T细胞分泌IFN-γ(参见实施例IV)，再次表明这第二种反向免疫学方法也能鉴定真正的T细胞表位。
总之，鉴定了来源于CMV pp65抗原的几个新序列，它们能够与HLA II类分子结合，考虑作为II类表位的候选物(表3中带阴影的)。包含所述表位的肽的免疫原性，以及它们的CD4+特异性，通过检测它们在来自体内地刺激CMV血清阳性供体和/或HLA-DRB1*0401转基因小鼠的T细胞后诱导IFN-γ产生的能力得到证实(参见实施例V、VI和VII)。
表3.CMV pp65蛋白的各种15mer肽与可溶性HLA分子的结合。新鉴定的结合剂带有阴影。
混合物编号 肽编号 肽序列 与DRB1*0401的结合 与DRB1*0404的结合 与DRB1*0101的结合 参考文献，注释
2和31 37 HETRLLQTGIHVRVS - nd nd Gallot et al.，CD4+克隆/DQ*0602
2和35 41 LLQTGIHVRVSQPSL - nd nd Gallot et al.，CD4+克隆/DQ*0602
2和37 43 QTGIHVRVSQPSLIL - nd nd Gallot et al.，CD4+克隆/DQ*0602
3和27 54 SLILVSQYTPDSTPC - nd nd
3和28 55 LILVSQYTPDSTPCH + nd nd 新，要求保护
3和29 56 ILVSQYTPDSTPCHR ++ nd nd 新，要求保护
3和30 57 LVSQYTPDSTPCHRG ++ - - 新，要求保护
3和31 58 VSQYTPDSTPCHRGD ++ nd nd 新，要求保护
3和32 59 SQYTPDSTPCHRGDN ++ nd nd 新，要求保护
3和33 60 QYTPDSTPCHRGDNQ ++ nd nd 新，要求保护
混合物编号 肽编号 肽序列 与DRB1*0401的结合 与DRB1*0404的结合 与DRB1*0101的结合 参考文献，注释
3和34 61 YTPDSTPCHRGDNQL ++ nd nd 新，要求保护
3和35 62§ TPDSTPCHRGDNQLQ - nd nd 新，要求保护
3和36 63§ PDSTPCHRGDNQLQV - nd nd 新，要求保护
3和37 64 DSTPCHRGDNQLQVQ + nd nd 新，要求保护
3和38 65 STPCHRGDNQLQVQH - nd nd
4和23 107 EPMSIYVYALPLKML - nd -
4和25 109 SIYVYALPLKMLNIP - nd + 新，要求保护
4和27 111 IYVYALPLKMLNIPS - nd -
6和29 170 RQQNQWKEPDVYYTS - nd nd
6和31 172 QNQWKEPDVYYTSAF - nd nd
6和33 174 QWKEPDVYYTSAFVF - nd -
6和34 175 WKEPDVYYTSAFVFP - nd +
6和35 176 KEPDVYYTSAFVFPT +/- nd -
6和36 177 EPDVYYTSAFVFPTK + nd nd Bitmansour etal.，CD4+克隆
6和37 178 PDVYYTSAFVFPTKD ++ nd nd
6和38 179 DVYYTSAFVFPTKDV + nd nd
6和39 180 VYYTSAFVFPTKDVA +/- nd nd
15和27 357 LQRGPQYSEHPTFTS - nd nd
15和28 358 QRGPQYSEHPTFTSQ + nd nd
15和29 359 RGPQYSEHPTFTSQY +/- nd nd
15和30 360 GPQYSEHPTFTSQYR +/- nd nd
15和31 361 PQYSEHPTFTSQYRI +/- nd nd Khattab et al.，CD4+克隆/DR11
15和32 362 QYSEHPTFTSQYRIQ - nd nd
混合物编号 肽编号 肽序列 与DRB1*0401的结合 与DRB1*0404的结合 与DRB1*0101的结合 参考文献，注释
15和33 363 YSEHPTFTSQYRIQG - nd nd
15和35 365 EHPTFTSQYRIQGKL - nd nd Gallot et al.，CD4+克隆/DR*1302
15和37 367 PTFTSQYRIQGKLEY - nd nd Gallot et al.，CD4+克隆/DR*1302
16和28 379 LEYRHTWDRHDEGAA - nd nd
16和29 380 EYRHTWDRHDEGAAQ - nd nd
16和31 382 RHTWDRHDEGAAQGD - nd nd
16和32 383 HTWDRHDEGAAQGDD +/- nd nd 新，要求保护
16和33 384 TWDRHDEGAAQGDDD + nd nd 新，要求保护
16和34 385 WDRHDEGAAQGDDDV - nd nd
16和37 388 HDEGAAQGDDDVWTS - nd nd
18和26 419 RVTGGGAMAGASTSA - - nd Bitmansour，CD4+克隆
18和28 421 TGGGAMAGASTSAGR - + nd 新，要求保护
18和30 423 GGAMAGASTSAGRKR - - nd
nd 448 SGVMTRGRLKAESTV - nd nd
nd 449 GVMTRGRLKAESTVA +/- nd nd 新，要求保护
nd 450 VMTRGRLKAESTVAP + nd nd 新，要求保护
混合物编号 肽编号 肽序列 与DRB1*0401的结合 与DRB1*0404的结合 与DRB1*0101的结合 参考文献，注释
nd 451 MTRGRLKAESTVAPE + nd nd 新，要求保护
nd 452 TRGRLKAESTVAPEE + + nd 新，要求保护
nd 453 RGRLKAESTVAPEED + nd nd 新，要求保护
nd 454 GRLKAESTVAPEEDT + nd nd 新，要求保护
nd 455 RLKAESTVAPEEDTD - nd nd
18和35 468 TDEDSDNEIHNPAVF - - nd
18和36 469 DEDSDNEIHNPAVFT - +/- nd 新，要求保护
18和37 470 EDSDNEIHNPAVFTW - +/- nd 新，要求保护
19和38 492 LARNLVPMVATVQGQ - ++ - Bitmansour，CD4+克隆
19和40 494 RNLVPMVATVQGQNL - ++ - ？
19和42 496 LVPMVATVQGQNLKY - + + ？
20和32 507 NLKYQEFFWDANDIY +/- nd nd Bitmansour etal.，CD4+clone
20和33 508 LKYQEFFWDANDIYR +/- nd nd Bitmansour，Khattab，CD4+/DR3
20和35 510 YQEFFWDANDIYRIF - nd nd Khattab et al.，CD4+/DR3
20和37 512 EFFWDANDIYRIFAE - nd nd
#“-”未结合；“+/-”弱结合；“+”中度结合；“++”强结合；“nd”未测定。肽不溶于水。
实施例IV：通过测定对排列为矩阵的15-mer肽集合的细胞因子应答对T细胞表位的鉴定，以及各种肽的证实
设计547种肽，每种肽由15个氨基酸组成，15个氨基酸中的14个与其前体重叠，覆盖CMV pp65抗原的完整序列。所有肽的序列都在表2中显示。
因为可以获得的用于筛选T细胞应答的PBMC的数量通常有限，肽不单个使用，而是与以矩阵形式排列的列集合或行集合组合(图6)。首先，各种肽以5mg/ml的浓度溶解于100％DMSO中。然后制备21种肽的混合物，使得每种肽恰好包含于2个集合中。为了再刺激人PBMC，肽混合物用测定培养基稀释，使得每种肽的终浓度为5μg/ml。该浓度高于Maecker等人(Maecker论文)发现对于CD4和CD8阳性T细胞应答而言饱和的1.75μg/ml的浓度。每个样品中DMSO的终浓度为2.1％。
总之，来自10名CMV血清阳性、HLA-A2阳性的健康供体的PBMC用于筛查图6所示的42个肽集合。为了证实通常短于15个氨基酸的I类表位是否在15mer肽内被适当识别，以及高DMSO含量不损害T细胞的激活和功能，在每次筛选中包含一种良好表征的来自CMV pp65的免疫显性CD8限制的9-mer表位(NLVPMVATV，位点495-503)，其浓度为10μg/ml(DMSO终浓度为0.1％)。
当读取T细胞再激活时，使用人IFN-γElispot。图8a显示与极少肽集合反应的供体。阳性列与行集合的交叉点鉴定肽490-492。这3种肽含有良好表征的免疫显性CD8限制的9-mer最小表位NLVPMVATV，位点495-503。这些肽集合引发的应答大部分等于9-mer最小表位引发的应答(图8a)。这表明，较短的表位在15-mer肽内被适当识别，高DMSO含量不损害T细胞应答。
大多数其它供体显示针对几种表位的更复杂的应答。一个例子如图8b所示。用所有10名供体进行的第一次筛选的结果总结于表4中。
表4.第一次筛选的总结
  供体编号   HLA型   与水平混合物反应   与垂直反应混合物   确定下列肽重新检测
  9936   A2/24，B44/41   19   36，37，38，39   490，491，492，493
  10511   A2/28，B16/40   2，10，19，20，21   31，33，34，35，37，38，40，41，42   37，39-41，43，44，46-48；256，258-260，262，263，265-267；485，487-489，491，492，494-496；506，508-510，512，513，515-517；527，529-531，533，534；536-538
  10632   A2/28，B12/27   19   29-32；34-39   483-486；488-493
  10687   A2/11，B7/13   10，11，17，18，19   22，23；33-42   247，248，258-267；268，269，279-288；394，395，405-414；415，416，426，427，468-475；476，477，487-496
  10689   A2/25，B13/18   8，19   22，23；28，29，30，36-41   205，206；211-214，219-224；476，477；482-484；490-495
  10736   A2/3，B15/35   19   35-38   489-492
  10764   A2/24，B7/27   10，17，18，20   22；28-31；36-42   247，253-256，261-267；394，400-403，408-414；415，421-424；469-475；497，503-506；511-517
供体编号  HLA型 与水平混合物反应  与垂直混合物反应 确定下列肽重新检测
10788  A2/29，B44/60 2，3，4，14-16，17-19，21  22-42 28-32，36-48；49-53，57-105；331-335，339-351；352-356，360-372；373-377；381-393；394-398，402-414；415-419，423-427；468-475；47 6-480，484-496；518-522；526-538
10791  A2/3，B7/27 11，12，19  32-42 278-287；299-308；486-495
在第二次筛选中，重新检测对应于阳性行和列集合的交叉点的所有肽。在此情况下，相同供体的PBMC与终浓度为20μg/ml的各种肽温育20小时。再次用人IFN-γElispot测定读取T细胞再激活。
图9显示供体10736的结果，他在第一次筛选中鉴定为一名具有高度集中的T细胞应答的个体(图8a)。用肽489-495重新检测证实了肽490-492的反应性，另外也鉴定了肽493是IFN-γ分泌的诱导剂。对15mer肽的反应程度与9-mer最小表位相当。在第一次筛选中包括随机选择的对应于阴性行和列混合物的交叉点的肽作为阴性对照；不诱导任何IFN-γ分泌(图9)。
这第二次筛选的全部结果和由它确定的所有表位都总结于表5(表位已经在文献中描述)和表6(新型表位通过根据本发明的方法鉴定)中。
在已知的表位中，引人注目的是，良好表征的CD8限制的9-mer最小表位(NLVPMVATV，位点495-503)在10名供体中的9名中被识别，证明它是CMV pp65抗原中最常被识别的HLA-A*0201限制的表位之一。在10名HLA A2供体中，有2名也表达HLA-B7。根据文献已知两种HLA-B7限制的表位：pp65 265-274和pp65 417-426。这两种都在HLA B7阳性供体中发现，特别是pp65 417-426表位似乎比HLA-A*0201限制的pp65 495-503表位诱导更多的IFN-γ分泌。该数据与下列发现相一致：对CMV pp65抗原的T细胞应答与HLA-A2和/或HLA-B7表位的表达强烈相关(Eur.J.Immunol.，2000，30，2531-2539)。除了这些所谓的“免疫显性”表位之外，再次发现了pp65内描述的大多数其它表位(表5)。这证明该方法既是非常灵敏的又是广泛适用的，因此适于检测免疫显性和亚显性的表位。
表5a.发现的表位与文献中所知的I类表位的比较
在我们的筛选中有反应性的肽   如文献所述的肽   描述为   描述的HLA限制     文献  筛选频率1)
0   14-22  T细胞表位   A0201 Solache等人，1999     0/9
#10788：117，118，119，120   120-128  T细胞表位   A0201 Solache等人，1999     1/9
除了10764：489-493之外的全部   495-503  T细胞表位   A0201 Wills等人，1996和Weekes等，1999a     8/9
#10764：522   522-530517-531  预测的T细胞表位   A0201 Solache等人，1999Kern等人，1999     1/9
#10788：108   110-118109-123  结合的T细胞表位   A0201 Solache等人，1999Kern等人，1999     1/9
#10687：282，284#10791：282，283，284？，285，287   286-295289-303  结合的T细胞表位   A0201 Solache等人，1999Kern等人，1999     2/9
#10511：516？，517#10764：513-517   519-527517-531  结合的T细胞表位   A0201 Solache et ai.，1999Kern等人，1999     2/9
0   316-338  T细胞表位   A0201 Bitmansour等人，2001     0/9
发现：9名HLAA2阳性供体中8种文献已知表位中的6种
0   353-375  T细胞表位   A1 Retiere等人，2000     0/0
发现：0名HLAA1阳性供体中1种文献已知表位中的0种
0   113-121  T细胞表位   A24 Retiere等人，2001     0/2
0   328-337  T细胞表位   A24 Kuzushima等人，2001     0/2
发现：2名HLAA24阳性供体中2种文献已知表位中的0种
在#10632中可能识别   512-520  T细胞表位   B12 Wills等人，1996和Weekes等，1999a     1/1
发现：1名HLAB12阳性供体中1种文献已知表位中的1种
0   123-131  T细胞表位   B35 Gavin等人，1993和Wills等人，1996     0/1
0   187-195  T细胞表位   B35 McLaughlin-Tsylor等人，1994     0/1
#10687(B7而不是B35)：394，395   397-411  T细胞表位   B35 Wills等人，1996和Weekes等人，1999a     1/7
发现：1名B35阳性供体中3种文献已知表位中的0种；HLAB35阴性供体中发现1种
#10687：260-265#10764：261-264   265-274  T细胞表位   B7 Weekes等人，1999b     2/2
#10687：414，415，416#10764：413，414，415   417-426  T细胞表位   B7 Weekes等人，1999a     2/2
发现：2名HLAB7阳性供体中2种文献已知表位中的2种
1)重新发现的数量/表达各自HLA类型的供体的数量
表5b.发现的表位与文献已知的II类表位的比较
在我们的筛选中有反应性的肽  如文献所述的肽   描述为  描述的HLA限制     文献 筛选频率1)
0   34-56  T细胞表位     DQ0602 Bitmansour等人，2001     0
0   364-386  T细胞表位     D1302 Bitmansour等人，2001     0
#10788：361   361-376  T细胞表位     DR11 Khattab等人，1997     1
#10511：309，510   509-523  T细胞表位     DR3 Khattab等人，1997和Bitmansour等人，2001     1
0   144-166  T细胞表位     DR1401 Bitmansour等人，2001     0
0   177-191  T细胞表位     II类 Bitmansour等人，2001     0
可能性：#10687：284#10791：285   285-299  T细胞表位     II类 Bitmansour等人，2001     2
0   417-431  T细胞表位     II类 Bitmansour等人，2001     0
可能性：10511：487，48910687：487，488，489   489-503  T细胞表位     II类 Bitmansour等人，2001     2
0   205-219  T细胞表位     ？ Kem等人，1999     0
可能性#10687：287，288   293-307  T细胞表位     ？ Kem等人，1999     1
1)没有关于供体的MHC II类表型的信息可以获得。
表6列出了如实施例I和II所述通过根据本发明的方法鉴定的所有新型T细胞表位。
第一组表位(肽262、394、395、411、415、416、417)含有已经在文献中描述为T细胞表位的序列，虽然它们具有与此处发现的不同的HLA限制。这些结果表明，这些表位在与以前所知不同的HLA内容中也能够被T细胞识别。该发现是新的发现，扩展了这些肽的有效性，例如作为适用于表达这些具体HLA的个体的疫苗的一部分。
第二组表位(肽213、214和216)已经在文献中描述为与HLA-A*0201分子结合，然而在我们的工作之前，没有数据证明这些肽能够激活T细胞。一种肽的结合是被T细胞激活/识别的前提条件，但是不能确保这种激活/识别。首先，一种抗原内不是所有可能的肽序列都同样较好地产生，或者在体内抗原加工和呈递过程中根本不产生。因此，与HLA结合的合成肽不一定是一种天然存在的表位。即使通过主动接种能够引发针对这些肽的T细胞，它们也不能用于对抗病原体，因为感染的细胞不在其表面展示这些肽。其次，即使结合的肽对应于一种天然存在的表位，这也不能确保它能够诱导功能性T细胞。相反，某些肽能够作为拮抗剂，使T细胞无反应性。这些数据第一次显示，由于病毒感染，这些肽能够在人体中诱导分泌IFN-γ的功能性T细胞。这一发现是新的发现，为针对CMV的疫苗中包含这些肽提供了理论基础。
第三组表位(肽211、476、477、479、421、422、423、424、469、470、503、506)迄今为止根本没有描述。由于这些数据显示，由于病毒感染，这些肽能够诱导的分泌IFN-γ的功能性T细胞，它们本身就是或者在其序列内含有新的T细胞表位。它们尤其可用于包含于针对CMV的疫苗中。
由于该实施例描述的筛选使用全部PBMC，因此分析对所有15mers的全部T细胞应答。该应答可能限于各自供体表达的任何一种HLA-等位基因。在每种情况下包括HLA-A、-B、-C(I类)和HLA-DR、-DP、-DQ(II类)中的至少两种可能的等位基因。为了进一步表征此处提供的新型表位，人们可以定义这些表位的准确HLA限制，和T细胞识别的序列内的最小表位。它们都能用本领域技术人员公知的多种已经建立的方法完成(《现代免疫学方法》(Current Protocols inImmunology)，John Wiley & Sons，Inc.)。
首先，能够利用可以公开获得的程序根据结合基序预测T细胞表位。例如包括：http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/(Parker等人1994)，http://134.2.96.221/scripts/MHCServer.dll/home.htm(Rammensee等人1999)，http://mypage.ihost.com/usinet.hamme76/(Sturniolo等人1999)。后一种预测算法使得可能鉴定混杂的T辅助表位，即可与几种HLA II类分子结合的肽。用最高概率预测的各自的HLA分子在表4中列出。通过检测肽与各自HLA的结合能够证实这些预测。对于预测可能是II类表位的序列，检测它们与DRB1*0101、*0401和*0404分子的结合(见实施例III)。发现肽421、469、470(覆盖氨基酸421-438、469-484和470-485)与DRB1*0404结合(见表5)。
快速辨别对一种肽的应答是I类还是II类限制的一种方法是用纯CD4+或CD8+T效应细胞群体重复ELIspot测定。其实现方法例如是利用磁性细胞分选分离各自的亚组。纯CD8+T细胞也能够与只表达一种目的HLA分子的人工抗原呈递细胞一起在ELIspot测定中检测。一个例子是HLA-A*0201阳性T2细胞(174CEM.T2，Nijman等人，1993)。此外，也能够在特异阻断CD4+或CD8+T细胞亚群的单克隆抗体存在下，用全PBMC进行ELIspot测定。准确的HLA限制能够用类似的方法测定，使用对某种等位基因特异的阻断单克隆抗体。例如，加入HLA-A24特异的单克隆抗体能够特异地阻断对HLA-A24限制的表位的应答。
为了确定T细胞识别的肽序列内的最小表位，例如能够合成一系列重叠的和截短的肽(例如8-、9-、10-mers)并分别重新检测。实施例V：通过T2-ELIspot对新型HLA-A*0201表位的证实
为了证实预测的阳性15mer内的HLA-A2表位，合成9-或10-mer肽，并分别检测。用T2细胞作为抗原呈递细胞以及从几名供体中分离的CD8+T细胞进行ELIspot测定。在该设置中，只有从外部与HLA-A*0201结合的最佳长度的表位能够触发IFN-γ分泌。有5种新HLA-A*0201表位能够用这种方法证实(表6)。该测定如前所述进行(Herr 1997)。简言之，T2细胞(Nijman 1993)在ELIspot培养基中生长(参见M&M部分)，在使用前3天调节为4×105/ml。在洗涤2次后(PBS；1％人白蛋白，来自SIGMA)，细胞以2.5×106/ml的浓度接种到ELIspot培养基中，加入10μg/ml肽培养过夜。次日，T2细胞用ELIspot培养基洗涤一次，100μl(1×106 T2细胞/ml)接种包被并封闭的ELIspot板(见上)，其中补充了20μg/ml肽。为了分离CD8+淋巴细胞，1×107PBMNC与20μl抗人CD8+微珠(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)混合，终体积为100μl，在冰上温育15分钟。之后，细胞用过量的MACS缓冲液洗涤10次，CD8+细胞在磁性微型柱(Miltenyi)上分离。每孔加入调节为1×106c/ml的100μl CD8+淋巴细胞。在培养20小时后，用PBS，0.05％Tween 20洗涤4次分离细胞，如M&M部分所述进行测定。
表6：针对HLA-A*0201限制的CMV pp65表位的CD8+T细胞应答，通过对IFN-γ的T2 ELIspot测定评价。
供体1)表位2) 10511 10632 10687 10689 10788
ILKEPVHGV(HIV，阴性对照) 17(±4)3) 16(±3) 25(±7) 77(±2) 34(±2)
NLVPMVATV495-503x(CMV，阳性对照) ＜ 165(±10) 193(±1) 189(±10) 172(±2)
RLLQTGIHV40-48 ＜ ＜ ＜ ＜ 67(±9)
VIGDQYVKV218-226 ＜ 31(±1) 112(±5) ＜ 100(±8)
YLESFCEDV227-235 ＜ ＜ ＜ ＜ ＜
AMAGASTSA425-433 ＜ ＜ 96(±5) ＜ 104(±8)
FTWPPWQAGI482-491 ＜ ＜ ＜ ＜ 70(±
KYQEFFWDA509-517 ＜ 32(±1) ＜ ＜ 72(±22)
RIFAELEGV522-530 ＜ ＜ 92(±8) ＜ 71(±18)
1)除第一次矩阵筛选外新血液抽取3-6个月
2)新表位以黑体字显示
3)每100,000个CD8+T细胞的斑点数量；＜：低于背景(含HIV阴性对照肽的斑点)加两个标准差。
实施例VI：使用人PBMC通过表位捕获方法鉴定的新型II类(HLA-DR4)表位的证实
其中，15mer 55-61通过表位捕获法确定为可溶性HLA-DRB1*0401的强结合剂(图7a，7b)。各种重叠15mer 55-61的结合确定氨基酸序列YTPDSTPCH为LILVSQYTPDSTPCHRGDNQL的核心结合区，它可含有几种形式的II类表位。众所周知，II类表位含有可变长度的末端，伸出于MHC结合沟槽。有趣的是，供体10788显示对15mer 57和59的强T细胞应答(图10)，通过如实施例IV所述的IFN-γELIspot测定。这证实LILVSQYTPDSTPCHRGDNQL是或者含有至少一种HTL表位，该表位至少可与最初通过本发明的表位捕获法发现的HLA-DRB1*0401结合。
图10：使用CMV pp65 15mers 57、59和对照(med：不含肽，HIV：无关HIV衍生肽，ConA：多克隆刺激)的IFN-γELIspot使用来自受试者10788的PBMC。
作为另一个实施例，对于通过本发明的表位捕获法确定为与DRB1*0404弱结合的15mer 469和470(表3)，检测它与人PBMC的反应性。为了辨别CD8阳性CTL介导的或CD4-阳性HTL介导的反应性，进行细胞内细胞因子染色联合表面标志物染色：融解后，PBMNC在含有10％人AB型血清(BioWhittaker)的RPMI1640中保存过夜(37℃，5％CO2)。次日，2百万个PBMNC的等份与肽(80μg/ml)或伴刀豆球蛋白A(SIGMA)一起温育。1小时后，加入10μg/ml布雷菲德菌素A(SIGMA)，继续温育5小时。对CD4(藻红蛋白)、CD8(细胞色素)、CD69(别藻蓝蛋白)的表面染色用如述标记的抗体(Pharmingen，San Diego，CA，USA)进行。在用1％低聚甲醛PBS溶液固定后，通过在0.5％BSA/0.1％叠氮钠/0.1％皂苷PBS溶液中温育15分钟使细胞透化。细胞内细胞因子用抗-IFN-γ(FITC)抗体4S.B3(Pharmingen)染色。样品(淋巴细胞门中的100,000个事件)用FACScalibur(Becton Dickinson)读数。
覆盖DEDSDNEIHNPAVFTW469-484的15mer 469和470含有A*0201和II类结合基序，并可与可溶性DRB1*0404结合(表3)。细胞内细胞因子染色证实，对于供体10788，在CD8和CD4阳性T细胞区室中有显著的IFN-γ分泌(图11，下面两张图)。相反，供体10687只显示针对15mer 489 AGILARNLVPMVATV489-503的CD8介导的IFN-γ分泌，表明在这种情况下只有HLA-A2表位NLVPMVATV495-503被靶向。这些结果证实，肽DEDSDNEIHNPAVFTW469-484含有I类和II类限制的表位。
图11：通过细胞内IFN-γ染色证实针对CMV pp65 15mer 469、470的同时的CD4+和CD8+T细胞应答。来自两名供体(10687、10788)的PBMC用ConA作为阳性对照(第一列)、含有推断的I类和II类表位的15mer(第2列和第3列)或培养基作为阴性对照(右列)刺激。对胞内IFN-γ(x轴)或表面T细胞分化标记CD4或CD8(y轴)染色细胞。标出了右上四分之一的百分数，显著高于背景的数字用黑体显示。
实施例VII：利用HLA-DR4转基因小鼠，通过表位捕获法鉴定的新型II类(HLA-DRB1*0401)表位的证实
为此，在表达DRB1*0401分子的HLA-DR4转基因小鼠中进行DRB1*0401结合实验，其中检测CMV血清阳性个体不能证明T细胞的反应性。合成覆盖可与DRB1*0401分子结合的所有候选表位的较长肽(1500-1505)(见表7)，并注射到小鼠中。最后一次注射一周后，总鼠脾细胞用下列成分来自体内地再刺激：用于接种的相同肽，以及代表相应较长肽的重叠15-mer，和一种无关的流感血凝素衍生肽(1171)作为阴性对照。T细胞反应性通过INF-γELISpot试验检测(图12)，结果6种较长肽中有5种显示免疫原性。而且，代表较长的肽并显示与DRB1*0401分子的亲和力的大多数15-mer也已经证实再激活DRBI*0401转基因小鼠的来自体内的T细胞。有一种肽(1503)至少在这些研究使用的免疫条件下不诱导免疫应答。
为了免疫原性肽的精确表位作图和CD4+特异性的体内检测，小鼠接种较长的肽，如上所述将脾细胞分成CD4+和CD8+T细胞群体(CD4+级分的纯度为92-94％)，待测IFN-γ的产生。图12显示该ELISpot测定的结果。在所有情况下，用脾细胞测定的T细胞应答能够用CD4+细胞证实。CD8+应答通常可以忽略。肽1502同时所见的CD4+和CD8+应答可能是由于肽序列内所含的另一种I类小鼠表位。
表7a总结了用可溶性DR分子进行的肽结合研究和小鼠实验的所有数据。观察到肽对DRB1*0401分子的亲和力与HLA-DR4转基因小鼠中CD4+细胞的特异性刺激之间的良好相关性。例如，肽1500-1502和1504在两种方法中显示相似的结果。肽1505在结合测定中不是很好，在肽注射后引起小鼠产生最高频率的T细胞。在体外与DRB1*0401分子有弱亲和力的肽1503在注射CpG1668或CFA/IFA的小鼠中没有免疫原性。在此也应当提到，根据用于注射的佐剂不同，有些肽显示可变的免疫原性和特定的CD4+频率。根据使用CD4+细胞富集级分的小鼠ELISpot测定和使用可溶性DRB1*0401分子的肽结合测定的结果，能够确定可被携带DRB1*0401的T细胞识别的表位核心序列(参见表7和表7a)。其中4种与通过TEPITOPE算法序列预测的恰好一致，除了没有预测到肽1501可与DRB1*0401分子结合之外。
表7.DRB1*0401配体在转基因小鼠中作为候选表位的证实突出了提出的DRB1*0401核心结合基序。
 序号   肽序列   AA                与DRB1*的结合      DRB1*0401小鼠     注释，参考文献
  0401   0404   0101  0701   1101     totalSC   CD4+
  1500   PSLILVSQYTPDSTPCHR-GDNQLQVQHTR   53-81 ++ ++ + - - + +     新表位，在此研究中为人PBMC
  1501   QWKEPDVYYTSAFVFPTK-DVALR   174-196 + - ++ - +/- + +     Bitmansour，etal.，CD4+克隆
1502 LLQRGPQYSEHPT-FTSQYRIQG   356-377 + - - - ++ + ++     Khattab etal.，CD4+克隆/DR11
  1503   YRHTWDRHDEGAAQG-DDDVW   381-400 +/- - - - - - - 非免疫原性
  1504   TSGVMTRGRLKAES-TVAPEEDTDE   447-470 + +++ + - + + ++ 新表位
  1505   QGQN-LKYQEFFWDANDIYRIF   504-524 +/- - - - - ++ ++     Khattab etal.，，CD4+克隆/DR3
“-”不结合/T细胞应答；“+/-弱结合/T细胞应答；“+”中度结合/T细胞应答；“++”强结合/T细胞应答。
总之，对于用“反向免疫学”方法发现是可溶性DRB1*0401分子的配体的大多数肽，证实它在DRB1*0401转基因小鼠中引发特异的CD4+应答。因此，6个候选表位中有5个是真正的DRB1*0401表位。另外，它们是混杂的(见表7和表7a)。其中3个(1501、1502、1503)已经在以前的文献中描述，但不是作为DRB1*0401特异的表位。也发现2种DRB1*0401结合剂(57和59)和与DRB1*0404结合的3种肽(421、469、470)在来自CMV血清阳性供体的PBMC中可诱导INF-γ的产生(见实施例IV和VI)。总之，表明该表位捕获方法能够鉴定真正的T细胞表位。
表7a.使用可溶性DRB1*0401分子和HLA DR4转基因小鼠鉴定人II类表位的总结
肽序号   肽序列                      与DRB1的结合        DRB1*0401小鼠 注释，
   *0401    *0404    *0101   *0701   *1101     totalSC CD4+
1500 PSLILVSQ YTPDSTPCHRG-DNQLQVQHTR ++ ++ + - - + + AA 53-81，新鉴定的
  54   SLILVSQYTPDSTPC     - - +/-
  55   LILVSQ YTPDSTPCH + ++ +
  56   ILVSQ YTPDSTPCHR ++ ++ +
  57   LVSQ YTPDSTPCHRG     ++     -     -     ++     +
  58   VSQ YTPDSTPCHRGD ++ - + - - ++ +
  59   SQ YTPDSTPCHRGDN ++ ++ +/-
  60   Q YTPDSTPCHRGDNQ ++ ++ +/-
  61   YTPDSTPCHRGDNQL     - + +/-
  62   TPDSTPCHRGDNQLQ     - - -
  63   PDSTPCHRGDNQLQV     -     -     -
  64   DSTPCHRGDNQLQVQ + - -
  65   STPCHRGDNQLQVQH     -     -     -
  1501   QWKEPDVYYTSAFVVFPTK-DVALR + - ++ - + + + AA 174-196，已知II类
  174   QWKEPDVYYTSAFVF     - +/- +/-
  175   WKEPDVYYTSAFVFP     - + +
  176   KEPDVYYTSAFVFPT +/- + +
177   EPDVYYTSAFVFPTK + - ++ - + + +
  178   PDVYYTSAFVFPTKD ++ + +
  179   DVYYTSAFVFPTKDV + + +
  180   VYYTSAFVFPTKDVA +/- + +/-
  181   YYTSAFVFPTKDVAL     -     +     +/-
  182   YTSAFVFPTKDVALR     +/-     +/-
  1502   LLQRGPQYSEHPT-FTSQYRIQG     +   -     - -     ++     ++     ++ AA 356-377，已知DR11
  356   LLQRGPQYSEHPTFT     +/-     +/-
357   LQRGPQYSEHPTFTS     - + +/-
358   QRGPQYSEHPTFTSQ + ++ +/-
359   RGPQYSEHPTFTSQY +/- - - - +/- ++ ++
360   GPQYSEHPTFTSQYR +/- ++ ++
361   PQYSEHPTFTSQYRI +/- + ++
362   QYSEHPTFTSQYRIQ     - + ++
  363   YSEHPTFTSQYRIQG     +     ++
  1503 YRHTWDRHDEGAAQGDDDVW +/- - - - - - - AA 381-400，非免疫原性
  380   EYRHTWDRHDEGAAQ     -     -     -
  381   YRHTWDRHDEGAAQG     -     -     -
  382   RHTWDRHDEGAAQGD     -     -     -
  383   HTWDRHDEGAAQGDD +/- - -
  384   TWDRHDEGAAQGDDD +/- - - - - - -
  385   WDRHDEGAAQGDDDV     -     -     -
  1504   TSGVMTRGRLKAES-TVAPEEDTDE + ++ + - + + ++ AA 447-470，新鉴定的
  448   RGVMTRGRLKAESTV     -     +/-     -
  449   GVMTRGRLKAESTVA +/- + ++
  450   VMTRGRLKAESTVAP + + ++
  451   MTRGRLKAESTVAPE + + ++
  452   TRGRLKAESTVAPEE + ++ ++ - - + ++
  453   RGRLKAESTVAPEED + +/- +/-
  454   GRLKAESTVAPEEDT + +/- +/-
  455   RLKAESTVAPEEDTD     -     -     -
  456   LKAESTVAPEEDTDE     -     -
 1505 QGQNLKYQEFFWDANDIYRIF + - - - - ++ ++ AA 504-524，已知DR3
 504   QGQNLKYQEFFWDAN     -     -     -
 505   GQNLKYQEFFWDAND     - + -
 506   QNLKYQEFFWDANDI     - ++ +/-
 507   NLKYQEFFWDANDIY     +/- - - - - ++ +
 508   LKYQEFFWDANDIYR +/- ++ ++
 509   KYQEFFWDANDIYRI     - ++ ++
510   YQEFFWDANDIYRIF     - ++ ++
“-”不结合/T细胞应答；“+/-”弱结合/T细胞应答；“+”中度结合/T细胞应答；“++”强结合/T细胞应答
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Claims (30)

1.分离具有结合MHC/HLA分子的能力的配体或含有该配体和该MHC/HLA分子的复合物的方法，其特征在于下列步骤：
—提供配体集合，该集合含有可与该MHC/HLA分子结合的配体和不与该MHC/HLA分子结合的配体，
—使该MHC/HLA分子接触该配体集合，从而使具有结合该MHC/HLA分子的能力的配体与该MHC/HLA分子结合，形成含有该配体和该MHC/HLA分子的复合物，
—检测该复合物，任选地使该复合物与不与该MHC/HLA分子结合的配体分离，和
—任选地从该复合物中分离并表征配体。
2.分离具有结合MHC/HLA分子的能力的T细胞表位或含有该表位和该MHC/HLA分子的复合物的方法，其特征在于下列步骤：
—提供配体集合，该集合含有可与一种MHC/HLA分子结合的配体和不与该MHC/HLA分子结合的配体，
—使该MHC/HLA分子接触该配体集合，从而使具有结合该MHC/HLA分子的能力的配体与该MHC/HLA分子结合，形成含有该配体和该MHC/HLA分子的复合物，
—检测该复合物，任选地使该复合物与不与该MHC/HLA分子结合的配体分离，
—任选地从该复合物中分离并表征配体，
—用T细胞测定法测定任选地分离的该配体或该复合物之T细胞激活能力，和
—提供具有T细胞激活能力的任选地分离的配体作为T细胞表位或复合物。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于该配体集合选自：肽集合，特别是重叠肽的集合，蛋白质片段集合，糖脂的集合，鞘糖脂的集合，脂肽的集合，脂类的集合，聚糖的集合，修饰肽的集合，由抗原呈递细胞获得的集合，优选地是其总裂解物或级分的形式，特别是从这些细胞的表面或MHC/HLA分子上洗脱的级分，包含细胞特别是病原体细胞、肿瘤细胞或组织之片段的集合，包含肽库的集合，由重组DNA文库产生的，特别是来源于病原体或肿瘤细胞的(多)肽的集合，来自具体病原体的蛋白质和/或蛋白质片段的集合，或其混合物。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于该MHC/HLA分子选自：HLA I类分子、HLA II类分子、非传统MHC/HLA和MHC/HLA-样分子或其混合物，或它们的混合物。
5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于利用一种方法表征该复合物的配体，该方法选自：质谱法，多肽测序，结合测定，特别是SDS-稳定性测定，通过用层析，特别是HPLC测定其保留因子鉴定配体，或其它光谱技术，特别是紫外线(UV)、红外线(IR)、核磁共振(NMR)、圆二色性(CD)或电子自旋共振(ESR)，或其组合。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于它与细胞因子分泌测定组合，优选地与Elispot测定、细胞内细胞因子染色、FACS或ELISA组合。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于该T细胞测定包括该复合物与分离的T细胞混合并温育，随后测定分离的T细胞的细胞因子分泌或增殖。
8.根据权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于该T细胞测定包括测定激活标记特别是CD69、CD38的上调，或表面标记特别是CD3、CD8或TCR的下调。
9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其特征在于该T细胞测定包括特别是通过实时RT-PCR测定与T细胞激活有关的mRNAs的上调/下调。
10.根据权利要求1-8中任一项的方法，其特征在于该T细胞测定选自：测定T细胞受体下游成分，特别是p56 lck、TCR的ITAMS和zeta链、ZAP70、LAT、SLP-76、fyn和lyn的磷酸化/去磷酸化的T细胞测定，测定细胞内Ca++浓度或Ca++-依赖蛋白质激活的T细胞测定，测定免疫突触形成的T细胞测定，测定效应分子特别是穿孔素、粒酶或granulolysin释放的T细胞测定，或这些T细胞测定的组合。
11.可通过根据权利要求2-10中任一项的方法鉴定的T细胞表位，该T细胞表位选自含有序列KMQVIGDQYV、FTWPPWQAGI、AMAGASTSA、SDNEIHNPAV、KYQEFFWDA或其组合的多肽。
12.具有T细胞激活能力的HLA A0201结合表位，其可以利用HLA A0201分子作为MHC/HLA分子，通过根据权利要求2-10中任一项的方法鉴定，该HLA A0201结合表位选自含有序列RLLQTGIHV、VIGDQYVKV、YLES FCEDV或其组合的多肽。
13.含有序列RPHERNGFTV的肽在制备用于在B7阴性个体中激活T细胞的组合物中的用途。
14.含有序列DDVWTSGSDSDE的肽在制备用于在B35阴性个体中激活T细胞的组合物中的用途。
15.含有序列TPRVTGGGAM的肽在制备用于在B7阴性个体中激活T细胞的组合物中的用途。
16.可与II类HLA分子结合的肽，其选自根据表3的肽55-64、109、383、384、421、449-454、469和470。
17.根据权利要求11-16中任一项的表位或肽，其特征在于它进一步含有1-30个、优选地2-10个、特别是2-6个天然存在的氨基酸残基，特别是在N端、C端或在N端和C端。
18.根据权利要求11-17中任一项的表位或肽，其特征在于它进一步在N端、C端或在N端和C端含有非天然存在的氨基酸，优选地1-1000个，更优选地2-100个，特别是2-20个非天然存在的氨基酸残基。
19.根据权利要求11-18中任一项的表位或肽在制备用于治疗或预防巨细胞病毒(CMV)感染的HLA限制疫苗中的用途。
20.根据权利要求11、17或18中任一项的表位在制备用于治疗或预防巨细胞病毒(CMV)感染的疫苗中的用途。
21，用于治疗或预防巨细胞病毒(CMV)感染的疫苗，其含有根据权利要求11、17或18中任一项的表位。
22.用于治疗或预防巨细胞病毒(CMV)感染的HLA特异的疫苗，其含有根据权利要求11-18中任一项的表位或肽。
23.如权利要求19-22中任一项所述的疫苗，其特征在于它进一步含有免疫调节物，优选地选自：聚阳离子物质，特别是聚阳离子多肽，免疫调节核酸，特别是含有寡脱氧核苷酸的脱氧尿苷和/或脱氧肌苷，或其混合物。
24.如权利要求19-23中任一项所述的疫苗，其特征在于它进一步含有一种药学可接受的载体。
25.如权利要求19-24中任一项所述的疫苗，其特征在于该表位以一种选自下列的形式提供：肽、肽类似物、蛋白质、裸DNA、RNA、病毒载体、病毒样颗粒、重组/嵌合病毒、重组细菌或用蛋白质/肽/RNA脉冲或用含有该表位的DNA转染的树突细胞。
26.T细胞、T细胞克隆或T细胞群体或制品，其特异识别根据权利要求11-18中任一项的表位或肽。
27.根据权利要求26的T细胞、T细胞克隆或T细胞群体或制品在鉴定不规则表位中的用途。
28.根据权利要求26的T细胞、T细胞克隆或T细胞群体或制品在制备用于治疗CMV患者的组合物中的用途。
29.根据权利要求1-10中任一项的方法，其特征在于抗原的配体或片段，特别是来自下列生物的抗原：人类免疫缺陷病毒(HIV)，甲型肝炎和乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒(HCV)，劳斯肉瘤病毒(RSV)，EB病毒(EBV)，流感病毒，轮状病毒，金黄色葡萄球菌，肺炎衣原体，沙眼衣原体，结核分枝杆菌，肺炎链球菌，炭疽芽孢杆菌，霍乱弧菌，疟原虫属的种(恶性疟原虫、间日疟原虫等)，曲霉属的种或白色念珠菌，肿瘤抗原或自身免疫抗原。
30.根据权利要求1-10和29中任一项的方法，其特征在于该配体是具有结合MHC/HLA分子的能力的HCV-肽、HIV-肽、HAV-肽、HBV-肽、RSV-肽、EBV-肽、流感病毒肽或轮状病毒肽。
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