ES2872013T3 - Una cepa para la producción de tirosol natural y un método de preparación de tirosol natural - Google Patents

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Wei Liu
Liuyun Huang
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Abstract

Una levadura Saccharomyces sp. OMK-58, en donde la cepa se almacena en el China Center for Type Collection con N.º CCTCC: M 2018479.

Description

DESCRIPCIÓN
Una cepa para la producción de tirosol natural y un método de preparación de tirosol natural
Campo de la técnica
La invención se refiere a una cepa para la producción de tirosol natural y a un método de preparación de tirosol natural.
Antecedentes de la invención
El tirosol se encuentra ampliamente en el aceite de oliva, la salsa de soja, la frambuesa y en productos de fermentación, tales como la cerveza, el vino de frutas y el vino de arroz japonés. Es un importante intermedio farmacéutico y de fragancias. También se usa ampliamente en la síntesis de modificadores de superficie, materiales de almacenamiento de información y aditivos alimentarios.
En la actualidad, los principales métodos de producción de tirosol son la síntesis química y la extracción de plantas. El método de síntesis química tiene las desventajas de una alta contaminación ambiental, duras condiciones de proceso, altos requisitos en el equipo y bajo rendimiento. El bajo contenido de tirosol en las plantas y la extracción compleja limitan el suministro de tirosol. La capacidad de producción está lejos de satisfacer la demanda del mercado. Ehrlich F. propuso la biosíntesis de tirosol en 1911. Elsden S. R. et al. sugirió en 1958 que la síntesis de tirosol se producía mediante fermentación de levaduras, bacterias y algunos hongos con un rendimiento de aproximadamente 200 mg/l. Guerrini S. et al. (Fermentation 2018, 4 (2), 26), Soejima H. et al. (Journal of the Institute of Brewing, vol.
118, número 3, 1 de Noviembre de 2012, páginas 264-268) y el Documento de Patente Japonesa de Número JP 2004 215644 describen cepas de Saccharomyces cerevisiae que producen tirosol a partir de tirosina en fermentación alcohólica. Mohammed A. S. y otros usaron Candida para fermentación. El rendimiento relativo a tirosina fue de aproximadamente el 50%. No alcanzó el nivel de producción de g/l pero se mantuvo en el nivel de mg/l, que no se puede industrializar.
Cada vez más personas abogan por productos naturales, rechazando el uso de productos químicos sintetizados químicamente, por lo que es imperativo estudiar un método biológico para la síntesis de tirosol.
Compendio de la invención
Uno de los propósitos de la invención es proporcionar una levadura Saccharomyces sp. OMK-58, que tiene la capacidad de sintetizar tirosol natural. La cepa se ha conservado en el China Center for Type Collection (CCTCC, por sus siglas en inglés) el 13 de julio de 2018. El lugar de conservación es la Universidad de Wuhan, Ciudad de Wuhan, Provincia de Hubei, China. El número de conservación es CCTCC M 2018479.
Otro propósito de la invención es proporcionar la aplicación de la levadura Saccharomyces sp. OMK-58 para la producción de tirosol natural.
Un propósito más de la invención es proporcionar un método para la producción de tirosol natural usando la levadura Saccharomyces sp. OMK-58 para la producción.
En donde, el método de producción es un método de fermentación microbiana.
Preferiblemente, el sustrato de fermentación del método de fermentación microbiana es tirosina.
Preferiblemente, el proceso de producción de tirosol natural incluye las siguientes etapas:
1) la activación de la cepa de la levadura Saccharomyces sp. OMK-58;
2) el cultivo de la siembra;
3) la fermentación: el líquido de siembra cultivado hasta la fase de crecimiento logarítmico se inocula en un medio de cultivo de fermentación a una proporción de volumen del 5 al 20% en condiciones estériles; el medio de cultivo de fermentación consiste en masa del 2,0 al 5,0% de materia prima de azúcares, del 0,2 al 0,5% de sulfato de amonio, del 0,05 al 0,1% de sulfato de magnesio, del 0,2 al 0,5% de dihidrogenofosfato de potasio, del 0,1 al 1,5% de extracto de levadura en polvo y del 0,5 al 2,0% de tirosina; se fermenta el medio de cultivo de fermentación que contiene el líquido de siembra y se obtiene el líquido de fermentación que contiene tirosol.
Preferiblemente, el valor del pH inicial del medio de cultivo de fermentación es de 5,0 a 8,0, se fermenta el medio de cultivo de fermentación que contiene el líquido de siembra durante 48 a 72 horas en las condiciones de 30 a 37°C, una velocidad de rotación de 200 a 500 rpm y una ventilación de 1:0,05-0,15.
Preferiblemente, dicha materia prima de azúcares es al menos una de entre glucosa, sacarosa y almidón.
Preferiblemente, en la etapa 3) se añade tirosina al medio en una dosis o en lotes.
Preferiblemente, cuando la etapa 3) va seguida de la etapa 4), el tirosol se separa del líquido de fermentación. En comparación con la tecnología antes mencionada, la solución técnica tiene las siguientes ventajas:
La levadura proporcionada por la invención se puede usar para la producción de tirosol natural mediante un método de fermentación. La tirosina se usa como sustrato durante la fermentación y el producto objetivo se produce mediante metabolismo microbiano. Es un método de operación seguro y simple a baja temperatura y presión, y es un método de producción seguro y respetuoso con el medio ambiente.
Breve descripción de los dibujos
Esta invención se explica con más detalle junto con los dibujos y realizaciones adjuntos.
La Figura 1 es un cromatograma de un patrón de tirosol.
La Figura 2 es un cromatograma de un patrón de tirosina.
La Figura 3 es un cromatograma de un líquido de fermentación en la realización 2.
Descripción detallada
1. La cepa
El experimento usó levadura de panadería como cepa de partida para seleccionar una cepa mutante mediante mutagénesis química. La cepa mutante podría transformar la L-tirosina en tirosol. La cepa nombrada Saccharomyces sp. OMK-58 se conservó en el China Center for Type Collection el 13 de Julio de 2018, con el número de conservación N. 2 CCTCC: M 2018479.
2. El cultivo de la cepa
En condiciones estériles, se extendió uniformemente un asa bacteriológica llena del líquido de la cepa procedente de la reserva de glicerol sobre el medio inclinado sólido y luego se cultivó en una incubadora bioquímica de 25 a 30°C durante 24 a 48 horas. El medio inclinado sólido era un medio de mosto.
3. El cultivo de la siembra
En condiciones estériles, se tomó un asa bacteriológica llena de levaduras de buen aspecto a partir del medio inclinado sólido y se insertó en el medio de cultivo de siembra estéril. El valor del pH inicial del medio de cultivo de siembra fue de 5,0 a 8,0 y la cepa se cultivó hasta la fase de crecimiento logarítmico a la temperatura de cultivo de 28 a 35°C y a una velocidad de rotación de 150 a 500 rpm. La fórmula del medio de cultivo de siembra en proporción en masa (%) es la siguiente: del 1,0 al 3,5 de uno de los azúcares tales como glucosa, sacarosa o almidón, del 0,2 al 1,0 de dihidrogenofosfato de potasio, del 0,1 al 0,5 de hidrógenofosfato de dipotasio, del 0,2 al 0,8 de cloruro de sodio, del O, 1 al 1,0 de extracto de levadura en polvo y del 0,1 al 1,0 de peptona.
4. La fermentación
El líquido de siembra cultivado hasta la fase de crecimiento exponencial se usa para inocular un medio de cultivo de fermentación a una proporción en volumen del 10% en condiciones estériles. El valor del pH inicial del medio de cultivo de fermentación es de 5,0 a 8,0 y el valor del pH óptimo es de 5,0 a 6,0. El tiempo de fermentación es de 48 a 72 horas en las condiciones de 30 a 37°C, una velocidad de rotación de 200 a 500 rpm y una ventilación de 1:0,05-0,15. La fórmula de fermentación en proporción de masa (%) es la siguiente:
Del 2,0 al 5,0 de uno de los azúcares tales como glucosa, sacarosa y almidón, del 0,2 al 0,5 sulfato de amonio, del 0,05 al 0,1 de sulfato de magnesio, del 0,2 al 0,5 de dihidrogenofosfato de potasio, del 0,1 al 1,5 de extracto de levadura en polvo y del 0,5 al 2,0 tirosina.
La tirosina se puede añadir al medio en una dosis o en lotes.
5. Determinación
Método de determinación de tirosol mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés): columna cromatográfica: COSMOSIL 5C18-PAQ (DI 4,6 * 250 mm); fase móvil: líquido acuoso de acetonitrilo:ácido fosfórico al 0,15% = 70:30 (V/V); el caudal es 0,8 ml/min; la longitud de onda de detección fue 216 nm; la temperatura de la columna es 35°C. El volumen de inyección es 5 gl y en las Figuras 1 a 3 se muestra el cromatograma.
Realización 1: la producción de tirosol natural (fermentación oscilante en matraces triangulares)
El medio de cultivo de siembra se preparó como sigue (g/l): glucosa 10, dihidrogenofosfato de potasio 2,0, hidrogenofosfato de dipotasio 1,0, cloruro de sodio 2,5, extracto de levadura en polvo 10,0, peptona 5,0 y agua como disolvente; el pH inicial fue de 6,0. El medio de cultivo de siembra se esterilizó a 121°C durante 15 minutos.
El medio de cultivo de fermentación se preparó como sigue (g/l): glucosa 30, dihidrogenofosfato de potasio 4, sulfato de amonio 3,0, sulfato de magnesio 0,8, extracto de levadura en polvo 1,0, tirosina 10,0 y agua como disolvente; el pH inicial fue de 7,0. El medio de cultivo de fermentación se esterilizó a 121°C durante 15 minutos.
La preparación de la siembra: en condiciones estériles, se transfirió la cepa de Saccharomyces sp. OMK-58 en un tubo de glicerol a baja temperatura a una placa sólida estéril nueva para su cultivo a 30°C durante 24 horas. Se recogió una sola colonia de Saccharomyces sp. OMK-58 y se inoculó en un matraz de 500 ml para el cultivo de la siembra. El volumen del medio de cultivo de la siembra en la botella fue de 50 ml. El matraz se hizo girar a 180 rpm y se cultivó a 30°C durante 16 horas para obtener un líquido de siembra.
La fermentación del tirosol natural: el medio de cultivo de fermentación de 50 ml se vertió en un matraz triangular estéril de 500 ml, y luego se inoculó el líquido de siembra de 7,5 ml para la fermentación. La temperatura de fermentación fue de 30°C y la velocidad de rotación del agitador fue de 200 rpm. Después de la fermentación durante 100 horas, se determinó la concentración de tirosol natural en el líquido de fermentación mediante HPLC. La concentración fue de 2,0 g/l.
Realización 2: la producción de tirosol natural (fermentación del biorreactor de 20 l)
El medio de cultivo de siembra y el medio de cultivo de fermentación se prepararon de la misma manera que en la realización 1.
La preparación de la siembra: en condiciones estériles, se transfirió la cepa de Saccharomyces sp. OMK-58 en un tubo de glicerol a baja temperatura a una placa sólida estéril nueva para su cultivo a 30°C durante 24 horas. Se recogió una sola colonia y se inoculó en un tanque de siembra de 3 l que contenía 1,8 l de medio de cultivo de siembra para el cultivo de la siembra. El agitador dentro del tanque se hizo girar a 300 rpm y se cultivó a 30°C durante 18 horas para obtener el líquido de siembra.
La fermentación del tirosol natural: se colocó el medio de cultivo de fermentación de 10,2 l en un fermentador de 20 l, se esterilizó a 121°C durante 15 minutos, y luego se inoculó el líquido de siembra de 1,8 l en el fermentador de 20 l para la fermentación. La temperatura de fermentación fue de 30°C, la velocidad de rotación fue de 400 rpm y la relación de ventilación fue de 1:0,1. Después de la fermentación durante 60 horas, se determinó la concentración de tirosol natural en el líquido de fermentación mediante el método de HPLC. La concentración fue de 5,0 g/l.
La invención se puede resumir como sigue: La invención describe una cepa para la producción de tirosol natural y un método de preparación para tirosol natural. La cepa es una levadura, Saccharomyces sp. OMK-58. La cepa se puede usar para producir tirosol natural. El método de preparación del tirosol natural es usar la cepa para producir tirosol mediante fermentación microbiana. El método de fermentación incluye las etapas de activación de la cepa, cultivo de la siembra, fermentación, extracción, etc. El método tiene las ventajas de operación relativamente segura y simple a baja temperatura y presión, y menos contaminación. El presente método es un método de producción seguro y respetuoso con el medio ambiente.
Aplicabilidad industrial
La invención adopta un método de fermentación para producir tirosol natural, con una operación relativamente segura y sencilla a baja temperatura y presión.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Una levadura Saccharomyces sp. OMK-58, en donde la cepa se almacena en el China Center for Type Collection con N.° CCTCC: M 2018479.
2. La aplicación de la levadura Saccharomyces sp. OMK-58 según la reivindicación 1, para producir tirosol natural.
3. Un método para la producción de tirosol natural, en donde la levadura Saccharomyces sp. OMK-58 según la reivindicación 1 se usa para la producción.
4. El método para la producción de tirosol natural según la reivindicación 3, en donde dicho método para producción es un método de fermentación microbiana.
5. El método para la producción de tirosol natural según la reivindicación 4, en donde el sustrato para la fermentación es tirosina.
6. El método para la producción de tirosol natural según la reivindicación 3, en donde el método comprende las siguientes etapas:
1) la activación de la cepa de la levadura Saccharomyces sp. OMK-58;
2) el cultivo de la siembra;
3) la fermentación: el líquido de siembra cultivado hasta la fase de crecimiento logarítmico se inocula en un medio de cultivo de fermentación con una relación de volumen del 5 al 20% en condiciones estériles; el medio de cultivo de fermentación consiste en masa del 2,0 al 5,0% de materia prima de azúcares, del 0,2 al 0,5% de sulfato de amonio, del 0,05 al 0,1% de sulfato de magnesio, del 0,2 al 0,5% de dihidrogenofosfato de potasio, del 0,1 al 1,5% de extracto de levadura en polvo y del 0,5 al 2,0% de tirosina; se fermenta el medio de cultivo de fermentación que contiene el líquido de siembra y se obtiene el líquido de fermentación que contiene tirosol.
7. El método para la producción de tirosol natural según la reivindicación 6, en donde en la etapa 2) el medio de cultivo de siembra incluyen en masa: del 1,0 al 3,5% de materia prima de azúcares, del 0,2 al 1,0% de dihidrogenofosfato de potasio, del 0,1 al 0,5% de hidrogenofosfato dipotásico, del 0,2 al 0,8% de cloruro de sodio, del 0,1 al 1,0% de extracto de levadura en polvo y del 0,1 al 1,0% de peptona.
8. El método para la producción de tirosol natural según las reivindicaciones 6 y/o 7, en donde el valor del pH inicial del medio de cultivo de fermentación es de 5,0 a 8,0, se fermenta el medio de cultivo de fermentación que contiene el líquido de siembra durante 48 a 72 horas en las condiciones de 30 a 37°C, una velocidad de rotación de 200 a 500 rpm y una ventilación de 1:0,05-0,15.
9. El método para la producción de tirosol natural según una cualquiera o más de las reivindicaciones 6 a 8, en donde dicha materia prima de azúcares incluye al menos uno de glucosa, sacarosa y almidón.
10. El método para la producción de tirosol natural según una cualquiera o más de las reivindicaciones 6 a 9, en donde en la etapa 3) se añade tirosina al medio en una dosis o en lotes.
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