ES2870851T3 - Método para detectar enfermedades musculares degenerativas y método para determinar la eficacia terapéutica sobre las enfermedades - Google Patents

Método para detectar enfermedades musculares degenerativas y método para determinar la eficacia terapéutica sobre las enfermedades Download PDF

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Abstract

Un método para detectar una enfermedad muscular degenerativa, comprendiendo el método la etapa de medir un contenido de ácido 11,15-dioxo-9α-hidroxi-2,3,4,5-tetranorprostan- 1,20-dioico en una muestra aislada de un sujeto, en donde la muestra es orina, y la enfermedad muscular degenerativa se selecciona de distrofias musculares y esclerosis lateral amiotrófica.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para detectar enfermedades musculares degenerativas y método para determinar la eficacia terapéutica sobre las enfermedades
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para la detección temprana de enfermedades musculares degenerativas y a un método para predecir y/o determinar la eficacia de un agente terapéutico y/o un método terapéutico.
Antecedentes de la técnica
Los grupos de enfermedades que implican trastornos musculares o mionecrosis se denominan miopatía. La distrofia muscular y la amiotrofia son ejemplos representativos de esta clase de enfermedad. La distrofia muscular es una expresión colectiva utilizada para enfermedades hereditarias que se caracterizan por un debilitamiento y atrofia muscular gradual. Las distrofias musculares progresivas afectan al mayor número de pacientes y causan debilidad muscular hereditaria y progresiva. La amiotrofia es una enfermedad neurogénica causada por daños en el nervio motor.
El tipo de distrofia muscular que afecta a un mayor número de pacientes es la distrofia muscular de Duchenne, que es una enfermedad hereditaria recesiva ligada al sexo que se desarrolla solo en hombres. La enfermedad afecta de 3 a 5 individuos por cada 100.000 personas y a 1 de cada 2.000 a 3.000 varones recién nacidos. La enfermedad generalmente se desarrolla a la edad de aproximadamente 3 a 5 años con defectos para caminar y la bipedestación, tales como problemas para correr y caídas frecuentes. La capacidad de caminar se pierde alrededor de los 10 años de edad. Estos síntomas van seguidos de un rápido progreso de la deformación de la columna vertebral y artrogriposis, que en muchos casos conducen a insuficiencia respiratoria y, con menos frecuencia, insuficiencia cardíaca y neumonía.
Las pruebas utilizadas para el diagnóstico de distrofia muscular incluyen un análisis de sangre, una prueba de conducción nerviosa, electromiografía, una biopsia muscular y un análisis de ADN. La prueba de conducción nerviosa determina si el deterioro de la movilidad o el deterioro de la percepción se deben a una neuropatía periférica, o busca un sitio dañado o la extensión del daño. La prueba mide la tasa de conducción de un estímulo en un nervio electroestimulado. Por su naturaleza, la prueba requiere equipo especial y, dado que se aplica una electroestimulación directamente al nervio, la prueba es algo exigente en el sentido de que implica conmoción, dolor y malestar.
La electromiografía determina si el deterioro de la movilidad se origina en un músculo o un nervio, o busca un sitio dañado o la extensión del daño. La prueba requiere equipo especial e implica dolor por la inserción de una aguja en el músculo. Se dispone de electromiografía de superficie indolora; sin embargo, la medición debe realizarse en instalaciones de ensayo.
La biopsia muscular requiere la recogida de tejido muscular y, por tanto, es invasiva e incómoda. El análisis de ADN, necesario para el diagnóstico de distrofias musculares de Duchenne y Becker causadas por una mutación en el gen de la distrofina, no se ha aplicado a enfermedades musculares degenerativas y carece de versatilidad.
El análisis de sangre generalmente busca creatina cinasa. La creatina cinasa es una enzima presente de manera predominante en las fracciones solubles del músculo esquelético y del músculo cardíaco, y se filtra a la sangre desde las células dañadas. Un músculo esquelético dañado o muerto eleva considerablemente los niveles de creatina cinasa en sangre y, por lo tanto, dichos niveles elevados de creatina cinasa en sangre se pueden utilizar para el diagnóstico de distrofia muscular. Sin embargo, dado que los niveles de creatina cinasa en sangre también pueden aumentar en otras enfermedades, un diagnóstico diferencial basado únicamente en la concentración de creatina cinasa es difícil y se realiza de manera simultánea con otras pruebas.
El análisis de sangre que mide la creatina cinasa en sangre también se realiza para otras distrofias musculares progresivas y para enfermedades que implican daño muscular o muerte causada por defectos nerviosos. Sin embargo, como se ha indicado anteriormente, los niveles elevados de creatina cinasa en sangre también se producen en enfermedades distintas de los trastornos musculares y la mionecrosis, y se necesitan otros marcadores para los trastornos musculares y la mionecrosis.
Por consiguiente, existe una necesidad de un método o un kit de diagnóstico que permita un diagnóstico temprano y fácil de enfermedades degenerativas musculares tales como la distrofia muscular.
El ácido 11,15-dioxo-9a-hidroxi-2,3,4,5-tetranorprostan-1,20-dioico (en lo sucesivo en el presente documento, tetranor-PGDM) se conoce como un metabolito de la prostaglandina D2 (en lo sucesivo en el presente documento, PGD2), y hay un informe de que el Tetranor-PGDM excretado en la orina aumenta a través de reacciones inflamatorias en seres humanos y ratones, y que el Tetranor-PGDM es un marcador que refleja la producción de PGD2 (Bibliografía no patentada 1).
También hay informes de que el aumento de la expresión de prostaglandina D sintetasa hematopoyética (en lo sucesivo en el presente documento, HPGDS) que cataliza la producción de PGD2 se produce en los sitios afectados por enfermedades musculares degenerativas tales como la distrofia muscular, y que la PGD2 está implicada en la prevención y mejora de la progresión de la enfermedad (Bibliografía de patentes 1, bibliografía no patentada 2). El PTL 2 se refiere a un agente farmacéutico particular que tiene un nuevo compuesto de benzimidazol o una sal del mismo como principio activo y, en particular, a un agente farmacéutico que tiene un compuesto de benzimidazol o una sal del mismo como principio activo para la prevención y/o tratamiento de enfermedades alérgicas e inflamatorias, y como inhibidor del agravamiento de la enfermedad de Alzheimer o daño cerebral, debido a su actividad inhibidora de la prostaglandina D sintasa.
NPL 3 se refiere a 15-desoxi-A12,14-prostaglandina J2 que se describe como el electrófilo endógeno que induce la apoptosis neuronal.
Sin embargo, no se sabe que tetranor-PGDM se detecta en concentraciones elevadas como excreción en la orina de pacientes con enfermedades degenerativas musculares, y que la concentración de tetranor-PGDM disminuye significativamente mediante la administración de un inhibidor de HPGDS.
Lista de citas
Bibliografía de patentes
PTL 1: publicación de patente japonesa no examinada n.° 2005-119984
PTL 2: EP 1911755
Bibliografía no patentada
NPL 1: J.Biol.Chem, Vol. 283, N.° 2, 1179-1188 (2008)
NPL 2: Acta Neuropathol, 104, 377-384 (2002)
NPL 3: Mitsuhiro Kondo et al., Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS) 2002, 99(11), páginas 7367-7372
Sumario de la invención
Problema técnico
Es un objetivo de la presente invención proporcionar un método para el diagnóstico eficaz de una enfermedad muscular degenerativa a través de la medición de tetranor-PGDM en la orina, y un método para determinar la eficacia terapéutica de un agente terapéutico y/o un método terapéutico para dichas enfermedades.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un kit de diagnóstico de enfermedades musculares degenerativas que se dirige a tetranor-PGDM.
Solución al problema
Los presentes inventores llevaron a cabo estudios intensivos para lograr los objetivos anteriores y completaron la invención basándose en los siguientes hallazgos.
1) Un modelo animal con distrofia muscular tenía niveles elevados del metabolito tetranor-PGDM de PGD2 en la orina en comparación con animales normales.
2) La administración de un inhibidor de la PGD2 sintetasa conocido en un modelo animal con distrofia muscular redujo la cantidad de tetranor-PGDM excretada en la orina.
La presente invención proporciona un método para detectar una enfermedad muscular degenerativa, el uso de un kit para la medición diagnóstica de una enfermedad muscular degenerativa, y el uso de un kit para predecir y/o determinar la eficacia de un agente terapéutico y/o un método terapéutico para enfermedades musculares degenerativas, como se establece en las reivindicaciones.
La siguiente lista de elementos proporciona un sumario de la presente divulgación:
Elemento 1.
Un método para detectar una enfermedad muscular degenerativa, comprendiendo el método la etapa de medir un contenido de tetranor-PGDM en una muestra aislada de un sujeto.
Elemento 2.
Un método para determinar la eficacia de un agente terapéutico y/o un método terapéutico para una enfermedad muscular degenerativa, comprendiendo el método la etapa de medir un contenido de tetranor-PGDM en una muestra aislada de un paciente con enfermedad muscular degenerativa.
Elemento 3.
El método de acuerdo con el elemento 1 o 2, en donde la muestra es orina.
Elemento 4.
El método de acuerdo con uno cualquiera de los elementos 1 a 3, en donde el tetranor-PGDM se mide mediante el uso de cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS), inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo de fluorescencia (FIA), ELISA o un método enzimático.
Elemento 5.
El método de acuerdo con el elemento 1 o 2, en donde la enfermedad muscular degenerativa es distrofia muscular progresiva, distrofia muscular congénita, distrofia muscular de la cintura y extremidades, distrofia muscular facioescapulohumeral, distrofia muscular miotónica, esclerosis lateral amiotrófica o miopatía.
Elemento 6.
Un kit de medición de diagnóstico para una enfermedad muscular degenerativa, comprendiendo el kit un anticuerpo contra tetranor-PGDM.
Elemento 7.
Un kit para predecir y/o determinar la eficacia de un agente terapéutico y/o un método terapéutico para una enfermedad muscular degenerativa, comprendiendo el kit un anticuerpo contra tetranor-PGDM.
Elemento 8.
El kit de acuerdo con el elemento 6 o 7, que comprende los anticuerpos contra tetranor-PGDM, tetranor-PGDM marcado y, opcionalmente, al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo antiinmunoglobulina, una solución de dilución de muestra, una solución de dilución para el anticuerpo y el tetranor-PGDM marcado, tetranor-PGDM estándar de concentración conocida, un sustrato de EIA y una solución de parada de EIA.
Efectos ventajosos de la invención
La presente invención permite un diagnóstico fácil y temprano de una enfermedad muscular degenerativa mediante la medición de tetranor-PGDM en una muestra aislada de un sujeto, y puede determinar de manera eficaz la eficacia terapéutica de un agente terapéutico y/o un método terapéutico para dichas enfermedades.
La presente invención también se puede utilizar como un kit de diagnóstico para un fácil diagnóstico de enfermedades musculares degenerativas, mediante el uso de un aumento de tetranor-PGDM en la orina como marcador.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un diagrama que muestra cambios en la concentración de tetranor-PGDM en la orina y la fuerza de agarre del antepié en ratones mdx a los que se les administró un inhibidor de HPGDS.
La figura 2 es un diagrama que muestra cambios en la concentración de tetranor-PGDM en la orina tras la administración de un disolvente después de aproximadamente un año de administración del inhibidor de HPGDS (izquierda) y cambios en la concentración de tetranor-PGDM en la orina de perro con distrofia muscular (CXMDj) que recibió el disolvente durante aproximadamente un año antes de que se le administrara el inhibidor (derecha).
Descripción de realizaciones
La presente invención permite el diagnóstico de enfermedades musculares degenerativas utilizando tetranor-PGDM como índice y puede determinar de manera eficaz la eficacia terapéutica de agentes terapéuticos y/o métodos terapéuticos para estas enfermedades. Además, mediante el uso de tetranor-PGDM como marcador, la invención puede proporcionar el uso de un kit de diagnóstico para estas enfermedades, o el uso de un kit para predecir y/o determinar la eficacia de agentes terapéuticos y/o métodos terapéuticos para enfermedades musculares degenerativas.
De acuerdo con una realización de la presente invención, una enfermedad que implica un trastorno muscular o mionecrosis como se define en la reivindicación 1 se puede detectar o diagnosticar mediante la medición del tetranor-PGDM en una muestra aislada de un sujeto afectado o posiblemente afectado por una enfermedad muscular degenerativa. Específicamente, el sujeto se puede diagnosticar con enfermedad muscular degenerativa cuando la concentración o el contenido del tetranor-PGDM en una muestra excede un valor predeterminado. El valor predeterminado del tetranor-PGDM en una muestra aislada de un sujeto se puede determinar a partir del tetranor-PGDM medido en muestras de un individuo sano y de un paciente con enfermedad muscular degenerativa.
El método para determinar la eficacia de agentes terapéuticos y/o métodos terapéuticos compara los valores medidos de tetranor-PGDM en muestras de un paciente con enfermedad muscular degenerativa antes y después del tratamiento/administración de un agente terapéutico. El método determina que el tratamiento y la administración del agente terapéutico son eficaces cuando el valor medido de tetranor-PGDM en la muestra ha disminuido de manera significativa o marginalmente significativa después del tratamiento/administración del agente terapéutico. Por otra parte, el método determina que el agente terapéutico/método terapéutico es ineficaz cuando no hay una diferencia significativa o marginalmente significativa en los valores medidos de tetranor-PGDM en la muestra antes y después del tratamiento/administración del agente terapéutico.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se puede proporcionar el uso de un kit de diagnóstico que utilice anticuerpos para la detección de tetranor-PGDM en una muestra.
Tal como se usa en el presente documento, "sujeto" se refiere a mamíferos, incluyendo, por ejemplo, seres humanos, monos, bovinos, caballos, ratas, ratones, cobayas, conejos, perros, gatos, ovejas y cabras. Preferentemente, el sujeto es un ser humano.
El tetranor-PGDM medido por el método de la presente invención se encuentra como un metabolito de PGD2 en la orina. El tetranor-PGDM también se puede encontrar en la sangre y las heces. En la presente invención, la muestra aislada de un sujeto es preferentemente orina, heces, sangre, plasma sanguíneo o suero, más preferentemente orina. En el método de acuerdo con la presente invención, la muestra es orina.
Tal como se usa en el presente documento, el término "medición" abarca la detección, cuantificación y semicuantificación. Por tanto, "medir tetranor-PGDM" significa tanto detectar tetranor-PGDM en una muestra como medir el nivel de expresión. El término también abarca determinar si el nivel de expresión está en, o por encima de, un valor predeterminado, en otras palabras, detectar expresión cuando el nivel de expresión es igual o superior a un valor predeterminado.
Ejemplos del método que se puede utilizar para medir tetranor-PGDM incluyen GC-MS, HPLC, cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS), inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo de fluorescencia (FIA), ELISA y un método enzimático. De estos, se prefiere la cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) y, para facilitar el procedimiento, inmunoensayos que utilizan anticuerpos antitetranor-PGDM, específicamente se prefiere el inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo fluorescente (FIA) y ELISA, y particularmente el inmunoensayo enzimático (EIA) y ELISA.
Ejemplos generales de enfermedad muscular degenerativa incluyen distrofia muscular progresiva, distrofia muscular congénita, distrofia muscular de la cintura y extremidades, distrofia muscular facioescapulohumeral, distrofia muscular miotónica, esclerosis lateral amiotrófica, miopatía, distensión muscular, miocardiopatía (infarto de miocardio) y enfermedad vascular periférica diabética (trastorno del músculo liso vascular). Se prefieren las distrofias musculares y la esclerosis lateral amiotrófica, tales como la distrofia muscular progresiva, distrofia muscular congénita, distrofia muscular de la cintura y extremidades, distrofia muscular facioescapulohumeral y distrofia muscular miotónica. En la presente invención, la enfermedad muscular degenerativa se selecciona de distrofias musculares y esclerosis lateral amiotrófica.
El agente terapéutico que se puede utilizar para la determinación de la eficacia terapéutica para enfermedades musculares degenerativas no está particularmente limitado y se puede utilizar cualquier agente terapéutico, incluyendo, por ejemplo, inhibidores de la prostaglandina D sintetasa hematopoyética (HPGDS) y antagonistas del receptor de prostaglandina D, de los cuales se prefieren los inhibidores de la prostaglandina D sintetasa hematopoyética (HPGDS).
Es preferible que la concentración de tetranor-PGDM en una muestra se mida mediante inmunoensayo, porque permite fácilmente mediciones simultáneas de un gran número de muestras.
Los anticuerpos antitetranor-PGDM utilizados para el inmunoensayo y el kit pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales.
Con respecto a la producción de anticuerpos, se pueden producir anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales mediante la administración de tetranor-PGDM y la inmunización de un animal (rata, ratón, cobaya, conejo, perro, gato, oveja, cabra, etc.). Como alternativa, los anticuerpos policlonales y los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse del suero recogido de un animal (rata, ratón, cobaya, conejo, perro, gato, oveja, cabra, etc.) y tratarse mediante un método conocido después de un período de tiempo predeterminado desde el intervalo de administración del animal con una mezcla en suspensión de un adyuvante adecuado y tetranor-PGDM unido a una proteína adecuada, por ejemplo, tal como albúmina de suero bovino (BSA), globulina, tiroglobulina y hemocianina.
Específicamente, los anticuerpos monoclonales se pueden obtener a partir de hibridomas producidos mediante la fusión de células de mieloma con células productoras de anticuerpos monoclonales obtenidas del bazo después de inmunizar a un animal con un inmunógeno, para lo cual se utiliza el tetranor-PGDM utilizado para la producción de anticuerpos policlonales y opcionalmente unido a una proteína adecuada.
Los hibridomas se pueden obtener como sigue. El tetranor-PGDM, obtenido como se ha indicado anteriormente, ya sea solo o como un complejo con una proteína, se administra por vía intraperitoneal, intravenosa o subcutánea con un adyuvante completo de Freund a un animal adecuado (tal como un ratón, una rata y un conejo) cada 2 a 3 semanas en porciones divididas para inmunizar al animal. Las células productoras de anticuerpos que se originan en el bazo u otros órganos se fusionan después con células tumorales, tales como células de mieloma, que pueden proliferar en un tubo de ensayo. Las células se pueden fusionar utilizando polietilenglicol de acuerdo con el método ordinario de Kohler y Milstein (Nature, vol. 256, 495 (1975)), o utilizando el virus Sendai.
El inmunoensayo de tetranor-PGDM se realiza utilizando los anticuerpos antitetranor-PGDM obtenidos como se ha indicado anteriormente. Preferentemente, el inmunoensayo se realiza mediante métodos de inmunoensayo competitivo conocidos dirigidos a la sustancia medida tetranor-PGDM. Ejemplos de dichos métodos incluyen el inmunoensayo enzimático (EIA), inmunoensayo de fluorescencia, inmunoensayo luminiscente y radioinmunoensayo (RIA), clasificados de acuerdo con la sustancia de marcado. De estos, se prefiere particularmente EIA.
Normalmente, los antígenos marcados se utilizan para el método de competencia. Ejemplos de sustancias de marcado incluyen enzimas, sustancias fluorescentes, sustancias luminiscentes y radioisótopos. La conjugación entre la sustancia de marcado y los antígenos se puede realizar utilizando métodos conocidos que forman un enlace covalente o un enlace no covalente. Ejemplos de dichos métodos de conjugación incluyen un método que forma un enlace covalente utilizando, por ejemplo, un agente de condensación, y un método que utiliza varios reticulantes (véase, por ejemplo, Tanpakushitsu Kakusan Kouso (PNE), Volumen separado 31, págs. 37 a 45 (1985)). El método de unión covalente se puede utilizar para producir antígenos marcados mediante el uso del grupo funcional presente en los antígenos, o mediante unión de un grupo funcional tal como un grupo tiol, un grupo amino, un grupo carboxilo y un grupo hidroxilo después de introducir estos grupos utilizando un método ordinario. El método de unión no covalente puede ser, por ejemplo, un método de adsorción física.
Preferentemente, el tetranor-PGDM se inmunoensaya, por ejemplo, como se expone a continuación. A través de una reacción de competencia entre una cantidad predeterminada de tetranor-PGDM marcado, anticuerpos antitetranor-PGDM y una muestra que contiene tetranor-PGDM (en particular, una muestra de orina), se cuantifica el tetranor-PGDM en la muestra a partir de la cantidad de antígenos marcados que se han unido a los anticuerpos o no se han unido a los anticuerpos.
Los antígenos marcados unidos a los anticuerpos se pueden aislar de los antígenos marcados no unidos mediante la adición de anticuerpos antiinmunoglobulina y el aislamiento de los conjugados precipitados (antígeno marcado)-(anticuerpo antitetranor-PGDM)-(anticuerpo antiinmunoglobulina), seguido de la medición de la sustancia de marcado que se ha unido a los conjugados o que no se ha unido a los conjugados. El método, llamado técnica de doble anticuerpo, también se puede realizar utilizando un método que utiliza un filtro de carbón. El ensayo con anticuerpos antiinmunoglobulina también se puede realizar mediante la mediación de los anticuerpos antiinmunoglobulina que se han unido a la fase sólida, o mediante la medición de la sustancia de marcado que se ha unido a la fase sólida o no se ha unido a la fase sólida. Los anticuerpos antiinmunoglobulina pueden unirse a la fase sólida utilizando métodos conocidos, por ejemplo, tales como un método de adsorción física, un método de unión química que utiliza un reticulante o un enlace covalente, y un método de unión que utiliza un enlace avidina-biotina. La medición de la sustancia de marcado debe seleccionarse de acuerdo con el tipo de sustancia de marcado utilizada.
El kit de acuerdo con el uso del kit de la presente invención incluye anticuerpos antitetranor-PGDM. En una realización más preferida, el kit incluye tetranor-PGDM marcado y anticuerpos antitetranor-PGDM. Según sea necesario, el kit también puede incluir, por ejemplo, anticuerpos antiinmunoglobulina que se unen a los anticuerpos antitetranor-PGDM, una solución de dilución de muestra, una solución de dilución para los anticuerpos y tetranor-PGDM marcado, y tetranor-PGDM estándar de concentración conocida. Para EIA, el kit puede incluir adicionalmente, por ejemplo, un sustrato y una solución de parada.
La muestra utilizada para la medición de tetranor-PGDM en la presente invención puede ser específicamente, por ejemplo, orina recogida de seres humanos.
El método de determinación de la eficacia para pacientes con enfermedades musculares degenerativas compara los valores medidos de tetranor-PGDM en una muestra (específicamente, orina) antes y después de la administración de un agente terapéutico.
La muestra puede ser un conjunto de orina recogida durante un día, o una muestra recogida puede utilizarse directamente para la medición. La orina recogida puede conservarse a temperatura ambiente, preferentemente a baja temperatura antes de su utilización en la medición.
El tetranor-PGDM en una muestra puede medirse en relación con la cantidad total de la muestra recogida, o en relación con una parte de la muestra recogida, teniendo en cuenta la corrección por sustancias de referencia tales como la creatinina.
Para facilitar el procedimiento, el tetranor-PGDM en una muestra se mide preferentemente en relación con una parte de la muestra recogida teniendo en cuenta la corrección por creatinina.
El valor predeterminado utilizado en la presente invención se describe a continuación.
El valor predeterminado utilizado para la determinación de la eficacia terapéutica para pacientes con enfermedad muscular degenerativa se puede determinar mediante la medición del tetranor-PGDM en muestras de un individuo sano y un paciente, y cada valor medido se puede utilizar después para determinar un "valor predeterminado" como un criterio para determinar la presencia o ausencia de eficacia terapéutica de acuerdo con un método ordinario. Por ejemplo, cuando se utiliza orina como muestra, el valor predeterminado debe determinarse preferentemente utilizando una cantidad diaria de orina combinada de un individuo sano y de un paciente con enfermedad muscular degenerativa, o la orina recogida en un tiempo predeterminado.
En el método para determinar la eficacia terapéutica mediante la medición de tetranor-PGDM, se utiliza como el valor predeterminado la concentración del tetranor-PGDM contenida en la orina de un paciente antes de la administración de un agente terapéutico en tratamiento controlado, y el agente terapéutico y/o el método terapéutico se determinan como eficaces cuando la concentración de tetranor-PGDM en la orina es de manera significativa o marginalmente significativa inferior que el valor predeterminado. A continuación, se prosigue con el método terapéutico y/o la administración del agente terapéutico. Por otra parte, cuando no hay una disminución significativa o marginalmente significativa en la concentración de tetranor-PGDM en la orina, se determina que el método terapéutico y/o el agente terapéutico son ineficaces, y se buscan otros agentes terapéuticos y/o métodos terapéuticos.
Ejemplos
La presente invención se describe a continuación con más detalle basándose en el ejemplo. Sin embargo, debe observarse que la invención no está limitada por el siguiente ejemplo.
Ejemplo 1
1. Materiales y métodos
(1) Materiales y muestras
Los siguientes animales se utilizaron como modelos animales con distrofia muscular.
Ratón con distrofia muscular: mdx (C57Bl/10 ScSn; disponible de JAX Laboratories)
Perro con distrofia muscular: CXMDj (CXMDj ; disponible de National Center of Neurology and Psychiatry) Con fines de comparación, se utilizaron como controles animales del mismo linaje.
Ratón de tipo silvestre (C57BL/10 ScSn; disponible de JAX Laboratories)
Beagle normal (disponible de National Center of Neurology and Psychiatry)
(2) Compuestos de ensayo
Se utilizaron los siguientes compuestos de ensayo, disponibles como inhibidores conocidos de la prostaglandina D sintetasa hematopoyética (HPGDs ).
Compuesto de ensayo 1: 4-benzhidriloxi-1-{3-(1H-tetrazol-5-il)-propil}piperidina (Jpn. J. Pharmacol., 78, 1-10 (1998)) Compuesto de ensayo 2: N-metoxi-N-metil-4-(5-benzoilbenzimidazol-2-il-3,5-dimetilpirrol-2-carboxamida (Documento WO2007007778)
(3) Recolección de orina de ratón
Se administró por vía oral un disolvente (solución de metilcelulosa al 0,5 %) o el compuesto de ensayo 1 a ratones mdx, de 4 semanas de edad, durante 5 días a una dosis de 30 mg/kg. Usando una jaula de metabolismo para ratones, se recogió la orina en el transcurso de aproximadamente 12 horas antes de la administración del compuesto de ensayo 1 y 5 días después de la administración. Con fines de comparación, también se recogió la orina de ratones de tipo silvestre de las mismas semanas de edad y del mismo linaje utilizados como control. La concentración de creatinina en la orina se midió utilizando un kit de medición (tipo L Wako CREM, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
(4) Recolección de orina de perro
Se administró a CXMDj por vía oral un disolvente (solución de metilcelulosa al 0,5%) o el compuesto de ensayo 2 durante aproximadamente 1 año, seguido de la administración del compuesto de ensayo 2 para el perro al que se le administró disolvente, y el disolvente para el perro al que se administró el compuesto de prueba 2. Se recogió la orina antes de cambiar del disolvente al compuesto de ensayo 2 y del compuesto de ensayo 2 al disolvente. La orina se recogió con el tiempo después de que se cambió la solución administrada. Con fines de comparación, también se recogió orina de perros beagles normales utilizados como control.
(5) Tratamiento previo de la orina
La orina (200 j l) recogida de los ratones o perros se mezcló con 5 ng de tetranor-PGDM-d6 marcado con deuterio (Cayman Chemical) utilizado como patrón interno. El volumen se ajustó a 2 ml con agua purificada y el pH se ajustó a 3. Después, la orina se inyectó en un cartucho Sep-Pak Vac C18 (Waters) equilibrado con acetonitrilo (5 ml) y agua purificada (5 ml). La muestra se lavó con una solución de acetonitrilo al 10 % (5 ml) preparada con agua purificada, y con hexano (10 ml) y se eluyó con acetato de etilo (5 ml) antes de secarse bajo una corriente de nitrógeno. El residuo se disolvió en una solución de acetonitrilo al 10 % (100 j l) preparada con agua purificada y se utilizó como muestra de medición.
(6) Medición de tetranor-PGDM
La muestra de orina previamente tratada se utilizó para medir los niveles de tetranor-PGDM. Para la medición se utilizó un aparato de cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS). La medición utilizó el aparato de HPLC Prominence System (controlador del sistema CBM-20A, dos unidades de administración LC-20AD, desaireador en línea DGU-20A3, horno de columna CTO-20A, automuestreador SIL-20AC con función de enfriamiento, Shimadzu Corporation), la columna de protección InertsilODS3 (diámetro interior 2 , 1 m m * 50 m m de longitud; GL Science) y la columna de separación InertsilODS3 (diámetro interior 2,1 mm x 250 mm de longitud; GL Science). La fase móvil tenía un gradiente de concentración del 0,01 % al 0,2 % de ácido fórmico o del 0,01 % al 0,2 % de ácido acético y, acetonitrilo o acetonitrilo/metanol (90:10). El caudal fue de 0,2 ml/min. El horno de columna se fijó a 37 °C y el automuestreador a 4 °C. Un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (sistema 4000 Q TRAP LC/MS/MS, Applied Biosystems) que utiliza ionización por electropulverización como fuente de iones se utilizó para la sección Ms /MS. Para la cuantificación se utilizó MRM (Monitorización de múltiples reacciones). En esta técnica, solo los iones originales verdaderos se seleccionan específicamente de la masa de los iones originales (ion precursor) y de los iones de fragmentos resultantes de CID (disociación inducida por colisión), y los iones originales se cuantifican con precisión a partir del área de los iones seleccionados. Específicamente, los iones originales de la molécula diana se producen mediante ionización por electropulverización, y estos iones originales se aíslan mediante un primer analizador de masas (Q1). En una sección de colisión (Q2), los iones de fragmentos característicos de los iones originales son producidos mediante CID (disociación inducida por colisión). A continuación, los iones de fragmentos se aíslan en un segundo analizador de masas (Q3) y se detectan en el detector proporcionado cadena abajo. Se detectó tetranor-PGDM (número de masa 328) mediante el uso de cualquiera de los iones con un m/z (número de masa carga) de 155, 143 y 109 producidos al descomponer aún más los iones producto con un m/z de 327 mediante CID (disociación inducida por colisión). El patrón interno de tetranor-PGDM-d6 (número de masa 334) se detectó mediante el uso de cualquiera de los iones producto con un m/z (número de masa carga) de 161, 149 y 109 producidos al descomponer aún más los iones producto con un m/z. de 333 mediante CID (disociación inducida por colisión). El análisis de datos se realizó con el programa informático Analyst Versión 1.4.1 adjunto a MS/MS. Se realizaron cálculos de área para los máximos que se originaban en el tetranor-PGDM en el cromatograma de masas resultante, y cada máximo se cuantificó a partir de la curva estándar creada a partir de la muestra estándar. En la cuantificación, se realizó la corrección mediante el uso del valor de área del máximo proveniente del tetranor-PGDM-d6 introducido como patrón interno para la corrección de la eficacia de extracción y eficacia de ionización en cada análisis.
(7) Evaluación de síntomas
Para la evaluación de síntomas de los ratones mdx, se midió la fuerza de agarre del antepié utilizando un dinamómetro de agarre para ratones (medidor de tracción; BrainSienceldea). Cada medición se realizó en 2 min y se calculó el valor medio de cinco ensayos.
2. Resultados
(1) Los niveles de concentración de tetranor-PGDM son elevados en la orina de ratones mdx
La concentración de tetranor-PGDM después de la corrección con la concentración de creatinina en la orina fue de 17,8 ± 0,8 ng/mg de Cre (valor medio ± error estándar, p <0,0003) en los ratones mdx, un valor aproximadamente tres veces mayor que el valor 6,8 ± 1,0 ng/mg de Cre (valor medio ± error estándar) obtenido de los ratones de tipo silvestre.
Este resultado sugiere que la concentración de tetranor-PGDM en la orina se puede utilizar como un marcador en orina para el desarrollo de síntomas en la distrofia muscular.
(2) El inhibidor de HPGDS mejora los síntomas en ratones mdx y reduce la concentración de tetranor-PGDM en la orina
Se evaluó el efecto del inhibidor de HPGDS para los síntomas en ratones mdx. En contraste con el grupo al que se administró disolvente que no mostró cambios significativos en la fuerza de agarre del antepié, los ratones mdx a los que se administró por vía oral el compuesto de ensayo 1 de forma repetida tenían una fuerza de agarre del antepié significativamente aumentada (Figura 1, derecha). La concentración de tetranor-PGDM medida en la orina de los mismos ratones mdx fue significativamente inferior en el grupo al que se administró el compuesto de ensayo 1 (Figura 1, izquierda). El resultado sugiere que existe una correlación entre la mejora de los síntomas y los cambios en la concentración de tetranor-PGDM en la orina en ratones mdx.
(3) Los niveles de concentración de tetranor-PGDM son elevados en la orina de CXMDj
El modelo de perro CXMDj con distrofia muscular tenía niveles de concentración de tetranor-PGDM en la orina más elevados que los perros normales, y la concentración de tetranor-PGDM disminuyó en la orina de los CXMDj administrados con el compuesto de ensayo 2 (Tabla 1). Este resultado sugiere que la concentración de tetranor-PGDM en la orina se puede utilizar como un marcador en orina para el desarrollo de síntomas en la distrofia muscular.
Tabla 1
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(4) La administración de inhibidor de HPGDS reduce la concentración de tetranor-PGDM en la orina en CXMDj
La concentración de tetranor-PGDM en la orina aumentó y las puntuaciones de los síntomas empeoraron en CXMDj que recibieron el disolvente después de haberles administrado por vía oral el compuesto de ensayo 2 durante aproximadamente 1 año (Figura 2, izquierda). Por otra parte, la concentración de tetranor-PGDM en la orina disminuyó y las puntuaciones de los síntomas mejoraron en CXMDj que recibieron el inhibidor después de haberles administrado por vía oral el disolvente durante aproximadamente 1 año (Figura 2, derecha). Estos resultados sugieren que los cambios en la concentración de tetranor-PGDM en la orina se pueden utilizar como un marcador para determinar o predecir el efecto de la administración de agentes terapéuticos en la distrofia muscular.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un método para detectar una enfermedad muscular degenerativa,
comprendiendo el método la etapa de medir un contenido de ácido 11,15-dioxo-9a-hidroxi-2,3,4,5-tetranorprostan-1.20- dioico en una muestra aislada de un sujeto, en donde la muestra es orina, y
la enfermedad muscular degenerativa se selecciona de distrofias musculares y esclerosis lateral amiotrófica.
2. Un método para determinar la eficacia de un agente terapéutico y/o un método terapéutico para una enfermedad muscular degenerativa,
comprendiendo el método la etapa de medir un contenido de ácido 11,15-dioxo-9a-hidroxi-2,3,4,5-tetranorprostan-1.20- dioico en una muestra aislada de un paciente con enfermedad muscular degenerativa,
en donde la enfermedad muscular degenerativa se selecciona de distrofias musculares y esclerosis lateral amiotrófica, y la muestra es orina.
3. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el ácido 11,15-dioxo-9a-hidroxi-2,3,4,5-tetranorprostan-1,20-dioico se mide utilizando cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS), inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo de fluorescencia (FIA), ELISA o un método enzimático.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la enfermedad muscular degenerativa se selecciona de distrofia muscular progresiva, distrofia muscular congénita, distrofia muscular de la cintura y extremidades, distrofia muscular facioescapulohumeral, distrofia muscular miotónica y esclerosis lateral amiotrófica.
5. Uso de un kit para el diagnóstico de una enfermedad muscular degenerativa,
comprendiendo el kit un anticuerpo contra el ácido 11,15-dioxo-9a-hidroxi-2,3,4,5-tetranorprostan-1,20-dioico; en donde la enfermedad muscular degenerativa se selecciona de distrofias musculares y esclerosis lateral amiotrófica; y en donde la muestra es orina.
6. Uso de un kit para predecir y/o determinar la eficacia de un agente y/o un método para tratar una enfermedad muscular degenerativa,
comprendiendo el kit un anticuerpo contra el ácido 11,15-dioxo-9a-hidroxi-2,3,4,5-tetranorprostan-1,20-dioico; en donde la enfermedad muscular degenerativa se selecciona de distrofias musculares y esclerosis lateral amiotrófica, y en donde la muestra es orina.
7. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 5 o 6, en donde el kit comprende el anticuerpo contra el ácido 11,15-dioxo-9a-hidroxi-2,3,4,5-tetranorprostan-1,20-dioico, ácido 11,15-dioxo-9a-hidroxi-2,3,4,5-tetranorprostan-1,20-dioico marcado y, opcionalmente, al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo antiinmunoglobulina, una solución de dilución de muestra, una solución de dilución para el anticuerpo y el ácido 11,15-dioxo-9a-hidroxi-2,3,4,5-tetranorprostan-1,20-dioico marcado, ácido 11,15-dioxo-9a-hidroxi-2,3,4,5-tetranorprostan-1,20-dioico estándar de concentración conocida, un sustrato de EIA y una solución de parada de EIA.
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