ES2848031T3 - Dendrímeros peptídicos que comprenden péptidos de unión al fibrinógeno - Google Patents

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Abstract

Un dendrímero peptídico que comprende un núcleo ramificado y una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno unidos covalentemente por separado al núcleo ramificado, en el que el núcleo ramificado comprende ya sea: de dos a diez residuos de aminoácidos multifuncionales, en los que cada péptido de unión al fibrinógeno está unido covalentemente por separado a un residuo de aminoácidos multifuncional del núcleo ramificado; una pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales, en los que uno o más péptidos de unión al fibrinógeno están unidos covalentemente por separado a cada uno de al menos dos residuos de aminoácidos multifuncionales adyacentes del núcleo ramificado; una pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales, en los que dos o más péptidos de unión al fibrinógeno están unidos covalentemente por separado a al menos uno de los residuos de aminoácidos multifuncionales del núcleo ramificado; una pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales, en los que dos o más residuos de aminoácidos multifuncionales están unidos covalentemente a través de una cadena lateral de un residuo de aminoácidos multifuncional adyacente; o un único residuo de aminoácido multifuncional, y un péptido de unión al fibrinógeno se une covalentemente por separado a cada grupo funcional del residuo de aminoácido multifuncional; en el que los residuos de aminoácidos multifuncionales comprenden residuos de aminoácidos tri- o tetrafuncionales, o son residuos de aminoácidos tri- y tetrafuncionales, o el único residuo de aminoácidos multifuncional es un residuo de aminoácido tri- o tetrafuncional; en el que los residuos de aminoácidos trifuncionales comprenden un átomo de carbono central que lleva un grupo amino, un grupo carboxilo y una cadena lateral que lleva un grupo funcional adicional, y los residuos de aminoácidos tetrafuncionales comprenden un átomo de carbono central que lleva un grupo amino, un grupo carboxilo y una cadena lateral que lleva otros dos grupos funcionales.

Description

DESCRIPCIÓN
Dendrímeros peptídicos que comprenden péptidos de unión al fibrinógeno
Esta invención se refiere a dendrímeros y agentes peptídicos que comprenden péptidos de unión al fibrinógeno, a composiciones que comprenden los dendrímeros o agentes peptídicos, y a su uso para polimerizar el fibrinógeno y como agentes hemostáticos.
La formación del polímero de fibrina insoluble a partir de su fibrinógeno precursor soluble es la etapa final de la coagulación sanguínea. La conversión del fibrinógeno en fibrina se produce en tres etapas: proteólisis limitada del fibrinógeno en monómero de fibrina por trombina; ensamblaje de monómeros de fibrina en protofibrillas semiescalonadas de doble cadena; y reticulación de fibrina ensamblada para fortalecer el coágulo.
La molécula del fibrinógeno consta de tres pares de cadenas polipeptídicas no idénticas, Aa, Bp y y, unidas entre sí por enlaces disulfuro. Las cadenas del fibrinógeno se pliegan en tres regiones estructurales distintas, dos regiones D distales unidas a una región E central. Cada región D contiene orificios de polimerización "a" y "b" ubicados en el extremo C de las cadenas y y Bp, respectivamente. La trombina cataliza la eliminación de péptidos cortos, fibrinopéptidos A (FpA) y B (FpB), del amino terminal de las cadenas Aa y Bp del fibrinógeno en la región E central, respectivamente, exponiendo dos sitios de polimerización: "botón A ", con secuencia amino-terminal Gly-Pro-Arg-; y "botón B", con secuencia amino-terminal Gly-His-Arg-. Los botones de polimerización recién expuestos de un monómero de fibrina interactúan con los orificios correspondientes de otro monómero de fibrina a través de interacciones de botón-orificio 'A-a' y 'B-b', lo que da como resultado el ensamblaje de monómeros de fibrina en protofibrillas semiescalonadas de doble cadena.
Las protofibrillas se agregan lateralmente para formar fibras más gruesas que se conjugan para formar una red tridimensional de coágulos de fibrina. FpA se escinde del fibrinógeno más rápidamente que FpB. La eliminación de FpA desencadena la formación de protofibrillas, mientras que la eliminación de FpB coincide con su agregación lateral. La liberación de FpB, que es muy lenta al comienzo de la reacción, se acelera con la formación del polímero. Este retraso en la escisión de FpB es necesario para el ensamblaje normal de la fibrina y también está relacionado con la formación de diferentes tipos de coágulos. La fibrina I, en la que solo se eliminan los FpA, es menos compacta y la plasmina la digiere más fácilmente, mientras que la fibrina II, en la que se eliminan tanto FpA como FpB, es más compacta y más resistente a la fibrinólisis.
Los estudios con enzimas de veneno de serpiente que eliminan solo FpA o principalmente FpB han demostrado que los coágulos de fibrina se pueden formar mediante interacciones ya sea "A-a" o "B-b", lo que indica que ambas interacciones pueden mediar la formación de protofibrillas. Los experimentos con una variante del fibrinógeno recombinante mostraron que las interacciones "B-b" pueden desempeñar un papel sustancial en la formación de protofibrillas cuando las interacciones "A-a" se debilitan. Otros estudios han demostrado que solo se producen interacciones 'A-a' durante la unión de los fragmentos de fibrina a las moléculas de fibrinógeno, incluso cuando están disponibles tanto los botones 'B' como los orificios 'b', y que las interacciones entre los botones y los orificios 'B-b' eran evidentes solo cuando se excluyeron las interacciones 'A-a'. Sin embargo, los estudios de inhibición de péptidos han indicado que las interacciones "B-b" pueden ocurrir simultáneamente con "A-a".
La fibrina se estabiliza mediante la formación de enlaces cruzados covalentes entre las cadenas laterales de diferentes moléculas en la fibra de fibrina. Los enlaces peptídicos se forman entre cadenas laterales específicas de glutamina y lisina en una reacción de transamidación que es catalizada por el factor XIIIa.
El adhesivo tisular de fibrina (FTA) es el nombre que se le da a los productos formados imitando la última etapa de la cascada de coagulación para formar un coágulo de fibrina. Los kits de FTA disponibles comercialmente producen rápidamente geles fuertes y biodegradables que se usan para hemostasia, administración de fármacos y como pegamentos quirúrgicos y selladores de tejidos. El fibrinógeno, el factor XIII, la trombina y los iones de calcio se administran por lo general mediante un dispositivo de jeringa que separa el fibrinógeno y el factor XIII de los iones de calcio y la trombina durante el almacenamiento. La mezcla de los componentes durante la descarga de la jeringa da como resultado la trombinólisis del fibrinógeno para crear fibrina, que se autoensambla en un gel que luego se reticula con el Factor XIII activado por iones de calcio.
Los FTA convencionales tienen la desventaja de que no se suministran en forma lista para su uso, por lo que los componentes del FTA se deben mezclar antes de su aplicación a una herida. Una vez que se mezclan los componentes, el FTA se debe usar dentro de un período corto de tiempo. El requisito de preparar la mezcla poco antes de su uso puede ser particularmente desventajoso, por ejemplo, si el producto se requiere en una emergencia.
Muchos FTA usan trombina bovina, que está contaminada con antígeno bovino, en particular factor V bovino. Los anticuerpos generados contra este antígeno pueden reaccionar de forma cruzada con el factor V humano y provocar hemorragias potencialmente mortales y, en algunas circunstancias, anafilaxia y muerte. La trombina humana se ha aislado del plasma combinado de donantes en un esfuerzo por minimizar estos riesgos, pero tiene el potencial de transmitir patógenos transmitidos por la sangre, especialmente virus. Una trombina humana recombinante ha sido desarrollada y aprobada para su uso por the US Food and Drug Administration (FDA). Tiene la ventaja de ser mínimamente antigénica y no conlleva el riesgo de transmisión viral. Sin embargo, se fabrica usando una línea celular de ovario de hámster chino genéticamente modificada, por lo que su producción es relativamente costosa.
Las preparaciones de trombina humana recombinante y bovina purificada se almacenan a temperatura ambiente como un polvo que debe reconstituirse con solución salina en solución antes de su uso.
La trombina humana purificada aprobada por la FDA se envasa como una solución, pero solo se puede almacenar a temperatura ambiente hasta por 24 horas; el almacenamiento a largo plazo requiere congelación (Lew and Weaver, Biologics: Targets & Therapy 2008:2(4) 593-599). Una desventaja adicional del uso de trombina es que la enzima necesita tiempo para convertir el fibrinógeno en fibrina, por lo que hay un retraso antes de que se acelere la coagulación sanguínea.
Los FTA convencionales también usan cantidades muy elevadas de fibrinógeno. Otros hemostáticos se basan en el propio fibrinógeno del paciente para promover la formación de coágulos. Una matriz hemostática, denominada "FLOSEAL", consiste en una mezcla de matriz de gelatina de origen bovino, trombina de origen humano y cloruro de calcio. La trombina se proporciona en forma liofilizada y se debe disolver en una solución de cloruro de calcio y luego mezclar con la matriz de gelatina antes de su uso. El producto se debe usar dentro de las ocho horas posteriores a su preparación. De nuevo, el requisito de preparar la mezcla poco antes de su uso puede ser particularmente desventajoso, por ejemplo, si el producto se requiere en una emergencia.
El documento WO 2008/065388 describe la formación de un biogel usando un agente que es capaz de polimerizar fibrinógeno en ausencia de trombina. El agente comprende varios péptidos de unión al fibrinógeno conjugados con un portador soluble de albúmina de suero humano (HSA) usando el agente de reticulación succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC). El documento US 2012/0114682 describe el uso de conjugados de péptidos de botón de fibrina para formar polímeros de fibrina y su uso en la reparación de heridas. Este documento también describe la producción de un conjugado que comprende el péptido de unión al fibrinógeno GPRP (SEQ ID NO: 1) unido a polietilenglicol (PEG). El conjugado "botón-PEG" se preparó haciendo reaccionar un PEG activado con maleimida con una cisteína C-terminal del péptido botón sintetizado.
Los métodos de conjugación son a menudo complejos, requiriendo múltiples etapas, algunos de los cuales pueden necesitar ser completados en diferentes lugares, y frecuentemente dan como resultado un rendimiento relativamente bajo del producto deseado. Una desventaja adicional de los productos conjugados es que pueden ser sensibles a la radiación esterilizante, debido a los materiales portadores y/o enlazantes usados en su síntesis.
Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar hemostatos que puedan polimerizar rápidamente el fibrinógeno, que se puedan producir fácilmente sin el uso de reactivos inmunogénicos, que sean resistentes a la radiación esterilizante y que se puedan proporcionar en forma lista para su uso.
De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un dendrímero peptídico que comprende un núcleo ramificado y una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno unidos covalentemente por separado al núcleo ramificado, en el que el núcleo ramificado comprende ya sea:
de dos a diez residuos de aminoácidos multifuncionales, en los que cada péptido de unión al fibrinógeno está unido covalentemente por separado a un residuo de aminoácidos multifuncional del núcleo ramificado;
una pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales, en los que uno o más péptidos de unión al fibrinógeno están unidos covalentemente por separado a cada uno de al menos dos residuos de aminoácidos multifuncionales adyacentes del núcleo ramificado;
una pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales, en los que dos o más péptidos de unión al fibrinógeno están unidos covalentemente por separado a al menos uno de los residuos de aminoácidos multifuncionales del núcleo ramificado;
una pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales, en los que dos o más residuos de aminoácidos multifuncionales están unidos covalentemente a través de una cadena lateral de un residuo de aminoácidos multifuncional adyacente; o
un único residuo de aminoácido multifuncional y un péptido de unión al fibrinógeno se une covalentemente por separado a cada grupo funcional del residuo de aminoácido multifuncional;
en el que los residuos de aminoácidos multifuncionales comprenden residuos de aminoácidos tri- o tetrafuncionales, o son residuos de aminoácidos tri- y tetrafuncionales, o el único residuo de aminoácidos multifuncional es un residuo de aminoácidos tri- o tetrafuncional;
en el que los residuos de aminoácidos trifuncionales comprenden un átomo de carbono central que lleva un grupo amino, un grupo carboxilo y una cadena lateral que lleva un grupo funcional adicional, y los residuos de aminoácidos tetrafuncionales comprenden un átomo de carbono central que lleva un grupo amino, un grupo carboxilo y una cadena lateral que lleva otros dos grupos funcionales.
Cada péptido de unión al fibrinógeno tiene un punto de unión diferente al núcleo ramificado, por lo que los péptidos de unión al fibrinógeno que se denominan en este documento "unidos covalentemente por separado" al núcleo ramificado.
El núcleo ramificado comprende cualquier secuencia de aminoácidos apropiada. El núcleo ramificado puede comprender hasta diez residuos de aminoácidos multifuncionales, por ejemplo de dos a diez, o de dos a seis residuos de aminoácidos multifuncionales.
El núcleo ramificado puede comprender una pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales consecutivos. El núcleo ramificado puede comprender hasta diez residuos de aminoácidos multifuncionales consecutivos.
El término "aminoácido trifuncional" se usa en este documento para hacer referencia a cualquier compuesto orgánico con un primer grupo funcional que es una amina (-NH2), un segundo grupo funcional que es un ácido carboxílico (-COOH), y un tercer grupo funcional. El término "aminoácido tetrafuncional" se usa en este documento para referirse a cualquier compuesto orgánico con un primer grupo funcional que es una amina (-NH2), un segundo grupo funcional que es un ácido carboxílico (-COOH), un tercer grupo funcional y un cuarto grupo funcional. El tercer y cuarto grupo funcional puede ser cualquier grupo funcional que sea capaz de reaccionar con un extremo carboxi terminal de un péptido de unión al fibrinógeno, o con un grupo funcional de un enlazante unido al extremo carboxi terminal de un péptido de unión al fibrinógeno.
Los aminoácidos multifuncionales pueden comprender un átomo de carbono central (a- o 2-) que lleva un grupo amino, un grupo carboxilo y una cadena lateral que lleva un grupo funcional adicional (proporcionando así un aminoácido trifuncional), u otros dos grupos funcionales (proporcionando así un aminoácido tetrafuncional.
El, o cada, residuo de aminoácido multifuncional puede ser un residuo de un aminoácido multifuncional proteinogénico o no proteinogénico, o un residuo de un aminoácido multifuncional natural o no natural.
Los aminoácidos trifuncionales proteinogénicos poseen un átomo de carbono central (a- o 2-) que lleva un grupo amino, un grupo carboxilo, una cadena lateral y una conformación levo de a-hidrógeno. Los ejemplos de aminoácidos proteinogénicos trifuncionales apropiados incluyen L-lisina, L-arginina, ácido L-aspártico, ácido L-glutámico, L-asparagina, L-glutamina y L-cisteína.
Los ejemplos de residuos de aminoácidos no proteinogénicos trifuncionales apropiados incluyen residuos de D-lisina, beta-lisina, L-ornitina, D-ornitina y D-arginina.
De este modo, los ejemplos de residuos de aminoácidos trifuncionales apropiados para su uso en un dendrímero peptídico de la invención incluyen residuos de lisina, ornitina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina y cisteína, tales como residuos de L-lisina, D-lisina, beta-lisina, L-ornitina, D-ornitina, L-arginina, D-arginina, ácido L-aspártico, ácido D-aspártico, ácido L-glutámico, ácido D-glutámico, L-asparagina, D- asparagina, L-glutamina, D-glutamina, L-cisteína y D-cisteína.
Los ejemplos de apropiados aminoácidos no naturales multifuncionales apropiados para su uso en un dendrímero peptídico de la invención incluyen citrulina, ácido 2,4-diaminoisobutírico, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico y ácido cis-4-amino-L-prolina. Los aminoácidos no naturales multifuncionales están disponibles en Sigma-Aldrich.
En algunas realizaciones, el núcleo ramificado puede comprender una secuencia de aminoácidos multifuncional homopolimérica, por ejemplo, una secuencia de polilisina, poliarginina o poliornitina, tal como un núcleo ramificado que comprende de dos a diez, o de dos a seis, residuos consecutivos de lisina, arginina u ornitina. En otras realizaciones, el núcleo ramificado puede comprender diferentes residuos de aminoácidos multifuncionales, por ejemplo uno o más residuos de lisina, uno o más residuos de arginina y/o uno o más residuos de ornitina.
En otras realizaciones, el núcleo ramificado puede comprender una pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales y uno o más de otros residuos de aminoácidos.
Cuando el núcleo ramificado comprende una pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales, los residuos de aminoácidos multifuncionales adyacentes se pueden unir mediante enlaces de cadena lateral de aminoácidos, mediante enlaces peptídicos, o se pueden unir algunos residuos de aminoácidos multifuncionales adyacentes, juntos por enlaces de cadena lateral y otros por enlaces peptídicos.
En realizaciones adicionales, el núcleo ramificado puede comprender dos o más residuos de aminoácidos multifuncionales, y al menos un péptido de unión al fibrinógeno se une por separado a cada uno de dos o más de los residuos de aminoácidos multifuncionales, y dos o más péptidos de unión al fibrinógeno se unen por separado a al menos uno de los residuos de aminoácidos multifuncionales del núcleo ramificado.
Según otras realizaciones, dos péptidos de unión al fibrinógeno se unen por separado a un residuo de aminoácido multifuncional terminal del núcleo ramificado.
Los ejemplos de estructuras de dendrímeros peptídicos de la invención incluyen dendrímeros peptídicos en los que: • el núcleo ramificado comprende un primer residuo de aminoácido trifuncional al que se unen dos péptidos de unión al fibrinógeno, y un segundo residuo de aminoácido trifuncional al que se une un péptido de unión al fibrinógeno; • el núcleo ramificado comprende un primer residuo de aminoácido trifuncional al que se unen dos péptidos de unión al fibrinógeno, y un segundo residuo de aminoácido trifuncional al que se unen dos péptidos de unión al fibrinógeno;
• el núcleo ramificado comprende un primer residuo de aminoácido trifuncional al que se unen dos péptidos de unión al fibrinógeno, un segundo residuo de aminoácido trifuncional al que se une un péptido de unión al fibrinógeno y un tercer residuo de aminoácido trifuncional al que se une un péptido de unión al fibrinógeno; o
• el núcleo ramificado comprende un primer residuo de aminoácido trifuncional al que se unen dos péptidos de unión al fibrinógeno, un segundo residuo de aminoácido trifuncional al que se une un péptido de unión al fibrinógeno, un tercer residuo de aminoácido trifuncional al que se une el péptido de unión al fibrinógeno y un cuarto residuo de aminoácido trifuncional al que se une un péptido de unión al fibrinógeno.
Un dendrímero peptídico de la invención puede comprender la siguiente fórmula general (I):
FBP-(enlüZüiite)-
Figure imgf000005_0001
(I)
dónde:
FBP es un péptido de unión al fibrinógeno;
-(enlazante)- es un enlazante opcional, preferiblemente un enlazante no peptídico;
X es un residuo de aminoácido trifuncional, preferiblemente lisina, ornitina o arginina;
Y es -FBP o -NH2;
Z es -(enlazante)-FBP cuando Y es -FBP, o -[- Xn-(enlazante)-FBP]a-(enlazante)-FBP cuando Y es - NH2 ; dónde:
Xn es un residuo de aminoácido trifuncional, preferiblemente lisina, L-ornitina o arginina; y
a es 1-10, preferiblemente 1-3.
Por ejemplo, cuando Y es NH2 , Z es -[-Xn-(enlazante)-FBP]a-(enlazante)-FBP, la estructura del dendrímero es la siguiente:
donde a es 1:
FBP -(enlazanie}-X-(enlazante) -N H j
X -(enlazante) - FBP
(enlazante) -FBP
o, donde a es 2:
FBP -(enlazante) -X-(enlazante) -NH?
X-(enlazante) - FBP
X-(enlazante) - FBP
(enlazante) - FBP
o, donde a es 3:
FBP -(enlazante) -X-(enlazante) -NHj
X_ (enlazante) - FBP
X-(enlazante) - FBP
X-(enlazante) - FBP
(enlazante) - FBP
Alternativamente, Z es -[- Xn-(enlazante)-FBP]a-(enlazante)-FBP cuando Y es -FBP;
dónde:
Xn es un residuo de aminoácido trifuncional, preferiblemente lisina, L-ornitina o arginina; y
a es 1-10, preferiblemente 1-3.
Por ejemplo, cuando Y es -FBP, Z es -[- Xn-(enlazante)-FBP]a-(enlazante)-FBP y a es 1, la estructura del dendrímero es la siguiente:
FBP -(enlazante) -X-(enlazante) - FBP
I
X-(enlazante) - FBP
I
(enlazante) - FBP
Un dendrímero peptídico de la invención puede comprender la siguiente fórmula general (II):
FBP-(enlazante)-NH-CH-CO-(enlazante)'Y
I
Z
(II)
dónde:
FBP es un péptido de unión al fibrinógeno;
-(enlazante)- es un enlazante opcional, que preferiblemente comprende -NH(CH2)5CO-;
Y es -FBP o -NH2;
Z es:
-R-(enlazante)-FBP, cuando Y es -FBP, o
-R-COCHNH-(enlaza lite}-FBP R. (enlaza lite J-FBP.
cuando Y es -NH2; o
-R-COCHNH-(enla^iiteí-FBP
I
R-COCHNH-(enlazante)-FBP
I
R. (enlazante) -FBP,
cuando Y es -NH2 ; o
- R-COCH NH - {<* n I a za nte)- FBP
I
R-COCHNH-{enlaza lite)-FBP
I
R-COCHNH-{enlaza lite)-FBP
I
R. (enlazante) -FBP, cuando Y es -NH2 ;
donde R es -(CH2)4NH-, -(CH2)3NH-, o -(CH2)3NHCNHNH-En consecuencia, en una realización, Z puede ser:
H NH-(e 111a za nte I - FBP h
Figure imgf000007_0001
-(enlazante) - FBP,
cuando Y es -NH2 ;
donde R es -(CH2)4NH-, -(CH2)3NH-, o -(CH2)3NHCNHNH-donde a es 1-3.
Alternativamente, a puede ser 4-10 o puede ser 1-10.
En otra realización, Z es:
NH-(en|azanteí-FBP]il
Figure imgf000007_0002
-(enlazante) - FBP,
cuando Y es-FBP;
donde R es -(CH2)4NH-, -(CH2)3NH-, o -(CH2)3NHCNHNH-donde a es 1-10, preferiblemente 1-3.
Por ejemplo, Z es:
-R-CGCHNH-(enlazante) -FBP
R. (enlazante) -FBP,
cuando Y es -FBP y a es 1.
Un dendrímero peptídico de la invención puede comprender la siguiente fórmula general (III):
FBP- (enlazante)-NH-CH-CO (enlazante)-Y
1
2
(III)
dónde:
FBP es un péptido de unión al fibrinógeno;
-(enlazante)- es un enlazante opcional, que preferiblemente comprende -NH(CH2)5CO-;
Y es -FBP o -NH2;
Z es:
-(CH2)4NH-(enlazante)-FBP, cuando Y es -FBP; o
(CH^NHCOCHNH-(enlazante) - FBP
(CH£}4NH-{enlazante)-FBP,
cuando Y es -NH2 ; o
-(enlazante) - FBP
Figure imgf000008_0001
HCOCHNI-Menlazante} - FBP
(CH^NFHenlazante) - FBP,
cuando Y es -NH2 ; o
(CH?)4NHC0CHNH-(enlazante) - FBP
I
(CH^NHCOCHNH-lenlazante) - FBP
I
(CH2)4NHCOCHNH-{enlazante) - FBP
I
(CH^NH-íenlazante) - FBP,
cuando Y es -NH2.
En consecuencia, en una realización, Z puede ser:
-[-(CH2)4NHCOCHNH-(en|azante) FBP]a
(CHsjiNH-(enlazante) -FBP;
cuando Y es -NH2;
donde a es 1-3.
Alternativamente, a es 4-10, o puede ser 1-10.
En otra realización, Z es:
[-(CHí)4NHCOCHNH-(enlüzante)-FBP]a
(CHs)4NH-{enlazante} -FBP;
cuando Y es-FBP;
donde a es 1-10, preferiblemente 1-3.
Por ejemplo, Z es:
(CH^NHCOCHNH- (enlazante) - FBP
I
(CHe)*NH-(enlazante) - FBP,
cuando Y es -FBP y a es 1.
En una realización, el dendrímero peptídico no comprende la siguiente estructura:
Figure imgf000009_0001
Se puede usar cualquier peptido de unión al fibrinógeno (FBP) apropiado. Por ejemplo, el peptido puede ser capaz de unirse a una región del fibrinógeno que se une naturalmente a la fibrina o por las glicoproteínas de la membrana plaquetaria GPIIb-IIIa. La unión de la fibrina al fibrinógeno se analiza en Mosesson et al. 2001, Ann. N.Y. Acad. Sci., 936, 11-30. La unión de GPIIb-IIIa al fibrinógeno se analiza en Bennett, 2001, Annals of NY Acad. Sci., 936, 340-354.
El término "péptido", como se usa en este documento, también incorpora análogos de péptidos. El experto conoce varios análogos de péptidos. Se puede usar cualquier análogo apropiado siempre que el fibrinógeno sea capaz de unirse al péptido de unión al fibrinógeno.
En los documentos WO 2005/035002, WO 2007/015107 y WO 2008/065388 se proporcionan ejemplos de péptidos de unión al fibrinógeno apropiados y cómo se pueden identificar.
Preferiblemente, los péptidos de unión al fibrinógeno tienen cada uno de 3-60, preferiblemente 3-30, más preferiblemente 3-10, residuos de aminoácidos de longitud.
Preferiblemente, cada péptido de unión al fibrinógeno se une al fibrinógeno con una constante de disociación (Kd) de entre 10'9y 10'6 M, por ejemplo alrededor de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400 o más nM. Se prefiere una Kd de alrededor de 100 nM. La constante de disociación se puede medir en equilibrio. Por ejemplo, el fibrinógeno radiomarcado de concentración conocida se puede incubar con microesferas a las que se ha reticulado la unidad estructural de unión del fibrinógeno. Por lo general, el péptido 5 |iM se reticula con microesferas de 1 g, o entre 15-40 emoles de péptido se reticula con 1 g de microesferas. Las microesferas unidas a péptidos se diluyen a 0.5 mg/ml y se incuban en solución reguladora isotónica a pH 7.4 (por ejemplo, solución reguladora Hepes 0.01 M que contiene NaCl 0.15 M) con fibrinógeno radiomarcado a concentraciones de entre 0.05 y 0.5 mg/ml durante hasta 1 hora a 20 °C. El fibrinógeno unido a la unidad estructural de unión del fibrinógeno en las microesferas se puede separar del fibrinógeno libre mediante centrifugación y se mide la cantidad del fibrinógeno libre y unido. A continuación, la constante de disociación se puede calcular mediante análisis de Scatchard trazando la concentración del fibrinógeno unido frente a la proporción de las concentraciones del fibrinógeno unido: libre, donde la pendiente de la curva representa Kd.
Según algunas realizaciones, los péptidos de unión al fibrinógeno de los dendrímeros peptídicos de la invención se unen preferentemente al orificio "a" del fibrinógeno sobre el orificio "b" del fibrinógeno. Ejemplos de secuencias de péptidos de unión al fibrinógeno apropiados que se unen preferentemente al orificio "a" sobre el orificio "b" del fibrinógeno incluyen: GPR-; GPRP-(SEQ ID NO: 1); GPRV-(SEQ ID NO: 2); GPRPFPA-(SEQ ID NO: 3); GPRVVAA-(SEQ ID NO: 4); GPRPVVER-(SEQ ID NO: 5); GPRPAA-(SEQ ID NO: 6); GPRPPEC-(SEQ ID NO: 7); GPRPPER-(SEQ ID NO: 8); GPSPAA-(SEQ ID NO: 9).
Según otras realizaciones, los péptidos de unión al fibrinógeno de los dendrímeros peptídicos de la invención se unen preferentemente al orificio "b" del fibrinógeno sobre el orificio "a" del fibrinógeno. Ejemplos de secuencias de péptidos de unión al fibrinógeno que se unen preferentemente al orificio 'b' sobre el orificio 'a' del fibrinógeno incluyen: GHR-, GHRP-(SEQ ID NO: 10), GHRPY-(SEQ ID NO: 11), GHRPL-(SEQ ID NO: 12), GHRPYamida-(SEQ ID NO: 13).
Cada péptido de unión al fibrinógeno de un dendrímero peptídico de la invención puede, independientemente, estar unido en su extremo carboxi terminal (opcionalmente mediante un enlazante), o en su extremo amino terminal (opcionalmente mediante un enlazante) al núcleo ramificado del dendrímero. Si el péptido de unión al fibrinógeno está unido en su extremo amino terminal, el extremo carboxi terminal del péptido puede comprender un grupo amida. La presencia de un grupo amida, en lugar de un grupo carboxilo (o un ion carboxilato cargado negativamente), en el extremo carboxi terminal expuesto del péptido puede ayudar a optimizar la unión del péptido de unión al fibrinógeno con el fibrinógeno.
En algunas realizaciones, cada péptido de unión al fibrinógeno se une (opcionalmente mediante un enlazante) en su extremo carboxi terminal al núcleo ramificado del dendrímero. En otras realizaciones, al menos un péptido de unión al fibrinógeno se une (opcionalmente a través de un enlazante) en su extremo amino terminal al núcleo ramificado del dendrímero. Por ejemplo, al menos un péptido de unión al fibrinógeno que se une preferentemente al orificio 'a' sobre el orificio 'b' del fibrinógeno, tal como un péptido que comprende la secuencia APFPRPG (SEQ ID NO: 14), se puede unir (opcionalmente a través de un enlazante) en su extremo amino terminal hasta el núcleo ramificado del dendrímero.
Ventajosamente, un dendrímero peptídico de la invención comprende péptidos de unión al fibrinógeno de secuencia diferente (denominados en este documento como dendrímero peptídico "quimérico"). Por ejemplo, en algunas realizaciones, un dendrímero peptídico de la invención comprende péptidos de unión al fibrinógeno que tienen diferente selectividad de unión al orificio "a" sobre el orificio "b" del fibrinógeno.
También se describe un agente que comprende una pluralidad de portadores, en el que cada portador tiene una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno unidos al portador, y en el que los péptidos de unión al fibrinógeno unidos a los portadores comprenden péptidos de unión al fibrinógeno de secuencia diferente.
En algunas realizaciones, la pluralidad de portadores comprende una primera pluralidad de portadores y una segunda pluralidad de portadores, en los que los péptidos de unión al fibrinógeno unidos a la primera pluralidad de portadores son de secuencia diferente a los péptidos de unión al fibrinógeno unidos a la segunda pluralidad de portadores.
En otras realizaciones, cada portador tiene péptidos de unión al fibrinógeno de secuencia diferente unidos al mismo.
El portador puede ser un portador soluble o insoluble, pero preferiblemente no es una plaqueta. El portador puede ser apropiado para la administración tópica en un sitio de tejido de un sujeto, por ejemplo, un sitio de herida sangrante o un sitio de mucosa. Los portadores solubles pueden ser apropiados para administración intravenosa en lugar de tópica. El portador puede comprender una proteína soluble o insoluble, un fármaco terapéutico, un polímero (por ejemplo, un polímero biocompatible, tal como polietilenglicol) o una combinación de cualquiera de estos. Ejemplos de portadores proteicos son una enzima o una proteína que no es una enzima, tal como la albúmina de suero humano.
Un portador insoluble puede ser una micropartícula (que incluye una micropartícula sólida, hueca o porosa, preferiblemente una micropartícula sustancialmente esférica). La micropartícula puede estar formada por cualquier sustancia apropiada, por ejemplo proteína reticulada. Una proteína apropiada es la albúmina (derivada de suero o recombinante, humana o no humana en secuencia) o gelatina. Las micropartículas apropiadas para su uso como portadores insolubles se pueden formar secando por pulverización albúmina de suero humano (HSA) usando una tecnología de secado por pulverización bien conocida, por ejemplo, como en el documento WO 92/18164. Las alternativas al uso de micropartículas como portadores incluyen liposomas, partículas de polímero sintético (tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico y ácido poli (láctico/glicólico)) o fragmentos de membrana celular.
Al menos la mayoría de los portadores pueden tener una dimensión máxima inferior a 6 |im. Esto puede ser preferido si los agentes son para administración intravenosa.
Alternativamente, al menos la mayoría de los portadores pueden tener una dimensión máxima superior a 6 |im. Esto puede ser preferido si los agentes son para administración tópica.
En teoría, no existe un límite superior para el número de péptidos de unión al fibrinógeno por molécula portadora. Es probable que el número óptimo dependa de muchos factores, tal como la naturaleza del portador y el número de grupos reactivos de cada portador para unir los péptidos de unión al fibrinógeno. Sin embargo, se prefiere que, en promedio, haya hasta 100 péptidos de unión al fibrinógeno por molécula portadora. Preferiblemente, en promedio hay al menos tres, preferiblemente al menos cuatro o cinco péptidos de unión al fibrinógeno por molécula portadora. Un intervalo preferido es de 10-20 péptidos de unión al fibrinógeno por molécula portadora.
El portador puede comprender grupos que permitan la unión de los péptidos de unión al fibrinógeno al portador. Por ejemplo, el portador puede comprender unidades estructurales de tiol o unidades estructurales de amina en su superficie. Si el portador es proteínico, las unidades estructurales de tiol o amina pueden ser proporcionadas por cadenas laterales de aminoácidos, por ejemplo cisteína o lisina. Se pueden agregar al portador grupos no peptídicos. Esto es particularmente ventajoso si el portador se forma a partir de una proteína, tal como HSA. Por ejemplo, se pueden agregar grupos tiol al portador usando reactivos tales como 2-iminotiolano (2-IT) que puede reaccionar con grupos amina primaria en el portador.
Los péptidos de unión al fibrinógeno de secuencia diferente pueden comprender un primer péptido de unión al fibrinógeno que se une preferentemente al orificio 'a' sobre el orificio 'b' del fibrinógeno, y un segundo péptido de unión al fibrinógeno que se une con mayor selectividad al orificio 'a' sobre el orificio 'b' del fibrinógeno que el primer péptido de unión al fibrinógeno. Se ha encontrado que tales dendrímeros peptídicos polimerizan el fibrinógeno rápidamente en un intervalo relativamente amplio de concentración de dendrímeros peptídicos.
Por ejemplo, el primer péptido de unión al fibrinógeno puede comprender una secuencia de aminoácidos GPRP-(SEQ ID NO:1) en su extremo amino terminal, y/o el segundo péptido de unión al fibrinógeno puede comprender una secuencia de aminoácidos -APFPRPG (SEQ ID NO: 14) en su extremo carboxi terminal, donde se indican los residuos de aminoácidos de las secuencias en orden de amino a carboxi, y "-" indica el extremo de la secuencia que está unida al núcleo ramificado del dendrímero peptídico o al portador. Un péptido de unión al fibrinógeno con la secuencia -APFPRPG (SEQ ID NO: 14) en su extremo carboxi terminal se une con mayor selectividad al orificio 'a' sobre el orificio 'b' del fibrinógeno que un péptido de unión al fibrinógeno con la secuencia GPRP-(SEQ ID NO: 1) en su extremo amino terminal.
En otras realizaciones, los péptidos de unión al fibrinógeno de secuencia diferente pueden comprender un primer péptido de unión al fibrinógeno que se une preferentemente al orificio 'a' sobre el orificio 'b' del fibrinógeno, y un segundo péptido de unión al fibrinógeno que se une preferentemente al orificio 'b' sobre el orificio 'a' de fibrinógeno. Se ha descubierto que tales dendrímeros peptídicos se polimerizan con fibrinógeno para formar hidrogeles relativamente densos en comparación con los dendrímeros peptídicos equivalentes que contienen solo péptidos de unión al fibrinógeno que se unen preferentemente al orificio "a" sobre el orificio "b" del fibrinógeno. Se cree que el aumento de la densidad de los hidrogeles formados se debe a la unión de los péptidos de unión al fibrinógeno de los dendrímeros al orificio "a" y al orificio "b" del fibrinógeno, fortaleciendo así la red del fibrinógeno polimerizado.
Por ejemplo, el primer péptido de unión al fibrinógeno puede comprender una secuencia de aminoácidos GPRP-(SEQ ID NO:1) en su extremo amino terminal y/o el segundo péptido de unión al fibrinógeno puede comprender una secuencia de aminoácidos GHRP-(SEQ ID NO: 10), o una secuencia de aminoácidos GHr Py -(SEQ ID NO: 11), en su extremo amino terminal. Los péptidos de unión al fibrinógeno con la secuencia GPRP-(SEQ ID NO: 1) en el extremo amino terminal se unen con cierta selectividad al orificio 'a' del fibrinógeno. Los péptidos de unión al fibrinógeno con la secuencia GHRP-(SEQ ID NO: 10) o GHRPY-(SEQ ID NO: 11), en el extremo amino terminal se unen preferentemente al orificio 'b' del fibrinógeno.
Uno o más, o cada uno de los péptidos de unión al fibrinógeno se pueden unir covalentemente al núcleo ramificado de un dendrímero peptídico de la invención mediante un enlazante no peptídico. El enlazante puede ser cualquier enlazante apropiado que no interfiera con la unión del fibrinógeno a los péptidos de unión al fibrinógeno del dendrímero peptídico. El enlazante puede comprender un enlazante de cadena lineal flexible, adecuadamente un grupo alquilo de cadena lineal. Tales enlazantes permiten que los péptidos de unión al fibrinógeno del dendrímero peptídico se extiendan entre sí. Por ejemplo, el enlazante puede comprender un grupo -NH(CH2)nCO-, donde n es cualquier número, adecuadamente 1-10, por ejemplo 5. Un enlazante que comprende un grupo -NH(CH2)5CO- se puede formar mediante el uso de ácido e-aminoácido 6-aminohexanoico (eAhx).
En teoría, no hay límite para el número total de péptidos de unión al fibrinógeno que pueden estar presentes en un dendrímero peptídico de la invención. Sin embargo, en la práctica, para cualquier estructura particular, el número de péptidos de unión al fibrinógeno se puede variar y probar para determinar el número óptimo para las propiedades deseadas de polimerización del fibrinógeno, por ejemplo, para la velocidad de polimerización del fibrinógeno o para la densidad del hidrogel producido por polimerización con fibrinógeno. Los dendrímeros peptídicos pueden comprender un total de hasta veinte péptidos de unión al fibrinógeno por dendrímero, por ejemplo, hasta diez péptidos de unión al fibrinógeno por dendrímero, o hasta cinco péptidos de unión al fibrinógeno por dendrímero.
El solicitante ha descubierto que, sorprendentemente, las mezclas de un dendrímero peptídico de la invención con un péptido conjugado, que comprenden dos o más péptidos de unión al fibrinógeno, pueden polimerizar el fibrinógeno más rápidamente que ya sea el dendrímero peptídico o el péptido conjugado, solo.
Según la invención, se proporciona una composición que comprende un dendrímero peptídico de la invención y un péptido conjugado que comprende dos o más péptidos de unión al fibrinógeno.
El péptido conjugado puede comprender péptidos de unión al fibrinógeno de la misma secuencia o de secuencia diferente. Por ejemplo, el péptido conjugado puede comprender solo péptidos de unión al fibrinógeno que se unen preferentemente al orificio 'a' sobre el orificio 'b' del fibrinógeno, o sólo péptidos de unión al fibrinógeno que se unen preferentemente al orificio 'b' sobre el orificio 'a' del fibrinógeno , o uno o más péptidos de unión al fibrinógeno que se unen preferentemente al orificio 'a' sobre el orificio 'b' del fibrinógeno y uno o más péptidos de unión al fibrinógeno que se unen preferentemente al orificio 'b' sobre el orificio 'a' del fibrinógeno.
El péptido conjugado puede comprender un portador al que se unen los péptidos de unión al fibrinógeno. Un portador apropiado puede comprender uno o más residuos de aminoácidos, por ejemplo, un único residuo de aminoácido, tal como un residuo de aminoácido de lisina. Una ventaja de los conjugados que comprenden portadores que comprenden uno o más residuos de aminoácidos es que se pueden preparar fácilmente usando métodos de síntesis de péptidos en fase sólida.
Cada péptido de unión al fibrinógeno del péptido conjugado puede, independientemente, estar unido en su extremo carboxi terminal (opcionalmente mediante un enlazante), o en su extremo amino terminal (opcionalmente mediante un enlazante), al portador. Si el péptido de unión al fibrinógeno está unido en su extremo amino terminal, el extremo carboxi terminal del péptido puede comprender un grupo amida.
En algunas realizaciones, el péptido conjugado puede ser un dendrímero peptídico de la invención.
Los péptidos de unión al fibrinógeno del dendrímero peptídico de una composición de la invención se pueden unir preferentemente al orificio 'a' del fibrinógeno sobre el orificio 'b' del fibrinógeno, y los péptidos de unión al fibrinógeno del péptido conjugado se pueden unir preferentemente al orificio 'b' del fibrinógeno sobre el orificio 'a' del fibrinógeno.
Se ha descubierto que tales composiciones tienen efectos sinérgicos porque son capaces de polimerizar fibrinógeno más rápidamente que ya sea el dendrímero peptídico o el péptido conjugado solo. El mecanismo de este efecto sinérgico no se comprende completamente, pero sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que puede ocurrir porque la composición proporciona más sitios de polimerización del fibrinógeno "A" y "B".
Alternativamente, los péptidos de unión al fibrinógeno del dendrímero peptídico de una composición de la invención se pueden unir preferentemente al orificio 'b' del fibrinógeno sobre el orificio 'a' del fibrinógeno, y los péptidos de unión al fibrinógeno del péptido conjugado se unen preferentemente al orificio 'a' del fibrinógeno sobre el orificio 'b' del fibrinógeno.
Según la invención, también se proporciona una composición farmacéutica, que comprende un dendrímero peptídico de la invención, o una composición de la invención, y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Los portadores, excipientes y diluyentes apropiados farmacéuticamente aceptables son bien conocidos para el experto en la técnica. Los portadores, excipientes y diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen los apropiados para la administración tópica con un dendrímero peptídico, o una composición, de la invención en el sitio de una herida. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables apropiados incluyen portadores, preferiblemente en forma fluida, tales como gelatina, fibrina, quitosano, fibronectina, colágeno, almidón, ácido hialurónico. Los diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables apropiados incluyen soluciones reguladoras, tales como soluciones reguladoras de Tris-HCl, acetato o fosfato, aditivos tales como detergentes o agentes solubilizantes (por ejemplo, Tween 80, Polisorbato 80), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservantes (por ejemplo, meta-cresol, parabenos (metilo, propilo, o butilo), clorobutanol, sales fenilmercúricas (por ejemplo, acetato, borato, nitrato), ácido sórbico, alcohol bencílico) y sustancias de carga (por ejemplo, lactosa , manitol), agentes de tonicidad (por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio), compuestos poliméricos, tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico.
Una ventaja particular de los dendrímeros peptídicos y las composiciones de la invención es que se pueden esterilizar fácilmente, por ejemplo, mediante exposición a irradiación, adecuadamente irradiación gamma, sin pérdida significativa de la capacidad del dendrímero peptídico, o composición, para polimerizar con fibrinógeno.
Según la invención, se proporciona un método de esterilización de un dendrímero peptídico de la invención, o una composición de la invención, que comprende exponer el dendrímero peptídico o la composición a irradiación gamma, preferiblemente hasta 30 kGy. El dendrímero peptídico o la composición puede estar en forma seca, húmeda o en disolvente.
Según la invención, también se proporciona un dendrímero peptídico de la invención, o una composición de la invención, que es estéril.
Los dendrímeros peptídicos, o composiciones, de la invención se pueden proporcionar ventajosamente como una formulación estéril lista para su uso, en particular, como una formulación hemostática o para el tratamiento de heridas estéril lista para su uso.
En algunas realizaciones, un dendrímero peptídico de la invención se puede formular en una pasta de gelatina fluida hidratada y empaquetarse en una jeringa que se puede irradiar para proporcionar un producto fluido estéril, listo para su uso.
Según la invención, también se proporciona un método de polimerización de fibrinógeno, que comprende poner en contacto fibrinógeno con un dendrímero peptídico de la invención, o con una composición de la invención.
La concentración relativa del dendrímero y el fibrinógeno usados para la polimerización dependerá de la naturaleza del dendrímero, por ejemplo, cuántos péptidos de unión al fibrinógeno están presentes y la secuencia de los péptidos de unión al fibrinógeno. El solicitante ha observado tiempos de polimerización rápidos usando dendrímeros peptídicos de la invención a concentraciones que varían desde 0.005 mg/ml a 2 mg/ml con niveles fisiológicos del fibrinógeno (3 mg/ml).
Para algunos dendrímeros peptídicos de la invención, a medida que aumenta la concentración del dendrímero, se reduce la velocidad de polimerización del fibrinógeno (es decir, el "tiempo de coagulación"). Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que esto se debe a la saturación de los orificios "a" y/o "b" de las moléculas del fibrinógeno por los péptidos de unión al fibrinógeno del dendrímero. A estas concentraciones más altas de dendrímero, hay un exceso de péptidos de unión al fibrinógeno que compiten por los orificios de unión del fibrinógeno libres (es decir, por los orificios vacíos 'a' y/o 'b'), y se cree que esta competencia reduce la velocidad a la que se produce la polimerización sitio.
También se proporciona según la invención un kit para la formación de un hidrogel, que comprende un dendrímero peptídico de la invención, o una composición de la invención y, por separado, fibrinógeno.
Se proporciona además según la invención un hidrogel que comprende un copolímero de un dendrímero peptídico de la invención, o de una composición de la invención, y fibrinógeno.
Los dendrímeros peptídicos y las composiciones de la invención se pueden usar como agentes hemostáticos, por ejemplo, para tratar hemorragias o para tratar una herida.
También se describe un método de tratamiento de hemorragias, o de tratamiento de una herida, que comprende administrar un dendrímero peptídico de la invención, un agente o una composición de la invención, en un sitio de hemorragia o en una herida.
El dendrímero, agente o composición de péptido puede polimerizar el fibrinógeno endógeno (es decir, el huésped) presente en el sitio del sangrado o de la herida. En algunas realizaciones, se puede administrar fibrinógeno exógeno así como el dendrímero peptídico, el agente o la composición de la invención en el sitio del sangrado o en la herida.
El término "fibrinógeno" se usa en este documento para incluir fibrinógeno natural, fibrinógeno recombinante o un derivado del fibrinógeno que se puede convertir mediante trombina para formar fibrina (por ejemplo, monómero de fibrina natural o recombinante, o un derivado de monómero de fibrina que puede o no ser capaz de ensamblarse espontáneamente). El fibrinógeno debería poder unirse al menos a dos péptidos de unión al fibrinógeno. El fibrinógeno se puede obtener de cualquier fuente y de cualquier especie (incluido el fibrinógeno bovino), pero preferiblemente es fibrinógeno humano. El fibrinógeno humano se puede obtener de sangre autóloga o de un donante. Se prefiere el fibrinógeno autólogo, o fibrinógeno recombinante, porque esto reduce el riesgo de infección cuando se administra a un sujeto.
Una cantidad apropiada del dendrímero peptídico para la administración a un sujeto humano dependerá, por ejemplo, del tipo de dendrímero, por ejemplo, cuántos péptidos de unión al fibrinógeno están presentes por molécula de dendrímero y del tipo y tamaño de la herida o sitio de sangrado. Sin embargo, una cantidad típica de dendrímero es de 0.1 ml a 50 ml, por ejemplo de 0.1 ml a 5 ml, o de 1 a 50 ml, de una preparación (por ejemplo, una preparación acuosa) que contiene el dendrímero en una concentración de 0.005 a 25 mg/ml.
Una cantidad apropiada del fibrinógeno exógeno para la administración a un sujeto humano es desde 0.1 mg a 200 mg, por ejemplo, de 3 mg a 200 mg.
Los dendrímeros peptídicos, agentes o composiciones de la invención se pueden proporcionar como un fluido para su administración directamente a una herida, o aplicarse a una esponja o tejido (por ejemplo, impregnado o recubierto), opcionalmente con fibrinógeno, antes de la aplicación. Alternativamente, los dendrímeros, agentes o composiciones de péptidos de la invención se pueden mezclar con una pasta fluida para su administración con una jeringa.
Según la invención, también se proporciona un dendrímero peptídico de la invención, o una composición de la invención, para su uso como medicamento.
Se proporciona además según la invención un dendrímero peptídico de la invención, o una composición de la invención, para su uso en el tratamiento de hemorragias o para su uso en el tratamiento de una herida.
También se describe el uso de un dendrímero peptídico de la invención, un agente o una composición de la invención, en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de hemorragias o para su uso en el tratamiento de una herida.
Los dendrímeros peptídicos, agentes y composiciones de la invención tienen varias ventajas importantes. En particular, en ciertas realizaciones, los dendrímeros peptídicos, agentes y composiciones se pueden fabricar fácilmente usando procedimientos convencionales de síntesis de péptidos en fase sólida. A concentraciones óptimas, los dendrímeros peptídicos, agentes y composiciones de la invención pueden polimerizar fibrinógeno, en ausencia de trombina, en menos de un segundo. Los dendrímeros peptídicos y los agentes de la invención también pueden polimerizar fibrinógeno en plasma humano en menos de un segundo.
La estructura de un dendrímero peptídico o agente de la invención se puede seleccionar para optimizar sus propiedades para el uso pretendido del dendrímero. Por ejemplo, un dendrímero peptídico que comprende cinco péptidos de unión al fibrinógeno de la misma secuencia que se unen preferentemente al orificio "a" del fibrinógeno es capaz de polimerizar el fibrinógeno casi instantáneamente. Por el contrario, un dendrímero peptídico 'quimérico' con uno o más péptidos de unión al fibrinógeno que se unen preferentemente al orificio 'a' del fibrinógeno, y uno o más péptidos de unión al fibrinógeno diferentes que se unen preferentemente al orificio 'b' del fibrinógeno, puede polimerizar el fibrinógeno más lentamente, pero forma hidrogeles de mayor densidad y tamaño.
Los dendrímeros peptídicos, agentes y composiciones de la invención se pueden esterilizar sin pérdida de la actividad de polimerización de fibrinógeno. Esta es una ventaja importante porque permite que los dendrímeros peptídicos, agentes y composiciones se proporcionen en formulaciones estériles, listas para su uso, por ejemplo, como formulaciones hemostáticas listas para su uso o para el tratamiento de heridas.
Las realizaciones de la invención se describen ahora solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos en los que:
La figura 1 muestra la capacidad de un dendrímero peptídico de una realización preferida para polimerizar fibrinógeno a concentraciones variables;
La figura 2 muestra la capacidad de varios dendrímeros peptídicos diferentes para polimerizar fibrinógeno a concentraciones variables. La numeración se refiere a la identidad del dendrímero peptídico;
La figura 3 muestra la capacidad de varios dendrímeros peptídicos diferentes para polimerizar fibrinógeno en concentraciones variables. La numeración se refiere a la identidad del dendrímero peptídico;
La figura 4 muestra la capacidad de varios dendrímeros peptídicos diferentes para polimerizar fibrinógeno a concentraciones variables. La numeración se refiere a la identidad del dendrímero peptídico;
La figura 5 muestra una fotografía de hidrogeles formados por polimerización del fibrinógeno usando diferentes dendrímeros peptídicos de la invención;
La figura 6 muestra la capacidad de diferentes combinaciones de dendrímeros peptídicos de la invención con conjugados de péptidos para polimerizar fibrinógeno a concentraciones variables; y
La figura 7 muestra la capacidad de varios dendrímeros peptídicos diferentes de la invención para polimerizar fibrinógeno en plasma humano.
Ejemplo 1
Síntesis de dendrímeros peptídicos y péptidos conjugados
Los péptidos se sintetizaron en resina Rink amida MBHA de baja carga (Novabiochem, 0.36 mmol/g), mediante síntesis de péptidos Fmoc estándar, usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Novabiochem).
En general, se usaron ciclos de acoplamiento único a lo largo de la síntesis y se empleó la química de activación de HBTU (se usaron HBTU y PyBOP (de AGTC Bioproducts) como agentes de acoplamiento). Sin embargo, en algunas posiciones el acoplamiento fue menos eficiente de lo esperado y se requirieron acoplamientos dobles.
Los péptidos se ensamblaron usando un sintetizador de péptidos automático y HBTU hasta los puntos de ramificación y mediante síntesis manual de péptidos usando PyBOP para las ramificaciones de péptidos.
Para la síntesis automatizada, se usó un exceso de tres veces de aminoácido y HBTU para cada acoplamiento y un exceso de nueve veces de diisopropiletilamina (DIPEA, Sigma) en dimetilformamida (d Mf , Sigma).
Para la síntesis manual se usó un exceso de tres veces de aminoácido y PyBOP para cada acoplamiento y un exceso de nueve veces de DIPEA en N-metilpirrolidinona (NMP, Sigma).
La desprotección (eliminación del grupo Fmoc) de la cadena peptídica en crecimiento usando piperidina al 20% (Sigma) en DMF puede no ser siempre eficaz y requerir una doble desprotección.
Se prepararon ramificaciones usando Fmoc-Lys (Fmoc)-OH, Fmoc-Lys (Boc)-OH, o Fmoc-Lys (Mtt)-OH.
La desprotección final y la escisión del péptido del soporte sólido se realizó mediante el tratamiento de la resina con TFA al 95% (Sigma) que contenía triisopropilsilano (TIS, Sigma), agua y anisol (Sigma) (1:1:1, 5%) durante 2-3 horas. El péptido escindido se precipitó en éter dietílico frío (Sigma), se peletizó mediante centrifugación y se liofilizó. Las pellas se volvieron a disolver en agua (10-15 mL), se filtró y se purificó mediante HPLC de fase inversa usando una columna C-18 (Phenomenex a una velocidad de flujo de 20 ml/min) y un gradiente de acetonitrilo/agua que contenía TFA al 0.1%. El producto purificado se liofilizó y analizó mediante ESI-LC/MS y HPLC analítica y se demostró que era puro (> 95%). Todos los resultados de masa coincidieron con los valores calculados.
Dendrímeros peptídicos y conjugados peptídicos
Las estructuras de dendrímeros peptídicos y conjugados peptídicos sintetizados usando los métodos descritos anteriormente se muestran a continuación.
El grupo "NH2-" al final de una secuencia de péptidos indica un grupo amino en el extremo amino terminal de la secuencia. El grupo "-am" al final de una secuencia peptídica indica un grupo amida en el extremo carboxi terminal de la secuencia.
Péptido conjugado No: 1:
Figure imgf000015_0001
Péptido conjugado No. 2:
Figure imgf000015_0002
Dendrímero peptídico No. 3:
Figure imgf000016_0001
Dendrímero peptídico No. 4:
Figure imgf000016_0002
Dendrímero peptídico No. 5:
Figure imgf000017_0001
Dendrímero peptídico No. 8:
Figure imgf000017_0002
Dendrímero peptídico No. 9:
Figure imgf000018_0001
Dendrímero peptídico No. 10:
Figure imgf000018_0002
Dendrímero peptídico No. 11:
Ċ
Figure imgf000019_0001
Dendrímero peptídico No. 12:
Ċ
Figure imgf000020_0001
Dendrímero peptídico No. 13:
Figure imgf000021_0001
Copolimerización de un dendrímero peptídico con fibrinógeno
El dendrímero No. 12 comprende un núcleo ramificado con cinco residuos de lisina consecutivos. Los residuos de lisina están unidos covalentemente a través de una cadena lateral de un residuo de lisina adyacente.
Se evaluó la capacidad del dendrímero peptídico No. 12 para polimerizar fibrinógeno. Se agregaron 30 |il de dendrímero en solución, a una concentración que variaba desde 0.005 a 2 mg/ml, a 100 |il del fibrinógeno humano purificado a 3 mg/ml (el nivel del fibrinógeno encontrado en la sangre). La polimerización del fibrinógeno se analizó usando un analizador de coagulación Sigma Amelung KC4 Delta. La figura 1 muestra un gráfico de los tiempos de polimerización (coagulación) (en segundos) con una concentración creciente de dendrímero.
Los resultados muestran que el dendrímero fue capaz de copolimerizar con fibrinógeno casi instantáneamente, incluso a concentraciones muy bajas de dendrímero. Se cree que el aumento del tiempo de coagulación con concentraciones de dendrímero por encima de 0.5 mg/ml se explica por un exceso de péptidos de unión al fibrinógeno en comparación con el número de bolsillos de unión libres en el fibrinógeno. A concentraciones más altas, los péptidos de unión al fibrinógeno del dendrímero pueden saturar los bolsillos de unión de fibrinógeno, dando como resultado un número significativo de moléculas de dendrímero en exceso que no son capaces de copolimerizar con fibrinógeno.
Ejemplo 3
Efecto de la variación del número de péptidos de unión al fibrinógeno por dendrímero sobre la velocidad de copolimerización con fibrinógeno
Este ejemplo investiga el efecto de variar el número de péptidos de unión al fibrinógeno por dendrímero de péptido sobre la velocidad de copolimerización con fibrinógeno.
Se evaluó la capacidad del dendrímero peptídico Nos. 4, 5, 10, 11 y 12 para copolimerizar con fibrinógeno usando el mismo método descrito en el ejemplo 2. La concentración de cada dendrímero se varió desde 0.005 a 0.5 mg/ml. La figura 2 muestra un gráfico de los tiempos de coagulación (en segundos) con una concentración creciente de cada dendrímero diferente.
Los resultados muestran que el dendrímero No. 5 (con sólo dos péptidos de unión al fibrinógeno/dendrímero) no pudo copolimerizar con fibrinógeno. A medida que el número de péptidos de unión al fibrinógeno se incrementó de tres a cinco, a concentraciones de dendrímero desde ~ 0.125 a ~ 0.275 mg/ml, aumentó la velocidad de copolimerización. A concentraciones por debajo de ~0.125 mg/ml de dendrímero, el dendrímero No. 10 (con tres péptidos de unión al fibrinógeno/dendrímero) produjo tiempos de coagulación más rápidos que el dendrímero No. 4 (con cuatro péptidos de unión al fibrinógeno/dendrímero). En el intervalo de ~0.02-0.5 mg/ml, el dendrímero No. 12 (con cinco péptidos de unión al fibrinógeno/dendrímero) produjeron una coagulación casi instantánea. En el intervalo de ~0.05-0.3 mg/ml, el dendrímero no. 11 (con cuatro péptidos de unión al fibrinógeno/dendrímero) también produjo una coagulación casi instantánea.
Se concluye que la velocidad a la que se polimeriza el fibrinógeno por un dendrímero de la invención generalmente aumenta a medida que aumenta el número de péptidos de unión al fibrinógeno por dendrímero.
Ejemplo 4
Efecto de la orientación del péptido de unión al fibrinógeno y de las diferentes secuencias del péptido de unión al fibrinógeno sobre la velocidad de copolimerización con el fibrinógeno
Para evaluar si la orientación de un péptido de unión al fibrinógeno podría afectar a la capacidad de un dendrímero peptídico para copolimerizar con fibrinógeno, se sintetizaron dendrímeros peptídicos que comprenden tres péptidos de unión al fibrinógeno unidos a un único residuo de aminoácido trifuncional (lisina) (denominados dendrímeros de "tres ramas"), pero con uno de los péptidos de unión al fibrinógeno orientado con su extremo amino terminal unido al núcleo ramificado, y amidado en su extremo carboxi terminal. También se ensayó la capacidad de los dendrímeros peptídicos que comprenden diferentes secuencias de péptidos de unión al fibrinógeno para copolimerizar con fibrinógeno.
Los péptidos de unión al fibrinógeno de los dendrímeros peptídicos Nos. 3 y 10 son cada uno de secuencia GPRPG (SEQ ID NO: 15). Cada péptido de unión al fibrinógeno del dendrímero peptídico No. 10 está orientado con su extremo carboxi terminal unido al núcleo ramificado. Uno de los péptidos de unión al fibrinógeno del dendrímero peptídico No.
3 está orientado con su extremo amino terminal unido al núcleo ramificado. El extremo carboxi terminal de ese péptido comprende un grupo amida.
Dos de los péptidos de unión al fibrinógeno del dendrímero peptídico No. 8 son de secuencia GPRPG (SEQ ID NO: 15), y el tercer péptido de unión al fibrinógeno es de secuencia APFPRPG (SEQ ID NO: 14) orientado con su extremo amino terminal unido al núcleo ramificado. El extremo carboxi terminal de ese péptido comprende un grupo amida.
Dos de los péptidos de unión al fibrinógeno del dendrímero peptídico No. 9 son de secuencia GPRPFPA (SEQ ID NO: 3), y el tercer péptido de unión al fibrinógeno es de secuencia APFPRPG (SEQ ID NO: 14) orientado con su extremo amino terminal unido al núcleo ramificado. El extremo carboxi terminal de ese péptido comprende un grupo amida.
La secuencia GPRPG (SEQ ID NO: 15) se une al orificio "a" y al orificio "b" del fibrinógeno, pero con cierta preferencia por el orificio "a". La secuencia GPRPFPA (SEQ ID NO: 3) se une con alta preferencia por el orificio 'a' en el fibrinógeno. La secuencia Pro-Phe-Pro estabiliza esqueleto de la cadena peptídica y mejora la afinidad de la interacción del botónorificio (Stabenfeld et al., BLOOD, 2010, 116: 1352-1359).
Se evaluó la capacidad de los dendrímeros para copolimerizar con fibrinógeno usando el mismo método descrito en el ejemplo 2, para una concentración de cada dendrímero que variaba desde 0.005 a 0.5 mg/ml. La figura 3 muestra un gráfico de los tiempos de coagulación (en segundos) obtenidos con una concentración creciente de cada dendrímero diferente.
Los resultados muestran que cambiar la orientación de uno de los péptidos de unión al fibrinógeno de un dendrímero de tres ramas, de modo que el péptido esté orientado con su extremo amino terminal unido al núcleo ramificado (es decir, el dendrímero No. 3), redujo la capacidad del dendrímero para copolimerizar con fibrinógeno (se compara el tiempo de coagulación del dendrímero No. 3 con el del dendrímero No. 10). Sin embargo, a concentraciones más altas de fibrinógeno, el dendrímero No. 3 pudo copolimerizar con fibrinógeno (datos no mostrados).
Un dendrímero de tres ramas con un péptido de unión al fibrinógeno de secuencia diferente orientado con su extremo amino terminal unido al núcleo ramificado fue capaz de copolimerizar con fibrinógeno (véanse los resultados para el dendrímero No. 8).
Un dendrímero de tres ramas en el que dos de los péptidos de unión al fibrinógeno comprenden una secuencia que se une preferentemente al orificio 'b' en el fibrinógeno (secuencia GPRPFPA (SEQ ID NO: 3)), con estos péptidos orientados con su extremo carboxi terminal unido al núcleo ramificado, y el otro péptido que comprende la secuencia inversa (es decir, secuencia APFPRPG (SEQ ID NO: 14)) orientada con su extremo amino terminal unido al núcleo ramificado (Dendrímero No. 9) también fue muy activo en la copolimerización con fibrinógeno.
Ejemplo 5
Capacidad de dendrímeros peptídicos con diferentes secuencias de péptidos de unión al fibrinógeno para copolimerizar con fibrinógeno
Los motivos GPRPG (SEQ ID NO: 15) y GPRPFPA (SEQ ID NO: 3) se unen principalmente al orificio "a" del fibrinógeno. Este ejemplo describe una evaluación de la capacidad de un dendrímero peptídico quimérico (es decir, un dendrímero peptídico con diferentes secuencias peptídicas de unión a fibrinógeno unidas al mismo núcleo ramificado) para copolimerizar con fibrinógeno.
El dendrímero peptídico No. 13 es un dendrímero peptídico quimérico de cuatro ramas que comprende dos péptidos de unión al fibrinógeno con secuencia GPRPG-(SEQ ID NO: 15) (que tiene una preferencia de unión por el orificio 'a'), y dos péptidos de unión al fibrinógeno con secuencia GHRPY-(SEQ ID NO: 11) (que se une preferentemente al orificio 'b'). Los dendrímeros peptídicos no quiméricos Nos. 11 y 12 son dendrímeros peptídicos de cuatro y cinco ramas, respectivamente. Cada péptido de unión al fibrinógeno de estos dendrímeros tiene la secuencia GPRPG-(SEQ ID NO: 15). Cada péptido de unión al fibrinógeno de los dendrímeros Nos. 11, 12 y 13 está unido en su extremo carboxi terminal al núcleo ramificado.
Se evaluó la capacidad de los dendrímeros para copolimerizar con fibrinógeno usando el mismo método descrito en el ejemplo 2, para una concentración de cada dendrímero que variaba desde 0.005 a 0.5 mg/ml. La figura 4 muestra un gráfico de los tiempos de coagulación (en segundos) obtenidos con una concentración creciente de cada dendrímero diferente.
Los resultados muestran que la velocidad de coagulación usando el dendrímero quimérico fue más lenta que la de los dendrímeros no quiméricos a concentraciones por debajo de 0.3 mg/ml. Sin embargo, la figura 5 muestra una fotografía de los hidrogeles obtenidos con los diferentes dendrímeros. Los geles se marcan con el número del dendrímero peptídico usado (11, 12 y 13), y "P" marca un hidrogel formado usando un producto en el que varios péptidos de unión al fibrinógeno están unidos a albúmina de suero humano soluble. El hidrogel formado por el dendrímero quimérico era más denso y contenía menos líquido en comparación con los hidrogeles formados usando los dendrímeros Nos. 11 y 12 (a 3 mg/ml de fibrinógeno, o a concentraciones más altas de fibrinógeno). De este modo, aunque el tiempo de coagulación fue más lento usando el dendrímero quimérico, el hidrogel formado usando este dendrímero fue más denso.
Ejemplo 6
Capacidad de mezclas de dendrímeros peptídicos y péptidos conjugados para copolimerizar con fibrinógeno
El péptido de unión al fibrinógeno de secuencia GPRP-(SEQ ID NO: 1) se une fuerte y preferentemente al orificio "a" del fibrinógeno (Laudano et al., 1978 PNAS 7S). El péptido conjugado No. 1 comprende dos péptidos de unión al fibrinógeno con esta secuencia, cada uno unido a un residuo de lisina. El primer péptido se une en su extremo carboxi terminal mediante un enlazante al residuo de lisina, y el segundo péptido se une en su extremo amino terminal mediante un enlazante al residuo de lisina. El extremo carboxi terminal del segundo péptido comprende un grupo amida.
El péptido de unión al fibrinógeno de secuencia GHRPY-(SEQ ID NO: 11) se une fuerte y preferentemente al orificio 'b' del fibrinógeno (Doolittle and Pandi, Biochemistry 2006, 45, 2657-2667). El péptido conjugado No. 2 comprende un primer péptido de unión al fibrinógeno con esta secuencia, unido en su extremo carboxi terminal mediante un enlazante a un residuo de lisina. Un segundo péptido de unión al fibrinógeno, que tiene la secuencia inversa (YPRHG (SEQ ID NO: 16)), está unido en su extremo amino terminal mediante un enlazante al residuo de lisina. El extremo carboxi terminal del segundo péptido comprende un grupo amida.
El enlazante permite que los péptidos se extiendan unos de otros.
Se mezcló el péptido conjugado No. 1 o 2 (2 mg/ml) con dendrímero peptídico No. 3 o 4 y fibrinógeno, y se evaluó la capacidad de las mezclas para copolimerizar con fibrinógeno usando el mismo método descrito en el ejemplo 2, para una concentración de cada dendrímero que oscila entre 0.025 y 0.5 mg/ml. La figura 6 muestra un gráfico de los tiempos de coagulación (en segundos) obtenidos con una concentración creciente de cada dendrímero diferente.
Los resultados muestran que, sorprendentemente, solo las mezclas que contienen el péptido conjugado No. 2 (es decir, con los péptidos del botón B) y los dendrímeros peptídicos eran sinérgicas y aumentaban la actividad, mientras que las mezclas que contenían el péptido conjugado No. 1 (los péptidos de botón A) no estaban activos cuando se agregaron ya sea al péptido conjugado No. 2 o los dendrímeros peptídicos.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un dendrímero peptídico que comprende un núcleo ramificado y una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno unidos covalentemente por separado al núcleo ramificado, en el que el núcleo ramificado comprende ya sea: de dos a diez residuos de aminoácidos multifuncionales, en los que cada péptido de unión al fibrinógeno está unido covalentemente por separado a un residuo de aminoácidos multifuncional del núcleo ramificado;
una pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales, en los que uno o más péptidos de unión al fibrinógeno están unidos covalentemente por separado a cada uno de al menos dos residuos de aminoácidos multifuncionales adyacentes del núcleo ramificado;
una pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales, en los que dos o más péptidos de unión al fibrinógeno están unidos covalentemente por separado a al menos uno de los residuos de aminoácidos multifuncionales del núcleo ramificado;
una pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales, en los que dos o más residuos de aminoácidos multifuncionales están unidos covalentemente a través de una cadena lateral de un residuo de aminoácidos multifuncional adyacente; o
un único residuo de aminoácido multifuncional, y un péptido de unión al fibrinógeno se une covalentemente por separado a cada grupo funcional del residuo de aminoácido multifuncional;
en el que los residuos de aminoácidos multifuncionales comprenden residuos de aminoácidos tri- o tetrafuncionales, o son residuos de aminoácidos tri- y tetrafuncionales, o el único residuo de aminoácidos multifuncional es un residuo de aminoácido tri- o tetrafuncional;
en el que los residuos de aminoácidos trifuncionales comprenden un átomo de carbono central que lleva un grupo amino, un grupo carboxilo y una cadena lateral que lleva un grupo funcional adicional, y los residuos de aminoácidos tetrafuncionales comprenden un átomo de carbono central que lleva un grupo amino, un grupo carboxilo y una cadena lateral que lleva otros dos grupos funcionales.
2. El dendrímero peptídico según la reivindicación 1, en el que el núcleo ramificado comprende una pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales consecutivos y preferiblemente hasta diez residuos de aminoácidos multifuncionales.
3. El dendrímero peptídico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, de la siguiente fórmula general (I):
FBP-(enlazante)-X-(enlazüiite)-Y
I
Z
(I)
dónde:
FBP es un péptido de unión al fibrinógeno;
-(enlazante)- es un enlazante opcional, preferiblemente un enlazante no peptídico;
X es un residuo de aminoácido trifuncional, preferiblemente un residuo de lisina, ornitina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina o cisteína;
Y es -FBP o -NH2;
Z es -(enlazante)-FBP cuando Y es -FBP, o -[-Xn-(enlazante)-FBP]a-(enlazante)-FBP cuando Y es -NH2, o -[-Xn-(enlazante)-FBP]a-(enlazante)-FBP cuando Y es -FBP;
dónde:
Xn es un residuo de aminoácido trifuncional, preferiblemente un residuo de lisina, ornitina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina o cisteína; y
a es 1-10, preferiblemente 1-3.
4. El dendrímero peptídico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, de la siguiente fórmula general (II): FBP-(enlazante} -NH-CH-CO-(enlazante J-Y
z i
{II)
dónde:
FBP es un péptido de unión al fibrinógeno;
-(enlazante)- es un enlazante opcional, que preferiblemente comprende -NH(CH2)5CO-;
Y es -FBP o -NH2;
Z es:
-R-(enlazante)-FBP, cuando Y es -FBP, o
-R-CO C H N H-(e 111 a za nt e }-FBP
R-(enlaza nte}-FBP.
cuando Y es -NH2 ; o
R-COCHNhMenlazaiitel-FBP
NH-ienlaza lite}-FBP
Figure imgf000029_0001
enlazante} -FBP,
cuando Y es -NH2 ; o
R-COCHNH-(enlazante) - FBP
I
R-COCHNH-{enlazante) - FBP
I
R-COCHNPMenlazante} - FBP
R.(enlazante} - FBP,
cuando Y es -NH2 ; o
(en lazante) - FBP]a
Figure imgf000029_0002
zante} - FBP,
cuando Y es -FBP y a es 1-10, preferiblemente 1-3 donde R es -(CH2)4NH-, -(CH2)aNH-, o -(CH2)aNHCNHNH.
5. El dendrímero peptídico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, de la siguiente fórmula general (III): FB P- {enlüZünte}-NH-CH-CO-(enlazante}-Y
]
2
(III)
dónde:
FBP es un péptido de unión al fibrinógeno;
-(enlazante)- es un enlazante opcional, que preferiblemente comprende -NH(CH2)5CO-;
Y es -FBP o -NH2;
Z es:
-(CH2)4NH-(enlazante)-FBP, cuando Y es -FBP; o
'(CHs^NHCÜCHNH-(enlazante) - FBP
(CH£}4 NH-(enlaiante)-FBP,
cuando Y es -NH2 ; o
Figure imgf000030_0001
cuando Y es -NH2 ; o
(CH^NHCOCHNH-ienlazante) - FBP
I
(CH.^NHCOCHNH-íenlazante} - FBP
I
(CH2)„NHCOCHNH-{enlazante} - FBP
I
(CH?)iNH-(enlazante} - FBP,
cuando Y es -NH2 ; o
-[-(CH2)4NHCOCHNH-{enlazante}-FBP]a
(C H 2)4 NH-{e 11 lazante} -FBP;
cuando Y es -FBP y a es 1-10, preferiblemente 1-3.
6. El dendrímero peptídico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada péptido de unión al fibrinógeno está unido al núcleo ramificado mediante un enlazante no peptídico.
7. El dendrímero peptídico según la reivindicación 6, en el que el enlazante comprende un enlazante de cadena lineal, preferiblemente un grupo alquilo de cadena lineal, y más preferiblemente -NH(CH2)nCO-, donde n es 1-10.
8. Una composición que comprende el dendrímero peptídico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un péptido conjugado que comprende dos o más péptidos de unión al fibrinógeno.
9. Una composición farmacéutica, que comprende el dendrímero peptídico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o la composición según la reivindicación 8, y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
10. Un método de esterilización del dendrímero peptídico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o la composición según la reivindicación 8, que comprende exponer el dendrímero peptídico o la composición a irradiación gamma, preferiblemente hasta 30 kGy.
11. Un método de polimerización de fibrinógeno, que comprende poner en contacto fibrinógeno con el dendrímero peptídico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o con la composición según la reivindicación 8.
12. Un kit para la formación de un hidrogel, que comprende el dendrímero peptídico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o la composición según la reivindicación 8, y, por separado, fibrinógeno.
13. Un hidrogel que comprende un copolímero del dendrímero peptídico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o de la composición según la reivindicación 8, y fibrinógeno.
14. El dendrímero peptídico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o la composición según la reivindicación 8, para su uso como medicamento.
15. El dendrímero peptídico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o la composición según la reivindicación 8, para su uso en el tratamiento de hemorragias o para su uso en el tratamiento de una herida.
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