KR102410065B1 - 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 펩타이드 덴드리머 - Google Patents

피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 펩타이드 덴드리머 Download PDF

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Abstract

피브리노겐을 중합하고 지혈제로서 사용될 수 있는 펩타이드 덴드리머 및 제제가 기재된다. 펩타이드 덴드리머는 분지된 코어, 및 분지된 코어에 별도로 공유적으로 부착된 복수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함한다. 분지된 코어는: i) 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드가 상기 분지된 코어의 다작용성 아미노산 잔기에 별도로 공유적으로 부착되는, 2 내지 10개의 다작용성 아미노산 잔기; il) 하나 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드가 상기 분지된 코어의 각각의 적어도 2개의 인접한 다작용성 아미노산 잔기에 별도로 공유적으로 부착되는 복수의 다작용성 아미노산 잔기; Hi) 2 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드가 상기 분지된 코어의 상기 다작용성 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 별도로 공유적으로 부착되는, 복수의 다작용성 아미노산 잔기; iv) 2 이상의 다작용성 아미노산 잔기가 인접한 다작용성 아미노산 잔기의 측쇄를 통해 공유적으로 연결되는, 복수의 다작용성 아미노산 잔기; 또는 y) 단일의 다작용성 아미노산 잔기(피브리노겐-결합 펩타이드는 상기 다작용성 아미노산 잔기의 각각의 작용기에 별도로 공유적으로 부착됨)를 포함한다. 다작용성 아미노산 잔기는 3- 또는 4-작용성 아미노산 잔기, 또는 3- 및 4-작용성 아미노산 잔기를 포함하거나, 또는 상기 단일의 다작용성 아미노산 잔기는 3- 또는 4-작용성 아미노산 잔기이다.

Description

피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 펩타이드 덴드리머{PEPTIDE DENDRIMERS COMPRISING FIBRINOGEN-BINDING PEPTIDES}
본 발명은 펩타이드 덴드리머 및 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 제제, 펩타이드 덴드리머 또는 제제를 포함하는 조성물, 및 피브리노겐을 중합하기 위한 그리고 지혈제로서 그들의 용도에 관한 것이다.
불용성 피브린 중합체의 그의 가용성 전구체 피브리노겐으로부터의 형성은 혈액 응고의 최종 단계이다. 피브리노겐의 피브린으로의 전환은 3단계로 일어난다: 트롬빈에 의한 피브리노겐의 피브린 단량체로의 제한된 단백질분해; 피브린 단량체의 절반의 엇갈린, 이중-가닥 원섬유 내로의 조립; 및 혈병을 단단하게 하는 조립된 피브린의 가교.
피브리노겐 분자는 이황화 결합에 의해 함께 연결된 3쌍의 동일하지 않은 폴리펩타이드 쇄인 Aα, Bβ 및 γ로 이루어진다. 피브리노겐 쇄는 3개의 별도의 구조적 영역으로 폴딩되며, 2개의 원위 D 영역은 하나의 중심 E 영역에 연결된다. 각각의 D 영역은 각각 γ 및 Bβ 쇄의 C 말단에 위치된 중합 'a' 및 'b' 홀(hole)을 함유한다. 트롬빈은 중심 E 영역에서 피브리노겐의 Aα 및 Bβ쇄의 아미노-말단으로부터 짧은 펩타이드인 피브리노펩타이드 A(FpA) 및 B(FpB)의 제거를 각각 촉매하여, 2개의 중합 부위("노브(knob) A"(아미노-말단의 서열 Gly-Pro-Arg-를 지님); 및 "노브 B"(아미노-말단의 서열 Gly-His-Arg-을 지님))를 노출시킨다. 하나의 피브린 단량체의 새로 노출된 중합 노브는 'A-a' 및 'B-b' 노브-홀 상호작용을 통해 다른 피브린 단량체의 대응하는 홀과 상호작용하여, 피브린 단량체의 절반의 엇갈린, 이중-가닥 원섬유 내로의 조립을 초래한다.
원섬유는 측면이 응집되어 더 두꺼운 섬유를 생성하는데, 이는 피브린 혈병의 3차원 네트워크를 형성하기 위해 응집된다. FpA는 피브리노겐으로부터 FpB보다 더 빠르게 절단된다. FpA의 제거는 원섬유의 형성을 촉발하는 한편, FpB의 제거는 그들의 측면 응집과 동시에 일어난다. 반응의 시작 시 매우 느린 FpB 방출은 중합체 형성 시 가속화된다. FpB 절단에서의 이런 지연은 정상 피브린 조립체에 대해 필수적이며, 또한 상이한 유형의 혈병의 형성과 관련된다. FpA만이 제거되는 피브린 I는 덜 빽빽하며, 플라스민에 의해 더 용이하게 분해되는 반면, FpA와 FpB가 둘 다 제거되는 피브린 II는 더 빽빽하고, 섬유소 용해에 대해 더 저항성이 있다.
FpA만을 또는 원칙적으로 FpB를 제거하는 사독 효소를 이용하는 연구는 피브린 혈병이 'A-a' 또는 'B-b' 상호작용 중 하나에 의해 형성될 수 있다는 것을 입증하였는데, 상호작용은 둘 다 원섬유 형성을 매개할 수 있다는 것을 나타낸다. 변이체 재조합 피브리노겐에 의한 실험은 'A-a' 상호작용이 약화될 때 'B-b' 상호작용이 원섬유 형성에서 실질적인 역할을 할 수 있다는 것을 나타내었다. 다른 연구는 'B' 노브와 'b' 홀을 둘 다 이용가능할 때조차 피브리노겐 분자에 대한 피브린 단편의 결합 동안 'A-a' 상호작용만이 일어난다는 것과, 'A-a' 상호작용이 제외될 때에만 'B-b' 노브-홀 상호작용이 명확하다는 것을 입증하였다. 그러나, 펩타이드 저해 연구는 'B-b' 상호작용이 'A-a'와 동시에 일어날 수 있다는 것을 나타내었다.
피브린은 피브린 섬유 내 상이한 분자의 측쇄 사이에서 공유 결합의 형성에 의해 안정화된다. 펩타이드 결합은 인자 XIIIa에 의해 촉매되는 아미노기 전이 반응에서 특이적 글루타민과 라이신 측쇄 사이에 형성된다.
피브린 조직 접착제(fibrin tissue adhesive: FTA)는 피브린 혈병을 형성하기 위한 응고 캐스케이드의 마지막 단계를 모방함으로써 형성되는 생성물에 대해 주어진 명칭이다. 상업적으로 입수가능한 FTA 키트는 지혈, 약물 전달용으로, 그리고 수술용 접착제, 및 조직 접합제로서 사용되는 강한 생분해성 겔을 빠르게 생성한다. 피브리노겐, 인자 XIII, 트롬빈 및 칼슘 이온은 전형적으로 저장 동안 칼슘 이온과 트롬빈으로부터 피브리노겐과 인자 XIII를 분리시키는 주사기 장치를 통해 전달된다. 주사기로부터의 방출 동안 구성성분의 혼합은 피브리노겐의 트롬빈 용해(thrombinolysis)를 야기하여 피브린을 생성하는데, 이는 칼슘 이온-활성화된 인자 XIII에 의해 이후에 가교되는 겔로 자기 조립된다.
전통적인 FTA는 그것이 바로 사용가능한 형태로 공급되지 않는다는 단점을 가지며, 따라서 FTA의 구성성분은 상처에 대한 도포 전에 혼합되어야 한다. 일단 구성성분이 혼합되면, FTA는 단시간 내에 사용되어야 한다. 사용 직전에 혼합물을 제조하기 위한 필요는, 예를 들어 생성물이 응급상황에 필요하다면, 특히 불리할 수 있다.
다수의 FTA는 소 항원, 특히 소 인자 V로 오염된 소 트롬빈을 이용한다. 이 항원에 대해 생성된 항체는 인간 인자 V와 상호작용하고, 생명을 위협하는 출혈, 일부 경우에 과민증 및 사망을 야기할 수 있다. 인간 트롬빈은 이들 위험을 최소화하는 노력에서 공여체의 풀링된 혈장으로부터 단리되었지만, 혈액 매개 병원체, 특히 바이러스를 수송하기 위한 잠재력을 가진다. 재조합 인간 트롬빈이 개발되었고, 미국 식품 의약국(FDA)에 의해 사용을 위한 승인을 받았다. 이는 최소로 항원성인 이점을 가지며, 바이러스 전염 위험을 운반하지 않는다. 그러나, 이는 유전자 변형된 중국 햄스터 난소 세포주를 이용하여 제조되며, 따라서 생산하는 것이 상대적으로 비싸다.
정제된 소, 및 재조합 인간 트롬빈 제제는 사용 전에 식염수에 의해 재구성되어야 하는 분말로서 실온에서 저장된다. FDA-승인된 정제된 인간 트롬빈은 용액으로서 패키징되지만, 이는 실온에서 24시간까지 동안만 저장될 수 있고; 장기간 저장은 냉동을 필요로 한다(Lew and Weaver, Biologics: Targets & Therapy 2008:2(4) 593-599). 트롬빈을 이용하는 것의 추가적인 이점은 효소가 피브리노겐을 피브린으로 전환하는데 시간이 걸리며, 따라서 혈액 응고가 가속화되기 전에 지연된다는 것이다.
전통적인 FTA는 또한 매우 다량의 피브리노겐을 사용한다. 다른 지혈제는 혈병 형성의 촉진을 위한 환자 자신의 피브리노겐에 의존한다. "플로실(FLOSEAL)"로 칭해지는 지혈제 기질은 소-유래 젤라틴 기질, 인간 유래 트롬빈 및 염화칼슘의 혼합물로 이루어진다. 트롬빈은 냉동 건조 형태로 제공되고, 염화칼슘 용액 중에서 용해되어야 하며, 이어서, 사용 전에 젤라틴 기질과 혼합된다. 생성물은 제조 8시간 이내에 사용되어야 한다. 또한 사용 직전에 혼합물을 제조할 필요는, 예를 들어, 생성물이 응급 상황에서 필요하다면 특히 불리할 수 있다.
WO 2008/065388은 트롬빈이 없을 때 피브리노겐을 중합할 수 있는 제제를 사용하는 바이오겔의 형성을 기재한다. 제제는 가교제 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC)를 이용하는 가용성 인간 혈청 알부민(HSA) 담체에 컨쥬게이션된 몇몇 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함한다. 미국 특허 제2012/0114682호는 피브린 중합체를 형성하는 피브린 노브의 펩타이드의 컨쥬게이트의 용도 및 상처 수선에서 그들의 용도를 기재한다. 이 문헌은 또한 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 부착된 피브리노겐-결합 펩타이드 GPRP(서열번호 1)를 포함하는 컨쥬게이트의 생성을 기재한다. "노브-PEG" 컨쥬게이트는 말레이미드-활성화된 PEG를 합성된 노브 펩타이드의 C-말단 시스테인과 반응시킴으로써 이루어졌다.
컨쥬게이션 방법은 종종 복잡하며, 다단계를 필요로 하는데, 이중 일부는 상이한 위치에서 완료될 필요가 있을 수 있고, 종종 상대적으로 저수율의 목적으로 하는 생성물을 초래한다. 컨쥬게이션된 생성물의 추가적인 이점은 그들이 그들의 합성에서 사용되는 담체 및/또는 링커 물질에 기인하여 멸균 방사선에 민감할 수 있다는 점이다.
따라서, 피브리노겐을 용이하게 중합할 수 있고, 면역원성 시약을 사용하지 않고 용이하게 생성될 수 있으며, 멸균 방사선에 대해 저항성이 있고, 바로 사용가능한 형태로 제공될 수 있는 지혈제를 제공할 필요가 있다.
본 발명의 제1 양상에 따르면 분지된 코어, 및 분지된 코어에 별도로 공유적으로 부착된 복수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 펩타이드 덴드리머가 제공되되, 분지된 코어는:
각각의 피브리노겐-결합 펩타이드가 분지된 코어의 다작용성 아미노산 잔기에 별도로 공유적으로 부착되는, 2 내지 10개의 다작용성 아미노산 잔기;
하나 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드가 분지된 코어의 각각의 적어도 2개의 인접한 다작용성 아미노산 잔기에 별도로 공유적으로 부착되는 복수의 다작용성 아미노산 잔기;
2 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드가 분지된 코어의 다작용성 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 별도로 공유적으로 부착되는, 복수의 다작용성 아미노산 잔기;
2 이상의 다작용성 아미노산 잔기가 인접한 다작용성 아미노산 잔기의 측쇄를 통해 공유적으로 연결되는, 복수의 다작용성 아미노산 잔기; 또는
단일의 다작용성 아미노산 잔기(피브리노겐-결합 펩타이드는 다작용성 아미노산 잔기의 각각의 작용기에 별도로 공유적으로 부착됨)를 포함하되;
다작용성 아미노산 잔기는 3- 또는 4-작용성 아미노산 잔기, 또는 3- 및 4-작용성 아미노산 잔기를 포함하거나, 또는 단일의 다작용성 아미노산 잔기는 3- 또는 4-작용성 아미노산 잔기이다.
각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 분지된 코어에 대해 상이한 부착 지점을 가지며, 따라서 피브리노겐-결합 펩타이드는 본 명세서에서 분지된 코어에 대해 "별도로 공유적으로 부착된"으로서 지칭된다.
분지된 코어는 임의의 적합한 아미노산 서열을 포함한다. 분지된 코어는 10개까지의 다작용성 아미노산 잔기, 예를 들어 2 내지 10개 또는 2 내지 6개의 다작용성 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
분지된 코어는 복수의 연속적 다작용성 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 분지된 코어는 10개까지의 연속적 다작용성 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
용어 "3작용성 아미노산"은 본 명세서에서 아민(-NH2)인 제1 작용기, 카복실산(-COOH)인 제2 작용기, 및 제3 작용기를 지니는 임의의 유기 화합물을 지칭하기 위해 사용된다. 용어 "4-작용성 아미노산"은 본 명세서에서 아민(-NH2)인 제1 작용기, 카복실산(-COOH)인 제2 작용기, 제3 작용기, 및 제4 작용기를 지칭하기 위해 사용된다. 제3 작용기 및 제4 작용기는 피브리노겐-결합 펩타이드의 카복시-말단 끝과, 또는 피브리노겐-결합 펩타이드의 카복시-말단 끝에 부착된 링커의 작용기와 반응할 수 있는 임의의 작용기일 수 있다.
다작용성 아미노산은 아미노기, 카복실기, 및 추가 작용기를 보유하는 측쇄(이에 의해 3-작용성 아미노산을 제공함), 또는 추가 2개의 작용기(이에 의해 4-작용성 아미노산을 제공함)를 보유하는 중심 탄소 원자(α- 또는 2-)를 포함할 수 있다.
상기 또는 각각의 다작용성 아미노산 잔기는 단백질 구성원인(proteinogenic) 또는 단백질 구성원이 아닌 다작용성 아미노산의 잔기, 또는 천연 또는 비천연 다작용성 아미노산의 잔기일 수 있다.
단백질 구성원인 3작용성 아미노산은 아미노기, 카복실기, 측쇄 및 α-수소 좌선성 입체구조를 보유하는 중심 탄소 원자(α- 또는 2-)를 가진다. 적합한 3작용성 단백질 구성원 아미노산의 예는 L-라이신, L-알기닌, L-아스팔트산, L-글루탐산, L-아스파라긴, L-글루타민, 및 L-시스테인을 포함한다.
적합한 3작용성의 단백질 구성원이 아닌 아미노산 잔기의 예는 D-라이신, 베타-라이신, L-오르니틴, D-오르니틴 및 D-알기닌 잔기를 포함한다.
따라서, 본 발명의 펩타이드 덴드리머에서 사용하기 위한 적합한 3작용성 아미노산 잔기의 예는 라이신, 오르니틴, 알기닌, 아스팔트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민 및 시스테인 잔기, 예컨대 L-라이신, D-라이신, 베타-라이신, L-오르니틴, D-오르니틴, L-알기닌, D-알기닌, L-아스팔트산, D-아스팔트산, L-글루탐산, D-글루탐산, L-아스파라긴, D-아스파라긴, L-글루타민, D-글루타민, L-시스테인 및 D-시스테인 잔기를 포함한다.
본 발명의 펩타이드 덴드리머에서 사용하기에 적합한 다기능성 비천연 아미노산의 예는 시트룰린, 2,4-다이아미노아이소뷰티르산, 2,2'-다이아미노피멜산, 2,3-다이아미노프로피온산, 및 시스-4-아미노-L-프롤린을 포함한다. 다작용성 비천연 아미노산은 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich)로부터 입수가능하다.
일부 실시형태에서, 분지된 코어는 동종중합체 다작용성 아미노산 서열, 예를 들어 폴리-라이신, 폴리-알기닌 또는 폴리-오르니틴 서열, 예컨대 2 내지 10개, 또는 2 내지 6개의 연속적 라이신, 알기닌 또는 오르니틴 잔기를 포함하는 분지된 코어를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 분지된 코어는 상이한 다작용성 아미노산 잔기, 예를 들어 하나 이상의 라이신 잔기, 하나 이상의 알기닌 잔기, 및/또는 하나 이상의 오르니틴 잔기를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 분지된 코어는 복수의 다작용성 아미노산 잔기, 및 하나 이상의 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
분지된 코어가 복수의 다작용성 아미노산 잔기를 포함하는 경우, 인접한 다작용성 아미노산 잔기는 펩타이드 결합에 의한 아미노산 측쇄 연결에 의해 함께 연결될 수 있거나, 또는 일부 인접한 다작용성 아미노산 잔기는 측쇄 연결에 의해 그리고 나머지는 펩타이드 결합에 의해 함께 연결될 수 있다.
추가 실시형태에서, 분지된 코어는 2 이상의 다작용성 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 적어도 하나의 피브리노겐-결합 펩타이드는 다작용성 아미노산 잔기 중 각각 2 이상에 별도로 부착되며, 2 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드는 분지된 코어의 다작용성 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 별도로 부착된다.
다른 실시형태에 따르면, 2개의 피브리노겐-결합 펩타이드는 분지된 코어의 말단 다작용성 아미노산 잔기에 별도로 부착된다.
본 발명의 펩타이드 덴드리머의 구조의 예는 펩타이드 덴드리머를 포함하며, 이때:
Figure 112016070643809-pct00001
분지된 코어는 2개의 피브리노겐-결합 펩타이드가 부착되는 제1의 3작용성 아미노산 잔기, 및 1개의 피브리노겐-결합 펩타이드가 부착된 제2의 3작용성 아미노산 잔기를 포함하고;
Figure 112016070643809-pct00002
분지된 코어는 2개의 피브리노겐-결합 펩타이드가 부착되는 제1의 3작용성 아미노산 잔기, 및 2개의 피브리노겐-결합 펩타이드가 부착된 제2의 3작용성 아미노산 잔기를 포함하며;
Figure 112016070643809-pct00003
분지된 코어 2개의 피브리노겐-결합 펩타이드가 부착된 제1의 3작용성 아미노산 잔기, 1개의 피브리노겐-결합 펩타이드가 부착된 제2의 3작용성 아미노산 잔기, 및 1개의 피브리노겐-결합 펩타이드가 부착된 제3의 3작용성 아미노산 잔기를 포함하거나; 또는
Figure 112016070643809-pct00004
분지된 코어는 2개의 피브리노겐-결합 펩타이드가 부착된 제1의 3작용성 아미노산 잔기, 1개의 피브리노겐-결합 펩타이드가 부착된 제2의 3작용성 아미노산 잔기, 1개의 피브리노겐-결합 펩타이드가 부착된 제3의 3작용성 아미노산 잔기, 및 1개의 피브리노겐-결합 펩타이드가 부착된 제4의 3작용성 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 펩타이드 덴드리머는 하기 일반식 (I)을 포함할 수 있다:
Figure 112016070643809-pct00005
식 중:
FBP는 피브리노겐-결합 펩타이드이고;
-(링커)-는 선택적 링커, 바람직하게는 비-펩타이드 링커이며;
X는 3작용성 아미노산 잔기, 바람직하게는 라이신, 오르니틴, 또는 알기닌이고;
Y는 -FBP 또는 -NH2이며;
Z는 Y가 -FBP일 때 -(링커)-FBP이거나, 또는 Y가 -NH2일 때 -[-Xn-(링커)-FBP]a-(링커)-FBP이고;
여기서:
Xn은 3작용성 아미노산 잔기, 바람직하게는 라이신, L-오르니틴, 또는 알기닌이며;
a는 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 3이다.
예를 들어, Y가 NH2일 때, Z는 -[-Xn-(링커)-FBP]a-(링커)-FBP이고, 덴드리머의 구조는 다음과 같다:
a가 1인 경우:
Figure 112016070643809-pct00006
또는, a가 2인 경우:
Figure 112016070643809-pct00007
또는, a가 3인 경우:
Figure 112016070643809-pct00008
대안적으로, Y가 -FBP일 때 Z는 -[-Xn-(링커)-FBP]a-(링커)-FBP이고;
여기서:
Xn은 3작용성 아미노산 잔기, 바람직하게는 라이신, L-오르니틴, 또는 알기닌이며;
a는 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 3이다.
예를 들어, Y가 -FBP일 때, Z는 -[-Xn-(링커)-FBP]a-(링커)-FBP이며, a는 1이고, 덴드리머의 구조는 다음과 같다:
Figure 112016070643809-pct00009
본 발명의 펩타이드 덴드리머는 다음의 일반식 (II)를 포함할 수 있다:
Figure 112016070643809-pct00010
식 중:
FBP는 피브리노겐-결합 펩타이드이고;
-(링커)-는 바람직하게는 -NH(CH2)5CO-를 포함하는 선택적 링커이며;
Y는 -FBP 또는 -NH2이며;
Z는:
Y가 -FBP일 때, -R-(링커)-FBP이거나, 또는
Y가 -NH2일 때,
Figure 112016070643809-pct00011
이거나; 또는
Y가 -NH2일 때,
Figure 112016070643809-pct00012
이거나; 또는
Y가 -NH2일 때,
Figure 112016070643809-pct00013
이고;
여기서, R은-(CH2)4NH-, -(CH2)3NH-, 또는 -(CH2)3NHCNHNH-이다.
결과적으로, 일 실시형태에서, Y가 -NH2일 때,
Z는
Figure 112016070643809-pct00014
일 수 있으며;
여기서, R은 -(CH2)4NH-, -(CH2)3NH-, 또는 -(CH2)3NHCNHNH-이고;
a는 1 내지 3이다.
대안적으로, a는 4 내지 10일 수 있거나, 또는 1 내지 10일 수 있다.
다른 실시형태에서, Y가 -FBP일 때,
Z는
Figure 112016070643809-pct00015
이며;
여기서, R은 -(CH2)4NH-, -(CH2)3NH-, 또는 -(CH2)3NHCNHNH-이고;
여기서, a는 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 3이다.
예를 들어, Y가 -FBP이고, a가 1일 때,
Z는
Figure 112016070643809-pct00016
이다.
본 발명의 펩타이드 덴드리머는 하기 일반식 (III)을 포함할 수 있다:
Figure 112016070643809-pct00017
식 중:
FBP는 피브리노겐-결합 펩타이드이고;
-(링커)-는 바람직하게는 -NH(CH2)5CO-를 포함하는 선택적 링커이며;
Y는 -FBP 또는 -NH2이며;
Z는:
Y가 -FBP일 때 -(CH2)4NH-(링커)-FBP이거나; 또는
Y가 -NH2일 때,
Figure 112016070643809-pct00018
이거나; 또는
Y가 -NH2일 때,
Figure 112016070643809-pct00019
이거나; 또는
Y가 -NH2일 때,
Figure 112016070643809-pct00020
이다.
결과적으로, 일 실시형태에서, Y가 -NH2일 때,
Z는
Figure 112016070643809-pct00021
이고;
a는 1 내지 3이다.
대안적으로 a는 4 내지 10이거나, 또는 1 내지 10일 수 있다.
다른 실시형태에서, Y가 -FBP일 때,
Z는
Figure 112016070643809-pct00022
이고;
여기서, a는 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 3이다.
예를 들어, Y가 -FBP이고, a가 1일 때,
Z는
Figure 112016070643809-pct00023
이다.
일 실시형태에서, 펩타이드 덴드리머는 다음의 구조를 포함하지 않는다:
Figure 112016070643809-pct00024
임의의 적합한 피브리노겐-결합 펩타이드(FBP)가 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 피브린에 자연적으로 결합되는 피브리노겐의 영역에 결합할 수 있거나 또는 혈소판 막 당단백질 GPIIb-IIIa에 의해 결합될 수 있다. 피브리노겐에 대한 피브린 결합은 문헌[Mosesson et al. 2001, Ann. N.Y . Acad . Sci ., 936, 11-30]에서 논의된다. 피브리노겐에 대한 GPIIb-IIIa의 결합은 문헌[Bennett, 2001, Annals of NY Acad . Sci., 936, 340-354]에서 논의된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "펩타이드"는 또한 펩타이드 유사체를 포함한다. 몇몇 펩타이드 유사체는 당업자에게 공지되어 있다. 임의의 적합한 유사체가 사용될 수 있으며, 단, 피브리노겐은 피브리노겐 결합 펩타이드에 결합할 수 있다.
적합한 피브리노겐 결합 펩타이드의 예 및 그들이 동정될 수 있는 방법은 WO 2005/035002, WO 2007/015107 및 WO 2008/065388에 제공된다.
바람직하게는, 피브리노겐-결합 펩타이드는 각각 길이로 3 내지 60개, 바람직하게는 3 내지 30개, 더 바람직하게는 3 내지 10개의 아미노산 잔기이다.
바람직하게는, 각각의 피브리노겐 결합 펩타이드는 10-9 내지 10-6 M, 예를 들어 대략 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400 이상의 nM의 해리 상수(KD)로 피브리노겐에 결합한다. 대략 100nM의 KD가 바람직하다. 해리 상수는 평형상태에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 공지된 농도의 방사선 표지 피브리노겐은 피브리노겐 결합 모이어티가 가교된 마이크로스피어와 함께 인큐베이션될 수 있다. 전형적으로 5μM 펩타이드는 1그램 마이크로스피어에 가교되거나, 또는 15 내지 40μ몰의 펩타이드는 1그램의 마이크로스피어에 가교된다. 펩타이드 연결된 마이크로스피어는 0.5㎎/㎖로 희석되고, 20℃에서 1시간까지 동안 0.05 내지 0.5㎎/㎖의 농도로 방사선 표지된 피브리노겐과 함께 pH 7.4(예를 들어 0.15M NaCl을 함유하는 0.01M 헤페스 완충제)에서 등장 완충제와 함께 인큐베이션된다. 마이크로스피어 상에서 피브리노겐 결합 모이어티에 결합된 피브리노겐은 원심분리에 의해 분리될 수 있고, 유리 및 결합된 피브리노겐의 양이 측정된다. 이어서, 해리 상수는 결합된 피브리노겐:유리 피브리노겐의 비에 대해 결합된 피브리노겐의 농도를 플롯팅함으로써 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 계산될 수 있으며, 곡선의 기울기는 KD를 나타낸다.
일부 실시형태에 따르면, 본 발명의 펩타이드 덴드리머의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 홀 'a'에 우선적으로 결합한다. 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 홀 'a'에 우선적으로 결합하는 적합한 피브리노겐-결합 펩타이드의 서열의 예는 하기를 포함한다: GPR-; GPRP-(서열번호 1); GPRV-(서열번호 2); GPRPFPA-(서열번호 3); GPRVVAA-(서열번호 4); GPRPVVER-(서열번호 5); GPRPAA-(서열번호 6); GPRPPEC-(서열번호 7); GPRPPER-(서열번호 8); GPSPAA-(서열번호 9).
다른 실시형태에 따르면, 본 발명의 펩타이드 덴드리머의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 홀 'a' 이상으로 홀 'b'에 우선적으로 결합한다. 피브리노겐의 홀 'a' 이상으로 홀 'b'에 우선적으로 결합하는 피브리노겐-결합 펩타이드의 서열의 예는 하기를 포함한다: GHR-, GHRP-(서열번호 10), GHRPY-(서열번호 11), GHRPL-(서열번호 12), GHRPY아마이드-(서열번호 13).
본 발명의 펩타이드 덴드리머의 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 독립적으로 덴드리머의 분지된 코어에 대해 그의 카복시-말단의 끝에서(선택적으로 링커를 통해), 또는 그의 아미노-말단의 끝에서(선택적으로 링커를 통해) 부착될 수 있다. 피브리노겐-결합 펩타이드가 그의 아미노-말단의 말단에 부착된다면, 펩타이드의 카복시-말단의 끝은 아마이드 기를 포함할 수 있다. 펩타이드의 노출된 카복시-말단의 끝에서 카복실기(또는 음으로 하전된 카복실레이트 이온)보다는 아마이드기의 존재는 피브리노겐에 대한 피브리노겐-결합 펩타이드의 결합을 최적화시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 덴드리머의 분지된 코어에 대해 그의 카복시-말단의 끝에서 (선택적으로 링커를 통해) 부착된다. 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 피브리노겐-결합 펩타이드는 덴드리머의 분지된 코어에 대해 그의 아미노-말단의 끝에서 (선택적으로 링커를 통해) 부착된다. 예를 들어, 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 홀 'a'에 우선적으로 결합하는 적어도 하나의 피브리노겐-결합 펩타이드, 예컨대 서열 APFPRPG(서열번호 14)를 포함하는 펩타이드는 덴드리머의 분지된 코어에 대해 그의 아미노-말단의 끝에서 (선택적으로 링커를 통해) 부착될 수 있다.
유리하게는, 본 발명의 펩타이드 덴드리머는 상이한 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드(본 명세서에서 '키메라' 펩타이드 덴드리머로서 지칭됨)를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드 덴드리머는 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 홀 'a'에 대해 상이한 결합 특이성을 갖는 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함한다.
본 발명의 제2 양상에 따르면, 복수의 담체를 포함하는 제제가 제공되되, 각각의 담체는 담체에 부착된 복수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 가지고, 담체에 부착된 피브리노겐-결합 펩타이드는 상이한 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함한다.
본 발명의 제2 양상의 일부 실시형태에서, 복수의 담체는 제1의 복수의 담체, 및 제2의 복수의 담체를 포함하되, 제1의 복수의 담체에 부착된 피브리노겐-결합 펩타이드는 제2의 복수의 담체에 부착된 피브리노겐-결합 펩타이드에 대해 상이한 서열을 가진다.
본 발명의 제2 양상의 다른 실시형태에서, 각각의 담체는 그것에 부착된 상이한 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드를 가진다.
담체는 가용성 또는 불용성 담체일 수 있지만, 바람직하게는 혈소판이 아니다. 담체는 대상체의 조직 부위, 예를 들어 출혈 상처 부위 또는 점막 부위에 대한 국소 투여에 적합할 수 있다. 적합한 담체는 국소 투여보다는 정맥내에 적합할 수 있다. 담체는 가용성 또는 불용성 단백질, 치료적 약물, 중합체(예를 들어, 생분해성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜), 또는 이들 중 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 단백질 담체의 예는 효소, 예컨대 인간 혈청 알부민이 아닌 효소 또는 단백질이다.
불용성 담체는 마이크로입자(중공 또는 다공성 마이크로입자, 바람직하게는 실질적으로 구형의 마이크로입자를 포함하는 고체)일 수 있다. 마이크로입자는 임의의 적합한 물질, 예를 들어 가교된 단백질로 형성될 수 있다. 적합한 단백질은 알부민(서열에서 혈청-유도 또는 재조합, 인간 또는 비인간) 또는 젤라틴이다. 본 발명에서 불용성 담체로서 사용하기에 적합한 마이크로입자는, 예를 들어 WO 92/18164에서와 같은 잘 공지된 분무-건조 기법을 이용하여 인간 혈청 알부민(HSA)을 분무 건조시킴으로써 형성될 수 있다. 담체로서 마이크로입자의 사용에 대한 대안은 리포좀, 합성 중합체 입자(예컨대 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 폴리(락트/글리콜)산), 또는 세포막 단편을 포함한다.
적어도 대다수의 담체는 최대 치수가 6㎛ 미만일 수 있다. 이는 본 발명의 제제가 정맥내 투여용이라면 바람직할 수 있다.
대안적으로, 적어도 대다수의 담체는 최대 치수가 6㎛ 미만일 수 있다. 이는 본 발명의 제제가 국소 투여용이라면 바람직할 수 있다.
이론에서 담체 분자 당 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드에 대한 상한은 없다. 최적의 수는 다수의 인자, 예컨대 담체의 특성 및 피브리노겐-결합 펩타이드를 부착하기 위한 각각의 담체에 대한 반응기의 수에 의존할 가능성이 있다. 그러나, 평균적으로 담체 분자 당 100개까지의 피브리노겐-결합 펩타이드가 있는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 담체 분자 당 평균적으로 적어도 3, 바람직하게는 적어도 4 또는 5개의 피브리노겐-결합 펩타이드가 있다. 바람직한 범위는 담체 분자 당 10 내지 20개의 피브리노겐-결합 펩타이드이다.
담체는 담체에 대해 피브리노겐-결합 펩타이드를 부착시키는 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 담체는 그의 표면 상에 티올 모이어티 또는 아민 모이어티를 포함할 수 있다. 담체가 단백질성이라면, 티올 또는 아민 모이어티는 아미노산, 예를 들어 시스테인 또는 라이신의 측쇄에 의해 제공될 수 있다. 비펩타이드기가 담체에 첨가될 수 있다. 담체가 단백질, 예컨대 HSA로부터 형성된다면 특히 유리하다. 예를 들어, 티올기는 담체 상의 1차 아민기와 반응할 수 있는 시약, 예컨대 2-이미노티올란(2-IT)을 이용하여 담체에 첨가될 수 있다.
상이한 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 홀 'a'에 우선적으로 결합하는 제1 피브리노겐-결합 펩타이드, 및 제1 피브리노겐-결합 펩타이드보다 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 홀 'a'에 대해 더 높은 선택성으로 결합하는 제2 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함할 수 있다. 이러한 펩타이드 덴드리머는 상대적으로 넓은 범위의 펩타이드 덴드리머 농도에 걸쳐 빠르게 피브리노겐을 중합하는 것으로 발견되었다.
예를 들어, 제1 피브리노겐-결합 펩타이드는 그의 아미노-말단의 끝에서 아미노산 서열 GPRP-(서열번호 1)를 포함할 수 있고/있거나, 제2 피브리노겐-결합 펩타이드는 그의 카복시-말단의 끝에서 아미노산 서열 -APFPRPG(서열번호 14)를 포함할 수 있으며, 여기서 서열의 아미노산 잔기는 아미노-에서 카복시- 순서로 나타내며, "-"는 펩타이드 덴드리머의 분지된 코어에 대해, 또는 담체에 대해 부착되는 서열의 말단을 의미한다. 서열 -APFPRPG(서열번호 14)를 지니는 피브리노겐-결합 펩타이드는 그의 카복시 말단 끝에서 그의 아미노-말단의 끝에서 서열 GPRP-(서열번호 1)를 지니는 피브리노겐-결합 펩타이드보다 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 홀 'a'에 대해 더 높은 선택성으로 결합한다.
다른 실시형태에서, 상이한 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 홀 'a'에 우선적으로 결합하는 제1 피브리노겐-결합 펩타이드, 및 피브리노겐의 홀 'a' 이상으로 홀 'b'에 우선적으로 결합하는 제2 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함할 수 있다. 이러한 펩타이드 덴드리머는 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 홀 'a'에 우선적으로 결합하는 피브리노겐-결합 펩타이드만을 함유하는 등가의 펩타이드 덴드리머에 비해 상대적으로 밀집한 하이드로겔을 형성하기 위해 피브리노겐과 함께 중합하는 것으로 발견되었다. 형성된 하이드로겔의 증가된 밀도는 피브리노겐의 홀 'a' 및 홀 'b'에 대한 덴드리머의 피브리노겐-결합 펩타이드의 결합에 기인하며, 이에 의해 중합된 피브리노겐의 망상구조를 강화하는 것으로 믿어진다.
예를 들어, 제1 피브리노겐-결합 펩타이드는 그의 아미노-말단의 끝에서 아미노산 서열 GPRP-(서열번호 1)를 포함할 수 있고/있거나 제2 피브리노겐-결합 펩타이드는 그의 아미노 말단의 끝에서 아미노산 서열 GHRP-(서열번호 10), 또는 아미노산 서열 GHRPY-(서열번호 11)를 포함할 수 있다. 아미노-말단의 끝에서 서열 GPRP-(서열번호 1)를 지니는 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 홀 'a'에 대해 일부 선택성을 지니도록 결합한다. 아미노-말단의 끝에서 서열 GHRP-(서열번호 10), 또는 GHRPY-(서열번호 11)를 지니는 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 홀 'b'에 우선적으로 결합한다.
하나 이상의, 또는 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 비-펩타이드 링커에 의한 본 발명의 펩타이드 덴드리머의 분지된 코어에 공유적으로 부착될 수 있다. 링커는 펩타이드 덴드리머의 피브리노겐-결합 펩타이드에 대한 피브리노겐의 결합을 방해하지 않는 임의의 적합한 링커일 수 있다. 링커는 가요성, 직쇄 링커, 적합하게는 직쇄 알킬기를 포함할 수 있다. 이러한 링커는 펩타이드 덴드리머의 피브리노겐-결합 펩타이드가 서로로부터 연장되게 한다. 예를 들어, 링커는 -NH(CH2)nCO- 기를 포함할 수 있으며, 여기서 n은 임의의 수, 적합하게는 1 내지 10, 예를 들어 5이다. -NH(CH2)5CO- 기를 포함하는 링커는 ε-아미노산 6-아미노헥산산(εAhx)의 사용에 의해 형성될 수 있다.
이론에서, 본 발명의 펩타이드 덴드리머에 존재할 수 있는 피브리노겐-결합 펩타이드의 총 수는 제한되지 않는다. 그러나, 실행에서, 임의의 특정 구조에 대해, 피브리노겐-결합 펩타이드의 수는 다를 수 있고, 목적으로 하는 피브리노겐 중합 특성을 위해, 예를 들어, 빠른 피브리노겐 중합을 위해 또는 피브리노겐에 의한 중합에 의해 생성된 하이드로겔의 밀도에 대해 최적의 수를 결정하기 위해 시험될 수 있다. 펩타이드 덴드리머는 총 20개까지의 피브리노겐-결합 펩타이드/덴드리머, 예를 들어 10개까지의 피브리노겐-결합 펩타이드/덴드리머, 또는 5개까지의 피브리노겐-결합 펩타이드/덴드리머를 포함할 수 있다.
출원인은, 놀랍게도, 2 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 펩타이드 컨쥬게이트를 지니는 본 발명의 펩타이드 덴드리머의 혼합물이 펩타이드 덴드리머, 또는 펩타이드 컨쥬게이트 단독보다 더 빠르게 피브리노겐을 중합할 수 있다는 것을 발견하였다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 펩타이드 덴드리머, 및 2 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 펩타이드 컨쥬게이트를 포함하는 조성물이 제공된다.
펩타이드 컨쥬게이트는 동일한 서열, 또는 상이한 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 컨쥬게이트는 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 홀 'a'에 우선적으로 결합하는 피브리노겐-결합 펩타이드만을, 또는 피브리노겐의 홀 'a' 이상으로 홀 'b'에 우선적으로 결합하는 피브리노겐-결합 펩타이드만을, 또는 하나 이상의 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 홀 'a'에 우선적으로 결합하는 피브리노겐-결합 펩타이드 및 하나 이상의 피브리노겐의 홀 'a' 이상으로 홀 'b'에 우선적으로 결합하는 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함할 수 있다.
펩타이드 컨쥬게이트는 피브리노겐-결합 펩타이드가 부착되는 담체를 포함할 수 있다. 적합한 담체는 하나 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 단일 아미노산 잔기, 예컨대 라이신 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한 담체를 포함하는 컨쥬게이트의 이점은 그들이 고체상 펩타이드 합성 방법을 이용하여 용이하게 이루어질 수 있다는 것이다.
펩타이드 컨쥬게이트의 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 독립적으로 카복시-말단의 끝에서(선택적으로 링커를 통해), 또는 그의 아미노-말단의 끝에서(선택적으로 링커를 통해) 담체에 부착될 수 있다. 피브리노겐-결합 펩타이드가 그의 아미노-말단의 말단에 부착된다면, 펩타이드의 카복시-말단의 끝은 아마이드 기를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 펩타이드 컨쥬게이트는 본 발명의 펩타이드 덴드리머일 수 있다.
본 발명의 조성물의 펩타이드 덴드리머의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 홀 'a'에 우선적으로 결합할 수 있고, 펩타이드 컨쥬게이트의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 홀 'a' 이상으로 피브리노겐의 홀 'b'에 대해 우선적으로 결합할 수 있다.
이러한 조성물은 그들이 펩타이드 덴드리머 또는 펩타이드 컨쥬게이트 단독보다는 더 빠르게 피브리노겐을 중합할 수 있다는 점에서 상승 효과를 갖는 것으로 발견되었다. 이 상승 효과의 메커니즘은 완전히 이해되지 않지만, 이론에 의해 구속되는 일 없이, 조성물은 더 많은 'A' 및 'B' 피브리노겐 중합 부위를 제공하기 때문에 이것이 일어나는 것으로 믿어진다.
대안적으로, 본 발명의 조성물의 펩타이드 덴드리머의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 홀 'a' 이상으로 피브리노겐의 홀 'b'에 우선적으로 결합할 수 있고, 펩타이드 컨쥬게이트의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 피브리노겐의 홀 'a'에 우선적으로 결합한다.
본 발명에 따르면 본 발명의 펩타이드 덴드리머, 본 발명의 제제, 또는 본 발명의 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
적합한 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제는 상처 부위에 대해 본 발명의 펩타이드 덴드리머, 제제, 또는 조성물에 의한 국소 투여에 적합한 것을 포함한다. 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체의 예는 담체, 바람직하게는 유동성 형태, 예컨대 젤라틴, 피브린, 키토산, 피브리노겐, 콜라겐, 전분, 하이알루론산을 포함한다. 적합한 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 부형제는 완충제, 예컨대 트리스(Tris)-HCl, 아세트산염, 또는 인산염 완충제, 첨가제, 예컨대 세정제 또는 가용화제(예를 들어, 트윈 80, 폴리솔베이트 80), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 메타중아황산나트륨), 보존제(예를 들어, 메타-크레졸, 파라벤(메틸, 프로필 또는 뷰틸), 클로로뷰탄올, 페닐수은 염(예를 들어, 아세트산염, 붕산염, 질산염), 솔브산, 벤질 알코올), 및 증량 물질(예를 들어, 락토스, 만니톨), 등장제(예를 들어, 당, 염화나트륨), 중합체 화합물, 예컨대 폴리락트산, 폴리글리콜산을 포함한다.
본 발명의 펩타이드 덴드리머, 제제 및 조성물의 특정 이점은 그들이 피브리노겐과 중합하는 펩타이드 덴드리머, 또는 조성물 능력의 상당한 손실 없이, 예를 들어 조사(irradiation), 적합하게는 감마 조사에 의해 용이하게 멸균될 수 있다는 것이다.
본 발명에 따르면, 펩타이드 덴드리머, 제제 또는 조성물을 감마 조사에, 바람직하게는 30 kGy까지 노출시키는 단계를 포함하는 본 발명의 펩타이드 덴드리머, 본 발명의 제제, 또는 본 발명의 조성물의 멸균 방법이 제공된다. 펩타이드 덴드리머, 제제 또는 조성물은 건식, 습식 또는 용매 형태일 수 있다.
본 발명에 따르면, 멸균인 본 발명의 펩타이드 덴드리머, 본 발명의 제제 또는 본 발명의 조성물이 또한 제공된다.
본 발명의 펩타이드 덴드리머, 제제 또는 조성물은 유리하게는 멸균의, 바로 사용가능한 제형으로서, 특히, 멸균의, 바로 사용가능한 지혈제 또는 상처 치료 제형으로서 제공될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드 덴드리머는 수화된 유동성 젤라틴 페이스트로 제형화되고, 멸균의, 바로 사용가능한, 유동성 제품을 제공하도록 조사될 수 있는 주사기 내로 패키징될 수 있다.
본 발명에 따르면, 또한 피브리노겐을 본 발명의 펩타이드 덴드리머, 본 발명의 제제 또는 본 발명의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 피브리노겐을 중합하는 방법이 제공된다.
중합을 위해 사용되는 덴드리머 및 피브리노겐의 상대적 농도는 덴드리머의 특성, 예를 들어 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드가 존재하는 방법 및 피브리노겐-결합 펩타이드의 서열에 의존할 것이다. 출원인은 생리적 수준 피브리노겐(3㎎/㎖)과 함께 0.005㎎/㎖ 내지 2㎎/㎖의 범위에 있는 농도에서 본 발명의 펩타이드 덴드리머를 이용하여 빠른 중합 시간을 관찰하였다.
본 발명의 일부 펩타이드 덴드리머에 대해, 덴드리머의 농도가 증가됨에 따라, 피브리노겐 중합 속도(즉, "응고 시간")는 감소된다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 이는 덴드리머의 피브리노겐-결합 펩타이드에 의한 피브리노겐 분자의 'a' 및/또는 'b' 홀의 포화에 기인하는 것으로 믿어진다. 이들 더 높은 덴드리머 농도에서, 유리 피브리노겐 결합 홀에 대해(즉, 비어있는 'a' 및/또는 'b' 홀에 대해) 경쟁하는 과량의 피브리노겐-결합 펩타이드가 있으며, 이 경쟁은 중합이 일어나는 속도를 감소시키는 것으로 믿어진다.
또한 본 발명의 펩타이드 덴드리머, 본 발명의 제제 또는 본 발명의 조성물 및 별도로, 피브리노겐을 포함하는 하이드로겔의 형성을 위한 키트가 본 발명에 따라 제공된다.
본 발명의 펩타이드 덴드리머의 공중합체, 본 발명의 제제, 또는 본 발명의 조성물, 및 피브리노겐을 포함하는 하이드로겔이 본 발명에 따라 추가로 제공된다.
본 발명의 펩타이드 덴드리머, 제제, 및 조성물은, 예를 들어 출혈을 치료하기 위해, 또는 상처를 치료하기 위해 지혈제로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면 본 발명의 펩타이드 덴드리머, 본 발명의 제제, 또는 본 발명의 조성물을 출혈 또는 상처 부위에 투여하는 단계를 포함하는 출혈을 치료하거나 상처를 치료하는 방법이 제공된다.
펩타이드 덴드리머, 제제 또는 조성물은 출혈 또는 상처에 존재하는 내인성(즉, 숙주) 피브리노겐을 중합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 외인성 피브리노겐은 본 발명의 펩타이드 덴드리머, 제제 또는 조성물은 출혈 또는 상처 부위에 투여될 수 있다.
용어 "피브리노겐"은 본 명세서에서 천연 피브리노겐, 재조합 피브리노겐, 또는 피브린을 형성하기 위해 트롬빈에 의해 전환될 수 있는 피브리노겐의 유도체(예를 들어, 자발적 조립이 가능할 수도 있고 가능하지 않을 수도 있는 천연 또는 재조합 피브린 단량체, 또는 유도체)를 포함하기 위해 사용된다. 피브리노겐은 적어도 2개의 피브리노겐 결합 펩타이드에 결합할 수 있어야 한다. 피브리노겐은 임의의 공급원으로부터, 그리고 임의의 종(소 피브리노겐을 포함)으로부터 얻어질 수 있지만, 바람직하게는 인간 피브리노겐이다. 인간 피브리노겐은 자가 또는 공여체 혈액으로부터 얻을 수 있다. 자가 피브리노겐, 또는 재조합 피브리노겐이 바람직한데, 이것은 대상체에게 투여될 때 감염 위험을 감소시키기 때문이다.
인간 대상체에 대한 투여를 위한 적합한 양의 펩타이드 덴드리머는, 예를 들어, 덴드리머의 유형, 예를 들어 얼마나 많은 피브리노겐-결합 펩타이드가 덴드리머 분자 당 존재하는지, 그리고 상처 또는 출혈 부위의 유형 및 크기에 의존할 것이다. 그러나, 전형적인 양의 덴드리머는 0.005 내지 25㎎/㎖의 농도로 덴드리머를 함유하는 0.1㎖ 내지 50㎖, 예를 들어 0.1㎖ 내지 5㎖, 또는 1 내지 50㎖의 제제(예를 들어, 수성 제제)이다.
인간 대상체에 대한 투여를 위한 적합한 양의 외인성 피브리노겐은 0.1㎎ 내지 200㎎, 예를 들어 3㎎ 내지 200㎎이다.
본 발명의 펩타이드 덴드리머, 제제 또는 조성물은 상처에 직접적으로 투여를 위한 유체로서 제공될 수 있거나, 또는 도포 전에 선택적으로 피브리노겐과 함께 스펀지 또는 직물(예를 들어, 침윤 또는 코팅됨)에 도포될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 펩타이드 덴드리머, 제제 또는 조성물은 주사기에 의한 투여를 위해 유동성 페이스트와 혼합될 수 있다.
본 발명에 따르면 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 펩타이드 덴드리머, 본 발명의 제제 또는 본 발명의 조성물이 또한 제공된다.
출혈의 치료에서 사용하기 위한 또는 상처를 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 펩타이드 덴드리머, 본 발명의 제제, 또는 본 발명의 조성물이 본 발명에 따라 추가로 제공된다.
또한 출혈의 치료에서 사용하기 위한 또는 상처를 치료하는데 사용하기 위한 의약의 제조에서 본 발명의 펩타이드 덴드리머, 본 발명의 제제, 또는 본 발명의 조성물의 용도가 본 발명에 따라 제공된다.
본 발명의 펩타이드 덴드리머, 제제 및 조성물은 몇몇 중요한 이점을 가진다. 특히, 특정 실시형태에서, 펩타이드 덴드리머, 제제 및 조성물은 통상적인 고체상 펩타이드 합성 절차를 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 최적의 농도에서, 본 발명의 펩타이드 덴드리머, 제제 및 조성물은 트롬빈이 없을 때, 1초 미만으로 피브리노겐을 중합할 수 있다. 본 발명의 펩타이드 덴드리머 및 제제는 또한 1초 미만으로 인간 혈장에서 피브리노겐을 중합할 수 있다.
본 발명의 펩타이드 덴드리머 또는 제제의 구조는 덴드리머의 의도된 용도에 대해 그의 특성을 최적화하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 피브리노겐의 'a' 홀에 우선적으로 결합하는 동일한 서열의 5개의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 펩타이드 덴드리머는 거의 정맥내로 피브리노겐을 중합할 수 있다. 대조적으로, 피브리노겐의 'a' 홀에 우선적으로 결합하는 하나 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드, 및 피브리노겐의 'b' 홀에 우선적으로 결합하는 하나 이상의 상이한 피브리노겐-결합 펩타이드를 지니는 '키메라' 펩타이드 덴드리머는 피브리노겐을 더 느리게 중합할 수 있지만, 더 큰 밀도 및 크기의 하이드로겔을 형성한다.
본 발명의 펩타이드 덴드리머, 제제 및 조성물은 피브리노겐 중합 활성의 손실 없이 멸균될 수 있다. 이는 펩타이드 덴드리머, 제제 및 조성물이 멸균의, 바로 사용가능한 제형으로, 예를 들어 바로 사용가능한 지혈제 또는 상처 치료 제형으로서 제공되게 하기 때문에 중요한 이점이다.
본 발명의 실시형태는 이제 수반하는 도면을 참고하여 단지 예로서 기재된다:
도 1은 다양한 농도에서 피브리노겐을 중합하는 바람직한 실시형태의 펩타이드 덴드리머의 능력을 도시한 도면;
도 2는 다양한 농도에서 피브리노겐을 중합하는 몇몇 상이한 펩타이드 덴드리머의 능력을 도시한 도면. 넘버링은 펩타이드 덴드리머의 정체를 지칭한다;
도 3은 다양한 농도에서 피브리노겐을 중합하는 몇몇 상이한 펩타이드 덴드리머의 능력을 도시한 도면. 넘버링은 펩타이드 덴드리머의 정체를 지칭한다;
도 4는 다양한 농도에서 피브리노겐을 중합하는 몇몇 상이한 펩타이드 덴드리머의 능력을 도시한 도면. 넘버링은 펩타이드 덴드리머의 정체를 지칭한다;
도 5는 상이한 본 발명의 펩타이드 덴드리머를 이용하는 피브리노겐의 중합에 의해 형성된 하이드로겔의 사진을 도시한 도면;
도 6은 상이한 농도에서 피브리노겐을 중합하기 위한 펩타이드 컨쥬게이트와 본 발명의 펩타이드 덴드리머의 상이한 조합의 능력의 도시한 도면; 및
도 7은 인간 혈장에서 피브리노겐을 중합하기 위한 몇몇 상이한 본 발명의 펩타이드 덴드리머의 능력을 도시한 도면.
실시예 1
펩타이드 덴드리머 및 펩타이드 컨쥬게이트의 합성
펩타이드를 Fmoc 보호된 아미노산(노바바이오켐(Novabiochem))을 이용하는 표준 Fmoc 펩타이드 합성에 의해 링크(Rink) 아마이드 MBHA 저 부하 수지(노바바이오켐, 0.36m㏖/g) 상에서 합성하였다.
일반적으로, 합성 내내 단일 결합 주기를 사용하였고, HBTU 활성화 화학을사용하였다(HBTU 및 PyBOP(AGTC 바이오프로덕츠(AGTC Bioproducts))를 결합제로서 사용하였다). 그러나, 일부 위치에서 결합은 예상보다 덜 효율적이었고, 이중 결합을 필요로 하였다.
자동 펩타이드 합성기 및 분지점까지의 HBTU를 이용하고 펩타이드 분지에 대해 PyBOP를 이용하는 수동 펩타이드 합성에 의해 펩타이드를 조립하였다.
자동화된 합성에 대해, 3배 과량의 아미노산 및 HBTU를 각각의 결합에 대해 사용하였고, 다이메틸폼아마이드(DMF, 시그마) 중에서 9배 과량의 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 시그마(Sigma))을 사용하였다.
수동 합성에 대해, 3배 과량의 아미노산 및 PyBOP를 각각의 결합에 대해 사용하였고, N-메틸피롤리디논(NMP, 시그마) 중의 9배 과량의 DIPEA를 사용하였다.
DMF 중의 20% 피페리딘(시그마)을 이용하는 증가하는 펩타이드 쇄의 탈보호(Fmoc 기 제거)는 마찬가지로 항상 효율적이지 않을 수도 있으며 이중 탈보호를 필요로 한다.
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH 또는 Fmoc-Lys(Mtt)-OH를 이용하여 분지를 생성하였다.
트라이아이소프로필실란(TIS, 시그마), 물 및 아니솔(시그마)을 함유하는(1:1:1, 5%) 95% TFA(시그마)에 의한 수지의 2 내지 3시간 동안의 처리에 의해 고체 지지체로부터 펩타이드의 최종 탈보호 및 절단을 수행하였다.
절단된 펩타이드를 원심분리에 의해 펠렛화한 차가운 다이에틸 에터(시그마) 중에 침전시키고, 동결건조시켰다. 펠렛을 물(10 내지 15㎖) 중에 재용해시키고 나서, 여과 후, C-18 칼럼(유속 20㎖/분에서 페노미넥스(Phenomenex)) 및 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 이용하는 역상 HPLC를 통해 정제하였다. 정제한 생성물을 동결건조시키고 나서, ESI-LC/MS 및 분석 HPLC에 의해 분석하고, 순수하게 되는 것을 입증하였다(>95%). 질량 결과는 모두 계산치와 일치되었다.
펩타이드 덴드리머 및 펩타이드 컨쥬게이트
상기 기재한 방법을 이용하여 합성한 펩타이드 덴드리머 및 펩타이드 컨쥬게이트의 구조를 이하에 나타낸다.
펩타이드 서열의 말단에서 "NH2-" 기는 서열의 아미노-말단의 끝에서의 아미노기를 나타낸다. 펩타이드 서열의 끝에서 "-am" 기는 서열의 카복시-말단의 끝에서 아마이드 기를 의미한다.
펩타이드 컨쥬게이트 1번:
Figure 112016070643809-pct00025
펩타이드 컨쥬게이트 2번:
Figure 112016070643809-pct00026
펩타이드 덴드리머 3번:
Figure 112016070643809-pct00027
펩타이드 덴드리머 4번:
Figure 112016070643809-pct00028
펩타이드 덴드리머 5번:
Figure 112016070643809-pct00029
펩타이드 덴드리머 8번:
Figure 112016070643809-pct00030
펩타이드 덴드리머 9번:
Figure 112016070643809-pct00031
펩타이드 덴드리머 10번:
Figure 112016070643809-pct00032
펩타이드 덴드리머 11번:
Figure 112016070643809-pct00033
펩타이드 덴드리머 12번:
Figure 112016070643809-pct00034
펩타이드 덴드리머 13번:
Figure 112016070643809-pct00035
실시예 2
펩타이드 덴드리머의 피브리노겐과의 공중합
덴드리머 12번은 5개의 연속적 라이신 잔기를 지니는 분지된 코어를 포함한다. 라이신 잔기는 인접한 라이신 잔기의 측쇄를 통해 공유적으로 연결된다.
피브리노겐을 중합하는 펩타이드 덴드리머 12번의 능력을 평가하였다. 0.005 내지 2㎎/㎖ 범위의 농도에서 용액 중의 30㎕의 덴드리머를 3㎎/㎖(혈액 중에서 발견한 피브리노겐의 수준)로 100㎕ 정제된 인간 피브리노겐에 첨가하였다. 시그마 아멜룽(Sigma Amelung) KC4 델타 응고 분석기를 이용하여 피브리노겐의 중합을 분석하였다. 도 1은 덴드리머 농도가 증가함에 따른 중합(응고) 시간(초)의 플롯을 나타낸다.
결과는 매우 저농도의 덴드리머에서 조차 덴드리머가 거의 즉각적으로 피브리노겐과 공중합할 수 있다는 것을 나타낸다. 0.5㎎/㎖ 초과의 덴드리머 농도에 의한 응고 시간의 증가는 피브리노겐에서 유리 결합 포켓의 수와 비교하여 과량의 피브리노겐-결합 펩타이드에 의해 설명되는 것으로 생각된다. 더 고농도에서, 덴드리머의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐 결합 포켓을 포화시켜, 피브리노겐과 공중합할 수 없는 상당한 수의 과량의 덴드리머 분자를 생성할 수 있다.
실시예 3
피브리노겐과의 공중합 속도에 대한 덴드리머 당 피브리노겐-결합 펩타이드의 수 변화의 효과
본 실시예는 피브리노겐과의 공중합 속도에 대한 펩타이드 덴드리머 당 피브리노겐-결합 펩타이드 수 변화의 효과를 조사한다.
실시예 2에 기재한 것과 동일한 방법을 이용하여 피브리노겐과 공중합하는 펩타이드 덴드리머 4, 5, 10, 11 및 12번의 능력을 평가하였다. 각각의 덴드리머의 농도는 0.005 내지 0.5㎎/㎖로 다양하였다. 도 2는 각각의 상이한 덴드리머의 농도가 증가함에 따른 응고 시간(초)의 플롯을 도시한 도면.
결과는 덴드리머 5번(단지 2개의 피브리노겐-결합 펩타이드/덴드리머)가 피브리노겐과 함께 공중합할 수 없다는 것을 나타낸다. 피브리노겐-결합 펩타이드의 수가 3에서 5로 증가함에 따라, 대략 0.125 내지 대략 0.275㎎/㎖의 덴드리머 농도에서, 공중합 속도는 증가되었다. 대략 0.125㎎/㎖ 미만의 덴드리머 농도에서, 덴드리머 10번(3개의 피브리노겐-결합 펩타이드/덴드리머)은 덴드리머 4번(4개의 피브리노겐-결합 펩타이드/덴드리머)보다 더 빠른 응고 시간에 생성되었다. 대략 0.02 내지 0.5㎎/㎖의 범위에서, 덴드리머 12번(5개 피브리노겐-결합 펩타이드/덴드리머)은 거의 즉각적인 응고를 생성하였다. 대략 0.05 내지 0.3㎎/㎖의 범위에서, 덴드리머 11번(4개 피브리노겐-결합 펩타이드/덴드리머)는 또한 거의 즉각적인 응고를 생성하였다.
피브리노겐이 본 발명의 덴드리머에 의해 중합되는 속도는 일반적으로 덴드리머 당 피브리노겐-결합 펩타이드의 수가 증가됨에 따라 증가되는 것으로 결론을 내린다.
실시예 4
피브리노겐과의 공중합 속도에 대한 피브리노겐-결합 펩타이드 배향의 효과, 및 상이한 피브리노겐-결합 펩타이드 서열의 효과
피브리노겐-결합 펩타이드의 배향이 피브리노겐과 공중합하는 펩타이드 덴드리머의 능력에 영향을 미칠 수 있는지의 여부를 평가하기 위해, 단일 3작용성 아미노산 잔기(라이신)에 부착된 3개의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 펩타이드 덴드리머를 합성하였지만(3분지 덴드리머로서 지칭됨), 피브리노겐-결합 펩타이드 중 하나는 그의 아미노-말단의 끝이 분지된 코어에 부착되고, 그의 카복시-말단의 끝에서 아미드화되도록 배향된다. 피브리노겐과 공중합하는 상이한 피브리노겐-결합 펩타이드 서열을 포함하는 펩타이드 덴드리머의 능력을 또한 시험하였다.
펩타이드 덴드리머 3번 및 10번의 피브리노겐-결합 펩타이드는 각각의 서열 GPRPG(서열번호 15)이다. 펩타이드 덴드리머 10번의 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 그의 카복시-말단의 끝이 분지된 코어에 부착되도록 배향된다. 펩타이드 덴드리머 3번의 피브리노겐-결합 펩타이드 중 하나는 그의 아미노-말단 끝이 분지된 코어에 부착되도록 배향된다. 해당 펩타이드의 카복시-말단의 끝은 아마이드기를 포함한다.
펩타이드 덴드리머 8번의 피브리노겐-결합 펩타이드 중 둘은 서열 GPRPG(서열번호 15)을 가지며, 제3 피브리노겐-결합 펩타이드는 그의 아미노-말단 끝이 분지된 코어에 부착되도록 배향된 서열 APFPRPG(서열번호 14)를 가진다. 해당 펩타이드의 카복시-말단의 끝은 아마이드기를 포함한다.
펩타이드 덴드리머 9번의 피브리노겐-결합 펩타이드 중 둘은 서열 GPRPFPA(서열번호 3)를 가지며, 제3 피브리노겐-결합 펩타이드는 그의 아미노-말단 끝이 분지된 코어에 부착되도록 배향된 서열 APFPRPG(서열번호 14)를 가진다. 해당 펩타이드의 카복시-말단의 끝은 아마이드기를 포함한다.
서열 GPRPG(서열번호 15)는 피브리노겐의 홀 'a' 및 홀 'b'에 결합하지만, 일부는 홀 'a'를 선호한다. 서열 GPRPFPA(서열번호 3)는 피브리노겐에서 홀 'a'에 대해 높은 선호도로 결합한다. 서열 Pro-Phe-Pro는 펩타이드쇄의 백본을 안정화시키고, 노브-홀 상호작용의 친화도를 향상시킨다(Stabenfeld et al., BLOOD, 2010, 116: 1352-1359).
피브리노겐과 공중합하는 덴드리머의 능력을 0.005 내지 0.5㎎/㎖ 범위에 있는 각각의 덴드리머 농도에 대해 실시예 2에 기재한 것과 동일한 방법을 이용하여 평가하였다. 도 3은 각각의 상이한 덴드리머의 농도가 증가함에 따라 얻은 응고 시간(초)의 플롯을 나타낸다.
결과는 펩타이드가 그의 아미노-말단 끝이 분지된 코어(덴드리머 3번)에 부착되게 배향되도록 3 분자 덴드리머의 피브리노겐-결합 펩타이드 중 하나의 배향을 변화시키는 것이 (덴드리머 3번의 응고 시간을 덴드리머 10번의 응고시간과 비교함) 피브리노겐과 공중합하는 덴드리머의 능력을 감소시켰다는 것을 발견하였다. 그러나, 더 높은 피브리노겐 농도에서, 덴드리머 3번은 피브리노겐과 공중합할 수 있었다(데이터 미제시).
아미노-말단의 끝이 분지된 코어에 부착되도록 배향된 상이한 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드를 지니는 3분지 덴드리머는 피브리노겐과 공중합할 수 있었다(덴드리머 8번에 대한 결과 참조).
피브리노겐-결합 펩타이드 중 둘이 피브리노겐에서 홀 'b'에 우선적으로 결합하는 서열(서열 GPRPFPA(서열번호 3))을 포함하는 3분자 덴드리머(이들 펩타이드는 그들의 카복시-말단의 끝이 분지된 코어에 부착되도록 배향되고, 역방향 서열(즉, 서열 APFPRPG(서열번호 14))을 포함하는 다른 펩타이드는 그의 아미노-말단의 끝이 분지된 코어(덴드리머 9번)에 부착되도록 배향됨)은 또한 피브리노겐과의 공중합에서 매우 활성이었다.
실시예 5
피브리노겐과 공중합하는 상이한 피브리노겐-결합 펩타이드 서열을 지니는 펩타이드 덴드리머의능력
GPRPG(서열번호 15) 및 GPRPFPA(서열번호 3) 모티프는 주로 피브리노겐 상의 'a' 홀에 결합한다. 본 실시예는 피브리노겐과 공중합하는 키메라 펩타이드 덴드리머(즉, 동일한 분지된 코어에 부착된 상이한 피브리노겐-결합 펩타이드 서열을 지니는 펩타이드 덴드리머)의 능력 평가를 기재한다.
펩타이드 덴드리머 13번은 서열 GPRPG-(서열번호 15)를 지니는 2개의 피브리노겐-결합 펩타이드('a' 홀에 대한 결합 선호도를 가짐), 및 서열 GHRPY-(서열번호 11)를 지니는 2개의 피브리노겐-결합 펩타이드('b' 홀에 우선적으로 결합함)를 포함하는 키메라 4분지 펩타이드 덴드리머이다. 비-키메라 펩타이드 덴드리머 11번 및 12번은 각각 4- 및 5-암 펩타이드 덴드리머이다. 이들 덴드리머의 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 서열 GPRPG-(서열번호 15)를 가진다. 덴드리머 11, 12 및 13번의 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 분지된 코어에 대한 그의 카복시-말단의 끝에서 부착된다.
피브리노겐과 공중합하는 덴드리머의 능력을 0.005 내지 0.5㎎/㎖ 범위에 있는 각각의 덴드리머 농도에 대해 실시예 2에 기재한 것과 동일한 방법을 이용하여 평가하였다. 도 4는 각각의 상이한 덴드리머의 농도가 증가함에 따라 얻어진 응고 시간(초)의 플롯을 나타낸다.
결과는 키메라 덴드리머를 이용하는 응고속도가 0.3㎎/㎖ 미만의 농도에서 비키메라 덴드리머보다 더 느리다는 것을 나타낸다. 그러나, 도 5는 상이한 덴드리머를 이용하여 얻은 하이드로겔의 사진을 나타낸다. 겔을 사용한 펩타이드 덴드리머의 번호(11, 12 및 13)로 표지하고, "P"는 생성물을 이용하여 형성된 하이드로겔을 표지하는데, 이때 몇몇 피브리노겐-결합 펩타이드는 가용성 인간 혈청 알부민에 부착된다. 키메라 덴드리머에 의해 형성된 하이드로겔은 더 밀집하였고, 덴드리머 11 및 12번을 이용하여 형성된 하이드로겔에 비해 더 적은 유체를 함유하였다(3㎎/㎖ 피브리노겐에서, 또는 더 고농도의 피브리노겐에서). 따라서, 키메라 덴드리머를 이용할 때 응고 시간은 더 느리지만, 이 덴드리머를 이용하여 형성된 하이드로겔은 더 밀집하였다.
실시예 6
피브리노겐과 공중합하는 펩타이드 덴드리머 및 펩타이드 컨쥬게이트의 혼합물의 능력
서열 GPRP-(서열번호 1)의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 'a' 홀에 강하게 그리고 우선적으로 결합한다(Laudano et al., 1978 PNAS 7S). 펩타이드 컨쥬게이트 1번은 이 서열을 지니는 2개의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하며, 각각은 라이신 잔기에 부착된다. 제1 펩타이드는 그의 카복시-말단의 끝이 링커에 의해 라이신 잔기에 부착되고, 제2 펩타이드는 그의 아미노-말단의 끝에서 링커에 의해 라이신 잔기에 부착된다. 제2 펩타이드의 카복시-말단의 끝은 아마이드기를 포함한다.
서열 GHRPY-(서열번호 11)의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 'b' 홀에 강하게 그리고 우선적으로 결합한다(Doolittle and Pandi, Biochemistry 2006, 45, 2657-2667). 펩타이드 컨쥬게이트 2번은 링커에 의해 라이신 잔기에 부착된 이 서열을 지니는 제1 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함한다. 역방향 서열(YPRHG(서열번호 16))을 갖는 제2 피브리노겐-결합 펩타이드는 그의 아미노 말단 끝에서 링커에 의해 라이신 잔기에 부착된다. 제2 펩타이드의 카복시-말단의 끝은 아마이드기를 포함한다.
링커는 펩타이드가 서로로부터 연장되게 한다.
펩타이드 컨쥬게이트 1 또는 2번(2㎎/㎖)을 펩타이드 덴드리머 3 또는 4번, 및 피브리노겐과 혼합하였고, 피브리노겐과 공중합하는 혼합물의 능력을 0.025 내지 0.5㎎/㎖ 범위에 있는 각각의 덴드리머의 농도에 대해 실시예 2에 기재한 것과 동일한 방법을 이용하여 평가하였다. 도 6은 각각의 상이한 덴드리머의 농도가 증가함에 따라 얻어진 응고 시간(초)의 플롯을 나타낸다.
결과는 놀랍게도 펩타이드 컨쥬게이트 2번(즉, B-노브 펩타이드를 지님) 및 덴드리머 펩타이드를 함유하는 혼합물만이 상승적이고 증가된 활성인 반면, 펩타이드 컨쥬게이트 1번(A-노브 펩타이드)을 함유하는 혼합물은 펩타이드 컨쥬게이트 2번 또는 펩타이드 덴드리머 중 하나에 첨가될 때 활성이 아니라는 것을 나타낸다.
실시예 7
인간 혈장에서 피브리노겐을 중합하는 펩타이드 덴드리머의 능력
인간 혈장에서 피브리노겐을 중합하는 몇몇 상이한 펩타이드 덴드리머(4, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13번)의 능력을 시험하였다.
30㎕의 각각의 덴드리머(0.25㎎/㎖의 농도에서)를 37℃에서 100㎕ 인간 혈장에 첨가하고 나서, 시그마 아멜룽 KC4 델타 응고 분석기를 이용하여 피브리노겐의 중합을 결정하였다.
각각의 덴드리머에 대한 응고 시간을 도 7에 나타내고, 펩타이드 덴드리머 10, 11, 4, 12 및 13번은 인간 혈장에서 피브리노겐을 중합할 수 있으며, 덴드리머 12번이 특히 효과적이라는 것(1초 미만의 응고 시간)을 나타낸다. 그러나, 펩타이드 덴드리머 5, 8 및 9번은 인간 혈장에서 피브리노겐을 중합할 수 없었다.
실시예 8
바로 사용가능한 펩타이드 덴드리머 제형에 대한 멸균 효과
본 실시예는 수화된 젤라틴과 함께 바로 사용가능한 페이스트로서 제형화된 펩타이드 덴드리머의 지혈제 활성에 대한 감마 조사 효과를 기재한다.
2㎖의 펩타이드 덴드리머 12 또는 13번의 용액을 서지플로(SURGIFLO) 지혈제 기질(수화된 유동성 젤라틴 기질)과 혼합하여 각각의 펩타이드의 페이스트를 형성하였다. 각각의 페이스트를 30kGy 용량에서 60Co 감마선 조사에 의해 멸균한 다음, 실온에서 저장하였다. 멸균 페이스트의 샘플을 2주 및 4주 동안 저장 후 사용하였다.
저장 후에, 10mM HEPES 완충제를 이용하여 각각의 페이스트로부터 펩타이드 덴드리머를 추출하였다. 30㎕의 각각의 추출물(약 0.25 ㎎/㎖의 펩타이드 농도를 지님)을 3㎎/㎖에서 100㎕의 인간 피브리노겐에 첨가하고 나서, 37℃에서 피브리노겐을 중합하는 각각의 덴드리머의 능력(응고 활성)을 시그마 아멜룽 KC4 델타 응고 분석기를 이용하여 결정하였다. 비조사 대조군 샘플의 중합 활성을 또한 결정하였다. 결과를 이하의 표에서 요약한다.
Figure 112016070643809-pct00036
결과는 수화된 젤라틴과 함께 바로 사용가능한 페이스트로서 제형화한 본 발명의 펩타이드 덴드리머가 조사 후 멸균 후에 피브리노겐을 중합하는 능력을 보유한다는 것을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Haemostatix Limited <120> PEPTIDE DENDRIMERS COMPRISING FIBRINOGEN-BINDING PEPTIDES <130> WO/2015/104544 <140> PCT/GB2015/050024 <141> 2015-01-08 <150> GB1400292.7 <151> 2014-01-08 <160> 16 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Pro Arg Pro 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Pro Arg Val 1 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Pro Arg Pro Phe Pro Ala 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Pro Arg Val Val Ala Ala 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Pro Arg Pro Val Val Glu Arg 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gly Pro Arg Pro Ala Ala 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Pro Arg Pro Pro Glu Cys 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gly Pro Arg Pro Pro Glu Arg 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Pro Ser Pro Ala Ala 1 5 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gly His Arg Pro 1 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly His Arg Pro Tyr 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gly His Arg Pro Leu 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Carboxy-terminal end comprises an amide group <400> 13 Gly His Arg Pro Tyr 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Carboxy-terminal end may comprise an amide group <400> 14 Ala Pro Phe Pro Arg Pro Gly 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Carbox-terminal end may comprise an amide group <400> 15 Gly Pro Arg Pro Gly 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Carboxy-terminal end comprises an amide group <400> 16 Tyr Pro Arg His Gly 1 5

Claims (40)

  1. 하기 일반식(I):
    Figure 112022032793732-pct00057
    의 펩타이드 덴드리머로서,
    식 중
    FBP는 피브리노겐-결합 펩타이드이고;
    -(링커)-는 -NH(CH2)nCO-(여기서, n은 1 내지 10)를 포함하는 비-펩타이드 링커이고;
    X는 3작용성 아미노산 잔기이고;
    Y는 -FBP 또는 -NH2이고;
    Z는 -[-X-(링커)-FBP]a-(링커)-FBP이고; a는 1 내지 10이며,
    각 피브리노겐-결합 펩타이드는 그 카르복시 말단에서 분지된 코어에 부착되고, 그 아미노 말단에 GPRP-(서열번호: 1) 또는 GHRP-(서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는, 펩타이드 덴드리머.
  2. 제1항에 있어서, 상기 3작용성 아미노산 잔기는 라이신, 오르니틴, 알기닌, 아스팔트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민 또는 시스테인 잔기를 포함하는, 펩타이드 덴드리머.
  3. 제1항에 있어서, 하기 일반식 (II)를 갖는 펩타이드 덴드리머:
    Figure 112022032793732-pct00038

    식 중:
    FBP는 피브리노겐-결합 펩타이드이고;
    -(링커)-는 -NH(CH2)nCO-(여기서, n은 1 내지 10)를 포함하는 비-펩타이드 링커이며;
    Y는 -FBP 또는 -NH2이며;
    Z는:
    Y가 -NH2일 때,
    Figure 112022032793732-pct00039
    이거나; 또는
    Y가 -NH2일 때,
    Figure 112022032793732-pct00040
    이거나; 또는
    Y가 -NH2일 때,
    Figure 112022032793732-pct00041
    이거나; 또는
    Y가 -FBP이고 a가 1 내지 10일 때,
    Figure 112022032793732-pct00042
    이고,
    여기서, R은-(CH2)4NH-, -(CH2)3NH-, 또는 -(CH2)3NHCNHNH-이다.
  4. 제1항에 있어서, 하기 일반식 (III)을 갖는 펩타이드 덴드리머:
    Figure 112022032793732-pct00043

    식 중:
    FBP는 피브리노겐-결합 펩타이드이고;
    -(링커)-는 -NH(CH2)nCO-(여기서, n은 1 내지 10)를 포함하는 비-펩타이드 링커이며;
    Y는 -FBP 또는 -NH2이며;
    Z는:
    Y가 -NH2일 때,
    Figure 112022032793732-pct00044
    이거나; 또는
    Y가 -NH2일 때,
    Figure 112022032793732-pct00045
    이거나; 또는
    Y가 -NH2일 때,
    Figure 112022032793732-pct00046
    이거나; 또는
    Y가 -FBP이고 a가 1 내지 10일 때,
    Figure 112022032793732-pct00047
    이다.
  5. 제4항에 있어서, a는 1 내지 3인, 펩타이드 덴드리머.
  6. 제1항에 있어서, 상기 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 피브리노겐의 홀 'a'에 우선적으로 결합하는, 펩타이드 덴드리머.
  7. 제1항에 있어서, 상기 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 홀 'a' 이상으로 피브리노겐의 홀 'b'에 우선적으로 결합하는, 펩타이드 덴드리머.
  8. 제1항에 있어서, 하기를 포함하지 않는, 펩타이드 덴드리머:
    Figure 112022032793732-pct00048
  9. 제1항에 있어서, 상이한 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 펩타이드 덴드리머.
  10. 제9항에 있어서, 상이한 서열의 상기 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 홀 'a'에 대한 결합의 상이한 선택성을 갖는, 펩타이드 덴드리머.
  11. 제9항에 있어서, 상이한 서열의 상기 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 피브리노겐의 홀 'a'에 우선적으로 결합하는 제1 피브리노겐-결합 펩타이드, 및 상기 제1 피브리노겐-결합 펩타이드보다 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 피브리노겐의 홀 'a'에 대한 결합의 더 큰 선택성으로 결합하는 제2 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는, 펩타이드 덴드리머.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1 피브리노겐-결합 펩타이드는 아미노-말단에 아미노산 서열 GPRP-(서열번호 1)을 포함하는, 펩타이드 덴드리머.
  13. 제9항에 있어서, 상이한 서열의 상기 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 피브리노겐의 홀 'a'에 우선적으로 결합하는 제1 피브리노겐-결합 펩타이드, 및 피브리노겐의 홀 'a' 이상으로 피브리노겐의 홀 'b'에 우선적으로 결합하는 제2 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는, 펩타이드 덴드리머.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제1 피브리노겐-결합 펩타이드는 아미노-말단의 끝에 아미노산 서열 GPRP-(서열번호 1)를 포함하는, 펩타이드 덴드리머.
  15. 제13항에 있어서, 상기 제2 피브리노겐-결합 펩타이드는 그 아미노 말단에 아미노산 서열 GHRP-(서열번호 10)를 포함하는, 펩타이드 덴드리머.
  16. 제13항에 있어서, 상기 제2 피브리노겐-결합 펩타이드는 그 아미노 말단에 아미노산 서열 GHRPY-(서열번호 11)를 포함하는, 펩타이드 덴드리머.
  17. 제1항에 있어서, 하기를 포함하는, 펩타이드 덴드리머:
    Figure 112022032793732-pct00056
  18. 제1항의 펩타이드 덴드리머 및 2 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 펩타이드 컨쥬게이트를 포함하는, 출혈의 치료 또는 상처를 치료하는데 사용하기 위한 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 펩타이드 컨쥬게이트는 제1항에 따른 펩타이드 덴드리머인, 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 펩타이드 덴드리머의 상기 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 피브리노겐의 홀 'a'에 우선적으로 결합하고, 상기 펩타이드 컨쥬게이트의 상기 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 홀 'a' 이상으로 피브리노겐의 홀 'b'에 우선적으로 결합하는, 조성물.
  21. 제18항에 있어서, 상기 펩타이드 덴드리머의 상기 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 홀 'a' 이상으로 피브리노겐의 홀 'b'에 우선적으로 결합하고, 상기 펩타이드 컨쥬게이트의 상기 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 홀 'b' 이상으로 피브리노겐의 홀 'a'에 우선적으로 결합하는, 조성물.
  22. 제1항에 따른 펩타이드 덴드리머, 또는 제18항에 따른 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는, 출혈의 치료 또는 상처를 치료하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 바로 사용가능한 지혈제 제형이며, 상기 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 수화된 젤라틴을 포함하는, 약제학적 조성물.
  24. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 멸균성인, 펩타이드 덴드리머.
  25. 제18항에 있어서, 멸균성인, 조성물.
  26. 제1항의 펩타이드 덴드리머 또는 제18항의 조성물의 멸균 방법으로서, 상기 펩타이드 덴드리머 또는 조성물을 감마 조사에 노출시키는 단계를 포함하는, 멸균 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 펩타이드 덴드리머 또는 조성물을 30kGy까지 감마 조사에 노출시키는 단계를 포함하는, 멸균 방법.
  28. 피브리노겐의 중합 방법으로서, 피브리노겐을 제1항 내지 내지 제17항 중 어느 한 항의 펩타이드 덴드리머, 또는 제18항에 따른 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 피브리노겐의 중합 방법.
  29. 하이드로겔의 형성을 위한 키트로서, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 펩타이드 덴드리머, 또는 제18항에 따른 조성물 및 별도로 피브리노겐을 포함하는, 하이드로겔의 형성을 위한 키트.
  30. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 펩타이드 덴드리머, 또는 제18항에 따른 조성물 및 피브리노겐의 공중합체를 포함하는, 출혈의 치료 또는 상처를 치료하는데 사용하기 위한 하이드로겔.
  31. 출혈의 치료 또는 상처를 치료하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 펩타이드 덴드리머.
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