CN1222918A - 细胞粘连抑制剂 - Google Patents
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Abstract
式(Ⅰ)的环肽或其盐,其中Xaa1可从选自Phe、Lys和Arg的L－氨基酸;选自Phe和Met的D－氨基酸,所述L－和D－氨基酸任选在其α－碳或其α－氨基上被C1－4烷基取代和MeIle中选择;Xaa2、Xaa3和Xaa4分别为Leu、Asp、Val,任选在其α－碳或其α－氨基上被C1－4烷基取代;X1可从选自Ala、Phe、Arg、Lys、Trp、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)、Orn(Me2)、Lys(CHMe2)和Arg(Pmc)的D－氨基酸,任选在其α－碳或其α－氨基上被C1－4烷基取代;式(Ⅱ)化合物;NH(CH2)5CO和NH(CH2)2S(CH2)yCO,其中y为1或2中选择;X2可从选自Ala、Arg、Lys、His、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)和Orn(Me2)的D－氨基酸,任选在其α－碳或其α－氨基上被C1－4烷基取代;NH(CH2)2SCH2CO和NH(CH2)xCO,其中x为2或3中选择;Xaa5和Xaa6各自独立为选自Ala和Arg的D－氨基酸,任选在其α－碳或其α－氨基上被C1－4烷基取代;p为0或1;q为0或当p为1时,q为0或1。所述环肽抑制血管细胞粘附分子－1和纤连蛋白与整联蛋白非常后期抗原4(α4β1)的互相作用以及抑制粘膜地址素粘附分子－1(MAdCAM－1)与整联蛋白α4β7的互相作用。它们在例如类风湿性关节炎、多发性硬化症、哮喘、牛皮癣、炎症性肠疾病和胰岛素依赖性糖尿病中具有治疗作用。
Description
许多细胞-细胞和细胞-细胞外基质的相互作用是由蛋白配体(如纤连蛋白、玻连蛋白和VCAM-1)和它们的整联蛋白受体[如VLA-4(α4β1]介导的。最新研究表明这些相互作用在许多生理(如胚的形成和伤口的愈合)和病理(如肿瘤细胞的侵入和转移、炎症、动脉粥样硬化症和自身免疫性疾病)状态中起重要的作用。可以选择性抑制部分此相互作用的药物预计可用于治疗某些疾病。
整联蛋白为异源二聚体的细胞表面受体，它们含有非共价结合的α和β亚单位。应用分子生物学和蛋白化学技术已经鉴定了数种α和β亚单位。根据β亚单位可以将整联蛋白家族再分为多个种类，它们可以与一个或多个α亚单位结合。最广泛分布的整联蛋白属于β1类，也称为非常后期抗原(VLA)。整联蛋白的第二类为白细胞特异性受体，含有与β2蛋白复合的三个α亚单位(αL、αM或αX)中的一个。细胞粘连物(cytoadhesins)αⅡbβ3和αvβ3组成第三类整联蛋白。第四类整联蛋白包括α4β7。
多种的蛋白起着整联蛋白受体配体的作用。一般而言，可以由整联蛋白识别的蛋白归为以下三类中的一种：细胞外基质蛋白、血浆蛋白和细胞表面分子。细胞外基质蛋白，如胶原蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、血小板反应蛋白和玻连蛋白可以与许多整联蛋白结合。许多此类粘连蛋白也可以在血浆中循环并与活化的血细胞结合。血浆中整联蛋白配体的其它成分包括纤维蛋白原和X因子。细胞结合的补体C3bi和数种跨膜蛋白，例如Ig-样的细胞粘连分子(ICAM-1,2,3)和血管细胞粘连分子(VCAM-1)(Ig超家族的成员)也起着某些整联蛋白细胞表面配体的作用。粘膜地址素细胞粘连分子-1(MAdCAM-1)为Ig超家族的另一个成员并被整联蛋白α4β7结合。
已经鉴定了多种整联蛋白的靶氨基酸序列。例如在α5β1、αⅡβ3和αv5β3中靶序列为Arg-Gly-Asp三肽,在蛋白如纤连蛋白、纤维蛋白原、血小板反应蛋白、1型胶原蛋白、玻连蛋白和vWF中发现。然而，Arg-Gly-Asp序列不是唯一的可以被粘连配体用作整联蛋白的识别基元。另一整联蛋白α4β1与纤连蛋白的可变区(CS1)是通过序列Leu-Asp-Val结合，血小板整联蛋白αⅡbβ3也可以识别纤维蛋白原γ链的羧基-末端的序列His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gla-Ala-Gly-Asp-Val。
本发明主要涉及可以阻断配体VCAM-1与其整联蛋白受体VLA-4(α4β1)的相互作用的药物[见对VLA-4的综述：整联蛋白VLA-4的结构和其细胞-细胞以及细胞基质粘连功能，M.E.Hemler,M.J.Elices,C.Parker和Y.Takada,(Immunological Reviews),114(1990)45-65.]。整联蛋白α4β1表达于许多造血细胞和已确立的细胞系中，包括造血前体、外周和细胞毒素T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、胸腺细胞和嗜酸性细胞。不同于仅仅涉及细胞-细胞外基质相互作用的其它的β1整联蛋白，α4β1可以介导细胞-细胞以及细胞-细胞外基质的相互作用。表达活化的α4β1的细胞可以与纤连蛋白的羧基末端细胞结合区域结合(非Arg-Gly-Asp介导的)，可以与内皮细胞表达的VCAM-1结合，可以相互结合以促进同型凝集。内皮细胞的VCAM-1的表达可以受促炎细胞因子例如INF-γ、TNF-α和IL-1β的正调节。
本发明也涉及阻断配体MAdCAM-1和整联蛋白α4β7相互作用的药物。
α4β1-介导的细胞粘连的调节在多种生理过程中起着重要的作用，包括T-细胞增殖、B-细胞在生发中心的定位以及活化的T细胞和嗜酸性细胞与内皮细胞的粘连。此外，整联蛋白α4β1-介导的过程与肿瘤细胞转移和涉及淋巴细胞、单核细胞或嗜酸性细胞募集的疾病有关，如多发性硬化症、类风湿性关节炎、哮喘、牛皮癣、胰岛素依赖性糖尿病、肾小球性肾炎、炎症性肠疾病、缺血性心脏病、心肌炎、外周血管疾病、移植排斥反应如慢性同种移植排斥反应和过敏性疾病。在上述疾病过程中涉及VLA-4/VCAM-1相互作用的证据已经通过对下列的调查研究积累起来：在各种体外和体内炎症的试验模型(如小鼠接触性皮肤过敏性反应)、试验性自身免疫性脑脊髓炎、肺抗原激发、糖尿病、溃疡性结肠炎、肾炎和同种移植排斥反应中对VLA-4或VCAM-1特异性的肽CS-1和抗体的作用。此外，整联蛋白α4β7-介导的过程与疾病例如炎症性肠疾病和胰岛素依赖性糖尿病的淋巴细胞的募集有关。
例如，在关节炎(通过单一腹膜内注射得自A组链球菌细胞壁的肽聚糖-多糖片段在同系繁殖的雌性Lewis大鼠中诱导的关节炎)试验模型中，给关节炎发病的动物在关节炎开始时(第0-4天，300μg/天)时或在第11-16天静脉给予CS-1，表明可以抑制急性和慢性炎症[参见：通过干扰白细胞粘连和募集合成纤连蛋白肽抑制大鼠关节炎，S.M.Wahl,J.B.Allen,K.L.Hines,T.Imamichi,A.M.Wahl,L.T.Furcht和J.B.McCarthy,J.Clin.Invest.,94(1994)655-662]。
在另一个炎症模型(噁唑酮(ozazalone)或2,4-二硝基氟代苯-敏感小鼠的接触过敏反应)，静脉给予抗-α-4特异性单克隆抗体R1-2或PS/2(在激发前4-6小时)可以显著抑制(在耳肿胀反应中减少50-60％)输出反应[参见：对整联蛋白α-4亚单位的单克隆抗体抑制鼠的接触性过敏反应，P.L.Chisholm,C.A.Williams和R.R.Lobb,Eur.J.Immunol.,23(1993)682-688]。在肠炎症模型(在Cotton-top tamarin中的急性结肠炎)中，与VLA-4结合的抗-α4整联蛋白单克隆抗体HP1/2导致急性结肠炎的显著的减弱。相反，在Cotton-top tamarin中的10天治疗阶段后，两种抗-E-选择蛋白单克隆抗体(BB11和EH8)微微减弱结肠炎[参见：在Cotton-top tamarin中由抗-α4整联蛋白单克隆抗体的结肠炎减弱作用，D.K.Podolsky,R.Lobb,N.King,C.D.Benjamin,B.Pepinsky,P Sehgal和M.deBeaumont,J.Clin.Invest.,92(1993)372-380]。
已经证明所述抗体对于自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型也有效。EAE为中枢神经系统的炎症性疾病，与多发性硬化症相似。在该模型中，实验性诱导炎症。在EAE和多发性硬化症中，循环的白细胞可以穿过血-脑屏障并破坏髓鞘质，从而导致神经传导损伤和麻痹。通过启动动物的CNS蛋白样髓鞘质碱性蛋白(MBP)可以活性地诱导EAE或通过注射对这些CNS抗原特异性的活化的淋巴细胞进行EAE的诱导。当给辐射的雌性(PL/J x SJL)F1小鼠注射时，各种单克隆抗体，MK/1(抗VCAM-1)和PS/2和LPAM-1(抗α4整联蛋白)延缓疾病的发病。当在疾病发病后，继续每3天注射α4整联蛋白抗体(即LPAM-1和PS/2)时，不仅可以延缓疾病的发病，而且疾病的严重程度也可以显著降低[参见：Surface Expression of α4 Integrin by CD4 T Cells IsRequired for Their Entry into Brain Parenchyma,J.L.Baron,J.A.Madri,N.H.Ruddle,J.Hashim和C.A.Janeway,Jr.,J.Exp.Med.,177(1993)57-68]。
也已经证明VCAM-1(M/K-1)和VLA-4(PS-2)的单克隆抗体在试验性哮喘模型(抗原诱导的嗜酸性细胞和T-细胞募集)中有活性。当在吸入的卵白蛋白激发前24小时腹膜内注射这两种抗体时，它们可以显著降低(73-74％)小鼠嗜酸性细胞的透过[参见：Role of vascular celladhesion molecule-1/verv late activation antigen 4 and intracellularadhesion molecule 1/lymphocyte function-associated antigen linteractions in antigen-induced eosinophil and T-recruitment into thetissue,H.Nakajima,H.Sano,T.Nishimura,S.Yoshida and I.Iwamoto,JExp.Med.,179(1994)1145-1154]。当在卵白蛋白激发前注射抗VLA-4单克隆抗体HP1/2(3-10mg/kg)时，在豚鼠中获得了相似的结果[参见：Antibody to very late activation antigen 4 prevent antigen-inducedbronchial hyperreactivity and cellular infiltration in the guinea-pegairways,M.Pretolani,C.Ruffie,J-R Lapa e Silva,D.Joseph,R.R.Lobb和B.B.Vargafrig,J.Exp.Med.,180(1994),795-805和Role of the VLA-4 intergrin inleukocyte recruitment and bronchial hyperresponsiveness inthe guinea-pig,A.A.Y.Milne和P.J.Piper,European J Pharmacol.,282(1995),243-249]。
证明对α4-整联蛋白(LPAM-1)和其配体之一VCAM-1特异性的抗体对于治疗非过度肥胖性糖尿病小鼠的胰岛素依赖性糖尿病也有效。认为胰岛素依赖性糖尿病为自身免疫性疾病，其中活化的T淋巴细胞破坏胰岛中产生胰岛素的β-细胞。抗体R1-2可以阻止非过度肥胖糖尿病小鼠剂量依赖性的胰岛炎的出现。对于疾病的阻断伴随着胰岛的淋巴细胞透过的显著降低[参见：The Pathogenesis of Adoptive MurineAutoimmune Diabetes Requires an Interaction Betweenα4-Integrins andVascular Cell Adhesion Molecule-1,J.L.Baron,E-P.Reich,I.Visintin和C.A.Janeway,Jr.,J.Clin.Invest.,93(1994)1700-1708]。
已经证明表达整联蛋白α4β1的细胞与肝素Ⅱ结合区域的序列结合并选择性地剪接位于纤连蛋白的羧基末端细胞结合区域的Ⅲ型连接片段(ⅢCS)。在ⅢCS区域，α4β1与定义为CS-1的肽序列(一个25个氨基酸的肽)具有很高的结合力结合，表明这是纤连蛋白α4β1相互作用的主要位点。三肽Leu-Asp-Val是CS-1中能够支持造血细胞粘连或能够抑制α4β1-介导的细胞与纤连蛋白结合的最小序列[参见CS1:The Minimal Essential Sequence for a Major Cell Type-SpecificAdhesion Site(CS1)Within the Altematively Spliced TypeⅢConnecting Segment Domain of Fibronectin is Leucine-Aspartic Acid-Valine,A.Komoriya,L.J.Green,M.Mervic,S.S.Yamada,K.M.Yamada和M.J.Humphries,J.Biol.Chem.,23(1991)15075-15079；Activation-Dependent Recognition by Hematopoietic Cells of the LDVSequence in the V Region of Fibronectin,E.A.Wayner和N.L.Kovach,J.Cell Biol.,116(1992)489-497.]。
除含有Leu-Asp-Val的上述序列外，已经报道环八肽1-金刚烷乙酰基-Cys-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys(含有两个半胱氨酸残基间的二硫桥)在阻断Jurkat细胞与CS-1包被板的粘连中与含有肽Cys-Leu-His-Gly-Pro-Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr的LDV同样有效(IC5030μM)。所述环肽也可以抑制Jurkat细胞与纤连蛋白包被板的结合。除抑制α4β1-诱导的粘连外，所述八肽也可以抑制αvβ3功能以及αⅡbβⅢa-依赖性测定。因此，所述八肽对α4β1介导的粘连没有选择性[参见：Cyclic RGD Peptide Inhibitsα4β1 Interaction with ConnectingFragment l and Vascular Cell Adhesion Molecule,P.M.Cardarelli,R.R.Cobb,D.M.Nowlin,W.Scholz,F.Gorcsan,M.Moscinski,M.Yasuhara,S-L.Chiang和T.J.Lobl,J.Biol.Chem.,269(1994)18668-18673]。
也已经报导非常少的几个非肽类化合物[参见：Non-peptidicSurrogates of the Leu-Asp-Val Sequence and Their Use in the Treatmentof Inflammation,Autoimmune Diseases and Tumour progression,YEDAResearch and Development Co.Ltd,WO94/02445,1994年2月3日公开]可以抑制α4β1-诱导的粘连。
此外，在WO96/00581(1996年1月11日公开)中报道部分含有Leu-Asp-Val序列和至少一个Cys氨基酸残基和/或Glu氨基酸残基的环肽可以抑制α4β1整联蛋白与VCAM-1或纤连蛋白的结合。然而，在该专利申请中公开的环肽中的三个(即c(Glu-Trp-Leu-Asp-Val)、c(Glu-Trp-Leu-Asp-Val-Asp)和c(Glu-Trp-Leu-Asp-Val-Pro-Glu-Trp-Leu-Asp-Val)，其中c代表所述氨基酸序列为环状的)证明为HL-60细胞与VCAM-1-IgG融合蛋白结合的非常弱的抑制剂(IC50值分别为94、＞1000和＞1000μM)(参见：P.Vanderslice,K.Ren,J.K.Revelle,D.C.Kim,D.Scott,R.J.Bjercke,E.T.H.Yeh,P.J.Beck和T.P.Kogan,J.Immunology,158(1997),1710-1718]。
也已经报道二硫环五肽Arg-Cys-Asp-硫代脯氨酸-Cys(硫代脯氨酸=噻唑烷-4-羧酸)为白细胞与纤连蛋白粘连的抑制剂。此外，该环肽也可以抑制与纤连蛋白的120kDa的胰凝乳蛋白酶(chymotryptic)片段的结合，胰凝乳蛋白酶含有Arg-Gly-Asp中心细胞结合区域。同样，该肽对于α4β1和α5β1结合没有选择性[参见：A Novel CyclicPentapeptide Inhibitsα4β1和α5β1 Intergrin-Mediated Cell Adhesion,D.M.Nowlin,F.Gorcsan,M.Moscinski,S-L.Chiang,T.J.Lobl和P.M.Cardarelli,J.Biol.Chem.,268(1993)20352-20359]。
在我们共同未决的PCT申请WO96/20216(1996年7月4日公开)中报道了抑制α4β1整联蛋白与VCAM-1或纤连蛋白结合的含有Leu-Asp-Val序列的环肽。
尽管已经发现了多种抑制VCAM-1和纤连蛋白与整联蛋白VLA4相互作用的肽，但是仍然需要可抑制该种相互作用的替代化合物，特别是可以制成缓释药用组合物的化合物。也需要可抑制MAdCAM-1与整联蛋白α4β7相互作用的化合物。
根据本发明的一个方面提供具有下式的环肽或其盐：
其中Xaa1可从选自Phe、Lys和Arg的L-氨基酸；选自Phe和Met的D-氨基酸，所述L-和D-氨基酸任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；和MeIle中选择；
Xaa2为Leu，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
Xaa3为Asp，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
Xaa4为Val，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
X1可从选自Ala、Phe、Arg、Lys、Trp、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)、Orn(Me2)、Lys(CHMe2)和Arg(Pmc)的D-氨基酸，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
NH(CH2)5CO和NH(CH2)2S(CH2)yCO，其中y为1或2中选择；
X2可从选自Ala、Arg、Lys、His、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)和Orn(Me2)的D-氨基酸，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；NH(CH2)2SCH2CO和NH(CH2)xCO，其中x为2或3中选择；
Xaa5和Xaa6各自独立为选自Ala和Arg的D-氨基酸，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
p为0或1；q为0或当p为1时，q为0或1；其前提为当Xaa1为MeIle,Xaa2为Leu,Xaa3为Asp,Xaa4为Val,p和q均为0，
ⅰ)当X1为D-Ala时，X2不为D-Ala、D-Arg或D-Lys；
ⅱ)当X1为：
时，X2不为D-Arg；
ⅲ)当X1为D-Arg时，X2不为D-Ala、D-Arg或D-His；
ⅳ)当X1为D-Orn(CHMe2)或D-Arg(Pmc)时，X2不为D-Ala；
ⅴ)当X1为D-Lys时，X2不为D-Ala或D-Lys；
ⅵ)当X1为D-Phe或D-Trp时，X2不为D-Lys或D-Arg。
优选所述环肽在此后所述MOL T-4细胞-纤连蛋白测定中，具有IC50小于10μM，更优选小于5μM，或者在此后所述的MOL T-4细胞/重组可溶性VCAM-1测定中，具有IC50小于30μM，更优选小于5μM。
所述环肽在此后所述的JY细胞/MAdCAM-1粘连测定中也具有活性。
可以理解除特别指明外，氨基酸具有L-构型，所有的残基成分即Xaa1至Xaa6、形成所述环肽的X1和X2是沿氨基(N-末端)至羧基(C-末端)方向由左向右书写的。所述残基成分连接在一起使一个残基的羧基末端与相邻残基的氨基末端相连。在天然存在的氨基酸具有一个以上的羧基和/或氨基的情况下，连接分别通过α-羧基和α-氨基完成。D-hArg(Et)2、D-Orn(CHMe2)、D-Orn(Me2)、D-Lys(CHMe2)和D-Arg(Pmc)残基的连接此后根据符号进行定义。在环肽中天然存在的氨基酸残基一般以三个字母代码来定义，Ala代表丙氨酸，His代表组氨酸，Ile代表异亮氨酸，Lys代表赖氨酸，Arg代表精氨酸，Val代表缬氨酸，Asp代表天冬氨酸，Met代表甲硫氨酸，Phe代表苯丙氨酸，Leu代表亮氨酸和Trp代表色氨酸。MePhe和MeIle分别指N-甲基苯丙氨酸和N-甲基异亮氨酸。D-hArg(Et)2、D-Orn(CHMe2)、D-Orn(Me2)、D-Lys(CHMe2)和D-Arg(Pmc)在此后的所述符号中定义。
可以理解一般性术语例如“烷基”包括直链和支链的变异体。本发明的化合物包括溶剂化物例如水化物，并包括前体药物例如在体内可以水解的酯。
优选Xaa1包括L-MeIle、L-MePhe、L-Lys、L-Arg、D-Phe和D-Met。优选的Xaa2、Xaa3和Xaa4分别为Leu、Asp和Val。X1优选可从选自Ala、Phe、Arg、Lys、Trp、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)、Orn(Me2)、Lys(CHMe2)和Arg(Pmc)的D-氨基酸；和
NH(CH2)5CO和NH(CH2)2S(CH2)yCO，其中y为1或2中选择。X2优选可从选自Ala、Arg、Lys、His、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)和Orn(Me2)的D-氨基酸；NH(CH2)2SCH2CO和NH(CH2)xCO，其中x为2或3中选择；Xaa5和Xaa6优选各自独立为D-Ala或D-Arg。
其中X1、X2、(Xaa5)p和(Xaa6)q中的任何两个为D-Arg的环肽或其盐代表本发明特别优选的方面。
根据本发明的另一方面，环肽或其盐具有下式：
其中Xaa1可从选自Phe、Lys和Arg的L-氨基酸；选自Phe和Met的D-氨基酸，所述L-和D-氨基酸任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；和MeIle中选择；最优选为MePhe；
Xaa2为Leu，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
Xaa3为Asp，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
Xaa4为Val，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
X1可从选自Ala、Phe、Arg、Lys、Trp的D-氨基酸，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)、Orn(Me2)、Lys(CHMe2)和Arg(Pmc)取代；和
NH(CH2)5CO和NH(CH2)2S(CH2)yCO，其中y为1或2中选择；
X2可从选自Ala、Arg、Lys、His的D-氨基酸，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)和Orn(Me2)取代；NH(CH2)2SCH2CO和NH(CH2)xCO，其中x为2或3中选择；
Xaa5和Xaa6各自独立为选自Ala和Arg的D-氨基酸，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
p为0或1；q为0或当p为1时，q为0或1；其前提为当p和q均为0时，Xaa1不为MeIle。在这样的环肽中，当Xaa1为MeIle时，p为1和q为0或1。
根据本发明的另一方面，环肽或其盐具有下式：其中Xaa1为选自MePhe和MeIle的L-氨基酸；
Xaa2为Leu，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
Xaa3为Asp，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
Xaa4为Val，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
X1可从选自Ala和Arg的D-氨基酸，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；和NH(CH2)2S(CH2)yCO，其中y为1或2中选择；
X2可从选自Ala和Arg的D-氨基酸，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；和NH(CH2)xCO，其中x为2或3中选择；
Xaa5和Xaa6各自独立为选自Ala和Arg的D-氨基酸，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
p为l；q为0或l。
根据本发明特别优选的环肽为具有此后表2中化合物1-38任一结构的环肽或其盐。结构1-38的任一氨基酸任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基(特别是甲基)取代。优选的环肽为化合物8、20-23、25-32、37和38中任何一个。更优选的环肽为化合物20、21、27和31中任何一个。
本发明的环肽具有至少下列的一个优点：在我们的试验中它们比已知的化合物如CS-1(25个氨基酸的肽)更有效；它们比CS-1更小，因此更易合成，为环状对酶降解更稳定；它们与缓释药用组合物是相容的。
优选的化合物在多种小鼠体内筛选中具有活性，例如在噁唑酮诱导的皮肤的延缓型过敏反应(接触过敏，CHS)或由卵白蛋白诱导的爪垫过敏(延缓型过敏，DTH)、胶原蛋白诱导的关节炎、抗原诱导的细支气管(bronchiolar)灌洗嗜酸性细胞和试验性过敏性脑脊髓炎中。例如，在DTH中产生半数-最大抑制反应所需的CS-1的剂量为1mg/kg/天，而化合物20仅为0.01mg/kg/天。在有效剂量下没有观察到本发明的化合物的毒性作用。
根据本发明的另一方面，提供含有本发明的环肽以及药学上可接受的稀释剂或载体的药用组合物。本发明也提供药用组合物，它包含根据本发明的环肽的药学上可接受的盐以及药学上可接受的稀释剂或载体。
药学上可接受的盐包括例如，对于具有足够碱性的环肽如那些具有游离的胍基像精氨酸的环肽而言，与形成生理上可接受的阴离子酸的盐，例如与无机酸像卤氢酸如盐酸、氢溴酸、磺酸和膦酸形成的盐；与有机酸特别是乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸、对-甲苯磺酸、甲磺酸等形成的盐。对于具有足够酸性的环肽，例如那些具有游离的羧酸基团的环肽而言，与形成生理上可接受的阳离子碱的盐，例如与碱金属如钠和钾形成盐；与碱土金属如镁和钙形成盐；铝和铵盐，以及与有机碱如乙醇胺、甲胺、二乙胺、异丙胺、三甲基胺等形成的盐。用本领域已知的任何适当的方法可以制备此类盐。
所述组合物可以为经下列途径使用的任何形式：经口使用，例如片剂、胶囊剂、水溶液或油溶液、悬浮液或乳液；经鼻使用，例如吸入剂、鼻喷雾剂或鼻滴剂；经阴道或直肠使用，例如栓剂；吸入给药，例如精细粉末或液体气雾剂；舌下或颊使用，例如片剂或胶囊剂；或胃肠外使用(包括静脉、皮下、肌内、血管内或输注)，例如无菌水溶液或油溶液或悬浮液，或将药物掺入可生物降解聚合物中的包埋剂(depot formulation)。所述组合物可以为适于局部给药的形式，例如乳油、软膏或凝胶剂。也设计了皮肤贴剂。一般的制剂在ComprehensiveMedicinal Chemistry(第5卷，Hansch等编辑，Pergamon出版社1990)中第25.2章中描述。
一般而言，上述组合物可以用常规的赋形剂以常规的方法制备。然而，在为口服给药的组合物的情况下，所述组合物包括包衣物以保护所述环肽活性成分在胃中不受酶的作用可能比较方便。
本发明优选的组合物为一适于口服给药的单位剂型，例如在每一单位剂量中含有2.5-500mg，优选10-100mg环肽的片剂或胶囊剂，或者为一适于胃肠外给药的单位剂型，每ml溶液含有0.5-100mg环肽，优选每ml溶液含有1-10mg环肽。
优选胃肠外组合物为等渗的盐水或等渗的葡聚糖溶液，缓冲至pH5-9(如果需要)。或者，将所述胃肠外组合物设计为缓释的组合物，在此情况下，每单位剂量的环肽的量一般比使用常规的注射制剂时所需的量大。优选的缓释制剂为连续的释放制剂，例如在欧洲专利说明书58481号中所述类型的制剂。对于含有聚乙酸/聚羟基乙酸基聚合物的缓释制剂而言，优选本发明的环肽含有碱性基团。对于此类环肽，另外的缓释制剂述于国际专利申请公开号WO93/24150中。碱性氨基酸定义为在其侧链含有碱性官能团例如氨基或胍基的氨基酸，所述两个基团任一个可任选被C1-4烷基取代。一个此类特别优选的碱性氨基酸为精氨酸。在本发明特别优选的实施方案中，在式Ⅰ环肽中，X1、X2、(Xaa5)q和(Xaa6)q中任何两个为D-Arg。含有碱性氨基酸的此类环肽可以与酸封端的聚酯如聚交酯(polyactide)形成所谓的“肽-聚合物”盐。这些盐具有溶解特征的优势，因此使它们特别适合生产缓释胃肠外制剂，它们具有有利的释放模式并具有储存稳定性。优选的缓释胃肠外制剂每单位剂量含有1-100mg环肽。设计的优选的胃肠外给药的药用组合物可以缓慢释放至少5天的时间。
本发明的组合物正常给药，使日口服剂量为0.1mg/kg-50mg/kg，日胃肠外剂量为5，优选20μg/kg-10mg/kg。
根据本发明的另一个方面，提供在需要此治疗的温血哺乳动物例如人类中，抑制VCAM-1和/或纤连蛋白和整联蛋白受体VLA-4之间相互作用的方法，该方法包括给予所述动物有效量的本发明的环肽或其药学上可接受的盐。本发明也提供此环肽或其药学上可接受的盐在生产用于治疗由纤连蛋白和/或VCAM-1(特别是VCAM-1)和整联蛋白受体VLA-4间的相互作用介导的疾病或身体紊乱的药物中的用途。也可以用作研究的工具。
根据本发明的另一个方面，提供在需要此治疗的温血哺乳动物例如人类中，抑制MAdCAM-1和整联蛋白α4β7间相互作用的方法，该方法包括给予所述动物有效量的本发明的环肽或其药学上可接受的盐。本发明也提供此环肽或其药学上可接受的盐在生产用于治疗由MAdCAM-1和整联蛋白α4β7间相互作用介导的疾病或身体紊乱的药物中的用途。
根据本发明的另一方面，提供在此所述的本发明的环肽作为药物的用途。根据本发明的另一个方面，提供在需要此治疗的哺乳动物中，抑制VCAM-1和/或纤连蛋白和整联蛋白受体VLA-4间相互作用的方法，该方法包括给予所述哺乳动物有效量的在此所述的药用组合物。在优选的实施方案中，需要此治疗的哺乳动物患有多发性硬化症或类风湿性关节炎。在另一个优选的实施方案中，需要此治疗的哺乳动物患有哮喘或牛皮癣。
根据本发明的另一方面，提供在需要此治疗的哺乳动物中，抑制MAdCAM-1和整联蛋白α4β7间相互作用的方法，该方法包括给予所述动物有效量的在此所述的药用组合物或其药学上可接受的盐。在优选的实施方案中，需要治疗的哺乳动物患有炎症性肠疾病和胰岛素依赖性糖尿病。
根据本发明的另一方面，提供本发明的环肽或其药学上可接受的盐在生产用于治疗由VCAM-1或纤连蛋白和整联蛋白受体VLA-4间相互作用介导的疾病或身体紊乱的药物中的用途。
根据本发明的另一方面，提供本发明的环肽或其药学上可接受的盐在生产用于治疗由MAdCAM-1和整联蛋白α4β7间相互作用介导的疾病或身体紊乱的药物中的用途。
合成详述
可以根据可用于相似化合物合成的肽化学领域熟知的任何方法制备本发明的环肽。因此，例如用与Athertion和Sheppard的“固相肽合成方法：一条可行的途径”(由Oxford大学出版社的IRL出版，1989)、Stewart和Young的“固相肽合成”(由Pierce Chemical Company出版，Illinois,1984)、M.Bodanszky的“肽合成的原理”(由Springer-Verlag出版，Berlin Heidelberg,1984)、M.Bodanszky和A.Bodanszky的“肽合成的实践”(由Springer-Verlag出版，Berlin Heidelberg,1984)以及丛书“氨基酸、肽和蛋白”(第1-26卷；1995年出版的第26卷)(由Royal Society of Chemistry出版，Cambridge,UK)中所公开的相似的方法可以获得本发明的环肽。除这些书外，也发表了许多关于肽的合成的综述[如“固相肽合成：银年会报告”，G.Barany,N.Kneib-Cordonier和D.G.Mullen,Intemational Journal of Peptide and Protein Research,30(1987)705-739；“用9-芴基甲氧基羰基氨基酸进行的固相肽合成”，G.B.Fields和R.L Noble,International Journal of Peptide andProtein Research,35(1990)161-214]。合成进展也发表于美国、欧洲和日本肽研讨会的会议论文集上。用自动或人工的方法可以进行合成。
根据本发明的另一个方面，提供制备本发明环肽的方法，选自：
(a)以逐步的方式，将所需的线性肽装配(assembling)(一次增加一个氨基酸)，接着选择性去除N-和C-末端的任何保护基团，环化并最后去质子化得到本发明的环肽，并任选(如果需要)将如此获得的产物制成其盐；
(b)通过使两个肽单元偶合形成酰胺键，所述一个肽单元含有羧酸基团或其活性的衍生物，而另一个含有氨基基团，以产生本发明的保护或未保护的环肽，并如果需要用下列方法(c)去除保护基团，如果需要可任选将如此获得的产物转化为其盐；和
(c)从在Asp侧链的酸基团上具有保护基团的保护的环肽中去除一个或多个常规的肽保护基团，得到本发明的环肽，并任选同时或随后也去除存在的任何另外的常规肽保护基团，并任选如果需要将如此获得的产物转化为其盐。
上述的去保护和偶合步骤可以用用于有机化合物合成的常规技术在固相载体(固相肽合成)或在溶液中进行。除固相载体外，所有其它的保护基团、偶合试剂、解封试剂和纯化技术都与固相和液相肽合成技术相似。
对于固相载体上的肽合成而言，选择适当的树脂，该树脂在从所述树脂上裂解后可以提供游离的羧基，或可选择性去保护的肽衍生物以得到C-末端羧基。该固体载体可以含有聚苯乙烯珠粒、聚二甲基丙烯酰胺珠粒、聚二甲基丙烯酰胺-聚苯乙烯复合物(Polyhipe)或聚苯乙烯-聚氧化乙烯树脂(Tentagel树脂)。含有用于固相肽合成的固相载体的适当的连接基团的几个实例示于下列中。除所示的连接剂外，也可以使用部分其它的连接剂如羟基巴豆酰氨基甲基(HYCRAM)。然后通过本申请中所述的肽合成的方法或通过使用于肽合成中的任何偶合试剂使第一个氨基酸与所述树脂偶合。部分偶合试剂的实例也在本申请中描述。
[Merrifield氯代甲基和羟甲基树脂]
在肽的装配过程中，可以用各种保护基团保护不参加反应的所述氨基酸的官能团。例如，可以用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、联苯基异丙氧基羰基(Bpoc)、2-[3,5-二甲氧基苯基]丙基-2-氧基羰基(Ddz)、金刚烷基氧基羰基(Adoc)、烯丙氧基(Aloc)、2,2,2-三氯乙氧基羰基(Troc)、苄氧基羰基和各种取代的苄氧基羰基保护N-末端和所述侧链氨基。需要时，用标准的技术(如酸或碱处理、催化氢解和Pd(0)处理或锌/乙酸处理)可以裂解这些保护基团。
用于保护α-羧基或侧链羧基的适合的保护基团包括各种酯(如甲基、乙基、叔丁基、苄基、硝基苄基、烯丙基和9-芴基甲基的酯)。
用于在含有精氨酸残基的肽中保护侧链胍基的适合的保护基团包括包括硝基、金刚烷基氧基羰基、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基(Mtr)、2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)和2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)。用于在含有组氨酸残基的肽中保护侧链咪唑基的适合的保护基团包括三苯甲基、对甲苯磺酰基、二硝基苯基、Adoc、Boc或Fmoc基团。
在温度4-40℃范围内(优选在室温，约25℃)进行所述保护基团的裂解反应。所述裂解反应可以进行10分钟至24小时。
用于各个氨基酸或肽片段偶合的适合的偶合方法包括通常使用的叠氮化物、对称的酸酐、混合的酸酐和各种活性的酯和碳二亚胺。在各种碳二亚胺(如二环己基-或二异丙基-碳二亚胺)的情况下，也可以加入添加剂[如1-羟基苯并三唑和N-羟基琥珀酰亚胺]。此外，用多种其它的试剂如1H-苯并三唑-1-基-氧代-三-吡咯烷六氟代磷酸鏻(PyBOP)、(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基四氟硼酸脲鎓(uronium)(TBTU)和(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3,-四甲基六氟磷酸脲鎓(HBTU)]。
所述偶合反应可以于-20℃至40℃温度范围内进行。完成该反应所需的时间为10分钟至24小时。
用于中间体和终产物的适当的纯化方法包括逆流分布、离子交换、凝胶过滤和各种其它的层析技术，包括高压液相层析(HPLC)以及有机化学中使用的多种其它的标准技术(如溶剂萃取和结晶)。
用下列非限定性实施例说明本发明，其中
图1说明化合物1号的合成(表2)；
图2说明化合物20号的合成(表2)；
图3说明化合物24号的合成(表2)；
图4说明D-Orn(CHMe2)的结构；
图5说明D-Lys(CHMe2)的结构；
图6说明D-Orn(Me2)的结构；
图7说明D-hArg(Et)2的结构；和
图8说明D-Arg(Pmc)的结构。
在图4-8中带箭头键代表连接点或直接的键(即不是-CH2-基团)。例如，参照在化合物4(表1)中的D-Lys(CHMe2)(图5)，氮原子上的带箭头键与Val的C-末端的-C(O)-连接，-C(O)-上的带箭头键与D-Ala的N-末端的氮原子连接。
使用下列缩写：
hArg(Et)2 高-Arg(Et)2
Orn 鸟氨酸
实施例
化合物1-38的合成(见表1和2)
根据本发明的环肽在表1和2中的编号为1-38。通过使表1中编号39-75的相应的前体肽(一般为线性)环化获得这些环肽。化合物1、20和24合成的细节在下面详细描述(见图1-3)。在其它化合物的情况下，仅仅提到标准方法的改变。
实施例1
1．化合物1的合成(图1)
通过固相方法，用2-氯代三苯甲基氯树脂制备所述环肽(图1，步骤5)。将部分保护的线性肽装配于所述树脂上后，从所述树脂上裂解该肽，并且不经任何纯化用于随后的步骤。然而，在鉴定前，用反相高压液相层析(HPLC)对终产物进行充分地纯化。
1.1．化合物1的合成(步骤1，图1)
将溴代乙酸叔丁酯(4.88g,25mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液加至1-哌嗪羧酸叔丁酯(4.65g,25mmol)和三乙胺(3.5ml,25mmol)的二氯甲烷(30ml)溶液中。将该反应混合物搅拌过夜，过滤去除过夜析出的固体，蒸发滤液至干。使残留物分配于乙酸乙酯和水之间，然后用水洗涤有机层，经硫酸镁干燥并蒸发至干。使残留物从乙醚-异己烷中结晶得到产物(5.66g,75％,m.p.99-100℃)。[元素分析：实测值：C,59.8％,H,9.6％,N,9.1％；C15H28N2O4理论值：C,60.0％；H,9.4％；N,9.33％]。[在硅胶板上进行薄层层析显示为单一点；在乙酸乙酯-异己烷(1∶1)中Rf为0.38；在甲醇-氯仿(1∶9)中为0.68)]。
1.2．化合物1的合成(步骤2，图1)
用三氟乙酸-水(95∶5,50ml)的混合液处理部分1.1所述的化合物(5g,16.6mmol)1小时。真空蒸发去除所述酸，用乙醚研磨残留的油状物得到固体，收集该固体，用乙醚洗涤，在真空下经五氧化二磷/氢氧化钾干燥(6.25g,m.p.177-182℃)。然后将该固体溶于含有碳酸钾(6.92g,3当量)的水和丙酮(1∶1,150ml)混合液中。在搅拌下，用20分钟加入9-芴基甲基-N-羟基琥珀酰亚胺(5.66g,16.7mmol)的丙酮(30ml)溶液。通过加入M的碳酸钾溶液维持该溶液的pH约为9。于室温下搅拌过夜后，真空蒸发去除丙酮，用硫酸氢钾溶液酸化水溶液。将产物萃取入乙酸乙酯中，用水洗涤该溶液(6次)，用饱和的氯化钠溶液洗涤。经硫酸镁干燥有机层，蒸发得到油状物，用异己烷和乙醚研磨后固化(产量3.72g,60％)。使样品从乙醇-乙醚中重结晶，m.p.179-182℃,(M+H)+367。
1.3．化合物1的合成(步骤3和4，图1)
将在二氯甲烷(15ml)和二异丙基乙胺(1.05ml,3当量)的上述的Fmoc-哌嗪衍生物(732mg,2mmol)加至2-氯代三苯甲基氯树脂(Novabiochem.,2.05g)中，将该反应混合物轻轻振摇60分钟。加入10％二异丙基乙胺的甲醇溶液(10ml)，并继续振摇10分钟。滤除树脂，顺序用二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二氯甲烷和乙醚洗涤，于50℃在真空干燥箱中干燥(重2.55g)。
将上述树脂置于配有烧结玻璃盘的反应器中。然后人工进行下列一系列反应得到所需的肽树脂。
(a)经20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液处理两次(1×5min和1×15min)，随后用二甲基甲酰胺洗涤5次，以去除过量的试剂并裂解产物而去除Fmoc基团。
(b)在二甲基甲酰胺(8ml)中，用经O-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟代磷酸脲鎓(HBTU)(1.90g,5mmol)活化的Fmoc-Val(1.70g,5mmol)酰化1小时。用二甲基甲酰胺将所述树脂再洗涤5次去除过量的试剂。
用Fmoc-Asp(Obut)(2.06g,5mmol)、Fmoc-Leu(1.77g,5mmol)、Fmoc-MeIle(1.83g,5mmol)、Fmoc-D-Arg(Pbf)(3.76g,5mmol)重复上述的去保护和偶合循环。在Fmoc-D-Arg(Pbf)的情况下，用O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟代磷酸脲鎓(HATU)(1.90g,5mmol)活化所述氨基酸衍生物。然后解封一半的所述树脂，用HBTU(1.14g,3mmol)和二异丙基乙胺(1.05ml,6mmol)，使其与Fmoc-NH(CH2)2-COOH(911mg,3mmol)反应得到与氯代三苯甲基树脂连接的保护的五肽衍生物(步骤3)。用在二甲基甲酰胺中的20％哌啶裂解N-末端Fmoc基团(1×5min和1×15min)，顺序用二甲基甲酰胺、二氯甲烷和乙醚洗涤该肽树脂，于50℃在真空干燥箱中干燥。
用乙酸-三氟乙醇-二氯甲烷(2∶2∶6)的混合液(25ml)将肽树脂处理1小时。过滤出树脂，用裂解剂再处理1小时。蒸发合并的滤液，用乙醚研磨残留物得到为乙酸盐的线性五肽衍生物(824mg,0.682mmol)。然后通过将所述乙酸盐溶于水-乙腈(2∶1,60ml)的混合液中，冷却至0℃，加入1.05当量的1N HCl并冷冻干燥内容物将乙酸盐转化为盐酸盐。
1.4．化合物1的合成(步骤5，图1)
通过下列c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg)(化合物24)相当的步骤中所述方法使线性肽环化并去保护得到最终的环肽终产物(1)。
2.c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg)(化合物20，图2)的合成
通过固相方法，用2-氯代三苯甲基氯树脂制备该环肽。合成的详细方法见下述。使部分保护的线性肽装配于所述树脂上后，将该肽从所述树脂上裂解，并不经任何纯化用于随后的步骤。然而，在鉴定前，用反相高压液相层析(HPLC)对终产物进行充分地纯化。
2.1 Fmoc-Val-氯代三苯甲基树脂的制备(步骤1，图2)
使2-氯代三苯甲基氯树脂(Alexis Corporation；1.31mmol Cl/g；10g)在二氯甲烷(40ml)(经分子筛干燥)中溶胀5分钟。加入Fmoc-Val(3.39g,10mmol)和二异丙基乙胺(5.6ml,32mmol)的二氯甲烷(20ml)溶液，将该悬浮液机械振摇45分钟。加入甲醇(9ml)和二异丙基乙胺(1ml)并继续振摇5分钟。过滤收集树脂，顺序用二氯甲烷、二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤并立即用于下一个步骤的合成(2.2)。
2.2 D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val-氯代三苯甲基树脂的制备(步骤2和3，图2)
将上述Fmoc-Val树脂置于配有烧结玻璃盘的反应器中。然后人工进行下列一系列反应得到所需的肽树脂。
(a)经20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液处理两次(1×5min和1×15min)，随后用二甲基甲酰胺洗涤5次，以去除过量的试剂并裂解产物而去除Fmoc基团。
(b)在二甲基甲酰胺(22ml)中，用经O-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟代磷酸脲鎓(HBTU)(5.70g,15mmol)和二异丙基乙胺(5.25ml,30mmol)活化的Fmoc-Asp(OBut)(6.17g,15mmol)酰化1小时。用二甲基甲酰胺将所述树脂再洗涤5次去除过量的试剂。
用Fmoc-Leu(5.29g,15mmol)、Fmoc-MePhe(6.01g,15mmol)、Fmoc-D-Arg(Pbf)(11.27g,15mmol)和Fmoc-D-Arg(Pbf)(11.27g,15mmol)重复上述的去保护和偶合循环得到Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val-氯代三苯甲基树脂。如同在化合物l的情况下，用O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟代磷酸脲鎓(HATU)和二异丙基乙胺达到Fmoc-D-Arg衍生物的偶合。用在二甲基甲酰胺中的20％哌啶裂解N-末端Fmoc基团(1×5min和1×15min)(步骤3)，顺序用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤肽树脂D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val-氯代三苯甲基树脂。
2.3．D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val,HCl的制备(步骤4，图2)
将肽树脂D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val-氯代三苯甲基树脂悬浮在乙酸-三氟乙醇-二氯甲烷(2∶2∶6)的混合液(100ml)中1小时。过滤出树脂，用相同的混合液再处理1小时。蒸发合并的滤液，用乙醚处理残留物得到为乙酸盐的D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val(11.66g)。然后通过将所述乙酸盐溶于水-乙腈(2∶1,350ml)的混合液中，冷却至0℃，加入1.05当量的1N HCl并冷冻干燥内容物将乙酸盐转化为盐酸盐(重11.5g)。
2.4．c(D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val)的制备(步骤5，图2)
将上述线性肽盐酸盐，D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val(HCl)(11.5g,8.1mmol)溶于二甲基甲酰胺(8000ml)中，向该溶液中加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟代磷酸脲鎓(HATU)(4.62g,12.15mmol)和二异丙基乙胺(5.67ml,32.4mmol)。用分析性HPLC监测该环化反应。所述反应完成后(于室温下2小时)，真空将该反应混合物蒸发至干。用10％碳酸氢钠水溶液研磨残留物。收集固体，用10％碳酸氢钠、水、10％硫酸氢钾溶液，最后用水洗涤。在真空干燥箱中，于45℃用五氧化二磷干燥该固体[在Vydac 218TP54柱上的保留时间为24.80分钟，用含有0.1％三氟乙酸的乙腈-水(40-80％)梯度洗脱，流速1.0ml/min，洗脱30分钟]，将其不经任何纯化用于下一步骤。
2.5．c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg)[化合物20]的制备(步骤6，图2)
用三氟乙酸-水(95∶5,80ml)和三异丙基硅烷(3ml)的混合液将上述保护的环肽，c(D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val)处理90分钟，以去除精氨酸和天冬氨酸侧链保护基团。将该反应混合物蒸发至小体积并分配于水和乙醚之间。用乙醚洗涤水层4次，冷冻干燥得到10.9g粗品产物。将该粗品产物在Vydac C18 218TP1015100柱(4英寸×25cm)上经制备性反相HPLC纯化，用含有0.1％三氟乙酸的乙腈-水(15-35％)梯度洗脱80分钟，流速为180.ml/min。合并含有产物的组分并冷冻干燥得到纯化的环肽(3.63g)。用氨基酸分析和质谱鉴定该肽(表2)。
3．c(D-Arg-MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala)(化合物24，图3)的合成
通过固相方法，用2-氯代三苯甲基氯树脂制备该环肽。使部分保护的线性肽装配于所述树脂上后，将该肽从所述树脂上裂解，并不经任何纯化用于随后的步骤。然而，在鉴定前，用反相高压液相层析(HPLC)对终产物进行充分地纯化。
3.1 Fmoc-D-Ala-氯代三苯甲基树脂的制备(步骤1，图3)
使2-氯代三苯甲基氯树脂(Nova Biochem.；1.35mmol Cl/g；lg)在二氯甲烷(10ml)(经分子筛干燥)中溶胀5分钟。加入Fmoc-D-Ala(311mg,1mmol)和二异丙基乙胺(525μl,3mmol)的二氯甲烷(8ml)溶液，将该悬浮液机械振摇45分钟。加入甲醇(9ml)和二异丙基乙胺(1ml)并继续振摇5分钟。过滤收集树脂，顺序用二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、异丙醇和乙醚洗涤，最后在真空干燥箱中于50℃干燥(重1.51g)。
3.2 D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Ala-D-Ala-氯代三苯甲基树脂的制备(步骤2和3，图3)
将上述的Fmoc-D-Ala树脂置于配有烧结玻璃盘的反应器中。然后人工进行下列一系列反应得到所需的肽树脂。
(a)经20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液处理两次(1×5min和1×15min)，随后用二甲基甲酰胺洗涤5次，以去除过量的试剂并裂解产物而去除Fmoc基团。
(b)在二甲基甲酰胺(3ml)中，用经O-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟代磷酸脲鎓(HBTU)(760mg,2mmol)和二异丙基乙胺(700μl,4mmol)活化的Fmoc-D-Ala(622mg,2mmol)酰化1小时。用二甲基甲酰胺将所述树脂再洗涤5次去除过量的试剂。
用Fmoc-Val(678mg,2mmol)、Fmoc-Asp(OBut)(822mg,2mmol)、Fmoc-Leu(700mg,2mmol)、Fmoc-MeIle(734mg,2mmol)和Fmoc-D-Arg(Pmc)(1.40g,2mmol)重复上述的去保护和偶合循环得到Fmoc-D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Ala-D-Ala-氯代三苯甲基树脂。如同在化合物1的情况下，用O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟代磷酸脲鎓(HATU)和二异丙基乙胺获得Fmoc-D-Arg衍生物的偶合。用在二甲基甲酰胺中的20％哌啶裂解N-末端Fmoc基团(1×5min和1×15min)(步骤3)，顺序用二甲基甲酰胺、二氯甲烷和乙醚洗涤肽树脂D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Ala-D-Ala-氯代三苯甲基树脂并在真空干燥箱中于50℃干燥(重2.5g)。
3.3．D-Arg(Pme)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Ala-D-Ala(HCl)的制备(步骤4，图3)
将肽树脂D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Ala-D-Ala-氯代三苯甲基树脂悬浮在乙酸-三氟乙醇-二氯甲烷(2∶2∶6)的混合液(25ml)中1小时。过滤出树脂，用相同的混合液再处理1小时。蒸发合并的滤液，用乙醚研磨残留物得到为乙酸盐的D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Ala-D-Ala(1.18g)。然后通过将所述乙酸盐溶于水-乙腈(2∶1,60ml)的混合液中，冷却至0℃，加入1.05当量的1N HCl并冷冻干燥内容物将乙酸盐转化为盐酸盐。
3.4．c(D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Ala-D-Ala)的制备(步骤5，图3)
将上述线性肽盐酸盐，D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Ala-D-Ala(HCl)(1.18g,1.02mmol)溶于二甲基甲酰胺(1000ml)中，向该溶液中加入O-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟代磷酸脲鎓(HBTU)(395mg,1.02mmol)和二异丙基乙胺(545μl,3.1mmol)。用分析性HPLC监测该环化反应。所述反应完成后(于室温下2小时)，真空将该反应混合物蒸发至干。使残留物分配于乙酸乙酯和水之间。然后顺序用1M柠檬酸、饱和的氯化钠、10％碳酸氢钠水溶液和饱和的氯化钠洗涤有机层，经硫酸镁干燥并于真空中蒸发至干。收集产物[在Vydac 218TP54柱上的保留时间为27.06分钟，用含有0.1％三氟乙酸的乙腈-水(20-80％)梯度洗脱，流速1.0ml/min，洗脱30分钟]，将其不经任何纯化用于下一步骤。
3.5．c(D-Ala-D-Ala-D-Arg-MeIle-Leu-Asp-Val)[化合物24]的制备(步骤6，图3)
用三氟乙酸-水(95∶5,30ml)和三异丙基硅烷(1ml)的混合液将上述保护的环肽c(D-Ala-D-Ala-D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val)处理4小时，以去除精氨酸和天冬氨酸侧链保护基团。将该反应混合物蒸发至小体积并用乙醚研磨得到粗品环肽(575mg)。将粗品产物在Deltapak C18柱(30×30mm)上经制备性反相HPLC纯化，用含有0.1％三氟乙酸的乙腈-水(10-30％)梯度洗脱80分钟，流速为30.0ml/min。合并含有产物的组分并冷冻干燥得到纯化的环肽(353mg)。用氨基酸分析和质谱鉴定该肽[在HPLC上为单峰，在Vydac 218TP54柱上，用含有0.1％三氟乙酸的乙腈-水(10-40％)梯度洗脱30分钟，流速为1.0ml/min，保留时间为21.19分钟](表2)。
4．化合物2的合成
用化合物1使用的合成途径(如图1所示)，但是用γ-氨基丁酸代替β-丙氨酸合成化合物2。
5．化合物3-5的合成
通过使环肽c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Orn-D-Orn)或c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Lys-D-Ala)与所需的醛或酮和氰基硼氢化钠反应制备上述环肽。例如，通过将环肽c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Orn-D-Orn)(100μmol)溶于无水丙酮(2ml)中并与氰基硼氢化钠(10当量)反应制备化合物3。1小时后，将该反应混合物蒸发至干，将溶于水(5ml)中的残留物用乙酸酸化并于高度真空下蒸发。经HPLC纯化粗品肽。
根据图3所示的化合物24的合成途径合成母体环肽c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Orn-D-Orn)和c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Lys-D-Ala)。
6．化合物6-8的合成
根据化合物24所述的方法获得化合物6-8所需的线性肽D-hArg(Et)2-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Ala、D-hArg(Et)2-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Phe和D-hArg(Et)2-D-hArg(Et)2-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val。由所需的C-末端氨基酸即D-Ala开始合成化合物6，由D-Phe开始合成化合物7，由Val开始合成化合物8)。Boc-D-hArg(Et)2的合成途径在以前的文献中已报道[H.B.Arzeno等，Synthetic Communications,20(1990)3433-3437；J.J.Nestor,Jr.等，Journal of Medicinal Chemistry,35(1992)3942-3948]。通过标准的方法将该衍生物转化为Fmoc-D-hArg(Et)2并用于上述线性肽的合成中。然后根据图3所示的化合物24的环化方法由相应的线性肽获得化合物6-8。
7．化合物9-19的合成
用与化合物24所述相似的方法合成环肽9-19。如表1所述，所有的线性肽都是用Fmoc-缬氨酸作原料在氯代三苯甲基树脂上合成的。
8．化合物21-23和25-32的合成
用与化合物20所述相似的方法合成环肽21-23和25-32。如表1所述，所有的线性肽都是用Fmoc-缬氨酸作原料在氯代三苯甲基树脂上合成的。
9．化合物33-35的合成
用与化合物20所述相似的方法合成环肽33-35。然而，如表1所示，分别用Fmoc-NH(CH2)5-COOH、Fmoc-NH(CH2)2-S-CH2-COOH或Fmoc-NH(CH2)2-S-(CH2)2COOH衍生物作原料代替Fmoc-缬氨酸在氯代三苯甲基树脂上合成该三种线性肽。
同氨基己酸(可以由商业获得)不一样，可以用下列方法合成其它两种含硫氨基酸衍生物。由2-氨基乙硫醇和2-溴代乙酸获得Fmoc-NH(CH2)2-S-CH2-COOH(上述使用的)。将2-氨基乙硫醇盐酸盐(5.68g,50mmol)溶于水(200ml)中，向其中加入碳酸氢钠(25.2g,300mmol)。用30分钟，将溶于乙腈(100ml)中的2-溴代乙酸(6.95g,50mmol)逐份加至上述制备的搅拌溶液中。于室温下1小时后，加入9-芴基甲基-N-羟基琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(16.85g,50mmol)的乙腈(150ml)溶液中，并继续搅拌16小时。蒸发微微浑浊的溶液以去除大部分的乙腈，用乙酸乙酯(3×50ml)萃取残留的水溶液，通过加入盐酸酸化(pH2)。收集白色固体，用水洗涤，于45℃真空干燥。产率17g(95％),(M+H)+358.0。
根据上述Fmoc-NH(CH2)2-S-CH2-COOH所述方法，用3-溴代丙酸和2-氨基乙硫醇获得Fmoc-NH(CH2)2-S-(CH2)2-COOH。(M+H)+372。
10．化合物36-38的合成
用与化合物20所述相似的方法合成环肽36-38。如表1所示，除化合物61外，所有的线性肽都是用Fmoc-缬氨酸作原料在氯代三苯甲基树脂上合成的。如图2所示，用Fmoc-Ala作原料制备化合物61。在线性肽的合成中的适合的阶段，用Fmoc-NH(CH2)2-S-CH2-COOH加入含硫的氨基酸残基-NH(CH2)2-S-CH2-CO-。
实施例2-体外和体内测定
在该实施例中使用下列缩写和原料来源。
MOLT-4细胞-淋巴细胞T细胞系(由ATCC衍生)
纤连蛋白-根据E.Nengvall、E.Ruoslahti(Int.J.Cancer,1977,20,第1-5页)和J.Forsyth等(Methods in Enzymology,1992,215，第311-316页)所述方法制备或为试剂级的人纤连蛋白。经明胶-琼脂糖亲和层析由人血浆中纯化后者(见：Bio Products Elstree UK.Product No9136)。关于纤连蛋白的综述文章为：纤连蛋白-细胞表面和血液的粘附糖蛋白(K.M.Yamada和K.Olden,Nature,275(1978)179-184。rsVCAM-1-(参考：Biochem Biophys Res Comm 1991 178 N3；1498-1504)。VCAM-1为血管内皮以及巨噬细胞样和dandritic细胞型对某些炎症刺激反应产生的细胞表面糖蛋白。VCAM-1与单核白细胞中存在的整联蛋白VLA-4相互作用。
通过从IL-1β活化的人内皮细胞中筛选cDNA库，分离VCAM-1的cDNA。用杆状病毒表达体系在昆虫细胞中表达大量蛋白。已经表明VCAM-1表达细胞与各种VLA-4表达细胞系(Jurkat、THP-1、U937)特异性结合。
关于VCAM-1的另一篇文献为：杆状病毒感染的昆虫细胞合成的重组人血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的表达和功能鉴定(J.K.Stoltenborg,R.A.Straney,R.J.Tritch,W.M.Mackin和H.J.George,蛋白表达和纯化，4(1993)585-593)。
PRMI-1640-细胞培养基。来自Gibco BRL(Lifetechnologies,CatNo 31870-025)。
FCS-胎牛血清。来自Advanced protein products(West MidlandsUK)Cat No AS-302-50。
BCECF-AM-2’,7’-双(2羧基乙基)-5-(ε6)-羧基fluoroscein乙酰氧基甲酯)。来自：Molecular Probes Inc USA；Cat No B-1150。
CHO DG44-中国仓鼠卵巢细胞系(由ATCC衍生；参考：Som CellMol Gen 1986；12；555-666)
DMEM-Dulbecco氏改良伊格尔培养基。来自Gibco BRL(Lifetechnologies；Cat No 41966-029)。
抗生素-青霉素-链霉素。来自Gibco BRL(Life Technologies；CatNo 15070-022)。
FluorskanTM-为荧光计。
HUVEC-人脐静脉内皮细胞。由组织样品中制备的初级培养物。(参考：J Clin Invest.1973 52；2745-2747)。
重组人TNFα-肿瘤细胞坏死因子
Alzet渗透微型泵-皮下植入的微型渗透泵，Alza Corporation PaloAlto,California。
在下列测定和模型中，参照化合物指本发明的环肽。
2.1 细胞/固定配体测定
2.1.1 MOLT-4细胞/纤连蛋白-VCAM-1粘附测定。
使用MOLT-4细胞/纤连蛋白-VCAM-1粘附测定以研究表达于MOLT-4细胞膜上的整联蛋白VLA4(非常后期抗原，α4/β1)与纤连蛋白或重组可溶性VCAM-1(rs VCAM-1)的相互作用。于4℃分别将纤连蛋白或rs VCAM-1以20μg/ml和1μg/ml的浓度包被于聚苯乙烯96-孔微量滴定板上。接着，加入浓BSA溶液(10mg/ml)以阻断非特异性结合位点。当这些溶液吸收后，加入等体积的化合物和MOLT-4细胞悬浮液(1×10E6细胞/毫升)。于37℃孵育2小时过程中发生粘附反应，轻轻搅动接着真空吸入去除未粘附或粘附不牢固的细胞。用酸性磷酸酶活性的比色测定法对残留的粘附细胞进行定量，定量数据可从分光光度计上读出。抑制粘附的化合物具有较低的吸收值。标准、对照和受试条件用一式三份进行测定。根据每个培养板上总(无抑制剂)和非特异性(无纤连蛋白)标准计算抑制的百分比。
2.1.2 JY细胞/MAdCAM-1粘附测定
使用JY细胞(人B成淋巴母细胞的)/MAdCAM-1粘附测定以研究表达于JY细胞膜上的整联蛋白α4β7与重组可溶性MAdCAM-1的相互作用。将MAdCAM-1以10μg/ml的浓度包被于聚苯乙烯96-孔微量滴定板上1小时。此后，将浓BSA溶液(10mg/ml)加入以阻断非-特异性结合位点。吸入这些溶液后，加入等体积的化合物和JY细胞悬浮液(1×10E6细胞/毫升)。测定物中含有终浓度为0.2mM的锰以活化JY细胞上的α4β7。于37℃孵育20分钟过程中发生粘附。通过轻轻搅动接着真空吸入去除未粘附或粘附不牢固的粘附细胞。然后用5％戊二醛固定粘附细胞20分钟，用0.1％结晶紫溶液染色20分钟。加入10％乙酸溶解结晶紫，通过在分光光度计上于405nm处测定吸收度对粘附细胞数目进行定量。抑制粘附的化合物产生较低的吸收值。标准、对照和受试条件以一式五份进行测定。相对于每培养板上总(无抑制剂)和非-特异性(无MAdCAM-1)标准计算抑制的百分比。
2.2 细胞-细胞测定
2.2.1．VCAM-1 CHO细胞
用荧光染料BCECF-AM(30μg/ml，每3×10E6细胞)对MOLT-4细胞(补充有5％FCS和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640)进行标记。通过FACS分析对用全长度VCAM-1 cDNA转染的CHO DG44进行选择作为VCAM-1表达并于96孔组织培养板上生长至融合。在用于粘附测定前，将CHO DG44细胞洗涤三次(用含有5％FCS,2mM L-谷氨酰胺和2％抗生素的DMEM)。使MOLT-4(10E5细胞/孔)细胞覆盖表达VCAM-1的CHO细胞，于37℃、5％二氧化碳中孵育30分钟。通过洗涤三次所述培养板(用含有5％FCS和2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640)去除未粘附细胞，接着在组织纸上吸干所述板。向每孔中加入100μl的2％Triton X-100，用Flroroskan(激发=485nM，发射=538nM)读出所述板。将化合物溶于适当的溶剂中，在加至HUVEC培养物中前加至MOLT-4细胞中。通过比较对照溶媒处理的细胞和化合物处理的细胞的粘附(荧光)水平计算粘附抑制。
2.2.2 人脐静脉内皮细胞
用荧光染料BCECF-AM(30μg/ml每3×10E6细胞)对MOLT-4细胞(用5％FCS和2mM L-谷氨酰胺补充的RPMI 1640)进行标记。使初级HUVEC在96孔组织培养板上生长至融合，用2U/ml重组人TNFα孵育18小时。在用于粘附测定前，洗涤(用5％FCS、2mM L-谷氨酰胺和2％抗生素补充的M199)初级HUVEC单层细胞。将MOLT-4(10E5细胞/孔)细胞覆盖于初级HUVEC上，并于37℃、5％二氧化碳中孵育30分钟。通过洗涤所述培养板3次(补充5％FCS和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640)除去未粘附细胞，在组织纸上吸干。向每孔中加入100μl的2％Triton X-100，用Flroroskan(激发=485nM，发射=538nM)读出所述板。将化合物溶于适当的溶剂中，在加至HUVEC培养物中前加至MOLT-4细胞中。通过比较对照溶媒处理的细胞和化合物处理的细胞的粘附(荧光)水平计算粘附抑制。
2.3 体内接触过敏反应
通过将噁唑酮(50μl 0.24％的丙酮/橄榄油溶液)局部应用于剃光的背部皮肤区域对Balb/C雄性小鼠(20-25g)致敏。7天后，通过将噁唑酮(25μl 0.25％的丙酮/橄榄油溶液)局部应用于其耳的表面对所述小鼠进行激发。24小时后发生该耳的红肿，测定该耳的厚度并与激发前的厚度比较，计算耳厚度增加的百分比。在噁唑酮激发前24小时，由皮下植入的Alzet渗透微型泵使化合物以10mg/kg/天-0.001mg/kg/天的剂量连续输注释放。比较溶媒处理的动物和化合物处理的动物(每组n=6个动物)计算对炎症反应的抑制。
2.4 体内卵白蛋白延缓型过敏模型
用卵白蛋白(Sigma；0.1ml皮下注射2mg/ml的与完全福氏佐剂混合(1∶1)的溶液，Difco)乳液在胁腹对Balb/C雌性小鼠(20-25g)进行免疫。7天后，通过足底下注射卵白蛋白(30μl的1％热凝集的卵白蛋白生理盐水)至左后足垫激发所述鼠。24小时发生该足的红肿，测定该足垫的厚度并与激发前的厚度比较。计算足垫厚度增加的百分比。在卵白蛋白激发前24小时，由皮下植入的Alzet渗透微型泵使化合物以10mg/kg/天-0.001mg/kg/天的剂量连续输注释放。比较溶媒处理的动物和化合物处理的动物(每组n=5个动物)计算对炎症反应的抑制。
2.5 体内抗原诱导的关节炎模型
用在完全福氏佐剂中的100μg甲基化的BSA(s.c.)对小鼠进行免疫并于7天后加强，接着腹膜内注射博代氏杆菌属百日咳菌。加强两周后，用100μg甲基化的-牛血清白蛋白(BSA)关节内激发加强的动物，通过检测膝关节的红肿、组织学和急性期蛋白的变化测定炎症/关节炎的程度。通过在激发前24小时，由皮下植入的Alzet渗透微型泵使化合物以30mg/kg/天-0.001mg/kg/天的剂量连续输注释放。比较对照动物和对侧膝盖的炎症/关节炎程度。
2.6 实验的自身免疫脑脊髓炎模型
通过s.c.注射脊髓匀浆、髓鞘质碱性蛋白(MBP)或脑脊髓(encephalogenic)肽与完全福氏佐剂(CFA)的混合液以及i.p注射百日咳毒素诱导疾病。对于急性病，在免疫后两天重复百日咳注射。对于慢性病，省略百日咳，在7天间隔内对小鼠注射两次在CFA中的抗原。用组织学支持的临床分级评价疾病。通过在激发前24小时，由皮下植入的Alzet渗透微型泵使化合物以10mg/kg/天-0.001mg/kg/天的剂量连续输注释放。症状与对照动物比较。
2.7 小鼠细支气管灌洗嗜酸性细胞模型
在4-5天间隔内，通过i.p.注射0.1ml含有100μg卵白蛋白和2.5mg氢氧化铝的盐水三次使雄性C57BL/6J小鼠(20-25g)致敏。在最后一次致敏注射10-14天后，将所述动物置于Perspex室内，并暴露于由DeVilbiss Aerosonic喷雾器释放进入空气流的溶于生理盐水(高达15mg/ml)的气雾化卵白蛋白，空气流以约3L/min的速率进入该室。将小鼠暴露于气雾化的卵白蛋白2-4小时，连续3-4天，在最后一次暴露的当天，通过过量的巴比妥钠使小鼠致死。暴露每个小鼠的气管，用园端的针进行插管，用4×1ml生理盐水进行支气管泡(bronchioalveolar)灌洗。将收集的灌洗液体中的细胞涂于玻璃显微镜片上，固定并用Leukostat染色。计数最少200个白细胞进行差别细胞计数，并计算嗜酸性细胞的百分比。通过在雾化卵白蛋白激发前24小时，由皮下植入Alzet渗透微型泵使测试化合物以10mg/kg/天-0.001mg/kg/天的剂量连续释放。通过比较给予溶媒组或化合物组小鼠(每组n=5-10)计算嗜酸性细胞的抑制。
2.8 胶原蛋白诱导的关节炎模型
用0.1ml等份的在0.05M乙酸中的牛胶原蛋白Ⅱ型(2mg/ml)和完全福氏佐剂(Sigma)的混合物免疫DBA/l雄性小鼠(ex Harlan/OlacU.K.)。将该混合物在尾底部注射。20分钟后，通过皮下的Alzet渗透微型泵，使化合物或溶媒以10mg/kg/天-3mg/kg/天的剂量连续输注释放。在第二天，每只动物腹膜内加强注射在乙酸中的0.1ml胶原蛋白Ⅱ型。比较溶媒处理和化合物处理的动物的关节炎的程度。
表1．环肽的合成和纯化
| 48 | D-Lys(Boc)-D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val | 11 | c(Melle-Leu-Asp-Val-D-Lys-D-Arg) | 10-30％(60min.) |
| 49 | D-Ala-D-Lys(Boc)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val | 12 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Lys) | 10-40％(60min.) |
| 50 | D-Arg(Pmc)-D-Lys(Boc)-Melle-Leu-Asp(OBut)-Val | 13 | c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Lys) | 10-30％(60min.) |
| 51 | D-Ala-D-Ala-Lys(Boc)-Leu-Asp(OBut)-Val | 14 | c(Lys-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala) | 10-20％(60min.) |
| 52 | D-Ala-D-Ala-Arg(Pmc)-Leu-Asp(OBut)-Val | 15 | c(Arg-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala) | 5-20％(60min.) |
| 53 | D-Ala-D-Lys(Boc)-D-Phe-Leu-Asp(OBut)-Val | 16 | c(D-Phe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Lys) | 10-30％(60min.) |
| 54 | D-Ala-D-Ala-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val | 17 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala) | 10-50％(60min.) |
| 55 | D-Ala-D-Ala-D-Phe-Leu-Asp(OBut)-Val | 18 | c(D-Phe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala) | 20-40％(60min.) |
| 56 | D-Ala-D-Lys(Boc)-D-Met-Leu-Asp(OBut)-Val | 19 | c(D-Met-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Lys) | 5-20％(60min.) |
| 57 | D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val | 20 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg) | 15-30％(100min.) |
| 58 | D-Arg(Pbf)-D-His(Trt)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val | 21 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-His) | 15-30％(100min) |
| 59 | D-Trp-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val | 22 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Trp-D-Arg) | 25-35％(90min.) |
| 60 | D-Arg(Pmc)-D-Ala-D-Arg(Pmc)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val | 23 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Ala-D-Arg) | 5-30％(60min.) |
| 61 | D-Arg(Pmc)-Melle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Ala-D-Ala | 24 | c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg) | Deltapak柱10-30％(80min.) |
| 62 | D-Arg(Pmc)-D-Ala-D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val | 25 | c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Ala-D-Arg) | 10-30％(60min.) |
| 63 | D-Ala-D-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-Melle-Leu-Asp(OBut)-Val | 26 | c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Arg-D-Arg) | 10-30％(60min.) |
| 64 | D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val | 27 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Arg-D-Arg) | 10-35％(60min.) |
| 65 | D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val | 28 | c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg-D-Ala) | 10-30％(60min.) |
| 66 | D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val | 29 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg-D-Ala) | 10-35％(60min.) |
| 67 | D-Ala-D-Ala-D-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val | 30 | c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg-D-Arg) | 10-25％(60min.) |
| 68 | D-Ala-D-Ala-D-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val | 31 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg-D-Arg) | 10-40％(60min.) |
| 69 | Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Ala-D-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val | 32 | c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Ala) | 4″Vydac柱15-35％(100min.) |
| 70 | D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-NH(CH2)5COOH | 33 | c(D-Arg-MeIle-Leu-Asp-Val-NH(CH2)5CO) | Deltapak column15-30％(80min.) |
| 71 | D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-NH(CH2)2-S-(CH2)2-COOH | 34 | c(D-Arg-MeIle-Leu-Asp-Val-NH(CH2)2-S-(CH2)2-CO) | Deltapak柱15-30％(80min.) |
| 72 | D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-NH(CH2)2-S-CH2-COOH | 35 | c(D-Arg-MeIle-Leu-Asp-Val-NH(CH2)2-S-CH2-CO) | Deltapak柱10-30％(80min.) |
| 73 | D-Arg(Pmc)-NH(CH2)2-S-CH2CO-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val | 36 | c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-NH(CH2)2-S-CH2CO) | 10-40％(60min.) |
| 74 | NH2-CH2-CH2-S-CH2-CO-D-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val | 37 | c(MeIle-Leu-Asp-Val-NH-CH2-CH2-S-CH2-CO-D-Arg-D-Arg) | 10-40％(60min.) |
| 75 | NH2-CH2-CH2-S-CH2-CO-D-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val | 38 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-NH-CH2-CH2-S-CH2-CO-D-Arg-D-Arg) | 10-30％(60min.) |
用反相(C18)1英寸直径的Vydac柱(218TP1022,22×25mm)进行制备性HPLC。在某些情况下(如表中所述)，可以使用Deltapak柱(30×300mm)或Vydac4”柱。所述溶剂体系含有水和乙腈(每一种都含有0.1％三氟乙酸)。用逐渐增加乙腈浓度的梯度(溶剂的比例和时间列于表中)洗脱所述柱，Vydac柱流速为10ml/min,Deltapak柱为30ml/min,4”Vydac柱为100ml/min。
表2．环肽的合成和鉴定
| 11 | c(MeIle-Leu-Asp-Va1-D-Lys-D-Arg) | Asp 1.05,Val 1.0,Leu 1.01,Lys 0.95,Arg 0.99. | 8.9820-80％(40min.) | 739.5 |
| 12 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Lys) | Asp 0.96,Ala 1.0,Val 0.95,Leu 1.05,Lys 0.95. | 24.2710-40％(40min.) | 688.2 |
| 13 | c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Lys) | Asp 1.05,Val 1.0,Leu 1.01,Lys 1.01,Arg 0.96. | 19.3710-40％(40min.) | 739.5 |
| 14 | c(Lys-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala) | Asp 1.0,Ala 2.09,Val 0.96,Leu 0.96,Lys 0.97. | 9.1110-40％(40min.) | 598.3 |
| 15 | c(Arg-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala) | Asp 1.0,Ala 2.06,Val 0.97,Leu 0.95,Arg 0.95. | 11.8410-30％(40min.) | 626.4 |
| 16 | c(D-Phe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Lys) | Asp 1.0,Ala 1.05,Val 0.97,Leu 0.97,Lys 0.96,Phe0.99. | 18.5810-40％(40min.) | 674.5 |
| 17 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala) | Asp 1.0,Ala 2.09,Val 0.97,Leu 0.98. | 16.9220-80％(40min.) | 631.4 |
| 18 | c(D-Phe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala) | Asp 1.05,Ala 1.95,Val 1.0,Leu 0.98,Phe 0.95. | 12.3420-80％(40min.) | (M-H)615.3 |
| 19 | c(D-Met-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Lys) | Asp 1.05,Ala 1.0,Val 1.01,Leu 1.03,Lys 1.03,Met0.98. | 13.2310-40％(40min) | 658.3 |
| 20 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg) | Asp 1.00,Val 0.96,Leu 1.0,Arg 1.96. | 21.1910-40％(30min.) | 801.4 |
| 21 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-His) | Asp 1.03,Val 1.01,Leu 1.0,Arg 1.0,His 0.99. | 10.5920-35％(15min.) | 782.3 |
| 22 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Trp-D-Arg) | Asp 0.99,Val 0.97,Leu 1.0,Arg 1.03,Trp 0.59. | 7.8930-45％(15min.) | 831.0 |
| 23 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Ala-D-Arg) | Asp 1.04,Ala 1.05,Val 1.0,Leu 0.98,Arg 1.99. | 20.2410-40％(40min.) | 872.6 |
| 24 | c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg) | Asp 0.98,Ala 2.03,Val 0.97,Leu 1.0,Arg 1.01 | 21.1910-40％(30min.) | 753.4 |
| 25 | c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Ala-D-Arg) | Asp 1.04,Ala 0.98,Val 1.0,Leu 1.0,Arg 2.01 | 18.4110-40％(40min.) | 838.4 |
| 26 | c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Arg-D-Arg) | Asp 1.01,Ala 1.07,Val 1.0,Leu 1.0,Arg 1.90 | 23.6810-40％(40min.) | 838.5 |
| 27 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Arg-D-Arg) | Asp 1.05,Ala 1.0,Val 0.97,Leu 0.98,Arg 2.0 | 26.4810-40％(40min.) | 871.5 |
| 28 | c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg-D-Ala) | Asp 1.03,Ala 0.99,Val 1.0,Leu 1.0,Arg 1.97. | 23.1610-40％(30min.) | 838.4 |
| 29 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg-D-Ala) | Asp 1.02,Ala 1.0,Val 0.98,Leu 0.99,Arg 1.96. | 27.3810-40％(30min.) | 872.5 |
| 30 | c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg-D-Arg) | Asp 1.03,Ala 1.98,Val 0.97,Leu 1.0,Arg 2.05. | 22.5510-40％(30min.) | 909.6 |
| 31 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg-D-Arg) | Asp 1.06,Ala 2.09,Val 1.0,Leu 1.0,Arg 1.99 | 24.3510-40％(30min.) | 943.5 |
| 32 | c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Ala) | Asp 1.0,Ala 2.08,Val 0.96,Leu 1.05,Arg 1.95. | 24.3310-40％(30min.) | 909.5 |
| 33 | c(D-Arg-MeIle-Leu-Asp-Val-NH(CH2)5CO) | Asp 1.01,Val 0.98,Leu 0.99,Ahx 0.99,Arg 1.02 | 23.1610-40％(30min.) | 724.3 |
| 34 | c(D-Arg-MeIle-Leu-Asp-Val-NH(CH2)2-S-(CH2)2-CO) | Asp 1.03,Val 0.96,Leu 0.99,Arg 1.02 | 23.2310-40％(30min.) | 742 |
| 35 | c(D-Arg-MeIle-Leu-Asp-Val-NH(CH2)2-S-CH2-CO) | Asp 0.97,Val 0.97,Leu 1.01,Arg 1.05 | 23.2310-40％(30min.) | 728.4 |
| 36 | c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-NH(CH2)2-S-CH2CO) | Asp 1.0,Val 1.02,Leu 1.04,Arg 1.01. | 17.3720-40％(40min.) | 728.4 |
| 37 | c(MeIle-Leu-Asp-Val-NH-CH2-CH2-S-CH2-CO-D-Arg-D-Arg) | Asp 1.0,Val 1.0,Leu 1.01,Arg 2.0. | 13.020-40％(40min.) | 884.4 |
| 38 | c(MePhe-Leu-Asp-Val-NH-CH2-CH2-S-CH2-CO-D-Arg-D-Arg) | Asp 1.0,Val 0.95,Leu 0.98,Arg 1.97. | 16.020-40％(40min.) | 918.4 |
用反相(C18)Vydac柱(218TP54,4.6×250mm)或Novapak柱(3.9×150mm)进行分析性HPLC。除特别指明外，在上述表中的化合物使用Vydac柱。所述溶剂体系含有水和乙腈(每一种都含有0.1％三氟乙酸)。用逐渐增加乙腈浓度的梯度洗脱所述柱(溶剂的比例和时间列于表中)，流速为1ml/min。在氨基酸分析时观察到存在部分非天然的氨基酸，但是没有估计含量。
Claims (21)
1．具有下式的环肽或其盐：其中Xaa1可从选自Phe、Lys和Arg的L-氨基酸；选自Phe和Met的D-氨基酸，所述L-和D-氨基酸任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；和MeIle中选择；
Xaa2为Leu，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
Xaa3为Asp，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
Xaa4为Val，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
X1可从选自Ala、Phe、Arg、Lys、Trp、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)、Orn(Me2)、Lys(CHMe2)和Arg(Pmc)的D-氨基酸，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
NH(CH2)5CO和NH(CH2)2S(CH2)yCO，其中y为1或2中选择；
X2可从选自Ala、Arg、Lys、His、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)和Orn(Me2)的D-氨基酸，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；NH(CH2)2SCH2CO和NH(CH2)xCO，其中x为2或3中选择；
Xaa5和Xaa6各自独立为选自Ala和Arg的D-氨基酸，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
p为0或1；q为0或当p为1时，q为0或1；其前提为当Xaa1为MeIle,Xaa2为Leu,Xaa3为Asp,Xaa4为Val,p和q均为0，
ⅰ)当X1为D-Ala时，X2不为D-Ala、D-Arg或D-Lys；
ⅱ)当X1为：
时，X2不为D-Arg；
ⅲ)当X1为D-Arg时，X2不为D-Ala、D-Arg或D-His；
ⅳ)当X1为D-Orn(CHMe2)或D-Arg(Pmc)时，X2不为D-Ala；
ⅴ)当X1为D-Lys时，X2不为D-Ala或D-Lys；和
ⅵ)当X1为D-Phe或D-Trp时，X2不为D-Lys或D-Arg。
2．权利要求1的环肽或其盐：其中Xaa1可从选自MeIle、MePhe、Lys和Arg的L-氨基酸和选自Phe和Met的D-氨基酸中选择；
Xaa2、Xaa3和Xaa4分别为Leu、Asp和Val；
X1可从选自Ala、Phe、Arg、Lys、Trp、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)、Orn(Me2)、Lys(CHMe2)和Arg(Pmc)的D-氨基酸；
NH(CH2)5CO和NH(CH2)2S(CH2)yCO，其中y为1或2中选择；
X2可从选自Ala、Arg、Lys、His、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)和Orn(Me2)的D-氨基酸；NH(CH2)2SCH2CO和NH(CH2)xCO，其中x为2或3中选择。Xaa5和Xaa6各自独立为选自Ala和Arg的D-氨基酸。
3．权利要求1的环肽或其盐，其中X1、X2、(Xaa5)p和(Xaa6)q中的任何两个为D-Arg。
4．下式的环肽或其盐：其中Xaa1可从选自Phe、Lys和Arg的L-氨基酸；选自Phe和Met的D-氨基酸，所述L-和D-氨基酸任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；和MeIle中选择；
Xaa2为Leu，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
Xaa3为Asp，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
Xaa4为Val，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
X1可从选自Ala、Phe、Arg、Lys、Trp、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)、Orn(Me2)、Lys(CHMe2)和Arg(Pmc)的D-氨基酸，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
NH(CH2)5CO和NH(CH2)2S(CH2)yCO，其中y为1或2中选择；
X2可从选自Ala、Arg、Lys、His、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)和Orn(Me2)的D-氨基酸，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；NH(CH2)2SCH2CO和NH(CH2)xCO，其中x为2或3中选择；
Xaa5和Xaa6各自独立为选自Ala和Arg的D-氨基酸，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
p为0或1；q为0或当p为1时，q为0或1；其前提为当p和q都为0时，Xaa1不为MeIle。
5．权利要求4的环肽，其中Xaa1为MePhe。
6．具有下式的环肽或其盐：其中Xaa1为选自MePhe和MeIle的L-氨基酸；
Xaa2为Leu，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
Xaa3为Asp，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
Xaa4为Val，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
X1可从选自Ala和Arg的D-氨基酸，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
和NH(CH2)2S(CH2)yCO，其中y为1或2中选择；
X2可从选自Ala和Arg的D-氨基酸，任选在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代和NH(CH2)xCO，其中x为2或3中选择；
Xaa5和Xaa6各自独立为选自Ala和Arg的D-氨基酸，任选在其α-碳或其α-氨基上被G1-4烷基取代；
p为1；q为0或1。
7．权利要求6的环肽或其盐，其中p为1,q为l。
8．权利要求6的环肽或其盐，其中p为1,q为0。
9．权利要求1的环肽，其中所述环肽选自： 
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Orn(CHMe2)-D-Orn(CHMe2))
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Lys(CHMe2)-D-Ala)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Orn(Me2)-D-Orn(Me2))
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-hArg(Et)2)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Phe-D-hArg(Et)2)
e(MeIle-Leu-Asp-Val-D-hArg(Et)2-D-hArg(Et)2)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Lys-D-His)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg(Pmc)-D-Lys)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Lys-D-Arg)
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Lys)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Lys)
c(Lys-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala)
c(Arg-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala)
c(D-Phe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Lys)
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala)
c(D-Phe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Lys)
c(D-Met-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Lys)
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg)
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-His)
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Trp-D-Arg)
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Ala-D-Arg)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Ala-D-Arg)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Arg-D-Arg)
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Arg-D-Arg)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg-D-Ala)
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg-D-Ala)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg-D-Arg)
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg-D-Arg)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Ala)
c(D-Arg-MeIle-Leu-Asp-Val-NH(CH2)5CO)
c(D-Arg-MeIle-Leu-Asp-Val-NH(CH2)2-S-(CH2)2-CO)
c(D-Arg-MeIle-Leu-Asp-Val-NH(CH2)2-S-CH2-CO)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-NH(CH2)2-S-CH2CO)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-NH-CH2-CH2-S-CH2-CO-D-Arg-D-Arg)
c(MePhe-Leu-Asp-Val-NH-CH2-CH2-S-CH2-CO-D-Arg-D-Arg)。
10．权利要求9的环肽选自：
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-hArg(Et)2-D-hArg(Et)2)
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg)
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-His)
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Trp-D-Arg)
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Ala-D-Arg)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Ala-D-Arg)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Arg-D-Arg)
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Arg-D-Arg)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg-D-Ala)
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg-D-Ala)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg-D-Arg)
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg-D-Arg)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Ala)
c(MeIle-Leu-Asp-Val-NH-CH2-CH2-S-CH2-CO-D-Arg-D-Arg)
c(MePhe-Leu-Asp-Val-NH-CH2-CH2-S-CH2-CO-D-Arg-D-Arg)。
11．下式的权利要求10的环肽
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-His)。
12．下式的权利要求10的环肽
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg)。
13．下式的权利要求10的环肽
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Arg-D-Arg)。
14．下式的权利要求10的环肽
c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg-D-Arg)。
15．含有权利要求1-14中任何一项的环肽或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的稀释剂或载体的药用组合物。
16．制备权利要求1-14中任何一项的环肽或其盐的方法，该方法选自：
(a)以逐步的方式，装配所需的线性肽(一次增加一个氨基酸)，接着选择性去除N-和C-末端任何的保护基团，环化并最后去质子化得到权利要求1-14中任何一项的环肽，并任选(如果需要)将如此获得的产物制成其盐；
(b)通过使两个肽单元偶合形成酰胺键，所述一个肽单元含有羧酸基团或其活性的衍生物，而另一个含有氨基基团，以产生权利要求1-14中任何一项的保护或未保护的环肽，并如果需要用下列方法(c)去除保护基团，并任选如果需要将如此获得的产物转化为其盐；和
(c)从下式的保护的环肽中除去一个或多个常规肽保护基团：
其中Pr1为Xaa3侧链中的所述酸性基团上的保护基团，得到权利要求1-14任何一项的环肽，并任选同时或随后去除存在的任何另外的常规肽保护基团，并任选如果需要将如此获得的产物转化为其盐。
17．在需要此治疗的哺乳动物中，抑制VCAM-1和/或纤连蛋白和整联蛋白受体VLA-4间相互作用的方法，该方法包括给予所述哺乳动物有效量的权利要求1-14中任何一项的环肽、其药学上可接受的盐或权利要求15的药用组合物。
18．权利要求17的方法，用于治疗多发性硬化症、类风湿性关节炎、哮喘或牛皮癣。
19．在需要此治疗的哺乳动物中，抑制MAdCAM-1和整联蛋白α4β7间相互作用的方法，该方法包括给予所述哺乳动物有效量的权利要求1-14中任何一项的环肽、其药学上可接受的盐或权利要求15的药用组合物。
20．权利要求1-14中任何一项的环肽或其药学上可接受的盐在制备用于治疗由VCAM-1或纤连蛋白和整联蛋白受体VLA-4间相互作用介导的疾病或紊乱的药物中的用途。
21．权利要求1-14中任何一项的环肽或其药学上可接受的盐在制备用于治疗由MAdCAM-1和整联蛋白α4β7间相互作用介导的疾病或紊乱的药物中的用途。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C01 | Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |