KR20240007140A - Psd-95 억제제 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PSD-95의 PDZ 도메인에 결합할 수 있는 화합물 및 PSD-95에 의해 매개된 단백질-단백질 상호작용의 억제제로서 이의 의학적 용도에 관한 것이다.

Description

PSD-95 억제제 및 이의 용도
본 발명은 PSD-95의 PDZ 도메인(domain)에 결합할 수 있는 화합물 및 PSD-95에 의해 매개된 단백질-단백질 상호작용의 억제제로서 이의 의학적 용도에 관한 것이다.
PSD-95는 이의 PSD-95/디스크스(Discs)-라지(large)/ZO-1(PDZ) 도메인을 통해 N-메틸-D-아스파르테이트(NMDA) 수용체(Kornau et al. 1995) 및 뉴우런 산화질소 신타제(neuronal nitric oxide synthase; nNOS)와 상호작용하는 뉴우런 시냅스(neuronal synapse) 내 스캐폴딩 단백질(scaffolding protein)이다. 뇌 경색(cerebral ischemia) 동안, 과도한 글루타메이트 방출은 NMDA 수용체의 과활성화를 초래하고 Ca2+ 및 NO의 세포내 수준의 유해한 상승을 초래하며, 이는 궁극적으로 신경세포사(neuronal death) 및 뇌 손상(brain damage)을 유도한다(Aarts et al., 2002; Dawson et al., 1991; Huang et al., 1994; Sattler et al., 1999). PSD-95는 급성 허혈성 뇌졸중(acute ischemic stroke; AIS) 및 뇌에서 관련된 허혈성 상태(ischemic condition)에서 약물 표적(drug target)으로서 탐구되고 있다.
20-량체 펩타이드 네리네타이드(20-mer peptide nerinetide)(또한 Tat-NR2B9c 또는 NA-1로서 공지됨)가 최근에 제3상 임상 시험 ESCAPE-NA1에서 시험되었고(Hill et al., 2020), 이는 알테플라제(조직 플라스미노겐 활성인자, tPA)와 같은 표준물 외에, 네리네타이드를 사용한 치료가 허혈성 뇌졸중을 지니고 혈전 절제술(endovascular thrombectomy)을 겪은 환자에 대한 임상 결과를 증진시킬 수 있는지의 여부를 평가하였다(Hill et al., 2020). 총 1105명의 환자가 연구에 포함되었고, 여기서 659명의 환자가 tPA 치료를 제공받았고, 446명의 환자는 제공받지 않았다. 네리네타이드가 알테플라제를 제공받는 환자에서 효과적이지 않았지만, 알테플라제를 제공받지 않은 그룹에서, 네리네타이드는 증진된 기능성 결과, 감소된 사망률, 및 감소된 경색 용적(reduced infarction volume)을 야기하였음이 밝혀졌다(Hill et al., 2020). tPA-치료된 그룹에서 효과의 결여는 네리네타이드와 tPA 사이의 약물-약물 상호작용에 의해 설명될 수 있었음이 최근에 입증되었다. 구체적으로, tPA는 네리네타이드를 절단하는 세린 프로테아제인, 플라스민을 생성한다(Mayor-Nunez et al. 2021). 따라서, 약물이 AIS에 대한 보호 표준인, 혈전용해제(thrombolytic agent)의 투여와 병용하는 것이 매우 유리하다.
네리네타이드는 표적 PSD-95에 대해 비교적 낮은 친화성으로 고통을 받으며, 이는 또한 UCCB01-144 (AB144) 및 UCCB01-125로 각각 공지된, Tat-N-이량체(dimer) 및 O-이량체와 같은 이량체성 화합물의 설계를 촉진하였다(Bach et al., 2009, 2012; WO 2010/004003, WO 2012/156308; Kucharz et al., 2017). 시험관 내(in vitro) 형광편광 분석(fluorescence polarization; FP) 검정에서, PSD095의 PDZ1 및 PDZ2를 향한 네리네타이드의 K i 값은 5 내지 10 μM이었다(Bach et al., 2012). 대조적으로, AB144 및 UCCB01-125는, 이의 이량체 구조 및 2가 특성으로 인하여, PSD-95이 PDZ1 및 PDZ2에 동시에 결합하여, 단량체성 네리네타이드의 것과 비교하여 PDZ1-2에 대해 1000배 더 높은 친화성을 유도한다(각각 4.6 및 9.5 nM의 K i 값)(Bach et al., 2012). 영구적인 중 대뇌 동맥 폐색(permanent middle cerebral artery occlusion; pMCAO)을 겪는 마우스에서, 허혈증 30분 후에 제공된 AB144(3 nmol/g)의 단일 정맥내(i.v.) 볼루스 주사(bolus injection)는 염수의 효과와 비교하여, 각각 6시간 및 48시간의 허혈증 후 생존 기간에서 40% 및 37%의 경색 용적을 감소시켰다(Bach et al., 2012). 더욱이, 악력(grip strength) 및 로타로드 성능(rotarod performance)과 같은 기능성 결과가 증진됨으로써 경색 크기의 감소와 관련되었다. 동일한 실험 조건 및 용량(3 nmol/g) 하에서, 네리네타이드는 유의적인 신경보호 특성을 나타내지 않았다(Bach et al., 2012). 유사하게, Tat 모이어티(moiety)가 없는 UCCB01-125는 뇌에 도달하지 않았고 신경보호 특성을 나타내지 않았다(Bach et al., 2012).
따라서, PSD-95는 급성 상태, 예를 들면, 지주막하 출혈(subarachnoid hemorrhage; SAH) 및 AIS의 치료를 위한 특히 촉망되는 약물 표적으로 고려되고 있다. 중요하게도, PSD-95는 세포내에 위치하므로, PSD-95를 표적화하는 어떠한 약물도 세포 막을 효율적으로 횡단하여 PSD-95에 결합할 필요가 있다.
요약
본 발명자는 PSD-95에 대해 높은 친화성을 지닌 일련의 신규 화합물을 개발하였다. 네리네타이드와 같은 공지된 PSD-95 억제제와 비교하여, 본 발명의 화합물은 증진된 세포 흡수 및 훨씬 더 높은 플라스민 안정성(plasmin stability)을 갖는다. 따라서, 본 발명의 화합물은 흥분성독-관련 질환(excitotoxic-related disease), 예를 들면, AIS 및 SAH의 치료에 유용하고, 보호의 표준, 예를 들면, 혈전용해제와 상용성(compatible)이 있다.
일 양태에서, 본 발명은:
a. 아미노산 서열 X2TX3V(서열 번호: 53)을 포함하거나 이로 이루어진 제1의 펩타이드 (P1)(여기서,
X2는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X3은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택된다);
b. 아미노산 서열 X5TX6V (서열 번호: 55)를 포함하거나 이로 이루어진 제2의 펩타이드 (P2)(여기서,
X5는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X6은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택된다); 및
c. i. 3 내지 20개의 L-아르기닌 잔기로 이루어진 폴리-L-아르기닌 펩타이드(폴리-Arg);
ii. yGrkkrrqrrr (서열 번호: 9, D-TAT);
iii. RQIKIWFQNRRMKWKK (서열 번호: 14, L-Pen);
iv. rqikiwfqnrrmkwkk (서열 번호: 15, D-Pen);
v. RKKRRRESRKKRRRES (서열 번호: 17, L-DPV3);
vi. LLIILRRRIRKQAHAHSK (서열 번호: 18, L-pVEC);
vii. KLALKLALKALKAALKLA (서열 번호: 16, L-MAP);
viii. PLIYLRLLRGQF (서열 번호: 19, L-TP2);
ix. |(Dap)KAPETALD| (서열 번호: 21, MiniAp4); 및
x. |Ff(Nal2)RrRrQ|GABA-K (서열 번호: 22, CPP12)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포 침투 펩타이드(Cell Penetrating Peptide; CPP)를 포함하는 화합물에 관한 것이고,
여기서, CPP는 이의 C-말단을 통해 링커(linker)에 연결되고, P1 및 P2는 이의 N-말단을 통해 링커에 접합되고, 화합물은 하기 화학식 (I)의 구조 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 갖는다:
다른 양태에서, 본 발명은 의약(medicament)으로서 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 화합물에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 흥분독-관련 질환(excitotoxic-related disease), 예를 들면, 허혈성 뇌졸중 및 지주막하 출혈로부터 선택된, 뇌졸중(stroke)의 발달을 치료하고/하거나, 방지하고/하거나, 감소시키고/시키거나 지연시키는데 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 화합물에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 통증(pain)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 화합물에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 화합물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
도 1. FP에 의해 측정된 바와 같은 PSD-95 PDZ1-2에 대한 O-PEG4 이량체(화합물 1 내지 7)의 친화성(affinity). 데이타는 평균 + SEM, n = 3으로 나타낸다.
도 2. FP에 의해 측정된 바와 같은 PSD-95 PDZ1-2에 대한 Ac-TAT 및 Ac-폴리Arg에 융합된 이량체 리간드의 친화성. 데이타는 평균 + SEM, n = 3으로 나타낸다.
도 3. FP에 의해 측정된 바와 같은 PSD-95 PDZ1-2에 대한 다양한 CPP-태그(tag)(서열 번호: 8 내지 22)에 융합된 N-PEG4(IETDV)2의 친화성. 데이타는 평균 + SEM, n = 3으로 나타낸다.
도 4. FP에 의해 측정된 바와 같은 PSD-95 PDZ1-2에 대한 폴리Arg CPP-태그에 융합된 NPEG4-(KETLV)2 이량체성 리간드의 친화성. 데이타는 평균 + SEM, n = 3으로 나타낸다.
도 5. 시험관 내(in vitro) 혈장 안정성 검정에서 측정된 바와 같은 Ac-TAT 및 Ac-폴리Arg에 융합된 이량체성 리간드의 반감기. 데이타는 평균 + SEM, n = 3으로서 나타낸다.
도 6. 시험관 내 플라스민 안정성 검정에서 측정된 바와 같은 다양한 CPP-태그(서열 번호: 8 내지 22)에 융합된 N-PEG4(IETDV)2의 반감기. 데이타는 평균 + SEM, n = 3으로 나타낸다.
도 7. CAPA에 의해 측정된 바와 같은 Ac-TAT 및 Ac-폴리Arg에 융합된 이량체성 리간드의 세포 흡수(cellular uptake). 데이타는 평균 + SEM, n = 3으로 나타낸다.
도 8. CAPA에 의해 측정된 바와 같은 다양한 CPP-태그(서열 번호: 8 내지 22)에 융합된 N-PEG4(IETDV)2의 세포 흡수. 데이타는 평균 + SEM, n = 3으로 나타낸다.
도 9. CAPA에 의해 측정된 바와 같은 다양한 폴리Arg CPP-태그에 융합된 N-PEG4(IETDV)2 및 N-PEG4(KETLV)2의 세포 흡수. 데이타는 평균 + SEM, n = 3으로 나타낸다.
도 10. 사람 혈장 안정성 검정에서 측정된 바와 같은 폴리Arg CPP-태그에 융합된 N-PEG4(IETDV)2 및 N-PEG4(KETLV)2의 반감기. 데이타는 평균 ± SEM, n = 3으로 나타낸다.
도 11. PSD-95의 PDZ1-2에 결합하는 화합물의 일반적인 구조. R1 내지 R5는 본원에 기술된 바와 같은 아미노산 측쇄이고 R6은 본원에 기술된 바와 같은 CPP-태그를 나타낸다.
상세한 설명
정의
아미드 결합: 본원에 사용된 바와 같은 용어 '아미드 결합'은 카복실산과 아민(및 수반되는 물의 제거) 사이의 반응에 의해 형성된 화학적 결합이다. 반응이 2개의 아미노산 잔기 사이에서 일어나는 경우, 반응의 결과로 형성된 결합은 펩타이드 연결(펩타이드 결합)으로 알려져 있다.
포함하는(comprising): 본원에 사용된 바와 같은 용어 '포함하는'은 포괄적인 방식으로 이해되어야 한다. 따라서, 예로서, 화합물 X를 포함하는 조성물은 화합물 X 및 임의로 추가의 화합물을 포함할 수 있다
이량체(Dimer): 본원에 사용된 바와 같은 용어 이량체는 화학적 또는 물리적 상호작용에 의해 연합된 2개의 동일하거나 동일하지 않은 화학적 모이어티(moiety)를 지칭한다. 예로서, 이량체는 단독이량체, 예를 들면, 링커에 의해 연결된 2개의 동일한 화학적 모이어티일 수 있다. 이량체는 또한 이종이량체(heterodimer), 예를 들면, 링커에 이해 연결된 2개의 상이한 화학적 모이어티일 수 있다. 이량체의 예는 링커의 수단에 의해 공유결합으로 연결된 2개의 펩타이드를 포함하는 화합물인 본 발명의 PSD-95 억제제이며, 여기서 펩타이드는 PSD-95의 PDZ1 및 PDZ2와 동시에 결합할 수 있거나, 또는 상호작용할 수 있다.
디펩타이드: 본원에 사용된 바와 같은 용어 '디펩타이드'는 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개의 천연 또는 비-천연 아미노산을 지칭한다.
지방 산: 본원에 사용된 바와 같은 용어 지방산(FA로 약술됨)은 전형적으로 긴 지방족 탄소 쇄를 지닌 카복실산을 지칭하고, 이는 포화되거나 불포화될 수 있다. 지방산은 단-쇄 지방산(short-chain fatty acid; SCFA), 중-쇄 지방산(Medium-chain fatty acid; MCFA), 장-쇄 지방산(Long-chain fatty acid; LCFA) 및 매우 긴 쇄 지방 산(Very long chain fatty acid; VLCFA)으로부터 선택될 수 있다. 단-쇄 지방산(SCFA)은 6개 미만의 탄소의 지방족 테일(aliphatic tail)을 지닌 지방산(즉, 부티르산)이다. 중-쇄 지방산(MCFA)은 6 내지 12개의 탄소의 지방족 테일을 지닌 지방산이고, 이는 중-쇄 트리글리세라이드를 형성할 수 있다. 장-쇄 지방산(LCFA)은 13 내지 21개의 탄소의 지방족 테일을 지닌 지방산이다. 매우 긴 쇄 지방산(VLCFA)은 22개보다 긴 탄소의 지방족 테일을 지닌 지방산이다. 본 발명의 지방산은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 적합한 지방산 또는 지방산 유도체일 수 있다.
비-단백질생성 아미노산(non-proteinogenic amino acid): 비-암호화된, 비-가닥 또는 비-천연 아미노산으로 또한 지칭된 비-단백질생성 아미노산은 유전 코드에 의해 암호화되지 않은 아미노산이다. 비-단백질생성 아미노산의 완전하지 않은 목록은 γ-아미노부티르산, L-3-(2-나프틸)알라닌, L-2,3-디아미노프로피온산, α-아미노-n-부티르산, 노르발린, 노르루이신, 이소루이신, 알로이소루이신, 3급-루이신, α-아미노-n-헵탄산, 피페콜산, α,β-디아미노프로피온산, α,γ-디아미노부티르산, 오르니틴, 알로트레오닌, 호모시스테인, 호모세린, β-알라닌, β-아미노-n-부티르산, β-아미노이소부티르산, α-아미노이소부티르산, 이소발린, 사르코신, N-에틸 글리신, N-프로필 글리신, N-이소프로필 글리신, N-메틸 알라닌, N-에틸 알라닌, N-메틸 β-알라닌, N-에틸 β-알라닌, 이소세린 및 α-하이드록시-γ-아미노부티르산을 포함한다.
단백질생성 아미노산: 천연 아미노산으로 또한 지칭된 단백질생성 아미노산은 알라닌, 시스테인, 셀레노시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소루이신, 라이신, 루이신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 피롤라이신, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판 및 타이로신을 포함한다. 대문자 약어는 L-아미노산을 나타내지만, 소문자 약어는 D-아미노산을 나타낸다.
PDZ: 본원에 사용된 바와 같은 용어 'PDZ'는 후시냅스 밀도 단백질(Postsynaptic density protein)-95(PSD-95), 드로소필라 동족체 디스크 큰 종양 억제제(Drosophilahomologue discs large tumor suppressor)(DlgA), 폐쇄 띠-1 단백질(Zonula occludens-1 protein)(zo-1)을 나타낸다.
PSD-95: 본원에 사용된 바와 같은 용어 'PSD-95'는 후시냅스 밀도 단백질(postsynaptic density protein)-95를 지칭한다.
PSD-95 억제제: 본원에 사용된 바와 같은 용어 'PSD-95 억제제'는 PSD-95의 PDZ1, PDZ2, 또는 PDZ1 및 PDZ2 둘 다에 결합하여 세포 내에서 이러한 PDZ 도메인(domain)에 의해 촉진된 단백질-단백질 상호작용을 억제하는 화합물을 지칭한다. PSD-95 억제제에 의해 억제된 상호작용의 예는 nNOS, PSD-95 및 NMDA 수용체 사이의 3원 복합체(ternary complex) 형성이다.
화합물
일 양태에서, 본 발명은 세포 침투 펩타이드(Cell Penetrating Peptide; CPP)에 연결된 제1의 펩타이드를 포함하는 화합물에 관한 것이다. 일 구현예에서, P1은 링커(linker)를 통해 CPP에 연결된다. 일 구현예에서, 화합물은 제2의 펩타이드(P2)를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, CPP는 링커를 통해 P1 및 P2에 연결된다. 따라서, 일 구현예에서, CPP는 이의 C-말단을 통해 링커에 연결되고, P1 및 P2는 이의 N-말단을 통해 링커에 접합되고, 화합물은 하기의 화학식 (I)의 일반 구조를 갖는다:
따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 제1의 펩타이드(P1) 및 제2의 펩타이드(P2)를 포함하고, 여기서 P1 및 P2 둘 다는 PSD095의 PDZ1 및 PDZ2 도메인에 동시에 결합할 수 있는데, 즉, 화합물은 이량체성 PSD-95 억제제이다.
일 양태에서, 본 발명은 아미노산 서열 X2TX3V(서열 번호: 53)를 포함하거나 또는 이로 이루어진 펩타이드(P1)을 포함하는 화합물에 관한 것이고, 여기서
a. X2는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
b. X3은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
여기서 P1은 세포 침투 펩타이드(CPP)에 연결된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 링커를 통해 제2의 펩타이드(P2)에 연결된 제1의 펩타이드(P1)을 포함하는 화합물, 예를 들면, 화학식 (XXIV)의 일반 구조를 갖는 화합물에 관한 것이다:
상기식에서,
링커, P1 및 P2는 본원에 정의된 바와 같다. 바람직하게는, P1 및 P2는 KETLV(서열 번호: 2), KETTV(서열 번호: 3), KETVV(서열 번호: 4), KETRV(서열 번호: 5), ISTDV(서열 번호: 6) 또는 VETVV(서열 번호: 7)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 임의로, 링커는 세포 침투 펩타이드(CPP) 또는 알부민 결합 모이어티에 추가로 접합됨으로써, 막 또는 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier)을 횡단하는 펩타이드의 통과를 증가시킨다. 알부민 결합 모이어티는 알부민에 결합하는 임의의 적합한 화학 그룹일 수 있다. 바람직하게는, 알부민 결합 모이어티는 지방산이다. 일 구현예에서, 링커는 CPP에 추가로 접합되는데, 즉, 화합물은 화학식 (I)의 일반 구조를 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은:
a. 아미노산 서열 X2TX3V (서열 번호: 53)를 포함하거나 또는 이로 이루어진 제1의 펩타이드(P1)(여기서
X2는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X3은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택된다);
b. 아미노산 서열 X5TX6V (서열 번호: 55)를 포함하거나 또는 이로 이루어진 제2의 펩타이드(P2)(여기서
X5는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X6은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택된다); 및
c. i. 3 내지 20개의 L-아르기닌 잔기로 이루어진 폴리-L-아르기닌 펩타이드(폴리-Arg);
ii. yGrkkrrqrrr (서열 번호: 9, D-TAT);
iii. RQIKIWFQNRRMKWKK (서열 번호: 14, L-Pen);
iv. rqikiwfqnrrmkwkk (서열 번호: 15, D-Pen);
v. RKKRRRESRKKRRRES (서열 번호: 17, L-DPV3);
vi. LLIILRRRIRKQAHAHSK (서열 번호: 18, L-pVEC);
vii. KLALKLALKALKAALKLA (서열 번호: 16, L-MAP);
viii. PLIYLRLLRGQF (서열 번호: 19, L-TP2);
ix. |(Dap)KAPETALD| (서열 번호: 21, MiniAp4); 및
x. |Ff(Nal2)RrRrQ|GABA-K (서열 번호: 22, CPP12)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포 침투 펩타이드(CPP)를 포함하는 화합물에 관한 것이고.
여기서 CPP는 이의 C-말단을 통해 링커에 연결되고, P1 및 P2는 이의 N-말단을 통해 링커에 접합되며, 화합물은 화학식 (I)의 일반 구조 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 갖는다:
결합 펩타이드 P 1 및 P 2
펩타이드 P1 및 P2는 PSD-95의 PDZ1 및 PDZ2 도메인(domain)에 대해 높은 친화성(affinity)을 갖는다. 일 구현예에서, 화합물은 PSD-95 억제제인데, 즉, 화합물은 PSD-95의 PDZ 도메인 중 하나 이상에 결합할 수 있다.
일 구현예에서, 화합물은 아미노산 서열 X2TX3V(서열 번호: 53)를 포함하거나 또는 이로 이루어진 제1의 펩타이드(P1)을 포함하고, 여기서
a. X2는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
b. X3는 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일 구현예에서, P1은 서열 X1X2TX3V(서열 번호: 54)를 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 여기서
a. X1은 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
b. X2는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
c. X3은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일 구현예에서, P1은 IETDV(서열 번호: 1)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 구현예에서, P1은 KETLV(서열 번호: 2)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 구현예에서, P1은 KETTV(서열 번호: 3)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 구현예에서, P1은 KETVV(서열 번호: 4)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 구현예에서, P1은 KETRV(서열 번호: 5)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 구현예에서, P1은 ISTDV(서열 번호: 6)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 구현예에서, P1은 VETVV(서열 번호: 7)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일 구현예에서, P1은 4 내지 10개의 아미노산 잔기, 예를 들면, 5개의 아미노산 잔기, 예를 들면, 6개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 서열 번호: 53 또는 서열 번호: 54로 제공된 아미노산 잔기의 과량의 아미노산 잔기는 단백질생성 또는 비-단백질생성 아미노산일 수 있다.
일 구현예에서, 화합물은 아미노산 서열 X5TX6V(서열 번호: 55)를 포함하거나 또는 이로 이루어진 제2의 펩타이드(P2)를 추가로 포함하고, 여기서
a. X5는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
b. X6은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일 구현예에서, P2는 서열 X4X5TX6V(서열 번호: 56)를 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 여기서
a. X4는 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
b. X5는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
c. X6은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일 구현예에서, P2는 IETDV(서열 번호: 1)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 구현예에서, P2는 KETLV(서열 번호: 2)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 구현예에서, P2는 KETTV(서열 번호: 3)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 구현예에서, P2는 KETVV(서열 번호: 4)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 구현예에서, P2는 KETRV(서열 번호: 5)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 구현예에서, P2는 ISTDV(서열 번호: 6)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 구현예에서, P2는 VETVV(서열 번호: 7)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일 구현예에서, P2는 4 내지 10개의 아미노산 잔기, 예를 들면, 5개의 아미노산 잔기, 예를 들면, 6개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 서열 번호: 55 또는 서열 번호: 56으로 제공된 아미노산 잔기의 과량의 아미노산 잔기는 단백질생성 또는 비-단백질생성 아미노산일 수 있다.
일 구현예에서, P1 및 P2는 동일하다.
일 구현예에서, X2가 E인 경우, X3은 D가 아니다. 일 구현예에서, X5가 E인 경우, X6은 D가 아니다. 일 구현예에서, P1 및/또는 P2는 IETDV(서열 번호: 1)가 아니다.
바람직한 구현예에서, 펩타이드 P1 및 P2는 이의 N-말단을 통해 링커 또는 CPP에 접합된다. 일 구현예에서, 아미노산 서열 X2TX3V(서열 번호: 53)는 P1의 C-말단이다. 일 구현예에서, 아미노산 서열 X5TX6V(서열 번호: 55)는 P2의 C-말단이다.
세포 침투 펩타이드(Cell Penetrating Peptide: CPP)
본 발명의 화합물은 세포 침투 펩타이드(CPP)에 연결된 펩타이드 P1을 포함한다. CPP는 혈액 뇌 장벽(BBB) 및/또는 포유동물 세포의 혈장 막을 횡단하는 능력에 의해 특성화됨으로써 카보 분자(cargo molecule), 예를 들면, 이것이 연결된 펩타이드, 단백질, 올리고뉴클레오타이드의 세포내 전달을 일으킬 수 있다.
일 구현예에서, CPP는 폴리-L-아르기닌 펩타이드(폴리-Arg)이다. 일 구현예에서, 폴리-Arg는 3 내지 20개의 L-아르기닌 잔기로 이루어진다. 일 구현예에서, 폴리-Arg는 5 내지 10개의 L-아르기닌 잔기, 예를 들면, 7 내지 10개의 L-아르기닌 잔기, 예를 들면, 8 또는 9개의 L-아르기닌 잔기로 이루어진다. 일 구현예에서, 폴리-Arg는 3 내지 10개의 L-아르기닌 잔기로 이루어진다. 일 구현예에서, CPP는 아미노산 서열 RRRRRRRRR(L-Arg9, 서열 번호: 12)을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 구현예에서, CPP는 아미노산 서열 RRRRRRRR(L-Arg8, 서열 번호: 57)을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 구현예에서, CPP는 아미노산 서열 RRRRRRR(L-Arg7, 서열 번호: 58)을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 구현예에서, CPP는 아미노산 서열 RRRRRR(L-Arg6, 서열 번호: 59)을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 구현예에서, CPP는 아미노산 서열 RRRRR(L-Arg5, 서열 번호: 60)을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 구현예에서, CPP는 아미노산 서열 RRRR(L-Arg4, 서열 번호: 61)을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 구현예에서, CPP는 아미노산 서열 RRR(L-Arg3)을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일 구현예에서, CPP는 표 1에 제공된 CPP로부터 선택된다.
[표 1]
일 구현예에서, CPP는 폴리-L-아르기닌 펩타이드(폴리-Arg), 예를 들면, L-Arg9; D-TAT; L-Pen; D-Pen; L-DPV3; L-pVEC; L-MAP; L-TP2; MiniAp4 및 CPP12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩타이드를 포함한다. 일 구현예에서, CPP는 폴리- L-아르기닌 펩타이드(폴리-Arg), 예를 들면, L-Arg9; D-TAT; L-Pen; D-Pen; L-DPV3; L-pVEC; L-MAP; L-TP2; MiniAp4 및 CPP12로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일 구현예에서, CPP는 D-TAT이다. 일 구현예에서, CPP는 L-Pen이다. 일 구현예에서, CPP는 D-Pen이다. 일 구현예에서, CPP는 L-DPV3이다. 일 구현예에서, CPP는 L-pVEC이다. 일 구현예에서, CPP는 L-MAP이다. 일 구현예에서, CPP는 L-TP2이다. 일 구현예에서, CPP는 MiniAp4이다. 일 구현예에서, CPP는 CPP12이다.
일 구현예에서, CPP는 20개 이하의 아미노산 잔기, 예를 들면, 19개 이하, 예를 들면, 18개 이하, 예를 들면, 17개 이하, 예를 들면, 16개 이하, 예를 들면, 15개 이하, 예를 들면, 14개 이하, 예를 들면, 13개 이하, 예를 들면, 12개 이하, 예를 들면, 11개 이하, 예를 들면, 10개 이하, 예를 들면, 9개 이하, 예를 들면, 8개 이하, 예를 들면, 7개 이하의 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, CPP는 비-펩타이드 모이어티에 접합된다. 예를 들면, CPP는 메틸화되거나 아세틸화될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드가 본원에 아미노산 잔기의 특정 서열로 이루어진 것으로 정의되는 경우, 상기 펩타이드는 어떠한 다른 아미노산 잔기에 접합되지 않지만 상기 펩타이드는 비-펩타이드 모이어티에 대한 접합이 다른 아미노산 서열이 되도록 하지 않는 한, 비-펩타이드 모이어티에 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, CPP의 N-말단은 비-펩타이드 모이어티에 접합된다. 일부 구현예에서, CPP의 C-말단은 비-펩타이드 모이어티에 접합된다. 일부 구현예에서, CPP의 N-말단은 아세틸화되는데, 즉, 화학 구조 CH3C(O)-에 결합된다. 예를 들면, CPP는 N-말단에서 아세틸화된 9개의 L-아르기닌 잔기로 이루어진 폴리-Arg 펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, CPP의 N-말단은 클로로알칸 태그chloroalkane tag; CA)에 접합되며, 이는 하기 구조를 갖는다:
.
일 구현예에서, CPP의 N-말단은 메틸화된다. 다른 구현예에서, CPP의 N-말단은 포르밀화된다.
링커
본원에 사용된 바와 같은 용어 '링커'는 하나의 화학적 실체(chemical entity)로부터 다른 것으로의 연결을 형성하는 하나 이상의 원자를 지칭한다. 예로서, 본원에 지칭된 '링커'는 이의 N-말단 각각에 대해 링커를 형성함으로써 2개의 PDZ-도메인 결합 펩타이드 P1 및 P2를 결합(join)시킬 수 있다. 다양한 링커가 당해 분야에 공지되어 있다. 링커는 예를 들면, 화학적 링커 또는 펩타이드 링커, 또는 이의 조합일 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 활성 작용 그룹, 예를 들면, 친지성 또는 친핵성 작용 그룹을 포함하고 이는 각각의 펩타이드에 링커를 부착하는데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 링커는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 단위를 포함한다.
PEG는 하기 화학식 C2nH4n+2On+1 및 반복 구조를 갖는 에틸렌 글리콜의 중합체이고:
여기서 n은 정수이다.
따라서, PEG 단위는 하기 구조를 갖는다:
예를 들면, 4개의 PEG 모이어티, 또는 PEG4로 이루어진 중합체는 4개의 에틸렌 글리콜 모이어티(n=4)의 중합체에 상응한다.
용어 "PEG 단위" 및 "PEG 모이어티"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
일 구현예에서, PEG 단위 중 하나의 적어도 하나의 산소 원자가 질소 원자로 대체되어 NPEG를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 '에틸렌 글리콜 모이어티'는 PEG 또는 NPEG 링커를 구성하는 구조 단위를 포함한다.
일 구현예에서, 2개의 PDZ-도메인 결합 펩타이드 P1 및 P2의 N-말단은 하나 이상의 PEG 단위를 포함하는 링커에 의해 서로 연결되고, 여기서 PEG 단위의 적어도 하나의 산소 원자가 질소 원자로 임의로 대체된다. 일 구현예에서, P1 및/또는 P2는 PEG/NPEG 단위에 스페이서 그룹, 예를 들면, 짧은 알칸 쇄를 통해 개별적으로 결합된다.
일 구현예에서, 링커는 하나 이상의 PEG 단위를 포함하고, 여기서 PEG 단위 중 하나의 적어도 하나의 산소 원자가 질소 원자로 대체되어 NPEG를 제공한다. 일 구현예에서, 링커는 NPEG 단위를 포함하고, 여기서 CPP는 링커에 화학적 결합을 통해 직접적으로 또는 간접적으로 NPEG 링커의 골격 내 질소 원자에 결합된다. NPEG 링커의 질소에 대한 CPP의 연결은 아미드 결합, 1,3-이극성 폐환부가(cycloaddition), 예를 들면, 구리 촉매된 아지드-알킨 폐환부가, 말레이미드 커플링, 이황화물 결합, 또는 N-하이드록시석신이미드(NHS) 에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 석신이미딜 카보네이트, p-니트로페닐 카보네이트, 석신이미딜 우레탄, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 아실 아지드, 설포닐 클로라이드, 알데하이드, 카보네이트, 이미디오에스테르 또는 무수물로부터 선택된 아미노-반응성 친핵성 그룹; 및 할로아세틸, 알킬 할라이드 유도체, 아지리딘, 아크릴로일 유도체 아릴화제로부터 선택된 티오-반응성 그룹을 통해 매개될 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 하나 이상의 PEG 단위를 포함하고, 여기서 PEG 단위 중 하나의 적어도 하나의 산소 원자가 질소 원자로 대체되어 NPEG를 제공하고, 여기서 CPP는 아미드 결합에 의해 링커의 질소 원자에 연결된다. 대안적으로, NPEG 단위를 포함하는 링커의 질소에 대한 CPP의 연결은 스페이서 그룹(spacer group)을 통해 매개될 수 있고, 여기서 적합한 스페이서 그룹은 예를 들면, 임의의 아미노산(들); 짧은 알칸 쇄 또는 짧은 PEG/NPEG 쇄일 수 있다.
일 구현예에서, 링커는 NPEG 단위를 포함하고, 여기서 CPP는 아미드 결합에 의해 링커의 질소 그룹에 연결된다. 예를 들면, 일 구현예에서, 화합물은 하기 화학식 (III)의 일반 구조를 갖는다:
상기 화학식에서,
CPP, P1 및 P2는 본원에 정의된 바와 같고;
p는 0 내지 10의 정수이고;
q는 0 내지 10의 정수이다.
일 구현예에서, p는 q이다. 일 구현예에서, p는 > q이다. 일 구현예에서, p는 < q이다. 일 구현예에서, p와 q의 합은 1 내지 20의 정수이다. 일 구현예에서, p는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택된 정수이다. 일 구현예에서, p는 0 내지 4의 정수이다. 일 구현예에서, q는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택된 정수이다. 일 구현예에서, q는 0 내지 4의 정수이다. 일 구현예에서, 에틸렌 글리콜 모이어티 p + q의 총 수는 2 내지 12, 예를 들면, 2, 예를 들면, 4, 예를 들면, 6, 예를 들면, 8, 예를 들면, 10, 예를 들면, 12이다. 일 구현예에서, 에틸렌 글리콜 모이어티 p + q의 총 수는 4이다. 일 구현예에서, p는 2이고 q는 2이다.
전반적인 이량체 구조
일 구현예에서, 화합물은 하기 화학식 (XXV)의 일반 구조를 갖는다:
상기 화학식에서,
P1 및 P2는 본원에 정의된 바와 같고;
Xa는 로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
CPP는 본원에 정의된 바와 같고;
p는 0 내지 10의 정수이고;
q는 0 내지 10의 정수이다.
일 구현예에서, p와 q는 2이고, 화합물은 하기 화학식 (XXVI)의 일반 구조를 갖는다:
.
일 구현예에서, 화합물은 화학식 (XXVI)의 화합물이고, 여기서 Xa는 -O-이고 P1 및 P2는 KETLV(서열 번호: 2)이며, 따라서 화합물 2, 즉, OPEG4-(KETLV)2를 형성한다.
일 구현예에서, 화합물은 화학식 (XXVI)의 화합물이고, 여기서 Xa는 -O-이고 P1과 P2는 KETTV(서열 번호: 3)이며, 따라서 화합물 3, 즉, OPEG4-(KETTV)2를 형성한다.
일 구현예에서, 화합물은 화학식 (XXVI)의 화합물이고, 여기서 Xa는 -O-이고 P1과 P2는 KETVV(서열 번호: 4)이며, 따라서 화합물 4, 즉, OPEG4-(KETVV)2를 형성한다.
일 구현예에서, 화합물은 화학식 (XXVI)의 화합물이고, 여기서 Xa는 -O-이고 P1과 P2는 KETRV(서열 번호: 5)이며, 따라서 화합물 5, 즉, OPEG4-(KETRV)2를 형성한다.
일 구현예에서, 화합물은 화학식 (XXVI)의 화합물이고, 여기서 Xa는 -O-이고 P1과 P2는 ISTDV(서열 번호: 6)이며, 따라서 화합물 6, 즉, OPEG4-(ISTDV)2를 형성한다.
일 구현예에서, 화합물은 화학식 (XXVI)의 화합물이고, 여기서 Xa는 -O-이고 P1과 P2는 VETVV(서열 번호: 7)이며, 따라서 화합물 7, 즉, OPEG4-(VETVV)2를 형성한다.
일 구현예에서, 화합물은 하기 화학식 (V)의 일반 구조를 갖고:
상기 화학식에서,
CPP는 본원에 정의된 바와 같고;
X1은 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X2는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X3은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
X4는 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X5는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X6은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되고
p는 0 내지 10의 정수이고;
q는 0 내지 10의 정수이다.
화학식 (V)의 화합물(여기서 p 및 q는 2이다)은 도 11에서 추가로 나타낸다. R1 내지 R5는 펩타이드 X1X2TX3V(서열 번호: 54) 및 X4X5TX6V(서열 번호: 56)의 아미노산 측쇄이고, R6은 본원에 정의된 바와 같은 CPP-태그를 나타낸다.
CPP로서 폴리-Arg
일 구현예에서, CPP는 폴리-L-아르기닌 펩타이드(폴리-Arg)이다. 따라서, 일 구현예에서, 화합물은 하기 화학식 (II)의 일반 구조를 갖는다:
상기 화학식에서,
폴리-Arg, 링커, P1 및 P2는 본원에 정의된 바와 같다.
일 구현예에서, CPP는 3 내지 20개의 L-아르기닌 잔기로 이루어진 폴리-L-아르기닌 펩타이드(폴리-Arg)이다. 일 구현예에서, CPP는 3 내지 15개의 L-아르기닌 잔기로 이루어진 폴리-L-아르기닌 펩타이드(폴리-Arg)이다. 일 구현예에서, CPP는 3 내지 12개의 L-아르기닌 잔기로 이루어진 폴리-L-아르기닌 펩타이드(폴리-Arg)이다. 일 구현예에서, CPP는 3 내지 10개의 L-아르기닌 잔기아르기닌 잔기로 이루어진 폴리-L-아르기닌 펩타이드(폴리-Arg)이다. 일 구현예에서, 폴리-Arg의 N-말단은 임의로 변형되어 있는데, 예를 들면, 임의로 아세틸화되어 있다.
폴리-Arg CPP-태그, 예를 들면, L-Arg9(서열 번호: 12)를 지닌 본 발명의 화합물은 낮은 CP50 값(실시예 4, 도 7 내지 9)을 갖는데, 즉 세포 흡수가 매우 효율적이며, 이는 우수한 BBB 침투 및 세포내 전달을 시사한다. 놀랍게도, CPP L-Arg9(서열 번호: 12)를 함유하는 화합물은 D-아미노산 또는 마크로사이클릭 CPP를 함유하는 화합물과 비교하여 시험관내 플라스민 반감기 시간을 나타내었다(도 5 및 6). 놀랍게도, L-Arg9 함유 화합물의 반감기는 l-TAT(서열 번호 8)보다 훨씬 더 우수하였다(도 5).
일 구현예에서, CPP는 폴리-Arg이고 링커는 NPEG 단위를 포함하는 PEG 링커이고, CPP는 링커의 질소 원자에 아미드 결합을 통해 연결된다. 따라서, 일 구현예에서, 화합물은 하기 화학식 (IV)의 일반 구조를 갖는다:
상기 화학식에서,
폴리-Arg, P1 및 P2는 본원에 정의된 바와 같고;
p은 0 내지 10의 정수이고;
q는 0 내지 10의 정수이다.
일 구현예에서, p는 2이고 q는 2이다. 따라서, 일 구현예에서, 화합물은 하기 화학식 (VII)의 일반 구조를 갖는다:
상기 화학식에서,
폴리-Arg, P1 및 P2는 본원에 정의된 바와 같다.
일 구현예에서, 화합물은 하기 화학식 (VI)의 일반 구조를 갖는다:
상기 화학식에서,
X1은 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X2는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X3은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
X4는 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X5는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X6은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
p는 0 내지 10의 정수이고;
q는 0 내지 10의 정수이다.
일 구현예에서, p는 2이고 q는 2이다. 따라서, 일 구현예에서, 화합물은 하기 화학식 (VIII)의 일반 구조를 갖는다:
상기 화학식에서,
폴리-Arg, X1, X2 , X3, X4, X5, 및 X6은 본원에 정의된 바와 같다.
일 구현예에서, CPP는 L-Arg9이고, p는 2이고 q는 2이다. 따라서, 일 구현예에서, 화합물은 화학식 (IX)의 일반 구조를 갖는다:
상기 화학식에서,
X1, X2 , X3, X4, X5, 및 X6은 본원에 정의된 바와 같다.
일 구현예에서, 화합물은 화학식 (X) 내지 (XVI)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
.
일 구현예에서, 펩타이드 P1, P2 및/또는 CPP 중 어느 것도 추가로 변형될 수 있다. 예를 들면, 일 구현예에서, CPP의 N-말단은 임의로 아세틸화된다. 따라서, 일 구현예에서, 화합물은 화학식 (XVII) 내지 (XXIII)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
.
구체적인 화합물
일 구현예에서, 화합물은 CPP- NPEG4-(P1)(P2)의 일반 구조를 가지는데, 즉, 화합물은 화학식 (XXVIII)의 화합물이고:
CPP, P1 및 P2는 표 2에 정의된 바와 같다. 일 구현예에서, 화합물은 화합물 9 내지 63으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
[표 2]
일 구현예에서, 화합물은 화학식 (XXVII)의 화합물이고:
P1 및 P2는 표 3에 정의된 바와 같다. 일 구현예에서, 화합물은 화합물 2 내지 7로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
[표 3]
일 구현예에서, 화합물은 화학식 (XXIX) 내지 (XXXIV)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
일 구현예에서, P1 및 P2는 아미노산 서열 IETDV(서열 번호: 1)로 이루어지고, CPP는 D-Pen(rqikiwfqnrrmkwkk, 서열 번호: 15); L-pVEC (LLIILRRRIRKQAHAHSK, 서열 번호: 18); L-TP2 (PLIYLRLLRGQF, 서열 번호: 19); MiniAp4 (|(Dap)KAPETALD|, 서열 번호: 21); 및 CPP12 (|Ff(Nal2)RrRrQ|GABA-K, 서열 번호: 22)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
염 및 전구약물
본원에 정의된 바와 같은 화합물은 상기 화합물의 약제학적으로 허용되는 염 또는 전구약물의 형태일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 본원에 정의된 바와 같은 화합물은 상기 화합물의 약제학적으로 허용되는 부가 염 또는 수화물로서, 예를 들면, 그러나 이에 제한되지 않는, K+, Na+ 뿐만 아니라, 비-염(non-salt), 예컨대, H+으로 제형화될 수 있다.
약제학적 조성물
일 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물의 약제학적 조성물로의 제형은 당해 분야에 잘 공지되어 있고 문헌: Gennaro (ed.), 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000); 및 Ansel et al., 1999, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers에 추가로 기술되어 있다.
막 투과능
PSD-95는 세포내적으로 국재화되므로, PSD-95를 표적화(targeting)하는 어떠한 약물도 세포 막을 효율적으로 횡당하도록 하는 것이 필수적이다. 본원에 정의된 바와 같은 화합물의 세포 투과능 및 세포질로의 전달을 평가하기 위하여, 세포 클로로알칸 침투 검정(cellular chloroalkane penetration assay; CAPA)을 사용할 수 있다(Peraro et al. 2018). 이러한 검정은 클로로알칸(CA) 분자에 공유결합적으로 결합하도록 설계된 변형된 할로알칸 데할로게나제의 장점을 취한다. HaloTag, 녹색 형광성 단백질(GFP) 및 미토콘드리아-표적화 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 HeLa 세포주를 사용하여 세포질 전달을 보고한다. CAPA의 일반적인 포맷은 펄스-체이스 검정(pulse-chase assay)이다(Deprey & Kritzer, 2020). HaloTag 효소를 발현하는 세포는 CA-태그된(tagged) 펩타이드와 함께 항온처리된다. 이러한 CA-펩타이드는 세포 막을 침투하여 세포질에 도달하게 되는 경우, 이는 HaloTag에 결합하여 이와 반응시킨다(펄스 단계(pulse step)). 세척 단계 후, 세포를 세포 막을 정량적으로 침투하여 남아있는 반응하지 않은 HaloTag 부위와 반응하는 CA-태그된 염료와 함께 항온처리한다(체이스 단계(chase step)). 유동 세포분석법을 사용하여 세포의 형광성 강도를 측정하고 측정된 형광성은 침투된 세포에 도달하는 CA-펩타이드의 양에 반비례하므로 세포질 전달을 평가하는데 사용할 수 있다. 수득된 데이타는 일반적으로 50% 세포 침투가 관찰된 농도인, CP50 값으로 나타낸다. 화합물의 CP50 값은 실시예 4에 기술된 바와 같이 측정할 수 있다. 실시예 4는 기술된 화합물의 세포 흡수가 사용된 86.1 μM(화합물 22) 내지 0.68 μM(화합물 30)의 범위의 CP50 값을 측정하는 CPP에 크게 의존함을 나타낸다(도 7). 추가로, CPP-태그(서열 번호 8 내지 22)의 범위에 접합된 NPEG4(IETDV)2에 대한 세포 흡수 효능는 예측되지 않은 범위의 CP50 값을 생성한다(도 8).
일 구현예에서, 화합물은 250 μM 이하, 예를 들면, 200 μM 이하, 예를 들면, 150 μM 이하, 예를 들면, 100 μM 이하, 예를 들면, 80 μM 이하, 예를 들면, 70 μM 이하, 예를 들면, 60 μM 이하, 예를 들면, 50 μM 이하, 예를 들면, 40 μM 이하, 예를 들면, 30 μM 이하, 예를 들면, 20 μM 이하, 예를 들면, 15 μM 이하, 예를 들면, 10 μM 이하, 예를 들면, 5 μM 이하의 CP50 값을 갖는다. 바람직하게는, 화합물은 60 μM 이하의 CP50 값을 갖는다.
플라스민 안정성
허혈성 뇌졸중(또한 '뇌 허혈증(brain ischemia)' 또는 '대뇌 허혈증(cerebral ishchemia)'으로 지칭됨)은 일반적으로 뇌에 혈액을 공급하는 동맥내 차단에 의해 유발된다. 차단은 혈류 및 뇌로 가는 산소를 감소시켜, 뇌 세포의 손상 또는 사멸을 초래한다. 혈관의 차단은 광범위한 기계 장치를 사용하거나, 정맥내 또는 동맥내로 전달되는 "혈전 파괴제(clot busting agent)"를 사용하여 제거할 수 있다. 이러한 혈정 파괴제 중에는 조직 플라스미노겐 인자(Tissue plasminogen factor; tPA)가 있으며, 이는 플라스미노겐으로부터 플라민을 생성한다. 재조합 tPA의 예는 알테플라제, 레테플라제 및 테넥테플라제이고, 혈전을 파괴하는 다른 혈전용해 약물은 스트렙토키나제, 우로키나제 및 데스모타플라제를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 tPA 또는 재조합 tPA를 제공받는 대상체(subject)에게 투여되며, 이는 AIS에 대한 보호 표준(standard-of-care)이다. 따라서, 화합물은 세린 프로테아제인, 플라스민의 생성을 포함하는, tPA의 투여와 상용성(compatible)이다.
본 발명의 화합물의 시험관 내 플라스민 안정성은 실시예 3에서 측정되었다. 일 구현예에서, 화합물은 실시예 3에 기술된 플라스민 안정성 검정에서 플라스민의 존재하에 적어도 10분, 예를 들면, 적어도 30분, 예를 들면, 적어도 1시간, 예를 들면, 적어도 2시간, 예를 들면, 적어도 3시간, 예를 들면, 적어도 4시간, 예를 들면, 적어도 5시간, 예를 들면, 적어도 6시간, 예를 들면, 적어도 7시간, 예를 들면, 적어도 8시간, 예를 들면, 적어도 9시간, 예를 들면, 적어도 10시간, 예를 들면, 적어도 15시간, 예를 들면, 적어도 20시간, 예를 들면, 적어도 30시간의 반감기를 갖는다.
PSD-95의 PDZ1-2에 대한 친화성
바람직하게는, 본 발명의 화합물은 PSD-95의 PDZ1-2에 대해 나노몰 범위의 친화성을 가짐으로써, 이들이 매우 강력한 억제제가 되도록 한다. PSD-95의 PDZ1-2에 대한 친화성은 치료 효과를 달성하는데 필요한 약물의 역치 농도(threshold concentration)를 감소시키는 중요한 인자이고, 이는 BBB가 표적에서 약물 농도의 축적을 제한하는 경향이 있을 것이므로, 약물이 혈액 뇌 장벽(BBB)을 횡단하여 이의 표적에 도달하는 경우 특히 중요하다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 PDZ1 및 PDZ2에 동시에 결합하는 이량체 PSD-95 억제제이고, 이는 이러한 도메인에 대해 이의 높은 친화성을 나타낼 수 있다.
실시예 2에 기술된 바와 같이, 본 발명의 화합물에 대한 PSD-95의 PDZ1-2에 대해 수득된 친화성은 낮은 나노몰 범위이고 l-TAT-NPEG4(IETDV)2와 유사하다.
일 구현예에서, 화합물의 PSD-95의 PDZ1-2에 대한 K i 값은 100 nM 이하, 예를 들면, 80 nM 이하, 예를 들면, 70 nM 이하, 예를 들면, 60 nM 이하, 예를 들면, 50 nM 이하, 예를 들면, 40 nM 이하, 예를 들면, 30 nM 이하, 예를 들면, 20 nM 이하, 예를 들면, 10 nM이다.
의학적 용도
일 양태에서 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 화합물은 의약으로서 사용하기 위한 것이다.
PSD-95의 PDZ1 및 PDZ2 도메인은 수개의 단백질과 상호작용하는데, 예를 들면, NMDA-유형의 이온성(ionotropic) 글루타메이트 수용체 및 산화질소(NO)를 생산하는 효소 nNOS에 동시 결합한다. NMDA 수용체는 흥분성독성(excitotoxicity), 즉 글루타메이트-매개된 신경독성의 주요 매개인자이고, 이는 신경변성 질환(neurodegenerative disease) 및 급성 뇌 손상(acute brain injury)과 연루되어 있다. PSD-95는 NMDA 수용체, 주로 GluN2A 및 GluN2B 소단위, 및 nNOS에 PDZ1 및 PDZ2 각각을 통해 동시에 결합한다. NMDA 수용체의 활성화는 칼슘 이온의 유입을 유발하며, 이는 nNOS를 활성화시킴으로써 NO 생성을 초래한다. 따라서, PSD-95는 NMDA 수용체 활성화와 NO 생산 사이에 특이적인 연합을 매개하며, 이는 보다 긴 기간 동안 지속되는 경우 세포에 대해 유해할 수 있고, 글루타메이트-매개된 신경독성의 주요 촉진인자이다. PSD-95를 표적화함에 의한 nNOS/PSD-95/NMDA 수용체 상호인자의 3원 복합체의 억제는 칼슘 이온 도입과 NO 생산 사이의 기능성 연결에 손상을 입힙으로써, 마우스에서 허혈성 뇌 손상을 방지하지만, NMDA 수용체의 생리학적 기능, 예를 들면, 이온-플럭스(ion-flux) 및 전-생존 신호전달 경로(pro-survival signaling pathway)는 완전하게 남는다. 흥분성독성의 특이적인 억제는 세포내 nNOS/PSD-95/NMDA 수용체 복합체를 PSD-95 억제제를 사용하여 교란함으로써 수득할 수 있다.
본 발명의 화합물은 PSD-95 억제제이므로 흥분성독성을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 다양한 질환, 특히 신경 질환, 및 특히 부분적으로 흥분성독성에 의해 매개된 질환을 치료하는데 유용하다. 이러한 질환 및 상태는 뇌졸중(stroke), 뇌전증(epilepsy), 저산소증(hypoxia), 뇌졸중과 관련되지 않은 CNS에 대한 외상성 손상(traumatic injury to the CNS not associated with stroke), 예를 들면, 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury) 및 척수 손상(spinal cord injury), 다른 뇌 허혈증(other cerebral ischemia), 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease) 및 파킨슨 질환(Parkinson's disease)을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 흥분독성-관련된 질환의 발달을 방지, 치료, 감소 및/또는 지연시키는데 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 화합물에 관한 것이다. 일 구현예에서, 흥분독성-관련된 질환은 뇌졸중이다. 일 구현예에서, 흥분독성-관련된 질환은 허혈성 뇌졸중이다. 일 구현예에서, 흥분독성-관련된 질환은 뇌 허혈증이다. 일 구현예에서, 흥분독성-관련된 질환은 급성 허혈성 뇌졸중이다. 일 구현예에서, 흥분독성-관련된 질환은 지주막하 출혈이다.
일 양태에서, 본 발명은 흥분독성-관련된 질환의 발달을 방지, 치료, 감소 및/또는 지연시키기 위한 의약의 제조를 위한 본원에 정의된 바와 같은 화합물의 용도에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 흥분독성-관련된 발달을 방지, 치료, 감소 및/또는 지연시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 치료학적 유효량의 본원에 정의된 바와 같은 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 흥분성독성의 손상 효과에 대해 감소 및/또는 보호하는데 사용하기 위한 화합물에 관한 것이다. 일 구현예에서, 화합물은 뇌졸중의 손상 효과를 감소시키는데 사용하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 화합물은 급성 허혈성 뇌졸중의 손상 효과를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 화합물은 지주막하 출혈의 손상 효과를 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 뇌 또는 척추에 대한 흥분성독성의 손상 효과에 대해 보호하고/하거나 감소시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 유효량의 본원에 정의된 바와 같은 화합물을 투여함으로써 손상 효과에 대해 보호하고/하거나 감소시키는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 상태를 가지거나 가질 위험이 있는 사람 대상체에게 본원에 정의된 바와 같은 화합물을 투여하는 단계를 포함하여 세포성독성에 의해 매개된 상태의 발달을 치료, 감소, 또는 지연시키는 방법에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 상태를 가지거나, 상태와 관련된 위험 인자를 가진 대상체에게 본원에 정의된 바와 같은 화합물을 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 세포성독성에 의해 매개된 상태의 적어도 하나의 신호 또는 증상을 치료 또는 억제 또는 지연시키는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 상기 상태는 뇌졸중 또는 CNS에 대한 외상성 손상이다. 일 구현예에서, 흥분독성-관련된 질환은 CNS에 대한/내에서/이의 허혈성 또는 외상성 손상이다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 뇌졸중의 손상 효과를 감소시키기 위한 유효량의 화합물을 투여하는 단계를 포함하여, 뇌졸중을 가진 대상체에서 뇌졸중의 손상 효과를 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "뇌졸중"은 뇌에 공급하는 하나 이상의 혈관의 폐색 또는 출혈에 의해 유발되어 세포 사멸을 초래하는 상태를 지칭하는 일반적인 용어이다. 본원에 사용된 바와 같은 "허혈성 뇌졸중"은 뇌에 공급하는 하나 이상의 혈관의 폐색에 의해 유발된 뇌졸중을 지칭한다. 허혈성 뇌졸중의 유형은 예컨대, 색전성 뇌졸중(embolic stroke), 심장색전성 뇌졸중(cardioembolic stroke), 뇌 혈전(thrombotic stroke), 대 혈관 혈전증(large vessel thrombosis), 열공성 뇌경색(lacunar infarction), 동맥-동맥 뇌졸중(artery-artery stroke) 및 원인불명 뇌졸중(cryptogenic stroke)을 포함한다. "뇌 허혈증(Cerebral ischemia)"은 동맥내 차단이 산소가 풍부한 혈액의 뇌로의 전달을 제한하여, 뇌 조직에 대한 손상을 야기하는 상태이다. 대뇌 허혈증은 때때로 뇌 허혈증 또는 뇌혈관 허혈증로 불린다.
본원에 사용된 바와 같은 "출혈성 뇌졸중(hemorrhagic stroke)"은 외에 공급하는 하나 이상의 혈관에 의해 유발된 뇌졸중을 지칭한다. 출혈성 뇌졸중의 유형은 예컨대, 경막하 뇌졸중(subdural stroke), 뇌실질내 뇌졸중(intraparenchymal stroke), 경막외 뇌졸중(epidural stroke) 및 지주막하 뇌졸중(subarachnoid stroke)을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물에 의해 치료가능한 질환은 CNS의 허혈성 또는 외상성 손상이다. 일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 뇌 또는 척추에 대한 외상성 손상 또는 허혈증의 손상 효과를 감소시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 상기 대상체를 상기 감소를 시행하기 위해 본원에 정의된 바와 같은 화합물로 치료하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 혈관내 수술(endovascular surgery)을 하는 대상체에게 본원에 정의된 바와 같은 화합물을 대뇌 허혈증을 억제하기에 효과적인 요법으로 투여하는 단계를 포함하여, 혈관내 수술로 인한 대뇌 허혈증을 억제하는 방법에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 유효 요법의 본원에 정의된 바와 같은 화합물을 혈관내 수술을 하는 대상체에게 투여하여 동맥류(aneurysm)를 치료하거나 진단상의 혈관조영(diagnostic angiography)을 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, 혈관내 수술로부터의 허혈성 손상을 억제함으로써 동맥류(aneurysm), 진단상의 혈관조영(diagnostic angiography) 또는 경동맥 스텐팅(carotid stenting)을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 신경수술(neurosurgery)로부터의 허혈성 손상을 억제하는데 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 화합물에 관한 것이다. 일 구현예에서, 상기 신경수술은 동맥류를 치료하기 위한 뇌 또는 혈관내 수술의 진단상의 혈관조영이다.
일부 구현예에서, 화합물은 재관류 치료요법과 함께 투여된다. 일 구현예에서, 화합물 및 재관류는 동시에, 순차적으로 또는 별개로 대상체에게 투여된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 '재관류 치료요법'은 차단된 동맥을 통해서 또는 주변에서 혈류를 회복시키기 위한 의학적 치료를 지칭한다. 재관류 치료요법은 의학적 제제 및 기계적 재관류를 포함한다. 상기 의학적 제제는 혈전용해로 불리는 공정에 사용된 혈전용해제(thrombolytic) 또는 피브린용해제(fibrinolytic)이다. 일부 구현예에서, 재관류 치료요법은 혈정용해제, 예를 들면, 플라스미노겐 활성인자, 예를 들면, tPA를 투여함으로써 수행된다.
일 구현예에서, 화합물은 화합물 8(AB144)이고, 상기 화합물은 플라스미노겐 활성인자, 예를 들면 tPA와 함께 투여된다.
일부 구현예에서, 재관류 치료요법은 기계적 재관류, 예를 들면, 수술이다. 수행된 수술은 최소한의 침입성 혈관내 과정일 수 있다. 기계적 재관류 장치 중에는, 동맥내 카테터(intra-arterial catheter), 벌룬(balloon), 스텐트(stent), 및 다양한 혈전 회수 장치(clot retrieval device)가 있다.
일 구현예에서, 화합물은 혈정용해제와 함께 투여되고, 화합물 및 혈전용해제는 동시에, 순차적으로 또는 별개로 대상체에게 투여된다.
일 양태에서, 본 발명은
a) 본원에 정의된 바와 같은 화합물을 허혈증을 가지거나 가질 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계, 및
b) 대상체에서 재관류 치료요법을 수행하는 단계를 포함하여, 중추 신경계에서 허혈증의 손상 효과를 치료하는 방법에 관한 것이고,
여기서 화합물 및 재관류 치료요법은 대상체의 중추 신경계에서 허혈증의 손상 효과를 치료한다.
일 양태에서, 본 발명은 허혈증을 가지거나 가질 위험이 있는 대상체에서 중추 신경계의 허혈증의 손상 효과를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 화합물에 관한 것이고, 여기서 재관류 치료요법은 대상체에서 수행되고, 화합물 및 재관류 치료요법은 대상체의 중추 신경계에서 허혈증의 손상 효과를 치료한다.
일 구현예에서, 방법은 혈전용해제를 대상체에게 동시에, 순차적으로 또는 별개로 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 적어도 2개의 별개의 단위 투여량 형태 (A) 및 (B)를 포함하는 부분의 키트(kit of parts)에 관한 것이고, 여기서
(A)는 본원에 정의된 바와 같은 화합물을 포함하고;
(B)는 혈전용해제를 포함한다.
일 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 부분의 키트는 중추 신경게에서 허혈증의 손상 효과를 치료에 사용하기 위한 것이고, 여기서 (A) 및 (B)는 대상체에게 동시에, 순차적으로 또는 별개로 투여된다.
일 양태에서, 본 발명은 지주막하 출혈의 손상 효과를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 화합물에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "지주막하 출혈"은 지주막하 강(subarachnoid cavity)에서 출혈 상태를 지칭한다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 화합물을 지주막하 출혈을 가진 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 지주막하 출혈을 치료하는 방법에 관한 것이고, 여기서 대상체에서 신경인지직 결핍증(neurocognitive deficit)이 억제된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 화합물을 지주막하 출혈을 가진 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 지주막하 출혈의 신경학적 또는 신경인지적 결핍증의 발달을 억제하는 방법에 관한 것이고, 여기서 대상체에서 신경학적 또는 신경인지적 결핍증의 발달이 억제된다.
흥분성독성과 관련된 것으로 알려지지 않은 본 발명의 화합물에 의해 치료가능한 다른 신경학적 질환은 불안증 및 통증을 포함한다. PSD-95를 표적화하는 이량체성 리간드는 만성 통증(chronic pain) 및 허혈성 뇌졸증(ischemic stroke)에 대한 치료로서 전-임상/임상 평가 중에 있다(Andreasen et al., Neuropharmacol, 2013, 67, 193-200; Bach et al, PNAS USA, 2012, 109, 3317-3322). 일 구현예에서, 본원에 정의된 바와 같은 화합물은 통증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 본원에 지칭된 바와 같은 대상체는 포유동물, 예를 들면, 사람이다.
합성
본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 화합물은:
a) 본원에 정의된 바와 같은 펩타이드 P1/P2를 합성하는 단계;
b)의 펩타이드를 OPEGn 또는 NPEGn 링커로 이량체화(dimerizing)하는 단계(여기서 'n'는 PEG 모이어티의 수이다);
c) NPEG 링커의 N에서 CPP 태그를 예를 들면, 자동화된 펩타이드 합성기(automated peptide synthesizer)를 사용하여 부착시키는 일반적인 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 화합물은:
a) Ns-NPEG 이산 링커(diacid linker)를 제공하는 단계;
b) 펩타이드 P1/P2를 Fmoc-기반 고체상 펩타이드 합성을 사용하여 제조하는 단계;
c) Fmoc-탈보호된 펩타이드 P1/P2를 Ns-NPEG 이산 링커로 이량체화하여 링커-이량체 접합체(linker-dimer conjugate)를 형성시키는 단계; 및
d) CPP를 링커-이량체 접합체의 NPEG 링커의 N에, 예를 들면, 자동화된 펩타이드 합성기를 사용하여 부착시키는 일반적인 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 하기 기술된 바와 같이 합성된다.
Ns-NPEG 이산 링커(diacid linker)
'Ns-NPEG 이산 링커'는 NPEG 링커가 링커 질소 상에서 오르토-니트로벤젠설포닐(ortho-nitrobenzenesulfonyl; Ns) 보호 그룹으로 보호된 구조이고, 여기서 NPEG 링커의 말단은 카복실산을 포함한다. 이러한 화학적 시약 또는 빌딜 블록(building block)은 2개의 펩타이드 모이어티, P1 및 P2를 이량체화하는데 사용된다.
오르토-니트로벤젠설포닐(Ns)-보호된 NPEG 링커는 고체 상 또는 용액 속에서 생산된다.
고체 상 과정은 전형적으로 고체 상 펩타이드 합성에 유용한 고체 지지체, 예를 들면, 2-클로로트리틸 클로라이드를 Fmoc-NH-PEG-CH2CH2COOH로,특이적인 수지(예컨대, DCM, DMF, ACN, THF) 및 염기(예컨대, DIPEA, DBU, 콜리딘, NMM)에 대한 적절한 유기 용매를 사용하여 로딩함으로써 출발한다.
Fmoc 그룹은 염기(예컨대, 피페리딘, 디메틸아민, 모르폴린, 피페라진, 디사이클로헥실아민, DMAP)에 의해 적절한 용매(예컨대, DMF, DCM, ACN, THF) 속에서 제거할 수 있다.
오르토-니트로벤젠설포닐 클로라이드는 유리 아민에 염기(예컨대, DIPEA, DBU, 콜리딘, NMM) 및 적절한 용매(예컨대, THF, DCM)를 사용하여 커플링시켜 Ns-NH-PEG-CH2CH2COO-수지를 수득할 수 있다.
링커 생성물의 제2의 부분은 수지-결합된 링커에 미츠노부-화학(Mitsunobu-chemistry)을 사용하여 연결시킬 수 있다. 수지는 트리페닐포스핀,HO-PEG-CH2CH2COOtBu, 용매, 및 아조카복실산의 에스테르- 또는 아미드 시약(예컨대, 디이소프로필 아조디카복실레이트, DIAD; 디에틸 아조디카복실레이트, DEAD; 1,1'-(아조디카보닐)-디피페리딘, ADDP)로 처리한다.
최종의 Ns-NPEG 이산 링커는 수지를 산, 예를 들면, 트리플루오로아세트산(TFA)으로 처리하여 수득한다.
용액-상 과정은 NH2-PEG-CH2CH2COOtBu의 아민 그룹을 Ns로 보호한 다음, 미츠노부 화학에 의해 용액 속에서 트리페닐포스핀 및 DIAD, DEAD, 또는 ADDP, 또는 유사한 시약, HO-PEG-CH2CH2COOtBu, 및 적절한 용매(THF, DCM)를 사용하여 수행할 수 있다. 최종의 Ns-보호된 NPEG-링커는 이후에 산, 예를 들면, TFA로 처리하여 수득한다.
펩타이드 합성: 펩타이드 서열은 Fmoc-기반 고체-싱 펩타이드 합성에 의해 고체 지지체, 예를 들면, 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 또는 왕 수지(Wang resin), Fmoc-보호된 아미노산, 염기, 커플링 시약(예컨대, HBTU [N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트], O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트[HATU], PyBOB, DIC/HOBt) 및 용매를 사용하여 합성한다. 대안적으로, 커플링 시약에 대해, Fmoc-보호된 아미노산의 커플링 시약(예컨대, 펜타플루오로페닐, 석신이미드)을 사용할 수 있다.
이량체화: Fmoc-보호된 수지-결합된 펩타이드는 Ns-NPEG 이산 링커를 사용하여 수지-상 이량체화 공정(on-resin dimerization process)에 의해 수지를 반화학량론적 양(예컨대, 1/6)의 Ns-NPEG 이산 링커, 염기, 커플링 시약, 및 적절한 용매(예컨대, DMF, DCM, THF)로 반복적으로 처리함으로써 이량체화시킨다. 커플링 시약에 대해 대안적으로 Ns-NPEG 링커의 활성화된 에스테르를 사용할 수 있다.
이량체화 공정은 또한 용액 속에서 Ns-NPEG 링커의 활성화된 에스테르(예컨대, 펜타플루오로페닐, 석신이미드)를 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) 또는 하이드록시벤조트리아졸(HOBt)과 적절한 측쇄-보호된 펩타이드(예컨대, 3급-부틸)과 함께 용매(예컨대, ACN, DMF, DCM, THF) 속에서 사용하여 형성시킬 수 있다. 또한, 용액 속에서 이량체화는 Ns-NPEG 이산 링커, 커플링 시약(예컨대, HBTU, HATU 등), 염기 및 용매를 사용하여 수행할 수 있다.
Ns-그룹은 머캅토에탄올 및 1,8-디아자비사이클로[5.4.0]운데크-7-엔(DBU)에 의해 또는 나트륨 티오페놀레이트에 의해 제거한다.
링커-이량체 접합체의 N PEG 링커의 NH 모이어티에 대한 CPP의 부착: 우선, 아미노산을 NPEG 링커의 NH 모이어티에 커플링시키고, 후속적으로 CPP를 다음의 표준(수동/자동) Fmoc SPPS에 따라 수지 상에서 합성한다.
에스테르 보호 그룹은 절단된 생성물을 수성 염기(예컨대, NaOH, LiOH) 및 아세토니트릴 속에서 교반한 다음 TFA 또는 HCl로 산성화시켜 제거할 수 있다.
본 발명의 최종 화합물은 동결건조 및 HPLC에 의한 정제 또는 유사한 크로마토그래피 방법에 의해 수득한다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 화합물의 합성은 실시예 1에 요약된 바와 같이 수행한다.
항목
1. 아미노산 서열 X2TX3V(서열 번호: 53)를 포함하거나 또는 이로 이루어진 제1의 펩타이드 (P1)을 포함하는 화합물로서, 여기서
X2가 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X3이 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되며,
여기서 P1은 세포 침투 펩타이드(CPP)에 연결되는, 화합물.
2. 링커에 의해 제2의 펩타이드(P2)에 연결된 제1의 펩타이드(P1)를 포함하는 화합물로서, 여기서 P1 및 P2는 KETLV(서열 번호: 2), KETTV(서열 번호: 3), KETVV(서열 번호: 4), KETRV(서열 번호: 5), ISTDV(서열 번호: 6) 및 VETVV(서열 번호: 7)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 화합물.
3. 항목 2에 따른 화합물로서, 여기서 P1 및 P2가 세포 침투 펩타이드(CPP) 또는 알부민 결합 모이어티에 링커를 통해 연결됨으로써, 막 또는 혈관 뇌 장벽을 횡단하는 펩타이드의 통과를 증가시키는, 화합물.
4. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 화합물이 250 μM 이하, 예를 들면, 200 μM 이하, 예를 들면, 150 μM 이하, 예를 들면, 100 μM 이하, 예를 들면, 80 μM 이하, 예를 들면, 70 μM 이하, 예를 들면, 60 μM 이하, 예를 들면, 50 μM 이하, 예를 들면, 40 μM 이하, 예를 들면, 30 μM 이하, 예를 들면, 20 μM 이하, 예를 들면, 15 μM 이하, 예를 들면, 10 μM 이하, 예를 들면, 5 μM 이하의 CP50 값을 갖는, 화합물.
5. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 화합물이 플라스민 안정성 검정에서 적어도 10분, 예를 들면, 적어도 30분, 예를 들면, 적어도 1시간, 예를 들면, 적어도 2시간, 예를 들면, 적어도 3시간, 예를 들면, 적어도 4시간, 예를 들면, 적어도 5시간, 예를 들면, 적어도 6시간, 예를 들면, 적어도 7시간, 예를 들면, 적어도 8시간, 예를 들면, 적어도 9시간, 예를 들면, 적어도 10시간, 예를 들면, 적어도 15시간, 예를 들면, 적어도 20시간, 예를 들면, 적어도 30시간의 반감기를 갖는, 화합물.
6. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 화합물의 PSD-95의 PDZ1에 대한 K i 값이 100 nM 이하, 예를 들면, 80 nM 이하, 예를 들면, 70 nM 이하, 예를 들면, 60 nM 이하, 예를 들면, 50 nM 이하, 예를 들면, 40 nM 이하, 예를 들면, 30 nM 이하, 예를 들면, 20 nM 이하, 예를 들면, 10 nM인, 화합물.
7. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 CPP가 폴리-L-아르기닌 펩타이드(폴리-Arg)인, 화합물.
8. 항목 7에 따른 화합물로서, 폴리-Arg가 5 내지 10개의 L-아르기닌 잔기, 예를 들면, 7 내지 10개의 L-아르기닌 잔기, 예를 들면, 8 또는 9개의 L-아르기닌 잔기로 이루어지는, 화합물.
9. 항목 7에 따른 화합물로서, 여기서 폴리-Arg가 아미노산 서열 RRRRRRRRR(서열 번호: 12)을 포함하거나 또는 이로 이루어진, 화합물.
10. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 화합물로서, CPP가 L-TAT(YGRKKRRQRRR, 서열 번호: 8)인, 화합물.
11. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 화합물로서, CPP가 D-TAT(yGrkkrrqrrr, 서열 번호: 9)인, 화합물.
12. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 화합물로서, CPP가 mTAT(rRrGrKkRr, 서열 번호: 10)인, 화합물.
13. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 화합물로서, CPP가 riTAT(rrrqrrkkr, 서열 번호: 11)인, 화합물.
14. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 화합물로서, CPP가 D-Arg9(rrrrrrrrr, 서열 번호:13)인, 화합물.
15. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 화합물로서, CPP가 L-Pen(RQIKIWFQNRRMKWKK, 서열 번호: 14)인, 화합물.
16. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 화합물로서, CPP가 D-Pen(rqikiwfqnrrmkwkk, 서열 번호: 15)인, 화합물.
17. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 화합물로서, CPP가 L-DPV3(RKKRRRESRKKRRRES, 서열 번호: 17)인, 화합물.
18. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 화합물로서, CPP가 L-pVEC (LLIILRRRIRKQAHAHSK, 서열 번호: 18)인, 화합물.
19. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 화합물로서, CPP가 L-MAP (KLALKLALKALKAALKLA, 서열 번호: 16)인, 화합물.
20. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 화합물로서, CPP가 L-TP2 (PLIYLRLLRGQF, 서열 번호: 19)인, 화합물.
21. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 화합물로서, CPP가 D-TP2 (pliylrllrGqf, 서열 번호: 20)인, 화합물.
22. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 화합물로서, CPP가 MiniAp4 (|(Dap)KAPETALD|, 서열 번호: 21)인, 화합물.
23. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 화합물로서, CPP가 CPP12 (|Ff(Nal2)RrRrQ|GABA-K, 서열 번호: 22)인, 화합물.
24. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 아미노산 서열 X2TX3V(서열 번호: 53)이 P1의 C-말단인, 화합물.
25. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, P1이 4 내지 10개의 아미노산 잔기, 예를 들면, 5개의 아미노산 잔기, 예를 들면, 6개의 아미노산 잔기로 이루어진, 화합물.
26. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, P1이 서열 X1X2TX3V(서열 번호: 54)를포함하거나 또는 이로 이루어진 화합물이고, 여기서
a. X1이 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
b. X2가 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
c. X3이 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 화합물.
27. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, P1이 KETLV(서열 번호: 2), KETTV(서열 번호: 3), KETVV(서열 번호: 4), KETRV(서열 번호: 5), ISTDV(서열 번호: 6), VETVV(서열 번호: 7) 및 IETDV(서열 번호: 1)를 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 화합물.
28. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 화합물이 아미노산 서열 X5TX6V(서열 번호: 55)를 포함하거나 또는 이로 이루어진 제2의 펩타이드 (P2)를 포함하는, 화합물로, 여기서
a. X5는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
b. X6은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
29. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 아미노산 서열 X5TX6V(서열 번호: 55)이 P2의 C-말단인, 화합물.
30. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, P2가 4 내지 10개의 아미노산 잔기, 예를 들면, 5개의 아미노산 잔기, 예를 들면, 6개의 아미노산 잔기로 이루어지는, 화합물.
31. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, P2가 서열 X4X5TX6V(서열 번호: 56)을 포함하거나 또는 이로 이루어진 화합물이고, 여기서
a. X4는 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
b. X5는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
c. X6은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 화합물.
32. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, P2가 KETLV(서열 번호: 2), KETTV(서열 번호: 3), KETVV(서열 번호: 4), KETRV(서열 번호: 5), ISTDV(서열 번호: 6), VETVV(서열 번호: 7) 및 IETDV(서열 번호: 1)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 화합물.
33. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, P1 및 P2가 동일한, 화합물.
34. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, P1 및 P2가 링커에 이의 N-말단을 통해 접합되는, 화합물.
35. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, CPP, 예를 들면, 폴리-Arg가 P1에 링커를 통해 연결되는, 화합물.
36. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, CPP, 예를 들면, 폴리-Arg가 P1 및 P2에 링커를 통해 연결되는, 화합물.
37. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, CPP, 예를 들면, 폴리-Arg가 링커에 이의 C-말단을 통해 연결되고 P1 및 P2가 링커에 이의 N-말단을 통해 접합되고, 화합물이 하기 화학식 (I)의 일반 구조를 갖는, 화합물:
.
38. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 CPP가 폴리-Arg이고 화합물이 하기 화학식 (II)의 일반 구조를 갖는, 화합물:
.
39. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 링커가 하나 이상의 PEG 단위를 포함하는, 화합물.
40. 항목 39에 따른 화합물로서, 여기서 PEG 단위 중 하나의 적어도 하나의 산소 원자가 질소 원자로 치환되어 NPEG를 제공하는, 화합물.
41. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 링커가 NPEG 단위 및 CPP를 포함하고, 예를 들면, 폴리-Arg가 링커의 질소 원자에 아미드 결합에 의해 연결되는, 화합물.
42. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 화합물이 화학식 (III)의 일반 구조를 갖는, 화합물:
상기 화학식에서,
p는 0 내지 10의 정수이고;
q는 0 내지 10의 정수이다.
43. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 화합물이 화학식 (IV)의 일반 구조를 갖는, 화합물:
상기 화학식에서,
p는 0 내지 10의 정수이고;
q는 0 내지 10의 정수이다.
44. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 화합물이 화학식 (V)의 일반 구조를 갖는, 화합물:
상기 화학식에서,
X1은 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X2는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X3은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X4는 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X5는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X6은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
p는 0 내지 10의 정수이고;
q는 0 내지 10의 정수이다.
45. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 화합물이 화학식 (VI)의 일반 구조를 갖는, 화합물:
상기 화학식에서
X1은 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X2는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X3은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X4는 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X5는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X6은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
p는 0 내지 10의 정수이고;
q는 0 내지 10의 정수이다.
46. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 p가 q인, 화합물.
47. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 p > q인, 화합물.
48. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 p < q인, 화합물.
49. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 p와 q의 합이 1 내지 20의 정수인, 화합물.
50. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 에틸렌 글리콜 모이어티의 수, p가 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10개의 에틸렌 글리콜 모이어티로부터 선택되는, 화합물.
51. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 에틸렌 글리콜 모이어티의 수, p가 0 내지 4인, 화합물.
52. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 에틸렌 글리콜 모이어티의 수, q가 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10개의 에틸렌 글리콜 모이어티인, 화합물.
53. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 에틸렌 글리콜 모이어티의 수, q가 0 내지 4인, 화합물.
54. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 에틸렌 글리콜 모이어티의 총 수 p + q가 2 내지 12, 예를 들면, 2, 예를 들면, 4, 예를 들면, 6, 예를 들면, 8, 예를 들면, 10, 예를 들면, 12인, 화합물.
55. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 에틸렌 글리콜 모이어티의 총 수, p + q가 4인, 화합물.
56. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 p가 2이고 q가 2인, 화합물.
57. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 화합물이 화학식 (VII)의 일반 구조를 갖는, 화합물:
.
58. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 화합물이 화학식 (VIII)의 일반 구조를 갖는, 화합물:
.
59. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 화합물이 화학식 (IX)의 일반 구조를 갖는, 화합물:
.
60. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 화합물이 화학식 (X) 내지 (XVI)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 화합물:
.
61. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 CPP의 N-말단이 아세틸화되는, 화합물.
62. 항목 1 내지 60 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 CPP의 N-말단이 클로로알칸 태그(CA)이고, 이는 하기의 구조를 갖는, 화합물:
.
63. 항목 1 내지 60 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 CPP의 N-말단이 메틸화된, 화합물.
64. 항목 1 내지 60 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 CPP의 N-말단이 포르밀화(formylating)되는, 화합물.
65. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 상기 화합물의 약제학적으로 허용되는 염 또는 전구약물(prodrug)인, 화합물.
66. a. 아미노산 서열 X2TX3V(서열 번호: 53)를 포함하거나 또는 이로 이루어진 제1의 펩타이드(P1)로서, 여기서
X2가 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X3이 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 제1의 펩타이드;
b. 아미노산 서열 X5TX6V(서열 번호: 55)를 포함하거나 또는 이로 이루어진 제2의 펩타이드(P2)로서, 여기서
X5가 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X6이 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 제2의 펩타이드; 및
c. 세포 침투 펩타이드(CPP)를 포함하는 화합물로서,
여기서 CPP는 링커에 이의 C-말단을 통해 연결되고, P1 및 P2는 링커에 이의 N-말단을 통해 접합되며, 화합물은 화학식 (I)의 일반 구조를 갖는, 화합물:
상기 화학식에서,
화합물은 20 μM이하의 CP50 값을 갖는다.
67. 항목 66에 따른 화합물로서, 여기서 P1이 서열 X1X2TX3V(서열 번호: 54)를 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 여기서
X1은 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X2는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택;
X3은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
여기서 P2는 서열 X4X5TX6V(서열 번호: 56)를 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 여기서
X4는 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X5는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X6은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
68. 항목 66 또는 67에 따른 화합물로서, 여기서 P1 및/또는 P2가 4 내지 10개의 아미노산 잔기, 예를 들면, 5개의 아미노산 잔기로 이루어지는, 화합물.
69. 항목 66 내지 68 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 X3 및 X6이 L, T, V, 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 화합물.
70. 항목 66 내지 68 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 P1 및 P2가 KETLV(서열 번호: 2), KETTV(서열 번호: 3), KETVV(서열 번호: 4), KETRV(서열 번호: 5), ISTDV(서열 번호: 6), 및 VETVV(서열 번호: 7)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지는, 화합물.
71. 항목 66 내지 70 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 링커가 하나 이상의 PEG 단위를 포함하고, 여기서 PEG 단위 중 하나의 적어도 하나의 산소 원자가 질소 원자로 대체되어 NPEG를 제공하고, 여기서 CPP는 아미드 결합에 의해 링커의 질소 원자에 연결되고, 화합물은 화학식 (III)의 일반 구조를 갖는, 화합물:
상기 화학식에서,
p는 0 내지 10의 정수이고;
q는 0 내지 10의 정수이다.
72. 항목 66 내지 71 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 CPP가 폴리-L-아르기닌 펩타이드(폴리-Arg); D-TAT(yGrkkrrqrrr, 서열 번호: 9), L-Pen(RQIKIWFQNRRMKWKK, 서열 번호: 14); D-Pen(rqikiwfqnrrmkwkk, 서열 번호: 15); L-DPV3(RKKRRRESRKKRRRES, 서열 번호: 17); L-pVEC(LLIILRRRIRKQAHAHSK, 서열 번호: 18); L-MAP(KLALKLALKALKAALKLA, 서열 번호: 16); L-TP2(PLIYLRLLRGQF, 서열 번호: 19); MiniAp4(|(Dap)KAPETALD|, 서열 번호: 21); 및 CPP12 (|Ff(Nal2)RrRrQ|GABA-K, 서열 번호: 22)로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 화합물.
73. 항목 66 내지 72 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 CPP가 폴리-L-아르기닌 펩타이드(폴리-Arg), 예를 들면, 5 내지 10개의 L-아르기닌 잔기, 예를 들면, 8 또는 9개의 L-아르기닌 잔기로 이루어진 폴리-Arg이고, 예를 들면, 여기서 폴리-Arg는 아미노산 서열 RRRRRRRRR(서열 번호: 12)를 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 화합물.
74. 항목 66 내지 73 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 화합물이 화학식 (VI)의 일반 구조를 갖는, 화합물:
상기 화학식에서,
X1은 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X2는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X3은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X4는 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X5는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X6은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
p는 0 내지 10의 정수이고;
q는 0 내지 10의 정수이다.
75. 항목 66 내지 74 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 p가 2이고 q가 2인, 화합물.
76. 항목 66 내지 75 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 여기서 CPP의 N-말단이 아세틸화되거나 또는 여기서 CPP의 N-말단이 클로로알칸 태그(CA)에 접합되고, 이는 하기의 구조를 갖는, 화합물:
77. 선행 항목 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 화합물이 PSD-95 억제제인, 화합물.
78. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물을 포함하는 약제학적 조성물.
79. 의약(medicament)으로서 사용하기 위한 선행 항목 중 어느 하나에 따른 화합물.
80. 항목 1 내지 77 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 흥분독성-관련된 질환의 발달을 치료, 방지, 감소 및/또는 지연시키는데 사용하기 위한, 화합물.
81. 항목 80에 있어서, 흥분독성-관련된 질환이 뇌졸중인, 사용하기 위한, 화합물.
82. 항목 80에 있어서, 흥분독성-관련된 질환이 허혈성 뇌졸중인, 사용하기 위한, 화합물.
83. 항목 80에 있어서, 흥분독성-관련된 질환이 대뇌 허혈증인, 사용하기 위한, 화합물.
84. 항목 80에 있어서, 흥분독성-관련된 질환이 급성 허혈성 뇌졸중인, 사용하기 위한, 화합물.
85. 항목 80에 있어서, 흥분독성-관련된 질환이 지주막하 출혈인, 사용하기 위한, 화합물.
86. 항목 1 내지 77 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 통증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 화합물.
87. 적어도 2개의 별개의 단위 투여량 형태 (A)및 (B)를 포함하는 부분의 키트로서, 여기서
(A)는 항목 1 내지 77 중 어느 하나에 따른 화합물을 포함하고;
(B)는 혈전용해제를 포함하는, 부분의 키트.
88. 항목 87에 있어서, 흥분독성-관련된 질환 및/또는 통증의 발달을 치료, 방지, 감소 및/또는 지연시키는데 사용하기 위한 부분의 키트로서, 여기서 (A) 및 (B)가 동시에, 순차적으로 또는 별개로 대상체에게 투여되는, 부분의 키트.
실시예
실시예 1: 합성
수지 결합된 화합물 2 내지 7(OPEG4-KETLV , OPEG4-KETTV, OPEG4-KETVV, OPEG4-KETRV, OPEG4-ISTDV 및 OPEG4-VETVV)을 앞서 기술된 바와 같이 합성하였다: Bach et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2009, 48, 9685.
수지 결합된 NPEG4-IETDV, NPEG4-KETLV, NPEG4-KETTV, NPEG4-KETVV, NPEG4-KETRV, NPEG4-ISTDV 및 NPEG4-VETVV는 문헌, Bach et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2012, 109, 3317에 이미 기술된 바와 같이 합성되었다. 제1의 C-말단 아미노산(Fmoc-Ala-OH, Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-d-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(OAll)-OH, Fmoc-l-Lys(Boc)-OH, Fmoc-d-Lys(Boc)-OH, Fmoc-l-Lys(Ns)-OH, Fmoc-l-Phe-OH, Fmoc-d-Phe-OH, , Fmoc-l-Ser(tBu)-OH) of the linear CPPs (l-TAT, dTAT, mTAT, riTAT, polyR, d-폴리R, L-Pen, D-Pen, L-pVEC, L-MAP, L-DPV3, L-TP2, d-TP2, MiniAp4, CPP12)을 NPEG4 링커의 질소에 O-(1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HCTU)를 커플링제로 사용하여 3회 수동으로 커플링시켰다. 후속적인 CPP의 합성을 자동화된 펩타이드 합성기(Prelude X, Gyros Protein Technologies, 미국)를 사용하여 달성하였다. Prelude X를 사용하는 합성을 위해 모든 시약은 DMF 중 용액으로서 제조하였다: Fmoc-보호된 아미노산(0.2 M), HCTU(0.4 M), 및 DIPEA(1.0 M). 서열 연장을 다음의 프로토콜을 사용하여 달성하였다: 탈보호(2 × 2 min, 실온, 350 rpm 진탕) 및 커플링(3 × 10 min, 50℃, 350 rpm 진탕). 아미노산을 수지 로딩(resin loading)에 걸쳐 5배로 Fmoc-아미노산/HCTU/DIPEA(1:1:2.5) 혼합물을 사용하여 3중 커플링시켰다. 사이클릭 CPP(MiniAp4 및 CPP12) 함유 펩타이드를 디클로로메탄(DCM) 중 20 eq. PhSiH3 및 0.2 eq. Pd(PPh3)4로 질소 하에 2 × 15분 동안 처리하여 알릴 및 알록 보호 그룹을 제거하였다. 수지를 DCM에 이어 디메틸포름아미드(DMF)로 세척하였다. Asp/Dap의 측쇄 및/또는 Glu의 C-말단과 Phe의 N-말단 사이의 폐환 반응은 펩타이드를 DMF 중 2 eq.의 (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP) 및 2 eq.의 DIPEA로 16시간 동안 실온에서 처리한 다음 DMF 세척으로 수행하였다. CPP 태그된 이량체성 펩타이드의 성공적인 합성 후, 수지를 2개로 분할하였다. 수지-결합된 펩타이드의 1개 부분의 N-말단을 DMF:아세트산 무수물:DIPEA(8:1.5:0.5)의 혼합물을 사용하여 10분 동안 2회 캡핑하였다. 수지-결합된 펩타이드의 다른 부분의 N-말단은 클로로알칸 태그(CA)로 기능화하였다. CA 태그를 CPP 태그된 펩타이드의 N-말단의 질소 그룹에 DMF(3:3:10) 중 CA:PyBOP:DIPEA의 혼합물을 사용하여 16시간 동안 커플링시켰다. CPP12 함유 펩타이드의 경우에, CA 태그 커플링 전에, 오르토-니트로벤젠설포닐(Ns) 그룹을 DMF(2 mL) 중 1,8-디아자비사이클로[5.4.0]운데크-7-엔(DBU, 0.5 mmol) 및 DMF(2 mL) 중 머캅토에탄올(0.5 mmol)을 가하고 30분 동안 진탕시켜 제거하였다. DMF 중 유동 세척 후, 머캅토에탄올/DBU 처리를 4회 반복하였다. DMF 속에서 최종 유동-세척 후, CA 태그를 Lys 잔기의 측쇄 질소에 커플링시켰다.
펩타이드 화합물 2 내지 75를 건조된 수지로부터 TFA/트리이소프로필실란/2,2'-(에틸렌디옥시)디에탄티올(DODT)/H2O(90/2.5/2.5)로 2시간 동안 절단한 다음 여과, 증발, 빙-냉 에테로로 침전, 동결건조, 및 제조 RP-HPLC로 정제하였다. 최종의 펩타이드 리간드는 분자량 측정의 경우 LC-MS 및 순도(>95%)의 경우 UPLC(214 nm)에 의해 특성화하였다.
상술한 바와 같은 합성을 또한 40 mmol에서 또는 100 mmol 이하의 규모로 수행하여 본원에 보고된 펩타이드 화합물의 다중-그램(multi-gram) 제제를 수득하였다.
본원에 기술된 펩타이드 화합물은 25 mg/mL 농도 이상에 도달하는 탁월한 용해도 특성을 나타내었다.
본 실시예는 리간드가 합성되고, 정제되어 순수한 형태로 수득될 수 있음을 입증한다.
실시예 2: PSD-95의 PDZ1-2에 대한 친화성의 측정
PSD-95의 PDZ1-2에 대한 화합물 1 내지 75의 결합 친화성을 문헌: Bach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2012, 109, 3317에 기술된 바와 같이 시험관 내 형광 편광(FP) 검정을 사용하여 측정하였다. 먼저, 포화 결합 곡선을 수득하여 형광성 이량체 프로브와 PSD-95의 PDZ1-2 사이의 상호작용에 대한 K D 값을 측정하였다. 증가하는 농도의 PDZ1-2(0.015-30 nM)를 일정한 농도의 프로브(0.5 nM)에 가하였다. 샘플의 형광성 편광(fluorescence polarization; FP)을 635/670 nm의 여기/방출 파장에서 측정하고 생성된 FP 값을 1개 부위(site) 결합 모델에 소프트웨어 GraphPad Prism를 사용하여 조정하였다. 이후에, PSD-95 PDZ12에 대한 표지되지 않은 펩타이드의 친화성을 이종 경쟁 결합 분석으로 평가하였고 여기서 시험한 펩타이드를 증가하는 농도(0.4 내지 960 nM, 최종 농도)로 고정된 양의 PSD-95 PDZ12(4 nM) 및 프로브(0.5 nM)에 포화 결합 실험과 동일한 조건을 사용하여 가하였다. FP 값을 GraphPad prism에서 1개 부위 경쟁(다양한 기울기) 모델에 고정시켰다. 수득되는 IC50 값을 문헌: Nikolovska-Coleska et al., Anal. Biochem., 2004, 332, 261)에 의해 이미 기술된 바와 같이 K i 값으로 전환시켰다.
본 실시예는 PSD-95의 PDZ1-2에 결합하는 리간드의 친화성을 측정하는 방법을 설명한다. 결과는 표 4 내지 7, 및 도 1 내지 4에 제시한다. 결론적으로, 시험한 화합물은 낮은 나노몰 범위의 친화성(K i 값)을 나타내었고 이는 화합물 1과 비교가능하다.
[표 4]
[표 5]
[표 6]
[표 7]
실시예 3: 리간드의 시험관 내 플라스민 안정성
화합물 8 내지 62의 시험관 내 플라스민 안정성은 플라스민(5 ug/mL)이 보충된 포스페이트 완충된 염수(PBS) 중 100 μM의 리간드를 37℃에서 0 내지 1440분 동안 항온처리함으로써 측정하였다. 항온처리 동안 선택된 시점에서, 리간드를 80 μL의 검정 매트릭스로부터 80 μL의 50% 아세토니트릴(ACN)로 처리함으로써 추출하였다. 샘플을 여과하고 UPLC로 분석하여 남아있는 리간드의 양을 측정하였다. LC-MS 분석을 수행하여 리간드 통합성을 입증하고 절단 부위를 확인하였다.
본 실시예는 PSD-95의 PDZ1-2에 결합하는 리간드의 시험관 내 플라스민 안정성을 측정하기 위한 방법을 나타낸다. 결과는 표 8 및 9, 및 도 5 및 6에서 제시된다. 결론적으로, CPP L-Arg9(서열 번호: 12)를 함유하는 시험한 화합물은 D-아미노산 또는 마크로사이클릭 CPP를 함유하는 화합물과 비교가능한 시험관 내 플라스민 반감기 시간을 나타낸다(도 6). 예상치않게도, L-Arg9 함유 화합물의 반감기는 L-TAT(서열 번호 8)의 것보다 유의적으로 더 우수하였다(도 5, 및 6).
[표 8]
[표 9]
실시예 4: 리간드의 막 투과능 및 세포 흡수의 측정
화합물 10 내지 75의 막 투과능을 세포질 내에 전적으로 위치한 HaloGFP를 안정하게 발현하는 HeLa 세포에서 측정하였다. 세포를 실험 전날 40.000개이 세포/웰의 밀도에서 씨딩(seeding)하였다. 성장 배지를 흡인하고 100 μL의 Opti-MEM, Opti-MEM 중 25 μL의 리간드의 제조된 일련 희석물을 세포에 가하고(일정한 DMSO 농도), 혈소판을 4시간 동안 37℃ 및 5% CO2 에서 항온처리하였다. 웰의 성분을 흡인하고, 세포를 신선한 Opti-MEM으로 15분 동안 세척하였다. 세척물을 흡인한 후, 세포를 TAMRA-CA(5 μM)와 함께 15분 동안 항온처리하였다. 체이스 용액(chase solution)을 흡인한 후, 세포를 Opti-MEM로 30분 동안 세척하였다. 세척액을 제거한 다음, 세포를 트립신처리하고, PBS(2% FBS) 속에 재현탁시키고, 벤치톱 유동 세포분석기(benchtop flow cytometer)를 사용하여 분석하였다. 리간드가 없고 TAMRA-CA가 없는 대조군 웰을 사용하여, 수득한 형광성 강도 데이타를 표준화하고 용량-반응 곡선(dose-response curve)에서 플롯팅하였다. 보고된 CP50 값은 리간드의 세포 침투여 대해 역으로 거동하는 최대 적색 형광성의 1/2을 나타낸다.
본 실시예는 PSD-95의 PDZ1-2에 결합하는 CA-태그된 화합물의 막 투과능 및 세포 흡수를 측정하는 방법을 설명한다. 결과는 표 10 내지 12, 및 도 7 내지 9에 제시한다. 결론적으로, 시험한 화합물은 유의적으로 상이한 세포 흡수를 나타내며, 이는 사용된 CPP에 크게 의존하다. 놀랍게도, CPP-태그 L-Arg9(서열 번호 12) 및 L-pVEC(서열 번호: 18)는 최저의 CP50 값을 생성하였다(도 8). 이량체성 리간드에 따라서, L-Arg9는 1 μM 이하의 CP50 값으로 매우 효율적인 세포 흡수를 추가로 촉진하며(도 7), 이는 우수한 BBB 침투 및 세포내 전달을 시사한다. 또한, L-Arg9 CPP-태그는 이의 세포-침투가능한 특성을 상실하지 않고(도 9), 7, 6, 5, 또는 4개의 아르기닌으로 절두(truncation)될 수 있다(참고: 표 12).
[표 10]
[표 11]
[표 12]
실시예 5: 시험관 내 혈장 안정성의 측정
화합물 8, 23, 35, 67, 69, 71 및 73의 시험관 내 혈장 안정성은 100 μM의 리간드를 희석되지 않은 혼주된 사람 혈장 속에서 37℃에서 1440분 동안 항온처리함으로써 측정하였다. 항온처리 동안 선택된 시점에서, 리간드를 검정 매트릭스를 6M 우레아에 가한 다음 아세톤 중 20% TCA를 사용하여 침전시킴으로써 검정 매트릭스로부터 추출하였다. 밤새 항온처리한 후, 샘플을 여과하고 UPLC로 분석하여 남아있는 리간드의 양을 측정하였다. LC-MS 분석을 수행하여 리간드 통합성을 입증하고 절단 부위를 확인하였다.
본 실시예는 PSD-95의 PDZ1-2에 결합하는 리간드의 시험관 내 혈장 안정성을 측정하는 방법을 설명한다. 결과는 표 13, 및 도 10에 제시한다. 결론적으로, L-Arg9 CPP-태그는 사람 혈장에 대해 유의적으로 매우 안정하게 7, 6, 5, 또는 4개의 아르기닌을 절두시킬 수 있다(참고: 표 13).
[표 13]
실시예 6: 정맥내 주사 후 생체 내 뇌 수준의 측정
암컷 Balb/c 마우스(3마리의 동물의 4개 그룹)에게 18 nmol/g의 체중의 목적한 화합물을 비히클로서 등장성 염수를 사용하여 투여하였다. 그룹 1을 사용하여 선택된 시점(주사 후 최대 4시간째)에서 정맥내 주사 후 혈액 농도 프로파일을 수득한다. 그룹 2 내지 4를 사용하여 3개의 상이한 시점에서 혈액 및 뇌 농도를 측정한다. 따라서, 동물은 정맥내 주사 후 선택된 시점에서 희생시키고, 관련 조직을 수집하고 적절한 방법(LC-MS/MS)으로 분석한다.
본 실시예는 PSD-95의 PDZ1-2에 결합하는 리간드의 생체 내 뇌 수준을 측정하는 방법을 설명한다. 더욱이, 혈액 대 뇌 비율 및 상태적인 조직 표적화 효능을 측정하며, 이는 혈액-뇌 장벽을 횡단하여 뇌 속의 표적에 도달하는 화합물의 능력을 알려준다.
실시예 7: pMCAO 마우스 모델을 사용하여 뇌졸중 유발된 손상에 대한 생체 내 신경보호 효과의 측정.
실험 및 수술 세부사항은 문헌: Bach et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2012, 109, 3317을 참고한다. 요약하면, 허혈성 경색의 정도는 무작위된, 이중-맹검의, 위약-제어된 연구에서 C57BL/6J 마우스에서 영구적인 중뇌 동맥 폐색(permanent middle cerebral artery occlusion; pMCAO) 모델을 사용하여 측정한다. 마취 및 동맥 폐색 후, 동물에게 수술 후 30분 째에 투여한다. 수술 6시간 후 생존하는 동물을 희생시키고, 뇌를 조심스럽게 제거한다. 뇌의 고정 및 슬라이싱(slicing) 후, 경색 용적 분석(infarct volumetric analysis)을 수행하고, 총 경색 용적을 계산하였다.
본 실시예는 PSD-95의 PDZ1-2에 결합하는 리간드의 생체 내 신경보호 효과를 측정하는 방법을 설명한다. 판독 매개변수는 화합물 처리된 그룹 대 위약 제어된 그룹에서 경색 용적이다.
참고 문헌
SEQUENCE LISTING <110> University of Copenhagen <120> PSD-95 inhibitors and uses thereof <130> P5985PC00 <160> 71 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <400> 1 Ile Glu Thr Asp Val 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <400> 2 Lys Glu Thr Leu Val 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <400> 3 Lys Glu Thr Thr Val 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <400> 4 Lys Glu Thr Val Val 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <400> 5 Lys Glu Thr Arg Val 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> 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<211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> L-Arg7 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal conjugated to chloroalkane (CA) <400> 68 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 69 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> L-Arg6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal conjugated to chloroalkane (CA) <400> 69 Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> L-Arg5 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal conjugated to chloroalkane (CA) <400> 70 Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 71 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(4) <223> L-Arg4 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal conjugated to chloroalkane (CA) <400> 71 Arg Arg Arg Arg 1

Claims (45)

  1. a. 아미노산 서열 X2TX3V(서열 번호: 53)을 포함하거나 이로 이루어진 제1의 펩타이드 (P1)(여기서,
    X2는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X3은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택된다);
    b. 아미노산 서열 X5TX6V (서열 번호: 55)를 포함하거나 이로 이루어진 제2의 펩타이드 (P2)(여기서,
    X5는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X6은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택된다); 및
    c. i. 3 내지 20개의 L-아르기닌 잔기로 이루어진 폴리-L-아르기닌 펩타이드(폴리-Arg);
    ii. yGrkkrrqrrr (서열 번호: 9, D-TAT);
    iii. RQIKIWFQNRRMKWKK (서열 번호: 14, L-Pen);
    iv. rqikiwfqnrrmkwkk (서열 번호: 15, D-Pen);
    v. RKKRRRESRKKRRRES (서열 번호: 17, L-DPV3);
    vi. LLIILRRRIRKQAHAHSK (서열 번호: 18, L-pVEC);
    vii. KLALKLALKALKAALKLA (서열 번호: 16, L-MAP);
    viii. PLIYLRLLRGQF (서열 번호: 19, L-TP2);
    ix. |(Dap)KAPETALD| (서열 번호: 21, MiniAp4); 및
    x. |Ff(Nal2)RrRrQ|GABA-K (서열 번호: 22, CPP12)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포 침투 펩타이드(Cell Penetrating Peptide; CPP)를 포함하는 화합물로서,
    여기서, CPP는 이의 C-말단을 통해 링커(linker)에 연결되고, P1 및 P2는 이의 N-말단을 통해 링커에 접합되고, 화합물은 하기 화학식 (I)의 구조 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 갖는, 화합물:
    .
  2. 제1항에 있어서,
    P1이 서열 X1X2TX3V(서열 번호: 54)를 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 여기서
    X1은 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X2는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X3은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    여기서 P2가 서열 X4X5TX6V(서열 번호: 56)를 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 여기서
    X4는 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X5는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X6은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, P1 및/또는 P2가 4 내지 10개의 아미노산 잔기, 예를 들면, 5개의 아미노산 잔기로 이루어지는, 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X3 및 X6이 L, T, V, 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 하나 이상의 PEG 단위를 포함하는, 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 하나 이상의 PEG 단위를 포함하고, 여기서 PEG 단위 중 하나의 적어도 하나의 산소 원자가 질소 원자로 대체되어 NPEG를 제공하는, 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 하나 이상의 PEG 단위를 포함하고, 여기서 PEG 단위 중 하나의 적어도 하나의 산소 원자가 질소 원자로 대체되어 NPEG를 제공하고, 여기서 CPP는 아미드 결합에 의해 링커의 질소 원자에 연결되는, 화합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 하나 이상의 PEG 단위를 포함하고, 여기서 PEG 단위 중 하나의 적어도 하나의 산소 원자가 질소 원자로 대체되어 NPEG를 제공하고, 여기서 CPP는 아미드 결합에 의해 링커의 질소 원자에 연결되고, 화합물은 하기 화학식 (III)의 일반 구조를 갖는, 화합물:

    상기 화학식에서,
    p는 0 내지 10의 정수이고;
    q는 0 내지 10의 정수이다.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, P1이 P2와 동일한, 화합물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, P1 및 P2가 아미노산 서열 KETLV(서열 번호: 2)로 이루어지는, 화합물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, P1 및 P2가 아미노산 서열 KETTV(서열 번호: 3)로 이루어지는, 화합물.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, P1 및 P2가 아미노산 서열 KETVV(서열 번호: 4)로 이루어지는, 화합물.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, P1 및 P2가 아미노산 서열 KETRV(서열 번호: 5)로 이루어지는, 화합물.
  14. 제1항 내지 제3항 또는 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, P1 및 P2가 아미노산 서열 ISTDV(서열 번호: 6)로 이루어지는, 화합물.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, P1 및 P2가 아미노산 서열 VETVV(서열 번호: 7)로 이루어지는, 화합물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, CPP가 3 내지 20개의 L-아르기닌 잔기, 예를 들면, 3 내지 15개, 예를 들면, 3 내지 12개, 예를 들면, 3 내지 10개의 L-아르기닌 잔기로 이루어진 폴리-L-아르기닌 펩타이드(폴리-Arg)인, 화합물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 하기 화학식 (VI)의 일반 구조를 갖는, 화합물:

    상기 화학식에서,
    X1은 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X2는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X3은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    X4는 K, V 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X5는 E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X6은 L, T, V, R 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    p는 0 내지 10의 정수이고;
    q는 0 내지 10의 정수이고;
    폴리-Arg는 3 내지 20개의 L-아르기닌 잔기로 이루어진 폴리-L-아르기닌 펩타이드이다.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리-Arg가 3 내지 20개의 L-아르기닌 잔기, 예를 들면, 3 내지 15개, 예를 들면, 3 내지 12개, 예를 들면, 2 내지 10개의 L-아르기닌 잔기로 이루어지는, 화합물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, CPP가 RRRRRRRRR(서열 번호: 12)인, 화합물.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, CPP가 RRRRRRRR(서열 번호: 57)인, 화합물.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, CPP가 RRRRRRR(서열 번호: 58)인, 화합물.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, CPP가 RRRRRR(서열 번호: 59)인, 화합물.
  23. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, CPP가 RRRRR(서열 번호: 60)인, 화합물.
  24. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, CPP가 RRRR(서열 번호: 61)인, 화합물.
  25. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, CPP가 RRR인, 화합물.
  26. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, CPP가 yGrkkrrqrrr (서열 번호: 9, D-TAT)인, 화합물.
  27. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, CPP가 RQIKIWFQNRRMKWKK (서열 번호: 14, L-Pen)인, 화합물.
  28. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, CPP가 rqikiwfqnrrmkwkk (서열 번호: 15, D-Pen)인, 화합물.
  29. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, CPP가 RKKRRRESRKKRRRES (서열 번호: 17, L-DPV3)인, 화합물.
  30. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, CPP가 LLIILRRRIRKQAHAHSK (서열 번호: 18, L-pVEC)인, 화합물.
  31. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, CPP가 KLALKLALKALKAALKLA (서열 번호: 16, L-MAP)인, 화합물.
  32. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, CPP가 PLIYLRLLRGQF (서열 번호: 19, L-TP2)인, 화합물.
  33. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, CPP가 |(Dap)KAPETALD| (서열 번호: 21, MiniAp4)인, 화합물.
  34. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, CPP가 |Ff(Nal2)RrRrQ|GABA-K (서열 번호: 22, CPP12)인, 화합물.
  35. 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, p가 2이고 q가 2인, 화합물.
  36. 제8항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, CPP의 N-말단이 아세틸화되거나, 또는 CPP의 N-말단이 하기 구조를 갖는 클로로알칸 태그(chloroalkane tag; CA)에 접합되는, 화합물:
    .
  37. 제1항에 있어서, 화합물이 화학식 (XXVIII)의 화합물이고:

    여기서, P1 및 P2는 하기와 같고
    CPP의 N-말단은 임의로 아세틸화되는, 화합물:

    .
  38. 제1항에 있어서, 화합물이 화학식 (X) 내지 (XXIII)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 화합물:



    .
  39. 제1항 내지 제3항, 제5항 내지 제9항, 제35항 및 제36항 중 어느 한 항에 있어서, P1 및 P2가 아미노산 서열 IETDV(서열 번호: 1)로 이루어지고, CPP가 rqikiwfqnrrmkwkk(서열 번호: 15, D-Pen); LLIILRRRIRKQAHAHSK(서열 번호: 18, L-pVEC); PLIYLRLLRGQF(서열 번호: 19, L-TP2); |(Dap)KAPETALD|(서열 번호: 21, MiniAp4); 및 |Ff(Nal2)RrRrQ|GABA-K(서열 번호: 22, CPP12)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 화합물.
  40. 제1항에 있어서, 화합물이 하기 화학식 (XXVIII)의 일반 구조를 갖는, 화합물:

    상기 화학식에서,
    P1 및 P2는 아미노산 서열 IETDV(서열 번호: 1)로 이루어지고,
    CPP는 rqikiwfqnrrmkwkk(서열 번호: 15, D-Pen); LLIILRRRIRKQAHAHSK(서열 번호: 18, L-pVEC); PLIYLRLLRGQF(서열 번호: 19, L-TP2); |(Dap)KAPETALD|(서열 번호: 21, MiniAp4); 및 |Ff(Nal2)RrRrQ|GABA-K(서열 번호: 22, CPP12)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 PSD-95 억제제인, 화합물.
  42. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 의약(medicament)으로서 사용하기 위한, 화합물.
  43. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 흥분독성-관련된 질환(excitotoxic-related disease), 예를 들면, 급성 허혈성 뇌졸중(acute ischemic stroke) 및 지주막하 출혈(subarachnoid hemorrhage)로부터 선택된 뇌졸중(stroke)의 발달을 치료, 방지, 감소 및/또는 지연시키는데 사용하기 위한, 화합물.
  44. a. 펩타이드 P1/P2를 합성하는 단계;
    a)의 펩타이드를 OPEGn 또는 NPEGn 링커로 이량체화(dimerizing)하는 단계(여기서 'n'는 PEG 모이어티(moiety)의 수이다);
    c. NPEG 링커의 N에서 CPP 태그(tag)를 예를 들면, 자동화된 펩타이드 합성기(automated peptide synthesizer)를 사용하여 부착시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 제조 방법.
  45. a. Ns-NPEG 이산 링커(diacid linker)를 제공하는 단계;
    b. 펩타이드 P1/P2를 Fmoc-기반 고체상 펩타이드 합성을 사용하여 제조하는 단계;
    c. Fmoc-탈보호된 펩타이드 P1/P2를 Ns-NPEG 이산 링커로 이량체화하여 링커-이량체 접합체(linker-dimer conjugate)를 형성시키는 단계; 및
    d. CPP를 링커-이량체 접합체의 NPEG 링커의 N에, 예를 들면, 자동화된 펩타이드 합성기를 사용하여 부착시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 제조 방법.
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