ES2829975T3 - Detección automatizada de células tumorales en circulación - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de deteccion de celulas en una muestra liquida, comprendiendo los siguientes pasos: a) filtrado de la muestra liquida a traves de una membrana porosa generando una diferencia de presion, donde aguas arriba del filtro hay una presion mas alta que aguas abajo, donde la membrana porosa es apropiada para retener las celulas a detectar, de tal manera que las celulas a detectar se retengan sobre al menos una parte de la superficie de la membrana y que al menos una parte del liquido de la muestra pase a traves de la membrana, b) aplicacion de un primer liquido de proceso que contenga un primer medio para marcar las celulas a detectar con un primer marcador, c) incubacion del liquido de proceso sobre la membrana durante un periodo de tiempo predeterminado, marcando las celulas a detectar, d) deteccion de las celulas marcadas a detectar en la superficie de la membrana, donde durante el paso c) se aplica una sobrepresion en el lado de la membrana opuesto al lado en el que las celulas a detectar llegaron a estar en el paso a), donde la sobrepresion se elige de tal manera que se evite un flujo del liquido de proceso a traves de la membrana.
Description
DESCRIPCIÓN
Detección automatizada de células tumorales en circulación
La presente invención pertenece al ámbito del diagnóstico in vitro y se refiere a un procedimiento y una disposición para la detección de células vivas, circulantes o diseminadas de fluidos corporales (por ejemplo, sangre, orina) y/o muestras de tejido mezcladas con líquido (por ejemplo, médula ósea). El procedimiento conforme a la invención sirve particularmente para la extracción y análisis automatizados de células tumorales circulantes y se usa, por tanto, preferentemente en el diagnóstico de tumores.
La invención permite la detección automatizada de células o componentes celulares de la sangre periférica o médula ósea mediante una prueba funcional, después de que la sangre o la médula ósea se haya filtrado mediante un método de filtración especial. Las células son particularmente células tumorales circulantes (del inglés circulating tumor cells, CTC o (en plural) CTCs), células madre mesenquimales de sangre periférica o bacterias de sangre u otros fluidos corporales, así como células tumorales diseminadas de la médula ósea (del inglés disseminated tumor cells, DTC).
La aparición de CTCs en la sangre periférica es un indicativo de una posible diseminación de células de un tumor sólido en una etapa muy temprana, en la que aún no se puede detectar ninguna metástasis con los métodos convencionales de examen por imágenes. Por lo tanto, tanto la detección como la caracterización de CTCs en la sangre periférica representan oportunidades prometedoras para detectar muy temprano la propagación sistémica de células tumorales y para utilizar las CTCs como marcadores de pronóstico. De esta forma se podrían expresar o realizar pronósticos y seguimiento continuo de terapias sistémicas. Además, la caracterización y evaluación de las CTCs podrían utilizarse como herramienta de diagnóstico para seleccionar un tratamiento adecuado para los tumores sólidos.
Para la detección temprana, el diagnóstico y el control de la terapia del cáncer es cada vez más importante la detección de células tumorales circulantes (CTC) en la sangre. Además, debido al muy pequeño número de CTC, que puede estar en el rango de solo 3-5 en un mililitro de sangre, y debido al gran fondo de leucocitos (6-10x106 por mililitro), se debe elegir un procedimiento para enriquecer las CTC de la manera más selectiva posible, pero capaz de representar ante un gran exceso de otras células sanguíneas. Se emplean además, por ejemplo, métodos físicos como la filtración, que permite una selección por tamaño de las células mediante tamaños de poros apropiados u otros procedimientos, que, por ejemplo, permitan el enriquecimiento de CTCs en una muestra de sangre a través de una unión selectiva de anticuerpos.
Hasta la fecha, ningún procedimiento basado en la selección por tamaño está completamente automatizado. Entre el paso de enriquecimiento y las verdaderas reacciones de detección inmunoquímica selectiva de las CTC siempre son necesarios pasos de trabajo manuales.
Además de los procedimientos citométricos de flujo (por ejemplo, el procedimiento FACS, fluorescence activated cell sorting = clasificación de células activadas por fluorescencia) y los procedimientos de filtración, el único sistema disponible comercialmente que ha sido aprobado para el diagnóstico in vitro de rutina es el de la empresa Veridex (CellSearch). El procedimiento utilizado permite en un volumen inicial de unos pocos ml de sangre la detección de CTC, cuando el número a detectar sea igual o superior a 3 por mililitro. El procedimiento utilizado para el enriquecimiento usa la unión específica de anticuerpos acoplados a perlas magnéticas a las CTCs. La detección específica de las CTCs enriquecidas se realiza ópticamente con la ayuda de anticuerpos marcados con fluorescencia.
También se conocen procedimientos físicos, que enriquecen las CTC a través de una selección por tamaño y/o agotan los leucocitos en la sangre y los "fijan" suavemente. Además, se utilizan filtros con tamaños de poro definidos, que permitan la penetración de leucocitos y otros componentes sanguíneos, pero deban evitar que las CTCs se deslicen. Para el posterior procesamiento, que consiste en una serie de pasos de lavado y teñido selectivo, la transferencia manual del filtro a una estación de teñido es la manera habitual de proceder.
En contraste, la presente invención permite un procedimiento automatizable, económico y fiable para la detección de células (vivas) en una muestra, particularmente de células tumorales en una muestra de sangre.
Descripción de la invención
La invención se relaciona con el procedimiento según la reivindicación 1 y la distribución según la reivindicación 8. En un proceso de filtración en el sentido de la invención, una suspensión se filtra a través de un filtro, por ejemplo, una membrana filtrante. Además, el permeado se fuerza a través del filtro y el retenido se retiene en la superficie del filtro (o en los poros y cavidades del filtro). Durante el proceso de filtrado existe, por tanto, una dirección de flujo
predominante del permeado a través del filtro, de forma que se puede hablar de un área aguas arriba del filtro, en la que se retiene el retenido (que contiene las células como componente fundamental), y un área aguas abajo, a la que se fuerza el permeado y, por ejemplo, puede acumularse allí. Independientemente de esta dirección de flujo predominante, en casos excepcionales, la dirección de flujo puede también invertirse, por ejemplo, cuando el filtro se lava a contracorriente.
Para presionar el permeado a través del filtro, puede generarse una diferencia de presión, donde entonces hay una presión más alta aguas arriba del filtro que aguas abajo. Esto puede lograrse aplicando una presión positiva aguas arriba del filtro, aplicando una presión negativa aguas abajo o mediante una combinación de ambos. Para detener el flujo de permeado a través del filtro (reducirlo a cero), se puede establecer una diferencia de presión de cero. Esto es independiente de la orientación del filtro en el espacio. Para el caso especial de que la dirección del flujo en el filtro sea vertical o un componente vertical (es decir, discurra en la dirección de o contra la fuerza de la gravedad), también hay que tener en cuenta que la columna de agua sobre el filtro contribuye a la diferencia de presión.
Para algunas aplicaciones del procedimiento conforme a la invención se prefiere que la dirección de flujo de la filtración en el filtro transcurra esencialmente en la dirección de la gravedad. De este modo, el retenido llega a reposar sobre la superficie del filtro, lo que, por ejemplo, permite un fácil procesamiento ulterior del retenido (de las células).
Para ciertas aplicaciones puede preferirse no filtrar en la dirección de la fuerza gravitacional sino contra la fuerza gravitacional, por ejemplo, cuando el retenido flote o para recoger las células desde el fondo del filtro en un recipiente después de filtrar.
La invención se relaciona con un procedimiento para detectar células en una muestra líquida, comprendiendo los siguientes pasos:
a) filtrado de la muestra líquida a través de una membrana porosa adecuada para retener las células a detectar, de tal manera que las células a detectar se retengan sobre al menos una parte de la superficie de la membrana y que al menos una parte del líquido de la muestra pase a través de la membrana como permeado,
b) aplicación de un primer líquido de proceso que contenga un primer medio para marcar las células a detectar,
c) incubación del primer líquido de proceso en la membrana durante un período de tiempo predeterminado, marcándose las células a detectar,
d) detección de las células marcadas a detectar en la superficie de la membrana,
donde durante el paso c) se aplica una sobrepresión en el lado de la membrana opuesto al lado en el que las células a detectar se han retenido en el paso a), y donde la sobrepresión se selecciona de tal manera que se impida un flujo de líquido de proceso a través de la membrana.
La muestra líquida puede, por ejemplo, ser una muestra de sangre, de orina o de plasma.
Según un modo de operación de la invención, el paso b) se implementa añadiendo el líquido de proceso directamente a la muestra líquida.
Según un modo de operación de la invención, el primer fluido de proceso se elimina antes de detectar las células marcadas a detectar, por ejemplo, presionándolo a través de la membrana.
Los medios adecuados para marcar incluyen marcadores que pueden teñir las células de forma no específica o específica. Los marcadores no específicos pueden ser, por ejemplo, colorantes que tiñan proteínas, ácidos nucleicos u otros componentes celulares. Los marcadores específicos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos, oligonucleótidos sonda, péptidos u otras moléculas que se unan específicamente a proteínas, secuencias de ácidos nucleicos u otras estructuras específicas de células. El marcador puede estar marcado directamente con una marca detectable, por ejemplo, tintes cromogénicos, tintes fluorescentes, marcado isotópico, etc. Alternativamente, el marcador también puede detectarse usando un reactivo de detección secundario (por ejemplo, anticuerpos secundarios o sistema enzima-sustrato).
Además, puede aplicarse opcionalmente al menos un fluido de proceso adicional, por ejemplo, antes del paso b) o tras el paso d).
El al menos un líquido de proceso adicional contiene preferentemente medios, que se seleccionan entre:
- medios para lavar,
- medios para fijar estructuras biológicas,
- medios para prevenir eventos de marcado inespecíficos o
- medios para marcar las células a detectar con un marcador adicional, donde el marcador adicional es diferente del primer medio de marcado.
Como medios de lavado se conocen los correspondientes tampones de lavado. Estos pueden contener además medios para permeabilizar las membranas celulares, por ejemplo, tensoactivos, saponina y similares. como medios para fijar estructuras biológicas se conocen las correspondientes soluciones de fijación que contienen medios de fijación, por ejemplo, formalina, glutaraldehído y similares.
Como medios para prevenir eventos de marcado no específicos se conocen los correspondientes tampones de bloqueo. Cuando, por ejemplo, se use un anticuerpo como marcador, se sabe saturar las uniones inespecíficas del anticuerpo mediante un tampón de bloqueo, que contenga inmunoglobulinas inespecíficas de la misma especie, de la que procede el anticuerpo marcador.
El fluido de proceso adicional contiene preferentemente medios apropiados para lavar o fijar las células o para prevenir eventos de marcado inespecíficos.
Según un aspecto preferido de la invención, en el procedimiento, después de filtrar las células sobre la membrana, se tiñen con un colorante mediante incubación con un correspondiente fluido de proceso. Para ello, pueden seleccionarse colorantes que tiñan las células o componentes celulares y sean conocidos de la citología e histología. Estos pueden ser tintes vivos o muertos, colorantes que tiñan específicamente los núcleos celulares u otros orgánulos o determinados componentes celulares específicos, por ejemplo, ácidos nucleicos o proteínas. Son tintes celulares conocidos, por ejemplo, azul tripán, DAPI y similares.
Las células a detectar se pueden analizar también microscópicamente sin colorear o coloreadas sobre la membrana. Conforme a la invención, durante el paso c) se aplica una sobrepresión en el lado de la membrana opuesto al lado, en el que se han retenido las células a detectar en el paso a), donde la sobrepresión se selecciona de tal forma que se evite que el líquido de proceso pueda fluir a través de la membrana., donde la sobrepresión asciende a < 50 mbar, < 20 mbar, < 10 mbar ó < 5 mbar. La sobrepresión es preferentemente de 3-10 mbar. Una ligera sobrepresión evita que el líquido de proceso gotee a través de la membrana.
La sobrepresión se selecciona preferentemente de tal manera que, en el caso de una dirección de flujo descendente (en la dirección de la fuerza de atracción), sea igual o mayor que la presión de la columna de agua sobre el filtro. Además, es válido: 1 cm de columna de agua corresponde a aproximadamente 1 mbar. La columna de agua corresponde al nivel de llenado de la suspensión por encima del filtro con una distribución esencialmente horizontal del filtro, donde se filtra de arriba hacia abajo.
Según un modo de operación preferido de la invención, durante el paso d) se aplica una presión negativa en el lado de la membrana opuesto al lado, en el que las células a detectar han llegado a estar en el paso a), donde la presión negativa se selecciona de tal manera que el líquido del proceso se succione a través de la membrana.
Según un modo de operación preferido de la invención, la célula a detectar es una célula tumoral. El procedimiento conforme a la invención es especialmente apropiado para la detección de CTCs.
Según un modo de operación preferido de la invención, en el paso c), el fluido de proceso y las condiciones de incubación se seleccionan de tal manera que las células a detectar puedan sobrevivir durante el período de tiempo predeterminado. De este modo es posible realizar en las células más pruebas funcionales. Como fluido de proceso pueden seleccionarse aquí tampones con concentraciones fisiológicas de sal. La incubación puede tener lugar en condiciones adecuadas de temperatura y humedad.
Además, se pueden detectar las sustancias liberadas por las células a detectar.
La invención se refiere además a una disposición para ejecutar las etapas a) a d) del procedimiento conforme a la invención, comprendiendo:
a) una membrana porosa apropiada para retener las células a detectar
b) medios para aplicar un líquido a la membrana,
c) medios para forzar el líquido a través de la membrana,
d) medios para establecer una diferencia de presión antes y después de la membrana,
e) medios para controlar la sincronización que pueden controlar la aplicación del líquido a la membrana, la residencia del líquido sobre la membrana durante un período de tiempo predeterminado y la presión del líquido a través de la membrana,
donde los medios para ajustar la diferencia de presión permiten crear una sobrepresión en el lado posterior de la membrana para permitir que el líquido permanezca sobre la membrana durante un período de tiempo predeterminado.
Los medios para aplicar un líquido sobre la membrana pueden, por ejemplo, estar diseñados como línea de suministro o como dispositivo de pipeteo.
Los medios para forzar el líquido a través de la membrana pueden comprender medios, con los que se genera una diferencia de presión, donde entonces hay una presión más alta aguas arriba del filtro que aguas abajo.
Los medios para controlar la secuencia temporal se pueden prever como un control programable de la disposición, en el que se puede establecer el período de tiempo predeterminado.
Según un modo de operación preferido de la invención, se aplica una sobrepresión en el lado de la membrana opuesto al lado, en el que se han retenido las células a detectar, donde la sobrepresión se selecciona de tal manera que se evite un flujo de líquido de proceso a través de la membrana, donde la sobrepresión vale < 50mbar, < 20mbar, <10mbar o <5mbar. La sobrepresión es preferentemente de 3-10 mbar. Una ligera sobrepresión evita que el líquido de proceso gotee a través de la membrana.
Preferentemente, la sobrepresión se elige de tal modo que en una dirección de flujo descendente (en la dirección de la atracción gravitacional) sea igual o mayor que la presión de la columna de agua sobre el filtro. Además, es válido: 1 cm de columna de agua corresponde a aproximadamente 1 mbar. La columna de agua corresponde al nivel de llenado de la suspensión por encima del filtro con una disposición esencialmente horizontal del filtro, donde se filtra desde arriba hacia abajo.
La membrana puede estar tensada en un correspondiente dispositivo de sujeción de forma que se puedan aplicar las correspondientes presiones negativas o positivas.
Preferentemente, la membrana está dispuesta sobre un portaobjetos, de forma que, tras realizar los pasos a) a d) del procedimiento conforme a la invención, el portaobjetos con la membrana pueda examinarse para la detección de las células, por ejemplo, examinándolo con un microscopio.
Un portaobjetos de microscopía es una placa transparente de aproximadamente 26 x 76 mm (ISO 8255-2) y un grosor de aproximadamente 0,1 a 1,5 mm.
El portaobjetos tiene preferentemente aberturas de forma que los líquidos puedan succionarse sin problemas. Pueden ser varias aberturas pequeñas, por ejemplo, poros o agujeros. Alternativamente, también pueden ser uno o más cortes más grandes que pueden estar cubiertos por la membrana.
La membrana tiene, por ejemplo, un tamaño de poro de 0,1 a 200 mm. Esto permite que las células se retengan mientras que los fragmentos celulares, los trombocitos y los componentes sólidos más pequeños de la muestra pasan a través del filtro (membrana).
Según un aspecto preferido de la invención, la membrana tiene un tamaño de poro de 2 a 50 mm, más preferentemente de 5 a 20 mm, aún más preferentemente de 5 a 10 mm. Los tamaños de poro en los rangos de tamaño de 2 a 50 mm, de 5 a 20 mm o particularmente de 5 a 10 mm ofrecen la ventaja de que las células quedan retenidas por él, pero permanecen parcialmente adheridas a los poros y, por lo tanto, se adhieren particularmente bien a la membrana y están disponibles para análisis posteriores.
Según un aspecto de la invención, con el primer marcador se detecta un antígeno de la siguiente Lista 1 o Lista 2. Según un aspecto preferido de la invención, cuando se usa una muestra de sangre, antes del filtrado se lleva a cabo una lisis de eritrocitos (por ejemplo, mediante lisis hipotónica), para eliminar los eritrocitos interferentes.
Además, las células también se pueden incorporar de nuevo en medio de cultivo celular después del filtrado y cultivarlas para otras investigaciones. Así, por ejemplo, las células tumorales detectadas se pueden cultivar y examinar más a fondo para comprobar la respuesta a determinados fármacos (por ejemplo, citostáticos).
Lista 1: antígenos específicos de células preferidos:
- alfa-l-fetoproteína (AFP) en carcinoma hepatocelular y tumores de células germinales gonadales y extragonadales - proteína de Bence Jones en mieloma múltiple
- beta-HCG (subunidad beta de la gonadotropina coriónica humana) para tumores de células germinales del ovario y tumores no seminomatosos de los testículos
- CA 15-3 en cáncer de mama (cáncer de mama) o cáncer de ovario (cáncer de ovario)
- CA 19-9 y CA 50 en cáncer de páncreas (carcinoma de páncreas)
- CA-125 en cáncer de ovario (cáncer de ovario)
- Calcitonina (calcitonina humana, hCT), en el cáncer de tiroides medular
- Antígeno carcinoembrionario (CEA) en cáncer colorrectal, cáncer de páncreas y adenocarcinoma de pulmón - Fragmento de citoqueratina 21 (CYFRA 21-1) y Serpin B4 (SCC) en todas las variantes de cáncer de pulmón (carcinoma bronquial)
- HER-2 / nuevo
- Anticuerpos o antígenos del VPH
- Ácido homovanílico en neuroblastoma
- Ácido 5-hidroxiindol acético en el carcinoide
- Catecolaminas, ácido mandélico vainílico en feocromocitoma
- Lactato deshidrogenasa (LDH) en tumores de células germinales
- Isoenzima 1 de lactato deshidrogenasa (LDH-1) en tumores de células germinales; una determinación de rutina aún no se recomienda en las directrices actuales
- Antígenos MAGE
- Metanefrina en feocromocitoma
- MUC1 en cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) o en cáncer de mama
- NSE en carcinoma de pulmón microcítico (CPCP), neuroblastoma y tumores seminomatosos de células germinales - Fosfatasa alcalina placentaria (PLAP) en tumores de células germinales seminomatosos
- PSA en cáncer de próstata (cáncer de próstata)
- Tiroglobulina (Tg) en cualquier concentración en el carcinoma de tiroides papilar o folicular
- Timidina quinasa
- Citoqueratinas, por ejemplo, citoqueratina 8, 18, 19
Lista 2: Antígenos específicos de células adicionales
- p2-microglobulina (p2-M),
- CA 54-9,
- CA 72-4,
- CA 195,
- Antígeno sérico asociado al cáncer (CASA),
- Péptido C,
- Citoqueratina,
- Gastrina,
- Glucagón,
- Glucosa-6-fosfato isomerasa (GPI),
- Insulina,
- Neopterina,
- Proteína de matriz nuclear 22 (NMP 22),
- Ostasa,
- Autoanticuerpos P53,
- Paraproteínas,
- Prolactina (PRL),
- Proteína S-100,
- Serpin B4 (SCC),
- Glicoproteína p1 específica del embarazo (SP-1),
- Glicoproteína 12 asociada a tumores (TAG 12),
- Timidina quinasa (TK),
- Antígeno polipeptídico tisular (TPA),
- Antígeno específico de polipéptido tisular (TPS),
- Tumor M2-PK,
- Polipéptido intestinal vasoactivo (VIP),
- Proteína L similar a la transcetolasa (TKTL1)
Los antígenos mencionados en las Listas 1 y 2 son dianas ejemplares para marcadores específicos (por ejemplo, anticuerpos). a través de los cuales se pueden detectar células, particularmente células tumorales, según el procedimiento conforme a la invención.
El procedimiento conforme a la invención se describe a continuación ejemplarmente. En la Figura 1 adjunta se representan esquemáticamente los pasos a) a d) del procedimiento conforme a la invención.
El paso A muestra el filtrado de la muestra líquida a través de una membrana porosa de tal manera que las células a detectar queden retenidas o queden sobre la superficie de la membrana.
El paso B muestra la aplicación de un primer líquido de proceso que contiene un primer medio para marcar las células a detectar,
El paso C muestra la incubación del líquido de proceso sobre la membrana durante un período de tiempo predeterminado, donde las células a detectar se marcan (representadas mediante sombreado de las células marcadas), y
El paso D muestra la extracción del líquido del proceso, por ejemplo, mediante succión.
Los sólidos (células, partículas, tejidos) a separar del medio circundante (líquido de muestra) se separan del medio por el hecho de que permanecen sobre la superficie de una membrana filtrante, que es impermeable a los sólidos a separar, pero permeable al medio circundante y también para los sólidos que contaminan el sólido a separar. Para este propósito se prevén medios que permitan determinar y modificar específicamente el caudal del gas o líquido a través de la superficie que les es permeable. En el diagnóstico médico, los sólidos son preferentemente componentes celulares y el medio circundante es sangre pura/suero/plasma, que también puede contener partículas, para las cuales, sin embargo, la superficie es permeable debido a sus propiedades (por ejemplo, leucocitos).
Mediante una manera de proceder automatizada, además de la muestra, todos los reactivos necesarios para el aislamiento/enriquecimiento y la detección se aplican selectivamente sobre la superficie de la membrana, por ejemplo, mediante un robot de pipeteo. La muestra y los reactivos pueden permanecer de forma controlada sobre la superficie con fines de incubación y/o pueden eliminarse a través de la superficie que les es permeable. Esto se logra usando diferentes sensores y actuadores, que permitan que las sustancias atraviesen de manera controlada la capa de permeación (superficie permeable) de la membrana, según las necesidades. Además, la regulación puede tener lugar, por ejemplo, en función del caudal o, en el caso de componentes celulares especialmente sensibles, también mediante una diferencia de presión aplicada al sistema (respecto a la presión ambiente).
Todos los pasos, desde la aplicación del medio sobre la superficie semipermeable hasta el marcado selectivo, se realizan y monitorizan preferentemente de forma automática en un robot de manipulación de líquidos. Además, puede lograrse un procesamiento simultáneo y paralelo de una pluralidad de muestras a examinar.
Mediante el procesamiento del protocolo secuencial de aislamiento/enriquecimiento y de las reacciones de detección selectivas en una unidad de aparatos, sin los pasos intermedios manuales hasta ahora habituales y la transferencia de muestras, se logra un análisis menos propenso a errores y un tiempo de procesamiento más rápido. Dado que el procedimiento aquí propuesto también regula la incubación de todos los fluidos de proceso o reactivos necesarios para la detección mediante la aplicación selectiva sobre la superficie semipermeable y el flujo controlado a través de esta superficie, los volúmenes de reactivo utilizados pueden reducirse significativamente, lo que, en el caso de los reactivos inmunoquímicos frecuentemente costosos, significa una considerable ventaja de costes. Tanto en la tinción inmunoquímica manual como con los conocidos "colorantes automáticos", el volumen de incubación es significativamente mayor, ya que no solo tiene que mojarse la superficie a tratar, sino que se lava un área mucho mayor y/o se ha de llenar todo el recipiente de incubación con un volumen suficiente.
Para realizar los pasos de enriquecimiento/lavado y teñido es necesario:
(a) el volumen de líquido y/o el nivel de llenado por encima de la superficie semipermeable
(b) la velocidad de penetración del líquido a través de la superficie semipermeable
(c) conocer la diferencia de presión entre el entorno y el aparato necesaria para la permeación y utilizarla para controlar la velocidad de permeación y para determinar el volumen de muestra actualmente analizado. Los sensores y actuadores necesarios para ello pueden ser parte tanto del aparato de permeación como también del robot de pipeteado, o pueden estar distribuidos, lo que hace necesaria una comunicación entre los componentes.
Para el control individual de cada muestra/canal individual, se requiere al menos 1 sensor de presión y 1 válvula, con que se puede regular la diferencia de presión aplicada en el sistema respecto al entorno (es decir, la sobrepresión o depresión). La respectiva diferencia de presión se establece, por ejemplo, mediante la conexión a un recipiente de almacenamiento en el que impera una depresión o una sobrepresión respecto al entorno.
El flujo de líquido puede monitorizarse ventajosamente a través de un robot de manejo de líquidos, que, para este propósito, asume los siguientes pasos:
a) medición de nivel de llenado específica del canal (por ejemplo, capacitiva) para determinar el volumen de líquido por encima de la membrana semipermeable para el control del desbordamiento y el control del tiempo de reposición,
(b) conversión de los datos de medición registrados en datos que puedan ser leídos por software externo y alimentarse a su posterior procesamiento.
(c) dependiendo del nivel de llenado respectivo, pipeteo de una alícuota de líquido adicional.
La velocidad a la que se lleva a cabo la permeación del medio a través de la superficie semipermeable se controla ventajosamente bien mediante el caudal o bien mediante la diferencia de presión necesaria para la permeación. Para ello, en el caso de componentes a aislar sensibles, se aplica la diferencia de presión más baja posible, por ejemplo, de hasta 7 mbar, pero esta también puede aumentar hasta 50 mbar. La medición continua de la diferencia de presión sirve, sin embargo, también para determinar si todavía hay material de muestra sobre la membrana semipermeable y, por tanto, puede servir como una señal de la permeación completa, o puede usarse como una señal de desconexión del análisis en caso de obstrucción de la superficie semipermeable durante el desarrollo del ensayo.
Mediante la adición en porciones de la muestra, por ejemplo, mediante un robot de manipulación de líquidos, y la mezcla ocasional de la muestra, puede evitarse sustancialmente una sedimentación de las células y la pérdida de células asociada.
A modo de ejemplo se describen los pasos automatizados para el enriquecimiento y la detección inmunoquímica y/o la caracterización biológica molecular de las CTCs en una muestra de sangre.
(i) Pasos de trabajo manual:
• inserción de las muestras de sangre a examinar en el aparato
• aplicación de los reactivos preparados necesarios
• aplicación de los otros consumibles (por ejemplo, puntas de pipeta)
• después del análisis: eliminación de los residuos
(ii) Procedimiento para el enriquecimiento automatizado de CTCs y la detección inmunoquímica de CTCs:
• mezcla de las muestras de sangre
• extracción de la muestra de sangre y adición a un tampón de dilución/digestión/fijación
• incubación de muestra de sangre y tampón
• acondicionamiento opcional de la membrana mediante una serie de pasos de lavado e incubación
• pipeteo de la muestra de sangre tratada en la distribución, de forma que la membrana quede cubierta. • enriquecimiento de las CTCs en la membrana controlado por el nivel de llenado y la diferencia de presión (por ejemplo, usando sensores de nivel de llenado en la punta de la pipeta, medición de la presión y control de la diferencia de presión usando una válvula al recipiente de almacenamiento de presión negativa/positiva)
• parada del proceso de permeación en caso de obstrucción permanente de la membrana
• leve fijación y lavado de las células en la membrana semipermeable.
• tinción inmunoquímica mediante la incubación de las células en la membrana con los fluidos/reactivos de proceso necesarios
• secuencia de ensayo controlada por el nivel de llenado y la diferencia de presión (sensores de nivel de llenado en la punta de la pipeta, medición de la presión y control de la diferencia de presión mediante una válvula al recipiente de almacenamiento de presión negativa/positiva)
• parada del proceso de permeación en caso de obstrucción permanente de la membrana: (c) "Caracterización biológica molecular" por FISH (hibridación in situ de fluorescencia)
• tinción biológica molecular mediante incubación a temperatura controlada en la membrana con los reactivos necesarios
• prevención de la evaporación durante incubaciones más largas colocando un cubreobjetos, que se retira nuevamente después de la incubación
(iv) Pasos finales
• pipeteo de un medio de montaje adecuado, que también puede estar solidificado, sobre la membrana semipermeable
• aplicación de un cubreobjetos
El paso (iv) puede realizarse opcionalmente de nuevo manualmente.
En la denominada inmunotinción, las células corporales o las asociaciones de células (secciones de tejido) se incuban, por ejemplo, con disoluciones de anticuerpos, reactivos de marcado, tampones de lavado y diversos fluidos de proceso (en la mayoría de los casos, secuencialmente). Típicamente, los objetos teñidos se analizan sobre un portaobjetos de microscopio (ingl. slide) con un microscopio.
Los pasos de proceso fluídicos necesarios para la tinción (coloración) son muy diversos y complejos. Los reactivos utilizados son a veces muy caros. Un procesamiento automatizado sobre un portaobjetos apenas permite un procesamiento ahorrador de costes con poco volumen. Los reactivos se enjuagan por lo general sobre el portaobjetos, lo que, además de un alto consumo de reactivos, en determinadas circunstancias también puede estar asociado a una pérdida parcial de objetos.
Los reactivos no se enjuagan sobre una superficie, sino a través de una membrana, lo que ahorra reactivos, evita la pérdida de objetos y generalmente permite un generalmente mejor control del proceso.
Claims (9)
1. Procedimiento de detección de células en una muestra líquida, comprendiendo los siguientes pasos:
a) filtrado de la muestra líquida a través de una membrana porosa generando una diferencia de presión, donde aguas arriba del filtro hay una presión más alta que aguas abajo, donde la membrana porosa es apropiada para retener las células a detectar, de tal manera que las células a detectar se retengan sobre al menos una parte de la superficie de la membrana y que al menos una parte del líquido de la muestra pase a través de la membrana,
b) aplicación de un primer líquido de proceso que contenga un primer medio para marcar las células a detectar con un primer marcador,
c) incubación del líquido de proceso sobre la membrana durante un período de tiempo predeterminado, marcando las células a detectar,
d) detección de las células marcadas a detectar en la superficie de la membrana,
donde durante el paso c) se aplica una sobrepresión en el lado de la membrana opuesto al lado en el que las células a detectar llegaron a estar en el paso a), donde la sobrepresión se elige de tal manera que se evite un flujo del líquido de proceso a través de la membrana.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde antes del paso b) o tras el paso c) se aplica al menos un fluido de proceso adicional.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, donde el al menos un fluido de proceso adicional contiene medios, seleccionados entre medios para lavar, medios para fijar estructuras biológicas, medios para prevenir eventos de marcado inespecíficos o medios para marcar las células a detectar con un marcador adicional, donde el marcador adicional es diferente del primer marcador.
4. Procedimiento según una de las anteriores reivindicaciones, donde el segundo fluido de proceso contiene medios apropiados para lavar o fijar las células o para evitar eventos de marcaje inespecíficos.
5. Procedimiento según una de las anteriores reivindicaciones, donde durante el paso d) se aplica una presión negativa en el lado de la membrana, opuesto al lado en el que las células a detectar se encuentran en el paso a), donde la presión negativa se selecciona de tal forma que el fluido de proceso se succione a través de la membrana.
6. Procedimiento según una de las anteriores reivindicaciones, donde las células a detectar son células tumorales.
7. Procedimiento según una de las anteriores reivindicaciones, donde se detectan las sustancias liberadas por las células a detectar.
8. Distribución para ejecutar el procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo:
a) una membrana porosa, que es apropiada para retener células a detectar,
b) medios para aplicar un líquido a la membrana,
c) medios para forzar el líquido a través de la membrana,
d) medios para ajustar una diferencia de presión delante y detrás de la membrana,
e) medios para controlar el curso temporal, que puede controlar la aplicación del líquido a la membrana, la permanencia del líquido sobre la membrana durante un período de tiempo predeterminado y la presión del líquido a través de la membrana,
donde los medios para ajustar la diferencia de presión permiten generar una sobrepresión de <50 mbar sobre la cara posterior de la membrana, para permitir la permanencia del líquido sobre la membrana durante un período de tiempo predeterminado, y donde la membrana se dispone sobre un portaobjetos.
9. Distribución según la reivindicación 8, que presenta además un contenedor de residuos para recoger fluidos forzados a través de la membrana.
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