ES2666594T3 - Procedimiento para diagnosticar un cáncer invasivo - Google Patents

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Paul Hofman
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris 5 Rene Descartes
Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Centre Hospitalier Universitaire de Nice
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Abstract

Procedimiento para diagnosticar un cáncer invasivo, que comprende: (a) aislar o extraer células tumorales circulantes haciendo pasar una muestra de sangre anticoagulada o una muestra de sangre diluida anticoagulada obtenida de un sujeto en riesgo de desarrollar un cáncer, mediante filtración vertical a través un filtro y recuperar las células aisladas o extraídas que no pasan a través del filtro; en el que el filtro tiene un tamaño de poro comprendido entre 3 y 100 mm, y una densidad de poros de entre 3 x 103 y 5 x 106 poros/cm2 y en el que el filtro retiene las células tumorales circulantes, pero permite el paso de células de la sangre más pequeñas que las células tumorales circulantes a través del filtro; (b) analizar las células de (a) utilizando un análisis citomorfológico y/o inmunomarcaje y/o análisis molecular in situ, y/o análisis molecular de ADN, y/o ARN, y/o microARN, y/o análisis molecular de moléculas de proteína para determinar si las células tumorales circulantes están presentes, determinando de esta manera el riesgo del sujeto de tener un cáncer.

Description

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no raras.
[0115] Se permite recoger las células raras individualmente, como células individuales o grupos de células individuales, o como células mezcladas con células raras no residuales para análisis moleculares adicionales.
[0116] Se acelera la detección y recuento de las células raras mediante la eliminación de los millones de pequeños leucocitos y billones de eritrocitos
[0117] Se permite extraer o aislar células fijadas o frescas para otros análisis.
[0118] Otros modos de filtración. Se pueden emplear varios modos de filtración, siempre que se permita el aislamiento de células raras de otros tipos de células y/o en capas sobre el filtro para su posterior análisis. Por ejemplo, la fuerza para separar células raras de otros tipos de células que pasan a través de un filtro puede ser la gravedad, presión positiva o negativa, o la fuerza centrífuga.
[0119] Tratamiento previo de las muestras. Las muestras biológicas se pueden diluir y/o tratar antes y/o después de la filtración mediante los agentes utilizados para lisar los eritrocitos como saponina, cloruro de amonio, anticuerpos líticos, soluciones hipotónicas, anticoagulantes como EDTA, heparina, coumadina y otros antagonistas de la vitamina K, antagonistas del factor Xa, inhibidores de trombina; aspirina (ácido salicílico) y otros agentes que impiden la agregación de plaquetas (http://en.wikipedia.org/wiki/Antiplatelet_drug, consultado el 21 de mayo de, 2013), fármacos mucolíticos, y agentes de fijación (véase más adelante).
[0120] Las células raras extraídas o aisladas de muestras biológicas por filtración pueden ser células fijadas o células frescas. Las células raras fijadas o frescas extraídas o aisladas de muestras biológicas por filtración pueden ser transferidas a un soporte que comprende de manera no exclusiva portaobjetos, placa de Petri, pocillo o micropocillo o tubo de ensayo u otro soporte para el análisis, análisis moleculares o cultivo. La transferencia de células desde el filtro a un soporte se puede obtener mediante el uso de medios de recolección y/o separación y/o tampones. Por ejemplo, a fin de transferir todas las células desde el filtro a un portaobjetos o a un soporte sólido y evitar la pérdida de células raras, es posible utilizar portaobjetos adhesivos disponibles comercialmente, tales como SuperFrost Ultra Plus® slidesor Clearcell® y Adcell® BioAdhesion Slides y/o para tratar el filtro antes de la filtración con agentes que evitar que se adhieran las células al filtro con agentes de siliconado, como Sigmacote® o similar. Con el fin de transferir todas las células recogidas en el filtro a un portaobjetos o a cualquier otro soporte y para evitar la pérdida de células raras, también es posible ayudar a la transferencia con soluciones que han de aplicarse a la parte posterior del filtro, de este modo la cara que no se adhiere a las células, y creando un flujo de tampón a través de los poros hacia la superficie sólida que separará las células del filtro, de modo que puedan adherirse al portaobjetos u otro soporte sólido. Este proceso de transferencia de células y células raras recogidas en un filtro a un portaobjetos u otro soporte sólido también se puede mejorar mediante el uso de aire positivo y/o presión de líquido aplicada a la parte posterior del filtro: aire y/o líquido pasarán a través de los poros y ayudarán a las células a ser transferidas al portaobjetos u otro soporte sólido. Todos estos protocolos para separar las células y las células raras del filtro y transferirlas a un portaobjetos o soporte sólido funcionarán mejor si no se secan las células en el filtro, por lo tanto si la transferencia se lleva a cabo poco después de la filtración.
[0121] La extracción o aislamiento de células fijadas por filtración se lleva a cabo mediante la fijación de éstas antes de la filtración usando agentes de fijación que comprenden de manera no exclusiva formaldehído, paraformaldehído, glutaraldehído, RCL2, mercuriales como B5 y fijador de Zenker, alcohol metílico y alcohol etílico, picratos como solución de Bouin, fijador de Rigaud etc.
[0122] Las células raras frescas extraídas o aisladas de muestras biológicas por filtración se pueden fijar después de la filtración usando agentes de fijación que comprenden de manera no exclusiva formaldehído, paraformaldehído, glutaraldehído, RCL2, mercuriales como B5 y fijador de Zenker, alcohol metílico y alcohol etílico, picratos como solución de Bouin, fijador de Rigaud, etc.
[0123] Cultivo de células raras. Las células raras extraídas o aisladas de muestras biológicas pueden cultivarse a fin de aumentar su número y facilitar su detección y/o diagnóstico y/o caracterización. El protocolo de cultivo puede incluir medios para estimular preferentemente el crecimiento o células raras en comparación con el crecimiento de células no raras con el fin de aumentar la pureza de las células raras. Los medios para estimular preferentemente el crecimiento de células raras en comparación con el crecimiento de células no raras comprenden de manera exclusiva factores de crecimiento específicos y/o agentes estimulantes del crecimiento de células raras, cocultivo de células raras con otros tipos de células y/o el uso de capas de alimentación que ayudan al crecimiento de células raras, y medios para bloquear el crecimiento y/o supervivencia de las células no raras, tales como anticuerpos inhibidores, bloqueadores del ciclo celular, factores proapoptóticos, siARN, y fármacos de cualquier tipo que reconocen específicamente células no raras con el fin de obtener el bloque de su crecimiento y/o su eliminación.
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[0124] Caracterización de células raras. La detección y/o diagnóstico y/o caracterización de céluls raras pueden obtenerse a través de análisis citomorfológico y/o inmunomarcaje y/o análisis moleculares. El análisis citomorfológico y/o inmunomarcaje se llevan a cabo in situ en células intactas, es decir, en células cuya membrana plasmática y/o límite citoplásmico y/o límite nuclear es reconocible.
[0125] El análisis citomorfológico de manera no exclusiva comprende tinción con hematoxilina y/o eosina, tinción de May Grunwald y/o Giemsa, tinción de Papanicolau, tinción de Feulgen y todo tipo de coloración y tinción estequiométrica con el objetivo de analizar detalles morfológicos celulares y analizar y/o cuantificar componentes celulares. El análisis citomorfológico de manera no exclusiva comprende análisis citoquímicos que de manera no exclusiva comprenden PAS, Sudán, tinción con azul Alcian, procedimientos enzimáticos y no enzimáticos capaces de revelar componentes celulares que de manera no exclusiva comprenden calcio, lípidos, polisacáridos, enzimas y otras moléculas. El inmunomarcaje de manera no exclusiva comprende componentes celulares de marcaje con anticuerpos que de manera no exclusiva comprenden anticuerpos dirigidos a antígenos epiteliales, a antígenos mesenquimales, a los antígenos específicos de órganos, a los antígenos específicos de tumores, a los antígenos específicos fetales, a antígenos específicos de células madre, a factores de transcripción, a proteínas mutadas y a cualquier proteína y/o péptido y/o componente celular cuya detección puede ayudar a la identificación celular y/o diagnóstico y/o caracterización. El inmunomarcaje comprende también de manera no exclusiva inmunocitoquímica, inmunofluorescencia, PCR inmunitaria, y todos los tipos de marcaje de la estructura celular a través de anticuerpos unidos a un medio utilizado para revelar el enlace inmunológico y la diana celular.
[0126] Pueden llevarse a cabo in situ o en células intactas análisis moleculares comprenden de manera no exclusiva FISH (Hibridación Fluorescente In Situ), PRINS (marcaje imprimado in situ)), TUNEL (marcaje del extremo libre por dUTP desoxinucleotidil transferasa) immunoPCR, PNA (ácido nucleico peptídico), PCR in situ y otros procedimientos que utilizan de manera no exclusiva sondas moleculares.
[0127] Se pueden realizar análisis de imágenes de células raras después de la tinción in situ y/o inmunomarcaje y/o análisis moleculares in situ y las imágenes pueden almacenarse y/o transferirse informáticamente antes de más análisis moleculares de células raras que implican la lisis celular.
[0128] Los análisis moleculare que comprenden de manera no exclusiva PCR de transcriptasa inversa, PCR en tiempo real, PCR digital, Whole Genomic Amplification, secuenciación, secuenciación de alto rendimiento, Cast-PCR, PCR fría, hibridación genómica comparada (CGH), array de CGH, microarrays, análisis de metilación, análisis de polimorfismo, etc pueden realizarse en células cuya estructura ha sido alterada y/o lisada con el fin de analizar los componentes moleculares que comprenden de manera no exclusiva moléculas de ADN, ARN, microARN y proteína.
[0129] Los análisis moleculares que comprenden de manera no exclusiva PCR de transcriptasa inversa, PCR en tiempo real, PCR digital, Whole Genomic Amplification, secuenciación, secuenciación de alto rendimiento, Cast-PCR, PCR fría, hibridación genómica comparada (CGH), array de CGH, microarrays, análisis de metilación, análisis de polimorfismo, etc pueden ser dirigidos a células individuales, o a grupos de células individuales o a todas las células extraídas o aisladas a través de filtración de una muestra biológica.
[0130] Los análisis dirigidos a células individuales o grupos de células identificadas de acuerdo con criterios morfológicas y/o inmunomarcaje se pueden realizar mediante el uso de microdisección por láser de la parte de filtro que contiene las células de interés, o de las células después de la transferencia a un soporte, seguido de lisis de las proteínas celulares y análisis molecular de ADN celular (ADN genómico y/o mitocondrial), ARN, microARN y moléculas de proteína. Alternativamente, las células raras extraídas o aisladas por filtración se pueden separar del filtro y las células individuales o grupos de células identificados de acuerdo con criterios morfológicos y/o inmunomarcaje pueden aislarse mediante el campo magnético (Biosistema de silicio u otros procedimientos basados en el campo magnético), o mediante micropipeteado capilar manual o automatizado. Alternativamente, todas las células extraídas o aisladas por filtración se pueden lisar en el filtro, o después de la transferencia a un soporte, mediante el uso de un tampón apropiado para llevar a cabo su análisis molecular de ADN (ADN genómico y/o mitocondrial), ARN, microARN o proteínas mediante el uso no exclusivo de PCR, PCR de transcriptasa inversa, PCR en tiempo real, PCR digital, Whole Genomic Amplification, secuenciación, secuenciación de alto rendimiento, Cast-PCR, PCR fría, hibridación genómica comparada (CGH), array de CGH, microarrays, análisis de metilación, análisis de polimorfismo, etc ..
[0131] Teranóstico no invasivo. Entre sus otros aspectos, la invención hace que sea posible aislar células tumorales circulantes de la sangre y utilizarlas para teranóstico no invasivo. Teranóstico es el uso de un resultado de diagnóstico para guiar en la prescripción de un tratamiento "dirigido" específico. Estos procedimientos aprovechan un biomarcador molecular particular que puede estar presente en células tumorales para predecir su susceptibilidad a responder o no una terapia determinada. Como las terapias contra el cáncer son costosas y a menudo tóxicas, el teranóstico es de este modo
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lisada (volumen total 15 µl) y la preamplificación se lleva a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
[0168] A continuación, se añaden 60 µl de cóctel de amplificación y la amplificación se realiza de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los productos WGA pueden ser purificados utilizando el kit Zymo Research D4014 de acuerdo 5 con las instrucciones del fabricante.
[0169] Las amplificaciones específicas de genes se realizan en 60 µl que contiene 6 µl de Tris-HCl 10 mM, KCl 50 mM, 1,5 a 2,5 mM de MgCl2, 200 µM de cada desoxinucleótido, 0,5 µl de cebador y 2 U de Taq Gold (Life Technologies). Dos microlitros de producto PCRouter fueron reamplificados en 20 µl usando cebadores específicos de gen 'interior' y el mismo
10 protocolo de PCR.
[0170] Utilizando productos WGA de PicoPlex, la PCR anidada puede no ser necesaria para todos los genes. Además, estos productos WGA son compatibles con secuenciación de alto rendimiento y análisis de microarrays CGH
15 [0171] Las secuencias de cebador y las condiciones de ciclado se indican en la siguiente Tabla 1:
Cebador
Secuencia Condiciones específicas
KRAS OUT directo
AAAAGGTACTGGTGGAGTATTTGA (SEQ ID NO. 3) Hibridación a 58ºC durante 30 segundos MgCl2 2 mM
KRAS OUT inverso
TCATGAAAATGGTCAGAGAAACC (SEQ ID NO: 4)
KRAS IN directo
GTATTAACCTTATGTGTGACA (SEQ ID NO: 5) Hibridación a 58ºC durante 30 segundos MgCl2 2 mM
KRAS IN inverso
GTCCTGCACCAGTAATATGC (SEQ ID NO: 6)
BRAF OUT directo
TTAGATCTCTTACCTAAACTCTTCA (SEQ ID NO. 7) Hibridación a 55ºC durante 30 segundos MgCl2 2,5 mM
BRAF OUT inverso
TCAGGGCCAAAAA TTT AATC A (SEQ ID NO: 8)
BRAF IN directo
TGCTTGCTCTGATAGGAAAATG (SEQ ID NO: 9) Hibridación a 60ºC durante 30 segundos MgCl2 2,2 mM
BRAF IN inverso
CCACAAAATGGATCCAGACA (SEQ ID NO: 10)
Exón de EGFR 19 directo
TGC CAG TTA ACG TCT TCC TT (SEQ ID NO: 11) Hibridación a 61ºC durante 30 segundos MgCl2 2,2 mM
Exón de EGFR 19 inverso
CAG GGT CTA GAG CAG AGC AG (SEQ ID NO: 12)
Exón de EGFR 20 directo
CAT TCA TGC GTC TTC ACC TG (SEQ ID NO: 13) Hibridación a 55ºC durante 30 segundos MgCl2 2,2 mM
Exón de EGFR 20 inverso
TTA TCT CCC CTC CCC GTA TC (SEQ ID NO: 14)
Exón de EGFR 21 directo
CTT CCC ATG ATG ATC TGT CC (SEQ ID NO: 15) Hibridación a 60ºC durante 30 segundos MgCl2 2,2 mM
Exón de EGFR 21 inverso
GCTGCGAGCTGACCCAGAATGTCTGG (SEQ ID NO. 16)
VHL-Exón 1 parte 1 directo
GCGCGTTCCATCCTCTAC (SEQ ID NO: 17) Hibridación a 55ºC durante 30 segundos MgCl2 2,5 mM
VHL-Exón 1 parte 1 inverso
GGCCTCCATCTCCTCCTC (SEQ ID NO: 18)
VHL-Exón 1 parte 2 directo
GAGTACGGCCCTGAAGAAGA (SEQ ID NO: 19) Hibridación por “touch down” (6560ºC) durante 30 segundos MgCl2 2,5 mM
VHL-Exón 1 parte 2 inverso
CCGTCGAAGTTGAGCCATAC (SEQ ID NO: 20)
VHL-Exón 1 parte 3 directo
GCCGAGGAGGAGATGGAG (SEQ ID NO: 21) Hibridación a 54ºC durante 30 segundos MgCl2 2,5 mM
VHL-Exón 1 parte 3 inverso
GCTTCAGACCGTGCTATCGT (SEQ ID NO: 22)
VHL-Exón 2 directo
ACCGGTGTGGCTCTTTAACA (SEQ ID NO: 23) Hibridación a 56ºC durante 30 segundos MgCl2 2,5 mM
VHL-Exón 2 inverso
TCCTGTACTTACCACAACAACCTT (SEQ ID NO: 24)
VHL-Exón 3 directo
GCCACTGAGGATTTGGTTTT (SEQ ID NO 25) Hibridación a 58ºC durante 30 segundos MgCl2 2,5 mM
VHL-Exón 3 inverso
CAAAAGCTGAGATGAAACAGTG (SEQ ID NO: 26)
[0172] Después de la PCR específica de gen, el estado mutacional del gen se determina mediante secuenciación tradicional, análisis de fragmentos, ensayos de SNP (ensayos Taqman), PCR en frío, cast-PCR o análisis HRM. [0173] El análisis molecular también se puede realizar sin microdisección por captura lásert después de la lisis de todas 20
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(PY)
Número Promedio Intervalo
53 (81) 38,2 0-152
Tamaño del tumor
Promedio Intervalo
3,9 0,4-18
Histología
Adenocarcinoma invasivo (ADC) ADC predominante acinar ADC predominante papilar ADC predominante micropapilar ADC predominante lepídico ADC predominante sólido con producción de mucina
65 (100) 33 (51) 21 (32) 4 (6) 4 (6) 3 (5)
Número de CTC
> 50 CNHC-MF (intervalo 51-500) < 50 CNHC-MF (intervalo 51-500)
28 (43) 37 (57)
Fase de pTNM
I IA IB II IIA IIB III IIIA IIIB IV
30 (46) 12 18 16 (25) 9 7 14 (21) 12 2 5 (8)
Expresión de antígeno de TTF1
44 (67)
Terapia con neoadyuvante
14 (21)
TNM: Metástasis de nódulo tumoral PY: paquetes al año CNHC-MF: células no hematológicas circulantes con características malignas
[0183] Los tumores se clasificaron según la clasificación de 7ª pTNM y la última clasificación histológica de los adenocarcinomas de pulmón [26, 27]. El análisis FISH se realizó en las muestras tumorales utilizando una sonda de rotura para el gen ALK (Vysis LSI ALK Dual Color, Abbott Molecular, Abbott Park, IL) (datos complementarios). Para interpretarse 5 adecuadamente, los núcleos de las células tumorales deben tener al menos una señal de colocalización. Para ser considerado como reordenado en ALK, al menos el 15% de los núcleos de las células tumorales interpretables debe albergar un patrón de hibridación de sonda anormal [28]. La inmunohistoquímica (IHC) se realizó sobre secciones desparafinizadas utilizando un anticuerpo primario contra la proteína ALK (1:50, 5A4; Abcam, Cambridge, Reino Unido) incubado durante 45 minutos a temperatura ambiente (datos complementarios). El análisis de la mutación dirigida de, i)
10 los puntos claves de mutación de EGFR, ii) puntos claves de mutación de KRAS, y iii) mutaciones de BRAF, se llevó a cabo a partir de ADN extraído de secciones de tejido congeladas de tumores mediante pirosecuenciación, tal como se describe anteriormente [29, 30] (datos complementarios) .
Inmunocitoquímica (ICC) e hibridación fluorescente in situ (FISH) en los filtros ISET.
15 [0184] ICC y FISH se realizaron sobre CTC aisladas por el procedimiento ISET en puntos sin teñir de los filtros correspondientes que contienen CTC con características malignas detectadas por tinción con MGG en 6 puntos [15]. Dos puntos se utilizaron para ICC y dos puntos se utilizaron para FISH por filtro. Para ICC, los puntos se incubaron con un anticuerpo primario contra la proteína ALK (1:50, 5A4; Abcam, Cambridge, Reino Unido) durante 30 minutos a temperatura
20 ambiente. Las reacciones se visualizaron con 3,3'-diaminobenzidina, seguido de contratinción con hematoxilina. La tinción citoplasmática se consideró positiva para ALK [30] (datos complementarios). La FISH realizada en dos o más puntos utilizó una sonda de separación por rotura para el gen ALK (Vysis LSI ALK Dual Color, Abbott Molecular, Abbott Park, IL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células que muestran señales de división o señales 3’ solas se consideraron positivas para reordenamiento de ALK [31]. Los filtros se examinaron de forma independiente y cegados a
22
datos clínicos, IHC, ICC y genotipo del tejido. Hemos probado la reproducibilidad de los resultados de ICC y FISH para la detección de ALK en las CTC de 102 filtros de 34 pacientes que se sometieron a muestreo de sangre antes de la cirugía, y 7 y 15 días después de la cirugía.
5 [0185] 14 a 500 núcleos de las células tumorales interpretables se analizaron para cada paciente. Para ser interpretado correctamente, los núcleos de las células tumorales deben tener al menos una señal de colocalización. Para ser considerado como reordenamiento de ALK, al menos el 15% de los núcleos de las células tumorales interpretables debe albergar un patrón de sondas de hibridación anormal.
10 [0186] La línea celular de NSCLC humano H2228 obtenida a partir de ATCC (Manassas, VA) se usó como un control positivo de reordenamiento de ALK [32]. Las células fueron cultivadas y mantenidas en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%, como se describe anteriormente [32]. Alrededor de 50 células se mezclaron en 10 ml de una muestra de sangre tomada de voluntarios sanos. Las muestras fueron luego filtradas utilizando el procedimiento ISET, como se describe anteriormente [23]. Se realizaron entonces FISH utilizando una sonda de rotura e ICC con anticuerpos
15 anti-ALK como se describe anteriormente.
[0187] La inmunotinción positiva ALK se encontró en cinco tumores correspondientes a los adenocarcinomas con una estructura predominante sólida con producción de mucina. Estos cinco casos mostraron una fuerte tinción citoplasmática positiva (puntuación 3+) para todas las células tumorales, tal como se define anteriormente, con refuerzo de membrana
20 en un par de células [31]. El análisis FISH realizado en el mismo bloque de parafina en secciones en serie, mostró adenocarcinomas reordenados de ALK. Los otros 82 tumores fueron negativos para la inmunotinción de ALK y para reordenamiento de ALK utilizando análisis de FISH. Diez tumores (12%) estaban mutados en EGFR (mutaciones 1 exón 18, 6 exón 19, y 3 exón 21) y 20 casos (24%) mutados en KRAS (18 codón 12 del exón 2 y 2 codón 13 del exón 2). La mutación BRAF no se detectó. Los cinco tumores reordenados de ALK eran EGFR, KRAS y BRAF de tipo natural.
25 [0188] Se halló inmunotinción positiva de ALK en las CTC aisladas en cinco pacientes, correspondientes a los pacientes que tenía una reordenamiento de ALK en los tumores (Figura 1A, A1 y B1, y Figura 1B). Los datos clinicopatológicos de estos cinco pacientes se detallan en la tabla 3.
30 Tabla 3. Datos clinicopatológicos de los casos con reordenamiento de gen ALK de FISH e inmunocitoquímica positiva utilizando un anticuerpo anti-ALK en CTC aisladas mediante el procedimiento de aislamiento por tamaño de células tumorales epiteliales (ISET).
NÚMERO DE CASO
1 2 3 4 5
Sexo
Masculino Masculino Femenino Masculino Femenino
Edad
45 años 48 años 47 años 52 años 43 años
Estado de fumar
Nunca fumó Nunca fumó Nunca fumó Nunca fumó Nunca fumó
Etnia
Caucásica Caucásica Caucásica Caucásica Caucásica
Fase de pTNM
IIA IIA IIIB IV IV
Histología
Adenocarcinoma con arquitectura sólida Adenocarcinoma con arquitectura sólida Adenocarcinoma con arquitectura sólida Adenocarcinoma con arquitectura sólida Adenocarcinoma con arquitectura sólida
Estado para mutaciones de EGFR, KRAS, BRAF
Tipo natural Tipo natural Tipo natural Tipo natural Tipo natural
ALK FISH (tumor)
Positivo (40% de las células) Positivo (50% de las células) Positivo (60% de las células) Positivo (40% de las células) Positivo (50% de las células)
ALK IHC (tumor)
Positivo (100% de las células) Positivo (100% de las células) Positivo (100% de las células) Positivo (100% de las células) Positivo (100% de las células)
Número de CNHC-MF
≥ 50 células (7090 células) ≥ 50 células (60150 células) ≥ 50 células (70100 células) ≥ 50 células (60100 células) ≥ 50 células (80120 células)
ALK-FISH (CTC)
Positivo (100% de las células) Positivo (100% de las células) Positivo (100% de las células) Positivo (100% de las células) Positivo (100% de las células)
ALK ICC CTC)
Positivo (100% de las células) Positivo (100% de las células) Positivo (100% de las células) Positivo (100% de las células) Positivo (100% de las células)
Seguimiento (5 años)
vivo (sin recaída) vivo (sin recaída) Fallecido Fallecido Fallecido
Abreviaturas: FNM = metástasis de nódulos tumorales; CNHC-MF: células no hematológicas circulantes con tumor
23
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