ES2872344T3

ES2872344T3 - Separación selectiva de ácidos nucleicos

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Publication number: ES2872344T3
Application number: ES15814215T
Authority: ES
Inventors: Michael Pugia; Julia Philip; Karen Marfurt
Original assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 2014-07-02
Filing date: 2015-07-02
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2035-07-02
Also published as: US10604751B2; EP3164204B1; EP3164204A1; EP3164204A4; WO2016004308A1; US20170137805A1

Abstract

Método de separación de células poco frecuentes con ácidos nucleicos intactos de células frecuentes en una muestra de sangre completa, plasma o suero que comprende las células poco frecuentes y células frecuentes, comprendiendo el método: (a) combinar la muestra con un medio acuoso que tiene un pH en el intervalo de 5 a 8 en una cantidad de 10 a 100 ml de medio acuoso por 10 ml de muestra; (b) mantener la combinación durante un periodo de 15 minutos a 7 días y a una temperatura de 5ºC a 30ºC para liberar selectivamente ácidos nucleicos de las células frecuentes, pero no de las células poco frecuentes, y (c) someter la muestra a filtración para separar células poco frecuentes de células frecuentes; en el que las células poco frecuentes son células cancerosas.

Description

DESCRIPCIÓN

Separación selectiva de ácidos nucleicos

ANTECEDENTES

La invención se refiere a métodos para enriquecer ácidos nucleicos procedentes de células poco frecuentes en relación con ácidos nucleicos procedentes de células frecuentes.

Se usa filtración celular para la separación de células cancerosas usando una matriz porosa para clasificar células por tamaño y, en la mayoría de los casos, tales métodos de filtración permiten la extracción de células tras la separación. En estos enfoques de filtración se usan métodos tanto de posfiltración microfluídica como de membrana microfluídica. Las células poco frecuentes contienen solo pequeñas cantidades de ácidos nucleicos y estas cantidades están muy por debajo de lo que puede detectarse mediante métodos aplicados antes de la separación de células poco frecuentes de células frecuentes. Actualmente, con el fin de analizar ácidos nucleicos en una muestra que contiene algunas células poco frecuentes (de 1 a 1000 células/10 ml), los ácidos nucleicos deben estar concentrados. Sin embargo, esto no aumenta la pureza de los ácidos nucleicos, es decir, la razón de ácidos nucleicos asociados con un estado patológico (ácidos nucleicos asociados con enfermedad) con respecto a ácidos nucleicos no asociados con un estado patológico (ácidos nucleicos no asociados con enfermedad). Las impurezas se deben a ácidos nucleicos procedentes de células no enfermas, que se producen a partir de ácidos nucleicos que circulan libremente y a ácidos nucleicos procedentes de células frecuentes. Estas impurezas hacen que el análisis de ácidos nucleicos procedentes de células enfermas sea no sensible y propenso a resultados falsos. Por tanto, aunque se conocen métodos para potenciar la cantidad de células poco frecuentes con respecto a las células frecuentes, en una muestra quedan suficientes ácidos nucleicos no asociados con enfermedad, de modo que no puede determinarse con precisión la cantidad de ácidos nucleicos asociados con enfermedad debido a los ácidos nucleicos no asociados con enfermedad.

Además, la filtración celular normalmente requiere la fijación de células para obtener una alta recuperación de células enfermas. Sin fijación, se obtiene menos del 40% de recuperación de las células enfermas, mientras que, con fijación, la recuperación es mayor del 90%. También se requiere fijación para la estabilidad de la muestra. Sin embargo, la fijación provoca problemas, ya que los ácidos nucleicos habitualmente están muy fragmentados y modificados químicamente por un agente de fijación como tal, por ejemplo, formaldehído. Aunque la modificación por formaldehído no puede detectarse en ensayos de control de calidad convencionales tales como, por ejemplo, electroforesis en gel, interfiere fuertemente con el análisis de ácidos nucleicos. Si bien los métodos de aislamiento y purificación de ácidos nucleicos pueden optimizarse para revertir la mayor cantidad posible de modificaciones por formaldehído sin degradación adicional del ARN, el ARN purificado a partir de muestras fijas no es un buen candidato para aplicaciones posteriores que requieren ARN de longitud completa tal como, por ejemplo, los métodos con reacción en cadena de la polimerasa.

Pueden encontrarse ácidos nucleicos procedentes de células poco frecuentes dentro de células poco frecuentes o como ácidos nucleicos circulantes libres de las células. El análisis de los ácidos nucleicos tanto celulares como libres de células es importante. Los ácidos nucleicos celulares dentro de las células poco frecuentes en circulación, tal como los procedentes de células tumorales circulantes, se encuentran en pacientes con cáncer. Estas células están intactas, vivas y, a menudo, pueden replicarse. Sin embargo, las cantidades de ácidos nucleicos procedentes de estas células son de concentración extremadamente baja y están en el intervalo de attogramo por tubo de sangre (7-10 ml). Esto se debe a la pequeña cantidad de estas células poco frecuentes por tubo de sangre, por ejemplo, de 1 a 300 células tumorales circulantes. Sin embargo, estas células pueden sobrevivir en la sangre y hacer que la enfermedad se propague cuando las células entran en los tejidos del cuerpo. El tiempo de latencia que estas células pueden sobrevivir en la sangre es extremadamente largo y del orden de años. Por tanto, es importante saber si estas células poco frecuentes enfermas están presentes y analizar sus ácidos nucleicos para determinar si tales células se adaptarán y sobrevivirán a la tensión de la sangre con potencial para entrar en el tejido o provocar una enfermedad resistente a tratamiento.

Los ácidos nucleicos libres de células surgen principalmente de células poco frecuentes que residen dentro de los tejidos, tales como células poco frecuentes del interior de tumores cancerosos sólidos y tejidos infectados. Estos ácidos nucleicos libres de células se liberan a la circulación en una concentración mucho más alta que los ácidos nucleicos procedentes de células poco frecuentes circulantes. El intervalo observado de ácidos nucleicos circulantes libres de células en la sangre es de entre 200 ng y 40 |ig por 10 ml de sangre en personas sanas. Durante la enfermedad, los ácidos nucleicos libres de células aumentan si se produce enfermedad significativa en los tejidos. Para producir nanogramos de ácidos nucleicos libres de células, miles de millones de células de enfermedades raras deben liberar ácidos nucleicos. Por tanto, la cantidad mínima de tejido enfermo con células poco frecuentes es de tamaño significativo, por ejemplo, un tumor por encima de una masa crítica de tamaño de cm.

El principio de captura de partículas se conoce bien y se ha usado para unir, aislar, separar y concentrar ácidos nucleicos en circulación, tal como a Rn o ADN (Vogelstein B, Gillespie D., Proc Nati Acad Sci 1979: 79: 615-19). Uno de los primeros procedimientos se desarrolló para retirar ADN, e implica el uso de partículas de vidrio preparadas a partir de viales de centelleo esmerilados (American Flint Glass Co.). En ese momento, el gel de sílice y las perlas de vidrio poroso no eran adecuados para retirar ácidos nucleicos. Recientemente, se ha descubierto que las partículas magnéticas recubiertas de sílice son útiles para aislar, separar y concentrar ácidos nucleicos, tales como ARN o ADN (documento WO 03/058649, patentes estadounidenses n.os 8.846.897 y US 8.703.931). Estas partículas magnéticas tienen una capa de sílice ultrafina no porosa y pueden aislar y separar ácidos nucleicos de muestras de tejido y fluidos biológicos haciendo uso de la capa de sílice para unir los ácidos nucleicos y las propiedades magnéticas para retener partículas durante las etapas de lavado. Los métodos son no selectivos y capturan todos los ácidos nucleicos, ya sean procedentes de células poco frecuentes o de células frecuentes.

El problema de la pureza de los ácidos nucleicos se ve agravado por los métodos de aislamiento de ácidos nucleicos. Tales métodos emplean reactivos tales como, por ejemplo, detergentes o fenoles, que pueden dañar el material de ácido nucleico. Además, la contaminación de ácidos nucleicos con otros reactivos, tales como disolventes orgánicos y otros productos químicos de extracción, puede afectar a la integridad de las muestras de ácidos nucleicos. Otros problemas de integridad incluyen degradación, fragmentación y unión y reticulación de ácidos nucleicos.

Por tanto, existe la necesidad de desarrollar un método de enriquecimiento de ácidos nucleicos asociados con enfermedad con respecto a ácidos nucleicos no asociados con enfermedad. El método debe mejorar la recuperación de ácido nucleico procedente de células poco frecuentes y reducir o eliminar la contaminación y permitir una determinación sensible y precisa de ácidos nucleicos en células poco frecuentes.

SUMARIO

Algunos ejemplos según los principios descritos en el presente documento se refieren a métodos de separación de células poco frecuentes con ácidos nucleicos intactos de células frecuentes en una muestra que comprende las células poco frecuentes y células frecuentes. La muestra se combina con un medio acuoso, y la combinación se mantiene durante un periodo de tiempo y a una temperatura para liberar selectivamente ácidos nucleicos de las células frecuentes, pero no de las células poco frecuentes. La muestra se somete a filtración para separar células poco frecuentes de células frecuentes.

Algunos ejemplos según los principios descritos en el presente documento se refieren a métodos de aislamiento de ácidos nucleicos intactos procedentes de células poco frecuentes en una muestra que comprende las células poco frecuentes y células frecuentes. La muestra se combina con un medio acuoso, y la combinación se mantiene durante un periodo de tiempo y a una temperatura para liberar selectivamente ácidos nucleicos de las células frecuentes, pero no de las células poco frecuentes. La muestra se somete a filtración para separar células poco frecuentes de células frecuentes. Los ácidos nucleicos intactos se extraen de las células poco frecuentes separadas.

Algunos ejemplos según los principios descritos en el presente documento se refieren a métodos de determinación de ácidos nucleicos en células poco frecuentes en una muestra que comprende células poco frecuentes y células frecuentes. En el método, la muestra se combina con un medio acuoso. La combinación se mantiene durante un periodo de tiempo y a una temperatura para liberar selectivamente ácidos nucleicos de las células frecuentes, pero no de las células poco frecuentes. La muestra se somete a filtración para separar células poco frecuentes de células frecuentes. Se retira y se identifica uno o más de los ácidos nucleicos de las células poco frecuentes.

Algunos ejemplos según los principios descritos en el presente documento se refieren a métodos de aislamiento y, opcionalmente, de determinación de ácidos nucleicos celulares y circulantes secretados de células poco frecuentes en un fluido corporal y libres de las células. En el método, la muestra se combina con un medio acuoso y partículas de captura de ácido nucleico. La combinación se mantiene durante un periodo de tiempo y a una temperatura para liberar selectivamente ácidos nucleicos de las células frecuentes, pero no de la partícula de captura de ácido nucleico. La combinación se somete a filtración para separar ácidos nucleicos en la partícula de captura de otros componentes circulantes. Se retira y, opcionalmente, se identifica uno o más de los ácidos nucleicos de partículas de captura o de células poco frecuentes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES ESPECÍFICAS

Los ejemplos según los principios descritos en el presente documento permiten la liberación preferencial de ácidos nucleicos de células frecuentes en presencia de células poco frecuentes en una muestra que contiene tanto células frecuentes como células poco frecuentes. Las células poco frecuentes pueden someterse entonces a una o más técnicas de identificación para identificar los ácidos nucleicos presentes en las células poco frecuentes. En algunos ejemplos, los ácidos nucleicos pueden extraerse de las células poco frecuentes antes de la identificación.

Tal como se mencionó anteriormente, algunos ejemplos según los principios descritos en el presente documento se refieren a métodos para liberar selectivamente ácidos nucleicos de células frecuentes en una muestra que contiene células frecuentes y células poco frecuentes. La muestra que va a analizarse es una que se sospecha que contiene células frecuentes y células poco frecuentes. Las muestras pueden ser muestras biológicas o muestras no biológicas. Las muestras biológicas pueden proceder de un sujeto mamífero o de un sujeto no mamífero. Los sujetos mamíferos pueden ser, por ejemplo, seres humanos u otras especies de animales. Las muestras biológicas incluyen fluidos biológicos, tales como sangre completa, suero, plasma, esputo, líquido linfático, semen, moco vaginal, heces, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, heces, líquido cefalorraquídeo, lágrimas y moco, por ejemplo. El tejido biológico incluye, a modo de ilustración, pelo, piel, secciones o tejidos extirpados de órganos u otras partes del cuerpo; por ejemplo. En muchos casos, la muestra es sangre completa, plasma o suero.

Las células poco frecuentes son aquellas células que están presentes en una muestra en cantidades relativamente pequeñas cuando se compara con la cantidad de células frecuentes en una muestra. En algunos ejemplos, las células poco frecuentes están presentes en una cantidad de aproximadamente el 10-8% a aproximadamente el 10-2% en peso de una población celular total en una muestra que se sospecha que contiene las células poco frecuentes. Las células poco frecuentes pueden ser, pero no se limitan a, células malignas tales como neoplasmas malignos o células cancerosas; células endoteliales circulantes; células epiteliales circulantes; células fetales; células inmunitarias (células B, células T, macrófagos, células NK, monocitos); células inmunitarias poco frecuentes; células infectivas; células madre; glóbulos rojos nucleados (normoblastos o eritoblastos); y granulocitos inmaduros; por ejemplo.

Las células frecuentes son aquellas células que están presentes en cantidades relativamente grandes cuando se compara con la cantidad de células poco frecuentes en una muestra. En algunos ejemplos, las células frecuentes son al menos aproximadamente 10 veces, o al menos aproximadamente 102 veces, o al menos aproximadamente 103 veces, o al menos aproximadamente 104 veces, o al menos aproximadamente 105 veces, o al menos aproximadamente 106 veces, o al menos aproximadamente 107 veces, o al menos aproximadamente 108 veces mayor que la cantidad de las células poco frecuentes en la población celular total en una muestra que se sospecha que contiene células frecuentes y células poco frecuentes. Las células frecuentes pueden ser, pero no se limitan a, glóbulos blancos, plaquetas y glóbulos rojos, por ejemplo.

Los ácidos nucleicos libres de células surgen principalmente de células poco frecuentes que residen dentro de los tejidos, tales como células poco frecuentes procedentes del interior de tumores cancerosos sólidos y tejidos infectados. En algunos ejemplos, los ácidos nucleicos libres de células son al menos aproximadamente 1o4 veces, o al menos aproximadamente 105 veces, o al menos aproximadamente 106 veces, o al menos aproximadamente 107 veces, o al menos aproximadamente 108 veces, o al menos aproximadamente 109 veces, o al menos aproximadamente 1010 veces mayor que los ácidos nucleicos celulares que surgen de células poco frecuentes en circulación. Los ácidos nucleicos libres de células pueden ser, por ejemplo, ADN o ARN, y pueden originarse a partir del núcleo celular, ribosomas, mitocondrias, citoplasma y estar dentro de células, vesículas, exosomas o estar circulando libremente o circulando en formas unidas.

Tal como se mencionó anteriormente, en algunos ejemplos la muestra que va a someterse a prueba es una muestra de sangre procedente de un mamífero tal como, pero sin limitarse a, un sujeto humano, por ejemplo. La muestra de sangre es una que contiene células tales como, por ejemplo, células frecuentes y células poco frecuentes. En algunos ejemplos, la muestra de sangre es sangre completa o plasma.

Las muestras de sangre se recogen del cuerpo de un sujeto en un recipiente adecuado tal como, pero sin limitarse a, una bolsa, una botella, una aguja o un recipiente VACUTAIn ER®, por ejemplo. El recipiente puede contener un medio de recogida en el que se suministra la muestra. El medio de recogida es habitualmente un medio seco y puede comprender una cantidad de agente de desactivación de plaquetas eficaz para lograr la desactivación de plaquetas en la muestra de sangre cuando se mezcla con la muestra de sangre y/o una cantidad eficaz de un anticoagulante. El medio de recogida también puede contener uno o más agentes adicionales tales como, pero sin limitarse a, C_1-Cl3 o MnCl2, dextrosa, glucosa, citrato, trifosfato de adenosina, inosina, dihidroxiacetona, 2,3-difosfoglicerol, cloranfenicol, sulfato de neomicina, cloruro de magnesio, yodoacetamida, ascorbato de sodio, ácido acético, dimetilsulfóxido, sulfato de cinc, 2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol, urea y derivados de urea, acetamida, formamida, hidantoína, alcoholes, ácido acético, ácido fórmico, oxidante deshidratado (osmio), agentes de fijación, factores de crecimiento, inhibidores de transferrina e inhibidores para la fosforilación y otras enzimas, por ejemplo. Estos agentes adicionales, si están presentes, están presentes en cantidades que logran sus propósitos deseados respectivos. En algunos ejemplos, el medio de recogida es un medio anticoagulante o de recogida de sangre convencional. Es importante señalar que los métodos según los principios descritos en el presente documento son eficaces cuando no se emplean agentes de fijación, evitando de ese modo problemas en las determinaciones de ácido nucleico cuando se emplean agentes de fijación.

Antes de someter una muestra a métodos según los principios descritos en el presente documento, la muestra puede almacenarse durante un periodo de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 5 días o más a una temperatura de aproximadamente 20C a aproximadamente 40oC, o aproximadamente de 20C a 30oC, o aproximadamente de 20C a aproximadamente 20oc, o de aproximadamente 50c a aproximadamente 40oc, o de aproximadamente 50c a aproximadamente 30oc, o de aproximadamente 50c a aproximadamente 250c, o de aproximadamente 50c a aproximadamente 20oc, o de 10c a aproximadamente 40oc, o de aproximadamente 10oc a aproximadamente 30oc, o de aproximadamente 10oc a aproximadamente 250c, o de aproximadamente 10oc a aproximadamente 20oc, por ejemplo.

Tal como se mencionó anteriormente, según los principios descritos en el presente documento, la muestra se combina con un medio acuoso. El medio acuoso puede ser únicamente agua o el medio acuoso también puede contener disolventes orgánicos tales como, por ejemplo, disolventes apróticos polares, disolventes próticos polares tales como, por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), acetonitrilo, un ácido orgánico o un alcohol, y disolventes no polares miscibles con agua tales como, por ejemplo, dioxeno, en una cantidad de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 50

aproximadamente el 1% a aproximadamente el 50%, o de aproximadament aproximadamente el 50

aproximadamente el 1% a aproximadamente el 40%, o de aproximadament aproximadamente el 30

aproximadamente el 1% a aproximadamente el 20%, o de aproximadament aproximadamente el 10%, o de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 40%, o de aproximadament aproximadamente el 30%, o de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 20%, o de aproximadamente el 5 % a

aproximadamente el 10%, en volumen. En algunos ejemplos, el pH para el medio acuoso es habitualmente un pH

moderado. En algunos ejemplos, el pH del medio acuoso es de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, o de

aproximadamente 6 a aproximadamente 8, o de aproximadamente 7 a aproximadamente 8, o de aproximadamente 5 a

aproximadamente 7, o de aproximadamente 6 a aproximadamente 7, o pH fisiológico, por ejemplo.

La cantidad de medio acuoso empleado depende de varios factores tales como, pero sin limitarse a, la naturaleza y la

cantidad de la muestra, la naturaleza y la cantidad de cualquier tampón, el pH del medio, los componentes del medio

acuoso tales como, por ejemplo, la presencia de un disolvente orgánico, la fuerza iónica del medio, y la tensión superficial

del medio, por ejemplo. En algunos ejemplos según los principios descritos en el presente documento, la cantidad de

medio acuoso por 10 ml de muestra es de aproximadamente 5 ml a aproximadamente 100 ml, o de aproximadamente

5 ml a aproximadamente 80 ml, o de aproximadamente 5 ml a aproximadamente 60 ml, o de aproximadamente 5 ml a

aproximadamente 50 ml, o de aproximadamente 5 ml a aproximadamente 30 ml, o de aproximadamente 5 ml a

aproximadamente 20 ml, o de aproximadamente 5 ml a aproximadamente 10 ml, o de aproximadamente 10 ml a

aproximadamente 100 ml, o de aproximadamente 10 ml a aproximadamente 80 ml, o de aproximadamente 10 ml a

aproximadamente 60 ml, o de aproximadamente 10 ml a aproximadamente 50 ml, o de aproximadamente 10 ml a

aproximadamente 30 ml, o de aproximadamente 10 ml a aproximadamente 20 ml, o de aproximadamente 20 ml a

aproximadamente 100 ml, o de aproximadamente 20 ml a aproximadamente 80 ml, o de aproximadamente 20 ml a

aproximadamente 60 ml, o de aproximadamente 20 ml a aproximadamente 50 ml, o de aproximadamente 20 ml a

aproximadamente 30 ml, por ejemplo.

Según los principios descritos en el presente documento, la combinación que comprende la muestra y el medio acuoso

se mantiene durante un periodo de tiempo y a una temperatura para liberar ácidos nucleicos de las células frecuentes,

pero no de las células poco frecuentes. La temperatura y la duración de este tratamiento depende de la naturaleza del

medio acuoso, la naturaleza de la muestra, la naturaleza de cualquier tampón si está presente, la naturaleza de las células

poco frecuentes, la naturaleza de las células frecuentes, y la naturaleza de los ácidos nucleicos, por ejemplo. En algunos

ejemplos la temperatura del medio acuoso durante el mantenimiento es de aproximadamente 50C a aproximadamente

40oC, o de aproximadamente 50c a aproximadamente 350C, o de aproximadamente 50c a aproximadamente 30oc, o de

aproximadamente 50c a aproximadamente 25oc, o de aproximadamente 50c a aproximadamente 20oc, o de

aproximadamente 50c a aproximadamente 15oc, o de aproximadamente 10oc a aproximadamente 30oc, o de

aproximadamente 10oc a aproximadamente 25oc, o de aproximadamente 10oc a aproximadamente 20oc, o de

aproximadamente 20oc a aproximadamente 25oc, por ejemplo. El periodo de tiempo para el tratamiento de la muestra en

el medio acuoso es de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 20 días, o de aproximadamente 15 minutos a

aproximadamente 15 días, o de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 10 días, o de aproximadamente 15

minutos a aproximadamente 7 días, o de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 5 días, o de aproximadamente

1 día a aproximadamente 20 días, o de aproximadamente 1 día a aproximadamente 15 días, o de aproximadamente 1

día a aproximadamente 10 días, o de aproximadamente 1 día a aproximadamente 5 días, o de aproximadamente 2 días

a aproximadamente 20 días, o de aproximadamente 2 días a aproximadamente 15 días, o de aproximadamente 2 días a

aproximadamente 10 días, o de aproximadamente 2 días a aproximadamente 5 días, o de aproximadamente 5 días a

aproximadamente 10 días, o de aproximadamente 10 días a aproximadamente 20 días, o de aproximadamente 10 días a

aproximadamente 15 días, por ejemplo.

En algunos ejemplos, el medio acuoso comprende un tampón, que puede ser, pero no se limita a, un tampón fosfato (por

ejemplo, solución salina tamponada con fosfato, tampón monohidrogenofosfato, tampón dihidrogenofosfato; tampón

organofosfato (por ejemplo, tampón glicerolfosfato, tampón fenilfosfato, tampón ácido fítico y tampones alquilfosfato, o

combinaciones de los mismos); un tampón carbonato (por ejemplo, un tampón bicarbonato, carbonato de calcio y

carbonato de sodio, o combinaciones de los mismos); un tapón ácido carboxílico (por ejemplo, ácido cítrico, ácido málico,

EDTA, ácidos alquilcarboxílicos (por ejemplo, ácido acético); una guanidina (por ejemplo, arginina, creatina, saxitoxina,

triazabiciclodeceno, guanidina); un tampón borato (por ejemplo, tampón borato de sodio o solución salina tamponada con

borato, o combinaciones de los mismos); amina alifática sustituida con XH que contiene de 2 a 20 átomos de carbono en

la que X es O, S o SO3; o barbital, por ejemplo, y combinaciones de dos o más de los anteriores.

Tal como se mencionó anteriormente, en algunos ejemplos, el tampón es una amina alifática sustituida con XH que

contiene de 2 a 20 átomos de carbono en la que X es O, S o SO3. En algunos ejemplos, el número de átomos de carbono

en la amina alifática sustituida con XH es de 2 a 15, o de 2 a 10, o de 2 a 5, o de 3 a 15, o de 3 a 10, o de 3 a 5, o de 4 a

20, o de 4 a 15, o de 4 a 10, o de 4 a 5, o de 5 a 20, o de 5 a 15, o de 5 a 10, por ejemplo. En algunos ejemplos, la amina

alifática sustituida con XH comprende al menos un sustituyente XH por siete átomos de carbono, o al menos dos

sustituyentes XH por siete átomos de carbono, o al menos tres sustituyentes XH por siete átomos de carbono, por ejemplo.

En algunos ejemplos, el número de sustituyentes XH en la amina alifática sustituida con XH es de 1 a 5, o de 1 a 4, o de

1 a 3, o de 1 a 2, o de 2 a 5, o de 2 a 4, o de 2 a 3, o de 3 a 5, o de 3 a 4, o de 4 a 5. El término “alifático” se refiere a

compuestos no aromáticos que pueden estar saturados o insaturados (es decir, contener uno o más dobles enlaces,

habitualmente dobles enlaces no conjugados) o pueden contener uno o más anillos que son no aromáticos. Las aminas

alifáticas pueden contener uno o más heteroátomos además de los átomos de nitrógeno de los grupos amina donde los heteroátomos pueden seleccionarse del grupo que consiste en oxígeno, azufre y fósforo, por ejemplo. La amina puede ser una amina primaria, una secundaria o una terciaria y puede estar ramificada o no ramificada y puede ser parte de uno o más anillos no aromáticos. Las aminas alifáticas pueden contener uno o más grupos amina, tales como, por ejemplo, un grupo amina, o dos grupos amina, o tres grupos amina, que pueden ser cada uno independientemente una amina primaria, una amina secundaria o una amina terciaria.

En algunos ejemplos, la amina alifática sustituida con XH tiene la fórmula NR1R2-(CH2)a-L, en la que:

L es SO3H o CR3R4R5 en la que R3, R4 y R5 son independientemente H o CH2XH, en la que al menos uno de R3, R4 y R5 es CH2XH;

a es un número entero desde 0 hasta 10, o desde 1 hasta 10, o desde 1 hasta 9, o desde 1 hasta 8, o desde 1 hasta 7, o desde 1 hasta 6, o desde 1 hasta 5, o desde 1 hasta 4, o desde 1 hasta 3, o desde 1 hasta 2, o desde 2 hasta 10, o desde 2 hasta 9, o desde 2 hasta 8, o desde 2 hasta 7, o desde 2 hasta 6, o desde 2 hasta 5, o desde 2 hasta 4, o desde 2 hasta 3, o desde 3 hasta 10, o desde 3 hasta 9, o desde 3 hasta 8, o desde 3 hasta 7, o desde 3 hasta 6, o desde 3 hasta 5, o desde 3 hasta 4, o desde 4 hasta 10, o desde 4 hasta 9, o desde 4 hasta 8, o desde 4 hasta 7, o desde 4 hasta 6, o desde 4 hasta 5, o desde 5 hasta 10, o desde 5 hasta 9, o desde 5 hasta 8, o desde 5 hasta 7, o desde 5 hasta 6, o desde 6 hasta 10, o desde 6 hasta 9, o desde 6 hasta 8, o desde 6 hasta 7, o desde 7 hasta 10, o desde 7 hasta 9, o desde 7 hasta 8, o desde 8 hasta 10, o desde 8 hasta 9, o desde 9 hasta 10, siendo al menos 1 cuando L es SO3H; y

R1 y R2 son independientemente H, alquilo, o (CH2)bC(O)NR6R7 en la que:

b es un número entero desde 1 hasta 10, o desde 1 hasta 9, o desde 1 hasta 8, o desde 1 hasta 7, o desde 1 hasta 6, o desde 1 hasta 5, o desde 1 hasta 4, o desde 1 hasta 3, o desde 1 hasta 2, o desde 2 hasta 10, o desde 2 hasta 9, o desde 2 hasta 8, o desde 2 hasta 7, o desde 2 hasta 6, o desde 2 hasta 5, o desde 2 hasta 4, o desde 2 hasta 3, o desde 3 hasta 10, o desde 3 hasta 9, o desde 3 hasta 8, o desde 3 hasta 7, o desde 3 hasta 6, o desde 3 hasta 5, o desde 3 hasta 4, o desde 4 hasta 10, o desde 4 hasta 9, o desde 4 hasta 8, o desde 4 hasta 7, o desde 4 hasta 6, o desde 4 hasta 5, o desde 5 hasta 10, o desde 5 hasta 9, o desde 5 hasta 8, o desde 5 hasta 7, o desde 5 hasta 6, o desde 6 hasta 10, o desde 6 hasta 9, o desde 6 hasta 8, o desde 6 hasta 7, o desde 7 hasta 10, o desde 7 hasta 9, o desde 7 hasta 8, o desde 8 hasta 10, o desde 8 hasta 9, o desde 9 hasta 10; y R6 y R7 son independientemente H o alquilo, o en la que R1 y R2 se toman juntos para formar un anillo alifático de cinco miembros, un anillo alifático de seis miembros o un anillo alifático de siete miembros, que puede ser, a modo de ilustración y no de limitación, un anillo morfolino o un anillo piperazina.

En algunos ejemplos, la amina alifática sustituida con XH tiene la fórmula NR1R2-(CH2)bCR3R4R5 en la que R1 y R2 son independientemente H o alquilo; R3, R4 y R5 son independientemente H o CH2XH en la que al menos uno de R3, R4 y R5 es CH2XH; y b (tal como se definió anteriormente) es un número entero desde 1 hasta 10, o desde 1 hasta 9, o desde 1 hasta 8, o desde 1 hasta 7, o desde 1 hasta 6, o desde 1 hasta 5, o desde 1 hasta 4, o desde 1 hasta 3, o desde 1 hasta 2, o desde 2 hasta 10, o desde 2 hasta 9, o desde 2 hasta 8, o desde 2 hasta 7, o desde 2 hasta 6, o desde 2 hasta 5, o desde 2 hasta 4, o desde 2 hasta 3, o desde 3 hasta 10, o desde 3 hasta 9, o desde 3 hasta 8, o desde 3 hasta 7, o desde 3 hasta 6, o desde 3 hasta 5, o desde 3 hasta 4, o desde 4 hasta 10, o desde 4 hasta 9, o desde 4 hasta 8, o desde 4 hasta 7, o desde 4 hasta 6, o desde 4 hasta 5, o desde 5 hasta 10, o desde 5 hasta 9, o desde 5 hasta 8, o desde 5 hasta 7, o desde 5 hasta 6, o desde 6 hasta 10, o desde 6 hasta 9, o desde 6 hasta 8, o desde 6 hasta 7, o desde 7 hasta 10, o desde 7 hasta 9, o desde 7 hasta 8, o desde 8 hasta 10, o desde 8 hasta 9, o desde 9 hasta 10.

En algunos ejemplos, la amina alifática sustituida con XH se selecciona del grupo que consiste en:

NH2-C(CH20H)3: 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol (TRIS);

(H0-(CH2)2)2-N-CH2-C(O)0H: ácido 2-(bis(2-hidroxietil)amino)acético (BICINE);

H03S-(CH2)2-NH-CH2-C(O)NH2: ácido 2-(carbamoilmetilamino)etanosulfónico (ACES);

0(CH2CH2)2N-(CH2)3-S03H: ácido 3-morfolinopropano-l-sulfónico (MOPS);

0(CH2CH2)2N-(CH2)2-S03H: ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES);

H0-(CH2)2-N(CH2CH2)2N-(CH2)2-S03H:

ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]-etanosulfónico (HEPES); y H03S-(CH2)2-N(CH2CH2)2N-(CH2)2-S03H: ácido 1,4-piperazindietanosulfónico (PIPES), por ejemplo, y combinaciones de dos o más de los anteriores.

Una cantidad de tampón en el medio acuoso es aquella que es suficiente para promover la liberación de ácidos nucleicos de las células frecuentes, pero no de las células poco frecuentes. La cantidad de tampón en el medio acuoso depende de uno o más de varios factores tales como, por ejemplo, la naturaleza y la cantidad de la muestra, la naturaleza del tampón, la naturaleza de las células poco frecuentes y las células frecuentes, el número de células en la muestra, la temperatura y el tiempo del mantenimiento de la muestra y el medio acuoso, y el pH deseado.

La expresión “ácidos nucleicos” se refiere a macromoléculas poliméricas o polinucleótidos formados a partir de nucleótidos e incluye, pero no se limita a, ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN ), por ejemplo.

Según Ios principios descritos en el presente documento, después de la incubación de la muestra en el medio acuoso, la muestra se trata para separar células poco frecuentes con ácidos nucleicos intactos de las células frecuentes con el fin de concentrar el número de células poco frecuentes frente al número de células frecuentes. En algunos ejemplos, las células poco frecuentes también se separan de Ios ácidos nucleicos liberados de las células frecuentes.

Antes de la separación tal como mediante filtración, las células pueden someterse a fijación, lo que inmoviliza las células y conserva la estructura celular. Una cantidad de fijador empleada es aquella que conserva las células, pero no conduce a resultados erróneos en un análisis posterior de Ios ácidos nucleicos diana. La cantidad de fijador depende de una o más de la naturaleza del fijador y la naturaleza de las células, por ejemplo. En algunos ejemplos, la cantidad de fijador es de aproximadamente el 0,05% a aproximadamente el 0,15% o de aproximadamente el 0,05% a aproximadamente el 0,10%, o de aproximadamente el 0,10% a aproximadamente el 0,15%, por ejemplo, en volumen de la muestra. Los agentes para llevar a cabo la fijación de las células incluyen, pero no se limitan a, agentes de reticulación tales como, por ejemplo, un reactivo de aldehido (tal como, por ejemplo, formaldehido, glutaraldehido y paraformaldehido); un alcohol (tal como, por ejemplo, alcoholes C1-C5 tales como metanol, etanol e isopropanol); una cetona (tal como una cetona C3-C5 tal como acetona); por ejemplo. Las designaciones C1-C5 o C3-C5 se refieren al número de átomos de carbono en el alcohol o la cetona. Pueden llevarse a cabo una o más etapas de lavado en las células fijadas usando un medio acuoso tamponado.

La separación de células poco frecuentes de células frecuentes puede lograrse, por ejemplo, mediante filtración tal como, pero sin limitarse a, métodos de filtración por capilaridad, filtración por membrana, posfiltración microfluidica y membrana microfluidica, por ejemplo. La filtración incluye poner en contacto el medio acuoso con una matriz porosa. Puede emplearse cualquiera de varias técnicas de filtración; tales técnicas de filtración incluyen, pero no se limitan a, microfiltración, ultrafiltración o filtración de flujo cruzado, por ejemplo. La matriz porosa generalmente forma parte de un módulo de filtración donde la matriz porosa forma parte de un conjunto para uso conveniente durante la filtración.

En un enfoque, la muestra se pone en contacto con una matriz porosa de manera que las células poco frecuentes quedan retenidas preferiblemente en la matriz porosa y las células frecuentes y Ios ácidos nucleicos liberados pasan a través de la matriz porosa.

La matriz porosa es un material sólido o semisólido y puede estar compuesta por un material insoluble en agua, orgánico o inorgánico. La matriz porosa puede tener cualquiera de varias formas tales como, por ejemplo, tubular (por ejemplo, fibra hueca, arrollamiento en espiral y fibra fina hueca), superficie sometida a revelado de trazas nucleares, o plana o aplanada (por ejemplo, tira, disco, película, membrana y placa). La matriz puede fabricarse de una amplia variedad de materiales, que pueden producirse de manera natural o ser sintéticos, poliméricos o no poliméricos, fibrosos o no fibrosos. La matriz porosa puede producirse mediante tecnología microelectromecánica (MEMS), mecanizado por láser, tecnología de semiconductores de óxido metálico (CMOS) o procedimientos de microfabricación para producir microtamices. Los ejemplos, a modo de ilustración y no de limitación, de tales materiales para fabricar una matriz porosa incluyen celulosa (incluyendo papel), nitrocelulosa, acetato de celulosa, policarbonato, poli(cloruro de vinilo), poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), nailon y poli(butirato de vinilo), material cerámico, material metálico, por ejemplo, ya sea usados soIos o conjuntamente con otro y/o con otros materiales.

El tamaño de Ios poros de la matriz porosa es aquel que es suficiente para retener preferiblemente células poco frecuentes, que pueden aglutinarse, mientras se permite el paso de otros materiales tales como ácidos nucleicos liberados y células frecuentes a través de Ios poros según Ios principios descritos en el presente documento. El tamaño de Ios poros de la matriz porosa depende de la naturaleza y el tamaño de las células poco frecuentes y las células frecuentes, de si las células poco frecuentes son células poco frecuentes aglutinadas, de la presión aplicada a la muestra de sangre, del grado de fijación, del tamaño de la partícula de captura y de la naturaleza de la partícula de captura, por ejemplo. En algunos ejemplos, el tamaño promedio de Ios poros de la matriz porosa es de aproximadamente 0,1 |im a aproximadamente 100 |im, o de aproximadamente 1 |im a aproximadamente 75 |im, o de aproximadamente 1 |im a aproximadamente 50 |im, o de aproximadamente 1 |im a aproximadamente 20 |im, o de aproximadamente 1 |im a aproximadamente 10 |im, o de aproximadamente 5 |im a aproximadamente 100 |im, o de aproximadamente 5 |im a aproximadamente 75 |im, o de aproximadamente 5 |im a aproximadamente 50 |im, o de aproximadamente 5 |im a aproximadamente 20 |im, o de aproximadamente 5 |im a aproximadamente 10 |im, por ejemplo. La densidad de poros en la matriz porosa es de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 80%, o de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 80%, o de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 80%, o de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 80%, o de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 70%, por ejemplo.

Tal como se mencionó anteriormente, en algunos casos, Ios ácidos nucleicos pueden ser una población de ácidos nucleicos no celulares. En tal caso, se añade una entidad de partículas de captura que comprende una pareja de unión para Ios ácidos nucleicos, que se une a Ios ácidos nucleicos en la población de ácidos nucleicos celulares para colocarlos en forma de partículas con el fin de llevar a cabo la potenciación de una concentración de ácidos nucleicos sobre otra población de ácidos nucleicos para formar una muestra concentrada según Ios principios descritos en este documento. La pareja de unión puede ser específica para ácidos nucleicos en general o específica para una o más poblaciones de ácidos nucleicos o para un ácido nucleico particular que puede estar presente.

Tal como se mencionó anteriormente, algunos ejemplos según Ios principios descritos en el presente documento se refieren a métodos de aislamiento y, opcionalmente, de determinación de ácidos nucleicos circulantes secretados de células poco frecuentes en un fluido corporal y libres de las células. El fluido puede comprender además células frecuentes. La muestra se combina con un medio acuoso y una partícula de captura de ácido nucleico que puede unirse a los ácidos nucleicos. La combinación se mantiene durante un periodo de tiempo y a una temperatura para liberar selectivamente ácidos nucleicos de las células frecuentes, pero no de las partículas de captura. La muestra se somete a filtración para separar los ácidos nucleicos en la partícula de la captura de otros componentes circulantes tales como, por ejemplo, plasma, proteínas, ácidos nucleicos no capturados, células lisadas y células pequeñas. Los ácidos nucleicos se retiran de la partícula de captura de ácido nucleico y pueden identificarse adicionalmente.

La composición de la partícula de la entidad de partículas de captura puede ser orgánica o inorgánica, magnética o no magnética con recubrimiento de sílice aplicado. Los polímeros orgánicos incluyen, a modo de ilustración y no de limitación, nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de hidroxietilo), poli(estireno/divinilbenceno), poli(estireno/acrilato), poli(tereftalato de etileno), resina de melamina, nailon, poli(butirato de vinilo), por ejemplo, ya sea usados solos o conjuntamente con otros materiales e incluyendo látex, formas de micropartículas y nanopartículas de los mismos. Las partículas también pueden comprender carbono (por ejemplo, nanotubos de carbono), metal (por ejemplo, oro, plata y hierro, incluyendo óxidos metálicos de los mismos) o coloides.

El diámetro de las partículas de la entidad de partículas depende de una o más de la naturaleza del ácido nucleico diana, la naturaleza de la muestra, la naturaleza y el tamaño de los poros de una matriz de filtración, la adhesión de la partícula a la matriz, la superficie de la partícula, la superficie de la matriz, la fuerza iónica del líquido, la tensión superficial del líquido y los componentes en el líquido, y el número, el tamaño y la forma de las partículas, por ejemplo. Cuando se emplea una matriz porosa en la etapa de separación por filtración, el diámetro de las partículas debe ser lo suficientemente grande como para reducir la contribución de fondo a un nivel aceptable, pero no tan grande como para lograr una separación ineficaz de las partículas de las moléculas frecuentes. En algunos ejemplos según los principios descritos en el presente documento, el diámetro promedio de las partículas debe ser de al menos aproximadamente 0,02 micrómetros (20 nm) y no más de aproximadamente 2000 micrómetros, o no más de aproximadamente 250 micrómetros. En algunos ejemplos, las partículas tienen un diámetro promedio de desde aproximadamente 0,1 micrómetros hasta aproximadamente 10 micrómetros, o desde aproximadamente 0,1 micrómetros hasta aproximadamente 15 micrómetros, o desde aproximadamente 10 micrómetros hasta aproximadamente 50 micrómetros, o desde aproximadamente 10 micrómetros hasta aproximadamente 100 micrómetros, o desde aproximadamente 50 micrómetros hasta aproximadamente 250 micrómetros, o desde aproximadamente 100 micrómetros hasta aproximadamente 300 micrómetros, o desde aproximadamente 200 hasta aproximadamente 600 micrómetros, o desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 600 micrómetros, o desde aproximadamente 600 hasta aproximadamente 1500 micrómetros, o desde aproximadamente 600 hasta aproximadamente 2000 micrómetros, desde aproximadamente 800 hasta aproximadamente 1200 micrómetros, por ejemplo. En algunos ejemplos, la adhesión de las partículas a la superficie es tan fuerte que el diámetro de partícula puede ser más pequeño que el tamaño de poro de la matriz. En otros ejemplos, las partículas son suficientemente más grandes que el tamaño de poro de la matriz, de manera que físicamente las partículas no pueden caer a través de los poros.

La partícula de captura incluye una pareja de unión que es o bien específica o bien no específica para el ácido nucleico diana no celular. La expresión “pareja de unión específica” se refiere a una molécula que es un miembro de una pareja de unión específica. Un miembro de una pareja de unión específica es una de dos moléculas diferentes que tienen un área en la superficie o en una cavidad, que se une específicamente y, por tanto, se define como complementaria con una organización espacial y polar particular de la otra molécula. Los miembros de la pareja de unión específica pueden ser miembros de un par inmunológico tal como pares de sílice, anticuerpo y polinucleóTidos tales como ADN-ADN, ADN-ARN, por ejemplo. Por otro lado, la unión no específica implica la unión no covalente entre moléculas que es relativamente independiente de estructuras de superficie específicas. La unión no específica puede resultar de varios factores, incluyendo interacciones hidrófobas entre moléculas.

La pareja de unión puede unirse, o bien covalentemente o bien no covalentemente, a la partícula del reactivo de partículas. “No covalentemente” significa que la pareja de unión se une a la partícula como resultado de uno o más enlaces de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, fuerzas electrostáticas, efectos hidrófobos, atrapamiento físico en las partículas e interacciones cargadas, por ejemplo. “Covalentemente” significa que la pareja de unión se une a la partícula mediante un enlace o un grupo de unión, que puede ser alifático o aromático y puede comprender una cadena de 2 a aproximadamente 60 o más átomos que incluyen carbono, oxígeno, azufre, nitrógeno y fósforo.

Tal como se mencionó anteriormente, en algunas realizaciones, la combinación se mantiene durante un periodo de tiempo y a una temperatura para liberar selectivamente ácidos nucleicos de las células frecuentes, pero no de las partículas de captura. En algunos ejemplos, la temperatura del medio acuoso durante el mantenimiento es de aproximadamente 50C a aproximadamente 40oc, o de aproximadamente 50c a aproximadamente 350C, o de aproximadamente 50c a aproximadamente 30oc, o de aproximadamente 50c a aproximadamente 25oc, o de aproximadamente 50c a aproximadamente 20oc, o de aproximadamente 50c a aproximadamente 15oc, o de aproximadamente 10oc a aproximadamente 30oc, o de aproximadamente 10oc a aproximadamente 25oc, o de aproximadamente W C a aproximadamente 20oc, o de aproximadamente 20oc a aproximadamente 25oc, por ejemplo. El periodo de tiempo para la etapa de mantenimiento es de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 20 días, o de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 15 días, o de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 10 días, o de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 7 días, o de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 5 días, 0 de aproximadamente 1 día a aproximadamente 20 días, o de aproximadamente 1 día a aproximadamente 15 días, o de aproximadamente 1 día a aproximadamente 10 días, o de aproximadamente 1 día a aproximadamente 5 días, o de aproximadamente 2 días a aproximadamente 20 días, o de aproximadamente 2 días a aproximadamente 15 días, o de aproximadamente 2 días a aproximadamente 10 días, o de aproximadamente 2 días a aproximadamente 5 días, o de aproximadamente 5 días a aproximadamente 10 días, o de aproximadamente 10 días a aproximadamente 20 días, o de aproximadamente 10 días a aproximadamente 15 días, por ejemplo.

En algunos ejemplos según los principios descritos en el presente documento, se aplica presión a la muestra sobre la matriz porosa para facilitar el paso de células frecuentes y ácidos nucleicos liberados alterados a través de la membrana.

El término “presión” se refiere a diferencias de presión con respecto a la presión atmosférica normal y puede ser o bien presión positiva (aumento de la presión en relación con la presión atmosférica normal) o bien presión negativa (vacío) (disminución de la presión en relación con la presión atmosférica normal). El nivel de presión aplicada depende de uno o más de la naturaleza y el tamaño de las células frecuentes, la naturaleza y el tamaño de las células poco frecuentes aglutinadas, la naturaleza de la matriz porosa y el tamaño de los poros de la matriz porosa, por ejemplo. En algunos ejemplos, el nivel de presión positiva aplicada es de aproximadamente 1 milibar a aproximadamente 500 milibar, o de aproximadamente 1 milibar a aproximadamente 400 milibar, o de aproximadamente 1 milibar a aproximadamente

300 milibar, o de aproximadamente 1 milibar a aproximadamente 200 milibar, o de aproximadamente 1 milibar a aproximadamente lOo milibar, o de aproximadamente 1 milibar a aproximadamente 50 milibar, o de aproximadamente 1 milibar a aproximadamente 30 milibar, o de aproximadamente 1 milibar a aproximadamente 25 milibar, o de aproximadamente 1 milibar a aproximadamente 20 milibar, o de aproximadamente 1 milibar a aproximadamente

15 milibar, o de aproximadamente 1 milibar a aproximadamente 10 milibar, o de aproximadamente 5 milibar a aproximadamente 30 milibar, o de aproximadamente 5 milibar a aproximadamente 25 milibar, o de aproximadamente

5 milibar a aproximadamente 20 milibar, o de aproximadamente 5 milibar a aproximadamente 15 milibar, o de aproximadamente 5 milibar a aproximadamente 10 milibar, por ejemplo. El nivel de presión negativa (vacío) aplicada es el valor negativo de los intervalos anteriores.

En algunos ejemplos la presión aplicada a la muestra sobre la matriz porosa es una presión oscilante, lo que significa que la presión se aplica intermitentemente a intervalos regulares o irregulares, que pueden ser, por ejemplo, de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 6OO segundos, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente

5OO segundos, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 25O segundos, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 1OO segundos, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 50 segundos, o de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 6OO segundos, o de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 5OO segundos, o de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 25O segundo aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 1OO segundos, o de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 50 segundos, o de aproximadamente 1OO segundos a aproximadamente 6OO segundos, o de aproximadamente 1OO segundos a aproximadamente 5OO segundos, o de aproximadamente 1OO segundos a aproximadamente 25O segundos, por ejemplo. En este enfoque, la presión se hace oscilar a de aproximadamente O milibar a aproximadamente 10 milibar, o de aproximadamente 1 milibar a aproximadamente 10 milibar, o de aproximadamente

1 milibar a aproximadamente 7,5 milibar, o de aproximadamente 1 milibar a aproximadamente 5,O milibar, o de aproximadamente 1 milibar a aproximadamente 2,5 milibar, por ejemplo, durante parte o toda la aplicación de presión a la muestra de sangre. La presión oscilante se logra usando un interruptor de encendido-apagado, por ejemplo, y puede realizarse de manera automática o manual. Se permiten altas caídas de presión dependiendo de uno o más del volumen de depósito, el volumen de muestra y la tasa de filtración.

El contacto de la muestra con la matriz porosa continúa durante un periodo de tiempo suficiente para lograr la detención preferente de las células poco frecuentes frente a las células frecuentes sobre la matriz porosa. El periodo de tiempo depende de uno o más de la naturaleza y el tamaño de las células frecuentes, de la naturaleza y el tamaño de las células poco frecuentes estén o no aglutinadas, de la naturaleza de la matriz porosa, del tamaño de los poros de la matriz porosa, del nivel de presión aplicada a la muestra sobre la matriz porosa, del volumen que va a filtrarse, del área superficial del filtro, por ejemplo. En algunos ejemplos, el periodo de contacto es de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 1 hora, o de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente

45 minutos, o de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 30 minutos, o de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 20 minutos, o de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 10 minutos, o de aproximadamente

10 minutos a aproximadamente 1 hora, o de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 45 minutos, o de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 30 minutos, o de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 20 minutos, por ejemplo.

Los ácidos nucleicos que quedan retenidos sobre la superficie de una membrana de un dispositivo de filtración según los principios descritos en el presente documento pueden retirarse mediante cualquier método conveniente. Los ejemplos de tales métodos incluyen, pero no se limitan a, perforar el agregado de partículas de la membrana para dar un recipiente adecuado, extraer el agregado de partículas de la membrana, filtrar las partículas portadoras con partículas marcadoras a través de la membrana o recoger las partículas portadoras con partículas marcadoras de la membrana, por ejemplo.

En el enfoque de perforación, la membrana se corta en áreas que contienen la célula o la partícula de captura usando una herramienta para segmentar o cortar el área. Dichas herramientas incluyen, pero no se limitan a, un punzón, un láser y un borde cortante, por ejemplo. El área puede seleccionarse basándose en la presencia de poros o por estar prevista para rotura. El área cae o se recoge en un pocilio para su tratamiento con líquidos para lavado, amplificación adicional o

análisis de ácidos nucleicos. Alternativamente, la partícula puede mantenerse mediante una fuerza magnética en el fondo del pocilio para que no interfiera con el análisis.

Dependiendo del método para la identificación de ácidos nucleicos de las células poco frecuentes tal como se comenta en más detalle a continuación en el presente documento, la muestra puede tratarse o no para extraer ácidos nucleicos de las células poco frecuentes. En el caso de que se lleve a cabo extracción, el método empleado para la extracción de ácidos nucleicos de las células poco frecuentes depende de la naturaleza de los ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN o ARN). La extracción de ácidos nucleicos de las células poco frecuentes puede implicar uno o más de los siguientes procedimientos: lisis celular; desnaturalización de ADN y proteínas usando agentes de desnaturalización tales como, a modo de ilustración y no de limitación, ADNasa y proteinasa K, por ejemplo; eliminación de lípidos de la membrana celular; eliminación de proteínas celulares; aislamiento de ácidos nucleicos sobre sílice; modificación del gradiente de sacarosa; centrifugación en columna; cromatografía; separaciones con partículas magnéticas tales como, a modo de ejemplo y no de limitación, perlas de óxido de hierro recubiertas con una capa de sílice, por ejemplo; extracción con ácido de guanidiniofenol; tratamiento con agentes caotrópicos tales como, pero sin limitarse a, cloruro de guanidinio e isotiocianato de guanidinio, por ejemplo; centrifugación en gradiente de densidad usando cloruro de cesio o trifluoroacetato de cesio; uso de filtros de fibra de vidrio; aislamiento con cloruro de litio y urea; cromatografía en columna de oligo(dt)-celulosa; y purificación de ácidos nucleicos mediante purificación/aislamiento poli (A) sin columna, por ejemplo.

En los ejemplos en los que se emplea fijación de las células, la extracción de ácidos nucleicos puede incluir un procedimiento para eliminar la fijación de las células. La eliminación de la fijación puede lograrse empleando, a modo de ilustración y no de limitación, calor o productos químicos que pueden revertir los enlaces de reticulación, o una combinación de ambos, por ejemplo.

La lisis celular implica la alteración de la integridad de la membrana celular con un agente lítico, liberando de ese modo el contenido intracelular de las células. Se conocen en la técnica numerosos agentes líticos. Los agentes líticos que pueden emplearse pueden ser agentes físicos y/o químicos. Los agentes líticos físicos incluyen mezclado, trituración y sonicación, y combinaciones o dos o más de los mismos, por ejemplo. Los agentes líticos químicos incluyen, pero no se limitan a, detergentes no iónicos, detergentes aniónicos, detergentes anfóteros, disoluciones acuosas de baja fuerza iónica (disoluciones hipotónicas), agentes bacterianos y anticuerpos que producen lisis dependiente del complemento y combinaciones de dos o más de los mismos, por ejemplo, y combinaciones o dos o más de los anteriores. Los detergentes no iónicos que pueden emplearse como agente lítico incluyen tanto detergentes sintéticos como detergentes naturales.

La naturaleza y la cantidad o la concentración del agente lítico empleado depende de la naturaleza de las células, de la naturaleza del contenido celular, de la naturaleza del análisis que va a llevarse a cabo y de la naturaleza del agente lítico, por ejemplo. La cantidad del agente lítico es al menos suficiente para provocar la lisis de las células para liberar el contenido de las células. En algunos ejemplos la cantidad del agente lítico es (los porcentajes son en peso) de aproximadamente el 0,0001% a aproximadamente el 0,5%, de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 0,4%, de aproximadamente el 0,01% a aproximadamente el 0,3%, de aproximadamente el 0,01% a aproximadamente el 0,2%, de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 0,3%, de aproximadamente el 0,2% a aproximadamente el 0,5%, de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 0,2%, por ejemplo.

La eliminación de lípidos puede llevarse a cabo usando, a modo de ilustración y no de limitación, detergentes, tensioactivos, disolventes y agentes de unión, y combinaciones de dos o más de los anteriores, por ejemplo, y combinaciones de dos o más de los mismos. El uso de un tensioactivo o un detergente como agente lítico, tal como se comentó anteriormente, logra tanto la lisis celular como la eliminación de lípidos. La cantidad del agente para eliminar lípidos es al menos suficiente para eliminar al menos aproximadamente el 50%, o al menos aproximadamente el 60%, o al menos aproximadamente el 70%, o al menos aproximadamente el 80%, o al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95% de los lípidos de la membrana celular. En algunos ejemplos, la cantidad del agente lítico es (porcentajes en peso) de aproximadamente el 0,0001% a aproximadamente el 0,5%, de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 0,4%, de aproximadamente el 0,01% a aproximadamente el 0,3%, de aproximadamente el 0,01% a aproximadamente el 0,2%, de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 0,3%, de aproximadamente el 0,2% a aproximadamente el 0,5%, de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 0,2%, por ejemplo.

En algunos ejemplos, puede ser deseable eliminar o desnaturalizar las proteínas de las células, lo que puede lograrse usando un agente proteolítico tal como, pero sin limitarse a, proteasas, calor, ácidos, fenoles y sales de guanidinio, y combinaciones de dos o más de los mismos, por ejemplo. La cantidad del agente proteolítico es al menos suficiente para degradar al menos aproximadamente el 50%, o al menos aproximadamente el 60%, o al menos aproximadamente el 7o%, o al menos aproximadamente el 80%, o al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95% de las proteínas en las células. En algunos ejemplos, la cantidad del agente lítico es (porcentajes en peso) de aproximadamente el 0,0001% a aproximadamente el 0,5%, de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 0,4%, de aproximadamente el 0,01% a aproximadamente el 0,3%, de aproximadamente el 0,01% a aproximadamente el 0,2%, de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 0,3%, de aproximadamente el 0,2% a aproximadamente el 0,5%, de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 0,2%, por ejemplo.

Los métodos empleados para purificar ácidos nucleicos de las células poco frecuentes se eligen basándose en la naturaleza de los ácidos nucleicos (ADN o ARN), por ejemplo. La purificación de ácidos nucleicos de la muestra tal como se trató anteriormente puede llevarse a cabo usando, a modo de ilustración y no de limitación, precipitación con alcohol (por ejemplo, etanol o isopropanol, o una combinación de Ios mismos) o precipitación con cloroformo a una temperatura de aproximadamente -10oC a aproximadamente 10oC, extracción con fenol-cloroformo, purificación en mini-columna, cromatografía de afinidad y captura magnética, y combinaciones de dos o más de Ios mismos, por ejemplo.

También puede evaluarse la integridad de Ios ácidos nucleicos extraídos. Un método empleado para la evaluación de la integridad depende de la naturaleza del ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN), por ejemplo. Los métodos para evaluar la integridad del ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, electroforesis en gel de agarosa, técnicas espectrofotométricas (por ejemplo, tecnología NANODROP®) y técnicas microfluídicas (por ejemplo, tal como AGILENT 2100 BIOANALYZER) y combinaciones de las mismas, por ejemplo.

En algunos ejemplos, se separan entre sí diferentes tipos de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN y el ARN pueden separarse entre sí y de otros componentes celulares tales como, por ejemplo, proteínas, mediante métodos que incluyen, pero no se limitan a, centrifugación diferencial, extracción con disolvente combinada con precipitación usando sal, separación de partículas magnéticas, y combinaciones de Ios mismos, por ejemplo.

Tras la extracción de Ios ácidos nucleicos de las células poco frecuentes, Ios ácidos nucleicos (ácidos nucleicos diana) se someten a una o más técnicas de identificación. En algunos ejemplos, antes de o conjuntamente con la identificación, Ios ácidos nucleicos pueden someterse a una técnica para amplificar ácidos nucleicos. Tales técnicas incluyen, pero no se limitan a, amplificación enzimática tal como, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación basada en la secuencia de Ios ácidos nucleicos (NASBA), amplificación mediante la Q-P-replicasa, 3SR (específico para ARN y similar a NASBA excepto que la actividad ARNasa-H está presente en la transcriptasa inversa), amplificación mediada por transcripción (TMA) (similar a NASBA en la utilización de dos enzimas en una replicación de secuencia autosostenida), amplificación de genoma completo (WGA) con o sin una amplificación secundaria tal como, por ejemplo, PCR, amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) con o sin una amplificación secundaria tal como, por ejemplo, PCR, amplificación de transcriptoma completo (WTA) con o sin una amplificación secundaria tal como, por ejemplo, PCR o PCR con transcriptasa inversa, por ejemplo.

Los agentes de identificación para identificar ácidos nucleicos incluyen, a modo de ilustración y no de limitación, sondas de ácido nucleico que tienen secuencias complementarias a secuencias de ácidos nucleicos (y son, por tanto, específicas para la secuencia complementaria), por ejemplo. La sonda de ácido nucleico puede estar, o puede ser capaz de estar, marcada con un grupo indicador (marcador) o puede estar, o puede ser capaz de unirse, a un soporte, o ambos. La unión de las sondas a las secuencias de ácido nucleico diana se detecta mediante Ios marcadores. La unión puede detectarse separando la sonda unida de la sonda libre y detectando el marcador. En un ejemplo, se forma una intercalación compuesta por la sonda marcada, la secuencia diana y una sonda que está o puede unirse a una superficie. Alternativamente, la unión puede detectarse mediante un cambio en las propiedades productoras de señales del marcador tras la unión de la sonda con la secuencia diana, tal como un cambio en la eficacia de emisión de un marcador fluorescente o quimioluminiscente. Esto permite que la detección se lleve a cabo sin una etapa de separación. La detección de la señal depende de la naturaleza del marcador o del grupo indicador. Si el marcador o grupo indicador es una enzima, Ios miembros adicionales del sistema de producción de señales incluyen, por ejemplo, sustratos enzimáticos. En un enfoque, Ios ácidos nucleicos diana se inmovilizan sobre un soporte sólido y luego se ponen en contacto con sondas de ácido nucleico marcadas adecuadas, seguido por la detección de Ios marcadores.

El marcador habitualmente forma parte de un sistema de producción de señales, que incluye uno o más componentes, siendo al menos un componente un marcador detectable, que genera una señal detectable que se refiere a la cantidad de marcador unido y/o no unido, es decir, la cantidad de marcador unido o no unido al ácido nucleico diana que está detectándose o a un agente que refleja la cantidad de ácido nucleico diana que va a detectarse. El marcador es cualquier molécula que produce o puede inducirse que produzca una señal y puede ser, por ejemplo, un agente que fluoresce, un radiomarcador, una enzima, un agente quimioluminiscente o un fotosensibilizador. Por tanto, la señal se detecta y/o mide detectando la actividad enzimática, la luminiscencia, la absorbancia de luz o la radiactividad, dependiendo de la naturaleza del marcador.

Los marcadores adecuados incluyen, a modo de ilustración y no de limitación, tintes; agentes que fluorescen, tales como fluoresceína, isotiocianato, compuestos de rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina; enzimas tales como fosfatasa alcalina, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (“G6PDH”), P-galactosidasa y peroxidasa de rábano picante; ribozima; un sustrato para una replicasa tal como QB replicasa; promotores; complejos tales como Ios preparados a partir de CdSe y ZnS presentes en nanocristales semiconductores conocidos como puntos cuánticos; agentes quimioluminiscentes tales como isoluminol y ésteres de acridinio, por ejemplo; sensibilizadores; coenzimas; sustratos de enzimas; radiomarcadores tales como 1251, 1311, 14C, 3H, 57Co y 75Se; partículas tales como partículas de látex, partículas de carbono, partículas metálicas incluyendo partículas magnéticas, por ejemplo, partículas de dióxido de cromo (Cr02) y similares; sol metálico; cristalita; liposomas; células, etc., que pueden marcarse adicionalmente con un tinte, un catalizador u otro grupo detectable.

El marcador puede producir directamente una señal y, por tanto, no se requieren componentes adicionales para producir una señal. Numerosas moléculas orgánicas, por ejemplo, agentes que fluorescen, pueden absorber luz ultravioleta y visible, donde la absorción de luz transfiere energía a estas moléculas y las eleva a un estado de energía excitado. Esta energía absorbida se disipa luego mediante la emisión de luz a una segunda longitud de onda. Otros marcadores que producen directamente una señal incluyen colorantes e isótopos radiactivos.

Alternativamente, el marcador puede necesitar otros componentes para producir una señal, y el sistema de producción de señales incluiría entonces todos los componentes necesarios para producir una señal medible. Tales otros componentes pueden incluir sustratos, coenzimas, potenciadores, enzimas adicionales, sustancias que reaccionan con productos enzimáticos, catalizadores, activadores, cofactores, inhibidores, eliminadores, iones metálicos y una sustancia de unión específica necesaria para la unión de sustancias de generación de señales.

El marcador u otros miembros de un sistema de producción de señales pueden estar unidos a un soporte o pueden unirse a una molécula tal como una célula que está dispuesta sobre un soporte. El soporte puede estar compuesto por un material orgánico o inorgánico, sólido o fluido, insoluble en agua, que puede ser transparente o parcialmente transparente. El soporte puede tener cualquiera de varias formas, tales como partículas, incluyendo perla, película, membrana, tubo, pocilio, tira, varilla, superficies planas (tales como, por ejemplo, lámina, placa y platina) y fibra, por ejemplo. Dependiendo del tipo de ensayo, el soporte puede suspenderse o no en el medio en el que se emplea. Ejemplos de soportes que pueden suspenderse son materiales poliméricos tales como látex; bicapas lipídicas o liposomas; gotitas de aceite y soportes metálicos tales como, por ejemplo, partículas magnéticas; por ejemplo. Otras composiciones de soporte incluyen polímeros, tales como nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli (te reftal ato de etileno), nailon y poli(butirato de vinilo), usados o bien por sí mismos o bien conjuntamente con otros materiales. En algunos ejemplos, el soporte es la matriz porosa usada en una filtración como se comentó anteriormente.

El marcador y/u otros miembros de un sistema de producción de señales pueden unirse a una sonda de ácido nucleico o a otra molécula. La unión del marcador a la sonda puede lograrse mediante reacciones químicas que dan como resultado la sustitución de un átomo de hidrógeno del marcador por una unión a la sonda o puede incluir un grupo de enlace entre el marcador y la sonda. Otros miembros de un sistema de producción de señales también pueden unirse covalentemente a sondas de ácido nucleico. Por ejemplo, dos miembros de un sistema de producción de señales tal como, por ejemplo, un agente que fluoresce y un agente de extinción, pueden unirse cada uno a sondas de ácido nucleico diferentes que forman un complejo específico con un ácido nucleico diana. La formación del complejo aproxima al agente que fluoresce y al agente de extinción, permitiendo de ese modo que el agente de extinción interaccione con el agente que fluoresce para producir una señal.

Posteriormente a la identificación, los ácidos nucleicos pueden someterse a técnicas analíticas adicionales tales como, pero sin limitarse a, técnicas de secuenciación, PCR, pruebas de ADN ramificado, reacción en cadena de la ligasa y métodos de hibridación, incluyendo combinaciones de dos o más de los anteriores, por ejemplo. Los métodos de secuenciación de ácidos nucleicos incluyen, a modo de ilustración y no de limitación, secuenciación química (por ejemplo, secuenciación de Maxam-Gilbert), secuenciación de terminación de cadena (por ejemplo, secuenciación de Sanger), secuenciación de novo, secuenciación al azar, amplificación clonal in vitro (por ejemplo, PCR en puente), secuenciación de alto rendimiento, secuenciación mediante ligación (secuenciación SOLiD), secuenciación mediante síntesis, pirosecuenciación, secuenciación de semiconductores iónicos, secuenciación en tiempo real de molécula única, secuenciación de firma masivamente en paralelo (MPSS), secuenciación polony, secuenciación de nanobolas de ADN, secuenciación de molécula única y combinaciones de las mismas, por ejemplo.

En algunos ejemplos, pueden emplearse técnicas de hibridación in situ (ISH) para identificar ácidos nucleicos que están presentes en o dentro de una célula poco frecuente sin extracción de los ácidos nucleicos. Las técnicas de ISH utilizan sondas de ácido nucleico marcadas que son complementarias a los ácidos nucleicos que van a identificarse.

En algunos ejemplos que utilizan técnicas de ISH, puede ser necesario someter las células poco frecuentes a permeabilización. La permeabilización proporciona acceso a través de la membrana celular a los ácidos nucleicos de interés. La cantidad de agente de permeabilización empleada es la que altera la membrana celular y permite el acceso a los ácidos nucleicos. La cantidad de agente de permeabilización depende de una o más de la naturaleza del agente de permeabilización y la naturaleza y la cantidad de las células poco frecuentes, por ejemplo. En algunos ejemplos, la cantidad de agente de permeabilización en peso es de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 0,5%, o de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 0,4%, o de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 0,3%, o de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 0,2%, o de aproximadamente el 0,2% a aproximadamente el 0,5%, o de aproximadamente el 0,2% a aproximadamente el 0,4%, o de aproximadamente el 0,2% a aproximadamente el 0,3%, por ejemplo. Los agentes para llevar a cabo la permeabilización de las células poco frecuentes incluyen, pero no se limitan a, un alcohol (tal como, por ejemplo, alcoholes C1-C5 tales como metanol y etanol); una cetona (tal como una cetona C3-C5, tal como acetona); un detergente (tal como, por ejemplo, saponina, T riton® X-100 y Tween®-20); por ejemplo. Pueden llevarse a cabo una o más etapas de lavado en las células permeabilizadas usando un medio acuoso tamponado.

La expresión “al menos”, tal como se usa en el presente documento, significa que el número de elementos especificados puede ser igual a o mayor que el número mencionado. El término “aproximadamente”, tal como se usa en el presente documento, significa que el número citado puede diferir en más o menos un 10%; por ejemplo, “aproximadamente 5” significa un intervalo de 4,5 a 5,5.

Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren y no limiten el alcance de la invención. Las partes y los porcentajes dados a conocer en el presente documento son en volumen a menos que se indique otra cosa.

EJEMPLOS

Todos Ios productos químicos pueden adquirirse de Sigma-Aldrich Company (St, Louís MO), a menos que se indique otra cosa.

Abreviaturas:

WBC = glóbulos blancos

RBC = glóbulos rojos

min = minuto(s)

|im = micrómetro(s)

ml = mililitro(s)

|il = microlitro(s)

mg = miligramos(s)

|ig = microgramo(s)

mBar = milibar

TA = temperatura ambiente

DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol

PBS = solución salina tamponada con fosfato (Na2HP043,2 mM, KH2PO40,5 mM, KCl 1,3 mM, NaCI 135 mM, pH 7,4) EDTA = etilendiaminotetraacetato

Ejemplo 1. Separación de ácidos nucleicos de células poco frecuentes de ácidos nucleicos de células frecuentes Se recogieron para las pruebas muestras de sangre completa (aproximadamente 8 ml) de donantes sanos en tubos que contenían K3EDTA y 0,45 ml de conservante TRANSFIX®, que también contenían paraformaldehído al 1% (VACUTEST® KIMA S, r, 1., Italia, TVT-09-50-45). Se recogieron células cancerosas de cultivo celular y se añadió un número conocido a cada muestra de sangre, Se usó para las pruebas la línea de células de cáncer de pulmón H226 o H2228 (ATCC), Estas células no fijadas se añadieron a de 1 a 10.000 recuentos de células por tubo de sangre,

Las muestras de tampón para las pruebas se crearon añadiendo 9 ml de PBS más albúmina sérica bovina (BSA) al 1% a un tubo que contenía K3EDTA y 0,45 ml de conservante TRANSFIX®, que también contenían paraformaldehído al 1% (Vacutest® Kima S, r, 1, TVT-09-50-45), Se recogieron células cancerosas de cultivo celular y se añadió un número conocido a cada tubo, Se usó para las pruebas la línea de células de cáncer de pulmón H226 o H2228 (ATCC), Estas células no fijadas se añadieron a de 1 a 10.000 recuentos de células por tubo,

Antes de la filtración, se transfirió una muestra (7-10 ml) a un tubo FALCON® de 50 ml, que se llenó hasta 20 ml con PBS fría o PBS con de 0,2 a 10 mg/L de fibrina añadida o con medio acuoso que contenía un tampón, Se voltearon Ios tubos manualmente dos veces, Se almacenaron las mezclas a de 50C a 30oC durante de 15 minutos a 7 días dependiendo de la naturaleza del medio acuoso, El tiempo y la temperatura se seleccionaron basándose en la ausencia de ácidos nucleicos liberados de células poco frecuentes y la cantidad de ácidos nucleicos liberados de células frecuentes, La cantidad de ácidos nucleicos liberados de células poco frecuentes y frecuentes se determinó mediante tinción con DAPI y examen microscópico, Los ácidos nucleicos liberados de las células se caracterizaron como liberados,

Se coIocó la muestra diluida en una estación de filtración y se filtró la muestra diluida a través de la membrana de la estación de filtración según un método dado a conocer en la publicación de solicitud de patente estadounidense n,o 2012/0315664. La membrana tenía un tamaño de poro promedio de 8 |im, Durante la filtración, la muestra en la membrana se sometió a un mBar negativo, es decir, una disminución mayor de aproximadamente -30 mBar desde la presión atmosférica, El vacío aplicado varió desde 1 hasta - 30 mBar a medida que el volumen de la muestra se reducía durante la filtración, Fueron permisibles altas caídas de presión dependiendo del depósito y del volumen de muestra y de la tasa de filtración, Después de la filtración, se lavó la membrana con PBS, La muestra no se fijó con formaldehido después de la filtración y no se sometió a permeabilización,

Después de filtración, las membranas o bien se procesaron inmediatamente para extraer y purificar ARN según un método comentado a continuación o bien se almacenaron a -20oc sobre trozos de papel de aluminio en bolsas de plástico con desecante, Para las pruebas, se colocaron las membranas que contenían sangre filtrada y células cancerosas añadidas en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se empujó la membrana hasta el fondo del tubo usando unas pinzas, Se preparó el tampón proteinasa K combinando 240 |il de tampón PKD (Qiagen mat n,o 1034963, Qiagen, Inc,, Valencia CA) y 10 |il de disolución de proteinasa K (Qiagen mat n,01014023, Qiagen, Inc,), Se añadió tampón proteinasa K (250 |il) a cada tubo que contenía membrana. Se usó proteinasa K para liberar ARN de las células. Se incubaron los tubos a 56oc durante 15 min con mezclado ocasional mediante agitación con vórtex. Entonces se incubaron los tubos a 80oc durante 15 min con agitación ocasional con vórtex. Se mantuvieron los tubos a temperatura ambiente mientras se elevaba la temperatura del bloque de calentamiento desde 56oc hasta 80oc. Se empleó la temperatura más alta para revertir la reticulación del ARN con formaldehido.

A continuación, se añadieron 500 |il de tampón RBC (Qiagen mat n.o 1034958, Qiagen, Inc.) al tampón proteinasa K y la membrana en el tubo. Todo el volumen de la mezcla de reacción se cargó en una columna de centrifugación con eliminador de ADNg (Qiagen mat n.o 1030958, Qiagen, Inc.). Esta columna, en combinación con el tampón con alto contenido en sal, se utilizó para permitir la eliminación eficaz del ADN genómico. Las columnas se centrifugaron a 8.000xg por 1 minuto. Se retuvo el material de flujo continuo y se descartó la columna de eliminador de ADNg. Entonces se añadieron 1200 |il de etanol al 100% (Sigma E7023-4L) al material de flujo continuo. El material de flujo continuo más etanol se hizo pasar a través de una minicolumna de centrifugación RNEASY® (Qiagen mat n.o 11011708, Qiagen, Inc.) en lotes de 700 |il de una vez mediante centrifugación a 8.000xg durante 1 min. Se añadió etanol al material de flujo continuo de la columna de centrifugación de eliminador de ADNg para proporcionar condiciones de unión apropiadas para el ARN, donde el ARN total se une a la membrana y los contaminantes se elimina eficazmente por lavado. Se lavó la columna con 700 |il de tampón RW1 (Qiagen mat n.o 1064143, Qiagen, Inc.) mediante centrifugación a 8.000xg durante 1 min y se descartó el flujo continuo.

La disolución de ADNasa se preparó combinando 26 |il de agua (Qiagen mat n.o 1020506, Qiagen, Inc.), 4 |il de tampón de refuerzo de ADNasa (Qiagen mat n.o 1064143, Qiagen, Inc.) y 10 |il de ADNasa I (Qiagen mat n.o 1064141, Qiagen, Inc.). Se añadió disolución de ADNasa (40 |il) a cada columna, que entonces se incubó durante 15 min a TA. Se añadió tampón RPE (Qiagen mat n.o 1017974, Qiagen, Inc.) (500 |il) a cada columna y se lavó mediante centrifugación a 8.000xg durante 1 min. Se descartó el material de flujo continuo. Se añadieron otros 500 |il de tampón RPE a la columna y se lavó mediante centrifugación a 8.000xg durante 1 min. Se descartó el material de flujo continuo. Se colocaron las columnas en tubos de recogida nuevos de 2 ml y se centrifugaron a 20.800xg (velocidad máxima de centrifugación) durante 2 min para retirar los restos de tampón restantes. Se descartó el material de flujo continuo.

Se eluyó el ARN de las columnas situando las columnas en tubos de recogida nuevos de 1,5 ml y añadiendo 30 |il de agua libre de ARNasa directamente a la columna de centrifugación (Qiagen mat n.o 1017979, Qiagen, Inc.), centrifugando entonces las columnas a 8.000xg durante 1 min. Se añadieron otros 30 |il de agua a las columnas y se recogieron mediante centrifugación a 8.000xg durante 1 min.

El ARN purificado se usó inmediatamente en aplicaciones posteriores o se congeló a -20oc o a -70oc. El ADNc se sintetizó usando el kit de síntesis de ADNc ISCRIPT™ (BioRad, n.o de cat. 170-8891, BioRad Laboratories, Inc., Hercules CA). Se combinaron 4 |il de mezcla de reacción 5 x ISCRIPT™, 1 |il de transcriptasa inversa ISCRIPT™ y 15 |il de molde (ARN aislado) más agua para formar la mezcla de reacción de ADNc. La mezcla de reacción de ADNc se incubó en un termociclador (BioRad Laboratories, Inc.) en un tubo de paredes delgadas en el siguiente programa: 1) 25oc durante 5 min, 2) 42oc durante 30 min, 3) 85oc durante 5 min, 4), mantenimiento a 40c. Como control, se prepararon reacciones con y sin transcriptasa inversa. Se prepararon muestras solo con agua como molde como controles adicionales.

Se amplificó el gen diana mediante PCR. Se combinaron 10 |il de HOTSTAR TAQ® Píus Master Mix (Qiagen mat n.o 103962, Qiagen, Inc.), 1 |il de cebadores de ensayo PRIMEPCR™ (BioRad Laboratories, Inc.) y 9 |i de molde más agua para formar la mezcla de reacción de PCR. Se usaron 9 |il del producto de ADNc como molde. Se incubaron las muestras en un termociclador en tubos de paredes delgadas en el siguiente programa: 1) 95oc durante 5 min, 2) 94oc durante 1 min, 3) 60oc durante 1 min, 4) 72oc durante 1 min, 5) ir a la etapa 2 durante 70 repeticiones, 6) 72oc durante 10 min, 7) mantenimiento a 40c. Como control, se llevó a cabo una reacción con solo agua como molde.

Los productos de PCR se detectaron mediante análisis en un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Lake Forest CA) usando el kit DNA 12000 o el kit DNA 1000 (Agilent Technologies). La presencia de una banda en el tamaño de pares de bases esperado indicó que la muestra original contenía ARN del gen diana. La ausencia de una banda en una muestra correspondiente en la que la reacción de ADNc se llevó a cabo sin transcriptasa inversa indicó que la banda es el resultado de detectar el ARN diana y no el resultado de contaminación por ADNg.

Usando el protocolo descrito anteriormente, se aisló ARN de células H2228 incubadas en tubos TRANSFIX® con tampón PBS más BSA, de células H2228 añadidas a sangre de donantes sanos en tubos TRANSFIX® y de células H226 añadidas a sangre de donantes sanos en tubos TRANSFIX®. Se usaron los cebadores de ensayo PRIMEPCR™ para detectar tanto citoqueratina 19 (CK19), un marcador de células cancerosas presente en ambas líneas celulares, como cinasa de linfoma anapíásico (ALK), un marcador de subtipo de cáncer de pulmón presente en las células H2228 y ausente de las células H226. Los resultados se muestran a continuación en la tabla 1 (+++ representa una banda fuerte en el gel en un par de bases (pb) correcto.

Tabla 1

El procedimiento anterior se usó en muestras de sangre completa enriquecidas con de 100 a 100.000 células cancerosas H2228 añadidas, excepto que las muestras no se sometieron a filtración. Se siguió el método del fabricante para 8 ml de muestras de sangre completa sin filtrar (kit midi RNEASY®, Qiagen, Inc.). El método no pudo detectar el a Rn de CK 19 y ALK de las células H2228 incluso hasta 100.000 células/tubo. Sin restringirse a ninguna teoría en particular, la no detección de las células anteriores podría haber sido el resultado de la contaminación de los ácidos nucleicos circulantes y genómicos.

Sin embargo, usando un método según los principios descritos en el presente documento con filtración de la misma muestra de sangre diluida en medio acuoso, se detectaron tan solo 25 células/tubo. Este método también fue eficaz para detectar ARN de KRAS de glóbulos blancos poco frecuentes en la muestra. La detección de ARN puede analizarse entonces para investigar los niveles de expresión de ARN en células poco frecuentes.

Este resultado demuestra que la incubación de la muestra de sangre en un medio acuoso y la posterior filtración da como resultado la detección de ácidos nucleicos procedentes de células poco frecuentes. La tabla 1 anterior muestra adicionalmente que la sensibilidad del método para detectar ARNm aumenta con la incubación de las células en un medio acuoso. En muestras obtenidas en su totalidad con medio acuoso, se detectaron 100 células mientras que, en muestras obtenidas con sangre diluida, la sensibilidad fue de 1000 células.

Se compararon imágenes de muestras de sangre con células cancerosas tratadas según los principios descritos en el presente documento para alterar los ácidos nucleicos de las células sanguíneas dejando intactos los ácidos nucleicos de las células cancerosas. Se tiñó con DAPI el ADN de todas las células aisladas. Se empleó una tinción anti-citoqueratina 8, 18, 19 para las células cancerosas. El núcleo de las células cancerosas conservaba una morfología normal mientras que los núcleos de los glóbulos blancos poco frecuentes aislados eran núcleos altamente anómalos, lo que indica que el tratamiento según los principios descritos en el presente documento altera selectivamente los ácidos nucleicos de los glóbulos blancos.

Además, se procesaron geles de ADN de Agilent (Agilent Technologies) usando muestras con y sin transcriptasa inversa (RT) y con y sin células cancerosas. El ADNc amplificado por PCR se detectó como una banda solo para las muestras que contenían células cancerosas y RT.

Ejemplo 2. Separación de ácidos nucleicos circulantes de células poco frecuentes de ácidos nucleicos de células frecuentes

Se recogieron para las pruebas muestras de sangre completa (aproximadamente 8 ml) de donantes sanos en tubos que contenían K3EDTA y 0,45 ml de conservante TRANSFIX®, que también contenían paraformaldehído al 1% (VACUTEST® KIMA S. r. 1. TVT-09-50-45). Se recogieron células cancerosas de cultivo celular y se añadió un número conocido a cada muestra de sangre. Para las pruebas se usó la línea de células cancerosas SBKr (ATCC). Estas células no fijadas se lisaron mediante sonicación de modo que solo quedaran ácidos nucleicos libres de células y se añadieron a de 104(por ejemplo, 10.000) a 108 recuentos de células por tubo de sangre. Los tubos con sangre se centrifugaron usando una centrífuga y se retiró el plasma (aproximadamente de 3 a 5 ml). Estas muestras de plasma contenían células frecuentes (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica o capa leucocitaria) en concentraciones típicas.

Antes de la filtración, se transfirió una muestra de plasma (3-5 ml) a un tubo FALCON® de 50 ml, que se llenó hasta 20 ml con PBS fría o medio acuoso que contenía tampón. A esto le siguió la adición de 25 |il de partículas magnéticas recubiertas de sílice a cada tubo (Siemens Healthcare Diagnostics, VERSANT® Sample Preparation Reagents). A esto le siguió la adición de 25 |il de partículas magnéticas recubiertas de sílice de 0,2 micrómetros de diámetro a cada tubo (Siemens Healthcare Diagnostics, VERSANT® Tissue Preparation Reagents). Opcionalmente, puede usarse disolución de proteinasa K para inactivar nucleasas que, de otro modo, podrían degradar el ADN o el ARN durante el aislamiento.

Se voltearon los tubos manualmente dos veces. Se almacenaron las mezclas a de 50C a 30oC durante de 15 minutos a 7 días dependiendo de la naturaleza del medio acuoso. El tiempo y la temperatura se seleccionaron basándose en la cantidad de ácidos nucleicos liberados de células poco frecuentes y separados por filtración de los ácidos nucleicos en las partículas de captura. La cantidad de ácidos nucleicos liberados de células frecuentes se determinó mediante tinción con DAPI y examen microscópico.

Se coIocó la muestra diluida en una estación de filtración y se filtró la muestra diluida a través de la membrana de la estación de filtración tal como se muestra en el ejemplo 1, siendo las únicas diferencias que el tamaño de Ios poros de la membrana de filtración osciló entre 0,1 |im y 10 |im y que el vacío aplicado varió desde 1 hasta -80 mBar y que el diámetro de la partícula de captura usada fue de 0,2 |im. La muestra no se fijó con formaldehido después de la filtración y no se sometió a permeabilización.

Después de la filtración, se incubó la membrana y se lavó con un medio acuoso, tal como PBS u otro tampón que pueda liberar ácidos nucleicos de células frecuentes, tales como Ios que contienen tiocianato de guanidina tamponado, etanol, detergentes y proclin-300 al 0,05% (Siemens Healthcare Diagnostics, VERSANT® Sample Preparation Reagents). El tampón lisa las células y desnaturaliza Ios núcleos a la vez que libera ARN y ADN. Las incubaciones y Ios lavados se realizaron a de 250C a 60oC durante de 15 minutos a 2 horas, dependiendo de la naturaleza del medio acuoso. El número de lavados, el tiempo de incubación, el tampón y la temperatura se seleccionaron basándose en la ausencia de ácidos nucleicos liberados de células poco frecuentes y células frecuentes. La cantidad de ácidos nucleicos liberados de células poco frecuentes y frecuentes se determinó mediante tinción con DAPI y examen microscópico. Los ácidos nucleicos liberados de las células se caracterizaron como liberados.

Las membranas o bien se procesaron inmediatamente para extraer y purificar ácidos nucleicos según un método tal como se comenta en el ejemplo 1 o bien se almacenaron a -20oc sobre trozos de papel de aluminio en bolsas de plástico con desecante. En general, las membranas, o partes de las mismas, se trataron con un tampón de elución, tal como TRIS 1 M a pH 8,0 en un vial para extraer Ios ácidos nucleicos de la membrana. Después de la elución, se realizó digestión con ADNasa 1 para eliminar el ADN, puesto que solo se necesitaba el análisis de ARN.

Usando el protocolo descrito anteriormente, se aisló ARN de células SKBR de cáncer de mama lisadas añadidas a sangre de donantes sanos en tubos TRANSFIX®. Se usaron cebadores de ensayo PRIMEPCR™ para detectar el ARN de la citoqueratina 19 (CK19) de estas células lisadas. Los resultados se muestran a continuación en la tabla 2 (+++ representa una fuerte banda en el gel en un par de bases (pb) correcto.

Tabla 2

Este resultado demuestra que la incubación de las partículas con medio acuoso y la posterior filtración da como resultado la detección más sensible de ácidos nucleicos procedentes de células poco frecuentes. La sensibilidad es el resultado directo de menos ARN de células frecuentes en la membrana. La tabla 2 anterior muestra adicionalmente que la sensibilidad del método para detectar ARNm aumenta desde 106 células lisadas hasta 104 células lisadas por ml de muestra de sangre.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método de separación de células poco frecuentes con ácidos nucleicos intactos de células frecuentes en una muestra de sangre completa, plasma o suero que comprende las células poco frecuentes y células frecuentes, comprendiendo el método:

(a) combinar la muestra con un medio acuoso

que tiene un pH en el intervalo de 5 a 8 en una cantidad de 10 a 100 ml de medio acuoso por 10 ml de muestra;

(b) mantener la combinación durante un periodo de 15 minutos a 7 días y a una temperatura de 50C a 30oC para liberar selectivamente ácidos nucleicos de las células frecuentes, pero no de las células poco frecuentes, y

(c) someter la muestra a filtración para separar células poco frecuentes de células frecuentes;

en el que las células poco frecuentes son células cancerosas.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende además aislar ácidos nucleicos intactos procedentes de células poco frecuentes, en el que

en la etapa a) la muestra se combina adicionalmente con partículas de captura de ácido nucleico, y en el que en la etapa b) la combinación se mantiene durante un periodo de tiempo y a una temperatura para liberar selectivamente ácidos nucleicos de las células frecuentes, pero no de las partículas de captura, y en el que

en la etapa c) Ios ácidos nucleicos de las partículas de captura se separan de las células frecuentes, y en el que el método comprende, además:

(d) extraer ácidos nucleicos intactos de las partículas de captura.

3. Método según la reivindicación 1, que comprende además determinar uno o más ácidos nucleicos en células poco frecuentes mediante (d) identificar uno o más de Ios ácidos nucleicos de las células poco frecuentes.

4. Método según la reivindicación 1 o 3, en el que la muestra se trata con un agente de fijación antes de combinar la muestra con el medio acuoso.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la filtración comprende disponer la muestra sobre un lado de la matriz porosa y aplicar presión a la muestra dispuesta.

6. Método según la reivindicación 5, en el que la presión aplicada es de aproximadamente 1 milibar a aproximadamente 30 milibar y en el que el tamaño de poro de la matriz porosa es de aproximadamente 0,1 |im a aproximadamente 100 |im.

7. Método según la reivindicación 1, que comprende además extraer ácidos nucleicos intactos de las células poco frecuentes.

8. Método según la reivindicación 3, en el que la identificación comprende poner en contacto Ios ácidos nucleicos con uno o más agentes de identificación específicos para el uno o más ácidos nucleicos.

9. Método según la reivindicación 3, en el que Ios ácidos nucleicos se extraen de las células poco frecuentes y Ios ácidos nucleicos extraídos se someten a una o más técnicas de amplificación para amplificar ácidos nucleicos.