CN109517895B - 通过过滤从生物样品提取或分离罕见细胞的多种分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通过过滤从生物样品提取或分离罕见细胞的多种分析方法。具体地，提供一种用于安全且非介入性产前诊断遗传疾病的方法，包括：从孕妇的含有滋养层罕见细胞的宫颈外口(子宫外颈)收集样品；免疫标记和/或在具有阿尔新蓝的溶液中染色细胞；使所述样品通过过滤器分离、提取或浓缩滋养层罕见细胞，其中所述过滤器具有回收滋养层罕见细胞的孔径、孔密度或其他物理特性；对从(c)中回收的细胞进行免疫标记和/或分子分析以鉴定滋养层罕见细胞并确定遗传疾病的存在或不存在。本发明还提供了一种试剂盒。

Description

通过过滤从生物样品提取或分离罕见细胞的多种分析方法
本申请是发明名称为“通过过滤从生物样品提取或分离的罕见细胞的多种分析方法”、申请日为2013年5月23日的国际专利申请PCT/EP2013/060671进入中国国家阶段的发明专利申请CN201380039782.3的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求在35U.S.C.§119(e)下于2012年5月24日递交的U.S.临时申请号61/651,437的优先权，该申请通过引用整体并入本文中。
技术领域
本发明涉及通过过滤从生物样品中分离罕见细胞，并且随后对这些罕见细胞和它们的组分进行分析。罕见细胞具有使其与其它种类的细胞不同的特征，或者以使其与其它种类的细胞不同的频率出现在生物样品中。罕见细胞的类型包括罕见的肿瘤或罕见的癌症细胞，罕见种类的内皮细胞，罕见的胚胎细胞和罕见的被感染的白血细胞(白细胞)。
背景技术
罕见细胞。罕见细胞以绝对低或相对低的数量，存在于从人类或动物获得的生物样品。罕见细胞的存在经常与特定疾病、障碍或症状有关。例如，罕见肿瘤细胞可以在具有肿瘤或癌症的受试者的血液中发现。
罕见细胞的种类。存在很多不同种类的罕见细胞，并且罕见细胞非排它性地可以是：
上皮细胞和它们的祖细胞，间充质细胞和它们的祖细胞，成熟和不成熟的内皮细胞和它们的祖细胞，成纤维细胞和它们的祖细胞，以及黑素细胞和它们的祖细胞；
单核细胞和巨噬细胞和它们的祖细胞，活化的淋巴细胞和它们的祖细胞，浆细胞和它们的祖细胞，嗜曙红粒细胞和它们的祖细胞，嗜碱性粒细胞和它们的祖细胞，及巨核细胞和它们的祖细胞；
任何亚型的干细胞；
任何来源和类型的胚胎细胞，包括淋巴瘤细胞，红细胞，骨髓细胞，胚胎干细胞，诸如细胞滋养层和合胞体滋养层的滋养层细胞，及胚细胞；以及
任何来源和类型的肿瘤细胞，及任何分化程度的肿瘤细胞，包括肿瘤干细胞，肿瘤微血栓，聚集的肿瘤细胞，任何类型的集合的肿瘤细胞(collective tumor cell)，以及任何来源和类型的非典型性细胞。
一些种类的罕见细胞是病变细胞。这样的病变细胞的实例包括肿瘤或癌症细胞，诸如源自或来源于肺癌、前列腺癌、结肠癌、乳癌、胰脏癌、肾癌、肝癌、胃癌、食道癌，以及任何类型的癌(carcinoma)、肉瘤、骨髓瘤、黑素瘤、骨肉瘤、神经母细胞瘤、白血病和淋巴瘤的细胞。
罕见细胞也与其中罕见细胞通过病变在生物样品中的数量增加或减少的病症相关。这样的罕见细胞包括：
病理上较高数量地存在于患癌症的患者或患心血管障碍(如心脏病发作)的患者的血液中的内皮细胞；
携带细胞内病毒、细菌或其它病原体，如HIV、HBV、HPV、志贺氏杆菌、利什曼虫、结核病菌感染的单核细胞、感染的巨噬细胞、感染的淋巴细胞、活化的淋巴细胞；以及
携带与遗传疾病相关的突变的细胞，如来自受遗传障碍影响的胚胎的胚胎细胞，如非整倍性21、13、18、XXY、XO，地中海贫血，囊性纤维化，脊髓性肌萎缩，杜氏病(Duchenne’s disease)，亨廷顿氏病(Huntington’s disease)等等，以及携带遗传突变或与易患如下限定的病变相关联的分子特征的细胞：如病毒性感染、炎症、慢性退行性疾病、阿尔茨海默、糖尿病、代谢紊乱。
罕见细胞还可以与非病变症状，诸如怀孕相关联。
罕见细胞可以典型地代表在生物流体中从约103至约1010个细胞，从约104至约1010个细胞，从约105至约1010个细胞，从约106至1010个细胞，从约107至约1010个细胞，或甚至从约108至约1010个细胞的细胞群中的一个细胞。罕见细胞可以典型地代表在1mL生物流体中小于500个细胞，1mL生物流体中小于200个细胞，1mL生物流体中小于100个细胞，1mL生物流体中小于50个细胞，或甚至1mL生物流体中小于10个细胞。例如，已知循环的肿瘤细胞(CTC)典型地为每一毫升血液中的约6x106个白细胞，约2x108个血小板和约4x109个红细胞中存在1至10或1至500个CTC。
分离罕见细胞的现有方法。
可以从生物样品中提取或分离罕见细胞。提取的细胞是从液体样品中提取的细胞，且没有与其它细胞分离。经分离的罕见细胞是与液体样品中存在的其它种类的细胞分离的罕见细胞。从生物样品中提取或分离的罕见细胞对非罕见细胞的比例有差异，因此经提取或分离的罕见细胞的纯度可以是可变的。
已经提出了几种从生物样品中提取或分离罕见细胞的方法；尤其已经报道了几种从血液中分离肿瘤或胚胎细胞的方法。但是，这些方法没有解决罕见细胞提取或分离的三重挑战：(i)尽可能少的丢失或没有丢失，(ii)尽可能少的选择性偏差或没有选择性偏差地进行罕见细胞的提取或分离；以及(iii)以使它们能够在多重分析程序中容易或同时使用的方式，进行罕见细胞的提取或分离。
仅重新获得样品中的一些罕见细胞的方法，在数量上损害了分离或提取的罕见细胞在随后的分析程序中的应用。这些方法还可以引入选择性偏差。
当提取或分离方法导致丢失样品中一种或几种类型的选择的罕见细胞时，则出现选择性偏差。例如，通过使罕见肿瘤细胞与抗上皮细胞的抗体结合，从血液样品中分离肿瘤细胞的方法造成不表达与抗体结合的上皮细胞抗原的罕见肿瘤细胞的丢失。
苛刻的提取或分离程序，或以其它方式改变分离或提取的罕见细胞的可检测特征的程序，折中解决了它们在随后分析程序中的应用。
罕见细胞的诊断重要性。预期罕见细胞的检测和表征及它们在诊断和治疗中的应用，将在人类和兽医临床实践中和研究中越来越重要。罕见细胞在个性化医学或诊疗，对患者进行基于他或她的特定遗传特征和他或她的罕见细胞的特征的个体诊断疗法中的应用是特别有价值的。在这种设置中，罕见细胞需要通过多种途径进行分析，该多种途径提供他们的诊断鉴定和进行大规模表征。例如，通过旨在检测具有预后和/或治疗诊断价值的基因突变的分子分析，可以对从患癌症的患者血液中分离的罕见细胞进行表征。但是，如果仅进行靶向基因突变的分子分析，而没有旨在诊断血液中存在或不存在肿瘤细胞的分析，则可能偏差地影响测试结果。事实上，如果从给定患者的血液中分离的罕见细胞不包括肿瘤细胞，则在分离的罕见细胞中不存在基因突变将不表明循环肿瘤细胞中不存在基因突变。因此，为了获得用于选择定向治疗的可靠的信息，以追踪它们的效果和检测可能的药物抗性，需要对从生物样品中提取或分离的罕见细胞进行多种分析。
进一步地，从血液或其它生物样品中提取或分离的罕见细胞可以用作通过外科手术或半手术方法获得的样品的替代物，该外科手术或半手术方法包括非排它性的外科和半外科介入、活检、腹腔穿刺术(laparocentesis)、胸腔穿刺、腹腔穿刺、脊椎穿刺、羊膜穿刺、绒毛膜取样和脐穿刺。在这种设置中，罕见细胞代表珍贵的材料，需要通过用于诊断和/或治疗诊断的应用和用于大规模分子和/或遗传表征的多种分析获取信息。
肺癌来源的罕见细胞。肺癌是最普遍的赘生物，并且是全世界肿瘤相关死亡率的主要原因[1-5]。尽管在切除的肺癌的治疗和转移肿瘤的更有效治疗中取得了最近的进展，但患肺癌的患者的治愈率仍然很低。但是，最近发现了在肺癌中的致癌性驱动突变，以及定向治疗的日益发展，示出在晚期患者中的新的令人鼓舞的结果[6-8]。在这些疗法中，使用了吉非替尼(gefitinib)和埃罗替尼(erlotinib)，吉非替尼和埃罗替尼针对表皮生长因子受体(EGFR)的酪氨酸激酶抑制剂，显示出在10％至20％的腺癌中的酪氨酸活化突变。最近，在小部分肺癌患者中，鉴定出涉及间变性淋巴瘤激酶(ALK)(2p23)和棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)(2p21)基因的基因组改变，该小部分肺癌患者对ALK小分子抑制剂(克唑替尼(crizotinib))有显著有利的应答[7,10-13]。根据在大多数肿瘤中大多数没有KRAS和EGFR相关突变的系列，在1％至7％的非小细胞肺癌(NSCLC)中，发现了ALK基因重排[10,12-14]。具体的组织学特征表征了该小部分ALK阳性的肺腺癌，显示具有固体或腺泡生长模式、多孔结构、存在粘液细胞(印指环状细胞(signet-ring cell)或杯状细胞)、丰富的细胞外粘液、缺乏贴壁状生长(lepidic growth)及缺乏明显的核多形性[14]。此外，在大部分系列中，患ALK重排的肿瘤的患者年纪较小，更常为男性，并且是从不吸烟者/之前的轻度吸烟者[12,14]。
根据系列和方法，可以在超过40％的肺癌患者中分离循环的肿瘤细胞(CTC)[15-17]。此外，肺癌患者的预后(疾病晚期和早期)与CTC的存在和数量相关[15,16]。可以通过不同的直接和间接的方法分离CTC[18,19]。已经证明，在NSCLC患者中分离的CTC中存在基因组改变，尤其是在EGFR基因中出现的突变[20]。
发明人之前已经证明了，甚至在正在经历肺癌手术的患者的早期疾病中，也能够通过不同的方法分离CTC[15,21]。此外，CTC的存在和数量与较差的预后相关[15]。有趣的是，通过使用根据它们的大小分离CTC的直接方法(ISET，通过上皮肿瘤细胞的大小进行的分离)，发明人定义了恶性细胞病理学标准，该恶性细胞病理学标准允许对具有恶性特征的CTC进行良好的表征[22,23]。而且，通过对从NSCLC患者中通过ISET分离的CTC应用免疫细胞化学(ICC)途径，我们组和另一组示出了CTC的可变数量显示出上皮-间叶细胞转化(EMT)的表型[17,21,24,25]。
还没有报道，对从肺癌患者分离的CTC中的ALK-基因重排进行测定。这是意义重大的临床目标，用于非介入性预筛选肺癌患者，以避免与肺活检和肿瘤组织去除相关的潜在的发病。
滋养层的罕见细胞。已经报道了从母体血液中分离滋养层细胞的非介入性方法，例如如在2010年1月26日颁布的U.S.专利7,651,838中所述的方法。但是，需要通过完全非介入性且安全(例如，没有引起流产的风险)的途径，从子宫颈样品中获得滋养层细胞的方法。这样的方法应当始终如一地从怀孕女性中获取滋养层细胞，为了使该途径能用于非介入性地在产前诊断遗传缺陷、疾病或障碍(Imudia AN,Kumar S,Diamond MP,DeCherneyAH,Armant DR.Transcervical retrieval of fetal cells in the practice of modernmedicine:a review of the current literature and future direction.FertilSteril.2010:93:1725-30)。例如，通过提取游离的DNA，并且通过新一代测序分析游离的胚胎DNA，可以实现在怀孕女性中诊断胚胎21三体综合征。如果游离的胚胎DNA的量太少，则不能获得与存在或不存在胚胎非整倍性有关的可靠结果。因此，可以分析循环的胚胎细胞，以进行非介入性产前诊断。U.S.专利7,651,838描述了通过非介入性方法从血液中分离滋养层细胞。可以从子宫颈样品中分离或提取滋养层细胞，但是不知道如何始终如一且非介入性地(没有引起流产的风险)从子宫颈样品、子宫颈粘液或从自粘膜获得的样品中获得滋养层细胞(Imudia AN,et al Fertil Steril.2010:93:1725-30)。
发明人试图通过如下方法解决上述问题：使用过滤和本文所公开的其它分离和分析程序，从诸如血液和粘膜分泌物的生物样品中提取罕见细胞。
发明内容
本文公开的方法解决了这些问题，并且使用过滤作为最适当的方式挑战了从生物样品中提取或分离罕见细胞。在通过过滤进行提取或分离之后，罕见细胞存在于适于进行多种或甚至同时的分析程序的症状中。该方法有效地从生物样品分离或提取罕见细胞，鉴定罕见细胞，并且然后为了诊断目的而分子表征罕见细胞，以选择、引导、监控治疗，并且尤其以选择定向治疗，并且监控对该定向治疗的应答和/或抗性。
本发明包括分析或表征罕见细胞的各种模式。这些模式包括：(i)为了诊断或治疗诊断的目的，使用定量分析和定性分析通过过滤分离的罕见细胞，并且随后选择疗法；(ii)“定性分析”包括对通过过滤分离的相同罕见细胞进行多种分析。对相同样品进行的多种分析避免了与其中罕见细胞是不丰富的症状相关的问题，或与含少量罕见细胞的生物样品相关的问题；(iii)“定性分析”包括通过过滤分离未固定(新鲜)的罕见细胞，允许进行罕见细胞的培养和RNA分析；(iv)使用通过过滤分离的循环的肿瘤细胞，用于侵入性癌症的早期诊断；以及(v)使用从子宫颈粘膜样品中分离的滋养层细胞，用于遗传障碍的非介入性产前诊断。
在它的一个方面中，本发明是用于对与罕见细胞相关的症状、障碍或疾病进行鉴定、诊断或提供预后的方法，所述方法包括：(a)通过使生物样品通过过滤器分离或提取罕见细胞，并且在所述过滤器上获取分离的罕见细胞；其中，所述过滤器具有保留罕见细胞但允许其它种类的细胞穿过的孔径、孔密度或其它物理特征；(b)确定所述分离或提取的罕见细胞的细胞形态，和/或对所述分离的罕见细胞进行免疫标记，和/或对所述分离的罕见细胞进行分子分析；(c)基于分离或提取的罕见细胞的细胞形态和/或免疫标记和/或分子分析，鉴定与罕见细胞存在和/或数量和/或特征相关的症状、障碍或疾病和/或症状、障碍或疾病的阶段。该方法可以用于分离、提取、浓缩或其它纯化在感兴趣的生物样品中的罕见细胞。生物样品可以是含有或怀疑含有罕见细胞的任何生物样品。这样的生物样品包括血液或其它细胞外流体、除了血液之外的生物流体，诸如羊水，眼房水和玻璃体液，胆汁，血清，血浆，母乳，脑脊液，耵聍(耳屎)，内淋巴，外淋巴，女性射精，胃液，粘液(包括从粘膜收集的鼻腔引流、痰和其它材料)，腹膜液，胸膜液，唾液，皮脂(皮肤油)，精液，汗，眼泪，阴道分泌物，呕吐物和尿液。这样的生物样品优选非介入性地获得，但是样品也可以从活检组织或从由固体或半固体的组织样品制得的细胞悬浮液获得。
生物样品可以从感兴趣的受试者获得，诸如已知患癌症或肿瘤，怀疑患癌症或肿瘤，或有发展为癌症或肿瘤风险的受试者。样品也可以从如下受试者获得，该受试者已知患有与罕见细胞相关或由罕见细胞引起的任何症状、障碍或疾病，怀疑患有与罕见细胞相关或由罕见细胞引起的任何症状、障碍或疾病，或有发展与罕见细胞相关或由罕见细胞引起的任何症状、障碍或疾病的风险，诸如非癌性增殖的症状、障碍或疾病。例如，生物样品可以从如下受试者获得，该受试者：患有炎症和/或退行性症状、障碍或疾病，或怀疑患有或有患炎症和/或退行性症状、障碍或疾病的风险；患有心血管症状、障碍或疾病，或怀疑患有或有患有心血管症状、障碍或疾病的风险；或者含有感染症状、障碍或疾病，或怀疑患有或有患感染症状、障碍或疾病的风险。
在上面公开的方法中，在步骤(a)中，通过使生物样品穿过聚碳酸酯过滤器、PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)或其它适当的多孔的过滤器或材料，可以分离、提取、浓缩或其它方式的纯化罕见细胞，并且获取在聚碳酸酯过滤器上的罕见细胞。
生物样品可以是：新鲜的，诸如刚从受试者中提取的生物样品；储存的样品，诸如保藏的、冷藏的或冷冻的样品；或，进行另一处理(诸如固定)的样品。依赖于生物样品的类型，可以使用溶粘蛋白剂、抗凝血剂、蛋白酶处理生物样品，或者使用溶解剂处理生物样品，该溶解剂在保藏样品中的罕见细胞的条件下，选择性去除生物样品中的特定类型的细胞。
在穿过过滤器之前，生物样品可以被稀释或经其它方式的处理，以便于进行罕见细胞的分离、提取、浓缩或纯化。
在进一步进行如步骤(b)的分析或用于培养之前，可以将通过如本文所述的过滤方法分离、提取、浓缩或其它方式纯化的罕见细胞转移至支撑载体。
在通过过滤分离或提取罕见细胞之后，可以收集各个罕见细胞，用于分子分析；或者，可以收集通过过滤从生物样品中分离或提取的多个罕见细胞或所有的罕见细胞，用于(b)中的分析。此外，在进行(b)中的分析之前，可以培养或扩增分离或提取的罕见细胞。例如，为了确定与没有经过相同处理的罕见细胞相比，罕见细胞对药物或试剂的应答，可以在存在或不存在特定药物或试剂(诸如生物试剂、化学试剂或放射性试剂)的条件下培养罕见细胞。该方法可以用于选择靶向从特定患者分离的罕见细胞的治疗，并且监控患者对治疗的应答，或者监控对使用特殊药物或试剂的治疗的抗性发展。
在(b)中的分析之前，可以在用于分离罕见细胞的过滤器上，原位固定或染色分离或提取的罕见细胞，或者在从过滤器上移除之后，固定或染色分离或提取的罕见细胞。例如，在过滤器上或在另一基底上进行染色或免疫染色之后或之前，可以通过原位分子分析，在(b)中分析分离或提取的罕见细胞；或者，(b)可以包括，在过滤器上或在另一支撑载体上，对分离或提取的罕见细胞进行原位细胞形态分析，其中分离的罕见细胞(或随后经培养或繁殖的罕见细胞)被转移至该另一支撑载体。还可以通过其它不需要将罕见细胞锚固至支撑载体的其它方法，分析或评价分离或提取的罕见细胞。
在本文公开的方法中，(b)可以包括，在过滤器或另一支撑载体上对分离或提取的罕见细胞的蛋白、核酸或其它组分进行原位分子分析，罕见细胞或培养的罕见细胞被应用至该另一支撑载体上。例如，(b)中的分子分析可以包括对分离或提取的罕见细胞的蛋白、肽或多肽进行分子分析；对分离或提取的罕见细胞的DNA、RNA或微小RNA(microRNA)进行分子分析；或对罕见细胞中除多肽或核酸的其它组分进行分子分析。
本文公开的方法还可进一步包括：(b1)在细胞形态分析、免疫标记或原位分子分析之后，使分离或提取的罕见细胞的图像可视化；和/或(b2)在细胞形态分析、免疫标记或原位分子分析之后，记录分离或提取的罕见细胞的图像。
在另一实施方式中，本发明涉及一种检测罕见细胞的存在或不存在的方法，包括：(a)通过使生物样品穿过过滤器，分离、提取、浓缩或其它方式地纯化罕见细胞，并且在过滤器上获取分离的罕见细胞；其中，所述过滤器具有保留罕见细胞但允许其它种类的细胞穿过的孔径、孔密度或其它物理特征；(b)任选地，培养分离或提取的罕见细胞；(c)任选地，固定或染色分离或提取的罕见细胞，或任选地培养分离或提取的罕见细胞；(d)通过免疫标记，和/或原位分子分析，和/或对罕见细胞DNA、RNA和/或微小RNA的分子分析，和/或对罕见细胞蛋白分子的分子分析，分析来自(a)、(b)或(c)的分离或提取的罕见细胞。该方法可以使用上述的相同种类的生物样品，并且可以经如上所述的稀释生物样品或预处理生物样品之后，分离或提取罕见的细胞。在过滤之后的罕见细胞还可以被固定，或被新鲜地使用，或经历上述的其它处理或步骤。在步骤(d)中，分离、浓缩、提取或其它方式地纯化的罕见细胞可以被裂解或完整地使用。
当分离或提取的罕见细胞被裂解时，(d)可以包括检测裂解的罕见细胞中与症状、障碍或疾病相关的突变的蛋白和/或突变的RNA和/或DNA突变。例如，罕见细胞可以被裂解以分离被包含在罕见细胞内的多肽或其它免疫学组分，被裂解以分离、浓缩或其它方式地纯化要被检测的组分，或被裂解以分离用于分子分析的核酸。
该方法可进一步涉及选择个性化医疗的靶向治疗，以基于对裂解的罕见细胞中的突变DNA，和/或突变RNA和/或突变蛋白的检测，评价治疗效果或检测对治疗的可能的抗性。例如，在裂解罕见细胞之后，(d)可涉及检测在裂解的罕见细胞中的ALK突变的存在或不存在；检测在裂解的罕见细胞中的ALK突变的存在或不存在，其中，所述方法进一步包括根据治疗效果，为受试者选择治疗，或基于ALK突变的存在或不存在，检测对治疗的抗性；检测裂解的罕见细胞中的K-RAS和/或EGFR突变的存在或不存在，其中所述方法进一步包括根据治疗效果，为受试者选择治疗，或基于K-RAS和/或EGFR突变的存在或不存在，检测对治疗的抗性；或检测裂解的罕见细胞中的B-RAF和/或HER2突变的存在或不存在，其中所述方法进一步包括根据治疗效果，为受试者选择治疗，或基于B-RAF和/或HER2突变的存在或不存在，检测对治疗的抗性。
本发明还考虑了个性化药物治疗，包括使用在不同时间，从同一受试者获得的生物样品，重复上面公开的方法。例如，在使用药物或其它试剂治疗之前，可以从受试者分离罕见细胞样品；在治疗过程中可以再次或几次地从受试者分离罕见细胞样品；并在治疗已经终止之后，再次从受试者分离罕见细胞样品。这允许对治疗效果进行纵向评价。
因此，在治疗之前和之后，在症状的治疗过程中的不同点，或在与罕见细胞相关的症状、障碍或疾病的不同治疗方案的过程中，从同一患者获得生物样品。该个性化药物治疗还可以涉及(e)和/或(f)，包括进一步对比在不同时间获得的样品之间的罕见细胞的数量，以确定治疗方案的效果或检测对治疗方案的抗性；其中，检测到的罕见细胞的相对数量的下降，表明治疗方案的相对效果；并且，其中，检测到的罕见细胞的相对数量的升高，表明对治疗效果的抗性或没有效果；并且任选地，(f)基于(e)选择对受试者有效的个性化靶向治疗。
例如通过染色，通过物理形态，或通过对它们的蛋白、核酸或其它组分的分子分析，可以免疫地确定罕见细胞的种类、同一性或来源。例如，(d)可以包括分析分离或提取的罕见细胞，包括确定罕见细胞的上皮至间叶细胞转化的状况；可以包括分析分离或提取的罕见细胞，包括确定罕见干细胞的状况；或者，可以包括通过确定罕见细胞是否具有与转移或浸润性细胞相关的基因表达标志，或罕见细胞是否表达与转移或浸润相关的决定因子，分析分离或提取的罕见细胞。
本文所述的方法还可以进一步包括，基于(d)进行与罕见细胞相关的症状、障碍或疾病的早期诊断，或对症状进行预测。例如，如上所述的方法可涉及，基于(d)，进行与罕见细胞相关的癌症和/或浸润性癌症的早期诊断；可以涉及，进行器官的早期诊断，癌症和/或浸润性癌症来源于该器官；或者，可涉及基于(d)，对与罕见细胞相关的感染症状、障碍或疾病进行早期诊断。
本文公开的方法可进一步包括：评价候选药物或候选治疗对罕见细胞的分子特征的效果；以及，选择与没有给予药物或治疗的对照相比，降低受试者体内罕见细胞数量的药物或治疗；以及，选择与对照相比，降低罕见细胞相对数量或改变罕见细胞的分子或免疫特征的药物或治疗。
本文公开的方法还进一步包括：评价受试者发展出与罕见细胞相关的症状、障碍或疾病的倾向性和/或风险，其中，与基线或对照值相比，罕见细胞相对数量的增加表明发展出所述症状、障碍或疾病的倾向性或增加的风险；或其中，与基线或对照值相比，罕见细胞中的分子或免疫变化表明发展出所述症状、障碍或疾病的倾向性或增加的风险。例如，它们可以包括，评价受试者发展出遗传症状、障碍或疾病；癌症，肿瘤或赘生物症状，障碍或疾病；或感染症状，障碍或疾病的倾向性和/或风险。
除了本文公开的方法和办法，本发明还涉及一种试剂盒，该试剂盒包括以下组成部分中的至少一种：用于从生物流体提取或分离罕见细胞的一种或多种过滤器；一种或多种缓冲液、稀释剂，或其它用于在过滤之前处理生物流体的试剂；用于在从生物流体提取或分离罕见细胞之后悬浮、洗涤或其它方式处理罕见细胞的一种或多种缓冲液；用于将分离或提取的罕见细胞从过滤器转移到不同的支撑载体的一种或多种转移缓冲液；一种或多种细胞形态和/或细胞化学染色试剂或其它细胞染色剂或对应的缓冲液；用于免疫标记罕见细胞的一种或多种抗体或其它试剂或对应的缓冲液；用于在过滤器或其它支撑载体上原位分析罕见细胞的一种或多种试剂；用于裂解罕见细胞的一种或多种溶解剂或裂解缓冲液；用于对罕见细胞蛋白进行分子分析的一种或多种抗体或其它试剂或对应的缓冲液；一种或多种探针、引物、核苷酸、酶或用于对罕见细胞的核酸进行分子分析(包括PCR)的其它试剂。
本发明还涉及组合物，该组合物包括通过使生物样品穿过过滤器，并且在过滤器上获取分离的罕见细胞而分离、浓缩、提取或其它方式纯化的一种或多种罕见细胞；其中，所述过滤器具有保留罕见细胞但允许其它种类的细胞穿过的孔径、孔密度或其它物理特征，以及包括罕见细胞的过滤器或其它支撑载体。
可以组装试剂盒以使上述方法更容易，所述试剂盒包括完成过滤步骤和多种分析中各种分析的工具、设备和/或试剂。
附图说明
图1A.A(病例1)和B(病例2)。A1和B1。循环的肿瘤细胞示出颜色深且细胞质的染色(得分3+)，且一些膜强化(箭头)(使用5A4mAb的ALK免疫染色，免疫过氧化物酶，原始放大x1000；条：16μm)。A2和B2。循环细胞的核与双色2p23LSI ALK座位特异性的分裂探针(splitprobe)杂交。两种探针(3’，红色；5’，绿色)示出红色和绿色信号(箭头)的鲜明分离，表明2p23ALK基因座的重排。探针给出核内重叠的信号，且没有重排(箭头)。还观察到(星号)分离的3’信号(红色)(原始放大x 1000；条：16μm)。A3和B3。通过ISET方法分离的循环细胞示出恶性细胞形态标准(原始放大x 1000；MGG染色；条：16μm)。C.在组织肿瘤中具有阴性FISHALK和阴性IHC ALK的一位患者。C1.循环肿瘤细胞示出没有染色(得分0)(使用5A4mAb的ALK免疫染色，免疫过氧化物酶，原始放大x 1000；条：16μm)。C2.循环细胞的核与双色2p23LSIALK位点特异性的分裂探针杂交。两种探针(3’，红色；5’，绿色)给出核内重叠的信号，且没有重排(箭头)。在这些肿瘤细胞中没有检测到分裂信号(原始放大x 1000；条：16μm)。C3.循环细胞示出通过ISET方法分离的恶性细胞形态标准(原始放大x 1000；MGG染色；条：16μm)。D.通过ISET方法分离的H22213细胞。使用5A4mAb免疫染色的D1ALK(免疫过氧化物酶，原始放大x 1000)示出颜色深且细胞质的染色(得分3+)，且一些膜强化(箭头)。D2.在H2228肿瘤细胞系使用双色2p23LSI ALK座位特异性分裂探针进行的FISH刺入外周血液中，并且通过ISET方法进一步分离。两种探针(3’，红色；5’，绿色)示出红色和绿色信号(箭头)的鲜明分离，表明2p23ALK基因座的重排。探针给出核内的重叠信号，且没有重排(箭头)。还观察到(星号)分离的3’信号(红色)(原始放大x 1000；条：16μm)。D3.血液过滤之后经MGG染色的H2228细胞(原始放大x 1000；MGG染色；条：16μm)。
图1B.A(病例3)、B(病例4)和C(病例5)。A1-C1.循环的肿瘤细胞示出颜色深且细胞质的染色(得分3+)，且一些膜强化(箭头)(使用5A4mAb进行的ALK免疫染色，免疫过氧化物酶，原始放大x 1000；条：16μm)。A2-C2.循环细胞的核与双色2p23LSI ALK位点特异性的分裂探针杂交。两种探针(3’，红色；5’，绿色)示出红色和绿色信号(箭头)的鲜明分离，表明2p23ALK基因座的重排。探针给出核内重叠的信号，且没有重排(箭头)。还观察到(星号)分离的3’信号(红色)(原始放大x 1000；条：16μm)。A3-C3.循环细胞示出通过ISET方法分离的恶性细胞形态标准(原始放大x 1000；MGG染色；条：16μm)。
图2：具有恶性特征的循环的非血液细胞的细胞形态分析–在患COPD的患者中使用ISET方法检测到的循环的肿瘤细胞(CTC)。
(A)和(B)在已经发展出肺癌的患COPD的患者中，通过ISET方法分离的CTC和通过MGG染色方案鉴定的CTC。(A)具有恶性细胞形态特征的分离的CTC(双箭头：过滤器的孔)。(B)由具有恶性细胞形态特征的9种CTC构成的集群(CTM)(原始放大x 1000；条：8μm；双箭头：过滤器的孔)。
(C)和(D)对于患COPD患者，使用ISET方法在过滤的血液上观察到的免疫染色的CTC。(C)仅在患COPD的患者中的强表达角蛋白抗原的CTC。(D)在患COPD的患者中的共表达角蛋白和波形蛋白抗原的CTC(原始放大x 400；条：16μm；使用角蛋白抗体(KL1)进行的免疫磷酸酶染色和使用抗波形蛋白抗体进行的免疫过氧化物酶染色；双箭头：过滤器的孔)。
图3：使用ISET在子宫颈样品中检测细胞滋养层细胞(A)和合胞体滋养层(B)。通过具有信息标记物D5S615(A)和D21S11(B)的STR-基因分型证实分离细胞的胚胎性质。
具体实施方式
样品。生物样品包括：非排它的生物流体，包括非排它的静脉和动脉血液，淋巴液，尿液，精液，腹水，脑脊液，胸膜液，痰，吐出物，鼻液，关节液，泪腺液，来自尿道和输尿管的液体，胆管流体，胰腺流体，胃液，肠液，直肠流体，阴道流体；从粘膜和器官非排它地收集的样品，该粘膜和器官如口，喉，咽，子宫，子宫颈，阴道，食道，胃，小肠和大肠的粘膜；通过活检或其它手术介入非排它地收集的样品，包括非排它地来自乳房，前列腺，肝脏，肺，骨髓和任何其他器官的样品。
过滤器和过滤。可以用于分离或提取罕见细胞的过滤器，非排它地包括聚碳酸酯、PET(聚对苯二甲酸乙二酯)或其它材料的膜，具有适于提取或分离所定义的罕见细胞的厚度和孔径和密度。在公布的U.S.专利申请US 2009/0226957中，Paterlini-Brechot公开的过滤器、过滤装置、过滤方法、缓冲液和其它设备和供应由此通过引用并入本文中。
这些包括：(i)涉及包括使用至少一种基本过滤区的过滤器的方法，由此每一基本过滤区具有限定的表面积；以及(ii)选择每一基本过滤区的表面积和基本过滤区的数量作为要被过滤的液体的类型、要被分离的生物颗粒的类型和要被过滤的液体的体积的函数。
相应地，本发明涉及分离生物颗粒和含该生物颗粒的流体的方法，用于纯化或分析及可能地用于诊断，所述方法包括通过过滤器至少一个垂直过滤阶段，该过滤器的孔隙度适于要被分离的生物颗粒的性质，以便所述生物颗粒被过滤器保留住，其特征在于，使用的过滤器包括至少一个基本过滤区，每一基本过滤区具有有限的表面，并且其特征在于，根据要被过滤的流体的性质、要被分离的生物颗粒的性质和要被过滤的流体的体积，选择每一基本过滤区的表面和基本过滤区的数量。
所述方法的每一基本过滤区的表面等于直径在0.6cm至3cm的圆盘的表面，并且选择基本过滤区的数量，以便过滤至过滤表面的流体体积的比率小于40ml/cm2，且优选大于0.14ml/cm2。
优选地，每一基本过滤区的表面等于直径大于或等于0.8cm的圆盘的表面。
优选地，过滤器具有校正至3μm至100μm之间大小的孔，并且具有在3x 103至5x 106个孔/cm2之间的孔密度。
优选地，通过0.05巴至1巴之间的压力减小，及可能地，小于1巴的压力增加，进行过滤。
为了进行过滤，优选使用形成标记的过滤器，该标记适于与通过定位基本过滤区分析过滤残留物的方式相关。
优选地，形成过滤器的标记被并入一次性过滤模件中，该一次性过滤模件包括至少一个容纳要被过滤的流体的腔室，并且可以在使用之前处理该流体，以对该流体进行消毒或使该流体不含消化DNA、RNA或蛋白的酶。
要被分离的生物颗粒例如是细胞。在这种情况中，在过滤含细胞的流体之前，通过预富集要被分离细胞和/或通过稀释，可以从含细胞的流体样品(诸如生物流体或细胞培养物)制备用于过滤的流体样品。
含细胞的流体可以是血液，并且优选地，在这种情况中的过滤器具有在5μm至25μm之间的标准化的孔。
含生物颗粒的流体是尿液，并且过滤器的标准化的孔在8μm至100μm之间。
所述方法可以用于：在通过活检、手术方法或通过口洗涤获得的诸如血液、尿液、腹水、脑脊液(cephalorachidian fluid)、乳、胸膜渗出液、洗涤子宫颈的流体、细胞悬浮液的生物流体中检测细胞，用于诊断目的，检测的所述细胞诸如为肿瘤、胚胎、内皮、成纤维细胞、肌肉、神经或单核细胞、细胞株、器官细胞、祖细胞或造血细胞；检测动物或植物细胞。
本发明还涉及用于实施所述方法的过滤模件，所述模件包括：腔室单元，包括至少一个隔室，该至少一个隔室在其下部被包括至少一个开口的基底封闭；过滤器支撑抽屉，包括至少一个洞，每一个洞都被设置为面向在所述腔室单元中的开口；过滤器，紧贴在所述腔室单元的底面和所述支撑抽屉之间。
在该模件中，在腔室单元的基底中的每一开口的尺寸和在过滤器支撑抽屉中的每一洞的尺寸，使得在腔室单元的基底中的开口构成的每一对和在过滤器支撑抽屉中的相关的洞，限定出有限表面的基本过滤区，并且其中每一隔室的有用体积与位于隔室基底中的基本过滤区的数量成比例。
优选地，基本过滤区的表面等于当量直径在0.6cm至3cm之间的圆盘的表面，并且每一隔室的有用体积与包括在隔室基底中的开口的表面总和的比率小于40ml/cm2，并且优选大于0.14ml/cm2以及所有中间值和上述范围的子范围。
优选地，在腔室单元基底中的至少一个开口的尺寸和在过滤器支撑抽屉中的对应的洞的尺寸，使得对应的基本过滤区的表面大于或等于直径为0.8cm的圆盘的表面。
优选地，至少一个隔室可以被至少一个可移动的分离壁分成部分隔室，这样至少一个部分隔室在它的基底中包括至少一个开口，并且所述部分隔室的体积与在该部分隔室基底中的开口的表面总和的比率小于40ml/cm2，并且优选大于0.14ml/cm2以及所有中间值和上述范围的子范围。
优选地，过滤模件包括设置在腔室单元的基底和过滤器之间的槽舌密封接缝，该槽舌密封接缝包括对应于腔室单元基底中的洞的至少一个洞，该洞被至少一个突出的唇状物包围。
此外，过滤模件还优选包括在过滤器和过滤支撑载体之间的平板接缝，该平板接缝包括与过滤器支撑载体中的洞相对的至少一个开口。
过滤器可以形成标记，该标记的中央部分包括至少一个多孔区，并且该标记的边缘形成一框架，该框架包括指示它在过滤支撑载体上的位置的工具。
指示工具例如是具有不同直径的至少两个洞，该洞被设计为与设置在过滤器支撑载体上的具有对应直径的轴(stud)配合。
优选地，过滤器的至少一个中央多孔部分包括3x 103个孔/cm2至5x 106个孔/cm2，且孔为3μm至100μm。将所有中间的孔径值和子范围都考虑在该范围内，包括3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,25,27.5,30,35,40,45,50,55,60,70,75,80,85,87.5,90,92.5,95,97.5和100μm。也考虑所有中间的孔密度范围和子范围，1,2,3,4,5,6,7,8或9x 103,104,1,2,3,4,5,6,7,8或9x 104,105,1,2,3,4,5,6,7,8或9x 105,106,及1,2,3,4,5,6,7,8或9x 106个孔/cm2。
优选地，过滤模件还包括至少一个阻塞物，用于关闭隔室的上开口。
优选地，腔室单元在它的较低部分处包括轮缘(rim)，该轮缘朝外延伸，并且与至少一个组装销配合，允许过滤器紧贴在过滤器支撑载体和腔室单元之间，该组装销包括在腔室单元的轮缘上延伸的易碎的端部。
优选地，它的所有部件都是由适于消毒操作或被设计为使它们没有RNase、DNase和蛋白酶的材料制成。
最后，本发明涉及一种用于将过滤模件保持在过滤器上的过滤模件支撑载体，该过滤模件支撑载体包括可以在打开位置和加持位置之间移动的至少一个凸轮，该凸轮被设计为在过滤支撑载体和腔室元件之间的过滤器上施加压力。
优选地，至少一个凸轮被设计为，如果过滤模件包括至少一个固定销，且该至少一个固定销的一端是易碎的，则当至少一个凸轮向过滤器施加压力时，切割至少一个固定销的端部。
支撑单元形成过滤器的一部分。
优选地，过滤模件还包括设计为与在支撑单元上的互补工具配合的工具，以便向过滤模件施加相对于支撑单元的取向，并且支撑单元包括设计为与过滤模件上的工具配合的工具，以便指示过滤模件相对于支撑单元的取向。
根据本发明，用于分离包含在流体中的生物颗粒的方法由在过滤器上过滤流体组成，该过滤器具有适于要被分离的颗粒的性质的特征。生物颗粒可以是细胞、红血细胞、血小板凝聚物、纤维蛋白或组织废物。过滤的流体尤其是从生物流体样品获得的流体，该生物流体样品可以已经经过在先处理，以便于通过过滤操作进行分离。特别当要被分离的颗粒是细胞时，该在先操作(将在下面更详细描述)通过包括以下操作中的一种或多种：被设计为预富集要被分离的细胞的化学处理，稀释，被设计为便于分离进行的化学处理，该分离通过过滤要分离的细胞进行。
而且，用于制备过滤的流体样品的这些条件，发明人注意到，为了在分离要被检测的细胞的方法中实现良好的可靠性，需要使过滤器的某些特征适应过滤流体的体积。特别是，过滤器必需被分成基本过滤区，每一个基本过滤区的表面都等于直径在0.6cm至3cm之间的圆盘的表面，并且优选直径大于0.8cm的圆盘的表面，并且甚至直径为0.8cm至1.5cm之间的圆盘的表面，以及所有中间值和上述范围的子范围。基本过滤区例如可以为圆盘的形状。
此外，要被过滤的流体的量必需在1ml至100ml之间，并且优选地，该体积应当在8ml至15ml之间；其中，要被过滤的流体必需穿过每一个基本过滤区。这些范围包括所有中间值和上述范围的子范围。
因此，为了过滤特定样品，必需使用装置，以在过滤器上限定与要被过滤的样品的体积成比例的基本过滤区的数量。
通常，要被过滤的样品的体积一方面依赖于可以初始采集的生物流体的体积，并且另一方面依赖于可能的稀释，该可能的稀释尤其依赖于要被分离的生物颗粒的性质。采用的体积尤其依赖于采集的流体的性质，和从中采集流体的患者的年龄。本领域技术人员知道，如何依赖于采集的流体的性质和从中采集流体的患者，确定采用的体积。
稀释尤其依赖于可以在采集的流体中发现的，每单位体积中的颗粒的数量。事实上，如果过滤在令人满意的条件下进行，则每单位要过滤的流体的体积中要分离的颗粒的数量不应太大，以避免阻塞过滤器。此外，如果所述方法要用于检测与数量大得多的细胞混合在一起的特定的罕见细胞，则每单位体积中的细胞的数量不应太小，以便实现以合理的可能性在过滤器上发现寻找的细胞。本领域技术人员还知道，依赖于所述流体的性质和要寻找的细胞的类型，如何确定这些稀释率。
从患者中采集的生物样品例如可以是血液、尿液、腹水、脑脊液、奶或胸膜外渗液；它还可以是来自洗涤子宫颈的流体，或从患者中采集生物样品可能产生的任何其它流体。
还可以使用分析方法，以搜寻样品中的细胞，该样品不是直接从患者中采集的，并且例如为在由涂片制成的细胞培养基或活检中采集的样品，或人类或动物组织样品，或进一步地在人类或动物细胞系的培养基中。
如果采集的生物流体是血液，则采集的量通常在1ml至20ml之间，并且血液以5至20倍的比率进行稀释，以获得用于过滤的流体样品。在这些条件下，该用于过滤的流体样品在1至20个基本过滤区上进行过滤。这些值包括所有中间值和上述范围的子范围。
对于所有其它流体，样品接近5ml至10ml，并且以2倍至10倍之间的比率进行稀释，或者它们可以不被稀释。这些样品在一定数量的基本过滤区上进行过滤，该一定数量的基本过滤区可以是多达5个或甚至更多，特别是如果这些样品是已经以10倍比率进行稀释的10ml样品。这些值包括所有中间值和上述范围的子范围。
可以寻找的细胞特别是罕见细胞，诸如肿瘤细胞、胚胎细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、神经细胞、单核细胞、细胞株、器官细胞(肝脏细胞、肾脏细胞等)、祖细胞和造血细胞。作为实例给出的该列表不是限制性的。
在过滤之前，可以通过密度梯度类型的处理，或通过裂解不感兴趣的细胞，或通过免疫介导的方法，通过阳性或阴性筛选，通过刺激试图增殖的细胞等等，预富集细胞。
该列表不是限制性的，并且本领域技术人员知道如何选择适于他或她要分离的细胞性质的预富集的方法。
以及对于预富集处理，可以通过根据要寻找的细胞的性质的试剂，处理含细胞的流体样品，以便于进行通过过滤操作的分离。
如果生物样品含有血液，则处理的目的可以是裂解红血细胞和防止血液凝集，并且例如由添加皂角苷和EDTA(乙二胺四乙酸)构成。
如果过滤要分离经固定的细胞，则处理的目的也可以是例如通过添加甲醛，固定有核细胞。在这种情况中，处理的目标是使富集变成可能。
如果过滤要分离未经固定的细胞，则可以使用适于临时使生物膜坚硬的试剂或条件(例如，通过添加多糖、DMSO(二甲基亚砜)、通过低温等)下，处理生物样品。
本领域技术人员知道，如何根据要寻找的细胞的性质，选择最适合的方法。
生物样品可以已经使用允许过滤适于最后的寻找的试剂进行稀释、预富集或处理过，然后该生物样品经过滤穿过过滤器，该过滤器由聚碳酸酯或其它等价材料制成，具有的标准孔径在1μm至100μm之间，且适于要分离的颗粒的性质。将所有中间值和子范围都考虑在该范围内，包括1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,25,27.5,30,35,40,45,50,55,60,70,75,80,85,87.5,90,92.5,95,97.5和100μm。例如，如果要特别分离肿瘤细胞或上皮细胞，则该孔径优选在3μm至25μm之间，并且约为8μm。
孔密度适于要分离的颗粒的性质。优选地，过滤器的孔密度在5x 103至5x 106个孔/cm2之间，并且甚至更好在5x 104至5x 105之间。将所有中间值和子范围都考虑在该范围内，以及下面的具体值：1,2,3,4,5,6,7,8或9x 103,104,1,2,3,4,5,6,7,8或9x 104,105,1,2,3,4,5,6,7,8或9x 105,106,及1,2,3,4,5,6,7,8或9x 106个孔/cm2。
优选压力下降0.05巴至1巴之间，并且优选接近0.1巴，进行过滤。考虑所有中间值和该范围内子范围，包括0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,0.60,0.70,0.80,0.90和1.0巴。可以通过略增加位于过滤器上的流体的压力，辅助过滤。但是，该压力的增加必需小于1巴。这些条件特别适于细胞分离。
该方法可以用于不同的目标，例如，用于寻找生物流体中的悬浮液中的罕见细胞，以便允许诊断或纯化流体，以分析溶液中各成分的良好状态。
如果所述方法用于寻找细胞并且分析它们，则在过滤后，回收已经用于过滤流体的过滤器，以确保过滤区被清楚地鉴定，并且能够在这些过滤区和过滤的样品之间建立联系。然后，过滤器用于分析可能已经在过滤区中获取的细胞。
这些分析方法本身是已知的，例如为以下类型：细胞学染色(苏木精、曙红等)，免疫标记(免疫组织化学，免疫荧光)，PNA，FISH，PRINS，原位PCR或其他分子技术，分光光度法，激光显微切割，随后对DNA(DNA提取、基因分型、定量PCR、突变分析、CGH(比较基因组杂交))、RNA(提取和通过转录物PCR、定量PCR进行的分析)和蛋白质(蛋白质的提取，微测序等)进行靶向分子分析。
可以对富集的细胞进行分子分析，该富集的细胞被保持在过滤器上，并且通过与Southern技术类似的技术被转换至载玻片，单独微切割从过滤器或从根据限定标准的载玻片(具有或没有不同性质的标记的细胞的形态学特征)富集的细胞，并且进行单独或合并的分子分析。
通过使用适当的缓冲液进行洗涤，还可以使细胞与过滤器分离，以提取和分析它们的DNA、RNA和蛋白。
然后，使用显微镜检验通过过滤分离的各组分，并且可以手动或通过自动工具，尤其是通过使用图像分析设备，进行对过滤器上获得的图像的分析。
所述方法还可以用于纯化生物流体，诸如在溶液中含有要分析的DNA、RNA或蛋白的尿液。纯化流体的目的是除去流体中存在的所有生物颗粒，这些生物颗粒可能干扰分析。在这种情况中，不保留过滤器，并且分析的是经过滤的流体。
该过滤方法及样品制备和分析方法尤其可以用作之前所述的诊断目的，以检测与特定细胞的存在相关的病理，该特定细胞可能以极小的量存在。所述方法尤其可以用于检测癌症细胞，在手术操作的过程中，该癌症细胞可能已经被释放到患者的血液中。本领域技术人员知道，可以寻找什么细胞以检测特定的病理。
支撑载体。支撑载体可以表现为没有孔的实体支撑体，诸如载玻片，或皮氏培养皿(petri dish)，或培养孔，或由玻璃或塑料或任何实体材料制成的任何其它支撑载体，可以用作细胞培养、处理或任何类型的分析的支撑载体。任何类型的分析为：细胞形态学，免疫标记，原位分子分析方法(包括蛋白、RNA或DNA分析)，以及用于分子分析(包括蛋白质、RNA或DNA分析)的细胞的收集。
过滤。通过使用非排它的聚碳酸酯、PET(聚对苯二甲酸乙二酯)或其它材料的膜，进行生物样品的过滤，以提取、分离、纯化或浓缩罕见细胞，并且通过在过滤器下施加减压(depression)，以分离或提取罕见细胞。其中，使用的聚碳酸酯、PET或其它材料的膜具有适于提取或分离所述罕见细胞的孔径和孔密度。
通过垂直过滤生物样品进行细胞提取，允许细胞分层堆积，并且使得它们可用于进一步的分析，诸如用于检测和表征和诊断罕见细胞。通过垂直过滤生物样品进行细胞分离，允许罕见细胞与较小的细胞分开，以富集它们并使得它们可用于进一步的分析，诸如用于检测、表征和/或诊断罕见细胞。通常，通过过滤血液分离罕见细胞，允许分离大部分嗜中性粒细胞和成熟的淋巴细胞和红细胞(红细胞不包含核，因此不将它们考虑为真正的细胞并且通过在过滤之前被裂解)，以使大于嗜中性粒细胞和成熟的淋巴细胞的细胞保留在过滤器上，包括活化的淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、干细胞、肿瘤细胞，癌细胞、肿瘤微栓子、成熟和未成熟的内皮细胞、上皮细胞，除了嗜中性粒细胞和成熟淋巴细胞之外的间充质细胞、黑素原粒细胞、早幼粒细胞、原巨核细胞、巨核细胞，以及通常为体内不是嗜中性粒细胞和成熟的淋巴细胞的所有细胞。嗜中性粒细胞和成熟的淋巴细胞和红细胞是体内最小的细胞，因为它们的大小为6至9微米。进一步地，通过过滤血液分离罕见细胞，还允许在过滤器的另一侧上收集血浆和白细胞，或生物样品中与通过过滤分离的罕见细胞不同的其它组分。血浆包含游离的DNA和RNA和蛋白，在患癌症的患者中包括游离的肿瘤DNA和肿瘤RNA和肿瘤微小RNA和蛋白，而在怀孕女性中包括游离的胚胎DNA、胚胎RNA和胚胎微小RNA和蛋白。术语“游离的”指“细胞外”，因此指在血浆中的游离的核酸。游离的肿瘤DNA用于诊断患癌症患者中的肿瘤突变，并且游离的胚胎DNA用于产前诊断非整倍性和其它遗传性障碍、胚胎性别、RhD状况、亲子鉴定。在收集罕见细胞和血浆的同时收集白细胞，可用于分析和获得关于个体遗传背景的信息。预期游离的肿瘤DNA和/或RNA和/或蛋白来源于裂解的(可能是凋亡的)肿瘤细胞，该肿瘤细胞来自肿瘤块和/或肿瘤转移物和/或循环的肿瘤细胞隔室。通过从血浆中提取DNA和/或RNA和/或蛋白，进行游离的肿瘤DNA和/或RNA和/或蛋白的分析，并且通过分子分析寻找突变。例如，从血浆中提取游离的DNA，在患肺癌的患者中进行存在K-Ras突变的快速分析，并且通过PCR、CastPCR、低温PCR(Cold PCR)、数字PCR和其它靶向分子测试，寻找突变的K-Ras分子。因此，在循环的肿瘤细胞中分析K-Ras突变，可以与血浆DNA中的KRas突变分析相关联。此外，本研究可以从寻找血浆中的KRas突变开始，这是成本比较低的。并且如果没有发现突变，则可以在循环的肿瘤细胞中寻找KRas突变，这是成本较高的。
通过分析血浆DNA，容易并且低成本地诊断胚胎性别。但是，如果血浆中游离的胚胎DNA的量低，则Y特异性分子分析的阴性信号不允许获得可靠的结果。在这种情况中，增加对循环的胚胎细胞进行更加昂贵的分析的可能性，将允许获得胚胎性别的可靠的诊断。
通过从血浆中提取诸如DNA和/或RNA，和/或微小RNA和/或蛋白的分子，可以进行感染性疾病的检测，如由HBV,HCV或HIV，或由细菌或其它病原体引起的感染性疾病；并且通过分子分析，寻找病毒或细菌或其它病原体的DNA，和/或RNA，和/或微小RNA和/或蛋白的存在。作为补充测试，可以在循环的罕见细胞中，寻找病原体特异性的DNA，和/或RNA，和/或微小RNA和/或蛋白。
在具体情况中，同时获得关于罕见细胞中的突变或感染性分子，血浆中的突变或感染性分子，以及个体的基因组特征的信息，这也可以是有用的。在这种情况中，在过滤后收集血浆和白细胞，以分离循环的罕见细胞是极其有用的。例如，在被感染的患者中，在循环的罕见细胞中，在血浆中寻找感染性分子，诸如来自TBC杆菌的DNA，这可以是有用的；并且在白细胞中寻找遗传易感性性状。例如，在患遗传来源的癌症的患者中，寻找循环的肿瘤细胞中、血浆中和白细胞中的突变，诸如BRCA1或BRCA2，这将是有用的。例如，在怀孕女性中，分析罕见的循环的胚胎细胞是否存在杜氏疾病(一种仅影响男性胚胎的遗传疾病)可以是有用的，以寻找在游离的胚胎DNA中的Y序列，以知道胚胎是否是男性，并且寻找母体白细胞中的携带状况。例如，在怀孕女性中，分析罕见的循环的胚胎细胞是否存在亨廷顿氏病(一种可能是晚发型的显性遗传疾病)可以是有用的，以寻找在游离的胚胎DNA中的亨廷顿氏突变的序列，并且在母体白细胞中寻找的亨廷顿氏突变的存在。事实上，因为突变是显性的，突变在两位亲本中的一位中的存在使胚胎有50％的风险受到影响。如果遗传分析发现胚胎受到影响，则通过分析母体的白细胞，检验母体是否携带突变，将是有用的。
这些实例不是排它性的。通常，分离循环的罕见细胞，并且同时收集血浆和白细胞，用于即时分析或用于储存和未来分析的可能性，在非介入性个性化医疗中具有高潜力和价值。
过滤器的孔径对要过滤的生物样品进行的适应性变化，允许选择性分离尺寸有区别的细胞，例如肿瘤细胞、微栓子和合胞体滋养层，细胞组和多核细胞，和具有比个别细胞大的尺寸的细胞材料，从而通过使用孔径大于20～25微米的过滤，通过过滤去除所有白细胞和红细胞，从而从具有高纯度(白细胞或其它较小细胞的污染低或没有)的血液或其它流体中，有效分离这样的材料。
通过类比，通过研究给定肿瘤类型和/或在给定患者中的肿瘤细胞的特定尺寸，和/或通过研究要分离的某罕见细胞的特定尺寸，可以适应性调整孔径、孔密度或过滤器的其它化学或物理特征，以使分离的肿瘤细胞和/或罕见细胞的获取和纯度最大化。例如，胚胎细胞的尺寸可以从10微米改变为30微米。合胞体滋养层的尺寸通常大于100微米。成熟内皮细胞不是圆的而是细长的细胞，它的尺寸大约为40微米或50微米对10微米至20微米。因此，感兴趣的孔径范围在5微米至30微米之间，并且较大的孔径允许去除所有的白细胞。事实上，较大的白细胞(是巨噬细胞和单核细胞)具有通常不大于20微米的尺寸。孔径必需非常紧密地适应孔密度，并且在0.5至2.0E5个孔/cm2的范围内，因为足够的过滤器材料必需在孔与孔之间以允许收集罕见细胞。
肿瘤细胞尺寸。通过定义，肿瘤细胞不是“静息细胞”，因为它们产生蛋白并且可以增殖，因此它们的染色质是开放的，并且从不像成熟白细胞(如成熟淋巴细胞和成熟嗜中性粒细胞)的染色质那样是紧密的，其中成熟淋巴细胞和成熟嗜中性粒细胞是主要的白细胞(在数量上)并且由此小于肿瘤细胞。个别肿瘤细胞的尺寸可以从10微米改变为50微米或更大，这依赖于肿瘤细胞的类型。来自小细胞肺癌(SCLC)的肿瘤细胞的前尺寸(Ex size)：是淋巴细胞的尺寸的1.5至3倍(12至24微米)，来自非小细胞肺癌(NSCLC)的肿瘤细胞的尺寸：大于淋巴细胞的尺寸的3倍(24微米)。肿瘤微栓子的尺寸通常大于100微米。
过滤的优点。与提取/分离的其它方法相比，通过过滤提取或分离罕见细胞具有几个优点：
它允许以非常高的灵敏度分离罕见细胞，包括将一种单独的罕见细胞收集在1ml血液中，该一种单独的罕见细胞可以在过滤之前达到顶峰，因此与几百万白细胞和几十亿的红细胞混合。
它允许独立地从罕见细胞表达的抗原提取或分离罕见细胞，因此避免产生罕见细胞丢失的分离偏差。
它便于罕见细胞的多种分析的进行，包括形态学、免疫标记、原位分子分析和没有其它非罕见细胞的干扰的分子分析。
它允许调整分离的罕见细胞的纯度，使得对该罕见细胞的多种分析更容易，包括形态学、免疫标记、原位分子分析和没有其它非罕见细胞的干扰的分子分析。
它允许独个地收集罕见细胞，如单个细胞或单个细胞的组，或如与残余的非罕见细胞混和的细胞，用于进一步的分子分析。
通过除去数百万的小白细胞和数十亿的红细胞，它加速了罕见细胞的检测和计数。
它允许提取或分离固定或新鲜的细胞，用于进一步的分析。
过滤的其它模式。可以采用各种过滤模式，这要它们允许从其它种类的细胞分离罕见细胞和/或使罕见细胞在过滤器上分层堆积，用于进一步的分析。例如，用于从其它种类的细胞(穿过过滤器)中分离罕见细胞的力可以是重力，正压或负压，或离心力。
样品的预处理。在过滤之前和/或之后，可以通过用于裂解红细胞的试剂对生物样品进行稀释和/或处理，该试剂如皂角苷，氯化铵，裂解抗体，低渗溶液，如EDTA、肝素、香豆素和其他维生素K拮抗剂、Xa因子拮抗剂、凝血酶抑制剂的抗凝血剂；阿司匹林(水杨酸)，和其它防止血小板凝集的试剂(http://en.wikipedia.org/wiki/Antiplatelet_drug,于2013年5月21日登录)，粘液溶解的药物，和固定剂(见下文)。
通过过滤从生物样品提取或分离的罕见细胞可以是固定的细胞或新鲜的细胞。通过过滤从生物样品提取或分离的固定或新鲜的罕见细胞，可以被转移至支撑载体，该支撑载体非排它地包括载玻片、皮氏培养皿、孔或微孔或试管或其它用于分析、分子分析或培养的支撑载体。通过使用收集工具和/或解离工具和/或缓冲液，可以获得细胞从过滤器至支撑载体的转移。例如，为了将所有细胞从过滤器转移到载玻片或实体支撑载体，并且避免流失罕见细胞，可以使用商业可用的粘附载玻片，诸如SuperFrost Ultra
Figure BDA0001797519980000191
slidesorClearcellTM和AdcellTM BioAdhesion(生物粘着)载玻片，和/或在过滤之前，使用防止细胞与过滤器粘贴的试剂，使用硅烷化试剂(如SigmacoteTM或类似试剂)，处理过滤器。为了将所有在过滤器上收集的细胞转移到载玻片或任何其它的支撑载体，并且避免流失罕见细胞，还可以将溶液施加至过滤器的背面(没有粘贴至细胞的一侧)来辅助转移，并且产生缓冲液穿过孔向实体表面的流动，这将使细胞与过滤器解离，以便它们可以粘附至载玻片或其它实体支撑载体。还可以通过使用施加在过滤器背面的正气压和/或正液压：空气和/或液体将穿过孔，并且帮助细胞转移至载玻片或其它实体支撑载体，从而改进在过滤器上收集的细胞和罕见细胞的转移至载玻片或其它实体支撑载体的这种方法。如果在过滤器上的细胞没有干燥，因此如果转移在过滤之后很快就进行，则所有这些从过滤器上解离细胞和罕见细胞，并且将它们转移至载玻片或实体支撑载体的这些方案，将工作得更好。
通过在过滤之前使用固定试剂固定细胞，再通过过滤提取或分离固定的细胞。该固定剂非排它地包括：甲醛，多聚甲醛，戊二醛，RCL2，如B5和Zenker(岑克)固定剂的汞剂，甲醇和乙醇，如布安氏溶液(Bouin's solution)的苦味酸盐，里戈固定剂(Rigaudfixative)等。
在过滤之后使用固定试剂，可以固定通过过滤从生物样品中提取或分离的新鲜的罕见细胞。该固定剂非排它地包括：甲醛，多聚甲醛，戊二醛，RCL2，如B5和Zenker固定剂的汞剂，甲醇和乙醇，如布安氏溶液的苦味酸盐，里戈固定剂等。
罕见细胞的培养。可以培养从生物样品中提取或分离的罕见细胞，以增加它们的数量，并且便于它们的检测和/或诊断和/或表征。培养方案可以包括，相对于非罕见细胞的生长，优选刺激罕见细胞的生长的工具，以增加罕见细胞的纯度。相对于非罕见细胞的生长，优选刺激罕见细胞的生长的工具非排它地包括：刺激罕见细胞生长的特异性生长因子和/或试剂，罕见细胞与其它细胞类型的细胞共培养和/或使用帮助罕见细胞生长的滋养层，以及阻断非罕见细胞生长和/或存活的工具，诸如抑制抗体、细胞周期的阻断剂、促凋亡因子(proapoptotic factor)、siRNA和特异性靶定非罕见细胞以阻断它们的生长和/或使它们消除的任何类型的药物。
罕见细胞的表征。通过细胞形态学和/或免疫标记和/或分子分析，可以获得罕见细胞的检测和/或诊断和/或表征。对完整的细胞，即可识别它的质膜和/或细胞质界限和/或核界限的细胞，原位进行细胞形态学和/或免疫标记分析。
细胞形态学分析非排它地包括：通过苏木精和/或曙红染色，迈格林华(MayGrunwald)染色和/或姬姆萨(Giemsa)染色，帕氏染色(Papanicolau staining)，富尔根染色和所有类型染色和化学计量染色，以分析细胞形态的细节，以及分析和/或定量细胞组分。细胞形态学分析非排它地包括细胞化学分析，该细胞化学分析非排它地包括能够揭示细胞组分的PAS、苏丹、阿辛兰染色，酶和非酶方法，该细胞组分非排它地包括钙、脂质、多肽、酶和其它分子。免疫标记非排它地包括使用抗体标记细胞组分，该抗体非排它地包括：针对上皮抗原的抗体，针对间叶细胞抗原的抗体，针对器官特异性抗原的抗体，针对肿瘤特异性抗原的抗体，针对胚胎特异性抗原的抗体，针对干细胞特异性抗原的抗体，针对转录因子的抗体，针对突变蛋白的抗体，和针对任何蛋白和/或肽和/或细胞组分的抗体，这些蛋白和/或肽和/或细胞组分的检测可以帮助细胞鉴定和/或诊断和/或表征。免疫标记非排它地包括通过抗体进行的免疫细胞化学、免疫荧光、免疫-PCT和所有类型的细胞结构的标记，该抗体与用于揭示免疫联系和细胞靶点的工具结合。
可以对完整的细胞原位进行分子分析，该分子分析非排它地包括FISH(荧光原位杂交)、PRINS(引物原位标记)、TUNEL(末端脱氧核苷酸转移缺口末端标记)、免疫PCR、PNA(肽核酸)、原位PCR和使用非排它的分子探针的其它方法。
在原位染色和/或免疫标记和/或原位分子分析之后，在进一步进行罕见细胞的分子分析(暗指细胞裂解)之前，可以进行罕见细胞的图像分析，并且图像可以储存和/或信息转移。
可以对细胞进行分子分析，该分子分析非排它地包括PCR、逆转录PCR、实时PCR、数字PCR、全基因组扩增、测序、高通量测序、Cast-PCR、低温PCR冷、比较基因组杂交(CGH)、CGH阵列、微阵列分析、甲基化分析、多态性分析等等，该细胞的结构已经被破坏和/或裂解，以分析非排它地包括DNA、RNA、微小RNA和蛋白分子的分子组分。
分子分析可以靶向通过过滤从生物样品中提取或分离的个别细胞或靶向个别细胞的组或所有细胞，该分子分析非排它地包括PCR、逆转录PCR、实时PCR、数字PCR、全基因组扩增、测序、高通量测序、Cast-PCR、低温PCR冷、比较基因组杂交(CGH)、CGH阵列、微阵列分析、甲基化分析、多态性分析等等。
通过对含感兴趣的细胞的过滤器部件，或对在转移至支撑载体后的细胞进行激光微切割，对根据形态学标准和/或免疫标记鉴定出的个别细胞或细胞组进行靶向分析。然后，裂解细胞蛋白，并且分子分析细胞DNA(基因组和/或线粒体DNA)、RNA、微小RNA和蛋白分子。可选择地，可以从过滤器上解离通过过滤提取或分离的罕见细胞，并且可以通过磁场(硅生物系统或基于磁场的其它方法)，或通过人工或自动进行毛细管微量吸移，分离根据形态学标准和/或免疫标记鉴定出的个别细胞或细胞组。可选择地，通过使用适当的缓冲液，可以在过滤器上，或在转移至支撑载体之后，裂解通过过滤提取或分离的所有细胞，以通过非排它地PCR、逆转录酶PCR、实时PCR、数字PCR、全基因组扩增、测序、高通量测序、Cast-PCR、低温PCR、比较基因组杂交(CGH)、CGH阵列、微阵列、甲基化分析、多态性分析等，进行细胞的DNA(基因组和/或线粒体DNA)、RNA、微小RNA或蛋白分子分析。
非介入性的治疗诊断学。在其它方面中，本发明使得从血液中分离循环的肿瘤细胞，并且使用它们进行非介入性的治疗诊断成为可能。治疗诊断学是使用诊断结果，以引导特异性“靶向”治疗的药方。这些程序利用了特定的分子生物标记物，该分子生物标记物可以存在于肿瘤细胞中，以预示它们对给定治疗的响应的易感性或没有响应。因为癌症治疗是昂贵的并且常常是有毒的，因此治疗诊断学对于最小化医疗保健的成本及由于对患者的副作用所带来的负荷至关重要。现在，正在寻找原发性肿瘤和转移组织中的治疗诊断学生物标记物。但是，已经证实在原发性肿瘤中的肿瘤细胞具有遗传异质性，并且活检可能漏掉携带对建立最佳靶向治疗有用的遗传信息的肿瘤细胞集群。转移物被认为是较好的参照，但是它们的活检难以获得。实际上，由于与这些介入性程序相关的高比率的发病率，癌症患者的身体状况常常阻止通过介入性途径(手术或活检)，获得来自原发性肿瘤或转移物的样品。此外，肿瘤细胞遗传特征可能在靶向治疗的压力下发生变化，使得在治疗过程中跟踪肿瘤细胞很重要，以检测逃脱靶向治疗的新的“肿瘤细胞突变体”。但是，由于相关的发病率，介入性跟踪癌症细胞的遗传特征在临床环境中是难以实施的。最后，非介入性地研究特定患者中肿瘤细胞的遗传特征应当是有用的，以在手术前实施靶向疗法，这样做的目的是为了在介入之前降低肿瘤负荷，并且更好地去除肿瘤。
现在，靶向疗法可用于一些常见的癌症(乳癌、肺癌、结直肠癌等)，并且已经在一定比例的情况中示出了它们的效果。但是，在不存在证实的肿瘤响应的预测因子下，将向大多数患者开出这些靶向的昂贵的疗法，同时相关成本大大增加且没有成比例的收益；或者，不向大多数患者开出这些靶向的昂贵的疗法，从而阻碍了患者从该疗法中受益。
因此，治疗诊断的生物标记物的实现期望产生给人印象深刻的治疗改进。但是，对肿瘤组织(原发性肿瘤、转移物)进行治疗诊断学分析暗示介入性(手术或半手术)程序，该介入性程序不能在衰弱的患者中进行，并且非常昂贵，并且常常提供不完整的数据。因此，对非介入性获得的肿瘤细胞和肿瘤微栓子的分析在临床肿瘤学中是极度重要的。
罕见细胞的遗传表征。可以从循环的肿瘤细胞(CTC)、循环的肿瘤微栓子(CTM)，以及从生物流体(尿液、腹水、精液、脑脊髓液(CSF)、唾液、痰等)中收集的肿瘤细胞中，非介入性地获得肿瘤细胞遗传特征的信息。
研究肿瘤细胞遗传特征的方法根据要检测的遗传异常而发生改变。它们可以依靠细胞学、细胞化学、免疫细胞化学分析、FISH、PRINS、免疫PCR、靶向基因或感兴趣的序列和/或整个外显子组或整个基因组/转录组序列的DNA和RNA的提取和分析。
已经验证了几种治疗诊断的生物标记物，特别是用于非小细胞肺癌(NSCLC)和结肠癌的治疗诊断的生物标记物。表皮生长因子受体(EGFR)是膜受体酪氨酸激酶。在很多癌症中都发现了EGFR的过表达或过度活性。在患NSCLC的所有患者的10％至15％中，及在临床响应EGFR酪氨酸激酶抑制剂，诸如吉非替尼(gefitinib)(AstraZeneca(阿斯利康))或埃罗替尼(erlotinib)(Roche(罗氏))的80％的患者中，检测到EGFR突变。已知的EGFR突变包括位于EGFR酪氨酸激酶结构域的外显子18至21中的突变。尤其在肺癌中，很好地描述了这些突变。具有原发性肿瘤的患者对EGFR抑制剂的响应好于患野生型KRAS肿瘤，该原发性肿瘤具有L858R突变或缺失外显子19的突变[13]。L858R突变或缺失外显子19的突变属于肺癌中最常见的EGFR突变，分别具有接近所有EGFR突变的43％和48％的频率(http://www.mycancergenome.org,2013年5月21日登录)。
KRAS(还已知为V-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源物)编码定位在内膜上的21kDa的GTPase。该蛋白是EGFR上游的信号转导途径的核心组分。KRAS突变出现在15-25％的肺腺癌中(http://www.mycancergenome.org,2013年5月21日登录)。KRAS更加频繁的突变导致KRAS激酶活性的组成性活化。在KRAS基因的外显子2中的密码子12(所有KRAS突变的82％)和密码子13(所有KRAS突变的17％)中出现点突变。标准测序在所有密码子12和密码子13突变(G12C:c34G>T,G12R:c34G>C,G12A:c35G>C,G12D:c35G>A,G12V:c35G>A,G12S:c34G>A,G13C:c37G>T,G13D:c38G>A)的一个测试中进行检测。
在NSCLC患者中的EGFR抑制剂有效性需要野生型KRAS[13]。在患转移性结直肠癌的患者中，抗EGFR的治疗抗体(Eli Lilly,Bristol-Myers Squibb,Merck Serono)的有效性也需要野生型KRAS[14,15]。也已经报道了在密码子61和146中的突变，但是它们代表KRAS突变的较小部分(1-4％)，并且它们的临床相关性仍然是不确定的[15]。
目前，具有KRAS突变的NSCLC患者没有有效的治疗策略。Ganetespib(盖那特斯皮博)(Synta Pharmaceutical)是伴侣蛋白Hsp90的小分子抑制剂，目前正在进行III期临床试验。II期试验示出了，在使用ganetespib治疗后8周，在超过60％的具有KRAS突变的NSCLC患者中出现了肿瘤收缩，其中，作为单一疗法，ganetespib一星期给药一次(国际肺癌研究协会(International Association for the Study of Lung Cancer)，第14届世界肺癌大会)。
最近，在小部分肺癌患者中，鉴定出了涉及间变性淋巴瘤激酶(ALK)(2p23)和棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)(2p21)基因的基因组改变。这些患者对ALK小分子抑制剂(克唑替尼(Pfizer))有显著有利的应答[16,17,18,19]。事实上，目前在III期临床试验中测试了克唑替尼，并且II期试验的初步结果证明在ALK重排的肺肿瘤中有给人印象深刻的90％的疾病控制率[20]。根据大多数系列，尤其在晚期腺癌中，已经在1％至7％的NSCLC中发现了这种重排，且没有EGFR和KRAS相关的突变[21]。
在其它类型的癌症中，已经证实了两种其它治疗诊断的生物标记物。人类表皮生长因子受体2(HER2)是细胞膜表面结合的受体酪氨酸激酶，并且正常参与引起细胞生长和分化的信号传导途径。HER2座位在20-30％的乳肿瘤中被扩增，并且该扩增的存在指示肿瘤响应靶向疗法的曲妥单抗(抗HER2，Roche(罗氏))[22]。
威罗菲尼(Zelboraf)(Roche(罗氏))是非常有效的药物，最近已经被食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗患黑色素瘤的患者，这些患者的肿瘤携带V-raf鼠源肉瘤病毒性致癌基因同源物B1(BRAF)基因的V600E突变。因为这一突变也存在于1％的肺癌患者中，因此肺癌患者在未来可能变得符合使用该药物的条件。其它经证实或正在进行临床试验的治疗诊断的生物标记物包括：
乳癌和卵巢癌：ER,PR,BRCA1,BRAC2
胃肠癌：c-Kit,CDC4,p53
非小细胞肺癌：ROS1,HER2,FGFR,PDGFRA,VEGFR,PI3K
MTOR,MEK,STAT3,AKT,RET融合体
前列腺癌：重组的TMPRSS2/ERG。
关于肿瘤细胞的非介入性治疗诊断分析，本发明考虑处理的目前未解决的问题如下：
必需以非常灵敏的方式从生物样品中提取或分离肿瘤细胞，以避免它们的丢失，并且具有最大的纯度，即具有最小的非肿瘤细胞的污染(以避免通过分子分析获得错误的阴性结果)。
进一步地，非介入性地获得的肿瘤细胞是罕见的、低存在的材料；而且，它们需要成为几种分析和分子分析的靶点，以用作非介入性治疗诊断测试。这些未解决的问题阻碍了临床肿瘤学中的非介入性治疗诊断测试的发展和普遍应用。本发明描述了通过涉及以下步骤的方法，解决上述问题的方案：
(i)通过使用膜过滤生物样品，该膜的材料(聚碳酸酯、PET等)的特征、厚度、孔径和孔密度经特异性调整以适应要分离的肿瘤细胞的类型和数量，以及要处理的生物液体，以非介入性地分离肿瘤细胞和肿瘤微栓子。
(ii)通过细胞染色、免疫染色、FISH、Tunel、PRINS、免疫PCR和任何类型的分析(不使用细胞裂解作为治疗诊断测试)，对分离的细胞进行染色/标记。
(iii)经染色/标记的细胞的图像分析，包括扫描和高密度记录细胞图像。可以为了诊断目的分析、储存图像，和/或将图像信息转移给在诊断方法中提供帮助的专家。
(iv)对非介入性收集的新鲜或固定的细胞进行肿瘤细胞靶定性裂解。靶定途径包括激光捕获显微切割(LCM)步骤。LCM允许在通过过滤进行分离之后，分离单个的肿瘤细胞(或肿瘤细胞集群)。该方法允许进行遗传分析，以纯化肿瘤DNA。因为肿瘤细胞是异质的，并且与(组织中，以及过滤器上的)正常细胞混合在一起，因此LCM目前是可用于评价CTC群中突变的CTC的百分比的方法。作为LCM的替代方法是显微操作系统、DEPArray(DEP阵列)(Silicon Biosystem(硅生物系统))或CellCelector(ALS)。在裂解之后，细胞进行DNA和/或RNA和/或蛋白分析。
(v)对通过过滤提取或分离的所有固定或新鲜的细胞进行非靶向性裂解，用于它们的分子(RNA、DNA和/或蛋白)分析，包括靶向与非突变的序列混合的突变序列的分子分析(低温PCR、CastPCR等)。
(vi)针对RNA、DNA和/或蛋白的治疗诊断分子分析，靶向一种或几种生物标记物，或应用于整个外显子组或基因组序列。
该策略的优点如下：
(a)经优化的途径，以最大的灵敏度和纯度从生物样品中分离罕见细胞，并且不存在罕见细胞的选择偏差，该罕见细胞可以源自基于免疫标记和/或基于标记物的捕获系统。
(b)对非介入性收集的同一种罕见细胞进行几种诊断和/或预后和/或治疗诊断分析的可能性。例如，在患肺癌的患者中，将可以从非介入性收集的同一种肿瘤细胞中获得ALK分析(FISH)，和KRAS和EGFR分子分析(在细胞裂解之后的DNA分析)的结果。例如，在患感染性疾病的患者中，将可以从免疫系统(诸如活化的淋巴细胞和单核细胞和巨噬细胞)的细胞中，获得对细胞内病毒(HIV等)或微生物原(志贺氏菌、TBC杆菌、利什曼原虫等)具有特异性的FISH分析的结果，和对感染原具有特异性的DNA和/或RNA和/或蛋白分析的结果。
例如，在怀孕女性中，将可以从分离的罕见胚胎细胞非介入性地获得细胞病理学和/或免疫标记和/或原位分子分析(具有Y特异性探针的FISH或PRINS)的结果，以诊断男性胚胎细胞的存在，并且获得对裂解的细胞进行的DNA和/或RNA和/或蛋白突变分析，该分析证实突变分子的存在或不存在，因此证实胚胎遗传障碍的存在或不存在。
(c)在进行细胞裂解之前，获得通过过滤提取或分离的肿瘤细胞或其它罕见细胞的存在或不存在及其数量的诊断和/或预后和/或治疗诊断信息，并且储存细胞病理学和/或免疫标记和/或原位分子分析的图像的可能性，这允许获得在分析的生物样品的罕见细胞中，与存在或不存在DNA和/或RNA和/或蛋白突变有关的，或与存在或不存在病理DNA和/或RNA和/或蛋白分子有关的诊断和/或预后和/或治疗诊断信息。
例如，在患癌症的患者中，将可以从非介入性地收集的同一种肿瘤细胞，获得细胞病理学和/或免疫标记和/或原位分子分析的结果的储存的图像，以诊断肿瘤细胞的存在，并且通过原位免疫学和原位分子分析表征这些肿瘤细胞，并且获得对裂解细胞进行的DNA和/或RNA和/或蛋白突变分析。
例如，在患感染性疾病的患者中，将可以非介入性地从分离的罕见细胞，获得细胞病理学和/或免疫标记和/或原位分子分析的结果的储存的图像，以诊断被感染的细胞的存在，并且通过原位免疫学和原位分子分析表征这些被感染的细胞，并且从裂解细胞中获得DNA和/或RNA和/或蛋白分析，这将证实感染原分子的存在或不存在，从而证实感染原的存在或不存在及数量。
例如，在怀孕女性中，将可以从分离的罕见胚胎细胞，非介入性地获得细胞病理学和/或免疫标记和/或原位分子分析的结果的储存的图像，以诊断胚胎细胞的存在，并且通过原位免疫学和原位分子分析表征这些胚胎细胞，并且对裂解细胞进行DNA和/或RNA和/或蛋白突变分析，这将证实突变分子的存在或不存在，从而证实胚胎遗传障碍的存在或不存在。
目前，任何靶向罕见细胞的方法和包括用于非介入性治疗诊断分析步骤的方法都没有这些优点。
实施例
实例1：对通过过滤从血液富集的新鲜的、未固定的肿瘤细胞进行的多元分析。
过滤。如在公布的专利申请US-2009-0226957中所述的，通过过滤从血液中提取和富集新鲜的肿瘤细胞。
对该提取的、未固定的细胞进行染色，以确定它们的形态，并且提取它们的核酸，并且在全基因组扩增之后，通过RT-PCR或PCR分析它们的核酸。
为了从血液中提取和富集罕见的肿瘤细胞，使用用于红血细胞裂解的缓冲液，将血液样品稀释20倍。在轻柔震荡下，在室温允许裂解进行5分钟。
然后，在–6m巴的低压下，立即过滤经处理的血液样品。在过滤完全完成之前，即孔中剩余约200μL溶液，终止过滤。
通过轻柔地转移3次1mL细胞培养基(DMEM HEPES 1％胎牛血清),收集经富集的新鲜的肿瘤细胞材料。
然后，经收集的材料在1000rpm离心5分钟，并且仔细地去除上清液。将细胞团重悬在细胞培养基中。
然后，可以使用DMEM 10％胎牛血清培养提取的细胞。然后，提取或培养的细胞可以用于在增殖测定或在粘附测定中进行功能分析，诸如测试分泌的蛋白。
(i)在显微镜下，基于单个的细胞大小标准或免疫标记，可以使用(微)移液管分离各个肿瘤细胞；或(ii)可以使用细胞分选仪，诸如DEParray(Silicon Biosystems(硅生物系统))，分离各个肿瘤细胞。
在分离单个细胞之后，可以进行DNA和/或RNA水平的核酸的分子分析。
DNA分析。对于新鲜的单个细胞的DNA分析，使用3-10μL裂解缓冲液(100mmol/LTris-HCl,pH 8；400μg/mL蛋白酶K)，裂解细胞15分钟。在94℃，使蛋白酶K失活15min。
可选择地，可以使用热稳定的蛋白酶(诸如prepGem(ZyGem))及其相关缓冲液(Gold(金牌)缓冲液)在75℃裂解细胞5min，然后在95℃失活5min。对来自新鲜的单个细胞的DNA的下游处理，与在实施例X中描述的对固定的、经微切割的细胞的DNA下游处理相同。
RNA分析。对于RNA分析，在含有400mM Tris-HCl pH 8、1000μg/mL蛋白酶K和2.5U的RNAase抑制剂的缓冲液中，裂解新鲜或固定的细胞，或新鲜或固定的单个细胞。对于逆转录，来自裂解细胞的RNA在70℃变性10min。使用10单位MMLV、10单位抑制剂、随机引物、dNTP和与酶一起供应的1X浓度的逆转录缓冲液，在40μL的总体积中，进行逆转录。反应典型地在室温孵育15分钟，并且在42℃孵育30分钟。然后，酶在70℃失活10分钟，并且在通过PCR进行转录物特异性扩增或使用商业化的试剂盒(Life Technologies(生命技术),Illumina)进行全cDNA扩增之前，在冰上冷却。
在具体实施例中，可以使用Taqman测定(hs03654556,Hs03654557,Hs03654558,Hs03654560,Hs03654559,Life technologies(生命技术))或通过标准PCR，检测ALK基因重组。EML4-ALK重组转录物变体3a和3b的检测，可以使用以下引物：
正向引物：5'-GCATAAAGATGTCATCATCAACCAAG-3'(SEQ ID NO:1)
反向引物：5'-TCTTGCCAGCAAAGCAGTAGTTGG-3'(SEQ ID NO:2)
通过使用针对上皮标记物的抗体和/或针对治疗诊断学重要的蛋白(HER2、ALK等)的抗体的多元免疫标记，鉴定肿瘤细胞。在使用配备有细胞切割模件(cell cut module)(MMI，苏黎世，瑞士)的尼康(Nikon)TE2000U(Nikon巴黎，法国)，进行单细胞激光捕获纤维切割(LCM)之后，允许进行靶向循环肿瘤细胞的分子分析。
可以在2～15μL的裂解缓冲液(100mmol/L Tris-HCl,pH 8；400μg/mL蛋白酶K)中，裂解每一个经显微切割的细胞。在94℃，使蛋白酶K失活15min。可选择地，可以使用热稳定的蛋白酶(诸如prepGem(ZyGem))及其相关缓冲液(Gold(金牌)缓冲液)在75℃裂解细胞15min，然后在95℃失活5min。
使用引物延伸预扩增(Primer Extension Preamplication，PEP)或商业化的试剂盒(Rubicon Genomics,Sigma,Qiagen,Silicon Biosystems(硅生物系统))，可以进行WGA。
对于引物延伸预扩增(PEP)，将其中含5μL 400μM的随机引物溶液(genPEP)，10μL含15mM MgCl2的10X PCR缓冲液(Life technologies(生命技术))，0.6μL四种dNTP的混合物(每一种为2mM)，及1μL(5U)Taq聚合酶(Life technologies)的终体积60μL，添加到裂解的细胞中。
对于使用来自Rubicon Genomics的PicoPlex的WGA，首先将5μL预扩增的鸡尾酒添加到裂解细胞中(总体积15μL)，并且根据制造商的说明书进行预扩增。
然后，添加60μL扩增鸡尾酒，并且根据制造商的说明书进行扩增。可以使用ZymoResearch D4014试剂盒，根据制造商的说明书，纯化WGA产物。
在含6μL10mM Tris-HCl、50mM KCl、1.5-2.5mM MgCl2、200μM的每一种脱氧核苷酸、0.5μL引物及2U的Taq Gold(Life technologies)的60μL中，进行基因特异性扩增。使用“内部”基因特异性引物和相同的PCR方案，在20μL中，再次扩增2微升PCR外部产物(PCRouter product)。
使用来自PicoPlex的WGA，巢式PCR可能对于所有基因并不是必需的。进一步地，这些WGA产物与高通量测序和CGH微阵列分析相容。
引物序列和循环条件示于下面的表1中：
表1：引物序列和循环条件
Figure BDA0001797519980000271
Figure BDA0001797519980000281
在基因特异性PCR之后，使用传统测序、片段分析、SNP测定(Taqma测定)、低温PCR、cast-PCR或HRM分析，确定基因的突变状态。
在裂解了过滤点上存在的所有细胞之后，还可以在没有激光捕获显微切割的情况下，进行分子分析。使用孔径和孔密度适于提高限定的罕见细胞的纯度的过滤器，可以改进罕见细胞的富集和纯度。
在体积至少为45μL的蛋白裂解之后，收集肿瘤细胞的DNA，该肿瘤细胞的DNA与来自白细胞的野生型DNA混合。可以将提取的DNA分成几种WGA反应，或者被纯化且用于一种WGA反应。
对于单个细胞，使用引物延伸预扩增(Primer Extension Preamplication，PEP)或商业化的试剂盒(Rubicon Genomics,Sigma,Qiagen,Silicon Biosystems)，可以进行WGA。
在WGA之后，可以使用灵敏的基因突变特异性测定，测定在未突变的DNA中存在突变的DNA。这可以使用不同的方法，诸如数字PCR、低温PCR或cast-PCR来实现。
在Cast-PCR的情况中，可以在典型的20μL cast反应中，使用2μL的纯化的WGA DNA(约20ng的DNA)。
实例2：循环的肿瘤细胞的遗传表征和循环的肿瘤细胞中的治疗诊断突变的检测：
肺癌。根据实施的优选模式，可以通过过滤，从患肺癌的患者的血液中分离罕见细胞；可以通过细胞形态分析鉴定出在分离的罕见细胞中的肿瘤细胞，并且通过ALK特异性抗体和分子探针表征该肿瘤细胞。
ALK基因重排，对来自肺腺癌患者的循环的肿瘤细胞和肿瘤组织进行的比较分析
该工作的目标描述如下：1)在患肺腺癌的87位患者中，在通过ISET分离的具有恶性细胞形态标准的CTC中，测定ALK状态；以及，2)对比在CTC中和在对应的肿瘤组织中发现的ALK状态。对这一目的，使用基于对ALK基因重排的双重免疫化学和FISH途径的测定，并且将该测定应用于CTC和对应的肿瘤组织样品。
患者和样品
在之前使用ISET方法的研究中，该ISET方法用于经历NSCLC手术的患者，在76/208(37％)的病例中检测到具有细胞形态恶性特征的CTC。
对于本次工作，发明人从后者具有初始腺癌的40例群体中进行选择。此外，在2011年5月至12月之间，包括在本研究中的47位肺腺癌患者具有恶性特征的CTC。在这87位患者中，34位具有血液样品(10ml)，该血液样品通过使用固定缓冲液(含细胞固定剂)并且如在公布的专利申请US 2009-0226957中描述的，在不同的时间点(手术前以及手术后7天和15天)通过ISET收集和处理。所有患者都给出了他们对参加本研究的知情同意书。选定的87位患者的主要临床病理特征总结在表2中。
表2：包括在本研究中的87例的主要临床病理数据
Figure BDA0001797519980000291
Figure BDA0001797519980000301
根据第7种pTNM分类，并且根据肺腺癌的最终组织学分类，对肿瘤进行分类[26,27]。使用ALK基因的分离探针(break-apart probe)(Vysis LSI ALK Dual Color,AbbottMolecular,Abbott Park,IL)(补充数据)，对肿瘤样品进行FISH分析。为了进行充分解释，肿瘤细胞核应具有至少一种共定位信号。为了考虑为ALK重排，至少15％的可解释的肿瘤细胞核应携带变态的探针杂交模式[28]。使用针对ALK蛋白的初级抗体(1:50,5A4；Abcam,剑桥,UK)对经石蜡包埋的切片进行免疫组化(IHC)，在室温孵育45分钟(补充数据)。如之前所述的[29,30]，通过焦磷酸测序，对从冷冻肿瘤组织切片提取的DNA进行如下的靶向突变分析：i)EGFR突变热点，ii)KRAS突变热点，及iii)BRAF突变(补充数据)。
在ISET过滤器上进行免疫细胞化学和荧光原位杂交(FISH)。
在对应的过滤器的未染色的斑点上，通过MGG在6个斑点上的染色[15]，对通过ISET方法分离的CTC进行ICC和FISH，其中对应的过滤器的未染色的斑点包含具有恶性特征的CTC。对于每一个过滤器，两个斑点用于ICC，并且两个斑点用于FISH。对于ICC，斑点与针对ALK蛋白的初级抗体(1:50,5A4；Abcam,剑桥,UK)在室温孵育30分钟。经3,3'二氨基联苯胺使反应可视化，然后使用苏木精复染。认为细胞染色对ALK是阳性的[30](补充数据)。根据制造商的说明书，在两个或更多的斑点上进行的FISH使用用于ALK基因的分离探针(Vysis LSI ALK Dual Color,Abbott Molecular,Abbott Park,IL)。示出分开的信号或仅示出3’信号的细胞被认为对ALK重排是阳性的[31]。以隐藏了临床、IHC、ICC数据和组织基因型的方式，独立检验过滤器。我们测试了，对于在34位患者的102个过滤器的CTC上进行的ALK检测的ICC和FISH结果的再现性，在手术之前，及在手术之后的7天和15天，采集该34位患者的血液。
分析每一位患者的14至500个可解释的肿瘤细胞核。为了进行正确地解释，肿瘤细胞核应具有至少一种共定位信号。为了考虑为ALK重排，至少15％的可解释的肿瘤细胞核应携带异常的探针杂交模式。
从ATCC(Manassas(马纳萨斯),VA)获得的人类NSCLC细胞系H2228，用作ALK重排的阳性对照[32]。如之前所述的[32]，在补充有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养且维持细胞。约50个细胞混合在从健康志愿者采集的10ml血液样品中。然后，如之前所述的[23]，使用ISET方法过滤样品。然后，如之前所述的，进行使用分离探针的FISH和使用抗ALK的抗体的ICC。
在对应于具有粘蛋白产生的固体为主型的结构的腺癌的五个肿瘤中，发现阳性ALK的免疫染色。对于如之前限定的所有肿瘤细胞，这5个病例示出强阳性的细胞质染色(得分3+)，同时在少数细胞中膜强化[31]。对同一石蜡封闭的系列切片进行FISH分析，证实了ALK重排的腺癌。其它82个肿瘤对于ALK免疫染色和使用FISH分析的ALK重排是阴性的。10个肿瘤(12％)是EGFR突变的(1个是外显子18突变，6个是外显子19突变，并且3个是外显子21突变)，并且20个病例(24％)是KRAS突变的(18个是外显子2的密码子12，并且2个是外显子2的密码子13)。没有检测到BRAF突变。5个ALK重排的肿瘤是EGFR、KRAS和BRAF野生型。
在5位患者中分离的CTC中发现了阳性的ALK免疫染色，该5位患者对应于在肿瘤中具有ALK重排的患者(图1A、A1和B1，和图1B)。这5位患者的临床病理数据详细描述在表3中。
Figure BDA0001797519980000321
使用5A4克隆的抗ALK的ICC，100％的CTC示出强细胞质染色(得分3+)，在大多数细胞中膜强化(图1、A1和B1，和图1B)。ALK FISH在这5个病例中提供有益信息(图1、A2和B2，和图1B)。所有的CTC都具有异常的信号模式，其中在每一病例中的每个细胞中观察到至少3种信号，该异常的信号模式与基因扩增或异倍体一致(图1、A2和B2，和图1B)。此外，FISH证实了ALK易位的存在，所有病例都具有5’和3’的分离探针及每一个细胞的多种信号(图1、A2和B2，和图1B)。5个病例都不没有FISH探针的任一部分的丢失。最后，对于这5位患者，使用MGG染色的CTC示出具有恶性特征的CTC，如之前所述(图1、A3和B3，和图1B)[22]。对于每一位具有CNHC-MF的患者，控制ALK-ICC和ALK-FISH的阳性，该CNHC-MF是使用ISET，在第一次检测之后7天和15天分离的。
在82位、示出对MGG染色具有恶性特征的CTC的其他选择的肺癌患者中，证实了使用抗ALK的抗体没有阳性免疫染色，及使用FISH分析没有ALK重排(图1，C1-C3)。ALK重排的H2228细胞稀释在血液样品中，然后通过ISET方法过滤，证实强阳性的ALK免疫染色和ALK易位(图1，D1-D3)。
对来自34位患者的102个过滤器上的CTC，测试通过ICC和FISH检测ALK结果的再现性，在手术之前，及在手术之后的7天和15天，对该34位患者进行血液取样。在包括的34位患者中，5位患者具有ALK阳性的肿瘤组织，并且29位患者具有ALK阴性的肿瘤组织。阳性结果与通过ICC和FISH对从三种不同的血液样品获得的结果一致，从具有ALK阳性肿瘤的5位患者的每一位获得该三种不同的血液样品。ALK的阴性结果与通过ICC和FISH对从三种不同的血液样品获得的结果一致，从具有ALK阴性肿瘤的29位患者的每一位获得该三种不同的血液样品。
补充数据：患者和样品
使用ALK基因的分离探针(break-apart probe)(Vysis LSI ALK双色,AbbottMolecular(艾伯特分子),Abbott Park(艾伯特派克),IL)(补充数据)，对肿瘤细胞样品进行FISH分析。使用63x的物镜，在落射荧光显微镜(BX51,(奥林帕斯Olympus),东京,日本)上读取(MI,EL,CB)载玻片，并且使用软成像系统(Soft Imaging system)(Cell(细胞),Olympus)软件分析图像。以隐藏了临床和免疫组化数据和基因型的方式，独立地测定结果。当注意到三位病理学家之间的差异时，检查载玻片以获得一致。分析每一肿瘤的50个可解释的肿瘤细胞核。为了进行充分解释，肿瘤细胞核应具有至少一种共定位信号。
使用针对ALK蛋白的初级抗体(1:50,5A4；Abcam,剑桥,UK)对经石蜡包埋的切片进行免疫组化(IHC)，在室温孵育45分钟。如下，半定量地测定染色密度及阳性细胞的比例：0＝在<10％的肿瘤细胞中没有或有微弱的染色；1+＝在>10％的肿瘤细胞中有微弱的染色；2+＝中等染色；3+＝强染色。阳性ALK表达被认为在1+至3+之间。对其隐藏了临床数据和基因型的三位病理学家(MI、VH和PH)，独立地测定样本中的免疫组化染色。当注意到三位病理学家之间的差异时，检查载玻片以获得一致。
如之前所述[29,30]，通过焦磷酸测序，对从冷冻的肿瘤组织切片中提取的DNA进行对以下位点的靶向突变分析：i)在密码子719,768,790和858–861中的EGFR突变热点，以及外显子19中的缺失和复杂突变；ii)密码子12,13和61中的KRAS突变热点，以及iii)密码子600和464–469中的BRAF突变。根据制造商的说明书，使用对应的
Figure BDA0001797519980000341
Pyro试剂盒(
Figure BDA0001797519980000342
EGFR
Figure BDA0001797519980000343
试剂盒,CE-IVD,Ref.971480；
Figure BDA0001797519980000344
KRAS
Figure BDA0001797519980000345
试剂盒,CE-IVD,Ref.971460；
Figure BDA0001797519980000346
BRAF
Figure BDA0001797519980000347
试剂盒,CE-IVD,Ref.971470；Qiagen,希尔登(Hilden),德国)，进行PCR扩增。在以24孔格式中处理PCR产物(10μl)，用于根据标准的制造商的方案，使用PyroMark Q24MDx真空工作站(Qiagen)进行焦磷酸测序分析。将板直接转移至PyroMark Q24系统(Qiagen)，用于序列确定。使用PyroMark Q24软件(Qiagen)自动分析数据。
补充数据：在ISET过滤器上进行免疫细胞化学和荧光原位杂交(FISH)。
对于ICC，使用ALK的靶向修复溶液(pH 9)(Dako,卡平特里亚(Carpinteria),CA)，进行热诱导的表位修复。使用3％的过氧化氢处理斑点20分钟，以阻止内源过氧化物酶的活性，然后在去离子水中洗涤2-4分钟。然后，斑点与针对ALK蛋白的初级抗体(1:50,5A4；Abcam,剑桥,UK)在室温孵育30分钟。经3,3'二氨基联苯胺使反应可视化，然后使用苏木精复染。认为细胞染色对ALK是阳性的[30]。如上所述，通过三位病理学家(MI、VH和PH)半定量地评价染色的密度，以及阳性细胞的百分比。以隐藏了临床、IHC数据和组织和细胞基因型的方式，独立检验过滤器。当注意到三位病理学家之间的差异时，检查载玻片以获得一致。
使用双ICC-FISH测定，发明人已经示出可以在小部分的肺癌患者中，非介入性地检测CTC中的ALK状态，该CTC通过细胞形态学途径表征。此外，这些结果证实了，在CTC中确定的ALK状态和在87位肺腺癌患者系列中的对应肿瘤组织样品中的ALK状态之间的紧密联系。这些患者中的5位具有之前报道的，与在西方人群中的ALK基因重排相关联的临床病理特征，并且在CTC和在对应的被切除的肿瘤样品中都示出ALK基因重排[28]。相反地，在具有没有ALK基因重排的肿瘤的患者中，从没有发现具有ALK基因重排的CTC，如通过FISH的最近研究所证实的，该FISH的最近研究将它们的兴趣集中在ALK阳性肺癌患者的预后的相关性上，这独立于ALK靶向的疗法之外[33-35]。这些研究中的一些证实了，在没有经在先ALK抑制剂治疗的患者中，ALK阳性的患者具有最短的存活，并且与较高的转移风险相关联[33,35]。此外，与ALK阴性的患者相比，ALK阳性的患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的治疗有更大的抗性[33]。相反地，最近的研究证明了，野生型EGFR ALK阳性的肺腺癌患者具有较好的结果[34]。在本工作中，对5位EGFR野生型的ALK阳性患者进行5年跟踪，示出2位经过手术的II期患者没有复发，而3位IIIb/IV期患者在诊断之后6个月内死亡。在这些患者中，没有给予辅助疗法，尤其是没有给予针对ALK重排的靶向疗法。
通过CTC分离和表征，检测ALK基因重排的非介入性测定是基于临床考虑的。使用克唑替尼的治疗必需被限制至具有被证实的ALK基因重排的肿瘤，这暗示使用可靠的技术途径对肿瘤样品进行系统性预筛。但是，不是总能获得，或以足够进行病理检验和不断增加的免疫/分子分析的量获得来自患肺癌的患者的肿瘤组织，其中病理检验和不断增加的免疫/分子分析目的在于，为了使用靶向疗法而使患者阶层化。由于血浆中游离的肿瘤DNA/RNA的变化，该游离的肿瘤DNA/RNA可能源自于凋亡的细胞并且缺乏肿瘤细胞的浸润特性，因此CTC可以代表“液体活检”，并且构成非介入性治疗诊断测试的理想目标。
发明人使用ISET途径以分离CTC，因为他们和其他人已经示出该方式显示了对NSCLC患者中的CTC分离具有高灵敏度[15-17]。如之前所指出的，通过ISET进行的CTC分离依赖于细胞尺寸，并且与任何细胞标记物无关。因此，由于EMT，通过ISET有效地分离表达上皮标记物的肿瘤细胞，以及具有丢失的上皮抗原的那些肿瘤细胞[17,21,24,25]。此外，在使用ISET分离和表征CTC中，已经开发了ICC和分子分析，包括FISH[17,18,21,23-25]。有趣的是，证实了对在手术之前及在手术之后的7天和15天测试的34位患者的小组，并且包括5位肿瘤组织为ALK阳性的患者，通过ICC和FISH检测ALK的结果的再现性。在从每一位患者获得的三种样品中，以隐藏了其信息的方式获得了一致的结果。这些结果证实对在过滤器上的ALK进行ICC和FISH分析的技术再现性，并且示出通过CTC分析动态实时跟踪患者的可行性。
对在肺肿瘤组织中的ALK基因重排的可靠测定，被认为是诊断和技术挑战[31,36]。可以使用FISH、免疫组化和/或逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)，评价肿瘤样品的ALK状态[31,35-39]。在目前使用克唑替尼的临床试验中，FISH是用作合格标准的诊断方法。使用对人类ALK蛋白具有特异性的抗体(抗体克隆ALK1)进行的HC，是用于诊断在间变性大细胞淋巴瘤的子集中的ALK重排的方法，它的灵敏度和特异性使得遗传测试被认为是不必要的[38]。在NSCLC中，来自重排的ALK基因的ALK蛋白的表达较低。但是，新的ALK特异性抗体的开发和使用已经提供了非常有趣的结果。
发明人已经使用抗ALK的抗体，克隆5A4，该抗体最近已经示出准确地测定20/20NSCLC肿瘤组织的类型[36]。在5例ALK重排的病例中，注意到在肿瘤中，不超过50％的肿瘤细胞是ALK-FISH阳性的，而通过IHC显示100％的这些细胞都是ALK阳性。但是，ALK的IHC在肿瘤细胞的特定区域中是异质性的，并且一些细胞仅被弱染色(1+)，而其它细胞被强染色(3+)。因此，如在最近的研究中所述的，仅在肿瘤的一些区域中可以观察到用于ALK基因重排的IHC和FISH之间的关系[40]，从而提出了在FISH阳性和“仅IHC 3+”阳性的细胞之间进行更好且更适当的对比的问题。如初步数据，本研究示出了，对CTC进行的ICC可以是检测ALK重排以及其它基因组改变(诸如EGFR突变)的有希望的工具。在这一方面，可以使用特异性抗体，在小部分肺腺癌中通过IHC证明一些EGFR突变[31,41]。我们可以推测，在这一小部分的肺癌中，也可以使用对CTC的ICC途径证明这样的EGFR突变。值得注意的是，在本研究中检测的所有CTC都是ALK-FISH阳性的，并且通过使用针对ALK的特异性抗体的ICC表现出强阳性。携带该特异性基因组改变的CTC可以促进转移，并且代表了侵略性的肿瘤细胞组。还可以通过RT-PCR，检测ALK基因重排[30,36]。RT-PCR是需要高质量RNA的具有挑战性的途径，以提供具有可变大小的多种转录物的扩增[36]。最后，最近已经开发了定量的实时PCT途径，以量化ALK转录物，并且获得了令人鼓舞的结果[36]。发明人没有试图使用RT-PCR寻找ALK重排，因为认为可能潜在地从通过ISET分离的CTC中提取的RNA的数量和质量不足以用于测试，因为在过滤之前，用于血液稀释的商业缓冲液含有甲醛。但是，可以使用新开发的ISET缓冲液测试该策略，以分离新鲜的CTC。与固定的CTC相比，该新鲜的CTC具有不变的灵敏度。
使用非介入性的基于CTC的测试可以允许实施实时分子治疗诊断跟踪患者，以鉴定参与对靶向疗法的抗性的、潜在的新基因组改变[42]。在这一方面，对克唑替尼的获得性抗性的显露，是ALK阳性肺癌患者的医疗护理中的新挑战[11,43,44]。事实上，新的基因组改变可以在克唑替尼疗法的过程中出现，并且可以使得初始靶向治疗无效。因此，可以开发实时监控，以通过对CTC进行分子测试，来检测潜在的额外的基因组改变，该CTC是通过ISET分离的并且通过形态学途径进行诊断表征。
发明人已经示出了，检测CTC中的ALK基因重排的可行性，该CTC是通过ISET分离的并且被表征为具有恶性特征的CTC。发现了使用ICC和FISH分子途径的一致结果，并且重要的是，与在87位测试患者中的肿瘤组织相比，还在CTC中发现了一致的结果。这些结果提供了基于CTC的治疗诊断途径，用于评价预筛选肺癌患者的非浸润性ALK状态。
实例3：本发明在浸润性癌症的早期诊断中的应用
“哨兵(sentinel)”循环的肿瘤细胞允许对患者中的肺癌进行早期诊断，该患者具有慢性阻塞性肺病。
循环的肿瘤细胞(CTC)被认为是在浸润性癌症的非常早期循环；但是，从没有作为浸润性癌症的首次标志报道它们。我们报道了，在168位患慢性阻塞性肺病(COPD)的患者中约有3位具有非小细胞肺癌(NSCLC)的肿瘤前症状。发现这3位患慢性阻塞性肺病(COPD)患者具有ISET检测到的CTC(通过肿瘤细胞尺寸分离)，其中ISET是高度灵敏的“基于细胞病理学的”CTC平台。在CTC出现在血液之后仅1至4年，一年一次的CT扫描就会检测到肺结节，导致它的手术切除以及早期NSCLC的病理诊断。然后，在手术之后9个月或12个月，重复ISET，并且示出CTC的消失。概念验证，这3个病例示出CTC在“处于危险中”的患者中用作浸润性肺癌的早期指示物的潜力。
循环的肿瘤细胞(CTC)属于血液中“循环的罕见细胞”(CRC)的组，它的检测可以开启非介入性预测医学的新的途径。通过目前的血液分析，CTC是检测不到的，因为它们的水平可能低至每毫升血液中仅有1个细胞(或更低)，因此一个细胞与平均一千万白细胞和50亿红细胞混合。进一步地，CTC具有不同的类型，包括上皮CTC和间叶CTC，上皮非肿瘤细胞(通过炎症性疾病和医源性介入传播)，内皮细胞，干细胞和胚胎细胞(在怀孕的女性中)。因此，CTC的特异性检测暗示，它们与其它CRC不同的诊断，以及灵敏度和诊断特异性的双重技术挑战[45]
因为这些技术困难，已经使用了检测循环的上皮细胞，而不是诊断CTC的方法，以开发大部分在患转移性癌症的患者中的预后/预测性标记物[46]。但是，来自临床、分子和动物研究的数据组合最近已经示出，浸润性的癌症在它们发展的非常早期就播散了肿瘤细胞，暗示对于CTC检测的灵敏且诊断的途径可能有助于它们的早期诊断[47,48]。
肺癌是侵略性且高浸润性的疾病。它的早期诊断是关键问题，因为9400万吸烟者存在患病的高风险，这仍然是在美国国内死亡的主要原因[49]。国家肺癌筛查试验研究了53,454位具有患肺癌高风险的人，最近已经示出，低剂量的CT筛选与20％的肺癌死亡率的降低相关[49]。但是，这一结果与令人印象深刻的96.4％的假阳性结果有关，因为在筛选的26,309位患者中，发现7191位是阳性的，但仅649位被进一步揭示为患有肺癌。进一步地，患肺癌的患者总数为1060，包括411位假阴性，这些假阴性的患者被CT筛选漏掉了。
在这种设置中，发明人分析，肺癌的高浸润性特征可以用作它的致命要害(Achilles’heel)，并且允许通过CTC的灵敏且诊断的检测，进行它的早期诊断。因此，使用ISET(通过肿瘤细胞的尺寸进行的分离)，这是用于非常灵敏的分离完整的CTC的直接途径，从而能够对CTC进行细胞病理学诊断[46,50,51]。
3位患者被描述为患有慢性阻塞性肺病(COPD)，慢性阻塞性肺病的病理被认为是肺癌的风险因素，这些患者在通过成像进行肺肿瘤检测之前数年，就在血液中发现具有CTC。
该报道第一次示出，在人类中，CTC的灵敏且诊断的鉴定提供了用于早期诊断浸润性癌症的有希望的测试。
病例报道
病例1
在1995年，基于肺功能测试，在50％至79％之间的FEV1(第一秒用力呼气容积)，以及胸部X光检查，患者XB(男性，年龄49)在1995年被给出了中度(GOLD2)慢性阻塞性肺病(COPD)的诊断。他已经吸烟45PY(pack-year(吸烟指数)：每45年，每天一包香烟)。十四年之后(2009年10月)，他经ISET测试，并且发现在通过细胞病理学分析鉴定的10ml血液中，具有67个CTC和3个CTM(循环的肿瘤微栓子)。在同一天，进行低剂量的螺旋CT扫描，证实了COPD的诊断，但没有示出肺结节。然后，计划每年进行CT扫描，并且在一年之后(2010年10月)，在右下肺叶中首次示出直径1.5cm的肺结节。一个月之后进行手术。病理分析和癌症分期揭示IA期乳头状腺癌(tubulopapillary adenocarcinoma)，且没有向淋巴结节播散或远处转移(pT1aN0M0)。肿瘤的基因分型示出在密码子12中的K-Ras突变。患者没有接受任何其它治疗。他在手术后9个月经ISET测试，并且没有在他的血液中发现CTC。
病例2
基于肺功能测试，在30％至49％之间的FEV1，以及胸部X光检查，患者AC(男性)在1998年被给出了严重的(GOLD3)COPD的诊断。他已经吸烟60PY。十一年之后(2009年5月)，他经ISET测试，并且发现在通过细胞病理学分析鉴定的10ml血液中，具有43个CTC和1个CTM。在同一天，进行低剂量的螺旋CT扫描，示出了COPD的迹象，但没能检测到任何肺结节。然后，计划每年重复进行CT扫描，并且在3年之后(2012年9月)，在左上肺叶中首次示出直径2.4cm的肺结节的存在。患者在一个月之后进行手术。病理分析和癌症分期揭示IA期乳头状腺癌，且没有向淋巴结节播散或远处转移(pT1bN0M0)。肿瘤DNA的分析示出在密码子12中的K-Ras突变。患者没有接受任何其它治疗。他在手术后12个月经ISET测试，并且没有在他的血液中发现CTC。
病例3
基于肺功能测试，在50％至79％之间的FEV1，以及胸部X光检查，患者BM(男性)在1999年被给出了中度(GOLD2)COPD的诊断。他已经吸烟35PY。九年之后(2008年2月)，他经ISET测试，并且在10ml血液中发现具有32个CTC和1个CTM。在同一天，进行CT扫描，证实了COPD的诊断，但没有示出任何肺结节。然后，每年进行CT扫描，并且在4年之后(2012年8月)，在右上肺叶中示出直径1.4cm的肺结节。一个月之后进行手术。病理分析和癌症分期揭示IA期腺泡腺癌，且没有向淋巴结节播散或远处转移(pT1aN0M0)。肿瘤的基因分型示出在密码子12中的K-Ras突变。患者没有接受任何其它治疗。他在手术后12个月经ISET测试，并且没有在他的血液中发现CTC。
方法
ISET方式是基于发动机驱动的(engine-powered)血液过滤的途径，它在具有8微米孔的聚碳酸酯膜上富集循环的CTC和CTM[50,51]。将外周血液(10mL)收集在缓冲的EDTA中，被保持在4℃，并且在收集1小时内进行处理。处理膜上的7个斑点用于免疫细胞组化，并且3个斑点用于细胞学分析的May Grünwald Giemsa(吉姆萨)染色。如之前所述的，使用双重免疫标记进行免疫细胞化学，该双重免疫标记为在室温将角蛋白(pan-cytokeratin)抗体(小鼠，克隆KL-1，Immunotech,Marseille(马赛))和抗波形蛋白(小鼠，克隆V9，Dako，巴黎)的抗体施加至过滤器45分钟。
使用ISET，基于对经MGG染色的分离细胞进行的细胞病理分析，并且根据之前限定的标准[51]具有表征为恶性特征的细胞的检测，患者被认为是CTC阳性的(图2)。
结果
使用ISET，基于通过ISET的分离，及对经MGG染色的分离细胞进行的细胞病理分析，并且根据之前限定的标准[51]具有表征为恶性特征的细胞的检测，发现在168位COPD患者中的3位(1.8％)是CTC阳性的。
发现具有CTC的三位COPD患者具有32个至67个之间的CTC，这些CTC被分离或被分组到薄片(sheet)中(图2)，该CTC在基线被在ISET上进行细胞病理学分析检测到，该三位COPD患者在对他们的跟踪中发展出肺癌。CTC揭示了大核，具有分散的核沟、异染色质团和中等量的具有高的核/细胞质比率的细胞质(图2)。进一步地，这些患者证实如下偶然性CTM：患者1具有由3、9和15个CTC构成的3个CTM；患者2具有20个细胞的1个CTM；以及，患者3具有12个CTC的1个CTM。偶然性集簇揭示了椭圆形或多边形CTC的立体粘着薄片，该椭圆形或多边形CTC示出核异型的、显著的核大小范围不同(anisonucleosis)，且具有频繁的多核及核重叠。对应的免疫染色的细胞主要仅表达角蛋白(图2)。但是，少量的CTC强表达波形蛋白(图2)，波形蛋白的表达与角蛋白表达有微弱关系。
在168位COPD患者中的3位患者(1.8％)中，还通过ISET检测到具有更温和的细胞形态学特征的分离细胞。但是，在随后的跟踪过程中(平均跟踪时间：48个月)，这3位COPD患者或其它162位COPD患者都没有示出发展出肺结节。在42位没有可检测病理的对照吸烟者中，及在35位不吸烟的健康个体中没有检测到CTC。
讨论
肺癌已知是高浸润性的癌症，超过75％的患者在诊断时不符合进行手术的条件[52]。因为它高比率和高浸润性特征，它是在全球范围内引起癌症相关死亡的主要原因[53]。在本领域中，诊断和非浸润性生物标记物的发现，对展开低剂量的CT扫描筛查和早期手术介入的下面的步骤可以是至关重要的。因为肺癌的高恶性表现是与它的浸润潜力相结合的，因此认为使用CTC的高灵敏度和诊断检测，能够增强CT扫描的研究，并且帮助降低与CT扫描筛查相关的假阳性和阴性结果。因此，发明人选择了168位患COPD的患者群体作为目标。COPD是在美国引起死亡的第三位主要原因，并且预计由于吸烟比率的增加，COPD在2030年之前会成为在全球范围内引起死亡的第四位主要原因。COPD被认为是肺癌的肿瘤出现前的症状，并且已经进行了计算，总体上每年2.2％的COPD患者发展出肺癌。但是，COPD的进展使对肺癌病变易感性增加了高达4至6倍，被认为由于在COPD和肺癌中的分担机制的观察数据。因此，COPD的早期诊断是重要的，因为在COPD疾病过程中的早期吸烟停止示出疾病进展和减少发病率和致死率[54]。
已经使用几种方法，以分离和检测循环的肿瘤细胞，这些方法具有可变的敏感度和特异性[45]。但是，发明人认为，在肺癌早期诊断的设置中，仅细胞病理诊断途径可以适于揭示“哨兵CTC/CTM”，“哨兵CTC/CTM要在用于肺癌的早期诊断(还包括CT扫描筛查)的组合的途径中使用。
ISET是对血液的直接且快速的处理，从血液中以高度灵敏的方式分离完整的CTC，并且还允许进行它们的免疫细胞病理学和分子分析。
在本文中报道的三个病例揭示了，在通过CT扫描检测到肺结节之前1至4年，CTC/CTM的有关数量。不幸的是，ISET过滤器没有被储存在-20℃，从而不可能研究CTC/CTM中的DNA突变。但是，这些收据首次在人类中验证了在动物模型中获得的结果，其中示出浸润性癌症早在“原位”癌的时期就播散了CTC。在这种设置中，还重要的是，注意到通过ISET在没有可检测的病理的42位吸烟者中，以及在35位不吸烟的健康个体中，都没有发现CTC和CTM。总体上，已经通过ISET以不同的组研究了未患癌症的562位受试者，并且示出在他们的血液中没有CTC。
如本文首次示出的，对于有发展出肺癌风险的三位患者，发现这三位患者在通过成像鉴定出肺结节之前1至4年，都具有通过ISET检测到的CTC，及细胞病理学。在这三位患者中，在早期(IA)已经诊断出肺癌，促使进行手术切除。然后，他们在手术后几个月没有示出CTC。现在需要较大规模的研究，以测定CTC作为可靠的工具，用于在具有风险的患者中进行肺癌早期诊断的诊断鉴定的潜力。
实例4：本发明在从经子宫颈(transcervical)样品分离和表征子宫颈滋养层中的应用
滋养层。根据优选实施方式，可以通过过滤从经子宫颈样品中提取滋养层细胞，通过细胞形态分析鉴定该滋养层细胞，并且在激光显微切除和总基因组扩增之后，可以通过PCR对它们的基因组进行单独表征。
使用在子宫颈的中央开口中旋转的细胞刷工具，在妊娠第5周至第15周之间，从怀孕女性中收集经子宫颈样品。将经子宫颈样品转移到补充有固定剂的PBS溶液中。在过滤之前，样品可以在4℃储存数月。
在过滤之前，使用蒸馏水根据样品的细胞性(cellularity)稀释经子宫颈样品，并且通过细胞病理学染色分析该经子宫颈样品。
然后，通过激光捕获微切割收集单个子宫颈细胞，并且如文献所报道的，进行用于基因分型和遗传分析的分子分析(Saker et al,Prenatal Diagnosis 2006)。
在怀孕早期，用于在怀孕女性中非介入性分离子宫颈滋养层的新途径。
当前的产前检查的主要目标是以完全安全的“非介入性”测试取代介入性产前诊断，介入性产前诊断与1％至2％出现流产的风险[55]相关。可以从三种来源非介入性地得到胚胎DNA：在母体血液中，尤其是循环的红细胞和滋养层细胞中的循环的胚胎细胞，该胚胎细胞在分娩或流产之后不在血液中持续；经子宫颈的滋养层，在从子宫腔至子宫颈的运输中；以及，游离的胚胎DNA，该游离的胚胎DNA是在母体血液中循环的总细胞的游离DNA的一部分。预期胚胎细胞的非介入性获取，能够提供纯的(不与母体DNA混合的)胚胎DNA，允许发展对羊膜穿刺术和CVS的非介入性且完全可靠的替换物。但是，循环的胚胎细胞和子宫颈滋养层非常罕见，并且它们的分离是技术挑战性的。现在，可利用高强有力的靶向细胞游离胚胎DNA的下一代测序途径，并且已经证实该途径能够提供可靠且非介入性的产前非整倍性检测[56,57,58,59,60]。但是，这些方法不能替代羊膜穿刺术和CVS，因为它们不能靶向纯的胚胎DNA。进一步地，这些途径在怀孕早期不能应用，并且需要极其复杂和昂贵的技术。
我们的团队已经证实，通过ISET(通过上皮肿瘤/滋养层细胞的尺寸进行分离)，可以容易地从母体血液中提取循环的滋养层细胞，因为滋养层大于外周血液的白细胞。此外，分离的细胞经遗传分析，并且对于两种阴性障碍，脊肌萎缩症和囊胞性纤维症，证实了它们在非介入性产前诊断(NI-PND)中的有用性[61,62]。
Shettles在1971年首次证实了胚胎细胞在宫颈内膜中的存在。滋养层细胞被认为是在子宫腔中从退化的绒膜绒毛上脱落下来，并且从子宫腔朝子宫颈运输[63,64]。随着底蜕膜与壁蜕膜的融合，子宫腔在11周至12周妊娠(WG)之间消失，因此收集这些罕见细胞的可能性预期是短暂的并且限制在怀孕早期。从子宫颈和子宫腔的下极收集胚胎细胞(被称为经子宫颈细胞(TCC)取样)是从母体血液分离胚胎细胞的替代方式，并且为NI-PND提供了纯的胚胎DNA的额外来源。它的极大优点在于如下事实，TCC仅仅是脱落的并且在孕期之外是不持续的滋养层(细胞滋养层和合胞体滋养层)。开发了不同的TCC取样途径，并且这些不同的TCC取样途径包括如下步骤：子宫内灌洗，宫颈内灌洗，宫颈内粘液抽吸，以及使用细胞刷进行的子宫颈内取样。很多目的在于确定最佳TCC取样方法的研究已经建立了子宫和宫颈内灌洗是最有效的方法，以早在5周妊娠时就一致地产生胚胎细胞[65,66,67,68,69,70]。但是，尽管它们已经被描述为最低限度的侵入或半侵入，但关于这些方法主要考虑的是流产风险[71,72]。在大多数研究中，在终止妊娠之前马上收集样品，因此还不能有效检验对正在进行的妊娠的影响。
理想的取样方法应当不造成并发症，应当对正在进行的妊娠没有负面影响，在医院设置外容易进行，并且是有成本效益的。如在材料和方法部分(样品收集)中描述的，采取安全的方法。更重要的是，该方法的安全性被如下事实证实：它在妊娠前三个月常规进行。
在本研究中，收集子宫颈样品的安全取样途径与ISET组合，是一种研究罕见细胞的非常实用的方法，这不仅因为它根据尺寸消除了诸如精子和白细胞的成分，而且因为它形成细胞优化层，以辅助激光显微切割和任何其它类型的细胞分析。通过利用独特的染色方法，可以微切割单个细胞滋养层和合胞体滋养层，并且通过基因分型证实它们的胚胎性质；其中，该独特的染色方法促使识别培养细胞。本文还示出，作为从血液中分离的滋养层的情况，细胞能够用于NI-PND。提供了新的途径，以一致且非介入性地获取胚胎细胞，该新的途径可用作对于羊膜穿刺术和CVS的真正非介入性替代方式的一部分，用于非介入性的产前诊断遗传疾病。
材料和方法
样品收集：
从有患单基因遗传病胚胎风险的怀孕女性(内克儿童疾病医院(
Figure BDA0001797519980000421
Necker-Enfants Malades))中，以及从正在进行选择性妊娠终止(TOP)的女性(安托万(Antoine Béclère))中，在绒毛取样之前马上收集TCC样品。所有女性都是在7周至12周妊娠之间。使用细胞刷获得细胞，但是不像传统的TCC取样方法那样，在我们的研究中，该刷子不被插入子宫颈内管中，而是在子宫外口(external os)处旋转。细胞刷被转移至10ml的含甲醇的防腐液中。
使用阿尔新蓝(Alcian blue)对样品进行染色和固定：
1ml的每一样品与1ml 1.1％的阿尔新蓝8GX/3％冰醋酸溶液(Sigma-Aldrich,St.Louis(圣路易斯),MO,USA)混合，并且孵育30分钟至50分钟。然后，样品在水中稀释25倍，留给我们50ml的总体积。每一份样品都被彻底混合，并且孵育5分钟。
使用ISET进行的样品过滤：
如之前所述的进行ISET，仅有较小的改动[61]。简单来讲，通过聚碳酸酯过滤器过滤稀释的样品(50ml)，该聚碳酸酯过滤器具有标准化的8-μm直径的圆柱形孔。来自1ml样品的细胞被浓缩在过滤器上的10个0.6-cm直径斑点上。
使用红色核染料对细胞核进行染色：
为了对过滤器上的经浓缩的细胞核进行染色，每一斑点都覆盖有0.1％的核固红染料/5％硫酸铝(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)，孵育2分钟，并且然后使用水进行彻底清洗。过滤器在空气中干燥。
过滤器和激光微切割的分析：
典型地，每一样品制成2个过滤器，并且因此对平均2ml的每一样品进行处理。通过使用Nikon(尼康)TE 2000-U(Nikon巴黎,法国和MMI苏黎世,瑞士)配备激光的显微镜进行激光捕获的微切割，从过滤器上获取没有被阿尔新蓝染色，并且显示出细胞滋养层样或合胞体滋养层样形态的单一细胞。每一个单一细胞都被弹射到适于PCR的微量离心管的盖子上。
分子分析：
每一经微切割的细胞在15μL裂解缓冲液(100mmol/L Tris-HCl,pH 8；400μg/mL蛋白酶K)中在60℃裂解2h，然后在94℃使蛋白酶K失活15min。对于引物延伸预扩增(PEP)[73]，向裂解细胞中添加5μL的400μM随机引物溶液(试剂盒genPEP 75OD,Genetix,波士顿,USA),6μL的PCR缓冲液(25mM MgCl2/明胶(1mg/mL),100mM Tris-HCl,pH 8.3,500mM KCl),3μL的四种dNTP的混合物(每一种为2mM)，以及1μL(5U)的Taq聚合酶(Applied Biosystem,福斯特市,CA,USA)，终体积60μL。通过使用STR引物，进行单个细胞的基因分型，以鉴定具有胚胎基因组的细胞，其中通过分析父亲和母亲的基因组DNA，发现STR引物是有信息的。在60μL中进行扩增，该60μL中含有6μL的PEP产物、10mM Tris-HCl、50mM KCl、2.5mM MgCl2、200μM的每一种脱氧核苷酸、0.5μM的每一种STR‘外’引物，和2U的Taq Gold(AppliedBiosystems,福斯特市,CA,USA)。使用‘内’荧光STR引物和相同的PCR方案，在20μL终体积中再次扩增2μl 1:10稀释的PCR外产物(outer product)。然后，1μl 1:20稀释的PCR内产物(inner PCR product)与13.5μL去离子的Hi-Di甲酰胺和0.5μL Genescan 400HD(ROX)标记物(Applied Biosystems)混合，并且加载到ABI Prism 3100自动测序仪(AppliedBiosystems)上。使用Genescan和Genotyper的软件程序(Applied Biosystems)分析谱图。
如之前所述的[62]，进行SMA和囊胞性纤维症的非介入性产前诊断。
在巴黎内克儿童疾病医院的医学遗传学实验室，进行介入性诊断。
结果
总共筛查21份子宫颈样品，其中，从妊娠7周至12周的怀孕女性中，使用细胞刷仅在子宫外口水平获取细胞。其中，14位预定进行绒毛膜绒毛取样(CVS)，因为她们表现出有怀患单基因障碍的胚胎的风险，并且7位女性即将进行选择性妊娠终止(TOP)。
子宫颈样品典型地含有各种母体细胞。如在图3中所示的，在显微图像中易于识别外子宫颈鳞状上皮细胞。但是，子宫颈内细胞和胚胎细胞滋养层可以具有类似的形态，并且因此更难以进行区分。阿尔新蓝与子宫颈内产生粘液的柱状上皮细胞反应，并且因此用于促使胚胎细胞的识别，该胚胎细胞应仍然保持是未染色的。寻找显示细胞滋养层样形态的细胞：具有大且不规则的过染色的核(图3)。以这样的方式，我们能够分离单个细胞滋养层，该单个细胞滋养层的胚胎基因型通过有信息的STR标记物的荧光PCR分析进行验证。
表4.来自21份子宫颈样品的胚胎细胞的分离(细胞滋养层/合胞体滋养层)，及用于囊胞性纤维症的示例性的非介入性产前诊断。
Figure BDA0001797519980000441
Figure BDA0001797519980000451
TOP：妊娠终止；CF：囊胞性纤维症。
合胞体滋养层具有致密的核并且是多核的，并且因此据称较不易于进行分子分析。进一步地，合胞体滋养层可以是相当大的碎片，因此，应增加混合的细胞群体(胚胎和母体)的可能性。但是为了增大从每一样品获取的胚胎细胞的数量，我们还开始微切割多核的碎片，再次通过STR分析确定该多核的碎片的基因型(图3，表4)。同时，我们能够分离合胞体滋养层，该合胞体滋养层的纯的胚胎性质是经过证实的(表4)。如预期的，大多数碎片包含胚胎以及母体的成分，并且因此被从该研究中排除掉。
我们在所有21份样品中，以每毫升经处理的样品0.5至6个胚胎细胞的频率，鉴定了胚胎细胞(细胞滋养层或细胞滋养层和合胞体滋养层)。
为了示出我们之前公布的用于非介入性诊断囊胞性纤维症(CF)的方案，能够成功地应用于从子宫颈分离的胚胎细胞，对6个CF家庭进行示例性的诊断(表4)。CF的非介入性诊断基于DelF508突变的存在[62]。我们确定了，所有胚胎都缺乏DelF508突变，或仅是携带者(表4)。我们的结果通过绒毛膜绒毛取样得到证实。
讨论
开发适当的分离罕见的循环胚胎细胞的技术的竞争，已经不限于母体血流。同时，靶向母体血清中游离的胚胎DNA的下一代全基因组测序途径，特别在非整倍性检测中似乎是有希望的，可以被检测到的遗传性障碍的范围被简单地限制，因为胚胎DNA与母体DNA混合。从子宫颈获得胚胎细胞提供了可选择的来源并且具有优点，诸如在子宫颈中发现的胚胎细胞的仅有类型是已知在孕期之外是不持续的滋养层。主要挑战仍然是这些罕见细胞的获取和分离，不管这些罕见细胞是在母体血流中还是在子宫颈中。经子宫颈细胞(TCC)取样组合了开发出的不同方法，以从子宫颈内和子宫腔的下极获取胚胎细胞。但是，主要缺点是如下事实：这些技术是最低限度地侵入或半侵入，并且具有流产的风险。最小介入性的TCC取样方法使用细胞刷，该细胞刷典型地插入到子宫颈内管中约2cm，以获取子宫颈粘液。但是，在能够认为该方法安全之前，需要进行在正常进行的妊娠中的较大量的研究，包括长期跟踪。值得注意的还有如下事实：作者通过使用具有抗原性标记物的免疫荧光显微镜术，鉴定了胚胎细胞，但没有通过基因分型证实它们的胚胎性质。完全地非介入性和安全的取样方法(是在妊娠前三个月中常规进行的)从外子宫颈(刮刀)采集细胞，并且然后细胞刷在子宫颈的中央开口中旋转，以从外子宫颈和内子宫颈相接处的转变区域获取细胞。我们旋转采用该途径以在我们的研究中分离滋养层细胞，并且将该途径与ISET(在我们实验室中开发的技术)组合，从而简单地使细胞分层堆积在膜上，并且因此使它们平衡以用于微切割。在所有我们测试的样品中，我们都能够发现胚胎细胞，并且因此发现了用于遗传测试的纯的胚胎DNA的来源。我们示出，作为母体血液的情况，细胞易于进行遗传分析和诊断，并且因此证实各种遗传测试的潜力。从两种来源中完全非介入性的分离胚胎细胞，和通过临床认可的被证明为在妊娠过程中是安全的取样方法(抽血和我们的安全的子宫颈测试)分离培养细胞，能够为遗传疾病的早期、安全和可靠的诊断测试的开发铺平道路。
本发明包括以下的具体实施方式：
1、一种用于鉴定、诊断与罕见细胞相关的症状、障碍或疾病，或提供与罕见细胞相关的症状、障碍或疾病的预后的方法，包括：
(a)通过使生物样品穿过过滤器分离或提取罕见细胞，并且在过滤器上获取分离的所述罕见细胞；其中，所述过滤器具有保留罕见细胞但允许其它种类的细胞穿过的孔径、孔密度或其它物理特征；
(b)确定分离或提取的所述罕见细胞的细胞形态，和/或对分离的所述罕见细胞进行免疫标记，和/或对分离的所述罕见细胞进行分子分析；
(c)基于分离或提取的所述罕见细胞的细胞形态和/或免疫标记和/或分子分析，鉴定、诊断或提供与所述罕见细胞的存在和/或数量和/或特征相关的症状、障碍或疾病的预后，和/或与所述罕见细胞的存在和/或数量和/或特征相关的症状、障碍和/或疾病的阶段。
2、根据实施方式1所述的方法，其中所述生物样品是血液，可选择地以允许分离和获取罕见细胞以及与所述罕见细胞分离的白细胞和血浆的方式过滤该血液，用于分子分析。
3、根据实施方式1或2所述的方法，其中，所述生物样品是除了血液之外的生物流体。
4、根据实施方式1至3中任一个所述的方法，其中，所述生物样品是粘液或从粘膜获得。
5、根据实施方式1至4中任一个所述的方法，其中，所述生物样品从受试者获得，该受试者患有癌症或肿瘤，或该受试者被怀疑患有肿瘤或癌症，或有患肿瘤或癌症的风险。
6、根据实施方式1至5中任一个所述的方法，其中，所述生物样品从受试者获得，该受试者患有癌症或非癌性增殖的症状、障碍或疾病，或该受试者被怀疑患有非癌性增殖的症状、障碍或疾病，或有患非癌性增殖的症状、障碍或疾病的风险。
7、根据实施方式1至6中任一个所述的方法，其中，所述生物样品从受试者获得，该受试者患有炎症和/或退行性症状、障碍或疾病，或该受试者被怀疑患有炎症和/或退行性症状、障碍或疾病，或有患炎症和/或退行性症状、障碍或疾病的风险。
8、根据实施方式1至7中任一个所述的方法，其中，所述生物样品从受试者获得，该受试者患有心血管的症状、障碍或疾病，或该受试者被怀疑患有心血管的症状、障碍或疾病，或有患心血管的症状、障碍或疾病的风险。
9、根据实施方式1至8中任一个所述的方法，其中，所述生物样品从受试者获得，该受试者患有感染性症状、障碍或疾病，或该受试者被怀疑患有感染性症状、障碍或疾病，或有患感染性症状、障碍或疾病的风险。
10、根据实施方式1至9中任一个所述的方法，包括(a)通过使生物样品穿过聚碳酸酯过滤器分离或提取罕见细胞，并且在所述聚碳酸酯过滤器上获取分离或提取的所述罕见细胞。
11、根据实施方式1至10中任一个所述的方法，包括(a)通过使生物样品穿过PET(聚对苯二甲酸乙二酯)过滤器分离或提取罕见细胞，并且在所述PET(聚对苯二甲酸乙二酯)过滤器上获取分离或提取的所述罕见细胞。
12、根据实施方式1至11中任一个所述的方法，包括(a)通过使生物样品穿过由任何多孔材料制成的过滤器分离或提取罕见细胞，并且在所述过滤器上获取分离或提取的所述罕见细胞。
13、根据实施方式1至12中任一个所述的方法，其中，在(a)之前，稀释所述生物样品。
14、根据实施方式1至13中任一个所述的方法，其中，在(a)之前，所述生物样品是新鲜的。
15、根据实施方式1至14中任一个所述的方法，其中，在(a)之前，固定所述生物样品。
16、根据实施方式14或15所述的方法，其中，在(a)之前，通过细胞溶解剂处理所述生物样品。
17、根据实施方式14或15所述的方法，其中，在(a)之前，通过溶粘蛋白剂处理所述生物样品。
18、根据实施方式14或15所述的方法，其中，在(a)之前，通过蛋白水解剂处理所述生物样品。
19、根据实施方式14或15所述的方法，其中，在(a)之前，通过抗凝剂处理所述生物样品。
20、根据实施方式1至19中任一个所述的方法，其中，如在(b)中进一步分析或用于培养之前，通过过滤分离或提取的所述罕见细胞被转移至支撑载体。
21、根据实施方式1至20中任一个所述的方法，其中，在通过过滤提取或分离罕见细胞之后，个别收集该罕见细胞，用于分子分析。
22、根据实施方式1至21中任一个所述的方法，其中，收集通过过滤提取或分离的所有细胞，用于在(b)中使用。
23、根据实施方式1至22中任一个所述的方法，其中，在(b)之前，分离或提取的所述罕见细胞被培养。
24、根据实施方式1至23中任一个所述的方法，其中，分离或提取的所述罕见细胞被培养，并且用于测试它们对特定药物及其不同剂量的敏感性。
25、根据实施方式1至24中任一个所述的方法，其中，分离或提取的所述罕见细胞被用于选择要被给予患者的治疗或靶向治疗，并且监控对该治疗或靶向治疗的响应和/或抗性。
26、根据实施方式1至25中任一个所述的方法，其中，在(b)之前，分离或提取的所述罕见细胞被固定。
27、根据实施方式1至26中任一个所述的方法，其中，在(b)之前，分离或提取的罕见细胞在所述过滤器上被染色或免疫染色。
28、根据实施方式1至27中任一个所述的方法，其中，在染色或免疫染色之后或之前，在(b)中通过原位分子分析分析分离或提取的罕见细胞。
29、根据实施方式1至28中任一个所述的方法，其中，(b)包括在所述过滤器或其它支撑载体上，对分离或提取的所述罕见细胞进行原位细胞形态分析。
30、根据实施方式1至29中任一个所述的方法，其中，(b)包括在所述过滤器或其它支撑载体上，对分离或提取的所述罕见细胞原位进行免疫标记。
31、根据实施方式1至30中任一个所述的方法，其中，(b)包括在所述过滤器上，对分离或提取的所述罕见细胞的蛋白、核酸或其它组分原位进行分子分析。
32、根据实施方式1至32中任一个所述的方法，其中，(b)包括对分离或提取的所述罕见细胞的蛋白、肽或多肽进行分子分析。
33、根据实施方式1至32中任一个所述的方法，其中，(b)包括对分离或提取的所述罕见细胞的DNA、RNA或微小RNA进行分子分析。
34、根据实施方式1至33中任一个所述的方法，进一步包括(b1)：在细胞形态分析、免疫标记或原位分子分析之后，使分离或提取的所述罕见细胞的图像可视化。
35、根据实施方式1至34中任一个所述的方法，进一步包括(b2)：在细胞形态分析、免疫标记或原位分子分析之后，记录分离或提取的所述罕见细胞的图像。
36、一种检测罕见细胞存在或不存在的方法，包括:
(a)通过使生物样品穿过过滤器分离或提取罕见细胞，并且在过滤器上获取分离的所述罕见细胞；其中，所述过滤器具有保留罕见细胞但允许其它种类的细胞穿过的孔径、孔密度或其它物理特征；
(b)任选地，培养分离或提取的所述罕见细胞；
(c)任选地，固定或染色分离或提取的所述罕见细胞，或任选的培养的罕见细胞；
(d)通过免疫标记，和/或原位分子分析，和/或罕见细胞的DNA、RNA和/或微小RNA的分子分析，和/或罕见细胞蛋白分子的分子分析，分析来自(a)、(b)或(c)的分离或提取的所述罕见细胞。
37、根据实施方式36所述的方法，其中，裂解分离或提取的所述罕见细胞用于(d)，或在(d)的过程中裂解分离或提取的所述罕见细胞。
38、根据实施方式36或37所述的方法，其中，裂解分离或提取的所述罕见细胞，并且(d)包括检测在裂解的所述罕见细胞中与症状、障碍或疾病相关的突变的蛋白和/或突变的RNA和/或DNA突变。
39、根据实施方式38所述的方法，其中，进一步包括选择个性化医疗的靶向治疗，以基于对裂解的所述罕见细胞中的突变的DNA，和/或突变的RNA和/或突变的蛋白的检测，评价治疗效果或检测对治疗的可能的抗性。
40、根据实施方式36至40中任一个所述的方法，其中，裂解分离和提取的所述罕见细胞，并且(d)包括在裂解的所述罕见细胞中检测ALK突变的存在或不存在。
41、根据实施方式36至40中任一个所述的方法，其中，裂解分离或提取的所述罕见细胞，并且(d)包括在裂解的所述罕见细胞中检测ALK突变的存在或不存在，其中所述方法进一步包括根据治疗效果选择对受试者的治疗，或基于所述ALK突变的存在或不存在检测对治疗的抗性。
42、根据实施方式36至41中任一个所述的方法，其中，裂解分离或提取的所述罕见细胞，并且(d)包括在裂解的所述罕见细胞中检测K-RAS和/或EGFR突变的存在或不存在，其中所述方法进一步包括根据治疗效果选择对受试者的治疗，或基于所述K-RAS和/或EGFR突变的存在或不存在检测对治疗的抗性。
43、根据实施方式36至42中任一个所述的方法，其中，裂解分离或提取的所述罕见细胞，并且(d)包括在裂解的所述罕见细胞中检测B-RAF和/或HER2突变的存在或不存在，其中所述方法进一步包括根据治疗效果选择对受试者的治疗，或基于所述B-RAF和/或HER2突变的存在或不存在检测对治疗的抗性。
44、一种个性化的药物治疗，包括使用在不同时间从同一受试者获得的生物样品，重复根据实施方式36至43中任一个所述的方法。
45、根据权利要求44所述的个性化药物治疗，其中，在治疗之前和之后，在治疗症状的过程中的不同点，或在与罕见细胞相关的症状、障碍或疾病的不同治疗方案的过程中，从同一患者获得所述生物样品。
46、根据实施方式45所述的个性化药物治疗，
(e)进一步包括，对比在不同时间获得的样品之间的罕见细胞的数量，以确定治疗方案的效果或检测对治疗方案的抗性；其中，检测到的罕见细胞的相对数量的下降，表明治疗方案的相对效果；并且，其中，检测到的罕见细胞的相对数量的升高，表明对治疗效果的抗性或没有效果；并且任选地，
(f)基于(e)选择对受试者有效的个性化靶向治疗。
47、根据实施方式36至43中任一个所述的方法，其中，(d)分析分离或提取的所述罕见细胞包括确定所述罕见细胞的类型和/或来源。
48、根据实施方式36至43和47中任一个所述的方法，其中，(d)分析分离或提取的所述罕见细胞包括确定罕见细胞从上皮向间叶细胞转变的状态。
49、根据实施方式36至43和47至48中任一个所述的方法，其中，(d)分析分离或提取的所述罕见细胞包括确定罕见干细胞的状态。
50、根据实施方式36至43和47至49中任一个所述的方法，其中，(d)分析分离或提取的所述罕见细胞包括确定所述罕见细胞是否具有与转移或浸润性细胞相关的基因表达标签，或确定所述罕见细胞是否表达与转移或浸润相关的决定因素。
51、根据实施方式36至43和47至50中任一个所述的方法，进一步包括基于(d)，进行与所述罕见细胞相关的症状、障碍或疾病的早期诊断。
52、根据实施方式36至43和47至51中任一个所述的方法，进一步包括基于(d)，进行与所述罕见细胞相关的癌症和/或浸润性癌症的早期诊断。
53、根据实施方式36至43和47至52中任一个所述的方法，进一步包括进行器官的早期诊断，所述癌症和/或所述浸润性癌症来源于所述器官。
54、根据实施方式36至43和47至53中任一个所述的方法，进一步包括基于(d)，进行与所述罕见细胞相关的感染性的症状、障碍或疾病的早期诊断。
55、根据实施方式36至43和47至54中任一个所述的方法，进一步包括：评价候选药物或候选治疗对罕见细胞的分子特征的效果；以及，选择与没有给予药物或治疗的对照相比，降低受试者体内的罕见细胞数量的药物或治疗；以及，选择与对照相比，降低罕见细胞的相对数量或改变罕见细胞的分子或免疫特征的药物或治疗。
56、根据实施方式36至43和47至55中任一个所述的方法，进一步包括：评价受试者发展出与罕见细胞相关的症状、障碍或疾病的倾向性和/或风险，其中，与基线或对照值相比，罕见细胞的相对数量的增加表明发展出所述症状、障碍或疾病的倾向性或增加的风险；或其中，与基线或对照值相比，罕见细胞中的分子或免疫变化表明发展出所述症状、障碍或疾病的倾向性或增加的风险。
57、根据实施方式36至43和47至56中任一个所述的方法，其中,所述症状、障碍或疾病是遗传障碍。
58、根据实施方式36至43和47至57中任一个所述的方法，其中,所述症状、障碍或疾病是癌症或赘生物疾病。
59、根据实施方式36至43和47至56中任一个所述的方法，其中,所述症状、障碍或疾病是感染性症状、障碍或疾病。
60、一种试剂盒，包括以下组成部分中的至少一种：
用于从生物流体中提取或分离罕见细胞的一种或多种过滤器，
用于在过滤之前处理所述生物流体的一种或多种缓冲液、稀释剂或其它试剂，
用于在从生物流体中提取或分离所述罕见细胞之后，悬浮、洗涤或其它方式地处理所述罕见细胞的一种或多种缓冲液，
用于将分离或提取的所述罕见细胞从过滤器转移至不同的支撑载体的一种或多种转移缓冲液，
一种或多种细胞形态和/或细胞化学染色试剂或其它细胞染色剂，或对应的缓冲液，
用于免疫标记罕见细胞的一种或多种抗体或其它试剂，或对应的缓冲液，
用于在过滤器或其它支撑载体上对罕见细胞进行原位分析的一种或多种试剂，
用于裂解罕见细胞的一种或多种溶解剂或裂解缓冲液，
用于对罕见细胞蛋白进行分子分析的一种或多种抗体或其它试剂，或对应的缓冲液，
用于对罕见细胞的核酸进行分子分析的一种或多种探针、引物、核苷酸、酶或其它试剂，该分子分析包括PCR。
61、一种组合物，包括一种或多种罕见细胞，通过使生物样品穿过过滤器，并且在过滤器上获取分离的所述罕见细胞分离或提取一种或多种所述罕见细胞；其中，所述过滤器具有保留罕见细胞但允许其它种类的细胞穿过的孔径、孔密度或其它物理特征。
62、一种过滤器或其它支撑载体，包括根据实施方式61所述的组合物。
63、根据实施方式36至43和47至59中任一个所述的方法，进一步包括基于实施方式36至43和47至59的步骤d)，对与肿瘤细胞相关的肺癌进行早期诊断。
64、根据实施方式36至43和47至59中任一个所述的方法，进一步包括基于实施方式43和47至59的步骤d)，对与内皮细胞相关的心血管疾病的存在和/或严重性进行早期诊断。
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法国公立援助医院
国家健康与医学研究院
帕特里齐亚·帕特里尼-布雷绍
苏菲·拉热
保罗·霍夫曼
蒂埃里·卡派德
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<150> US 61/651,437
<151> 2012-05-24
<160> 26
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
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<220>
<223> 正向引物
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aaaaggtact ggtggagtat ttga 24
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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tgcttgctct gataggaaaa tg 22
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gctgcgagct gacccagaat gtctgg 26
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ggcctccatc tcctcctc 18
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gagtacggcc ctgaagaaga 20
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<212> DNA
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ccgtcgaagt tgagccatac 20
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gccgaggagg agatggag 18
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gcttcagacc gtgctatcgt 20
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accggtgtgg ctctttaaca 20
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<212> DNA
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<210> 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 反向引物
<400> 26
caaaagctga gatgaaacag tg 22

Claims (9)

1.一种用于安全且非介入性鉴定胚胎细胞的方法，包括：
(a)用细胞刷非介入性地从孕妇的含有滋养层罕见细胞的宫颈外口(子宫外颈)收集经子宫颈的样品，其中所述样品在妊娠第5到第15周期间收集；
(b)在具有阿尔新蓝的溶液中染色所述经子宫颈的样品的细胞；
(c)使所述样品通过过滤器分离、提取或浓缩滋养层罕见细胞，其中所述过滤器具有回收滋养层罕见细胞的孔径、孔密度或其他物理特性；
(d)对从(c)中回收的未经阿尔新蓝染色的细胞进行免疫标记和/或分子分析以鉴定滋养层罕见细胞，所述滋养层罕见细胞是胚胎细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在(b)中对(a)中收集的细胞免疫标记的同时进一步进行染色。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述样品在过滤前用固定剂稀释。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，在(d)中通过细胞形态学染色分析从(c)回收的细胞，并通过激光捕获微切割收集单个滋养细胞，并进行用于基因分型分子分析。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，在过滤之前用粘液溶解剂处理所述样品。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，在过滤之前用蛋白水解剂处理所述样品。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中通过使用激光微切割，从过滤器中单独收集滋养层罕见细胞，然后裂解细胞蛋白质和分子分析。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，在(d)的进一步分析之前将经分离、提取、浓缩的滋养层罕见细胞转移到支撑载体。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，单独收集经分离、提取、浓缩的滋养层罕见细胞用于(d)中的分析。
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